CN1221662C - 含有辅助分子配体基因的新表达载体和它们在免疫调节和治疗恶性肿瘤和自身免疫疾病中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及编码辅助分子配体的基因和它们在免疫调节，接种和在治疗各种人类疾病，包括恶性肿瘤和自身免疫疾病中的用途。本发明也叙述了由起源于肿瘤坏死因子家族的分子的各种区域和亚区域组成的辅助分子配体的用途。本发明的嵌合分子含有独特的使其活性稳定的特性，因此在疾病的治疗中具有较大的用途。也对表达编码本发明的分子的基因的载体进行了探讨。

Description

含有辅助分子配体基因的新表达载体和它们在免疫调节 和治疗恶性肿瘤和自身免疫疾病中的应用
相关的申请
本申请要求Kipps等人，1996年11月9日递交的含有辅助分子配体基因的新表达载体和它们在免疫调节和治疗恶性肿瘤中的用途，美国临时申请号60/132145，的优先权。该文献包括附图引入本文作为参考。
发明技术领域
本发明涉及含有编码辅助分子配体的基因的新表达载体和这些载体在免疫调节，改良接种方案和治疗恶性肿瘤和自身免疫疾病中的用途。更具体地说，本发明提供了治疗各种肿瘤性或恶性细胞的表达载体和方法，和治疗自身免疫疾病的表达载体和方法。本发明也涉及具有更大稳定性和增强的功能的辅助分子配体的生产和表达。
发明背景
白血病，淋巴瘤，癌和其它恶性肿瘤是已知的，并且在例如，内科医学的Harrison原理，Wilson等人，McGraw-Hill，纽约，1599-1612页中的描述。这些恶性肿瘤似乎是以某种方式逃避了免疫系统监督机制，该机制能够快速和连续地消除增殖的细胞。这些恶性肿瘤逃避免疫系统监督的准确机制还没有被认识。
这些恶性免疫系统细胞中的一些是在免疫级联中不能适当发挥作用的恶性抗原呈现细胞。例如，肿瘤性B细胞在体外甚至不能诱导微弱的异源或自身混合的淋巴反应。另外，由于免疫监督机制的失效而产生恶性肿瘤的证据包括无免疫应答的个体如异源移植的受体和那些接受长期免疫抑制剂治疗的个体中这样的恶性肿瘤的几率提高。另外，在患有获得性免疫缺陷综合症(AIDS)的病人和患有原发性免疫缺陷综合症，如伴X染色体的淋巴增殖综合症，或Wiscott-Aldrich综合症的病人(Thomas等人，癌症研究进展，57：329，1991)中这些恶性肿瘤的几率提高。
免疫系统通常能够发挥作用通过识别恶性肿瘤细胞为外源细胞，并且从体内清除这些细胞从而去除恶性肿瘤细胞。免疫反应取决于病人体内的免疫系统抗体应答和细胞免疫应答。更具体地说，作为将恶性肿瘤细胞识别为外源细胞的细胞免疫应答需要免疫系统的许多不同的细胞和这些细胞之间的相互作用。免疫反应从T淋巴细胞(T细胞)开始，这一T淋巴细胞在它的细胞表面具有T细胞受体。T细胞也具有在它的表面表达各种辅助分子的能力，这些分子与B淋巴细胞(B细胞)上的辅助分子相互作用。当T细胞的T细胞受体特异地结合外源抗原如恶性肿瘤细胞时被活化，并且在它的细胞表面表达辅助分子配体，CD40配体。辅助细胞分子配体只在短时间内存在于活化的T细胞上，并且快速地从细胞表面除去。在辅助细胞分子配体从活化的T细胞的表面除去后，它通过辅助分子配体结合B细胞的能力就被破坏了。
当存在于活化T细胞的表面时，辅助细胞配体可以特异地结合存在于B细胞上的辅助细胞分子。这一特异的T-B细胞相互作用引起B和T细胞表达共同刺激的表面辅助分子和细胞因子，这导致了免疫活化，产生特异地杀死和从体内除去恶性肿瘤细胞的溶细胞的T细胞。
与活化的T细胞的相互作用不是唯一地限制于B细胞，而且可以通过任何能够对T细胞呈现抗原的细胞(抗原呈现细胞)进行。这些细胞包括B淋巴细胞，巨嗜细胞，树突细胞，单核细胞，郎氏细胞，交错突细胞，小结树突细胞或肝巨嗜细胞。已知这些细胞都在细胞表面具有各种辅助分子，使它们与免疫系统的其它细胞相互作用。例如，这些抗原呈现细胞都在细胞表面具有辅助分子CD40。这些辅助分子的存在允许这些抗原呈现细胞特异地结合互补的辅助分子配体并且因此直接与其它免疫细胞相互作用。
大量的辅助分子配体是肿瘤坏死因子超家族的成员。(Fanslow等人，Sem.Immun.，6：267-268(1994))。许多这些辅助分子配体的基因已被克隆和鉴定。这些辅助分子配体基因编码都具有II型膜蛋白质的构型的辅助分子并且显示出与其它辅助分子配体基因的不同程度的同源性。例如，编码小鼠CD40配体和人CD40配体的辅助分子配体基因已经分离。参见，Armitage等人，自然，357：80-82(1992)和Hollenbaugh等人，EMBO J.11：4313-4321(1992)。
CD40和它的配体，CD40配体是正常免疫应答的关键成分。CD40介导的信号诱导免疫淋巴细胞增殖和分化，并且变成强大的抗原呈现细胞。恶性和肿瘤B细胞是不良的抗原呈现细胞，并且不能刺激强有力的异源混合的淋巴细胞反应(allogeneic mixed lymphocyte reaction)。免疫细胞上CD40分子的成功的交联导致强烈的异源混合的淋巴细胞反应，表明强烈的免疫反应。各种可溶的CD40配体或特异于CD40的抗体已经用于潜在地交联CD40。这些可溶的CD40配体和CD40特异抗体对于交联抗原呈现细胞上的CD40分子不是最适的，并且不能如细胞上表达的CD40配体一样有效地作用以致产生对抗原呈现细胞的强烈刺激。这些方法也是难于实现的，因为必须分离大量的CD配体构建体或抗体，这是困难和耗时的工作。在溶液中利用CD40配体或作为膜结合分子的其它方案包括利用CD40配体转化成纤维细胞以便产生培养的细胞，然后将细胞用于呈现抗原，这些是经不起体外的人临床方案的检验的。
CD95(Fas)与它的配体(Fas-配体，或FasL)的相互作用的作用是限制免疫应答的持久性和/或活化淋巴细胞的生存期。Fas-FasL结合诱导的细胞程序死亡的作用是清除活化的自我反应的淋巴细胞。改变这一途径引起的问题已经在Fas<->Fas-配体相互作用中具有缺陷的动物中得到证实。具有失活CD95或FasL的突变的小鼠发展了许多疾病，包括类似于患有类风湿关节炎(RA)或系统性狼疮的病人中见到的自身免疫病理。Zhang等人，临床研究杂志，100：1951-1957(1997)表明将FasL表达病毒注射进入患有胶原诱导的关节炎的小鼠的关节，导致了滑液细胞的细胞程序死亡和减轻关节炎综合症。Fas配体的表达允许清除在自身免疫疾病的病理中起作用的活化细胞。所以，在类风湿关节炎病人的关节中导入FasL的基因治疗方案可通过引起渗入型单核细胞的破坏改良疾病的病理来发挥作用。
给药可溶性辅助分子和辅助分子配体已经显示能够引发或关联不利的生理效应。例如，利用可溶性CD40L-CD8融合蛋白质治疗具有野生型CD40受体表达的小鼠导致了肺炎症的应答。这在CD40受体的基因已经除掉的小鼠中没有观察到。这些实验在Wiley，J.A.等人，免疫学杂志，158：2932-2938(1997)中已经叙述，支持体外的数据，表明CD40配体可以导致炎症应答。
如Tracey，K.J.，和A.Cerami，医学年评，45：491-503(1994)中所述，直接给药纯化的重组可溶性肿瘤坏死因子(α或β)导致休克和组织损伤。在急性的静脉内和动脉内给药TNF后几分钟内，休克综合症，组织损伤，毛细管渗漏综合症，氧不足，肺水肿，和多个器官失效结合高的死亡率接着发生。低剂量TNF的长期施用引起缺乏食欲，减重，失水和整个身体的蛋白质和脂的消耗。
可溶性Fas配体和受体也已经显示与组织损伤和其它不利效应相关。CD95，Fas受体，是细胞程序死亡的介导物。Fas配体通过结合Fas受体诱导了细胞程序死亡。如Galle，P.R.，等人，实验方法杂志，182：1223-1230(1995)中所示，给药竞争性抗Fas-抗体，导致了小鼠的肝损伤。利用竞争性抗体腹膜内注射的小鼠在几个小时内死亡，并且分析发现细胞程序死亡引起的严重肝损伤似乎是死亡的原因。
在Sato，K.等人，英国血液学杂志，94：379-382(1996)中叙述了在攻击性的淋巴瘤中的系统组织损伤的病理中，可溶性Fas配体(FasL)的作用。在这一报告中显示的发现结果表明可溶性FasL是与肝损伤和血细胞减少症的病理直接相关的。
在van Oers，等人，在血液82：3430-3436(1993)的报告中表明CD27，辅助分子配体CD70的受体是与B细胞恶性肿瘤相关的。
上面的发现都禁忌给药可溶性辅助分子配体，突出了增强这些分子的水平而没有导致它们的可溶形式的升高的治疗方法的需要。
尽管有很多有关辅助分子配体基因和它们在各种免疫细胞的表面的表达的资料，辅助分子配体基因在抗原呈现细胞上调节的准确机制仍然是未知的。没有在这些抗原呈现细胞上调节辅助分子配体基因的表达的特定知识，通过改变辅助分子配体基因改变免疫应答目前仍然是不可能的。没有关于怎样调节抗原呈现细胞上的辅助分子配体基因的表达的特定知识，改变对恶性肿瘤细胞的免疫应答是不可能。所以，需要增强正常和恶性肿瘤细胞包括抗原呈现细胞上的辅助分子配体基因的表达的方法。
另外，没有调节辅助分子配体的表达的能力，改变这些细胞的免疫去除是不可能的。
发明概要
本发明通过提供含有辅助分子配体基因的新表达载体和将这些基因导入正常和恶性抗原呈现细胞的方法从而改变免疫应答，治疗自身免疫疾病和治疗各种肿瘤，从而满足这些需要。本发明提供了载体，包括含有辅助分子配体基因的基因治疗载体。这些载体也含有其它遗传元件如启动子，增强子，多聚腺苷酸化信号(3i-末端)，这些元件允许将载体成功地放置在细胞内，指导细胞内辅助分子配体基因的表达。这样的基因治疗载体能够直接转化动物细胞，从而在该动物的细胞内以可以用于在细胞内生产辅助分子配体的形式导入辅助分子配体基因。
在本发明的其它方面，通过改变细胞表面的这种分子的半衰期或通过改变细胞表面的这种分子的表达水平修饰辅助分子配体的功能。在优选的的实施方案中，本发明提供被修饰的辅助分子配体以便提高这样的辅助分子配体在细胞表面的稳定性。利用本申请书中叙述的分子包括嵌合分子和至少在一个位点导入突变的分子的任何公开的方法可以实现这样的稳定性的增强。本发明也涉及增强这样的分子的表达。
本发明也提供含有辅助分子配体基因的基因治疗载体，这些辅助分子配体基因在起源于可能或可能不是来自不同种类的两个独立的辅助分子配体的基因的部分中是嵌合的。本发明的辅助分子配体基因包括编码肿瘤坏死因子(TNF)家族的分子的基因。组成TNF家族的分子包括TNFα，TNFβ，CD40配体，Fas配体，CD70，CD30配体，41BB配体(4-1BBL)，神经生长因子，和诱导TNF相关的细胞程序死亡的配体(TRAIL)。在本发明的一些实施方案中，本发明的嵌合辅助分子配体基因至少含有小鼠辅助分子配体基因部分以及起源于小鼠，人或其它种类的辅助分子配体基因部分。本发明的一些优选的实施方案利用了小鼠CD40配体基因和至少含有小鼠CD40配体基因的区段以及至少含有人CD40配体基因的区段的嵌合CD40配体基因。本发明涉及嵌合辅助分子配体基因，其中来自一个种类的辅助分子配体基因的区段已经与可任选地来自不同一个不同的种类的第二个辅助分子配体的区段相互变换。例如，在一个优选的实施方案中，小鼠CD40配体基因跨膜和细胞质区域已经附着于人CD40配体基因的细胞外区域。
本发明涉及能够直接感染人，哺乳动物，昆虫或其它细胞的基因治疗载体。这样的基因治疗载体的利用大大简化了在这些细胞中插入辅助分子配体基因。这些基因治疗载体可以在体内或体外感染需要的细胞并且对感染恶性细胞以维持生理配体的高水平表达特别有用。
本发明也涉及含有包括辅助分子配体基因和足够的为了在该细胞内表达辅助分子配体的遗传信息的基因治疗载体的动物，哺乳动物，和人细胞。在优选的实施方案中，本发明也涉及含有本发明的基因治疗载体或含有辅助分子配体基因以及启动子和3i-末端区的人肿瘤抗原呈现细胞。
本发明也涉及含有一种包括嵌合辅助分子配体基因的基因治疗载体的人细胞和人肿瘤细胞。本发明也涉及含有辅助分子配体基因，嵌合辅助分子配体基因，小鼠辅助分子配体基因，人辅助分子配体基因，本发明的基因治疗载体，本发明的载体，和嵌合辅助分子配体基因以及异源启动子，增强子或多聚腺苷酸化序列的细菌细胞或动物细胞。
本发明也涉及通过在人细胞中导入编码辅助分子配体基因的基因从而在这些人细胞的表面表达辅助分子配体，改变病人中的免疫应答或体内人细胞的免疫反应性的方法。这一方法包括作为基因治疗载体的部分的辅助分子配体基因或与异源或天然启动子，增强子或多聚腺苷酸化信号一起被导入。本发明的一些优选的实施方案利用了在人细胞中导入Fas的配体基因和嵌合Fas配体基因，如上面对CD40的构建的描述，以便改变它们的免疫反应性。本发明也包括在具有辅助分子的细胞中插入辅助分子配体基因的方法，该辅助分子配体与该辅助分子在细胞的表面结合。
本发明的改变免疫反应性的方法可用于所有类型的人，动物和小鼠细胞包括人肿瘤细胞如人淋巴瘤，白血病和其它恶性肿瘤。在优选的实施方案中，这一方法用于在病人的潜在的抗原呈现细胞中，或可以刺激近旁抗原呈现细胞的细胞中导入编码辅助分子配体的基因。这样的抗原呈现细胞包括单核细胞，巨嗜细胞，B细胞，郎氏细胞，交错突细胞，小结树突细胞，肝巨嗜细胞，和诸如此类。各种抗原呈现细胞可以作为病人中已知的恶性肿瘤的部分如白血病，淋巴瘤，急性单核细胞白血病(AML)，慢性淋巴细胞白血病(CLL)，急性骨髓单核细胞白血病(AMML)，急性骨髓单核细胞白血病(CMML)而存在，所以将包括能够对人或动物免疫系统呈现抗原或者能够刺激近旁抗原呈现细胞的任何细胞的所有肿瘤。本发明也涉及通过在病人中发现的任何数目的不同细胞，包括肌肉细胞，皮肤细胞，基质细胞，结缔组织细胞，成纤维细胞和诸如此类的细胞中导入编码本发明的辅助分子配体基因的基因调节免疫系统的方法。
本发明也涉及在病人或动物患者中治疗肿瘤的方法。在一个优选的实施方案中，该方法包括从人或动物患者中分离肿瘤细胞，并且在这些分离细胞中插入编码嵌合辅助分子配体或辅助分子配体的基因，以致在这些肿瘤细胞或其它体细胞的细胞表面上表达该分子。然后，将肿瘤细胞输回人或动物患者，并且参与增强免疫应答。
本发明也涉及辅助分子配体基因与编码肿瘤或癌特异抗原的基因一起共感染或共导入。然后，这一分子的联合在肿瘤细胞的表面表达，并且当这些细胞导入病人时引起快速的免疫应答，导致这些细胞的破坏。
本方法也包括在病人的肿瘤或肿瘤床中直接导入基因治疗载体或直接携带辅助分子配体基因的其它载体。在进入病人的肿瘤床后，基因治疗载体或其它载体进入存在于肿瘤或肿瘤床中的细胞，然后在这些细胞的表面上表达辅助分子配体基因。然后，这些细胞能够完全参与人的免疫或动物的免疫应答。
本发明也涉及增强对疫苗的免疫应答的方法。该方法是通过给动物施用一种疫苗使动物针对一种预先确定的有机体或抗原具有免疫性的，该疫苗具有一种含有辅助分子配体基因的遗传载体。本发明的其它实施方案包括通过施用两个独立的遗传载体接种动物，遗传载体中的一个含有来自所需的免疫性针对的生物体的抗原，通过分离靶动物的细胞和将这些细胞与一种编码至少一个来自预先确定的有机体的抗原的载体接触，使这些细胞表达该抗原，和将这些细胞也与在该动物的抗原呈现细胞表面表达辅助分子配体基因的不同载体接触来进行的。这两个独立的载体一起产生比单个抗原接种更强和更长的持久性的免疫性。
本接种方法可用于设计产生抗病毒，细胞，细菌和蛋白质或真菌的接种。本方法也用于抗各种癌症和肿瘤的免疫。在这些实施方案中，将所需的免疫性针对的肿瘤抗原与含有辅助分子配体基因的遗传载体一起导入动物。
本发明也涉及利用编码辅助分子配体的基因治疗载体治疗关节炎的方法。关节炎特别需要利用的是Fas配体分子，其中Fas活性的表达在关节中已经增强和/或在关节中的细胞上的Fas配体活性的稳定性增强。在其它实施方案中，本发明涉及利用嵌合辅助分子配体和嵌合辅助分子配体基因治疗关节炎的方法。本发明也涉及利用本发明的表达载体与Fas配体和包括嵌合分子的修饰的Fas配体一起进行体内和体外治疗关节炎的方法。
附图的简要说明
图1.图1是显示从序列数据推测的多个辅助分子配体基因和这些基因的I-IV区域的图。
图2.图2是显示嵌合辅助分子配体基因的例子的图。起源于小鼠辅助分子的部分用阴影部分表示。
图3.图3显示了在感染了含有编码这些分子的基因的基因治疗载体的Hela或CLL细胞的表面发现的小鼠或人CD40配体的量。图3A显示了未感染的Hela细胞(阴影)和感染了编码小鼠CD40配体的基因治疗载体的Hela细胞。图3B显示了未感染的Hela细胞(阴影)和感染了编码人CD40配体的基因治疗载体的Hela细胞。图3C显示了未感染的CLL细胞(阴影)和感染了编码小鼠CD40配体的基因治疗载体的CLL细胞。图3D显示了未感染CLL细胞(阴影)和感染了编码人CD40配体的基因治疗载体的CLL细胞。
图4.图4显示了在已经导入了含有辅助分子配体基因(小鼠CD40配体基因)的基因治疗载体的CLL细胞上CD54(图4B)和CD80(图4D)的表达增强的柱形图。阴影图表示在FACS分析中的对照染色，没有阴影的图表示用特异于CD54(图4A和4B)或CD80(图4C和4D)的单克隆抗体的染色。
图5.图5显示了在各种刺激方法的应答中通过异源T细胞的3H-TdR掺入量测量的细胞增殖。导入了含有表达辅助分子配体基因(小鼠CD40配体基因)的基因治疗载体的CLL细胞刺激异源T细胞增殖。
图6.图6显示了用含有辅助分子配体基因的CLL细胞刺激异源T细胞的γ干扰素(IFNg)的产生。
图7.图7显示了利用含有本发明的辅助分子配体基因的基因治疗载体治疗动物中的瘤。没有阴影的方快显示利用没有表达本发明的辅助分子配体的肿瘤细胞免疫的小鼠。在图的顶部以水平线表示表达本发明的辅助分子配体的肿瘤细胞免疫的小鼠，显示了没有发生死亡。
图8.图8显示了在CLL(上面的图)和正常血液单核细胞(下面的图)中的CD配体和CD40配体转录物的生产水平和稳定性。
图9.图9显示了在感染了辅助分子配体(CD40配体)的CLL B细胞中转基因表达的时间过程。根据左边的坐标上提供的量度，利用实线连接涂黑的圆圈表示利用PE标记的CD40配体染色的CD19+CLL细胞的荧光强度与利用PE标记的同种异型对照mAb染色同一细胞的荧光强度在每个时间点的MFIR(平均荧光强度比例)的比较。
图10.图10显示了在感染了含有辅助分子配体，CD40配体的基因治疗载体的CLL B细胞的表面抗原表现型中的变化。阴影的图形表示非特异对照抗体染色的未感染CLL(细线)细胞的染色，用细线画的没有阴影的图形表示利用FITC偶联的特异mAb染色的未感染CLL细胞，用粗线(标记的CD154-CLL)画的没有阴影的图形表示感染了辅助分子配体基因治疗载体和FITC偶联的特异mAb染色的CLL细胞。
图11.图11表示感染了含有辅助分子配体的基因治疗载体的CLL细胞产生的CD27的水平。图11A表示CD40L-感染的CLL(CD154-CLL)细胞表达的表面CD27的水平降低。没有阴影的图形表示未感染的CLL细胞(细线)或感染了FITC偶联的αCD27 mAb的CLL(粗线)各自的染色。图11B表示CLL B细胞产生的可溶性形式的CD27。
图12.图12表示了感染了含有辅助分子配体(CD40配体，也称为CD154)的基因治疗载体的CLL细胞诱导的异源T细胞应答。图12A表示了在利用含有辅助分子配体的CLL细胞刺激异源T细胞后，上清液中IFNg的浓度。图12B表示由掺入3H-胸腺嘧啶评估的细胞增殖。图12C和12D显示含有辅助分子配体的CLL诱导的二级异源T细胞应答。
图13.图13描绘了含有辅助分子配体，CD40配体或CD154，的CLL B细胞和对照诱导的自身T细胞应答。图13A表示了与CLL细胞共培养的自身T细胞掺入的3H胸腺嘧啶。图13B表示了与CLL细胞共培养的自身T细胞产生的人IFNg的水平。在图13C中，划出了含有辅助分子配体的CLL B细胞诱导的自身T细胞的CTL活性。
图14.图14显示了CTL对于自身CLL B细胞的特异性。在培养48小时后在上清液中评估IFNg浓度(图14A)，在培养3小时后，评估溶细胞活性(图14B)。在图14C中，在CTL测试之前在自身白血病靶细胞中加入mAb。
图15.图15表示了细胞间刺激在表达辅助分子配体的CLL细胞中观察到的表现型的变化中起了作用。在图15A中，显示了培养密度对利用含有分子分子配体(CD40配体，CD154)的基因治疗载体感染后诱导的CD54和CD80的表达的影响。阴影的图形表示利用FITC偶联的同种异型对照mAb染色的白血病B细胞。没有阴影的图形表示在高和低密度培养(箭头表示)，和利用特异于CD54或CD80的FITC偶联的mAb染色的CD154-CLL B细胞。图15B表示抗CD154 mAb对CD154-CLL细胞的激活。图15C和15D描述了表达辅助分子配体的CLL细胞诱导的近旁非感染CLLB细胞上免疫辅助分子的表达。阴影图形表示用PE偶联同种异型对照mAb的染色。
图16.图16显示了编码辅助分子配体的载体增强了在小鼠中的抗β-gal的免疫。图16A显示了接受肌肉内注射pCD40L载体的小鼠明显比注射非修饰pcDNA3载体或pCD40L的小鼠产生更多的抗β-gal的抗体。图16B，在d28收集的血清的系列稀释液的ELISA分析，表明共同注射placZ和pCD40L的小鼠比利用placZ+pcDNA3治疗的小鼠在d28时具有八倍高的抗β-gal抗体的平均效价。
图17.图17显示了对利用和没有利用编码辅助分子配体的载体，pCD40L肌肉内质粒DNA免疫的IgG1和IgG2a免疫应答的分析。在利用placZ和pcDNA3或placZ和pCD40L注射的小鼠的血清中IgG2a抗β-gal抗体比IgG1亚类抗体占优势。相反，利用β-gal蛋白质注射的BALB/c小鼠优先发展了IgG1抗β-gal抗体，并且没有可检测的IgG2a抗β-gal抗体。
图18.图18表示了利用编码辅助分子配体的载体，pCD40L在相同于placZ和不同于placZ的位点注射小鼠之间的比较。pCD40L的辅助作用需要利用placZ在同一位点注射。
图19.图19表示在真皮中共注射编码辅助分子配体的载体，pCD40L与placZ增强在BALB/c小鼠中的IgG抗β-gal应答。
图20.图20表示了编码辅助分子配体的载体，pCD40L增强了placZ诱导特异于同种同基因的b-gal表达的靶细胞的CTL的能力。已经接受placZ和pCD40L的注射的小鼠中取的脾细胞效应器细胞特异的裂解明显高于来自接受对照注射的小鼠的脾细胞。
图21.图21表示了在表达CD40的肺肿瘤细胞系中的人CD40L，但不是小鼠CD40L，的下调。
图22.图22A表示了在肺肿瘤细胞系中CD40结合诱导了肿瘤细胞表面标记CD95(Fas)，CD54(ICAM-1)，和MHC-I的表达增强。图22B表示CD40阳性肿瘤细胞下调了人CD40L。
图23.图23显示了在存在RA滑液液体时，淋巴细胞对Fas配体表达的抑制。
图24.图24表示对于B细胞CLL的辅助分子配体(CD40L)基因治疗的临床实验的概括图。
图25.图25表示了人Fas配体与小鼠Fas配体的区域III替代了人区域III的人Fas配体的序列排列。顶部的蛋白质序列是天然人Fas配体。区域III下面划线是点线。双划线表示推断的MMP裂解位点。底部的蛋白质序列是嵌合人-小鼠的Fas配体。人Fas配体的区域III替代了小鼠Fas配体的区域III(下面划点线)。数字对应于氨基酸序列号，使用数字1作为多肽序列的开始。编码氨基酸的密码子的第一个核苷酸碱基的序号是1+3×(n-1)，其中n是氨基酸序号。
图26.图26表示了人Fas配体与利用人CD70的区域III替代区域III的人Fas配体的序列排列。顶部蛋白质序列是天然人Fas配体，和底部序列是嵌合Fas配体，其中人CD70的区域III已经替代了Fas区域III。其它标记同样地如图25中所用。
图27.图27表示了人Fas配体与人CD70的区域III已经替代区域I的人Fas配体的序列排列。顶部的蛋白质是天然人Fas配体，底部蛋白质序列是嵌合Fas配体，其中已经利用人CD70的区域I替代了区域III。其它标记的利用如图25中一样。
图28.图28表示了如Smith，M.M.等人，生物化学杂志，270：6440-6449(95)和Nagase，H.，和G.B.Fields，生物多聚物(肽科学)40：399-416(96)中所述的在已知基质金属蛋白酶(MMP)裂解位点或周围的氨基酸，裂解位点是用箭头表示的。
本发明的详细说明
因此，本文引证的所有文献全部引入本文作为参考。
I.定义
“辅助分子配体基因”是编码所有或部分辅助分子配体的基因。该基因至少包括编码辅助分子配体的功能部分所需要的核苷酸序列。该基因可以任选地包括如启动子，增强子和3i-末端的遗传元件。该辅助分子配体基因是起源于肿瘤坏死因子(TNF)家族的成员的配体，包括CD40配体，Fas配体，CD70，TNFα，TNFβ，CD30配体，4-1BB配体(4-1BBL)，神经生长因子和诱导TNF相关的细胞程序死亡的配体(TRAIL)。如本文所用，术语“辅助分子配体基因”包括如下定义的嵌合辅助分子配体基因。
如本文所用，术语“恶性肿瘤细胞或肿瘤细胞”定义为在人病人或动物中发现的恶性肿瘤或癌细胞。恶性肿瘤或肿瘤细胞的优选的类型包括任何恶性抗原呈现细胞。在一些优选的实施方案中，这些恶性抗原呈现细胞至少在细胞表面具有低水平的CD40。
如本文所用，术语“肿瘤性人细胞”定义为肿瘤性的人细胞，包括但不限于抗原呈现细胞，任何具有抗原呈现细胞功能或具有促进抗原呈现功能的肿瘤细胞，肿瘤性单核细胞，肿瘤性巨嗜细胞，肿瘤B细胞，肿瘤性树突细胞，肿瘤性郎氏细胞，肿瘤性交错突细胞，或肿瘤性肝巨噬细胞和诸如此类的人细胞。肿瘤性人细胞的定义包括在病人的肿瘤床中与肿瘤细胞相关的那些细胞。通常，肿瘤性人细胞是抗原呈现细胞的白血病，淋巴瘤，AML，ALL，AMML，CML，CMML，CLL其它肿瘤或乳房，卵巢或肺肿瘤细胞。本发明也包括在体细胞中插入辅助分子配体基因或本发明的嵌合辅助分子配体基因。这些体细胞可以通过遗传工程的方法创建，通过这些方法将编码使这些细胞能够向免疫系统呈现抗原的基因导入这些细胞。
如本文所用，术语“嵌合基因”定义为其中的部分基因起源于第二个不同基因并与第一个基因进行组合的基因，以致至少每个基因的部分存在于得到的嵌合基因中。如果编码得到的蛋白质的序列的任何部分起源于第二个并且不同的基因，则该基因是嵌合的。典型的嵌合基因包括其中来自一个基因的特异功能区域被转移到第二个基因中并且替代第二个基因的相似区域的基因。例如，得到的嵌合基因可以具有起源于小鼠基因的一个区域和起源于人基因的几个区域。这些区域的大小范围可能在5个氨基酸到几百个氨基酸。嵌合辅助分子配体基因的其它例子包括含有编码在任何天然存在的辅助分子配体基因中没有发现的氨基酸的核苷酸的基因。嵌合基因和潜在的各种区域的联合的例子很多，本领域技术人员将会理解为了使一个基因成为嵌合基因，在第二个基因中必须存在的一个基因的量是没有限制的。
如本文所用，术语“小鼠CD40配体基因”定义为起源于小鼠CD配体基因的辅助分子配体基因。这样的小鼠CD40配体基因的例子包括Armitage等人，自然，357：80-82(1992)分离的基因，和起源于小鼠与Armitage等人所述的基因在低严格性杂交条件下杂交的其它基因。
如本文所用，术语“载体或遗传载体”定义为能够在生物体如细菌或动物细胞内复制其本身的核酸。典型的遗传载体包括通常用于重组DNA技术的质粒和能够在细菌或动物细胞内复制的各种病毒。遗传载体的优选的类型包括质粒，噬菌体，病毒，逆病毒，和诸如此类。
如本文所用，术语“基因治疗载体”定义为能够直接感染动物如病人体内细胞的遗传载体。在文献中已经叙述的许多基因治疗载体，包括Cantwell等人，血液，在题目为“腺病毒载体感染慢性淋巴细胞的白血病B细胞”的出版物(1996)中叙述的基因治疗载体。这样的载体例如在Woll，P.L.和I.R.Hart，癌症学年刊，6Suppl1：72(1995)；Smith，K.T.，A.J.Shepherd，J.E.Boyd，和G.M.Lees，基因治疗，3：190(1996)；Cooper，M.J.，癌症学讨论会，23：172(1996)；Shaughnessy，E.，D.Lu，S.Chatterjee，和K.K.Wong，癌症学讨论会，23：159(1996)；Glorioso，J.C.，N.A.DeLuca，和D.J.Fink，微生物学年评，49：675(1995)；Flotte，T.R.和B.J.Carter，基因治疗，2：357(1995)；Randrianarison-Jewtoukoff，V.和M.Perricaudet，生物学，23：145(1995)；Kohn，D.B.，最新儿科学评论，7：56(1995)；Russell，S.J.，癌症生物学讨论会，5：437(1994)；和Ali，M.，N.R.Lemoine，和C.J.Ring，基因治疗，1：367(1994)中描述的载体。本文引证的所有参考文献引入本文作为参考。
II.含有辅助分子配体基因的遗传载体和构建体
A.辅助分子配体基因
在本发明的一个实施方案中，优选的基因治疗载体含有辅助分子配体基因。这一辅助分子配体基因可以起源于任何来源并且可以包括人工的并且自然界中似乎是不存在的分子。本发明包括起源于编码肿瘤坏死家族(TNF)内的分子的基因的辅助分子配体基因，这些基因包括编码小鼠CD40配体，人CD40配体，Fas配体，TNFα，TNFβ，CD30配体，4-1BB配体，神经生长因子，CD70，诱导TNF相关的细胞程序死亡的配体(TRAIL)和嵌合辅助分子配体的基因。一个辅助分子配体的核苷酸序列，小鼠CD40配体基因的至少一种形式的序列已被确定，并列于SEQ ID NO：1。本发明包括与SEQ ID NO：1中存在的序列同源，因此与这一序列在低严格性的杂交条件下杂交的任何辅助分子配体基因的应用。本领域技术人员将理解的是用于本发明的辅助分子配体基因，包括小鼠CD40配体基因，可以从各种不同的小鼠品系中分离。
人CD40配体基因的核苷酸序列已被确定并示于SEQ ID NO：2。本发明包括与SEQ ID NO：2同源，因此与这一序列在低严格性条件下杂交的任何辅助分子配体基因的应用。本领域的一个普通技术人员将理解的是用于本发明的辅助分子配体基因，包括人CD40配体基因，可以根据基因从其中分离的个体而变化，这样的变化性已被证明可用于生产独特的辅助分子配体基因。本发明包括人CD40配体和/或人CD40配体基因的区域，亚区域，氨基酸和核苷酸序列在作为嵌合辅助分子配体或嵌合辅助分子配体基因中的用途。
已经确定了小牛CD40配体基因的核苷酸序列并示于SEO ID NO：8。本发明包括与SEQ ID NO：8同源，因此与该序列在低严格性条件下杂交的任何辅助分子配体基因的用途。本领域的普通技术人员将理解的是辅助分子配体基因，包括小牛CD40配体基因，将根据基因从其中分离的动物个体而变化，并且这样的变化性已被证明可用于生产独特的辅助分子配体基因。
人TNFα和人TNFβ的核苷酸序列已被确定，并且分别表示为SEQ IDNO：9和10。本发明包括任何与人TNFα或人TNFβ(SEQ ID NO：9和10)同源，因此与这些序列在低严格性条件下杂交的辅助分子配体基因的用途。在本发明中使用的辅助分子配体基因，包括人TNFα和人TNFβ基因，可以根据基因从其中分离的特定个体而变化，已经证明这些变化在生产独特的辅助配体基因中是有用的。
已经确定了猪TNFα和TNFβ的核苷酸序列并且表示为SEQ ID NO：11。本发明包括任何与SEQ ID NO：11同源，因此将与这些序列在低严格性条件下杂交的任何辅助分子配体基因的用途。本领域的普通技术人员将理解的是辅助分子配体基因，包括猪TNFα和TNFβ基因，可以根据基因从中分离的特定动物而变化，并且可以证明这样的变化在生产独特的辅助分子配体基因中是有用的。
已经确定了小鼠的TNFα基因的核苷酸序列并且表示为SEQ ID NO：12。本发明包括任何与SEQ ID NO：12同源，因此与该序列在低严格性条件下杂交的辅助分子配体基因的应用。本领域的普通技术人员将理解的是辅助分子配体基因，包括小鼠TNFα基因，可以根据从中分离的个体而变化，并且可以证明这些变化在生产独特的辅助分子基因中有用。
