CN1171791A - 纯化的血小板生成素及其制造方法 - Google Patents
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Abstract
本文公开了纯化的哺乳动物血小板生成素蛋白质和制造它们的方法。所说的蛋白质的特征是在变性条件下用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定时分子量为Mr=70,000±10,000道尔顿,并且就沾染蛋白质而言纯度至少为90%。所说的蛋白质可以由以下方法制备:将血小板生成素吸附在包含MPL受体之配体—结合结构域的多肽上,并从该多肽上洗脱,然后用阴离子交换色谱分级分离所洗脱的血小板生成素。
Description
发明背景
造血是血细胞从骨髓中的多能干细胞发育和分化的过程。这个过程包括复合物和多肽生长因子(细胞因子)通过靶细胞上膜结合的受体相互影响作用。细胞因子的作用导致细胞增殖和分化,同时伴随着对特定的常常是血统特异性的和/或阶段特异性的细胞因子的反应。单细胞型(如血小板)从干细胞的发育可能需要在适当的序列中作用的许多细胞因子的协同作用。
已知的细胞因子包括白介素(如IL-1、IL-2、IL-3、IL-6、IL-8等)和集落刺激因子(如G-CSF、M-CSF、GM-CSF、红细胞生成素(EPO)等)。通常,白介素作为免疫和炎症反应的介质。集落刺激因子刺激骨髓衍生的细胞的增殖,活化成熟白细胞,另外可形成宿主对炎症、感染和免疫激发反应的整合部分。
已经把各种细胞因子开发为治疗剂。例如,刺激红细胞发育的红细胞生成素可用于治疗由于肾衰竭引起的贫血。用几种集落刺激因子与癌症化疗相结合以促进患者免疫系统的恢复。白介素-2、α-干扰素和γ-干扰素用于某些癌症的治疗。
刺激巨核细胞生成和血小板生成的活性物已在血小板减少的动物液体中鉴别出来,在文献中称为“血小板生成素”(最近由McDonald的Exp.Hematol.16:201-205,1988和McDonald的Am.J.Ped.Hematol.Oncol.14:8-21,1992回顾)。
前不久鉴别了几组蛋白质和/或克隆了一种结合到细胞mpl受体并刺激巨核细胞生成和血小板生成的蛋白质。参见,de Sauvage等,自然369:533-538,1994;Lok等,自然369:565-568,1994;Kaushansky等,自然369:568-571,1994;Wendling等,自然369:571-574,1994和Bartley等,细胞77:1117-1124,1994。有人提议把这种蛋白质称为血小板生成素(Kaushansky等,同上)。虽然这种蛋白质已显示了在体内刺激血小板的产生(Kaushansky等,同上),但它看来似乎易发生蛋白水解,并以多相的或降解的形式分离(Bartley等,同上;Sauvage等,同上)。
蛋白水解和不均一性是明显的能阻碍新药剂的开发的问题。在本领域仍需要血小板生成素的均质的不降解的制剂以及制造这些制剂的方法。本发明满足了这些需要,并提供了其它的相关的优点。
发明概述
本发明的目的是提供包括人类血小板生成素的血小板生成素的纯化的制剂。
本发明的另一个目的是提供血小板生成素的均质制剂。
本发明的另外的目的是提供纯化和分级分离血小板生成素的方法。
一方面,本发明提供了纯化的哺乳动物血小板生成素(TPO),该血小板生成素的特征是:在变性条件下用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定时分子量为Mr=70,000±10,000道尔顿;和用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染测定时就沾染蛋白质而言纯度至少为90%。在一个实施方案中,所说纯化的哺乳动物血小板生成素基本上不含有Mr小于55kD的TPO物种。在另一个实施方案中,所说纯化的TPO是小鼠TPO、灵长类TPO或人TPO。
另一方面,本发明提供了从生物液体纯化血小板生成素的方法,这种方法包括:将包含血小板生成素的生物液体加到包含MPL受体之配体-结合结构域的多肽上,该多肽结合在固体支持物上,从而使所说的血小板生成素吸附在所说的多肽上;洗涤所说多肽,以洗脱未吸附的物质;从所说的多肽上洗脱所吸附的血小板生成素;经阴离子交换色谱分级分离所洗脱的血小板生成素;和收集分级分离的血小板生成素。在一个实施方案中,所说生物液体是条件细胞培养基或牛奶。在另一个实施方案中,所说生物液体是浓缩的条件细胞培养基。在另一个实施方案中,此方法还包括,在把生物液体加到受体多肽上之前浓缩生物液体的步骤。在另一个实施方案中,所说多肽包含小鼠或人MPL受体的配体结合结构域。在另一个实施方案中,所说多肽实质上由SEQ ID NO:7的27-480位残基组成。
在本发明的另一方面,通过以上所公开的方法纯化TPO,所收集的TPO的特征是:在变性条件下用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定时分子量为Mr=70,000±10,000道尔顿;和用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染测定时就沾染蛋白质而言纯度至少为90%。在一个实施方案中,所说纯化的哺乳动物血小板生成素基本上不含有Mr小于55kD的TPO物种。
参考下列详细描述和附图可以某些看出本发明的这些和其它方面。
附图的简要描述
图1说明Mr≌70kD和更低分子量的小鼠TPO形式的分离。最左边的两个道是分子量标记和未分级分离的TPO。
图2说明在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳的和银染色的分级分离的人TPO。
发明详述
在详细地描述本发明前,定义本文所用的术语可能是有用的。
等位变异体:通过突变产生的基因的替代形式或由突变的基因编码的变异多肽。基因突变可以是沉默的(编码的肽无变化),或可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。
生物液体:衍生自或包含细胞、细胞组分或细胞产物的任何液体。生物液体包括,但不限于细胞培养物上清液、细胞裂解物、澄清的细胞裂解物、细胞抽提物、组织提取物、血液、血浆、血清、牛奶及其组分。
cDNA:互补DNA,通过信使RNA模板、克隆或这类分子的扩增拷贝的逆转录制备。互补DNA可以是单链或双链。
表达载体:线性或环状DNA分子,该DNA分子包含编码目的多肽的片段,该片段可操作地连接到有利于其转录的附加片段上。这些附加片段包括启动子和终止序列,也可以包括一个或多个复制起点、一个或多个选择性标记、增强子、聚腺苷酸化信号等。表达载体通常衍生自质粒或病毒DNA,或包含两者的成分。术语“可操作地连接”是指排列片段以使它们协调作用,达到其意定的目的,例如,转录从启动子开始,并通过编码片段进行至终止子。
基因:编码多肽链的染色体DNA片段。基因包括一个或多个编码氨基酸的区域,在某些情况下,这些区域被非编码的“插入序列”(“内含子”)以及侧翼的有利于编码序列转录的非编码区分散开。
启动子:RNA聚合酶结合及mRNA合成起始的基因部分。
如以上所述的,本发明提供了用于以均质形式产生血小板生成素的物质和方法。本发明的TP0的特征是在变性条件下用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定时分子量为Mr=70,000±10,000道尔顿。本发明以至少为90%的纯度(用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染测定时就沾染蛋白质而言)提供TPO。在一个优选的实施方案中,当使用直接抗TPO N端的多克隆抗血清通过“Western”印迹分析时,所说蛋白质实质上不含较低分子量形式的TPO(即,表现出Mr<55kD的那些)(Towbin等,美国科学院学报76:4350-4354,1979;Towbin等,美国专利4,452,901,它们的全文本文一并参考)测定。“实质上不含有”意指不大于5%的免疫活性TPO在低分子量范围内。
如以上所述的,血小板生成素作为一种通过MPL受体刺激细胞生长的蛋白质被鉴别出来。在这种发现之前,所说受体(Souyri等,细胞63:1137-1147,1990)是“孤儿”受体,其天然配体是未知的。已经发现重组TPO可刺激巨核细胞的增殖和分化。
血小板生成素分子的特征在于它们具有特异性地结合到相同物种的MPL受体上并在体内刺激血小板产生的能力。对于普通的试验动物,在起始的每日施用10天内,TPO能够以100%或更高的水平增加血小板。本文所用的术语“血小板生成素”包括全长血小板生成素分子及其有生物活性的部分,其中生物活性部分是显示出完整的分子的定性的生物活性(受体结合和体内刺激血小板的产生)的血小板生成素片段。
