CN1956997A

CN1956997A - 嵌合型可溶性超il－11和其应用

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Publication number: CN1956997A
Application number: CNA200580016353XA
Authority: CN
Inventors: 安杰伊·马茨凯维奇; 汉娜·达姆斯－科兹沃夫斯卡; 斯特凡·罗斯－约翰
Original assignee: Agirx Ltd
Current assignee: Agirx Ltd
Priority date: 2004-05-21
Filing date: 2005-05-20
Publication date: 2007-05-02
Also published as: CA2564770A1; AU2005245601A1; EP1749028A1; JP2008502353A; WO2005113591A1; US20090010872A1; EP1598364A1

Abstract

本发明涉及一种新设计的被命名为H11的细胞因子，其通过用它们的天然序列融合两种可溶性组分可溶性白介素11受体(sIL－11R)和白介素11(IL－11)来构建，和它在制造用于治疗或预防疾病的药物中的应用，所述疾病选自增殖性疾病、细胞病变、辐射损伤、IL－11依赖的炎性疾病、IL－11依赖的退行性疾病和IL－11依赖或介导的软组织疾病。

Description

嵌合型可溶性超IL-11和其应用

技术领域

本发明涉及一种新设计的被命名为H11的细胞因子，其通过用它们的天然序列融合两种可溶性组分，可溶性白介素11受体(sIL-11R)和白介素11(IL-11)，来构建，和它在制造用于治疗或预防疾病的药物中的应用，所述疾病选自增殖性疾病、细胞病变、辐射损伤、IL-11依赖的炎性疾病、IL-11依赖的退行性疾病和IL-11依赖的或介导的软组织疾病。

背景技术

IL-11是一种功能性多效细胞因子(综述于Du et al.，1997)。最初它在1990年时被鉴定为一种促进IL-6依赖的小鼠浆细胞瘤细胞系生长的分子(Paul et al.，1990)。后来证明IL-11不但对造血系统表现出多重作用，而且它还作用于很多不同的细胞类型：肝、胃肠道、肺、心、中枢神经系统、骨、关节和免疫系统(综述于Du et al.，1997和Schwertschlag et al.，1999)。IL-11和其它生长因子一起在体外和体内协同作用于造血作用的不同阶段，包括作用于祖细胞、巨核细胞生成和血小板生成、红细胞生成、骨髓细胞生成。它也影响造血的微环境(Du et al.，1997)。由于它的造血活性，IL-11已经在严重的化疗诱导的和骨髓移植诱导的血小板减少症中被检验。动物模型中的试验已经揭示IL-11刺激血小板生成(Hawley et al.，1996)和加速骨髓移植后外周血嗜中性粒细胞和血小板的恢复(Du et al.，1993)。在癌症患者中的I期和II期临床试验已经证明了IL-11在加速多细胞谱系造血细胞的恢复和减轻血小板减少症中的潜力(Gordon et al.，1996，Tepler et al.，1996，Isaacs et al.，1997)。美国FDA已经批准IL-11用于治疗化疗引起的血小板减少症。已经证明IL-11由于它抑制核因子-_KB(NF-_KB)核转位的能力而显示出抗炎活性(Trepicchio et.Al，1997)，这降低了巨噬细胞分泌的促炎性细胞因子如肿瘤坏死因子(TNF)、IL-1β、IL-6、IL-12的生成(Trepicchio et al.，1996，Leng et al.，1997，Redlich et al.，1996)。动物模型和临床试验中的大量研究已经证明IL-11在治疗包括炎性肠病的炎性疾病(Peterson et al.，1998)、辐射引起的肺损伤(Redlich et al.，1996)、败血症(Chang et al.，1996)、类风湿性关节炎(Anguita et al.，1999，Walmsley et al.，1998)、炎性肝病(Bozza et al.，1999)、粘膜炎(Sonis et al.，1997)和银屑病(Trepicchio et al.，1999)中的功效。因此IL-11被认为是在多种炎性疾病中的潜在治疗剂。如上所述，IL-11在淋巴造血系统之外也被证明具有多样的生物活性。这些包括在肝细胞中诱导急性期蛋白的合成(Baumman et al.，1991)、在脂肪细胞中抑制脂蛋白脂酶活性(Ohsumi et al.，1994)、在永生化海马神经元中诱导分化(Mehler et al.，1993)、参与破骨细胞发育(Girasoleet al.，1994)、刺激金属蛋白酶的组织抑制因子产生(Maier et al.，1993)。此外，已经证明IL-11在雌性生育中发挥重要作用，因为缺乏IL-11R的小鼠是不育的，这是由于其对胚胎植入的缺陷性子宫反应(Robb et al.，1998)。月经周期期间IL-11和IL-11R在人子宫内膜中的表达指出IL-11活性在人类女性生育中可能是一个关键因子(Dimitriadis et al.，2000，Karpovich et al.，2003)。

IL-11与IL-6、白血病抑制因子(LIF)、制瘤素M(OSM)、睫状神经营养因子(CNTF)、心脏营养素1(CT-1)都属于造血细胞因子家族(被命名为IL-6型或gp130细胞因子)，它们具有结构相似性和共同的受体亚基(gp130)(Bazan etal.，1990)。虽然每种IL-6型细胞因子要求特异性(独特的)受体复合体，但是至少一分子的gp130总是被利用的。最初时，配体(IL-6、IL-11、CNTF)特异性结合它的非信号传递受体亚基和随后募集信号传递受体链。IL-6和IL-11使用gp130同二聚体用于转导信号，而LIF、CNTF、CT-1利用异二聚体gp130/LIFR。OSM或者募集gp130/OSMR或者gp130/LIFR异二聚体(综述于Heinrich et al.，2003，Bravo et al.，2000)。

IL-6型细胞因子的三级结构在最近几年已经被详细研究。LIF(Robinson et al.，1994)、CNTF(McDonald et al.，1995)、IL-6(Somers et al.，1997)和OSM(Deller etal.，2000)的晶体结构已经被确定。这些研究揭示每种配体都展示长链四螺旋束拓扑结构，其包含四个紧密包装的α螺旋(称作A、B、C、D)，其长度为15-22个氨基酸。螺旋通过多肽环以上-上-下-下排列相连接，而B-C环较短，因为它连接一对反向平行的螺旋。IL-6型细胞因子的详细结构分析和突变研究已经鉴定了三种受体结合位点(命名为I、II、III)，其在gp130家族中似乎是保守的(综述于Bravo et al.，2000)。位点I，其使得配体能够结合它的非信号传递受体，其由A-B环的C-末端部分和D螺旋的C末端残基形成。位点II似乎是IL-6型细胞因子的所有成员的通用gp130结合位点，它是由螺旋A和C上暴露的残基组成的。位点III是由螺旋D的N末端部分、A-B环的N-末端部分和C-D环末端的氨基酸残基组成的。这个位点总是被第二个信号传递受体所占据，比如：根据配体不同可以是gp130、LIFR或OSMR。

参与IL-6型细胞因子信号传递的受体属于I型膜蛋白。它们具有细胞外N-末端和一个跨膜结构域(CNTFR除外，其通过脂质锚连接到膜(Davis et al.，1991))。由于它们细胞外区域的共同结构基序，它们被分类为I类细胞因子受体家族(Bazan etal.，1990)。该家族的特征在于存在至少一个细胞因子结合同源性结构域(CHD)，其由被称为D2和D3的两个III型纤连蛋白样结构域(FNIII)组成。CHD由约200个氨基酸组成，其在N-末端结构域中有四个位置保守的半胱氨酸残基和在C-末端结构域具有特征性保守Trp-Ser-X-Trp-Ser(WSXWS)基序。此外，每个受体亚基含有Ig样结构域，其定位于近膜CHD的N-末端。IL-6型受体被分为两组：α和β亚基。受体α(对于IL-6、IL-11和CNTF)不参与信号转导。亚基β，是信号转导受体链，其含有比α亚基大得多的细胞质部分并且具有三个近膜FNIII结构域，这些结构域可能在比如跨膜受体二聚体的稳定和/或定向中发挥一些作用(综述于Bravo et al.，2000，Heinrich et al.，2003)。除了膜结合的IL-6型受体亚基以外，它们的可溶性形式在生物液中被发现(综述于Marz et al.，1999)。它们或者通过膜结合受体的限制性蛋白裂解作用(脱落)或者通过从差异剪接mRNA翻译而形成。

按照Czupryn et al.所建议的结构模型，IL-11具有四螺旋束拓扑结构(Czuprynet al.，1995)。广泛的结构分析和突变研究已经确定了三个受体结合位点，类似于IL-6或CNTF的位点I、II和III的位置。这些位点在小鼠以及人IL-11中已经被表征(分别在Barton et al.，1999，Tacken et al.，1999)。位点I使IL-11能够结合αIL-11R，而位点II和III介导与两个不同gp130分子的结合。羧基末端缺失突变研究已经证明去除最后4个氨基酸使重组人IL-11(rhIL-11)的活性降低25倍，而去除C-末端8个或更多残基完全消除了它的活性(Czupryn et al.，1995)。对配体-受体相互作用位点的详细研究能创造新的强效IL-11拮抗剂和激动剂(分别为Underhill-Day et al.，2003，Harmegnies et al.，2003)。通过将一或两个氨基酸替换为其它氨基酸而创建以上分子，其分别导致配体/受体形成的抑制和增加。

IL-11Rα亚基已经在小鼠和人中被描述(分别为Hilton et al.，1994，Cherel et al.，1995 and Nandrukar et al.，1996)。人IL-11Rα链的两种同种型已经被鉴定(Cherelet al.，1996)。它们的细胞质结构域是不同的，而细胞外和跨膜部分是相同的。第一种同种型(IL-11Rα1)具有短的细胞质结构域，另一种(IL-11α2)缺少这个区域。当在用gp130转染的Ba/F3细胞上进行测试时，两种同种型都表现相似的功能和特性(Lebeau et al.，1997)。从结构上看，αIL-11R的细胞外部分可以分成三个结构域：Ig样结构域(D1)，和一个由两个FNIII结构域(D2和D3)组成的CHD(Cherelet al.，1995)。对于IL-11Rα链中参与配体结合的氨基酸残基了解很少，因为迄今为止对IL-11R的CHD没有可用的结构信息。Schleinkofer et al.最近的研究证明D3结构域主要参与配体相互作用，因为这个结构域的结合能力与全长受体的结合能力同样高(Schleinkofer et al.，2001)。然而，以人生长激素及其受体复合物的X射线结构(de Vos et al.，1992)以及作为模板的人CNTF结构(McDonald et al.，1995)为基础，他们已经建立IL-11/IL-11R复合体的分子模型，该模型证明与IL-11位点I结合的IL-11R的区域位于结构域D2和D3之内。基于这个模型，以及对IL-6/IL-6R相互作用的模拟，因为D3结构域对配体结合是充分的但是对gp130结合不充分(Ozbek et al.，1998)，Schleinkefer研究组推测D2结构域似乎参与：(i)结构域间的稳定作用，(ii)提供特异性或(iii)形成与gp130亚基的界面或(iv)需要它来诱导与gp130相互作用所必需的配体位点III中的构象变化(Schleinkofer et al.，2001)。IL-11R的Ig样结构域的作用没有被确定，对于IL-6R尽管它对于组装功能性受体不是必需的(Yawata et al.，1993)，在细胞内运输期间它使受体稳定(Vollmeret al.，1999)。

高亲合力IL-11受体复合物的计量关系已经被体外确定为六聚体复合物，其由两个IL-11分子、两个IL-11Rα链和gp130分子的同二聚体组成(Barton et al.，2000)。据预测IL-11通过位点I结合αIL-11R，通过位点II结合gp130的CHD和通过位点III结合第二个gp130的Ig样结构域。然而，IL-11配体/受体复合物的化学计量仍然在争论之中。Grotzinger et al.已经提出形成了四聚体复合物，其中IL-11首先结合特异性α受体的CHD紧接着通过该细胞因子的位点II和III与两分子的gp130组装成四聚体(Grotzinger et al.，1997)。对于IL-6，该四聚体能够结合另外的IL-6/IL-6R复合物，形成六聚体的但是非信号传递的复合物(Grotzinger et al.，1999)。Neddermann et al.提出在体外形成五聚体复合物，其由两个IL-11、两个IL-11R和一个gp130分子组成。然而，他们建议有另一个未鉴定的β链，其有助于六聚体受体复合物的形成(Neddermann et al.，1996)。Harmegnies et al.最近的研究支持以上数据(Harmegnies et al.，2003)。他们创建了一个IL-11的突变蛋白，其在位点I具有增加的疏水性，其被证明是一种强IL-11激动剂并表现出不同的生物活性。根据在活性评估中使用的细胞模型，当与野生型IL-11比较时，突变的IL-11表现出增加或降低的激动特性。另一方面，对IL-11拮抗剂的研究支持由Barton et al.提出的六聚体复合物(Underhill-Day et al.，2003)。

IL-11Rα链的可溶性形式(sIL-11R)已经被推测是存在的，尽管迄今为止在体液中还没有被发现。它的存在是基于鉴定了潜在编码IL-11R可溶性形式的转录本(Robb et al.，1996)。重组sIL-11R在体外可作为IL-11的激动剂(Baumann et al.，1996，Neddermann et al.，1996，Karow et al.，1996，Curtis et al.，1997)。另外，sIL-11R不但加强IL-11对正常情况下应答IL-11的细胞的作用，而且仅在IL-11存在下介导表达gp130分子的细胞中的信号转导(Baumann et al.，1996，Karow et al.，1996)。然而，用sIL-11R介导生物学反应所需的IL-11浓度必须比使用膜受体高10-20倍(Curtis et al.，1997)。因为IL-11R的表达限制于某些细胞类型，而gp130在身体的所有细胞上都存在，使用sIL-11R显著扩大了IL-11生物活性的范围。进一步说，当在表达膜结合形式IL-11R和gp130的细胞上进行测试时，观察到sIL-11R能够作为IL-11拮抗剂(Curtis et al.，1997)。观察到的拮抗作用是由于在重组sIL-11R和跨膜IL-11R之间对IL-11的竞争和/或是依赖于gp130分子的数量。然而，这些发现显示sIL-11R的生理作用比sIL-6R更加复杂，并且对于sIL-6R所获得的结果不能直接应用于sIL-11R。

为了增加和修饰一些分子剂的潜在生物活性，将两个可溶性的天然存在的组分连接的想法已经被提出。融合蛋白被预期是更稳定的并且只需要更低的有效剂量以支持生物活性。这类重组融合蛋白已经被描述过。IL-12中被分开编码的亚基(p35和p40)已经通过多肽连接子被连接(Lieschke et al.，1997)。超-IL-6是新设计剂的另一个实例，其由经多肽连接子与IL-6连接的IL-6Rα链的D2和D3结构域组成(Fischer et al.，1997，WO 97/32891)。对于IL-6，观察到刺激缺少膜IL-6R细胞所需要的IL-6和sIL-6R的有效浓度是非常高的(Rose-John et al.，1990)。此外，IL-6/sIL-6R复合物的平均半衰期也许比组装IL-6/sIL-6R/gp130复合物所需要的时间更短(Wells et al.，1996)。通过连接两种组分以创建融合蛋白(超-IL-6)，使IL-6/sIL-6R复合物的稳定性增加(WO 97/32891)。超-IL-6能够直接结合到它的信号转导受体亚基并增强IL-6的活性。超-IL-6是全活性的融合蛋白，与可溶性IL-6和sIL-6R分子的组合相比较其以低10-1000倍的剂量介导反应(Fischer et al.，1997)。与之相似，已经设计了另一个IL-6型家族的称为IL-11/R-FP的超级激动剂(Pflanz etal.，1999)。通过用21个氨基酸的连接子使IL-11R的D2和D3结构域(位置L/109-G/318)与IL-11(位置P/29-L/199)共价连接创建IL-11/R-FP，并且其在体外表现出比IL-11和sIL-11R的组合具有高50倍的活性。然而，这个构建体是由截短的人IL-11R和IL-11的片段组成的，因此分别缺少受体和细胞因子天然存在的部分。此外，所用的人工连接子不是天然存在的序列，当用其治疗人类患者时将增加IL-11/R-FP的免疫原性。

因此，本发明的一个目的是构建一种新设计的细胞因子超IL-11(H11)，其由天然存在的组分组成，其在人宿主中只引起轻微的或不引起免疫原性并且其能够在体内提供超过现有技术IL-11/R-FP的抗肿瘤反应。

本发明的第二个目的是H11用于治疗和/或预防增殖性疾病、细胞病变、辐射损伤、IL-11依赖的炎性疾病、IL-11依赖的退行性疾病、IL-11依赖或介导的软组织疾病的用途。