已经确定了人Fas配体和小鼠(C57BL/6)Fas配体的核苷酸序列，并且分别表示为SEQ ID NO：13和14。小鼠的Balb/c Fas配体的核苷酸序列表示为SEQ ID NO：31。本发明包括任何与SEQ ID NO：13，14和31的任何一个同源，因此与该序列在低严格性条件下杂交的辅助分子配体基因的用途。本领域的普通技术人员将理解的是辅助分子配体基因，包括人Fas配体或小鼠Fas配体基因，可以根据基因从中分离的特定的个体或动物而变化，并且可以证明这样的变化在生产任何辅助分子基因中是有用的。
已经确定了人CD70基因的核苷酸序列并且表示为SEQ ID NO：15。小鼠CD70基因序列也已经确定，并且表示为SEQ ID NO：36，并且在Tesselaar等人，免疫学杂志，159：4959-65(1997)中叙述了。本发明包括任何与SEQ ID NO：15或36同源，因此与该序列在低严格性条件下杂交的辅助分子配体基因的用途。本领域技术人员将理解的是辅助分子配体基因，包括人CD70基因，将根据基因从中分离的个体而变化，可以证明这些变化在生产独特的辅助分子配体基因中的有用。
已经确定人CD30配体基因的核苷酸序列，并且表示为SEQ ID NO：16。本发明包括任何与SEQ ID NO：16同源，因此与该序列在低严格性条件下杂交的辅助分子配体基因的应用。本领域技术人员将理解的是辅助分子配体基因，包括人CD30配体基因，可以根据基因从其中分离的个体而变化，并且可以证明这样的变化可用于生产独特的辅助分子配体基因。
本发明也包括本文提供的辅助分子配体基因的核苷酸序列的变化和变异体，这些变化是由信息RNA的旁路剪接引起的。信息RNA的旁路剪接插入了其它核苷酸序列，这些序列可以编码一个或多个可任意选择的氨基酸区段，这些区段本身使被编码的辅助分子配体具有其它特性或功能。
已经确定了人和小鼠4-1BBL的核苷酸序列并且分别表示为SEQ IDNO：17和18。本发明包括与SEQ ID NO：17或18的任何一个同源，因此与这些序列在低严格性条件下杂交的任何辅助分子配体基因的用途。本领域技术人员将理解的是辅助分子配体基因，包括人4-1BBL基因，可以根据基因从中分离的个体而变化，并且可以证明这样的变化在产生独特辅助分子配体基因中有用。
本发明也涉及含有下面基因：小牛TNF-α(SEQ ID NO：21)，小鼠CD40配体(SEQ ID NO：22)，人神经生长因子-β(SEQ ID NO：23)，小鼠神经生长因子(SEQ ID NO：24)，大鼠Fas配体(SEQ ID NO：25)，人TNF-相关细胞程序死亡诱导配体(TRAIL)(SEQ ID NO：41，基因库登记号U37518)，小鼠TNF相关细胞程序死亡诱导配体(TRAIL)(SEQ ID NO：42，基因库登记号：U37522)，小鼠CD30-配体(SEQ ID NO：43)，人4-1BBL(SEQ IDNO：17)，和小鼠4-1BBL(SEQ ID NO：44和18)编码的含有任何区域，亚区域部分或氨基酸序列的嵌合辅助分子。本发明也包括利用编码与这些序列同源的氨基酸序列的基因的嵌合辅助分子。
本发明包括由起源于一个辅助分子配体基因的核苷酸区段和可操纵地连接的起源于不同辅助分子配体基因或其它基因的核苷酸序列组成的嵌合辅助分子配体基因。
例如，涉及的嵌合辅助分子配体基因由小鼠CD40配体基因的区段组成，该小鼠CD40配体基因区段已经可操作地连接至少一个其它的起源于不同辅助分子配体基因的基因区段。起源于不同辅助分子配体基因的特定区段的大小可以在编码几个氨基酸，辅助分子配体的亚区，辅助分子配体的区域，或多于辅助分子配体的区域的核苷酸序列中变化。本发明的其它嵌合辅助分子是由其中插入了编码不是天然存在的辅助分子配体的一部分的氨基酸区段的核苷酸的辅助分子配体基因组成的。这一氨基酸区段可以是人工产生的，或起源于自然界发现的蛋白质。该嵌合辅助分子配体基因编码嵌合氨基酸序列，并且因此编码的嵌合辅助分子配体除了起源于不同辅助分子配体基因的各个区段上发现的特性之外还可以具有独特的特性。该嵌合辅助分子配体基因可以编码一种辅助分子配体，该配体具有起源于用于构建该嵌合基因的辅助分子配体的特性。
属于肿瘤坏死因子家族的成员的每个辅助分子配体基因具有相似的二级结构，该二级结构由许多区域组成。这一区域结构包括一个第一个区域，该第一区域是辅助分子配体基因的5i-区编码的。第二个区域(区域II)是含有跨越细胞膜的氨基酸的区域，因此称为跨膜区域。第三个区域是近端细胞外区域，这些氨基酸存在于细胞膜的近端。第四个区域(区域IV)是由辅助分子配体基因的3i-末端编码的，被称为远端细胞外区域。远端细胞外区域(IV)通常组成了肿瘤坏死因子家族分子的可溶形式。根据人TNF的X射线晶体结构，M.Peitsch和C.Jongeneel，国际免疫学5：233-238(1993)已经推断了辅助分子，CD40配体的预测二级结构以及这些分子的区域结构。利用计算机分析以及比较人TNF和CD40配体区域结构推断了肿瘤坏死因子家族的其它成员的二级结构。在表I，表示了一些辅助分子配体基因的区域边界。在图1中表示了一些这些辅助细胞分子配体的这些区域的图。区域边界的分派是大约的，本领域技术人员将理解的是这些边界可以变化并且仍然可用于对区域的辨别。
                                    表1
                       肿瘤坏死因子家族分子 * 的区域结构
    区域1(细胞质)     区域II(跨膜)     区域III(近端细胞外)     区域IV(远端细胞外)
人CD40配体     1-42     43-135     136-330     331-786
小鼠CD40配体     1-42     43-135     136-327     328-783
小牛CD40配体     1-42     43-135     136-330     331-786
人TNF-α     1-87     88-168     169-228     229-699
小鼠TNF-α     1-87     88-168     169-237     238-705
猪TNF-α     1-87     88-168     169-228     229-696
人TNF-β     1-39     40-129     130-153     154-615
猪TNF-β     1-39     40-126     127-150     151-612
人Fas配体     1-237     238-315     316-390     391-843
小鼠Fas配体     1-237     238-309     310-384     385-837
人CD70小鼠CD70     1-611-73     62-11774-123     118-132124-138     133-579139-585
人CD30配体小鼠CD30配体     1-1171-135     118-186136-201     187-240202-255     241-702256-717
人4-1BBL小鼠4-1BBL人TRAIL小鼠TRAIL     1-691-2371-391-51     70-174238-33340-11752-111     175-210334-369118-375112-387     211-762370-927376-843388-873
*上面的区域是使用cDNA的起始甲硫氨酸的第一个核苷酸作为第1号核苷酸，由每个区域的核苷酸边界标定的。
本领域技术人员将理解的是典型的嵌合辅助分子基因包括通过在例如小鼠CD40配体基因和人CD40配体基因之间交换区域或亚区区段产生的基因。例如，通过可操作地连接人CD40配体基因的区域I到小鼠CD40配体基因的区域II-IV可以构建辅助分子基因。本领域技术人员将理解，使用表I中所示的辅助分子可以产生各种各样的嵌合辅助分子配体。本发明也包括表I中没有显示，但表明具有相同的区域结构的嵌合辅助分子。本发明也包括其它的嵌合基因，其中小的区段(或亚区区段)在，例如，小鼠CD40配体基因和人CD40配体基因或第二个小鼠CD40配体基因之间交换。本领域技术人员将理解，编码辅助分子的基因将至少具有对应于辅助分子配体如小鼠CD40配体基因(SEQ ID NO：1)的各种功能区段的基因区段。对于本领域技术人员同样明了的是在表I中标定的核苷酸边界可以与用于识别小鼠CD40配体基因(SEQ ID NO：1)的那些有很大的差异，并且仍然可用于限定可用于本发明的区段。
在一个优选的实施方案中，嵌合辅助分子配体基因是由与编码跨膜(区域II)的核苷酸可操作连接的编码人CD40配体的细胞外区域(区域III和IV)的核苷酸，和编码小鼠CD40配体基因的细胞质区域(区域I)的核苷酸组成的。这样的优选的嵌合辅助分子的例子表示在图2。这样的基因的核苷酸序列的例子是SEQ ID NO：7。在本发明的其它嵌合辅助分子配体基因中，编码小鼠CD40配体基因的细胞外区域(区域III和IV)的核苷酸可以可操作地连接编码人CD40配体基因的跨膜(区域II)和细胞质区域(区域I)的核苷酸。这样的基因的核苷酸序列的例子是SEQ ID NO：3。在本发明的其它优选的嵌合辅助分子配体基因中，编码人CD40配体的细胞外区域(区域III和IV)和跨膜区(区域II)的核苷酸与编码小鼠CD40配体基因的细胞质区域(区域I)的核苷酸偶联。这样的基因的核苷酸序列的例子是SEQ ID NO：6。本发明涉及的其它嵌合辅助分子基因包括编码小鼠CD40配体细胞外区域(区域III和IV)和细胞质区域(区域I)的核苷酸与编码人CD40配体的胞质区域基因的核苷酸可操作地连接。这样的基因的核苷酸序列例子是SEQID NO：5。本发明涉及其它嵌合辅助分子配体基因，其中人CD40配体基因细胞外区域(区域III和IV)可操作地连接小鼠CD配体基因跨膜区(区域I)，该区域可操作地连接人CD40配体基因细胞质区域(区域I)。这样的基因的核苷酸序列的例子是SEQ ID NO：4。
本领域的普通技术人员将理解利用任何辅助分子配体基因包括人CD40配体基因和小鼠CD40配体基因的区域或其它选择区段的许多结合是可能的。这样的其它嵌合辅助分子基因将包括下面的基因：嵌合辅助分子基因，其中编码区域I的核苷酸选自特定的辅助分子配体基因并且直接或通过其它核苷酸序列可操作地连接编码来自特定的辅助分子配体基因的区域II的核苷酸。然后，这些区域直接或通过其它核苷酸序列可操作地连接编码来自特定的辅助分子配体基因的区域III的核苷酸。然后，这一分子就直接或通过其它核苷酸序列可操作地连接编码特定的辅助分子配体基因的区域IV的核苷酸。以这种方式构建的嵌合辅助分子配体基因在末端或区域之间可能具有其它核苷酸，用于在这些位点提供不同氨基酸。本领域普通技术人员将理解的是这些特定的联合仅是为了说明，并且可能设想许多其它的联合，其中在不同辅助分子之间交换了含有编码小于辅助分子的整个区域的核苷酸的基因区段。
本发明也涉及由小鼠或人CD40配体的基因区段结合了起源于Fas配体，TNFα，TNFβ，CD70，CD30L，4-1BBL，神经生长因子或TNF相关的细胞程序死亡诱导配体(TRAIL)的基因区段组成的嵌合辅助分子配体基因。特别有用的嵌合辅助分子配体基因至少含有一个起源于小鼠CD40配体基因的基因区段以及起源于不同辅助分子配体基因的基因区段。
本发明也涉及嵌合辅助分子配体基因，其中产生的辅助分子已经修饰被除去了嵌合辅助分子内的氨基酸，这些被应用于翻译后的机制中以便调节特定细胞上的辅助分子或辅助分子蛋白质的表达水平。从嵌合辅助分子或嵌合分子中除去的位点可以包括组成蛋白酶裂解位点的氨基酸或位点，这些位点包括金属硫蛋白蛋白酶，丝氨酸蛋白酶和其它蛋白酶，这些蛋白酶特异地或非特异地识别氨基酸序列。在特别优选的实施方案中，已经修饰或除去了组成翻译后调节机制利用的潜在或真正识别位点的区域III中的氨基酸。
本发明也涉及这样的嵌合辅助分子配体基因，其中已经从一个辅助分子配体基因取出区域，亚区片断或其它氨基酸残基，并且转移到来自相同种类的第二个辅助分子配体基因中。在一特定的实施方案中，例如，来自CD40配体分子的人区域I，和人区域II可以可操作地连接编码来自例如CD70分子的人区域III的核苷酸，该人区域III本身可操作地结合CD40配体分子的人区域IV。所以，这一嵌合辅助分子含有人CD40L区域I，II和IV和人CD70区域III。这样的基因的核苷酸序列的例子是SEQ ID NO：19。本领域技术人员将理解的是，利用来自同样种类的不同辅助分子配体基因的区域的联合，可以产生具有特定的活性和特性的许多嵌合辅助分子基因。
本发明涉及嵌合辅助分子配体基因，其中特定的辅助分子配体基因的区域III已经被来自不同的辅助分子配体基因的区域III替代。在一个特定的优选的实施方案中，小鼠区域III被用于替代CD40配体分子中的人区域III。所以这一嵌合辅助分子含有人CD40L区域I，人CD40L区域II，小鼠CD40L区域III，和人CD40L区域IV。这样的基因的核苷酸序列的例子是SEQ ID NO：20。
本发明也涉及含有人工氨基酸序列的嵌合辅助分子的用途，该人工氨基酸序列插入在或替代了辅助分子基因的区域或其它氨基酸序列。通过选择可以用于给予辅助分子特定的功能或除去另一个不需要的功能的任何氨基酸序列可以选择这些人工的氨基酸区段。通过在辅助分子配体基因或嵌合辅助分子配体基因中插入在需要的位置编码这些特定的人工氨基酸区段需要的核苷酸序列，可以产生这些人工氨基酸区段。另外，嵌合辅助分子配体基因可以含有包括其它分子的亚区区段或为了所需的目的氨基酸已被改变的小区段的核苷酸区段。亚区核苷酸区段的应用允许在本发明的嵌合辅助分子中导入起源于其它分子的短氨基酸序列。在辅助分子配体中导入这样的短亚区区段或氨基酸变化允许导入该分子需要的特征或去除不需要的特征。
辅助细胞分子内的区域结构的鉴定是本领域已知的，并且通常需要鉴定辅助分子内的半胱氨酸残基，并随后鉴定各个半胱氨酸残基之间的二硫键的图谱。辅助分子的各种亚区区段的图谱是本领域已知的，包括辅助分子的氨基酸序列的分析，并且通常包括组织坏死因子的晶体结构的比较和利用推测的算法因此产生嵌合辅助分子或辅助分子的推测的结构。然后，这些分子的这一推测的结构可被用于选择待用于构建其它嵌合辅助分子的分子的各种亚区部分。这样的图谱研究的例子包括M.Pitsch和C.V.Jongneel，国际免疫学，5：233-238(1993)的研究和图1表示的分析。
本发明也涉及截短的和编码小于天然辅助分子配体中发现的全长氨基酸序列的辅助分子配体基因和嵌合辅助分子配体基因。这些截短可以改变辅助分子配体基因的特性但保留了一些鉴定的活性。可以通过从辅助分子基因中除去基因区段或一些基因区段进行这样的截短，并且通常通过除去没有直接参与辅助分子配体与它的辅助分子的结合的核苷酸编码区进行的。这些截短的辅助分子配体基因或嵌合截短的辅助分子配体基因可以进一步含有编码氨基酸区段的基因区段或替代从截短的辅助分子基因中除去的区域的区域。但是，通过截短除去的辅助分子的部分的这样的替代不是必须的。
利用标准基因工程方法，可操作地连接特定的来自一个辅助分子配体基因的特定的核苷酸序列与起源于相同或不同辅助分子配体基因的不同核苷酸序列可以构建本发明的嵌合辅助分子基因。另外，标准的遗传工程方法可以用于在嵌合辅助分子配体基因中插入人工核苷酸序列或亚区核苷酸序列。本领域技术人员将理解的是各种方法可以用于生产这样的嵌合辅助分子基因。例如，已知为“SOEN”的基因转化方法可以用于生产含有起源于不同嵌合辅助分子的核苷酸区段的嵌合辅助分子基因。用于这一基因转化方法的方法是本领域已知的，并且已经例如在Horton，R.M，分子生物技术，3：93(1995)；Ali，S.A.和A.Steinkasserer，生物技术，18：746(1995)；Vilardaga，J.P.，E.Di Paolo，和A.Bollen，生物技术，18：604(1995)；Majumder，K.，F.A.Fattah，A.Selvapandiyan和R.K.BhATNAGAR，PCR方法应用，4：212(1995)；Vallejo，A.N.，R.J.Pogulis，和L.R.Pease，PCR方法应用，4：S123(1994)；Henkel，T.和P.A.Baeuerle，生物化学年评，214：351(1993)；Tessier，D.C.和D.Y.Thomas，生物技术，15：498(1993)；Morrison，H.G.和R.C.和G.F.Joyce，PCR方法应用，2：28(1992)；和Stappert，J.，J.Wirsching，和R.Kemler，核酸研究，20：624(1992)中叙述了。或者，本领域技术人员将理解的是位点特异诱变可以用于在特定的核苷酸序列中导入变化以便直接产生或间接用于生产本发明的嵌合辅助分子基因。例如，BioRad实验室提供的诱变剂试剂盒可以与试剂盒内叙述的方法和方案一起使用，以便在核苷酸序列中产生需要的变化。美国科学院院刊，82：488-492(1985)和Kunkel等人，分子酶学方法，154：367-382(1987)最初叙述了这些方法。通过利用本文叙述和本领域已知的位点特异诱变方案，熟练的研究者可以诱导个别的核苷酸变化，导致改变的氨基酸序列，或保持氨基酸序列，但在该基因中导入需要的限制性酶识别序列。然后，这一新限制性内切酶识别位点可以用于在特定的点裂解基因并且将它用于另一个辅助分子配体基因的基因或区段。除了这些方法，本领域技术人员将理解的是利用本领域已知的合成方法可以合成完整的嵌合辅助分子配体基因。这一方法仅需要熟练的技术人员生产嵌合辅助分子配体基因的核苷酸序列，并且提供该序列给能够合成这样的基因的公司。
B.遗传构建体
本发明涉及存在于各种类型的遗传载体的辅助分子配体基因或嵌合辅助分子配体基因的用途。遗传载体指在细胞中能够自我复制的DNA分子，在该细胞中可以插入另一个DNA区段导致复制其它的DNA区段。能够表达包含在该载体中的基因的载体称为“表达载体”。所以，本发明的遗传载体和表达载体是至少含有两个在自然界不是正常发现在一起的核苷酸序列的重组DNA分子。
用于本发明的遗传载体含有编码辅助分子配体的辅助分子配体基因，该基因与适当的转录或翻译调节核苷酸序列。如起源于哺乳动物，微生物，病毒或昆虫基因的一个非强制性地可操作地连接。这样的调节序列包括在基因表达中具有调节作用的序列，如转录启动子，或增强子，控制转录的操纵子序列，编码信息RNA内的核糖体结合位点的序列，和控制转录，翻译起始或转录终止的适当序列。
特别有用的调节序列包括来自各种哺乳动物，病毒，微生物和昆虫基因的启动子区域。启动子区指导基因转录的起始并且导致通过和包括辅助分子配体基因的DNA的转录。有用的启动子区包括在劳斯肉瘤病毒(RSV)中发现的启动子-长终端重复(LTR)，人细胞肥大病毒(HCMV)增强子/启动子区lac启动子，和从腺病毒分离的启动子，和其它本领域技术人员已知的启动子，这些启动子将理解可用于真核生物，原核生物，病毒或微生物细胞中的基因表达。其它启动子是特别可用于在真核细胞中表达基因和蛋白质的启动子，这些启动子包括哺乳动物启动子序列和增强子序列，如那些起源于多聚物的病毒，腺病毒，猿猴病毒40(SV40)，和人巨细胞病毒。特定的用途是早期和后期启动子，通常发现在病毒如SV40中的复制病毒原点的邻近处。在Okiama和Berg(分子细胞生物学，3：280，1983)中已经叙述了已经用于表达载体的各种启动子的例子，Kossman等人，自然312：768(1984)叙述的pMLSVN SV40。一个普通技术人员理解的是选择特别有用的启动子取决于准确的细胞系和其它遗传构建体的各种参数，构建体待用于表达特定的细胞系中辅助分子配体基因或嵌合辅助分子配体基因。另外，一个普通技术人员将选择已知在靶细胞中以足够高水平表达基因的启动子，待用于本发明。
本发明的遗传载体和表达载体可任选地含有各种其它调节序列包括核糖体结合位点，允许有效地将产自表达载体的信息RNA翻译成蛋白质，编码各种可操作地连接辅助分子配体基因或嵌合辅助分子配体基因的信息肽的DNA序列。如果存在，信号肽作为前体氨基酸表达，前体氨基酸能够提高翻译融合多肽的细胞外分泌。
所以，本发明涉及的遗传构建体包括如上所述的各种形式的辅助分子配体基因，这些配体基因可操作地连接到启动子序列或启动子和增强子序列并且也可操作地连接多聚腺苷酸化序列，这些序列可以指导信息RNA的终止和多聚腺苷酸化。同时涉及的是本发明的遗传构建体将含有其它遗传序列，这些序列允许有效在需要的细胞内有效地复制和表达该构建体。这样的序列可以包括起源于天然辅助复制配体基因，例如来自病毒基因的内含子。
本发明也涉及能够直接感染哺乳动物的基因治疗载体，以致在细胞中导入需要的辅助分子配体基因或嵌合辅助分子配体基因。这些基因治疗载体可用于直接感染细胞，这些细胞已经从动物或病人中分离，或可以直接导入动物或病人，因此直接感染动物或病人中需要的细胞。
许多类型的基因治疗载体能够成功地转移基因，并且引起需要的外源DNA序列的表达，这些载体已经得到开发和在本文献中叙述了。例如，在Current Comm.Mol.Biol.，冷泉港实验室，纽约(1987)该文章的题目是“哺乳动物细胞的基因转移载体”的文章中。另外，通过任何技术的转染包括磷酸钙转染(Berman等人，美国科学院院刊，81：7176(1984))，DEAE-Dextran转染原生质体融合(Deans等人，美国科学院院刊，81：1292(1984))，电穿孔，脂质体融合，1，5，-二甲基-1，5-二氨十一亚甲基聚甲溴化物转染的转染方法和通过细胞膜的激光微穿孔，可以物理地在包括人细胞的真核细胞中导入裸露的DNA。另外，本领域技术人员将理解的是能够成功地以这样的方式在细胞中导入DNA的任何技术允许它整合到细胞的基因组中，并且允许将用于本发明的需要的基因的表达。
特定地，已经广泛地叙述了利用来自基因递送的重组感染病毒颗粒的基因治疗载体。参见例如，Brody，S.L.和R.G.Crystal.纽约学术科学年评，716：90(1994)；Srivastava，A.，血液细胞，20：531(1994)；Jolly，D.，癌症基因治疗，1：51(1994)；Russell，S.J.，当前癌症杂志，30A：1165(1994)；Yee，J.K.，T.Friedmann，和J.C.Burus，细胞生物学方法，43 PtA：99(1994)；Boris-Lawrie，K.A.和H.M.Temin，当前遗传发展评论。3：102(1993)；Tolstoshev，P.，药物毒性年评，33：573(1993)；和Carter，B.J.，当前生物技术评论，3：533(1992)。本发明涉及利用基因治疗载体以便通过在细胞中导入编码辅助分子配体基因或嵌合辅助分子配体基因的基因进行本发明需要的方法过程。许多病毒载体已经确定和用作基因治疗载体，并且包括起源于猿猴病毒40(SV40)，腺病毒，腺相关病毒和逆病毒的病毒载体。本领域技术人员将理解的是有用的基因治疗载体是能够在靶细胞中直接导入编码辅助分子配体的DNA的载体，并且允许DNA保持在细胞中，以致以需要的方式在细胞内表达辅助分子配体。
本发明的基因治疗载体可用于在各种哺乳动物细胞中包括人细胞中导入辅助分子配体基因。基因治疗载体感染的特定的细胞将取决于各种载体的特异性并且这样的载体可用于在造血或淋巴主干细胞，抗原呈现细胞，胚胎主干细胞和其它能够在免疫系统，包括在表面具有CD40的细胞内存在抗原的其它细胞中导入本发明的辅助分子配体基因。另外，这样的基因治疗载体能够在人肿瘤细胞如淋巴瘤，白血病，AML，CLL，CML，AMML，乳房癌，肺癌，卵巢癌或其它能够作为抗原呈现细胞或可以刺激旁抗原呈现细胞的细胞中导入编码辅助分子配体基因的基因。另外，涉及的基因治疗载体可以用于在已经工程化使细胞能够表现免疫系统的抗原的细胞中导入本发明的辅助分子配体基因。
III. 含有编码辅助分子配体或嵌合辅助分子配体的遗传构建体的细胞
本发明也涉及含有本发明的遗传构建体的各种细胞。这些细胞含有编码辅助分子配体基因的构建体，因此含有上面的部分II.B.中叙述的各种遗传元件。这些细胞可以是微生物细胞，真核细胞，昆虫细胞，和各种哺乳动物细胞包括人细胞。在本发明的优选的实施方案中，这些细胞包括各种肿瘤细胞包括人肿瘤细胞。这些肿瘤细胞可以是任何细胞类型并且包括免疫系统细胞和其它血液细胞。特别优选的是任何肿瘤细胞，可以起免疫系统内抗原呈现细胞的作用，肿瘤细胞可以通过表达本发明的转基因辅助细胞分子刺激旁抗原呈现细胞。通常能够对免疫系统呈现抗原的这些肿瘤性转化已经在细胞表面具有辅助分子如CD40分子。通常，这些细胞是天然能够对免疫系统呈现抗原的，但本发明也涉及在细胞中导入辅助分子配体基因，这些细胞不是天然能够对免疫系统呈现抗原的，但已经遗传工程化使细胞能够对免疫系统呈现抗原。通常这些细胞包括各种已知细胞类型如单核细胞，巨噬细胞，B细胞，郎氏细胞，交错突细胞，小结树突细胞，或肝巨嗜细胞和诸如此类已经变成肿瘤性转化的细胞。另外，本发明也涉及来自含有如上所述的遗传构建体的各种癌症，胸，乳房和肺癌症。在其它优选的实施方案中，本发明的辅助分子配体基因放置在可以注射进入处理位点如肿瘤床或关节的细胞中。例如，可以将本发明的辅助分子配体基因插入成纤维细胞，并且辅助配体在该细胞的表面表达。然后，将成纤维细胞注射进入处理位点，并且导致需要的免疫效应，因为在这些细胞的表面存在辅助分子配体。这些细胞刺激了存在处理位点的其它免疫细胞(旁细胞)。然后，这一过程导致免疫系统上需要的效应。
IV.利用遗传载体和含有辅助分子配体基因的构建体的方法
本发明涉及利用方法改变人细胞的免疫反应性的方法，方法包括在人细胞中导入编码辅助分子配体基因的基因以致在这些细胞表面上表达该基因编码的辅助分子配体。本发明可用于参与免疫反应的任何细胞，这些人细胞可作为免疫系统的靶或作为对应于外源靶的免疫系统的一部分。涉及的许多种方法中，最后的结果是在需要的细胞中导入辅助分子配体基因。这些方法包括来自体内的方法，体内的方法和各种其它方法，这些方法包括将DNA，遗传载体或基因治疗载体注射进入动物或人，包括直接注射进入存在于动物或人的肿瘤床。
涉及的来自体内的方法中，辅助分子配体基因待导入的细胞是从动物或病人中分离的，然后在这些利用适当的方法分离的细胞中导入该基因。例如，Raper，S.E.，M.Grossman，D.J.Rader，J.G.Thoene，B.J.Clark，D.M.Kolansky，D.W.Muller，和J.M.Wilson，外科学年评，223：116(1996)；Lu，L.，R.N.Shen，和H.E.Broxmeyer，Crit.Rev.Oncol.Hematol.，22：61(1996)；Koc，O.N.，J..A.Allay，K.Lee，B.M.Davis，J.S.Reese，和S.L.Gerson，癌症学讨论会，23：46(1996)；Fisher，L.J.和J.Ray，当前神经生物学评论，4：735(1994)，和Goldspiel，B.R.，L.Green，和K.A.Calis，临床药物学，12：488(1993)中已经叙述了有用的来自体内的方法的例子。D.Dilloo等人，在血液学90：1927-1933(1997)叙述了利用CD40L活化细胞治疗B急性原淋巴细胞白血病(ALL)的方法。它们共培养了编码CD40L的逆病毒载体感染的白血病细胞和成纤维细胞，然后将细胞混合物注射进入小鼠。如果细胞取自人，这样的途径将与本文涉及途径的区别在于治疗细胞在体内受到另一个表达辅助分子配体的细胞系的体外刺激。Schultze，J.L.等人，在血液89：3806-3816(1997)叙述了通过在体内将对滤泡性淋巴瘤(FL)细胞有毒性的T-TILs(肿瘤渗滤T细胞)与前面与CD40L表达成纤维细胞培养的FL B细胞接触，刺激它们的方法。他们提出过继免疫治疗，在这种治疗方法中以这种方法将刺激的T-TILS转输进入病人体内。这一方法也需要利用表达辅助分子的另一个细胞系体外刺激待转输的细胞。
在导入基因之后，包括保证辅助分子配体基因已经成功地导入这些分离的细胞的任何非强制的步骤后，将分离的细胞在特异的位点导入病人，或直接导入病人的循环系统。在本发明的优选的实施方案中，鉴定细胞的细胞表面标记，包括分子如肿瘤标记或抗原可用于特异地从病人分离这些分子。本领域技术人员将理解的是这样的分离方法是已知的，并且包括如荧光活化细胞分拣的方法，包括各种格式的免疫选择，包括淘选，柱和其它同样的方法。
本发明也涉及在动物或人病人体内需要的细胞中导入辅助分子配体基因，而没有首先从病人中除去这些细胞。
在体内，或病人的身体内的特异细胞中导入基因的方法是已知的，包括利用基因治疗载体，和直接注射各种遗传构建体到动物或病人中。有用的方法的例子已经叙述在Danko，I.和J.A.Wolff，疫苗，12：1499(1994)；RazE.，A.Watanabe，S.M.Baird，R.A.Eisenberg，T.B.Parr，M.Lotz，T.J.Kipps，和D.A.Carson，美国科学院院刊，90：4523(1993)；Davis，H.L.，R.G.Whalen，和B.A.Demeneix，人基因治疗。4：151(1993)；Sugaya，S.，K.Fujita，A.Kikuchi，H.Ueda，K.Takakuwa，S.Kodama，和K.Tanaka，人基因治疗，7：223(1996)；Prentice，H.，R.A.Kloner，Y.Li，L.Newman，和L.Kedes，分子细胞心脏病学杂志，28：133(1996)；Soubrane，C.，R.Mouawad，O.Rixe，V.Calvez.A.Ghoumari，O.Verola，M.Weil，和D.Khayat，当前癌症杂志，32A：691(1996)；Kass-Eisler，A.，K.Li，和L.A.Leinwand，纽约学术科学年评，772：232(1995)；DeMatteo，R.P.，S.E.Raper，M.Ahn，K.J.Fisher，C.Burke，A.Radu，G.Widera，B.R.Claytor，C.F.Barker，和J.F.Markmann，外科学年评，222：229(1995)；Addison，C.L.，T.Braciak，R.Ralston，W.J.Muller，J.Gauldie，和F.J.Graham，美国科学院院刊，92：8522(1995)；Hengge，U.R.，P.S.Walker，和J.C.Vogel，临床研究杂志，97：2911(1996)；Felgner，P.L.，Y.J.Tsai，L.Sukhu，C.J.Wheeler，M.Manthorpe，J.Marshall，和S.H.Cheng，纽约核酸科学年评，772：126(1995)；和Furth，P.A.，A.Shamay，和L.Hennighausen，Hybridoma，14：149(1995)。在常用的应用中，将含有辅助分子配体基因的基因治疗载体导入循环系统或导入病人的固定位置，以便允许基因治疗载体特异地感染需要的细胞。在其它优选的实施方案中，将基因治疗载体直接注射进入动物中存在的肿瘤床，该动物至少含有待导入辅助分子配体基因的一些细胞。
本发明也涉及在病人或动物中直接注射具有启动子和接着多聚腺苷酸化序列的辅助分子配体基因的遗传构建体中的DNA。这样有用的方法的例子已经在Vile，R.G.和I.R.Hart，癌症年评，5Suppl4：59(1994)中叙述了。将遗传构建体DNA直接注射进入动物或病人的肌肉或其它位点，或直接进入动物或病人的肿瘤床。可替代地，来自至少含有辅助分子配体基因的遗传构建体的DNA可以利用并且直接注射进入动物。
在本发明优选的实施方案中，通过在细胞，包括人细胞中导入辅助分子配体基因改变人病人或动物的免疫反应或应答，这些人细胞在细胞表面具有辅助分子。这样的细胞包括人细胞，人抗原呈现细胞，并且非强制性地，这些细胞可以是肿瘤性转化抗原呈现细胞，这些抗原呈现细胞具有在细胞或能够刺激的细胞的表面表达辅助分子的能力。在一些实施方案中，在辅助分子配体基因待导入的细胞的表面存在的辅助分子的量是非常小的，这样小的辅助分子的量可以来自这样的细胞的表面上的辅助分子的下调。一些实施方案中，导入辅助分子配体基因的细胞至少具有细胞表面存在的低水平的CD40分子，或起源于在细胞表面表达CD40配体分子，但已经减少或消除该表达的细胞。
