NO327411B1

NO327411B1 - Polynukleotid som koder for en kimaer CD40 ligand.

Info

Publication number: NO327411B1
Application number: NO19992756A
Authority: NO
Inventors: Thomas J Kipps; Sanjai Sharma; Mark Cantwell
Original assignee: Univ California
Priority date: 1996-12-09
Filing date: 1999-06-07
Publication date: 2009-06-22
Also published as: PT948614E; EP0948614B1; US7906638B2; EP1806360A2; DK0948614T3; CA2707726A1; IL130247A0; CA2274498A1; US7070771B1; WO1998026061A2; CN1246892A; EP0948614A2; CN1221662C; NO20074906L; DE69739220D1; EP1806360A3; JP2001505782A; NZ336092A; EP2145958B1; NO992756D0

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører et polynukleotid som koder for en kimær CD40 ligand.

Oppfinnelsen vedrører også en vertcelle som er transfektert med det ovennevnte polynukleotid.

Oppfinnelsen vedrører også et genetisk konstrukt og et farmasøytisk preparat som begge omfatter det ovennevnte polynukleotid.

Oppfinnelsen vedrører også anvendelse av det ovennevnte polynukleot id.

Endelig vedrører oppfinnelsen et kimært CD40 ligand polypeptid.

Nye ekspresjonsvektorer som inneholder genet som koder for den ovennevnte ligand kan anvendes for immunmodulering, for forbedrede vaksinasjonsprosedyrer og for behandling av maligniteter og autoimmune sykdommer. Mere spesielt kan ekspresjonsvektorene anvendes for å behandle forskjellige neoplastiske eller maligne celler, og for å behandle autoimmun sykdom. Ligander med større stabilitet og økt funksjon er oppnådd ved den foreliggende oppfinnelse.

Levkemier, lymfomer, karsinomer' og andre maligniteter er vel kjent og beskrevet i f.eks. Harrison<1>s Principles of Internal Medicine, Wilson et al., eds., McGraw-Hill, New York,

s. 1599-1612. Disse maligniteter synes på en måte å ha unn-sluppet immunsystemets overvåkningsmekanismer som raskt og kontinuerlig eliminerer proliferative celler. Den nøyaktige mekanisme hvorved disse maligniteter unnslipper immunsystem-overvåkingen er ikke kj ent.

Noen av disse maligne immunsystemceller er maligne antigenpresenterende celler som ikke fungerer riktig innenfor immun-kaskaden. Neoplastiske B celler kan f.eks. ikke indusere til og med svake allogene eller autologe blandede lymfocytt-reaksjoner in vitro. Ytterligere bevis for at maligniteter overlever på grunn av svikt i immunbevoktningsmekanismen inkluderer den økte hyppighet av slike maligniteter i immun-kompromiterte individer, slik som allograft-resipienter og dem som mottar langtids-immunsupresjonsterapi. Videre er hyppigheten av disse maligniteter økt i pasienter med "Acquired Immune Deficiency Syndrome" (AIDS) og pasienter med primære immunsviktsyndromer, som X-koblet lymfopolyferativt syndrom eller Wiscott-Aldrich Syndrome (Thomas et al., Adv. Cancer Res. 57:329, 1991).

Immunsystemet fungerer normalt for å eliminerer maligne celler ved å gjenkjenne de maligne celler som fremmede celler og fjerne disse celler fra kroppen. En immunreaksjon, avhenger både av immunsystemets antistoffrespons og av den cellulære immunrespons i en pasient. Mere spesielt krever den cellulære immunrespons som virker til å gjenkjenne maligne celler som fremmede, et antall ulike celler av immunsystemet og interaksjon mellom disse celler. En immunreaksjon starter med en T lymfocytt (T celle) som på sin celleoverflate har T celle reseptoren. T cellen har også evnen til å uttrykke på sin overflate forskjellige aksessoriske molekyler som interagerer med et aksessorisk molekyl på B lymfocytten (B celle). Når T celle reseptoren i T cellen binder spesifikt til et fremmed antigen, slik som en malign celle, blir den aktivert og uttrykker den aksessoriske molekyl liganden, CD40 liganden, på sin celleoverflate. De aksessoriske cellemolekyl ligander er kun tilstede på de aktiverte T celler i en kort tidsperiode og fjernes raskt fra celleoverflaten. Etter at den aksessoriske cellemolekyl liganden er fjernet fra overflaten av den aktiverte T celle, er dens evne til å binde til B celler via den aksessoriske molekyl liganden ødelagt.

Når den er tilstede på overflaten av en aktivert T celle, kan den aksessoriske celle liganden bindes spesifikt til det aksessoriske cellemolekyl tilstede på B cellen. Denne spesifikke T-B celle interaksjon fører til at B og T cellen ko-stimulerende uttrykker overflateaksessorisk molekyl og cytokiner som resulterer i en immunaktivering som fører til cyto-lytiske T celler som spesifikt dreper og fjerner den maligne celle fra kroppen.

Interaksjonen med en aktivert T celle er ikke alene begrenset til B celler, man kan heller gjennomføres med en hvilken som helst celle som er i stand til å presenterer antigen overfor T cellen (en antigenpresenterende celle). Disse celler inkluderer B lymfocytt, makrofager, dendrittiske celler, monocytter, Lahgerhans celler, interdigitasjonsceller, follikulære dendrittiske celler eller Kupffer celler. Disse celler er alle kjent til å ha forskjellige aksessoriske molekyler på celleoverflaten som tillater dem å interagere med andre celler i immunsystemet. Disse antigenpresenterende celler har alle f.eks. det aksessoriske molekyl CD40 på deres celleoverflate. Tilstedeværelsen av disse aksessoriske molekyler tillater disse antigenpresenterende celler å 'binde spesifikt til komplementær aksessorisk molekyl ligand og således interagere med andre immunceller.

Et stort antall aksessoriske molekyl ligander er medlemmer av tumornekrosefaktor superfamilien. (Fanslow et al., Sem. Immun., 6:267-268 (19.94)). Genene for en rekke av disse aksessoriske molekyl ligander er blitt klonet og identifisert . Disse aksessoriske molekyl ligand gener koder for aksessoriske molekyler som har konfigurasjonen av type II membran proteiner og utviser varierende grad av homologi med andre aksessoriske molekyl ligand gener. F.eks. er de aksessoriske molekyl ligand genene som koder for både murin CD40 ligand og human CD40 ligand blitt isolert. Se Armitage et al., Nature, 357:80-82 (1992) og Hollenbaugh et al., EMBO J., 11:4313-4321 (1992).

CD40 og dets ligand, CD40 ligand er kritiske komponenter for en normal immunrespons. CD40 medierte signaler induserer immunlymfocytter til å proliferere og differensiere og bli potente antigenpresenterende celler. Maligne eller neoplastiske B celler er dårlige antigenpresenterende celler og er ikke i stand til å stimulere en kraftig allogeneisk blandet lymfocyttreaksjpn. Vellykkede kryssbindinger av CD40 molekylet på immunceller resulterer i en streng allogeneisk blandet lymfocyttreaksjon som foreslår en sterk immunreaksjon. Forskjellige oppløselige CD40 ligander eller antistoffer spesifikke for CD40 er blitt anvendt for eventuelt å tverrbinde .CD40. Disse oppløselige CD40 ligander og CD40 spesifikke antistoffer er ikke optimale for tverrbinding av CD40 molekyler på antigenpresenterende celler, og arbeider ikke så effektivt som CD40 ligand uttrykt på en cellemembran til å produsere sterk stimulering av antigenpresenterende celler. Disse metoder er også vanskelige å implementere fordi store mengder CD40 ligand strukturer eller antistoffer må isoleres, noe som er vanskelig og et tidkrevende arbeide. Andre strategier for å anvende CD40 ligand.i oppløsning eller som et membranbundet molekyl inkluderende transformasjon av fibroblaster med CD40 ligand for å produsere dyrkede celler som deretter anvendes til å presentere antigen, kan ikke underkastes in vivo humane kliniske prosedyrer.

CD95 (Fas) interaksjon med dets ligand (Fas-ligand eller FasL) virker til å begrense varigheten av immunresponsen og/eller levetiden av aktiverte lymfocytter. Apoptose indusert ved Fas-FasL binding tjener til å fjerne aktiverte selvreaktive lymfocytter. Problemer forårsaket ved endring av dette mønster er blitt demonstrert i dyr med defekter, i Fas<->Fas ligand interaksjoner. Mus med mutasjoner som inaktiverer CD95 eller FasL utvikler en rekke lidelser inkluderende autoimmun patologi som ligner den som man ser i pasienter med revmatoid artritt (RA) eller systemisk lupus. Zhang, et al., i J. Clin. Invest 100:1951-1957 (1997) viser at injeksjon av FasLrUttrykkende virus, inn i ledd hos mus med kollagen-indusert artritt, resulterer i apoptose av synovialceller og en lindring av artrittsymptomer. Ekspresjon av Fas ligand tillater fjerning av aktiverte celler som spiller en rolle i patogenesen av en autoimmun sykdom. Derfor vil en genterapi strategi for å introdusere FasL inn i leddene til pasienter med revmatoid artritt kunne fungere til å forbedre sykdoms-patologien ved at den fører til destruksjon av de infiltre-rende mononukleære celler.

Administrering av oppløslige aksessoriske molekyler og aksessoriske molekyl ligander er blitt vist til å trigge eller til å være assosiert med' negative fysiologiske effekter. Behandling av mus som har villtype CD40 reseptor ekspresjon med f.eks. oppløselig CD40L-CD8 fusjonsprotein resulterer i en pulmonal inflammatorisk respons. Dette ble ikke observert i mus hvor genet for CD4Q reseptoren var blitt slått ut. Disse forsøk, beskrevet i Wiley, J.A. et al., Journal of Immunology 158:2932-2938 (1997), understøtter in vitro data som foreslår at CD40 ligering kan resultere i inflammatoriske responser.

Direkte administrering av renset rekombinant oppløselig tumornekrosefaktor (enten a eller P) resulterer i sjokk og vevskade, som beskrevet i Tracey, K. J., og A. Cerami, Annu. Rev. Med. 45:491-503 (1994). Innen minutter etter akutt intravenøs eller intraarteriell administrering av TNF, følger et sjokksyndrom, vevskade, kapillær lekkasje, hypoksi, pulmonalt ødem og multippel organsvikt forbundet med høy mortalitet. Kronisk lav dose av TNF fører til anoreksi, vekt-tap, dehydrering og deplesjon av totalt protein og lipid i kroppen.

Oppløselig Fas ligand og reseptor er også blitt vist å være assosiert med vevsskade og andre negative virkninger. CD95, Fas reseptoren, er en mediator av apoptose. Fas ligand induserer apoptose ved å binde til Fas reseptor. Som vist i Galle, P.R., et al., J. Exp. Med. 182:1223-1230 (1995) resulterer administrering av et angonistisk anti-Fas antistoff i leverskade hos mus. Mus som fikk injisert intraperitonealt det agonistiske antistoffet døde innen noen få timer, og analyser viste at alvorlig leverskade ved apoptose var den mest sannsynlige dødsårsak.

Rollen til oppløselig Fas ligand (FasL) i patogenesen av systemisk vevskade ved agressivt lymfom er beskrevet i Sato, K. et al., British Journal of Haematology, 94:379-382 (1996). Funnene som er presentert i denne rapport indikerer at opp-løselig FasL er direkte assosiert med patogenesen av leverskade og pancytopeni.

CD27, reseptoren for den aksessoriske molekyl liganden, CD70, ble i en rapport av Oers, et al., i Blood 82:3430-3436 (1993) vist til å være assosiert med B celle maligniteter.

De ovennevnte funn kontraindikerte alle administreringen av oppløselige aksessoriske molekyl ligander, og fremhever behovet for terapier som øker nivåene av disse molekyler uten å resultere i økning av deres oppløselige former.

Til tross for den rike informasjon vedrørende aksessoriske molekyl ligand gener og deres ekspresjon på overflaten av forskjellige immunceller, er den nøyaktige mekanisme hvorved de aksessoriske molekyl ligand gener er regulert på antigenpresenterende celler fremdeles ikke kjent. Uten spesifikk kunnskap om reguleringen av ekspresjonen av gener for aksessorisk molekyl ligand på disse antigenpresenterende celler, har en endring av immunresponsen ved å variere ekspresjonen av et gen for aksessorisk molekyl ligand til nå ikke vært mulig. Uten noen spesifikk kunnskap med hensyn til hvordan man skal regulere ekspresjonen av et aksessorisk molekyl ligand gen på en antigenpresenterende celle er det ikke mulig å endre immunresponsen mot maligne celler. Der var således et behov for en metode for å øke ekspresjonen av et aksessorisk molekyl ligand gen på normale og maligne celler inkluderende antigenpresenterende celler.

Videre, uten evnen til å regulere ekspresjonen av aksessoriske molekyl ligander er det ikke mulig å endre immun-clearence av disse celler.

Den foreliggende oppfinnelse oppfyller disse behov ved å tilveiebringe et polynukleotid som kodér for en kimær CD40 ligand; en vertcelle; et genetisk konstrukt; et farmasøytisk preparat samt anvendelse av polynukleotidet slik de er definert med de i kravene anførte trekk. Nye ekspresjonsvektorer som inneholder kimære CD40 ligand gener og et farmasøytisk preparat som kan anvendes for å introdusere disse gener i normale og maligne antigenpresenterende celler og derved tillate endring av en immunrespons, behandlingen av autoimmune sykdommer og behandlingen av forskjellige neoplasier er beskrevet. Vektorer, inkluderende genterapivektorer som inneholder kimære CD40 ligand gener er også beskrevet. Disse vektorer inneholder også ytterligere genetiske elementer som promotere, enhancere, polyadenylen-signaler (3<1> ender), som tillater at vektoren vellykket kan plasseres inne i cellen for å lede ekspresjonen av det kimære CD40 ligand genet i en celle. Slike genterapivektorer er i stand til å transformere animalske celler direkte og derved introdusere det kimære CD40 ligand genet inn i cellene til dette dyr i en form som kan benyttes til å produsere kimære CD40 ligander inne i denne celle. - Funksjonen til en aksessorisk molekyl ligand kan modifiseres ved å endre halveringstiden til molekylet på celleoverflaten eller ved å endre nivået, av ekspresjon av dette molekyl på celleoverflaten. Oppfinnelsen tilveiebringer kimære CD40 ligander som er modifiserte for å forbedre stabiliteten av disse ligander på celleoverflaten. Slik økt stabilitet kan oppnås ved anvendelse av hvilken som helst av de metoder som er beskrevet i denne søknad inkluderende kimære molekyler og molekyler inn i hvilke mutasjoner er blitt innført i minst én lokalitet. Den foreliggende oppfinnelse ser også på økning av ekspresjonen av et slikt molekyl.

Aksessoriske molekyl ligand gener som inkluderer gener som koder for molekyler av tumornekrosefaktor (TNF) familien er også beskrevet heri. Molekylene som utgjør TNF familien inkluderer TNFa, TNFp, CD40 ligand, Fas ligand, CD70, CD30 ligand, 41BB ligand (4-1BBL), nervevekstfaktor og TNF-relatert apoptoseinduserende ligand (TRAIL). Andre kimære aksessoriske molekyl ligand gener beskrevet heri inneholder minst en del av et murint aksessorisk molekyl ligand gen sammen med deler av aksessoriske molekyl ligand gener avledet fra enten mus, mennesker eller andre arter. Enkelte aksessoriske molekyler -anvender murine CD40 ligand gener og kimære CD40 ligand gener inneholdende minst et segment av det murine CD40 ligand genet sammen med minst et segment av det humane CD4 0 ligand genet. Gener for kimær aksessorisk molekyl ligand hvor segmenter fra det aksessoriske molekyl ligand genet fra én art er blitt utvekslet med segmenter fra et andre aksessorisk molekyl ligand gen som eventuelt kan være fra en annen art er også beskrevet. Foretrukket, er de trans-membrane og cytoplasmiske domener av det murine CD40 ligand gen festet til de ekstracellulære domener av human CD40 ligand gen.

Den foreliggende oppfinnelse ser også på genterapivektorer som er i stand til direkte, å infisere den humane celle, pattedyrcelle, insektscelle eller annen celle. Anvendelse av slike genterapivektorer forenkler i stor grad insersjonen av et kimært CD40 ligand gen inn i disses celler. Genterapivektorene kan anvendes in vivo eller in vitro til å infisere den ønskede celle og er særlig anvendbare for å infisere maligne celler for å bevirke forlenget ekspresjon på høyt nivå av en fysiologisk kimær CD40 ligand..

Den foreliggende oppfinnelse betrakter også animalske celler, pattedyrceller og humane celler som inneholder en genterapivektor som inkluderer et kimært CD40 ligand gen og tilstrekkelig genetisk informasjon til å uttrykke denne liganden inne i denne celle. Humane neoplastiske antigenpresenterende celler som inneholder genterapivektorer eller som inneholder et kimært CD4 0 ligand gen sammen med en promoter og 3' ende region er foretrukket.

Den foreliggende oppfinnelse betrakter også humane celler og humane neoplastiske celler som inneholder en genterapivektor som inkluderer et kimært CD40 molekyl ligand gen. Bakterie-celler eller animalske celler som inneholder kimære CD40 ligand gener, genterapivektorer,.vektorer og et kimært CD40 ligand gen sammen med en heterolog promoter, enhancer eller en polyadenyleringssekvens betraktes også.

Metoder for å endre immunresponsen i en human pasient eller immunreaktiviteten av humane celler in vivo ved å innføre et. gen som koder for et aksessorisk molekyl ligand gen i de humane celler slik at denne aksessoriske molekyl liganden uttrykkes på overflaten av disse humane celler er også beskrevet, som inkluderer innføringen av det aksessoriske molekyl ligand genet som en del av en genterapivektor eller i assosiasjon med en heterolog eller nativ promoter, enhancer eller polyadenyleringssignal. Innføring av Fas ligand gener og kimære Fas ligand gener, konstruert som sett på i det foregående for CD40, i humane celler for å endre deres immunreaktivitet er også beskrevet. Metoder hvor slike aksessoriske molekyl ligand gener innføres i celler som har det aksessoriske molekyl hvortil den aksessoriske molekyl liganden binder på overflaten av cellen inn i hvilken det aksessorisk molekyl ligand genet er innført, er også

. beskrevet.

Endring av immunreaktivitet kan anvendes på alle typer humane, animalske og murine celler inkluderende humane neoplastiske celler som humane lymfomer, levkemi og andre maligniteter. Foretrukket innføres genet iflge oppfinnelsen som koder for den kimære CD40 liganden i potensielle antigenpresenterende celler av en human pasient eller celle som kan stimulere "bystanding" antigenpresenterende celler. Slike antigenpresenterende celler inkluderer monocytter, makrofager, B celler, Langerhans<1> celler, interdigitasjonsceller, follikulære dendrittiske celler, Kupffer celler og lignende. De forskjellige antigenpresenterende celler kan være tilstede som del av en kjent malignitet i en human pasient slik som levkemier, lymfomer, akutt monocyttlevkemi (AML), kronisk lymfocyttlevkemi (CLL), akutt myelomonocyttlevkemi (AMML), kronisk myelpgen eller kronisk myelomonocyttlevkemi (CMML) og vil således inkludere alle tumorer av en hvilken som helst celle i stand til å presentere antigen mot det humane eller animalske immunsystem eller i stand til å stimulere "bystanding" antigenpresenterende celler. Immunsystemet kan moduleres ved å introdusere gener som koder for et kimært CD40 ligand gen ifølge oppfinnelsen i en rekke ulike, celler funnet i en pasient inkluderende muskelceller, hudceller, stromaceller, bindevevceller, fibroblaster og lignende.

For å behandle neoplasier i enten en human pasient eller i en animalsk pasient kan de neoplastiske celler fra den humane eller animalske pasient foretrukket isoleres og deretter innføres, i disse isolerte celler, det genet som koder for den kimære CD40 liganden eller den kimære CD40 liganden slik at molekylet uttrykkes på celleoverflaten av disse neoplastiske celler eller andre somatiske celler. De neoplastiske celler føres deretter tilbake i den humane eller animalske pasient og kan deretter delta i en økt immunrespons.

Ko-infeksjon eller ko-introduksjon av det kimære CD40 ligand genet ifølge oppfinnelsen sammen med et gen som koder for et tumor- eller karsinom-spesifikt antigen kan gjennomføres. Denne kombinasjon av molekyler uttrykkes deretter på overflaten av de neoplastiske celler og når disse celler innføres i pasienten, fører dette til hurtig immunrespons som resulterer i ødeleggelsen av disse celler.

Genterapivektoren eller annen vektor som bærer genet for den kimære CD40 liganden ifølge oppfinnelsen kan innføres direkte i tumoren eller tumorleiet til en pasient. Ved innføring i tumorleiet til en pasient, vil genterapivektoren eller annen vektor gå inn i cellene som er tilstede i tumoren eller tumorleiet og deretter uttrykke det kimære CD40 ligand genet på overflaten av disse.celler. Disse celler er deretter i stand til fullstendig å delta i den humane eller animalske immunrespons.

Immunresponsen overfor en vaksine kan økes. Et dyr kan vaksineres mot en forhåndsbestemt organisme eller antigen ved å administrere til dette dyr en vaksine som har en genetisk vektor som inneholder et.kimært CD40 ligand gen ifølge oppfinnelsen. Et dyr kan også vaksineres ved å administrere to separate genetiske vektorer, en som inneholder antigenene 'fra organismen mot hvilken immunitet er ønskelig ved å isolere cellene fra måldyret og bringe i kontakt, med disse celler, en vektor som koder for minst ett antigen fra en forhåndsbestemt organisme slik at antigenet uttrykkes ved hjelp av cellene, og også bringe disse cellene i kontakt med en annen vektor som uttrykker det kimære CD40 ligand genet på overflaten av dyrets antigenpresenterende celler. Sammen danner disse to separate vektorer en vaksinasjon som er mye sterkeré og som har en lengere varighet enn vaksinasjon med antigen alene.

En vaksine kan anvendes for vaksinasjoner som er utformet til å gi immunitet mot et virus, en celle, en bakterie, et hvilket, som helst protein eller en sopp. Denne vaksine kan også anvendes for å immunisere mot forskjellige karsinomer og neoplasier. I disse utførelsesformer blir tumorantigenet mot hvilket immunitet er ønskelig, innført i dyret sammen med den genetiske vektor som inneholder det kinære CD40 ligand genet ifølge oppfinnelsen.

Artritt kan behandles ved anvendelse av en genterapivektor som koder for en kimær CD40 ligand. Anvendelse av Fas ligand molekylet i forbindelse med artritt hvor ekspresjonen av Fas ligand aktivitet er blitt økt i leddet og/eller hvor stabiliteten av Fas ligand aktivitet på celler i leddet er økt er også beskrevet. Artritt kan også behandles ved anvendelse av kimære CD40 ligander og kimære CD40 ligand gener. Både ex vivo terapi og in vivo terapi av artritt. ved anvendelse av ekspresjonsvektorer sammen med Fas liganden og modifiserte versjoner av dette molekylet inkluderende kimære molekyler er beskrevet.