本发明的第三个目的是构建载体系统，尤其是携带H11的逆转录病毒、慢病毒和腺病毒载体，用于修饰癌细胞以及其它哺乳动物细胞，以及这些修饰细胞的用途，例如，用来治疗和/或预防癌症、尤其是黑素瘤、肾癌或胰腺癌的基因修饰肿瘤疫苗(GMTV)。

本发明的进一步的目的包括在不同表达系统包括杆状病毒表达系统中生产融合蛋白H11，和这种蛋白用于治疗或预防以下疾病的用途：增殖性疾病、细胞病变、辐射损伤、IL-11依赖的炎性疾病、IL-11依赖的退行性疾病和IL-11依赖或介导的软组织疾病。

发明内容

白介素11(IL-11)是一种多效细胞因子，最初被鉴定为一种刺激IL-6依赖的小鼠浆细胞瘤细胞系T1165增殖的因子(Paul et al.，1990)。现在已知IL-11与大量造血和非造血细胞类型发生相互作用(Du et al.，1997)。

IL-11受体复合物包括特异的α亚基和gp130。已经证明与sIL-6R对IL-6相似，sIL-11R对IL-11是激动性的(Baumann et al.，1996)。此外，已经显示转导IL-11进入小鼠黑素瘤细胞系B78H1细胞抑制肿瘤的生长(Dams-Kozlowska et al.，2000)。然而，如果与单独IL-11比较，sIL-11R修饰的B78H1细胞和IL-11分泌性B78H1细胞的混合物对肿瘤的生长没有更加优异的作用。为了增强体内IL-11活性，我们设计了一种新的细胞因子，称为超IL-11(Hyper IL-11，H11)，其显示出提高的体内抗肿瘤活性。H11的构建是基于αIL-11R的可溶形式(αIL-11R的细胞外部分，为了使其分泌包括它的信号序列)与IL-11序列(没有信号序列或没有信号序列的大部分)相连接。

因此本发明的一个方面提供多聚核苷酸，其选自：

(a)多聚核苷酸，其编码融合白介素-11受体(IL-11R)和IL-11多肽(H11)，其至少包含具有如SEQ ID NO：1所示推演氨基酸序列的sIL-11R和具有如SEQ IDNO：2所示推演氨基酸序列的成熟IL-11；

(b)编码H11的多聚核苷酸，其包含如SEQ ID NO：4所示sIL-11R的编码序列和如SEQ ID NO：5所示IL-11的编码序列；

(c)多聚核苷酸，其编码由(a)-(b)中任意一个多聚核苷酸编码的H11的片段和/或衍生物，其中与所述H11比较，在所述衍生物中一个或多个氨基酸残基被保守性替换，并且所述片段和/或衍生物具有体内抗肿瘤活性；

(d)多聚核苷酸，其与(a)-(c)中定义的任一多聚核苷酸具有至少70％一致性，且其编码具有体内抗肿瘤活性的H11；和

(e)多聚核苷酸，其互补链，优选在严谨条件下，与(a)-(d)中定义的任一多聚核苷酸杂交，且其编码具有体内抗肿瘤活性的H11；

或这样的多聚核苷酸的互补链。

在一个优选实施方案中，编码sIL-11R的多聚核苷酸定位在编码成熟IL-11的多聚核苷酸的5’末端。

在一个优选实施方案中，介于编码sIL-11R和成熟IL-11的多聚核苷酸之间的核苷酸序列编码一种非免疫原性的肽。

在一个优选实施方案中，编码sIL-11R和成熟IL-11的多聚核苷酸被直接连接。

在一个优选实施方案中，多聚核苷酸选自：

(a)多聚核苷酸，其编码具有如SEQ ID NO：3所示推演氨基酸序列的H11；

(b)多聚核苷酸，其包括如SEQ ID NO：6所示的H11的编码序列；

或这样的多聚核苷酸的互补链。

在本发明的多聚核苷酸的一个优选实施方案中，多聚核苷酸是DNA、基因组DNA或RNA。

本发明进一步的方面是载体，其含有至少一种本发明的多聚核苷酸。

在本发明的载体的一个优选实施方案中，多聚核苷酸可操作性连接到表达调控序列，其允许在原核和/或真核宿主细胞中表达。

在本发明载体的一个优选实施方案中，表达调控序列选自CMV、SV40、多角体蛋白启动子、逆转录病毒LTRs、磷酸甘油酸激酶(PKG)、延伸因子1-α(EF1α)和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)。

在本发明载体的一个优选实施方案中，所述载体选自质粒；噬菌粒；噬菌体；粘粒；人工哺乳动物染色体；人工酵母染色体；敲除或敲入构建体；病毒，尤其是腺病毒、痘苗病毒、减毒痘苗病毒、金丝雀痘病毒、慢病毒、疱疹病毒尤其是单纯疱疹病毒、杆状病毒、逆转录病毒、腺相关病毒(AAV)、鼻病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、丝状病毒及其工程化形式；病毒体；病毒样颗粒；和脂质体。

本发明进一步的方面是用本发明多聚核苷酸或本发明载体遗传工程改造的宿主细胞。

在一个优选实施方案中，宿主细胞选自昆虫细胞，尤其是粉纹夜蛾(Trichoplusiani)和草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)；哺乳动物细胞，特别是干细胞、肝细胞、脂肪细胞、神经元、破骨细胞、子宫内膜细胞、皮肤细胞、心肌细胞、粘膜细胞、造血细胞或肿瘤细胞，例如小鼠骨髓瘤细胞系-NSO；细菌细胞，特别是埃希氏菌属或芽孢杆菌属和酵母细胞，特别是毕赤酵母属(Pischia)或酵母属(Saccharomyces)。

在一个更优选的实施方案中，宿主细胞选自肾癌细胞、黑素瘤细胞、胰腺癌细胞、白细胞、包装细胞，特别是双嗜性或亲嗜性包装细胞。

在本发明宿主细胞的一个优选实施方案中，宿主细胞被遗传工程改造以进一步表达至少一种多聚核苷酸。

在本发明宿主细胞的一个优选实施方案中，进一步的多聚核苷酸编码一种细胞因子，特别是GM-CSF、IL-6、IL-11、IL-15、EPO、干扰素、LIF、OSM、CNTF、CT-I和sIL-6R/IL-6融合蛋白(例如超IL-6)。

本发明进一步的方面是制备能表达H11的细胞的方法，包括体外用本发明的载体基因工程化细胞，其中所述H11是由本发明的多聚核苷酸编码的。

本发明进一步的方面是制备由本发明多聚核苷酸编码的H11多肽的方法，其包括：培养本发明的宿主细胞和回收由所述多聚核苷酸编码的H11多肽。

本发明进一步的方面是具有由本发明多聚核苷酸编码的氨基酸序列的或由本发明方法可获得的H11多肽。

本发明进一步的方面是对由本发明多聚核苷酸编码的氨基酸序列的或由本发明方法可获得的多肽有特异性的抗体，其对sIL-11R和IL-11基本是无特异性的。

本发明进一步的方面是药物组合物，其包含本发明的或根据本发明方法可获得的宿主细胞、或者本发明的或根据本发明方法可获得的H11融合多肽，进一步包含赋形剂、稳定剂、保护剂、缓冲剂和/或添加剂。

本发明进一步的方面是本发明的或根据本发明方法可获得的宿主细胞、或者本发明的或根据本发明方法可获得的H11融合多肽的应用，用于制备用于预防或治疗选自以下疾病的药物：增殖性疾病、细胞病变、辐射损伤、IL-11依赖的炎性疾病、IL-11依赖的退行性疾病和IL-11依赖或介导的软组织疾病。

在一个优选实施方案中，增殖性疾病选自胃肠或结直肠道癌、肝癌、胰腺癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌、睾丸癌、皮肤癌、眼癌、黑素瘤、发育不良性口腔粘膜癌、侵入性口腔癌、小细胞和非小细胞肺癌、激素依赖性乳腺癌、非激素依赖性乳腺癌、移行和鳞状细胞癌、神经恶性瘤，包括神经母细胞瘤、神经胶质瘤、星形细胞瘤、骨肉瘤、软组织肉瘤、血管瘤、内分泌肿瘤、血液新生物包括白血病、淋巴瘤和其它骨髓增殖性和淋巴增殖性疾病、原位癌、增生性损伤、腺瘤、纤维瘤、组织细胞增多症、慢性炎症增生性疾病、血管增生性疾病和病毒诱导增生性疾病；尤其是黑素瘤、胰腺和肾癌。

在一个优选实施方案中，细胞病变选自血小板减少症、血细胞减少症和全血细胞减少症。

在一个优选实施方案中，辐射损伤是放疗期间引起的损伤，特别是治疗增殖性疾病期间。

在一个优选实施方案中，IL-11依赖的炎性疾病选自肝功能衰竭；肝炎；肝病；败血症；化疗或辐射诱导的组织损伤，尤其是肺损伤；炎性疾病，尤其是炎性肠病，类风湿性关节炎，炎性肝病；粘膜炎；变态反应；子宫内膜异位症；血管炎；内皮炎症相关的血管疾病，尤其是缺血性心脏病或外周血管病；和银屑病。

在一个优选实施方案中，IL-11依赖的退行性疾病选自退行性CNS疾病、PNS疾病和骨关节炎。

在一个优选实施方案中，IL-11依赖或介导的软组织疾病选自肥胖症和特发性女性不育。

在一个进一步优选的实施方案中，在施用H11或表达H11的宿主细之前、同时或随后施用进一步的细胞因子。

本发明一个进一步的方面是本发明的或根据本发明方法可获得的H11融合多肽的应用，用于制备干细胞治疗期间用于辅助疗法的药物。

本发明一个进一步的方面是本发明的或根据本发明方法可获得的H11融合多肽的应用，用于细胞的体外分化，尤其是干细胞或祖细胞。

具体实施方式

新设计的细胞因子超IL-11(H11)被构建，其是由天然存在的组分所组成。它含有用其天然序列与成熟人IL-11连接的全长人sIL-11R。这种构建有两个主要的优点：(i)它的组分尽可能接近两种蛋白的天然野生型形式和(ii)因此避免本领域已知的由于重组剂而导致的可能的免疫原性和其它副作用，所述重组剂与天然存在的分子不同，即其是“低野生型”的。

因此本发明在一个方面提供多聚核苷酸，其选自：

或这样的多聚核苷酸的互补链。

H11片段是在IL11或sIL-11R部分的一个或两个中携带N末端和/或C末端缺失的融合蛋白。IL-11被表达为具有199个氨基酸长度的蛋白质，其N末端的21个氨基酸在IL-11成熟过程中被切掉。包含在根据SEQ ID No：2的本发明H11中的IL-11片段包含第19-199位氨基酸，即它包含三个氨基酸，“AVA”，其在成熟蛋白质中并不存在。这三个氨基酸能够被视为在可溶性IL-11受体的功能部分和成熟IL-11之间的天然“间隔区”。

作为H11的部分，按照SEQ ID No：2的IL-11的C末端部分的缺失不应该超过6个氨基酸，优选仅为5、4、3、2或1个氨基酸。IL-11的N末端部分的缺失在H11中对IL-11的体内功能没有显著影响，因此H11中IL-11的N末端部分能够缺少10-1个之间的氨基酸，优选为N末端缺失少于10个、少于9个、少于8个、少于7个、少于6个、少于5个、少于4个、少于3个、少于2个、少于1个氨基酸。

不希望受任何理论的限制，发明人相信本发明H11融合多肽超过现有技术IL11融合多肽如Pflanz et al.的IL11融合多肽的令人吃惊的优势，部分依赖于避免通过缺失sIL-11R的更大部分，即Pflanz et al.所用从AA109开始的sIL-11R片段，而产生新的免疫原性表位，以及依赖于在融合蛋白中包括D1结构域，其在Pflanz et al.的融合产物中缺少。因此，应该避免缺失可溶性IL-11受体的更大部分，因为这既能够降低体内抗肿瘤活性又能增加体内免疫原性。最低程度的是，使用的sIL-11R分子应该包含IL-11R的D1、D2和D3结构域。根据SEQ ID No：1的sIL-11R蛋白能够在它的C-和/或N-末端有缺失，优选它能够在其C末端携带1-5个C末端氨基酸缺失，更优选4、3、2或1个C末端氨基酸缺失。在单独表达和在IL-11中即作为sIL-11R-IL-11融合蛋白表达的sIL-11R成熟期间，约22个氨基酸从sIL-11R的N末端被剪除。从而，有可能表达一种H11蛋白，其经蛋白质加工切割而缺少N末端部分，因此在一些优选实施方案中sIL-11R在N末端有22个氨基酸的缺失。D1结构域开始于sIL-11R的AA37，因此，如果H11的sIL-11R部分经工程化处理而具有缺失，它优选缺少N末端1-37个氨基酸。更进一步优选N末端缺失少于37个、少于36个、少于35个、少于34个、少于33个、少于32个、少于31个、少于30个、少于29个、少于28个、少于27个、少于26个、少于25个、少于24个和少于23个氨基酸。

H11的“衍生物”是具有不超过20个(例如，不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1)保守性替换的多肽。保守性替换在本领域是已知的并且典型的包括，例如，一个极性氨基酸替换为另一个极性氨基酸和一个酸性氨基酸替换为另一个酸性氨基酸。因此，保守性替换优选包括以下氨基酸组之内的替换：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、脯氨酸、异亮氨酸和亮氨酸(非极性，脂肪族侧链)；天冬氨酸、谷氨酸(带负电侧链)；天冬酰胺、谷氨酰胺、甲硫氨酸、半胱氨酸、丝氨酸和苏氨酸(极性不带电侧链)；赖氨酸、组氨酸和精氨酸；和苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸(芳香族侧链)；和赖氨酸、精氨酸和组氨酸(带正电侧链)。如何确定指定取代的影响在本领域是众所周知的，例如对pK_I等等。具有一个或多个保守性替换的多肽所必需的是它具有设计细胞因子H11至少10％(例如，至少：10％；20％；30％；40％；50％；60％；70％；80％；90％；95％；98％；99％；99.5％；或100％或甚至更多)引起体内抗肿瘤反应的能力。

两个序列间一致性百分率的确定通过使用Karlin和Altschul，1993的数学算法完成。这种算法整合到Altschul et al.，1990的BLASTN和BLASTP程序中。对于比较目的为获得有间隙比对，使用Altschul et al.，1997描述的Gapped BLAST。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，分别使用程序的缺省参数。

杂交也可以被用作确定两个核酸序列间同源性的手段。编码本文所公开H11多肽或其一部分的核酸序列，能够被用作根据标准杂交技术的杂交探针。杂交条件对本领域技术人员是已知的并且其可以从Current Protocols in Molecular Biology，JohnWiley & Sons，N.Y.，6.3.1-6.3.6，1991获得。中度杂交条件被定义为相当于在30℃在2×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂交，然后在50℃在1×SSC、0.1％SDS中洗涤。高严谨度条件被定义为相当于在45℃在6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂交，然后在65℃在0.2×SSC、0.1％SDS洗涤。

本发明的H11融合蛋白的体内抗肿瘤活性能够通过多种现有技术方法进行评估，包括在移植有肿瘤细胞的小鼠模型中的肿瘤生长。一个能够用来评估体内抗肿瘤反应的检测系统的实例公开于下面的实施例8。被认为具有体内抗肿瘤活性的H11融合多肽应该具有根据SEQ ID NO.3的H11多肽活性的至少10％，优选至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更多。

编码本文所公开H11多肽的多聚核苷酸可以基于它们与SEQ ID No.4-6中所列序列的相似性进行鉴定。例如，可以基于序列一致性进行鉴定。在某些优选实施方案中，本发明的特征在于分离的核酸分子，其与以下分子具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性：(a)核酸分子，其编码SEQ ID NOs：1-3的多肽或(b)SEQ ID NOs：4-6的核酸序列；并且编码具有体内抗肿瘤活性的H11多肽。

在一个优选实施方案中，编码sIL-11R的多聚核苷酸位于编码成熟IL-11的多聚核苷酸的5’端。这种排列是优选的，因为它使得IL-11的C末端区域不被与sIL-11R融合所障碍。

正如上面所指，本发明的一个目的是提供具有强激动作用、体内抗肿瘤作用和具有低抗原性的设计细胞因子。因此，在本发明多聚核苷酸的一个优选实施方案中，在编码sIL-11R和成熟IL-11的多聚核苷酸序列之间的核苷酸序列编码基本无免疫原性的肽。更优选地，由基本上无免疫原性肽连接的多聚核苷酸排列方式使得sIL-11R位于编码成熟IL-11的多聚核苷酸的5’端。术语基本“非免疫原性肽”表示一段短的长1-10个氨基酸的多聚氨基酸序列，优选少于9个、少于8个、少于7个、少于6个、少于5个、少于4个、少于3个、少于2个氨基酸通过肽键偶联，如果与无插入肽的相似融合肽相比较，其基本上不增加对sIL-11-R IL-11融合多肽的免疫反应。