改变特定的细胞的免疫反应性的优选的方法可用于包括人细胞的哺乳动物细胞。这些人细胞可以包括肿瘤性转化人细胞如人淋巴瘤，白血病，和其它恶性肿瘤包括胸，肺和乳房癌。在一些优选的实施方案中，这些细胞是人病人的正常的抗原呈现细胞，如单核细胞，巨嗜细胞，B细胞，郎氏细胞，交错突细胞，小结树突细胞，肝巨嗜细胞和其它同样的细胞。在优选的实施方案中，当本发明的辅助分子导入这些细胞中时，这些细胞是需要改变的免疫反应性的淋巴细胞。在其它优选的实施方案中，当本发明的辅助分子配体基因导入这些细胞中时，这些细胞可以是能够刺激旁抗原呈现细胞的肿瘤性转化或正常细胞。本发明也涉及不能天然对免疫系统呈现抗原的细胞，免疫系统可以是遗传工程化以便导入编码抗原表现需要的分子的基因，包括编码辅助分子的基因，因此允许这些细胞作为人工抗原呈现细胞。然后，在这些人工抗原呈现细胞中可以导入辅助分子配体基因。各种测试是本文献中已知的，以便确定是否特定的细胞能够发挥作为抗原呈现细胞的功能，如淋巴因子的细胞增殖或生产，因此本发明的这一方面可以容易地确定。
除了上面的正常人细胞，本发明也涉及在非强制性地是抗原呈现细胞的各种肿瘤性或恶性细胞中导入辅助分子配体基因。当在细胞中导入辅助分子配体时，涉及的这样的人肿瘤细胞包括白血病，淋巴瘤，AML，AMML，或CMML，CML，CLL和能够刺激近旁抗原呈现细胞的任何肿瘤细胞。同时涉及的是肿瘤细胞如胸，乳房，或肺癌细胞，这些细胞能够或工程化作为抗原呈现细胞。但是，本免疫调节也可用于没有特异鉴定的其它恶性肿瘤，因此将包括能够呈现动物或人免疫系统内的抗原的任何细胞的，或能够作为抗原呈现细胞，或能够在辅助分子配体基因已经导入这些细胞中后刺激近旁抗原呈现细胞的，任何细胞。通常这些抗原呈现细胞在细胞表面具有辅助分子。
本发明的改变人或动物细胞的免疫反应性的方法涉及在需要改变免疫反应性的细胞中导入辅助分子配体基因。用于本发明的基因包括上述的很多辅助分子配体基因和嵌合辅助分子配体基因，并在优选的实施方案中至少包括了小鼠CD40配体基因的部分。在特别优选的实施方案中，使用本发明的方法导入细胞中的辅助分子配体基因的选择应使其对应于存在于需要改变免疫反应性的细胞的表面的辅助分子。在本发明的一个特定的应用中，通过导入编码CD40配体分子和更优选地小鼠CD40配体分子的基因可以完成在细胞表面表达CD40分子的细胞的免疫反应性。
本发明也涉及通过在细胞中导入辅助分子配体基因改变人或动物细胞的免疫反应性，该基因是嵌合辅助分子配体基因。如上鉴定了各种有用的嵌合辅助分子配体基因，并且能够包括许多种类的分子，并且允许利用这些辅助分子配体基因的独特特性改变靶细胞的免疫反应性。在优选的实施方案中，有用的嵌合辅助分子配体基因是至少编码辅助分子配体的部分的基因，该配体能够结合存在于需要改变免疫反应性的细胞表面上的辅助分子。
用于改变免疫反应性的本发明的方法涉及遗传载体和遗传构建体的用途，包括基因治疗载体，这些载体编码辅助分子配体，所以含有辅助分子配体基因。通常，包括本发明的基因治疗载体的遗传载体和遗传构建体具有可操作地连接多聚腺苷酸化序列和辅助分子配体基因的启动子。在其它实施方案中，唯一的需要是本发明的遗传载体，遗传构建体，和基因治疗载体，含有辅助分子配体基因或嵌合辅助分子配体基因。
V. 治疗肿瘤的方法
本发明也涉及治疗人肿瘤的方法，包括在人肿瘤细胞中插入编码辅助分子配体的基因以致辅助分子配体在肿瘤细胞表面表达。本发明涉及在体内，来自体内和通过直接注射各种含有一种基因的各种DNA分子治疗人的肿瘤，该基因编码病人中的辅助分子配体。但是，至少，治疗人肿瘤的本方法包括在肿瘤细胞中以这样一种方式插入编码辅助分子配体基因，该方式允许这些肿瘤细胞在细胞表面表达辅助分子配体。在这些肿瘤细胞中辅助分子配体基因的表达调节免疫系统从而造成肿瘤的减小或消除。
在优选的治疗人肿瘤的方法中，该方法进一步含有第一步：从病人获得人肿瘤细胞，然后将编码辅助分子配体的基因插入在分离的人肿瘤细胞中，以致在肿瘤细胞的表面表达辅助分子配体。然后，将在细胞的表面上具有辅助分子配体的人肿瘤细胞输回病人。本领域技术人员将理解的是许多方法可用于将含有编码辅助分子配体的改变的人肿瘤细胞输回病人，并且这些方法是本领域已知的。
涉及的治疗人肿瘤的方法可用于许多种类的人肿瘤，包括淋巴瘤，白血病和其它恶性肿瘤。在优选的实施方案中，人肿瘤是包括人免疫系统的抗原呈现细胞的肿瘤，包括单核细胞，巨嗜细胞，B细胞，郎氏细胞，交错突细胞，小结树突细胞，肝巨嗜细胞，和诸如此类。在其它优选的实施方案中，人肿瘤是白血病，淋巴瘤，AML，AMML，CMML，CML或CLL，肺癌，胸癌，乳房癌和其它同样的肿瘤。
已经如上公开用于本发明的治疗人肿瘤的遗传载体，遗传构建体和基因治疗载体，包括启动子可操作地连接辅助分子配体基因或嵌合辅助分子配体基因的构建体，这些基因本身可操作地连接多聚腺苷酸化序列。治疗人肿瘤的方法涉及本说明书中叙述的遗传构建体，遗传载体和基因治疗载体的利用。另外，本发明涉及利用至少含有编码辅助分子配体基因的基因的DNA。这一基因可以或可以不含有启动子和其它调节序列。
在本发明的优选的实施方案中，含有人肿瘤的细胞至少定位于一个在病人中称为肿瘤床的确定的位点中。这一肿瘤床通常含有肿瘤或肿瘤细胞以及许多其它细胞，这些细胞与肿瘤或肿瘤细胞相关。本发明涉及通过在病人的肿瘤床中注射编码辅助分子配体的基因来治疗这样的人肿瘤，以致在肿瘤细胞表面上表达辅助分子配体，因此引起细胞参与免疫反应。编码辅助分子配体的基因可以作为基因治疗载体，遗传构建体或遗传载体的部分存在。
在优选的实施方案中，辅助分子配体基因是嵌合辅助分子配体基因，至少具有利用的小鼠CD40配体基因的部分。在其它优选的实施方案中，编码的辅助分子配体能够结合在待治疗的人肿瘤上存在的辅助分子。
用于本发明的治疗方法的各种基因治疗载体包括能够直接感染人细胞的载体。在文献中已经叙述了这样的载体并且容易地适用于本发明叙述的方法。
本发明涉及利用任何类型的基因治疗包括Raper，S.E.等人，外科学年评，223：116(1996)；Lu，L.等人，Crit.Rev.Oncol.Hematol.22：61(1996)；Koc，O.N.等人，癌症学讨论会，23：46(1996)；Fisher，L.J.等人，神经生物学当前评论，4：735(1994)；Goldspiel，B.R.等人，临床药物学，12：488(1993)；Danko，I.等人，免疫，12：1499(1994)；Raz，E.等人，美国科学院院刊，90：4523(1993)；Davis，H.L.等人，人基因治疗，4：151(1993)；Sugaya，S.等人，人基因治疗，7：223(1996)；Prentice，H.等人，分子细胞心脏学杂志，28：133(1996)；Soubrane，C.等人，癌症杂志，32A：691(1996)；Kass-Eisler，A.等人，纽约学术科学年评，772：232(1995)；DeMatteo，R.P.等人，外科学年评，222：229(1995)；Hengge，U.R.等人，临床研究杂志，97：2911(1996)；Felgner，P.L.等人，纽约学术科学年评，772：126(1995)；Furth，P.A.，Hybridoma，14：149(1995)；Yovandich，J.等人，人基因治疗6：603(1995)；Evans，C.H.等人，人基因治疗，7：1261的方法。
VI. 免疫方法
本发明涉及利用预定的生物体免疫动物的方法，包括对动物施用含有能够在利用需要的生物体在动物中引起对需要的生物体的免疫应答的免疫学动物抗原的疫苗，以及含有编码辅助分子配体的基因的载体。本发明也涉及接种动物的方法，包括给药编码能够引起需要的免疫应答或改变对特定的抗原的免疫应答的免疫原抗原的基因以及含有包括辅助分子配体基因的基因的载体。在这一特定的实施方案中，导入的载体或一些载体编码需要的免疫原抗原和需要的辅助分子配体。本发明也涉及编码免疫原肽或多个肽的基因或多个基因，他们可以存在于同一载体上，正如编码辅助分子配体的基因那样。
本发明的接种方法是一般的，因为它们可以用于生产抗任何预定的生物体如人病毒，细菌，真菌或其它生物体的接种。另外，本接种方法可以用于生产抗肿瘤性细胞的免疫应答。
在其它优选的实施方案中，本发明的接种方法利用了遗传载体，遗传构建体或基因治疗载体，这些载体和构建体含有是嵌合辅助分子配体基因的辅助分子配体基因。该嵌合辅助分子配体基因优选地至少含有小鼠CD40配体基因。在其它优选的实施方案中，接种方法利用了至少编码辅助分子配体基因或嵌合辅助分子配体基因的DNA分子。这一特定的DNA可以是或可以不包括指导辅助分子配体基因的表达的启动子序列。
本发明也涉及接种方法可以利用遗传载体，该载体能够在特定的细胞或生物体内表达辅助分子配体的遗传载体以及可以利用能够至少从腺病毒表达单个多肽的载体。这一腺病毒多肽可以从同一或不同载体表达，该载体在细胞中表达辅助分子配体。在这一特定的实施方案中，至少在生物体内的一个细胞类型中也表达腺病毒多肽，并且作用为调节在应答这一接种方案中发现的免疫应答。
本发明也涉及在细胞内导入辅助分子配体基因，这些细胞存在于患有类风湿关节炎的病人的关节中。在优选的实施方案中，导入的辅助分子配体基因至少包括Fas配体基因的一部分，在表达的基础上，辅助配体诱导在细胞表面上表达Fas的细胞的细胞死亡。这一过程导致减少炎症过程的破坏。
提供下面的实施例说明本发明的各种方面并且不限制本发明的范围。
VII. 治疗关节炎的方法
本发明也涉及治疗关节炎的方法，包括在关节中插入已经利用辅助分子如Fas配体转化的细胞。在优选的实施方案中，已经改变了在细胞表面上辅助分子配体的表达或该分子的稳定性。在这些优选的实施方案中，辅助分子配体以增强的方式起作用以便辅助在关节内的关节炎的治疗。本发明也涉及体内，来自体内，和通过直接在病人体内直接注射含有编码有用的辅助分子配体的基因的各种DNA分子治疗的人关节炎。对包括下面的实施例部分中叙述的那些的类风湿关节炎可以设计各种有用的方案。
本发明涉及利用辅助分子配体基因治疗关节炎，这些基因可以是起源于两个不同辅助分子配体基因的基因的部分组成的嵌合辅助分子配体基因。在其它实施方案中，通过利用来自同样的辅助分子配体基因的区域可以生产嵌合辅助分子配体。得到的嵌合辅助分子配体在它们表达的细胞的表面上具有改变的稳定性。这一改变的稳定性调节细胞周围局部环境中免疫系统的功能，在细胞中表达了这些嵌合辅助分子配体。例如，在一些优选的实施方案中，在患有关节炎的病人的关节内的细胞的表面改变了Fas配体的稳定性。这一改变的稳定性调节了免疫系统并且引起待靶击的细胞细胞程序死亡，并且因此减少了炎症的关节内的免疫应答。在其它实施方案中，改变了叙述的辅助分子配体基因以致得到的辅助分子配体具有改变的稳定性，并且引起可以用于治疗关节炎的免疫调节效应。
在优选的实施方案中，本发明涉及在治疗关节炎中利用的嵌合辅助分子配体基因。这些嵌合辅助分子配体基因优选地至少含有Fas配体基因区IV的一部分，该区域IV携带Fas配体的效应或功能。在优选的实施方案中，至少存在该区的一部分，允许Fas配体具有它的生物效应。在其它优选的嵌合辅助分子配体中，这些配体含有来自本发明的其它辅助分子配体基因或来自相同的辅助分子配体的不同的区的区域。特别优选的是在可操作地连接小鼠Fas配体的区域III的人Fas配体的区域IV上构成的Fas嵌合辅助分子配体基因。这一特定的联合导致更稳定的Fas配体，因此通过利用小鼠配体的区域III替代人Fas配体的区域III。人Fas配体基因的活性改变了。
可替代地，在其它优选的实施方案中，小鼠Fas配体基因可用于编码替代人Fas配体的细胞表面上的小鼠Fas配体。小鼠Fas配体比人Fas配体更加稳定，因此改变了关节中的Fas配体的活性。得到的改变的Fas配体活性可用于治疗类风湿关节炎。
其它优选的实施方案包括存在于人Fas配体的区域IV上的作用或功能与来自其它辅助分子配体的其它区域联合的实施方案。例如，CD70区域III比人Fas配体的区域III更加稳定，因此来自人CD70的区域III或Fas配体的区域IV与其它支持区组成的嵌合辅助分子配体将更加稳定。增强的稳定性得到增强的Fas配体活性。在其它优选的实施方案中，利用区域或多个区域的多个拷贝替代Fas配体的区域III。这样的区域的多个拷贝包括两个或多个其它区域的拷贝如CD70分子的区域III或I组成的区域。
在其它优选的实施方案中，本发明涉及辅助分子配体基因，如Fas配体基因，其中基质-金属蛋白酶(MMP)的裂解位点已经从辅助分子配体中除去。在Smith，M.M.等人，生物化学杂志，270：6440-6449(95)和Nagase，H.，和G.B.Fields，生物多聚物(肽科学)40：399-416(96)中讨论了图28中谈到的MMP裂解和识别位点。在优选的实施方案中，至少已经从Fas配体基因的区域III中除去至少一个MMP位点。来自Fas配体基因的MMP位点的除去使Fas配体更加稳定，因此在关节炎的治疗中更加有效。
在其它优选的实施方案中，人Fas配体基因的部分与来自其它人辅助分子配体或来自起源于其它种类的辅助分子的区组成嵌合辅助分子配体基因。例如，本发明涉及利用来自CD40配体，CD70配体，CD30配体，TNF相关的细胞程序死亡诱导配体(TRAIL)，TNF-α以及人Fas配体和小鼠Fas配体的突变体的区域。这样的辅助分子配体的生产是容易通过操作或生产辅助分子配体基因完成的，这些基因是嵌合的，因此，具有起源于至少两个不同辅助分子配体基因的部分。
                         实施例
         在人CLL细胞中人和小鼠辅助分子配体的表达
        a. 含有人或小鼠辅助分子配体基因的遗传构建体
                  或基因治疗载体的构建体
利用个别人和小鼠基因构建人辅助分子配体基因(人CD40配体)或小鼠辅助分子配体基因(小鼠CD40配体)。以下面的方式克隆这些基因中的每一个。
I. 小鼠CD40-L克隆
利用来自1×107B6小鼠脾细胞的RNA STAT-60试剂盒分离总RNA，小鼠脾细胞已经利用固定的CD3特异mAb活化8小时。然后，利用Superscript cDNA合成试剂盒合成(Gibco BRL，格兰特岛，纽约)合成cDNA，试剂盒中利用了oligo-dT引物。然后，利用下面的mCD40-L特异引物。5i--GTTAAGCTTTTCAGTCAGCATGATAGAA(SEQ ID NO：26)，5i--GTTTCTAGATCAGAGTTTGAGTAAGCC(SEQ ID NO：27)，通过PCR扩增来自cDNA的小鼠CD40配体(mCD40-L)基因。将扩增的mCD40-L PCR产物亚克隆进入真核表达载体pcDNA3(Invitrogen，圣迭戈，CA)的HindIII和Xbal位点。在利用BglII和XhoI酶限制消化后，从这一质粒构建体释放多聚腺苷酸化信号。然后，将这一DNA片断亚克隆进入穿梭质粒MCS(SK)pXCX2(Spessot R，1989，Virology168：378)，将穿梭质粒MCS(SK)pXCX2(Spessot R，1989，病毒学168：378)命名为mCD40-LpXCX2。这一质粒用于腺表达生产，如下所述。
ii.人CD40-L克隆
含有人CD40-L的基因的质粒可用于生产本文利用的人CD40-L基因。这一基因的序列可得，并且因此这一基因的来源可仅仅用于方便。参见基因库登记号X67878。这一质粒可用于人CD40-L基因的PCR扩增，其中利用了特异的引物，有意义引物5i-CCAAGACTAGTTAACACAGCATGATCGAAA3i-(SEQ ID NO：28)和反义引物5i-CCAATGCGGCCGCACTCAGAATTCAACCTG3i-(SEQ ID NO：29)。
这些引物含有可以亚克隆进入真核表达质粒pRc/CMV(Invitrogen)的侧接限制酶位点。将PCR扩增的CD40-L片断亚克隆进入pRc/CMV的SpeI和NotI位点，并且命名为bCD40-LpRc/CMV，然后，从这一质粒释放包括CMV启动子，hCD40-L基因和多聚腺苷酸化信号的BglII和XhoI片断，并且亚克隆进入穿梭质粒MCS(SK)pXCX2，如上所述。这一质粒命名为hCD40-L pXCX2。这一质粒可用于腺病毒生产，如下所述。
iii.腺病毒合成
mCD40-L pXCX2或hCD40-L pXCX2质粒与pJM17(Graham和Prevec，1991，分子生物学中的方法，7卷)共转染进入293细胞(美国类型培养物收藏处，Rockville，MD)，其中利用的共转染方法是磷酸钙方法(Sambrook，Fritsch，和Maniatis，1989，分子克隆，实验室手册，第二版，16章33-34)。通过再次感染293细胞挑出和扩展分离的腺病毒噬菌斑。如上所述除了下面的修饰的方法，高效价腺病毒制剂可以获得(Graham和Prevec，1991，分子生物学方法，7卷)。用于浓缩病毒颗粒的氯化铯梯度是步骤梯度，密度是1.45克/厘米3和1.2克/厘米3。在SW41离心机，在25,000rpm，在4℃中旋转样品(Beckman，Brea，CA)。利用Sephadex G25 DNA梯度柱脱盐病毒带(Pharmacia，Piscataway，NJ)。将分离的病毒储存在70℃，于磷酸缓冲的盐以及10％的甘油中。通过感染纯化的腺病毒的系列稀释液的293细胞，并且计算形成的噬菌斑的数目确定病毒效价。病毒效价通常的范围在1010到1012个噬菌斑形成单位/毫升(PFU/毫升)。
b. 在CLL细胞和HeLa细胞中导入小鼠和人辅助分子配体基因
对于腺病毒感染，将106个新鲜冷冻干燥和洗涤的CLL细胞或Hela细胞悬浮在0.5到1毫升培养基中，在37℃，在5％CO2-空气中的温育器中培育。以变化的感染复数(MOI)，在细胞中加入腺病毒，并且除非特别说明，在分析转基因表达之前，将感染细胞培育48小时。
c. 在CLL细胞和HeLa细胞中辅助分子配体基因的表达
利用含有实施例1b中制备的小鼠或人CD40配体基因的腺病毒载体感染CLL和Hela细胞。然后，利用制造商的说明，利用商业可得的免疫特异于人或小鼠CD40配体(Pharmingen，圣迭戈，CA)的单克隆抗体染色。在含有RPMI-1640，3％胎牛血清和0.05％迭氮化纳和含有碘化丙锭的染色培养基中洗涤CLL和HeLa细胞，然后在FACScan(Becton Dickinson，圣迭戈Jose，CA)上分析。从通过特征正向和侧光分散图谱和碘化丙锭染色的分析排除死细胞和碎片。以平均荧光强度比例(MFIR)测量表面抗原表达。MFIR等于利用特异的FITC-共轭MoAb染色的细胞的平均荧光强度(MFI)除于利用对照IgG-FITC染色的细胞的MFI。这一方法控制了在更大的更活化的细胞中看到的自我荧光的非特异增强。
在图3A-3D中显示了CLL细胞和HeLa细胞产生的组织图片，这些细胞含有遗传载体，遗传载体含有人CD40配体基因或小鼠CD配体基因和适当的对照。在图3A和3B中分别显示了在HeLa细胞中的小鼠和人辅助分子配体基因(CD40配体)的表达。在图3C和3D中显示了CLL细胞中小鼠和人辅助分子配体的表达。在图3C中显示了在CLL细胞中辅助分子配体基因的表达和在CLL细胞的表面上小鼠CD40配体的表达。在图3D中显示了CLL细胞的表面上不能表达人辅助分子配体。
图8显示了来自进行检测是否可以在诱导CLL病人的CD4+T细胞连接CD3后，表达辅助分子配体mRNA的实验数据。利用基于ELISA基础的定量竞争RT-PCR检测CD40配体转录水平。在这一实验中，，在CD3连接诱导后，将从CLL细胞中的CD40配体基因中转录的CD40配体和RNA与正常供体细胞中产生的CD40配体和RNA的水平比较。为了CD3活化，利用平板CLL或正常供体单核细胞制造和温育CD3 mAb的平板包衣以便指定时间的量，然后为了表达表面抗原或CD154RNA信息水平可以分析这些细胞。为了检测CD配体表面表达的调节的检测，在活化测试的开始时，在细胞中加入CLL或正常供体血清。
为了定量CD154 RT-PCR ELISA，提取总RNA，并且从含有CD40配体(CD154)cDNA的插入片断中产生竞争RNA。为了分开分离的总RNA中的孔，加入了改变量的竞争RNA，该RNA随后转化成cDNA。如Cantwell，M.等人，自然医学3：984-989(1997)中所述进行CD3活化，ELISA和PCR反应。在利用链霉素抗生物素(西格玛)包衣的微滴平板(BectonDickonson，Oxnard，CA)上捕获生物素化的PCR产物并且温育。利用NaOH处理平板以便除去反义链和随后洗涤。然后，将DNA与特异于野生型基因或特异于竞争物的低聚核苷酸杂交。利用末端转移酶，利用洋地黄毒苷-11-二脱氧UTP(Boehringer Mannheim)的分子标记每个探针。温育平板并且利用HYBE缓冲液和封闭缓冲液洗涤，然后，加入在封闭缓冲液中的过氧化物酶-共轭抗洋地黄毒苷抗体(150单位/毫升；BoehringerMannheim)。加入TMB(四甲基联苯胺)和过氧化物酶(Kirkegaard和Perry实验室，Gaithersburg，MD)以便显色，并且在450纳米和DeltasoftII测量光密度(Biometallics，Princeton，纽约)，将光密度用于数据分析。
制造标准的cDNA反应，规划RNA产物对光密度的标准曲线。然后，利用叙述这些标准曲线的方程计算存在于未知PCR反应中的野生型竞争物DNA的摩尔数，其中的根据是在ELISA读数中获得的光密度。然后，对这些起始样品中加入已知量的竞争物RNA划出野生型DNA的量对竞争物DNA的量的比例。为了样品的未知摩尔的靶RNA的量的外推法，取比例为1(1的比例是指靶RNA的量对竞争物RNA是相等的)。然后，根据下面的公式[靶CD154RNA的mole数)×(6×1023分子/摩尔)×(测试RNA的稀释因子)]/(在总细胞群体中的CD4 T细胞的％)计算每CD4细胞中靶RNA的分子
在图8中数目的图显示了具有CLL的病人的T细胞没有在CD3连接后，表达可检测的CD40配体。产生CD40配体RNA，但它是不可检测的。虽然在正常供体T细胞中(下面的图)表达了两个CD40配体和CD40配体RNA，蛋白质或RNA的水平稳定地维持了。
图9显示了CD配体的表面表达的时间过程。在感染后48小时，表达达到峰值，然后只在6天内维持高水平。在这一实验中，利用含有辅助分子配体的基因治疗载体以MOI为1000在时间零时感染CLL B细胞，然后，在各种时间通过流动细胞计量术评估。在横坐标上列出每个时间点，通过对应于右手坐标描述的百分数量度，以垂直条表示表达的可检测的CD154。
d.人和小鼠辅助分子配体的功能
1. 在细胞上诱导含有编码辅助分子的基因治疗载体的CD80或CD54
在实施例1b中制备了利用小鼠辅助分子配体基因感染的CLL细胞。然后，将感染的CLL细胞在组织培养平板中培养。然后，利用多参数FACS分析分析CLL细胞以便检测CD80和CD54表达的诱导，其中利用了免疫特异于每个这些各自的表面抗原的荧光素-异硫代氰酸共轭单克隆抗体。将非感染的CLL细胞用作对照。对这些细胞进行适当的FACS分析并且产生组织图谱。从Edward Clark博士获得CD80mAB和从CALTAG公司购买CD54mAb。利用在Kupps等人，实验室免疫学II，12：237-275(1992)中已经叙述的标准方法共轭CD80。
在图4A-4D中显示了这一分析的结果。图4A-4B比较了在还没有转染的CLL细胞(图4A)或导入了含有小鼠CD40配体基因的基因治疗载体的CLL细胞(图4B)的CD54表达的量。阴影图片表示FACS染色的同工型对照，和空白图片表示利用抗CD54抗体染色的细胞。这些结果显示了在CLL细胞中增强了CD54的表达水平，在CLL细胞中导入了含有小鼠CD40配体的基因治疗载体。
图4C和4D比较了在没有转染的CLL细胞(图4C)中或导入了含有小鼠CD40配体基因的基因治疗载体的CLL细胞(图4D)中的CD80表达的量。阴影图片表示FACS染色的同工型对照，并且空白的图片表示利用抗CD80抗体染色的细胞。这些结果显示了在CLL细胞中增强了CD80的表达的水平，在CLL细胞中，导入了含有小鼠CD40配体的基因治疗载体。
在另外的实验中，通过流动细胞计量术评估利用含有小鼠辅助分子配体基因的基因治疗载体感染的CLL细胞以便诱导不仅CD54和CD80，而且CD86，CD58，CD70和CD95的表达。从CALTAG购买了特异于人CD54和CD70的荧光素共轭mAb。特异于人CD27，CD58，CD80，或CD95的荧光素共轭mAb，和特异于人或小鼠CD40配体的藻红蛋白共轭mAb可以从Pharmingen获得。阴影的组织图片代表利用FITC共轭同工型非特异mAb染色的CLL B细胞。相反，未感染的CLL细胞(图10，薄线组织图片)，或Ad-lacZ-感染的CLL细胞(同样于利用未感染细胞获得的数据，没有显示)，利用编码表达高水平CD54(图10，上部左边)，CD80(图10，顶部中部)，CD86(图10，底部，中间)，CD58(图10，底部左边)，CD70(图10，底部中间)，和CD95(图10，底部右边)的CD40配体(CD154)的腺病毒载体感染CLL细胞。在其它方面，CD配体-CLL(CD154 CLL)明显地表达比未感染的(图11A，薄线组织图片)(P＜0.01，Bonferroni t-test)或Ad-lacZ-感染的CLL细胞(同样于利用未感染的细胞获得的数据，没有显示)更低水平的表面膜CD27(图11A，厚线-组织图片)和可溶的CD27(图11B)。，在感染后3天，在图11A中显示的实验中，通过流动细胞计量术，检测CLL B细胞中CD27的表达。阴影的组织图片代表利用PITC-共轭同工型对照mAb染色的CLLB细胞。在图11B中，在感染或刺激CLLB细胞72小时后收集无细胞上清液和通过ELISA测试人CD27的浓度。CD27减少的表达(图11B)同样于对于通过CD40刺激的白血病B细胞注意到的，其中CD40与CD32表达的L-细胞表现的mAb G28-5交联，正如Eassenti，L.Z.和T.J.Kipps，实验方法杂志，185：1435-1445中所述的。
ii. 对CLL细胞的异源T细胞应答，在CLL细胞中已经导入了含有小 鼠CD40配体基因的遗传治疗载体
利用细胞增殖测试分析已经利用含有小鼠CD40配体基因的基因治疗载体感染的CLL细胞刺激同种异型T细胞(即，来自另一个个体)的能力。简要地说，利用含有lac-Z基因，或小鼠CD40配体基因的遗传治疗载体以感染重复性为1,000，和在存在存在10纳克/毫升的浓度的IL-4时，共培养这些测试细胞。在其它样品中，利用MOPC21(对照IgG)或G28-5(抗CD-40单克隆抗体)刺激CLL细胞或在CD32-L细胞上预温育并且在同样的时间利用IL-4处理。利用CD32-L细胞以及利用IL-4处理的预温育已经显示是除了直接的基因转染外的交联CD40分子的有效形式。
在37℃培养3天后，利用丝裂霉素C处理这些细胞以便防止它们的增殖，然后用于刺激异源的T细胞。在这一共培养之前，利用抗CD40单克隆抗体已经处理或已经利用含有lac-Z或小鼠CD40配体基因的基因治疗载体以1∶10的刺激剂比例感染CLL细胞的不同等分试样。在37℃，培养2天后，通过ELISA测试测量干扰素r(IFNg)的生产。在37℃，5天共培养后，在8小时脉冲标记之后，测量在复制细胞中3H-胸腺嘧啶的掺入。在下面的表II和在图5中显示了这一测试的结果。
在另一个实验方案中，评估了利用含有CD40配体基因的基因治疗载体感染CLL B细胞作为异源混合淋巴细胞T细胞反应(MLTR)中的刺激物细胞的能力。平行地，如Ranheim，E.A.和T.J.Kipps，实验方法杂志，177：925-935(1993)，Clark，E.A.，和J.A.Ledbetter，美国科学院院刊，83：4494-4498(1986)，和Banchereau，J.等人，科学251：70-72(1991)中叙述，同时检测了已经利用CD32-L细胞和抗CD40 mAb(G28-5)，或同工型对照Ig已经培养的对照lac-Z-载体感染CLL细胞和CLL B细胞的刺激能力。来自非相关供体的效应器T细胞与效应器中的CLL刺激剂细胞以效应器对靶比例为4∶1共培养。，当利用CD154-CLL细胞培养时，在37℃培养18小时后，发现30％以上的异源CD3+细胞表达了活化相关的抗原CD69(数据没有显示)。相反，当与未感染或Ad-lacZ-感染CLL细胞共培养时，小于4％的T细胞表达了CD69(数据没有显示)。
在MLTR的起始后两天，通过ELISA测试在培养上清液中IFNg的浓度。利用辅助分子配体CD40L(图12A，CD154-CLL)感染的CLL细胞刺激MLTR的上清液中含有比利用抗CD40 mAb(图12A，aCD40-CLL)(23±3纳克/毫升)(P＜0.05，Boenferroni t-test)刺激的MLTR培养的明显更高的水平IFNg(306±5纳克/毫升)，m±SE，n＝3)。后者不是明显不同于利用对照Ad-lacZ-感染的CLL细胞刺激的MLTR培养物(图12A，lacZ-CLL)(43±10纳克/毫升)(P＞0.1，Bonferroni t-test)。单个效应器细胞的上清液或未感染的CLL细胞(图12A，CLL)刺激的MLTR培养物，或对照Ig处理的CLL细胞(图12A，MOPC-CLL)不含有可检测量的IFNg(＜2纳克/毫升)，同样，当单个培养，没有加入效应器T细胞，没有白血病B细胞群体产生可检测的量的IFNg(数据未显示)。
在5天后，通过掺入3H-胸腺嘧啶评估细胞增殖。具有同工型对照IgG处理(图12B，MOPC-CLL)或未感染(图12B，CLL)刺激物细胞的培养物没有掺入比没有加入白血病刺激物细胞(图12B，没有一个)的培养物更多的3H胸腺嘧啶。Ad-lacZ-感染的CLL B细胞(图12B，lacZ-CLL)也不能刺激异源T细胞以便掺入3H胸腺嘧啶的量比对照培养物中掺入的更多。相反，抗CD40刺激白血病细胞或CD154-CLL细胞每个诱导明显的效应器细胞增殖(图12B，aCD40-CLL或CD154-CLL)(P＜0.05，Bonferroni t-test)。另外，利用CD154-CLL细胞刺激的培养物掺入的3H胸腺嘧啶的量(41,004，±761cpm(m±SE)，n＝3)是明显大于利用相同数目aCD40-CLL细胞刺激培养物(22,935±1,892cpm，n＝3)(P＜0.05，Bonferroni t-test)。但是，当没有效应器T细胞培养时，这些丝裂霉素-C-处理白血病细胞群体掺入3H-胸腺嘧啶(数据没有显示)。同样，正如在异源T细胞和CD40刺激CLL细胞之间的MLTR{6549，7167，7168}中叙述，当加入在MLTR起始时，应答CD154-CLL的异源T细胞增殖可能通过CTLA-4-Ig或CD11amAb受到抑制，表明在CD80/CD86和CD28，或CD54和CD11a/CD18之间的各自的相互作用对注意到的异源T细胞反应有作用(数据没有显示)。
                            表II
             应答mCD40-L腺病毒感染的CLL细胞的异源T细胞
                            ％阳性细胞          异源应答
                                                (平均+SEM)
刺激物            mCD40-L   人CD80       3H-TdR吸收(cpm)  IFNγ生产(纳克/毫升)
没有(只有t细胞)   -         -            3577±821        n.d*
CLL
没有活化          0         1.4          4577±1097       n.d.