Kort beskrivelse av tegningene

Figur 1. Figur 1 er et diagram som viser en rekke gener for aksessoriske molekyl ligand og domener I-IV av disse gener som utledet fra sekvens data. Figur 2. Figur 2 er et diagram som viser eksempler på kimære aksessoriske molekyl ligand gener. Domenene avledet, fra den murine aksessoriske modul er skyggelagt. Figur 3. Figur 3 viser mengden av enten mus eller human CD40 ligand funnet på overflaten av Hela eller CLL celler infisert med genterapivektorer. som inneholder genene som koder for disse molekyler. Figur 3A viser ikke-infiserte Hela celler (skyggelagt) og Hela celler som er infisert med en genterapivektor som koder for murin CD40 ligand. Figur 3B viser ikke-infiserte Hela celler (skyggelagt) og Hela celler som er infisert med en gentrapivektor som koder for human CD40 ligand. Figur 3C viser ikke-infiserte CLL celler (skyggelagt) og CLL celler som er.infisert med en genterapivektor som koder for murin CD40 ligand. Figur 3D viser ikke-infiserte CLL celler (skyggelagt) og CLL celler infisert med en genterapivektor som koder for human CD40 ligand. Figur 4. Figur 4 viser histogrammer av den økte ekspresjon av CD54 (figur 4B) og CD80 (figur 4D) og CLL celler inn i hvilke en genterapivektor som inneholder genet for aksessorisk molekyl ligand (murint CD40 ligand gen) er innført. Den skyggelagte kurven indikerer kontrollmerking i FACS anlyse og den åpne kurve indikerer merking med monoklonale antistoffer som er immunspesifikke for enten CD54 (figur 4A og 4B) eller CD80 (figurene 4C og 4D). Figur 5. Figur 5 viser celleproliferasjonen som målt ved <3>H-TdR innlemmelse av allogeneiske T celler som svar på forskjellige stimuleringsregimer. CLL cellene som inneholder en genterapivektor som uttrykker et aksessorisk molekyl ligand gen (det murine CD40 ligand gen) ble innført, og stimulerer allogeneiske T celler til å proliferere. Figur 6. Figur 6 viser produksjon av gamma interferon (IFNg) ved allogeneiske T celler stimulert med CLL celler som inneholder et aksessorisk molekyl ligand gen. Figur 7. Figur 7 viser behandlingen av en neoplasi i et dyr ved anvendelse av en genterapivektor inneholdende et gen for aksessorisk molekyl ligand .ifølge oppfinnelsen. De åpne firkanter viser mus immunisert med neoplastiske celler som ikke uttrykker en aksessorisk molekyl ligand ifølge oppfinnelsen.

Mus immunisert med neoplastiske celler som uttrykker en aksessorisk molekyl ligand i henhold til oppfinnelsen er vist som den horisontale linje på toppen av figuren og viser ingen dødelighet. Figur 8. Figur 8 viser produksjonsnivåene og stabiliteten av CD40 ligand og CD40 ligand transkripter i CLL (øvre kurve) og mononukleære celler fra normalt blod (nedre kurve). Figur 9. Figur 9 viser tidsforløpet av transgenekspresjon i CLL B celler infisert med den aksessoriske molekyl liganden (CD4 0 ligand). MFIR (betyr gjennomsnittlig fluorescens-' intensitetsforhold), sammenligner fluorescensintensiteten av CD19<+> CLL celler merket med PE-merkede CD40 ligander versus de samme merket med et PE-merket isotype kontroll mAb i hvert tidspunkt, her representert ved de lukkede sirkler som er forbundet ved faste linjer i henhold til den skala som er tilveiebragt på ordinaten på venstre side. Figur 10. Figur 10 viser forandringer i overflateantigen-fenotypen av CLL B celler infisert med en genterapivektor som inneholder en aksessorisk molekyl ligand, CD40 ligand. De skyggelagte histogrammene representerer merking av ikke-infiserte celler (tynne linjer) merket med ikke-spesifikt kontrollantistoff, de åpne histogrammer som er trukket med tykke linjer representerer ikke-infiserte CLL celler som er merket med FITC-konjugert spesifikk mAb, og de åpne histogrammer som er trukket med tykke linjer (merket CD154-CLL) representerer CLL celler som er infisert med genterapivektoren for aksessorisk molekyl ligand og merket med FITC-konjugert spesifikk mAb. Figur 11. Figur 11 viser nivåer av CD27 produsert i CLL celler infisert med en genterapivektor som inneholder en aksessorisk molekyl ligand. Figur 11A viser at CD40L-infiserte CLL (CD154-CLL) celler uttrykker reduserte nivåer av overflate CD27. Åpne histogrammer representerer henholdsvis merking av ikke-infiserte celler (tynne linjer) eller infiserte CLL (tykke linjer) med FITC-konjugert aCD27 mAb. Figur 11B viser produksjon av oppløselig form av CD27 ved CLL B celler. Figur 12. Figur 12 viser allogeneiske T celle responser indusert ved CLL celler infisert med en genterapivektor som inneholder en aksessorisk molekyl ligand (CD40 ligand, også betegnet CD154). Figur 12A indikerer konsentrasjon av IFNg i supematantene etter stimulering av allogeneiske T celler med CLL celler som inneholder den aksessoriske molekyl liganden. Figur 12B viser celleproliferasjon, som vurdert ved innlemmelse av <3>H-thymidin. Figurer 12C og 12D viser sekundære allogeneiske T celle responser indusert ved CLL inneholdende den aksessoriske molekyl liganden. Figur 13. Figur 13 viser autologe T celle responser indusert ved CLL B celler inneholdende den aksessoriske molekyl liganden, CD40 liganden eller CD154, og kontroller. Figur 13A viser innlemmelsene av <3>H-thymidin ved autologe T celler ko-dyrket med CLL cellene. Figur 13B viser nivåene av human IFNg dannet ved autologe T celler ko-dyrket med CLL cellene. I figur 13C er CTL aktiviteten av autologe T celler indusert ved CLL B celler inneholdende den aksessoriske molekyl liganden, fremstilt grafisk. Figur 14. Figur 14 viser spesifisiteten av CTL for autologe CLL B celler. IFNg konsentrasjon ble vurdert i supernatantene etter 48 timers dyrking (figur 14A) og cytolytisk aktivitet ble vurdert etter 3 timers dyrking (figur 14B). I figur 14C ble mAb tilsatt til de autologe levkemi målceller før CTL analysen. Figur 15. Figur 15 viser at intercellulær stimulering spiller en rolle i produksjonen av fenotypiske forandringer observert i CLL celler som uttrykker den aksessoriske molekyl liganden. I figur 15A er effekten av kulturdensiteten på den induserte ekspresjon av CD54 og CD80 etter infeksjon med en genterapivektor som inneholder den aksessoriske molekyl liganden (CD40 liganden, CD154) vist. Skyggelagte histogrammer representerer merking av levkemi B celler med et FITC-konjugert isotype

kontroll mAb. Åpne histogrammer representerer CD154-CLL B celler, dyrket ved høy og lav densitet (indikert ved piler), og merket med et FITC-konjugert mAb som er spesifikk for CD54 eller CD80. Figur 15B viser inhibering av CD154-CLL celle-aktivering ved anti-CD154 mAb. Figurene 15C og 15D angir ekspresjon av immunaksessoriske molekyler på "bystander" ikke-infiserte CLL B celler indusert ved CLL celler som uttrykker den aksessoriske molekyl liganden. Skyggelagte histogrammer representerer merking med PE-konjugert isotype kontroll mAb.

Fiaur 16. Figur 16 viser at vektoren som koder for en aksessorisk molekyl ligand øker immuniseringen mot P-gal i mus. Figur 16A viser at mus som mottok intramuskulære injeksjoner av pCD40L vektoren produserte signifikant mer antistoffer mot P-gal enn det mus gjorde som var injisert med enten den ikke-modifiserte pcDNA3 vektoren eller pCD40L. Figur 16B, ELISA analyser av seriefortynninger av serum samlet på dag 28, viste at mus som var ko-injisert med placZ og pCD40L hadde et åtte-ganger høyere gjennomsnittlig titer av anti-p-gal antistoffer ved dag 28 enn mus som var behandlet med placZ + pcDNA3. Figur 17. Figur 17 viser analyse av IgGx og IgG2a immun-responsene mot intramuskulære plasmid DNA immuniseringer med og uten en vektor, pCD40L, som koder for en aksessorisk molekyl ligand. IgG2a anti-p-gal antistoffet er dominerende i forhold til IgG^L underklasse antistoffer i serum fra mus som er injisert med enten placZ og pcDNA3 eller placZ og pCD40L. I motsetning til dette utviklet BALB/c mus som er injisert med P-gal protein hovedsakelig IgG-L anti-p-gal antistoff, og ingen detekterbare IgG2a anti-p-gal antistoffer. Figur 18. Figur 18 viser sammenligningen mellom injeksjon av mus med en vektor, pCD40L, som koder for en aksessorisk molekyl ligand, på de samme og ulike steder som placZ. Adjuvanseffekt av pCD40L krever ko-injeksjon med placZ i det samme sted. Figur 19. Figur 19 viser at ko-injeksjon inn i dermis av en vektor som koder for en aksessorisk molekyl ligand, pCD40L, med placz øker IgG anti-p-gal responsen i BALB/c mus. Figur 20. Figur 2 0 viser at en vektor som koder for en aksessorisk molekyl ligand, pCD40L, øker den evne som placz har til å indusere CTL som er spesifikk for syngeneiske P~ gal-uttrykkende målceller. Splenocytt-effektor celler, som er tatt fra mus som har mottatt injeksjoner av placz og pCD40L, lyserte spesifikt signifikant flere celler enn splenocytter fra mus gjorde som mottok kontrollinjeksjoner. Figur 21. Figur,21 viser nedmodulering av human. CD4OL, men. ikke murin CD40L, i lungetumorcellelinjer som uttrykker CD40. Figur 22. Figur 22 viser at CD40 binding induserer økt ekspresjon av tumorcelleoverflatemarkører CD95 (Fas), CD54 (ICAM-1), og MHC-I, i lungetumorcellelinjer. Figur 22B viser nedmodulering av human CD40L ved CD40-positive tumorceller. Figur 23. Figur 23 viser inhiberingen av Fas ligand ekspresjon ved lymfocytter i nærvær av RA synovialfluid. Figur 24. Figur 24 viser en oversikt over et klinisk forsøk av en aksessorisk molekyl ligand (CD40L) genterapibehandling for B celle CLL. Figur 25. Figur 25 viser en sekvensoppstilling av human Fas ligand med human Fas ligand hvor Domene III er erstattet med Domene III fra murin Fas ligand. Den øverste proteinsekvensen er nativ human Fas ligand. Domene III er understreket med den prikkede linje. Den doble understreking indikerer et putativt MMP spaltingssted. Den nederste proteinsekvensen er den til kimær human-mus Fas ligand. Domene III av mus Fas liganden (understreket med prikket linje) erstatter Domene III av human Fas ligand. Tallene svarer til aminosyresekvenstallet idet man anvender 1 for starten av polypeptidsekvensen. Tallet til den første nukleotidbase for kodonet som koder for aminosyren er l+3x(n-l), hvor n er aminosyresekvenstallet. Figur 26. Figur 26 viser en sekvensoppstilling av human Fas. ligand med human Fas ligand hvor Domene III er blitt erstattet méd Domene III av human CD70. Den øverste proteinsekvens er nativ human Fas ligand, og den nederste sekvens er den til kimær Fas liganden, hvor Domene III av human CD70 erstatter Fas Domene III. Andre markeringer er anvendt på samme måte som i figur 25. Figur 27. Figur 27 viser en sekvensoppstilling av human Fas ligand med human Fas ligand hvor.Domene I er blitt erstattet med Domene III av human CD70. Den øverste proteinsekvens er nativ human Fas ligand, og den nederste proteinsekvens er den til kimær Fas ligand, hvor Domene III er blitt erstattet med Domene I av human CD70. Andre markeringer er anvendt som i figur 25. Figur 28. Figur 28 viser aminosyrene rundt og ved kjente matriks metalloproteinase (MMP) spaltingseter, som er beskrevet i Smith, M.M. et al., Journal of Biol. Chem. 270:6440-6449 (95) og Nagase, H., og G.B Fields,. Biopolymers (Peptide Science) 40:399-416 (96). Spaltingssetet er indikert med en pil.

I. Definisjoner

Et "aksessorisk molekyl ligand gen" er et gen som koder for hele eller en del av en aksessorisk molekyl ligand. Genet omfatter i det minste den nukleotidsekvens som kreves for å kode den funksjonelle delen av en aksessorisk molekyl ligand. Genet kan eventuelt omfatte slike genetiske elementer som promotere, enhancere og 3' ender. Det aksessoriske molekyl ligand genet er avledet fra en ligand som er medlem av tumornekrosefaktor (TNF) familien, inkluderende CD40 ligand, Fas ligand, CD70, TNFB( TNFp, CD30 ligand, 4-1BB ligand (4-1BBL), nervevekstfaktor og TNF-relatert apoptoseinduserende ligand (TRAIL). Som anvendt heri inkluderer betegnelsen "aksessorisk molekyl ligand gen" kimære aksessoriske molekyl ligand gener som definert i det etterfølgende.

Som anvendt heri er betegnelsen "maligne celler eller neoplastiske celler" definert til å bety maligne celler eller cancerceller som man finner i et menneske eller et dyr. Foretrukne typer av maligne eller neoplastiske celler inkluderer hvilken som helst maligne antigenpresenterende celle. I noen foretrukne utførelsesformer har disse maligne antigenpresenterende celler i det minste lave nivåer av CD40 tilstede på celleoverflaten.

Som anvendt heri er betegnelsen "neoplastiske humane celler" definert til å bety humane celler som er neoplastiske og som inkluderer, men som ikke er begrenset til, angigenpresenter-ende celler, hvilken som. helst neoplastisk celle som kan fungere som en antigenpresenterende celle eller som kan fungere til å forenkle antigenpresentasjon, neoplastiske monocytter, neoplastiske makrofager, neoplastiske B celler, neoplastiske dendrittiske celler, neoplastiske Langerhans celler, neoplastiske interdigitasjonsceller, neoplastiske follikulære dendrittiske celler eller neoplastiske Kupffer celler og lignende. Definisjonen av neoplastiske humane celler inkluderer de celler som er assosiert med neoplastiske celler i tumorleiet til humane pasienter. Typisk er de neoplastiske humane celler enten levkemier, lymfomer, AML, ALL, AMML, CML, CMML, CLL, andre tumorer av antigenpresenterende celler eller neoplastiske celler fra bryst, ovarier eller lunger. Det skal også forstås at aksessoriske molekyl ligand gener eller de kimære aksessoriske molekyl ligand genene i henhold til oppfinnelsen kan innføres i somatiske celler. Disse somatiske celler kan være dannet ved en genmanipule-ringsprosess som, i disse celler, har innført gener som koder for molekyler som gjør disse celler i stand til å presentere antigen overfor immunsystemet.

Som anvendt heri er betegnelsen "kimært gen" definert til å bety et gen hvor noe av genet er avledet fra et andre forskjellig gen og kombinert med det første gen slik at minst en del av hvert gen er tilstede i det resulterende kimære gen. Et gen kan være kimært dersom en hvilken som helst del av sekvensen som koder for det resulterende protein er avledet fra et andre og forskjellig gen. Typiske kimære gener inkluderer gener hvor spesifikke funksjonelle domener fra ett gen er blitt overført til et annet gen og erstatter de analoge domener av dette andre gen. Det resulterende kimære gen kan f.eks. ha ett domene avledet av et murint gen og flere domener avledet fra et humant gen. Disse domener kan i størrelse strekke seg fra 5 aminosyrer til flere hundre aminosyrer. Andre eksempler på kimære aksessoriske molekyl ligand gener inkluderer gener som inneholder nukleotider som koder for aminosyrer som man ikke finner i noe naturlig forekommende aksessorisk molekyl ligand gen. Eksempler på kimære gener og potensielle forskjellige kombinasjoner av domener er tallrike og en fagkyndig på området vil forstå at ingen begrensning settes på den mengden av ett gen som må være tilstede i et annet gen for å gjøre det kimært.

Som anvendt heri er betegnelsen "murint CD40 ligand gen" definert til å bety et aksessorisk molekyl ligand gen som er avledet fra et murint CD40 ligand gen. Eksempler på slike murine CD40 ligand gener inkluderer genet isolert av Armitage et al., Nature, 357:80-82 (1992) og andre gener avledet fra murin opprinnelse som hybridiserer til genet beskrevet av Armitage et al. under hybridiseringsbetingelser med lav stringens.

Som anvendt heri er betegnelsen "vektor eller genetisk vektor" definert til å bety en nukleinsyre som er i stand til å replikere seg selv i en organisme slik som bakterie eller animalsk celle. Typiske genetiske vektorer inkluderer plasmider som vanligvis anvendes i rekombinant DNA teknologi og forskjellige viruser som er i stand til å replikere inne i baktericeller eller animalske celler. Foretrukne typer av genetiske vektorer inkluderer plasmider, fager, viruser, retroviruser o.lign.

Som anvendt heri er betegnelsen "genterapivektor" definert til å bety en genetisk vektor som er i stand til direkte å infisere celler i et dyr slik som et menneske. En rekke genterapivektorer er blitt beskrevet i litteraturen og ligand gener, inkluderende murint CD40 ligand gen, som kan-anvendes i forbindelse med dannelse av de kimære CD40 ligand genene ifølge den foreliggende oppfinnelse, kan isoleres fra forskjellige ulike murine stammer.

Nukleotidsekvensen til et humant CD40 ligand gen er blitt bestemt og er vist i SEQ ID NO: 2. Anvendelsen av et hvilket som helst aksessorisk molekyl ligand gen som er homologt med SEQ ID NO: 2, og som således hybridiserer til denne sekvens

ved lavstringensbetingelser er beskrevet heri. En fagkyndig på området vil forstå at de aksessoriske molekyl ligand genene, inkluderende de humane CD40 ligand genene, ■ som er anvendbare i forbindelse med dannelse av de kimære CD40 ligand genene ifølge den foreliggende oppfinnelse, kan variere avhengig av det individ hvorfra genet er isolert og slike variasjoner kan vise seg å være nyttige for å fremstille unike aksessoriske molekyl ligand gener. Den foreliggende oppfinnelse ser på anvendelsen av domenene, sub-domenene, aminosyrene eller nukleotidsekvensen av den humane CD40 ligand og/eller human CD40 ligand genet som del av en kimær aksessorisk molekyl ligand eller kimært aksessorisk molekyl ligand gen.

Nukleotidsekvensen til et bovint CD40 ligand gen er blitt bestemt og er vist som SEQ ID NO: 8. Anvendelsen av et hvilket som helst aksessorisk molekyl ligand gen som er homologt med SEQ ID NO: 8, og som således hybridiserer til sekvensen ved lavstringensbetingelser er beskrevet heri. En fagkyndig på området vil forstå at aksessoriske molekyl ligand gener, inkluderende de bovine CD40 ligand gener, kan variere avhengig av det individuelle dyr hvorfra genet er isolert, og at slike variasjoner kan vise seg å være nyttige i fremstillingen av unike aksessoriske molekyl ligand gener.

Nukleotidsekvensen til human TNFa og TNFp er blitt bestemt og er vist som henholdsvis SEQ ID NO: 9 og 10. Anvendelsen av et hvilket som helst aksessorisk molekyl ligand gen som er

homologt med enten human TNFa eller TNFp (henholdsvis SEQ ID NO: 9 bg 10) og som således hybridiserer til disse sekvenser

ved lavstringensbetingelser er beskrevet heri. De aksessoriske molekyl ligand genene inkluderende de humane TNFa og TNFp genene, kan variere avhengig av det spesielle individ hvorfra genet er blitt isolert og disse variasjoner kan vise seg å være anvendbare for fremstilling av unike aksessoriske molekyl gener.

Nukleotidsekvensen til porcine TNFa og TNFp er blitt bestemt og er vist som SEQ ID NO: 11. Anvendelsen av et hvilket som helst aksessorisk molekyl ligand gen som er homologt med hver SEQ ID NO: 11, og som således vil kunne hybridisere til disse sekvenser ved lavstringensbetingelser er beskrevet heri. En fagkyndig, på området vil forstå at de aksessoriske molekyl ligand genene, inkluderende de porcine TNFa og TNFp genene, kan variere avhengig av det spesielle dyr hvorfra genet er isolert og at en slik variasjon kan vise seg anvendbar for fremstilling av unike aksessoriske molekyl gener.

Nukleotidsekvensen til et murint TNFa gen er blitt bestemt og er vist som SEQ ID NO: 12. Anvendelsen av et hvilket som helst aksessorisk molekyl ligand gen som er homologt med SEQ ID NO: 12, og som således hybridiserer til sekvensen ved lavstringensbetingelser er beskrevet heri. En fagkyndig på området vil forstå at de aksessoriske molekyl ligand genene, inkluderende det murine TNFa genet, kan variere avhengig av det individ hvorfra genet er isolert, og at disse variasjoner kan vise seg nyttige for fremstilling av unike aksessoriske molekyl gener.

Nukleotidsekvensen til human Fas ligand og murin (C57BL/6) Fas ligand er blitt bestemt og er vist som henholdsvis SEQ ID NO: 13 og 14. Nukleotidsekvensen til murin Balb/c Fas ligand er vist som SEQ ID NO: 31. Anvendelsen av et hvilket som helst aksessorisk molekyl ligand gen som er homologt med hvilken som helst av SEQ ID NO: 13, 14 og 31, og som således hybridiserer til sekvensene ved lavstringensbetingelser er beskrevet heri. En fagkyndig på området vil forstå at de aksessoriske molekyl ligand genene som inkluderer de humane Fas ligand eller murine Fas ligand genene, kan variere avhengig av det spesielle individ eller dyr hvorfra genene er isolert, og at slike variasjoner kan vise seg nyttige for fremstilling av hvilke som helst aksessoriske molekyl gener.

Nukleotidsekvensen til et humant CD70 gen er blitt bestemt og er vist som SEQ ID NO: 15. Den murine CD70 gensekvensen er også blitt bestemt og er vist som SEQ ID NO: 36 og ble beskrevet av Tesselaar et al., J. Immunol. 159:4959-65

(1997) . Anvendelsen av et hvilket som helst' aksessorisk molekyl ligand gen som er homologt med SEQ ID NO: 15 eller 36, og som således hybridiserer til denne sekvens ved lavstringensbetingelser er beskrevet heri. En fagkyndig på området vil forstå at de aksessoriske molekyl ligand genene inkluderende det humane CD70 gen kan variere avhengig av det individ hvorfra genet er isolert, og at disse variasjoner kan vise seg nyttige for fremstilling av unike aksessoriske molekyl ligand gener.

Nukleotidsekvensen til det humane CD30 ligand genet er blitt bestemt og er vist som SEQ ID NO: 16. Anvendelsen av et hvilket som helst aksessorisk molekyl ligand gen som er homologt med SEQ ID NO: 16, og som således hybridiserer til denne sekvens ved lavstringensbetingelser er beskrevet. En fagkyndig på området vil forstå at de aksessoriske molekyl ligand genene, inkluderende det humane CD30 ligand genet, kan variere avhengig av det individ hvorfra genet er isolert, og at slike variasjoner kan vise seg nyttige for fremstilling av unike aksessoriske molekyl ligand gener.

Variasjoner og varianter av nukleotidsekvensene til. aksessoriske molekyl ligand gener kan bevirkes ved alternativ spleising av budbringer RNA. Denne alternative spleising av budbringer RNA innskyter ytterligere nukleotidsekvenser som kan kode for en eller flere eventuelle aminosyresekvenser som i sin tur tillater at den aksessoriske molekyl liganden som er kodet for har ytterligere egenskaper eller funksjoner.

Nukleotidsekvensen til en human eller mus 4-1BBL er blitt bestemt og er vist som henholdvis SEQ ID NO:'17 og 18. Anvendelsen av et hvilket som helst aksessorisk molekyl ligand gen som er homologt med enten SEQ ID NO: 17 eller 18, og som således hybridiserer til disse sekvenser ved lavstringensbetingelser er beskrevet heri. En fagkyndig på området vil forstå at aksessoriske molekyl ligand gener inkluderende det humane 4-1BBL genet kan variere avhengig av det individ hvorfra det er isolert, og at slike variasjoner kan vise seg nyttige for fremstilling av unike aksessoriske molekyl ligand gener.

