NO331434B1 - Kimaert nukleinsyremolekyl, rekombinant ekspresjonsvektor og vertcelle - Google Patents
Kimaert nukleinsyremolekyl, rekombinant ekspresjonsvektor og vertcelle Download PDFInfo
- Publication number
- NO331434B1 NO331434B1 NO20074906A NO20074906A NO331434B1 NO 331434 B1 NO331434 B1 NO 331434B1 NO 20074906 A NO20074906 A NO 20074906A NO 20074906 A NO20074906 A NO 20074906A NO 331434 B1 NO331434 B1 NO 331434B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- cells
- ligand
- gene
- accessory molecule
- human
- Prior art date
Links
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 title claims description 17
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims description 15
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims description 15
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims description 15
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 title claims description 6
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims abstract description 98
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 108010029697 CD40 Ligand Proteins 0.000 claims description 119
- 241001529936 Murinae Species 0.000 claims description 105
- 102100032937 CD40 ligand Human genes 0.000 claims description 85
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 78
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 78
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 claims description 42
- 101150013553 CD40 gene Proteins 0.000 claims description 39
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 claims description 17
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 15
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 15
- 102000002274 Matrix Metalloproteinases Human genes 0.000 claims description 14
- 108010000684 Matrix Metalloproteinases Proteins 0.000 claims description 14
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 10
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 10
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 10
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 claims description 4
- 101000738343 Bos taurus CD40 ligand Proteins 0.000 claims description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 452
- 239000003446 ligand Substances 0.000 abstract description 420
- 239000013598 vector Substances 0.000 abstract description 168
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 abstract description 74
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 30
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 24
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 abstract description 16
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 abstract description 13
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 8
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 6
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 abstract description 4
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 abstract description 3
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 abstract description 3
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 abstract 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 453
- 208000032852 chronic lymphocytic leukemia Diseases 0.000 description 169
- 208000010839 B-cell chronic lymphocytic leukemia Diseases 0.000 description 156
- 208000031422 Lymphocytic Chronic B-Cell Leukemia Diseases 0.000 description 153
- 238000000034 method Methods 0.000 description 113
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 96
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 87
- 108050002568 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 6 Proteins 0.000 description 81
- 102100031988 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 6 Human genes 0.000 description 71
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 62
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 60
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 59
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 58
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 52
- 210000005170 neoplastic cell Anatomy 0.000 description 47
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 44
- 101000868215 Homo sapiens CD40 ligand Proteins 0.000 description 37
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 37
- 101000638161 Homo sapiens Tumor necrosis factor ligand superfamily member 6 Proteins 0.000 description 34
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 34
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 34
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 34
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 34
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 34
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 33
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 33
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 29
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 28
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 27
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 27
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 24
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 24
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 24
- 102100037877 Intercellular adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 23
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 23
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 22
- 101000914484 Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD80 Proteins 0.000 description 22
- 102100027222 T-lymphocyte activation antigen CD80 Human genes 0.000 description 22
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 22
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 22
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 22
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 22
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 22
- 101000934356 Homo sapiens CD70 antigen Proteins 0.000 description 21
- 101000599852 Homo sapiens Intercellular adhesion molecule 1 Proteins 0.000 description 21
- 230000009826 neoplastic cell growth Effects 0.000 description 21
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 20
- 230000006870 function Effects 0.000 description 20
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 20
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 20
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 19
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 19
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 18
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 18
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 17
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 17
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 15
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 15
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 14
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 14
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 14
- 102100024598 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 10 Human genes 0.000 description 13
- 101710097160 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 10 Proteins 0.000 description 13
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 13
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 13
- 102100025221 CD70 antigen Human genes 0.000 description 12
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 12
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 12
- 102100027207 CD27 antigen Human genes 0.000 description 11
- 102000017420 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Human genes 0.000 description 11
- 108050005493 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Proteins 0.000 description 11
- 101150064015 FAS gene Proteins 0.000 description 11
- 101000914511 Homo sapiens CD27 antigen Proteins 0.000 description 11
- 101100059511 Homo sapiens CD40LG gene Proteins 0.000 description 11
- 101000868216 Mus musculus CD40 ligand Proteins 0.000 description 11
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 11
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 11
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 11
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 11
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 11
- 230000000981 bystander Effects 0.000 description 11
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 11
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 11
- 238000012353 t test Methods 0.000 description 11
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 11
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 11
- 101000611023 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 6 Proteins 0.000 description 10
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 10
- 102100040403 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 6 Human genes 0.000 description 10
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 10
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 10
- 210000001503 joint Anatomy 0.000 description 10
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 10
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 10
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 9
- 102000053826 human CD70 Human genes 0.000 description 9
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 9
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 9
- 230000004044 response Effects 0.000 description 9
- 238000011725 BALB/c mouse Methods 0.000 description 8
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 8
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 8
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 8
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 8
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 241000894007 species Species 0.000 description 8
- 210000002437 synoviocyte Anatomy 0.000 description 8
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 7
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 7
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 description 7
- -1 TNFp Proteins 0.000 description 7
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 7
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 7
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 7
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 7
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 7
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 7
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 7
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 7
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 7
- 108010082808 4-1BB Ligand Proteins 0.000 description 6
- 206010000890 Acute myelomonocytic leukaemia Diseases 0.000 description 6
- 241000829100 Macaca mulatta polyomavirus 1 Species 0.000 description 6
- 208000033835 Myelomonocytic Acute Leukemia Diseases 0.000 description 6
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 6
- 108700012920 TNF Proteins 0.000 description 6
- 102100032100 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 8 Human genes 0.000 description 6
- 102100032101 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 9 Human genes 0.000 description 6
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 6
- 208000011912 acute myelomonocytic leukemia M4 Diseases 0.000 description 6
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 6
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 6
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 6
- 210000000285 follicular dendritic cell Anatomy 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 6
- 210000001865 kupffer cell Anatomy 0.000 description 6
- 210000001821 langerhans cell Anatomy 0.000 description 6
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 6
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 6
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 6
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 6
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 6
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 6
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 5
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 5
- 108010017987 CD30 Ligand Proteins 0.000 description 5
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 5
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 5
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 5
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 5
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 5
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 5
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 5
- 108010052621 fas Receptor Proteins 0.000 description 5
- 102000018823 fas Receptor Human genes 0.000 description 5
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 5
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 5
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 5
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 5
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 5
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 5
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 5
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 5
- 210000001179 synovial fluid Anatomy 0.000 description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 5
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 5
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 4
- 208000010833 Chronic myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 4
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 4
- 102100033215 DNA nucleotidylexotransferase Human genes 0.000 description 4
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 4
- 101000611183 Homo sapiens Tumor necrosis factor Proteins 0.000 description 4
- 101000638240 Mus musculus Tumor necrosis factor ligand superfamily member 6 Proteins 0.000 description 4
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 4
- 102000015336 Nerve Growth Factor Human genes 0.000 description 4
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 4
- 210000004207 dermis Anatomy 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- XVLXYDXJEKLXHN-UHFFFAOYSA-M dioc6 Chemical compound [I-].O1C2=CC=CC=C2[N+](CCCCCC)=C1C=CC=C1N(CCCCCC)C2=CC=CC=C2O1 XVLXYDXJEKLXHN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 4
- 229940044627 gamma-interferon Drugs 0.000 description 4
- 102000057041 human TNF Human genes 0.000 description 4
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 4
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 4
- 210000003127 knee Anatomy 0.000 description 4
- 208000037841 lung tumor Diseases 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 4
- 229940053128 nerve growth factor Drugs 0.000 description 4
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 4
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 4
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 4
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 4
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000025324 B-cell acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 description 3
- 208000032791 BCR-ABL1 positive chronic myelogenous leukemia Diseases 0.000 description 3
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 3
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 3
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 3
- 102100025137 Early activation antigen CD69 Human genes 0.000 description 3
- 208000009386 Experimental Arthritis Diseases 0.000 description 3
- 101100273745 Homo sapiens CD70 gene Proteins 0.000 description 3
- 101000934374 Homo sapiens Early activation antigen CD69 Proteins 0.000 description 3
- 101001063392 Homo sapiens Lymphocyte function-associated antigen 3 Proteins 0.000 description 3
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 3
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 3
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 3
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 3
- 206010067125 Liver injury Diseases 0.000 description 3
- 102100030984 Lymphocyte function-associated antigen 3 Human genes 0.000 description 3
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 3
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 3
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 3
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 3
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 3
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 3
- 229960001714 calcium phosphate Drugs 0.000 description 3
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 3
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 3
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 3
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 3
- 210000003162 effector t lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 201000003444 follicular lymphoma Diseases 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 3
- 210000001911 interdigitating cell Anatomy 0.000 description 3
- PGHMRUGBZOYCAA-UHFFFAOYSA-N ionomycin Natural products O1C(CC(O)C(C)C(O)C(C)C=CCC(C)CC(C)C(O)=CC(=O)C(C)CC(C)CC(CCC(O)=O)C)CCC1(C)C1OC(C)(C(C)O)CC1 PGHMRUGBZOYCAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PGHMRUGBZOYCAA-ADZNBVRBSA-N ionomycin Chemical compound O1[C@H](C[C@H](O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)/C=C/C[C@@H](C)C[C@@H](C)C(/O)=C/C(=O)[C@@H](C)C[C@@H](C)C[C@@H](CCC(O)=O)C)CC[C@@]1(C)[C@@H]1O[C@](C)([C@@H](C)O)CC1 PGHMRUGBZOYCAA-ADZNBVRBSA-N 0.000 description 3
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 3
- 238000007799 mixed lymphocyte reaction assay Methods 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 3
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 3
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 3
- 210000001258 synovial membrane Anatomy 0.000 description 3
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 3
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 3
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 2
- 208000010370 Adenoviridae Infections Diseases 0.000 description 2
- 206010060931 Adenovirus infection Diseases 0.000 description 2
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N Deoxyuridine 5'-triphosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 2
- 206010015150 Erythema Diseases 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 2
- 229920000209 Hexadimethrine bromide Polymers 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 101100005713 Homo sapiens CD4 gene Proteins 0.000 description 2
- 101001002709 Homo sapiens Interleukin-4 Proteins 0.000 description 2
- 101000917826 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-a Proteins 0.000 description 2
- 101000917824 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-b Proteins 0.000 description 2
- 101000764535 Homo sapiens Lymphotoxin-alpha Proteins 0.000 description 2
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 2
- 101000638255 Homo sapiens Tumor necrosis factor ligand superfamily member 8 Proteins 0.000 description 2
- 108700001097 Insect Genes Proteins 0.000 description 2
- 108010064593 Intercellular Adhesion Molecule-1 Proteins 0.000 description 2
- 102100029204 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-a Human genes 0.000 description 2
- 208000030289 Lymphoproliferative disease Diseases 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 2
- 108700005443 Microbial Genes Proteins 0.000 description 2
- 108091061960 Naked DNA Proteins 0.000 description 2
- 206010028851 Necrosis Diseases 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- 101000638260 Rattus norvegicus Tumor necrosis factor ligand superfamily member 6 Proteins 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 2
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 2
- 101800000859 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 6, soluble form Proteins 0.000 description 2
- 102400000084 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 6, soluble form Human genes 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- 208000011589 adenoviridae infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 230000000240 adjuvant effect Effects 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 230000001270 agonistic effect Effects 0.000 description 2
- 210000003423 ankle Anatomy 0.000 description 2
- 230000000719 anti-leukaemic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N beta-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N 0.000 description 2
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 2
- 239000003618 borate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 238000010805 cDNA synthesis kit Methods 0.000 description 2
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 2
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 231100000234 hepatic damage Toxicity 0.000 description 2
- 102000055229 human IL4 Human genes 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 2
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 2
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 230000008818 liver damage Effects 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 201000009546 lung large cell carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 2
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 2
- 235000020030 perry Nutrition 0.000 description 2
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 2
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 2
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 2
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000010507 Adenocarcinoma of Lung Diseases 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- KHOITXIGCFIULA-UHFFFAOYSA-N Alophen Chemical compound C1=CC(OC(=O)C)=CC=C1C(C=1N=CC=CC=1)C1=CC=C(OC(C)=O)C=C1 KHOITXIGCFIULA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 101000597784 Bos taurus Tumor necrosis factor Proteins 0.000 description 1
- 101150088890 CD70 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100378877 Caenorhabditis elegans allo-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 1
- 102000000503 Collagen Type II Human genes 0.000 description 1
- 108010041390 Collagen Type II Proteins 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 108010008286 DNA nucleotidylexotransferase Proteins 0.000 description 1
- 206010011968 Decreased immune responsiveness Diseases 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 108010039471 Fas Ligand Protein Proteins 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100036242 HLA class II histocompatibility antigen, DQ alpha 2 chain Human genes 0.000 description 1
- 101000930801 Homo sapiens HLA class II histocompatibility antigen, DQ alpha 2 chain Proteins 0.000 description 1
- 101000935040 Homo sapiens Integrin beta-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000599940 Homo sapiens Interferon gamma Proteins 0.000 description 1
- 101001076407 Homo sapiens Interleukin-1 receptor antagonist protein Proteins 0.000 description 1
- 101100207070 Homo sapiens TNFSF8 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000830565 Homo sapiens Tumor necrosis factor ligand superfamily member 10 Proteins 0.000 description 1
- 101000638251 Homo sapiens Tumor necrosis factor ligand superfamily member 9 Proteins 0.000 description 1
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102100025390 Integrin beta-2 Human genes 0.000 description 1
- 229940119178 Interleukin 1 receptor antagonist Drugs 0.000 description 1
- 102000051628 Interleukin-1 receptor antagonist Human genes 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 208000012659 Joint disease Diseases 0.000 description 1
- 206010023232 Joint swelling Diseases 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 108010031801 Lipopolysaccharide Receptors Proteins 0.000 description 1
- 208000008771 Lymphadenopathy Diseases 0.000 description 1
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 description 1
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 description 1
- 229940124761 MMP inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 description 1
- 208000034486 Multi-organ failure Diseases 0.000 description 1
- 208000010718 Multiple Organ Failure Diseases 0.000 description 1
- 101100207071 Mus musculus Tnfsf8 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000638253 Mus musculus Tumor necrosis factor ligand superfamily member 9 Proteins 0.000 description 1
- 108700019961 Neoplasm Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000048850 Neoplasm Genes Human genes 0.000 description 1
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 206010033661 Pancytopenia Diseases 0.000 description 1
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 241001505332 Polyomavirus sp. Species 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 206010036700 Primary immunodeficiency syndromes Diseases 0.000 description 1
- 206010037423 Pulmonary oedema Diseases 0.000 description 1
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 206010041660 Splenomegaly Diseases 0.000 description 1
- 238000012288 TUNEL assay Methods 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 206010068348 X-linked lymphoproliferative syndrome Diseases 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000002730 additional effect Effects 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 208000022531 anorexia Diseases 0.000 description 1
- 230000002456 anti-arthritic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 1
- 230000003416 augmentation Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 208000035269 cancer or benign tumor Diseases 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000004970 cd4 cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000008614 cellular interaction Effects 0.000 description 1
- 208000019065 cervical carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- GVPFVAHMJGGAJG-UHFFFAOYSA-L cobalt dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Co+2] GVPFVAHMJGGAJG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000010205 computational analysis Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 210000001608 connective tissue cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 206010061428 decreased appetite Diseases 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000003628 erosive effect Effects 0.000 description 1
- 231100000321 erythema Toxicity 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 210000004744 fore-foot Anatomy 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 1
- 238000012637 gene transfection Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 231100000753 hepatic injury Toxicity 0.000 description 1
- 210000000548 hind-foot Anatomy 0.000 description 1
- 230000036732 histological change Effects 0.000 description 1
- 238000010562 histological examination Methods 0.000 description 1
- 102000043557 human IFNG Human genes 0.000 description 1
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 description 1
- 230000007954 hypoxia Effects 0.000 description 1
- 230000005934 immune activation Effects 0.000 description 1
- 230000007124 immune defense Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000002650 immunosuppressive therapy Methods 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 210000004969 inflammatory cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 239000003407 interleukin 1 receptor blocking agent Substances 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007919 intrasynovial administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 150000002540 isothiocyanates Chemical class 0.000 description 1
- 210000000629 knee joint Anatomy 0.000 description 1
- 210000003041 ligament Anatomy 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 201000005249 lung adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 201000005296 lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 206010025135 lupus erythematosus Diseases 0.000 description 1
- 208000018555 lymphatic system disease Diseases 0.000 description 1
- 210000003738 lymphoid progenitor cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001589 lymphoproliferative effect Effects 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000003475 metalloproteinase inhibitor Substances 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 208000029744 multiple organ dysfunction syndrome Diseases 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 201000008383 nephritis Diseases 0.000 description 1
- 238000000424 optical density measurement Methods 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 230000023603 positive regulation of transcription initiation, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 208000028529 primary immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 208000005333 pulmonary edema Diseases 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 238000011536 re-plating Methods 0.000 description 1
- 230000036647 reaction Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000008844 regulatory mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 238000009738 saturating Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 210000004927 skin cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- IHQKEDIOMGYHEB-UHFFFAOYSA-M sodium dimethylarsinate Chemical compound [Na+].C[As](C)([O-])=O IHQKEDIOMGYHEB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 208000017572 squamous cell neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 1
- 108020001568 subdomains Proteins 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 1
- 210000005222 synovial tissue Anatomy 0.000 description 1
- 201000004595 synovitis Diseases 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 201000000596 systemic lupus erythematosus Diseases 0.000 description 1
- 210000000457 tarsus Anatomy 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 210000003371 toe Anatomy 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000439 tumor marker Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/48—Nerve growth factor [NGF]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/525—Tumour necrosis factor [TNF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/525—Tumour necrosis factor [TNF]
- C07K14/5255—Lymphotoxin [LT]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70575—NGF/TNF-superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2799/00—Uses of viruses
- C12N2799/02—Uses of viruses as vector
- C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Oppfinnelsen vedrører et polynukleotid som koder for et kimært molekyl hvor polynukleotidet omfatter, i rekkefølge, nukleotidsekvenser som koder for et proksimalt ekstracellulært domene (domene III) av et murint CD40 ligand gen og at distalt ekstracellulært domene (domene IV) av et humant CD40 ligand gen. Likeledes vedrører oppfinnelsen også et polynukleotid som koder for et kimært molekyl hvor polynukleotidet omfatter, i rekkefølge, nukleotidsekvenser som koder for et proksimalt ekstracellulært domene (domene III) av et humant CD40 ligand gen og et distalt ekstracellulært domene (domene IV) av et humant TNFa ligand gen. En human vertcelle og en rekombinant ekspresjonsvektor er også omtalt.
Description
Den foreliggende oppfinnelse vedrører et kimært nukleinsyremolekyl. Oppfinnelsen vedrører også en vertcelle. Endelig vedrører oppfinnelsen en rekombinant ekspresjonsvektor.
Levkemier, lymfomer, karsinomer og andre maligniteter er vel kjent og beskrevet i f.eks. Harrison's Principles of Internal Medicine, Wilson et al., eds., McGraw-Hill, New York,
s. 1599-1612. Disse maligniteter synes på en måte å ha unnsluppet immunsystemets overvåkningsmekanismer som raskt og kontinuerlig eliminerer proliferative celler. Den nøyaktige mekanisme hvorved disse maligniteter unnslipper immunsystemovervåkingen er ikke kjent.
Noen av disse maligne immunsystemceller er maligne antigenpresenterende celler som ikke fungerer riktig innenfor immun-kaskaden. Neoplastiske B celler kan f.eks. ikke indusere til og med svake allogene eller autologe blandede lymfocytt-reaksjoner in vitro. Ytterligere bevis for at maligniteter overlever på grunn av svikt i immunbevoktningsmekanismen inkluderer den økte hyppighet av slike maligniteter i immunkompromiterte individer, slik som allograft-resipienter og dem som mottar langtids-immunsupresjonsterapi. Videre er hyppigheten av disse maligniteter økt i pasienter med "Acquired Immune Deficiency Syndrome" (AIDS) og pasienter med primære immunsviktsyndromer, som X-koblet lymfopolyferativt syndrom eller Wiscott-Aldrich Syndrome (Thomas et al., Adv. Cancer Res. 57:329, 1991).
Immunsystemet fungerer normalt for å eliminerer maligne celler ved å gjenkjenne de maligne celler som fremmede celler og fjerne disse celler fra kroppen. En immunreaksjon avhenger både av immunsystemets antistoff respons og av den cellulære immunrespons i en pasient. Mere spesielt krever den cellulære immunrespons som virker til å gjenkjenne maligne celler som fremmede, et antall ulike celler av immunsystemet og interaksjon mellom disse celler. En immunreaksjon starter med en T lymfocytt (T celle) som på sin celleoverflate har T celle reseptoren. T cellen har også evnen til å uttrykke på sin overflate forskjellige aksessoriske molekyler som interagerer med et aksessorisk molekyl på B lymfocytten (B celle). Når T celle reseptoren i T cellen binder spesifikt til et fremmed antigen, slik som en malign celle, blir den aktivert og uttrykker aksessorisk molekyl liganden, CD40 ligand, på sin celleoverflate. Aksessorisk cellemolekyl ligander er kun tilstede på de aktiverte T celler i en kort tidsperiode og fjernes raskt fra celleoverflaten. Etter at aksessorisk cellemolekyl liganden er fjernet fra overflaten av den aktiverte T celle, er dens evne til å binde til B celler via aksessorisk molekyl liganden ødelagt.
Når den er tilstede på overflaten av en aktivert T celle, kan aksessorisk celle liganden bindes spesifikt til det aksessoriske cellemolekyl tilstede på B cellen. Denne spesifikke T-B celle interaksjon fører til at B og T cellen ko-stimulerende uttrykker overflateaksessorisk molekyl og cytokiner som resulterer i en immunaktivering som fører til cytolytiske T celler som spesifikt dreper og fjerner den maligne celle fra kroppen.
Interaksjonen med en aktivert T celle er ikke alene begrenset til B celler, man kan heller gjennomføres med en hvilken som helst celle som er i stand til å presentere antigen overfor T cellen (en antigenpresenterende celle). Disse celler inkluderer B lymfocytt, makrofager, dendrittiske celler, monocytter, Langerhans celler, interdigitasjonsceller, follikulære dendrittiske celler eller Kupffer celler. Disse celler er alle kjent til å ha forskjellige aksessoriske molekyler på celleoverflaten som tillater dem å interagere med andre celler i immunsystemet. Disse antigenpresenterende celler har alle f.eks. det aksessoriske molekyl CD40 på deres celleoverflate. Tilstedeværelsen av disse aksessoriske molekyler tillater disse antigenpresenterende celler å binde spesifikt til komplementær aksessorisk molekyl ligand og således interagere med andre immunceller.
Et stort antall aksessorisk molekyl ligander er medlemmer av tumornekrosefaktor superfamilien. (Fanslow et al., Sem. Immun., 6:267-268 (1994)). Genene for mange av disse aksessoriske molekyl ligander er blitt klonet og identifisert. Disse aksessorisk molekyl ligand gener koder for aksessoriske molekyler som har konfigurasjonen av type II membranproteiner og utviser varierende grad av homologi med andre aksessorisk molekyl ligand gener. F.eks. er genene for aksessorisk molekyl ligand som koder for både murin CD40 ligand og human CD40 ligand blitt isolert. Se Armitage et al., Nature, 357:80-82 (1992) og Hollenbaugh et al., EMBO J., 11:4313-4321 (1992).
CD40 og dets ligand, CD40 ligand er kritiske komponenter for en normal immunrespons. CD40 medierte signaler induserer immunlymfocytter til å proliferere og differensiere og bli potente antigenpresenterende celler. Maligne eller neoplastiske B celler er dårlige antigenpresenterende celler og er ikke i stand til å stimulere en kraftig allogeneisk blandet lymfo-cyttreaksjon. Vellykkede kryssbindinger av CD40 molekylet på immunceller resulterer i en streng allogeneisk blandet lymfo-cyttreaksjon som foreslår en sterk immunreaksjon. Forskjellige oppløselige CD40 ligander eller antistoffer spesifikke for CD40 er blitt anvendt for eventuelt å tverrbinde CD40. Disse opp-løselige CD40 ligander og CD40 spesifikke antistoffer er ikke optimale for tverrbinding av CD40 molekyler på antigenpresenterende celler, og arbeider ikke så effektivt som CD40 ligand uttrykt på en cellemembran til å produsere sterk stimulering av antigenpresenterende celler. Disse metoder er også vanskelige å implementere fordi store mengder CD40 ligand strukturer eller antistoffer må isoleres, noe som er vanskelig og et tidkrevende arbeide. Andre strategier for å anvende CD40 ligand i oppløsning eller som et membranbundet molekyl inkluderende transformasjon av fibroblaster med CD4 0 ligand for å produsere dyrkede celler som deretter anvendes til å presentere antigen, kan ikke under-kastes in vivo humane kliniske prosedyrer.
CD95 (Fas) interaksjon med dets ligand (Fas-ligand eller FasL) virker til å begrense varigheten av immunresponsen og/eller levetiden av aktiverte lymfocytter. Apoptose indusert ved Fas-FasL binding tjener til å fjerne aktiverte selv-reaktive lymfocytter. Problemer forårsaket ved endring av dette mønster er blitt demonstrert i dyr med defekter i Fas<->Fas ligand interaksjoner. Mus med mutasjoner som inaktiverer CD95 eller FasL utvikler en rekke lidelser inkluderende autoimmun patologi som ligner den som man ser i pasienter med revmatoid artritt (RA) eller systemisk lupus. Zhang, et al., i J. Clin. Invest 100:1951-1957 (1997) viser at injeksjon av FasL-uttrykkende virus, inn i ledd hos mus med kollagenindusert artritt, resulterer i apoptose av synovialceller og en lindring av artrittsymptomer. Ekspresjon av Fas ligand tillater fjerning av aktiverte celler som spiller en rolle i patogenesen av en autoimmun sykdom. Derfor vil en genterapi strategi for å introdusere FasL inn i leddene til pasienter med revmatoid artritt kunne fungere til å forbedre sykdomspatologien ved at den fører til destruksjon av de infiltrerende mononukleære celler.
Administrering av oppløslige aksessoriske molekyler og aksessorisk molekyl ligander er blitt vist til å trigge eller til å være assosiert med negative fysiologiske effekter. Behandling av mus som har villtype CD40 reseptor ekspresjon med f.eks. oppløselig CD40L-CD8 fusjonsprotein resulterer i en pulmonal inflammatorisk respons. Dette ble ikke observert i mus hvor genet for CD40 reseptoren var blitt slått ut. Disse forsøk, beskrevet i Wiley, J.A. et al., Journal of Immunology 158:2932-2938 (1997), understøtter in vitro data som foreslår at CD40 ligering kan resultere i inflammatoriske responser.
Direkte administrering av renset rekombinant oppløselig tumor nekrose faktor (enten a eller (3) resulterer i sjokk og vevskade, som beskrevet i Tracey, K. J., og A. Cerami, Annu. Rev. Med.
45:491-503 (1994). Innen minutter etter akutt intravenøs eller intraarteriell administrering av TNF, følger et sjokksyndrom, vevskade, kapillær lekkasje, hypoksi, pulmonalt ødem og
multippel organsvikt forbundet med høy mortalitet. Kronisk lav dose av TNF fører til anoreksi, vekttap, dehydrering og deplesjon av totalt protein og lipid i kroppen.
Oppløselig Fas ligand og reseptor er også blitt vist å være assosiert med vevsskade og andre negative virkninger. CD95, Fas reseptoren, er en mediator av apoptose. Fas ligand induserer apoptose ved å binde til Fas reseptor. Som vist i Galle, P.R., et al., J. Exp. Med. 182:1223-1230 (1995) resulterer administrering av et angonistisk anti-Fas antistoff i leverskade hos mus. Mus som fikk injisert intraperitonealt det agonistiske antistoffet døde innen noen få timer, og analyser viste at alvorlig leverskade ved apoptose var den mest sannsynlige dødsårsak.
Rollen til oppløselig Fas ligand (FasL) i patogenesen av systemisk vevskade ved agressivt lymfom er beskrevet i Sato, K. et al., British Journal of Haematology, 94:379-382 (1996). Funnene som er presentert i denne rapport indikerer at oppløselig FasL er direkte assosiert med patogenesen av leverskade og pancytopeni.