MOPC21            0         1.0          5259±1788       n.d.
G2B-5             0         26.7         22935±1892      22.3±1.6
lac-Z-adeno       0         4.8          9037±1781       43.2±10.5
mCD40L-adeno      17.5      19.7         41004±761       305.7±4.5
*n.d.-没有可检测的
iii.通过含有辅助分子配体基因的CLL细胞刺激γ干扰素
通过确定那些细胞活化T淋巴细胞的能力分析含有辅助分子配体基因(小鼠CD40配体)的CLL细胞的功能。如下进行该方法：利用磁化小珠和特异于CD14和CD19抗原的单克隆抗体纯化来自健康供体的异源T淋巴细胞(大于90％CD3+)。然后，这些异源T淋巴细胞与MMC处理CLL细胞一起培养，后面的细胞是用辅助分子配体基因(小鼠CD40配体)或lac-Z基因感染的。这一共培养物在含有10％胎牛血清的RPMI-1640培养基中进行。在培养24小时后，利用标准FACS分拣方案收集和分析细胞以便确定在T淋巴细胞上抗原CD69的表达。在2天后，收集培养物中细胞培养物上清液并且利用ELISA测试确定人干扰素γ的浓度。在存在人白细胞介素4IL-4(5纳克/毫升)时培养含有辅助分子配体基因(小鼠CD40配体)的CLL细胞的部分和含有表达lacZ的腺病毒的细胞的部分。通过在存在这一量的人干扰素4时的异源T淋巴细胞生产的干扰素γ同时得到分析。图6显示了来自这些分析物的结果。
正如可以看到，当比较含有lac-Z基因的CLL细胞时含有辅助分子配体基因(小鼠CD40)的人CLL细胞确实在细胞培养物上清液中产生更高的干扰素γ浓度。T淋巴细胞与含有辅助分子配体基因的CLL细胞接触增强了干扰素γ(IFNg)的生产表明含有辅助分子配体基因的这些CLL细胞在生产增强的免疫应答中是有效的。
iv.预接触含有辅助分子配体基因的非修饰CLL B细胞的异源T细胞的刺激
过去的研究表明，在缺乏起源于协同刺激分子的信号如CD28，对T细胞呈现的抗原可以导致特异的T细胞克隆无反应性。由于这一原因，对前面已经培养了的异源T细胞与非修饰CLL B细胞，缺乏CD80表达的非修饰CLL B细胞和其它免疫辅助分子，测试了它们应答含有CD40配体基因的CLL细胞的能力。异源效应器细胞与它们单独培养时(图12C，没有)时相比，在对非修饰的CLL细胞(图12C，CLL)，或利用Ad-lacZ感染的对照CLL细胞(图12C，lacZ-CLL)应答时没有掺入更多的3H-胸腺嘧啶。相反，甚至在与非修饰的CLL B细胞共培养之前，异源效应器细胞仍然可以得到诱导以便增殖(图12C，CD154 CLL)或以便产生应答表达辅助分子配体的细胞的IFNg(图12D，CD154CLL)。虽然当利用Ad-lacZ感染的白血病细胞用作刺激物细胞(图12D，lacZ-CLL)时，在这样的二级培养物的上清液中可以检测到最大量的IFNg，这一水平明显比含有Ad-CD40-配体感染的CLL细胞(图12D，CD154-CLL)(p＜0.05，Bonferroni t-test)的二级结构注意到的低。同样，利用含有可忽略的IFNg(＜2纳克/毫升)的未感染的CLL细胞(图12D，CLL)刺激MLTR培养物的单个白血病细胞(数据未显示)，和单个效应器细胞(图12D，没有一个)。这些结果表明与非修饰的CLL B细胞培养的异源效应器细胞没有从含有辅助分子配体基因的基因治疗载体感染的CLL B细胞的应答中排除。
v.已经导入编码小鼠辅助分子配体的基因治疗载体的CLL细胞的自身T细胞应答
检测从来自CLL病人的血液分离的T细胞，体外应答含有编码小鼠辅助分子，CD40配体的基因治疗载体的自身CLL B细胞的能力。分离T细胞到＞95％纯度，然后利用丝裂霉素-C处理的自身白血病细胞，在补充了外源白细胞介素-2以25单位/毫升补充的无血清AIM-V培养基中共培养。在外源IL-2(图13A，数据未显示)中没有加入刺激细胞，其次加入部分刺激细胞的培养基中检测不过分的3H胸腺嘧啶的掺入(＜10,000cpm)。但是，T细胞增殖的水平在未感染的CLL细胞(图13A，CLL)或Ad-lacZ-感染的CLL细胞(图13A，lacZ-CLL)中没有增加。相反，利用含有辅助分子配体(图13A，CD154-CLL)的基因治疗载体感染的CLL细胞诱导自身T细胞明显掺入比任何对照培养物(P＜0.05，Bonferroni t-test)更多的3H-胸腺嘧啶(17,368±1,093cpm，n＝3)。另外，利用编码辅助分子配体(CD40L)的载体感染的CLL细胞刺激的MLTR也明显产生比任何其它培养物(图13B)(P＜0.05，Bonferroni t-test)更多的IFNg(165±3纳克/毫升，n＝3)。
在5天后，从自身MLTR收集T细胞，并且评估这些T细胞抵抗自身CLL B细胞的CTL活性。利用自身CD40配体-CLL细胞共培养T细胞开发非修饰CLL B细胞的CTL活性，以2∶1的E∶T比例产生40.1％溶菌物(±2。3％)(图13C，CD154)。但是，当与未感染或Ad-lacZ感染的CLL细胞共培养时(图13C)，这样的T细胞没有在对照反应中开发同样的靶细胞的可检测CTL活性。
Vi.对于异源CLL B细胞的自身CD40配体-CLLB细胞刺激CTL的特异性
评估自身CD40-配体-CLL刺激的效应器细胞分泌抗异源CLL B细胞的IFNg或表现CTL活性的能力。在利用CD154-CLL或lacZ-CLLdMLTRd 5天后，通过Ficoll密度梯度离心分离T细胞，广泛洗涤，并且然后在培养基中培养24小时。将洗涤的T细胞与自身(i°Auto CLLi±，实心条)或异源(i°Allo-1 CLLi±或“All0-2 CLLi±，或“Allo-2-CLLi±，阴影或斜纹条)靶CLL B细胞混合。在利用CD40-配体-CLL细胞，没有利用lacZ-CLL细胞的自身MLTR中刺激的T细胞，明显在应答利用非修饰自身CLL B细胞的二级培养物的6应答中比利用异源CLL B细胞明显生产更多的IFNg(图14A)(P＜0.05，Binferroni t-test)。另外，利用CD40配体-CLL细胞，但没有利用lacZ-CLL细胞刺激的T细胞对于自身CLL细胞是毒性的，但对于异源CLL细胞是没有毒性的(图14B)。利用异源供体的自身MLTR活化T细胞获得的同样结果，再次证明自身CLL B细胞的特异的细胞毒性(数据未显示)。最后，W6/32，对I类主要的组织相容性复合物(MHCI)抗原的mAb明显可以抑制利用对于自身CLL B细胞的CD配体-CLL细胞刺激的T细胞的细胞毒性(图14C，αHLA-I类))(P＜0.05，Bonferroni t-test)。特异于MHC II类抗原的mAb(TU 14C，αHLA-DP)，特异于Fas配体的mAb(图14C，αFasL)，或相关特异性的同工型对照(图14C，MOPC-21)没有观察到这样的抑制。总的来说，这些研究表明Ad-CD40-配体感染CLL细胞可以诱导体外自身抗白血病细胞免疫应答，导致产生特异于自身非修饰白血病B细胞的MHC-类I限制CTL的产生。
e.Ad-CD40L CLL细胞反式激活非感染旁白血病B细胞
为了阐述是否在肿瘤标记表达中的变化(在部分1di中叙述)来自对细胞间刺激的细胞内，检测在利用编码辅助分子配体(CD40L，或CD154)的腺表达基因治疗载体感染后，在诱导CD54和CD80的表达上的培养密度的效果。在感染后，在标准的高密度(例如，1×106细胞/毫升)或低密度(例如，2×105细胞/毫升)在37℃培养CLL细胞3天。以高密度平铺包含在同型聚集物中的细胞，而在低密度平铺的细胞甚至保留分散和没有真正的细胞-细胞接触(数据没有显示)。不管表达同样水平的同源CD154，诱导高密度时培养的CD154-CLL B细胞以便表达CD54和CD80的水平比培养在低密度时培养的CD154-CLL细胞(图15A)更高。在高密度获得刺激可以通过利用能够阻止CD40<->CD154相互反应的仓鼠抗小鼠CD154mAb进行培养细胞进行抑制(图15B，aCD154 Ab)。总的说来，这些研究表明CD154-CLL细胞可以相互以顺式活化，并且CD154的表面表达是最佳白细胞刺激所必须的。
另外，利用绿荧光染料标记Ad-CD154-感染，未感染，Ad-lacZ感染，或G28-5刺激CLL细胞以便检测是否CD154-CLL可以刺激非感染的旁白血病细胞。染料标记的细胞用作等数目非标记同种CLL B细胞的刺激物细胞。在2天的培养后，它们自己保留的绿荧光染料培养了刺激细胞，允许这样的细胞通过流动细胞计量术区别于非标记的CLL细胞。当与Ad-CD154感染的白血病B细胞共培养，但没有与模拟感染CLL细胞(图15C和15D，左边组织图片)，G28-5-刺激CLL细胞，或Ad-lacZ-感染CLL细胞(数据未显示)共培养时，诱导旁(绿荧光阴性)CD19+CLL B细胞表达CD54(图15C，右边组织图片)或CD86(图15D，右边图片)。正如期望，这些旁(绿荧光阴性)CLL细胞对于异源CD154也是阴性。
f.利用编码辅助分子配体的基因治疗载体的白血病的治疗
图24显示了利用编码修饰的CD40配体的腺病毒基因治疗载体测试治疗B细胞CLL的临床试验的轮廓。利用编码修饰CD40配体的复制缺陷载体感染pheresis收获白血病细胞。在这一蛋白质表达后，将这些细胞给药回到病人，目的是刺激寄主抗白血病细胞免疫应答。这一方案远远优越于利用基因治疗的一个，以便实现只有一个没有刺激分子在白血病细胞表面上的表达。确实，这一方案产生表达免疫刺激辅助分子和细胞因子，以及可以影响从未收获的病人的白血病细胞中同样的改变的分子的排列的白血病细胞。
2.嵌合辅助分子配体基因的表达
利用标准技术如本文所述制备了嵌合辅助分子配体基因。
a.利用来自两个不同的辅助分子基因的区域制备嵌合辅助分子配体基因
从来自T细胞制备的RNA分离人CD40配体基因，T细胞已经利用5i-和3i-引物以及已知的PCR技术通过抗CD3单克隆抗体活化。人CD40配体的嵌合辅助分子基因和小鼠CD40配体是从新克隆的人CD40配体基因和如本文SEQ ID NO：2叙述的小鼠CD40配体基因构建的。将人CD40配体基因的跨膜和细胞质区与小鼠CD40配体基因的那些交换，并且命名为H(Ex)-M(Tm-Cy)CD40配体。利用如SOEN所述的基因转换技术生产这些嵌合辅助分子配体基因，该技术前面已经由Horton，分子生物技术3：93(1995)。在图4中显示的是产生的描述嵌合辅助分子配体基因的图片。如下面的表中表明，将这些个别嵌合辅助分子配体基因的每个的核苷酸序列命名为SEQ ID NOS：3-7。
表III
嵌合辅助分子配体基因SEQ ID NO：
HuIC/HuTM/MuEX  CD40-配体            SEQ ID NO：3
HuIC/HuTM/MuEX  CD40-配体            SEQ ID NO：4
HuIC/HuTM/MuEX  CD40-配体            SEQ ID NO：5
HuIC/HuTM/MuEX  CD40-配体            SEQ ID NO：6
HuIC/HuTM/MuEX  CD40-配体            SEQ ID NO：7
利用实施例1中叙述的方法构建图2中显示的编码每个嵌合辅助分子的腺病毒载体。然后，根据实施例1的方法，将这些构建体中的每一个转染进入HeLa细胞或CLL细胞。
b.在CLL和HeLa细胞上的嵌合辅助分子配体的表达
利用如实施例1中特异的FACS分析，分析了上面构建的每个嵌合辅助分子配体基因的表达。选择免疫特异于人或小鼠CD40配体的外部区或的适当的单克隆抗体，并且用于确定嵌合辅助分子在这些细胞表面上的表达。在适当分析和制备适当的组织图片后，证实了至少含有小鼠CD40配体基因的一部分的嵌合辅助分子的表达。
c.嵌合辅助分子配体的功能
利用mCD40L腺病毒的各种MOI感染CLL细胞，然后在感染后的各种时间，在48或24孔组织培养平板中培养(48，72和96小时)。然后，通过多参数FACS分析法分析CD19+B细胞中利用特异于如实施例1中所述的每个各自的表面抗原的荧光异硫氰酸共轭mAb诱导CD80和CD54的表达。在这些细胞上发现了CD54和CD80的量增加，这些细胞含有起源于小鼠CD40配体基因的区域或多个区域的嵌合辅助分子。
根据实施例1(d)进行含有嵌合辅助分子基因的细胞的进一步分析。含有嵌合辅助分子基因的细胞能够刺激gamma干扰素和T细胞增殖的生产，这些基因含有起源于小鼠CD40配体基因的区域。
d.含有来自相同种类的两个不同辅助分子的邻近细胞外区域的嵌合辅助分子基因的表达
制备了含有来自人CD70基因(区域III)的邻近细胞外区域的嵌合辅助分子配体基因，区域III具有起源于人CD40配体基因的区域的残留物。利用如前面本文所述的标准生物学技术制备了该基因。这一嵌合辅助分子配体基因具有SEQ ID NO：19显示的DNA序列。制备了含有来自小鼠CD40配体具有的邻近细胞外区域的不同嵌合辅助分子配体基因，小鼠CD40配体基因具有起源于人CD40配体基因的区域的残留物。利用如前面本文所述的标准技术制备这一基因。如SEQ ID NO：20所示，这一嵌合辅助分子配体基因具有DNA序列。
将SEQ ID NO：19和20显示的嵌合辅助分子基因掺入实施例1中所示的适当载体，并且导入人肿瘤细胞。如实施例1中所述确定细胞中嵌合辅助分子基因的表达。
在利用实施例1中叙述的FACS分析，在人肿瘤细胞的表面上发现这些嵌合辅助分子基因的每个编码的嵌合辅助分子。利用实施例1中叙述的技术在含有嵌合辅助分子基因的细胞上发现CD54和CD80的量增加。含有嵌合辅助分子基因的细胞能够刺激γ干扰素的生产和T细胞的增殖，如上所述，并且根据实施例1测试。
3.利用编码辅助分子的载体扩大接种
利用下面的过程证实利用编码辅助分子的基因治疗载体接种方案的增大。
a.在利用辅助分子基因治疗载体和placZ共注射的小鼠中的抗体应答的增大
利用标准技术包括那些本文叙述的技术制备三个不同基因治疗构建体。第一个是对照基因治疗载体，pcDNA3，没有含有任何基因。第二个placZ，含有编码β-半乳糖苷酶(β-gal)的Lac-Z基因。第三个p-mCD40L含有实施例1中所述的小鼠CD40配体基因。
在任何免疫之前，从6-8星期大的BALB/c-小鼠分离血清以便确定任何β-半乳糖苷酶的起始抗体的量。利用100微克质粒DNA注射一次，注射每个动物。在一个星期的间隔给出四次独立的注射。
在第三个注射之前，取动物的血液以便检测对β-gal的早期抗体应答。在最后注射质粒DNA后一个星期，取动物的血液以便检测对β半乳糖苷酶的后抗体应答。为了测试测试的敏感性，平行测试从抗β-gal抗血清分离的已知量的抗β-gal抗体。
在ELISA中测试血清稀释液1∶40，1∶200或1∶1000的抗β-gal抗体。为此，利用在磷酸缓冲盐中的10微克/毫升的β-gal包衣聚苯乙烯微滴ELISA平板。利用含有1％小牛血清白蛋白(BSA)在硼酸缓冲盐(BBS)(0.1M硼酸，0.2摩尔/升NaCl pH8.2)中的0.2％的吐温的封闭缓冲液洗涤平板3次。在分离的孔中加入50微升稀释的血清。在室温下至少1小时后，利用封闭的缓冲液洗涤平板2，3次，然后允许与碱性磷酸共轭山羊抗小鼠IgG抗体反应。一小时后，利用封闭缓冲液再次洗涤平板4次，并且利用25毫升TMB过氧化物酶底物温育(Kirkegaard和Perry，Gaithersburg，MD)。利用微滴平板读数器测量405纳米的每个孔中的吸光值(分子装置，Menlo Park，CA)。O.D.读数越高，样品中特异抗体的量越大。
在下面几页后的表IV和V中提供了两个实验的每个的数据。对照同时提供的来自两个实验的数据，在表VI和VII中概括了结果。在概括页n表示四个小组的每个中的动物的号。S.D.表示标准偏差，和Avg.是在特别的小组中所有动物的平均O.D.读数。
小组4的结果证实了利用编码辅助分子配体(CD40L)的基因治疗载体增强抗遗传或基因治疗载体编码的β-gal的免疫。来自这一小组的动物的血清的1∶40稀释液的平均O.D.读数明显高于小组1，2和3(P＜0.05，Bonferronit tests，参见表VII)。
来自其它实验的数据进一步支持了这样的发现，即编码辅助分子配体的基因治疗载体增强了抗β-gal的免疫(图16)。这里，将pCD40L和placZ共注射进入骨骼肌肉，以便测试对placZ，基于pcDNA3编码大肠杆菌β半乳糖苷酶的载体的免疫应答的增强。通过ELISA确定相对抗β-gal Ab活性。正如期望的，利用非修饰pcDNA3载体或pCD40L单独注射小鼠没有生产对b-gal的可检测的抗体(图16A)。利用100微克pcDNA3，50微克pcDNA3+50微克pCD40L(线条块)，50微克pcDNA3+50微克placZ(条纹块)，或50微克pCD40L+50微克placZ(实心块)注射小鼠。在其它方面，在28天，在第四次和最后注射后一星期，接受placZ和pcDNA3的小鼠开发了可检测的抗b-gal抗体。接受placZ和pCD40L的小鼠开发比利用placZ和pcDNA3注射的小鼠更高效价的抗β-gal抗体。在28天，接受placZ和pcDNA3的小鼠在第四和最后注射后一星期发展了可检测的抗b-gal抗体。接受placZ和pcD40L的小鼠发展了比注射placZ和pcDNA3的小鼠更高效价的抗b-gal抗体。图16B，在28天收集的血清的系列稀释液的ELISA的分析显示了利用placZ和pCD40L共注射小鼠具有比利用placZ+pcDNA3处理的小鼠在28天时高8倍的抗β-gal抗体的平均效价。
i.辅助分子载体共注射刺激的免疫球蛋白亚类生产
尽管增强抗β-gal抗体应答的效价，通过共注射pCD40L诱导的抗β-galIgG亚类没有被共注射pcD40L改变。IgG2a抗β-gal抗体在利用placZ和pcDNA3或placZ和pCD40L注射的小鼠的血清中超过IgG1亚类抗体(图17)。同时描述的是存在于预免疫血清(条纹条)或后免疫血清(实心条)中存在的抗β-gal IgG1和抗β-gal IgG2a的ELISA O.D.测量，这些血清是28天如横坐标上表明的注射的每个小鼠组中收集的。相反，利用β-gal蛋白质注射的BALB/c小鼠优先发展了IgG1抗β-gal抗体，和没有可检测的IgG2a抗β-gal抗体。
ii. 通过辅助分子载体接种的增大需要与placZ在同一位点共注射
只有当它注射进入placZ的同一位点才观察到在抗β-gal抗体应答上的pCD40L质粒的辅助效应(图18)。BALB/c小鼠(n＝4)的小组接受在同一位点肌肉内注射plzcZ和pCD40L，或如在远侧位点(右和左后腿四头及)同时分开注射。对照组在同一位点接受placZ和pcDNA3的肌肉内注射。在28天取血动物，在不同稀释度，如横坐标表明测试血清的抗β-gal Ab。该图说明了每组在1∶40，1∶200或1∶000稀释度时，每组的血清样品的每个的孔的复式份在405纳米处的平均O.D.。利用placZ和Pcd40L同时，但在不同位点注射的动物没有发展可检测的抗β-gal抗体直到28天。另外，在28天来自这样的动物的血清的抗β-gal抗体效价与接受plzcZ和pcDNA3的小鼠的相同，并且明显地小于接受placZ和pCD40L在同一位点一起注射的动物的那些。
iii.当在真皮中共注射辅助分子载体和placZ时增大接种
当注射进入真皮时，pCD40L质粒同时增强了对placZ的抗b-gal抗体应答。在图19中显示的实验中，利用50微克pcDNA3(棋盘式条)，25微克pcDNA3+25微克pCD40L(线条)25微克pcDNA3+25微克placZ(条纹条)，或25微克pCD40L+25微克placZ(实心条)，在尾巴的基部，小鼠接受真皮注射。如图16A中进行了注射，取血和ELISA分析。棋盘条和线条组每个包括8个小鼠，而条纹条和实心条组每个包括12个小鼠。每个条的高度代表每组的1∶40稀释度时血清的平均O.D.±S.E.。该数据的统计分析表明条纹条和实心条组是独立的(P＜.05)。正如利用肌肉内注射观察到的，在二次注射后一星期，利用placZ和pCD40L共注射的小鼠比利用placZ和pcDNA3注射小鼠提早了2星期，发展了可检测血清抗β-gal抗体。另外，这些动物也具有比28天时placZ注射的组的小鼠更高8倍的抗β-gal抗体的平均效价。利用非修饰pcDNA3载体或pCD40L单独注射的小鼠没有生产对β-gal的可检测的抗体。
b.在利用辅助分子基因治疗载体和placZ共注射的小鼠中CTL应答的增大
测试pCD40L增强placZ诱导特异于表达同源的b-gal的靶细胞CTL的能力。利用pCD40L和pLACz共注射进入骨骼肌肉(图20A)或真皮(图20B)的BALB/c小鼠产生比利用placZ和pcDNA3共注射的小鼠更大数目的特异于P13.2，placZ转染的P815细胞系的CTL。以5∶1的效应器∶靶比例，来自接受肌肉内注射placZ和pCD40L的小鼠脾细胞效应器细胞获得比P13.2高20％的特异溶菌物。相反当利用接受placZ和pcDNA3对照注射的小鼠脾细胞获得这一水平的特异溶菌物需要9倍更高比例的效应器对靶细胞。同样，在效应器∶靶细胞比例为4∶1时，接受皮内注射placZ和pCD40L的小鼠的脾细胞效应器细胞杀死50％以上的P13.2细胞。为了获得特异溶菌物的可比较水平需要更高8倍的效应器∶靶比例，其中利用接受皮内注射placZ和pcDNA的小鼠脾细胞。但是，利用pCD40L和placZ共注射的小鼠脾细胞没有比接受placZ和pcDNA3的小鼠更高的p815细胞的非特异CTL活性(图20)。正如期望的，来自接受pcDNA3单独，或pcDNA3和pcD40L注射的小鼠脾细胞不介导P13.2或P815细胞的特异溶解。
                                               表IV实验#1                                       质粒DNA的注射i.m.：4/3/96；4/10/96；4/17/96；4/24/96
抗β半乳糖苷酶的ELISA抗体组    动物 预取血的稀释度(4/3) 取血的稀释度(4/17) 取血的稀释度(5/1)
    1/140     1/200     1/1000     1/140     1/200     1/1000     1/40     1/200     1/1000
pcDNA3(p-对照，100mcg)     1     0.09     0.11     0.09     0.06     0.06     0.06     0.11     0.17     0.11
(对照载体)     2     0.11     0.09     0.09     0.07     0.07     0.07     0.10     0.09     0.08
    3     0.12     0.11     0.10     0.09     0.09     0.10     0.12     0.08     0.08
    4     0.11     0.10     0.10     0.08     0.11     0.07     0.11     0.07     0.08
  平均值标准误     0.11     0.11     0.11     0.11     0.11     0.11     0.11     0.11     0.11
    0.01     0.01     0.01     0.01     0.02     0.02     0.01     0.04     0.01
p-LacZ(50mcg)     5     0.13     0.10     0.10     0.07     0.11     0 06     0.15     0.10     0.08
+     6     0.10     0.11     0.10     0.07     0.06     0.06     0.22     0.15     0.14
p-Control(50mcg)     7     0.19     0.10     0.18     0.07     0.07     0.06     0.78     0.29     0.12
    8     0.10     0.09     0.10     0.08     0.07     0.07     3.04     1.84     0.77
  平均值标准误     0.13     0.10     0.12     0.07     0.08     0.06     1.05     0.60     0.28
    0.04     0.01     0.04     0.01     0.02     0.00     1.36     0.84     0.33
p-lacZ(50mcg)     Z7     0.06     0.06     0.06     0.13     0.11     0.08     2.30     1.68     0.72
+     18     0.06     0.06     0.06     0.27     0.13     0.10     2.35     0.09     0.28
pRcCMV-mCD40L(p-mCD40L.     19     0.06     0.06     0.06     0.23     0.19     0.11     2.06     1.09     0.39
    20     0.06     0.06     0.06     0.23     0.19     0.11     2.06     1.09     0.39
  平均值标准误     0.06     0.06     0.06     0.74     0.47     0.21     2.25     1.00     0.47
    0.00     0.00     0.00     1.06     0.66     0.24     0.13     0.67     0.19
                                 表V实验#2    .注射质粒DNA i.m.：6/5/96；6/12/96；6/19/96；6/26/96
抗β′半乳糖苷酶抗体的血消的稀释度组    动物 预取血的稀释度(6/5) 取血的稀释度(7/19) 取血的稀释度(8/3)
    1/40     1/200     1/1000     1/140     1/200     1/1000     1/40     1/200     1/1000
p-对照(50mcg)     9     0.02     0.02     0.06     0.04     0.01     0.01     0.04     0.03     0.05
+     10     0.06     0.02     0.10     0.02     0.02     0.00     0.08     0.09     0.05
p-mCD40L(50mcg)     11     0.02     0.02     0.07     0.03     0.01     0.00     0.02     0.02     0.05
    12     0.06     0.03     0.05     0.18     0.04     0.01     0.11     0.04     0.05
  平均值标准误     0.04     0.04     0.04     0.04     0.04     0.04     0.04     0.04     0.04
    0.02     0.01     0.02     0.07     0.01     0.01     0.04     0.03     0.00
p-lacZ(50mcg)     5     0.02     0.03     0.02     0.06     0.04     0.04     0.39     0.11     0.03
+     6     0.03     0.02     0.03     0.14     0.03     0.04     2.85     1.58     0.41
p-对照(50mcg)     7     0.56     0.13     0.06     0.29     0.06     0.02     0.22     0.07     0.03
    8     0.01     0.02     0.05     0.06     0.02     0.02     0.11     0.04     0.05
  平均值标准误     0.15     0.05     0.04     0.13     0.04     0.03     0.89     0.45     0.13
    0.27     0.05     0.02     0.11     0.02     0.01     1.31     0.75     0.19
p-lacZ(50mcg)     13     0.23     0.06     0.05     0.28     0.07     0.02     2.37     0.73     0.18
+     14     0.02     0.02     0.03     0.04     0.02     0.01     3.05     2.23     0.59
p-mCD40L(50mcg)     15     0.02     0.02     0.02     0.89     0.21     0.05     2.46     0.96     0.21
    16     0.05     0.04     0.02     0.11     0.04     0.04     2.75     1.39     0.34
  平均值标准误     0.08     0.04     0.03     0.33     0.08     0.03     2.66     1.33     0.33
    0.10     0.02     0.02     0.39     0.09     0.02     0.31     0.67     0.19
                                              表VI概括
  预免疫@β-gal     早期@β-gal     后期@β-gal
    1/140     1/200     1/1000     1/140     1/200     1/1000     1/40     1/200     1/1000
 1)p-对照(n=4) 平均值标准误     0.11     0.11     0.11     0.11     0.11     0.11     0.11     0.11     0.11
    0.01     0.01     0.01     0.01     0.02     0.02     0.01     0.04     0.01
  2)p-mCD40L+p-对照 (n=4)   平均值标准误     0.04     0.04     0.04     0.04     0.04     0.04     0.04     0.04     0.04
    0.02     0.01     0.02     0.07     0.01     0.01     0.04     0.03     0.00
  3)p-lacZ+p对照 (n=8)   平均值标准误     0.11     0.04     0.04     0.11     0.03     0.03     0.61     0.31     0.09
    0.22     0.04     0.01     0.09     0.02     0.02     1.11     0.62     0.16
  4)p-lacZ+p-mCD40L(n=8)   平均值标准误     0.11     0.04     0.03     0.25     0.06     0.03     2.06     1.04     0.26
    0.10     0.02     0.01     0.32     0.07     0.02     0.97     0.69     0.18
抗β半乳糖苷酶标准：    67ng  22ng  7.4ng  2.5ng  .82ng  .27ngO.D.                    3.01  2.98  2.05   1.10   0.52   0.263.14  3.14  2.25   1.20   0.56   0.26
                                   表VII
BONFERRONI t-测验
  比较                   平均差     t     P＜.05
  4对2：     2.06-     0.04＝     2.02     3.782     是
  4对1：     2.06-     0.11＝     1.95     3.651     是
  4对3：     2.06-     0.61＝     1.45     3.325     是
  3对2：     0.61-     0.04＝     0.57     1.067     否
  3对1：     0.61-     0.11＝     0.50     没有检测
  1对2：     0.11-     0.04＝     0.07     没有检测
自由度：20
方差的单方法分析
    组     N     平均     标准偏差     SEM
    1     4     0.11     0.01     0.00
    2     4     0.04     0.04     0.02
3 8 0.61 1.11 0.39
    4     8     2.06     0.97     0.34
    5     4     1.51     0.77     0.38
    6     4     1.14     0.53     0.26
    7     4     0.83     0.43     0.22
方差的单方法分析
    反差来源     SS     DF     方差(MS)
    组间     18.29     6     3.05
    组内     18.39     29     0.63
    总计     36.69     35
F = s 2 _ bet s 2 _ wit = MSbet Mswit = 3.05 0.63 = 4.81 P = 0.002
4.利用含有辅助分子基因或嵌合辅助分子基因的基因治疗载体治疗肿瘤
a.在小鼠中治疗肿瘤
利用编码本发明的辅助分子配体的基因已经证明在小鼠模型系统中的肿瘤的治疗。正如在上面的实施例中前面已经叙述，制备了含有辅助分子配体基因(小鼠CD40配体)的基因治疗载体。利用这些基因治疗载体在来自在BALB/c小鼠中起源的肿瘤的肿瘤细胞，1系细胞中导入辅助分子配体基因。根据上面的实施例，将辅助分子导入肿瘤细胞。正如在上面的实施例中已经叙述的，利用流动细胞计量术证明在这些肿瘤细胞的表面上表达了辅助分子配体。
如下显示了用于治疗肿瘤的辅助分子配体基因的有效性。利用1.0×105辐射1系肿瘤细胞注射雌性BALB/c小鼠(6-8星期大)。肿瘤性1系细胞起源于BALB/c小鼠中自发肺腺癌。Blieden等人，Int.J.CancerSupp.，6：82(1991)已经叙述了这一肿瘤细胞。利用1.0×105辐射1系肿瘤细胞注射其它雌性BALB/c小鼠，这些肿瘤细胞前面已经利用如上所述的编码辅助分子配体基因(小鼠CD40)的基因治疗载体转导。
允许每组小鼠产生免疫应答10天。在10天后，利用1.0×104活，非辐射1系肿瘤细胞攻击每组小鼠。然后，检测这些小鼠中肿瘤的形成，然后，当因为发病，肿瘤生长到2.0厘米时，杀死。在图7中显示了这一检测的结果。正如图7可以看到，在细胞表面利用表达本发明的表达辅助分子配体的肿瘤细胞免疫的小鼠在实验过程中保留了无肿瘤。在利用肿瘤细胞攻击后50天，利用没有本发明的辅助分子配体基因的肿瘤细胞免疫的小鼠长出肿瘤。
图21证明了在表达CD40的肺肿瘤细胞系中，人CD40L，但不是小鼠CD40L的下调。利用编码lac-Z(Ad-LacZ)，小鼠CD40L(Ad-mCD40L)，和人CD40L(Ad-hCD40L)的腺病毒以MOI0(空白)，A427(CD40阴性肺癌，图21B)，1和10感染人细胞系HeLa(CD40阴性肺癌，图21B)，NCI460(弱CD40-阳性肺大细胞癌，图21C)，和SK-Mes-1(强CD-阳性肺多鳞细胞肿瘤，图21D)。感染后48小时，确定小鼠CD40L和人CD40L表面表达。在Y轴划出表达配体的细胞的百分数。在CD40-阴性细胞系中以相等水平表达人和小鼠CD40L。但是，在表达CD40的细胞系上只有小鼠CD40L表达是稳定的。相反于mCD40L，在CD40阳性肿瘤上下调人CD40L。
在图22A中划出的数据显示CD结合诱导肿瘤表面标记的表达。利用αCD40 mAb治疗表达CD40肺癌细胞系导致肿瘤细胞表面标记CD95(Fas)，CD54(ICAM-1)和I类主要的组织相容性抗原(MHC I)的表达。将NCI460，弱CD40阳性肺大细胞癌与表达CD32的小鼠成纤维细胞上的CD40特异单克隆抗体(粗线)，或MOPC21同工型对照mAb(细线)温育48小时。在温育48小时后，分析分析肺肿瘤细胞中FACS表达CD95，CD54，和MHC-I。
图22B再次显示CD40阳性肿瘤细胞下调人CD40L。将HeLa(CD40-阳性)，CLL(CD40-阳性)，和SK-MES-1(CD40-阳性)肿瘤细胞与CD3活化正常供体T细胞以肿瘤细胞∶T细胞比例2.5∶1共培养24小时。在共培养后，分析表达CD2的T细胞中FACS的CD40L表面表达。细线表示利用FITC标记的同工型对照抗体(MOPC21)染色的T细胞并且粗线表示利用FITC标记的αCD40L抗体(αCD154抗体)染色的活化的T细胞。CD40阳性肿瘤细胞系，SK-MES-1和CLL，没有在它们的表面表达CD40配体。
5.在人血液淋巴细胞中，表达人和小鼠辅助分子配体，Fas配体
a.含有人和小鼠Fas配体基因的遗传构建体和基因治疗载体的构建
利用各自的人和小鼠基因构建人辅助分子配体基因(人Fas配体)或小鼠辅助分子配体基因(小鼠Fas配体)。制造除去推断的MMP-裂解位点的改变的辅助细胞分子并且命名为ΔFasL-pcDNA3。如SEQ ID NO：40列出了ΔFasL-pcDNA3的核苷酸序列。从ΔFasL中失去了编码6个氨基酸的人Fas配体核苷酸325到342。ΔFasL的设计的基础是区域III含有与MMPs最易接近的位点，并且因此可以是来自细胞的表面的分子裂解的靶。已经确定人Fas配体基因的序列并且如SEQ ID NO：13和30列出(基因库登记号U11821)。已经确定了小鼠Fas配体基因的序列并且列出如SEQ ID NO：14(C57BL/6，基因库登记号U10984)和31(Balb/c，基因库登记号U58995)。已经确定小鼠Fas配体基因的序列，并且列出如SEQ ID NO：25(基因库登记号U03470)。如在实施例2中的CD40配体嵌合构建体所述，制造了嵌合构建体，其中人Fas配体的区域III是利用其它蛋白质特别是TNF家族的蛋白质的区域替代。嵌合构建体包括，但不限于具有小鼠Fas配体的区域III替代区域III的人Fas配体(如SEQ ID NO：37，列出的嵌合序列，图37中显示的列出的序列)，或人CD70的区域III替代区域III的人Fas配体(如SEQ ID NO：38列出的嵌合序列，图38显示列出的序列)，或人CD70的区域I替代的区域III的人Fas配体(列出如SEQ ID NO：38的嵌合序列，在图39中显示列出的序列)。利用实施例I中叙述的方法同时制造嵌合构建体，在该嵌合构建体中将多个区域，例如人CD70区域III的两个拷贝插入人Fas配体的区域III。同时制造了将合成序列用于替代人Fas配体的区域II的嵌合构建体。
I.人Fas配体克隆