Det er også beskrevet kimære aksessoriske molekyler som inneholder en hvilken som helst domene del eller sub-domene del, eller aminosyresekvenser som er kodet for av de følgende gener: bovin TNF-a (SEQ ID NO: 21), murin CD40 ligand (SEQ ID NO: 22), human nervevekstfaktor-p (SEQ ID NO: 23) , murin nervevekstfaktor (SEQ ID NO: .24), rotte Fas ligand (SEQ ID NO: 25) human TNF-relatert apoptoseinduserende ligand (TRAIL)

(SEQ ID NO: 41, Genbank deponeringsnummer U37518), murin TNF-relatert apoptoseinduserende ligand (TRAIL) (SEQ ID NO: 42, Genbank deponeringsnummer U37522), murin CD30 ligand (SEQ ID NO: 43), human 4-1BB1 (SEQ ID NO: 17) og murin 4-1BBL (SEQ ID NO: 44 og 18). Det er også beskrevet kimære aksessoriske molekyler som benytter gener som koder for aminosyresekvenser som er homologe med disse sekvenser.

Kimære gener for aksessorisk molkekyl ligand som er omfattet av et nukleotid segement avledet fra et aksessorisk molekyl ligand gen som er operativt koblet til en nukleotidsekvens avledet fra et annet aksessorisk molekyl ligand gen eller annet gen er beskrevet heri.

Kimære aksessoriske molekyl ligand gener er f.eks. beskrevet som omfattes av et segement av det murine CF40 ligand gen som er blitt operativt koblet til minst et annet ytterligere gensegment avledet fra et annet aksessorisk molekyl ligand gen. Størrelsen av dette spesielle segment avledet fra det forskjellige aksessoriske molekyl ligand genet kan variere fra en nukleotidsekvens som koder for. noen få aminosyrer, et sub-domene av den aksessoriske molekyl liganden, et domene av den aksessoriske molekyl liganden eller mer enn ett domene av en aksessorisk molekyl ligand. Andre kimære aksessoriske molekyler er omfattet av et aksessorisk molekyl ligand gen inn i hvilket nukleotider som koder for et aminosyresegment som ikke finnes som en del av en naturlig forekommende aksessorisk molekyl ligand er blitt innført. Dette aminosyresegment kan være kunstig dannet eller avledet fra et protein som man finner i naturen. Det kimære aksessoriske molekyl ligand genet koder for en kimær aminosyresekvens og således kan en kodet kimær aksessorisk molekyl ligand utvise unike egenskaper i tillegg til de egenskaper som man finner på individuelle segmenter som er avledet fra de forskjellige aksessoriske molekyl ligand gener. Det kimære aksessoriske. molekyl ligand genet kan kode for en aksessorisk molekyl ligand som har egenskaper avledet fra den aksessoriske molekyl liganden.som anvendes til å konstruere det kimære gen.

Hver av de aksessoriske molekyl ligand genene som er et medlem av tumornekrosefaktorfamilien har en lignende sekundær struktur som består av en rekke domener. Denne domenestruktur inkluderer et første domene som kodes for av 5' regionen av det aksessoriske molekyl ligand genet. Det andre domene (Domene II) er det domene som inneholder aminosyrene som strekker seg over cellemembranen og som således betegnes transmembrandomene. Det tredje domene (Domene III) er det proksimale ekstracellulære domene og disse aminosyrer er aminosyrene som finnes proksimalt til den cellulære membran. Det fjerne domene (Domene IV) kodes for av 3' enden av det aksessoriske molekyl ligand genet og er blitt betegnet det distale ekstracellulære domene. Det distale ekstracellulære domene (Domene IV) utgjør generelt den oppløselige formen av tumornekrosefaktorfamiliemolekylet. Basert på røntgen-krystallstrukturen til human TNF, den forutsagte sekundære struktur av det aksessoriske molekyl, har CD40 ligand blitt utledet sammen med domenestrukturen til disse molekyler av M. Peitsch og C. Jongeneel,. International Immunology, 5:233-238

(1993). De sekundære strukturer for de andre medlemmer av tumornekrosefaktorfamilien ble utledet ved anvendelse av computeranalyse sammen med sammenligning med den humane TNF og CD4 0 ligand domenestrukturen. I tabell I, er domenegrensene til en rekke aksessoriske molekyl ligand gener vist. Et diagram av disse domener for en rekke av disse aksessoriske cellemolekyl ligander er vist i figur 1. Fastsettelsen av domenegrensene er. omtrentlig, og en fagkyndig på området vil forstå at disse grensene kan variere og fremdeles tilveiebringe anvendbar indentifikasjon av domener. En fagkyndig på området vil forstå at typiske kimære aksessoriske molekyl gener vil kunne inkludere gener som er dannet ved å bytte domener eller sub-domene segmenter mellom f.eks. et mus CD40 ligand gen eller et humant CD40 ligand gen. Kimært aksessorisk molekyl gen kan f.eks. konstrueres ved operativ kobling av Domene I av det humane CD40 ligand gen til Domener II-IV av det murine CD40 ligand genet. En fagkyndig på området vil forstå det mangfold av de kimære aksessoriske molekyl ligand genene som kan dannes ved anvendelse av de aksessoriske molekyler identifisert i tabell I: Andre kimære gener er også beskrevet hvor mindre segmenter (sub-domene segmenter) er byttet mellom f.eks. et murint CD40 ligand gen og et humant CD40 ligand gen eller et annet murint CD4 0 ligand gen. En fagkyndig på området vil forstå at gener som koder for aksessoriske molekyler vil ha i det minste gensegmenter som svarer til forskjellige funksjonelle segmenter av en aksessorisk molekyl ligand slik som den murine CD40 ligand kodet for av det murine CD40 ligand genet (SEQ ID NO: 1) . Det vil også være klart for en fagkyndig på området at nukleotidgrensene som er identifisert i tabell I kan variere i betydelig grad fra dem som er identifisert for det murine CD40 ligand genet (SEQ ID NO: 1) og fremdeles definere domener som er anvendbare i den foreliggende oppfinnelse.

Foretrukket er det kimære CD40 ligand genet ifølge oppfinnelsen omfattet av nukleotidene som koder for ekstra^ cellulære domener (Domene III og IV) av human CD40 ligand operativt koblet til nukleotidene som koder for transmembran (Domene II) og nukleotidene som koder for cytoplasmatisk domene (Domene I) av det murine CD40 ligand genet. Eksempler på slike foretrukne kimære aksessoriske molekyler er vist i figur 2. Et eksempel på nukleotidsekvens for et slikt gen er SEQ ID NO: 7. I andre kimære CD40 ligand gener i henhold til oppfinnelsen kan nukleotidene som koder for de ekstracellulære domener (Domener III og IV) av det murine CD40 ligand genet være operativt koblet til nukleotider som koder for transmembrandomenet (Domene II) og det cytoplasmatiske domene (Domene I) av det humane CD40 ligand genet. Et eksempel på en nukleotidsekvens for et slikt gen er SEQ ID NO: 3. I andre foretrukne kimære CD40 ligand gener i henhold til oppfinnelsen er nukleotidene som koder for de ekstracellulære domener (Domener III og IV) og transmembrandomenet (Domene II) av human CD40 ligand koblet til nukleotidene som koder for det cytoplasmatiske domene (Domene I) av murint CD40 ligand gen. Et eksempel på en nukleotidsekvens for et slikt gen er SEQ ID NO: 6. Andre kimære CD40 ligand gener som er omfattet av den foreliggende oppfinnelse omfatter nukleotidene som koder for de ekstracellulære domener (Domene III og IV) og transmembrandomenet (Domene II) av det murine CD40 ligand genet operativt koblet til nukleotidene som koder for det cytoplasmatiske domene av det humane CD40 ligand genet. Et eksempel på en nukleotidsekvens for et slikt gen er SEQ ID NO: 5. I. andre kimære CD40 ligand gener omfattet av den foreliggende oppfinnelse er de ekstracellulære domener (Domene III og IV) av det humane CD40 ligand genet operativt koblet til transmembrandomenet (Domene II) av det murine CD40 ligand genet som er operativt koblet til det cytoplasmatiske domene (Domene I) av det humane CD40 ligand genet. Et eksempel på en nukleotidsekvens for et slik gen er SEQ ID NO: 4.

En fagkyndig på området vil forstå at mange flere kombinasjoner som anvender domener eller andre valgte segmenter av hvilke som helst av de aksessoriske molekyl ligand genene inkluderende de humane CD40 ligand genene og mus CD40 ligand genene er mulig. Slike ytterligere kimære aksessoriske molekyl gener vil kunne inkludere følgende gener: kimære aksessoriske molekyl gener hvori nukleotidene som koder for Domene I er valgt fra et spesielt aksessorisk molekyl ligand gen og operativt koblet, enten direkte eller ved hjelp av en ytterligere nukleotidsekvens, til nukleotidene som koder for Domene II fra et spesielt aksessorisk molekyl ligand gen. Disse domener vil deretter kobles operativt enten direkte eller ved hjelp av en ytterligere nukleotidsekvens til nukleotidene som koder for Domene III fra et spesielt aksessorisk molekyl ligand gen. Dette molekyl vil deretter være operativt koblet enten direkte eller ved en ytterligere nukleotidsekvens til nukleotidene som koder for Domene IV av et spesielt aksessorisk molekyl ligand gen. Det kimære aksessoriske molekyl ligand gen som er konstruert på denne måte kan ha ytterligere nukleotider på begge ender eller mellom domener som er anvendbare for å tilveiebringe forskjellige aminosyrer i disse posisjoner. En fagkyndig på området vil forstå at disse spesielle kombinasjoner kun er illustrasjoner og at en rekke andre kombinasjoner vil kunne kontempleres hvor gensegmentene som omfatter nukleotider som koder for mindre enn hele domenet til et aksessorisk molekyl er byttet mellom ulike aksessoriske molekyler.

Kimære aksessoriske molekyl ligand gener som omfatter gensegmenter for mus eller human CD40 ligand i kombinasjon med gensegmenter avledet fra Fas ligand, TNFa, TNFp, CD70, CD3 0L, 4-1BBL, nervevekstfaktor eller TNF-relatert apoptoseinduserende ligand (TRAIL) er også beskrevet. Særlig anvendbare kimære aksessoriske molekyl ligand gener omfatter minst ett gensegment som er avledet fra et murint CD40 ligand gen sammen med gensegmenter eller et gensegment avledet fra et annet aksessorisk molekyl ligand gen.

Kimære aksessorisk molekyl ligand gener hvor de aksessoriske molekyler som dannes er blitt modifisert for å fjerne aminosyrer i det kimære aksessoriske molekyl kan anvendes ved post-translasjonsmekanismer til å regulere nivået av ekspresjon av det aksessoriske molekyl eller det aksessoriske molekylprotein på en spesiell celle. De steder som fjernes fra de kimære aksessoriske molekyler eller det kimære molekyl kan inkludere aminosyrer eller steder som utgjør protease-spaltingsseter inkluderende metallotioninproteaser, serin-proteaser og andre proteaser som gjenkjenner en aminosyresekvens enten spesifikt eller ikke-spesifikt. Særlig foretrukket er aminosyrer i Domene III som utgjør et eller flere potensielle aktuelle gjenkjennelsesseter anvendt ved post-translasjonsregulerendé mekanismer blitt modifisert eller fjernet.

Kimære aksessoriske molekyl ligand gener hvor domenene, sub-domenefragmenter eller andre aminosyrerester er blitt tatt fra ett aksessorisk molekyl ligand gen og innført i et annet aksessorisk molekyl ligand gen fra de samme arter er beskrevet heri. Det humane Domene I, og det humane Domene II fra CD40 ligand molekylet kan f.eks. være operativt koblet til nukleotidene som koder for det humane Domene III fra f.eks. CD70 molekylet som i sin tur kobles operativt til humant Domene IV for CD40 ligand molekylet. Dette kimære aksessorisk molekyl inneholder derfor humane CD40L Domener I, II og IV og humant CD70 Domene III. Et eksempel på en nukleotidsekvens for et slikt gen er SEQ ID NO: 19. En fagkyndig på området vil forstå at en rekke slike kombinasjoner med anvendelse av domener fra de samme arter fra ulike aksessorisk molekyl ligand gener kan danne en rekke kimære aksessoriske . molekyl gener som alle har spesifikke aktiviteter og egenskaper .

Kimære aksessorisk molekyl ligand gener hvor Domene III av et spesielt aksessorisk molekyl ligand gen er blitt erstattet med et Domene III fra et annet aksessorisk molekyl ligand gen er beskrevet heri. Foretrukket har mus Domene III blitt anvendt til å erstatte det humane Domene III i CD40 ligand molekylet. Dette kimære aksessoriske molekyl inneholder derfor det humane CD40L Domene I, det humane CD40L Domene II, mus CD40L Domene III og det humane CD40L Domene IV. Et eksempel på nukleotidsekvens for et slikt gen er SEQ ID NO: 20.

j

Kimære aksessoriske molekyler som inneholder aminosyresekvenser dannet av mennesker som er innskutt i eller er i stedet for en del av et domene eller annen aminosyresekvens til et aksessorisk molekyl gen kan anvendes heri. Aminosyresegmenter dannet av mennesker kan generelt frembringes ved å velge en hvilken som helst aminosyresekvens som kan anvendes til å gi det aksessoriske molekyl en spesiell funksjon eller for å fjerne annen uønsket funksjon. Disse aminosyresegmenter som er dannet av mennesker fremstilles ved å innføre i det aksessoriske molekyl ligand genet eller i det kimære aksessoriske molekyl ligand genet, de nukleotidsekvensene som kreves for å kode for disse spesielle aminosyresekvenser dannet av mennesker i de ønskede posisjoner. Videre kan de kimære aksessoriske molekyl ligand genene inneholde nukleotidsegmenter som omfatter sub-dbmene segmenter av andre molekyler eller mindre segmenter hvor aminosyrene er blitt forandret for et ønsket formål. Anvendelse av sub-domene nukleotidsegmenter tillater innføringen av korte aminosyresekvenser avledet fra andre molekyler inn i kimære aksessoriske molekyler. Innlemmelsen av slike korte sub-domene segmenter eller aminosyreforandringer i den aksessoriske molekyl liganden tillater innføringen av ønskede eller fjerning av uønskede trekk i dette molekyl.

Identifiksjonen av domenestrukturer i aksessorisk cellemole-kyler er vel kjent innen teknikkens stand og krever generelt identifikasjonen av cysteinrester i de aksessoriske molekyler og den påfølgende kartlegging av disulfidbindinger mellom de forskjellige cysteinrester. Kartleggingen av forskjellige sub-domenesegementer i et aksessorisk molekyl er vel kjent innen teknikken og involverer analyse av aminosyresekvensen til de aksessoriske molekyler og involverer generelt et sammenligning av krystallstrukturen for vevsnekrosefaktor ved anvendelsen av prediktive algoritmer for derved å produsere en forutsagt struktur av et kimært aksessorisk molekyl eller et aksessorisk molekyl. Denne forutsagte struktur for disse molekyler kan deretter anvendes til å selektere forskjellige sub-domenedeler av molekylet for anvendelse for å konstruere ytterligere kimære aksessoriske molekyler. Eksempler på slike kartleggingsstudier omfatter studiene til M. Pitsch og CV. Jongeneel, International Immunology, 5:233-238 (1993) og analysen vist i figur 1.

Aksessoriske molekyl ligand gener og kimære aksessoriske molekyl ligand gener som er forkortet og som koder for mindre enn den fulle lengde av aminosyresekvensen funnet i den native aksessoriske molekyl liganden er også beskrevet. Disse forkortinger kan endre egenskapene til aksessorisk molekyl ligand genet, men noe identifisert aktivitet opprettholdes. Slike forkortinger kan gjennomføres for å fjerne et gensegment eller gensegmenter av det aksessoriske molekyl genet og vil typisk utføres ved å fjerne nukleotider som koder for domener som ikke er direkte involvert i bindingen av den aksessoriske molekyl liganden med dens aksessoriske molekyl. Disse forkortede aksessoriske molekyl ligand gener eller kimære forkortede aksessoriske molekyl ligand gener kan inneholde ytterligere gensegmenter som koder for aminosyresegmenter eller domener som erstatter domenene fjernet fra dette forkortede aksessoriske molekyl genet. Slik erstatning av delene av det aksessoriske molekyl som er fjernet ved forkorting er ikke nødvendig.

De kimære aksessoriske molekyl genene beskrevet heri og de kimære CD40 ligand genene i henhold til. oppfinnelsen kan konstrueres ved anvendelse av standard genmanipulerings-metoder for operativ kobling av en spesiell nukleotidsekvens fra et aksessorisk molekyl ligand gen til en forskjellig nukleotid sekvens avledet fra det samme eller et annet aksessorisk molekyl ligand gen. I tillegg kan standard genetikkmetoder anvendes til å innføre menneske-dannede nukleotidsekvenser eller sub-domene nukleotidsekvenser i det kimære aksessoriske molekyl ligand genet. En fagkyndig på området vil forstå at forskjellige metoder kan anvendes for å danne slike kimære aksessoriske molekyl gener. En genomdan-nelsesmetode kjent som "SOEN" kan f.eks. anvendes for å fremstille et kimært aksessorisk molekyl gen som inneholder nukleotidsegmenter avledet fra forskjellige kimære aksessoriske molekyler. Metodene for å anvende denne genomdannelses-metoden er vel kjent innen teknikken og er f.eks. blitt beskrevet i Horton, R. M., Mol. Biotechnol., 3:93 (1995); Ali, S. A. og A. Steinkasserer, Biotechniques, 18:746 (1995); Vilardaga, J. P., E. Di Paolo og A. Bollen, Biotechniques, 18:604 (1995); Majumder, K., F. A. Fattah, A. Selvapandiyan> og R. K. Bhatnagar, PCR. Methods Appl., 4:212 (1995); Boles, E. og T. Miosga, Curr. Genet. 28:197 (1995); Vallejo, A. N., R. J. Pogulis og L. R. Pease, PCR. Methods Appl., 4:S123

(1994); Henkel, T. og P. A. Baeuerle, Anal, Biochem., 214:351

(1993); Tessier, D. C. og D. Y. Thomas, Biotechniques, 15:351

(1993) ; Morrison, H. G. og R. C. Desrosiers, Biotechniques, 14:454 (1993); Cadwell, R. C. og G. F. Joyce, PCR. Methods Appl., 2:28 (1992) og Stappert, J., J. Wirsching og R. Kemler, Nucléic Acids Res., 20:624 (1992). Alternativt vil en. fagkyndig på området forstå at seterettet mutagenese kan anvendes for å introdusere forandringer i en spesiell nukleotidsekvens for direkte å produsere eller for å anvendes indirekte for å produsere et kimært aksessorisk molekyl gen eller et kimært CD40 ligand gen i henhold til oppfinnelsen. Det mutagene kit som er tilveiebragt av BioRad Laboratories kan f.eks. anvendes sammen med metoder og prosedyrer som er beskrevet i kitet for å danne de ønskede forandringer i nukleotidsekvensen. Disse metoder ble opprinnelig beskrevet av Kunkel, Proe. Nati. Acad, Sei, USA 82:488-492 (1985) og Kunkel et al., Meth. Enzol. Mol. 154:367-382 (1987). Ved anvendelse av de seterettede mutagenese-prosedyrer som er beskrevet heri og som er kjent innen teknikken, kan en fagkyndig forsker indusere individuelle nukleotidforandringer som resulterer i en endret aminosyresekvens eller som preserverer en aminosyresekvens, men introduserer en ønsket restriksjonsenzym-gjenkjennelsesfrekvens i genet. Dette nye restriksjonsendonukleoase-gjenkjennelsessted kan deretter anvendes for å kutte genet i dette spesielle punkt og anvende det til et gen eller segment av annet aksessorisk molekyl ligand gen. I tillegg til disse metoder vil en fagkyndig på området forstå at et helt kimært aksessorisk molekyl ligand gen kan syntetiseres ved anvendelse av.syntesemetoder som er kjent innen teknikken. Denne metodologi krever kun at den fagkyndige danner nukleotidsekvens av et kimært aksessorisk molekyl ligand gen og gir denne sekvens til et selskap som er i stand til å syntetisere et slikt gen.

B. Genetiske konstrukter

Foreliggende oppfinnelse vedrører anvendelsen av de kimære CD40 ligand gener ifølge oppfinnelsen og beskriver anvend- . eisen av andre aksessoriske molekyl ligand gener eller kimære aksessorisk molekyl ligand.gener som er tilstede i forskjellige typer av genetiske vektorer. En genetisk vektor referer-er til et DNA molekyl i stand til autonom replikasjon i en celle inn i hvilken et annet DNA segment kan innføres for å bevirke at de ytterligere DNA segmenter vil replikere. Vektorer som er i stand til å uttrykke gener inneholdt i denne vektor omtales som "ekspresjonsvektorer". Således er de genetiske vektorer og ekspresjonsvektorer rekombinante DNA molekyler som omfatter i det minste to.nukleotidsekvenser som ikke normalt finnes sammen i naturen.

De genetiske vektorer som kan anvendes i forbindelse med den foreliggende oppfinnelse inneholder et kimært CD40 ligand gen ifølge oppfinnelsen eller det er beskrevet at vektorer inneholder et annet aksessorisk molekyl ligand gen som koder for en aksessorisk molekyl ligand som eventuelt er operativt koblet til en passende transkripsjons- eller translasjons-regulerende nukleotidsekvens, slik som en avledet fra et pattedyr-, mikrobielt, virus- eller insektsgen. Slike regulerende sekvenser inkluderer sekvenser som har en regulerende rolle i genekspresjon, slik som en transkripsjons-promotor eller enhancer, en operatorsekvens for å regulere transkrip-sjonen, en sekvens som koder for et ribosom-bindingssete i budbringer RNA og passende sekvenser som regulerer transkripsjon, translasjonsinitiering eller transkripsjonsterminering.

Særlig anvendbare regulerende sekvenser omfatter promoter-regionene fra forskjellige pattedyr-, virus-, mikrobielle og insektsgener. Promoterregionen styrer en initiering av transkripsjon av genet og bevirker transkripsjon av DNA gjennom og inkluderende det aksessoriske molekyl ligand genet. Anvendbare promoterregioner inkluderer promoteren funnet i Rous Sarcoma Virus (RSV) - long terminal repeat (LTR), human cytomegalovirus (HCMV) enhancer/promoter region lac promotere, promotere isolert fra adenovirus, og hvilken som helst annen promoter som er kjent av fagkyndige på området som vil kunne forstås til å være anvendbare for genekspresjon i eukaryoter, prokaryoter, viruser eller mikrobielle celler. Andre promoterer som er særlig anvendbare for å uttrykke gener og proteiner i eukaryotiske celler inkluderer pattedyrcellepromotersekvenser og enhancer sekvenser slik som dem avledet fra polyomavirus, adenovirus, simian virus 40 (SV40) og det humane cytomegalovirus. Særlig anvendbare er de virale tidlige og sene promotere som typisk finnes nær det virale replikasjons-origo i viruser som SV40. Eksempler på forskjellige promotere som er blitt anvendt i ekspresjonsvektorer er blitt beskrevet av Okiama og Berg (Mol. Cell. Biol. 3:280, 1983), pMLSVN SV40 beskrevet av Kossman et al., Nature 213:768 (1984). En fagkyndig på området vil forstå at seleksjonen av en spesiell anvendbar promoter avhenger av de nøyaktige cellelinjer og andre forskjellige parametere til den genetiske struktur som skal anvendes for å uttrykke det aksessoriske molekyl ligand genet eller det kimære aksessoriske molekyl ligand genet innen en spesiell cellelinje. I tillegg vil en fagkyndig på området velge en promoter som er kjent til å uttrykke gener i målcellen i et tilstrekkelig høyt nivå til å kunne være anvendbar i den foreliggende oppfinnelse.

De genetiske vektorene og ekspresjonsvektorene inneholder eventuelt forskjellige ytterligere reguleringssekvenser som inkluderer ribosombindingsseter som tillater effektiv trans-lasjon av budbringer RNA dannet fra en ekspresjonsvektor i proteiner, DNA sekvensen som koder for forskjellige signal-peptider som kan være operativt koblet til det aksessoriske molekyl ligand genet eller det kimære aksessoriske molekyl ligand genet. Signalpeptidet, om tilstede, er uttrykt som en forløper-aminosyre som muliggjør forbedret .ekstracellulær sekresjon av translasjons-fusjons-polypeptid.