免疫反应的程度能够通过多种已知的现有技术方法进行评估，例如，确定B细胞刺激作用的检测等等。评估多肽连接子的免疫原性的另一个方法是用在融合多肽的sIL-11R和IL-11部分之间包含肽连接子的本发明H11多肽免疫测试动物，随后确定测试动物是否产生特异性识别该肽连接子的抗体。识别的特异性通过比较观察到的与该肽连接子的结合量和观察到的与不相关蛋白的结合量进行确定。这类不相关蛋白的实例是非测试动物内源性的蛋白质，包括，例如牛血清白蛋白、乳蛋白等。与不相关蛋白质相比较，如果测试动物的多克隆血清对该肽连接子显示出5倍或更小、优选4倍或更小、更优选3倍或更小和最优选2倍或更小的特异性，则该肽连接子被认为基本无免疫原性。

基本无免疫原性的连接子的实例是具有小侧链的氨基酸的片段，所述小侧链氨基酸，例如，甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、苏氨酸或丝氨酸，并能够按下式描述：N_X，其中在长为X的肽链的每个位置上N独立地表示A、G、S、T或V，并且X表示1、2、3、4、5、6、7、8、9-10。连接子序列能够用于在H11的IL-11R和IL-11部分之间保持与在根据SEQ ID No：3的sIL-11R-IL-11融合物中实现的，即IL-11R的AA 314处D3亚结构域的末端和IL-11的AA 35处IL-11第一个预测α螺旋区域之间，相同的距离。在本发明的优选多肽SEQ ID No.3中所述距离是67AA，并且通过连接子的缺失和/或插入使其保持在62AA到72AA。因此，如果SEQ ID No：2的IL-11的“天然连接子”被删除，这个序列可以替换为上述连接子使距离维持在上述范围内，例如如果根据SEQ ID No：1的sIL-11R的C末端有1-5AA缺失和根据SEQ ID No：2的IL-11的N末端有1-6AA缺失，可以插入连接子以维持两个参考点间的总体距离。优选的是，插入连接子以保持距离为62-72AA，优选在63、64、65、66、67、68、69、70或71AA范围。连接子的总长应该保持尽可能的短，以避免产生潜在有害的免疫原性表位。在本发明的一种优选排列中，其中sIL 11R位于N末端和IL-11蛋白定位于C末端和其中sIL-11R部分优选携带不超过

因此，在一个优选实施方案中，连接子选自：A、G、S、T、V；AA、AG、AS、AT、AV、GA、GG、GS、GT、GV、SA、SG、SS、ST、SV、TA、TG、TS、TT、TV、VA、VG、VS、VT、VV；AAA、AAG、AGA、GAA、AAS、ASA、SAA、AAT、ATA、TAA、AAV、AVA、VAA、GGG、GGA、GAG、AGG、GGS、GSG、SGG、GGT、GTG、TGG、GGV、GVG、VGG、SSS、SSA、SAS、ASS、SSG、SGS、GSS、SST、STS、TSS，SSV、SVS、VSS、VVV、VVA、VAV、AVV、VVG、VGV、GVV、VVS、VSV、SVV、VVT、VTV、TVV、AGS、ASG、GAS、GSA、SAG、SGA、AGT、ATG、GAT、GTA、TAG、TGA，AGV、AVG、GAV、GVA、VAG、VGA、AST、ATS、SAT、STA、TAS、TSA、ASV、AVS、SAV、SVA、VAS、VSA、GST、GTS、SGT、STG、TGS、TSG、GSV、GVS、SGV、SVG、VGS、VSG、STV、SVT、TSV、TVS、VST和VTS。

在本发明多聚核苷酸的一个特别优选的实施方案中，编码sIL-11R和成熟IL-11的多聚核苷酸被直接连接。在本文中“直接连接”表示没有编码非天然存在连接子的非天然存在的核苷酸位于编码多聚核苷酸的sIL-11R和IL-11之间。

在一个进一步优选的实施方案中，多聚核苷酸选自：

(b)多聚核苷酸，其包括如SEQ ID NO：6所示的H11的编码序列；

或这样的多聚核苷酸的互补链。

在优选实施方案中所用术语“片段”、“衍生物”和“体内肿瘤活性”具有与上述相同的意思。

本发明的编码H11的核酸分子可以是DNA、cDNA、基因组DNA、合成DNA或RNA，且可以是双链或单链，正义链和/或反义链。这些分子的区段也被认为在本发明的范围内，并且可以通过，例如，多聚酶链反应(PCR)制备或用一种或多种限制性内切酶处理产生。核糖核酸(RNA)分子能够通过，例如，体外转录产生。

本发明的多聚核苷酸分子可以含有天然存在的序列，或这样的序列，其不同于那些天然存在的序列，但是由于遗传密码的简并性而编码同样多肽，即具有SEQ IDNOs：1-3的多肽。多聚核苷酸分子能够在3’和/或5’端末尾包括另外的多聚核苷酸，其编码进一步的多肽。

本发明的融合多聚核苷酸分子的多聚核苷酸能够在体外合成(例如，基于亚磷酰胺合成)或者能够从细胞，比如细菌、酵母、昆虫或哺乳动物细胞获得。

本发明进一步的方面是含有本发明多聚核苷酸的载体或者由本发明多聚核苷酸编码的H11融合蛋白。术语“载体”表示一种装置，其包括，例如，蛋白质或多聚核苷酸或其混合物，其能够被引入细胞或将本发明的蛋白质和/或多聚核苷酸引入细胞。某些载体特别适合用于将多聚核苷酸或多肽引入仅仅一些特异性细胞类型，而另一些载体能够被引入到多种不同的细胞类型。本领域技术人员知道如何根据细胞类型选择特定的载体，以使多聚核苷酸或多肽被引入所述细胞中。

在一个优选实施方案中，本发明的载体包括质粒；噬菌粒；噬菌体；粘粒；人工染色体，尤其是人工哺乳动物染色体或人工酵母染色体；敲除或敲入构建体；病毒，尤其是腺病毒、痘苗病毒、减毒痘苗病毒、金丝雀痘病毒、慢病毒(Chang and Gay，2001)、疱疹病毒尤其是单纯疱疹病毒(HSV-1，Carlezon，et al.，2000)、杆状病毒、逆转录病毒、腺相关病毒(AAV，Carter and Samulski.2000)、鼻病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、丝状病毒和上述病毒的工程化形式(见例如Kobinger et al.，2001)；病毒体；“裸”DNA，脂质体；病毒样颗粒；和核酸包被颗粒，尤其是金球(gold spheres)。尤其优选的是病毒载体，象腺病毒载体、慢病毒载体、杆状病毒载体或逆转录病毒载体(Lindemann et al.，1997，和Springer et al.，1998)。允许产生这些重组病毒载体的质粒实例包括pFastBacl(Invitrogen Corp.，Carlsbad CA)，pDCCMV(Wiznerowiczet al.，1997)和pShuttle-CMV(Q-biogene，Carlsbad，California)。

脂质体也是优选的载体并且通常是由阳离子、中性和/或阴离子脂质构成的小单层或多层小泡(vesicle)，例如，通过对脂质悬浮液进行超声处理。例如，多聚核苷酸可以以离子形式结合在脂质体的表面或以内在形式包裹在脂质体中。合适脂质混合物是本领域已知的，且包括，例如，DOTMA(1，2-二油酰氧丙基-3-三甲基溴化铵)和DPOE(二油酰磷脂酰-乙醇胺)，这两者都已经被用于多种细胞系。

包被核酸的颗粒是用于将本发明的多聚核苷酸引入细胞中的另一种手段，其使用所谓的“基因枪”，其允许以机械方式使颗粒引入细胞中。优选的是，颗粒自身是惰性的，因此在一个优选实施方案中优选由金球制成。

在一个进一步的方面，本发明的多聚核苷酸可操作性连接于一个或多个表达调控序列，其允许在原核和/或真核宿主细胞中表达。以上涉及的转录/翻译调控元件包括，但并不限于，可诱导的和非可诱导的、组成型、细胞周期调节的、代谢调节的启动子、增强子、操作子(operator)、沉默子、阻遏子和为本领域技术人员已知并驱动或以别的方式调节基因表达的其它元件。这些调控元件包括但不限于指导组成型表达的调控元件，例如，由RNA聚合酶III转录的启动子，例如，snRNA U6或scRNA7SK基因的启动子、巨细胞病毒hCMV立即早期基因的启动子、SV40腺病毒的早期或晚期启动子、来源于例如以下病毒的病毒启动子和激活序列：NBV、肝炎(HCV)、单纯疱疹病毒(HSV)、人乳头状瘤病毒(HPV)、Ebstein-Barr病毒(EBV)、人T细胞白血病病毒(HTLV)、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)或HIV；其允许可诱导表达，例如，CUP-1启动子、tet阻遏子，例如，用于tet开或tet关系统、 lac系统、 trp系统；指导细胞周期特异性表达的调控元件，例如，cdc2、cdc25C或细胞周期蛋白A启动子；或TAC系统、TRC系统、噬菌体A的主要操作子和启动子区、fd衣壳蛋白的控制区、磷酸甘油酸激酶(PGK)的启动子、酸性磷酸酶的启动子和酵母α-或a接合因子的启动子。尤其优选的启动子是组成型CMV立即早期基因启动子、早期或晚期SV 40启动子、多角体蛋白启动子、逆转录病毒LTRs、PGK启动子、延伸因子1-α(EF1-α)和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)。

正如在本文中使用的，“操作性连接”表示整合到遗传构建体中以致于表达调控序列有效的控制感兴趣编码序列的表达。

本发明的另一方面是经上述用本发明的多聚核苷酸或载体基因工程化的宿主细胞。可以用于本发明目的的宿主细胞包括但不限于原核细胞如细菌(例如，大肠杆菌和枯草杆菌)，其能用例如含有本发明多聚核苷酸分子的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体进行转化；简单真核细胞如酵母(例如，酵母属(Saccharomyces)和毕赤酵母属(Pichia))，其可以用例如含有本发明多聚核苷酸分子的重组酵母表达载体转化；昆虫细胞系统，例如，草地夜蛾和粉纹夜蛾细胞系，例如Sf9或Hi5细胞，其能用例如含有本发明多聚核苷酸分子的重组病毒表达载体(例如，杆状病毒)感染；爪蟾卵母细胞(xenopus oocyte)，其能用例如质粒注射；植物细胞系统，其能用例如重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒(CaMV)或烟草花叶病毒(TMV))感染或用含有编码H11多肽的核苷酸序列的重组质粒表达载体(例如，Ti质粒)转化；或哺乳动物细胞系统(例如，COS，CHO，BHK，HEK293，VERO，HeLa，MDCK，Wi38，NSO和NIH 3T3细胞)，其能用含有例如来源于例如哺乳动物细胞基因组(例如，金属硫蛋白启动子)、哺乳动物病毒(例如，腺病毒晚期启动子和痘苗病毒7.5K启动子)或细菌细胞(例如，用于tet-on和tet-off系统的tet阻遏物结合)的启动子的重组表达构建体进行转化。同样有用的宿主细胞是直接从哺乳动物获得的原代细胞或继代细胞，并且用质粒载体转染或用病毒载体感染。根据宿主细胞和用来引入本发明多聚核苷酸的各自载体，多聚核苷酸能够整合入，例如，染色体或线粒体DNA中或能够以染色体外形式被维持，例如，附加体型或能够仅能够短暂的包含在细胞中。优选的宿主细胞是草地夜蛾和粉纹夜蛾；哺乳动物细胞，尤其是干细胞、造血细胞、肝细胞、脂肪细胞、神经元、破骨细胞、子宫内膜细胞、皮肤细胞、心肌细胞、粘膜细胞、白细胞或肿瘤细胞；细菌细胞，尤其是埃希氏菌属或芽孢杆菌属菌种和酵母细胞，尤其是毕赤酵母或酵母属菌种。

本发明人已经发现，用本发明的多聚核苷酸或载体工程化的肿瘤细胞或细胞系能用于预防或治疗多种增殖性疾病。所述肿瘤细胞或细胞系可以来源于广泛的肿瘤和物种。能够从其获得肿瘤细胞的物种优选是哺乳动物，其选自人、非人灵长类动物、马、牛、绵羊、山羊、猪、狗、猫、山羊、兔、小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠或沙鼠，尤其是人。工程化的肿瘤细胞能够直接来源于肿瘤或能够在工程化处理前进一步传代培养。肿瘤细胞延长的传代培养通常导致细胞系的建立，其主要由克隆细胞组成。肿瘤细胞或细胞系能来源于任何肿瘤，然而优选源自胃肠或结直肠道癌、肝癌、胰腺癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌、睾丸癌、皮肤癌、眼癌、黑素瘤、发育不良性口腔粘膜癌、侵入性口腔癌、小细胞和非小细胞肺癌、激素依赖性乳腺癌、非激素依赖性乳腺癌、移行和鳞状细胞癌、神经恶性瘤，包括神经母细胞瘤、神经胶质瘤、星形细胞瘤、骨肉瘤、软组织肉瘤、血管瘤、内分泌肿瘤、血液新生物包括白血病、淋巴瘤和其它骨髓增殖性和淋巴增殖性疾病、原位癌、增生性损伤、腺瘤、纤维瘤、组织细胞增多症、慢性炎症增生性疾病、血管增生性疾病和病毒诱导增生性疾病；尤其是黑素瘤、胰腺和肾癌。尤其优选的是来源于黑素瘤、胰腺癌和肾癌的肿瘤细胞或细胞系。用本发明的多聚核苷酸或载体工程化并且后来被用于预防或治疗一个物种中增殖性疾病的肿瘤细胞系优选来源于相同物种(异基因源)或甚至来源于被治疗的真正对象(自体同源)。因此，在一个优选实施方案中，来源于待治疗患者或来源于患有相同或相似肿瘤类型的另一个患者的人肿瘤细胞或人肿瘤细胞系用本发明的多聚核苷酸或载体进行工程化处理并用于预防或治疗人患者的增殖性疾病。能被工程化的优选肿瘤细胞系包括但不限于NSO、B78H1、Renca、Hep G2、B9、人黑素瘤、肾癌，尤其是肾细胞癌、胰腺癌、自体同源和异基因源T细胞。

因为本发明的一个优选的方面涉及转移本发明的多聚核苷酸进入某些病毒载体，其是产生用本发明多聚核苷酸工程化的细胞的方便工具，即通过简单的注射，同样预想到的是，用本发明的多聚核苷酸工程化的宿主细胞是能够包装本发明多聚核苷酸进入病毒的细胞。因此，另一个宿主细胞优选类型是包装细胞，尤其是双嗜性包装细胞，例如，PA 317、亲嗜性包装细胞如GP+E86、人胚胎肾细胞-239。PA 317适合与包含本发明多聚核苷酸的载体DCCMV配对，以产生含有H11序列的重组反转录病毒颗粒。

本发明的发明人已经进一步的观察到，如果细胞经工程化处理包括至少一种进一步的多聚核苷酸，用本发明的多聚核苷酸或载体工程化的宿主细胞，尤其是肿瘤细胞或细胞系，行使的体内抗肿瘤作用能被进一步增强。因此在一个优选实施方案中，用编码至少一种进一步多肽的至少一种进一步的多聚核苷酸对本发明的宿主细胞进行工程化处理。其通过使用载体优先实现，尤其是以上有关H11指征的一种载体，并且随后或同时引入这个(这些)载体进入宿主细胞。所述一个或多个额外的多聚核苷酸可以包含于分离的载体中或可以包含于编码H11的多聚核苷酸的同一个载体中。优选宿主细胞同时表达H11蛋白和由至少一种进一步的多聚核苷酸编码的至少一种进一步的蛋白质。在一个优选实施方案中，所述至少一种进一步的多聚核苷酸被引入编码细胞因子宿主细胞，所述细胞因子尤其是GM-CSF、IL-6、IL-11、IL-15、抗TGF、EPO、干扰素、LIF、OSM、CNTF、CT-1和sIL-6R/IL-6融合蛋白，尤其是超-IL-6。在上下文中，同样优选的是，宿主细胞选自上面指出的有关H11的优选宿主细胞中的一个，即肿瘤细胞或细胞系。