将编码人Fas配体的cDNA亚克隆进入真核表达载体pcDNA3。利用1纳克/毫升PMA加0.5微摩尔离子霉素活化正常供体血液淋巴细胞4小时。利用Qiagen Rneasy试剂盒分离总RNA。然后，利用oligo-dT引物，利用Gibco-BRL Superscript cDNA合成试剂盒从poly-A合成cDNA。然后，利用Fas-配体特异引物(有意义引物，SEQ ID NO：32，反义引物SEQ ID NO：33)PCR扩增编码人Fas配体的基因。然后，利用标准的分子生物学技术在pcDNA3中亚克隆Fas配体PCR产物。将亚克隆进入pcDNA3中的RT-PCR产物命名为hFasL-pcDNA3。
ii.小鼠Fas配体克隆
在利用如上所述PMA加离子霉素活化小鼠脾细胞后，同时扩增来自小鼠的Balb/c和C57/BL6的品系的小鼠Fas配体基因并且从如上所述poly-A合成的cDNA(有意义引物，SEQ ID NO：34，反义引物，SEQ ID NO：35)扩增。将这些基因亚克隆进入pTARGET表达载体(普洛美格，麦迪生，WI)。将亚克隆进入pcDNA3的RT-PCR产物命名为mFasL-pcDNA3。
iii.腺病毒载体的构建
为了构建编码人Fas配体，小鼠Fas配体或ΔFas-配体的腺病毒载体，将克隆的cDNA亚克隆进入质粒pRc/RSV(Invitrogen，圣迭戈，CA)的HindIII-Xbal位点。将具有RSV启动子-增强子和小牛生长激素poly-A信号序列的BglII-XhoI片断亚克隆进入质粒MCS(SK)pXCX2的BamHI-Xhol位点。质粒MCS(SK)pXCX2是质粒pXCX2的修饰质粒，其中将pBluescript多接头序列克隆进入E1区。然后，利用磷酸钙方法将得到的质粒与pJM17一起共转染进入293细胞。挑出腺病毒载体的独立的噬菌体，并且通过感染的293细胞扩展。如上所述，获得高效价的腺病毒制剂，其中利用了通过步骤梯度为了浓缩病毒颗粒的氯化铯梯度，密度为1.45克/立方厘米和1.20克/立方厘米，其中在SW41离心机(Beckman，Brea，CA)在25,000rpm在4℃离心样品2小时。利用Sephadex G25 DNA级别柱(Pharmacia，Piscataway，NJ)脱盐病毒带，并且将分离的病毒储存在-70℃的含有10％甘油的磷酸缓冲盐中。通过在感染各种稀释度的许可的293细胞并且计算噬菌斑的数目来确定病毒的效价。通常效价的范围在1010到1012噬菌斑形成单位/毫升。将腺病毒构建体命名为Ad-hFasL，Ad-mFasL，和Ad-ΔFasL。
b.在人细胞中导入小鼠和人Fas配体基因
将构建体hFasL-pcDNA3，mFasL-pcDNA3，和ΔFasL-pcDNA3通过电穿孔转染进入293。在含有G418的培养基中选择转染的细胞。利用抗Fas-配体抗体和流动细胞计量术筛选Fas-配体转染体中转基因的表达。利用的方法与在CLL细胞中转染CD40L叙述的那些一样。
为了FasL腺病毒感染，在0.5到1毫升培养基中悬浮106新鲜冷冻干燥和洗涤的CLL细胞或HeLa细胞，在5％空气中CO2的温育器中温育37℃。在细胞中以变化的感染重复数(MOI)在细胞中加入腺病毒，除非特别说明，在分析转基因表达之前，培养感染的细胞48小时。
c.在人细胞中Fas配体基因的表达
具有淋巴增殖或一般化的淋巴增殖紊乱的小鼠不能删除在胸腺以外的活化自我反应细胞。这与这样的事实相关，即，在这些小鼠中，Fas受体和辅助分子配体，Fas配体之间的相互作用是有缺陷的。这些动物发展了许多紊乱，包括淋巴结病，脾大，肾炎，和系统自我免疫病理，该病理类似于在患有系统的红斑狼疮或类风湿关节炎(RA)的病人中看到的。可以相信在Fas受体和辅助发展配体之间的相互反应是负责从在RA病人中可能损伤的关节中清除活化的淋巴细胞。
RA滑液淋巴细胞比匹配的RA血液淋巴细胞以更高比例的匹配正常供体血液淋巴细胞表达Fas受体。在其它方面，RA滑液淋巴细胞表达小的或没有表达辅助分子配体。因为RA滑液淋巴细胞对Fas诱导的细胞程序死亡敏感，在RA关节中局部表达Fas配体可能起去除潜在介导RA自我免疫病理的滑液单核细胞的作用是可行的。
图23显示了在淋巴细胞中Fas配体表达受到RA滑液液体的暴露的抑制。将正常供体血液T细胞利用1纳克/毫升PMA加0.5微摩尔/升离子霉素活化5小时。在存在类风湿关节炎血液血浆(圆环)，RA滑液液体(菱形)，或其它(方快)时温育细胞。另外，利用浓度提高的MMP抑制剂BB94温育细胞。在活化后，分析细胞中FACS表面表达Fas-配体。在图23中划出表达Fas配体的细胞的百分数。这一实验证明在RA滑液液体中存在因子和防止Fas-配体的表面表达的血清。
d.人，小鼠，和嵌合辅助分子配体，Fas配体的功能
为了确定ΔFasL构建体的能力，将上面提到的转染细胞与Fas-配体敏感的人T细胞系JURKAT混合。在共培养4小时后，收集非粘连JURKAT细胞并且评估细胞程序死亡。利用荧光化合物3，3i-二己基oxacarbocyanineiodide(DiOC6)评估细胞程序死亡，其中利用了前面叙述的方案的修饰方案。因为这，在室温下在磷酸缓冲盐中洗涤细胞(PBS，pH7.2)。将细胞放置于96孔的U底塑料平板的独立的孔中，放置的量是105-5×105细胞/孔，总体积为50毫升。如果表明，在加入DiOC6和碘化丙锭(PI)后，加入饱和量的PE共轭抗体。分别以40钠摩尔/升和10纳克/毫升的最后浓度利用了DiOC6和PI。然后，在37℃，5％CO2组织培养温育器中温育细胞15分钟。然后，染色的细胞在冰冷的PBS中洗涤两次，最后悬浮于200毫升SM并且通过FACS分析。从分析中排除具有正向的轻的分散的图谱和PI染色的特征的死细胞和碎片。
细胞表达ΔFasL-pcDNA3以便指导表达细胞的CD95的Fas-介导的细胞程序死亡的能力可以与表达FasL-pcDNA3的细胞比较。利用RA滑液液体，和具有或没有金属蛋白酶抑制剂，ΔFasL-pcDNA3或FasL-pcDNA3前和后培养物编码的蛋白质产物的相对稳定性已经通过表达配体的细胞流动计量术进行评估。
6.编码辅助分子配体，Fas配体的基因治疗载体的关节炎的治疗
如上所述制造的异源Fas-配体构建体显示了表达的最高的稳定性以及介导Fas诱导的细胞程序死亡的最大的能力，这些构建体可用于RA的基因治疗。在很好鉴定的关节炎的小鼠模型中测试了潜在的治疗构建体以便评估体内的效力和功能。
a.在小鼠中的关节炎的基因治疗
I.关节炎的小鼠模型
一个小鼠关节炎的模型是胶原诱导的关节炎。已知利用完全Freund佐药(CFA)中利用II型胶原注射DBA/1小鼠诱导了具有组织学相似RA的滑膜炎和侵蚀的关节炎。为了我们的研究，在0天利用在完全Freund佐药中的小牛II型胶原免疫雄性DBA/I小鼠，并且在21天腹膜内加强免疫。在28天，给予动物其它利用脂多糖(LPS)和/或同一类型的胶原的注射，或乙酸单独的注射。通常在第二次注射后3或4星期检测利用胶原免疫的动物中前爪或后爪的肿胀和/或红斑。脊椎很少受到影响，然后，只有几星期后，开始外在关节肿胀。在滑膜肥大后，受影响的关节展示滑膜水肿的最初的组织学变化。
另一个动物模型，是Kouskoff，V.等人在细胞87：811-822(1997)中最近叙述的，是通过将T细胞受体(TCR)转基因小鼠品系与非肥胖糖尿病(NOD)品系杂交偶然产生的，以便产生RA的KRN×NOD小鼠模型。这样的匹配的后代广泛地发展了与患有RA的病人的高度相似的关节疾病。另外，在这些动物中的疾病具有早的和可再生的开始时间和高度可再生的过程。通过转基因TCR偶然识别NOD起源的主要组织相容性复合物II类分子明显诱导了关节炎，导致在自我耐受和系统自我反应性的一般机制的破坏。
ii.在利用编码辅助分子配体的基因治疗载体治疗的小鼠中关节炎症状的缓解
我们已经采取和修改了最初Sawchuk和同事叙述的在小鼠关节中微注射腺病毒的方案。利用这一过程，我们可以在小鼠漆盖的关节空间再生性地注射5微升体积腺病毒载体。在这一过程中，利用metofane麻醉小鼠。利用#11粗刀片在漆盖的后面的皮肤中小小切入大约2-3毫米以便可见漆胫节韧带。我们可以利用微型100微升Hamilton针筒和30计量的针头注射5微升液体。在注射后，利用Nexabond(畜牧业产品实验室)封闭漆盖切入。通常我们的腺病毒效价超过每毫升1010个噬菌斑形成单位(pfu)，使它可能在漆关节中在5毫升中至少递送至少5×108pfu的病毒，如上面概述。利用对照Ad-lacZ载体，缺乏转基因的复制缺陷腺病毒载体，或利用用于悬浮病毒的缓冲液(10毫摩尔/升Tris，1毫摩尔/升MgCl2，10％甘油)注射对照动物。
在另一个方法中，从与打算接受转导细胞的转移的寄主动物同源的小鼠中收集脾细胞。利用外源的IL-12(100单位/毫升)将诱导细胞增殖48小时。计数细胞，并且然后以每孔1毫升完全培养基，在12个孔的盘中以每毫升5×105或1×106个细胞的密度再涂布。在存在polybrene(8微克/毫升)时，在再涂布时间一起加入病毒和ConA。在利用含有100单位的重组IL-2每毫升的完全培养基感染后改变培养基24小时。以便通过流动细胞计量术在感染或48小时检测转导细胞的等分试样中Fas配体的表达。
动物将腹膜内接受标准数目的细胞因子生产细胞或对照模拟转染细胞。在小鼠滑膜中直接注射浓缩的细胞悬浮液，如部分4A所述。平行地，转染的细胞群体的等分试样维持在利用外源IL-2补充的组织培养物中。
以盲目的方式检测小鼠的关节炎的信号。记录疾病启动的日期并且将每个关节或关节组(脚趾，跗节，倮关节，手腕，漆盖)的临床严重性分级如下：0(正常)，1(红斑)，2(肿胀)，3(变形)，4(坏死)。总结得分情况产生关节炎得分。以疾病的临床过程中给定日期观察到的平均得分，和以每个小鼠达到的最大关节炎得分的平均表达关节炎的严重性。在死亡时间，自由解剖后爪并且进行组织学检测或RT-PCR。对于滑膜增殖和炎症细胞渗滤，在0-3的规模上评估关节炎的组织学严重性，其中0得分是正常和3＝严重。
对于接受滑膜内注射测试的腺病毒载体的对照的小鼠，比较在对侧位置之间观察到的关节炎的水平。另外，对于整个动物，将整个关节得分减去注射的关节的得分可以与在注射对照或测试腺病毒载体的关节中观察到的比较。
局部给药Fas-配体腺病毒表达载体将导致清除活化细胞，如定量RT-PCR测量CD80 mRNA的相对水平评估的。这一治疗也将导致增强的水平。同时，是否在受影响的小鼠滑膜组织中鉴定的细胞程序死亡的这样的水平得到TUNEL测试的评估(i°终端脱氧核苷酸转移酶(TdT)-介导的dUTPNick End标记i±)。通过在TdT缓冲液(30mMTris-HCl，pH7.2，140纳摩尔/升碳酸钠，1毫摩尔/升氯化钴)中浸泡切片，然后加入TdT(GIBCO BRL，格兰特岛，NY)和生物素化dUTP(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)进行TUNEL。通过在TB缓冲液(300毫摩尔/升氯化钠，30毫摩尔柠檬酸钠)中浸泡切片终止反应。随后，理由过氧化物酶标记的链霉抗生物素白蛋白处理样品，然后利用VECTASTAIN ABC试剂盒(载体实验室公司，Burlingame，CA)观察。对于免疫学组织化学，利用4％脱脂牛奶在室温下封闭切片30分钟，然后利用特异于小鼠CD30，B220，CD80，或CD95(Fas)的生物素化mAbs温育。这些抗体是可以从Pharmingen获得(圣迭戈，CA)。
b.利用编码辅助分子配体，Fas配体的基因治疗载体治疗类风湿关节炎病人
将鉴定为具有潜在的治疗效益的候选Fas-配体构建体用于治疗人的RA的方案。人方案包括递送Fas配体构建体的体内或来自体内的方法。另外，通过病毒或非病毒方法潜在地递送Fas配体构建体。下面叙述了治疗方案的轮廓。
来自体内的治疗相似于对于为了合成白细胞介素-1受体拮抗物逆转录病毒转导的自我滑膜细胞的关节内移植叙述的方案(Evan，Christopher，等人，评估安全性，可行性，和转移潜在的抗关节细胞因子基因到患有类风湿关节炎的人关节的效力的临床实验，人基因治疗，7卷，1261-1280)。在这一过程中，在RA临床诊断后，在总关节替代过程中收获滑膜。再分离和扩展滑膜细胞，然后利用异源Fas-配体转导和转染进入滑膜细胞(通过逆病毒，腺病毒，裸露的DNA，等等)。然后在病人中再注射基因修饰的滑膜细胞，该病人已经检测和测试了RA相关的症状的改良，和在修饰的滑膜细胞中Fas-配体的表达和功能。
在另一个来自体内的方案中，将稳定地表达异源Fas-配体的异源固定细胞系给药于RA病人。在这一方案中，构建表达Fas配体的稳定的不灭的细胞系(通过非病毒方法人电穿孔在细胞中转染基因，或通过在细胞中病毒转导基因导入)。在病人中注射修饰的细胞系，该病人已经检测和测试了RA相关症状的改良和修饰的滑膜细胞中hFas-配体的表达和功能。
基于体内的治疗将相似于利用Zhang，等人，临床研究杂志，100：1951-1957(1997)中叙述的小鼠Fas-配体腺病毒基因治疗载体的胶原诱导的关节炎的改良的概念。在我们的这样的途径的利用中，利用病毒或非病毒方法进行直接递送hFas-配体构建体或嵌合ΔfasL到RA病人的关节。在这一方案中，在滑膜中直接注射Fas-配体构建体(例如，hFas-配体腺病毒)。检测和测试病人中RA相关症状的改良以及生物学测试修饰的滑膜细胞中hFas-配体的表达和功能。
                                     序列表
(1)总信息：
  (i)申请人：Kipps，Thomas J.Sharma，Sanjai Cantwell，Mark
  (ii)发明的题目：含有辅助分钟配体基因的新表达载体和它们在恶性肿瘤和自我免疫疾病的免疫调节和治疗中的用途
  (iii)序列数目：35
  (iv)通讯地址
  (A)收信人：Lyon和Lyon
  (B)街道：西第五街633号，4700座
  (C)城市：洛杉矶
  (D)州：加里弗尼亚
  (E)国家：美国
  (F)邮编：90071-2066
  (v)计算机可读形式：
  (A)介质类型：3.5”软盘，1.44Mb储存
  (B)计算机：IBM兼容
  (C)操作系统：IBM P.C.Dos5.0
  (D)软件：FastSeq版本2.0
  (vi)当前申请资料：
  (A)申请号：待定
  (B)递交日期：
  (C)分类：
  (vii)在先申请资料：
  (A)申请号：60/132145
  (B)递交日期：96年9月12日
(viii)代理人信息：
(A)姓名：Guise，Jeffrey W.
(B)登记号：34,613
(C)档案号：231/003
(ix)通讯信息：
(A)电话：(213)489-1600
(B)传真：(213)955-0440
(C)电传：67-3510
(2)SEQ ID NO：1的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：786碱基对
(B)类型：核酸
(C)链数：单链
(D)拓扑结构：线性
(xi)序列描述：SEQ ID NO：1
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CTCTGA                                                               786
(2)SEQ ID NO：2的信息：
(I)序列特征：
(A)长度：783碱基对
(B)类型：核酸
(C)链数：单链
(D)拓扑结构：线性
(xi)序列描述：SEQ ID NO：2
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TGA                                                                  783
(2)SEQ ID NO：3的信息：
(I)序列特征：
(A)长度：783碱基对
(B)类型：核酸
(C)链数：单链
(D)拓扑结构：线性
(xi)序列描述：SEQ ID NO：3
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TGA                                                                  783
(2)SEQ ID NO：4的信息：
(I)序列特征：
(A)长度：786碱基对
(B)类型：核酸
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(xi)序列描述：SEQ ID NO：4
ATGATCGAAA CATACAACCA AACTTCTCCC CGATCTGCGG CCACTGGACT GCCCATCAGC     60
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  (I)序列特征：
  (A)长度：783碱基对
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ATGATCGAAA CATACAACCA AACTTCTCCC CGATCTGCGG CCACTGGACT GCCCATCAGC     60
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(2)SEQ ID NO：6的信息：
  (I)序列特征：
  (A)长度：786碱基对
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ATGATAGAAA CATACAGCCA ACCTTCCCCC AGATCCGTGG CAACTGGACT TCCAGCGAGC     60
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CTCTGA                                                               786
(2)SEQ ID NO：7的信息：
  (I)序列特征：
  (A)长度：786碱基对
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ATGATAGAAA CATACAGCCA ACCTTCCCCC AGATCCGTGG CAACTGGACT TCCAGCGAGC     60
ATGAAGATTT TTATGTATTT ACTTACTGTT TTCCTTATCA CCCAAATGAT TGGATCTGTG    120
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CTCTGA                                                               786
(2)SEQ ID NO：8的信息：
  (I)序列特征：
  (A)长度：864碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
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  (xi)序列描述：SEQ ID NO：8
AACTCTAACG CAGCATGATC GAAACATACA GTCAACCTTC TCCCCGCTCC GTGGCCACTG     60
GACCACCTGT CAGTATGAAA ATTTTTATGT ATTTACTTAC AGTTTTTCTT ATCACCCAGA    120
TGATTGGGTC AGCGCTTTTT GCTGTGTATC TTCACAGACG ATTGGACAAG ATAGAAGACG    180
AAAGGAATCT TCATGAAGAT TTTGTGTTCA TGAAAACGAT ACAGAGATGC AATAAAGGAG    240
AGGGGTCCTT ATCCTTACTG AACTGTGAGG AAATTAGAAG CCGGTTTGAA GACTTGGTCA    300
AGGATATAAT GCAAAACAAA GAAGTAAAGAAGAAAGAAAA  AAACTTTGAA ATGCACAAGG    360
GTGATCAGGA GCCTCAGATA GCGGCACATG TCATCAGTGA GGCCAGTAGT AAAACAACCT    420
CTGTTCTCCA GTGGGCCCCC AAAGGATACT ACACCCTAAG CAACAACCTG GTAACCCTCG    480
AAAACGGGAA ACAGCTGGCC GTGAAAAGAC AAGGATTCTA TTACATCTAC ACCCAAGTCA    540
CCTTCTGTTC CAATCGGGAA ACTTTGAGTC AAGCTCCATT TATAGCCAGC CTCTGCCTGA    600
AGTCCCCAAG TGGATCAGAG AGAATCTTAC TGAGAGCTGC AAACACCCAC AGTTCTTCCA    660
AACCATGCGG GCAGCAATCC ATTCACTTAG GAGGAGTCTT TGAATTGCAA TCGGGTGCTT    720
CGGTGTTTGT CAATGTGACT GATCCAAGTC AAGTGAGCCA CGGGACGGGC TTCACATCAT    780
TTGGCTTACT CAAACTCTGA ACGGTGTAAG CCAGCAGGCT GCGGCTGGGC TGATGCTGGT    840
GGTCTTCACA ATCCAGGAAA GCAG                                           864
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  (I)序列特征：
  (A)长度：3634碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (D)拓扑结构：线性
  (xi)序列描述：SEQ ID NO：9
GAATTCCGGG TGATTTCACT CCCGGCTGTC CAGGCTTGTC CTGCTACCCC ACCCAGCCTT     60
TCCTGAGGCC TCAAGCCTGC CACCAAGCCC CCAGCTCCTT CTCCCCGCAG GACCCAAACA    120
CAGGCCTCAG GACTCAACAC AGCTTTTCCC TCCAACCCGT TTTCTCTCCC TCAACGGACT    180
CAGCTTTCTG AAGCCCCTCC CAGTTCTAGT TCTATCTTTT TCCTGCATCC TGTCTGGAAG    240
TTAGAAGGAA ACAGACCACA GACCTGGTCC CCAAAAGAAA TGGAGGCAAT AGGTTTTGAG    300
GGGCATGGGG ACGGGGTTCA GCCTCCAGGG TCCTACACAC AAATCAGTCA GTGGCCCAGA    360
AGACCCCCCT CGGAATCGGA GCAGGGAGGA TGGGGAGTGT GAGGGGTATC CTTGATGCTT    420
GTGTGTCCCC AACTTTCCAA ATCCCCGCCC CCGCGATGGA GAAGAAACCG AGACAGAAGG    480
TGCAGGGCCC ACTACCGCTT CCTCCAGATG AGCTCATGGG TTTCTCCACC AAGGAAGTTT    540
TCCGCTGGTT GAATGATTCT TTCCCCGCCC TCCTCTCGCC CCAGGGACAT ATAAAGGCAG     600
TTGTTGGCAC ACCCAGCCAG CAGACGCTCC CTCAGCAAGG ACAGCAGAGG ACCAGCTAAG     660
AGGGAGAGAA GCAACTACAG ACCCCCCCTG AAAACAACCC TCAGACGCCA CATCCCCTGA     720
CAAGCTGCCA GGCAGGTTCT CTTCCTCTCA CATACTGACC CACGGCTTCA CCCTCTCTCC     780
CCTGGAAAGG ACACCATGAG CACTGAAAGC ATGATCCGGG ACGTGGAGCT GGCCGAGGAG     840
GCGCTCCCCA AGAAGACAGG GGGGCCCCAG GGCTCCAGGC GGTGCTTGTT CCTCAGCCTC     900
TTCTCCTTCC TGATCGTGGC AGGCGCCACC ACGCTCTTCT GCCTGCTGCA CTTTGGAGTG     960
ATCGGCCCCC AGAGGGAAGA GGTGAGTGCC TGGCCAGCCT TCATCCACTC TCCCACCCAA    1020
GGGGAAATGA GAGACGCAAG AGAGGGAGAG AGATGGGATG GGTGAAAGAT GTGCGCTGAT    1080
AGGGAGGGAT GAGAGAGAAA AAAACATGGA GAAAGACGGG GATGCAGAAA GAGATGTGGC    1140
AAGAGATGGG GAAGAGAGAG AGAGAAAGAT GGAGAGACAG GATGTCTGGC ACATGGAAGG    1200
TGCTCACTAA GTGTGTATGG AGTGAATGAA TGAATGAATG AATGAACAAG CAGATATATA    1260
AATAAGATAT GGAGACAGAT GTGGGGTGTG AGAAGAGAGA TGGGGGAAGA AACAAGTGAT    1320
ATGAATAAAG ATGGTGAGAC AGAAAGAGCG GGAAATATGA CAGCTAAGGA GAGAGATGGG    1380
GGAGATAAGG AGAGAAGAAG ATAGGGTGTC TGGCACACAG AAGACACTCA GGGAAAGAGC    1440
TGTTGAATGC TGGAAGGTGA ATACACAGAT GAATGGAGAG AGAAAACCAG ACACCTCAGG    1500
GCTAAGAGCG CAGGCCAGAC AGGCAGCCAG CTGTTCCTCC TTTAAGGGTG ACTCCCTCGA    1560
TGTTAACCAT TCTCCTTCTC CCCAACAGTT CCCCAGGGAC CTCTCTCTAA TCAGCCCTCT    1620
GGCCCAGGCA GTCAGTAAGT GTCTCCAAAC CTCTTTCCTA ATTCTGGGTT TGGGTTTGGG    1680
GGTAGGGTTA GTACCGGTAT GGAAGCAGTG GGGGAAATTT AAAGTTTTGG TCTTGGGGGA    1740
GGATGGATGG AGGTGAAAGT AGGGGGGTAT TTTCTAGGAA GTTTAAGGGT CTCAGCTTTT    1800
TCTTTTCTCT CTCCTCTTCA GGATCATCTT CTCGAACCCC GAGTGACAAG CCTGTAGCCC    1860
ATGTTGTAGG TAAGAGCTCT GAGGATGTGT CTTGGAACTT GGAGGGCTAG GATTTGGGGA    1920
TTGAAGCCCG GCTGATGGTA GGCAGAACTT GGAGACAATG TGAGAAGGAC TCGCTGAGCT    1980
CAAGGGAAGG GTGGAGGAAC AGCACAGGCC TTAGTGGGAT ACTCAGAACG TCATGGCCAG    2040
GTGGGATGTG GGATGACAGA CAGAGAGGAC AGGAACCGGA TGTGGGGTGG GCAGAGCTCG    2100
AGGGCCAGGA TGTGGAGAGT GAACCGACAT GGCCACACTG ACTCTCCTCT CCCTCTCTCC    2160
CTCCCTCCAG CAAACCCTCA AGCTGAGGGG CAGCTCCAGT GGCTGAACCG CCGGGCCAAT    2220
GCCCTCCTGG CCAATGGCGT GGAGCTGAGA GATAACCAGC TGGTGGTGCC ATCAGAGGGC    2280
CTGTACCTCA TCTACTCCCA GGTCCTCTTC AAGGGCCAAG GCTGCCCCTC CACCCATGTG    2340
CTCCTCACCC ACACCATCAG CCGCATCGCC GTCTCCTACC AGACCAAGGT CAACCTCCTC    2400
TCTGCCATCA AGAGCCCCTG CCAGAGGGAG ACCCCAGAGG GGGCTGAGGC CAAGCCCTGG    2460
TATGAGCCCA TCTATCTGGG AGGGGTCTTC CAGCTGGAGA AGGGTGACCG ACTCAGCGCT    2520
GAGATCAATC GGCCCGACTA TCTCGACTTT GCCGAGTCTG GGCAGGTCTA CTTTGGGATC    2580
ATTGCCCTGT GAGGAGGACG AACATCCAAC CTTCCCAAAC GCCTCCCCTG CCCCAATCCC    2640
TTTATTACCC CCTCCTTCAG ACACCCTCAA CCTCTTCTGG CTCAAAAAGA GAATTGGGGG    2700
CTTAGGGTCG GAACCCAAGC TTAGAACTTT AAGCAACAAG ACCACCACTT CGAAACCTGG    2760
GATTCAGGAA TGTGTGGCCT GCACAGTGAA GTGCTGGCAA CCACTAAGAA TTCAAACTGG    2820
GGCCTCCAGA ACTCACTGGG GCCTACAGCT TTGATCCCTG ACATCTGGAA TCTGGAGACC    2880
AGGGAGCCTT TGGTTCTGGC CAGAATGCTG CAGGACTTGA GAAGACCTCA CCTAGAAATT    2940
GACACAAGTG GACCTTAGGC CTTCCTCTCT CCAGATGTTT CCAGACTTCC TTGAGACACG    3000
GAGCCCAGCC CTCCCCATGG AGCCAGCTCC CTCTATTTAT GTTTGCACTT GTGATTATTT    3060
ATTATTTATT TATTATTTAT TTATTTACAG ATGAATGTAT TTATTTGGGA GACCGGGGTA    3120
TCCTGGGGGA CCCAATGTAG GAGCTGCCTT GGCTCAGACA TGTTTTCCGT GAAAACGGAG    3180
CTGAACAATA GGCTGTTCCC ATGTAGCCCC CTGGCCTCTG TGCCTTCTTT TGATTATGTT    3240
TTTTAAAATA TTTATCTGAT TAAGTTGTCT AAACAATGCT GATTTGGTGA CCAACTGTCA    3300
CTCATTGCTG AGCCTCTGCT CCCCAGGGGA GTTGTGTCTG TAATCGCCCT ACTATTCAGT    3360
GGCGAGAAAT AAAGTTTGCT TAGAAAAGAA ACATGGTCTC CTTCTTGGAA TTAATTCTGC    3420
ATCTGCCTCT TCTTGTGGGT GGGAAGAAGC TCCCTAAGTC CTCTCTCCAC AGGCTTTAAG    3480
ATCCCTCGGA CCCAGTCCCA TCCTTAGACT CCTAGGGCCC TGGAGACCCT ACATAAACAA    3540
AGCCCAACAG AATATTCCCC ATCCCCCAGG AAACAAGAGC CTGAACCTAA TTACCTCTCC    3600
CTCAGGGCAT GGGAATTTCC AACTCTGGGA ATTC                                3634
(2)SEQ ID NO：10的信息：
  (I)序列特征：
  (A)长度：1997碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (D)拓扑结构：线性
  (xi)序列描述：SEQ ID NO：10
GAGACAGAGT CTTGCTCTGT CCCCCAGGCT GGAATACAGT GGTGCGATCT TGACTCACTG     60
CAGCCTCCGC CTCCCAGGTT CAAATAATTC TCCAGCCTCA GCCTCCCGAG TAGCTGGGAC    120
TGCAGATGCG CACCAGCACG CCTGGCTAAT TTTTGTATTT ATTATAGAGA TGGGGTTTCA    180
CCATGTTGGC CAGCTGGTCT CAAACTCCTG ACCTCAAGTA ATCCGCCCAC CTCAGACTCC    240
CAAAGTGCCA GGATTACAGG TGTGAGCCAC TGCACCAGGC CTGGAACAAT TTTAAAATAA    300
TGTATTGGCT CTGCAAATGC AGCTTCAGAA CAAGTCCCTT AGCTGTCCCC ACCCCACCCT     360
AAGTCACCAC CCTTAAGCCT CACCCATGTG GAATTCTGAA ACTTCCTTTG TAGAAAACTT     420
TGGAAGGTGT CTGCCACATT GATCCTGGAA TGTGTGTTTA TTTGGGGTTA TATAAATCTG     480
TTCTGTGGAA GCCACCTGAA GTCAGGAAGA GATGGAGGGC ATCCTTCAGG AGTGAGATGA     540
GACCTCATCA TACTTGACTG TCCAGCATCA TCTCTGAGTA AGGGGACCAA AAAATTTATC     600
TTCCAAACTA GGACACTTTC AAGAGTGGAA GGGGGATCCA TTAATATTTT CACCTGGACA     660
AGAGGCAAAC ACCAGAATGT CCCCGATGAA GGGGATATAT AATGGACCTT CTTGATGTGA     720
AACCTGCCAG ATGGGCTGGA AAGTCCGTAT ACTGGGACAA GTATGATTTG AGTTGTTTGG     780
GACAAGGACA GGGGTACAAG AGAAGGAAAT GGGCAAAGAG AGAAGCCTGT ACTCAGCCAA     840
GGGTGCAGAG ATGTTATATA TGATTGCTCT TCAGGGAACC GGGCCTCCAG CTCACACCCC     900
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CCCACTCCCT GGCCCTCCCA GCCCACGATT CCCCTGACCC GACTCCCTTT CCCAGAACTC    1020
AGTCGCCTGA ACCCCCAGCC TGTGGTTCTC TCCTAGGCCT CAGCCTTTCC TGCCTTTGAC    1080
TGAAACAGCA GTATCTTCTA AGCCCTGGGG GCTTCCCCGG GCCCCAGCCC CGACCTAGAA    1140
CCCGCCCGCT GCCTGCCACG CTGCCACTGC CGCTTCCTCT ATAAAGGGAC CTGAGCGTCC    1200
GGGCCCAGGG GCTCCGCACA GCAGGTGAGG CTCTCCTGCC CCATCTCCTT GGGCTGCCCG    1260
TGCTTCGTGC TTTGGACTAC CGCCCAGCAG TGTCCTGCCC TCTGCCTGGG CCTCGGTCCC    1320
TCCTGCACCT GCTGCCTGGA TCCCCGGCCT GCCTGGGCCT GGGCTTGGTG GGTTTGGTTT    1380
TGGTTTCCTT CTCTGTCTCT GACTCTCCAT CTGTCAGTCT CATTGTCTCT GTCACACATT    1440
CTCTGTTTCT GCCATGATTC CTCTCTGTTC CCTTCCTGTC TCTCTCTGTC TCCCTCTGCT    1500
CACCTTGGGG TTTCTCTGAC TGCATCTTGT CCCCTTCTCT GTCGATCTCT CTCTCGGGGG    1560
TCGGGGGGTG CTCTCTCCCA GGGCGGGAGG TCTGTCTTCC GCCGCGTGCC CCGCCCCGCT    1620
CACTGTCTCT CTCTCTCTCT CTCTTTCTCT GCAGGTTCTC CCCATGACAC CACCTGAACG    1680
TCTCTTCCTC CCAAGGGTGT GTGGCACCAC CCTACACCTC CTCCTTCTGG GGCTGCTGCT    1740
GGTTCTGCTG CCTGGGGCCC AGGTGAGGCA GCAGGAGAAT GGGGGCTGCT GGGGTGGCTC    1800
AGCCAAACCT TGAGCCCTAG AGCCCCCCTC AACTCTGTTC TCCCCTAGGG GCTCCCTGGT    1860
GTTGGCCTCA CACCTTCAGC TGCCCAGACT GCCCGTCAGC ACCCCAAGAT GCATCTTGCC    1920
CACAGCACCC TCAAACCTGC TGCTCACCTC ATTGGTAAAC ATCCACCTGA CCTCCCAGAC    1980
ATGTCCCCAC CAGCTCT                                                   1997
(2)SEQ ID NO：11的信息：
  (I)序列特征：
  (A)长度：10240碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (D)拓扑结构：线性
  (xi)序列描述：SEQ ID NO：11
GAATTCCCCG GATCAAAGTC AGCATTAAAT CCCAGTTTAG GTTTTGAGGC TAAGTTCAAG      60
TTTGAGTCTA ATGTCATTTC AGCCTTGTTT GGAGGACTCA GAGATTTCAC TAGTTTCTCC     120
GCAGAGACCA CTGTAGAAAC TGCATTTCCC TGAGTTTTGG GCACAAGACT CCAGTCATCA     180
CCCCTCCCAC ACAGGGAAAG CCCCAAACCA ACTGCTGGCC TCCTCAAGAA AGAAACCGAA     240
TTTCACACAA CCTCCGAAAC TAAGATTGAA ACCAAGATTG GCCCATCTCA AGGCGCGTCC     300
TCCAGCACAT TGAGAATGTC GCTGATGGAG CCTCGGCCCA GCTCTCGAGC TTCCTTCCTT     360
TCTGTCTCTC ATGTCTTCTC ATCACTCCTT CTCACCTTCC CGTTTTTGTC CTGCAATGCC     420
CCCTTCTTCC TCTCTTCCTG GGGTTTTTCC CTTTATTTCT CACTGTACCA TTTTATATTT     480
TAATAAAGCC GAGGTCTCCT AGTCCATCAG CTCCTACTGT TGGAGAGGAG GCAGAAAGAA     540
ACAGCAGGAC GGCAAAGGGA CTCCAGAGAA AGAGACTCAG AGGAAAGGCA AGAAACAGGG     600
ACCAAGAGAG AGGCCAACAG TGACACAAGA CACAGTGAGG TTAAAAGAAA TAAGATGAGG     660