编码典型的小鼠和人TPO蛋白质的cDNA克隆序列分别显示在SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:3中,相应的氨基酸序列分别显示在SEQ ID NO:2和SEQID NO:4中。本领域的那些技术人员将认识到:在SEQ ID NO:1、2、3和4中显示的序列对应于鼠或人基因的单个等位基因,预期有等位变异存在。SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3所显示的DNA序列的等位变异体包括那些沉默突变和那些导致氨基酸序列变化的突变。明显地是,本领域的技术人员能够制备额外的变体,如使用可替代的密码子通过有利于操纵核苷酸序列的工程位点来制备。
氨基酸序列分析表明成熟蛋白质从SEQ ID NO:2氨基酸残基45(丝氨酸)延伸到残基379(苏氨酸)(SEQ ID NO:4的残基22-353)。预料的人蛋白质的氨基末端精确地对应于所说明的重组鼠TPO成熟氨基末端(Lok等,同上)。
本文所公开的鼠和人序列是制备分离的编码其它物种(“物种同系物”)TPO蛋白质的多核苷酸分子的有用工具。优选的这类物种同系物包括哺乳动物同系物如牛、犬、猪、羊、马,尤其是灵长类蛋白质。使用第一物种的序列信息克隆第二物种对应的多核苷酸序列的方法在本领域是众所周知的。参见,例如,Ausubel等,编者,分子生物学的现代方法,JohnWiley和Sons,公司,NY,1987。
mRNA分布的分析显示编码TPO的mRNA在人和小鼠的某些组织中存在,在肺、肝、心、骨骼肌和肾中大量存在。因此,为从其它物种分离同系物,优选地从所发现的组织之一产生较高水平的mRNA,制备了cDNA文库。制备cDNA文库的方法在本领域是众所周知的。参见,例如,Sambrook等,eds,分子克隆:实验手册,第二版,冷泉港实验室出版社,1989和本文引用的参考文献。为检测编码TPO的分子,然后用本文公开的小鼠或人DNA序列或其片段或基于所公开的序列的更小的探针探查DNA文库。探针的特殊效用在于探针包括至少大约14个或更多核苷酸的寡核苷酸,及达25个或更多至少80%与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ I D NO:5或它们的补体序列的相同长度部分相同的寡核苷酸。优选的是探测较低杂交严格性的文库,即约2×SSC且杂交温度约50℃下使用标记的探针。与探针杂交的分子使用标准的检测方法检测。阳性克隆通过序列分析和活性测定[如结合同源MPL受体(即作为cDNA的相同物种的MPL受体)或刺激同源髓细胞能力]证实。可以利用其它的克隆方法,这对本领域的技术人员是明显的。
TPO蛋白质实质上与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4及它们的物种同系物蛋白质是同源的。术语“实质上同源”本文用于表明蛋白质有50%,优选的有60%或更优选的至少80%的序列与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4或它们的物种同系物中所显示的序列相同。这类蛋白质的序列更优选的是至少90%、最优选的是95%或更多与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4或它们的物种同系物的序列相同。序列相同的百分数用常规方法测定。参见,例如,Altschul等,Bull.Math.Bio 48:603-616,1986和Henikoff和Henikoff,美国科学院学报89:10915-10919,1992。简言之,使用Henikoff和Henikoff的缺口开口减10(gap opening penalty of 10)、缺口延伸突出减1(gap extension penalty of 1)和“blosum 62”的记分基准(如表1所示)(氨基酸通过标准的单字母码表示)对比两种氨基酸序列以优化序列对比分数。然后计算相同百分率如下:
表1A R N D C Q E G H I L K M F P S T W Y VA 4R -1 5N -2 0 6D -2 -2 1 6C 0 -3 -3 -3 9Q -1 1 0 0 -3 5E -1 0 0 2 -4 2 5G 0 -2 0 -1 -3 -2 -2 6H -2 0 1 -1 -3 0 0 -2 8I -1 -3 -3 -3 -1 -3 -3 -4 -3 4L -1 -2 -3 -4 -1 -2 -3 -4 -3 2 4K -1 2 0 -1 -3 1 1 -2 -1 -3 -2 5M -1 -1 -2 -3 -1 0 -2 -3 -2 1 2 -1 5F -2 -3 -3 -3 -2 -3 -3 -3 -1 0 0 -3 0 6P -1 -2 -2 -1 -3 -1 -1 -2 -2 -3 -3 -1 -2 -4 7S 1 -1 1 0 -1 0 0 0 -1 -2 -2 0 -1 -2 -1 4T 0 -1 0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1 1 5W -3 -3 -4 -4 -2 -2 -3 -2 -2 -3 -2 -3 -1 1 -4 -3 -2 11Y -2 -2 -2 -3 -2 -1 -2 -3 2 -1 -1 -2 -1 3 -3 -2 -2 2 7V 0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3 3 1 -2 1 -1 -2 -2 0 -3 -1 4
实质上同源的蛋白质,其特征在于此蛋白质具有一个或更多氨基酸的取代、缺失或添加。这些变化优选地是一种次要的性质变化,如保守的氨基酸取代,这种取代不能明显地影响蛋白质的折叠或活性(参见表2)。通常参见Ford等的蛋白质的表达和纯化2:95-107,1991,本文一并参考。
表2
保守氨基酸取代
碱性的: 精氨酸
赖氨酸
组氨酸
酸性的: 谷氨酸
天冬氨酸
极性的: 谷氨酰胺
天冬酰胺
疏水的: 亮氨酸
异亮氨酸
缬氨酸
芳香族的: 苯丙氨酸
色氨酸
酪氨酸
分子量小的:甘氨酸
丙氨酸
丝氨酸
苏氨酸
甲硫氨酸
TPO中的必需氨基酸可按照本领域中已知的方法鉴别,如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells,科学244,1081-1085,1989)。在新技术中,单个的丙氨酸突变在分子中以每个残基导入,试验产生的突变分子的生物活性(如受体结合,体外或体内的增殖活性)以鉴别对分子活性关键的氨基酸残基。配体受体相互作用的位点也可通过晶体的结构分析测定,如用核磁共振、晶体学或光亲和标记测定。参见,例如,de Vos等,科学255:306-312,1992;Smith等,分子生物学杂志224:899-904,1992;Wlodaver等,FEBS通信309:59-64,1992。
通常,预期细胞因子有4个α螺旋结构,第一个和第四个螺旋在配体受体相互作用中最重要,且在所有螺旋中更保守。参考SEQ ID NO:4中显示的人TPO氨基酸序列,细胞因子序列的对比表明这些螺旋分别在氨基酸残基29和53、80和99、108和130、144和168(界线是±4个残基)之间。小鼠(SEQ ID NO:2)和其它非人TPOs的螺旋界限可通过和人序列的序列对比确定。TPO的其它重要结构方面包括SEQ ID NO:2的51、73、129和195位置(与SEQ ID NO:4的28、50、106和172位置对应)的半胱氨酸残基。
在本发明内,血小板生成素可从包括血液、血浆、尿、细胞培养基和牛奶的各种物源制备。通常优选的是产生于工程培养的细胞或多细胞有机体中作为重组体蛋白质的TPO。然后,从细胞裂解物或提取物、条件培养基或(在多细胞有机体的情况下)牛奶或其它体液纯化蛋白质。
血小板生成素可按照常规技术从基因工程培养的细胞中产生。适合的宿主细胞是那些可用外源DNA转化或转染的及在培养物中生长的细胞类型,且包括细菌、真菌细胞和培养的更高级的真核细胞。操纵克隆的DNA分子及把外源DNA引入各种宿主细胞的技术已由Sambrook等,分子克隆:实验手册,第二版,冷泉港实验室出版社,冷泉港,NY,1989和Ausubel等,同上公开,本文一并参考。
通常,编码TPO蛋白质的DNA序列是可操作地连接到表达载体的转录启动子和终止子的。虽然本领域技术人员会认识到:在一定系统内,选择性标记可由单独的载体提供,外源DNA的复制子可通过整合进入宿主细胞染色体组提供,但载体通常包含一个或更多选择性标记及一个或更多起始复制子。启动子、终止子、选择性标记、载体及其它元件的选择在本领域的普通技术水平内,是常规的设计问题。许多这类元件在文献中已描述,且可通过市售获得。
为指导TPO进入宿主细胞的分泌路径,分泌信号序列(也作为前导序列、前序列已知)在表达载体中提供。分泌信号序列在正确阅读读框中结合到编码本发明的蛋白质的DNA序列上。虽然特定的信号序列可定位在目的DNA序列的其它部位(参见,例如Welch等,美国专利5,037,743;Holland等,美国专利5,143,830),分泌信号序列通常定位在编码目的蛋白质的DNA序列的5′端。分泌信号序列通常可以与TPO有关或可衍生自编码另一种分泌蛋白质(如组织类型血纤蛋白溶酶原激活剂)的基因。