De genetiske konstrukter inkluderer derfor forskjellige former av kimære CD40 ligand gener som beskrevet over som er operativt koblet til enten en promotersekvens eller en promoter- og enhancersekvens og også operativt koblet til en polyadenyleringsekvens som styrer termineringen og poly-. adenyleringeri av budbringer RNA. De genetiske konstrukter i henhold til oppfinnelsen kan inneholde andre genetiske sekvenser som tillater den effektive replikasjon og ekspresjon av denne struktur i de ønskede celler. Slik sekvens kan omfatte introner som er avledet fra native aksessoriske molekyl ligand gener eller f.eks. fra et virus gen.

Genterapivektorer kan infisere pattedyrceller direkte for å innføre det ønskede kimære CD40 ligand gen i denne celle. Disse genterapivektorer er anvendbare for direkte infeksjon av celler som er blitt isolert fra et dyr eller pasient, eller kan innføres direkte i et dyr eller pasient og kan derved direkte infisere den ønskede celle i dette dyr eller denne pasient.

En rekke typer av genterapivektorer som vellykket kan over-føre gener og føre til ekspresjon av de ønskede.fremmede DNA sekvenser er blitt utviklet og beskrevet i litteraturen. Artikkelen med tittelen "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" i Current Comm. Mol. Biol., Cold Springs Harbor Laboratory, New York (1987) kan f.eks. nevnes. Videre kan naken DNA innføres fysisk i eukaryotiske celler inkluderende humane celler ved transfeksjon ved anvendelse av en rekke teknikker som omfatter kalsiumfosfattransfeksjon (Berman et al., Proe. Nati. Acad. Schi. USA 81:7176 (1984)), DEAE-dekstran transfeksjon, protoplastfusjon (Deans & al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 81:1292 (1984)), elektroporering, liposom fusjon, polybren transfeksjon og direkte genover-føring ved laser mikropunktur av cellemembranet. I tillegg vil en fagkyndig på området forstå at hvilken som helst teknikk som vellykket kan innføre DNA i en celle på en slik måte at det kan integrere i genomet til en celle og tillate ekspresjon av det ønskede gen, vil kunne anvendes i den foreliggende oppfinnelse.

Spesifikt er genterapivektorer som anvender rekombinante infeksiøse viruspartikler for genavlevering blitt beskrevet i utstrakt grad. Se f.eks. Brody, S. L. og R. R. Crystal, Ann. N. Y. Acad. Sei., 716:90 (1994); Srivastava, A., Blood, Cells, 20:531 (1994); Jolly, D., Cancer Gene Ther., 1:51

(1994); Russel, S. J., Euir. J. Cancer, 30A:1165 (1994); Yee, J. K., T. Friedmann og J. C. Burns, Methods Cell Biol., 43 Pt A:99 (1994); Boris-Lawrie, K. A. og H. M. Temin, Curr. Opin. Genet, Dev., 3:102 (1993); Tolstoshev, P., Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 33:573 (1993); og Carter, B. J., Curr. Opin. Biotechnol., 3:533 (1992). Genterapivektorer kan anvendes for å gjennomføre den ønskede metodologi ved å innføre en gen som koder for et kimært CD40 ligand gen i cellen. En rekke virale vektorer er blitt definert og anvendt som genterapivektorer og inkluderer virusvektorer avledet fra simian virus 40 (SV40), adenoviruser, adenoassosierte viruser og retroviruser. En fagkyndig på området vil forstå at anvendbare genterapivektorer er vektorer som er i stand til direkte å innføre, i målcellene, det DNA som koder for den kimære CD40 liganden og som tillater at DNA forblir i cellen for å uttrykke liganden på ønsket måte i cellen.

Genterapivektorene er anvendbare for å innføre kimære CD40 ligand gener i en rekke pattedyrceller inkluderende menneskeceller. De spesielle celler som infiseres med genterapivektoren vil avhenge av vektorens forskjellige særegenheter og slike vektorer kan anvendes til å innføre de kimære CD40 ligand gener i henhold til oppfinnelsen i hematopoietiske eller lymfoide stamceller, antigenpresenterende celler, embryoniske stamceller og andre celler som er i stand til å presentere antigen i immunsystemet inkluderende celler som har CD40 på deres overflate. Videre er slike genterapivektorer i stand til å innføre et gen som koder for et kimært CD40 ligand gen i en human neoplastisk celle som lymfom, levkemi, AML, CLL, CML, AMML, CMML, brystcancer, lungecancer, ovariecancer eller en hvilken som helst tumor som er i stand til å virke som antigenpresenterende celler eller celler som kan stimulere bystander-antigenpresenterende celle. Videre kan genterapivektorene tilveiebragt heri anvendes til å innføre de kimære CD40 ligand genene i henhold til oppfinnelsen i celler som er blitt manipulert slik at disse celler kan presentere antigen for immunsystemet.

III. Celler som inneholder genetiske konstrukter som koder for en aksessorisk molekyl liaand eller kimær

aksessorisk molekyl liaand

Foreliggende oppfinnelse vedrører også forskjellige celler som inneholder de genetiske konstrukter i henhold til oppfinnelsen. Disse celler inneholder konstruktene som koder for det kimære CD40 ligand genet og inneholder således de for-skjéllige genetiske elementer beskrevet i del II.B. i det foregående. Disse celler kan være mikrobielle celler, eukaryotiske celler, insektceller og forskjellige pattedyrceller inkluderende menneskeceller. I foretrukne utførelsesformer av den foreliggende oppfinnelse, omfatter disse celler forskjellige neoplastiske celler inkluderende humane neoplastiske celler. Disse neoplastiske celler kan være av en hvilken som helst celletype og inkludere celler fra immunsystemet og andre blodceller. Særlig foretrukket er hvilke som helst neoplastiske celler som kan fungere som antigenpresenterende celler i immunsystemet eller som kan stimulere bystander-antigenpresenterende celler ved ekspresjon av et transgent aksessorisk celle-molekyl ifølge oppfinnelsen. Disse neoplastiske celler som er i stand til å virke til å presentere antigen for immunsystemet har typisk eller har typisk hatt et aksessorisk molekyl, slik som CD40 molekylet, på celleoverflaten. Disse celler er generelt naturlig i stand til å presentere antigen for immunsystemet, men den foreliggende oppfinnelse omfatter også innføringen av kimære CD40 ligand gener i en celle som ikke naturlig er i stand til å presentere antigen for immunsystemet, men som er blitt genmanipu-lert slik at cellen kan presentere antigen for immunsystemet. Disse celler inkluderer typisk forskjellige kjente celletyper slik som monocytter, makrofager, B celler, Langerhans celler, interdigitasjonsceller, follikulære dendrittiske celler eller Kupffer celler og lignende som er blitt neoplastiske. I tillegg omfatter den foreliggende oppfinnelse også celler fra forskjellige karsinomer, fra brystcancer> ovariecancer og lungecancer som inneholder de genetiske konstrukter beskrevet heri. Foretrukket blir et kimært CD40 ligand gen i henhold til oppfinnelsen anbragt i celler som kan injiseres inn i et behandlingssted slik som et tumorleie eller ledd. Det kimære CD40 ligand genet i henhold til oppfinnelsen kan f.eks. innføres i en fibroblastcelle og den kimære CD40 liganden kan uttrykkes på overflaten av cellen. Fibroblastene injiseres deretter i behandlingsstedet og fører til ønsket immuneffekt som skyldes tilstedeværelsen av den kimære CD40 liganden på overflaten av disse celler. Disse celler stimulerer andre immunceller tilstede i behandlingsstedet (bystander celler). Denne prosess kan resultere i den ønskede effekt på immunsystemet.

IV. Metoder for å anvende genetiske vektorer og konstrukter

inneholdende et aksessorisk molekyl ligand gen Immunreaktiviteten til humane celler kan endres ved anvendelse av en metode som inkluderer innføring av et gen som koder for et kimært CD40 ligand gen i menneskecellene slik at den kimære CD40 liganden som kodet for av dette gen uttrykkes på overflaten av disse celler. Dette kan anvendes for hvilke som helst menneskecelle som deltar i en immunreaksjon, enten som et mål for immunsystemet eller som del av immunsystemet som responderer på det fremmede mål. En rekke metoder er sett på hvor sluttresultatet er at det aksessoriske molekyl ligand genet eller det kimære CD40 ligand genet ifølge oppfinnelsen innføres i de ønskede celler. Disse metoder omfatter ex vivo metoder, in vivo metoder og forskjellige andre metoder som involverer injeksjon av DNA, genetiske vektorer eller genterapivektorer inn i dyr eller mennesker inkluderende injeksjon direkte inn i tumorleiet tilstede i et hvilket som helst dyr eller menneske.

Ex vivo metoder er sett på heri hvor cellene inn i hvilke det aksessoriske molekyl ligand genet skal innføres, isoleres fra dyret eller pasienten, og hvor genet deretter innføres i disse isolerte celler ved anvendelse av passende metoder. Eksempler på anvéndbare ex vivo metoder er f.eks. blitt beskrevet av Raper, S. E., M: Grossman, D. J. Rader, J. G. Thoene, B. J. Clark, D. M. Kolansky, D. W. Muller og J. M. Wilson, Ann. Surg. 223:116 (1996); Lu, L., R. N. Shen og H. E. Broxmeyer, Crit, Rev. Oncol. Hematol., 22:61 (1996); Koc, 0. N., J. A. Allay, K. Lee, B. M. Davis, J. S. Reese og S. L. Gerson, Semin Oncol., 23:46 (1996); Fisher, L. J. og J. Ray, Curr. Opin. Neurobiol., 4:735 (1994); og Goldspiel, B. R., L. Green og K. A. Calis, Clin. Pharm., 12:488 (1993). D. Dilloo et al., i Blood 90:1927-1933 (1997), beskriver en metode med anvendelse av CD40L-aktiverte celler for behandling av B-akutt lymfoblastlevkemi (ALL). De ko-dyrket levkemiceller med fibroblaster er infisert med en retroviral vektor som koder for CD40L, og deretter injiseres celleblandingen i mus. En slik prosedyre, dersom benyttet i mennesker, ville avvike fra den som er sett på heri ved at de terapeutiske celler stimuleres in vitro ved en annen cellelinje som uttrykker den kimære CD40 liganden. Schultze, J.L. et al,, i Blood 89:3806-3816 (1997) beskriver en metode for å stimulere T-TILer (tumor-infUtrerende T celler) cytotoksisk for follikulære lymfom (FL) celler ved å eksponere dem, in vitro, for FL B celler som på forhånd var dyrket med CD40L-uttrykkende fibroblaster. De foreslår en adoptiv immunterapi hvor T-TILer stimulert på denne måte overføres til pasienter. Denne metode krever også in vitro stimulering av cellene som skal over-føres, med en annen cellelinje som uttrykker et aksessorisk molekyl.

Etter introduksjon av genet som inkluderer hvilke som helst eventuelle trinn for å sikre at det aksessoriske molekyl ligand genet er innført vellykket i de isolert celler, inn-føres de isolerte celler i pasienten, enten i et spesifikt sted eller direkte inn i pasientens sirkulasjon. Foretrukket blir celleovereflatemarkører, inkluderende molekyler som tumormarkører eller antigener for å identifisere cellen, anvendt for spesifikt å isolere disses molekylene fra pasienten. En fagkyndig på området vil forstå at slike isoleringsmetoder er vel kjente og inkluderer slike metodo-logier som fluorescensaktivert cellesortering (FACS), immunseleksjon involverende en rekke formater inkluderende vasking, kolonner eller lignende metoder.

Aksessoriske molekyl ligand gener kan innføres i de ønskede celler i kroppen til et dyr eller til et menneske uten først å fjerne disse celler fra pasienten. Metoder for å innføre gener i spesifikke celler in vivo eller i pasientens kropp er vel kjent og inkluderer anvendelse av genterapivektorer og direkte injeksjon av forskjellige genetiské konstrukter inn i dyret eller pasienten. Eksempler på anvendbare metoder er blitt beskrevet av Danko,. I. og J. A. Wolff, Vaccine, 12:1499

(1994); Raz, E., A. Watanabe, S. M. Baird, R. A. Eisenberg, T. B. Parr, M. Lotz, T. J. Kipps og D.. A. Carson, Proe. Nati. Acad. Schi. U.S.A., 90:4523 (1993); Davis, H. L., R. G. Whalen og B. A. Demeneix, Hum. Gene Ther., 4:151 (1993); Sugaya, S., K. Fujita, A. Kikuchi, H. Ueda, K. Takakuwa, S. Kodama og K. Tanaka, Hum. Gene Ther., 7:223 (1996); Prentice, H., R. A. Kloner, Y. Li, L. Newman og L. Kedes,- J. Mol. Cell Cardiol., 28:133 (1996); Soubrane, C, R. Mouawad, 0. Rixe, V. Calvez, A. Ghoumari, 0. Verola, M. Weil og D. Khayat, Eur. J. Cancer, 32A:691 (1996); Kass-Eisler, A., K. Li og L. A. Leinwand, Ann. N. Y. Acad. Sei., 772:232 (1995); DeMatteo, R. P., S. E. Raper, M. Ann, K. J. Fisher, C. Burke, A. Radu, G. Widera, B. R. Claytor, C. F. Barker og J. F. Markmann, Ann. Surg., 222:229 (1995); Addison, C. L., T. Braciak, R. Ralston, W. J. Muller, J. Gauldie og F. L. Graham, Proe. Nati. Acad, Sei. U.S.A., 92:8522 (1995); Hengge, U. R., P. S. Walker og J. C. Vogel, J.. Clin. Invest., 97:2911 (1996); Felgner, P. L., Y. J. Tsai, L. Sukhu, C. J. Wheeler, M. Manthorpe, J. Marshall og S. H. Cheng, Ann. N. Y. Acad, Sei., 772:126 (1995); og Furth, P. A., A. Shamay og L. Hennighausen, Hybridoma, 14:149 (1995). I en typisk anvendelse blir en genterapivektor som inneholder et aksessorisk molekyl ligand gen innført i sirkulasjonen eller på et lokalisert sted hos pasienten for å tillate at genterapivektoren spesifikt infiserer de ønskede celler. I andre foretrukne utførelsesformer injiseres genterapivektoren direkte inn i tumorleiet tilstede i et dyr som inneholder i det minste noen av cellene inn i hvilke det aksessoriske molekyl ligand genet skal innføres.

Direkte injeksjon av DNA fra et genetisk konstrukt ifølge oppfinnelsen som har en promoter og et kimært CD4 0 ligand gen etterfulgt av en polyadenyleringssekvens inn i en pasient eller et dyr kan gjennomføres. Eksempler på slike anvendbare metoder er blitt beskrevet av Vile, R. G. og I. R. Hart, Ann. Oncol., 5 Suppl 4:59 (1994). Den genetiske konstrukt DNA ifølge oppfinnelsen kan injiseres direkte i muskelen eller andre steder på dyret eller pasienten eller direkte inn i tumorleiet til dyret eller pasienten. Alternativt blir et DNA fra et genetisk konstrukt som inneholder i det minste et aksessorisk molekyl ligand gen anvendt og injisert direkte inn i dyret.

I forbindelse med oppfinnelsen, blir foretrukket immunreak-sjonen eller responsen hos en menneskepasient eller et dyr endret ved å innføre det kimære CD40 ligand genet i celler, inkluderende humane celler som har et aksessorisk molekyl tilstede på celleoverflaten. Slike celler inkluderer humane celler, human antigenpresenterende celler og disse celler kan eventuelt være neoplastiske antigenpresenterende celler som har kapasitet til å uttrykke det aksessoriske molekyl på overflaten av cellen eller cellene som er i stand til stimulering. Mengden av aksessorisk molekyl tilstede på overflaten av cellene inn i hvilke det kimære CD40 ligand genet skal innføres, er av og til svært liten og slike små mengder av. aksessorisk molekyl kan resultere fra nedregulering av dette aksessoriske molekyl på overflaten av slike celler. I enkelte utførelsesformer har cellene inn i hvilke det kimære CD40 ligand genet innføres i det minste små mengder av CD40 molekylet tilstede på celleoverflaten eller er avledet fra celler som uttrykker CD40 ligand molekylet på celleoverflaten, men har redusert eller eliminert denne ekspresjon.

De foretrukne metoder for å endre immunreaktiviteten for en spesiell celle kan anvendes på pattedyrceller inkluderende menneskeceller. Disse menneskeceller kan omfatte neoplastiske menneskeceller som humane lymfomer, levkemier og andre maligniteter som inkluderer brystcancer, lungecancer og ovariecancer. Cellene er foretrukket normale antigenpresenterende celler i en menneskepasient som monocytter, makrofager, B celler, Langérhans celler, interdigitasjonsceller, follikulære dendrittiske celler, Kupffer celler og andre lignende celler. Cellene er foretrukket lymfocytter som krever endret immunreaktivitet når de kimære CD40 ligand molekyler i henhold til oppfinnelsen innføres i disse celler. Cellene kan også være neoplastiske eller normale celler som er i stand til å stimulere bystander-antigenpresenterende celler når de kimære CD40 ligand genene i henhold til oppfinnelsen innføres i disse celler. Celler som ikke naturlig kan presentere antigen for immunsystemet., kan manipuleres genetisk for å innføre genene som koder for molekylene som kreves for antigenpresentasjon, inkluderende gener som koder for et kimært CD40 ligand molekyl, og således tillates disse celler å virke som artifisielle antigenpresenterende celler. Det kimære CD40 ligand genet kan deretter innføres i disse artifisielle antigenpresenterende celler. Forskjellige tester er vel kjent innen litteraturen for å bestemme om en spesiell celle er i stand til å virke som en antigenpresenterende celle, slik som celleproliferasjon eller produksjon av lymfo-kiner og dette aspekt kan derfor lett bestemmes.

I tillegg til de ovennevnte normale humane celler, kan det kimære CD40 ligand genet ifølge oppfinnelsen innføres i forskjellige neoplastiske eller maligne celler som eventuelt er antigenpresenterende celler. Slike humane neoplastiske celler som er sett på inkluderer levkemi, lymfomer, AML, AMML eller CMML, CML, CLL og hvilke som helst neoplastiske celler som kan stimulere bystander-antigenpresenterende celler når en kimaer CD40 ligand innføres i denne celle. Også omfattet er neoplastiske celler slik som brystcancerceller, ovariecancer-celler eller lungecancerceller som kan eller som er manipulert til å virke som en antigenpresenterende celle. Den foreliggende immunmodulering er også anvendbar på andre maligniteter som ikke er spesifikt identifisert og vil således inkludere en hvilken som helst tumor av en hvilken som helst celle i stand til å presentere antigen i det animalske eller menneskelige immunsystem eller hvilken som helst celle som kan virke som en antigenpresenterende celle eller som kan stimulere bystander-antigenpresenterende celler etter at et aksessorisk molekyl ligand gen er blitt innført i disse celler. Disse antigenpresenterende celler har generelt aksessoriske molekyler på overflaten av cellen.

De foreliggende metoder for å endre immunreaktiviteten til en human eller animalsk celle kontemplerer introduksjonen av et kimært CD40 ligand gen ifølge oppfinnelsen i cellene for hvilke endret immunreaktivitet er ønskelig. Genene som kan anvendes i forbindelse med den foreliggende oppfinnelse inkluderer de kimære CD40 ligand genene ifølge oppfinnelsen. Det kimære CD40 ligand genet som innføres i cellene ved anvendelse av metoden er særlig valgt til å svare til det aksessoriske molekyl tilstede på overflaten av cellene for hvilke endret immunreaktivitet er ønskelig. I en særlig anvendelse av oppfinnelsen vil immunreaktiviteten til en celle som uttrykker CD40 molekylet på celleoverflaten oppnås ved å innføre genet som koder for det kimære CD40 ligand molekylet ifølge oppfinnelsen.

Immunreaktiviteten til humane eller animalske celler kan endres ved å innføre et aksessorisk molekyl ligand gen som er et kimært aksessorisk molekyl ligand gen i cellen. De forskjellige anvendbare kimære aksessoriske molekyl ligand genene ble identifisert i det foregående og vil kunne inkludere en rekke molekyler og tillater anvendelse av de unike egenskaper av disse kimære aksessoriske molekyl ligand genene for å endre immunreaktiviteten til målcellene. Kimære aksessoriske molekyl ligand gener som koder for minst en del av den aksessoriske molekyl liganden som er i stand til å binde det aksessoriske molekyl tilstede på overflaten av cellene for hvilke endret immunreaktivitet er ønsket er anvendbare.

Metodene for å endre immunreaktiviteten ser på anvendelsen av genetiske vektorer og genetiske konstrukter som inkluderer genterapivektorer som koder for en kimær CD40 ligand og som derfor inneholder et kimært CD40 ligand gen. Typisk har de genetiske vektorer og genetiske konstrukter som inkluderer genterapivektorene en promoter som er operativt koblet til det kimære CD40 ligand genet etterfulgt av en polyadenyleringssekvens. I andre utførelsesformer er det eneste krav at de genetiske vektorer, genetiske konstrukter og genterapivektorer inneholder det kimære CD40 ligand genet.

V. Metoder for å behandle neoplasier

Foreliggende oppfinnelse ser også på anvendelse av et kimært CD40 ligand gen ifølge oppfinnelsen for fremstilling av et medikament for å behandle en neoplasi. I en human neoplastisk celle innføres et kimært CD40 ligand gen slik at den kimære CD40 liganden uttrykkes på overflaten av de neoplastiske celler. Humane neoplasier kan behandles både in vivo, ex vivo og ved direkte injeksjon av forskjellige DNA molekyler som inneholder et gen som koder for en kimær CD40 ligand i pasienten. For behandling av humane neoplasier er det imidlertid som et minimum involvert innføring av genet som koder for den kimære CD40 liganden inn i de neoplastiske celler på en slik måte at disse neoplastiske celler kan uttrykke den kimære CD40 liganden på celleoverflaten. Ekspresjonen av det kimære CD40 ligand genet i disse neoplastiske celler modulerer immunsystemet til å bevirke at neoplasier reduseres eller elimineres.

For å behandle humane neoplasier er det videre foretrukket trinnene med først å oppå de humane neoplastiske celler fra et menneske og deretter innføre, i de isolerte humane neoplastiske celler, et gen som koder for en kimær CD40 ligand slik at den kimære CD40 liganden uttrykkes på overflaten av de neoplastiske celler. De humane neoplastiske celler som har den kimære CD40 liganden på overflaten av denne celle infu-seres deretter tilbake inn i pasienten. En fagkyndig på området vil forstå at en rekke metoder kan anvendes for å infusere de endrede humane neoplastiske celler som inneholder genet som koder for den kimære CD40 liganden tilbake inn i pasienten, og at disse metoder er vel kjent innen teknikken.

De metoder som man ser på for behandling av humane neoplasier er anvendbare på en rekke forskjellige humane neoplasier som inkluderer lymfomer, levkemier og andre maligniteter. I foretrukne utførelsesformer er den humane neoplasi en neoplasi som inkluderer antigenpresenterende celler av det humane . immunsystem og som inkluderer monocytter, makrofager, B celler, Langerhans celler, interdigitasjonsceller, follikulære dendrittiske celler, Kupffer celler og lignende. I andre foretrukne utførelsesformer er den humane neoplasi en levkemi, lymfom, AML, AMML, CMML, CML eller CLL, lungecancer, brystcancer, ovariecancer og andre lignende neoplasier.