因此，特别优选的是，表达本发明的至少一种H11多肽和至少一种进一步多肽，尤其是细胞因子(例如GM-CSF、IL-6或IL-11)，的宿主细胞来源于从参与增殖性疾病的组织中起源的细胞或细胞系，所述增殖性疾病优选胃肠或结直肠道癌、肝癌、胰腺癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌、睾丸癌、皮肤癌、眼癌、黑素瘤、发育不良性口腔粘膜癌、侵入性口腔癌、小细胞和非小细胞肺癌、激素依赖性乳腺癌、非激素依赖性乳腺癌、移行和鳞状细胞癌、神经恶性瘤，包括神经母细胞瘤、神经胶质瘤、星形细胞瘤、骨肉瘤、软组织肉瘤、血管瘤、内分泌肿瘤、血液新生物包括白血病、淋巴瘤和其它骨髓增殖性和淋巴增殖性疾病、原位癌、增生性损伤、腺瘤、纤维瘤、组织细胞增多症、慢性炎症增生性疾病、血管增生性疾病和病毒诱导增生性疾病；尤其是黑素瘤、胰腺和肾癌。尤其优选的是来源于黑素瘤、胰腺癌和肾癌的肿瘤细胞或细胞系。同样，该肿瘤细胞或细胞系可以是自体源的、同种异体源的或异种源的。

本发明进一步的方面是制备能表达H11细胞的方法。这种方法包括在体外用至少一种本发明载体对细胞进行基因工程处理，其中所述H11是由本发明的多聚核苷酸编码。能够被转化的细胞类型没有限制，并且依赖用于基因工程处理细胞的各自的载体或载体系统。优选用于转化某些细胞类型的载体和载体系统已经在上面给出。此外，优选将上面给出的特定细胞和细胞系用于本发明的这个方法。

本发明进一步的方面是制备由本发明的多聚核苷酸编码的H11多肽的方法，其包括：培养本发明的宿主细胞和收集由所述多聚核苷酸编码的H11多肽。本领域技术人员知道多种表达系统，其以高水平表达异源蛋白质，因此其能用于制备本发明的H11多肽。表达系统的选择依赖于需要的蛋白质量和需要的修饰。虽然使用单细胞生物表达异源蛋白质是标准的，但是也可以应用来自多细胞生物的细胞。原则上，任何这类细胞都可使用，无论其源自脊椎动物还是非脊椎动物培养物。除了哺乳动物细胞以外，所述这些细胞还包括由重组病毒表达载体(例如，杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；由重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)感染的植物细胞系统；或由重组质粒表达载体(例如，Ti质粒)转化的，由质粒或人工染色体转化的酵母和由质粒、粘粒、噬菌粒或噬菌体转化的原核细胞，所述载体含有一个或多个H11多肽的编码序列。

在有用的昆虫系统中，苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)被用作载体表达外源基因。病毒在草地夜蛾和粉纹夜蛾细胞中生长。草地夜蛾细胞用于病毒的扩增，而分离自粉纹夜蛾的H5细胞用于生产H11。H11多肽编码序列被克隆进入病毒的非必需区(例如，多角体蛋白基因)并且置于AcNPV启动子的控制下(例如，多角体蛋白启动子)。

成功的插入编码序列导致多角体蛋白基因的失活和产生非封闭(non-occluded)的重组病毒(即，病毒缺少由多角体蛋白基因编码的蛋白质衣壳)。随后这些重组病毒被用来感染草地夜蛾细胞，插入的基因在所述细胞中表达(例如，美国专利No.4,215,051，Smith，作为参考文献并入本文中)。能够用来产生重组病毒的载体的实例已经在上面指出。

有用的哺乳动物宿主细胞系的实例是VERO和HeLa细胞、CHO细胞系、WI 38、BHK、COS-7、293、HepG2、NIH3T3、RIN、NSO和MDCK细胞系。此外，可以选择宿主细胞株来调节插入序列的表达，或以期望的特异性方式修饰和加工基因产物。蛋白质产物的这些修饰(例如，糖基化)和加工(例如，切割)对于蛋白质的功能有可能是非常重要的。不同的宿主细胞具有具有特有的和特异的蛋白质翻译后加工和修饰的机制。可以选择合适的细胞系或宿主系统以确保表达的外源蛋白质被正确的修饰和加工。适合表达本发明的H11蛋白质的各种哺乳动物表达系统是已知的，其包括，例如，GS基因表达系统(Lonza Biologicals，Slough，great Britain)，其使用谷氨酰胺合成酶(GS)缺陷细胞或者，例如，经甲硫氨酸亚氨基代砜(methioninesulfoximine，MSX)敏化成谷氨酰胺缺陷的CHO细胞和包括谷氨酰胺合成酶基因的载体以补充GS的缺少或缺少足够量的GS。

用于哺乳动物细胞的表达载体通常包括复制起始点(如果必需)，位于待表达基因前面的启动子，连同任何必需的核糖体结合位点，RNA剪接位点，多聚腺苷酸位点和转录终止序列。可以通过构建载体以包括外源起始点，比如源自SV40或其它病毒(例如，多瘤病毒(Polyoma)、腺病毒、CMV、VSV、BPV)，或者可以通过宿主细胞染色体的复制机制提供复制起始点。如果载体整合于宿主细胞的染色体，后者通常是充分的。

启动子可以源自哺乳动物细胞的基因组(例如，金属硫蛋白启动子)或源自哺乳动物病毒(例如，腺病毒晚期启动子；痘苗病毒7.5K启动子)。进一步说，也有可能并可以期望利用与H11多聚核苷酸正常相连的启动子或控制序列，如果这些控制序列与所用的宿主细胞系统是相容的。

可以利用多种基于病毒的表达系统，例如，经常使用的启动子是源自多瘤病毒、腺病毒2和最常用的猿病毒40(SV40)。SV40的早期和晚期启动子特别有用，因为很容易从病毒获得含有SV40病毒复制起始点以及二者的片段。更小或更大的SV40片段也可以被使用，如果包括有位于病毒复制起始点中从HindIII位点向BglII位点延伸的大约250bp的序列。

在使用腺病毒作为表达载体的情况下，编码序列可以连接至腺病毒转录/翻译调控复合物，例如，晚期启动子和三组分先导序列。然后这种嵌合基因可以通过体外或体内重组插入腺病毒基因组中。在病毒基因组非必需区(例如，E1、E3或E4区)的插入将导致重组病毒，其在感染宿主中有活力并能表达H11融合多肽。

H11融合多肽编码序列的有效翻译也可能需要特异性起始信号。这些信号包括ATG起始密码子和邻近序列。包括ATG起始密码子的外源翻译调控信号可能需要另外提供。本领域普通技术人员可以很容易的确定这些和提供必要的信号。众所周知，起始密码子与期望的编码序列的阅读框必须在框内(或相内)以确保完整插入序列的翻译。这些外源翻译调控信号和起始密码子可以是各种来源，既可以是天然的也可以是合成的。表达的有效性可以通过包含合适的转录增强子元件和转录终止子而被加强。在真核表达中，如果其没有包含于起始的克隆区段内，通常还期望将合适的多聚腺苷酸位点掺入转录单元(例如，5’-AATAAA-3’)。通常，多聚A添加位点被置于转录终止位置前的蛋白质终止位点“下游”约30-2000核苷酸处。

为了重组融合多肽长期、高产量的生产，稳定表达是优选的。例如，可以工程化稳定表达编码H11融合多肽的构建体的细胞系。优于使用含有病毒复制起始点的表达载体，宿主细胞能够用由合适表达调控元件(例如，启动子、增强子、序列、转录终止子、多聚腺苷酸位点等)控制的载体和可选择标记物进行转化。引入外源DNA后，工程化的细胞可以在富集培养基中生长1-2天，然后转移到选择培养基。重组质粒中的可选择标记对选择具有抗性并且允许细胞稳定的整合质粒进入它们的染色体和生长形成转化灶，其接下来能够被克隆和扩展为细胞系。

可以使用大量的选择系统，其包括但不限于分别在tk-、hgprt-或aprt-细胞中的单纯疱疹病毒胸苷激酶(tk)、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(hgprt)和腺嘌呤磷酸核糖转移酶(aprt)基因。同样，抗代谢物抗性能够被作为对二氢叶酸还原酶(DHFR)选择的基础，其赋予对甲氨蝶呤的抗性；gpt，其赋予对霉酚酸的抗性；新霉素(neo)，其赋予对氨基糖苷G-418的抗性；和潮霉素(hygro)，其赋予对潮霉素的抗性。

动物细胞能以两种方式在体外繁殖：遍布培养基容积的在悬浮液中生长的非附着依赖性细胞或为繁殖需要附着到固体基质上的附着依赖性细胞(即，单层型细胞生长)。

来自连续建立细胞系的非附着依赖性或悬浮培养是大规模生产细胞和细胞产物的最广泛应用的手段。然而，悬浮培养的细胞有局限性，比如致瘤性和比附着细胞更低的蛋白质产量。

哺乳动物在搅拌罐中大规模悬浮培养是生产重组蛋白质的通常方法。两种悬浮培养反应器设计有广泛的应用—搅拌反应器和气升式反应器。搅拌设计已经成功应用8000升的容量生产干扰素。细胞在高度直径比为1∶1-3∶1的不锈钢罐中生长。培养物通常用一个或多个搅拌器混合，其基于叶片式的盘或海洋螺旋桨式搅拌器的模式。比叶片式具有更少剪切力的搅拌器系统已经被描述。搅拌可以通过磁性偶联的驱动器直接或间接被驱动。间接驱动降低了通过搅拌杆的密封污染微生物的风险。

气升式反应器，最初也被描述用于微生物的发酵，后来修改用于哺乳动物细胞培养，所述反应器依靠气流进行混合和向培养物通氧。气流进入反应器的升液管部分并驱动循环。气体在培养基表面分离，引起无气泡的更密液体以使其沿反应器的下降段向下运动。这种设计的主要优势是其简单性和不需要机械混合。典型的是，高度对直径的比为10∶1。气升式反应器放大相对容易，具有良好的气体传质并产生相对低的剪切力。

本发明的H11融合多肽可以从细胞分泌到上清液或它可以保持在细胞内。虽然细胞上清液能够按以下描述直接进行进一步纯化步骤，但是使细胞内的蛋白质可进行进一步的纯化是必要的。可用多种方法破碎细胞，包括化学方法，例如离液剂(例如尿素、硫氰酸钠、GuHCl)、高盐和/或去污剂和机械手段，例如弗氏压碎(Frenchpressure)、冻融和/或超声处理。为获得在本发明中优选的基本正确折叠的非变性蛋白质，优选使用非变性方法，例如，在温和去污剂条件下组合冻融和弗氏压碎方法。

由此被溶解的蛋白质或包含在上清液中的蛋白质能够进行进一步的纯化步骤，其在本领域是众所周知的并且包括但不限于使用沉淀、层析和亲和纯化步骤。可使用的层析方法包括离子交换层析、体积排阻层析、染料吸附等方法。亲和纯化方法可使用树脂，其包被IL-11、IL-11R、sIL-11R或其部分，对IL-11、sIL-11R或包含在H11融合多肽中的标签具有特异性的抗体，或包含在H11融合多肽中并与另一种化合物或树脂特异性相互作用的标签。这些标签的实例是6xHis、FLAG、myc-标签、几丁质-标签、谷胱苷肽-S-转移酶-标签等。优选地标签被包括在本发明H11融合多肽的C-和/或N-末端，其允许用例如内肽酶去除标签。因此最终被纯化的H11蛋白质优选不含任何标签，所述标签向患者施用时可能引起免疫反应。

本发明的另一个方面是具有由本发明的多聚核苷酸编码的氨基酸序列的或可以通过上述方法获得的H11多肽。术语“多肽”和“蛋白质”可以交换使用并表示氨基酸的任何肽连接链，而不管长度或翻译后修饰。

本发明进一步的方面是含有如上所述的多聚核苷酸、载体和/或宿主细胞的非人转基因动物。所述动物可以是嵌合动物，其表示组成动物体的细胞中只有部分包含本发明的多聚核苷酸、载体和/或细胞，或者所述动物可以是转基因动物，其表示动物的所有细胞都含有本发明的或源自本发明细胞的多聚核苷酸和/或载体。嵌合或转基因动物相对于包含于细胞中的本发明多聚核苷酸可以是纯合或杂合的。在一个优选实施方案中，转基因动物相对于编码本发明蛋白质的基因是纯合或杂合的敲除或敲入动物。原则上，所述动物可以是任何动物，然而，优选哺乳动物，其选自非人灵长类动物、马、牛、绵羊、山羊、猪、狗、猫、兔、小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠或沙鼠。

本发明的另一个方面是生产由本发明多聚核苷酸编码的H11的方法，其包括：培养上述宿主细胞和回收由所述多聚核苷酸编码的多肽。宿主细胞和载体的优选组合已在上面描述，进一步的组合对本领域技术人员是显而易见的。根据所回收肽的以后用途，可以选择合适的细胞类型。如果期望由细胞产生的蛋白质表现出基本天然的糖基化模式，则优选真核细胞；如果，例如，不期望或不需要通常仅在真核细胞中被引入蛋白质的糖基化或其它修饰时，则选择原核细胞，

为检测本发明融合蛋白的表达，可以使用抗sIL-11或IL-11的多数抗体。然而，为区分sIL-11R、IL-11和由其形成的融合蛋白之间的表达，在本发明的一些方面，希望有一种抗体，其特异性检测融合蛋白，但是其对单独的sIL-11R和IL-11仅显示弱的或基本无特异性。因此，在本发明进一步的方面涉及一种对由本发明多聚核苷酸编码的或者可通过本发明生产H11多肽的方法获得的多肽具有特异性的抗体，所述抗体对sIL-11R和IL-11基本无特异性。本领域已知如何产生仅特异性识别蛋白质内特定表位的抗体。例如，可以用包括sIL-11R和IL-11间连接部分的肽免疫动物，特别是小鼠或兔。这将导致产生抗体，其特异性识别融合蛋白质。从由此产生的抗体中进一步进行选择，选出对sIL-11R和IL-11仅有弱的或基本无特异性的抗体。

正如上面所述，本发明的H11多肽能够自身使用或能够在宿主细胞环境中使用，即能够转染宿主细胞。在两种实施方案中，H11多肽自身或宿主细胞可以单独使用或与另外的物质组合使用，因此本发明进一步的方面涉及一种药物组合物，其包含本发明的至少一种多肽和/或至少一种宿主细胞和至少一种进一步的组分，所述组分选自脂质体、病毒体、微球、非离子表面活性剂微囊(niosomes)、树状聚体(dendrimeres)、稳定剂、缓冲剂、赋形剂和添加剂。

辅助生产和施用本发明组合物的赋形剂是本领域已知的赋形剂并包括，例如，藻酸盐、碳酸钙、葡萄糖、果糖、乳糖、麦芽糖、麦芽糖糊精等。稳定剂也是本领域已知的，其包括，例如，α-生育酚和多种碳水化合物。

本发明的发明人已经观察到表达本发明H11多肽的宿主细胞如果给小鼠施用会产生很强的抗肿瘤反应。此外，H11自身是一种很强的IL 11R激动剂并且因此能够用在需要IL-11治疗和改善作用的疾病治疗中。因此，本发明的进一步的方面是本发明的宿主细胞或可根据本发明一种方法获得的宿主细胞或者本发明的H11多肽在制备治疗或预防疾病的药物中的应用，所述疾病选自增殖性疾病、细胞病变、辐射损伤、IL-11依赖的炎性疾病、IL-11依赖的退行性疾病和IL-11依赖或介导的软组织疾病。

H11多肽和表达H11多肽的宿主细胞，特别是表达H11多肽的宿主细胞，能够用在治疗和/或预防广泛的多种不同增殖性疾病中，然而，根据本发明可治疗或预防的优选的增殖性疾病选自胃肠或结直肠道癌、肝癌、胰腺癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌、睾丸癌、皮肤癌、眼癌、黑素瘤、发育不良性口腔粘膜癌、侵入性口腔癌、小细胞和非小细胞肺癌、激素依赖性乳腺癌、非激素依赖性乳腺癌、移行和鳞状细胞癌、神经恶性瘤，包括神经母细胞瘤、神经胶质瘤、星形细胞瘤、骨肉瘤、软组织肉瘤、血管瘤、内分泌肿瘤、血液新生物包括白血病、淋巴瘤和其它骨髓增殖性和淋巴增殖性疾病、原位癌、增生性损伤、腺瘤、纤维瘤、组织细胞增多症、慢性炎症增生性疾病、血管增生性疾病和病毒诱导增生性疾病；尤其是黑素瘤、胰腺和肾癌。尤其是在增殖性疾病治疗的情况下，可以考虑的是患者在发生疾病的任何症状之前，或者在他们已经显现疾病症状之后后用“癌疫苗”对其进行免疫，前者即接受保护性免疫，后者即接受治疗性接种。

表达H11的宿主细胞和至少一种进一步的细胞因子，尤其是GM-CSF能够比只表达H11的细胞向某些肿瘤提供甚至更强的体内抗肿瘤反应。因此，优选表达H11的细胞和至少一种进一步的细胞因子用于制备预防或治疗增殖性疾病的药物。

H11多肽和表达H11的宿主细胞，尤其是H11多肽能够用在广泛的血细胞减少症治疗中，然而，根据本发明的应用可治疗或预防的优选的血细胞减少症选自血小板减少症、血细胞减少症和全血细胞减少症。