已经制备小鼠和人TPO的表达载体,并按布达佩斯条约的条款保藏在美国典型培养物保藏中心,12301 Parklawn Drive,Rockville,MD。载体pZGmp1-1081(ATCC 69566)包含与腺病毒的主要晚期启动子连接的小鼠TP0 cDNA。载体pZGmp1-124(ATCC 69615)包含与小鼠金属硫蛋白启动子和hGH终止子及DHFR的选择性标记连接的人TPO cDNA。
酵母细胞,尤其是酵母属的细胞,在产生重组TPO多肽中是有用的。酵母细胞在生产人消费品上已有漫长的历史,而且培养相对便宜。用外源DNA转化酵母细胞并从中产生重组蛋白质的方法已经公开,例如,Kawasaki,美国专利4,599,311;Kawasaki等,美国专利4,931,373;Brake,美国专利4,870,008;Welch等,美国专利5,037,743和Murray等,美国专利4,845,075,本文一并参考)。转化的细胞通过用选择性标记测定的表型选择,此表型通常是药物抗性或在缺少特定养分(如亮氨酸)情况下的生长能力。在酵母中使用的一个优选的载体系统是POT1载体系统,此载体系统由Kawasaki等公开(美国专利4,931,373),它可使得转化的细胞通过在包含葡萄糖的培养基中生长来选择。酵母中使用的适合的启动子和终止子包括糖酵解酶基因(参见,例如Kawasaki,美国专利4,599,311;Kingsman等,美国专利4,615,974和Bitter,美国专利4,977,092,本文一并参考)和醇脱氢酶基因的启动子和终止子。也参见,美国专利4,990,446;5,063,154;5,139,936和4,661,454,本文一并参考。其它酵母,包括多形汉逊酵母、粟酒裂殖酵母、乳酸克鲁维酵母、脆壁克鲁维酵母、玉米黑粉菌、巴斯德毕赤酵母、季也蒙毕赤酵母和麦芽糖假丝酵母(Candidamaltosa)的转化系统在本领域是已知的。参见,例如,Gleeson等,微生物遗传学杂志132:3459-3465,1986;Cregg,美国专利4,882,279和Stroman等,美国专利4,879,231。
其它真菌细胞也适于用作宿主细胞。例如,按照McKnight等,美国专利4,935,349的方法(本文一并参考),可以利用曲霉属细胞。转化枝顶孢霉的方法由Sumino等,美国专利5,162,228公开,本文一并参考。转化脉孢菌属的方法由Lambowitz,美国专利4,486,533公开,本文一并参考。
如以上指出的,在本发明内培养的哺乳动物细胞是优选的宿主。把外源DNA导入哺乳动物宿主细胞的方法包括:磷酸钙介导的转染(Wigler等,细胞14:725,1978;Corsaro和Pearson,体细胞遗传学7:603,1981;Graham和Van der Eb,病毒学52:456,1973)、电穿孔(Neumann等,EMBO杂志1:841-845,1982)、DEAE-葡聚糖介导的转染(Ausubel等,eds,分子生物学最新方法,John wiley和Sons公司,NY,1987)以及阳离子脂类介导的转染(Hawley-Nelson等,Focus 15:7379,1993),本文一并参考。培养的哺乳动物细胞中重组蛋白质的产生方法已公开,例如,Levinson等,美国专利4,713,339;Hagen等,美国专利4,784,950;Palmiter等,美国专利4,579,821和Ringold,美国专利4,656,134,本文一并参考。优选的培养哺乳动物细胞包括COS-1(ATCC CRL 1650)、COS-7(ATCC CRL 1651)、BHK(ATCC CRL 1632)、BHK 570(ATCC CRL 10314)、293(ATCC CRL 1573;Graham等,病毒遗传学杂志36:59-72,1977)以及中国仓鼠卵巢细胞系(例如,CHO-K1;ATCC CCL 61)。其它适合的细胞系在本领域是已知的,且可从公共保藏单位(如美国典型培养物保藏中心,Rockville,Maryland)获得。通常,强转录启动子(如SV-40或巨细胞病毒的启动子)是优选的。参见,例如,美国专利4,956,288。其它适合的启动子包括金属硫蛋白基因启动子(美国专利4,579,821和4,601,978,本文一并参考)和腺病毒的主要晚期启动子。
药物选择通常用于选择外源DNA插入的培养的哺乳动物细胞。这类细胞通常称为“转染子”。在选择性试剂存在的条件下培养的并能把目的基因传给后代的细胞称为“稳定转染子”。优选的选择性标记是编码对抗生素新霉素有抗性的基因。选择在新霉素型的药物(如G-418或其类似物)存在下进行。选择系统也可以用于提高目的基因的表达水平,此过程称为“扩增”。扩增通过在低水平的选择性试剂存在下培养转染子,然后增加选择性试剂的量以选择使导入的基因高水平表达的细胞进行。优选的可扩增的选择性际记是抗氨甲蝶呤的二氢叶酸还原酶。也可使用其它的药物抗性基因(例如潮霉素抗性,多药物抗性,嘌呤霉素乙酰转移酶)。
其它更高级的真核细胞,包括昆虫细胞、植物细胞和禽细胞也可以用作宿主。昆虫细胞的转化和其中外源蛋白质的产生由Guarino等,美国专利5,162,222;Bang等,美国专利4,775,624和WIPO出版物WO94/06463公开,本文一并参考。植物细胞中作为表达基因载体的发根土壤杆菌的用途已由Sinkar等,生物科学杂志(Bangalore)11:47-58,1987综述。
优选的原核生物宿主细胞是细菌大肠杆菌的菌株,虽然芽胞杆菌属和其它属也是有用的。转化这些宿主和表达其中克隆的外源DNA序列的技术在本领域是众所周知的(参见,例如Sambrook等,同上)。当在如大肠杆菌的细菌中表达蛋白质时,蛋白质可典型地作为不可溶的微粒在细胞质中保持,或可由细菌分泌序列作用定向地进入周质空间。在前种情况下,细胞溶解,使用如胍异硫氰酸盐可回收微粒并使其变性,然后,通过稀释变性剂,使变性的蛋白重新折叠。在后一种情况下,蛋白质可以可溶的和功能的形式通过破坏细胞(例如通过声处理或渗透压休克)从周质空间回收以释放周质空间的内含物物,并再回收蛋白质。
转化或转染的宿主细胞按照常规方法在包含养份和选择的宿主细胞生长所需的其它组分的培养基中培养。包括说明的培养基和复合物培养基的各种适合培养基在本领域是已知的,且一般包括碳源、氮源、必需氨基酸、维生素和矿物质。培养基也可以包含这类组分(如所需要的生长因子或血清)。生长培养基将选择包含添加的外源DNA的细胞,选择将通过如药物选择或必需养份的缺乏进行,其中所缺乏的养分用表达载体或共转染进入宿主细胞的选择性标记补充。
转基因的动物技术也可用于产生TPO。优选的是在雌性宿主哺乳动物的乳腺中产生蛋白质。在乳腺中的表达及后来目的蛋白质进入牛奶的分泌克服了许多在从其它源中分离蛋白质所遇到的困难。牛奶容易收集,可大量获得,且具有好的生化特征。而且,主要的牛奶蛋白质在牛奶中以高浓度存在(从大约1到15g/l)。
从商业的角度看,明显优选的是使用有大量牛奶产量的物种作为宿主。较小的动物(如小鼠和大鼠)可以使用(且优选的在验证概念阶段),优选的是使用家畜类哺乳动物,包括但不限于猪、山羊、绵羊和牛。由于物种中以前有转基因的历史、乳的产量、成本及收集羊奶的设备容易得到等因素,尤其优选的是羊。参见比较影响宿主物种选择因素的WIPO出版物WO88/00239。通常需要选择已经是农场饲养的动物物种如East Friesland羊(),或者需要在后期经饲养转基因系引入农场血统。在任何情况下,已知的所使用的动物应该具有良好的健康状况。
为在乳腺中表达,使用牛奶蛋白质基因的转录启动子。牛奶蛋白质基因包括那些编码酪蛋白(参见美国专利No.5,304,489,本文一并参考),β-乳球蛋白,α-乳清蛋白和乳清酸性蛋白质的基因。优选的是β-乳球蛋白(BLG)启动子。虽然,优选的是长达大约5kbp的5′侧面序列的较大部分(如包括5′侧面序列的启动子的-4.25kbp DNA片段和β-乳球蛋白基因的非编码部分),当启动子是羊β-乳球蛋白基因时,通常至少使用基因5′端侧面序列中邻近406bp的区域。参见Whitelaw等,生物化学杂志286:31-39,1992。其它物种启动子DNA的类似片段也适合使用。