De. genetiske vektorer, genetiske konstrukter og genterapivektorer som kan anvendes for å behandle humane neoplasier er blitt omtalt i det foregående og inkluderer konstrukter, hvor en promoter er operativt koblet til det kimære CD40 ligand genet som i sin tur er operativt koblet til en polyadenyleringssekvens. Metodene for å behandle humane neoplasier ser på anvendelsen av genetiske konstrukter, genetiske vektorer, genterapivektorer som beskrevet i denne beskrivelse. I tillegg ser mån på bruk av DNA som inneholder i det minste et gen som koder for et kimært CD40 ligand gen. Dette gen kan eventuelt inneholde en promoter og andre regulerende sekvenser.

j

I foretrukne utførelsesformer er celler omfattende de humane neoplasier lokalisert i minst ett definert sted betegnet et tumorleie i menneskepasienter. Dette tumorleiet inneholder typisk tumor- eller neoplastisk celle sammen med en rekke andre celler som er forbundet med tumorceller eller neoplastiske celler. Man ser på metoder for å behandle slik human neoplasi tilstede i et tumorleie ved å injisere, inn i tumorleiet til pasienten, et gen som koder for en kimær CD40 ligand slik at den kimære CD4 0 liganden uttrykkes på overflaten av tumorcellene og fører derved til at cellene deltar i en immunreaksjon. Genet som koder for den kimære CD40 liganden kan være tilstede som en del av en genterapivektor, genetisk konstrukt eller genetisk vektor.

I foretrukne utførelsesformer anvendes et kimært CD40 ligand gen ifølge krav Ir5. I andre foretrukne utførelsesformer er den kimære CD40 liganden som kodes i stand til å binde et aksessorisk molekyl tilstede på de humane neoplasier som skal behandles.

De forskjellige genterapivektorer som anvendes i behandlings-metodene inkluderer vektorer som direkte kan infisere humane celler. Slike vektorer er blitt beskrevet i litteraturen og kan lett tilpasses metodene som er beskrevet heri.

En hvilken som helst type genterapi kan anvendes som inkluderer metodene etter Raper, S.E. et al., Ann. Surg., 223:116 (1996); Lu, L. et al., Crit. Rev. Oncol. Hematol., 22:61 (1996); Koc, 0. N. et al., Semin. Oncol., 23:46 (1996); Fisher, L. J. et al., Curr. Opin. Neurobiol., 4:735 (1994); Goldspiel, B. R. et al., Clin, Pharm., 12:488 (1993); Danko, I. et al., Vaccine, 12:1499 (1994); Raz, E. et al., Proe. Nati. Acad, Sei, U.S.A., 90:4523 (1993); Sugaya, S. et al., J. Mol. Cell Cardiol., 28:133 (1996); Soubrane, C. et al., Eur. J. Cancer, 32A-691 (1996); Kass-Eisler, A. et all., ann. N. Y. Acad. Sei., 772:232 (1995); DeMatteo, R. P. et al., Ann. Surg., 222:22 9 (1995); Addison, C. L. et al., Proe. Nati. Acad. Sei, U.S.A. 92:8522 (1995); Hengge, U. R. et al., J. Clin. Invest., 97:2911 (1996); Felgner, P. L. et al., Ann. N. Y. Acad. Sei., 772:126 (1995); Furth, P. A., Hybridoma, 14:149 (1995); Yovandich, J. et al., Hum. Gene Ther., 6:603

(1995); Evans, C. H. et al., Hum. Gene Ther., 7:1261.

VI. Vaksinasj onsmetoder

Metoder for vaksinasjon av et dyr mot en forhåndsbestemt organisme kan omfatte administrering til dette dyr av en vaksine som inneholder immunogene animalske antigener i stand til å bevirke en immunrespons i dette dyret mot den ønskede organisme sammen med en vektor som inneholder et gen som koder for en kimær CD40 ligand. Metoder for å vaksinere et dyr kan også inkludere administrering av genene som koder for det immunogene antigen i stand til å bevirke en ønsket immunrespons eller endre immunresponsen til et spesielt antigen sammen med en vektor som inneholder et gen inkluderende det kimære CD40 ligand genet. I denne spesielle utførelsesform vil den eller de innførte vektorer kode for de immunogeniske antigener som er ønskelige og den ønskelige kimære CD40 liganden. Genet eller genene som koder.for det immunogeniske peptid eller peptider kan være tilstede på den samme vektor som genet eller genene som koder for den kimære CD40 liganden.

Vaksinasjonsmetodene er generelle ved at de kan anvendes for å fremstille en vaksinasjon mot en hvilken som hélst forut-bestemt organisme slik som en virus, bakterie, sopp eller annen organisme. I tillegg kan de foreliggende vaksinasjons-metoder anvendes for å danne en immunrespons mot en neoplastisk celle.

Vaksinasjonsmetodene kan. anvende en genetisk vektor, et genetisk konstrukt eller en genterapivektor som inneholder et kimært CD40 ligand gen ifølge oppfinnelsen. Vaksinasjonsmetoden kan også anvende et DNA molekyl som koder for et kimært CD40 ligand gen ifølge oppfinnelsen. Dette spesielle DNA kan eventuelt inkludere en promotersekvens som styrer ekspresjonen av det kimære CD40 ligand genet.

Vaksinasjonsmetoden kan videre også anvende en genetisk vektor som er i stand til å uttrykke en kimær CD40 ligand i en spesielle celle eller organisme sammen med en vektor som er i stand til å uttrykke i det minste ett enkelt polypeptid fra et adenovirus. Dette adenoviruspolypeptid kan uttrykkes fra den samme eller en annen vektor som uttrykker den aksessoriske molekyl liganden i denne cellen. I denne spesielle utførelsesformen er adenoviruspolypeptidet også uttrykt i minst.en celletype i organismen og tjener til å modulere immunresponsen funnet som svar på denne vaksinasj onsprosedyre.

Et kimært CD40 ligand gen kan også introduseres i celler som er tilstede i ledd i pasienter med revmatoid artritt. Det er også beskrevet at det innførte aksessoriske molekyl ligand genet omfatter minst en del av Fas ligand genet og ved ekspresjon induserer den aksessoriske ligand celledød til celler som uttrykker Fas på celleoverflaten. Denne prosess fører til reduksjonen av den destruktive inflammatoriske prosess.

VII. Metoder for å behandle artritt

Metoder for å behandle artritt omfatter å innføre i et ledd, celler som er blitt transformert med en kimær CD40 ligand. Foretrukket er ekspresjonen av denne kimære CD4 0 liganden eller stabiliteten til dette molekyl på overflaten av cellene blitt forandret. I disse foretrukne utførelsesformer fungerer den kimære CD40 liganden på en økt måte til å understøtte behandlingen av artritt i leddet. Human artritt kan behandles både in vivo, ex vivo og ved direkte injeksjon av forskjellige DNA molekyler som inneholder gener som koder for den anvendbare kimære CD4 0 liganden ifølge oppfinnelsen i pasienten. Forskjellige anvendbare prosedyrer kan utformes i forbindelse med revmatoid artritt som inkluderer dem som er beskrevet i den etterfølgende eksempeldel.

For behandling av artritt kan det anvendes kimære CD40 ligand gener ifølge oppfinnelsen. De resulterende kimære CD40 ligander har en endret stabilitet på overflaten av celler, hvorpå de uttrykkes. Denne endrede stabilitet modulerer funksjonen til immunsystemet i det lokale miljøet rundt cellene hvor disse kimære CD40 ligander er uttrykt. Det er også beskrevet heri at Fas ligand stabilitet endres på overflaten av celler i et ledd til en pasient som lider av artritt. Denne endrede stabilitet modulerer immunsystemet og fører til at cellene kan være målrettet for apoptose og således med reduksjon av immunresponsen i det betente ledd. De aksessoriske molekyl ligand genene er endret slik at den resulterende aksessoriske molekyl liganden har en endret stabilitet og bevirker en immunmodulerende effekt som kan være anvendbar for å behandle artritt.

Kimære aksessoriske molekyl ligand gener kan anvendes i behandlingen av artritt. Disse kimære aksessoriske molekyl ligand genene inneholder foretrukket minst én del av Domene IV av Fas ligand genet, som bærer effekten eller funksjonen for Fas ligand. Foretrukket er minst én del av dette domene tilstede som tillater at Fas ligand har sin biologiske effekt. Disse ligander kan inneholde domener fra andre aksessoriske molekyl ligand gener eller fra et forskjellig domene av den samme aksessoriske molekyl liganden. Særlig foretrukne er Fås kimære aksessoriske molekyl ligand gener dannet av Domene IV av den humane Fas liganden som er operativt koblet til Domene III fra mus Fas liganden. Denne spesielle kombinasjon resulterer i en mer stabil Fas ligand og således, ved å erstatte Domene III i human Fas liganden med Domene III i mus liganden, blir aktiviteten til det humane Fas ligand genet endret.

Alternativt anvendes det murine Fas ligand genet til å kode for den murine Fas liganden på overflaten av celler i stedet for den humane Fas liganden. Den murine Fas liganden er mer stabil enn den humane Fas liganden og endrer således Fas ligand aktiviteten i leddet. Den resulterende endrede Fas ligand aktiviteten er anvendbar for behandling av revmatoid artritt.

Det er videre beskrevet at effekten eller funksjonen tilstede på Domene IV av den humane Fas ligand kombineres med andre domener fra andre aksessoriske molekyl ligander. CD70 Domene III er f.eks. mere stabilt enn Domene III av den humane Fas liganden og således vil den kimære aksessoriske molekyl liganden dannet av Domene III fra den humane CD70 og Domene IV av Fas liganden sammen med andre understøttende domener være mere stabile. Den økte stabilitet fører til økt Fas ligand aktivitet. Domene III av Fas liganden kan erstattes med multiple kopier av et domene eller domener. Slike multiple kopier av domener inkluderer domener dannet av to eller flere kopier av andre domener slik som Domene III eller I av CD70 molekylet.

Aksessoriske molekyl ligand gener, slik som Fas ligand gener, hvor et spaltingssete for matriks-metalloproteinase (MMP), er blitt fjernet fra aksessorisk molekyl liganden er beskrevet. MMP kuttings- og gjenkjennelsesseter, illustrert i figur 28, er omtalt i Smith, M.M. et al., Journal of Biol. Chem 270: 6440-6449 (95) og Nagase, H., og G.B. Fields, Biopolymers (Peptide Science) 40:399-416 (96). Minst ett MMP sete kan være fjernet fra i det minste Domene III av Fas ligand genet. Fjerningen av MMP setet fra Fas ligand genet gjør liganden mer stabil og således mer effektiv i behandling av artritt.

Videre er det beskrevet at de kimære aksessoriske molekyl ligand genene er omfattet av deler av det humane Fas. ligand således, ved å erstatte Domene III i human Fas liganden med Domene III i mus liganden, blir aktiviteten til det humane Fas ligand genet endret.

Det er videre beskrevet at. effekten eller funksjonen tilstede på Domene IV av den humane Fas ligand kombineres med andre domener fra andre aksessoriske molekyl ligander. CD70 Domene III er f.eks. mere stabilt enn Domene III av den humane Fas liganden og således vil den kimære aksessoriske molekyl liganden dannet av Domene III fra den humane CD70 og Domene IV av Fas liganden sammen med andre understøttende domener være mere stabile. Den økte stabilitet fører til økt Fas ligand aktivitet. Domene III av Fas liganden kan erstattes med multiple kopier av et domene eller domener. Slike multiple kopier av domener inkluderer domener dannet av to eller flere kopier av andre domener slik som Domene III eller I av CD70 molekylet.

Aksessoriske molekyl ligand gener, slik som Fas ligand gener, hvor et spaltingssete for matriks-metalloproteinase (MMP), er blitt fjernet fra aksessorisk molekyl liganden er beskrevet. MMP kuttings- og gjenkjennelsesseter, illustrert i figur 28, er omtalt i Smith, M.M. et al., Journal of Biol. Chem 270: 6440-6449 (95) og Nagase, H., og G.B. Fields, Biopolymers (Peptide Science) 40:399-416 (96). Minst ett MMP sete kan være fjernet fra i .det minste Domene. III av Fas ligand genet. Fjerningen av MMP setet fra Fas ligand genet gjør liganden mer stabil og således mer effektiv i behandling av artritt.

Videre er det beskrevet at de kimære aksessoriske molekyl ligand genene er omfattet av deler av det humane Fas ligand genet med andre domener fra andre humane aksessorisk molekyl . ligander eller domener fra aksessorisk molekyler avledet fra andre arter. Anvendelsen av domener fra CD40 ligand, CD70 ligand, CD3 0 ligand, TNF-relatert apoptoseinduserende ligand (TRAIL) , TNFa såvel som mutanter av human Fas ligand og murin Fas ligand er beskrevet. Dannelse av slike kimære aksessoriske molekyl ligander kan lett gjennomføres ved å manipulere og produsere aksessoriske molekyl ligand gener som er kimære og som således har deler avledet fra i det minste to forskjellige aksessoriske molekyl ligand gener.

De etterfølgende eksempler er tilveiebragt for å illustrere forskjellige.aspekter at den foreliggende oppfinnelse.

EKSEMPLER

1. Ekspresjon av human og mus aksessorisk molekyl ligand i humane CLL celler

a. Konstruksjon av et genetisk konstrukt og genterapivektor som inneholder et humant gen og musegen for aksessorisk molekyl ligand

Enten det humane aksessoriske molekyl ligand genet (human CD40 ligand) eller det murine aksessoriske molekyl ligand genet (murin CD40 ligand) ble konstruert ved anvendelse av de respektive humane og murine gener. Hvert av disse gener ble klonet på følgende måte.

i.. Murin CD40- L kloning

Det totale RNA ble isolert ved anvendelse av RNA STAT-60 kittet (Tel-Test "B" Inc., Friendswood, TX) fra 1 x IO<7> B6 musesplenocytter som på forhånd var aktivert i 8 timer med immobilisert CD3-spesifikke mAb. cDNA ble deretter syntetisert med Superscript cDNA syntesekit (Gibco BRL, Grand Island, NY) ved anvendelse av oligo-dT primere. Det murine CD40 ligand (mCD40-L) genet ble deretter amplifisert fra cDNA ved PCR ved anvendelse av følgende mCD40-L spesifikke primere. 5'-GTTAAGCTTTTCAGTCAGCATGATAGAA (SEQ ID NO: 26), 5'-GTTTCTAGATCAGAGTTTGAGTAAGCC (SEQ ID NO: 27). Det amplifiserte mCD4 0-L PCR produkt ble subklonet inn i HindiII og Xbal seter av den eukaryotiske ekspresjonsvektor pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, CA) . Et DNA fragment som omfatter CMV promo.teren, mCD40-L genet og polyadenyleringssignalet ble frigjort fra denne plasmidstrukturen etter restriksjonskutt med Bglll og Xhol enzymer. Dette DNA fragment ble deretter subklonet inn i skyttelplasmid MCS(SK)pXCX2 (Spessot R, 1989, Virology 168:378) som var betegnet mCD40-L pXCX2. Dette plasmid ble anvendt for adenovirusproduksjon som beskrevet i det etter-følgende .

ii. Human CD40- L kloning

Et plasmid som inneholder genet for human CD40-L ble anvendt for å fremstille det humane CD40-L genet anvendt heri. Sekvensen til dette gen er tilgjengelig og således ble denne kilde for genet anvendt for letthets skyld. Se GenBank deponeringsnummer X67878. Dette plasmid ble anvendt for PCR amplifikasjon av det humane CD40-L genet ved anvendelse av spesifikke primere, senseprimer 5' CCAAGACTAGTTAACACAGCATGATCGAAA 3' (SEQ ID NO: 28) og anti-senseprimer 5' CCAATGCGGCCGCACTCAGAATTCAACCTG 3' (SEQ ID NO: 29) .

Disse primere inneholder flankerestriksjonsenzymseter for subkloning inn i det eukaryotiske ekspresjonsplasmid pRc/CMV (Invitrogen). Det PCR amplifiserte CD40-L fragment ble subklonet inn i Spel og Noti setene av pRc/CMV og betegnet hCD40-L pRc/CMV. Et Bglll og Chol fragment som omfatter CMV promoteren, hCD40-L genet og polyadenyleringssignalet ble deretter frigjort fra dette plasmid og subklonet inn i skyttelplasmidet MCS(SK)pXCX2 som beskrevet over. Dette plasmid ble betegnet hCD40-L pXCX2. Dette plasmid ble anvendt for adenovirusproduksjon som beskrevet senere.

iii. Adenovirussynteser

Enten mCD40-L pXCX2 eller hCD40-L pXCX2 plasmider ble ko-transferert med pJM17 (Graham og Prevec, 1991, Methods in Molecular Biology, Vol 7) inn i 2 93 celler (American Type Culture Collection, Rockvilie, MD) ved anvendelse av kalsiumfosfatmetoden (Sambrook, Fritsch og Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. utgave, kapittel 16:33-34). Isolerte adenovirusplakker ble plukket og ekspandert ved igjen å infisere 293 celler. Høytiteraderio-viruspreparater ble oppnådd som beskrevet (Graham og Prevec, 1991, Methods in Molecular Biology, Vol 7), med unntak av de følgende modifikasjoner. Cesiumkloridgradienten anvendt for konsentrasjon av viruspartikler var en trinn-gradient med densiteter på 1,45 g/cm<3> og 1,2 g/cm<3>. Prøvene ble rotert i en SW41 rotor (Beckman, Brea, CA) ved 25.000 opm ved 4°C. Virus-båndet ble avsaltet ved anvendelse av en Sephadex G25 DNA kolonne (Pharmacia, Piscataway, NJ). Det isolerte virus ble lagret ved 70°C i fosfatbufret saltoppløsning med 10% glyserol. Virus titer ble bestemt ved å infisere 293 celler med seriefortynninger av det rensede adenovirus og med telling av antall dannede plakker. Virustiteret strekker seg typisk fra 10<10> til 10<12> plakkdannelsesenheter/ml (PFU/ml).

b. Introduksjon av et murint eller humant aksessorisk molekyl ligand gen inn i CLL celler og HeLa celler. For adenovirusinfeksjon ble 10<6> nytinte og vaskede CLL celler eller HeLa celler suspendert i 0,5 til 1 ml kulturmedium for dyrking ved 37°C i en 5% C02-i-luft inkubator. Adenovirus ble tilsatt til cellene ved varierende "multiplicity of infection" (MOI), og de infiserte celler ble dyrket i 48 timer dersom ikke annet er angitt, før de analyseres for transgenekspresj on.

c. Ekspres-ion av et aksessorisk molekyl ligand aen i CLL

celler og HeLa celler .

CLL og HeLa cellene som var infisert med adenovirusvektoren som inneholder enten mus eller humane CD40 ligand gener fremstilt i eksempel lb. ble deretter merket med kommersielt tilgjengelige monoklonale antistoffer som er immunspesifikke for enten den humane eller mus CD40 liganden (Pharmingen, San Diego, CA) ved anvendelse av produsentens retningslinjer. CLL og HeLa cellene ble vasket i merkingsmedium (SM) som omfattet RPMI-1640, 3% føtalt kalveserum og 0,05% natriumazid og som inneholdt propidiumjodid og ble deretter analysert på en FACScan (Becton Dickinson, San Jose, CA). Døde celler og debris ble ekskludert fra analyse ved karakteristiske spred-ningsprofiler med foroverrettet lys og sidelys og propidium-jodidmerking. Overflateantigenekspresjon ble målt som gjennomsnittlig fluorescensintensitetforhold (MFIR). MFIR er lik gjennomsnittlig fluorescensintensitet (MFI) for celler merket med et spesifikt.FITC-konjugert MoAb, dividert med MFI for celler merket med et kontroll IgG-FITC. Denne metode kontrol-lerer de ikke-spesifikke økninger i autofluorescens som man ser i større, mere aktiverte celler.

Histogrammehe, dannet for CLL cellene og HeLa cellene som inneholder enten en genetisk vektor som inneholder det humane CD40 ligand genet eller det murine CD40 ligand genet og de passende kontroller, er vist i figur 3A-3D. Ekspresjonen av både det murine og humane aksessorisk molekyl ligand genet (CD4 0 ligand) i HeLa celler er vist i henholdsvis figurer 3A og 3B. Ekspresjonen av den murine og humane aksessorisk molekyl liganden i CLL cellene er vist i figur 3C og 3D. Ekspresjon av et aksessorisk molekyl ligand gen i CLL celler og ekspresjon av murin CD40 ligand på overflaten av CLL cellen er vist i figur 3C. Svikten i ekspresjonen av human aksessorisk molekyl ligand på overflaten av CLL cellene er vist i figur 3D.

Figur 8 viser data fra et forsøk som er utført for å under-søke om CD4<+> T celler fra CLL pasienter kunne induseres til å uttrykke aksessorisk molekyl ligand mRNA etter CD3 ligering. En ELISA-basert kvantitativ konkurrerende RT-PCR ble anvendt for å måle CD40 ligand transkriptnivåene. I dette forsøk blir CD4 0 ligand og RNA transkribert fra CD40 ligand genet i CLL celler sammenlignet med nivåer av CD40 ligand og RNA dannet i normale donorceller, etter induksjon ved CD3 ligering. For

CD3 aktivering, ble platebelegg av CD3 mAb dannet og inkubert med utplatet CLL eller normale donor-mononukleære celler i den indikerte tidsperiode, hvoretter cellen ble analysert for ekspresjon av overflateantigener eller CD154 RNA budbringer-nivåer. CLL eller normalt donorserum ble tilsatt til cellene på begynnelsen av aktiveringsanalysen for å undersøke modulering av CD40 ligand overflateekspresjon.

For kvantitativ CD154 RT-PCR ELISA, ble total RNA ekstrahert og konkurrerende RNA ble dannet fra innskuddet som inneholder CD40 ligand (CD154) cDNA. Varierende mengder konkurrerende RNA ble tilsatt til separate brønner av isolert total RNA som deretter ble omdannet til. cDNA. CD3 aktivering, ELISA'er og PCR reaksjoner ble utført som beskrevet i Cantwell, M. et al., Nature Medicine 3:984-989 (1997). Biotinylerte PCR produkter ble festet på mikrotiterplater (Becton, Dickinson, Oxnard, CA) belagt med streptavidin (Sigma) og inkubert. Platen ble behandlet med NaOH for å fjerne sensetrådene og deretter vasket. DNA ble deretter hybridisert med enten villtype genspesifikke eller konkurrentspesifikke oligo-nukleotider. Ved anvendelse av terminal transferase ble hver probe merket med et digoksigenin-ll-dideoksyUTP molekyl (Boehringer Mannheim). Platen ble inkubert og vasket med HYBE buffer og blokkeringsbuffer, og deretter ble peroksidase-konjugert anti-digoksigeninantistoff (150 U/ml; Boehringer Mannheim) i blokkeringsbuffer tilsatt. TMB (tetrametyl-benzidin) og peroksidase (Kirkegaard og Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) ble tilsatt for fargeutvikling, og optiske densiteter ble målt ved 450 nm og Deltasoft II (Biometallics, Princeton, NJ) ble anvendt for dataanalyser.

Standardkurver som plotter mol RNA produkt versus optisk densitet ble fremstilt for standard cDNA reaksjoner. Ligninger som beskriver disse standardkurver ble deretter anvendt for å beregne mol villtype eller konkurrent DNA tilstede i de ukjente PCR reaksjoner basert på optiske densiteter oppnådd i ELISA avlesningene. Forholdet mellom mengden villtype DNA og mengden konkurrent DNA ble deretter plottet mot den kjente mengde konkurrent- RNA tilsatt i de initiale prøver. Et forhold på 1 ble tatt for ekstrapolering-en av mengden av ukjente mol target RNA i prøven (et forhold på 1 betyr at mengden target RNA versus konkurrent RNA er lik). Molekylene av target RNA per CD4 celle ble deretter beregnet basert på følgende formel: [(mol target CD154 RNA) x (6 X IO23 molekyler/mol) x fortynningsfaktor av test RNA)]/(% av CD4 T celler i total cellepopulasjon).

Den.øverste kurven i figur 8 viser at T celler hos pasienter med CLL ikke uttrykker detekterbar CD40 ligand etter CD3 ligering. CD40 ligand RNA dannes, men er ikke stabil. Skjønt både CD4 0 ligand og CD40 ligand RNA uttrykkes i normale donor T celler (nederste kurve), blir hverken nivåene av protein eller RNA opprettholdt stabilt.