自愿或非自愿暴露于辐射，包括x射线、α、β和γ射线，的人或动物，根据辐射的时间和强度，可能遭受严重的局部或全身性毒性作用。特别是在各种疾病包括增殖性疾病的放射治疗中，放射治疗相关的毒性经常限制治疗所应用的剂量和/或放射治疗的频次。然而，已知的是，例如，如果每天接受放射治疗，乳腺肿瘤有50％机会的局部复发(Barker et al.，1980)和如果接受每天两次治疗，局部复发机会只有20-27％(Fastenberg et al.，1985)。因此，期望发现能够改善非自愿暴露于放射的影响的物质，以及允许以同样毒性水平施用更高放射剂量或以更低毒性水平施用目前用于放疗相同放射剂量的物质。本发明人现已经惊奇的发现H11多肽和/或表达H11的宿主细胞，尤其是H11多肽能够用来预防和/或治疗和/或改善辐射的影响，即能够用作辐射保护剂。为此目的，H11多肽和/或表达H11多肽的宿主细胞能够在辐射暴露之前、期间和/或之后施用。特别是在有关放疗中，优选在治疗前和治疗后施用。

此外，H11多肽和/或表达H11多肽的宿主细胞，尤其是H11多肽能够用在各种IL 11依赖的炎性疾病的治疗中，然而，根据本发明应用能治疗或预防的优选的IL 11依赖的炎性疾病选自肝功能衰竭；肝炎；肝病；败血症；化疗或放疗引起的组织损伤，尤其是肺损伤；炎性疾病，尤其是炎性肠病，类风湿性关节炎，炎性肝病；粘膜炎；过敏；子宫内膜异位症；血管炎；内皮炎症相关的血管疾病，尤其是缺血性心脏病或外周血管病；和银屑病。

相似的，根据本发明应用能治疗或预防的优选的IL-11依赖的退行性疾病选自退行性CNS疾病、PNS疾病和骨关节炎。根据本发明应用能治疗或预防的IL-11依赖的或介导的软组织疾病选自肥胖症和特发性女性不育症。

因为本发明IL 11R激动剂的作用能够通过共同施用一种或多种细胞因子被加强，优选在施用H11或表达H11(和，如果期望一种细胞因子)的宿主细胞之前、同时或之后施用至少一种进一步的细胞因子。

已知IL-11能够刺激细胞的分化。例如，其已经显示出对海马神经元分化的作用。本发明可以考虑将已经部分分化的自体、同种异体或异种干细胞注射给患者，在此其定位于靶组织并进行终末分化。为促进和帮助这种分化过程，本发明考虑使用本发明的H11融合多肽或根据本发明方法可获得的H11融合多肽用于制造干细胞疗法期间的辅助治疗的药物。干细胞疗法的很多不同应用已经在现有技术中被讨论，这种干细胞疗法的实例包括但不限于帕金森疾病和ADA的治疗。相似的，本发明的或根据本发明方法可获得的H11融合多肽可以在体外用来刺激细胞分化，尤其是干细胞或前体细胞。然后，这些已分化的细胞能够用于自身治疗，例如，帕金森病和ADA。

H11表达细胞，例如，H11修饰的黑素瘤细胞能够应用于细胞接种领域已知的多种给药和施用方案中。给药和施用可以改变以引起持续的抗靶标免疫反应或疫苗，例如肿瘤和/或肿瘤疫苗。患者对接种的免疫反应可以通过本领域技术人员已知的技术确定，其包括但不限于ELISA。在治疗或预防增殖性疾病中，H11表达细胞，尤其是H11修饰的黑素瘤细胞的施用剂量为每剂量1×10⁵-1×10¹⁰细胞，优选为每剂量1×10⁶-5×10⁸细胞。药剂可以使用任何本领域已知的途径注射入患者，例如包括肌内(i.m.)、皮内(i.d.)、皮下(s.c.)注射，优选通过s.c.注射。接种的典型方案包括两个阶段：诱导和加强阶段。在诱导阶段，疫苗通常在一段短时间中被施用几次，例如，在两天到两周间隔内2-12次，优选1-2周间隔内4-10次，更优选在两周间隔内6-8次和随后在加强阶段每月一次。

包括以下实施例是为了举例说明本发明的优选实施方案。本领域的技术人员应该理解实施例中公开的技术手段，其代表本发明人所公开的在实施本发明时良好工作的技术手段，因此可以考虑作为优选实施方式。然而，本领域技术人员根据本发明公开的内容应该理解对所公开特定实施方案的很多变化没有偏离所附权利要求列出的本发明的精神和范围。所有引用的参考文献经引用并入本文中。

附图说明

图1表示使用常规单字母符号的融合蛋白H11的氨基酸序列(SEQ ID NO 3)。sIL-11R和IL-11的序列分别用黑色和灰色指出。分子的不同结构域指示如下：N末端信号肽(细下划线)，Ig样结构域(双下划线)，由两个100AA的亚结构域组成(D2和D3)的200AA的红细胞生成素结构域(加框的区域和亚结构域用虚线表示)，受体膜前区域(序列顶部的线)和IL-11分子，其中根据CNTF的已知三维结构，预测的α螺旋区域被定位并且用粗下划线表示。

图2显示H11的核酸序列(SEQ ID NO 6)。sIL-11R和IL-11的序列分别用黑色和灰色表示。黑色箭头指示用于扩增sIL-11R片段的引物序列，灰色箭头用于指示对应IL-11的引物序列。在序列上面和下面的箭头分别表示正向和反向的引物。此外，还显示了用于连接两个组分的限制性位点Xhol。

图3是以图例的方式表示新设计细胞因子的构建步骤的图，正如在实施例1中的详细说明。一些限制性位点被表示：S、X、E、No、N、B、Xb分别表示SalI、XhoI、EcoRI、NcoI、NotI、BamHI、XbaI。

图4、5和6以图例方式显示用于在杆状病毒表达系统中表达重组蛋白(图4和实施例2)，用于产生GMTV(图5，实施例3)的载体和用于腺病毒构建的重组转移载体pShuttle-CMV/H11(图6，实施例4)。

图7显示蛋白质印迹的放射自显影图。源自转导293FT细胞和CD34+细胞的条件培养基被电泳(PAGE/SDS)、转移到PDV膜上，并使用抗IL-11和抗IL-11R抗体(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)和作为二级抗体的山羊抗兔IgG/HRP(DAKO，Glostrap，Denmark)进行分析。从用携带有H11的重组杆状病毒感染的High Fvie细胞中收集的重组H11作为阳性对照。

图8和9显示蛋白质印迹的放射自显影图。源自转导B78H1细胞的条件培养基被电泳(PAGE/SDS)、转移到PDV膜上，并使用抗IL-11R抗体(Santa CruzBiotechnology，Santa Cruz，CA)和作为二级抗体的山羊抗兔IgG/HRP(DAKO，Glostrap，Denmark)进行分析。分析表明通过经重组逆转录-和腺病毒修饰的肿瘤细胞，融合蛋白被正确的表达和分泌(分别为图8和9，实施例6)。

图10是火箭免疫电泳的照片(实施例7)。简单说，HepG2细胞用不同浓度(收集培养基的百分比)的重组IL-6和来自对照和H11修饰B78H1细胞的条件培养基进行刺激。48h后从刺激HepG2细胞收集的培养基用火箭免疫电泳分析α1-抗胰凝乳蛋白酶的存在。

图11是蛋白质印迹的放射自显影图，其中分析STAT3分子的活化。简单说，3×10⁹的B9细胞在存在不同细胞因子的条件下培养：超IL-6、H11(50％的条件培养基从分别用超IL-6和H11修饰的B78H1细胞收集)、重组IL-11(0.6ng/ml)、重组sIL-11R(100ng/ml)和重组IL-11/sIL-11R的复合物(0.6/100ng/ml)。30分钟后细胞被裂解并且蛋白质被电泳(PAGE/SDS)、转移到PDV膜上并使用抗STAT3-P抗体(New England BioLabs，Beverly，MA)和作为二级抗体的山羊抗兔IgG/HRP(DAKO，Glostrap，Denmark)进行分析。作为阴性对照，使用来自非修饰的B78H1细胞的50％条件培养基。

图12和13是显示来自B9细胞增殖测试的结果图片。简单说，B9细胞(每孔2×10⁴细胞)在不同浓度(范围为1-25％)的收集自B78H1、B78H1/超IL-6、B78H1/H11细胞的培养基下进行增殖测试。当使用收集自用携带H11的重组逆转录病毒转导B78H1细胞之后的培养基时，培育4天后进行MMT检测(Sigma-AldrichCorporation，St.Louis，MI)。在540nm测量吸光度(图12)。腺病毒转导后获得的H11活性通过增殖B9细胞整合的放射性胸苷([甲基-³H]胸苷，Sigma-AldrichCorporation，St.Louis，MI)进行测定(图13)。

图14是显示描述Ba/Fgp130细胞增殖结果的图，所述细胞用不同浓度的从用超IL-6cDNA修饰的人黑素瘤A375细胞收集的培养基(范围为0.78-25％)和用从用携带H11 High-Five BTI-TN-5B1-4的重组杆状病毒感染的细胞(用携带H11的重组杆状病毒感染的昆虫细胞)收集的重组H11诱导。每孔接种10×10⁴Ba/Fgp130细胞后3天，定量细胞生长。通过MMT检测(Sigma-Aldrich Corporation，St.Louis，MI)测定活细胞的量，其对应于490nm吸光度。

图15是显示在肿瘤排斥模型中获得的H11体内活性分析结果的图。简单说，C57BLxC3H小鼠(6-8周)经皮下注射伪转导的和用IL-11和H11的cDNA修饰的小鼠黑素瘤细胞B78H1(每个小鼠使用悬浮在0.1ml PBS的5×10⁵细胞)。接下来，监测小鼠的肿瘤生长动力学(组A)和小鼠存活率(组B)。

图16是显示用对照和修饰的B78H1细胞免疫C57BLxC3H小鼠后所获得结果的图。C57BLxC3H小鼠按图15中描述的方法处理。两周后，免疫小鼠在远离前次注射的位置经皮下用亲代B78H1细胞(每只小鼠5×10⁵细胞)再次攻击。接下来，监测小鼠的肿瘤生长动力学(组A)和小鼠存活率(组B)。

图17是显示在肾癌的肿瘤排斥模型中对修饰的肿瘤疫苗功效分析的图。雌性Balb/c小鼠(8-12周)在右腿经皮下注射对照和用GM-CSF和H11的cDNA基因修饰的和H11/GM-CSF Renca细胞(每只小鼠5×10⁵细胞)被免疫。两周后，小鼠在左腿经皮下注射亲本Renca细胞被再次攻击。接下来，监测分析肿瘤出现(组A)、肿瘤生长动力学(组B)和小鼠存活率(组C)。

图18描述用H11和IL-11/R-FP修饰的B78-H1黑素瘤细胞的致瘤性。C57BL6xC3H小鼠注射伪转导的和H-11和IL-11/R-FP转导的B78-H1细胞。肿瘤生长动力学(组A)和小鼠存活率(组B)每周监测一次。

图19是显示对负责GMTV/H11的抗黑素瘤活性的细胞机制研究结果的图。SCID小鼠(6-8周)经皮下注射对照和用IL-11和H11的cDNA基因修饰的B78H1细胞(每只小鼠5×10⁵细胞)。评价免疫细胞在由H11介导的原代肿瘤排斥中的作用通过对肿瘤生长动力学(组A)和SCID小鼠存活率(组B)的分析进行研究。

图20和21总结在由IL-11和H11-GMTV引起免疫反应的诱导和效应阶段，滤过细胞的CD4+、CD8+和NK1.1免疫染色后所获得的结果。简单的说，使用C57BLxC3H小鼠进行两组试验。第一组，其中小鼠经皮下注射对照和IL-11或H11修饰的B78H1细胞(每只小鼠5×10⁵细胞)(图20)，和第二组，其中小鼠按上述进行注射，然后两周后，后者用亲本B78H1细胞(每只小鼠5×10⁵细胞)进行再次攻击(图21)。在初次注射后的2、5、9、11天和再次攻击后处死小鼠。切除注射位置的组织并在液氮中冷冻。制作5μm薄的冷冻切片。为了免疫染色，切片被干燥，固定在冷丙酮中，随后与一级抗体-生物素-偶联的大鼠抗小鼠CD4+(PharMingen，San Diego，CA)、生物素-偶联的大鼠抗CD8+(PharMingen，San Diego，CA)或小鼠抗-小鼠NK1.1细胞(PharMingen，San Diego，CA)一起培育过夜。需要时，载玻片接下来与生物素-偶联的兔抗小鼠IgG(Dako，Glostrup，Denmark)一起培育。阻断背景过氧化物酶活性后，切片被培育于亲合素-生物素过氧化物酶复合物ABC/HRP(Dako，Glostrup，Denmark)和过氧化物酶底物二氨基联苯胺DAB(Dako，Glostrup，Denmark)。洗过的载玻片用苏木精反染，脱水，固定于Permount(Sigma-AIdrichCorporation，St.Louis，MI)中并用盖玻片覆盖。为了评估免疫染色细胞的数量，使用以下标志：“-”无染色细胞，“-/+”染色细胞少于5％，“+”5-20％，“++”20-50％和“+++”超过50％的染色细胞。

实施例

为创建H11，使用来自M/I-Q/365的全长sIL-11R氨基酸序列。根据累积的数据，已经可能分辨预测的区域：(i)信号肽-位置M/I-S/23，(ii)Ig样区域-D1结构域，位置G/38-Y/111，(iii)由两个FNIII区域D2和D3结构域组成的CHD结构域，位置分别为P/112-R/217和P/218-T/314，和(iv)受体膜前区-部分介于D3结构域和跨膜区之间，位置P/315-Q/365(Nandurkar et al.，1996)。与一般观念相一致，受体的跨膜和细胞质区分别丧失26和31个氨基酸。

使用的IL-11序列编码全长成熟IL-11蛋白质(序列A/19-L/199)，其中所有预测的区域：结构域A、B、C、D和环A-B、B-C、C-D都能够被区分。正如上面提到的，IL-11需要三个特异性结合位点(I，II，III)与它的受体相互作用。这些位点通过组合来自不同结构域和环的氨基酸而形成。因此，全长细胞因子对发挥它的活性是必要的。两种蛋白(sIL-11R和IL-11)已经在cDNA水平上通过PCR/连接反应被连接并且没有应用连接子。为了保持融合蛋白的正确折叠，使用IL-11R的C-末端和IL-11的N-末端的天然序列。IL-11R的膜前区(约50个氨基酸)与IL-11的16个N末端残基一起不是螺旋并假设是柔性的，其能够保证复合物的正确组装。图1显示氨基酸(AA)序列，其中指出了分子的不同结构域。

通过标准PCR/连接反应(实施例1)在cDNA水平上构建新设计的细胞因子。sIL-11R的cDNA片段(位置1-1095)使用实施例1中所示引物进行扩增。正向引物有附加的限制性位点SalI序列。此外，为了分别提供Kozak共有序列和限制性位点NcoI，引入ATG前面的ACC核苷酸和紧接ATG之后的替换A/G。这种突变也导致了在位置²S→²G引入氨基酸替换。反向引物具有在IL-11的5’序列与限制位点XhoI出现重叠的附加序列。IL-11的cDNA使用如实施例1中所示的引物(位置55-600)进行扩增。扩增片段省略了IL-11的前导序列，但编码前导序列最后三个氨基酸(AVA)的天然序列除外，其现在在IL-11组分的N末端。反向引物含有另外的限制位点-SalI。扩增片段按照实施例1连接。H11序列显示在图2中和它的构建步骤显示在图3中。

作为下一个步骤，在杆状病毒表达系统中生产重组蛋白H11(实施例2)。重组供体质粒pFastBacl/Hll被构建并且重组杆状病毒穿梭载体通过位点特异性转位而产生。接下来，重组杆状病毒在Sf21昆虫细胞中扩增并用于在High-Five BTI-TN-5B1-4昆虫细胞中生产融合蛋白H11的优化系统中。按下述IEX和HIC层析方法实施融合蛋白的纯化。获得的蛋白通过膜过滤进行浓缩，然后用于体外研究。

此外，构建逆转录病毒载体pDCCMV/H11、MIHV/GM-CSF和腺病毒转移载体pShuttle-CMV/H11(分别为实施例3和4)，其用于修饰鼠黑素瘤(B78H1)和肾癌(Renca)细胞(实施例6)。修饰癌细胞能够表达、加工和分泌融合蛋白H11(附图8和9)。

在三个不同的体外生物分析中检测从H11修饰癌细胞收集的培养基以及纯化的重组H11的生物活性(实施例7)。在人肝细胞瘤细胞系HepG2分析中，其中sIL-11R能够诱导产生急性期蛋白，在B9(杂交瘤细胞系)生物分析中，其中IL-11诱导细胞增殖，和在Ba/Fgp130生物分析中，其中IL-11/sIL-11R复合物诱导细胞增殖。

此外，H11的体内活性使用鼠肿瘤排斥模型进行评估(实施例8)。鼠黑素瘤以及肾癌细胞的H11修饰在小鼠中降低了致瘤性并刺激长期持续的抗肿瘤免疫。Renca细胞的H11和GM-CSF修饰在这种模型中是最有效的(更详细的说明见实施例8)。

为了评估负责H11修饰疫苗(GMTV/H11)抗肿瘤活性的细胞机制，进行两组试验(在实施例9中详细描述)。我们使用SCID小鼠证明了H11抗原发肿瘤的活性也许与非特异性免疫反应有关。分析免疫细胞的浸润(免疫组织化学)，我们发现在免疫反应的诱导期，既不涉及CD4+细胞，也不涉及CD8+细胞。然而，我们观察到NK细胞密集的浸润，其确认了这些细胞在H11修饰的原发肿瘤生长抑制中的重要作用。由H11/GMTV刺激的主要效应细胞是NK细胞和在晚期是CD4+T淋巴细胞。

实施例1：构建新设计的细胞因子超IL-11(H11)

人IL-11的cDNA(序列位置55-600，其与氨基酸残基19-199相对应)已经通过标准PCR进行了扩增，其中使用以下引物：

IL-11正向：5’GCT GCT GCC CCT GGG CCA(SEQ ID NO.7)，

IL-11反向：5’TCC GCG GCC GCT ATG GCC GAC GTC GAC TCA CAG CCG AGT CTT CAG(SEQ ID NO.8).