CD27, reseptoren for aksessorisk molekyl liganden, CD70, ble i en rapport av Oers, et al., i Blood 82:3430-3436 (1993) vist til å være assosiert med B celle maligniteter.
De ovennevnte funn kontraindikerte alle administreringene av oppløselige aksessorisk molekyl ligander, og fremhever behovet for terapier som øker nivåene av disse molekyler uten å resultere i økning av deres oppløselige former.
Til tross for den rike informasjon vedrørende gener for aksessorisk molekyl ligand og deres ekspresjon på overflaten av forskjellige immunceller, er den nøyaktige mekanisme hvorved gener for aksessorisk molekyl ligander er regulert på antigenpresenterende celler fremdeles ikke kjent. Uten spesifikk kunnskap om reguleringen av ekspresjonen av gener for aksessorisk molekyl ligand på disse antigenpresenterende celler, har en endring av immunresponsen ved å variere ekspresjonen av et gen for aksessorisk molekyl ligand til nå ikke vært mulig. Uten noen spesifikk kunnskap med hensyn til hvordan man skal regulere ekspresjonen av et aksessorisk molekyl ligand gen på en antigenpresenterende celle er det ikke mulig å endre immunresponsen mot maligne celler. Der var således et behov for en metode for
å øke ekspresjonen av et aksessorisk molekyl ligand gen på normale og maligne celler inkluderende antigenpresenterende celler.
Videre, uten evnen til å regulere ekspresjonen av aksessorisk molekyl ligander er det ikke mulig å endre immun-clearance av disse celler.
Den foreliggende oppfinnelse oppfyller de ovennevnte behov ved å tilveiebringe et kimært nukleinsyremolekyl, som er kjennetegnet ved at det omfatter et første polynukleotid som koder for et domene bestående av domene III av CD4 0 ligand, hvori domenet III er hybridiserbart under lavstringensbetingelser til en nukleotidsekvens inneholdt i, og valgt fra, gruppen som består av SEQ ID NO 1, 2 og 8, og hvori domenet III mangler et matriks metalloproteinase (mmp) spaltingssete, og et andre polynukleotid som koder for domene IV av TNF-a som er hybridiserbart under
lavstringensbetingelser til en nukleotidsekvens inneholdt i,
og valgt fra, gruppen som består av SEQ ID NO 9, 11, 12 og 21.
Oppfinnelsen tilveiebringer også et kimært nukleinsyremolekyl, som er kjennetegnet ved at det omfatter et første polynukleotid som koder for et domene bestående av domene III av CD40 ligand, hvori domenet III er hybridiserbart under lavstringensbetingelser til en nukleotidsekvens inneholdt i, og valgt fra, gruppen som består av SEQ ID NO 1, 2 og 8, og hvori domenet III mangler et matriks metalloproteinase (mmp) spaltingssete, og et andre polynukleotid som koder for domene IV av TNF-|3 som er hybridiserbart under lavstringensbetingelser til en nukleotidsekvens inneholdt i, og valgt fra, gruppen som består av SEQ ID NO 10 og 11.
Oppfinnelsen tilveiebringer også en rekombinant ekspresjonsvektor, som er kjennetegnet ved at den omfatter det kimære nukleinsyremolekyl som angitt i krav 1 eller 4.
Endelig tilveiebringer oppfinnelsen en vertcelle, som er kjennetegnet ved at den er transfektert med den rekombinante ekspresjonsvektoren som angitt i krav 8.
Disse og ytterligere trekk ved oppfinnelsen fremgår fra de i kravene anførte trekk.
Nye ekspresjonsvektorer som inneholder gener for aksessorisk molekyl ligand og metoder for å introdusere disse gener i normale og maligne antigenpresenterende celler og derved tillate endring av en immunrespons, behandlingen av autoimmune sykdommer og behandlingen av forskjellige neoplasier er beskrevet. Vektorer inneholder også ytterligere genetiske elementer som promotere, enhancere, polyadenylensignaler (3' ender), som tillater at vektoren vellykket kan plasseres inne i cellen og for å lede ekspresjonen av genet for aksessorisk molekyl ligand i en celle. Slike genterapivektorer er i stand til å transformere animalske celler direkte og derved introdusere genet for aksessorisk molekyl ligand inn i cellene til dette dyr i en form som kan benyttes til å produsere aksessorisk molekyl ligander inne i denne celle.
Funksjonen til en aksessorisk molekyl ligand kan modifiseres ved å endre halveringstiden til molekylet på celleoverflaten eller ved å endre nivået av ekspresjon av dette molekyl på celleoverflaten. Aksessorisk molekyl ligander som er modifiserte for å forbedre stabiliteten av slike aksessorisk molekyl ligander på celleoverflaten er tilveiebrakt. Slik økt stabilitet kan oppnås ved anvendelse av hvilken som helst av de metoder som er beskrevet i denne søknad inkluderende kimære molekyler og molekyler inn i hvilke mutasjoner blir innført i minst én lokalitet. Ekspresjonen av et slikt molekyl kan økes.
Genterapivektorer som inneholder gener for aksessorisk molekyl ligand som er kimære ved at deler av genet er avledet fra to separate aksessorisk molekyl ligander som eventuelt kan være fra forskjellige arter er beskrevet. Genene for aksessorisk molekyl ligand som inkluderer gener som koder for molekyler av tumornekrosefaktor (TNF) familien er også beskrevet. Molekylene som utgjør TNF familien inkluderer TNFa, TNFp, CD40 ligand, Fas ligand, CD70, CD30 ligand, 41BB ligand (4-1BBL), nervevekst-
faktor og TNF-relatert apoptoseinduserende ligand (TRAIL). De kimære aksessorisk molekyl ligand genene inneholder minst en
del av et murint gen for aksessorisk molekyl ligand sammen med deler av gener for aksessorisk molekyl ligand avledet fra enten mus, mennesker eller andre arter. Foretrukket anvendes murine CD40 ligand gener og kimære CD40 ligand gener inneholdende minst ett segment av det murine CD4 0 ligand genet sammen med minst
ett segment av det humane CD40 ligand genet. Kimære aksessorisk molekyl ligand gener hvor segmenter fra genet for aksessorisk molekyl ligand fra én art er blitt utvekslet med segmenter fra et andre gen for aksessorisk molekyl ligand som eventuelt kan være fra en annen art er beskrevet. Foretrukket har de trans-membrane og cytoplasmiske domener av det murine CD4 0 ligand gen blitt festet til de ekstracellulære domener av human CD40 ligand gen.
Genterapivektorer som er i stand til direkte å infisere den humane celle, pattedyrcelle, insektscelle eller annen celle er også kontemplert. Anvendelse av slike genterapivektorer forenkler i stor grad insersjonen av et gen for aksessorisk molekyl ligand inn i disses celler. De genterapivektorer som man ser på kan anvendes in vivo eller in vitro til å infisere den ønskede celle og er særlig anvendbare for å infisere maligne celler for å bevirke forlenget ekspresjon på høyt nivå av en fysiologisk ligand.
Animalske, pattedyrceller og humane celler som inneholder en genterapivektor som inkluderer et gen for aksessorisk molekyl ligand og tilstrekkelig genetisk informasjon til å uttrykke denne aksessorisk molekyl liganden inne i denne celle er også kontemplert. Humane neoplastiske antigenpresenterende celler som inneholder genterapivektorer eller som inneholder et gen for aksessorisk molekyl ligand sammen med en promoter og 3' ende region er foretrukket.
Humane celler og humane neoplastiske celler som inneholder en genterapivektor som inkluderer et kimært aksessorisk molekyl ligand gen er kontemplert. Bakterielle celler eller animalske celler som inneholder aksessorisk molekyl ligand gener, kimære aksessorisk molekyl ligand gener, murine aksessorisk molekyl ligand gener, humane aksessorisk molekyl ligand gener, genterapivektorer, vektorer, et kimært aksessorisk molekyl ligand gen sammen med en heterolog promoter, enhancer eller en polyadenyleringssekvens betraktes også.
Metoder for å endre immunresponsen i en human pasient eller immunreaktiviteten av humane celler in vivo ved å innføre et gen som koder for en aksessorisk molekyl ligand i de humane celler slik at denne aksessorisk molekyl ligand uttrykkes på overflaten av disse humane celler er beskrevet. Denne metode inkluderer innføringen av genet for aksessorisk molekyl ligand som en del av en genterapivektor eller i assosiasjon med en heterolog eller nativ promoter, enhancer eller polyadenylerings signal. Introduksjon av Fas ligand gener og kimære Fas ligand gener, konstruert som sett på i det foregående for CD40, i humane celler å endre deres immunreaktivitet er beskrevet. Metoder hvor slike aksessorisk molekyl ligand gener innføres i celler som har det aksessoriske molekyl hvortil aksessorisk molekyl liganden binder på overflaten av cellen inn i hvilken aksessorisk molekyl ligand genet er innført er beskrevet.
Endring av immunreaktivitet kan anvendes på alle typer humane, animalske og murine celler inkluderende humane neoplastiske celler som humane lymfomer, levkemi og andre maligniteter. Foretrukket introduseres genet som koder for aksessorisk molekyl liganden inn i potensielle antigenpresenterende celler av en human pasient eller celle som kan stimulere "bystanding" antigenpresenterende celler. Slike antigenpresenterende celler inkluderer monocytter, makrofager, B celler, Langerhans celler, interdigitasjons celler, follikulære dendrittiske celler, Kupffer celler og lignende. De forskjellige antigenpresenterende celler kan være tilstede som del av en kjent malignitet i en human pasient slik som levkemier, lymfomer, akutt monocytt-levkemi (AML), kronisk lymfocyttlevkemi (CLL), akutt myelomono-cyttlevkemi (AMML), kronisk myelogen eller kronisk myelomono-cyttlevkemi (CMML) og vil således inkludere alle tumorer av en hvilken som helst celle i stand til å presentere antigen mot det humane eller animalske immunsystem eller i stand til å stimulere "bystanding" antigenpresenterende celler. Ved å introdusere gener som koder for en aksessorisk molekyl ligand i en rekke ulike celler funnet i en pasient inkluderende muskel-celler, hudceller, stromaceller, bindevevceller, fibroblaster og lignende kan immunsystemet moduleres.
For å behandle neoplasier i enten en human pasient eller i en animalsk pasient kan de neoplastiske celler fra den humane eller animalske pasient foretrukket isoleres og deretter innføres i disse isolerte celler, det genet som koder for den kimære aksessorisk molekyl ligand eller den aksessorisk molekyl ligand slik at molekylet uttrykkes på celleoverflaten av disse neoplastiske celler eller andre somatiske celler. De neoplastiske celler føres deretter tilbake i den humane eller animalske pasient og kan deretter delta i en økt immunrespons.
Koinfeksjon eller kointroduksjon av genet for aksessorisk
molekyl ligand sammen med et gen som koder for et tumor eller karsinom spesifikt antigen er beskrevet. Denne kombinasjon av molekyler uttrykkes deretter på overflaten av de neoplastiske celler og når disse celler innføres i pasienten, fører dette
til hurtig immunrespons som resulterer i ødeleggelsen av disse celler.
Genterapivektoren eller annen vektor som bærer genet for aksessorisk molekyl ligand kan innføres direkte i tumoren eller tumorleiet til en pasient. Ved innføring i tumorleiet til en pasient, vil genterapivektoren eller annen vektor gå inn i cellene som er tilstede i tumoren eller tumorleiet og deretter uttrykke genet for aksessorisk molekyl ligand på overflaten av disse celler. Disse celler er deretter i stand til fullstendig å delta i den humane eller animalske immunrespons.
Immunresponsen for en vaksine kan økes. Et dyr kan vaksineres mot en forhåndsbestemt organisme eller antigen ved å administrere til dette dyr en vaksine som har en genetisk vektor som inneholder et gen for aksessorisk molekyl ligand. Et dyr kan også vaksineres ved å administrere to separate genetiske vektorer, en som inneholder antigenene fra organismen mot hvilken immunitet er ønskelig ved å isolere cellene fra måldyret og bringe disse celler i kontakt med en vektor som koder for minst ett antigen fra en forhåndsbestemt organisme slik at antigenet uttrykkes ved hjelp av cellene, og også bringe disse cellene i kontakt med en annen vektor som uttrykker genet for aksessorisk molekyl ligand på overflaten av dyrets antigenpresenterende celler. Sammen danner disse to separate vektorer en vaksinasjon som er mye sterkere og som har en lengre varighet enn vaksinasjon med antigen alene.
De foreliggende metoder for vaksinasjon er anvendbare på vaksi-nasjoner som er utformet til å gi immunitet mot virus, en celle, en bakterie, et hvilket som helst protein eller en sopp. De foreliggende metoder kan også anvendes for å immunisere mot forskjellige karsinomer og neoplasier. Her blir tumorantigenet mot hvilket immunitet er ønskelig, innført i dyret sammen med den genetiske vektor som inneholder genet for aksessorisk molekyl ligand.
Artritt kan behandles ved anvendelse av en genterapivektor som koder for en aksessorisk molekyl ligand. Av særlig interesse for anvendelse i forbindelse med artritt er Fas ligand molekylet hvor ekspresjonen av Fas ligand aktivitet er blitt økt i leddet og/eller hvor stabiliteten av Fas ligand aktivitet på celler i leddet er økt. Metoder for å behandle artritt ved anvendelse av kimære aksessorisk molekyl ligander og kimære aksessorisk molekyl ligand gener er beskrevet. Både ex vivo terapi og in vivo terapi av artritt ved anvendelse av ekspresjonsvektorer sammen med Fas liganden og modifiserte versjoner av dette molekylet inkluderende kimære molekyler er beskrevet.
Kort beskrivelse av tegningene
Figur 1 Figur 1 er et diagram som viser en rekke gener for aksessorisk molekyl ligand og domener I-IV av disse gener som utledet fra sekvensdata. Figur 2 Figur 2 er et diagram som viser eksempler på kimære aksessorisk molekyl ligand gener. Domenene avledet fra den murine aksessoriske modul er skyggelagt. Figur 3 Figur 3 viser mengden av enten mus eller human CD40 ligand funnet på overflaten av Hela eller CLL celler infisert med genterapivektorer som inneholder genene som koder for disse molekyler. Figur 3A viser ikke-infiserte Hela celler (skyggelagt) og Hela celler som er infisert med en genterapivektor som koder for murin CD40 ligand. Figur 3B viser ikke-infiserte Hela celler (skyggelagt) og Hela celler som er infisert med en gentrapivektor som koder for human CD40 ligand. Figur 3C viser ikke-infiserte CLL celler (skyggelagt) og CLL celler som er infisert med en genterapivektor som koder for murin CD40 ligand. Figur 3D viser ikke-infiserte CLL celler (skyggelagt) og CLL celler infisert med en genterapivektor som koder for human CD40 ligand. Figur 4 Figur 4 viser histogrammer av den økte ekspresjon av CD54 (figur 4B) og CD80 (figur 4D) og CLL celler inn i hvilke en genterapivektor som inneholder genet for aksessorisk molekyl ligand (murint CD40 ligand gen) er innført. Den skyggelagte kurven indikerer kontrollmerking i FACS anlyse og den åpne kurve indikerer merking med monoklonale antistoffer som er immunspesifikke for enten CD54 (figur 4A og 4B) eller CD80 (figurene 4C og 4D). Figur 5 Figur 5 viser celleproliferas jonen som målt ved<3>H-TdR innlemmelse av allogeneiske T celler som svar på forskjellige stimuleringsregimer. CLL cellene som inneholder en genterapivektor som uttrykker et aksessorisk molekyl ligand gen (det murine CD40 ligand gen) ble innført, og stimulerer allogeneiske T celler til å proliferere. Figur 6 Figur 6 viser produksjon av gamma interferon (IFNg) ved allogeneiske T celler stimulert med CLL celler som inneholder et aksessorisk molekyl ligand gen. Figur 7 Figur 7 viser behandlingen av en neoplasi i et dyr ved anvendelse av en genterapivektor inneholdende et gen for aksessorisk molekyl ligand ifølge oppfinnelsen. De åpne firkanter viser mus immunisert med neoplastiske celler som ikke uttrykker en aksessorisk molekyl ligand ifølge oppfinnelsen. Mus immunisert med neoplastiske celler som uttrykker en aksessorisk molekyl ligand i henhold til oppfinnelsen er vist som den horisontale linje på toppen av figuren og viser ingen dødelighet. Figur 8 Figur 8 viser produksjonsnivåene og stabiliteten av CD40 ligand og CD40 ligand transkripter i CLL (øvre kurve) og mononukleære celler fra normalt blod (nedre kurve). Figur 9 Figur 9 viser tidsforløpet av transgenekspresjon i CLL B celler infisert med aksessorisk molekyl liganden (CD40 ligand). MFIR (betyr gjennomsnittlig fluore-scensintensitetsforhold), sammenligner fluore-scensintensiteten av CD19<+>CLL celler merket med PE-merkede CD40 ligander versus de samme merket med et PE-merket isotype kontroll mAb i hvert tidspunkt, her representert ved de lukkede sirkler som er forbundet ved faste linjer i henhold til den skala som er tilveiebragt på ordinaten på venstre side. Figur 10 Figur 10 viser forandringer i overflateantigenfeno-typen av CLL B celler infisert med en genterapivektor som inneholder en aksessorisk molekyl ligand, CD40 ligand. De skyggelagte histogrammene representerer merking av ikke-inf iserte celler (tynne linjer) merket med ikke-spesifikt kontrollantistoff, de åpne histogrammer som er trukket med tykke linjer representerer ikke-infiserte CLL celler som er merket med FITC-konjugert spesifikk mAb, og de åpne histogrammer som er trukket med tykke linjer (merket CD154-CLL) representerer CLL celler som er infisert med genterapivektoren for aksessorisk molekyl ligand og merket med FITC-konjugert spesifikk mAb. Figur 11 Figur 11 viser nivåer av CD27 produsert i CLL celler infisert med en genterapivektor som inneholder en aksessorisk molekyl ligand. Figur 11A viser at CD40L-infiserte CLL (CD154-CLL) celler uttrykker reduserte nivåer av overflate CD27. Åpne histogrammer representerer henholdsvis merking av ikke-infiserte celler (tynne linjer) eller infiserte CLL (tykke linjer) med FITC-konjugertaCD27 mAb. Figur 11B viser produksjon av oppløselig form av CD27 ved CLL B celler. Figur 12 Figur 12 viser allogeneiske T celle responser indusert ved CLL celler infisert med en genterapivektor som inneholder en aksessorisk molekyl ligand (CD40 ligand, også betegnet CD154). Figur 12A indikerer konsentrasjon av IFNg i supernatantene etter stimulering av allogeneiske T celler med CLL celler som inneholder aksessorisk molekyl liganden. Figur 12B viser celleproliferasjon, som vurdert ved innlemmelse av<3>H-thymidin. Figurer 12C og 12D viser sekundære allogeneiske T celle responser indusert ved CLL inneholdende aksessorisk molekyl liganden. Figur 13 Figur 13 viser autolog T celle responser indusert ved CLL B celler inneholdende aksessorisk molekyl liganden, CD40 ligand eller CD154, og kontroller. Figur 13A viser innlemmelsene av<3>H-thymidin ved autologe T celler ko-dyrket med CLL cellene. Figur 13B viser nivåene av human IFNg dannet ved autologe T celler ko-kultivert med CLL cellene. I figur 13C er CTL aktiviteten av autologe T celler indusert ved CLL B celler inneholdende aksessorisk molekyl liganden, grafisk fremstilt. Figur 14 Figur 14 viser spesifisiteten av CTL for autologe CLL
B celler. IFNg konsentrasjon ble vurdert i supernatantene etter 48 timers dyrking (figur 14A) og cytolytisk aktivitet ble vurdert etter 3 timers dyrking (figur 14B). I figur 14C ble mAb tilsatt til de autologe levkemi målceller før CTL analysen. Figur 15 Figur 15 viser at intercellulær stimulering spiller en rolle i produksjonen av fenotypiske forandringer observert i CLL celler som uttrykker aksessorisk molekyl liganden. I figur 15A er effekten av kulturdensiteten på den induserte ekspresjon av CD54 og CD80 etter infeksjon med en genterapivektor som inneholder aksessorisk molekyl liganden (CD40 ligand, CD154) vist. Skyggelagte histogrammer representerer merking av levkemi B celler med et FITC-konjugert isotype kontroll mAb. Åpne histogrammer representerer CD154-CLL B celler, dyrket ved høy og lav densitet (indikert ved piler), og merket med et FITC-konjugert mAb som er spesifikk for CD54 eller CD80. Figur 15B viser inhibering av CD154-CLL celleaktivering ved anti-CD154 mAb. Figurene 15C og 15D angir ekspresjon av immunaksessoriske molekyler på "bystander" ikke-infiserte CLL B celler indusert ved CLL celler som uttrykker aksessorisk molekyl liganden. Skyggelagte histogrammer representerer merking med PE-konjugert isotype kontroll mAb. Figur 16 Figur 16 viser at vektoren som koder for en aksessorisk molekyl ligand øker immuniseringen mot (3-gal i mus. Figur 16A viser at mus som mottok intramuskulære injeksjoner av pCD40L vektoren produserte signifikant mer antistoffer mot [3-gal enn det mus gjorde som var injisert med enten den ikke-modifiserte pcDNA3 vektoren eller pCD40L. Figur 16B, ELISA analyser av seriefortynninger av serum samlet på dag 28, viste at mus som var ko-injisert med placZ og pCD40L hadde et åtte-ganger høyere gjennomsnittlig titer av anti-|3-gal antistoffer ved dag 28 enn mus som var behandlet med placZ + pcDNA3. Figur 17 Figur 17 viser analyse av IgGiog IgG2aimmunresponsene mot intramuskulære plasmid DNA immuniseringer med og uten en vektor, pCD40L, som koder for en aksessorisk molekyl ligand. IgG2aanti-p-gal antistoffet er dominerende i forhold til IgGiunderklasse antistoffer i serum fra mus som er injisert med enten placZ og pcDNA3 eller placZ og pCD40L. I motsetning til dette utviklet BALB/c mus som er injisert med (3-gal protein hovedsakelig IgGianti-p-gal antistoff, og ingen detekterbare IgG2aanti-p-gal antistoffer. Figur 18 Figur 18 viser sammenligningen mellom injeksjon av mus med en vektor, pCD40L, som koder for en aksessorisk molekyl ligand, på de samme og ulike steder som placZ. Adjuvansef f ekt av pCD40L krever ko-injeksjon med placZ i det samme sted. Figur 19 Figur 19 viser at ko-injeksjon inn i dermis av en vektor som koder for en aksessorisk molekyl ligand, pCD40L, med placz øker IgG anti-p-gal responsen i BALB/c mus. Figur 20 Figur 20 viser at en vektor som koder for en aksessorisk molekyl ligand, pCD40L, øker den evne som placz har til å indusere CTL som er spesifikk for syngeneiske p-gal-uttrykkende målceller. Splenocytt-effektor celler, som er tatt fra mus som har mottatt injeksjoner av placz og pCD40L, lyserte spesifikt signifikant flere celler enn splenocytter fra mus gjorde som mottok kontrollinj eksj oner. Figur 21 Figur 21 viser nedmodulering av human CD40L, men ikke murin CD40L, i lungetumorcellelinjer som uttrykker CD40. Figur 22 Figur 22 viser at CD40 binding induserer økt ekspresjon av tumorcelleoverflatemarkører CD95 (Fas), CD54 (ICAM-1), og MHC-I, i lungetumorcellelinjer. Figur 22B viser nedmodulering av human CD40L ved CD40-positive tumorceller. Figur 23 Figur 23 viser inhiberingen av Fas ligand ekspresjon
ved lymfocytter i nærvær av RA synovialfluid. Figur 24 Figur 24 viser en oversikt over et klinisk forsøk av en aksessorisk molekyl ligand (CD40L) genterapibehandling for B celle CLL. Figur 25 Figur 25 viser en sekvensoppstilling av human Fas ligand med human Fas ligand hvor Domene III er erstattet med Domene III fra murin Fas ligand. Den øverste proteinsekvensen er nativ human Fas ligand. Domene III er understreket med den prikkede linje. Den doble understreking indikerer et putativt MMP spaltingssted. Den nederste proteinsekvensen er den til kimær human-mus Fas ligand. Domene III av mus Fas liganden (understreket med prikket linje) erstatter Domene III av human Fas ligand. Tallene svarer til aminosyresekvenstallet idet man anvender 1 for starten av polypeptidsekvensen. Tallet til den første nukleotidbase for kodonet som koder for aminosyren er l+3x(n-l), hvor n er aminosyresekvenstallet. Figur 26 Figur 26 viser en sekvensoppstilling av human Fas ligand med human Fas ligand hvor Domene III er blitt erstattet med Domene III av human CD70. Den øverste proteinsekvens er nativ human Fas ligand, og den nederste sekvens er den til kimær Fas liganden, hvor Domene III av human CD70 erstatter Fas Domene III. Andre markeringer er anvendt på samme måte som i figur 25. Figur 27 Figur 27 viser en sekvensoppstilling av human Fas ligand med human Fas ligand hvor Domene I er blitt erstattet med Domene III av human CD70. Den øverste proteinsekvens er nativ human Fas ligand, og den nederste proteinsekvens er den til kimær Fas ligand, hvor Domene III er blitt erstattet med Domene I av human CD70. Andre markeringer er anvendt som i figur 25. Figur 28 Figur 28 viser aminosyrene rundt og ved kjente matriks metalloproteinase (MMP) spaltingseter, som er beskrevet i Smith, M.M. et al., Journal of Biol. Chem. 270:6440-6449 (95) og Nagase, H., og G.B Fields, Biopolymers (Peptide Science) 40:399-416 (96). Spaltingssetet er indikert med en pil.
I. Definisj oner
Et "aksessorisk molekyl ligand gen" er et gen som koder for hele eller en del av en aksessorisk molekyl ligand. Genet omfatter i det minste den nukleotidsekvens som kreves for å kode den funksjonelle delen av en aksessorisk molekyl ligand. Genet kan eventuelt omfatte slike genetiske elementer som promotere, enhancere og 3' ender. Aksessorisk molekyl ligand genet er avledet fra en ligand som er medlem av tumornekrosefaktor (TNF) familien, inkluderende CD40 ligand, Fas ligand, CD70, TNFa, TNFp, CD30 ligand, 4-1BB ligand (4-1BBL), nervevekstfaktor og TNF-relatert apoptoseinduserende ligand (TRAIL). Som anvendt heri inkluderer betegnelsen "aksessorisk molekyl ligand gen" kimære aksessorisk molekyl ligand gener som definert i det etterfølgende.
Som anvendt heri er betegnelsen "maligne celler eller neoplastiske celler" definert til å bety maligne celler eller
cancerceller som man finner i et menneske eller et dyr. Foretrukne typer av maligne eller neoplastiske celler inkluderer hvilken som helst maligne antigenpresenterende celle. I noen foretrukne utførelsesformer har disse maligne antigenpresenterende celler minst lave nivåer av CD40 tilstede på celleoverflaten.
Som anvendt heri er betegnelsen "neoplastiske humane celler" definert til å bety humane celler som er neoplastiske og som inkluderer, men som ikke er begrenset til, angigenpresenterende celler, hvilken som helst neoplastisk celle som kan fungere som en antigenpresenterende celle eller som kan fungere til å forenkle antigenpresentasjon, neoplastiske monocytter, neoplastiske makrofager, neoplastiske B celler, neoplastiske dendrittiske celler, neoplastiske Langerhans celler, neoplastiske interdigitasjonsceller, neoplastiske follikulære dendrittiske celler eller neoplastiske Kupffer celler og lignende. Definisjonen av neoplastiske humane celler inkluderer de celler som er assosiert med neoplastiske celler i tumorleiet til humane pasienter. Typisk er de neoplastiske humane celler enten levkemier, lymfomer, AML, ALL, AMML, CML, CMML, CLL, andre tumorer av antigenpresenterende celler eller neoplastiske celler fra bryst, ovarier eller lunger. Det skal også forstås at gener for aksessorisk molekyl ligand eller de kimære aksessorisk molekyl ligand gener i henhold til oppfinnelsen kan innføres i somatiske celler. Disse somatiske celler kan være dannet ved en genmanipuleringsprosess som, i disse celler, har innført gener som koder for molekyler som gjør disse celler i stand til å presentere antigen overfor immunsystemet.