Figur 9 viser et tidsforløp for overflateekspresjon av CD40 ligand. Ekspresjonen nådde et toppnivå 48 timer etter infeksjon og vedvarte ved høye nivåer i minst 6 døgn deretter. I dette forsøk ble CLL B celler infisert med en genterapivektor som inneholder en aksessorisk molekyl ligand, ved en MOI på 1000 ved tiden 0, og ble deretter bestemt ved flow cytometri ved forskjellige påfølgende tidspunkter. I hvert tidspunkt som er angitt på abscissen, er andelene levedyktige CLL B celler som uttrykte detekterbare CD154 indikert ved de vertikale søyler som svarer til prosentandelskalaen angitt på brdinaten på høyre side. d. Funksjon av humane og murine aksessorisk molekyl ligander i. Induksjon av CD80 og CD54 på celler inneholdende en genterapivektor som koder for et aksessorisk

molekyl

CLL cellene infisert med det murine aksessorisk molekyl ligand genet fremstilt i eksempel lb. ble deretter dyrket i vevskulturplater. CLL cellene ble deretter analysert ved anvendelse av multiparameter FACS analyse for å detektere induksjon av CD80 og CD54 ekspresjon ved anvendelse av fluroescein isotiocyanatkonjugerte monoklonale antistoffer som er immunspesifikke for hvert av disse respektive over-flat eantigener. Ikke-infiserte CLL celler ble anvendt som en kontroll. Cellene ble underkastet passende FACS analyse og histogrammer ble dannet. CD80 mAb ble oppnådd fra Dr. Edward Clark og CD54 mAb ble oppnådd fra CALTAG Inc. CD80 ble konjugert ved anvendelse av standard metoder som er blitt beskrevet i Kipps et al., Laboratory Immunolbgy II, 12.237-275 (1992) .

Resultatene fra denne analyse er vist i figur 4A-4D. Figurene 4A-4B sammenligner mengden CD54 ekspresjon i CLL celler som ikke er blitt transfektert (figur 4A) eller CLL celler inn i hvilke en genterapivektor som inneholder det murine CD40 ligand genet var innført (figur 4B). Den skyggelagte kurve indikerer isotypekontrollen for FACS farging og den åpne kurve indikerer cellen merket med anti-CD54 antistoffet. Disse resultater viser at ekspresjonsnivået av CD54 økes i CLL celler inn i hvilke genterapivektoren inneholdende den murine CD4 0 ligand var innført.

Figurer 4C og 4D sammenligner mengden CD80 ekspresjon i CLL celler som ikke er blitt transfektert (figur 4C) eller CLL celler inn i hvilke en genterapivektor som inneholder det murine CD40 ligand gen var innført (figur 4D). Den skyggelagte kurve indikerer isotypekontrollen for FACS merking og den åpne kurve indikerer cellene merket med anti-CD80 antistoffet. Disse resultater viser at ekspresjonsnivået for . CD80 er økt i CLL cellene inn i hvilke genterapivektoren inneholdende den murine CD40 ligand var innført.

I et ytterligere forsøk ble CLL celler infisert med en genterapivektor inneholdende det murine aksessorisk molekyl ligand genet evaluert ved flow cytometri for indusert ekspresjon av ikke bare CD54 og CD80, men også CD86, CD58, CD70 og CD95. Fluorescein-korijugert mAb spesifikk for human CD54 og CD70 ble oppnådd fra CALTAG. Fluorescein-konjugert mAb spesifikk for human CD27, CD58, CD80, CD86 eller CD95, og fycoerytrin-konjugert mAb spesifikk for human eller mus CD40 ligand, ble oppnådd fra PharMingen. Skyggelagte histogrammer representerer merking av CLL B celler med FITC-konjugert isotype ikke-spesifikk mAb. I motsetning til ikke-infiserte CLL celler (figur 10, histogrammer med en tynn linje), eller Ad-lacZ-infiserte CLL celler (data lignende dem oppnådd med ikke-infiserte celler, men ikke vist), uttrykte CLL celler infisert med adenovirusvektor som koder for CD40 liganden (CD154) høye nivåer av CD54 (figur 10, øverst til venstre), CD80 (figur 10, øverst i midten), CD86 (figur 10, øverst til høyre), CD58 (figur 10, nederst til venstre), CD70 (figur.10, nederst i midten) og CD95 (figur 10, nederst til høyre). På den annen side uttrykte CD40 ligand-CLL (CD154 CLL) signifikant lavere nivåer av både membran CD27 (figur 11A, histogram med tykk linje) og oppløselig CD27 (figur 11B) enn ikke-inf iserte (figur 11A, histogram med tynn linje) (P < 0.01, Bonferroni t-test) eller Ad-lacZ-infiserte CLL celler (data lignende dem oppnådd med ikke-infiserte celler, men ikke vist) . I dette forsøk som vist i figur 11A, ble CLL B cellene undersøkt for ekspresjon av CD27 via flow cytometri, tre døgn etter infeksjon. Skyggelagte histogrammer representerer merking av CLL B celler med FITC-konjugert isotype kontroll mAb. I figur 11B, ble cellefrie supernatanter samlet, etter infeksjon eller stimulering av CLL B celler, i 72 timer og testet for konsentrasjon av human CD27 ved hjelp av ELISA. Den reduserte ekspresjon av CD27 (figur 11B) er lignende den notert for levkemi B celler stimulert via CD40 tverrbinding med mAb G28-5 presentert ved CD32-uttrykkende L celler, som beskrevet i Rassenti, L.Z. og T.J. Kipps, J. Exp. Med. 185:1435-1445. ii. Allogeneiske T celle responser på CLL celler in i hvilke en genetisk terapivektor inneholdende et

murint CD40 ligand gen er blitt innført.

Den evne som CLL celler som er blitt infisert med genterapivektor inneholdende det murine CD40 ligand genet har til å stimulere allogeneiske T celler (dvs. fra et annet individ) ble analysert ved anvendelse av celleproliferasjonsanalyse. Kort ble testcellene ko-dyrket med den genetiske terapivektor inneholdende lacZ-genet eller det murine CD40-ligand genet ved en MOI på 1.000 i nærvær av IL-4 i en konsentrasjon på 10 ng/ml. I andre prøver ble CLL-cellene stimulert med MOPC21 (en kontroll IgG) eller G28-5 (et anti-CD40 monoklonalt antistoff) eller ble preinkubert på CD32-L celler og samtidig behandlet med IL-4. Preinkubasjonen med CD32-L-cellene sammen med IL-4 behandling er blitt vist til å være en effektiv form av tverrbinding av CD40 molekylet annet enn direkte gentransfeksjon.

Etter tre døgns dyrking ved 37°C ble disse celler behandlet med mitomycin C for å forhindre deres proliferasjon og ble deretter anvendt til å stimulere allogeneiske T celler. Før denne ko-dyrking, hadde de forskjellige prøver av CLL celler enten blitt behandlet med anti-CD40 monoklonalt antistoff eller de var blitt infisert med genterapivektor inneholdende enten lacZ eller det murine CD40 ligand genet ved et stimu-latorforhold på 1:10. Etter to døgns dyrking ved 37°C ble interferon gamma (IFNg) produksjon målt ved ELISA-analyse. Etter fem døgns ko-dyrking ved 37°C, ble innlemmelsen av <3>H-thymidin i replikerende celler målt etter en åtte timers pulsmarkør. Resultatene fra denne analyse er vist i tabell II i det etterfølgende og i fig. 5.

I et annet forsøk ble CLL B celler infisert med genterapivektoren inneholdende CD40 ligand genet evaluert for deres evne til å virke som stimulatorceller i en allogeneisk blandet lymfocytt T cellereaksjon (MLTR). Parallelt ble også den stimulerende kapasitet til kontroll lacZ-vektorinfiserte CLL celler og CLL B celler som var blitt dyrket med CD32-L-celler og et anti-CD40 mAb (G28-5) eller et isotype kontroll lg, undersøkt som beskrevet i Ranheim, E.A. og T.J. Kipps, J. Exp. Med., 177:925-935 (1993), Clark, E.A. og J.A. Ledbetter, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 83:4494-4498 (1986) og Banchereau, J. et al, Science 251:70-72 (1991). Effektor T-celler fra en ikke-relatert donor ble ko-dyrket med CLL stimulator-cellene ved et effektor til target forhold på 4:1. Etter 18 timers dyrking ved 37°C ble over 30 % av de allogeneiske CD3<+> celler funnet til å uttrykke det aktiverings-assosierte antigen CD69 når dyrket med CD154-CLL celler (data ikke vist). I motsetning uttrykte mindre enn 4 % av T-cellene CD69 når ko-dyrket med ikke-infiserte eller Ad-lacZ-infiserte CLL celler (data ikke vist).

To dager etter initieringen av MLTR ble konsentrasjonene av IFNg i kultursupernatantene bestemt ved ELISA. Supernatantene av MLTR stimulert med CLL celler infisert med den aksessoriske molekyl liganden CD40L (fig. 12A, CD154-CLL) inneholdt signifikant høyere nivåer av IFNg (3 06 + 5 mg/ml, m + SE, n = 3) enn MLTR kulturer stimulert med anti-CD40 mAb

(fig. 12A, aCD40-CLL) (23 ± 3 ng/ml) (P < 0,05, Bonferroni t-test). Sistnevnte var ikke signifikant forskjellig fra den for MLTR kulturer stimulert med kontroll Ad-LacZ-infiserte CLL celler (fig. 12A, lacZ-CLL) (43 ± 10 ng/ml) (P > 0,1, Bonferroni t-test). Supernatantene til effektorceller alene, eller til MLTR kulturer stimulert med ikke-infiserte CLL celler (fig. 12A, CLL) eller kontroll lg behandlede CLL celler (fig. 12A, MOPC-CLL), inneholdt ikke detekterbare mengder IFNg (< 2 ng/ml). Likeledes dannet ingen av levkemi B celle populasjonene detekterbare mengder IFNg når de ble dyrket alene, uten tilsatte effektor T celler (data ikke vist).

Etter fem døgn ble celleproliferasjon bestemt ved innlemmelse av <3>H-thymidin. Kulturer med isotype kontroll IgG-behandlede (fig. 12B, MOPC-CLL) eller ikke-infiserte (fig. 12B, CLL) stimulatorceller innlemmer ikke mere.<3>H-thymidin enn kulturer uten tilsatte levkemistimulatorceller (fig. 12B, ingen). Ad-lacZ-infiserte CLL B celler (fig. 12B, lacZ-CLL) var heller ikke i stand til å stimulere allogeneiske T celler til å innlemme mengder av <3>H-thymidin som var større enn dem til kontrollkulturer. I motsetning til dette induserte anti-CD40-stimulerte levkemiceller eller CD154-CLL celler hver signifikant effektor celleproliferasjon (fig. 12B, aCD40-CLL eller CD154-CLL) (P < 0,05> Bonferroni t-test). Dessuten var mengden <3>H-thymidin innlemmet ved kulturer stimulert med CD154-CLL celler (41.004 + 761 cpm (m + SE), n = 3) signifikant større enn den til kulturer stimulert med et likt antall aCD40-CLL celler (22.935 ± 1.892 cpm, n = 3) (P < 0,05, Bonferroni t-test). Ingen av disse mitomycin-C-behandlede levkemicellepopulasjoner innlemmet imidlertid <3>H-thymidin når de ble dyrket uten effektor T celler (data ikke vist) . ' Også, som beskrevet for MLTR mellom allogeneiske T celler og CD40-stimulerte CLL celler {6549, 7167, 7168}, kunne allogenisk T celle proliferasjon som svar på CD154-CLL inhiberes ved CTLA-4-Ig eller CDlla mAb når tilsatt ved initieringen av MLTR, noe som indikerer at respektive interaksjoner mellom CD80/CD86 og CD28, eller CD4 rog CDlla/CD18 bidrar til den konstaterte allogeneiske T celle reaksjon (data ikke vist). iii. Stimulering av gamma interferon ved CLL celler inneholdende et aksessorisk molekyl ligand gen Funksjonen til CLL celler inneholdende et aksessorisk molekyl ligand gen (mus CD40 ligand) ble analysert ved å bestemme den evnen som disse celler har til å aktivere T lymfocytter. Prosedyren ble utført som følger: allogeneiske T lymfocytter fra en frisk donor (mer enn 90 % CD3<+>) ble renset ved anvendelse av magnetiske kuler og monoklonale antistoffer spesifikke for CD14 og CD19 antigenet. Disse allogeneiske T lymfocytter ble deretter dyrket sammen med MMC-?behandlede CLL celler som ble infisert med det aksessoriske molekyl ligandgenet (murin CD40 ligand) eller lacZ-genet. Denne ko-dyrking ble utført i RPMI-1640 medium inneholdende 10 % føtalt kalveserum. Etter dyrking i 24 timer ble cellene samlet og analysert for å bestemme ekspresjon av antigenet CD69 på T lymfocyttene ved anvendelse av en standard FACS sorterings-prosedyre. Cellekultursupernatantene ble samlet etter to døgn i kultur og testet for å bestemme konsentrasjonen av human interferon gamma ved anvendelse av en ELISA test. En del av CLL cellene inneholdende et aksessorisk molekyl ligand gen (murin CD40 ligand) eller en del av cellene inneholdende adenoviruset som uttrykker lacZ ble dyrket i nærvær av human interleukin 4 IL-4 (5 ng/ml). Dannelsen av interferon gamma ved allogeneiske T lymfocytter i nærvær av denne mengde humant interleukin 4 ble også analysert. Resultatene fra disse analyser er vist i fig. 6.

Som man kan se produserte de humane CLL celler som inneholdt det aksessoriske molekyl ligand genet (murin CD40) vesentlig høyere konsentrasjoner av interferon gamma i cellekultur-supernatanten sammenlignet med CLL celler som inneholdt LacZ-genet. Den økte produksjon av interferon gamme (IFNg) ved T lymfocytter eksponert for CLL celler inneholdende det aksessoriske molekyl ligand genet indikerer at disse CLL celler som inneholder de aksessoriske molekyl ligand genene var effektive til å gi en økt immunrespons.

iv. Stimulering av allogeneiske T celler pre— eksponert for ikke- modifiserte CLL B celler inneholdende et aksessorisk molekyl ligand gen. Tidligere studier har indikert at antigen presentasjon overfor T celler i fravær av signalene avledet fra ko-stimulerr ende molekyler slik som CD28, kan føre til spesifikk T celle klonal anergi. For denne reaksjon ble allogeneiske T celler som på forhånd var blitt dyrket med ikke-modifiserte CLL B celler som mangler ekspresjon av CD80 og andre immune aksessoriske molekyler, testet for deres evne til å respondere på CLL celler inneholdende CD40 ligand genet. Allogeneiske effektorceller innlemmet ikke mer <3>H-thymidin som svar på ikke-modifiserte CLL celler (fig. 12C, CLL), eller kontroll CLL celler infisert med Ad-lacZ (fig. 12C, lacZ-

CLL), enn når de ble dyrket alene (fig. 12C, ingen). I motsetning, til og med etter tidligere ko-dyrking med ikke-modifiserte CLL B celler, kunne allogeneiske effektor celler fremdeles induseres til å proliferere (fig. 12C, CD154-CLL) eller til å produsere IFNg (fig. 12D, CD154 CLL) som svar på celler som uttrykker en aksessorisk molekyl ligand. Skjønt beskjedne mengder-IFNg ble detektert i supernatantene til slike sekundære kulturer når Ad-lacZ-infiserte levkemiceller ble anvendt som stimulatorceller (fig. 12D, lacZ-CLL), var dette nivå signifikant lavere enn det som er registrert for sekundære kulturer med Ad-CD40-ligandinfiserte CLL celler (fig. 12D, CD154-CLL) (P < 0,05, Bonferroni t-test). Likeledes inneholdt supernatanten av levkemiceller alene (data ikke vist), og effektorcellene alene (fig. 12D, ingen), fra MLTR kulturene stimulert med ikke-infiserte CLL celler (fig. 12D, CLL), neglisjerbare mengder IFNg (<2 ng/ml). Disse resultater indikerer at allogeneiske effektorceller dyrket med ikke-modifiserte CLL B celler ikke utelukkes fra å respondere på CLL B celler infisert med en genterapivektor inneholdende det aksessoriske molekyl ligand genet.

v. Autologe T celle responser på CLL celler inn i hvilke en genterapivektor som koder for et murin

aksessorisk molekyl ligand gen er blitt innført.

T celler isolert fra blodet til CLL pasienter ble undersøkt for deres evne til respondere, in vitro, på autologe CLL B celler inneholdende en genterapivektor som koder for den murine aksessorisk molekyl CD40 liganden. T celler ble isolert til > 95 % renhet og deretter ko-dyrket med mitomycin-C-behandlede autologe levkemiceller i serumfritt AIM-V medium supplert med eksogen inerleukin-2 med 25 U/ml. Beskjeden <3>H-thymidininnlemmelse (s 10.000 cpm) ble detektert i kulturer uten tilsatte stimulatorceller, delvis sekundært til eksogent IL-2 (fig. 13A, og data ikke vist). Nivået av T celle proliferasjon økte imidlertid ikke som svar på ikke-infiserte CLL celler (fig. 13A, CLL) eller Ad-lacZ-infiserte CLL celler (fig. 13A, lacZ-CLL). I motsetning induserte CLL celler infisert med en genterapivektor inneholdende den aksessoriske molekyl liganden (fig. 13A, CD154-CLL) autologe T celler til å innlemme signifikant mere <3>H-thymidin (17 368 ± 1093 cpm, n = 3) enn noen av kontrollkulturene (P < 0,05, Bonferroni t-test). Videre dannet også MLTR stimulert med CLL celler infisert med en vektor som koder for en aksessorisk molekyl ligand (CD40L) signifikant mere IFNg (165 3 ng/ml, n = 3) enn noen av de andre kulturer (fig. 13B) (P

< 0,05, Bonferroni t-test).

T cellene ble høstet etter 5 døgn fra den autologe MLTR og målt for CTL aktivitet mot autologe CLL B celler. T celler ko-dyrket med autologe CD40-ligand-CLL celler utviklet CTL aktivitet for ikke-modifiserte CLL B celler, og bevirket 40,1 % lysis (± 2,3 %) ved et E:T forhold på 2:1 (fig. 13C, CD154). Slike T celler utviklet imidlertid ikke detekterbar CTL aktivitet for de samme målceller i kontrollreaksjonene når de ble ko-dyrket med ikke-infiserte eller Ad-lacZ-infiserte CLL celler (fig. 13C).

vi. Spesifisitet av CTL stimulert ved autologe CD40-ligand- CLL B celler for allogeneiske CLL B

celler.

Effektorceller stimulert med autolog CD40-ligand-CLL ble evaluert for deres evne til å utskille IFNg eller manifestere CTL aktivitet overfor allogeneiske CLL B celler (fig. 14). Etter 5 døgn av autolog MLTR med CD154-CLL eller lacZ-CLL, ble T celler isolert ved Ficoll densitet gradient sentri-fugering, vasket omfattende og' deretter dyrket i medier i 24 timer. Vaskede T celler ble blandet med autologe ("Auto CLL", fylt stolpe) eller allogeneiske ("Allo-1 CLL" eller "Allo-2 CLL", skyggelagte eller skraverte stolper) target CLL B celler. T celler stimulert i den autologe MLTR med CD40-ligand-CLL celler, men ikke med lacZ-CLL celler, produserte signifikant mere IFNg som svar på sekundær dyrking med ikke-modifiserte autologe CLL B celler enn med allogeneiske CLL B celler (fig. 14A) (P < 0,05, Bonferroni t-test). Videre var T celler stimulert med CD40-ligand-CLL celler, men ikke med lacZ-CLL celler, cytotoksiske for autologe CLL celler, men ikke for allogeneiske CLL celler (fig. 14B). Liknende resultater ble oppnådd med de autologe MLTR-aktiverte T celler til den allogeneiske donor, som igjen demonstrerer spesifikk cytoksisitet for autologe CLL B celler (data ikke vist). Endelig kunne W6/32, et mAb mot klasse I "major histocompatibility complex" (MHC I) antigener signifikant inhibere cytotoksisiteten til T celler stimulert med CD40-ligand-CLL celler, for autologe CLL B celler (fig. 14C, aHLA-klasse I) (P < 0,05, Bonferroni t-test). Slik inhibering ble ikke observert med mAb spesifikk for MHC klasse II antigen (fig. 14C, aHLA-DP), mAb spesifikk for Fas-liganden (fig. 14C, aFasL), eller et isotype-kontroll mAb med irrelevant spesifisitet (fig. 14C, MOPC-21). Samlet indikerer disse studier at Ad-CD40-ligand-infiserte CLL celler kan indusere en autolog anti-levkemi cellulær immunrespons in vitro som fører til dannelsen av MHC-klasse I-begrenset CTL spesifikk for autologe ikke-modifiserte leukemi B celler.

e . Transaktivering av ikke- infiserte bystander leukemi B

celler ved Ad- CD40L CLL celler.

For å se på om forandringene i tumormarkørekspresjon (beskrevet i avsnitt Idi.) er et resultat av intracellulær versus intercellulær stimulering, ble effekten av kultur-densitet på den induserte ekspresjon av CD54 og CD80 etter infeksjon med adenovirus genterapivektor som koder for aksessorisk molekyl liganden (CD40L eller CD154) undersøkt. Etter infeksjon ble CLL celler dyrket ved standard høy densitet (f.eks. 1 x IO<6> celler/ml) eller lav densitet (f.eks. 2 x IO<5> celler/ml) i 3 døgn ved 37°C. Celler med høy tetthet som ble utplatet inneholdt homotypiske aggregater, mens celler med lav densitet som ble utplatet forble jevnt dispergert og uten vesentlig celle-celle kontakt (data ikke vist). Til tross for å uttrykke liknende nivåer av heterolog CD154, ble CD154-CLL B celler dyrket ved høy tetthet indusert til å uttrykke høyere nivåer av CD54 og CD80 enn CD154-CLL celler dyrket ved lav tetthet (fig. 15A). Stimuleringen oppnådd ved høy tetthet kunne inhiberes ved å dyrke cellene med et hamster anti-mus CD154 mAb i stand til å blokkere CD40<->CD154 interaksjoner (fig. 15B, aCD154 Ab).^ Samlet indikerer disse studier at CD154-CLL celler kan aktivere hverandre in-trans og at overflateekspresjon av CD154 er nødvendig for optimal levkemicellestimulering.

I tillegg ble Ad-CD154-infiserte, ikke-infiserte, Ad-lacZ-inf iserte eller G28-5-stimulerte CLL celler merket med en grønn fluorescerende farge for å undersøke om CD154-CLL kunne stimulere ikke-infiserte bystander leukemiceller. Farge-merkede celler ble anvendt som stimulatorceller for like antall ikke-merkede syngeneiske CLL B celler. Etter 2 døgns dyrking bibeholdt stimulatorceller dyrket for seg selv den grønne flurescensfarge, som tillot at slike celler kunne skjelnes fra ikke-merkede CLL celler ved flow cytometri. Bystander {grønn-fluorescens-negative) CD19<+> CLL B celler ble indusert til å uttrykke CD54 (fig. 15C, høyre histogram) eller CD86 (fig. 15D, høyre histogram) når de ko-dyrkes med Ad-CD154-infiserte levkemi B celler, men ikke med mock-infiserte CLL celler (fig. 15C og 15D, venstre histogrammer), G28-5-stimulerte CLL celler eller Ad-lacZ-infiserte CLL celler (data ikke vist). Som forventet var disse bystander (grønn-fluorescens-negative) CLL celler også negative for heterolog CD154.

f. Behandling av levkemi med genterapivektorer som koder for en aksessorisk molekyl ligand.