通常,产生转基因动物的方法在本领域是已知的。参见,例如,Hogan等,操作小鼠胚:实验室手册,冷泉港实验室,1986;Simons等,生物学/技术6:179-183,1988;Wall等,Biol.Reprod.32:645-651,1985;Buhler等,生物学/技术8:140-143,1990;Ebert等,生物学/技术9:835-838,1991;Krimpenfort等,生物学/技术9:844-847,1991;Wall等,细胞生物化学杂志49:113-120,1992;美国专利Nos.4,873,191和4,873,316;WIPO出版物WO88/00239,WO90/05188,WO92/11757和GB 87/00458,本文一并参考。把外源DNA序列引入哺乳动物和它们的生殖细胞中的技术最初在小鼠中开发。参见,例如,Gordon等,美国科学院学报77:7380-7384,1980;Gordon和Ruddle,科学214:1244-1246,1981;Palmiter和Brinster,细胞41:343-345,1985;Brinster等,美国科学院学报82:4438-4442,1985;Hogan等(同上)。以后,这些技术适用于包括家畜类物种(参见,例如,WIPO出版物WO88/00239,WO90/05188和WO92/11757;Simons等生物学/技术6:179-183,1988)。为总结在转基因小鼠或家蓄类产生中用于定期的最有效路径,把几百个目的DNA的线性分子,按照本领域的标准技术注入受精卵的一个前核。也可以把DNA注入合子的细胞质。
也可以在转基因植物中产生。表达可以在整体或直接在特殊器官中进行,如块茎。参见,Hiatt自然344:469-479,1990;Edelbaum等,干扰素研究杂志12:449-453,1992;Sijmons等,生物学/技术8:217-221,1990;欧洲专利办公室出版物EP255,378和Hiatt等,美国专利NO.5,202,422。
按照本发明,使用包括基于主要蛋白质的亲和纯化和分离的组合方法纯化TPO。亲和纯化在固定的MPL受体蛋白质或其配体结合部分上进行,洗脱结合TPO且用常规方法易于进一步分离。
如以上所标明的,优选的是从液体(如条件细胞培养基、牛奶或其组分)纯化血小板生成素。通常,基因工程细胞和有机体比蛋白质的“天然”源(例如,血液、血浆、尿)的成本更低并提供更容易操纵和监测的产生系统。
为减少分离所需要的时间,优选的是首先浓缩生物液体的TPO。浓缩可用本领域中已知的任意许多方法完成。优选的浓缩方法包括在具有约10kD到30kD分子重量截断片段的膜上超滤和在如染色树脂(例如,MimeticGreenTM,Lexton科学国际信号Hill,CA)的吸收剂上直接俘获。
将包含血小板生成素的生物液体加到包含结合到固体支持物上的包含MPL受体之配体结合结构域的多肽上。MPL受体已在科学文献中描述。参见,例如,Vigon等,美国科学院学报89:5640-5644,1992和Skoda等,EMBO杂志12:2645-2653,1993。小鼠MPL受体的N-末端胞外结构域的氨基酸序列在SEQ ID NO:7中显示。本领域技术人员会意识到:SEQ ID NO:7是小鼠MPL受体的单一等位基因的代表,并预期存在等位变异体。其它物种(例如,人或其它灵长类、大鼠、狗、猪等)的MPL受体可通过与小鼠受体的功能和结构的相似之处鉴别。小鼠MPL受体之配体结合结构域包含在蛋白质的胞外部分(SEQ ID NO:7的残基27到480)内,并相信具有残基293-297、358-361和398-419的小鼠MPL受体之配体结合结构域对配体结合具有特殊的重要性。适合的固体支持物包括玻璃小珠、硅基树脂、纤维素树脂、琼脂糖小珠、交联的琼脂糖小珠、聚苯乙烯小珠、交联的聚丙烯酰胺树脂及在使用它们的条件下不可溶解的类似物。这些支持物可用反应基团修饰,这些反应基团可使蛋白质通过氨基、羧基、巯基、羟基和/或碳水化物部分附着。偶联化学的例子包括溴化氰活化、N-羟基琥珀酰亚胺活化、环氧化物活化、巯基活化、酰肼活化和碳二亚胺偶联化学的羧基和氨基衍生物。这些和其它的固体培养基在本领域是众所周知的,并广泛地使用,且可从市售获得。特殊方法的选择是常规的设计问题,并部分地决定于所选择的支持物的特征。参见,例如,亲和层析:主要方法,PharmaciaLKB生物技术,Uppsala,瑞典,1988。
在本发明的优选的实施方案中,结合到固体支持物的受体多肽以柱的形式提供。生物液体在吸收TPO进受体的最优条件下(例如,在包含0-1.0MNaCl的pH为7.0-9.0的缓冲液中)通过柱。然后洗涤柱以除去未吸附的物质。适合的洗涤条件将对本领域技术人员是明显的。优选的是用缓冲的中性微碱的低浓度溶液(如包含0.5至1.0M NaCl的pH为7.0至9.0的Tris-缓冲溶液)洗涤以缓和盐浓度。然后,从受体多肽洗脱吸收的TPO。洗脱通过用离液剂(如KSCN、尿素或盐酸胍),优选地使用2.0-3.5M的KSCN洗涤受体-TPO复合物进行。
在另一种方法中,TPO可成批地吸附到受体多肽上。在一种典型的方法中,受体多肽结合到不溶性颗粒(例如,树脂小珠),用包含TPO的溶液温育2-24小时。结合到固定的多肽上的TPO从溶液中除去(如通过轻轻的离心或过滤)。然后,用以上一般性说明的缓冲溶液洗涤受体多肽颗粒,TPO用离液剂从多肽洗脱。洗脱可通过加入离液剂成批进行以使TPO从多肽释放,接着通过离心从不溶性受体多肽颗粒分离可溶性TPO。在备择的方法中,将颗粒-受体多肽-TPO复合物注入柱中,如以上所公开的洗脱TPO。
再次纯化之前,优选的是从洗脱的TPO除去洗脱液。适合的除去方法包括透析、凝胶过滤和直接俘获,优选的是用透析。透析缓冲液的选择在本领域的普通技术水平内。弱碱性的缓冲的溶液是优选的。
然后,如通过阴离子交换色谱,可以分离包含TPO的溶液。优选的色谱介质包括具有季胺或二乙氨基乙基基团的阴离子交换基质,如MonoQ、Q-Sepharose和DEAE Sepharose(可从Pharmacia生物技术,Piscataway,NJ获得)。洗脱前,用低离子强度缓冲液(如pH为8.5的0.025M的Tris-HCL)洗涤柱。TPO应用盐梯度(如在pH为8.5的Tris缓冲液中的0-0.5M NaCL)从柱上洗脱。TPO以约0.05M到0.15M间的盐浓度洗脱。
纯化过程用常规的方法(如分光光度法或电泳法)监测。使用银染和“Western”印迹的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是检测纯化过程的优选的方法。
典型的阴离子交换分离在图1中说明。TPO分离成低分子量(18,000-55,000道尔顿)和高分子量(70,000±10,000道尔顿)种类。然后,收集高度纯化的TPO组分,在一个实施方案中,具有Mr=70,000±10,000道尔顿的TPO制剂实质上不含有Mr<55kD的TPO物种。
按照本发明制备的蛋白质,无论哪儿需要骨髓细胞增殖,都可用于治疗(血细胞减少症的治疗,此病症由如再生障碍性贫血、脊髓发育不良综合症、化疗或先天血细胞减少症及贫血治疗诱导)。此蛋白质对增加血小板的产生(如血小板减少的治疗)尤其有用。血小板减少与多组疾病有关,且临床状况可单独作用或协同作用以产生新病症。降低的血小板计数可由如血小板产生的缺陷、异常血小板的分布、由于大量转移而引起的稀释丢失或血小板的异常破坏获得。例如,用于癌治疗的化疗药物可抑制骨髓中血小板祖细胞的发展,产生的血小板减少限制化疗并使输血成为必要。此外,一定的恶性肿瘤可修复血小板产生和血小板分布。放射治疗用于杀死恶性细胞,也杀死血小板祖细胞。血小板减少也可由通过药物、新生的异免疫或血小板转输的异免疫诱导的各种血小板自身免疫失调引起。本发明的蛋白质可减少或除去对输血的需要,进而降低血小板异免疫的发生率。血小板的异常破坏可源于:(1)血管移植片或受损伤的组织中增加的血小板消耗;或(2)相关的免疫机制,例如,药物诱导的血小板减少、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、自身免疫疾病、血液学疾病(如白血病和淋巴瘤或涉及骨髓的转移性癌)。本发明蛋白质的其它适应症包括再生障碍性贫血和药物诱导的由例如化疗或用AZT治疗HIV感染引起的髓抑制。
血小板减少有增加出血(如鼻口部或肠胃道的粘膜出血以及从伤口、溃疡或注射位点的渗出)表现出来。
也已经发现TPO组合物对提高循环的红细胞和红细胞前体细胞水平是有效的。作为贫血的这些细胞的循环水平的降低是已知的。血液中的红细胞水平通过测定每100ml血红蛋白的量或血液中每100ml包围的红血细胞的体积测定。如果患者的血细胞比容水平降低到11-13gm/100ml血液以下(依赖于患者的年龄和性别),患者被诊断为贫血。TPO对与骨髓障碍有关的贫血的治疗特别有用,其中在骨髓障碍处细胞形成的减少与例如化疗的有毒影响有关。此外,一定的恶性肿瘤可修复血小板和红细胞的产生和分布。放射治疗用于杀死恶性细胞,也可杀死血小板和红细胞祖细胞。血小板和红细胞的异常破坏可由血液疾病(如白血病和淋巴瘤或涉及骨髓的转移性癌)引起。本发明的蛋白质治疗贫血和血小板减少的适应症包括再生障碍性贫血和由例如化疗或药物诱导的用AZT治疗HIV感染引起的髓抑制。在这方面,TPO可单独施用或与红细胞生成素结合施用。