Som anvendt heri er betegnelsen "kimært gen" definert til å bety et gen hvor en del av genet er avledet fra et andre forskjellig gen og kombinert med det første gen slik at minst en del av hvert gen er tilstede i det resulterende kimære gen. Et gen kan være kimært dersom en hvilken som helst del av sekvensen som koder for det resulterende protein er avledet fra et andre og forskjellig gen. Typiske kimære gener inkluderer gener hvor spesifikke funksjonelle domener fra ett gen er blitt overført til et annet gen og erstatter de analoge domener av dette andre gen. Det resulterende kimære gen kan f.eks. ha ett domene avledet av et murint gen og flere domener avledet fra et humant gen. Disse domener kan i størrelse strekke seg fra 5 aminosyrer til flere hundre aminosyrer. Andre eksempler på kimære aksessorisk molekyl ligand gener inkluderer gener som inneholder nukleotider som koder for aminosyrer som man ikke finner i noe naturlig forekommende gen for aksessorisk molekyl ligand. Eksempel på kimære gener og potensielle forskjellige kombinasjoner av domener er tallrike og en fagkyndig på området vil forstå at ingen begrensning settes på den mengden av et gen som må være tilstede i et annet gen for å gjøre det kimært.
Som anvendt heri er betegnelsen "murint CD40 ligand gen" definert til å bety et gen for aksessorisk molekyl ligand som er avledet fra et murint CD40 ligand gen. Eksempler på slike murine CD40 ligand gener inkluderer genet isolert av Armitage et al. , Nature, 357:80-82 (1992) og andre gener avledet fra murin opprinnelse som hybridiserer til genet beskrevet av Armitage et al. under hybridiseringsbetingelser med lav stringens.
Som anvendt heri er betegnelsen "vektor eller genetisk vektor" definert til å bety en nukleinsyre som er i stand til å replikere seg selv i en organisme slik som bakterie eller animalsk celle. Typiske genetiske vektorer inkluderer plasmider som vanligvis anvendes i rekombinant DNA teknologi og forskjellige viruser som er i stand til å replikere inne i bakterieceller eller animalske celler. Foretrukne typer av genetiske vektorer inkluderer plasmider, fager, viruser, retroviruser o.lign. Som anvendt heri er betegnelsen "genterapivektor" definert til å bety en genetisk vektor som er i stand til direkte å infisere celler i et dyr slik som et menneske. En rekke genterapivektorer er blitt beskrevet i litteraturen og inkluderer genterapivektoren beskrevet i Cantwell et al., Blood, In Press (1996) med tittel "Adenovirus Vector Infection of Chronic Lymphocytic Leukemia B Cells". Slike vektorer er blitt beskrevet f.eks. av Woll, J.P. og I.R. Hart, Ann. Oncol., 6 Suppl 1:73 (1995); Smith, K. T., A. J. Shepherd, J. E. Boyd og G. M. Lees, Gene Ther.,
3:190 (1996); Cooper, M. J., Semin. Oncol., 23:172 (1996); Shaughnessy, E. D., D. Lu, S. Chatterjee og K. K. Wong, Semin, Oncol., 23:159 (1996); Glorioso, J. C, N. A. DeLuca og D. J. Fink, Annu. Rev. Microbiol., 49:675 (1995); Flotte, T. R. og B. J. Carter, Gene Ther., 2:357 (1995); Randrianarison-Jewtoukoff, V. og M. Perricaudet, Biologicals., 23:145 (1995); Krohn, D. B., Curr. Opin. Pediatr., 7:56 (1995); Vile, R. G. og S. J. Russel, Br. Med. Bull., 51:12 (1995); Russel, S. J., Semin. Cancer Biol., 5:437 (1994); og Ali, M., N. R. Lemoine og C. J. Ring, Gene Ther., 1:367 (1994). II. Genetiske vektorer og strukturer som inneholder et gen for aksessorisk molekyl ligand
A. Gener for aksessorisk molekyl ligand
Foretrukne genterapivektorer som inneholder et aksessorisk molekyl ligand gen er beskrevet. Dette gen for aksessorisk
molekyl ligand kan være avledet fra en hvilken som helst kilde og kan inkludere molekyler som er laget av mennesker og som ikke er tilstede i naturen. Aksessorisk molekyl ligand gener som er avledet fra genene som koder for molekyler i tumornekrosefamilien (TNF) som inkluderer genene som koder for: murin CD40 ligand, human CD40 ligand, Fas ligand, TNFa, TNFp, CD30 ligand, 4-1BB ligand, nervevekstfaktor, CD70, TNF-relatert apoptoseinduserende ligand (TRAIL) og kimære aksessorisk molekyl ligander er beskrevet. Nukleotidsekvensen til en aksessorisk molekyl ligand, sekvensen av i det minste én form av det murine CD40 ligand genet, er blitt bestemt og angitt som SEQ ID NO: 1. Anvendelsen av et hvilket som helst aksessorisk molekyl ligand gen som er homologt med sekvensen tilstede i SEQ ID NO: 1, og
som således hybridiserer til denne sekvens ved hybridiseringsbetingelser ved lav stringens er kontemplert heri. En fagkyndig på området vil forstå at aksessorisk molekyl ligand gener, inkluderende murint CD40 ligand gen kan isoleres fra forskjellige ulike murine stammer.
Nukleotidsekvensen til et humant CD40 ligand gen er blitt bestemt og er vist i SEQ ID NO: 2. Anvendelsen av et hvilket som helst aksessorisk molekyl ligand gen som er homolog med SEQ ID NO: 2, og som således hybridiserer til denne sekvens ved lave stringensbetingelser er kontemplert heri. En fagkyndig på området vil forstå at genene for aksessorisk molekyl ligand, inkluderende de humane CD4 0 ligand gener, som er anvendbare i den foreliggende oppfinnelse, kan variere avhengig av det individ hvorfra genet er isolert og slike variasjoner kan vise seg å være nyttige for å fremstille unike gener for aksessorisk molekyl ligand. Anvendelsen av domenene, sub-domenene, aminosyrene eller nukleotidsekvensen av den humane CD40 ligand og/eller human CD40 ligand genet som del av en kimær aksessorisk molekyl ligand eller kimært aksessorisk molekyl ligand gen er kontemplert heri.
Nukleotidsekvensen til et bovint CD40 ligand gen er blitt bestemt og er vist som SEQ ID NO: 8. Anvendelsen av et hvilket som helst aksessorisk molekyl ligand gen som er homolog med SEQ ID NO: 8, og som således hybridiserer til sekvensen ved lavstringensbetingelser er kontemplert heri. En fagkyndig på området vil forstå at gener for aksessorisk molekyl ligand, inkluderende de bovine CD40 ligand gener, kan variere avhengig av det individuelle dyr hvorfra genet er isolert, og at slike variasjoner kan vise seg å være nyttige i fremstillingen av unike gener for aksessorisk molekyl ligand.
Nukleotidsekvensen til human TNFaog TNFp er blitt bestemt og er vist som SEQ ID NO: 9 og 10. Anvendelsen av et hvilket som helst aksessorisk molekyl ligand gen som er homologt med enten human TNFaeller TNFp (henholdsvis SEQ ID NO: 9 og 10) og som således hybridiserer til disse sekvenser ved lavstringensbetingelser er kontemplert heri. Gener for aksessorisk molekyl ligand som er anvendbare inkluderer de humane TNFaog TNFp gener, kan variere avhengig av det spesielle individ hvorfra genet er blitt isolert og disse variasjoner kan vise seg å være anvendbare for fremstilling av unike gener for aksessorisk molekyl.
Nukleotidsekvensen til porcine TNFaog TNFp er blitt bestemt og er vist som SEQ ID NO: 11. Anvendelsen av et hvilket som helst aksessorisk molekyl ligand gen som er homologt med hver SEQ ID NO: 11, og så således vil kunne hybridisere til disse sekvenser ved lavstringensbetingelser er kontemplert heri. En fagkyndig på området vil forstå at genene for aksessorisk molekyl ligand, inkluderende de porcine TNFaog TNFp genene, kan variere avhengig av det spesielle dyr hvorfra genet er isolert og at en slik variasjon kan vise seg anvendbar for fremstilling av unike aksessorisk molekyl gener.
Nukleotidsekvensen til et murint TNFagen er blitt bestemt og er vist som SEQ ID NO: 12. Anvendelsen av et hvilket som helst gen for aksessorisk molekyl ligand som er homologt med SEQ ID NO: 12, og som således hybridiserer til sekvensen ved lavstringensbetingelser er kontemplert heri. En fagkyndig på området vil forstå at genene for aksessorisk molekyl ligand, inkluderende det murine TNFagenet kan variere avhengig av det individ hvorfra genet er isolert, og at disse variasjoner kan vise seg nyttige for fremstilling av unike aksessorisk molekyl gener.
Nukleotidsekvensen til human Fas ligand og murin (C57BL/6) Fas ligand er blitt bestemt og er vist som henholdsvis SEQ ID NO: 13 og 14. Nukleotidsekvensen til murin Balb/c Fas ligand er vist som SEQ ID NO: 31. Anvendelsen av et hvilket som helst aksessorisk molekyl ligand gen som er homologt med hvilken som helst av SEQ ID NO: 13, 14 og 31, og som således hybridiserer til sekvensene ved lavstringensbetingelser er beskrevet. En fagkyndig på området vil forstå at genene for aksessorisk molekyl ligand som inkluderer de humane Fas ligand eller murine Fas ligand genene, kan variere avhengig av det spesielle individ eller dyr hvorfra genene er isolert, og at slike variasjoner kan vise seg nyttige for fremstilling av hvilke som helst aksessorisk molekyl gener.
Nukleotidsekvensen til et humant CD70 gen er blitt bestemt og er vist som SEQ ID NO: 15. Den murine CD70 gen sekvens er også blitt bestemt og er vist som SEQ ID NO: 36 og ble beskrevet av Tesselaar et al., J. Immunol. 159:4959-65 (1997). Anvendelsen av et hvilket som helst aksessorisk molekyl ligand gen som er homolog med SEQ ID NO: 15 eller 36, og som således hybridiserer til denne sekvens ved lavstringensbetingelser er beskrevet. En fagkyndig på området vil forstå at gener for aksessorisk molekyl ligand inkluderende det humane CD70 gen kan variere avhengig av det individ hvorfra genet er isolert, og at disse variasjoner kan vise seg nyttige for fremstilling av unike gen for aksessorisk molekyl ligand.
Nukleotidsekvensen til det humane CD30 ligand genet er blitt bestemt og er vist som SEQ ID NO: 16. Anvendelsen av et hvilket som helst aksessorisk molekyl ligand gen som er homolog med SEQ ID NO: 16, og som således hybridiserer til denne sekvens ved lavstringensbetingelser er beskrevet. En fagkyndig på området vil forstå at genene for aksessorisk molekyl ligand, inkluderende det humane CD30 ligand genet, kan variere avhengig av det individ hvorfra genet er isolert, og at slike variasjoner kan vise seg nyttige for fremstilling av unike gener for aksessorisk molekyl ligand.
Variasjoner og varianter av nukleotidsekvensene til genene for aksessorisk molekyl ligand som er tilveiebragt heri, og som er bevirket ved alternativ spleising av budbringer RNA er beskrevet. Denne alternative spleising av budbringer RNA innskyter ytterligere nukleotidsekvenser som kan kode for en eller flere eventuelle aminosyresekvenser som i sin tur tillater at aksessorisk molekyl liganden som er kodet for har ytterligere egenskaper eller funksjoner.
Nukleotidsekvensen til en human eller mus 4-1BBL er blitt bestemt og er vist som henholdvis SEQ ID NO: 17 og 18. Anvendelsen av et hvilket som helst aksessorisk molekyl ligand gen som er homolog med enten SEQ ID NO: 17 eller 18, og som således hybridiserer til disse sekvenser ved lavstringensbetingelser er beskrevet. En fagkyndig på området vil forstå at gener for aksessorisk molekyl ligand inkluderende det humane 4-1BBL genet kan variere avhengig av det individ hvorfra det er isolert, og at slike variasjoner kan vise seg nyttige for fremstilling av unike gener for aksessorisk molekyl ligand.
Kimære aksessoriske molekyler som inneholder en hvilken som helst domenedel eller sub-domene del, eller aminosyresekvenser som
er kodet for av de følgende gener: bovin TNF-a (SEQ ID NO: 21), murin CD40 ligand (SEQ ID NO: 22) , human nervevekstfaktor-(3 (SEQ ID NO: 23), murin nervevekstfaktor (SEQ ID NO: 24), rotte Fas ligand (SEQ ID NO: 25) human TNF-relatert apoptoseinduserende ligand (TRAIL) (SEQ ID NO: 41, Genbank deponeringsnummer U37518) , murin TNF-relatert apoptoseinduserende ligand (TRAIL) (SEQ ID NO: 42, Genbank deponeringsnummer U37522), murin CD30 ligand
(SEQ ID NO: 43), human 4-1BB1 (SEQ ID NO: 17) og murin 4-1BBL (SEQ ID NO: 44 og 18) er beskrevet. Kimære aksessoriske molekyler som benytter gener som koder for aminosyresekvenser som er homologe med disse sekvenser er også beskrevet.
Kimære gener for aksessorisk molkekyl ligand som er omfattet av et nukleotid segement avledet fra et aksessorisk molekyl ligand gen som er operativt koblet til en nukleotidsekvens avledet fra et annet aksessorisk molekyl ligand gen eller annet gen er beskrevet.
Kimære gener for aksessorisk molekyl ligand er f. eks . kontemplert og som omfattes av et segement av det murine CF4 0 ligand gen som er blitt operativt koblet til minst et annet ytterligere gensegment avledet fra et annet aksessorisk molekyl ligand gen. Størrelsen av dette spesielle segment avledet fra det forskjellige genet for aksessorisk molekyl ligand kan variere fra en nukleotidsekvens som koder for noen få aminosyrer, et sub-domene av aksessorisk molekyl liganden, et domene av aksessorisk molekyl liganden eller mer enn ett domene av en aksessorisk molekyl ligand. Andre kimære aksessoriske molekyler er omfattet av et aksessorisk molekyl ligand gen inn i hvilket nukleotider som koder for en aminosyresekvens som ikke finnes som en del av en naturlig forekommende aksessorisk molekyl ligand er blitt innført. Dette aminosyresegment kan være kunstig dannet eller avledet fra et protein som man finner i naturen. Det kimære gen for aksessorisk molekyl ligand koder for en kimær aminosyresekvens og således kan en kodet kimær aksessorisk molekyl ligand utvise unike egenskaper i tillegg til de egenskaper som man finner på individuelle segmenter som er avledet fra de forskjellige gener for aksessorisk molekyl ligand. Det kimære aksessorisk molekyl ligand genet kan kode for en aksessorisk molekyl ligand som har egenskaper avledet fra aksessorisk molekyl liganden som anvendes til å konstruere det kimære gen.
Hvert av genene for aksessorisk molekyl ligand som er et medlem av tumornekrosefaktor familien har en lignende sekundær struktur som består av en rekke domener. Denne domenestruktur inkluderer et første domene som kodes for av 5' regionen av aksessorisk molekyl ligand genet. Det andre domene (Domene II) er det domene som inneholder aminosyrene som strekker seg over cellemembranen og som således betegnes transmembrandomene. Det tredje domene (Domene III) er det proksimale ekstracellulære domene og disse aminosyrer er aminosyrene som finnes proksimalt til den cellulære membran. Det fjerne domene (Domene IV) kodes for av 3' enden av aksessorisk molekyl ligand genet og er blitt betegnet det distale ekstracellulære domene. Det distale ekstracellulære domene (Domene IV) utgjør generelt den oppløselige formen av tumornekrosefaktorfamiliemolekylet. Basert på røntgen-krystallstrukturen til human TNF, den forutsagte sekundære struktur av det aksessoriske molekyl, har CD40 ligand blitt utledet sammen med domenestrukturen til disse molekyler av M. Peitsch og C. Jongeneel, International Immunology, 5:233-238
(1993). De sekundære strukturer for de andre medlemmer av tumornekrosefaktorfamilien ble utledet ved anvendelse av
computeranalyse sammen med sammenligning med den humane TNF og CD40 ligand domenestrukturen. I tabell I, er domenegrensene til en rekke gener for aksessorisk molekyl ligand vist. Et diagram
av disse domener for en rekke av disse aksessorisk cellemolekyl ligander er vist i figur 1. Fastsettelsen av domenegrensene er omtrentlig, og en fagkyndig på området vil forstå at disse grensene kan variere og fremdeles tilveiebringe anvendbar identifikasjon av domener.
<*>Domenene i det foregående er idenfisert ved nukleotid-grensene til hvert domene ved anvendelse av det første nukleotid av det initiale metionin av cDNA som nukleotid nummer 1.
En fagkyndig på området vil forstå at typiske kimære gener for aksessorisk molekyl vil kunne inkludere gener som er dannet ved å bytte domener eller sub-domene segmenter mellom f.eks. et mus CD40 ligand gen eller et humant CD40 ligand gen. Kimært
aksessorisk molekyl gen kan f.eks. konstrueres ved operativ
kobling av Domene I av det humane CD4 0 ligand gen til Domener II-IV av det murine CD40 ligand genet. En fagkyndig på området vil forstå varieteten av de kimære gener for aksessorisk molekyl ligand som kan dannes ved anvendelse av de aksessoriske molekyler identifisert i tabell I. Kimære aksessoriske molekyler som ikke er vist i tabell I, er vist til å ha en lignende domenestruktur. Andre kimære gener er også beskrevet hvor mindre segmenter
(sub-domene segmenter) er byttet mellom f.eks. et murint CD40 ligand gen og et humant CD40 ligand gen eller et annet murint CD40 ligand gen. En fagkyndig på området vil forstå at gener som koder for aksessoriske molekyler vil i det minste ha gensegmenter som svarer til forskjellige funksjonelle segmenter
av en aksessorisk molekyl ligand slik som den murine CD40 ligand kodet for av det murine CD40 ligand genet (SEQ ID NO: 1). Det vil også være klart for en fagkyndig på området at nukleotid-grensene som er identifisert i tabell I kan variere i betydelig grad fra dem som er identifisert for det murine CD40 ligand genet (SEQ ID NO: 1) og fremdeles definere domener som er anvendbare i den foreliggende oppfinnelse.
Det kimære aksessorisk molekyl ligand genet som omfatter nukleotidene som koder for ekstracellulære domener (Domene III og IV) av human CD40 ligand er foretrukket operativt koblet til nukleotidene som koder for transmembran (Domene II) og nukleotidene som koder for cytoplasmatisk domene (Domene I) av det murine CD40 ligand genet. Eksempler på slike foretrukne kimære aksessoriske molekyler er vist i figur 2. Et eksempel på en nukleotidsekvens for et slikt gen er SEQ ID NO: 7. I andre kimære aksessorisk molekyl ligand gener kan nukleotidene som koder for de ekstracellulære domener (Domener III og IV) av det murine CD40 ligand genet være operativt koblet til nukleotider som koder for transmembranen (Domene II) og cytoplasmatisk domene (Domene I) av det humane CD40 ligand genet. Et eksempel på en nukleotidsekvens for et slikt gen er SEQ ID NO: 3. I andre foretrukne kimære aksessorisk molekyl ligand gener er nukleotidene som koder for de ekstracellulære domener (Domener III og IV) og transmembrandomenet (Domene II) av human CD40 ligand koblet til nukleotidene som koder for det cytoplasmatiske domene (Domene I) av murint CD40 ligand gen. Et eksempel på en nukleotidsekvens for et slikt gen er SEQ ID NO: 6. Andre kimære aksessorisk molekyl gener omfatter nukleotidene som koder for de ekstracellulære domener (Domene III og IV) og transmembrandomenet (Domene I) av det murine CD4 0 ligand gen operativt koblet til nukleotidene som koder for det cytoplasmatiske domene av det humane CD40 ligand genet. Et eksempel på en nukleotidsekvens for et slikt gen er SEQ ID NO: 5. I andre kimære aksessorisk molekyl ligand gener er de ekstracellulære domener (Domene III og IV) av human CD40 ligand genet operativt koblet til transmembrandomenet (Domene I) av det murine CD40 ligand genet som er operativt koblet til det cytoplasmatiske domenet (Domene I) av det humane CD40 ligand genet. Et eksempel på en nukleotidsekvens for et slik gen er SEQ ID NO: 4.
En fagkyndig på området vil forstå at en rekke flere kombinasjoner som anvender domener eller andre valgte segmenter av hvilke som helst av genene for aksessorisk molekyl ligand inkluderende de humane CD40 ligand gener og mus CD40 ligand genene er mulig. Slik ytterligere kimære aksessorisk molekyl gener vil kunne inkludere følgende gener: kimære aksessorisk molekyl gener hvori nukleotidene som koder for Domene I er valgt fra et spesielt aksessorisk molekyl ligand gen og operativt koblet, enten direkte eller ved hjelp av en ytterligere nukleotidsekvens, til nukleotidene som koder for Domene II fra et spesielt aksessorisk molekyl ligand gen. Disse domener vil deretter kobles operativt enten direkte eller ved hjelp av en ytterligere nukleotidsekvens til nukleotidene som koder for Domene III fra et spesielt aksessorisk molekyl ligand gen. Dette molekyl vil deretter være operativt koblet enten direkte eller ved en ytterligere nukleotidsekvens til nukleotidene som koder for Domene IV av et spesielt aksessorisk molekyl ligand gen. Det kimære gen for aksessorisk molekyl ligand som er konstruert på denne måte kan ha ytterligere nukleotider på begge ender eller mellom domener som er anvendbare for å tilveiebringe forskjellige aminosyrer i disse posisjoner. En fagkyndig på området vil forstå at disse spesielle kombinasjoner kun er illustrasjoner og at en rekke andre kombinasjoner vil kunne kontempleres hvor gensegmentene som omfatter nukleotider som koder for mindre enn hele domenet til et aksessorisk molekyl er byttet mellom ulike aksessoriske molekyler.
Kimære aksessorisk molekyl ligand gener som er omfattet av gensegmenter for mus eller human CD40 ligand i kombinasjon med gensegmenter avledet fra Fas ligand, TNFa, TNFp, CD70, CD30L, 4-1BBL, nervevekstfaktor eller TNF-relatert apoptoseinduserende ligand (TRAIL) er beskrevet. Særlig anvendbare kimære aksessorisk molekyl ligand gener omfatter minst ett gensegment som er avledet fra et murint CD40 ligand gen sammen med gensegmenter eller et gensegment avledet fra et annet aksessorisk molekyl ligand gen.
Kimære aksessorisk molekyl ligand gener hvor de aksessoriske molekyler som dannes er blitt modifisert for å fjerne aminosyrer i det kimære aksessoriske molekyl kan anvendes ved post-translasjonsmekanismer til å regulere nivået av ekspresjon av det aksessoriske molekyl eller det aksessoriske molekylprotein på en spesiell celle. De steder som fjernes fra de kimære aksessoriske molekyler eller det kimære molekyl kan inkludere aminosyrer eller steder som utgjør proteasespaltingsseter inkluderende metallotioninproteaser, serinproteaser og andre proteaser som gjenkjenner en aminosyresekvens enten spesifikt eller ikke-spesifikt. Særlig foretrukket er aminosyrer i Domene III som utgjør et eller flere potensielle aktuelle gjenkjennelsesseter anvendt ved post-translasjonsregulerende mekanismer
blitt modifisert eller fjernet.
Kimære aksessorisk molekyl ligand gener hvor domenene, sub-domenefragmenter eller andre aminosyrerester er blitt tatt fra ett aksessorisk molekyl ligand gen og innført i et annet aksessorisk molekyl ligand gen fra de samme arter er beskrevet. Det humane Domene I, og det humane Domene II fra CD40 ligand molekylet kan f.eks. være operativt koblet til nukleotidene som koder for det humane Domene III fra f.eks. CD70 molekylet som i sin tur kobles operativt til humant Domene IV for CD40 ligand molekylet. Dette kimære aksessorisk molekyl inneholder derfor humane CD40L Domener I, II og IV og humant CD70 Domene III. Et eksempel på en nukleotidsekvens for et slikt gen er SEQ ID NO: 19. En fagkyndig på området vil forstå at en rekke slike kombinasjoner med anvendelse av domener fra de samme arter fra ulike aksessorisk molekyl ligand gener kan danne en rekke kimære aksessorisk molekyl gener som alle har spesifikke aktiviteter og egenskaper.
Kimære aksessorisk molekyl ligand gener hvor Domene III av et spesielt aksessorisk molekyl ligand gen er blitt erstattet med et Domene III fra et annet aksessorisk molekyl ligand gen er beskrevet. Særlig foretrukket har mus Domene III blitt anvendt til å erstatte det humane Domene III i CD40 ligand molekylet. Dette kimære aksessorisk molekyl inneholder derfor det humane CD40L Domene I, det humane CD40L Domene II, mus CD40L Domene III og det humane CD40L Domene IV. Et eksempel på nukleotidsekvens for et slikt gen er SEQ ID NO: 20.
Anvendelsen av kimære aksessoriske molekyler som inneholder
aminosyresekvenser dannet av mennesker som er innskutt i eller er i stedet for en del av et domene eller annen aminosyresekvens til et aksessorisk molekyl gen er beskrevet. Disse aminosyresegmenter dannet av mennesker kan frembringes ved å velge en hvilken som helst aminosyresekvens som kan anvendes til å gi
det aksessoriske molekyl en spesiell funksjon eller for å fjerne annen uønsket funksjon. Disse aminosyresegmenter som er dannet av mennesker er fremstilt ved å innføre, i det aksessorisk molekyl ligand genet eller i det kimære aksessorisk molekyl ligand genet,
de nukleotidsekvensene som kreves for å kode for de spesielle aminosyresekvenser dannet av mennesker i de ønskede posisjoner. Videre kan de kimære aksessorisk molekyl ligand gener inneholde nukleotidsegmenter som omfatter sub-domene segmenter av andre molekyler eller mindre segmenter hvor aminosyrene er blitt
forandret for et ønsket formål. Anvendelse av sub-domene nukleotidsegmenter tillater innføringen av korte aminosyresekvenser avledet fra andre molekyler inn i kimære aksessoriske molekyler. Innlemmelsen av slike korte sub-domene segmenter eller aminosyreforandringer i aksessorisk molekyl liganden tillater innføringen av ønskede eller fjerning av uønskede trekk i dette molekyl.
Identifiksjonen av domenestrukturer i aksessorisk cellemole-kyler er vel kjent innen teknikkens stand og krever generelt identifikasjonen av cysteinrester i de aksessoriske molekyler og den påfølgende kartlegging av disulfidbindinger mellom de forskjellige cysteinrester. Kartleggingen av forskjellige sub-domenesegementer i et aksessorisk molekyl er vel kjent innen teknikken og involverer analyse av aminosyresekvensen til de aksessoriske molekyler og involverer generelt et sammenligning av krystallstrukturen for vevsnekrosefaktor ved anvendelsen av prediktive algoritmer for derved å produsere en forutsagt struktur av et kimært aksessorisk molekyl eller et aksessorisk molekyl. Denne forutsagte struktur for disse molekyler kan deretter anvendes til å selektere forskjellige sub-domenedeler av molekylet for å anvendes for å konstruere ytterligere kimære aksessoriske molekyler. Eksempler på slike kartleggingsstudier omfatter studiene til M. Pitsch og CV. Jongeneel, International Immunology, 5:233-238 (1993) og analysen er vist i figur 1.
Aksessorisk molekyl ligand gener og kimære aksessorisk molekyl ligand gener som er forkortet og som koder for mindre enn den fulle lengde av aminosyresekvensen funnet i den native aksessorisk molekyl liganden er beskrevet. Disse forkortinger kan endre egenskapene til aksessorisk molekyl ligand genet, men noe identifisert aktivitet opprettholdes. Slike forkortinger kan gjennomføres for å fjerne et gensegment eller gensegmenter av det aksessorisk molekyl genet og vil typisk utføres ved å fjerne nukleotider som koder for domener som ikke er direkte involvert i bindingen av aksessorisk molekyl liganden med dens aksessoriske molekyl. Disse forkortede gener for aksessorisk molekyl ligand eller kimære forkortede gener for aksessorisk molekyl ligand kan inneholde ytterligere gensegmenter som koder for aminosyresegmenter eller domener som erstatter domenene fjernet fra dette forkortede gen for aksessorisk molekyl. Slik erstatning av delene av det aksessoriske molekyl som er fjernet ved forkorting er ikke nødvendig.