Fig. 24 viser en oversikt over et klinisk forsøk for å teste behandlingen av B celle CLL med adenovirus genterapivektorer som koder for modifisert CD40 ligand. Levkemiceller som er høstet ved ferese infiseres med replikasjons-defekte vektorer som koder for den modifisérte CD40 ligand. Etter ekspresjon av dette protein, administreres cellene tilbake til pasienten for å stimulere en vert anti-levkemicelle-immunrespons. Denne strategi er. langt overlegen den som anvender genterapi for å påvirke ekspresjon av kun ett immunstimulerende molekyl på levkemi celle overflate. Denne strategi resulterer faktisk i at levkemiceller uttrykker en oppstilling av immun1-stimulerende aksessoriske molekyler og cytokiner, såvel som et molekyl som kan bevirke de samme forandringer i levkemiceller til pasienten som aldri ble høstet. 2 . Ekspresjon av kimære aksessoriske molekyl ligand gener De kimære aksessoriske molekyl ligand gener som beskrevet under fremstilles ved anvendelse av standard teknikker som beskrevet heri.

a. Fremstilling av kimære aksessoriske molekyl ligand gener ved anvendelse av domener fra to ulike

aksessoriske molekyl gener

Det human CD40 ligand genet ble isolert fra RNA fremstilt fra T celler som var blitt aktivert ved hjelp av et anti-CD3 monoklonalt antistoff ved anvendelse av 5<1> og 3<1> primere sammen med vel kjente PCR metoder. Kimære aksessoriske molekyl gener av human CD40 ligand og murin CD40 ligand konstrueres fra det nylig klonede humane CD40 ligand genet og mus CD40 ligand genet beskrevet heri som SEQ ID NO: 2. Transmembran- og cytoplasmatiske domener av humane CD40 ligand gener byttes med dem til det murine CD40 ligand genet og betegnet H(Ex)-M(Tm-Cy) CD40 ligand. Disse kimære aksessoriske molekyl ligand gener produseres ved anvendelse av genomdanneIsesteknikken beskrevet som SOEN som tidligere er blitt beskrevet av Horton, Mol. Biotechnol., 3:93 (1995). Et diagram som viser de kimære aksessoriske molekyl ligand genene som produseres er vist i fig. 4. Nukleotidsekvensene til hver av disse respektive kimære aksessoriske molekyl ligand gener er betegnet SEQ ID NO: 3-7 som indikert i

tabellen i det etterfølgende.

Adenovirusvektorer som koder for hvert av de kimære aksessoriske molekyler som er vist i fig. 2 konstrueres ved anvendelse av metoder beskrevet i eksempel 1. Hver av disse strukturer transfekteres deretter inn i enten HeLa celler eller CLL celler i henhold til metodene i eksempel 1.

b. Ekspresjon av kimære aksessoriske molekyl ligander på

CLL og HeLa celler.

Ekspresjonen av hvert av de kimære aksessoriske molekyl ligand gener som er konstruert i det foregående analyseres ved anvendelse av FACS analyse som spesifisert i eksempel 1. Det passende monoklonale antistoff som er immunspesifikt for det eksterne domene til enten human eller mus CD40 ligand selekteres og anvendes for å bestemme nivået for ekspresjon av de kimære aksessoriske molekyler på overflaten av disse celler. Etter passende analyse og fremstilling av passende histogrammer bekreftes ekspresjonen av kimære aksessoriske molekyler inneholdende minst en del av det murine CD40 ligand genet.

c. Funksjon av kimære aksessoriske molekyl ligander.

CLL celler infiseres med forskjellige MOI av mCD40L adenoviruset og dyrkes deretter i 48 eller 24 brønns vevskulturplater i forskjellige tidsperioder etter infeksjon (48, 72 og 96 timer). CD19<+> B cellene analyseres deretter ved multiparameter FACS analyse for induksjon av CD80 og CD54 ekspresjon ved anvendelse av fluorescein isotiocyanat-konjugert mAb spesifikk for hvert respektive overflateantigen som er beskrevet i eksempel 1. Økte mengder CD54 og CD80 er funnet på celler som har de kimære aksessoriske molekyler som inneholder domenet eller domenene avledet fra mus CD40 ligandgenet.

Videre analyse av cellene som inneholder de kimære aksessoriske molekyl genene gjennomføres i henhold til eksempel 1(d). Cellene som inneholder de kimære aksessoriske molekyl genene som inneholder domenene avledet fra det murine CD40 ligand genet er i stand til å stimulere produksjon av gamma interferon og T celle proliferasjon. d. Ekspresjon av kimære aksessoriske molekyl gener som inneholder proksimale ekstracellulære domener fra to forskjellige aksessoriske molekyler fra de samme s<p>esies.

Et kimært aksessorisk molekyl ligand gen fremstilles som inneholder det proksimale ekstracellulære domene fra det humane CD70 gen (domene III) med resten av domene avledet fra det humane CD40 ligand genet. Dette gen fremstilles ved anvendelse av standard biologiske teknikker som beskrevet tidligere heri. Dette kimære aksessoriske molekyl ligand genet har DNA sekvensen vist som SEQ ID No: 19. Et annet kimært aksessorisk molekyl ligand gen fremstilles som inneholder det proksimale ekstracellulære domene fra det murine CD4 0 ligand genet med resten av domenene avledet fra det humane CD40 ligand genet. Dette gen fremstilles ved anvendelse av standard teknikker som er beskrevet tidligere heri.. Dette kimære aksessorisk molekyl ligand genet har DNA sekvensen vist som SEQ ID No: 20.

De kimære aksessoriske molekyl genene vist som SEQ ID Nos: 19 og 2 0 innføres i passende vektorer som beskrevet i eksempel 1 og innføres i humane neoplastiske celler. Ekspresjonen av dette kimære aksessoriske molekyl gen i cellene bestemmes som beskrevet i eksempel 1.

Det kimære aksessoriske molekyl som hvert av disse kimære aksessoriske molekyl genene koder for finner man på overflaten av de humane neoplastiske celler ved anvendelse av FACS analyse beskrevet i eksempel 1. Økte mengder CD54 og CD80 er funnet på cellene som inneholder de kimære aksessoriske molekyl genene ved anvendelse av teknikken beskrevet i eksempel 1. Cellene som inneholder det kimære aksessoriske molekyl genet er i stand til å stimulere produksjonen av gamma interferon og T celle proliferasjon som beskrevet og bestemt i overensstemmelse med eksempel 1. 3. Økning av vaksinasjon ved anvendelse av vektorer som koder for aksessoriske molekyler.

Følgende prosedyrer ble anvendt for å vise økningen av en vaksinasjonsprosedyre ved anvendelse av en genterapivektor som koder for et aksessorisk molekyl.

a. Økning av antistoffresponsen i mus som var ko- injisert med en aksessorisk molekyl genterapivektor og placZ.

Tre ulike genterapistrukturer ble fremstilt ved anvendelse av standard teknikker inkluderende dem som er beskrevet heri. Den første, var en genterapivektor for kontroll, pcDNA3, som ikke inneholdt noe gen. Den andre placZ, inneholdt LacZ genet som kodet for p-galaktosidase (p-gal). Den tredje, p-mCD40L, inneholdt det murine CD40 ligand genet beskrevet i eksempel 1.

Før noen immuniseringer ble serum isolert fra 6-8 uker gamle BALB/c-mus for å bestemme mengden av eventuelle initiale antistoffer mot p-galaktosidase. Hvert dyr ble injisert intramuskulært med 100 / ig plasmid DNA pr. injeksjon. Fire separate injeksjoner ble gitt med en ukes intervall.

Før den tredje injeksjon ble det tatt blodprøver av dyrene for å måle den tidlige antistoffrespons mot p-gal. En uke etter den siste injeksjon av plasmid DNA, ble det tatt blod-prøver av dyrene for å måle den siste antistoffrespons overfor p-galaktosidase. For å teste analysens sensitivitet, ble kjente mengder anti-p-gal antistoffer isolert fra et anti-p-gal antiserum testet parallelt.

Serumfortynninger på 1:40, 1:200 eller 1:1000 ble testet i en ELISA for anti-p-gal antistoffer. For dette ble polystyren mikrotiter ELISA plater belagt med p-gal ved 10 /ig/ml i fosfatbufret saltoppløsning. Platene ble vasket tre ganger med blokkeringbuffer inneholdende 1 % bovint serumalbumin (BSA), 0,2 % Tween 20 i boratbufret saltoppløsning (BBS)

(0,1M borat, 0,2M NaCl, pH 8,2). 50 ul fortynnet serum ble tilsatt til de separate brønnene. Etter minst 1 time ved romtemperatur, ble platene vasket tre ganger med blokkeringsbuffer og fikk deretter reagere med alkalisk fosfatase-konjugert geit anti-mus IgG antistoff. 1 time senere ble platene igjen vasket fire ganger med blokkeringsbuffer og inkubert med 5 ml TMB peroksydasesubstrat (Kirkegaard & Perry, Gaithersburg, MD). Absorbansen ved 405 nm for hver brønn ble målt ved anvendelse av en mikroplateavleser

(Molecular devices, Menlo Park, CA). Desto høyere O.D. avlesning, desto større var mengden spesifikt antistoff i prøven.

Dataene for hvert av de to forsøk er tilveiebragt i tabell IV og V som er angitt senere. Resultatene som oppsummert i VI og VII som sammenligner dataene fra de to forsøk er likeledes tilveiebragt. Pa oppsummeringssiden står n for antall dyr i hver av de fire grupper. S.D. står for standard avvik og Avg. er gjennomsnittlig O.D. avlesning for alle dyrene i en spesiell gruppe.

Resultatene i gruppe 4 viser at anvendelse av en genterapivektor som koder for en aksessorisk molekyl ligand (CD40L) øker immuniseringen mot P-gal som er kodet for av en genetisk eller genterapivektor. Den gjennomsnittlige O.D. avlesning av 1:40 fortynningen av serum fra dyr i denne gruppe er signifikant høyere enn den for grupper 1, 2 og 3 (P<0,05, Bonferroni t-tester, se tabell VII).

Data fra et ytterligere forsøk forsterker videre det funn at genterapivektoren som koder for en aksessorisk molekyl ligand øker immunisering mot p-gal (fig. 16). Her ble pCD40L og placZ ko-injisert inn i skjelettmuskel for å teste for økning av immunresponsen mot placZ, en pcDNA3-basert vektor som koder for E. coil p-galaktosidase. De relative anti-p-gal Ab aktiviteter ble bestemt via ELISA. Som forventet, produserte mus som var injisert med enten den ikke-modifiserte pcDNA3-vektoren eller pCD40L alene ikke detekterbare antistoffer mot P-gal (fig. 16A) . Mus ble injisert med enten 100 /ig pcDNA3 (rutemønstret stolpe) , 50 /ig pcDNA3 + 50 ug pCD40L (linjert stolpe) , 50 ug pcDNA3 + 50 fig placZ (stripet stolpe) eller 50 fig pCD40L + 50 fig placZ (fylt stolpe) . På den annen side utvikles mus som hadde mottatt placZ og pcDNA3 detekterbare anti-p-gal antistoffer en uke etter den fjerde og siste injeksjon ved dag 28. Mus som mottok placZ og pCD40L utviklet høyere titere av anti-p-gal antistoffer enn mus injisert med placZ og pcDNA3. Fig. 16B, ELISA-analyser av seriefortynninger av serum samlet på dag 28, viser at mus som var ko-injisert med placZ og pCD40L hadde et åtte ganger høyere gjennomsnittlig titer av anti-p-gal antistoffer ved dag 28 enn mus behandlet med placZ + pcDNA3.

i. Immunglobulin subklasseproduksjon stimulert ved

aksessorisk molekylvektor ko- injeksjon

Til tross for økning av titeret av anti-p-gal antistoffresponsen, var subklassen av anti-p-gal IgG indusert ved injeksjon av placZ ikke endret ved ko-injeksjon av pCD40L. I<g>G2a anti-p-gal antistoffer dominerte over IgG-j^ subklasse antistoffer i serum fra mus injisert med enten placZ og pcDNA3 eller placZ og pCD40L (fig. 17). ELISA O.D. målingene av anti-p-gal IgG! og anti-p-gal IgG2a tilstede i pre-immunt serum (stripet stolpe) eller post-immunt serum (fylt stolpe), samlet ved dag 2 8 fra hver gruppe av mus, injisert som indikert på abscissen, er også vist. I motsetning til dette utviklet BALB/c mus injisert med p-galprotein hovedsakelig IgGx anti-p-gal antistoffer, og ingen detekterbare IgG2a anti-P-gal antistoffer. ii. Økning av vaksinasjon ved aksessorisk molekylvektor

krever ko- injeksjon med placZ i det samme sted Adjuvanseffekten av pCD40L plasmidet på anti-p-gal antistoff responsen ble kun notert når det ble injisert i det samme sted som placZ (fig. 18). Grupper av BALB/c mus (n=4) mottok intramuskulære injeksjoner av placZ og pCD40L sammen i det samme sted, eller som samtidige separate injeksjoner i distale steder (høyre og venstre baklegg-quadriceps). En kontrollgruppe mottok intramuskulære injeksjoner av placZ og pcDNA3 i det samme sted. Blodprøver ble tatt fra dyrene på dag 28 og serum ble testet for anti-p-gal Ab ved forskjellig fortynninger, som indikert på abscissen. Kurven illustrerer et representativt forsøk som viser gjennomsnittlig O.D. ved 405 nm av repeterte brønner av hver av serumprøvene for hver gruppe ved en 1:40, 1:200 eller 1:1000 fortynning. Dyr injisert samtidig med placZ og pCD40L, men i forskjellige steder, utviklet ikke detektbare anti-p-gal antistoffer inntil dag 28. Dessuten var anti-p-gål antistofftitrene til serum fra slike dyr på dag 28 lignende dem til mus som mottok

placZ og pcDNA3, og signifikant lavere, enn dem til dyr som mottok placZ og pCD40L sammen i det samme sted.

iii. Økning av vaksinasjon når aksessorisk molekyl vektor og

placZ ko- injiseres inn i dermis

pCD40L plasmidet økte også anti-p-gal antistoffreaksjonen mot placZ ved injeksjon inn i dermis. I forsøket som er vist i fig. 19 mottok mus intradermale injeksjoner, nær haleroten, av enten 50 /ig pcDNA3 (rutemøhstret stolpe), 25 /ig pcDNA3 + 25 ug pcCD40L (linjert stolpe), 25 /ig pcDNA3 + 25 /zg placZ

(stripet stolpe) eller 25 [ ig pCD40L + 25 /ig placZ (fylt stolpe). Injeksjoner, blodprøver og ELISA analyser ble utført som i fig. 16A. Gruppene i forbindelse med stolpen som var rutemønstret og stolpen som var linjert omfattet hver 8 mus mens gruppen i forbindelse med den stripete stolpe og den fylte stolpe hver omfattet 12 mus. Høyden av hver stolpe representerer gjennomsnittlig O.D. for serum ved en 1:40 fortynning for hver gruppe + S.E. Enxstatistisk analyse av dataene indikerte at gruppene for den stripete stolpe og den fylte stolpe er uavhengige (P<0,05). Som observert med intramuskulær injeksjon, utviklet mus som var ko-injisert med placZ og pCD40L detekterbare anti-p-gal serumantistoffer en

uke etter den andre injeksjon (dag 14), og to uker tidligere enn mus som var injisert med placZ og pcDNA3. Dessuten hadde disse dyr også et åtte ganger høyere gjennomsnittlig titer av anti-p-gal antistoffer enn mus i den placZ-injiserte gruppe ved dag 28. Mus som var injisert med enten den ikke-modifiserte pcDNA3 vektor eller med pCD40L alene produserte ikke detekterbare antistoffer mot p-gal.

b. Økning av CTL- responsen i mus som var ko- injisert med en

aksessorisk molekyl genterapivektor og placZ

Den evnen som pCD40L har til å øke induksjon, ved placZ, av CTL spesifikk for syngeneiske p-gal-uttrykkene målceller ble testet. BALB/c mus som var ko-injisert med pCD40L og placZ inn i skjelettmuskulaturen (fig. 20A) eller dermis (fig. 20B) dannet et større antall CTL spesifikke for P13.2, en placZ transfektert P815 cellelinje, enn mus som var ko-injisert med placZ og pcDNA3. Ved et 5:1 effektor:target forhold, opp-nådde splenocytt-effektorcellene fra mus som mottok intramuskulære injeksjoner av placZ og pCD40L mer enn 2 0 % spesifikk lysis av P13.2. I motsetning til dette, når splenocytter fra mus som mottok kontrollinjeksjonen med placZ og pcDNA3 ble anvendt, var et 9-ganger større forhold mellom effektor og targetceller nødvendige for å oppnå dette nivå av spesifikk lysis. Likeledes drepte splenocytt-effektorceller fra mus som mottok intradermale injeksjoner av placZ.og pCD40L mer enn 50 % av P13.2 cellene ved effektor:target forhold på 4:1. Oppnåelse av sammenlignbare nivåer, av spesifikk lysis krevde åtte-ganger høyere effektor:target forhold ved anvendelse av splenocytter fra mus som mottok intradermale injeksjoner av placZ og,pcDNA3. Uansett hadde splenocytter fra mus ko-injisert med pCD40L og placZ ikke større ikke-spesifikk CTL aktivitet for P815 celler enn dem fra mus som mottok placZ sammen med pcDNA3 (fig. 20). Som forventet medierte ikke splenocytter fra mus som mottok injeksjoner av pcDNA3 alene, eller pcDNA3 og pCD40L, spesifikk lysis av P13.2 eller P815 celler.

Frihetsgrad: 20

ENVEIS VARIANSANALYSE

i ENVEIS VARIANSANALYSE

4. Behandling av neoplasi ved anvendelse av en genterapivektor inneholdende et aksessorisk molekyl gen eller

kimært aksessorisk molekyl gen

a. Behandling av neoplasi i mus

Behandlingen av en neoplasi i et musemodellsystem er blitt vist ved anvendelse av genene som koder for aksessoriske molekyl ligander.. Genterapivektorer som inneholder et aksessorisk molekyl ligand gen (murin CD40 ligand) ble fremstilt som beskrevet tidligere i de foregående eksempler. Disse genterapivektorer ble anvendt til å introdusere dette aksessoriske molekyl ligand genet i neoplastiske celler, linjel-celler, fra en tumor som stammet fra BALB/c mus. De aksessoriske molekyler ble innført i de neoplastiske celler i henhold til de ovennevnte eksempler. Ekspresjonen av den aksessoriske molekyl liganden på overflaten av disse neoplastiske celler ble bekreftet ved anvendelse av flow cytometri som beskrevet i de ovennevnte eksempler.

Effektiviteten av genene for den aksessoriske molekyl liganden for behandling av neoplasi er vist som følger. BALB/c hunmus (6-8 uker gamle) fikk injisert i.p. 1,0 x IO<5 >bestrålte linjel neoplastiske celler. De neoplastiske linjel celler er avledet fra et spontant lungeadenocarcinom i en BALB/c mus. Denne neoplastiske celle er blitt beskrevet av Blieden et al., Int. J. Cancer Supp., 6:82 (1991). Andre BALB/c hunmus fikk injisert i.p. 1,0 x IO<5> bestrålte linjel tumorceller som på forhånd var blitt transdusert med genterapivektoren som koder for den aksessoriske molekyl liganden (murin CD40) som beskrevet over.

Hver gruppe av mus fikk danne en immunrespons i 10 dager, Etter 10 dager ble hver mus eksponert for 1,0 x 10<4> levende, ikke-bestrålte linjel neoplastiske celler. Disse mus ble deretter målt med hensyn til dannelsen av tumorer og ble avlivet når tumorene vokste til 2,0 cm på grunn av morbidi-tet. Resultatene fra denne måling er vist i fig. 7. Som det fremgår fra fig. 7 forble musene immunisert med den neoplastiske celle som uttrykker de aksessoriske molekyl ligandene på celleoverflatene fri for tumor gjennom forsøk. Mus som var immunisert med de neoplastiske celler som ikke har de aksessoriske molekyl ligand genene bukket under for tumor 50 dager etter eksponering for de neoplastiske celler.

Fig. 21 viser ned-modulering av human CD40L, men ikke murin CD40L, i lungetumorcellelinjer som uttrykker CD40. Humane cellelinjer HeLa (CD40-negativ cervikal carcinom, fig. 21A), A427 (CD50-negativ lungecarcinom, fig. 21B), NCI 460 (svakt CD40-positiv lunge-storcellecarcinom, fig. 21C), og SK-Mes-1 (sterk CD40-positiv lunge-skvamøs celle-tumor, fig. 21D) ble infisert med adenovirus som koder for lac-Z (Ad-LacZ), murin CD40L (Ad-mCD40L) og human CD40L (Ad-hCD40L) ved en MOI på 0 (blindprøve), 1 og 10. 48 timer etter infeksjon ble murin CD40L og human CD40L overflateekspresjon bestemt. Prosentandel celler som uttrykker ligand plottes på Y-aksen. Human og mus CD40L er uttrykt ved like nivåer i CD40-negative cellelinjer. Kun murin CD40L ekspresjon er imidlertid stabil på cellelinjer som uttrykker CD40. I motsetning til mCD40L er human CD40L nedmodulert på CD4 0-positive tumorer.

Dataene som er vist i form av kurver i fig. 22A viser at CD40 binding induserer ekspresjon av tumoroverflatemarkører. Behandling av CD40-uttrykkende lungecancer-cellelinjer med aCD40 mAb resulterte i økt ekspresjon av tumorcelleoverflate-markørene CD95 (Fas), CD54 (ICAM-1) og klasse I "major histocompatability" antigener (MHC I). NCI 460, et svakt CD40-positivt lunge-storcellecarcinom ble inkubert med et CD40-spesifikt monoklonalt antistoff (tykk linje) eller MOPC21, et isotype kontroll mAb (tynn linje), på CD32-uttrykkende musfibroblaster i 48 timer. Etter 48 timers inkubasjon ble lungetumorcellene analysert for CD95, CD54 og MHC-I ekspresjon ved FACS.

Fig. 22B viser igjen nedmodulering av human CD40L ved CD4 0-positive tumorceller. HeLa (CD40-negativ), CLL (CD40-positiv) og SK-MES-1 (CD40-positiv) tumorceller ble ko-dyrket i 24 timer med CD3-aktiverte normale donor T-celler ved et tumorcelle:T-celle forhold på 2,5:1. Etter ko-dyrking ble CD-2-uttrykkende T-celler analysert for CD40L overflateekspresjon ved PACS. Tynne linjer representerer T-celler merket med FITC-merket isotype kontrollantistoff (M0PC21) og tykke linjer representerer aktiverte T-celler merket med FITC-merket aCD40L antistoff (aCD154 antistoff). De CD40-positive tumorcellelinjer, SK-MES-1, og CLL, uttrykker ikke CD40 ligand på deres overflater. 5. Ekspresjon av human og mus aksessorisk molekyl liaand.