为使TPO用于药学上,按照常规方法,制备肠胃外,尤其是静脉内或皮下施用的TPO。静脉内施用将通过大丸剂注射或在1到几小时的典型时期内注入。通常,药物制剂包括与药学上可接受的载体结合的TPO,如盐水、缓冲盐水、含水5%的右旋糖或其类似物。此制剂还可包括一种或多种赋形剂、防腐剂、加溶剂、缓冲剂、清蛋白以预防药瓶表面蛋白质的丢失等。此外,TPO也可以与其它的细胞因子,尤其是早期作用的细胞因子(如干细胞因子、IL-3、IL-6、IL-11或GM-CSF)组合。利用这类组合物治疗时,细胞因子可以单一的形式结合或可以单独施用。配制方法在本领域是公知的,并且是公开的,例如,在Remington的药学科学中,Gennaro,ed.,Mack出版公司,Easton PA,1990,本文一并参考。本发明的TPO的治疗剂量通常将在0.1至100μg/kg患者体重/天的范围内,优选为0.5-50μg/kg/天,确切的剂量按照接受的标准,依照临床医生的意见并考虑到治疗条件的性质和严重度及病人的特点等测定。在一定情况下,如当治疗的患者显示增加的敏感性或需要延迟治疗时,将标明剂量为0.1-20μg/kg/天。此剂量的测定在本领域普通技术人员的水平内。TPO一般地将施用多达28天的期限,接着进行化疗或骨髓移植或直到得到的血小板数量>20,000/mm3,优选地>50,000/mm3。更普通地,TPO将在约一周或更少的时间内,经常是一至三天内施用。通常,TPO的治疗有效量是在增殖和/或骨髓祖细胞分化中产生临床上明显的增加的足够的量,其中,骨髓祖细胞的分化将作为血小、板或红细胞循环水平上的增加显示出来。这样,将继续血小板疾病的治疗,直到血小板的数量至少为20,000/mm3,优选的为50,000mm3。继续贫血的治疗直到标准的血细胞比容恢复。TPO也可与其它细胞因子(如IL-3、-6和-11;干细胞因子;红细胞生成素;G-CSF和GM-CSF)组合施用。在组合疗法的方法中,其它细胞因子的每日剂量通常是:EPO,≤150U/kg;GM-CSF,5-15μg/kg;IL-3,1-5μg/kg;和G-CSF,1-25μg/kg。例如,用EPO的组合疗法在具有低EPO水平的贫血患者中显示。
TPO也是在体外研究造血细胞的分化和发展(如阐明细胞分化的机制和测定成熟细胞的血统)的有价值的工具,同时也发现可作为细胞培养物的增生剂。
TPO也可用于来自体内如自体固有的髓培养物。简言之,化疗前,把骨髓从患者除去,并用TPO可选地用与一种或更多种其它细胞因子的组合物治疗。化疗后,把治疗的髓返回患者以加速髓的回收。此外,TPO也可用于髓或外围的血液祖(PBPC)细胞的来自体内的扩展。化疗前,髓可用干细胞因子(SCF)或G-CSF刺激以释放早期祖细胞外围循环。这些祖先可收集并从外围血液中浓缩,然后在培养物中用TPO,可有选择地用与一种或多种包括但不限于SCF、G-CSF、IL-3、GM-CSF、IL-6或IL-11的其它细胞因子的组合物治疗,以使进入高密度的巨核细胞培养物分化和增殖,然后,此培养物在高剂量化疗后返回到患者中。
本发明通过下列非限制性实施例进一步说明。
实施例
实施例1:人TPO基因的克隆
利用小鼠TPO cDNA(Lok等,同上,以及SEQ ID NO:1)作为探针,从扩增的人肺脏λFIX基因组文库(Stratagene克隆系统,La Jolla,CA)筛选编码人血小板生成素的基因。测定文库的滴度,30个150-mm的用大肠杆菌菌株LE-392细胞接种(Stratagene克隆系统)的平板用4×104噬斑形成单位感染。平板在37℃下培养过夜。滤膜噬斑隆起物利用HYBOND-NTM尼龙膜(Amersham公司,Arlington Height,IL)按照制造厂商推荐的方法制作。滤膜通过室温下在包含1.5M NaCl和0.5M的NaOH的溶液中变性7分钟加工。滤膜在滤纸上短时间印迹以除去过多的变性溶液,其后1M Tris-HCl(pH7.5)和1.5M NaCl中中和5分钟。噬菌体DNA以STRATALINKER UV交联器(Stratagene克隆系统)上使用1,200μ焦耳的UV能量固定在滤膜上。固定之后,滤膜在65℃下的0.25×SSC,0.25%SDS和1mM EDTA中预洗三次。在预洗之后,滤膜在通过0.45μM滤膜过滤的杂交溶液中(5×SSC,5×Denhardts溶液,0.2%SDS和1mM EDTA)预杂交。热变性的、剪切的鲑精DNA(最终浓度为100μg/ml)在使用之前加入。滤膜在65℃下预杂交过夜。
pZGmp1-1081(作为大肠杆菌DH5α转化体1994年2月14日保藏在美国典型培养物保藏中心,12301 Parklawn Drive,Rockville,MD,指定的保藏号为ATCC 69566)的全长度小鼠TPO cDNA由32P通过随机引物使用MEGAPRIMETMDNA标记系统(Amersham)按照制造厂商推荐的方法标记。预杂交溶液用包含约1×106cpm探针的新鲜杂交溶液代替,并使得在65℃下杂交过夜。杂交后,除去杂交溶液,滤膜各在包含0.25×SSC,0.25%SDS和1mMEDTA的洗涤溶液中冲洗4次或5次。冲洗后,滤膜用洗涤溶液在50℃下连续洗涤8次。最后一次洗涤后,把滤膜露置于放射自显影图膜(XAR-5;Eastman Kodak公司;Rochester,NY)用增感屏在70℃下放置4天。
放射自显影图的测验显示了几百个用标记的探针杂交的区域。将琼脂块从100个纯化的区域取走。各个琼脂块在包含1%(v/v)三氯甲烷的1ml SM(每升包含:5.8g NaCl,2g MgSO4.7H2O,50ml 1M Tris-Cl,pH值7.5,5ml 2%明胶;Maniatis等,eds,分子克隆:实验室手册,Cold SpringHarbor,NY,1982)中浸泡一夜。培养一夜后,每个块的噬菌体在SM中以1∶1,000稀释。把5μl的等分试样平铺于大肠杆菌菌系LE392细胞。把平板在37℃下培养过夜,揭下滤膜,并预杂交,杂交和洗涤,且如上所述进行放射自显影。
产生的放射自显影图的测验显示两个初级分离物的强的阳性信号和其它18个分离物的弱的信号。把琼脂块从20个信号的各个阳性区域取走。如以上所述处理琼脂块。从各个琼脂块洗脱的噬菌体在SM中以1∶100稀释,1μl的等分试样用大肠杆菌菌系LE392细胞平板接种。培养平板,如以上所述制备揭去噬菌体滤膜并杂交。滤膜在55℃下用洗涤缓冲液洗涤。滤膜的放射自显影图显示了对应于3个初始分离物8-3-2、10-1-1和29-2-1的单个的分散的噬菌体的杂交区域。
噬菌体分离物8-3-2、10-1-1和29-2-1分别称为λZGmpl-H8、λZGmpl-H10和λZGmpl-H29。分离物λZGmpl-H8、λZGmpl-H10和λZGmpl-H29的DNA使用LAMBDASORBTM噬菌体吸附剂(Promega公司,Madison,WI)按照制造厂商的说明纯化。噬菌体的人基因组DNA插入序列从噬菌体载体DNA通过用Xba I消化分离,通过琼脂糖凝胶电泳纯化。所有的三种噬菌体分离物包含与Southern印迹分析(Maniatis等,同上)所显示的小鼠mpl受体配体cDNA探针杂交的序列。分析噬菌体λZGmpl-H8,并发现λZGmpl-H8的杂交区域属于长度为9.5kb、2.5kb和1kb的三个XbaI DNA片段。2.5kb片段在XbaI消化的BLUESCRIPTII SK+噬菌粒(Stratagene克隆系统)中亚克隆,以产生质粒pZGmp1-H82.5。
人TPO基因序列和编码氨基酸的序列在SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6中显示。实施例2:人TPO cDNA的克隆
全长人TPO编码cDNA通过聚合酶链反应从人肝脏和肾的DNA模板中分离,其中使用了衍生自pZGmpl-H82.5上鉴定的外显子序列及小鼠TPO cDNA保守的5′端的未翻译的序列的特异性引物。
人肾、肝脏和肺polyd(T)选择的poly(A)+RNAs(Clontech palo Alto,CA)用于合成第一链cDNA。各个反应混合物使用4μg与1μg d(T)18(没有5′端磷酸盐)mRNA引物(新英格兰生物实验室,Beverly,MA)在19μl终体积混合的poly(A)+RNA制备。把混合物加热到65℃持续5分钟,并通过在冰上急冷冷却。cDNA合成由加入8μl的5×SUPERSCRIPTM缓冲液(GIBCOBRL,Garthersburg,MD),2μl的100mM二硫苏糖醇,2μl包含dATP、dGTP、dTTP和dCTP(Pharmacia LKB生物技术公司,Piscataway,NJ)各10mM的脱氧核苷酸三磷酸溶液,2μl的1μCi/μl32p-α-dCTP(Amersham公司,Arlington Heights,IL)和8μl RNA引物混合物各组分的200U/μl SUPERSCRIPTTM逆转录酶(GIBCO BRL)开始。反应物在45℃下温育1小时,并以TE(10mM pH值8.0 Tris-HCl,1mM EDTA)稀释到120μl。cDNAs通过加入50μl 8M乙酸铵和160μl异丙醇沉淀两次。产生的cDNA沉淀重新悬浮在10μl的TE中。每种反应物的第一链cDNA的产量从32p-dCTP的结合水平估计。