De kimære aksessorisk molekyl genene kan konstrueres ved anvendelse av standard genmanipuleringsmetoder for operativ kobling av en spesiell nukleotidsekvens fra et aksessorisk molekyl ligand gen til en forskjellig nukleotid sekvens avledet fra det samme eller et annet aksessorisk molekyl ligand gen.
I tillegg kan standard genetikkmetoder anvendes til å innføre menneske-dannede nukleotidsekvenser eller sub-domene nukleotidsekvenser i det kimære gen for aksessorisk molekyl ligand. En fagkyndig på området vil forstå at forskjellige metoder kan anvendes for å danne slike kimære gener for aksessorisk molekyl. En genomdannelsesmetode kjent som "SOEN" kan f.eks. anvendes for å fremstille et kimært aksessorisk molekyl gen som inneholder nukleotidsegmenter avledet fra forskjellige kimære aksessoriske molekyler. Metodene for å anvende denne genomdannelsesmetoden er vel kjent innen teknikken og blitt f.eks. beskrevet i Horton, R. M., Mol. Biotechnol., 3:93 (1995); Ali, S. A. og A. Steinkasserer, Biotechniques, 18:746 (1995); Vilardaga, J. P., E. Di Paolo og A. Bollen, Biotechniques, 18:604 (1995); Majumder, K., F. A. Fattah, A. Selvapandiyan, og R. K. Bhatnagar, PCR. Methods Appl., 4:212 (1995); Boles, E. og T. Miosga, Curr. Genet. 28:197 (1995); Vallejo, A. N., R. J. Pogulis og L. R. Pease, PCR. Methods Appl., 4:S123 (1994); Henkel, T. og P. A. Baeuerle, Anal, Biochem., 214:351 (1993); Tessier, D. C. og D. Y. Thomas, Biotechniques, 15:351 (1993); Morrison, H. G. og R. C. Desrosiers, Biotechniques, 14:454 (1993); Cadwell, R. C. og G. F. Hoyce, PCR. Methods Appl., 2:28 (1992) og Stappert, J., J. Wirsching og R. Kemler, Nucleic Acids Res., 20:624 (1992).
Alternativt vil en fagkyndig på området forstå at seterettet mutagenese kan anvendes for å introdusere forandringer i en
spesiell nukleotidsekvens for direkte å produsere eller for å anvendes indirekte for å produsere et kimært aksessorisk molekyl gen. Det mutagene kit som er tilveiebragt av BioRad Laboratories kan f.eks. anvendes sammen med metoder og prosedyrer som er
beskrevet i kittet for å danne de ønskede forandringer i nukleotidsekvensen. Disse metoder ble opprinnelig beskrevet av Kunkel, Proe. Nati. Acad, Sei, USA 82:488-492 (1985) og Kunkel et al., Meth. Enzol. Mol. 154:367-382 (1987). Ved anvendelse
av de seterettede mutagenese-prosedyrer som er beskrevet heri og som er kjent innen teknikken, kan en fagkyndig forsker indusere individuelle nukleotidforandringer som resulterer i en endret aminosyresekvens eller som preserverer en aminosyresekvens, men introduserer en ønsket restriksjonsenzym-gjenkjennelsesfre-kvens i genet. Dette nye restriksjonsendonukleoase-gjenkjennel-sessted kan deretter anvendes for å kutte genet i dette spesielle punkt og anvende det til et gen eller segment av annet aksessorisk molekyl ligand gen. I tillegg til disse metoder vil en fagkyndig på området forstå at et helt kimært gen for aksessorisk molekyl ligand kan syntetiseres ved anvendelse av syntesemetoder som
er kjent innen teknikken. Denne metodologi krever kun at den fagkyndige danner nukleotidsekvens av et kimært aksessorisk molekyl ligand gen og gir denne sekvens til et selskap som er i stand til å syntetisere slikt gen.
B. Genetiske Strukturer
Anvendelsen av aksessorisk molekyl ligand gener eller kimære aksessorisk molekyl ligand gener som er tilstede i forskjellige typer av genetiske vektorer er beskrevet. En genetisk vektor refererer til et DNA molekyl i stand til autonom replikasjon i en celle inn i hvilken et annet DNA segment kan innføres til å bevirke de ytterligere DNA segmenter til å replisere. Vektorer som er i stand til å uttrykke gener inneholdt i denne vektor omtales som "ekspresjonsvektorer". Således er de genetiske vektorer og ekspresjonsvektorer i samsvar med oppfinnelsen rekombinante DNA molekyler som omfatter i det minste to nukleotidsekvenser som ikke normalt finnes sammen i naturen. De genetiske vektorer som kan anvendes inneholder et aksessorisk molekyl ligand gen som koder for en aksessorisk molekyl ligand som eventuelt er operativt koblet til en passende transkripsjons-eller translasjons-regulerende nukleotidsekvens, slik som en avledet fra et pattedyr-, mikrobielt, virus-, eller insektsgen. Slike regulerende sekvenser inkluderer sekvenser som har en regulerende rolle i genekspresjon, slik som en transkripsjons-promotor eller enhancer, en operatorsekvens for å regulere transkripsjonen, en sekvens som koder for et ribosom-bindingssete i budbringer RNA og passende sekvenser som regulerer transkripsjon, translasjonsinitiering eller transkripsjons-terminering.
Særlig anvendbare regulerende sekvenser omfatter promoter-regionene fra forskjellige pattedyr-, virus-, mikrobielle og insektsgener. Promoterregionen styrer en initiering av transkripsjon av genet og bevirker transkripsjon av DNA gjennom og inkluderende genet for aksessorisk molekyl ligand. Anvendbare promoterregioner inkluderer promoteren funnet i Rous Sarcoma Virus (RSV) - long terminal repeat (LTR), human cytomegalovirus (HCMV) enhancer/promoter region lac promotere, promotere isolert fra adenovirus, og hvilken som helst annen promoter som er kjent av fagkyndige på området som vil kunne forstås til å være anvendbare for genekspresjon i eukaryoter, prokaryoter, viruser eller mikrobielle celler. Andre promoterer som er særlig anvendbare for å uttrykke gener og proteiner i eukaryotiske celler inkluderer pattedyrcellepromotersekvenser og enhancer sekvenser slik som dem avledet fra polyomavirus, adenovirus, simian virus 40 (SV40) og det humane cytomegalovirus. Særlig anvendbar er de virale tidlige og sene promotere som typisk finnes nær det virale replikasjons-origo i viruser som SV40. Eksempler på forskjellige promotere som er blitt anvendt i ekspresjonsvektorer er blitt beskrevet av Okiama og Berg (Mol. Cell. Biol. 3:280, 1983), pMLSVN SV40 beskrevet av Kossman et al., Nature 213:768 (1984) . En fagkyndig på området vil forstå at seleksjonen av en spesiell anvendbar promoter avhenger av de nøyaktige cellelinjer og andre forskjellige parametere til den genetiske struktur som skal anvendes for å uttrykke genet for aksessorisk molekyl ligand eller det kimære gen for aksessorisk molekyl ligand innen en spesiell cellelinje. I tillegg vil en fagkyndig på området velge en promoter som er kjent til å uttrykke gener i målcellen i et tilstrekkelig høyt nivå til å kunne være anvendbar i den foreliggende oppfinnelse.
De genetiske vektorene og ekspresjonsvektorene inneholder eventuelt forskjellige ytterligere reguleringssekvenser som inkluderer ribosombindingsseter som tillater effektiv trans-lasjon av budbringer RNA dannet fra en ekspresjonsvektor i proteiner, DNA sekvensen som koder for forskjellige signal-peptider som kan være operativt koblet til genet for aksessorisk molekyl ligand eller det kimære aksessorisk molekyl ligand genet. Signalpeptidet, om tilstede, er uttrykt som en forløper av aminosyre som muliggjør forbedret ekstracellulær sekresjon av translasjons-fusjons polypeptid.
De genetiske strukturer inkluderer derfor forskjellige former av gener for aksessorisk molekyl ligand som beskrevet over som er operativt koblet til enten en promotersekvens eller en promoter- og enhancersekvens og også operativt koblet til en polyadenyleringsekvens som styrer termineringen og poly-adenyleringen av budbringer RNA. De genetiske strukturer vil inneholde andre genetiske sekvenser som tillater den effektive replikasjon og ekspresjon av denne struktur i de ønskede celler. Slik sekvens kan omfatte introner som er avledet fra native gener for aksessorisk molekyl ligand eller f.eks. fra et virusgen.
Genterapivektorer kan direkte infisere pattedyrceller for å innføre det ønskede gen for aksessorisk molekyl ligand eller
kimært gen for aksessorisk molekyl ligand i denne celle. Disse genterapivektorer er anvendbare for direkte infeksjon av celler som er blitt isolert fra et dyr eller pasient, eller kan innføres direkte i et dyr eller pasient og derved direkte infisere den ønskede celle i dette dyr eller denne pasient.
En rekke typer av genterapivektorer som vellykket kan overføre gener og føre til ekspresjon av de ønskede fremmede DNA sekvenser er blitt utviklet og beskrevet i litteraturen. Artikkelen med tittelen "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" i Current Comm. Mol. Biol., Cold Springs Harbor Laboratory, New York (1987) kan f.eks. nevnes. Videre kan naken DNA innføres fysisk i eukaryotiske celler inkluderende humane celler ved transfeksjon ved anvendelse av en rekke teknikker som omfatter kalsium-fosfattransfeksjon (Berman et al., Proe. Nati. Acad. Schi. USA 81:7176 (1984)), DEAE-dextran transfeksjon, protoplastfusjon (Deans&al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 81:1292 (1984)), elektroporering, liposom fusjon, polybren transfeksjon og direkte genoverføring ved laser mikropunktur av cellemembranet. I tillegg vil en fagkyndig på området forstå at hvilken som helst teknikk som vellykket kan innføre DNA i en celle på en slik måte at det kan integrere i genomet til en celle og tillate ekspresjon av det ønskede gen, vil kunne anvendes i den foreliggende
oppfinnelse.
Spesifikt er genterapivektorer som anvender rekombinante infeksiøse viruspartikler for genavlevering blitt beskrevet i utstrakt grad. F.eks. Brody, S. L. og R. R. Crystal, Ann. N. Y. Acad. Sei., 716:90 (1994); Srivastava, A., Blood, Cells, 20:531 (1994); Jolly, D., Cancer Gene Ther., 1:51 (1994); Russel, S. J., Eur. J. Cancer, 30A:1165 (1994); Yee, J. K., T. Friedmann og J. C. Burns, Methods Cell Biol., 43 Pt A:99 (1994); Boris-Lawrie, K. A. og H. M. Temin, Curr. Opin. Genet, Dev., 3:102 (1993); Tolstoshev, P., Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 33:573 (1993); og Carter, B. J., Curr. Opin. Biotechnol., 3:533
(1992). Genterapivektorer kan anvendes for å gjennomføre den ønskede metodologi ved å innføre en gen som koder for et aksessorisk molekyl ligand gen eller et kimært aksessorisk molekyl ligand gen i cellen. En rekke virale vektorer er blitt definert og anvendt som genterapivektorer og inkluderer virusvektorer avledet fra simian virus 40 (SV40), adenoviruser, adenoassosierte viruser og retroviruser. En fagkyndig på området vil forstå at anvendbare genterapivektorer er vektorer som er i stand til direkte å innføre, i målcellene, det DNA som koder for aksessorisk molekyl liganden og som tillater at DNA forblir i cellen for å uttrykke liganden på ønsket måte i cellen.
Genterapivektorene er anvendbare for å innføre aksessorisk molekyl ligand gener i en rekke pattedyrceller inkluderende menneskeceller. De spesielle celler som infiseres med genterapivektoren vil avhenge av vektorens forskjellige sær-egenheter og slike vektorer kan anvendes til å innføre genene for aksessorisk molekyl ligand i henhold til oppfinnelsen i hematopoietiske eller lymfoide stamceller, antigenpresenterende celler, embryoniske stamceller og andre celler som er i stand til å presentere antigen i immunsystemet inkluderende celler som har CD40 på deres overflate. Videre er slike genterapivektorer i stand til å innføre et gen som koder for et aksessorisk molekyl ligand gen i en human neoplastisk celle som lymfom, levkemi, AML, CLL, CML, AMML, CMML, brystcancer, lungecancer, ovariecancer eller en hvilken som helst tumor som er i stand til å virke som antigenpresenterende celler eller celler som kan stimulere tilskuer-antigenpresenterende celle. Videre kan genterapivektorene tilveiebragt heri anvendes til å innføre aksessorisk molekyl ligand genene i henhold til oppfinnelsen i celler som er blitt manipulert slik at disse celler kan presentere antigen for immunsystemet.
III. Celler som inneholder genetiske strukturer som koder for en aksessorisk molekyl ligand eller kimær aksessorisk
molekyl ligand
Forskjellige celler kan inneholde de genetiske strukturer. Disse celler inneholder strukturene som koder for aksessorisk molekyl ligand genet og inneholder således de forskjellige genetiske elementer beskrevet i del II.B. i det foregående. Disse celler kan være mikrobielle celler, eukaryotiske celler, insektceller og forskjellige pattedyrceller inkluderende menneskeceller. I foretrukne utførelsesformer av den foreliggende oppfinnelse, omfatter disse celler forskjellige neoplastiske celler inkluderende humane neoplastiske celler. Disse neoplastiske celler kan være av en hvilken som helst celletype og inkludere celler fra immunsystemet og andre blodceller. Særlig foretrukket er hvilke som helst neoplastiske celler som kan fungere som antigenpresenterende celler i immunsystemet eller som kan stimulere bystander-antigenpresenterende celler ved ekspresjon av et transgent aksessorisk celle-molekyl ifølge oppfinnelsen. Disse neoplastiske celler som er i stand til å virke til å presentere antigen for immunsystemet har typisk eller har typisk hatt et aksessorisk molekyl, slik som CD40 molekylet, på celleoverflaten. Disse celler er generelt naturlig i stand til å presentere antigen for immunsystemet, men den foreliggende oppfinnelse omfatter også innføringen av aksessorisk molekyl ligand gener i en celle som ikke naturlig er i stand til å presentere antigen for immunsystemet, men som er blitt genmanipulert slik at cellen kan presentere antigen for immunsystemet. Disse celler inkluderer typisk forskjellige kjente celletyper slik som monocytter, makrofager, B celler, Langerhans celler, interdigitasjonsceller, follikulære dendrittiske celler eller Kupffer celler og lignende som er blitt neoplastiske celler. I tillegg omfatter den foreliggende oppfinnelse også celler fra forskjellige karsinomer, fra brystcancer, ovariecancer og lungecancer som inneholder de genetiske strukturer beskrevet heri. Foretrukket blir et aksessorisk molekyl ligand gen anbragt i celler som kan injiseres i et behandlingssted slik som et tumorleie eller ledd. Genet for aksessorisk molekyl ligand i henhold til oppfinnelsen kan f.eks. innføres i en fibroblastcelle og den aksessorisk molekyl liganden uttrykkes på overflaten av cellen. Fibroblastene injiseres deretter i behandlingsstedet og fører til ønsket immuneffekt som skyldes tilstedeværelsen av aksessorisk molekyl ligand på overflaten av disse celler. Disse celler stimulerer andre immunceller tilstede i behandlingsstedet (bystander celler). Denne prosess kan resultere i den ønskede effekt på immunsystemet.
IV. Metoder for å anvende genetiske vektorer og strukturer
inneholdende et aksessorisk molekyl ligand gen Immunreaktiviteten til humane celler kan endres ved anvendelse av en metode som inkluderer innføring av et gen som koder for et aksessorisk molekyl ligand gen i menneskecellene slik at
aksessorisk molekyl liganden som kodes for av dette gen uttrykkes på overflaten av disse celler. Dette kan anvendes for hvilke som helst menneskeceller som deltar i en immunreaksjon enten
som et mål for immunsystemet eller som del av immunsystemet som responderer på det fremmede mål. En rekke metoder er kontemplert hvor sluttresultatet er at genet for aksessorisk molekyl ligand innføres i de ønskede celler. Disse metoder omfatter ex vivo
metoder, in vivo metoder og forskjellige andre metoder som involverer injeksjon av DNA, genetiske vektorer eller genterapivektorer inn i dyr eller mennesker inkluderende injeksjon direkte inn i tumorleiet tilstede i et hvilket som helst dyr eller menneske.
Ex vivo metoder er kontemplert hvor cellene, inn i hvilke genet for aksessorisk molekyl ligand skal innføres, isoleres fra dyret eller pasienten, og hvor genet deretter innføres i disse isolerte celler ved anvendelse av passende metoder. Eksempler på anvendbare ex vivo metoder er f.eks. blitt beskrevet av Raper, S. E., M. Grossman, D. J. Rader, J. G. Thoene, B. J. Clark, D.
M. Kolansky, D. W. Muller og J. M. Wilson, Ann. Surg. 223:116
(1996) ; Lu, L., R. N. Shen og H. E. Broxmeyer, Crit, Rev. Oncol. Hematol., 22:61 (1996); Koc, 0. N., J. A. Allay, K. Lee, B. M. Davis, J. S. Reese og S. L. Gerson, Semin Oncol., 23:46 (1996); Fisher, L. J. og J. Ray, Curr. Opin. Neurobiol., 4:735 (1994); og Goldspiel, B. R., L. Green og K. A. Calis, Clin. Pharm., 12:488
(1993) . D. Dilloo et al., i Blood 90:1927-1933 (1997), beskriver en metode med anvendelse av CD40L-aktiverte celler for behandling av B-akutt lymfoblastlevkemi (ALL). De ko-dyrket levkemiceller med fibroblaster infisert med en retroviral vektor som koder for CD40L, og deretter injiseres celleblandingen i mus. En slik prosedyre, dersom benyttet i mennesker, ville avvike fra den som er kontemplert heri ved at de terapeutiske celler stimuleres in vitro ved en annen cellelinje som uttrykker aksessorisk molekyl liganden. Schultze, J.L. et al,, i Blood 89:3806-3816
(1997) beskriver en metode for å stimulere T-TILer (tumor-infUtrerende T celler) cytotoksisk for follikulære lymfom (FL) celler ved å eksponere dem, in vitro, for FL B celler som på forhånd var dyrket med CD4OL-uttrykkende fibroblaster. De foreslår en adoptiv immunterapi hvor T-TILer stimulert på denne måte overføres til pasienter. Denne metode krever også in vitro stimulering av cellene som skal overføres, med en annen cellelinje som uttrykker et aksessorisk molekyl.
Etter introduksjon av genet som inkluderer hvilke som helst
eventuelle trinn for å sikre at aksessorisk molekyl ligand genet er innført vellykket i de isolert celler, innføres de isolerte celler i pasienten, enten i et spesifikt sted eller direkte inn i pasientens sirkulasjon. Foretrukket blir celleovereflate-markører, inkluderende molekyler som tumormarkører eller antigener for å identifisere cellen, anvendt for spesifikt å isolere disses molekylene fra pasienten. En fagkyndig på området vil forstå at slike isoleringsmetoder er vel kjente og inkluderer slike metodologier som fluorescensaktivert cellesortering (FACS), immunseleksjon involverende en rekke formater inkluderende vasking, kolonner eller lignende metoder.
Aksessorisk molekyl ligand genet kan innføres i de ønskede celler i kroppen til et dyr eller til et menneske uten først å fjerne disse celler fra pasienten. Metoder for å innføre gener i spesifikke celler in vivo eller i pasientens kropp er vel kjent og inkluderer anvendelse av genterapivektorer og direkte injeksjon av forskjellige genetiske strukturer inn i dyret eller pasienten. Eksempler på anvendbare metoder er blitt beskrevet av Danko, I. og J. A. Wolff, Vaccine, 12:1499 (1994); Raz, E., A. Watanabe, S. M. Baird, R. A. Eisenberg, T. B. Parr, M. Lotz, T. J. Kipps og D. A. Carson, Proe. Nati. Acad. Schi. U.S.A.,
90:4523 (1993); Davis, H. L., R. G. Whalen og B. A. Demeneix, Hum. Gene Ther., 4:151 (1993); Sugaya, S., K. Fujita, A. Kikuchi, H. Ueda, K. Takakuwa, S. Kodama og K. Tanaka, Hum. Gene Ther., 7:223 (1996); Prentice, H., R. A. Kloner, Y. Li, L. Newman og L. Kedes, J. Mol. Cell Cardiol., 28:133 (1996); Soubrane, C, R. Mouawad, 0. Rixe, V. Calvez, A. Ghoumari, 0. Verola, M. Weil og D. Hkayat, Eur. J. Cancer, 32A:691 (1996); Kass-Eisler, A., K. Li og L. A. Leinwand, Ann. N. Y. Acad. Sei., 772:232 (1995); DeMatteo, R. P., S. E. Raper, M. Ahn, K. J. Fisher, C. Burke, A. Radu, G. Widera, B. R. Claytor, C. F. Barker og J. F. Markmann,
Ann. Surg., 222:229 (1995); Addison, C. L., T. Braciak, R.
Ralston, W. J. Muller, J. Gauldie og F. L. Graham, Proe. Nati. Acad, Sei. U.S.A., 92:8522 (1995); Hengge, U. R., P. S. Walker og J. C. Vogel, J. Clin. Invest., 97:2911 (1996); Felgner, P. L., Y. J. Tsai, L. Sikhu, C. J. Wheeler, M. Manthorpe, J. Marshall og S. H. Cheng, Ann. N. Y. Acad, Sei., 772:126 (1995); og Furth, P. A., A. Shamay og L. Henninghausen, Hybridoma, 14:149 (1995). I en typisk anvendelse blir en genterapivektor som inneholder et gen for aksessorisk molekyl ligand innført i sirkulasjonen eller på et lokalisert sted hos pasienten for å tillate at genterapivektoren spesifikt infiserer de ønskede celler. I andre foretrukne utførelsesformer injiseres genterapivektoren direkte inn i tumorleiet tilstede i et dyr som inneholder i det minste noen av cellene inn i hvilke genet for aksessorisk molekyl ligand skal innføres.
DNA fra en genetisk struktur som har en promoter og et gen for aksessorisk molekyl ligand etterfulgt av en polyadenyleringssekvens, kan injiseres direkte inn i en pasient eller et dyr. Eksempler på slike anvendbare metoder er blitt beskrevet av Vile, R. G. og I. R. Hart, Ann. Oncol., 5 Suppl 4:59 (1994). Den genetiske struktur DNA injiseres direkte i muskelen eller andre steder på dyret eller pasienten eller direkte inn i tumorleiet til dyret eller pasienten. Alternativt blir et DNA fra en genetisk struktur som inneholder i det minste ett gen for aksessorisk
molekyl ligand anvendt og injisert direkte i dyret.
Foretrukket blir immunreaksjonen eller responsen hos en menneskepasient eller et dyr endret ved å innføre genet for aksessorisk molekyl ligand i celler, inkluderende humane celler som har et aksessorisk molekyl tilstede på celleoverflaten. Slike celler inkluderer humane celler, human antigenpresenterende celler og disse celler kan eventuelt være neoplastiske antigenpresenterende celler som har kapasitet til å uttrykke det aksessoriske molekyl på overflaten av cellen eller cellene som er i stand til stimulering. Mengden aksessorisk molekyl tilstede på overflaten av cellene inn i hvilke genet for aksessorisk molekyl ligand skal innføres kan være svært liten og slike små mengder av aksessorisk molekyl kan resultere fra nedregulering av dette aksessoriske molekyl på overflaten av slike celler.
I enkelte utførelsesformer har cellene inn i hvilke genet for aksessorisk molekyl ligand innføres i det minste små mengder av CD40 molekylet tilstede på celleoverflaten eller er avledet fra celler som uttrykker CD40 ligand molekylet på celleoverflaten, men har redusert eller eliminert denne ekspresjon.
De foretrukne metoder for å endre immunreaktiviteten for en spesiell celle kan anvendes på pattedyrceller inkluderende menneskeceller. Disse menneskeceller kan omfatte neoplastiske menneskeceller som humane lymfomer, levkemier og andre maligniteter som inkluderer brystcancer, lungecancer og ovariecancer. Cellene er foretrukket normale antigenpresenterende celler i en menneskepasient som monocytter, makrofager, B celler, Langerhans celler, interdigitasjonsceller, follikulære dendrittiske celler, Kupffer celler og andre lignende celler. Cellene er foretrukket lymfocytter som krever endret immunreaktivitet når de aksessoriske molekyler i henhold til oppfinnelsen innføres i disse celler. Cellene kan også foretrukket være neoplastiske eller normale celler som er i stand til å stimulere bystander-antigenpresenterende celler når genene for aksessorisk molekyl ligand innføres i disse celler. Celler som ikke naturlig kan presentere antigen for immunsystemet kan manipuleres genetisk for å innføre genene som koder for molekylene som kreves for antigenpresentasjon, inkluderende gener som koder for et aksessorisk molekyl, og således tillater disse celler å virke som artifisielle antigenpresenterende celler. Aksessorisk molekyl ligand genet kan deretter innføres i disse artifisielle antigenpresenterende celler. Forskjellige tester er vel kjent innen litteraturen for å bestemme om en spesielle celle er i stand til å virke som en antigenpresenterende celle, slik som celleproliferasjon eller produksjon av lymfo-kiner og dette aspekt kan derfor lett bestemmes.
I tillegg til de ovennevnte normale humane celler, kan genet for aksessorisk molekyl ligand innføres i forskjellige neoplastiske eller maligne celler som eventuelt er antigen presenterende celler. Slike humane neoplastiske celler som er sett på inkluderer levkemi, lymfomer, AML, AMML eller CMML, CML, CLL og hvilke som helst neoplastiske celler som kan stimulere bystander-antigenpresenterende celler når et aksessorisk molekyl ligand innføres i denne celle. Også omfattet er neoplastiske celler slik som brystcancerceller, ovariecancerceller eller lungecancerceller som kan eller som er manipulert til å virke som en antigenpresenterende celle. Den foreliggende immunmodulering er også anvendbar på andre maligniteter som ikke er spesifikt identifisert og vil således inkludere en hvilken som helst tumor av en hvilken som helst celle i stand til å presentere antigen i det animalske eller menneskelige immunsystem eller hvilken som helst celle som kan virke som en antigenpresenterende celle eller som kan stimulere bystander-antigenpresenterende celler etter at et gen for aksessorisk molekyl ligand er blitt innført i disse celler. Disse antigenpresenterende celler har generelt aksessoriske molekyler på overflaten av cellen.
De foreliggende metoder for å endre immunreaktiviteten til en human eller animalsk celle kontemplerer introduksjonen av et
gen for aksessorisk molekyl ligand i cellene for hvilke endret immunreaktivitet er ønskelig. Genene som kan anvendes inkluderer en rekke gener for aksessorisk molekyl ligand og kimære gener for aksessorisk molekyl ligand identifisert i det foregående
og inkluderer foretrukket minst en del av det murine CD40 ligand genet. Særlig foretrukket er genet for aksessorisk molekyl ligand som innføres i cellene valgt til å svare til det aksessoriske molekyl tilstede på overflaten av cellene for hvilke endret
immunreaktivitet er ønskelig. I en særlig anvendelse vil immunreaktiviteten til en celle som uttrykker CD40 molekylet på celleoverflaten oppnås ved å innføre genet som koder for CD40 ligand molekylet og mere foretrukket det murine CD40 ligand molekyl.
Immunreaktiviteten til humane eller animalske celler kan endres ved å innføre et aksessorisk molekyl ligand gen som er et kimært aksessorisk molekyl ligand gen i cellen. De forskjellige anvendbare kimære aksessorisk molekyl ligand gener ble identifisert i det foregående og vil kunne inkludere en rekke molekyler og tillater anvendelse av de unike egenskaper av disse kimære aksessorisk molekyl ligand gener for å endre immunreaktiviteten til målcellene. Anvendbare kimære aksessorisk molekyl ligand gener er foretrukket gener som koder for minst en del av aksessorisk molekyl liganden som er i stand til å binde det aksessoriske molekyl tilstede på overflaten av cellene for hvilke endret immunreaktivitet er ønsket.