CCAAGATAGA GACCAAGCTA TTTAAAAGAG CCATCTGTGG CTACCCTTCT TCCGCCATCG     720
CATCTGGTCA GCCACCAAGA TTTTGCCTAG AAACGTTCCT CCTCTCCATT CTCCTGCTGC     780
TGCTGCTGCT GCTGCTGCTG CTGCTGCTGC TGCTGCTGCT GCTGCTGCTG CTGCCTTAAT     840
ACGAATGCAG GCTCTTGTCA TCTCCTTGCT GGGTTGTTGC AAAATCCTCC TAACTGGTCT     900
CCACACTTCT CATTTCCCCT CCAGCCCCCC ATCTTCCATA CTTCCATTTA TTTATTTTGG     960
CCATGCCCAT GGCATGTGGC AGTTCCAGGG GCCAGGGATC AAACCTGTGC CAATGCAGTG    1020
ACCGTGTCAG ATCCTTAACC CACTGCACAC AAGGCAACGC CCCTCGAGTC ATTCTCATTT    1080
TTTAAATATA CCAATTTGAG GGGGTCCCTC TTTCACTTAA AAATTTTGGC AGCTCCCTAT    1140
CATGATGAGA AGGAATTCCA AACCATTTTT CTTGTGTGCA AACCCTTCAG CATGTGTCCT    1200
CAGCTTACTT CCCAAGCCTC ATCCCTGCTC CTTCTACGTG TACCCATGTG TACATCTCCA    1260
CACACCATAT ACTCTTTTTT ACCTCCCATC TTTGCACCTT CTGTTCCCTC TCTCTGCCCC    1320
TCACCATCTT TTTTGCTTTG ATACTTAATG CCTCTCCCTC AGGCCAGGTT CAATGGCTTT    1380
TCTGTGGGCT GCTTTAAGCC CACTGTCATG GAACTTATCA CATTTTATTT TATTTGACTT    1440
TCTTTTTAGG GCCGCACCCA GCATATGGAG ATTCCCAGGC TAGGGATCTA ATCGGAGCTG    1500
TATCTGCCAG CCTGCGCTGG AGCCACAGCA ACGTGGGATC CGAGCCTGAG GGGTTTTGAT    1560
GTCCTGTGGC ACAGAAGTTA CATTCAGGCT GTGCATGAAC TATTTCTCCT GTTCTCCTCC    1620
CCCTGCTTGA GGCCCTGCAG CTTTGCCTCT CATGCCTTGC TGCTCTGACC TATGACTTCT    1680
TTTTGTTTGC ATTCCATCTC TTTAGTTTTC TCTCTGTTCC ACAAACATTT ACTGAGCATC    1740
TACATGAGGC ATTGAGGATA CGGATGGGAA AGACAGTCCC CTGACCTCTG GGACCTCAAA    1800
GACCAATTGT GGAAGACTGG TTGGTTATCA GATAATTACA ATGAAGTGTG GGAGTCCCTG    1860
TCATGGGTCA GCAGGTAATG AACCCAGTAA ACGATCCATG AGGATGCAGA TTCAATCCCT    1920
GGCCTTGCTC AGCGGGTTAA GGATCCAGCG TTCCCACAAG CTGTGGTGTA GGTCGCAGAT    1980
GCGACTCAGA TCTTGCATTG CTGTGGCTGT GGTGTAGGCT GGTGGCTACC CCTAGCCTGG    2040
GAACCTCCAT ATGCCTCAGG TGCGGCCCTA AAAGACAAAA AAAAAAAAGA GAGAAACTTT    2100
TCTTTTTCTT AATGTGTAAC CTACAAGCTA AGTGAAAACT GGCTCCTATT CCATAACGTT    2160
TGTATCATTT TTCATACTAG CCAAATACTA GAAACAGGGA GTTCCCGTCG TGGTGCAGCA    2220
GAAACAAATT CGACTAGGAA CCATGAGGTT GCGGGTTCGA TCCCTGGCCT TGCTCAGTGG    2280
GTTAAGGATC CGGCGTTGCC GTGAGCTGTG GTGTAGGTCG CAGATGTGGC TCGGATCTAG    2340
TGTTGCTGTG GCTCTGGTGT AGGCCGGCAG CAACAGCTCT GATTAGACTC CTAGCCTGAG    2400
AACCTCCATA AGCTGTGGCT GCGGCCCTAT AAAGACAAAA AAAAAAAAAA GGCCAAATAC    2460
TAGAAACAAA CCAAATGCCC ATCAACAGAA GAATAGATAA GTTAATTGGG GTATATGCAC    2520
ACAATAGCAT CACACAATAA CATGCACACA ATAACATCAC AATGAAATAA AAATTACTAC    2580
TGACAGACAC AACCATATAG ATGAATTTCA CAAACACAAC AGCGAGAATA AAAGCCAAGC    2640
ACAGATGAGT TGTCTGTGTG GATTCATTTC TATGAAGTTC AAGCGCAGGA AGAACTTAAT    2700
CTATAGTGAC AGAGGTCAGA GAGCAGTTGG TTGTCTTTGG CAGGTATGAA CTGGGAGTGG    2760
GCATGAGAGA ACTTTCTGGA GACCTAAAAA TATATTGGAC TGGATGGTGG CAACATGGCT    2820
ACAAGAAGAT GGAAAAGTTC CTCAGGCTGT CCACTTGGGA GACGGGCTTC TCACGGGACC    2880
TAAGTTCTGC ATCAGCAGAG GGGGAAATCC TTAATGATTT GACAATTACA AAGTGTATTG    2940
GCTTTACCGA TGTATTTTCA ACACAATCCC TCTGCTGTCC CCACCCCACC CTAGGTCACC    3000
ACCCTTAAGC TCCACCTGTG TGGAATTCTG AAGCCTCCCC TGTAGAGAAC TTTAGCAGTT    3060
GCCACGTTCT TTTGATGCAG GAACGTGTTG TCTAGAGTTA GACACATCTG ATCTGTGGGG    3120
CCCACCCAAG GTTGGGACAT GGTGGGGGGC GGCCTTCTGC AGTGAGATGA AACCTCATTG    3180
TAGGTGATTT CGTGGCCTCA TCCCTGAGTC AGATCTTCCA AATGAGGACA CTTTGGAGAG    3240
CAAAAGGGGG CTCCCTGAAG ATTTCCTCCA GGACAGCAGG AACAAACCAG GATGTCCCAG    3300
GCAGGAGGGT ATAGAAGGGA ACTTGTTGAT ATGAAATCAG CCAGATGACC TGGAAAATAC    3360
ACAGACTGGG ACAAGTGTGA CTTGAGCCTC TTGGGCCCAG GACAGGGGTA CAGAGGAGGA    3420
AACGTGCACA GAGAGAAGCC CGTAATCAGC CAAGGCTGCA GAGGTGTTAT ACATAATCGC    3480
TCTTCACGCA ACCGGGCAAG CAGCCCACGC CCCAGCTGCA CTCCATCTCC TCCTCTGAAC    3540
TCACCGTCCC TTCTCTGGAA CTCCTAAGCC TGACCCCGCT CCCTGGCCCT CCCAGCCCAC    3600
GGTTCCCCTG ACCCCACTCC CTTTCCCAGA ACTCAGTCAT CTGAGCCCCC AGCCTGCGTT    3660
CTCTCCTAGG CCTCAGCCTT TCCTGCCTTC GCGTGAAACA GCAGCATCTT CTAAGCCCTG    3720
GGCTTCCCCA GGCCCCAGCC CCGGCCTAGA ACCCGCCCAG CCGACCTGCC CACGCTGCCA    3780
CTGCCGGCTT CCTCTATAAA GGGACCCAGG GCGCCCAGAA AGGGGCCCAC AGGGGTCCCG    3840
CACAGCAGGT GAGACTCTCC CACCCCATCT CCTAGGGCTG TCCGGGTGCT GGACTCCCCC    3900
CTCACTTCGG TCCCTCCGCC CGCTCCCTGG CCTTCCTGCC CCTCCTGCAT CTTCACCCCG    3960
GCCTGGGCCT TGGTGGGTTT GGTTTTGGTT TGTTCTCTCT GATTCTTTAT CTGTCAGGCT    4020
CTTTCTAGCT CTCACACACT CTGATCCCTC TCTGTTCCCT TCCCATCTCT GTTTCTCTCT    4080
GGGTCTCCCC CTGCTCACCT CGGGATTTCC CTGAGTGCCT CTGGTCCCCT TCTCTGTCTG    4140
GCGCCCCGTC TCTTGTCTCT CGGGGTGGCT GTCTCCGAGG GCAGGAGGCC TTCTTCCGCA    4200
GGTGCCCCGC CCCGCTCACT GTCTCTCTCC CCCCACAGGT TTTCCCCATG ACACCACCTG    4260
GACGCCTCTA CCTCCGGAGG GTGTGCAGCA CCCCCATCCT CCTCCTCCTG GGGCTGCTGC    4320
TGGCCCTGCC GCCCGAGGCC CAGGTGAGGC AGCAGGAGAG CGGGCCGTGG GGGCAGCCTT    4380
CGCCAACCTT GGGCCTCAGA GCCTCTCTGA CGCTCTTCTC CCCTAGGGGC TCCCTGGCGT    4440
CGGCCTCCCA CCCTCAGCTG CACAGCCTGC CCATCAGCAC CCCCCAAAGC ACTTGGCCAG    4500
AGGCACCCTC AAACCTGCCG CTCACCTCGT TGGTAAACAT CCACCTGGCC TCCCAGACCT    4560
GTAGCCCCCA GTCCTCCTCC TATGCCCCTG CTTCAGGGAC TGAAGCATCC CTCCCCCCCA    4620
TCTCCCCCCA CCCCCTAAAT GGAGGCATCC CACTCCCGAC TCCCTCCCAA CCATCCCCCA    4680
GGAACTCAGT CCAGCACCTG CTTCCTCAGG GATTGAGACC TCCGACCCCC AGGTCCTTGA    4740
CTCCCACCCC CTCTGGCTCT TCCTAGGAGA CCCCAGCACC CCGGACTCAC TGCGCTGGAG    4800
AGCGAACACG GATCGTGCCT TCCTCCGCCA TGGCTTCTTG CTGAGCAACA ACTCCCTGCT    4860
GGTCCCCACC AGTGGCCTCT ACTTTGTCTA CTCCCAGGTC GTCTTCTCCG GGGAAGGCTG    4920
CTTCCCCAAG GCCACCCCCA CCCCTCTCTA CCTGGCCCAC GAGGTCCAGC TCTTCTCCTC    4980
CCAGTACCCC TTCCACGTGC CGCTCCTCAG CGCTCAGAAG TCCGTGTGCC CCGGGCCACA    5040
GGGACCTTGG GTGCGCTCTG TGTACCAGGG GGCTGTGTTC CTGCTCACCC AGGGAGATCA    5100
GCTGTCCACA CACACAGACG GCACCCCCCA CCTGCTCCTC AGCCCCAGTA GCGTCTTCTT    5160
TGGAGCCTTC GCTCTATAGA AGAATCCAGA AAGAAAAAAA TTGGTTTCAA GGCCTTCTCC    5220
CCTTTTCACC TCCCTTATGA CCACTTCGGA GGTCACCGCG CCTCTCCTCT GACAATTTCC    5280
AACAGTCTCA TCTTCCCCCA CGCTCAGCAC CTGGAGCTTC TGTAGAAGGA ATTCTAGGCA    5340
CCTCGGGGGA ACTGGAACCA CCCCGGATGC TCTGCTGAGG ATCTGAATGC CCGCCTGGAG    5400
CCCTTCCCCT GTCCTGCCCG TCTAGGGGCC CTCGTCCAGG ACGTGGAAGG GAAGCTGACC    5460
CATGAGGGAC TTTGAACGGA TGACCGGAGC GGTGTGGGGG GGTTATTTAT GAAGGGGAAA    5520
ATTAAATTAT TTATTTATGG AGGATGGAGA GAAGGGAATC ACAGAGGGAT GTCAGAAGAG    5580
TGTGACACAT GTGCCCAAGA GATAAAGTGA CAGAAGGCAT GGGCTCCAGA TGACCCGGCC    5640
AGAGAGGGCA AAGTGGCTCA GGAAGGGGCT GCTTGACTGG AGGCTCATGA GGAGACGGCT    5700
GACCCTCGAT GAAACCCAAT AAAGCTCTTT TCTCTGAAAT GCTGTCTGCT CGTATCTGTC    5760
ACTCGGGAGG GGAGAATTCT CCAGATGTCT CTAAGGAGTG GAGGGAGGAC AGGAATCAGA    5820
GGGGACGGGA GCTGTGGGTG TGTGATGAGG CCTAAGGGGC TCAGGTGAGA GATGGCGGCC    5880
TCAGGGTGAG GGCAGCCAGA CCCCTGCAGG AGAAGCAGAT GGTTCCTCTG AGAAGACAAA    5940
GGAAGAGATG CAGGGCCAAG GTCTTGAGAA CCGAGGTCGG GGGTCGCCTG GCAGATATGG    6000
CCACAGGTAG AGGGACAGAG GAATAGGGGT GACAGGAGGC TTCCCGGGAG AAGGGAACAC    6060
ACTGAGGGGT GTTCGGGATT CTGAGGGAGG AGCACGGGGA CGCCCTGGGA GACATGCCGT    6120
CCAGGGCCAT GAGGAGTGGG AGAGCCTCTG AGGCTAGCGG CTGGAGATAC AGGGACATTT    6180
GAGGAGACAC GGTCATGGCC AGGAGCCGCG AGGGCCTGGA CAGTCTCTAG GAATCTCGAA    6240
GAAGCAGGAA TTCTTTGAGG ATACGTGGCC ACACAAAGGG AGGCTGAGGT GTGGGGACTT    6300
CATGCAGAAG TCAGGGCCTC ACATTCCCTT GGAAGCCGAG ACTGAAACCA GCAGCAGAGT    6360
TTTGGTGAGT TCCTGTCAGA GTGAAAGGAG AAGGCCCGCC ATGGTGGGTT TGTGAATTCC    6420
CAGCCTGGCT TCCTCTCCCT CTGGGGCTGT CCCAGGCCTG TTCCTGCCGT CCTCCCCCAG    6480
CCCGTGTAGG GCCTCCAGCT GCCCTTCTCC CAGCTCCTCT TCCCTCCAGG AGACGAAACA    6540
TGGGTCTCAG CACCCAGCGC GGTGTCGTCT AAGTTTTCTC TCCATTAAGA ACTCAGCTTT    6600
CTGAAGCTCC TCCCATTCCT AGTTCTACCC CTACCTGAGC CCTGTTCGGA AATCAGAGAG    6660
AAATAGAAGT CATCCCCCAA AGAAAAGGAA TTTGTCCCCC AAAGAAACAG AACTTGTCCC    6720
CCAAAGAAAT GGAAACAATG GGAAATGGGA GGCAGGGGGG ACCTGGGGTC CAGCCTCCAG    6780
GGTCCTACAC ACAGAGCAGT AACTGGCCCA GCAAGCCCAC CTCAGGATCC GGGCAGGGAG    6840
GGTAGGAAGT ATCCCTGATG CCTGGGTGTC CCCAACTTTC CAAACCGCCG CCCCCGCTAT    6900
GGAGATGAAA CTAAGACAGA AGGTGCAGGG CCCGCTACCG CTTCCTCCAG ATGAGCTCAT    6960
GGGTTTCTCC ACCAAGGAAG TTTTCCGCTG GTTGAAAGAG AGCCTCTCCC CGCCCTCTTC    7020
TCACCCAGAG CGTATAAATG CAGCTGTTTG CACACCCAGC CAGCAGAAGC TCCCAGAGTG    7080
AGGACACCAG GGGACCAGCC AGGAGAGAGA CAAGCCATCT CCAGGACCCC CTAGAAATAA    7140
CCTCTCAGAA GACACACCCC CGAACAGGCA GCCGGACGAC TCTCTCCCTC TCACACGCTG    7200
CCCCGGGGCG CCACCATCTC CCAGCTGGAC CTGAGCCCCT CTGAAAAAGA CACCATGAGC    7260
ACTGAGAGCA TGATCCGAGA CGTGGAGCTG GCGGAGGAGG CGCTCGCCAA GAAGGCCGGG    7320
GGCCCCCAGG GCTCCAGGAG GTGCCTGTGC CTCAGCCTCT TCTCCTTCCT CCTGGTCGCA    7380
GGAGCCACCA CGCTCTTCTG CCTACTGCAC TTCGAGGTTA TCGGCCCCCA GAAGGAAGAG    7440
GTGAGCGCCT GGCCAGCCTT GGCTCATTCT CCCACCCGGA GAGAAATGGG GAAGAAAGAG    7500
GGCCAGAGAC GAGCTGGGGG AAAGAAGTGT GCTGATGGGG AGTGTGGGGA GGAAATCATG    7560
GAGAAAGATG GGGAGGCAGA AGGAGACGTG GAGAGAGATG GGGGGAGAGA GAGAAGGATG    7620
GAGAGAAATC CGGTGGCCCG GCCCTTGGAA ATGCTCTCTA AATATTTGTT GCACGAATGA    7680
GTGAGTAAGC AGGGACACCG ATATAAAGAG AGATGAGTAG ACAGACAAGG GGTGTGGTAG    7740
AAAGATAGGG AAAAAACAAG TGATCTGGAT AAAGATAGTG AGACAGGAAG AGGTAGAGGA    7800
GATAGGAAAG AGAGATAAGG AGAGAAGAAG GAAGCGTGGG TGTCTGGCAC GTGGAAGGCA    7860
CTCAATGAAG GAGTTGTTGA ATGGATGGGT GGATGAGAAA ATGGATGAGT GGAGAGAAAA    7920
AACTAGACAT CAGGGCAGAG AGTACAAGCT AGAGAAGCAG GTGGCTGTTT TCCCTTCAGA    7980
GGGGACTTAT TCAAATCTAA TTAATCCTTC TTCTTCTCCC CAACAGTTTC CAGCTGGCCC    8040
CTTGAGCATC AACCCTCTGG CCCAAGGACT CAGTAAGTAT CTCTAAAACC TGTCTCTCAG    8100
TTCTGAGCTT GGACAGGGGT GGGGTTAGTG CTGGGGTGGA AGGAAGAAGG GAAATTTAGG    8160
GTCTGGGTTT GGCGGGGGGA ATGCAGGTCA AAGTAGTGAG ATATTTTCTG GGAAGTCTGA    8220
GGGTCTCATC TTTTTCTTTC CTCTTTCCTC CTCAGGATCA TCGTCTCAAA CCTCAGATAA    8280
GCCCGTCGCC CACGTTGTAG GTAAGAGTTC TGAGGATGTG TCTGGGGGAT GAAGAAATAG    8340
GCAGGACAGA GAGGGATAGG ATTTGGGGGC TGAAGCCAGG CTGAGGGTAG CCAGAGCTTG    8400
GAGATAGTAT GAGGAGGACT CGCTGAGCTC CAGGGGAGGA TGGGGGATAC TCAGAACTTG    8460
AGGAGGATAC TCGGAACCTC ATGGACAGAT GGGATGTGGG AAGACAGACC GAGGGGACAG    8520
GAACCGGATG TGGGGGGCGG GCAGAACTCG AGGGCCAGGA TGTGGAGAGT GGAACTGACA    8580
GGGTCACACT GACTCACCCC TCCCTCTTTG TCTCCTCCCT CCAGCCAATG TCAAAGCCGA    8640
GGGACAGCTC CAATGGCAGA GTGGGTATGC CAATGCCCTC CTGGCCAACG GCGTGAAGCT    8700
GAAAGACAAC CAGCTGGTGG TGCCGACAGA TGGGCTGTAC CTCATCTACT CCCAGGTCCT    8760
CTTCAGGGGC CAAGGCTGCC CTTCCACCAA CGTTTTCCTC ACTCACACCA TCAGCCGCAT    8820
CGCCGTCTCC TACCAGACCA AGGTCAACCT CCTCTCTGCC ATCAAGAGCC CTTGCCAGAG    8880
GGAGACCCCC GAGGGGGCCG AGGCCAAGCC CTGGTACGAA CCCATCTACC TGGGAGGGGT    8940
CTTCCAGCTG GAGAAGGATG ATCGACTCAG TGCCGAGATC AACCTGCCCG ACTATCTGGA    9000
CTTTGCTGAA TCTGGGCAGG TCTATTTTGG GATCATTGCC CTGTGAGGGG GCAGGACATC    9060
CGTTCCCTCC CCTGTCCATC CCTTTATTAT TTTACTCCTT CAGACCCCCT CACGTCCTTC    9120
TGGTTTAGAA AGAGAATGAG GGGCTGGGGA CTGGGCTCCA AGCTTAAAAC TTTAAACAAC    9180
AACAGCAACA CTTAGAAATC AGGGATTCAG GGATGTGTGG CCTGGACAAC CAGGCACTGA    9240
CCACCACCAA GAATTGGAAC TGGGGCTTCC AGACTCGCTG GGGTCCTTGG GTTTGGATTC    9300
CTGGATGCAA CCTGGGACAT CTGGAATGTG GCTGCCAGGG AAGCTTGGGT TCCAATCGGA    9360
ATACTTCAGA ACATTCCTTG AGAAGATTTC ACCTCAATCT TGATGACTTT TTAGGCTTCC    9420
CTTTCTTCCA ATTTTCCAGA CTTCCCTGGG ATGGGGAGCC CAGCCCCAAA CCCCACAGGC    9480
CAGCTCCCTC TTATTTATAT TTGCACTTGG CATTATTATT TATTTATTTA TTTATTATTT    9540
ATTTACTAGT GAATGTATTT ATTCAGGAGG GCGAGGTGTC CTGGGAGACC CAGCATAAGG    9600
GCTGCCTTGG TTCAGATGTG TTTTCTGTGA AAACGGAGCT GAACTGTAGG TTGCTCCCAC    9660
CTGGCCTCCT AGCCTCTGTG CCTCCTTTTG CTTATGTTTT TAAAAACAAA TATTTATCTG    9720
ATCGAGTTGT CTAAATAATG CTGATTTGGT GACTAACTTG TCGCTACATC GCTGAACCTC    9780
TGCTCCCCAG GGGAGTTGTG TCTGTAACCG CCCTACTGGT CAGTGGCGAG AAATAAAAGC    9840
GTGCTTAGAA AAGAAATCTG GCCTCTTTCT GCGACTGAAT TCTGCATCTC CTTGGGGGGG    9900
TGAGGCTGCT CCCCAAAATT CTTTCTCCAC CGGGCTTAGG ATTCCCTGGG CTTCACTCCT    9960
GAGCTTGGAC TGCCTGGCTC AGGAGCCTCT GCAAGAAACA AAGCCCAGCC AAACAGGTCC   10020
CTCCCCTAAG AAAGGAACCT GAAGGTAATT ACCTCTCCCT CAGGGTGTGG GAATTTCCAA   10080
GTCTGGGAAT TCCTATCCAG CTGGGGAAGT CTGCAGTGCA GGTGAGACTT CCGGCTGAAA   10140
GAGCCAGGGA GCGGCCAGAT GCTCAGGTAC CTGAACCAGA GCCAAGGGAC TTCCAGACAG   10200
TGAGGCAACT GGGCTCCAAA TAACCTGATC CGGGGAATTC                         10240
(2)SEQ ID NO：12的信息：
  (I)序列特征：
  (A)长度：1644碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (D)拓扑结构：线性
  (xi)序列描述：SEQ ID NO：12
CCTCAGCGAG GACAGCAAGG GACTAGCCAG GAGGGAGAAC AGAAACTCCA GAACATCCTG     60
GAAATAGCTC CCAGAAAAGC AAGCAGCCAA CCAGGCAGGT TCTGTCCCTT TCACTCACTG     120
GCCCAAGGCG CCACATCTCC CTCCAGAAAA GACACCATGA GCACAGAAAG CATGATCCGC     180
GACGTGGAAC TGGCAGAAGA GGCACTCCCC CAAAAGATGG GGGGCTTCCA GAACTCCAGG     240
CGGTGCCTAT GTCTCAGCCT CTTCTCATTC CTGCTTGTGG CAGGGGCCAC CACGCTCTTC     300
TGTCTACTGA ACTTCGGGGT GATCGGTCCC CAAAGGGATG AGAAGTTCCC AAATGGCCTC     360
CCTCTCATCA GTTCTATGGC CCAGACCCTC ACACTCAGAT CATCTTCTCA AAATTCGAGT     420
GACAAGCCTG TAGCCCACGT CGTAGCAAAC CACCAAGTGG AGGAGCAGCT GGAGTGGCTG     480
AGCCAGCGCG CCAACGCCCT CCTGGCCAAC GGCATGGATC TCAAAGACAA CCAACTAGTG     540
GTGCCAGCCG ATGGGTTGTA CCTTGTCTAC TCCCAGGTTC TCTTCAAGGG ACAAGGCTGC     600
CCCGACTACG TGCTCCTCAC CCACACCGTC AGCCGATTTG CTATCTCATA CCAGGAGAAA     660
GTCAACCTCC TCTCTGCCGT CAAGAGCCCC TGCCCCAAGG ACACCCCTGA GGGGGCTGAG     720
CTCAAACCCT GGTATGAGCC CATATACCTG GGAGGAGTCT TCCAGCTGGA GAAGGGGGAC     780
CAACTCAGCG CTGAGGTCAA TCTGCCCAAG TACTTAGACT TTGCGGAGTC CGGGCAGGTC     840
TACTTTGGAG TCATTGCTCT GTGAAGGGAA TGGGTGTTCA TCCATTCTCT ACCCAGCCCC     900
CACTCTGACC CCTTTACTCT GACCCCTTTA TTGTCTACTC CTCAGAGCCC CCAGTCTGTG     960
TCCTTCTAAC TTAGAAAGGG GATTATGGCT CAGAGTCCAA CTCTGTGCTC AGAGCTTTCA    1020
ACAACTACTC AGAAACACAA GATGCTGGGA CAGTGACCTG GACTGTGGGC CTCTCATGCA    1080
CCACCATCAA GGACTCAAAT GGGCTTTCCG AATTCACTGG AGCCTCGAAT GTCCATTCCT    1140
GAGTTCTGCA AAGGGAGAGT GGTCAGGTTG CCTCTGTCTC AGAATGAGGC TGGATAAGAT    1200
CTCAGGCCTT CCTACCTTCA GACCTTTCCA GACTCTTCCC TGAGGTGCAA TGCACAGCCT    1260
TCCTCACAGA GCCAGCCCCC CTCTATTTAT ATTTGCACTT ATTATTTATT ATTTATTTAT    1320
TATTTATTTA TTTGCTTATG AATGTATTTA TTTGGAAGGC CGGGGTGTCC TGGAGGACCC    1380
AGTGTGGGAA GCTGTCTTCA GACAGACATG TTTTCTGTGA AAACGGAGCT GAGCTGTCCC    1440
CACCTGGCCT CTCTACCTTG TTGCCTCCTC TTTTGCTTAT GTTTAAAACA AAATATTTAT    1500
CTAACCCAAT TGTCTTAATA ACGCTGATTT GGTGACCAGG CTGTCGCTAC ATCACTGAAC    1560
CTCTGCTCCC CACGGGAGCC GTGACTGTAA TTGCCCTACA GTCAATTGAG AGAAATAAAG    1620
ATCGCTTAAA ATAAAAAACC CCCC                                           1644
(2)SEQ ID NO：13的信息：
  (I)序列特征：
  (A)长度：1890碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (D)拓扑结构：线性
  (xi)序列描述：SEQ ID NO：13
AAACAGAGAG AGATAGAGAA AGAGAAAGAC AGAGGTGTTT CCCTTAGCTA TGGAAACTCT     60
ATAAGAGAGA TCCAGCTTGC CTCCTCTTGA GCAGTCAGCA ACAGGGTCCC GTCCTTGACA    120
CCTCAGCCTC TACAGGACTG AGAAGAAGTA AAACCGTTTG CTGGGGCTGG CCTGACTCAC    180
CAGCTGCCAT GCAGCAGCCC TTCAATTACC CATATCCCCA GATCTACTGG GTGGACAGCA    240
GTGCCAGCTC TCCCTGGGCC CCTCCAGGCA CAGTTCTTCC CTGTCCAACC TCTGTGCCCA    300
GAAGGCCTGG TCAAAGGAGG CCACCACCAC CACCGCCACC GCCACCACTA CCACCTCCGC    360
CGCCGCCGCC ACCACTGCCT CCACTACCGC TGCCACCCCT GAAGAAGAGA GGGAACCACA    420
GCACAGGCCT GTGTCTCCTT GTGATGTTTT TCATGGTTCT GGTTGCCTTG GTAGGATTGG    480
GCCTGGGGAT GTTTCAGCTC TTCCACCTAC AGAAGGAGCT GGCAGAACTC CGAGAGTCTA    540
CCAGCCAGAT GCACACAGCA TCATCTTTGG AGAAGCAAAT AGGCCACCCC AGTCCACCCC    600
CTGAAAAAAA GGAGCTGAGG AAAGTGGCCC ATTTAACAGG CAAGTCCAAC TCAAGGTCCA    660
TGCCTCTGGA ATGGGAAGAC ACCTATGGAA TTGTCCTGCT TTCTGGAGTG AAGTATAAGA    720
AGGGTGGCCT TGTGATCAAT GAAACTGGGC TGTACTTTGT ATATTCCAAA GTATACTTCC    780
GGGGTCAATC TTGCAACAAC CTGCCCCTGA GCCACAAGGT CTACATGAGG AACTCTAAGT    840
ATCCCCAGGA TCTGGTGATG ATGGAGGGGA AGATGATGAG CTACTGCACT ACTGGGCAGA     900
TGTGGGCCCG CAGCAGCTAC CTGGGGGCAG TGTTCAATCT TACCAGTGCT GATCATTTAT     960
ATGTCAACGT ATCTGAGCTC TCTCTGGTCA ATTTTGAGGA ATCTCAGACG TTTTTCGGCT    1020
TATATAAGCT CTAAGAGAAG CACTTTGGGA TTCTTTCCAT TATGATTCTT TGTTACAGGC    1080
ACCGAGAATG TTGTATTCAG TGAGGGTCTT CTTACATGCA TTTGAGGTCA AGTAAGAAGA    1140
CATGAACCAA GTGGACCTTG AGACCACAGG GTTCAAAATG TCTGTAGCTC CTCAACTCAC    1200
CTAATGTTTA TGAGCCAGAC AAATGGAGGA ATATGACGGA AGAACATAGA ACTCTGGGCT    1260
GCCATGTGAA GAGGGAGSAG CATGAAAAAG CAGCTACCCA GGTGTTCTAC ACTCATCTTA    1320
GTGCCTGAGA GTATTTAGGC AGATTGAAAA GGACACCTTT TAACTCACCT CTCAAGGTGG    1380
GCCTTGCTAC CTCAAGGGGG ACTGTCTTTC AGATACATGG TTGTGACCTG AGGATTTAAG    1440
GGATGGAAAA GGAAGACTAG AGGCTTGCAT AATAAGCTAA AGAGGCTGAA AGAGGCCAAT    1500
GCCCCACTGG CAGCATCTTC ACTTCTAAAT GCATATCCTG AGCCATCGGT GAAACTAACA    1560
GATAAGCAAG AGAGATGTTT TGGGGACTCA TTTCATTCCT AACACAGCAT GTGTATTTCC    1620
AGTGCCAATT GTAGGGGTGT GTGTGTGTGT GTGTGTGTGT GTGTATGACT AAAGAGAGAA    1680
TGTAGATATT GTGAAGTACA TATTAGGAAA ATATGGGTTG CATTTGGTCA AGATTTTGAA    1740
TGCTTCCTGA CAATCAACTC TAATAGTGCT TAAAAATCAT TGATTGTCAG CTACTAATGA    1800
TGTTTTCCTA TAATATAATA AATATTTATG TAGATGTGCA TTTTTGTGAA ATGAAAACAT    1860
GTAATAAAAA GTATATGTTA GGATACAAAT                                     1890
(2)SEQ ID NO：14的信息：
  (I)序列特征：
  (A)长度：1541碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (D)拓扑结构：线性
  (xi)序列描述：SEQ ID NO：14
GGGTGTCTCA CAGAGAAGCA AAGAGAAGAG AACAGGAGAA ATGGTGTTTC CCTTGACTGC     60
GGAAACTTTA TAAAGAAAAC TTAGCTTCTC TGGAGCAGTC AGCGTCAGAG TTCTGTCCTT    120
GACACCTGAG TCTCCTCCAC AAGGCTGTGA GAAGGAAACC CTTTCCTGGG GCTGGGTGCC    180
ATGCAGCAGC CCATGAATTA CCCATGTCCC CAGATCTTCT GGGTAGACAG CAGTGCCACT    240
TCATCTTGGG CTCCTCCAGG GTCAGTTTTT CCCTGTCCAT CTTGTGGGCC TAGAGGGCCG    300
GACCAAAGGA GACCGCCACC TCCACCACCA CCTGTGTCAC CACTACCACC GCCATCACAA    360
CCACTCCCAC TGCCGCCACT GACCCCTCTA AAGAAGAAGG ACCACAACAC AAATCTGTGG    420
CTACCGGTGG TATTTTTCAT GGTTCTGGTG GCTCTGGTTG GAATGGGATT AGGAATGTAT    480
CAGCTCTTCC ACCTGCAGAA GGAACTGGCA GAACTCCGTG AGTTCACCAA CCAAAGCCTT    540
AAAGTATCAT CTTTTGAAAA GCAAATAGCC AACCCCAGTA CACCCTCTGA AAAAAAAGAG    600
CCGAGGAGTG TGGCCCATTT AACAGGGAAC CCCCACTCAA GGTCCATCCC TCTGGAATGG    660
GAAGACACAT ATGGAACCGC TCTGATCTCT GGAGTGAAGT ATAAGAAAGG TGGCCTTGTG    720
ATCAACGAAA CTGGGTTGTA CTTCGTGTAT TCCAAAGTAT ACTTCCGGGG TCAGTCTTGC    780
AACAACCAGC CCCTAAACCA CAAGGTCTAT ATGAGGAACT CTAAGTATCC TGAGGATCTG    840