肝脏、肺和肾mRNA的第一链cDNA使用单独的聚合酶链反应,用于产生两种cDNA片段,N-末端三分之一和C-末端三分之二的序列。KpnI限制位点通过使用引物ZC7422(SEQ ID NO:8)和ZC7423(SEQ ID NO:9)的PCR诱变的基因组序列的单一的碱性变化引入cDNA片段。发生的核苷酸变化产生了普通的KpnI限制位点,而在所预测的氨基酸编码中没有变化。
N-末端片段在50μl包含5ng模板cDNA(在肾、肝脏和肺cDNAs的单独反应中),寡核苷酸ZC7424(SEQ ID NO:10)和ZC7422(SEQ ID NO:8)各80pmoles,5μl 2.5mM脱氧核苷酸三磷酸溶液(Cetus公司,Emeryvillle,CA),5μl 10×PCR缓冲液(Promega公司,Madison,WI)和2.5单位的Taq聚合酶(Boehringer Mannheim公司,Indianapolis,IN)的反应物中扩增。聚合酶链反应进行35个周期(在94℃下1分钟,58℃下1分钟,72℃下1.5分钟)接着72℃下温育71分钟。有义引物ZC7424(SEQ ID NO:10)穿过小鼠MPL受体配体5′端不翻译区,并包含ATG起始密码子。反义引物ZC7422(SEQ ID NO:8)包含对应于人基因组TPO DNA外显子4和5的区域的序列。
C-末端片段在50μl包含5ng模板cDNA(如以上所述的肾、肝脏和肺),寡核苷酸ZC7423(SEQ ID NO:9)和ZC7421(SEQ ID NO:11)各80pmoles,5μl2.5mM脱氧核苷酸三磷酸溶液(Cetus公司),5μl10×PCR缓冲液(Promega公司)和2.5个单位的Taq聚合酶(Boehringer Mannheim公司)的反应物中扩增。聚合酶链反应进行35个循环(在94℃下1分钟,65℃下1分钟,72℃下1.5分钟)接着72℃下温育71分钟。有义引物ZC7423(SEQ ID NO:9)包含对应于人基因组TPO DNA外显子4和5的区域的序列。反义引物ZC7421(SEQ ID NO:11)包含对应于人基因3′端非编码序列的区域的序列,并包含翻译终止密码子。
扩增的PCR产物直接经DNA测序分析,并亚克隆进pGEM-T(Promega公司),通过对小鼠cDNA序列与人基因组序列的比较进一步分析。编码人TPO的DNA序列在SEQ ID NO:3中显示,编码的氨基酸序列在SEQ ID NO:4中显示。序列分析表明:信号肽裂解发生在丝氨酸21(SEQ ID NO:4)后,成熟蛋白质从氨基酸22(SEQ ID NO:4)开始。
人N-末端和C-末端PCR片段作为EcoRI-KpnI片段从pGEM-T切除,并连接到表达载体Zem229R的EcoRI位点中。这种质粒使用lipofectamineTM(GIBCO BRL)转染进入BHK 570细胞。转染24小时后,培养基(DMEM+PSN+10%FCS)以新鲜培养基代替,并在选择性试剂存在时培养细胞48小时。条件培养基的增殖活性使用BaF3/MPLR1.1细胞系(按布达佩斯条约规定于1994年9月28日在美国典型培养物保藏中心,12301Parklawn Drive,Rockville,MD保藏,指定的保藏号为CRL11723)试验。简言之,向条件培养基中加入100μl 106/ml洗涤的BaF3/MPLR1.1细胞(RPMI 1640介质(JRH生物科学公司,Lenexa,KS)补充有2mM L-谷氨酰胺、PSN抗生素(GIBCO BRL)、0.00036%2-巯基乙醇和10%的热灭活胎牛犊血清)。增殖测定前,在低于5%CO2下在37℃培养细胞3天。在TPO存在时的细胞增殖使用基于3-(4,5二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基溴化四唑(MTT)(Mosman,免疫学方法.65:55-63,1983)的代谢降低的比色测定法定量测定。将20μl的10mg/ml MTT溶液(Polyscience公司,Warrington,PA)加到100μl BaF3/MPLR1.1测定细胞中,在37℃下培养细胞。培养4小时后,加入200μ1 0.04N HCl的异丙醇,混合溶液,样品的吸收率在模型EL320 ELISA读数仪(Bio-Tek仪器公司,Highland Park VT)上570nm处读出。结果清楚地显示:培养基中人TPO刺激表达小鼠MPL受体的BaF3细胞的增殖。
使用SUPERSCRIPTTM逆转录酶(GIBCO BRL)按照制造厂商的说明从人肝脏和肾mRNA(从Clontech laboratories公司获得)制备cDNA。然后,使用两种PCR反应物(在表3中所显示的条件下)制备来源于肝脏和肾的人TPO DNA克隆。反应以94℃下1分钟,58℃下1分钟,72℃下1.5分钟为一个循环共进行35个循环;接着在72℃下温育7分钟。
表3#1反应:
5ng肝脏或肾cDNA
4μl寡核苷酸ZC7454(20ρM/μl)(SEQ ID NO:12;引入ATG的5′EcoRI位点)
4μl寡核苷酸ZC7422(20ρM/μl)(SEQ ID NO:8;构造Asp718位点)
5μl包含2.5mM dATP,2.5mM dGTP,2.5mM dCTP和2.5mM dTTP的dNTPs溶液
5μl 10×Taq缓冲液(Boehringer Mannheim)
1μlTaq聚合酶(Boehringer Mannheim)
30μl水#2反应:
5ng肝脏或肾cDNA
4μl寡核苷酸ZC7423(20ρM/μl)(SEQ ID NO:9;构造Asp718位点)
4μl寡核苷酸ZC7453(20ρM/μl)(SEQ ID NO:13;构造TGA的3′EcoRI位点)
5μl包含2.5mM dATP,2.5mM dGTP,2.5mM dCTP和2.5mM dTTP的dNTPs溶液
5μl 10×Taq缓冲液(Boehringer Mannheim)
1μl Taq聚合酶(Bqehringer Mannhein)
30μl水
PCR产物用酚/氯仿/异戊醇处理,用95%ETOH沉淀,干燥,重新悬浮在20μl的水中。然后,把各种产物用限制酶Asp718和EcoRI切割并在1%琼脂糖凝胶上电泳。将#1反应的410bp片段(肝脏和肾)和#2反应的699bp片段(肝脏和肾)从凝胶上切割下来,并使用凝胶胶块通过尼龙织物的离心洗脱。使#1反应和#2反应的PCR产物与载体Zem229R(1993年9月28日保藏在美国典型培养物保藏中心,12301 Parklawn Drive Rockville,MD,保藏号为69447)连接在一起,此载体由EcoRI切割,因此在所构造的Asp718位点连接两种产物。产生的质粒定名为#10(包含来源于肾的cDNA)和#28(包含来源于肝脏的cDNA)。
关于测序DNA,单一PCR产生的错误分别在#28和#10质粒中单一的AvrII位点的5′和3′端发现。为构造无错误的TPO DNA,把826bp EcoRI-AvrII5′片段从#10分离出来,把283bp AvrII-EcoRI3′片段从#28分离出来。两种片段通过以EcoRI切割的载体Zem229R连接在一起。产生的质粒定名为pZGmp1-124。这种质粒作为大肠杆菌DH10b转化体于1994年5月4日保藏在美国典型培养物保藏中心,12301 Parklawn Drive,Rockville,MD,保藏号为69615。实施例3:人MPL受体cDNAs的克隆
编码cDNAs的人MPL-P和MPL-K受体对碘氧基苯甲醚通过逆转录聚合酶链反应(PCR),使用按照公布的编码受体的氨基和羧基末端的序列(Vigon等,美国科学院学报89:5640-5644,1992)构造的引物,从人红白血病(HEL)细胞(Martin和Papayannopoulu,科学216:1233-1235,1982)中分离出来。使用引物ZC5499(SEQ ID NO:14)由多d(T)选择的聚腺苷酸化RNA合成模板HEL细胞cDNA。将13μl的HEL细胞聚腺苷酸化的RNA以1μg/μl的浓度与3μl 20pmole/μl第一链引物ZC5499(SEQ ID NO:14)混合。把混合物在65℃下加热4分钟,并通过在冰上急冷冷却。
第一链cDNA合成从加入8μl第一链缓冲液(pH值8.3,250mM Tris-HCl,375mM KCl,15mM MgCl2)(5×SUPERSCRIPTTM缓冲液;GIBCO BRL),4μl 100mM二硫苏糖醇和3μl包含dATP,dGTP,dTTP和5-甲基-dCTP(Pharmacia Biotech公司,Piscataway,NJ)各10mM的脱氧核苷酸三磷酸溶液开始。反应混合物在45℃下温育4分钟,接着向RNA-引物混合物加入10μl 200U/μl的RNA酶H逆转录酶(SUPERCRIPTM逆转录酶;GIBCOBRL)。反应混合物在45℃下温育1小时,接着在50℃下温育15分钟。把60μl TE(10mM Tris-HCl,pH值8.0,1mM EDTA)加入反应混合物,然后把此混合物用通过400孔大小的凝胶过滤柱(CHROMA SPIN+TE-400TM;Clontech Laboratories公司)色谱以除去过多的引物。