Metodene for å endre immunreaktiviteten ser på anvendelsen av genetiske vektorer og genetiske strukturer som inkluderer
genterapivektorer som koder for en aksessorisk molekyl ligand og inneholder derfor et aksessorisk molekyl ligand gen. Typisk har de genetiske vektorer og genetiske strukturer som inkluderer genterapivektorene en promoter som er operativt koblet til genet for aksessorisk molekyl ligand etterfulgt av en polyadenyleringssekvens. I andre utførelsesformer er det eneste krav at de genetiske vektorer, genetiske strukturer og genterapivektorene inneholder genet for aksessorisk molekyl ligand eller det kimære gen for aksessorisk molekyl ligand.
V. Metoder for å behandle neoplasier
Metoder for å behandle humane neoplasier som omfatter å innføre i en human neoplastisk celle, et gen som koder for en aksessorisk molekyl ligand slik at liganden uttrykkes på overflaten av de neoplastiske celler er også beskrevet. Behandling av humane neoplasier både in vivo, ex vivo og ved direkte injeksjon av forskjellige DNA molekyler som inneholder et gen som koder for en aksessorisk molekyl ligand i pasienten er beskrevet. De foreliggende metoder for behandling av humane neoplasier involverer imidlertid, som et minimum, innføring av genet som koder for aksessorisk molekyl liganden inn i de neoplastiske celler på en slik måte at disse neoplastiske celler kan uttrykke aksessorisk molekyl liganden på celleoverflaten. Ekspresjonen av genet for aksessorisk molekyl ligand i disse neoplastiske celler modulerer immunsystemet til å bevirke at neoplasier reduseres eller elimineres.
I en foretrukket metode for å behandle humane neoplasier omfatter metoden videre trinnene med først å oppå de humane neoplastiske celler fra et menneske og deretter innføre, i de isolerte humane neoplastiske celler, et gen som koder for en aksessorisk molekyl ligand slik at aksessorisk molekyl liganden uttrykkes på overflaten av de neoplastiske celler. De humane neoplastiske celler som har aksessorisk molekyl liganden på overflaten av denne celle infuseres deretter tilbake inn i pasienten. En fagkyndig på området vil forstå at en rekke metoder kan anvendes for å infusere de endrede humane neoplastiske celler som inneholder genet som koder for aksessorisk molekyl liganden tilbake inn i pasienten, og at disse metoder er kjent innen teknikken.
De metoder som man ser på for behandling av humane neoplasier er anvendbare på en rekke forskjellige humane neoplasier som inkluderer lymfomer, levkemier og andre maligniteter. I foretrukne utførelsesformer er den humane neoplasi en neoplasi som inkluderer antigenpresenterende celler av det humane immunsystem og som inkluderer monocytter, makrofager, B celler, Langerhans celler, interdigitasjonsceller, follikulære dendrittiske celler, Kupffer celler og lignende. I andre foretrukne utførelsesformer er den humane neoplasi en levkemi, lymfom, AML, AMML, CMML, CML eller CLL, lungecancer, brystcancer, ovariecancer og andre lignende neoplasier.
De genetiske vektorer, genetiske strukturer og genterapivektorer som kan anvendes i metoden for å behandle humane neoplasier er blitt omtalt i det foregående og inkluderer strukturer hvor en promoter er operativt koblet til genet for aksessorisk molekyl ligand eller til det kimære aksessorisk molekyl ligand genet som i sin tur er operativt koblet til en polyadenyleringssekvens. Metodene for å behandle humane neoplasier ser på anvendelsen av genetiske strukturer, genetiske vektorer, genterapivektorer som beskrevet i denne beskrivelse. I tillegg er bruk av DNA som inneholder i det minste ett gen som koder for et aksessorisk molekyl ligand gen beskrevet. Dette gen kan eventuelt inneholde en promoter og andre regulerende sekvenser.
Foretrukket er celler omfattende de humane neoplasier lokalisert i minst ett definert sted betegnet et tumorleie i menneske-pasienter. Dette tumorleiet inneholder typisk tumor- eller neoplastisk celle sammen med en rekke andre celler som er forbundet med tumorceller eller neoplastiske celler. Metoder for å behandle slik human neoplasi tilstede i et tumorleie ved å injisere, inn i tumorleiet til pasienten, et gen som koder for en aksessorisk molekyl ligand slik at aksessorisk molekyl liganden uttrykkes på overflaten av tumorcellen og fører derved til at cellene deltar i en immunreaksjon er beskrevet. Genet som koder for aksessorisk molekyl liganden kan være tilstede som en del av en genterapivektor, genetisk struktur eller genetisk vektor.
Foretrukket er genet for aksessorisk molekyl liganden et kimært gen som i det minste har en del av det murine CD40 ligand gen. Foretrukket er også aksessorisk molekyl liganden som kodes i stand til å binde et aksessorisk molekyl tilstede på de humane neoplasier som skal behandles.
De forskjellige genterapivektorer som anvendes i behandlings-metodene inkluderer vektorer som direkte kan infisere humane celler. Slike vektorer er blitt beskrevet i litteraturen og kan lett tilpasses metodene som er beskrevet heri.
PA2
En hvilken som helst type genterapi kan anvendes som inkluderer metodene etter Raper, S.E. et al., Ann. Surg., 223:116 (1996); Lu, L. et al., Crit. Rev. Oncol. Hematol., 22:61 (1996); Koc, 0. N. et al., Semin. Oncol., 23:46 (1996); Fisher, L. J. et al., Curr. Opin. Neurobiol., 4:735 (1994); Goldspiel, B. R. et al., Clin, Pharm., 12:488 (1993); Danko, I. et al., Vaccine, 12:1499
(1994); Raz, E. et al., Proe. Nati. Acad, Sei, U.S.A., 90:4523
(1993); Sugaya, S. et al., J. Mol. Cell Cardiol., 28:133 (1996); Soubrane, C. et al., Eur. J. Cancer, 32A:691 (1996); Kass-Eisler, A. et all., ann. N. Y. Acad. Sei., 772:232 (1995); DeMatteo, R.P et al., Ann. Surg., 222:229 (1995); Addison, C. L. et al., Proe. Nati. Acad. Sei, U.S.A. 92:8522 (1995); Hengge, U. R. et al., J. Clin. Invest., 97:2911 (1996); Felgner, P. L. et al., Ann. N. Y. Acad. Sei., 772:126 (1995); Furth, P. A., Hybridoma, 14:149 (1995); Yovandich, J. et al., Hum. Gene Ther., 6:603
(1995); Evans, C. H. et al., Hum. Gene Ther., 7:1261.
VI Vaksinasjonsmetoder
Metoder for vaksinasjon av et dyr mot en forhåndsbestemt organisme kan omfatte administrering til dette dyr av en vaksine som inneholder immunogene animalske antigener i stand til å bevirke en immunrespons i dette dyret mot den ønskede organisme sammen med en vektor som inneholder et gen som koder for en aksessorisk molekyl ligand. Metoder for å vaksinere et dyr kan også inkludere administrering av genene som koder for det immunogene antigen i stand til å bevirke en ønsket immunrespons eller endre immunresponsen til et spesielt antigen sammen med en vektor som inneholder et gen inkluderende aksessorisk molekyl ligand genet. I denne spesielle utførelsesform vil den eller de innførte vektorer kode for de immunogeniske antigener som er ønskelig og den ønskelige aksessorisk molekyl liganden. Genet eller genene som koder for det immunogeniske peptid eller peptider kan være tilstede på den samme vektor som genet eller genene som koder for aksessorisk molekyl liganden.
Vaksinasjonsmetodene er generelle ved at de kan anvendes for å fremstille en vaksinasjon mot en hvilken som helst forutbestemt organisme slik som en virus, bakterie, sopp eller annen organisme. I tillegg kan de foreliggende vaksinasjonsmetoder anvendes for å danne en immunrespons mot en neoplastisk celle.
Foretrukket anvender vaksinasjonsmetodene en genetisk vektor, en genetisk struktur eller en genterapivektor som inneholder et gen for en aksessorisk molekyl ligand som er et kimært aksessorisk molekyl ligand gen. Dette kimære gen for aksessorisk molekyl ligand inneholder foretrukket minst en del av det murine CD40 ligand gen. Vaksinasjonsmetoden kan også foretrukket anvende et DNA molekyl som minst koder for aksessorisk molekyl ligand genet eller et kimært aksessorisk molekyl ligand gen. Dette spesielle DNA kan eventuelt inkludere en promotersekvens som styrer ekspresjonen av aksessorisk molekyl ligand genet.
Vaksinasjonsmetoden kan anvende en genetisk vektor som er i stand til å uttrykke en aksessorisk molekyl ligand i en spesielle celle eller organisme sammen med en vektor som er i stand til å uttrykke i det minste ett enkelt polypeptid fra et adenovirus. Dette adenoviruspolypeptid kan uttrykkes fra den samme eller en annen vektor som uttrykker aksessorisk molekyl liganden i denne cellen. I denne spesielle utførelsesform er adenoviruspolypeptidet også uttrykt i minst en celletype i organismen og tjener til å modulere immunresponsen funnet som svar på denne vaksinasjonsprosedyre.
Introduksjonen av et aksessorisk molekyl ligand gen i celler
som er tilstede i ledd i pasienter med revmatoid artritt er også beskrevet. Foretrukket omfatter det innførte aksessorisk molekyl ligand genet minst en del av Fas ligand genet og ved ekspresjon induserer den aksessoriske ligand celledød til celler som uttrykker Fas på celleoverflaten. Denne prosess fører til
reduksjonen av den destruktive inflammatoriske prosess.
De etterfølgende eksempler er tilveiebragt for å illustrere forskjellige aspekter at den foreliggende oppfinnelse.
VII Metoder for å behandle artritt
Metoder for å behandle artritt som omfatter å innføre i et ledd, celler som er blitt transformert med en aksessorisk molekyl ligand, slik som Fas liganden er beskrevet. Foretrukket er ekspresjonen av denne aksessorisk molekyl liganden eller stabiliteten til dette molekyl på overflaten av cellene blitt forandret. I disse foretrukne utførelsesformer fungerer aksessorisk molekyl liganden på en økt måte til å understøtte behandlingen av artritt i leddet. Human artritt kan behandles både in vivo, ex vivo og ved direkte injeksjon av forskjellige DNA molekyler som inneholder gener som koder for den anvendbare aksessorisk molekyl liganden i pasienten. Forskjellige
anvendbare prosedyrer kan utformes i forbindelse med revmatoid
artritt som inkluderer dem som er beskrevet i den etterfølgende eksempeldel.
Artritt kan behandles ved anvendelse av gener for aksessorisk molekyl ligand som kan være kimære gener for aksessorisk molekyl ligand som omfatter at deler av dette gen er avledet fra to forskjellige aksessorisk molekyl ligand gener. De kimære aksessorisk molekyl ligander kan også være dannet ved å anvende domener fra det samme aksessorisk molekyl ligand genet. De resulterende kimære aksessorisk molekyl ligander har en endret stabilitet på overflaten av celler hvorpå de uttrykkes. Denne endrede stabilitet modulerer funksjonen til immunsystemet i det lokale miljøet rundt cellene hvor disse kimære aksessorisk molekyl ligander er uttrykt. Foretrukket er f.eks. Fas ligand stabilitet endret på overflaten av celler i et ledd til en pasient som lider av artritt. Denne endrede stabilitet modulerer immunsystemet og fører til at cellene kan være målrettet for apoptose og med således reduksjon av immunresponsen i det betente ledd. Genene for aksessorisk molekyl liganden beskrevet heri kan også bli endret slik at den resulterende aksessorisk molekyl ligand har en endret stabilitet og bevirker en immunmodulerende effekt som kan være anvendbar for å behandle artritt.
Foretrukket anvendes kimære aksessorisk molekyl ligander gener i behandlingen av artritt. Disse kimære aksessorisk molekyl ligand gener inneholder foretrukket minst én del av Domene IV av Fas ligand genet, som bærer effekten eller funksjonen for Fas ligand. Foretrukket er minst én del av dette domene tilstede som tillater at Fas ligand har sin biologiske effekt. I andre foretrukne kimære aksessorisk molekyl ligander inneholder disse ligander domener fra andre aksessorisk molekyl ligand gener eller fra et forskjellig domene av den samme aksessorisk molekyl liganden. Særlig foretrukne er Fas kimære aksessorisk molekyl ligand gener dannet av Domene IV av human Fas liganden som er operativt koblet til Domene III fra mus Fas liganden. Denne
spesielle kombinasjon resulterer i en mer stabil Fas ligand og således, ved å erstatte Domene III i human Fas liganden med Domene
III i mus liganden, blir aktiviteten til det humane Fas ligand genet endret.
Alternativt, anvendes det murine Fas ligand gen til å kode for den murine Fas liganden på overflaten av celler i stedet for den humane Fas liganden. Den murine Fas liganden er mer stabil enn den humane Fas liganden og endrer således Fas ligand aktiviteten i leddet. Den resulterende endrede Fas ligand aktiviteten er anvendbar for behandling av revmatoid artritt.
Ytterligere foretrukket kombineres effekten eller funksjon tilstede på Domene IV av den humane Fas ligand med andre domener fra andre aksessorisk molekyl ligander. CD70 Domene III er f . eks . mere stabilt enn Domene III av human Fas liganden og således vil den kimære aksessorisk molekyl liganden dannet av Domene III fra den humane CD70 og Domene IV av Fas liganden sammen med andre understøttende domener være mere stabile. Den økte stabilitet fører til økt Fas ligand aktivitet. Også foretrukket er Domene III av Fas liganden erstattet med multiple kopier av et domene eller domener. Slike multiple kopier av domener inkluderer domener dannet av to eller flere kopier av andre domener slik som Domene III eller I av CD70 molekylet.
Aksessorisk molekyl ligand gener, slik som Fas ligand gener, hvor et spaltingssete for matriks-metalloproteinase (MMP), er blitt fjernet fra aksessorisk molekyl liganden er foretrukket. MMP kuttings- og gjenkjennelsesseter, illustrert i figur 28, er omtalt i Smith, M.M. et al., Journal of Biol. Chem 270:6440-6449 (95) og Nagase, H., og G.B. Fields, Biopolymers (Pepitde Science) 40:399-416 (96). Foretrukket er minst ett MMP sete fjernet fra i det minste Domene III av Fas ligand genet. Fjerningen av MMP setet fra Fas ligand genet gjør liganden mer stabil og således mer effektiv i behandling av artritt.
Også foretrukket er de kimære gener for aksessorisk molekyl ligand omfattet av deler av det humane Fas ligand genet med andre domener fra andre humane aksessorisk molekyl ligander eller domener fra aksessorisk molekyler avledet fra andre arter. Anvendelsen av domener fra CD40 ligand, CD70 ligand, CD30 ligand, TNF-relatert apoptoseinduserende ligand (TRAIL), TNFasåvel som mutanter av human Fas ligand og murin Fas ligand er beskrevet. Dannelse av slike kimære aksessorisk molekyl ligander kan lett gjennomføres ved å manipulere og produsere aksessorisk molekyl ligand gener som er kimære og som således har deler avledet fra i det minste to forskjellige aksessorisk molekyl ligand gener.
EKSEMPLER
1. Ekspresjon av human og mus aksessorisk molekyl ligand i humane CLL celler
a. Konstruksjon av en genetisk struktur og genterapivektor som inneholder et humant gen og musegen for aksessorisk
molekyl ligand
Enten det humane aksessorisk molekyl ligand genet (human CD40 ligand) eller det murine aksessorisk molekyl ligand genet (murin CD40 ligand) ble konstruert ved anvendelse av de respektive humane og murine gener. Hvert av disse gener ble klonet på følgende måte.
i. Murin CD40-L kloning
Det totale RNA ble isolert ved anvendelse av RNA STAT-60 kittet (Tel-Test "B" Inc., Friendswood, TX) fra 1 x IO<7>B6 musesplenocytter som på forhånd var aktivert i 8 timer med immobilisert CD3-spesifikke mAb. cDNA ble deretter syntetisert med Superscript cDNA syntesekitt (Gibco BRL, Grand Island, NY) ved anvendelse av oligo-dT primere. Det murine CD40 ligand (mCD40-L) genet ble deretter amplifisert fra cDNA ved PCR ved anvendelse av følgende mCD40-L spesifikke primere.
5'-GTTAAGCTTTTCAGTCAGCATGATAGAA (SEQ ID NO: 26),
5 '-GTTTCTAGATCAGAGTTTGAGTAAGCC (SEQ ID NO: 27). Det amplifiserte mCD40-L PCR produkt ble subklonet inn i Hindlll og Xbal seter av den eukaryotiske ekspresjonsvektor pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, CA) . Et DNA fragment som omfatter CMV promoteren, mCD40-L genet og polyadenyleringssignalet ble frigjort fra denne
plasmidstrukturen etter restriksjonskutt med Bglll og Xhol enzymer. Dette DNA fragment ble deretter subklonet inn i
skyttelplasmid MCS(SK)pXCX2 (Spessot R, 1989, Virology 168:378) som var betegnet mCD40-L pXCX2. Dette plasmid ble anvendt for adenovirusproduksjon som beskrevet i det etterfølgende.
ii. Human CD40-L kloning
Et plasmid som inneholder genet for human CD40-L ble anvendt for å fremstille det humane CD40-L genet anvendt heri. Sekvensen til dette gen er tilgjengelig og således ble denne kilde for genet anvendt for letthets skyld. Se GenBank deponeringsnummer X67878. Dette plasmid ble anvendt for PCR amplifikasjon av det humane CD40-L genet ved anvendelse av spesifikke primere, senseprimer 5' CCAAGACTAGTTAACACAGCATGATCGAAA 3' (SEQ ID NO: 28) og antisenseprimer 5 ' CCAATGCGGCCGCACTCAGAATTCAACCTG3 ' (SEQ ID NO: 29).
Disse primere inneholder flankerestriksjonsenzymseter for subkloning inn i det eukaryotiske ekspresjonsplasmid pRc/CMV
(Invitrogen) . Det PCR amplifiserte CD40-L fragment ble subklonet inn i Spel og Noti setene av pRc/CMV og betegnet hCD40-L pRc/CMV. Et Bglll og Chol fragment som omfatter CMV promoteren, hCD40-L genet og polyadenyleringssignalet ble deretter frigjort fra
dette plasmid og subklonet inn i skyttelplasmidet MCS(SK)pXCX2 som beskrevet over. Dette plasmid ble betegnet hCD40-L pXCX2. Dette plasmid ble anvendt for adenovirusproduksjon som beskrevet senere.
iii. Adenovirussynteser
Enten mCD40-L pXCX2 eller hCD40-L pXCX2 plasmider ble ko-transferert med pJM17 (Graham og Prevec, 1991, Methods in Molecular Biology, Vol 7) inn i 293 celler (American Type Culture Collection, Rockville, MD) ved anvendelse av kalsiumfosfatmetoden (Sambrook, Fritsch og Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. utgave, kapittel 16:33-34). Isolerte adenovirusplakker ble plukket og ekspandert ved igjen å infisere 293 celler. Høytiteradenoviruspreparater ble oppnådd som beskrevet (Graham og Prevec, 1991, Methods in Molecular Biology, Vol 7), med unntak av de følgende modifikasjoner. Cesium-kloridgradienten anvendt for konsentrasjon av viruspartikler var en trinn-gradient med densiteter på 1,45 g/cm<3>og 1,2 g/cm<3>. Prøvene ble rotert i en SW41 rotor (Beckman, Brea, CA) ved 25.000 opm ved 4°C. Virusbåndet ble avsaltet ved anvendelse av en Sephadex G25 DNA kolonne (Pharmacia, Piscataway, NJ). Det isolerte virus ble lagret ved 70°C i fosfatbufret saltoppløsning med 10% glyserol. Virus titer ble bestemt ved å infisere 293 celler med seriefortynninger av det rensede adenovirus og med telling av antall dannede plakker. Virustiteret strekker seg typisk fra 10<10>til IO<12>plakkdannelsesenheter/ml (PFU/ml) .
b. Introduksjon av et murint eller humant aksessorisk molekyl
ligand gen inn i CLL celler og HeLa celler.
For adenovirusinfeksjon ble IO<6>nytinte og vaskede CLL celler eller HeLa celler suspendert i 0,5 til 1 ml kulturmedium for dyrking ved 37°C i en 5% C02-i-luft inkubator. Adenovirus ble tilsatt til cellene ved varierende "multiplicity of infection"
(MOI), og de infiserte celler ble dyrket i 48 timer dersom ikke annet er angitt, før de analyseres for transgenekspresjon.
c. Ekspresjon av et aksessorisk molekyl ligand gen i CLL celler
og HeLa celler
CLL og HeLa cellene som var infisert med adenovirusvektoren som inneholder enten mus eller humane CD40 ligand gener fremstilt i eksempel lb. ble deretter merket med kommersielt tilgjengelige monoklonale antistoffer som er immunspesifikke for enten den humane eller mus CD40 liganden (Pharmingen, San Diego, CA) ved anvendelse av produsentens retningslinjer. CLL og HeLa cellene ble vasket i merkingsmedium (SM) som omfattet RPMI-1640, 3% føtalt kalveserum og 0,05% natriumazid og som inneholdt propidiumjodid og ble deretter analysert på en FACScan (Becton Dickinson, San Jose, CA). Døde celler og debris ble ekskludert fra analyse ved karakteristiske spredningsprofiler med forover-rettet lys og sidelys og propidiumjodidmerking. Overflate-antigenekspresjon ble målt som gjennomsnittlig fluorescens-intensitetforhold (MFIR). MFIR er lik gjennomsnittlig fluore-scensintensitet (MFI) for celler merket med et spesifikt FITC-konjugert MoAb, dividert med MFI for celler merket med et kontroll IgG-FITC. Denne metode kontrollerer de ikke-spesifikke
økninger i autofluorescens som man ser i større, mere aktiverte celler.
Histogrammene, dannet for CLL cellene og HeLa cellene som inneholder enten en genetisk vektor som inneholder det humane CD40 ligand genet eller det murine CD40 ligand genet og de passende kontroller, er vist i figur 3A-3D. Ekspresjonen av både det murine og humane aksessorisk molekyl ligand genet (CD40 ligand) i HeLa celler er vist i henholdsvis figurer 3A og 3B. Ekspresjonen av den murine og humane aksessorisk molekyl liganden i CLL cellene er vist i figur 3C og 3D. Ekspresjon av et aksessorisk molekyl ligand gen i CLL celler og ekspresjon av murin CD40 ligand på overflaten av CLL cellen er vist i figur 3C. Svikten i ekspresjonen av human aksessorisk molekyl ligand på overflaten av CLL cellene er vist i figur 3D.
Figur 8 viser data fra et forsøk som er utført for å undersøke om CD4<+>T celler fra CLL pasienter kunne induseres til å uttrykke aksessorisk molekyl ligand mRNA etter CD3 ligering. En ELISA-basert kvantitativ konkurrerende RT-PCR ble anvendt for å måle CD40 ligand transkriptnivåene. I dette forsøk blir CD40 ligand og RNA transkribert fra CD40 ligand genet i CLL celler sammenlignet med nivåer av CD40 ligand og RNA dannet i normale donorceller, etter induksjon ved CD3 ligering. For CD3 aktivering, ble platebelegg av CD3 mAb dannet og inkubert med utplatet CLL eller normale donor-mononukleære celler i den indikerte tidsperiode, hvoretter cellen ble analysert for ekspresjon av overflateantigener eller CD154 RNA budbringernivåer. CLL eller normalt donorserum ble tilsatt til cellene på begynnelsen av aktiveringsanalysen for å undersøke modulering av CD40 ligand overflateekspresjon.
For kvantitativ CD154 RT-PCR ELISA, ble total RNA ekstrahert
og konkurrerende RNA ble dannet fra innskuddet som inneholder CD40 ligand (CD154) cDNA. Varierende mengder konkurrerende RNA ble tilsatt til separate brønner av isolert total RNA som deretter ble omdannet til cDNA. CD3 aktivering, ELISA'er og PCR reaksjoner ble utført som beskrevet i Cantwell, M. et al., Nature Medicine
3:984-989 (1997). Biotinylerte PCR produkter ble festet på mikrotiterplater (Becton, Dickinson, Oxnard, CA) belagt med streptavidin (Sigma) og inkubert. Platen ble behandlet med NaOH for å fjerne sensetrådene og deretter vasket. DNA ble deretter hybridisert med enten villtype genspesifikke eller konkur-rentspesifikke oligonukleotider. Ved anvendelse av terminal transferase ble hver probe merket med et digoksigenin-11-dideoksyUTP molekyl (Boehringer Mannheim). Platen ble inkubert og vasket med HYBE buffer og blokkeringsbuffer, og deretter ble peroksidasekonjugert anti-digoksigeninantistoff (150 U/ml; Boehringer Mannheim) i blokkeringsbuffer tilsatt. TMB (tetra-metylbenzidin) og peroksidase (Kirkegaard og Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) ble tilsatt for fargeutvikling, og optiske densiteter ble målt ved 450 nm og Deltasoft II (Biometallics, Princeton, NJ) ble anvendt for dataanalyser.
Standardkurver som plotter mol RNA produkt versus optisk densitet ble fremstilt for standard cDNA reaksjoner. Ligninger som beskriver disse standardkurver ble deretter anvendt for å beregne mol villtype eller konkurrent DNA tilstede i de ukjente PCR reaksjoner basert på optiske densiteter oppnådd i ELISA avlesningene. Forholdet mellom mengden villtype DNA og mengden konkurrent DNA ble deretter plottet mot den kjente mengde konkurrent RNA tilsatt i de initiale prøver. Et forhold på 1 ble tatt for ekstrapolering av mengden ukjent mol target RNA i prøven (et forhold på 1 betyr at mengden target RNA versus konkurrent RNA er lik). Molekylene av target RNA per CD4 celle ble deretter beregnet basert på følgende formel: [(mol target CD154 RNA) x (6 X IO<23>molekyler/mol) x fortynningsfaktor av test RNA)]/(% av CD4 T celler i total cellepopulasjon).
Den øverste kurven i figur 8 viser at T celler hos pasienter med CLL ikke uttrykker detekterbar CD40 ligand etter CD3 ligering. CD40 ligand RNA dannes, men er ikke stabil. Skjønt både CD40 ligand og CD40 ligand RNA uttrykkes i normale donor T celler (nederste kurve), blir hverken nivåene av protein eller RNA opprettholdt stabilt.
Figur 9 viser et tidsforløp for overflateekspresjon av CD40 ligand. Ekspresjonen nådde et toppnivå 48 timer etter infeksjon og vedvarte ved høye nivåer i minst 6 døgn deretter. I dette forsøk ble CLL B celler infisert med en genterapivektor som inneholder en aksessorisk molekyl ligand, ved en MOI på 1000 ved tiden 0, og ble deretter bestemt ved flow cytometri ved forskjellige påfølgende tidspunkter. I hvert tidspunkt som er angitt på abscissen, er andelene levedyktige CLL B celler som uttrykte detekterbare CD154 indikert ved de vertikale søyler som svarer til prosentandelskalaen angitt på ordinaten på høyre side. d. Funksjon av humane og murine aksessorisk molekyl ligander i. Induksjon av CD80 og CD54 på celler inneholdende en genterapivektor som koder for et aksessorisk molekyl
CLL cellene infisert med det murine aksessorisk molekyl ligand genet fremstilt i eksempel lb. ble deretter dyrket i vevskulturplater. CLL cellene ble deretter analysert ved anvendelse av multiparameter FACS analyse for å detektere induksjon av CD80 og CD54 ekspresjon ved anvendelse av fluroescein isotio-cyanatkonjugerte monoklonale antistoffer som er immunspesifikke for hvert av disse respektive overf lateantigener. Ikke-inf iserte CLL celler ble anvendt som en kontroll. Cellene ble underkastet passende FACS analyse og histogrammer ble dannet. CD80 mAb ble oppnådd fra Dr. Edward Clark og CD54 mAb ble oppnådd fra CALTAG Inc. CD80 ble konjugert ved anvendelse av standard metoder som er blitt beskrevet i Kipps et al., Laboratory Immunology II,
12.237-275 (1992).