Fas- ligand. i humane blodlymfocytter

a. Konstruksjon av et genetisk konstrukt og genterapivektor

inneholdende humant og mus Fas- ligand gen

Det humane aksessorisk molekyl ligand genet (human Fas-ligand) eller det murine aksessoriske molekyl ligand genet (murin Fas-ligand) ble konstruert ved anvendelse av de respektive humane og murine gener. Et endret aksessorisk cellemolekyl, hvor et putativt MMP-spaltingssete var fjernet, ble dannet og betegnet AFasL-pcDNa3. Nukleotidsekvensen til AFasL-pcDNA3 er angitt som SEQ ID NO: 40. Humane Fas-ligand nukleotider 325 til 342, som koder for seks aminosyrer, er borte fra AFasL. Utformingen av AFasL var basert på den slutning at Domene III inneholder steder som er mest tilgjengelige for MMP'er og kunne således være målet på molekylet for spalting fra overflaten av cellen. Sekvenser av human Fas-ligand genet er blitt bestemt og er angitt som SEQ ID NO: 13 og 30 (Genbank deponeringsnr. U11821). Sekvenser av mus Fas-ligand gener er blitt bestemt og er angitt som SEQ ID NO: 14 (C57BL/6, Genbank deponeringsnr. UIO984) og 31

(Balb/c, Genbank deponeringsnr. U58995). Sekvensen til rotte Fas-ligand genet er blitt bestemt og angitt som SEQ ID NO: 25 (Genbank deponeringsnr. U03470). Kimære strukturer er dannet som beskrevet i eksempel 2 for CD40 ligand kimære strukturer, hvor Domene III av human Fas-ligand er erstattet med domener fra andre proteiner, særlig proteiner i TNF familien. Kimære strukturer inkluderer, men er ikke begrenset til, human Fas-ligand med Domene III erstattet med Domene III fra murin Fas-ligand (kimær sekvens angitt som SEQ ID NO: 37, sekvensoppstilling vist i fig. 37), eller erstattet med Domene III fra human CD70 (kimær sekvens angitt som SEQ ID NO: 38, sekvensoppstilling vist i fig. 38), eller erstattet med Domene I i

human CD70 (kimær sekvens angitt som SEQ ID NO: 39, sekvensoppstilling vist i fig. 3 9). Kimære strukturer hvor multiple domener, for eksempel, to kopier av human CD70 Domene III, er innskutt inn i human Fas-ligand i stedet for Domene III,

dannes også ved anvendelse av metoder beskrevet i eksempel 1. Kimære strukturer hvor syntetiske sekvenser anvendes for å erstatte Domene III til human Fas-ligand er også dannet.

i. Human Fas- ligand kloning

cDNA som koder for human Fas-ligand ble subklonet i den eukaryotiske ekspresjonsvektor pcDNA3. Normale donor-blodlymfocytter ble aktivert i 4 timer med 1 ng/ml PMA pluss 0,5 /zM ionomycin. Total RNA ble isolert med Qiagen Rneasy kit. cDNA ble deretter syntetisert fra poly-A RNA med oligo-dT primere ved anvendelse av Gibco-BRL Superscript cDNA syntese kit. Genet som koder for human Fas-ligand ble deretter PCR amplifisert med de Fas-ligand spesifikke primere (sense primer, SEQ ID NO: 32, antisense primer, SEQ ID NO: 33). Fas-ligand PCR produkt ble deretter subklonet inn i pcDNA3 ved anvendelse av standard teknikker innen molekylær biologi. RT-PCR produkter, subklonet inn i pcDNA3, betegnes hFasL-pcDNA3.

ii. Murin Fas- ligand kloning

De murine Fas-ligand gener fra Balb/c og C57/BL6 musestammer ble også amplifisert etter aktivering av musesplenocytter med PMA pluss ionomycin som beskrevet over, og amplifisert fra

poly-A syntetisert cDNA som beskrevet over (sense primer, SEQ ID NO: 34, antisense primer, SEQ ID NO: 35). Disse gener ble subklonet i pTARGET ekspresjonsvektoren (Promega, Madison, WI). RT-PCR produkter, subklonet inn i pcDNA3, betegnes mFasL-pcDNA3.

iii. Adenovirus vektorkonstruksjon

For konstruksjon av adenovirusvektorer som koder for human Fas-ligand, murin Fas-ligand eller AFas-ligand, blir det klonede cDNA innskudd subklonet inn i plasmidet pRc/RSV (Invitrogen, San Diego, CA) i HindIII-X-bal setet. Et Bglll-Xhol fragment med RSV promotor-enhanceren og poly-A signalsekvens av bovint veksthormon ble subklonet inn i BamH-Xhol setet av plasmid MCS(SK) pXCX2. Plasmidet MCS(SK)pXCX2 er en modifikasjon av plasmid pXCX2, hvor pBlueskript polylinkersekvensen var klonet inn i El regionen. Det resulterende plasmid ble deretter ko-transferert sammen med pJM17 inn i 293 celler ved anvendelse av kalsiumfosfatmetoden. Isolerte plakker av adenovirusvektorer plukkes og ekspanderes ved hjelp av infiserende 293 celler. Høytiter adenoviruspreparater oppnås som beskrevet over som anvender en cesiumkloridgradient for konsentrering av viruspartikler via en trinnvis gradient, med densiteter på 1,45 g/cm<3> og 1,20 g/cm<3>, hvor prøvene sentrifugeres i 2 timer i en SW41 rotor (Beckman, Brea, CA) ved 25 000 opm ved 4°C. Virus-båndet avsaltes ved anvendelse av en Sephadex G-25 DNA kolonne (Pharmacia, Piscataway, NJ), og de isolerte virus lagres ved -70°C i fosfatbufret saltoppløsning med 10 % glycerol. Titeret til viruset bestemmes ved å infisere valgfrie 293 celler ved forskjellige fortynninger og telle antallet plakker. Titeré strekker seg typisk fra 10<10> til IO<12> plakkdannende enheter/ml. Adenovirusstrukturene betegnes Ad-hFasL, Ad-mFasL og Ad-AFasL.

b. Introduksjon av murine og humane Fas- ligand gener inn i

humane celler

Konstruktene hFasL-pcDNA3, mFasL-pcDNA3 og AFasL-pcDNA3 transfekteres inn i 2 93 via elektroporering. De transfekterte celler velges i medium inneholdende G418. Fas-ligand transfektanter screenes for ekspresjon av transgenet ved anvendelse av anti-Fas-ligand antistoff og flow cytometri. Metodene som anvendes er lignende dem beskrevet for transfeksjon av CD4 0L inn i CLL celler.

For FasL-adenovirusinfeksjon, blir 10<6> nytinte og vaskede CLL celler eller HeLa celler suspendert i 0,5 til 1 ml kulturmedium for dyrking ved 3 7°C i en 5 % C02-i-luft inkubator. Adenovirus tilsettes til cellene ved varierende MOI, og de infiserte celler dyrkes i 48 timer, dersom annet ikke er angitt, før de analyseres for transgen ekspresjon. c. Ekspresjon av Fas- ligand genene i humane celler Mus med lymfoproliferativ eller generalisert lymfoproliferativ lidelse er ikke i stand til å fjerne aktiverte selvreaktive celler utenfor tymusen. Dette er relatert til det faktum at, i disse mus, er interaksjoner mellom Fas-reseptoren og en aksessorisk molekyl ligand, Fas-ligand, mangel-fulle. Disse dyrene utvikler en rekke lidelser som inkluderer lymfadenopati, splenomegali, nefritt og systemisk autoimmun patologi som ligner det som sees i pasienter med systemisk lupus erythematosus eller revmatoid artritt (RA). Det er mulig at de normale interaksjoner mellom Fas-reseptoren og aksessorisk molekyl liganden som er ansvarlig for fjerning, av aktiverte lymfocytter fra vev kan svekkes i RA pasienter.

RA synoviallymfocytter uttrykker Fas-reseptoren i en høyere andel enn matchede RA blodlymfocytter i forhold til matchede normale donor-lymfocytter. På den annen side uttrykker RA synoviallymfocytter lite eller ingen aksessorisk molekyl ligand. Da RA synoviallymfocytter er sensitive for Fas-indusert apotose, er det mulig at lokal ekspresjon av Fas-ligand i RA-leddet vil kunne tjene til å eliminere de synoviale mononukleære celler som eventuelt medierer RA autoimmun patologi.

Fig. 23 viser at Fas-ligand ekspresjon i lymfocytter inhiberes ved eksponering for RA synovial fluid. Normale

donorblod T-celler aktiveres i 5 timer med 1 ng/ml PMA pluss 0,5 /zM ionomycin. Celler ble inkubert i nærvær av revmatoid artritt blodplasma (sirkler), RA synovial fluid (ruter) eller ingen (firkanter). I tillegg ble cellene inkubert med økende konsentrasjoner av MMP inhibitoren BB94. Etter aktivering ble cellene analysert for Fas-ligand overflateekspresjon ved FACS. Prosentandel celler som uttrykker Fas-ligand er plottet i fig. 23. Dette forsøk viser at der er en eller flere faktorer tilstede i RA synovialfluid og serum som forhindrer overflateekspresjon av Fas-ligand.

d. Funksjon av human, murin og kimær aksessorisk molekyl

ligand. Fas- ligand

For å bestemme kapasiteten til AFasL-strukturene, blir de ovennevnte transfekterte celler blandet med den Fas-ligand sensitive humane T-cellelinje, JURKAT. Etter 4 timers kodyrking, blir de ikke-adherente JURKAT-celler samlet og evaluert for apoptose. Fluorescensforbindelsen 3,3'-diheksyloksakarbocyaninjodid (DiOC6) , anvendes for å evaluere apoptose ved anvendelse av en modifikasjon av en tidligere beskrevet prosedyre. For dette vaskes cellene en gang ved romtemperatur i fosfatbufret saltoppløsning (PBS, pH 7,2). Celler plasseres i separate brønner i en 96-brønns plast-mikrptiterplate med U-bunn ved IO<5> - 5 x IO<5> celler/brønn, i et totalvolum på 50 ml. Dersom indikert blir mettende mengder PE-konjugerte antistoffer tilsatt etterfulgt av tilsetning av DiOC6 og propidiumjodid (PI). DiOCe og PI anvendes ved 40 nM og 10 ng/ml sluttkonsentrasjoner. Cellene inkuberes deretter i 15 min. ved 37°C, 5 % C02 i en vevskultur inkubator. De merkede celler vaskes to ganger i iskald PBS og suspenderes til slutt i 2 00 ml SM og analyseres ved FACS. Døde celler og celleavfall med karakteristiske fremre og lyssprednings-profiler og PI-merking utelukkes fra analyse.

Cellenes evne til å uttrykke AFasL-pcDNA3 for å styre. Fas-mediert apoptose av celler som uttrykker CD95 sammenlignes med den til celler som uttrykker FasL-pcDNA3. Relativ stabilitet av proteinproduktene som kodes for av AFasL-pcDNA3 eller FasL-pcDNA3 før og etter dyrking med RA synovialfluid og med eller uten metalloproteinaseinhibitorene, bestemmes via flow cytometri av celler som uttrykker den ene eller andre ligand. 6. Behandling av artritt med genterapivektorer som koder for

en aksessorisk molekyl ligand. Fas-ligand

De heterologe Fas-ligand strukturer, dannet som beskrevet over, som viser den høyeste stabilitet av ekspresjon i kombinasjon med den største evne til å mediere Fas-indusert apoptose, anvendes i genterapi for RA. Potensielle terapeutiske strukturer testes i vel karakteriserte artritt-musemodeller for å bestemme effektivitet og funksjon in vivo.

a. Genterapibehåndling av artritt i mus

i. Musemodeller for artritt

Eh museartrittmodell er kollagenindusert artritt. Det er kjent at injeksjonen av DBA/1 mus med type II kollagen i Freunds fullstendige adjuvans (CFA) induserer en artritt med synovitt og erosjoner som er histologisk lignende RA. For våre undersøkelser, blir DBA/I hannmus immunisert med bovin II kollagen i Freunds fullstendige adjuvans på dag 0 og boosted intraperitonealt (i.p.) på dag 21. På dag 2 8 får dyrene en ytterligere i.p. injeksjon med lipopolysakkarid (LPS) og/eller den samme type koilagen, eller en injeksjon av kun eddiksyre. Svelling og/eller rødhet av en fremfot eller bakfot hos dyrene som er immunisert med kollagen detekteres typisk en tredje eller fjerde uke etter den andre injeksjon. Vertebraet påvirkes kun sjelden og da kun uker etter den initiale perifere leddsvelling. Berørte ledd utviser initiale histologiske endringer av synovialt ødem, etterfulgt av synovial hyperplasi.

En annen dyremodell, som nylig er beskrevet av Kouskoff, V. et al., i Cell 87:811-822 (1997), ble dannet tilfeldig ved å krysse en T-cellereseptor (TCR) transgen muslinje med NOD ("non-obese-diabetic" )• stammen for å danne KRN x NOD muse-modellen av RA. Avkommet av en slik paring utvikler i alle tilfeller en leddsykdom som er svært lik den til pasienter med RA. Dessuten har sykdommen hos disse dyr en tidlig og reproduserbar "time of onset" og et svært reproduserbart forløp. Artritten er tilsynelatende indusert ved endret gjenkjennelse av et NOD-avledet MHC ("major histocompatibility complex") klasse II molekyl med det transgene TCR, som fører til nedbrytning av de generelle mekanismer med selv-toleranse og systemisk selv-reaktivitet. ii. Lindring av artrittsymptomer i mus behandlet med en genterapivektor som koder for en aksessorisk molekyl ligand

Man har tilpasset og modifisert en prosedyre som opprinnelig er beskrevet av Sawchuk og kollegaer for mikro-injeksjon av adenoviruser inn i museledd. Ved anvendelse av denne prosedyre kan man på reproduserbar måte injisere et 5 ill volum inn i artikulærrommet i musekneet. I denne prosedyre bedøves musene med metofan. Et lite snitt på omtrent 2-3 mm utføres med et. #11 skalpellblad i huden over kneets lateralaspekt for å visualisere det patello-tibiale ligament. Man kan injisere opp til 5 [ il fluid ved anvendelse av en 100 /il-Hamilton mikrosprøyte og en nål med dimensjon 30. Etter injeksjonen lukkes knesnittet med Nexabond (Veterinary Products Laboratory). Våre adenovirustitere overskrider typisk 10<10 >plakkdannende enheter (pfu) pr. ml, noe som gjør det mulig å avlevere minst 5 x IO<8> pfu virus i 5 ml inn i kneleddene, som angitt over. Kontrolldyr injiseres med kontroll Ad-lacZ vektor, et replikasjons-defekt adenovirus som mangler et transgen, eller med bufferen som anvendes for å suspendere viruset (10 mM Tris, 1 mM MgCl2, 10 % glycerol).

I en annen metode vil splenocytter høstes fra mus som er syngeneiske med vertsdyret beregnet for adoptiv overføring av transduserte celler. Celleproliferasjon vil induseres med eksogen IL-12 (100 enheter/ml) i 48 timer. Cellene telles og utplates deretter på nytt i tettheter på 5 x IO<5> eller 1 x IO<6 >celler pr. ml i en 12-brønns plate med 1 ml fullstendig dyrkingsmedium pr. brønn. Virus og ConA tilsettes sammen på tidspunktet med re-utplating i nærvær av polybren (8 iig/ml) . Mediumet skiftes 24 timer etter infeksjon med komplett medium inneholdende 100 enheter rekombinant IL-2 pr. ml. Prøve-mengder av de transduserte celler undersøkes for Fas-ligand ekspresjon 48 timer etter infeksjon via flow cytometri.

Dyr vil motta standardiserte antall cytokin-produserende celler eller mock-transfekterte kontrollceller intraperitonealt. Konsentrerte cellesuspensjoner injiseres direkte inn i musesynovium, som beskrevet i avsnitt 4A i det foregående. Parallelt blir prøver av de overførte cellepopu-lasjoner opprettholdt i vevskultur supplert med eksogen IL-2. Mus måles tilfeldig for tegn på artritt. Dato for inntreden av sykdom nedtegnes og klinisk alvorlighet i hvert ledd eller gruppen av ledd (tær, tarsus, ankel, vrist, kne) graderes som følger: 0 (normalt), 1 (erytem), 2 (svelling), 3 (deformi-tet), 4 (nekrose). Poengene summeres til å gi artritt-poenget. Alvorligheten av artritt uttrykkes, både som gjennomsnittlig observert poeng på en gitt dag, og som gjennom-snittet av det maksimale artrittpoeng som nås for hver mus under det kliniske forløpet av sykdommen. På tidspunktet for død, blir baklabbene dissekert fri og prosessert for histologisk undersøkelse eller for RT-PCR. Den histologiske alvorlighet av artritt bedømmes på en skala fra 0-3 for synovial proliferasjon og inflammatorisk celleinfiltrasjon, hvor et poeng lik 0 = normal og 3 = alvorlig.

For mus som mottok intra-synovial injeksjon av kontroll av test-adenovirusvektor, sammenlignes nivået av artritt observert mellom kontralaterale steder. I tillegg blir det totale leddpoeng minus det til de injiserte ledd for hele dyret sammenlignet med det som observeres i leddet som er injisert med kontrollen eller test-adenovirusvektor.

Lokal administrering av Fas-ligand adenovirusekspresjons-vektprer vil resultere i fjerning av aktiverte celler, som bestemt ved å måle de relative nivåer av CD80 mRNA ved kvantitativ RT-PCR. Denne behandling vil også føre til et økt nivå. Også om slikt apoptosenivå identifisert i påvirket muse-synovialvev bestemmes ved TUNÉL-analysen ("Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)-mediated dUTP Nick End Labeling"). TUNEL utføres ved å nedsenke snittene i TdT buffer (30 mM Tris-HCl., pH 7,2, 140 nM natriumkakodylat, 1 mM koboltklorid), og med påfølgende tilsetning av TdT (GIBCO BRL, Grand Island, NY) og biotinylert dUTP (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). Reaksjonen termineres ved å nedsenke snittene i TB buffer (3 00 mM natriumklorid, 3 0 nM natriumcitrat.) . Deretter behandles prøvene med peroksydase-merket streptavidin og visualiseres ved anvendelse av VECTASTAIN ABC kit (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA). For immunhistokjemi, blokkeres snittene med 4 % skummmetmelk i 30 min. ved romtemperatur, inkuberes deretter med biotinylerte mAb'er som er spesifikke for mus CD3, B22 0, CD80 eller CD95 (Fas).. Disse antistoffer er tilgjengelige fra Pharmingen (San Diego, GA).

b. Behandling av pasienter med revmatoid artritt med en genterapivektor som koder for en aksessorisk molekyl

. ligand. Fas- ligand

Fas-ligand kanditatkonstrukter identifisert til å ha mulig terapeutisk fordel anvendes i prosedyrer på mennesker for å behandle RA. Prosedyrene omfatter enten in vivo eller ex vivo metoder for å avlevere Fas-ligand strukturene. Videre avleveres Fas-ligand strukturene eventuelt ved enten virale eller ikke-virale metoder. Oversikt over terapeutiske strategier er beskrevet i det etterfølgende.

En ex vivo terapi er lignende en prosedyre beskrevet for intra-artikulær transplantasjon av autologe synoviocytter retroviralt transdusert til å syntetisere interleukin-1 reseptorantagonist (Evan, Christopher et al., Clinical Trial to Assess the Safety, Feasibility, and Efficacy of Transfer-ring a Potentially Anti-Arthritic Cytokine Gene to Human Joints with Rheumatoid arthritis, Human Gene Therapy, vol. 7, 12 61-1280). I denne prosedyre, etter klinisk diagnose av RA, høstes synovium under total ledd-replassering. Synoviocyt-tene re-isoleres og ekspanderes, transduseres eller transfekteres deretter med heterolog Fas-ligand inn i synoviocytter (via retrovirus, adenovirus, naken DNA osv.) De gen-modifiserte synoviocytter re-injiseres deretter inn i pasienten som måles og testes for forbedring av RA-assosierte symptomer, og for ekspresjon og funksjon av Fas-liganden i modifiserte synoviocytter.

I en annen ex vivo prosedyre blir en allogeneisk immorta-lisert cellelinje som stabilt uttrykker.den heterologe Fas- . ligand administrert til RA-pasienten. Med denne prosedyre konstrueres en stabil 'immortalisert cellelinje som uttrykker Fas-ligand (innført ved transfeksjon av genet inn i cellen ved ikke-virale metoder, som elektroporering eller ved viral transduksjon av genet inn i cellen). Den modifiserte cellelinje injiseres inn i pasienten som måles og testes for forbedring av RA-assosierte symptomer, og for ekspresjon og funksjon av hFas-liganden i modifiserte synoviocytter.

En in vivo basert terapi er lignende i konsept til forbed-ringen av kollagen-indusert artritt ved anvendelse av en murin Fas-ligand adenovirusgenterapivektor beskrevet i Zhang et al., J. Clin. Invest. 100:1951-1957 (1997). I vår bruk av en slik fremgangsmåte, blir avlevering av hFas-ligand konstruktet eller kimær AFasL direkte til leddene i RA-pasienter utført ved anvendelse av enten virale eller ikke-virale metoder. I denne metode blir Fas-ligand konstruktet (f.eks. hFas-ligand adenovirus) injisert direkte inn i synovium. Pasienter måles og testes for forbedring av RA-assosierte symptomer så vel som biologisk testing for ekspresjon og funksjon av hFas-liganden i modifiserte synoviocytter.

Claims

1. Polynukleotid som koder for en kimær CD40 ligand, karakterisert ved at det består av et intracellulært domene (domene I), et transmembrandomene (domene II), et proksimalt ekstracellulært domene (domene III) og et distalt ekstracellulært domene (domene IV), hvori ett eller flere av de nevnte domener er avledet fra et polynukleotid som koder for murin CD40 ligand dg de andre domener er avledet fra et polynukleotid som koder for human CD4 0 ligand.

2. Polynukleotid som angitt i krav 1, hvori den kimære CD40 ligand kan uttrykkes i humane CD40+ celler.

3. Polynukleotid som angitt i krav 1, hvori ett eller flere av domenene I, II og III er avledet fra et polynukleotid som koder for murin CD40 ligand.

4. Polynukleotid som angitt i krav 1, hvori domene III er avledet fra et polynukleotid som koder for murin CD40 ligand.

5. Polynukleotid som angitt i krav 1, hvori polynukleotidet har nukleotidsekvensen SEQ ID NO:3 eller SEQ ID NO:5.

6. Vertcelle, karakterisert ved at den er transfektert med det kimære CD40 ligand polynukleotidet som angitt i ett eller flere av kravene 1 til 5.

7. Vertcelle som angitt i krav 6, hvori cellen er en pattedyrcelle.

8. Vertcelle som angitt i krav 7, hvori cellen er en antigenpresenterende- celle.

9. Vertcelle som angitt i krav 6, hvori cellen er en neoplastisk celle.

10. Vertcelle som angitt i ett eller flere av kravene 6, 7 eller 9, hvori cellen er en B celle.

11. Genetisk konstrukt, karakterisert ved at det omfatter det kimære CD40 ligand polynukleotidet som angitt i ett eller flere av kravene 1 til 5.

12. Genetisk konstrukt som angitt i krav 11, hvori polynukleotidet er inneholdt i en viral ekspresjonsvektor.

13. Genetisk konstrukt som angitt i krav 12, hvori den virale ekspresjonsvektor er en DNA eller RNA vektor.

14. Genetisk konstrukt som angitt i krav 13, hvori den virale ekspresjonsvektor er en DNA vektor som består av adenovirus eller adeno-assosiert virus.

15. Farmasøytisk preparat, karakterisert ved at det omfatter det kimære CD40 ligand polynukleotidet som angitt i ett eller flere av kravene 1 til 5, vertcellen som angitt i ett eller flere av kravene 6 til 10 eller det genetiske konstrukt som angitt.i ett eller flere av kravene 11 til 14.

16. Farmasøytisk preparat som angitt i krav 15, som videre omfatter et immunogent antigen.

17. Farmasøytisk preparat som angitt i krav 16, hvori det immunogene antigen er kodet på en viral ekspresjonsvektor.

18. Anvendelse av et polynukleotid som koder for en kimær CD40 ligand som angitt i ett eller flere av kravene 1 til 5 for fremstilling av et medikament for behandling av en neoplasi.

19. Anvendelse som angitt i krav 18, hvori neoplasien er valgt fra gruppen som består av en levkemi, et lymfom, lungecancer, brystcancer og ovariecancer.

20. Anvendelse som angitt i krav 19, hvori levkemien er valgt fra gruppen som består av akutt myeloid levkemi (AML), akutt myelomonoblastisk levkemi (AMML), kronisk myelomono-cytisk levkemi (CMML), kronisk myelogen levkemi (CML) og kronisk lymfocytisk levkemi (CLL).

21. Kimært CD40 ligand polypeptid, karakterisert ved at det består av et intracellulært domene (domene I) , et transmembrandomene (domene II), et proksimalt ekstracellulært domene (domene III) og et distalt ekstracellulært domene (domene IV), hvori ett eller flere av de nevnte domener er avledet fra en murin CD40 ligand og de andre domenene er avledet fra en human CD40 ligand.

22. Polypeptid som angitt i krav 21, hvori den kimære CD40 ligand er stabilt uttrykt på membranen av humane CD40+ celler.

23. Polypeptid som angitt i krav 21, hvori ett eller flere av domener I, II og III er avledet fra murin CD40 ligand.

24. Polypeptid som angitt i krav 23, hvori domene III er avledet fra murin CD40 ligand.

25. Polypeptid som angitt i krav 21, som er kodet for av et polynukleotid med nukleotidsekvensen SEQ ID NO:3 eller SEQ ID NO: 5 .