将第一链HEL细胞cDNA用作人MPL-P受体cDNA的扩增模板,使用相应于受体蛋白质(Vigon等,同上)氨基和羧基末端编码区的引物。引物也分别结合在不同的限制性内切酶连接位点上,以助于扩增产物(包含EcoRI位点的ZC5746,SEQ ID NO:15;包含XhoI位点的ZC5762,SEQ ID NO:16)的定向克隆。制备100μl包含10ng模板cDNA,50 pmoles各种引物;200μM各种脱氧核苷酸磷酸盐(Pharmacia Biotech公司);1μl 10×PCR缓冲液(Promega公司)和10个单位的Taq聚合酶(Roche Molecular System公司,Branchburg,NJ)的反应物。聚合酶链反应进行35个循环(95℃下1分钟,60℃下1分钟,72℃下2分钟,各连续的循环中另外间隔1秒),接着在72℃下温育10分钟。
除引物ZC5762(SEQ ID NO:16)以ZC5742(SEQ ID NO:17)代替例外,使用以上所述的方式,通过聚合酶链反应扩增从HEL细胞cDNA分离人MPL-K受体cDNA。PCR引物ZC5742对人MPI-K cDNA的3′末端具有特异性,并结合XhoI限制性位点以利于克隆。
反应产物用酚/三氯甲烷(1/1)提取两次,然后用三氯甲烷提取一次,并用乙醇沉淀。接着用EcoRI和XhoI消化,产物在0.8%少量熔化的琼脂糖凝胶(SEA PLAQUE GTGTM少量熔化的琼脂糖;FMC公司,Rockland,ME)上分级分离。1.9kb的对应于人MPL-P受体cDNA的扩增产物和1.7kb的对应于人MPL-K受体cDNA的产物通过用β琼脂糖酶I(新英格兰Biolabs公司,Beverly,MA)消化凝胶基质,接着用乙醇沉淀,从所切除的凝胶片回收。将所说cDNAs亚克隆进载体pBluescriptSK+(Stratagene Cloning System)以通过测序确证。实施例4:小鼠MPL受体cDNAs的克隆
从C57BL/KsJ-db/db小鼠中把脾除去,并立即置于液态氮中。整个RNA使用胍异硫氰酸盐(Chirgwin等,生物化学18:52-94,1979)从脾组织制备,接着进行CsCl离心。脾的聚腺苷酸化RNA使用d(T)少的纤维素色谱(Aviv和Leder,美国科学院学报69:1408-1412,1972)分离。
7.5μl的polyd(T)选择的聚腺苷酸化的小鼠脾RNA以1.7μg/μl的浓度与3μl包含NotI限制位点的20pmole/μl第一链引物ZC6091(SEQ ID NO:18)混合。混合物在65℃下加热4分钟,并通过急冷在冰上冷却。第一链cDNA合成从向RNA引物混合物加入8μl pH为8.3,250mM Tris-HCl,375mMKCl,15mM MgCl2(5×SUPERSCRIPTTM缓冲液;GIBCO BRL),4μl 100mM二硫苏糖醇和3μl包含dATP、dGTP、dTTP和5-甲基-dCTP个10mM脱氧核苷酸三磷酸溶液(Pharmacia Biotech公司)开始。反应混合物在45℃下温育4分钟,接着加入10μl 200U/μl的RNA酶H-逆转录酶(GIBCO BRL)。第一链的合成效率在平行反应中分析,通过向10μl反应混合物的等分试样加入10μCi32P-αdCTP以标记合成的反应物。把反应物在45℃下温育1小鼠,接着在50℃下温育15分钟。在标记的反应物中未结合的32P-αdCTP在400孔大小的凝胶过滤柱(CHROMA SPIN+TE-400TM;Clontech Laboratories公司)上色谱除去。在未标记的第一链反应物中未结合的核苷酸通过在8μg糖原载体、2.5M乙酸铵和2.5体积的乙醇存在下两次沉淀cDNA除去。未标记的cDNA重新悬浮在50μl的水中以用于第二链的合成。标记的第一链cDNA的长度通过琼脂糖凝胶电泳测定。
用第一链cDNA在促进第一链引导(priming)产生DNA的发夹形式的第二链合成物条件下进行第二链合成。反应混合物在室温下装配,包含50μl未标记的第一链cDNA,16.5μl水,20μl 5×聚合酶I缓冲液(100mMTris-HCl,pH值7.4,500mM KCl,25mM MgCl2,50mM(NH4)2SO4),1μl100mM二硫苏糖醇,2μl包含10mM各种脱氧核苷酸三磷酸的溶液,3μl 5mMβ-NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸),15μl 3U/μl大肠杆菌DNA连接酶(新英格兰Biolabs公司,Beverly,MA)和10U/μl大肠杆菌DNA聚合酶I(Amersham公司,Arlington Heights,IL)。反应物在室温下温育5分钟,接着加入1.5μl的2U/μl RNA酶H(GIBCO BRL)。在平行反应中通过加入10μCi32P-αdCTP标记10μl第二链合成混合物的等份试样,此平行反应可用于监测第二链的合成效率。反应物在15℃下温育2小时,接着在室温温育15分钟。在通过凝胶电泳分析前标记的反应物中未结合的32P-αdCTP,用通过400孔大小的凝胶过滤柱(Clontech Laboratories公司)色谱除去。未标记的反应通过用酚/三氯甲烷的两次提取和用三氯甲烷提取一次,接着在2.5M乙酸铵存在的条件下用乙醇沉淀终止。
发夹结构的单链DNA使用绿豆核酸酶裂解。反应混合物包含100μl第二链cDNA,20μl 10×绿豆核酸酶缓冲液(Stratagene Cloning System,La Jolla,CA),16μl 100mM二硫苏糖醇,51.5μl水和12.5μl以1∶10稀释的绿豆核酸酶(Pyomega公司;最后的浓度为10.5U/μl)的绿豆核酸酶稀释缓冲液。反应物在37℃下温育15分钟。反应通过加入20μl 1MTris-HCl,pH值8.0接着如上所述,顺序进行酚/三氯甲烷和三氯甲烷提取终止。抽取之后,DNA在乙醇中沉淀,并重新悬浮于水中。
重新悬浮的cDNA用T4 DNA聚合酶的钝化完成。重新悬浮在190μl水中的cDNA与50μl的5×T4 DNA聚合酶缓冲液(250mM Tris-HCl,pH值8.0,250mM KCl,25mM MgCl2),3μl 0.1M二硫苏糖醇,3μl包含各种脱氧核苷酸三磷酸10mM的溶液和4μl 1U/μl T4 DNA聚合酶(Boehringer Mannheim公司)混合。反应在10℃下温育1小时后,反应通过加入10μl的0.5MEDTA,接着如上所述顺序进行酚/三氯甲烷和三氯甲烷提取终止。DNA通过400孔大小的凝胶过滤柱(Clontech Laboratories公司)色谱以除去微量水平的蛋白质和长度小于-400bp的短cDNAs。在12μg糖原载体和2.5M乙酸铵存在的条件下用乙醇沉淀DNA,并重新悬浮在10μl的水中。基于32P-αdCTP的结合,cDNA的产量从12.5μg的起始mRNA模板估计约2μg。
把EcoRI衔接子连接到cDNA的5′末端使其能够克隆进入λ噬菌体载体。10μl cDNA(约2μg)的等分试样及65pmole/μl EcoRI衔接子(PharmaciaBiotech公司)与2.5μl10×连接酶缓冲液(Promega公司),1μl 10mM ATP和2μl 15U/μl T4 DNA连接酶(Promega公司)混合。反应在0℃到18℃的温度梯度下温育过夜(约18小时)。此外,把反应在12℃温育一夜。反应通过加入75μl水和10μl 3M醋酸钠,接着在65℃下温育30分钟终止。温育后,如上所述,cDNA用酚/三氯甲烷和三氯甲烷提取,并在2.5M乙酸铵和1.2体积的异丙醇存在时沉淀。离心之后,cDNA沉淀用70%乙醇洗涤,风干,重新悬浮于89μl的水中。
为促进cDNA进入λ噬菌体载体的定向克隆,cDNA用NotI消化,并产生具有5′EcoRI和3′NotI粘性末端的cDNA。以前已经通过引物ZG6091(SEQID NO:18)把cDNA 3′端的NotI限制位点引入。限制性内切酶消化在包含以上所述的89μl cDNA,10μl 6mM Tris-HCl,6mM MgCl2,150mM NaCl,1mM二硫苏糖醇(10×D缓冲液;Promega公司)和1μl 12U/μl NotI(Promega公司)的反应中进行。消化反应在37℃下进行1小时。反应由顺序的酚/三氯甲烷和三氯甲烷提取终止。用乙醇沉淀cDNA,以70%乙醇洗涤,风干,并在20μl加样缓冲液(10mM Tris-HCl,pH值8.0,1mM EDTA,5%甘油和0.125%溴酚蓝)的1×凝胶中重新悬浮。