扩增的IL-11片段克隆入pGEM-Teasy载体(Promega，Madison，WI)中。人IL-11R的cDNA(位置1-1095，其与氨基酸残基1-365相对应)也通过PCR进行了扩增，其使用含有限制位点SalI的正向引物和带有额外序列的特别的反向引物，该额外序列在IL-11的5’序列上与出现限制位点Xhol的位置重叠。

sIL-11R正向：5’ACG CGT CGA CGC CAC CAT GGG CAG CAG CTG CTC AGG GCT G(SEQID NO.9)

sIL-11R反向：5’AAC TCG AGG GGG GCC AGG TGG TGG CCC AGG GGC GAC AGC CTGCTC CAC AGA GTC CCT(SEQ ID NO.10).

PCR产物已经克隆入pGEM-Teasy载体中，然后用SalI和XhoI限制酶消化。将纯化的SalI/XhoI片段克隆入质粒pGEM-Teasy/IL-11的XhoI位点，其导致产生sIL-11R和IL-11的融合cDNA(没有任何人工连接序列)称为超IL-11(H11)。

新设计的细胞因子H11的核苷酸序列显示于图2中并且它的构建步骤在图3中进行了说明。

实施例2：生产重组H11

构建重组供体质粒(FastBac1/H11)。

用质粒pFastBac1生产表达重组蛋白H11的病毒。用SalI/SphI限制酶消化pGEM-Teasy/H11质粒，然后将纯化的片段克隆入pFastBac1质粒的SalI/SphI限制位点(Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)(图4)。

通过位点特异性转位生成重组杆粒(bacmid)。

重组杆状病毒的生产是基于表达盒以位点特异性方式转座到在大肠杆菌中扩增的杆状病毒穿梭载体(杆粒)上。

pFastBac1/H11质粒被转化入DH10Bac感受态细胞，其含有带mini-attTn7靶位点的杆粒和辅助质粒。在由辅助质粒提供的转位蛋白存在下，位于pFastBac1供体质粒上的mini-Tn7元件被转位到杆粒上的mini-attTn7靶位点上。通过抗生素选择和蓝/白筛选鉴定含有重组杆粒的菌落。接下来，制备高分子量的mini-prep DNA。为确定插入基因的存在，通过PCR反应对分离的DNA进行分析。使用的引物如下：

正向#9：5’ACC CAC CCG CTA CCT CAC CT(SEQ ID NO 11)

反问#2：5’GTC AGG AGC ACG GTG CT(SEQ ID NO 12)

用重组杆粒DNA转染Sf21细胞以及重组杆状病毒的扩增。

使用Effectene转染试剂(Qiagen，Valencia，CA)用重组杆粒DNA转染Sf21(草地夜蛾)细胞。3天后，收集上清液并确定病毒的滴度。为了扩增病毒原种，以感染复数(MOI)0.1对悬浮于无血清培养基(SFM)中的1.4×10⁶Sf21细胞进行感染72小时。重组H11杆状病毒的扩增操作进行两次，最后获得高质量、高滴度(2.87×10⁸pfu/ml)的病毒原种。将重组病毒原种在-80℃贮存。

优化异源蛋白的生产。

为了实现重组H11蛋白的最佳生产，需要考虑不同因素，比如细胞系(Sf21和粉纹夜蛾-High-Five BTI-TN-5B1-4)、培养基(Sf900II和Express5)、病毒感染参数(MOI)和表达动力学。为了表达重组基因产物，以MOI0.5、1、5和10pfu/ml对细胞密度为1、1.5和2×10⁶细胞/ml的High Five细胞悬浮培养物进行感染并在不同收获时点通过蛋白印迹分析监测H11的表达。重组H11蛋白的最优化生产是在细胞密度1×10⁶细胞/ml、MOI 5、使用High Five BTI-TN-5B1-4细胞在Express 5(Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)培养基中感染48小时的条件下获得。此外，在以1∶1000稀释比例用于培养基中的蛋白酶抑制剂混合物(Sigma-AldrichCorporation，St.Louis，MI)存在下，实施H11的生产。

纯化重组H11蛋白

将收获的上清液用pH11.8的20mM 1，3二氨基丙烷缓冲液按1∶8比例稀释。接下来，通过在8000g/4℃离心，将沉淀的蛋白移除并用Q XL阴离子交换介质(Amersham Pharmacia Biotech，Buckinghamshire，UK)在4℃过夜进行分批IEX层析。在0.5M NaCl、20mM 1，3二氨基丙烷pH 10.5缓冲液中重新获得吸附的蛋白，将NaCl的浓度增加到4M并进行柱HIC。将苯基FF(low sub)介质(AmershamPharmacia Biotech，Buckinghamshire，UK)用4M NaCl、20mM 1，3二氨基丙烷pH 10.5缓冲液平衡，加载蛋白质，用高摩尔起始缓冲液洗涤，接下来对其以呈线性递减梯度的盐浓度(4-0M NaCl)在20mM 1，3二氨基丙烷pH 10.5缓冲液中进行洗脱。合并含有重组H11蛋白的组分并通过使用30kDa截留的膜(MilliporeCorporation，Bedford，MA)对其进行膜过滤浓缩。

实施例3：构建逆转录病毒载体DCCMV/H11和MIHV/GM-CSF以及生产重组逆转录病毒颗粒

用NotI限制酶消化H11的cDNA，并将纯化后的片段克隆入双顺反子双拷贝逆转录病毒载体(DCCMV)(Wiznerowicz et al.，1997)的NotI位点。位于3’LTR的U3区域的DCCMV的表达盒含有CMV-IE启动子，其驱动表达下游H11和Neo抗性基因。DCCMV/H11的构建步骤显示于图5A中。

构建MIHV/GM-CSF载体是通过将鼠GM-CSF cDNA，其由NotI消化从pGEM-Teasy/mGM-CSF质粒切出，克隆入MIHV逆转录病毒载体的NotI位点而进行的(图5B)。

图5C显示逆转录病毒载体MSCV/hIL-11(鼠干细胞病毒)，其在研究中被作为对照(Dr.R Hawley，Toronto，Canada惠赠)。

通过电穿孔(250V/104ms)将DCCMV/H11载体转染进入双嗜性包装细胞系(PA317)。在14天的抗生素G418(500μg/ml)筛选后，收集含有重组逆转录病毒的上清液并在-80℃冷冻。当使用MIHV/GM-CSF时，为了生产携带hIL-11和GM-CSF的重组逆转录病毒，除了使用潮霉素(150μg/ml)进行筛选外其他步骤按照上述实施。

实施例4：构建腺病毒转移载体pShuttle-CMV/H11以及生产重组腺病毒

将NotI/SalI限制酶消化的H11 cDNA克隆入转移质粒pShuttle-CMV(Q-biogene，Carlsbad，CA)的NotI/XhoI位点，以产生pShuttle-CMV/H11(图6)。接下来，用PmeI线性化的pShuttle-CMV/H11质粒与携带腺病毒基因pAdEasy1(Q-biogene，Carlsbad，CA)的质粒共转化进入细菌，在此发生同源重组。用卡那霉素(50μg/ml)进行筛选后，将重组质粒分离，用PmeI线性化并转染QBI-293A细胞(Q-biogene，Carlsbad，CA)，其提供了生成腺病毒颗粒必需的反式腺病毒蛋白。接下来，将携带H11的腺病毒在QBI-293A细胞中扩增，通过不连续氯化铯梯度纯化，在PBS中透析并在-80℃贮存。高质量病毒原种的滴度为1.25×10⁸pfu/ml。

实施例5：构建表达重组H11蛋白的慢病毒

为了构建表达重组H11蛋白的慢病毒，使用基于Dddier Trono研发的使用3个质粒的人免疫缺陷病毒的逆转录病毒体系(见，例如，Dull et al.，1998或Zufferey etal.，1998)。慢病毒载体颗粒是通过用以下质粒瞬时转染载体产生细胞系而产生的，所述质粒包括：转导载体、包装载体和包膜载体。转导载体pWPXL含有HIV必需的用于包装、逆转录和整合、内部启动子和增强子的顺式作用序列，以及用于克隆cDNAs的独特限制性位点。包装构建体pCMV-deltaR8.91编码Gag、Pol、Tat和rev病毒蛋白。包膜载体pMD2G-VSVG表达VSV的表面糖蛋白(G)。pWPXL是自我失活载体，其在3’长末端重复序列(LTR)中有缺失，其破坏了LTR启动子活性。

用pWPXL-EF1alpa-GFP质粒生产在EF1alpa启动子控制下表达重组蛋白H11的慢病毒。GFP的cDNA用PmeI和EcoRI切除而且PmeI限制位点用DNAI聚合酶Klenow片段填充以产生平端。为了获得H11的cDNA，用SpeI消化pGEM-Teasy/H11质粒，用DNAI聚合酶Klenow片段产生平端，然后用EcoRI消化质粒。将纯化的H11片段克隆入质粒pWPXL的平端/EcoRI限制性位点。

表达H11 LV-H11的慢病毒载体的生产是基于用三种质粒pWPXL-H11、pCMV-deltaR8.91、pMD2G-VSVG共转染293FT细胞系(Invitrogen)。293FT细胞系源自293F细胞系并稳定表达SV40大T抗原。293F是293细胞系的快速生长变体-由原代人胚肾用剪切的人腺病毒5型DNA转化形成。

LV-H11被用于转导293FT细胞系和CD34+原代人细胞。通过PCR方法确认稳定的基因转移。与超-IL-11的IL-11和sIL-11R部分相对应的两套引物被用于从转导细胞中分离的基因组DNA扩增IL-11和sIL-11R。H11蛋白在293FT细胞和CD34+中的表达通过蛋白质印迹进行分析(图7)。

实施例6：鼠癌细胞(B78H1和Renca)的基因修饰

使用收集的含有携带H11的重组逆转录病毒的上清液转导鼠癌细胞：黑素瘤细胞系(B78H1)和肾癌细胞系(Renca)。如上所述转导的细胞在G418中进行筛选，然后分离几个克隆。按照标准Chomczynski和Sacchi(Chomczynski和Sacchi，1987)操作对来自所获得克隆的RNA进行分离并使用RNA印迹以hIL-11和hIL-11R作为特异性探针对其进行分析。hIL-11和hIL-11R的mRNA恰好在同一位置被发现，这表明两个靶序列位于一个mRNA上。RNA印迹分析可以筛选到H11表达最高水平的克隆。此外，使用抗IL-11R抗体对来自这些克隆的上清液进行蛋白印迹分析并证明所述细胞分泌H11(图8)。

作为对照研究，使用MSCV/hIL-11载体对B78H1细胞进行转导并用MIHV/GM-CSF载体对Renca细胞进行修饰。此外，用MIHV/GM-CSF对Renca/H11细胞进行共转导并在潮霉素(150μg/ml)中进行筛选。通过ELISA(RαD，Minneapolis，MN)对体外分泌到培养基中的蛋白质(IL-11和GM-CSF)进行测定。

此外，用携带H11的腺病毒转导B78H1细胞。过夜培养后更换培养基，两天后通过蛋白印迹分析对培养基中存在的H11进行测定(图9)。

实施例7：评估H11的体外活性

对来自B78H1/H11转导细胞的重组H11和上清液进行分析，在三种不同生物检测中分析其生物活性：HepG2，B9和Ba/Fgp130。

HepG2细胞(人肝细胞瘤细胞系)分泌内源IL-11，这使得它们对外源IL-11无反应。然而，HepG2对IL-11的不敏感性可通过加入sIL-11R而恢复。用H11而不是IL-11刺激HepG2细胞会引起α₁-抗胰凝乳蛋白酶的分泌增加(通过火箭免疫电泳测定)，这表明融合蛋白H11在体外是有生物活性的(图10)。

B9细胞(杂交瘤细胞系)具有IL-11R和gp130受体，这使得它们对IL-11有反应。用IL-11和H11(从用携带H11的逆转录-和腺病毒转导的B78H1细胞收集的培养基)刺激B9细胞导致引起STAT3分子磷酸化的信号转导(图11)，这最终导致了B9细胞的增殖(图12和13)。这些结果进一步表明H11融合蛋白在体外是有活性的。

Ba/F细胞(原B淋巴细胞系)的独特特征是缺少膜gp130分子，这使得它们对IL-11/sIL-11R复合物无反应。然而，用gp130 cDNA对Ba/F细胞进行转染使得它们对IL-11和sIL-11R的组合有反应。使用MTT检测，测定出用重组H11刺激Ba/Fgp130细胞导致它们扩增(图14)。

获得的结果证明在三种不同系统(杆状病毒表达系统，以及由逆转录-和腺病毒转导的真核细胞所分泌的蛋白)中产生的H11蛋白在体外是有活性的。此外，在用逆转录病毒和腺病毒载体转导后融合蛋白从真核细胞分泌。Ba/Fgp130检测证明了新设计的细胞因子H11作为复合体发挥作用。

实施例8：H11在动物模型中的体内抗肿瘤活性

为了评估H11的抗黑素瘤活性，将转导的B78H1细胞(5×10⁵)皮下注射入C57BLxC3H小鼠(s.c.)并监测肿瘤生长及存活情况。使用伪和IL-11转导细胞作为对照。

与IL-11和对照组相比，转导H11进入B78H1细胞在抑制肿瘤生长上明显具有更高水平。注射B78H1/H11细胞的小鼠体内后来出现肿瘤，肿瘤的平均体积比对照组中出现的小好几倍(图15A)。注射B78H1/H11细胞的小鼠的总存活时间比注射伪和IL-11转导的B78H1细胞的小鼠长7周。注射B78H1和B78H1/IL-11细胞的动物最长存活7周，而50％注射了B78H1/H-11细胞的小鼠存活12周(图15B)。

在第二系列实验中，首先用伪和B78H1转导细胞对未实验过的小鼠进行皮下注射免疫，两周后用亲代B78H1细胞对其进行再次攻击。90％用B78H1细胞免疫过的小鼠在第7周发现肿瘤，而同时接种B78H1/H11和B78H1/IL-11的动物分别只有30％和50％发现了肿瘤。在与对照组比较时，用H11修饰疫苗免疫的小鼠中肿瘤的平均体积要小好几倍(图16A)。接种对照和IL-11转导疫苗的小鼠存活9周，而70％用H11修饰疫苗免疫的动物存活了12周(图16B)。

此外，已经在肾细胞癌(肾癌细胞)的肿瘤排斥模型中对H11和GM-CSF基因修饰的癌症疫苗进行了分析。使用8-12周大的雌性Balb/c小鼠。创建4个实验组，每组含有10只动物。对照鼠接受模拟物转导的肾癌细胞，其它实验组分别接受表达GM-CSF、H-11或共表达H11和GM-CSF的细胞。用悬浮于0.125ml PBS中的5×10⁵对照或基因修饰细胞对小鼠进行皮下注射免疫。两周后，用亲代肾癌细胞在较远位置对小鼠进行皮下注射攻击。基于肿瘤出现、生长动力学和动物的存活情况的分析对疫苗功效进行评估。