Resultatene fra denne analyse er vist i figur 4A-4D. Figurene 4A-4B sammenligner mengden CD54 ekspresjon i CLL celler som ikke er blitt transfektert (figur 4A) eller CLL celler inn i hvilke en genterapivektor som inneholder det murine CD4 0 ligand genet var innført (figur 4B) . Den skyggelagte kurve indikerer isotypekontrollen for FACS farging og den åpne kurve indikerer cellen merket med anti-CD54 antistoffet. Disse resultater viser at
ekspresjonsnivået av CD54 økes i CLL celler inn i hvilke
genterapivektoren inneholdende den murine CD4 0 ligand var innført.
Figurer 4C og 4D sammenligner mengden CD80 ekspresjon i CLL celler som ikke er blitt transfektert (figur 4C) eller CLL celler inn i hvilke en genterapivektor som inneholder det murine CD40 ligand gen var innført (figur 4D). Den skyggelagte kurve indikerer
isotypekontrollen for FACS merking og den åpne kurve indikerer cellene merket med anti-CD80 antistoffet. Disse resultater viser at ekspresjonsnivået for CD80 er økt i CLL cellene inn i hvilke genterapivektoren inneholdende den murine CD4 0 ligand var
innført.
I et ytterligere forsøk ble CLL celler infisert med en genterapivektor inneholdende det murine aksessorisk molekyl ligand genet evaluert ved flow cytometri for indusert ekspresjon av ikke bare CD54 og CD80, men også CD86, CD58, CD70 og CD95. Fluorescein-konjugert mAb spesifikk for human CD54 og CD70 ble oppnådd fra CALTAG. Fluorescein-konjugert mAb spesifikk for human CD27, CD58, CD80, CD86 eller CD95, og fycoerytrin-konjugert mAb spesifikk for human eller mus CD40 ligand, ble oppnådd fra PharMingen. Skyggelagte histogrammer representerer merking av CLL B celler med FITC-konjugert isotype ikke-spesifikk mAb. I motsetning til ikke-infiserte CLL celler (figur 10, histogrammer med en tynn linje), eller Ad-lacZ-infiserte CLL celler (data lignende dem oppnådd med ikke-infiserte celler, men ikke vist), uttrykte CLL celler infisert med adenovirusvektor som koder for CD40 liganden (CD154) høye nivåer av CD54 (figur 10, øverst til venstre), CD80 (figur 10, øverst i midten) , CD86 (figur 10, øverst til høyre), CD58 (figur 10, nederst til venstre), CD70 (figur 10, nederst i midten) og CD95 (figur 10, nederst til høyre). På den annen side uttrykte CD40 ligand-CLL (CD154 CLL) signifikant lavere nivåer av både membran CD27 (figur 11A, histogram med tykk linje) og oppløselig CD27 (figur 11B) enn ikke-infiserte (figur 11A, histogram med tynn linje) (P < 0.01, Bonferroni t-test) eller Ad-lacZ-infiserte CLL celler (data lignende dem oppnådd med ikke-infiserte celler, men ikke vist). I dette forsøk som vist i figur 11A, ble CLL B cellene undersøkt for ekspresjon av CD27 via flow cytometri, tre døgn etter infeksjon. Skyggelagte histogrammer representerer merking av CLL B celler med FITC-konjugert isotype kontroll mAb. I figur 11B, ble cellefrie supernatanter samlet, etter infeksjon eller stimulering av CLL B celler, i 72 timer og testet for konsentrasjon av human CD27 ved hjelp av ELISA. Den reduserte ekspresjon av CD27 (figur 11B) er lignende den notert for levkemi B celler stimulert via CD40 tverrbinding med mAb G28-5 presentert ved CD32-uttrykkende L celler, som beskrevet i Rassenti, L.Z. og T.J. Kipps, J. Exp. Med. 185:1435-1445. ii. Allogeneiske T celle responser på CLL celler in i hvilke en genetisk terapi vektor inneholdende et murint CD40 ligand
gen er blitt innført.
Den evne som CLL celler som er blitt infisert med genterapivektor inneholdende det murine CD40 ligand genet har til å stimulere allogeneiske T celler (dvs. fra et annet individ) ble analysert ved anvendelse av celleproliferasjonsanalyse. Kort ble test-cellene ko-dyrket med den genetiske terapivektor inneholdende lacZ-genet eller det murine CD40-ligand genet ved en MOI på 1.000 i nærvær av IL-4 i en konsentrasjon på 10 ng/ml. I andre prøver ble CLL-cellene stimulert med MOPC21 (en kontroll IgG) eller G28-5 (et anti-CD40 monoklonalt antistoff) eller ble preinkubert på CD32-L celler og samtidig behandlet med IL-4. Preinkuba-sjonen med CD32-L-cellene sammen med IL-4 behandling er blitt vist til å være en effektiv form av tverrbinding av CD40 molekylet annet enn direkte gentransfeksjon.
Etter tre døgns dyrking ved 37°C ble disse celler behandlet med mitomycin C for å forhindre deres proliferasjon og ble deretter anvendt til å stimulere allogeneiske T celler. Før denne ko-dyrking, hadde de forskjellige prøver av CLL celler enten blitt behandlet med anti-CD40 monoklonalt antistoff eller de var blitt infisert med genterapivektor inneholdende enten lacZ eller det murine CD40 ligand genet ved et stimulatorforhold på 1:10. Etter to døgns dyrking ved 37°C ble interferon gamma (IFNg) produksjon målt ved ELISA-analyse. Etter fem døgns ko-dyrking ved 37°C, ble innlemmelsen av<3>H-thymidin i replikerende celler målt etter en åtte timers pulsmarkør. Resultatene fra denne analyse er vist i tabell II i det etterfølgende og i fig. 5.
I et annet forsøk ble CLL B celler infisert med genterapivektoren inneholdende CD4 0 ligand genet evaluert for deres evne til å virke som stimulatorceller i en allogeneisk blandet lymfocytt T cellereaksjon (MLTR). Parallelt ble også den stimulerende kapasitet til kontroll lacZ-vektorinfiserte CLL celler og CLL B celler som var blitt dyrket med CD32-Lceller og et anti-CD40 mAb (G28-5) eller et isotype kontroll lg, undersøkt som beskrevet i Ranheim, E.A. og T.J. Kipps, J. Exp. Med., 177:925-935 (1993), Clark, E.A. og J.A. Ledbetter, Proe. Nati. Acad. Sei. USA,
83:4494-4498 (1986) og Banchereau, J. et al, Science 251:70-72
(1991). Effektor T-celler fra en ikke-relatert donor ble ko-dyrket med CLL stimulator-cellene ved et effektor til target forhold på 4:1. Etter 18 timers dyrking ved 37°C ble over 30 % av de allogeneiske CD3<+>celler funnet til å uttrykke det aktiverings-assosierte antigen CD69 når dyrket med CD154-CLL celler (data ikke vist). I motsetning uttrykte mindre enn 4 % av T-cellene CD69 når ko-dyrket med ikke-infiserte eller Ad-lacZ-infiserte CLL celler (data ikke vist).
To dager etter initieringen av MLTR ble konsentrasjonene av IFNg i kultursupernatantene bestemt ved ELISA. Supernatantene av MLTR stimulert med CLL celler infisert med den aksessoriske molekyl liganden CD40L (fig. 12A, CD154-CLL) inneholdt signifikant høyere nivåer av IFNg (306 ± 5 mg/ml,
m + SE, n = 3) enn MLTR kulturer stimulert med anti-CD40 mAb (fig. 12A, aCD40-CLL) (23 + 3 ng/ml) (P < 0,05, Bonferroni
t-test). Sistnevnte var ikke signifikant forskjellig fra den for MLTR kulturer stimulert med kontroll Ad-LacZ-infiserte CLL celler (fig. 12A, lacZ-CLL) (43 + 10 ng/ml) (P > 0,1, Bonferroni t-test). Supernatantene til effektorceller alene, eller til
MLTR kulturer stimulert med ikke-infiserte CLL celler (fig. 12A, CLL) eller kontroll lg behandlede CLL celler (fig. 12A, MOPC-CLL), inneholdt ikke detekterbare mengder IFNg (< 2 ng/ml). Likeledes dannet ingen av levkemi B celle populasjonene detekterbare mengder IFNg når de ble dyrket alene, uten tilsatte effektor T celler (data ikke vist).
Etter fem døgn ble celleproliferasjon bestemt ved innlemmelse av<3>H-thymidin. Kulturer med isotype kontroll IgG-behandlede (fig. 12B, MOPC-CLL) eller ikke-infiserte (fig. 12B, CLL) stimulatorceller innlemmer ikke mere<3>H-thymidin enn kulturer uten tilsatte levkemistimulatorceller (fig. 12B, ingen). Ad-lacZ-infiserte CLL B celler (fig. 12B, lacZ-CLL) var heller ikke i stand til å stimulere allogeneiske T celler til å innlemme mengder av<3>H-thymidin som var større enn dem til kontroll-kulturer. I motsetning til dette induserte anti-CD40-stimu-lerte levkemiceller eller CD154-CLL celler hver signifikant effektor celleproliferasjon (fig. 12B, aCD40-CLL eller CD154-CLL) (P < 0,05, Bonferroni t-test). Dessuten var mengden<3>H-thymidin innlemmet ved kulturer stimulert med CD154-CLL celler (41.004 + 761 cpm (m + SE), n = 3) signifikant større enn den til kulturer stimulert med et likt antall aCD40-CLL celler
(22.935 ± 1.892 cpm, n = 3) (P < 0,05, Bonferroni t-test) . Ingen av disse mitomycin-C-behandlede levkemicellepopulasjoner
innlemmet imidlertid<3>H-thymidin når de ble dyrket uten effektor T celler (data ikke vist) . Også, som beskrevet for MLTR mellom allogeneiske T celler og CD40-stimulerte CLL celler {6549, 7167, 7168}, kunne allogeneisk T celle proliferasjon som svar på
CD154-CLL inhiberes ved CTLA-4-Ig eller CDlla mAb når tilsatt ved initieringen av MLTR, noe som indikerer at respektive interaksjoner mellom CD80/CD86 og CD28, eller CD4 og CDlla/CD18 bidrar til den konstaterte allogeneiske T celle reaksjon (data ikke
vist).
ili. Stimulering av gamma interf eron ved CLL celler inneholdende
et aksessorisk molekyl ligand gen
Funksjonen til CLL celler inneholdende et aksessorisk molekyl ligand gen (mus CD40 ligand) ble analysert ved å bestemme den evnen som disse celler har til å aktivere T lymfocytter. Prosedyren ble utført som følger: allogeneiske T lymfocytter fra en frisk donor (mer enn 90 % CD3<+>) ble renset ved anvendelse av magnetiske kuler og monoklonale antistoffer spesifikke for CD14 og CD19 antigenet. Disse allogeneiske T lymfocytter ble deretter dyrket sammen med MMC-behandlede CLL celler som ble infisert med aksessorisk molekyl ligand genet (murin CD40 ligand) eller lacZ-genet. Denne ko-dyrking ble utført i RPMI-1640 medium inneholdende 10 % føtalt kalveserum. Etter dyrking i 24 timer ble cellene samlet og analysert for å bestemme ekspresjon av antigenet CD69 på T lymfocyttene ved anvendelse av en standard
FACS sorteringsprosedyre. Cellekultursupernatantene ble
samlet etter to døgn i kultur og testet for å bestemme konsentra-sjonen av human interferon gamma ved anvendelse av en ELISA test. En del av CLL cellene inneholdende et aksessorisk molekyl ligand gen (murin CD40 ligand) eller en del av cellene inneholdende
adenoviruset som uttrykker lacZ ble dyrket i nærvær av human interleukin 4 IL-4 (5 ng/ml). Dannelsen av interferon gamma ved allogeneiske T lymfocytter i nærvær av denne mengde humant interleukin 4 ble også analysert. Resultatene fra disse analyser er vist i fig. 6.
Som man kan se produserte de humane CLL celler som inneholdt
aksessorisk molekyl ligand genet (murin CD40) vesentlig høyere konsentrasjoner av interferon gamma i cellekultursupernatanten sammenlignet med CLL celler som inneholdt LacZ-genet. Den økte produksjon av interferon gamme (IFNg) ved T lymfocytter eksponert for CLL celler inneholdende aksessorisk molekyl ligand genet
indikerer at disse CLL celler som inneholder aksessorisk molekyl ligand genene var effektive til å gi en økt immunrespons.
iv. Stimulering av allogeneiske T celler pre-eksponert for ikke-modifiserte CLL B celler inneholdende et aksessorisk
molekyl ligand gen.
Tidligere studier indikerte at antigen presentasjon overfor T celler i fravær av signalene avledet fra ko-stimulerende molekyler slik som CD28, kan føre til spesifikk T celle klonal anergi. For denne reaksjon ble allogeneiske T celler som på forhånd var blitt dyrket med ikke-modifiserte CLL B celler som mangler ekspresjon av CD80 og andre immune aksessoriske molekyler, testet for deres evne til å respondere på CLL celler inneholdende CD40 ligand genet. Allogeneiske effektorceller innlemmet ikke mer<3>H-thymidin som svar på ikke-modifiserte CLL celler (fig. 12C, CLL), eller kontroll CLL celler infisert med Ad-lacZ (fig. 12C, lacZ-CLL), enn når de ble dyrket alene (fig. 12C, ingen) . I motsetning, til og med etter tidligere ko-dyrking med ikke-modifiserte CLL B celler, kunne allogeneiske effektor celler fremdeles induseres til å proliferere (fig. 12C, CD154-CLL) eller til å produsere IFNg (fig. 12D, CD154 CLL) som svar på celler som uttrykker en aksessorisk molekyl ligand. Skjønt beskjedne mengder IFNg ble detektert i supernatantene til slike sekundære kulturer når Ad-lacZ-inf iserte levkemiceller ble anvendt som stimulatorceller (fig. 12D, lacZ-CLL) , var dette nivå signifikant lavere enn det som er registrert for sekundære kulturer med Ad-CD40-ligandinfiserte CLL celler (fig. 12D, CD154-CLL) (P < 0,05, Bonferroni t-test). Likeledes inneholdt supernatanten av levkemiceller alene (data ikke vist), og effektorcellene alene (fig. 12D, ingen), fra MLTR kulturene stimulert med ikke-infiserte CLL celler (fig. 12D, CLL), neglisjerbare mengder IFNg (<2 ng/ml). Disse resultater indikerer at allogeneiske effektorceller dyrket med ikke-modifiserte CLL B celler ikke utelukkes fra å respondere på CLL B celler infisert med en genterapivektor inneholdende aksessorisk molekyl ligand genet.
v. Autolog T celle responser på CLL celler inn i hvilke en genterapivektor som koder for et murint aksessorisk molekyl
ligand gen er blitt innført.
T celler isolert fra blodet til CLL pasienter ble undersøkt for deres evne til respondere, in vitro, på autologe CLL B celler inneholdende en genterapivektor som koder for den murine aksessorisk molekyl CD40 liganden. T celler ble isolert til
> 95 % renhet og deretter ko-dyrket med mitomycin-C-behandlede autologe levkemiceller i serumfritt AIM-V medium supplert med eksogen inerleukin-2 med 25 U/ml. Beskjeden<3>H-thymidininn-lemmelse (< 10.000 cpm) ble detektert i kulturer uten tilsatte stimulatorceller, delvis sekundært til eksogent IL-2 (fig. 13A, og data ikke vist). Nivået av T celle proliferasjon økte imidlertid ikke som svar på ikke-infiserte CLL celler (fig. 13A, CLL) eller Ad-lacZ-infiserte CLL celler (fig. 13A, lacZ-CLL).
I motsetning induserte CLL celler infisert med en genterapivektor inneholdende aksessorisk molekyl liganden (fig. 13A, CD154-CLL) autologe T celler til å innlemme signifikant mere<3>H-thymidin (17 368 ± 1093 cpm, n = 3) enn noen av kontroll-kulturene (P < 0,05, Bonferroni t-test). Videre dannet også MLTR stimulert med CLL celler infisert med en vektor som koder for en aksessorisk molekyl ligand (CD40L) signifikant mere IFNg
(165 + 3 ng/ml, n = 3) enn noen av de andre kulturer (fig. 13B)
(P < 0,05, Bonferroni t-test).
T cellene ble høstet etter 5 døgn fra den autologe MLTR og målt for CTL aktivitet mot autologe CLL B celler. T celler ko-dyrket med autologe CD40-ligand-CLL celler utviklet CTL aktivitet for ikke-modifiserte CLL B celler, og bevirket 40,1 % lysis (± 2,3 %) ved et E:T forhold på 2:1 (fig. 13C, CD154). Slike T celler utviklet imidlertid ikke detekterbar CTL aktivitet for de samme målceller i kontrollreaksjonene når de ble ko-dyrket med
ikke-infiserte eller Ad-lacZ-infiserte CLL celler (fig. 13C).
vi. Spesifisitet av CTL stimulert ved autologe CD40-ligand-CLL
B celler for allogeneiske CLL B celler.
Effektorceller stimulert med autolog CD40-ligand-CLL ble
evaluert for deres evne til å utskille IFNg eller manifestere CTL aktivitet overfor allogeneiske CLL B celler (fig. 14) . Etter 5 døgn av autolog MLTR med CD154-CLL eller lacZ-CLL, ble T celler isolert ved Ficoll densitetsgradient-sentrifugering, vasket
omfattende og deretter dyrket i medier i 24 timer. Vaskede T celler ble blandet med autologe ("Auto CLL", fylt stolpe) eller allogeneiske ("Allo-1 CLL" eller "Allo-2 CLL", skyggelagte eller skraverte stolper) target CLL B celler. T celler stimulert i den autologe MLTR med CD40-ligand-CLL celler, men ikke med
lacZ-CLL celler, produserte signifikant mere IFNg som svar på sekundær dyrking med ikke-modifiserte autologe CLL B celler enn med allogeneiske CLL B celler (fig. 14A) (P < 0,05, Bonferroni t-test). Videre var T celler stimulert med CD40-ligand-CLL
celler, men ikke med lacZ-CLL celler, cytotoksiske for autologe CLL celler, men ikke for allogeneiske CLL celler (fig. 14B). Liknende resultater ble oppnådd med de autologe MLTR-aktiverte T celler til den allogeneiske donor, som igjen demonstrerer spesifikk cytoksisitet for autologe CLL B celler (data ikke vist). Endelig kunne W6/32, et mAb mot klasse I "major histocompatibility complex" (MHC I) antigener signifikant inhibere cytotoksisiteten til T celler stimulert med CD40-ligand-CLL celler for autologe CLL B celler (fig. 14C, aHLA-klasse I) (P < 0,05, Bonferroni t-test). Slik inhibering
ble ikke observert med mAb spesifikk for MHC klasse II antigen (fig. 14C, aHLA-DP), mAb spesifikk for Fas-liganden (fig. 14C, aFasL), eller et isotype-kontroll mAb med irrelevant spesifisitet (fig. 14C, MOPC-21). Samlet indikerer disse studier at Ad-CD40-ligand-infiserte CLL celler kan indusere en autolog anti-levkemi cellulær immunrespons in vitro som fører til dannelsen av MHC-klasse I-begrenset CTL spesifikk for autologe ikke-modifiserte leukemi B celler.
e. Transaktivering av ikke-inf iserte bystander leukemi B celler
ved Ad-CD40L CLL celler.
For å se på om forandringene i tumormarkørekspresjon (beskrevet i avsnitt Idi.) er et resultat av intracellulær versus intercellulær stimulering, ble effekten av kulturdensitet på den induserte ekspresjon av CD54 og CD80 etter infeksjon med adenovirus genterapivektor som koder for aksessorisk molekyl liganden (CD40L eller CD154) undersøkt. Etter infeksjon ble CLL celler dyrket ved standard høy densitet (f.eks. 1 x IO<6>celler/ml) eller lav densitet (f.eks. 2 x IO<5>celler/ml) i 3 døgn ved 37°C. Celler med høy tetthet som ble utplatet inneholdt homotypiske aggregater, mens celler med lav densitet som ble utplatet forble jevnt dispergert og uten vesentlig celle-celle kontakt (data ikke vist). Til tross for å uttrykke liknende nivåer av heterolog CD154, ble CD154-CLL B celler dyrket ved høy tetthet indusert til å uttrykke høyere nivåer av CD54 og CD80 enn CD154-CLL celler dyrket ved lav tetthet (fig. 15A). Stimuleringen oppnådd ved høy tetthet kunne inhiberes ved å dyrke cellene med et hamster anti-mus CD154 mAb i stand til å blokkere CD40<->CD154 interaksjoner (fig. 15B, aCD154 Ab). Samlet indikerer disse studier at CD154-CLL celler kan aktivere hverandre in-trans og at overflateekspresjon av CD154 er nødvendig for optimal levkemicellestimulering.
I tillegg ble Ad-CD154-infiserte, ikke-infiserte, Ad-lacZ-infiserte eller G28-5-stimulerte CLL celler merket med en grønn fluorescerende farge for å undersøke om CD154-CLL kunne stimulere ikke-infiserte bystander leukemiceller. Fargemerkede celler ble anvendt som stimulatorceller for like antall ikke-merkede syngeneiske CLL B celler. Etter 2 døgns dyrking bibeholdt stimulatorceller dyrket for seg selv den grønne flurescensfarge, som tillot at slike celler kunne skjelnes fra ikke-merkede CLL celler ved flow cytometri. Bystander (grønn-fluorescens-negative) CD19<+>CLL B celler ble indusert til å uttrykke CD54 (fig. 15C, høyre histogram) eller CD86 (fig. 15D, høyre histogram) når de ko-dyrkes med Ad-CD154-infiserte levkemi B celler, men ikke med mock-infiserte CLL celler (fig. 15C og 15D, venstre histogrammer), G28-5-stimulerte CLL celler eller Ad-lacZ-infiserte CLL celler (data ikke vist). Som forventet var disse bystander (grønn-fluorescens-negative) CLL celler også negative for heterolog CD154.
f. Behandling av levkemi med genterapivektorer som koder for
en aksessorisk molekyl ligand.
Fig. 24 viser en oversikt over et klinisk forsøk for å teste behandlingen av B celle CLL med adenovirus genterapivektorer som koder for modifisert CD40 ligand. Levkemiceller som er høstet ved ferese infiseres med replikasjons-defekte vektorer som koder for den modifiserte CD40 ligand. Etter ekspresjon av dette protein, administreres cellene tilbake til pasienten for å stimulere en verts anti-levkemicelle-immunrespons. Denne strategi er langt overlegen den som anvender genterapi for å påvirke ekspresjon av kun ett immunstimulerende molekyl på
levkemi celle overflate. Denne strategi resulterer faktisk i at levkemiceller uttrykker en oppstilling av immunstimulerende aksessoriske molekyler og cytokiner, såvel som et molekyl som kan bevirke de samme forandringer i levkemiceller til pasienten som aldri ble høstet.
2. Ekspresjon av kimære aksessorisk molekyl ligand gener. Kimære aksessorisk molekyl ligand gener som beskrevet under fremstilles ved anvendelse av standard teknikker som beskrevet heri. a. Fremstilling av kimære aksessorisk molekyl ligand gener ved anvendelse av domener fra to ulike gener for aksessorisk molekyl. Det human CD40 ligand genet ble isolert fra RNA fremstilt fra T celler som var blitt aktivert ved hjelp av et anti-CD3 monoklonalt antistoff ved anvendelse av 5' og 3' primere sammen med vel kjente PCR metoder. Kimære aksessorisk molekyl gener av human CD40 ligand og murin CD40 ligand konstrueres fra det nylig klonede humane CD40 ligand genet og mus CD40 ligand genet beskrevet heri som SEQ ID NO: 2. Transmembran- og cytoplasmatiske domener av humane CD40 ligand gener byttes med dem til det murine CD40 ligand genet og betegnet H(Ex)-M(Tm-Cy) CD40 ligand. Disse kimære aksessorisk molekyl ligand gener produseres ved anvendelse av genomdannelsesteknikken beskrevet som SOEN som tidligere er blitt beskrevet av Horton, Mol. Biotechnol., 3:93 (1995). Et diagram som viser de kimære aksessorisk molekyl ligand genene som produseres er vist i fig. 4. Nukleotidsekvensene til hver av disse respektive kimære gener for aksessorisk molekyl ligand er betegnet SEQ ID NO: 3-7 som indikert i tabellen i det etterfølgende.
Adenovirusvektorer som koder for hvert av de kimære aksessoriske molekyler som er vist i fig. 2 konstrueres ved anvendelse av metoder beskrevet i eksempel 1. Hver av disse strukturer transfekteres deretter inn i enten HeLa celler eller CLL celler i henhold til metodene i eksempel 1.
b. Ekspresjon av kimære aksessorisk molekyl ligander på CLL og
HeLa celler.
Ekspresjonen av hvert av de kimære aksessorisk molekyl ligand gener som er konstruert i det foregående analyseres ved anvendelse av FACS analyse som spesifisert i eksempel 1. Det passende monoklonale antistoff som er immunspesifikt for det eksterne domene til enten human eller mus CD4 0 ligand selekteres og anvendes for å bestemme nivået for ekspresjon av de kimære aksessoriske molekyler på overflaten av disse celler. Etter passende analyse og fremstilling av passende histogrammer bekreftes ekspresjonen av kimære aksessoriske molekyler inneholdende minst en del av det murine CD40 ligand genet.
c. Funksjon av kimære aksessorisk molekyl ligander.
CLL celler infiseres med forskjellige MOI av mCD40L adenoviruset og dyrkes deretter i 48 eller 24 brønns vevskulturplater i forskjellige tidsperioder etter infeksjon (48, 72 og 96 timer).
CD19<+>B cellene analyseres deretter ved multiparameter FACS
analyse for induksjon av CD80 og CD54 ekspresjon ved anvendelse av fluorescein isotiocyanat-konjugert mAb spesifikk for hvert respektive overflateantigen som er beskrevet i eksempel 1. Økte mengder CD54 og CD80 er funnet på celler som har de kimære
aksessoriske molekyler som inneholder domenet eller domener avledet fra mus CD40 ligandgenet.
Videre analyse av cellene som inneholder de kimære aksessorisk molekyl genene gjennomføres i henhold til eksempel l(d).
Cellene som inneholder de kimære aksessorisk molekyl genene som inneholder domener avledet fra det murine CD40 ligand genet er i stand til å stimulere produksjon av gamma interferon og T celle proliferasjon.
d. Ekspresjon av kimære aksessorisk molekyl gener som inneholder proksimale ekstracellulære domener fra to forskjellige
aksessoriske molekyler fra de samme spesies.
Et kimært aksessorisk molekyl ligand gen fremstilles som inneholder det proksimale ekstracellulære domene fra det humane CD70 gen (domene III) med resten av domene avledet fra det humane CD40 ligand genet. Dette gen fremstilles ved anvendelse av standard biologiske teknikker som beskrevet tidligere heri. Dette kimære aksessorisk molekyl ligand genet har DNA sekvensen vist som SEQ ID No: 19. Et annet kimært aksessorisk molekyl ligand gen fremstilles som inneholder det proksimale ekstracellulære domene fra det murine CD40 ligand genet med resten av domenene avledet fra det humane CD4 0 ligand genet. Dette gen fremstilles ved anvendelse av standard teknikker som er beskrevet tidligere heri. Dette kimære aksessorisk molekyl ligand genet har DNA sekvensen vist som SEQ ID No: 20.
De kimære aksessorisk molekyl genene vist som SEQ ID Nos: 19
og 20 innføres i passende vektorer som beskrevet i eksempel 1 og innføres i humane neoplastiske celler. Ekspresjonen av dette kimære aksessorisk molekyl gen i cellene bestemmes som beskrevet i eksempel 1.
Det kimære aksessorisk molekyl som hvert av disse kimære aksessorisk molekyl genene koder for finner man på overflaten av de humane neoplastiske celler ved anvendelse av FACS analyse beskrevet i eksempel 1. Økte mengder CD54 og CD80 er funnet på cellene som inneholder de kimære aksessorisk molekyl genene ved anvendelse av teknikken beskrevet i eksempel 1. Cellene som inneholder det kimære aksessorisk molekyl genet er i stand til å stimulere produksjonen av gamma interferon og T celle proliferasjon som beskrevet og bestemt i overensstemmelse med eksempel 1. 3. Økning av vaksinasjon ved anvendelse av vektorer som koder
for aksessoriske molekyler.