GTGCTAATGG AGGAGAAGAG GTTGAACTAC TGCACTACTG GCCAGATATG GGCCCACAGC    900
AGCTACCTGG GGGCAGTATT CAATCTTACC AGTGCTGACC ATTTATATGT CAACATATCT    960
CAACTCTCTC TGATCAATTT TGAGGAATCT AAGACCTTTT TCGGCTTGTA TAAGCTTTAA   1020
AAGAAAAAGC ATTTTAAAAT GATCTACTAT TCTTTATCAT GGGCACCAGG AATATTGTCT   1080
TGAATGAGAG TCTTCTTAAG ACCTATTGAG ATTAATTAAG ACTACATGAG CCACAAAGAC   1140
CTCATGACCG CAAGGTCCAA CAGGTCAGCT ATCCTTCATT TTCTCGAGGT CCATGGAGTG   1200
GTCCTTAATG CCTGCATCAT GAGCCAGATG GAAGGAGGTC TGTGACTGAG GGACATAAAG   1260
CTTTGGGCTG CTGTGTAGCA ATGCAGAGGC ACAGAGAAAG AACTGTCTGA TGTTAAATGG   1320
CCAAGAGAAT TTTAACCATT GAAGAAGACA CCTTTACACT CACTTCCAGG GTGGGTCTAC   1380
TTACTACCTC ACAGAGGCCG TTTTTGAGAC ATAGTTGTGG TATGAATATA CAAGGGTGAG   1440
AAAGGAGGCT CATTTGACTG ATAAGCTAGA GACTGAAAAA AAGACAGTGT CTCATTGGCA   1500
CCATCTTTAC TGTTACCTGA TGTTTTCTGA GCCGACCTTT G                       1541
(2)SEQ ID NO：15的信息：
  (I)序列特征：
  (A)长度：888碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (D)拓扑结构：线性
  (xi)序列描述：SEQ ID NO：15
GGCTGGTCCC CTGACAGGTT GAAGCAAGTA GACGCCCAGG AGCCCCGGGA GGGGGCTGCA     60
GTTTCCTTCC TTCCTTCTCG GCAGCGCTCC GCGCCCCCAT CGCCCCTCCT GCGCTAGCGG    120
AGGTGATCGC CGCGGCGATG CCGGAGGAGG GTTCGGGCTG CTCGGTGCGG CGCAGGCCCT    180
ATGGGTGCGT CCTGCGGGCT GCTTTGGTCC CATTGGTCGC GGGCTTGGTG ATCTGCCTCG    240
TGGTGTGCAT CCAGCGCTTC GCACAGGCTC AGCAGCAGCT GCCGCTCGAG TCACTTGGGT    300
GGGACGTAGC TGAGCTGCAG CTGAATCACA CAGGACCTCA GCAGGACCCC AGGCTATACT    360
GGCAGGGGGG CCCAGCACTG GGCCGCTCCT TCCTGCATGG ACCAGAGCTG GACAAGGGGC    420
AGCTACGTAT CCATCGTGAT GGCATCTACA TGGTACACAT CCAGGTGACG CTGGCCATCT    480
GCTCCTCCAC GACGGCCTCC AGGCACCACC CCACCACCCT GGCCGTGGGA ATCTGCTCTC    540
CCGCCTCCCG TAGCATCAGC CTGCTGCGTC TCAGCTTCCA CCAAGGTTGT ACCATTGCCT    600
CCCAGCGCCT GACGCCCCTG GCCCGAGGGG ACACACTCTG CACCAACCTC ACTGGGACAC    660
TTTTGCCTTC CCGAAACACT GATGAGACCT TCTTTGGAGT GCAGTGGGTG CGCCCCTGAC    720
CACTGCTGCT GATTAGGGTT TTTTAAATTT TATTTTATTT TATTTAAGTT CAAGAGAAAA    780
AGTGTACACA CAGGGGCCAC CCGGGGTTGG GGTGGGAGTG TGGTGGGGGG TAGTGGTGGC    840
AGGACAAGAG AAGGCATTGA GCTTTTTCTT TCATTTTCCT ATTAAAAA                 888
(2)SEQ ID NO：16的信息：
  (I)序列特征：
  (A)长度：1906碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (D)拓扑结构：线性
  (xi)序列描述：SEQ ID NO：16
CCAAGTCACA TGATTCAGGA TTCAGGGGGA GAATCCTTCT TGGAACAGAG ATGGGCCCAG      60
AACTGAATCA GATGAAGAGA GATAAGGTGT GATGTGGGGA AGACTATATA AAGAATGGAC     120
CCAGGGCTGC AGCAAGCACT CAACGGAATG GCCCCTCCTG GAGACACAGC CATGCATGTG     180
CCGGCGGGCT CCGTGGCCAG CCACCTGGGG ACCACGAGCC GCAGCTATTT CTATTTGACC     240
ACAGCCACTC TGGCTCTGTG CCTTGTCTTC ACGGTGGCCA CTATTATGGT GTTGGTCGTT     300
CAGAGGACGG ACTCCATTCC CAACTCACCT GACAACGTCC CCCTCAAAGG AGGAAATTGC     360
TCAGAAGACC TCTTATGTAT CCTGAAAAGA GCTCCATTCA AGAAGTCATG GGCCTACCTC     420
CAAGTGGCAA AGCATCTAAA CAAAACCAAG TTGTCTTGGA ACAAAGATGG CATTCTCCAT     480
GGAGTCAGAT ATCAGGATGG GAATCTGGTG ATCCAATTCC CTGGTTTGTA CTTCATCATT     540
TGCCAACTGC AGTTTCTTGT ACAATGCCCA AATAATTCTG TCGATCTGAA GTTGGAGCTT     600
CTCATCAACA AGCATATCAA AAAACAGGCC CTGGTGACAG TGTGTGAGTC TGGAATGCAA     660
ACGAAACACG TATACCAGAA TCTCTCTCAA TTCTTGCTGG ATTACCTGCA GGTCAACACC     720
ACCATATCAG TCAATGTGGA TACATTCCAG TACATAGATA CAAGCACCTT TCCTCTTGAG     780
AATGTGTTGT CCATCTTCTT ATACAGTAAT TCAGACTGAA CAGTTTCTCT TGGCCTTCAG     840
GAAGAAAGCG CCTCTCTACC ATACAGTATT TCATCCCTCC AAACACTTGG GCAAAAAGAA     900
AACTTTAGAC CAAGACAAAC TACACAGGGT ATTAAATAGT ATACTTCTCC TTCTGTCTCT     960
TGGAAAGATA CAGCTCCAGG GTTAAAAAGA GAGTTTTTAG TGAAGTATCT TTCAGATAGC    1020
AGGCAGGGAA GCAATGTAGT GTGGTGGGCA GAGCCCCACA CAGAATCAGA AGGGATGAAT    1080
GGATGTCCCA GCCCAACCAC TAATTCACTG TATGGTCTTG ATCTATTTCT TCTGTTTTGA    1140
GAGCCTCCAG TTAAAATGGG GCTTCAGTAC CAGAGCAGCT AGCAACTCTG CCCTAATGGG    1200
AAATGAAGGG GAGCTGGGTG TGAGTGTTTA CACTGTGCCC TTCACGGGAT ACTTCTTTTA    1260
TCTGCAGATG GCCTAATGCT TAGTTGTCCA AGTCGCGATC AAGGACTCTC TCACACAGGA    1320
AACTTCCCTA TACTGGCAGA TACACTTGTG ACTGAACCAT GCCCAGTTTA TGCCTGTCTG    1380
ACTGTCACTC TGGCACTAGG AGGCTGATCT TGTACTCCAT ATGACCCCAC CCCTAGGAAC    1440
CCCCAGGGAA AACCAGGCTC GGACAGCCCC CTGTTCCTGA GATGGAAAGC ACAAATTTAA    1500
TACACCACCA CAATGGAAAA CAAGTTCAAA GACTTTTACT TACAGATCCT GGACAGAAAG    1560
GGCATAATGA GTCTGAAGGG CAGTCCTCCT TCTCCAGGTT ACATGAGGCA GGAATAAGAA    1620
GTCAGACAGA GACAGCAAGA CAGTTAACAA CGTAGGTAAA GAAATAGGGT GTGGTCACTC    1680
TCAATTCACT GGCAAATGCC TGAATGGTCT GTCTGAAGGA AGCAACAGAG AAGTGGGGAA    1740
TCCAGTCTGC TAGGCAGGAA AGATGCCTCT AAGTTCTTGT CTCTGGCCAG AGGTGTGGTA    1800
TAGAACCAGA AACCCATATC AAGGGTGACT AAGCCCGGCT TCCGGTATGA GAAATTAAAC    1860
TTGTATACAA AATGGTTGCC AAGGCAACAT AAAATTATAA GAATTC                   1906
(2)SEQ ID NO：17的信息：
  (I)序列特征：
  (A)长度：1619碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (D)拓扑结构：线性
  (xi)序列描述：SEQ ID NO：17
GTCATGGAAT ACGCCTCTGA CGCTTCACTG GACCCCGAAG CCCCGTGGCC TCCCGCGCCC     60
CGCGCTCGCG CCTGCCGCGT ACTGCCTTGG GCCCTGGTCG CGGGGCTGCT GCTGCTGCTG    120
CTGCTCGCTG CCGCCTGCGC CGTCTTCCTC GCCTGCCCCT GGGCCGTGTC CGGGGCTCGC    180
GCCTCGCCCG GCTCCGCGGC CAGCCCGAGA CTCCGCGAGG GTCCCGAGCT TTCGCCCGAC    240
GATCCCGCCG GCCTCTTGGA CCTGCGGCAG GGCATGTTTG CGCAGCTGGT GGCCCAAAAT    300
GTTCTGCTGA TCGATGGGCC CCTGAGCTGG TACAGTGACC CAGGCCTGGC AGGCGTGTCC    360
CTGACGGGGG GCCTGAGCTA CAAAGAGGAC ACGAAGGAGC TGGTGGTGGC CAAGGCTGGA    420
GTCTACTATG TCTTCTTTCA ACTAGAGCTG CGGCGCGTGG TGGCCGGCGA GGGCTCAGGC    480
TCCGTTTCAC TTGCGCTGCA CCTGCAGCCA CTGCGCTCTG CTGCTGGGGC CGCCGCCCTG    540
GCTTTGACCG TGGACCTGCC ACCCGCCTCC TCCGAGGCTC GGAACTCGGC CTTCGGTTTC    600
CAGGGCCGCT TGCTGCACCT GAGTGCCGGC CAGCGCCTGG GCGTCCATCT TCACACTGAG    660
GCCAGGGCAC GCCATGCCTG GCAGCTTACC CAGGGCGCCA CAGTCTTGGG ACTCTTCCGG    720
GTGACCCCCG AAATCCCAGC CGGACTCCCT TCACCGAGGT CGGAATAACG CCCAGCCTGG    780
GTGCAGCCCA CCTGGACAGA GTCCGAATCC TACTCCATCC TTCATGGAGA CCCCTGGTGC    840
TGGGTCCCTG CTGCTTTCTC TACCTCAAGG GGCTTGGCAG GGGTCCCTGC TGCTGACCTC    900
CCCTTGAGGA CCCTCCTCAC CCACTCCTTC CCCAAGTTGG ACCTTGATAT TTATTCTGAG    960
CCTGAGCTCA GATAATATAT TATATATATT ATATATATAT ATATATTTCT ATTTAAAGAG   1020
GATCCTGAGT TTGTGAATGG ACTTTTTTAG AGGAGTTGTT TTGGGGGGGG GGTCTTCGAC   1080
ATTGCCGAGG CTGGTCTTGA ACTCCTGGAC TTAGACGATC CTCCTGCCTC AGCCTCCCAA   1140
GCAACTGGGA TTCATCCTTT CTATTAATTC ATTGTACTTA TTTGCCTATT TGTGTGTATT   1200
GAGCATCTGT AATGTGCCAG CATTGTGCCC AGGCTAGGGG GCTATAGAAA CATCTAGAAA   1260
TAGACTGAAA GAAAATCTGA GTTATGGTAA TACGTGAGGA ATTTAAAGAC TCATCCCCAG   1320
CCTCCACCTC CTGTGTGATA CTTGGGGGCT AGCTTTTTTC TTTCTTTCTT TTTTTTGAGA   1380
TGGTCTTGTT CTGTCAACCA GGCTAGAATG CAGCGGTGCA ATCATGAGTC AATGCAGCCT   1440
CCAGCCTCGA CCTCCCGAGG CTCAGGTGAT CCTCCCATCT CAGCCTCTCG AGTAGCTGGG   1500
ACCACAGTTG TGTGCCACCA CACTTGGCTA ACTTTTTAAT TTTTTTGCGG AGACGGTATT   1560
GCTATGTTGC CAAGGTTGTT TACATGCCAG TACAATTTAT AATAAACACT CATTTTTCC    1619
(2)SEQ ID NO：18的信息：
  (I)序列特征：
  (A)长度：1239碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (D)拓扑结构：线性
  (xi)序列描述：SEQ ID NO：18
AGCCTATAAA GCACGGGCAC TGGCGGGAGA CGTGCACTGA CCGACCGTGG TAATGGACCA     60
GCACACACTT GATGTGGAGG ATACCGCGGA TGCCAGACAT CCAGCAGGTA CTTCGTGCCC    120
CTCGGATGCG GCGCTCCTCA GAGATACCGG GCTCCTCGCG GACGCTGCGC TCCTCTCAGA    180
TACTGTGCGC CCCACAAATG CCGCGCTCCC CACGGATGCT GCCTACCCTG CGGTTAATGT    240
TCGGGATCGC GAGGCCGCGT GGCCGCCTGC ACTGAACTTC TGTTCCCGCC ACCCAAAGCT    300
CTATGGCCTA GTCGCTTTGG TTTTGCTGCT TCTGATCGCC GCCTGTGTTC CTATCTTCAC    360
CCGCACCGAG CCTCGGCCAG CGCTCACAAT CACCACCTCG CCCAACCTGG GTACCCGAGA    420
GAATAATGCA GACCAGGTCA CCCCTGTTTC CCACATTGGC TGCCCCAACA CTACACAACA    480
GGGCTCTCCT GTGTTCGCCA AGCTACTGGC TAAAAACCAA GCATCGTTGT GCAATACAAC    540
TCTGAACTGG CACAGCCAAG ATGGAGCTGG GAGCTCATAC CTATCTCAAG GTCTGAGGTA    600
CGAAGAAGAC AAAAAGGAGT TGGTGGTAGA CAGTCCCGGG CTCTACTACG TATTTTTGGA    660
ACTGAAGCTC AGTCCAACAT TCACAAACAC AGGCCACAAG GTGCAGGGCT GGGTCTCTCT    720
TGTTTTGCAA GCAAAGCCTC AGGTAGATGA CTTTGACAAC TTGGCCCTGA CAGTGGAACT    780
GTTCCCTTGC TCCATGGAGA ACAAGTTAGT GGACCGTTCC TGGAGTCAAC TGTTGCTCCT    840
GAAGGCTGGC CACCGCCTCA GTGTGGGTCT GAGGGCTTAT CTGCATGGAG CCCAGGATGC    900
ATACAGAGAC TGGGAGCTGT CTTATCCCAA CACCACCAGC TTTGGACTCT TTCTTGTGAA     960
ACCCGACAAC CCATGGGAAT GAGAACTATC CTTCTTGTGA CTCCTAGTTG CTAAGTCCTC    1020
AAGCTGCTAT GTTTTATGGG GTCTGAGCAG GGGTCCCTTC CATGACTTTC TCTTGTCTTT    1080
AACTGGACTT GGTATTTATT CTGAGCATAG CTCAGACAAG ACTTTATATA ATTCACTAGA    1140
TAGCATTAGT AAACTGCTGG GCAGCTGCTA GATAAAAAAA AATTTCTAAA TCAAAGTTTA    1200
TATTTATATT AATATATAAA AATAAATGTG TTTGTAAAT                           1239
(2)SEQ ID NO：19的信息：
  (I)序列特征：
  (A)长度：606碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (D)拓扑结构：线性
  (xi)序列描述：SEQ ID NO：19
ATGATCGAAA CATACAACCA AACTTCTCCC CGATCTGCGG CCACTGGACT GCCCATCAGC     60
ATGAAAATTT TTATGTATTT ACTTACTGTT TTTCTTATCA CCCAGATGAT TGGGTCAGCA    120
CTTTTTGCTG TGTATCGCTT CGCACAGGCT TTTGAAATGC AAAAAGGTGA TCAGAATCCT    180
CAGATTGCGG CACATGTCAT AAGTGAGGCC AGCAGTAAAA CAACATCTGT GTTACAGTGG    240
GCTGAAAAAG GATACTACAC CATGAGCAAC AACTTGGTAA CCCTGGAAAA TGGGAAACAG    300
CTGACCGTTA AAAGACAAGG ACTCTATTAT ATCTATGCCC AAGTCACCTT CTGTTCCAAT    360
CGGGAAGCTT CGAGTCAAGC TCCATTTATA GCCAGCCTCT GCCTAAAGTC CCCCGGTAGA    420
TTCGAGAGAA TCTTACTCAG AGCTGCAAAT ACCCACAGTT CCGCCAAACC TTGCGGGCAA    480
CAATCCATTC ACTTGGGAGG AGTATTTGAA TTGCAACCAG GTGCTTCGGT GTTTGTCAAT    540
GTGACTGATC CAAGCCAAGT GAGCCATGGC ACTGGCTTCA CGTCCTTTGG CTTACTCAAA    600
CTCTGA                                                               606
(2)SEQ ID NO：20的信息：
  (I)序列特征：
  (A)长度：783碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (D)拓扑结构：线性
  (xi)序列描述：SEQ ID NO：20
ATGATCGAAA CATACAACCA AACTTCTCCC CGATCTGCGG CCACTGGACT GCCCATCAGC     60
ATGAAAATTT TTATGTATTT ACTTACTGTT TTTCTTATCA CCCAGATGAT TGGGTCAGCA    120
CTTTTTGCTG TGTATCTTCA TAGAAGATTG GATAAGGTCG AAGAGGAAGT AAACCTTCAT    180
GAAGATTTTG TATTCATAAA AAAGCTAAAG AGATGCAACA AAGGAGAAGG ATCTTTATCC    240
TTGCTGAACT GTGAGGAGAT GAGAAGGCAA TTTGAAGACC TTGTCAAGGA TATAACGTTA    300
AACAAAGAAG AGAAAAAAGA AAACAGCTTT GAAATGCAAA AAGGTGATCA GAATCCTCAA    360
ATTGCGGCAC ATGTCATAAG TGAGGCCAGC AGTAAAACAA CATCTGTGTT ACAGTGGGCT    420
GAAAAAGGAT ACTACACCAT GAGCAACAAC TTGGTAACCC TGGAAAATGG GAAACAGCTG    480
ACCGTTAAAA GACAAGGACT CTATTATATC TATGCCCAAG TCACCTTCTG TTCCAATCGG    540
GAAGCTTCGA GTCAAGCTCC ATTTATAGCC AGCCTCTGCC TAAAGTCCCC CGGTAGATTC    600
GAGAGAATCT TACTCAGAGC TGCAAATACC CACAGTTCCG CCAAACCTTG CGGGCAACAA    660
TCCATTCACT TGGGAGGAGT ATTTGAATTG CAACCAGGTG CTTCGGTGTT TGTCAATGTG    720
ACTGATCCAA GCCAAGTGAG CCATGGCACT GGCTTCACGT CCTTTGGCTT ACTCAAACTC    780
TGA                                                                  783
(2)SEQ ID NO：21的信息：
  (I)序列特征：
  (A)长度：558碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (D)拓扑结构：线性
  (xi)序列描述：SEQ ID NO：21
CTGCTGCACT TCGGGGTAAT CGGCCCCCAG AGGGAAGAGC AGTCCCCAGG TGGCCCCTCC     60
ATCAACAGCC CTCTGGTTCA AACACTCAGG TCCTCTTCTC AAGCCTCAAG TAACAAGCCG    120
GTAGCCCACG TTGTAGCCGA CATCAACTCT CCGGGGCAGC TCCGGTGGTG GGACTCGTAT    180
GCCAATGCCC TCATGGCCAA CGGTGTGAAG CTGGAAGACA ACCAGCTGGT GGTGCCTGCT    240
GACGGGCTTT ACCTCATCTA CTCACAGGTC CTCTTCAGGG GCCAAGGCTG CCCTTCCACC    300
CCCTTGTTCC TCACCCACAC CATCAGCCGC ATTGCAGTCT CCTACCAGAC CAAGGTCAAC    360
ATCCTGTCTG CCATCAAGAG CCCTTGCCAC AGGGAGACCC CAGAGTGGGC TGAGGCCAAG    420
CCCTGGTACG AACCCATCTA CCAGGGAGGA GTCTTCCAGC TGGAGAAGGG AGATCGCCTC    480
AGTGCTGAGA TCAACCTGCC GGACTACCTG GACTATGCCG AGTCCGGGCA GGTCTACTTT    540
GGGATCATTG CCCTGTGA                                                  558
(2)SEQ ID NO：22的信息：
  (I)序列特征：
  (A)长度：1783碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (D)拓扑结构：线性
  (xi)序列描述：SEQ ID NO：22
CAAGTCACAT GATCCAGGAT GCAGGGGAAA ATCCTTCTTG GAACAGAGCT GGGTACAGAA      60
CCGAATCAGA TGAGGAGAGA TAAGGTGTGA TGTGGGACAG ACTATATAAA GCATGGAGCC     120
AGGGCTGCAA CAAGCAGGCA GCTGTGGGGC TCCTTCCCCT GACCCAGCCA TGCAGGTGCA     180
GCCCGGCTCG GTAGCCAGCC CCTGGAGAAG CACGAGGCCC TGGAGAAGCA CAAGTCGCAG     240
CTACTTCTAC CTCAGCACCA CCGCACTGGT GTGCCTTGTT GTGGCAGTGG CGATCATTCT     300
GGTACTGGTA GTCCAGAAAA AGGACTCCAC TCCAAATACA ACTGAGAAGG CCCCCCTTAA     360
AGGAGGAAAT TGCTCAGAGG ATCTCTTCTG TACCCTGAAA AGTACTCCAT CCAAGAAGTC     420
ATGGGCCTAC CTCCAAGTGT CAAAGCATCT CAACAATACC AAACTGTCAT GGAACGAAGA     480
TGGCACCATC CACGGACTCA TATACCAGGA CGGGAACCTG ATAGTCCAAT TCCCTGGCTT     540
GTACTTCATC GTTTGCCAAC TGCAGTTCCT CGTGCAGTGC TCAAATCATT CTGTGGACCT     600
GACATTGCAG CTCCTCATCA ATTCCAAGAT CAAAAAGCAG ACGTTGGTAA CAGTGTGTGA     660
GTCTGGAGTT CAGAGTAAGA ACATCTACCA GAATCTCTCT CAGTTTTTGC TGCATTACTT     720
ACAGGTCAAC TCTACCATAT CAGTCAGGGT GGATAATTTC CAGTATGTGG ATACAAACAC     780
TTTCCCTCTT GATAATGTGC TATCCGTCTT CTTATATAGT AGCTCAGACT GAATAGTTGT     840
TCTTAACCTT TATGAAAATG CTGTCTACCA TACAGTACTT CATCTGTCCA AACATGGGCC     900
AAAGAAAATA TTAGGACAAC TCAAACTAAG CATGTGAGTT AGTGCACTTC TCTTTCTGTC     960
CTTTGGAAAA ATACAAACCC AGGATTTAGA AAGTGGAGTC TCCTTCAGAT GCACAAACAG    1020
GAAAGAATGT GATATGTGCA CAGAGACCTA CTTGGGCACT AGAAGGGGTG TGAGTTGTCC    1080
CAGTATAACC ACTAATTCAC TGACCTTGAG CCATTTTTCC TTCCCCCTGG AACTTGGGGT    1140
CTGAATCTGG AAAAGTAGGA GATGAGATTT ACATTTCCCC AATATTTTCT TCAACTCAGA    1200
AGACGAGACT GTGGAGCTGA GCTCCCTACA CAGATGAAGG CCTCCCATGG CATGAGGAAA    1260
ATGATGGTAC CAGTAATGTC TGTCTGACTG TCATCTCAGC AAGTCCTAAG GACTTCCATG    1320
CTGCCTTGTT GAAAGATACT CTAACCTCTT GTAATGGGCA AAGTGATCCT GTCTCTCACT    1380
GAGGGGAGTA GCTGCTGCCA TCTCCTGAGA CATACATGGA GACATTTTCT GCCCAAATTC    1440
CATTCTGTGT GCAGTTTTTA AGTATTCCCC CAAAAGTTCT TGACAATGAG AACTTTGAAT    1500
GTGGGAAGAG CTTCTGGACA GCAAACATTA ACAGCTTCTC CTGACCAGAG AGACCATGCA    1560
AGCTTGGTCT TAGACCCATC AAGCTTGAGG TTTCTACATT GTGGGAGACA GACTTTTGAC    1620
AAACCATTTG AGTTGATGTC TGGGCCCCTG GGAGTTCTCC TTCAGTAAGG AGAGCAAGCC    1680
GTTCTAGTGC TGTGTCAGAG GATGGAGTAA AATAGACACT TTTCTGAAGG AAAGGAGAAC    1740
AAAGTTCCAG AAAAAGGCTA GAAAATGTTT AAAAAGAAAA AAA                      1783
(2)SEQ ID NO：23的信息：
  (I)序列特征：
  (A)长度：1047碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (D)拓扑结构：线性
  (xi)序列描述：SEQ ID NO：23
AGAGAGCGCT GGGAGCCGGA GGGGAGCGCA GCGAGTTTTG GCCAGTGGTC GTGCAGTCCA      60
AGGGGCTGGA TGGCATGCTG GACCCAAGCT CAGCTCAGCG TCCGGACCCA ATAACAGTTT     120
TACCAAGGGA GCAGCTTTCT ATCCTGGCCA CACTGAGGTG CATAGCGTAA TGTCCATGTT     180
GTTCTACACT CTGATCACAG CTTTTCTGAT CGGCATACAG GCGGAACCAC ACTCAGAGAG     240
CAATGTCCCT GCAGGACACA CCATCCCCCA AGTCCACTGG ACTAAACTTC AGCATTCCCT     300
TGACACTGCC CTTCGCAGAG CCCGCAGCGC CCCGGCAGCG GCGATAGCTG CACGCGTGGC     360
GGGGCAGACC CGCAACATTA CTGTGGACCC CAGGCTGTTT AAAAAGCGGC GACTCCGTTC     420
ACCCCGTGTG CTGTTTAGCA CCCAGCCTCC CCGTGAAGCT GCAGACACTC AGGATCTGGA     480
CTTCGAGGTC GGTGGTGCTG CCCCCTTCAA CAGGACTCAC AGGAGCAAGC GGTCATCATC     540
CCATCCCATC TTCCACAGGG GCGAATTCTC GGTGTGTGAC AGTGTCAGCG TGTGGGTTGG     600
GGATAAGACC ACCGCCACAG ACATCAAGGG CAAGGAGGTG ATGGTGTTGG GAGAGGTGAA     660
CATTAACAAC AGTGTATTCA AACAGTACTT TTTTGAGACC AAGTGCCGGG ACCCAAATCC     720
CGTTGACAGC GGGTGCCGGG GCATTGACTC AAAGCACTGG AACTCATATT GTACCACGAC     780
TCACACCTTT GTCAAGGCGC TGACCATGGA TGGCAAGCAG GCTGCCTGGC GGTTTATCCG     840
GATAGATACG GCCTGTGTGT GTGTGCTCAG CAGGAAGGCT GTGAGAAGAG CCTGACCTGC     900
CGACACGCTC CCTCCCCCTG CCCCTTCTAC ACTCTCCTGG GCCCCTCCCT ACCTCAACCT     960
GTAAATTATT TTAAATTATA AGGACTGCAT GGTAATTTAT AGTTTATACA GTTTTAAAGA    1020
ATCATTATTT ATTAAATTTT TGGAAGC                                        1047
(2)SEQ ID NO：24的信息：
  (I)序列特征：
  (A)长度：1176碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (D)拓扑结构：线性
  (xi)序列描述：SEQ ID NO：24
GAGCGCCTGG AGCCGGAGGG GAGCGCATCG AGTGACTTTG GAGCTGGCCT TATATTTGGA      60
TCTCCCGGGC AGCTTTTTGG AAACTCCTAG TGAACATGCT GTGCCTCAAG CCAGTGAAAT     120
TAGGCTCCCT GGAGGTGGGA CACGGGCAGC ATGGTGGAGT TTTGGCCTGT GGTCGTGCAG     180
TCCAGGGGGC TGGATGGCAT GCTGGACCCA AGCTCACCTC AGTGTCTGGG CCCAATAAAG     240
GTTTTGCCAA GGACGCAGCT TTCTATACTG GCCGCAGTGA GGTGCATAGC GTAATGTCCA     300
TGTTGTTCTA CACTCTGATC ACTGCGTTTT TGATCGGCGT ACAGGCAGAA CCGTACACAG     360
ATAGCAATGT CCCAGAAGGA GACTCTGTCC CTGAAGCCCA CTGGACTAAA CTTCAGCATT     420
CCCTTGACAC AGCCCTCCGC AGAGCCCGCA GTGCCCCTAC TGCACCAATA GCTGCCCGAG     480
TGACAGGGCA GACCCGCAAC ATCACTGTAG ACCCCAGACT GTTTAAGAAA CGGAGACTCC     540
ACTCACCCCG TGTGCTGTTC AGCACCCAGC CTCCACCCAC CTCTTCAGAC ACTCTGGATC     600
TAGACTTCCA GGCCCATGGT ACAATCCCTT TCAACAGGAC TCACCGGAGC AAGCGCTCAT     660
CCACCCACCC AGTCTTCCAC ATGGGGGAGT TCTCAGTGTG TGACAGTGTC AGTGTGTGGG     720
TTGGAGATAA GACCACAGCC ACAGACATCA AGGGCAAGGA GGTGACAGTG CTGGCCGAGG     780
TGAACATTAA CAACAGTGTA TTCAGACAGT ACTTTTTTGA GACCAAGTGC CGAGCCTCCA     840
ATCCTGTTGA GAGTGGGTGC CGGGGCATCG ACTCCAAACA CTGGAACTCA TACTGCACCA     900
CGACTCACAC CTTCGTCAAG GCGTTGACAA CAGATGAGAA GCAGGCTGCC TGGAGGTTCA     960
TCCGGATAGA CACAGCCTGT GTGTGTGTGC TCAGCAGGAA GGCTACAAGA AGAGGCTGAC    1020
TTGCCTGCAG CCCCCTTCCC CACCTGCCCC CTCCACACTC TCTTGGGCCC CTCCCTACCT    1080
CAGCCTGTAA ATTATTTTAA ATTATAAGGA CTGCATGATA ATTTATCGTT TATACAATTT    1140
TAAAGACATT ATTTATTAAA TTTTCAAAGC ATCCTG                              1176
(2)SEQ ID NO：25的信息：
  (I)序列特征：
  (A)长度：1623碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (D)拓扑结构：线性
  (xi)序列描述：SEQ ID NO：25
TCAGAGTCCT GTCCTTGACA CTTCAGTCTC CACAAGACTG AGAGGAGGAA ACCCTTTCCT      60
GGGGCTGGGT GCCATGCAGC AGCCCGTGAA TTACCCATGT CCCCAGATCT ACTGGGTAGA     120
CAGCAGTGCC ACTTCTCCTT GGGCTCCTCC AGGGTCAGTT TTTTCTTGTC CATCCTCTGG     180
GCCTAGAGGG CCAGGACAAA GGAGACCACC GCCTCCACCA CCACCTCCAT CACCACTACC     240
ACCGCCTTCC CAACCACCCC CGCTGCCTCC ACTAAGCCCT CTAAAGAAGA AGGACAACAT     300
AGAGCTGTGG CTACCGGTGA TATTTTTCAT GGTGCTGGTG GCTCTGGTTG GAATGGGGTT     360
AGGAATGTAT CAACTCTTTC ATCTACAGAA GGAACTGGCA GAACTCCGTG AGTTCACCAS     420
CCACAGCCTT AGAGTATCAT CTTTTGAAAA GCAAATAGCC AACCCCAGCA CACCCTCTGA     480
AACCAAAAAG CCAAGGAGTG TGGCCCACTT AACAGGGAAC CCCCGCTCAA GGTCCATCCC     540
TCTGGAATGG GAAGACACAT ATGGAACTGC TTTGATCTCT GGAGTGAAGT ATAAGAAAGG     600