用未修饰细胞免疫的小鼠在攻击后四周开始出现肿瘤，比其他组更快。所有对照组中的动物在施用亲代肾癌细胞后7周内出现肿瘤。用Renca-GM-CSF免疫的小鼠在攻击后5周开始出现肿瘤。在整个实验期内，该组中有20％小鼠未患肿瘤。用Renca-H11疫苗进行免疫，保护了70％的动物免患肿瘤并且在30％的小鼠中肿瘤的出现晚于接受对照或GM-CSF-分泌Renca细胞的组。用共表达H11和GM-CSF基因的疫苗免疫的小鼠完全排斥植入的亲代肿瘤细胞(图17A)。

在用伪转导的Renca细胞免疫的小鼠中观察到了最惊人的肿瘤生长动力学。用Renca-GM-CSF和-H11疫苗免疫降低了肿瘤生长动力学；然而Renca-H11比RencaGM-SCF疫苗显示出更强的保护作用。在用Renca H11/GM-CSF多基因疫苗免疫的小鼠中未观察到肿瘤(图17B)。

在第二组实验中对用对照或基因修饰Renca细胞免疫的小鼠的存活情况进行了分析。在用对照Renca细胞免疫的小鼠中，观察到最高和最快的死亡率。使用RencaGM-CSF、H11和H11/GM-CSF疫苗免疫增加了用亲代Renca细胞攻击的小鼠的存活率。在实验最后，分别有20、70和100％的小鼠仍然存活(图17C)。

实施例9：与IL-11/R-FP相比较H11的体内抗肿瘤活性

为了比较H11和IL-11/R-FP的抗肿瘤活性，用H11或IL-11/R-FP cDNA以及伪转导的B78H1细胞，将转导的修饰细胞对小鼠进行皮下注射并进行致瘤性分析。与IL-11/R-FP相比，H11对肿瘤生长显示出更好的作用(图18A和B)。

实施例10：负责H11修饰疫苗(GMTV-H11)抗黑素瘤活性的细胞机制评估

在第一组实验中，使用SCID小鼠。它们缺少T和B淋巴细胞，但是拥有NK细胞，这允许评估这些细胞在H11介导的原发肿瘤排斥中所起的作用。在接受B78H1/IL-11和B78H1/H11细胞皮下注射的小鼠中，肿瘤的出现晚于对照小鼠。在注射B78H1/H11细胞的小鼠中的平均肿瘤体积小于注射伪和IL-11转导B78H1细胞的小鼠中的(图19A)。与对照组相比，接种B78H1/H11细胞的SCID小鼠的存活期延长了。接受B78H1和B78H1/IL-11细胞的动物分别存活了8和9周，而B78H1/H11免疫的SCID小鼠有50％存活了12周(图19B)。这些实验表明H11的抗-原发肿瘤活性可能与非特异性免疫反应有关。

在第二组实验中，分析由IL-11和H11基因修饰的肿瘤疫苗引起的抗黑素瘤免疫应答的诱导和效应期。通过向未接触抗原的小鼠注射对照和GMTV以及免疫细胞浸润分析(免疫组织化学)对诱导期进行研究。对照B78H1细胞被单一CD4+和CD8+T淋巴细胞浸润。GMTV-IL-11细胞被CD4+和CD8+细胞密集浸润，然而在B78H1/H11接种小鼠中没检测到。这些结果表明由IL-11和H11 GMTV引起的抗黑素瘤免疫应答的诱导期是由不同机制介导的。此外，B78H1/H11细胞被NK细胞密集浸润，这证实了这些细胞在原发肿瘤生长抑制中的重要作用。在效应期中，其中对之前用对照GMTV免疫的小鼠再次用亲代B78H1细胞攻击，发现单一CD4+细胞的浸润。然而，IL-11-GMTV免疫小鼠中的B78H1肿瘤被CD4+和CD8+密集浸润，而B78H1/H11免疫引起NK细胞的严重浸润。这些数据表明CD4+和晚期的CD8+淋巴细胞是由IL-11-GMTV刺激的重要效应细胞，而H11-GMTV激活NK和在晚期激活CD4+细胞。

图20和21总结了由IL-11和H11 GMTV引起的抗黑素瘤免疫应答的诱导和效应期分析。

参考文献

Altschul SF，Gish W，Miller W，Myers EW，Lipman DJ.Basic local alignment search tooL J MolBiol.1990 Oct 5；215(3)：403-10.

Altschul SF，Madden TL，Schaffer AA，Zhang J，Zhang Z，Miller W，Lipman DJ.GappedBLAST and PSI-BLAST：a new generation of protein database search programs.Nucleic AcidsRes.1997 Sep 1；25(17)：3389-402.

Anguita J，Barthold SW，Samanta S，Ryan J，Fikrig E.Selective anti-inflammatory action ofinterleukin-11 in murine Lyme disease：arthritis decreases while carditis persists.J Infect Dis.1999 Mar；179(3)：734-7.

Barker JL，Montague ED，Peters LJ.Clinical experience with inradiation of inflammatorycarcinoma of the breast With and Without elective chemotherapy.Cancer.1980 Feb15；45(4)：625-9.

Barton VA，Hudson KR，Heath JK.Identification of three distinct receptor binding sites ofmurine interleukin-11.J Biol Chem.1999 Feb 26；274(9)：5755-61.

Barton VA，Hall MA，Hudson KR，Heath JK.Interleukin-11 signals through the formation of ahexameric receptor complex.J Biol Chem.2000 Nov 17；275(46)：36197-203.

Baumann H，Schendel P.Interleukin-11 regulates the hepatic expression of the same plasmaprotein genes as interleukin-6.J Biol Chem.1991 Oct 25；266(30)：20424-7.

Baumann H，Wang Y，Morella KK，Lai CF，Dams H，Hilton DJ，Hawley RG，Mackiewicz A.Complex of the soluble IL-11 receptor and IL-11 acts as IL-6-type cytokine in hepatic andnonhepatic cells.J Immunol.1996 Jul 1；157(1)：284-90.

Bazan JF.Structural design and molecular evolution of a cytokine receptor superfamily.ProcNatl Acad Sci USA.1990 Se；87(18)：6934-8.

Bozza M，Bliss JL，Maylor R，Erickson J，Donnelly L，Bouchard P，Dorner AJ，Trepicchio WL.Interleukin-11 reduces T-cell-dependent experimental liver injury in mice.Hepatology.1999Dec；30(6)：1441-7.

Bravo J，Heath JK.Receptor recognition by gp130 cytokines.EMBO J.2000 Jun 1；19(11)：2399-411.

Carlezon WA Jr，Nestler EJ，Neve RL.Herpes simplex virus-mediated gene transfer as a tool forneuropsychiatric research.Crit Rev Neurobiol.2000；14(1)：47-67.

Carter PJ，Samulski RJ.Adeno-associated viral vectors as gene delivery vehicles.Int J Mol Med.2000 Jul；6(1)：17-27.

Chang M，Williams A，Ishizawa L，Knoppel A，van de Ven C，Cairo MS.Endogenousinterleukin-11(IL-11)expression is increased and prophylactic use of exogenous IL-11 enhancesplatelet recovery and improves survival during thrombocytopenia associated with experimentalgroup B streptococcal sepsis in neonatal rats.：Blood Cells Mol Dis.1996；22(1)：57-67.

Chang LJ，Gay EE.The molecular genetics of lentiviral vectors-current and future perspectives.Curr Gene Ther.2001 Sep；1(3)：237-51.

Cherel M，Sorel M，Lebeau B，Dubois S，Moreau JF，Bataille R，Minvielle S，Jacques Y.Molecular cloning of two isoforms of a receptor for the human hematopoietic cytokineinterleukin-11.Blood.1995 Oct 1；86(7)：2534-40.

Cherel M，Sorel M，Apiou F，Lebeau B，Dubois S，Jacques Y，Minvielle S.The humaninterleukin-11 receptor alpha gene(IL11RA)：genomic organization and chromosome mapping.Genomics.1996 Feb 15；32(1)：49-53.

Chomczynski P，Sacchi N.Single-step method of RNA isolation by acid guanidiniumthiocyanate-phenol-chloroform extraction.Anal Biochem.1987 Apr；162(1)：156-9.

Curtis DJ，Hilton DJ，Roberts B，Murray L，Nicola N，Begley CG.Recombinant solubleinterleukin-11(IL-11)receptor alpha-chain can act as an IL-11 antagonist.Blood.1997 Dec1；90(11)：4403-12.

Czupryn MJ，McCoy JM，Scoble HA.Structure-function relationships in human interleukin-11.Identification of regions involved in activity by chemical modification and site-directedmutagenesis.J Biol Chem.1995 Jan 13；270(2)：978-85.

Dams-Kozlowska H，Izycki D，Mackiewicz A.IL-11 is a potent anti-melanoma factor.Adv ExpMed Biol.2001；495：373-7.

Davis S，Aldrich TH，Valenzuela DM，Wong VV，Furth ME，Squinto SP，Yancopoulos GD.Thereceptor for ciliary neurotrophic factor.Science.1991 Jul 5；253(5015)：59-63.

Deller MC，Hudson KR，Ikemizu S，Bravo J，Jones EY，Heath JK.Crystal structure andfunctional dissection of the cytostatic cytokine oncostatin M.Structure Fold Des.2000 Aug15；8(8)：863-74.

Dimitriadis E，Salamonsen LA，Robb L.Expression of interleukin-11 during the humanmenstrual cycle：coincidence with stromal cell decidualization and relationship to leukaemiainhibitory factor and prolactin.：Mol Hurn Reprod.2000 Oct；6(10)：907-14.

Du XX，Neben T，Goldman S，Williams DA.Effects of recombinant human interleukin-11 onhematopoietic reconstitution in transplant mice：acceleration of recovery of peripheral bloodneutrophils and platelets.Blood.1993 Jan 1；81(1)：27-34.

Du X，Williams DA.Interleukin-11：review of molecular，cell biology，and clinical use.Blood.1997 Jun 1；89(11)：3897-908.

Dull T，Zufferey R，Kelly M，Mandel RJ，Nguyen M，Trono D，Naldini L.A third-generationlentivirus vector with a conditional packaging system.J Virol.1998 Nov；72(11)：8463-71.

Fastenberg NA，Martin RG，Buzdar AU，Hortobagyi GN，Montague ED，Blumenschein GR，Jessup JM.Management of inflammatory carcinoma of the breast.A combined modalityapproach.Am J Clin Oncol.1985 Apr；8(2)：134-41.

Fischer M，Goldschmitt J，Peschel C，Brakenhoff JP，Kallen KJ，Wollmer A，Grotzinger J，Rose-John S.I.A bioactive designer cytokine for human hematopoietic progenitor cell expansion.NatBiotechnol.1997 Feb；15(2)：142-5.

Girasole G，Passeri G，Jilka RL，Manolagas SC.Interleukin-11：a new cytokine critical forosteoclast development.J Clin Invest.1994 Apr；93(4)：1516-24.

Gordon MS，McCaskill-Stevens WJ，Battiato LA，Loewy J，Loesch D，Breeden E，Hoffman R，Beach KJ，Kuca B，Kaye J，Sledge GW Jr.A phase I trial of recombinant human interleukin-11(neumega rhIL-11 growth factor)in women with breast cancer receiving chemotherapy.Blood.1996 May 1；87(9)：3615-24.

Grotzinger J，Kurapkat G，Wollmer A，Kalai M，Rose-John S.The family of the IL-6-typecytokines：specificity and promiscuity of the receptor complexes.Proteins.1997 Jan；27(1)：96-109.

Grotzinger J，Kernebeck T，Kallen KJ，Rose-John S.IL-6 type cytokine receptor complexes：hexamer，tetramer or both？Biol Chem.1999 Jul-Aug；380(7-8)：803-13.

Harmegnies D，Wang XM，Vandenbussche P，Leon A，Vusio P，Grotzinger J，Jacques Y，Goormaghtigh E，Devreese B，Content J.Characterization of a potent human interleukin-11agonist.Biochem J.2003 Oct 1；375(Pt1)：23-32.

Hawley RG，Hawley TS，Fong AZ，Quinto C，Collins M，Leonard JP，Goldman SJ.Thrombopoietic potential and serial repopulating ability of murine hematopoietic stem cellsconstitutively expressing interleukin 11.Proc Natl Acad Sci USA.1996 Sep 17；93(19)：10297-302.

Heinrich PC，Behrmann I，Haan S，Hermanns HM，Muller-Newen G，Schaper F.Principles ofinterleukin(IL)-6-type cytokine signalling and its regulation.Biochem J.2003 Aug 15；374(Pt1)：1-20.

Hilton DJ，Hilton AA，Raicevic A，Rakar S，Harrison-Smith M，Gough NM，Begley CG，MetcalfD，Nicola NA，Willson TA.Cloning of a murineeceptor alpha-chain；requirement for gp130 forhigh affinity binding and signal transduction.EMBO J.1994 Oct 17；13(20)：4765-75.

Isaacs C，Robert NJ，Bailey FA，Schuster MW，Overmoyer B，Graham M，Cai B，Beach KJ，Loewy JW，Kaye JA.Randomized placebo-controlled study of recombinant human interleukin-11 to prevent chemotherapy-induced thrombocytopenia in patients with breast cancer receivingdose-intensive cyclophosphamide and doxorubicin.J Clin Oncol.1997 Nov；15(11)：3368-77.

Karow J，Hudson KR，Hall MA，Vernallis AB，Taylor JA，Gossler A，Heath JK.Mediation ofinterleukin-11-drependent biological responses by a soluble form of the interleukin-11 receptor.Biochem J.1996 Sep 1；318(Pt2)：489-95.

Karpovich N，Chobotova K Carver J，Heath JK，Barlow DH，Mardon HJ.Expression andfunction of interleukin-11 and its receptor alpha in the human endometrium.Mol Hum Reprod.2003 Feb；9(2)：75-80.

Karlin S，Altschul SF.Applications and statistics for multiple high-scoring segments inmolecular sequences.Proc Natl Acad Sci USA.1993 Jun 15；90(12)：5873-7.

Kobinger GP，Weiner DJ，Yu QC，Wilson JM.Filovirus-pseudotyped lentiviral vectot canefficiently and stably transduce airway epithelia in vivo.Nat Biotechnol.2001 Mar；19(3)：225-30.

Lebeau B，Montero Julian FA，Wijdenes J，Muller-Newen G，Dabmen H，Cherel M，HeinrichPC，Brailly H，Hallet MM，Godard A，Minvielle S，Jacques Y.Reconstitution of two isoforms ofthe human interleukin-11 receptor and comparison of their functional properties.FEBS Lett.1997 Apr 28；407(2)：141-7.

Leng SX，Elias JA.Interleukin-11 inhibits macrophage interleukin-12 production. J Immunol.1997 Sep 1；159(5)：2161-8.

Lieschke GJ，Rao PK，Gately MK，Mulligan RC.Bioactive murine and human interleukin-12fusion proteins which retain antitumor activiy in vivo.Nat Biotechnol.1997 Jan；15(1)：35-40.

Lindemann D，Patriquin E，Feng S，Mulligan RC.Versatile retrovirus vector systems forregulated gene expression in vitro and in vivo.Mol Med.1997 Jul；3(7)：466-76.

Mackiewicz A，Schooltink H，Heinrich PC，Rose-John S.Complex of soluble human IL-6-receptor/IL-6 up-regulates expression of acute-phase proteins.J Immunol.1992 Sep15；149(6)：2021-7.

Mackiewicz A，Wiznerowicz M，Roeb E，Karczewska A，Nowak J，Heinrich PC，Rose-John S.Soluble interleukin 6 receptor is biologically active in vivo.Cytokine.1995a Feb；7(2)：142-9.

Mackiewicz A，Wiznerowicz M，Roeb E，Nowak J，Pawlowski T，Baumann H，Heinrich PC，Rose-John S.Interleukin-6-type cytokines and their receptors for gene therapy of melanoma.Ann N Y Acad Sci.1995b Jul 21；762：361-73；discussion 373-4.

Mackiewicz A，Gomy A，Laciak M，Malicki J，Murawa P，Nowak J，Wiznerowicz M，HawleyRG，Heinrich PC，Rose-John S.Gene therapy of human melanoma Immunization of patientswith autologous tumor cells admixed with allogeneic melanoma cells secreting interleukin 6 andsoluble interleukin 6 receptor.Hum Gene Ther.1995c Jun；6(6)：805-11.

Maier R，Ganu V，Lotz M.Interleukin-11，an inducible cytokine in human articular chondrocytesand synoviocytes，stimulates the production of the tissue inhibitor of metalloproteinases.J BiolChem.1993 Oct 15；268(29)：21527-32.

Marz P，Otten U，Rose-John S.Neural activities of IL-6-type cytokines often depend on solublecytokine receptors.Eur J Neurosci.1999 Sep；11(9)：2995-3004.