Følgende prosedyrer ble anvendt for å vise økningen av en vaksinasjonsprosedyre ved anvendelse av en genterapivektor som koder for et aksessorisk molekyl.
a. Økning av antistoffresponsen i mus som var ko-injisert med
en aksessorisk molekyl genterapivektor og placZ.
Tre ulike genterapistrukturer ble fremstilt ved anvendelse av standard teknikker inkluderende dem som er beskrevet heri. Den første var en genterapivektor for kontroll, pcDNA3, som ikke inneholdt noe gen. Den andre placZ, inneholdt LacZ genet som kodet for (3-galaktosidase ((3-gal) . Den tredje, p-mCD40L, inneholdt det murine CD40 ligand genet beskrevet i eksempel 1.
Før noen immuniseringer ble serum isolert fra 6-8 uker gamle BALB/c-mus for å bestemme mengden av eventuelle initiale antistoffer mot (3-galaktosidase. Hvert dyr ble injisert intramuskulært med 100 ug plasmid DNA pr. injeksjon. Fire separate injeksjoner ble gitt med en ukes intervall.
Før den tredje injeksjon ble det tatt blodprøver av dyrene for å måle den tidlige antistoff respons mot (3-gal. En uke etter
den siste injeksjon av plasmid DNA, ble det tatt blodprøver av dyrene for å måle den siste antistoff respons overfor (3-galaktosidase. For å teste analysens sensitivitet, ble kjente mengder anti-(3-gal antistoffer isolert fra et anti-(3-gal antiserum
testet parallelt.
Serumfortynninger på 1:40, 1:200 eller 1:1000 ble testet i en ELISA for anti-(3-gal antistoffer. For dette ble polystyren mikrotiter ELISA plater belagt med (3-gal ved 10 ug/ml i fosfatbufret saltoppløsning. Platene ble vasket tre ganger med blokkeringbuffer inneholdende 1 % bovint serumalbumin (BSA),
0,2 % Tween 20 i boratbufret saltoppløsning (BBS) (0,1M borat, 0,2M NaCl, pH 8,2). 50 ul fortynnet serum ble tilsatt til de separate brønnene. Etter minst 1 time ved romtemperatur, ble platene vasket tre ganger med blokkeringsbuf f er og fikk deretter reagere med alkalisk fosfatase-konjugert geit anti-mus IgG
antistoff. 1 time senere ble platene igjen vasket fire ganger med blokkeringsbuffer og inkubert med 5 ml TMB peroksydase-substrat (Kirkegaard&Perry, Gaithersburg, MD). Absorbansen ved 405 nm for hver brønn ble målt ved anvendelse av en mikroplateavleser (Molecular devices, Menlo Park, CA). Desto høyere O.D. avlesning, desto større var mengden spesifikt antistoff i prøven.
Dataene for hvert av de to forsøk er tilveiebragt i tabell IV og V som er angitt senere. Resultatene som oppsummert i VI og VII som sammenligner dataene fra de to forsøk er likeledes tilveiebragt. På oppsummeringssiden står n for antall dyr i hver av de fire grupper. S.D. står for standard avvik og Avg. er gjennomsnittlig O.D. avlesning for alle dyrene i en spesiell gruppe.
Resultatene i gruppe 4 viser at anvendelse av en genterapivektor som koder for en aksessorisk molekyl ligand (CD40L) øker
immuniseringen mot (3-gal som er kodet for av en genetisk eller genterapivektor. Den gjennomsnittlige O.D. avlesning av 1:40 fortynningen av serum fra dyr i denne gruppe er signifikant høyere enn den for grupper 1, 2 og 3 (P<0,05, Bonferroni t-tester, se tabell VII).
Data fra et ytterligere forsøk forsterker videre det funn at genterapivektoren som koder for en aksessorisk molekyl ligand øker immunisering mot (3-gal (fig. 16) . Her ble pCD40L og placZ ko-injisert inn i skjelettmuskel for å teste for økning av immunresponsen mot placZ, en pcDNA3-basert vektor som koder for E. coli (3-galaktosidase. De relative anti-(3-gal Ab aktiviteter ble bestemt via ELISA. Som forventet, produserte mus som var injisert med enten den ikke-modifiserte pcDNA3-vektoren eller pCD40L alene ikke detekterbare antistoffer mot (3-gal (fig. 16A) . Mus ble injisert med enten 100 ug pcDNA3 ("rutemønstret"
stolpe), 50 ug pcDNA3 + 50 ug pCD40L (linjert stolpe), 50 ug
pcDNA3 + 50 ug placZ (stripet stolpe) eller 50 ug pCD40L + 50 ug placZ (fylt stolpe) . På den annen side utvikles mus som hadde mottatt placZ og pcDNA3 detekterbare anti-(3-gal antistoffer en uke etter den fjerde og siste injeksjon ved dag 28. Mus som
mottok placZ og pCD40L utviklet høyere titere av anti-(3-gal antistoffer enn mus injisert med placZ og pcDNA3. Fig. 16B, ELISA-analyser av seriefortynninger av serum samlet på dag 28, viser at mus som var ko-injisert med placZ og pCD40L hadde et åtte ganger høyere gjennomsnittlig titer av anti-(3-gal antistoffer ved dag 28 enn mus behandlet med placZ + pcDNA3.
i. Immunglobulin subklasseproduksjon stimulert ved aksessorisk
molekylvektor ko-injeksjon
Til tross for økning av titeret av anti-(3-gal antistoff responsen, var subklassen av anti-(3-gal IgG indusert ved injeksjon av placZ ikke endret ved ko-injeksjon av pCD40L. IgG2aanti-(3-gal antistoffer dominerte over IgGisubklasse antistoffer i serum fra mus injisert med enten placZ og pcDNA3 eller placZ og pCD40L (fig. 17). ELISA O.D. målingene av anti-(3-gal IgGiog anti-(3-gal IgG2atilstede i pre-immun serum (stripet stolpe) eller post-immun serum (fylt stolpe), samlet ved dag 28 fra hver gruppe av mus, injisert som indikert på abscissen, er også vist. I motsetning til dette utviklet BALB/c mus injisert med (3-gal-protein hovedsakelig IgGianti-p-gal antistoffer, og ingen detekterbare IgG2aanti-p-gal antistoffer.
ii. Økning av vaksinasjon ved aksessorisk molekyl vektor krever
ko-injeksjon med placZ i det samme sted. Adjuvanseffekten av pCD40L plasmidet på anti-p-gal antistoff responsen ble kun notert når det ble injisert i det samme sted som placZ (fig. 18). Grupper av BALB/c mus (n=4) mottok intramuskulære injeksjoner av placZ og pCD40L sammen i det samme sted, eller som samtidige separate injeksjoner i distale steder (høyre og venstre baklegg-quadriceps). En kontrollgruppe
mottok intramuskulære injeksjoner av placZ og pcDNA3 i det samme sted. Blodprøver ble tatt fra dyrene på dag 28 og serum ble testet for anti-p-gal Ab ved forskjellig fortynninger, som indikert på abscissen. Kurven illustrerer et representativt
forsøk som viser gjennomsnittlig O.D. ved 405 nm av repeterte brønner av hver av serumprøvene for hver gruppe ved en 1:40, 1:200 eller 1:1000 fortynning. Dyr injisert samtidig med placZ og pCD40L, men i forskjellige steder, utviklet ikke detektbare anti-p-gal antistoffer inntil dag 28. Dessuten var anti-p-gal antistoff titrene til serum fra slike dyr på dag 28 lignende dem til mus som mottok placZ og pcDNA3, og signifikant lavere enn dem til dyr som mottok placZ og pCD40L sammen i det samme sted.
iii. Økning av vaksinasjon når aksessorisk molekyl vektor og
placZ ko-injiseres inn i dermis
pCD40L plasmidet økte også anti-p-gal antistoffreaksjonen mot placZ ved injeksjon inn i dermis. I forsøket som er vist i fig.
19 mottok mus intradermale injeksjoner, nær haleroten, av enten 50 ug pcDNA3 ("rutemønstret" stolpe) , 25 ug pcDNA3 + 25 ug pcCD40L (linjert stolpe), 25 ug pcDNA3 + 25 ug placZ (stripet stolpe) eller 25 ug pCD40L + 25 ug placZ (fylt stolpe). Injeksjoner, blodprøver og ELISA analyser ble utført som i fig. 16A. Gruppene i forbindelse med stolpen som var "rutemønstret" og stolpen som var linjert omfattet hver 8 mus mens gruppen i forbindelse med den stripete stolpe og den fylte stolpe hver omfattet 12 mus. Høyden av hver stolpe representerer gjennomsnittlig O.D. for
serum ved en 1:40 fortynning for hver gruppe ± S.E. En statistisk analyse av dataene indikerte at gruppene for den stripete stolpe og den fylte stolpe er uavhengige (P<0,05) . Som observert med intramuskulær injeksjon, utviklet mus som var ko-injisert med placZ og pCD40L detekterbare anti-(3-gal serumantistof f er en uke etter den andre injeksjon (dag 14), og to uker tidligere enn
mus som var injisert med placZ og pcDNA3. Dessuten hadde disse dyr også et åtte ganger høyere gjennomsnittlig titer av anti-p-gal antistoffer enn mus i den placZ-injiserte gruppe ved dag 28. Mus som var injisert med enten den ikke-modifiserte pcDNA3 vektor eller med pCD4 0L alene produserte ikke detekterbare antistoffer mot p-gal.
b. Økning av CTL-responsen i mus som var ko-injisert med en
aksessorisk molekyl genterapivektor og placZ
Den evnen som pCD40L har til å øke induksjon, ved placZ, av CTL spesifikk for syngeneiske p-gal-uttrykkene målceller ble testet. BALB/c mus som var ko-injisert med pCD40L og placZ inn i skjelettmuskulaturen (fig. 20A) eller dermis (fig. 20B) dannet et større antall CTL spesifikke for P13.2, en placZ transfektert P815 cellelinje, enn mus som var ko-injisert med placZ og pcDNA3. Ved et 5:1 effektor:target forhold, oppnådde splenocytt-effektorcellene fra mus som mottok intramuskulære injeksjoner av placZ og pCD40L mer enn 20 % spesifikk lysis av P13.2. I motsetning til dette, når splenocytter fra mus som mottok kontrollinjeksjonen med placZ og pcDNA3 ble anvendt, var et 9-ganger større forhold mellom effektor og targetceller nødvendige for å oppnå dette nivå av spesifikk lysis. Likeledes drepte splenocytt-ef fektorceller fra mus som mottok intradermale injeksjoner av placZ og pCD40L mer enn 50 % av P13.2 cellene ved effektor:target forhold på 4:1. Oppnåelse av sammenlignbare nivåer av spesifikk lysis krevde åtte-ganger høyere effektor: target forhold ved anvendelse av splenocytter fra mus som mottok intradermale injeksjoner av placZ og pcDNA3. Uansett hadde splenocytter fra mus ko-injisert med pCD40L og placZ ikke større ikke-spesifikk CTL aktivitet for P815 celler enn dem fra mus som mottok placZ sammen med pcDNA3 (fig. 20). Som forventet medierte ikke splenocytter fra mus som mottok injeksjoner av pcDNA3 alene, eller pcDNA3 og pCD40L, spesifikk lysis av P13.2 eller P815 celler.
4. Behandling av neoplasi ved anvendelse av en genterapivektor inneholdende et aksessorisk molekyl gen eller kimært
aksessorisk molekyl gen
a. Behandling av neoplasi i mus
Behandlingen av en neoplasi i et musemodellsystem er blitt vist ved anvendelse av genene som koder for aksessorisk molekyl ligander. Genterapivektorer som inneholder et aksessorisk molekyl ligand gen (murin CD40 ligand) ble fremstilt som beskrevet tidligere i de foregående eksempler. Disse genterapivektorer ble anvendt til å introdusere dette aksessorisk molekyl ligand genet i neoplastiske celler, linjel-celler, fra en tumor som stammet fra BALB/c mus. De aksessoriske molekyler ble innført i de neoplastiske celler i henhold til de ovennevnte eksempler. Ekspresjonen av aksessorisk molekyl liganden på overflaten av disse neoplastiske celler ble bekreftet ved anvendelse av flow cytometri som beskrevet i de ovennevnte eksempler.
Effektiviteten av aksessorisk molekyl ligand genene for behandling av neoplasi er vist som følger. BALB/c hunmus (6-8 uker gamle) fikk injisert i.p. 1,0 x 10<5>bestrålte linjel neoplastiske celler. De neoplastiske linjel celler er avledet fra et spontant lungeadenocarcinom i en BALB/c mus. Denne neoplastiske celle er blitt beskrevet av Blieden et al., Int. J. Cancer Supp., 6:82 (1991). Andre BALB/c hunmus fikk injisert i.p. 1,0 x IO<5>bestrålte linjel tumorceller som på forhånd var blitt transdusert med genterapivektoren som koder for
aksessorisk molekyl liganden (murin CD40) som beskrevet over.
Hver gruppe av mus fikk danne en immunrespons i 10 dager. Etter 10 dager ble hver mus eksponert for 1,0 x IO<4>levende, ikke-bestrålte linjel neoplastiske celler. Disse mus ble deretter målt med hensyn til dannelsen av tumorer og ble avlivet når tumorene vokste til 2,0 cm på grunn av morbiditet. Resultatene fra denne måling er vist i fig. 7. Som det fremgår fra fig.
7 forble musene immunisert med den neoplastiske celle som uttrykker aksessorisk molekyl ligandene på celleoverflatene fri for tumor gjennom forsøk. Mus som var immunisert med de neoplastiske celler som ikke har genene for aksessorisk molekyl ligand, bukket under for tumor 50 dager etter eksponering for de neoplastiske celler.
Fig. 21 viser ned-modulering av human CD40L, men ikke murin CD40L, i lungetumorcellelinjer som uttrykker CD40. Humane cellelinjer HeLa (CD40-negativ cervikal carcinom, fig. 21A), A427 (CD50-negativ lungecarcinom, fig. 21B), NCI 460 (svakt CD40-positiv lunge-storcellecarcinom, fig. 21C), og SK-Mes-1 (sterk CD40-positiv lunge-skvamøs celle-tumor, fig. 21D) ble infisert med adenovirus som koder for lac-Z (Ad-LacZ) , murin CD40L (Ad-mCD40L) og human CD40L (Ad-hCD40L) ved en MOI på 0 (blindprøve), 1 og 10. 48 timer etter infeksjon ble murin CD40L og human CD40L
overflateekspresjon bestemt. Prosentandel celler som uttrykker ligand plottes på Y-aksen. Human og mus CD40L er uttrykt ved like nivåer i CD40-negative cellelinjer. Kun murin CD40L ekspresjon er imidlertid stabil på cellelinjer som uttrykker CD40. I motsetning til mCD40L er human CD40L nedmodulert på CD40-positive tumorer.
Dataene som er vist i form av kurver i fig. 22A viser at CD40 binding induserer ekspresjon av tumoroverflatemarkører. Behandling av CD40-uttrykkende lungecancer-cellelinjer med aCD40 mAb resulterte i økt ekspresjon av tumorcelleoverflate-markørene CD95 (Fas), CD54 (ICAM-1) og klasse I "major histocompatability" antigener (MHC I). NCI 460, et svakt CD40-positivt lunge-storcellecarcinom ble inkubert med et CD40-spesifikt monoklonalt antistoff (tykk linje) eller MOPC21, et isotype kontroll mAb (tynn linje), på CD32-uttrykkende musfibroblaster i 48 timer. Etter 48 timers inkubasjon ble lungetumorcellene analysert for CD95, CD54 og MHC-I ekspresjon ved FACS.
Fig. 22B viser igjen nedmodulering av human CD40L ved CD40-positive tumorceller. HeLa (CD40-negativ), CLL (CD40-positiv) og SK-MES-1 (CD40-positiv) tumorceller ble ko-dyrket i 24 timer med CD3-aktiverte normale donor T-celler ved et tumorcelle: T-celle forhold på 2,5:1. Etter ko-dyrking ble CD-2-uttrykkende
T-celler analysert for CD40L overflateekspresjon ved FACS. Tynne linjer representerer T-celler merket med FITC-merket isotype kontrollantistoff (M0PC21) og tykke linjer representerer aktiverte T-celler merket med FITC-merket aCD40L antistoff (aCD154 antistoff). De CD40-positive tumorcellelinjer, SK-MES-1, og CLL, uttrykker ikke CD40 ligand på deres overflater. 5. Ekspresjon av human og mus aksessorisk molekyl ligand,
Fas-ligand, i humane blodlymfocytter
a. Konstruksjon av en genetisk struktur og genterapivektor
inneholdende humant og mus Fas-ligand gen
Det humane aksessorisk molekyl ligand genet (human Fas-ligand) eller det murine aksessorisk molekyl ligand genet (murin
Fas-ligand) ble konstruert ved anvendelse av de respektive humane og murine gener. Et endret aksessorisk cellemolekyl, hvor et putativt MMP-spaltingssete var fjernet, ble dannet og betegnet AFasL-pcDNa3. Nukleotidsekvensen til AFasL-pcDNA3 er angitt som SEQ ID NO: 40. Humane Fas-ligand nukleotider 325 til 342, som koder for seks aminosyrer, er borte fra AFasL. Utformingen av AFasL var basert på den slutning at Domene III inneholder steder som er mest tilgjengelige for MMP'er og kunne således være målet på molekylet for spalting fra overflaten av cellen.
Sekvenser av human Fas-ligand genet er blitt bestemt og er angitt som SEQ ID NO: 13 og 30 (Genbank deponeringsnr. U11821).
Sekvenser av mus Fas-ligand gener er blitt bestemt og er angitt som SEQ ID NO: 14 (C57BL/6, Genbank deponeringsnr. U10984) og 31 (Balb/c, Genbank deponeringsnr. U58995) . Sekvensen til rotte Fas-ligand genet er blitt bestemt og angitt som SEQ ID NO: 25 (Genbank deponeringsnr. U03470). Kimære strukturer er dannet som beskrevet i eksempel 2 for CD40 ligand kimære strukturer, hvor Domene III av human Fas-ligand er erstattet med domener fra andre proteiner, særlig proteiner i TNF familien. Kimære strukturer inkluderer, men er ikke begrenset til, human Fas-ligand med Domene III erstattet med Domene III fra murin Fas-ligand (kimær sekvens angitt som SEQ ID NO: 37, sekvensoppstilling vist i fig. 37), eller erstattet med Domene III fra human CD70 (kimær sekvens angitt som SEQ ID NO: 38, sekvensoppstilling vist i fig. 38) , eller erstattet med Domene I i human CD70 (kimær sekvens angitt som SEQ ID NO: 39, sekvensoppstilling vist i fig. 39). Kimære strukturer hvor multiple domener, for eksempel, to kopier av human CD70 Domene III, er innskutt inn i human Fas-ligand i stedet for Domene III, dannes også ved anvendelse av metoder beskrevet i eksempel 1. Kimære strukturer hvor syntetiske sekvenser anvendes for å erstatte Domene III til human Fas-ligand er også dannet.
i. Human Fas-ligand kloning
cDNA som koder for human Fas-ligand ble subklonet i den eukaryotiske ekspresjonsvektor pcDNA3. Normale donor-blodlymfocytter ble aktivert i 4 timer med 1 ng/ml PMA pluss 0,5 uM ionomycin. Total RNA ble isolert med Qiagen Rneasy kit.
cDNA ble deretter syntetisert fra poly-A RNA med oligo-dT primere ved anvendelse av Gibco-BRL Superscript cDNA syntese kit. Genet som koder for human Fas-ligand ble deretter PCR amplifisert med de Fas-ligand spesifikke primere (sense primer, SEQ ID NO: 32, antisense primer, SEQ ID NO: 33). Fas-ligand PCR produkt ble deretter subklonet inn i pcDNA3 ved anvendelse av standard
teknikker innen molekylær biologi . RT-PCR produkter, subklonet inn i pcDNA3, betegnes hFasL-pcDNA3.
ii. Murin Fas-ligand kloning
De murine Fas-ligand gener fra Balb/c og C57/BL6 musestammer
ble også amplifisert etter aktivering av musesplenocytter med PMA pluss ionomycin som beskrevet over, og amplifisert fra poly-A syntetisert cDNA som beskrevet over (sense primer, SEQ ID NO: 34, antisense primer, SEQ ID NO: 35) . Disse gener ble subklonet i pTARGET ekspresjonsvektoren (Promega, Madison, WI). RT-PCR produkter, subklonet inn i pcDNA3, betegnes mFasL-pcDNA3.
iii. Adenovirus vektorkonstruksjon
For konstruksjon av adenovirusvektorer som koder for human Fas-ligand, murin Fas-ligand eller AFas-ligand, blir det klonede cDNA innskudd subklonet inn i plasmidet pRc/RSV (Invitrogen, San Diego, CA) i HindIII-X-bal setet. Et Bglll-Xhol fragment med RSV promotor-enhanceren og poly-A signalsekvens av bovint veksthormon ble subklonet inn i BamH-Xhol setet av plasmid MCS(SK) pXCX2. Plasmidet MCS(SK)pXCX2 er en modifikasjon av plasmid pXCX2, hvor pBlueskript polylinkersekvensen var klonet inn i El regionen. Det resulterende plasmid ble deretter ko-transferert sammen med pJM17 inn i 293 celler ved anvendelse av kalsiumfosfatmetoden. Isolerte plakker av adenovirusvektorer plukkes og ekspanderes ved hjelp av infiserende 293 celler. Høytiter adenoviruspreparater oppnås som beskrevet over som anvender en cesiumkloridgradient for konsentrering av viruspartikler via en trinnvis gradient, med densiteter på 1,45 g/cm<3>og 1,20 g/cm<3>, hvor prøvene sentrifugeres i 2 timer i en SW41 rotor (Beckman, Brea, CA) ved 25 000 opm ved 4°C. Virusbåndet avsaltes ved anvendelse av en Sephadex G-25 DNA kolonne (Pharmacia, Piscataway, NJ) , og de isolerte virus lagres ved -70°C i fosfatbufret saltoppløsning med 10 % glycerol. Titeret til viruset bestemmes ved å infisere valgfrie 293 celler ved forskjellige fortynninger og telle antallet plakker. Titere strekker seg typisk fra 10<10>til IO<12>plakkdannende enheter/ml.
Adenovirusstrukturene betegnes Ad-hFasL, Ad-mFasL og Ad-AFasL.
b. Introduksjon av murine og humane Fas-ligand gener inn i humane
celler
Strukturene hFasL-pcDNA3, mFasL-pcDNA3 og AFasL-pcDNA3 transfereres inn i 293 via elektroporering. De transfekterte celler velges i medium inneholdende G418. Fas-ligand transfektanter screenes for ekspresjon av transgenet ved anvendelse av anti-Fas-ligand antistoff og flow cytometri. Metodene som anvendes er lignende dem beskrevet for transfeksjon av CD40L inn i CLL celler.
For FasL-adenovirusinfeksjon, blir IO<6>nytinte og vaskede CLL celler eller HeLa celler suspendert i 0,5 til 1 ml kulturmedium for dyrking ved 37°C i en 5 % CC>2-i-luft inkubator. Adenovirus tilsettes til cellene ved varierende MOI, og de infiserte celler dyrkes i 48 timer, dersom annet ikke er angitt, før de analyseres for transgen ekspresjon.
c. Ekspresjon av Fas-ligand genene i humane celler
Mus med lymfoproliferativ eller generalisert lymfoproliferativ lidelse er ikke i stand til å fjerne aktiverte selv-reaktive celler utenfor tymusen. Dette er relatert til det faktum at, i disse mus, er interaksjoner mellom Fas-reseptoren og en aksessorisk molekyl ligand, Fas-ligand, mangelfulle. Disse dyrene utvikler en rekke lidelser som inkluderer lymfadenopati, splenomegali, nefritt og systemisk autoimmun patologi som ligner det som sees i pasienter med systemisk lupus erythematosus eller revmatoid artritt (RA) . Det er mulig at de normale interaksjoner mellom Fas-reseptoren og aksessorisk molekyl liganden som er ansvarlig for fjerning av aktiverte lymfocytter fra vev kan svekkes i RA pasienter.
RA synoviallymfocytter uttrykker Fas-reseptoren i en høyere andel enn matchede RA blodlymfocytter i forhold til matchede normale donor-lymfocytter. På den annen side uttrykker RA synoviallymf ocytter lite eller ingen aksessorisk molekyl ligand. Da RA synoviallymfocytter er sensitive for Fas-indusert apotose, er det mulig at lokal ekspresjon av Fas-ligand i RA-leddet vil kunne tjene til å eliminere de synoviale mononukleære celler som eventuelt medierer RA autoimmun patologi.
Fig. 23 viser at Fas-ligand ekspresjon i lymfocytter inhiberes ved eksponering for RA synovial fluid. Normale donorblod T-celler aktiveres i 5 timer med 1 ng/ml PMA pluss 0, 5 uM ionomycin. Celler ble inkubert i nærvær av revmatoid artritt blodplasma sirkler), RA synovial fluid (ruter) eller ingen (firkanter).
I tillegg ble cellene inkubert med økende konsentrasjoner av MMP inhibitoren BB94. Etter aktivering ble cellene analysert for Fas-ligand overflateekspresjon ved FACS. Prosentandel celler som uttrykker Fas-ligand er plottet i fig. 23. Dette forsøk viser at der er en eller flere faktorer tilstede i RA synovialfluid og serum som forhindrer overflateekspresjon av Fas-ligand. d. Funksjon av human, murin og kimær aksessorisk molekyl ligand,
Fas-ligand
For å bestemme kapasiteten til AFasL-strukturene, blir de ovennevnte transfekterte celler blandet med den Fas-ligand sensitive humane T-cellelinje, JURKAT. Etter 4 timers ko-dyrking, blir de ikke-adherente JURKAT-celler samlet og evaluert for apoptose. Fluorescensforbindelsen 3,3'- diheksyloksa-karbocyaninjodid (DiOC6) , anvendes for å evaluere apoptose ved anvendelse av en modifikasjon av en tidligere beskrevet prosedyre. For dette vaskes cellene en gang ved romtemperatur i fosfatbufret saltoppløsning (PBS, pH 7,2). Celler plasseres i separate brønner i en 96-brønns plastmikrotiterplate med U-bunn ved IO<5>- 5 x IO<5>celler/brønn i et totalvolum på 50 ml. Dersom indikert blir mettende mengder PE-konjugerte antistoffer tilsatt etterfulgt av tilsetning av DiOC6og propidiumjodid (PI) . DiOC6og PI anvendes ved 40 nM og 10 ng/ml sluttkonsentrasjoner.
Cellene inkuberes deretter i 15 min. ved 37°C, 5 % C02i en vevskulturinkubator. De merkede celler vaskes to ganger i
iskald PBS og suspenderes til slutt i 200 ml SM og analyseres ved FACS. Døde celler og celleavfall med karakteristiske fremre og lysspredningsprofiler og PI-merking utelukkes fra analyse.
Cellenes evne til å uttrykke AFasL-pcDNA3 for å styre Fas-mediert apoptose av celler som uttrykker CD95 sammenlignes med den til celler som uttrykker FasL-pcDNA3. Relativ stabilitet av proteinproduktene som kodes for av AFasL-pcDNA3 eller FasL-pcDNA3 før og etter dyrking med RA synovialfluid og med eller uten metalloproteinaseinhibitorene, bestemmes via flow cytometri av celler som uttrykker den ene eller andre ligand. 6. Behandling av artritt med genterapivektorer som koder for
en aksessorisk molekyl ligand, Fas-ligand
De heterologe Fas-ligand strukturer, dannet som beskrevet over, som viser den høyeste stabilitet av ekspresjon i kombinasjon med den største evne til å mediere Fas-indusert apoptose, anvendes i genterapi for RA. Potensielle terapeutiske strukturer testes i vel karakteriserte artritt-musmodeller for å bestemme effektivitet og funksjon in vivo.
a. Genterapibehandling av artritt i mus
i. Musemodeller for artritt
En museartrittmodell er kollagenindusert artritt. Det er kjent at injeksjonen av DBA/1 mus med type II kollagen i Freunds fullstendige adjuvans (CFA) induserer en artritt med synovitt og erosjoner som er histologiske lignende RA. For våre undersøkelser, blir DBA/I hannmus immunisert med bovin II kollagen i Freunds fullstendige adjuvans på dag 0 og boosted intraperitonealt (i.p.) på dag 21. På dag 28 får dyrene en ytterligere i.p. injeksjon med lipopolysakkarid (LPS) og/eller den samme type kollagen, eller en injeksjon av kun eddiksyre.