CGGCCTTGTG ATCAATGAGG CTGGGTTGTA CTTCGTATAT TCCAAAGTAT ACTTCCGGGG     660
TCAGTCTTGC AACAGCCAGC CCCTAAGCCA CAAGGTCTAT ATGAGGAACT TTAAGTATCC     720
TGGGGATCTG GTGCTAATGG AGGAGAAGAA GTTGAATTAC TGCACTACTG GCCAGATATG     780
GGCCCACAGC AGCTACCTAG GGGCAGTATT TAATCTTACC GTTGCTGACC ATTTATATGT     840
CAACATATCT CAACTCTCTC TGATCAATTT TGAGGAATCT AAGACCTTTT TTGGCTTATA     900
TAAGCTTTAA AGGAAAAAGC ATTTTAGAAT GATCTATTAT TCTTTATCAT GGATGCCAGG     960
AATATTGTCT TCAATGAGAG TCTTCTTAAG ACCAATTGAG CCACAAAGAC CACAAGGTCC    1020
AACAGGTCAG CTACCCTTCA TTTTCTAGAG GTCCATGGAG TGGTCCTTAA TGCCTGCATC    1080
ATGAGCCAGA TGGGAAGAAG ACTGTTCCTG AGGAACATAA AGTTTTGGGC TGCTGTGTGG    1140
CAATGCAGAG GCAAAGAGAA GGAACTGTCT GATGTTAAAT GGCCAAGAGC ATTTTAGCCA    1200
TTGAAGAAAA AAAAAACCTT TAAACTCACC TTCCAGGGTG GGTCTACTTG CTACCTCACA    1260
GGAGGCCGTC TTTTAGACAC ATGGTTGTGG TATGACTATA CAAGGGTGAG AAAGGATGCT    1320
AGGTTTCATG GATAAGCTAG AGACTGAAAA AAGCCAGTGT CCCATTGGCA TCATCTTTAT    1380
TTTTAACTGA TGTTTTCTGA GCCCACCTTT GATGCTAACA GAGAAATAAG AGGGGTGTTT    1440
GAGGCACAAG TCATTCTCTA CATAGCATGT GTACCTCCAG TGCAATGATG TCTGTGTGTG    1500
TTTTTATGTA TGAGAGTAGA GCGATTCTAA AGAGTCACAT GAGTACAACG CGTACATTAC    1560
GGAGTACATA TTAGAAACGT ATGTGTTACA TTTGATGCTA GAATATCTGA ATGTTTCTTG    1620
CTA                                                                  1623
(2)SEQ ID NO：26的信息：
  (I)序列特征：
  (A)长度：28碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (D)拓扑结构：线性
  (xi)序列描述：SEQ ID NO：26
GTTAAGCTTT TCAGTCAGCA TGATAGAA                                       28
(2)SEQ ID NO：27的信息：
  (I)序列特征：
  (A)长度：27碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (D)拓扑结构：线性
  (xi)序列描述：SEQ ID NO：27
GTTTCTAGAT CAGAGTTTGA GTAAGCC                                        27
(2)SEQ ID NO：28的信息：
  (I)序列特征：
  (A)长度：30碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (D)拓扑结构：线性
  (xi)序列描述：SEQ ID NO：28
CCAAGACTAG TTAACACAGC ATGATCGAAA                                     30
(2)SEQ ID NO：29的信息：
  (I)序列特征：
  (A)长度：30碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (D)拓扑结构：线性
  (xi)序列描述：SEQ ID NO：29
CCAATGCGGC CGCACTCAGA ATTCAACCTG                                     30
(2)SEQ ID NO：30的信息：
  (I)序列特征：
  (A)长度：972碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (D)拓扑结构：线性
  (xi)序列描述：SEQ ID NO：30
TCTAGACTCA GGACTGAGAA GAAGTAAAAC CGTTTGCTGG GGCTGGCCTG ACTCACCAGC     60
TGCCATGCAG CAGCCCTTCA ATTACCCATA TCCCCAGATC TACTGGGTGG ACAGCAGTGC    120
CAGCTCTCCC TGGGCCCCTC CAGGCACAGT TCTTCCCTGT CCAACCTCTG TGCCCAGAAG    180
GCCTGGTCAA AGGAGGCCAC CACCACCACC GCCACCGCCA CCACTACCAC CTCCGCCGCC    240
GCCGCCACCA CTGCCTCCAC TACCGCTGCC ACCCCTGAAG AAGAGAGGGA ACCACAGCAC    300
AGGCCTGTGT CTCCTTGTGA TGTTTTTCAT GGTTCTGGTT GCCTTGGTAG GATTGGGCCT    360
GGGGATGTTT CAGCTCTTCC ACCTACAGAA GGAGCTGGCA GAACTCCGAG AGTCTACCAG    420
CCAGATGCAC ACAGCATCAT CTTTGGAGAA GCAAATAGGC CACCCCAGTC CACCCCCTGA    480
AAAAAAGGAG CTGAGGAAAG TGGCCCATTT AACAGGCAAG TCCAACTCAA GGTCCATGCC    540
TCTGGAATGG GAAGACACCT ATGGAATTGT CCTGCTTTCT GGAGTGAAGT ATAAGAAGGG    600
TGGCCTTGTG ATCAATGAAA CTGGGCTGTA CTTTGTATAT TCCAAAGTAT ACTTCCGGGG    660
TCAATCTTGC AACAACCTGC CCCTGAGCCA CAAGGTCTAC ATGAGGAACT CTAAGTATCC    720
CCAGGATCTG GTGATGATGG AGGGGAAGAT GATGAGCTAC TGCACTACTG GGCAGATGTG    780
GGCCCGCAGC AGCTACCTGG GGGCAGTGTT CAATCTTACC AGTGCTGATC ATTTATATGT    840
CAACGTATCT GAGCTCTCTC TGGTCAATTT TGAGGAATCT CAGACGTTTT TCGGCTTATA    900
TAAGCTCTAA GAGAAGCACT TTGGGATTCT TTCCATTATG ATTCTTTGTT ACAGGCACCG    960
AGATGTTCTA GA                                                        972
(2)SEQ ID NO：31的信息：
  (I)序列特征：
  (A)长度：885碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (D)拓扑结构：线性
  (xi)序列描述：SEQ ID NO：31
ATGCAGCAGC CCATGAATTA CCCATGTCCC CAGATCTTCT GGGTAGACAG CAGTGCCACT     60
TCATCTTGGG CTCCTCCAGG GTCAGTTTTT CCCTGTCCAT CTTGTGGGCC TAGAGGGCCG    120
GACCAAAGGA GACCGCCACC TCCACCACCA CCTGTGTCAC CACTACCACC GCCATCACAA    180
CCACTCCCAC TGCCGCCACT GACCCCTCTA AAGAAGAAGG ACCACAACAC AAATCTGTGG    240
CTACCGGTGG TATTTTTCAT GGTTCTGGTG GCTCTGGTTG GAATGGGATT AGGAATGTAT    300
CAGCTCTTCC ACCTGCAGAA GGAACTGGCA GAACTCCGTG AGTTCACCAA CCAAAGCCTT    360
AAAGTATCAT CTTTTGAAAA GCAAATAGCC AACCCCAGTA CACCCTCTGA AAAAAAAGAG    420
CCGAGGAGTG TGGCCCATTT AACAGGGAAC CCCCACTCAA GGTCCATCCC TCTGGAATGG    480
GAAGACACAT ATGGAACCGC TCTGATCTCT GGAGTGAAGT ATAAGAAAGG TGGCCTTGTG    540
ATCAACGAAG CTGGGTTGTA CTTCGTATAT TCCAAAGTAT ACTTCCGGGG TCAGTCTTGC    600
AACAACCAGC CCCTAAACCA CAAGGTCTAT ATGAGGAACT CTAAGTATCC TGGGGATCTG    660
GTGCTAATGG AGGAGAAGAG GTTGAACTAC TGCACTACTG GACAGATATG GGCCCACAGC    720
AGCTACCTGG GGGCAGTATT CAATCTTACC AGTGCTGACC ATTTATATGT CAACATATCT    780
CAACTCTCTC TGATCAATTT TGAGGAATCT AAGACCTTTT TCGGCTTGTA TAAGCTTTAA    840
AAGAAAAAGC ATTTTAAAAT GATCTACTAT TCTTTATCAT GGGCA                    885
(2)SEQ ID NO：32的信息：
  (I)序列特征：
  (A)长度：29碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (D)拓扑结构：线性
  (xi)序列描述：SEQ ID NO：32
CTTAAGCTTC TACAGGACTG AGAAGAAGT                                      29
(2)SEQ ID NO：33的信息：
  (I)序列特征：
  (A)长度：30碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (D)拓扑结构：线性
  (xi)序列描述：SEQ ID NO：33
CTTGAATTCC AACATTCTCG GTGCCTGTAA                                     27
(2)SEQ ID NO：34的信息：
  (I)序列特征：
  (A)长度：27碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (D)拓扑结构：线性
  (xi)序列描述：SEQ ID NO：34
TCAGGATCCA CAAGGCTGTG AGAAGGA                                        27
(2)SEQ ID NO：35的信息：
  (I)序列特征：
  (A)长度：27碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (D)拓扑结构：线性
  (xi)序列描述：SEQ ID NO：35
CTTGTCTAGA CCTGGTGCC CATGATA                                         27
(2)SEQ ID NO：36的信息：
  (I)序列特征：
  (A)长度：680碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (D)拓扑结构：线性
  (xi)序列描述：SEQ ID NO：36
ATGCCGGAGG AAGGTCGCCC TTGCCCCTGG GTTCGCTGGA GCGGGACCGC GTTCCAGCGC         60
CAATGGCCAT GGCTGCTGCT GGTGGTGTTT ATTACTGTGT TTTGCTGTTG GTTTCATTGT        120
AGCGGACTAC TCAGTAAGCA GCAACAGAGG CTGCTGGAGC ACCCTGAGCC GCACACAGCT        180
GAGTTACAGC TGAATCTCAC AGTTCCTCGG AAGGACCCCA CACTGCGCTG GGGAGCAGGC        240
CCAGCCTTGG GAAGGTCCTT CACACACGGA CCAGAGCTGG AGGAGGGCCA TCTGCGTATC        300
CATCAAGATG GCCTCTACAG GCTGCATATC CAGGTGACAC TGGCCAACTG CTCTTCCCCA        360
GGCAGCACCC TGCAGCACAG GGCCACCCTG GCTGTGGGCA TCTGCTCCCC CGCTGCGCAC        420
GGCATCAGCT TGCTGCGTGG GCGCTTTGGA CAGGACTGTA CAGTGGCATT ACAGCGCCTG        480
ACATACCTGG TCCACGGAGA TGTCCTCTGT ACCAACCTCA CCCTGCCTCT GCTGCCGTCC        540
CGCAACGCTG ATGAGACCTT CTTTGGAGTT CAGTGGATAT GCCCTTGACC ACAACTCCAG        600
GATGACTTGT GAATATTTTT TTTCTTTTCA AGTTCTACGT ATTTATAAAT GTATATAGTA        660
CACATAAAAA AAAAAAAAAA                                                    680
(2)SEQ ID NO：37的信息：
  (I)序列特征：
  (A)长度：846碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (D)拓扑结构：线性
  (xi)序列描述：SEQ ID NO：37
ATGCAGCAGC CCTTCAATTA CCCATATCCC CAGATCTACT GGGTGGACAG CAGTGCCAGC         60
TCTCCCTGGG CCCCTCCAGG CACAGTTCTT CCCTGTCCAA CCTCTGTGCC CAGAAGGCCT        120
GGTCAAAGGA GGCCACCACC ACCACCGCCA CCGCCACCAC TACCACCTCC GCCGCCGCCG        180
CCACCACTGC CTCCACTACC GCTGCCACCC CTGAAGAAGA GAGGGAACCA CAGCACAGGC        240
CTGTGTCTCC TTGTGATGTT TTTCATGGTT CTGGTTGCCT TGGTAGGATT GGGCCTGGGG        300
ATGTTTCAGC TCTTCCACCT GCAGAAGGAA CTGGCAGAAC TCCGTGAGTT CACCAACCAA        360
AGCCTTAAAG TATCATCTTT TGAAAAGCAA ATAGGCCACC CCAGTCCACC CCCTGAAAAA        420
AAGGAGCTGA GGAAAGTGGC CCATTTAACA GGCAAGTCCA ACTCAAGGTC CATGCCTCTG        480
GAATGGGAAG ACACCTATGG AATTGTCCTG CTTTCTGGAG TGAAGTATAA GAAGGGTGGC        540
CTTGTGATCA ATGAAACTGG GCTGTACTTT GTATATTCCA AAGTATACTT CCGGGGTCAA        600
TCTTGCAACA ACCTGCCCCT GAGCCACAAG GTCTACATGA GGAACTCTAA GTATCCCCAG        660
GATCTGGTGA TGATGGAGGG GAAGATGATG AGCTACTGCA CTACTGGGCA GATGTGGGCC        720
CGCAGCAGCT ACCTGGGGGC AGTGTTCAAT CTTACCAGTG CTGATCATTT ATATGTCAAC        780
GTATCTGAGC TCTCTCTGGT CAATTTTGAG GAATCTCAGA CGTTTTTCGG CTTATATAAG        840
CTCTAA                                                                   846
(2)SEQ ID NO：38的信息：
  (I)序列特征：
  (A)长度：786碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (D)拓扑结构：线性
  (xi)序列描述：SEQ ID NO：38
ATGCAGCAGC CCTTCAATTA CCCATATCCC CAGATCTACT GGGTGGACAG CAGTGCCAGC         60
TCTCCCTGGG CCCCTCCAGG CACAGTTCTT CCCTGTCCAA CCTCTGTGCC CAGAAGGCCT        120
GGTCAAAGGA GGCCACCACC ACCACCGCCA CCGCCACCAC TACCACCTCC GCCGCCGCCG        180
CCACCACTGC CTCCACTACC GCTGCCACCC CTGAAGAAGA GAGGGAACCA CAGCACAGGC        240
CTGTGTCTCC TTGTGATGTT TTTCATGGTT CTGGTTGCCT TGGTAGGATT GGGCCTGGGG        300
ATGTTTCAGC TCTTCCGCTT CGCACAGGCT ATAGGCCACC CCAGTCCACC CCCTGAAAAA        360
AAGGAGCTGA GGAAAGTGGC CCATTTAACA GGCAAGTCCA ACTCAAGGTC CATGCCTCTG        420
GAATGGGAAG ACACCTATGG AATTGTCCTG CTTTCTGGAG TGAAGTATAA GAAGGGTGGC        480
CTTGTGATCA ATGAAACTGG GCTGTACTTT GTATATTCCA AAGTATACTT CCGGGGTCAA        540
TCTTGCAACA ACCTGCCCCT GAGCCACAAG GTCTACATGA GGAACTCTAA GTATCCCCAG        600
GATCTGGTGA TGATGGAGGG GAAGATGATG AGCTACTGCA CTACTGGGCA GATGTGGGCC        660
CGCAGCAGCT ACCTGGGGGC AGTGTTCAAT CTTACCAGTG CTGATCATTT ATATGTCAAC        720
GTATCTGAGC TCTCTCTGGT CAATTTTGAG GAATCTCAGA CGTTTTTCGG CTTATATAAG        780
CTCTAA                                                                   786
(2)SEQ ID NO：39的信息：
  (I)序列特征：
  (A)长度：864碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (D)拓扑结构：线性
  (xi)序列描述：SEQ ID NO：39
ATGCAGCAGC CCTTCAATTA CCCATATCCC CAGATCTACT GGGTGGACAG CAGTGCCAGC         60
TCTCCCTGGG CCCCTCCAGG CACAGTTCTT CCCTGTCCAA CCTCTGTGCC CAGAAGGCCT        120
GGTCAAAGGA GGCCACCACC ACCACCGCCA CCGCCACCAC TACCACCTCC GCCGCCGCCG        180
CCACCACTGC CTCCACTACC GCTGCCACCC CTGAAGAAGA GAGGGAACCA CAGCACAGGC        240
CTGTGTCTCC TTGTGATGTT TTTCATGGTT CTGGTTGCCT TGGTAGGATT GGGCCTGGGG        300
ATGTTTCAGC TCTTCCAATC CTCCATCCTC CCCTATGCCG GAGGAGGGTT CGGGCTGCTC        360
GGTGCGGCGC AGGCCCTATG GGTGCGTCCT GCGGCCATCC TCAATCCTAT AGGCCACCCC        420
AGTCCACCCC CTGAAAAAAA GGAGCTGAGG AAAGTGGCCC ATTTAACAGG CAAGTCCAAC        480
TCAAGGTCCA TGCCTCTGGA ATGGGAAGAC ACCTATGGAA TTGTCCTGCT TTCTGGAGTG        540
AAGTATAAGA AGGGTGGCCT TGTGATCAAT GAAACTGGGC TGTACTTTGT ATATTCCAAA        600
GTATACTTCC GGGGTCAATC TTGCAACAAC CTGCCCCTGA GCCACAAGGT CTACATGAGG        660
AACTCTAAGT ATCCCCAGGA TCTGGTGATG ATGGAGGGGA AGATGATGAG CTACTGCACT        720
ACTGGGCAGA TGTGGGCCCG CAGCAGCTAC CTGGGGGCAG TGTTCAATCT TACCAGTGCT        780
GATCATTTAT ATGTCAACGT ATCTGAGCTC TCTCTGGTCA ATTTTGAGGA ATCTCAGACG        840
TTTTTCGGCT TATATAAGCT CTAA
864
(2)SEQ ID NO：40的信息：
  (I)序列特征：
  (A)长度：828碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (D)拓扑结构：线性
  (xi)序列描述：SEQ ID NO：40
ATGCAGCAGC CCTTCAATTA CCCATATCCC CAGATCTACT GGGTGGACAG CAGTGCCAGC         60
TCTCCCTGGG CCCCTCCAGG CACAGTTCTT CCCTGTCCAA CCTCTGTGCC CAGAAGGCCT        120
GGTCAAAGGA GGCCACCACC ACCACCGCCA CCGCCACCAC TACCACCTCC GCCGCCGCCG        180
CCACCACTGC CTCCACTACC GCTGCCACCC CTGAAGAAGA GAGGGAACCA CAGCACAGGC        240
CTGTGTCTCC TTGTGATGTT TTTCATGGTT CTGGTTGCCT TGGTAGGATT GGGCCTGGGG        300
ATGTTTCAGC TCTTCCACCT ACAGCGAGAG TCTACCAGCC AGATGCACAC AGCATCATCT        360
TTGGAGAAGC AAATAGGCCA CCCCAGTCCA CCCCCTGAAA AAAAGGAGCT GAGGAAAGTG        420
GCCCATTTAA CAGGCAAGTC CAACTCAAGG TCCATGCCTC TGGAATGGGA AGACACCTAT        480
GGAATTGTCC TGCTTTCTGG AGTGAAGTAT AAGAAGGGTG GCCTTGTGAT CAATGAAACT        540
GGGCTGTACT TTGTATATTC CAAAGTATAC TTCCGGGGTC AATCTTGCAA CAACCTGCCC        600
CTGAGCCACA AGGTCTACAT GAGGAACTCT AAGTATCCCC AGGATCTGGT GATGATGGAG        660
GGGAAGATGA TGAGCTACTG CACTACTGGG CAGATGTGGG CCCGCAGCAG CTACCTGGGG        720
GCAGTGTTCA ATCTTACCAG TGCTGATCAT TTATATGTCA ACGTATCTGA GCTCTCTCTG        780
GTCAATTTTG AGGAATCTCA GACGTTTTTC GGCTTATATA AGCTCTAA                     828
(2)SEQ ID NO：41的信息：
  (I)序列特征：
  (A)长度：846碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (D)拓扑结构：线性
ATGGCTATGA TGGAGGTCCA GGGGGGACCC AGCCTGGGAC AGACCTGCGT GCTGATCGTG         60
ATCTTCACAG TGCTCCTGCA GTCTCTCTGT GTGGCTGTAA CTTACGTGTA CTTTACCAAC        120
GAGCTGAAGC AGATGCAGGA CAAGTACTCC AAAAGTGGCA TTGCTTGTTT CTTAAAAGAA        180
GATGACAGTT ATTGGGACCC CAATGACGAA GAGAGTATGA ACAGCCCCTG CTGGCAAGTC        240
AAGTGGCAAC TCCGTCAGCT CGTTAGAAAG ATGATTTTGA GAACCTCTGA GGAAACCATT        300
TCTACAGTTC AAGAAAAGCA ACAAAATATT TCTCCCCTAG TGAGAGAAAG AGGTCCTCAG        360
AGAGTAGCAG CTCACATAAC TGGGACCAGA GGAAGAAGCA ACACATTGTC TTCTCCAAAC        420
TCCAAGAATG AAAAGGCTCT GGGCCGCAAA ATAAACTCCT GGGAATCATC AAGGAGTGGG        480
CATTCATTCC TGAGCAACTT GCACTTGAGG AATGGTGAAC TGGTCATCCA TGAAAAAGGG        540
TTTTACTACA TCTATTCCCA AACATACTTT CGATTTCAGG AGGAAATAAA AGAAAACACA        600
AAGAACGACA AACAAATGGT CCAATATATT TACAAATACA CAAGTTATCC TGACCCTATA        660
TTGTTGATGA AAAGTGCTAG AAATAGTTGT TGGTCTAAAG ATGCAGAATA TGGACTCTAT        720
TCCATCTATC AAGGGGGAAT ATTTGAGCTT AAGGAAAATG ACAGAATTTT TGTTTCTGTA        780
ACAAATGAGC ACTTGATAGA CATGGACCAT GAAGCCAGTT TTTTCGGGGC CTTTTTAGTT        840
GGCTAA                                                                   846
(2)SEQ ID NO：42的信息：
  (I)序列特征：
  (A)长度：876碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (d)拓扑结构：线性
  (xi)序列描述：SEQ ID NO：42
ATGCCTTCCT CAGGGGCCCT GAAGGACCTC AGCTTCAGTC AGCACTTCAG GATGATGGTG         60
ATTTGCATAG TGCTCCTGCA GGTGCTCCTG CAGGCTGTGT CTGTGGCTGT GACTTACATG        120
TACTTCACCA ACGAGATGAA GCAGCTGCAG GACAATTACT CCAAAATTGG ACTAGCTTGC        180
TTCTCAAAGA CGGATGAGGA TTTCTGGGAC TCCACTGATG GAGAGATCTT GAACAGACCC        240
TGCTTGCAGG TTAAGAGGCA ACTGTATCAG CTCATTGAAG AGGTGACTTT GAGAACCTTT        300
CAGGACACCA TTTCTACAGT TCCAGAAAAG CAGCTAAGTA CTCCTCCCTT GCCCAGAGGT        360
GGAAGACCTC AGAAAGTGGC AGCTCACATT ACTGGGATCA CTCGGAGAAG CAACTCAGCT        420
TTAATTCCAA TCTCCAAGGA TGGAAAGACC TTAGGCCAGA AGATTGAATC CTGGGAGTCC        480
TCTCGGAAAG GGCATTCATT TCTCAACCAC GTGCTCTTTA GGAATGGAGA GCTGGTCATC        540
GAGCAGGAGG GCCTGTATTA CATCTATTCC CAAACATACT TCCGATTTCA GGAAGCTGAA        600
GACGCTTCCA AGATGGTCTC AAAGGACAAG GTGAGAACCA AACAGCTGGT GCAGTACATC        660
TACAAGTACA CCAGCTATCC GGATCCCATA GTGCTCATGA AGAGCGCCAG AAACAGCTGT        720
TGGTCCAGAG ATGCCGAGTA CGGACTGTAC TCCATCTATC AGGGAGGATT GTTCGAGCTA        780
AAAAAAAATG ACAGGATTTT TGTTTCTGTG ACAAATGAAC ATTTGATGGA CCTGGATCAA        840
GAAGCCAGCT TCTTTGGAGC CTTTTTAATT AACTAA                                  876
(2)SEQ ID NO：43的信息：
  (I)序列特征：
  (A)长度：720碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (D)拓扑结构：线性
  (xi)序列描述：SEQ ID NO：43
ATGGAGCCAG GGCTGCAACA AGCAGGCAGC TGTGGGGCTC CTTCCCCTGA CCCAGCCATG         60
CAGGTGCAGC CCGGCTCGGT AGCCAGCCCC TGGAGAAGCA CGAGGCCCTG GAGAAGCACA        120
AGTCGCAGCT ACTTCTACCT CAGCACCACC GCACTGGTGT GCCTTGTTGT GGCAGTGGCG        180
ATCATTCTGG TACTGGTAGT CCAGAAAAAG GACTCCACTC CAAATACAAC TGAGAAGGCC        240
CCCCTTAAAG GAGGAAATTG CTCAGAGGAT CTCTTCTGTA CCCTGAAAAG TACTCCATCC        300
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AACGAAGATG GCACCATCCA CGGACTCATA TACCAGGACG GGAACCTGAT AGTCCAATTC        420
CCTGGCTTGT ACTTCATCGT TTGCCAACTG CAGTTCCTCG TGCAGTGCTC AAATCATTCT        480
GTGGACCTGA CATTGCAGCT CCTCATCAAT TCCAAGATCA AAAAGCAGAC GTTGGTAACA        540
GTGTGTGAGT CTGGAGTTCA GAGTAAGAAC ATCTACCAGA ATCTCTCTCA GTTTTTGCTG        600
CATTACTTAC AGGTCAACTC TACCATATCA GTCAGGGTGG ATAATTTCCA GTATGTGGAT        660
ACAAACACTT TCCCTCTTGA TAATGTGCTA TCCGTCTTCT TATATAGTAG CTCAGACTGA        720
(2)SEQ ID NO：44的信息：
  (I)序列特征：
  (A)长度：930碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (D)拓扑结构：线性
  (xi)序列描述：SEQ ID NO：44
ATGGACCAGC ACACACTTGA TGTGGAGGAT ACCGCGGATG CCAGACATCC AGCAGGTACT         60
TCGTGCCCCT CGGATGCGGC GCTCCTCAGA GATACCGGGC TCCTCGCGGA CGCTGCGCTC        120
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CCAAAGCTCT ATGGCCTAGT CGCTTTGGTT TTGCTGCTTC TGATCGCCGC CTGTGTTCCT        300
ATCTTCACCC GCACCGAGCC TCGGCCAGCG CTCACAATCA CCACCTCGCC CAACCTGGGT        360
ACCCGAGAGA ATAATGCAGA CCAGGTCACC CCTGTTTCCC ACATTGGCTG CCCCAACACT        420
ACACAACAGG GCTCTCCTGT GTTCGCCAAG CTACTGGCTA AAAACCAAGC ATCGTTGTGC        480
AATACAACTC TGAACTGGCA CAGCCAAGAT GGAGCTGGGA GCTCATACCT ATCTCAAGGT        540
CTGAGGTACG AAGAAGACAA AAAGGAGTTG GTGGTAGACA GTCCCGGGCT CTACTACGTA        600
TTTTTGGAAC TGAAGCTCAG TCCAACATTC ACAAACACAG GCCACAAGGT GCAGGGCTGG        660
GTCTCTCTTG TTTTGCAAGC AAAGCCTCAG GTAGATGACT TTGACAACTT GGCCCTGACA        720
GTGGAACTGT TCCCTTGCTC CATGGAGAAC AAGTTAGTGG ACCGTTCCTG GAGTCAACTG        780
TTGCTCCTGA AGGCTGGCCA CCGCCTCAGT GTGGGTCTGA GGGCTTATCT GCATGGAGCC        840
CAGGATGCAT ACAGAGACTG GGAGCTGTCT TATCCCAACA CCACCAGCTT TGGACTCTTT        900
CTTGTGAAAC CCGACAACCC ATGGGAATGA                                         930

Claims (21)

1.一种用于在CD40+人细胞中表达嵌合CD40配体的药物组合物，其中所述嵌合CD40配体包括一个或多个衍生于人CD40配体基因的人的结构域和一个或多个衍生于鼠CD40配体基因的鼠的结构域，并且其中所述组合物包括编码所述嵌合CD40配体的嵌合多核苷酸。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述鼠CD40配体结构域包括细胞外鼠CD40配体结构域。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述细胞外鼠CD40配体结构域包括结构域III。
4.根据权利要求2所述的组合物，其中所述细胞外鼠CD40配体结构域包括结构域IV。
5.根据权利要求1所述的组合物，其中所述鼠CD40配体组成为结构域I。
6.根据权利要求1所述的组合物，其中所述鼠CD40配体组成为结构域II。
7.根据权利要求1所述的组合物，其中所述嵌合多核苷酸组成为SEQ IDNO.3的核酸序列。
8.根据权利要求1所述的组合物，其中所述嵌合多核苷酸组成为SEQ IDNO.20的核酸序列。
9.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物在人CD40+肿瘤细胞中有活性。
10.根据权利要求9所述的组合物，其中所述肿瘤细胞包括肿瘤B细胞。
11.根据权利要求9所述的组合物，其中所述肿瘤细胞包括肿瘤T细胞。
12.根据权利要求1所述的组合物，其中所述嵌合多核苷酸组成为SEQID NO.4的核酸序列。
13.根据权利要求1所述的组合物，其中所述嵌合多核苷酸组成为SEQID NO.5的核酸序列。
14.根据权利要求1所述的组合物，其中所述嵌合多核苷酸组成为SEQID NO.6的核酸序列。
15.根据权利要求1所述的组合物，其中所述嵌合多核苷酸组成为SEQID NO.7的核酸序列。
16.一种用于在人细胞中表达嵌合Fas配体的药物组合物，其中所述嵌合Fas配体包括一个或多个衍生于人Fas配体基因的人的结构域和一个或多个衍生于鼠Fas配体基因的鼠的结构域，并且其中所述组合物包括编码所述嵌合Fas配体的嵌合多核苷酸。
17.根据权利要求16所述的组合物，其中所述嵌合多核苷酸组成为SEQID NO.37的核酸序列。
18.根据权利要求16所述的组合物，其中所述嵌合多核苷酸组成为SEQID NO.38的核酸序列。
19.根据权利要求16所述的组合物，其中所述嵌合多核苷酸组成为SEQID NO.39的核酸序列。
20.一种药物组合物，其组成为通过权利要求1的嵌合CD40配体多核苷酸转染的哺乳动物、细菌或昆虫细胞。
21.一种药物组合物，其组成为通过权利要求16的嵌合Fas配体多核苷酸转染的哺乳动物、细菌或昆虫细胞。
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