McDonald NQ，Panayotatos N，Hendrickson WA.Crystal structure of dimeric human ciliaryneurotrophic factor determined by MAD phasing.EMBO J.1995 Jun 15；14(12)：2689-99.

Mehler MF，Rozental R，Dougherty M，Spray DC，Kessler JA.Cytokine regulation of neuronaldifferentiation of hippocampal progenitor cells.Nature.1993 Mar 4；362(6415)：62-5.

Nandurkar HH，Hilton DJ，Nathan P，Willson T，Nicola N，Begley CG.The human IL-11receptor requires gp130 for signalling：demonstration by molecular cloning of the receptor.Oncogene.1996 Feb 1；12(3)：585-93.

Neddermann P，Graziani R，Ciliberto G，Paonessa G.Functional expression of soluble humaninterleukin-11(IL-11)receptor alpha and stoichiometry of in vitro IL-11 receptor complexeswith gp130.J Biol Chem.1996 Nov 29；271(48)：30986-91.

Ohsumi J，Miyadai K，Kawashima I，Sakakibara S，Yamaguchi J，Itoh Y.Regulation oflipoprotein lipase synthesis in 3T3-L1 adipocytes by interleukin-11/adipogenesis inhibitoryfactor.Biochem Mol Biol Int.1994 Mar；32(4)：705-12.

Ozbek S，Grotzinger J，Krebs B，Fischer M，Wollmer A，Jostock T，Mullberg J，Rose-John S.The membrane proximal cytokine receptor domain of the human interleukin-6 receptor issufficient for ligand binding but not for gp130 association.J Biol Chem.1998 Aug14；273(33)：21374-9.

Paul SR，Bennett F，Calvetti JA，Kelleher K，Wood CR，O′Hara RM Jr，Lesry AC，Sibley B，Clark SC，Williams DA，et al.Molecular cloning of a cDNA encoding interleukin 11，a stromalcell-derived lymphopoietic and hematopoietic cytokine.Proc Natl Acad Sci U S A.1990Oct；87(19)：7512-6.

Peterson RL，Wang L，Albert L，Keith JC Jr，Dorner AJ.Molecular effects of recombinanthuman interleukin-11 in the HLA-B27 rat model of inflammatory bowel disease.Lab Invest.1998 Dec；78(12)：1503-12.

Pflanz S，Tacken I，Grotzinger J，Jacques Y，Minvielle S，Dahmen H，Heinrich PC，Muller-Newen G.A fusion protein of interleukin-11 and soluble interleukin-11 receptor acts as asuperagonist on cells expressing gp130.FEBS Lett.1999 Apr 30；450(1-2)：117-22.

Redlich CA，Gao X，Rockwell S，Kelley M，Elias JA.IL-11 enhances survival and decreasesTNF production after radiation-induced thoracic injury.J Immunol.1996 Aug 15；157(4)：1705-10.

Robb L，Hilton DJ，Willson TA，Begley CG.Structural analysis of the gene encoding the murineinterleukin-11 receptor alpha-chain and a related locus.J Biol Chem.1996 Jun 7；271(23)：13754-61.

Robb L，Li R，Hartley L，Naudurkar HH，Koentgen F，Begley CG.Infertility in female micelacking the receptor for interleukin 11 is due to a defective uterine response to implantation.NatMed.1998 Mar；4(3)：303-8.

Robinson RC，Grey LM，Staunton D，Vankelecom H，Vernallis AB，Moreau JF，Stuart DI，HeathJK，Jones EY.The crystal structure and biological function of leukemia inhibitory factor：implications for receptor binding.Cell 1994 Jul 1；77(7)：1101-16.

Rose-John S，Schooltink H，Lenz D，Hipp E，Dufhues G，Schmitz H，Schiel X，Hirano T，Kishimoto T，Heinrich PC.Studies on the structure and regulation of the human hepaticinterleukin-6 receptor.Eur J Biochem.1990 May 31；190(1)：79-83.

Schleinkofer K，Dingley A，Tacken I，Federwisch M，Muller-Newen G，Heinrich PC，Vusio P，Jacques Y，Grotzinger J.Identification of the domain in the human interleukin-11 receptor thatmediates ligand binding.J Mol Biol.2001 Feb 16；306(2)：263-74.

Schwertschlag US，Trepicchio WL，Dykstra KH，Keith JC，Turner KJ，Dorner AJ.Hematopoietic，immunomodulatory and epithelial effects of interleukin-11.Leukemia.1999 Sep；13(9)：1307-15.

Somers W，Stahl M，Seehra JS.1.9 A crystal structure of interleukin 6：implications for a novelmode of receptor dimerization and signaling.EMBO J.1997 Mar 3；16(5)：989-97.

Sonis ST，Van Vugt AG，McDonald J，Dotoli E，Schwertschlag U，Szklut P，Keith J.Mitigatingeffects of interleukin 11 on consecutive courses of 5-fluorouracil-induced ulcerative mucositis inhamsters.Cytokine.1997 Aug；9(8)：605-12.

Springer ML，Chen AS，Kraft PE，Bednarski M，Blau HM.VEGF gene delivery to muscle：potential role for vasculogenesis in adults.Mol Cell.1998 Nov；2(5)：549-58.

Tacken I，Dahmen H，Boisteau O，Minvielle S，Jacques Y，Grotzinger J，Kuster A，Horsten U，Blanc C，Montero-Julian FA，Heinrich PC，Muller-Newen G.Definition of receptor binding siteson human interleukin-11 by molecular modeling-guided mutagenesis.Eur J Biochem.1999Oct；265(2)：645-55.

Tepler I，Elias L，Smith JW 2nd，Hussein M，Rosen G，Chang AY，Moore JO，Gordon MS，KucaB，Beach KJ，Loewy JW，Garnick MB，Kaye JA.A randomized placebo-controlled trial ofrecombinant human interleukin-11 in cancer patients with severe thrombocytopenia due tochemotherapy.Blood.1996 May 1；87(9)：3607-14.

Trepicchio WL，Bozza M，Pedneault G，Dorner AJ.Recombinant human IL-11 attenuates theinflammatory response through down-regulation of proinflammatory cytokine release and nitricoxide production.J Immunol.1996 Oct 15；157(8)：3627-34.

Trepicchio WL，Wang L，Bozza M，Dorner AJ.IL-11 regulates macrophage effector functionthrough the inhibition of nuclear factor-kappaB.J Immunol.1997 Dec 1；159(11)：5661-70.

Trepicchio WL，Ozawa M，Walters IB，Kikuchi T，Gilleaudeau P，Bliss JL，Schwertschlag U，Dorner AJ，Krueger JG.Interleukin-11 therapy selectively downregulates type I cytokineproinflammatory pathways in psoriasis lesions.J Clin Invest.1999 Dec；104(11)：1527-37.

Underhill-Day N，McGovern LA，Karpovich N，Mardon HJ，Barton VA，Heath JK.Functionalcharacterization of W147A：a high-affinity interleukin-11 antagonist.Endocrinology.2003Aug；144(8)：3406-14.

Walmsley M，Butler DM，Marinova-Mutafchieva L，Feldmann M.An anti-inflammatory role forinterleukin-11 in established murine collagen-induced arthritis.Immunology.1998 Sep；95(1)：31-7.

Wells JA.Binding in the growth hormone recptor complex.Proc Natl Acad Sci USA.1996Jan 9；93(1)：1-6.

Wiznerowicz M，Fong AZ，Mackiewicz A，Hawley RG.Double-copy bicistronic retroviralvector platform for gene therapy and tissue engineering：application to melanoma vaccinedevelopment.Gene Ther.1997 Oct；4(10)：1061-8.

Vollmer P，Oppmann B，Voltz N，Fischer M，Rose-John S.A role for the immunoglobulin-likedomain of the human IL-6 receptor.Intracellular protein transport and shedding.Eur J Biochem.1999 Jul；263(2)：438-46.

de Vos AM，Ultsch M，Kossiakoff AA.Human growth hormone and extracellular domain of itsreceptor：crystal structure of the complex.Science.1992 Jan 17；255(5042)：306-12.

Yawata H，Yasukawa K，Natsuka S，Murakami M，Yamasaki K，Hibi M，Taga T，Kishimoto T.Structure-function analysis of human IL-6 receptor：dissociation of amino acid residues requiredfor IL-6-binding and for IL-6 signal transduction through gp130.EMBO J.1993Apr；12(4)：1705-12.

Zufferey R，Nagy D，Mandel RJ，Naldini L，Trono D.Multiply attenuated lentiviral vectorachieves effcient gene delivery in vivo.Nat BiotechnoL 1997 Sep；15(9)：871-5.RelatedArticles，Links

序列表

<110>爱吉瑞克斯有限公司

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cggcagctgg ctgcacagct gagggacaaa ttcccagctg acggggacca caacctggat 1260

tccctgccca ccctggccat gagtgcgggg gcactgggag ctctacagct cccaggtgtg 1320

ctgacaaggc tgcgagcgga cctactgtcc tacctgcggc acgtgcagtg gctgcgccgg 1380

gcaggtggct cttccctgaa gaccctggag cccgagctgg gcaccctgca ggcccgactg 1440

gaccggctgc tgcgccggct gcagctcctg atgtcccgcc tggccctgcc ccagccaccc 1500

ccggacccgc cggcgccccc gctggcgccc ccctcctcag cctggggggg catcagggcc 1560

gcccacgcca tcctgggggg gctgcacctg acacttgact gggccgtgag gggactgctg 1620

ctgctgaaga ctcggctgtg a 1641

<210>7

<211>18

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>扩增IL-11片段的PCR引物

<400>7

gctgctgccc ctgggcca 18

<210>8

<211>45

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>扩增IL-11片段的PCR引物

<400>8

tccgcggccg ctatggccga cgtcgactca cagccgagtc ttcag 45

<210>9

<211>40

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>扩增IL-11R片段的PCR引物

<400>9

acgcgtcgac gccaccatgg gcagcagctg ctcagggctg 40

<210>10

<211>57

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>扩增IL-11R片段的PCR引物

<400>10

aactcgaggg gggccaggtg gtggcccagg ggcgacagcc tgctccacag agtccct 57

<210>11

<211>20

<212>DNA

<213>人

<400>11

acccacccgc tacctcacct 20

<210>12

<211>17

<212>DNA

<213>人

<400>12

gtcaggagca cggtgct 17

Claims

1.多聚核苷酸，其选自：

或这样的多聚核苷酸的互补链。

2.权利要求1的多聚核苷酸，其中编码可溶性IL-11R的多聚核苷酸位于编码成熟IL-11的多聚核苷酸的5’端。

3.权利要求1或2的多聚核苷酸，其中插入编码可溶性IL-11R和成熟IL-11的多聚核苷酸序列的核苷酸序列编码非免疫原性肽。

4.权利要求1或2的多聚核苷酸，其中编码可溶性IL-11R和成熟IL-11的多聚核苷酸被直接连接。

5.权利要求4的多聚核苷酸，其中多聚核苷酸选自：

(b)多聚核苷酸，其包括如SEQ ID NO：6所示的H11的编码序列；

或这样的多聚核苷酸的互补链。

6.权利要求1-5中任一项的多聚核苷酸，其是DNA，cDNA、基因组DNA、合成DNA或RNA。

7.含有权利要求1-6中任一项的多聚核苷酸的载体。

8.权利要求7的载体，其中多聚核苷酸可操作性连接到表达调控序列，其允许在原核和/或真核宿主细胞中进行表达。

9.权利要求7或8的载体，其中表达调控序列选自CMV、SV40、多角体蛋白启动子、逆转录病毒LTRs、磷酸甘油酸激酶(PKG)、延伸因子1-α(EF1-α)和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)。

10.权利要求7-9中任一项的载体，其中载体选自质粒；噬菌粒；噬菌体；粘粒；人工哺乳动物染色体；人工酵母染色体；敲除或敲入构建体；病毒，尤其是腺病毒、痘苗病毒、减毒痘苗病毒、金丝雀痘病毒、慢病毒、疱疹病毒尤其是单纯疱疹病毒、杆状病毒、逆转录病毒、腺相关病毒(AAV)、鼻病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、丝状病毒、及其工程化形式；病毒体；病毒样颗粒；和脂质体。

11.用权利要求1-6中任一项的多聚核苷酸或权利要求7-10中任一项的载体基因工程化的宿主细胞。

12.权利要求11的宿主细胞，其中宿主细胞选自昆虫细胞，尤其是粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)和草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)，哺乳动物细胞，尤其是干细胞、造血细胞、肝细胞、脂肪细胞、神经元、破骨细胞、子宫内膜细胞、皮肤细胞、心肌细胞、粘膜细胞或肿瘤细胞；细菌细胞，尤其是埃希氏菌属或芽孢杆菌属，和酵母细胞，尤其是毕赤酵母属或酵母属。

13.权利要求11或12的宿主细胞，其中宿主细胞选自肾癌细胞、胰腺癌细胞、白细胞、黑素瘤细胞、包装细胞，尤其是双嗜性或亲嗜性包装细胞。

14.权利要求11-13任一项的宿主细胞，其经基因工程化以表达至少一种进一步的多聚核苷酸。

15.权利要求14的宿主细胞，其中进一步的多聚核苷酸编码细胞因子，特别是GM-CSF、IL-6、IL-11、IL-15、抗-TGF、EPO、干扰素、LIF、OSM、CNTF、CT-1和sIL-6R/IL-6融合蛋白，特别是超IL-6。

16.一种制备能表达H11的细胞的方法，其包括用权利要求7-10之一的载体在体外基因工程改造细胞，其中所述H11由权利要求1-6之一的多聚核苷酸编码。

17.一种生产由权利要求1-6之一的多聚核苷酸编码的H11多肽的方法，其包括：培养权利要求11-15之一的宿主细胞和回收由所述多聚核苷酸编码的H11多肽。

18.一种H11多肽，其具有由权利要求1-6之一的多聚核苷酸编码的氨基酸序列或通过权利要求17方法可获得。

19.一种抗体，其对由权利要求1-6之一的多聚核苷酸编码的或通过权利要求17的方法可获得的多肽具有特异性，所述抗体对可溶性IL-11R和IL-11基本无特异性。

20.一种药物组合物，其包含权利要求11-15之一的或根据权利要求16可获得的宿主细胞，或权利要求18的或按照权利要求17可获得的H11，其进一步包含赋形剂、稳定剂、保护剂、缓冲剂和/或添加剂。

21.权利要求11或15之一的或按照权利要求16可获得的宿主细胞或者权利要求18的H11在制造治疗疾病的药物中的应用，所述疾病选自增殖性疾病、细胞病变、辐射损伤、IL-11依赖的炎性疾病、IL-11依赖的退行性疾病和IL-11依赖或介导的软组织疾病。

22.权利要求21的应用，其中所述增殖性疾病选自胃肠或结直肠道癌、肝癌、胰腺癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌、睾丸癌、皮肤癌、眼癌、黑素瘤、发育不良性口腔粘膜癌、侵入性口腔癌、小细胞和非小细胞肺癌、激素依赖性乳腺癌、非激素依赖性乳腺癌、移行和鳞状细胞癌、神经恶性瘤，包括神经母细胞瘤、神经胶质瘤、星形细胞瘤、骨肉瘤、软组织肉瘤、血管瘤、内分泌肿瘤、血液新生物包括白血病、淋巴瘤和其它骨髓增殖性和淋巴增殖性疾病、原位癌、增生性损伤、腺瘤、纤维瘤、组织细胞增多症、慢性炎症增生性疾病、血管增生性疾病和病毒诱导增生性疾病；尤其是黑素瘤、胰腺和肾癌。

23.权利要求21的应用，其中细胞病变选自血小板减少症、血细胞减少症和全血细胞减少症。

24.权利要求21的应用，其中IL-11依赖的炎性疾病选自肝功能衰竭；肝炎；肝病；败血症；化疗或放疗引起的组织损伤，尤其是肺损伤；炎性疾病，尤其是炎性肠病，类风湿性关节炎，炎性肝病；粘膜炎；变态反应；子宫内膜异位症；血管炎；内皮炎症相关的血管疾病，尤其是缺血性心脏病或外周血管病；和银屑病。

25.权利要求21的应用，其中IL-11依赖的退行性疾病选自退行性CNS疾病、PNS疾病和骨关节炎。

26.权利要求21的应用，其中IL-11依赖或介导的软组织疾病选自肥胖症和特发性女性不育。

27.权利要求21-26中任一项的应用，其中在施用H11多肽或表达H11多肽的宿主细之前、同时或随后施用至少一种进一步的细胞因子。

28.权利要求18或根据权利要求17的方法可获得的IL-11在制造用于干细胞治疗期间辅助疗法的药物中的应用。

29.权利要求18或根据权利要求17的方法可获得的IL-11的应用，用于细胞尤其是干细胞或祖细胞体外分化。