Svelling og/eller rødhet av en fremfot eller bakfot hos dyrene som er immunisert med kollagen detekteres typisk en tredje eller fjerde uke etter den andre injeksjon. Vertebrae påvirkes kun sjelden og da kun uker etter den initiale perifere leddsvelling. Berørte ledd utviser initiale histologiske endringer av synovialt ødem, etterfulgt av synovial hyperplasi.
En annen dyremodell, som nylig er beskrevet av Kouskoff, V. et al., i Cell 87:811-822 (1997), ble dannet tilfeldig ved å krysse en T-cellereseptor (TCR) transgen muslinje med NOD ("non-obese-diabetic") stammen for å danne KRN x NOD musmodellen av RA. Avkommet av en slik paring utvikler i alle tilfeller en leddsykdom som er svært lik den til pasienter med RA. Dessuten har sykdommen hos disse dyr en tidlig og reproduserbar "time of onset" og et svært reproduserbart forløp. Artritten er tilsynelatende indusert ved endret gjenkjennelse av et NOD-avledet MHC ("major histocompatibility complex") klasse II molekyl med det transgene TCR, som fører til nedbrytning av de generelle mekanismer med selv-toleranse og systemisk selv-reaktivitet.
ii. Lindring av artrittsymptomer i mus behandlet med en
genterapivektor som koder for en aksessorisk molekyl ligand Man har tilpasset og modifisert en prosedyre som opprinnelig er beskrevet av Sawchuk og kollegaer for mikro-injeksjon av adenoviruser inn i museledd. Ved anvendelse av denne prosedyre kan man på reproduserbar måte injisere et 5 ul volum inn i artikulærrommet i musekneet. I denne prosedyre bedøves musene med metofan. Et lite snitt på omtrent 2-3 mm utføres med et
#11 skalpellblad i huden over kneets lateralaspekt for å
visualisere det patello-tibiale ligament. Man kan injisere opp til 5 ul fluid ved anvendelse av en 100 ul-Hamilton mikrosprøyte og en nål med dimensjon 30. Etter injeksjonen lukkes knesnittet med Nexabond (Veterinary Products Laboratory). Våre adeno-virustitere overskrider typisk 10<10>plakkdannende enheter (pfu) pr. ml, noe som gjør det mulig å avlevere minst 5 x IO<8>pfu virus i 5 ml inn i kneleddene, som angitt over. Kontrolldyr injiseres med kontroll Ad-lacZ vektor, et replikasjons-defekt adenovirus som mangler et transgen, eller med bufferen som anvendes for
å suspendere viruset (10 mM Tris, 1 mM MgCl2, 10 % glycerol).
I en annen metode vil splenocytter høstes fra mus som er syngeneiske med vertsdyret beregnet for adoptiv overføring av transduserte celler. Celleproliferasjon vil induseres med eksogen IL-12 (100 enheter/ml) i 48 timer. Cellene telles og utplates deretter på nytt i tettheter på 5 x IO<5>eller 1 x IO<6>celler pr. ml i en 12-brønns plate med 1 ml fullstendig dyrkingsmedium pr. brønn. Virus og ConA tilsettes sammen på tidspunktet med re-utplating i nærvær av polybren (8 ug/ml). Mediumet skiftes 24 timer etter infeksjon med komplett medium inneholdende 100 enheter rekombinant IL-2 pr. ml. Prøvemengder av de transduserte celler undersøkes for Fas-ligand ekspresjon 48 timer etter infeksjon via flow cytometri.
Dyr vil motta standardiserte antall cytokin-produserende celler eller mock-transfekterte kontrollceller intraperitonealt. Konsentrerte cellesuspensjoner injiseres direkte inn i muse-synovium, som beskrevet i avsnitt 4A i det foregående. Parallelt blir prøver av de overførte cellepopulasjoner opprettholdt i vevskultur supplert med eksogen IL-2.
Mus måles tilfeldig for tegn på artritt. Dato for inntreden
av sykdom nedtegnes og klinisk alvorlighet i hvert ledd eller gruppen av ledd (tær, tarsus, ankel, vrist, kne) graderes som følger: 0 (normalt), 1 (erytem), 2 (svelling), 3 (deformitet), 4 (nekrose). Poengene summeres til å gi artrittpoenget.
Alvorligheten av artritt uttrykkes både som gjennomsnittlig observert poeng på en gitt dag, og som gjennomsnittet av det
maksimale artrittpoeng som nås for hver mus under det kliniske forløpet av sykdommen. På tidspunktet for død, blir baklabbene dissekert fri og prosessert for histologisk undersøkelse eller for RT-PCR. Den histologiske alvorlighet av artritt bedømmes på en skala fra 0-3 for synovial proliferasjon og inflammatorisk celleinfiltrasjon, hvor et poeng lik 0 = normal og 3 = alvorlig.
For mus som mottok intra-synovial injeksjon av kontroll av test-adenovirusvektor, sammenlignes nivået av artritt observert mellom kontralaterale steder. I tillegg blir det totale leddpoeng minus det til de injiserte ledd for hele dyret sammenlignet med det som observeres i leddet som er injisert med kontrollen eller test-adenovirusvektor.
Lokal administrering av Fas-ligand adenovirusekspresjons-vektorer vil resultere i fjerning av aktiverte celler, som
bestemt ved å måle de relative nivåer av CD80 mRNA ved kvantitativ RT-PCR. Denne behandling vil også føre til et økt nivå. Også om slikt apoptosenivå identifisert i påvirket muse-synovialvev bestemmes ved TUNEL-analysen ("Terminal deoxynucleotidyl
transferase (TdT)-mediated dUTP Nick End Labeling"). TUNEL utføres ved å nedsenke snittene i TdT buffer (30 mM Tris-HCl, pH 7,2, 140 nM natriumkakodylat, 1 mM koboltklorid), og med påfølgende tilsetning av TdT (GIBCO BRL, Grand Island, NY) og biotinylert dUTP (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). Reaksjonen termineres ved å nedsenke snittene i TB buffer (300 mM natriumklorid, 30 nM natriumcitrat). Deretter behandles prøvene med peroksydasemerket streptavidin og visualiseres ved anvendelse av VECTASTAIN ABC kit (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA). For immunhistokjemi, blokkeres snittene med 4 % skummmetmelk i 30 min. ved romtemperatur, inkuberes deretter med biotinylerte mAb'er som er spesifikke for mus CD3, B220, CD80 eller CD95 (Fas). Disse antistoffer er tilgjengelige fra Pharmingen (San Diego, CA).
b. Behandling av pasienter med revmatoid artritt med en genterapivektor som koder for en aksessorisk molekyl ligand,
Fas-ligand
Fas-ligand kanditatstrukturer identifisert til å ha mulig terapeutisk fordel anvendes i prosedyrer på mennesker for å behandle RA. Prosedyrene omfatter enten in vivo eller ex vivo metoder for å avlevere Fas-ligand strukturene. Videre avleveres Fas-ligand strukturene eventuelt ved enten virale eller ikke-virale metoder. Oversikt over terapeutiske strategier er beskrevet i det etterfølgende.
En ex vivo terapi er lignende en prosedyre beskrevet for intra-artikulær transplantasjon av autologe synoviocytter retroviralt transdusert til å syntetisere interleukin-1 reseptorantagonist (Evan, Christopher et al., Clinical Trial to Assess the Safety, Feasibility, and Efficacy of Transferring a Potentially Anti-Arthritic Cytokine Gene to Human Joints with Rheumatoid arthritis, Human Gene Therapy, vol. 7, 1261-1280).
I denne prosedyre, etter klinisk diagnose av RA, høstes synovium under total ledd-replassering. Synoviocyttene re-isoleres og ekspanderes, transduseres eller transfekteres deretter med heterolog Fas-ligand inn i synoviocytter (via retrovirus, adenovirus, naken DNA osv.) De gen-modifiserte synoviocytter re-injiseres deretter inn i pasienten som måles og testes for forbedring av RA-assosierte symptomer, og for ekspresjon og funksjon av Fas-liganden i modifiserte synoviocytter.
I en annen ex vivo prosedyre blir en allogeneisk immortalisert cellelinje som stabilt uttrykker den heterologe Fas-ligand administrert til RA-pasienten. Med denne prosedyre konstrueres en stabil immortalisert cellelinje som uttrykker Fas-ligand (innført ved transfeksjon av genet inn i cellen ved ikke-virale metoder, som elektroporering eller ved viral transduksjon av genet inn i cellen). Den modifiserte cellelinje injiseres inn i pasienten som måles og testes for forbedring av RA-assosierte symptomer, og for ekspresjon og funksjon av hFas-liganden i modifiserte synoviocytter.
En in vivo basert terapi er lignende i konsept til forbedringen av kollagen-indusert artritt ved anvendelse av en murin
Fas-ligand adenovirusgenterapivektor beskrevet i Zhang et al., J. Clin. Invest. 100:1951-1957 (1997). I vår bruk av en slik fremgangsmåte, blir avlevering av hFas-ligand strukturen eller kimær AFasL direkte til leddene i RA-pasienter utført ved
anvendelse av enten virale eller ikke-virale metoder. I denne metode blir Fas-ligand strukturen (f.eks. hFas-ligand
adenovirus) injisert direkte inn i synovium. Pasienter måles og testes for forbedring av RA-assosierte symptomer så vel som biologisk testing for ekspresjon og funksjon av hFas-liganden i modifiserte synoviocytter.
Claims (9)
1. Kimært nukleinsyremolekyl,
karakterisert vedat det omfatter et første polynukleotid som koder for et domene bestående av domene III av CD40 ligand, hvori domenet III er hybridiserbart under lavstringensbetingelser til en nukleotidsekvens inneholdt i, og valgt fra, gruppen som består av SEQ ID NO 1, 2 og 8, og hvori domenet III mangler et matriks metalloproteinase (mmp) spaltingssete, og et andre polynukleotid som koder for domene IV av TNF-a som er hybridiserbart under lavstringensbetingelser til en nukleotidsekvens inneholdt i, og valgt fra, gruppen som består av SEQ ID NO 9, 11, 12 og 21.
2. Kimært nukleinsyremolekyl som angitt i krav 1, hvori domenet III kodes for av en nukleotidsekvens inneholdt i, og valgt fra, gruppen som består av SEQ ID NO 1, 2 og 8, hvori molekylet er modifisert for å deletere nukleotidsekvensen som koder for et mmp spaltingssete i henholdsvis human, murin eller bovin CD40 ligand domene III.
3. Kimært nukleinsyremolekyl som angitt i krav 1, hvori TNF-a
polynukleotidet som koder for domene IV av TNF-a er modifisert for å deletere nukleotidsekvensen som koder for et mmp spaltingssete.
4. Kimært nukleinsyremolekyl,
karakterisert vedat det omfatter et første polynukleotid som koder for et domene bestående av domene III av CD40 ligand, hvori domenet III er hybridiserbart under lavstringensbetingelser til en nukleotidsekvens inneholdt i, og valgt fra, gruppen som består av SEQ ID NO 1, 2 og 8, og hvori domenet III mangler et matriks metalloproteinase (mmp) spaltingssete, og et andre polynukleotid som koder for domene IV av TNF-|3 som er hybridiserbart under lavstringensbetingelser til en nukleotidsekvens inneholdt i, og valgt fra, gruppen som består av SEQ ID NO 10 og 11.
5. Kimært nukleinsyremolekyl som angitt i krav 4, hvori domenet III kodes for av en nukleotidsekvens inneholdt i, og valgt fra, gruppen som består av SEQ ID NO 1, 2 og 8, hvori molekylet er modifisert for å deletere nukleotidsekvensen som koder for et mmp spaltingssete i henholdsvis human, murin eller bovin CD40 ligand domene III.
6. Kimært nukleinsyremolekyl som angitt i krav 1, hvori domenet III kodes for av en CD40 nukleotidsekvens inneholdt i, og valgt fra, gruppen som består av SEQ ID NO 1, 2 og 8, og domenet IV kodes for av en TNF-a nukleotidsekvens inneholdt i, og valgt fra, gruppen som består av SEQ ID NO 9, 11, 12 og 21 eller en TNF-|3 nukleotidsekvens inneholdt i, og valgt fra, gruppen som består av SEQ ID NO 10 og 11.
7. Kimært nukleinsyremolekyl som angitt i krav 5, hvori TNF-(3 polynukleotidet som koder for domene IV av TNF-(3 er modifisert for å deletere nukleotidsekvensen som koder for et mmp spaltingssete .
8. Rekombinant ekspresjonsvektor,karakterisert vedat den omfatter det kimære nukleinsyremolekyl som angitt i krav 1 eller 4.
9. Vertcelle,
karakterisert vedat den er transfektert med den rekombinante ekspresjonsvektoren som angitt i krav 8.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US3214596P | 1996-12-09 | 1996-12-09 | |
US08/982,272 US7070771B1 (en) | 1996-12-09 | 1997-12-01 | Methods of expressing chimeric mouse and human CD40 ligand in human CD40+ cells |
PCT/US1997/022740 WO1998026061A2 (en) | 1996-12-09 | 1997-12-08 | Expression vectors containing accessory molecule ligand genes and their use for immunomodulation and treatment of malignancies and autoimmune disease |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO20074906L NO20074906L (no) | 1999-08-09 |
NO331434B1 true NO331434B1 (no) | 2011-12-27 |
Family
ID=26708033
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO19992756A NO327411B1 (no) | 1996-12-09 | 1999-06-07 | Polynukleotid som koder for en kimaer CD40 ligand. |
NO20074906A NO331434B1 (no) | 1996-12-09 | 2007-09-27 | Kimaert nukleinsyremolekyl, rekombinant ekspresjonsvektor og vertcelle |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO19992756A NO327411B1 (no) | 1996-12-09 | 1999-06-07 | Polynukleotid som koder for en kimaer CD40 ligand. |
Country Status (16)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US7070771B1 (no) |
EP (4) | EP0948614B1 (no) |
JP (1) | JP4015201B2 (no) |
CN (1) | CN1221662C (no) |
AT (2) | ATE547524T1 (no) |
AU (1) | AU5795798A (no) |
BR (1) | BR9714004A (no) |
CA (2) | CA2707726C (no) |
DE (1) | DE69739220D1 (no) |
DK (1) | DK0948614T3 (no) |
ES (1) | ES2321246T3 (no) |
IL (3) | IL130247A0 (no) |
NO (2) | NO327411B1 (no) |
NZ (1) | NZ336092A (no) |
PT (1) | PT948614E (no) |
WO (1) | WO1998026061A2 (no) |
Families Citing this family (24)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7070771B1 (en) * | 1996-12-09 | 2006-07-04 | Regents Of The University Of California | Methods of expressing chimeric mouse and human CD40 ligand in human CD40+ cells |
WO2000063395A1 (en) * | 1999-04-16 | 2000-10-26 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Nucleic acids encoding cd40/cd40l chimeric polypeptides, methods for their production and uses thereof |
GB9917180D0 (en) * | 1999-07-23 | 1999-09-22 | Univ Sheffield | Cell surface receptor |
GB0025307D0 (en) * | 2000-10-16 | 2000-11-29 | Celltech Chiroscience Ltd | Biological products |
WO2002036769A2 (en) * | 2000-10-31 | 2002-05-10 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Nucleic acids encoding cd40/cd40l chimeric polypeptides, methods for their production and uses thereof |
US7786282B2 (en) * | 2001-12-06 | 2010-08-31 | The Regents Of The University Of California | Nucleic acid molecules encoding TNF-α ligand polypeptides having a CD154 domain |
EP1478390A2 (en) * | 2002-02-25 | 2004-11-24 | Isis Innovation Limited | Novel complexes for inducing an immune response |
US7495090B2 (en) * | 2002-05-23 | 2009-02-24 | The Regents Of The University Of California | Nucleic acids encoding chimeric CD154 polypeptides |
US7435596B2 (en) | 2004-11-04 | 2008-10-14 | St. Jude Children's Research Hospital, Inc. | Modified cell line and method for expansion of NK cell |
US20130266551A1 (en) | 2003-11-05 | 2013-10-10 | St. Jude Children's Research Hospital, Inc. | Chimeric receptors with 4-1bb stimulatory signaling domain |
US20080044393A1 (en) * | 2004-07-16 | 2008-02-21 | White Robert L | Retinal dystrophin transgene and methods of use thereof |
WO2008109825A2 (en) * | 2007-03-08 | 2008-09-12 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Inducing immune-mediated tumor cell death |
US20100050276A1 (en) * | 2008-08-22 | 2010-02-25 | Brown University | Transgenic non-human animal models of apoptosis-mediated conditions |
EP2788021B1 (en) | 2011-12-09 | 2017-01-18 | Bavarian Nordic A/S | Poxvirus vector for the expression of bacterial antigens linked to tetanus toxin fragment c |
SG11201502941VA (en) * | 2012-10-17 | 2015-05-28 | Vascular Biogenics Ltd | Treatment methods using adenovirus |
WO2015148879A1 (en) * | 2014-03-27 | 2015-10-01 | The Regents Of The University Of Michigan | Cancer immunotherapy compositions and methods |
CA2948462A1 (en) | 2014-05-15 | 2015-11-19 | National University Of Singapore | Modified natural killer cells and uses thereof |
CN105567679B (zh) * | 2014-10-10 | 2019-07-05 | 深圳市北科生物科技有限公司 | 可分泌型trail蛋白构建物和表达载体 |
WO2017079297A1 (en) | 2015-11-02 | 2017-05-11 | Memgen Llc | Methods for treatment of cancer |
US11298420B2 (en) | 2016-12-21 | 2022-04-12 | Memgen, Llc | Armed oncolytic viruses |
CA3056439A1 (en) | 2017-03-27 | 2018-10-04 | National University Of Singapore | Truncated nkg2d chimeric receptors and uses thereof in natural killer cell immunotherapy |
WO2020180882A1 (en) | 2019-03-05 | 2020-09-10 | Nkarta, Inc. | Cd19-directed chimeric antigen receptors and uses thereof in immunotherapy |
CN112725379A (zh) * | 2021-01-27 | 2021-04-30 | 上海南方模式生物科技股份有限公司 | 人源化cd40基因改造动物模型的构建方法及应用 |
US11585330B1 (en) * | 2021-09-29 | 2023-02-21 | Halliburton Energy Services, Inc. | Flow control for geothermal well |
Family Cites Families (35)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ATE107362T1 (de) | 1986-06-20 | 1994-07-15 | Dainippon Pharmaceutical Co | Polypeptid-mutanten des menschlichen tnf und für diese mutanten codierende dns. |
US5095096A (en) | 1987-05-29 | 1992-03-10 | Sagami Chemical Research Center | Fused protein comprising lymphotoxin |
JP2930713B2 (ja) | 1989-08-16 | 1999-08-03 | カイロン コーポレイション | タンパク質ホルモン形成の抑制用の組成物およびその使用法 |
US5519119A (en) | 1990-09-21 | 1996-05-21 | Ishihara Sangyo Kaisha Ltd. | Muteins of TNF pharmaceutical compositions and a method of making |
CA2055168A1 (en) | 1990-11-21 | 1992-05-22 | Walter Fiers | Tnf-muteins |
ES2198025T3 (es) | 1991-10-25 | 2004-01-16 | Immunex Corporation | Anticuerpos contra cd40-l. |
EP0670730B1 (en) | 1992-03-30 | 2003-06-04 | Immunex Corporation | Fusion protein comprising two tumor necrosis factor receptors |
SK376492A3 (en) | 1992-04-02 | 1995-06-07 | Hoffmann La Roche | Tnf - muteins and method of their production |
CA2131003A1 (en) | 1992-05-26 | 1993-12-09 | Raymond G. Goodwin | Novel cytokine that binds cd30 |
AU5098493A (en) | 1992-08-21 | 1994-03-15 | Schering Corporation | Cd40 ligand, anti cd40 antibodies, and soluble cd40 |
WO1994004680A1 (en) | 1992-08-21 | 1994-03-03 | Schering Corporation | Human interleukin-13 |
US5540926A (en) | 1992-09-04 | 1996-07-30 | Bristol-Myers Squibb Company | Soluble and its use in B cell stimulation |
US5573924A (en) | 1992-09-08 | 1996-11-12 | Immunex Corporation | CD27 ligand |
CA2153806C (en) | 1993-01-22 | 2005-11-08 | Melanie K. Spriggs | Detection and treatment of mutations in a cd40 ligand gene |
US5565321A (en) | 1993-01-22 | 1996-10-15 | Immunex Corporation | Detection of mutations in a CD40 ligand gene |
US5830463A (en) | 1993-07-07 | 1998-11-03 | University Technology Corporation | Yeast-based delivery vehicles |
US5861310A (en) * | 1993-11-03 | 1999-01-19 | Dana-Farber Cancer Institute | Tumor cells modified to express B7-2 with increased immunogenicity and uses therefor |
JPH08127594A (ja) | 1993-11-10 | 1996-05-21 | Mochida Pharmaceut Co Ltd | Fas抗原に結合する新規蛋白質およびそれをコードするDNA |
AU1059095A (en) * | 1993-11-24 | 1995-06-13 | Australian National University, The | Treatment of viral disease with cd40l peptide |
JPH09507074A (ja) | 1993-12-23 | 1997-07-15 | イミュネックス・コーポレーション | Cd40を発現する腫瘍細胞を特徴とする疾患の予防又は治療方法 |
DE69535719T2 (de) | 1994-01-07 | 2009-03-19 | Mochida Pharmaceutical Co. Ltd. | Fas-antigenbindender ligand |
MX9605088A (es) | 1994-04-28 | 1997-08-30 | Boehringer Ingelheim Pharma | Metodos para proliferar y diferenciar celulas b y sus usos. |
US5606023A (en) | 1994-05-24 | 1997-02-25 | Thomas Jefferson University | Mutant tumor necrosis factor proteins |
US5759536A (en) | 1994-05-27 | 1998-06-02 | University Technology Corporation | Use of fas ligand to supress T-lymphocyte-mediated immune responses |
BR9508419A (pt) | 1994-07-22 | 1997-11-18 | Hoffmann La Roche | Composições farmacêuticas compreendendo uma proteina de ligação de tnf quinerica |
GB9425060D0 (en) | 1994-12-13 | 1995-02-08 | Univ Birmingham | Carcinoma treatment |
US5888764A (en) * | 1995-01-20 | 1999-03-30 | Uab Research Foundation | Human fas gene promoter region |
US6017527A (en) * | 1996-07-10 | 2000-01-25 | Immunex Corporation | Activated dendritic cells and methods for their activation |
US6544523B1 (en) | 1996-11-13 | 2003-04-08 | Chiron Corporation | Mutant forms of Fas ligand and uses thereof |
US7070771B1 (en) * | 1996-12-09 | 2006-07-04 | Regents Of The University Of California | Methods of expressing chimeric mouse and human CD40 ligand in human CD40+ cells |
US6016832A (en) * | 1997-04-16 | 2000-01-25 | Woodward Governor Company | Valve for controlling gas mass flow |
DE69841548D1 (de) | 1997-09-17 | 2010-04-22 | Mochida Pharm Co Ltd | Fas-liganden derivate |
US7786282B2 (en) * | 2001-12-06 | 2010-08-31 | The Regents Of The University Of California | Nucleic acid molecules encoding TNF-α ligand polypeptides having a CD154 domain |
US7495090B2 (en) * | 2002-05-23 | 2009-02-24 | The Regents Of The University Of California | Nucleic acids encoding chimeric CD154 polypeptides |
GB2392158B (en) * | 2002-08-21 | 2005-02-16 | Proimmune Ltd | Chimeric MHC protein and oligomer thereof |
-
1997
- 1997-12-01 US US08/982,272 patent/US7070771B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-12-08 AT AT09164341T patent/ATE547524T1/de active
- 1997-12-08 IL IL13024797A patent/IL130247A0/xx active IP Right Grant
- 1997-12-08 BR BR9714004-0A patent/BR9714004A/pt not_active IP Right Cessation
- 1997-12-08 EP EP97954089A patent/EP0948614B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-12-08 AT AT97954089T patent/ATE420956T1/de not_active IP Right Cessation
- 1997-12-08 ES ES97954089T patent/ES2321246T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-12-08 PT PT97954089T patent/PT948614E/pt unknown
- 1997-12-08 DE DE69739220T patent/DE69739220D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-12-08 CA CA2707726A patent/CA2707726C/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-12-08 CA CA2274498A patent/CA2274498C/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-12-08 EP EP10184082A patent/EP2287309A1/en not_active Withdrawn
- 1997-12-08 JP JP52695698A patent/JP4015201B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1997-12-08 DK DK97954089T patent/DK0948614T3/da active
- 1997-12-08 EP EP09164341A patent/EP2145958B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-12-08 AU AU57957/98A patent/AU5795798A/en not_active Abandoned
- 1997-12-08 EP EP06125424A patent/EP1806360A3/en not_active Ceased
- 1997-12-08 WO PCT/US1997/022740 patent/WO1998026061A2/en active Application Filing
- 1997-12-08 NZ NZ336092A patent/NZ336092A/en not_active IP Right Cessation
- 1997-12-08 CN CNB971816743A patent/CN1221662C/zh not_active Expired - Fee Related
-
1999
- 1999-06-02 IL IL130247A patent/IL130247A/en not_active IP Right Cessation
- 1999-06-07 NO NO19992756A patent/NO327411B1/no not_active IP Right Cessation
-
2004
- 2004-12-17 US US11/015,117 patent/US7524944B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2006
- 2006-09-26 IL IL178306A patent/IL178306A0/en not_active IP Right Cessation
-
2007
- 2007-09-27 NO NO20074906A patent/NO331434B1/no not_active IP Right Cessation
-
2009
- 2009-02-13 US US12/371,188 patent/US7906638B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
NO331434B1 (no) | Kimaert nukleinsyremolekyl, rekombinant ekspresjonsvektor og vertcelle | |
CA2486918C (en) | Novel chimeric cd154 | |
KR100689739B1 (ko) | 단백질 및 펩티드 항원의 면역원성을 증강시키는 Fc융합 단백질 | |
CA2321161C (en) | Compositions containing an ox-40 receptor binding agent or a nucleic acid encoding the same and methods for enhancing antigen-specific immune response | |
US20040209836A1 (en) | Induced activation in dendritic cell | |
JPH09503911A (ja) | ヒトh4−1bb受容体 | |
NZ510508A (en) | Method for down-regulating osteoprotegerin ligand (OPGL) by enabling the production of antibodies against OPGL to treat osteoporosis | |
WO1998026061A9 (en) | Expression vectors containing accessory molecule ligand genes and their use for immunomodulation and treatment of malignancies and autoimmune disease | |
JP4610194B2 (ja) | 新規キメラtnfリガンド | |
KR20060003903A (ko) | 사람 암배아 항원을 암호화하는 합성 유전자 및 이의 용도 | |
KR20220106775A (ko) | 암 치료를 위한 종양내 및/또는 정맥내 투여를 위한 재조합 mva 바이러스 | |
Wu et al. | Enhanced anti-tumor therapeutic efficacy of DNA vaccine by fusing the E7 gene to BAFF in treating human papillomavirus-associated cancer | |
US20050025754A1 (en) | Increased T-cell tumor infiltration by mutant light | |
AU781104B2 (en) | Novel expression vectors containing accessory molecule ligand genes and their use for immunomodulation and treatment of malignancies and autoimmune disease | |
MXPA99005326A (en) | Novel expression vectors containing accessory molecule ligand genes and their use for immunomodulation and treatment of malignancies and autoimmune disease | |
Class et al. | Patent application title: INDUCED ACTIVATION IN DENDRITIC CELLS Inventors: David Spencer (Houston, TX, US) David Spencer (Houston, TX, US) Brent Hanks (Houston, TX, US) Kevin Slawin (Houston, TX, US) | |
WO2005100558A1 (ja) | Cd40リガンドの変異体およびその使用 | |
ZA200508013B (en) | Synthetic gene encoding human carcinoembryonic antigen and use thereof |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM1K | Lapsed by not paying the annual fees |