重新悬浮的cDNA加热65℃持续5分钟,在冰上冷却,在0.8%的少量熔化的琼脂糖凝胶(SEA PLAQUE GTGTM少量熔化的琼脂糖;FMC公司)上电泳。从凝胶切除未结合的衔接子和长度低于1.6kb的cDNA。翻转电极,cDNA电泳直到其在泳道起端集中。把包含所集中的cDNA的凝胶区域除去,并置于微离心管中,凝胶切片的近似体积可以测定。把大约3倍于凝胶切片体积的水的等分试样(300μl)加入试管中,琼脂糖通过加热到65℃共15分钟熔化。平衡样品到42℃之后,加入10μl 1U/μl β-琼脂糖酶(新英格兰Biolabs公司),温育混合物90分钟以消化琼脂糖。温育后,把40μl的3M醋酸钠加入样品,混合物在冰上温育15分钟。样品在室温下以14,000×g离心15分钟以除去未消化的琼脂糖。上清液中的cDNA用乙醇沉淀,用70%乙醇洗涤,风干,并重新悬浮在37μl水中,以用于连接EcoRI衔接子的磷酸化激酶反应。
把以上所述的37μl cDNA溶液加到10μl 10×连接酶缓冲液(StratageneCloning System)中,并把混合物加热到65℃持续5分钟。把混合物在冰上冷却,并向其中加入5μl 10mM ATP和3μl 10U/μl T4多核苷酸激酶(Stratagene Cloning System)。反应在37℃下温育45分钟,并通过加热到65℃下持续10分钟,接着用酚/三氯甲烷和三氯甲烷顺序提取终止。磷酸化的cDNA在2.5M乙酸铵存在下用乙醇沉淀,用70%乙醇洗涤,风干,并重新悬浮在12.5μl水中。磷酸化的cDNA的浓度估计约为40fmole/μl。
产生的cDNA在购买的用EcoRI和NotI预消化的和脱磷酸化的λ噬菌体载体λExCellTM(Pharmacia Biotech公司)克隆。把cDNA连接到载体的反应在包含2μl的20fmole/μl制备的λExCellTM噬菌体臂,4μl水,1μl 10×连接酶缓冲液(Promega公司),2μl 40fmole/μl cDNA和15U/μl T4 DNA连接酶(Promega公司)的反应物中进行。连接反应在4℃下进行48小时。大约50%连接混合物使用GIGAPACKII Gold包装提取物(StratageneCloning System)按照供应者的说明包装进入噬菌体。产生的cDNA文库包含大于1.5×107个具有少于1.5%非插入噬菌体的背景水平的独立重组体。
32P标记的人MPL-K受体cDNA探针用于从小鼠脾cDNA噬菌体文库中分离小鼠MPL受体cDNA。把cDNA文库以40,000-50,000 PFU/150mm直径平板的密度平铺在大肠杆菌细胞(Stratagene Cloining System)SURE菌系上。把33个平板的噬斑转移到尼龙膜(Hybond NTM;Amersham公司,ArlingtonHeights,IL)上,并按照制造厂商的说明处理。把处理的滤膜在真空炉中80℃下烘烤2小时,接着在70℃下用洗涤缓冲液(0.25×SSC,0.25%SDS,1mM EDTA)洗涤几次,并在杂交炉(模型HB-2;Techne公司,普林斯顿(Princeton),NJ)的杂交溶液(5×SSC,5×Denhardts溶液,0.1%SDS,1mM EDTA和100μg/ml热变性鲑精DNA)中预杂交。预杂交之后,除去杂交溶液,并用新鲜的包含大约2×106cpm/ml32P标记的使用市售有效的标记试剂盒(MEGAPRIMETM试剂盒;Amersham公司,Arlington Heights,IL)制备的人MPL-KcDNA。在加入杂交溶液前,在98℃下变性探针5分钟。杂交在65℃下进行过夜。用洗涤缓冲液(0.25×SSC,0.25%SDS,1mMEDTA)在55℃下洗涤滤膜,用增感屏在-70℃下在CXAR-5膜(Eastman Kodak公司,Rochester,NY)放射自显影4天。使用作为模板的放射自显影图,琼脂块从对应于初级信号的平板区域回收,并在SM(0.1M NaCl;50mMTris-HCl,pH值7.5,0.02%明胶)中浸泡以洗脱噬菌体以用于噬斑纯化。分离了可携带与人MPL-K受体探针杂交的插入序列的7个噬斑纯化的噬菌体。包含在λExCellTM噬菌体内的噬菌粒使用活体内重组系统,按照供应者的说明回收。通过DNA测序确证cDNA插入序列的相同性。
分离的克隆编码显示与人MPL-P受体和前不久所报道的小鼠MPL受体(Skoda等,EMBO杂志12:2645-2653,1993)具有高度序列相同性的蛋白质。把7个克隆分为两组,每组具有编码N-末端附近一系列60个氨基酸残基缺失的3个克隆。编码未缺失的蛋白质的cDNA称为小鼠TypeI MPL受体cDNA。TypeII受体cDNA缺乏编码SEQ ID NO:7的TypeI受体残基131-190。此外,TypeI和II受体的不同在于:由于编码氨基酸残基222后插入的氨基酸残基Val-Arg-Thr-Ser-Pro-Ala-Gly-Glu(SEQ ID NO:19)的存在和甘氨酸残基取代位置241(此位置参考TypeI小鼠受体)的丝氨酸,所报道的小鼠MPL受体序列(Skoda等,同上)不同。
将TypeI和II小鼠MPL受体cDNAs在质粒载体pHZ-1中亚克隆以在哺乳动物细胞中表达。质粒pHZ-1是可用于在哺乳动物细胞中或已在活体外转录的mRNA的青蛙卵母细胞翻译系统中表达蛋白质的表达载体。pHZ-1表达单位包括小鼠金属硫蛋白-L启动子,侧面具有多个包含编码序列的插入的唯一限制位点的克隆库的噬菌体T7启动子,人生长激素终止子和噬菌体T7终止子。此外,pHZ-1包含大肠杆菌复制起点;细菌的β丙氨酸酶基因;包含SV40启动子和起端的哺乳动物的选择性标记,新霉素抗性基因和SV40转录终止子。为促进在pHZ-1的定向克隆,使用适合引物的聚合酶链反应用于分别从翻译起始密码子上游和翻译终止密码子的下游构造EcoRI位点和XhoI位点。聚合酶链反应在包含10μl的10×ULTMATM DNA聚合酶缓冲液(Roche MolecularSystems公司),6μl 25mM MgCl2,0.2μl包含dATP、dGTP、dTTP和dCTP(Pharmacia Biotech公司)各10mM的脱氧核苷酸三磷酸溶液,2.5μl 20pmole/μl引物ZC6603(SEQ ID NO:20),2.5μl20pmole/μl引物ZC5762(SEQ ID NO:16),32.8μl水,1μl包含I型或II型小鼠MPL受体质粒的早对数期细菌培养物和1μl 6U/μl DNA聚合酶(ULTMATM聚合酶;Roche Molecular Systems公司)的混合物中进行。AmpliWaxTM(Roche Molecular Systems公司)按照供应者的说明在反应中使用。聚合酶链反应进行25个循环(95℃下1分钟,55℃下1分钟,72℃下3分钟),接着在72℃下温育10分钟。扩增的产物顺序地用酚/三氯甲烷和三氯甲烷提取,然后,在6μg糖原载体和2.5M乙酸铵存在时,用乙醇沉淀。把沉淀重新悬浮在87μl加入10μl10×H缓冲液(BoehringerMannheim公司),2μl 10U/μl EcoRI(Boehringer Mannheim公司)和1μl40U/μl XhoI(Boehringer Mannheim公司)的水中。消化反应在37℃下进行1小时。反应通过加热到65℃下持续15分钟终止,并通过400孔大小的凝胶过滤柱(CHROMA SPIN+TE-400TM;Clontech Laboratories公司)。
将以上所述的分离的受体插入序列连接进消化的EcoRI和XhoI和脱磷酸化的pHZ-1载体。连接反应包含1μl 50ng/μl制备的pHZ-1载体,5μl5ng/μl cDNA插入序列,2μl10×连接酶缓冲液(Promega公司),11.75μl水和0.25μl 4U/μl T4 DNA连接酶(Stratagene Cloning Systems)。连接反应在10℃下进行一夜。连接的DNAs按照供应者的说明,转染进大肠杆菌(MAX EFFICIENCY DH10BTM感受态细胞;GIBCO BRL)。通过DNA测序确证I型和II型小鼠MPL和pHZ-L中人MPL-P受体插入序列的有效性。产生的质粒pSLmp1-8和pSLmp1-9分别携带小鼠TypeII和TypeI MPL受体cDNAs。质粒pSLmp-44携带人MPL-P cDNA插入序列。实施例5:可溶性MPL受体的制备
通过用pSLmp1-26的DNA片段、构建的以在细菌中产生可溶性小鼠I型MPL受体的表达质粒,组合pSLmp1-9的DNA片段、包含编码以上所述的全长小鼠I型MPL受体的cDNA的哺乳动物的表达质粒产生编码可溶性小鼠I型MPL受体(pSLmp1-53)的哺乳动物表达质粒。
利用引物ZC6704(SEQ ID NO:21)和ZC6703(SEQ ID NO:22)使用作为模板的全长受体质粒pSLmp1-9通过PGR分离编码小鼠I型MPL可溶性受体的cDNA片段。为促进定向克隆,引物ZC6704和ZC6703分别结合EcoRI和XhoI5′端的限制位点。引物ZC6703也编码蛋白激酶的非符合读框的共有靶序列,以使能够在活体外用32pγ-ATP(Li等,美国科学院学报86:558-562,1989)标记纯化的可溶性受体。PCR在包含10μl的10×ULTMATMDNA聚合酶缓冲液(Roche Molecular Systems公司),6μl 25mM MgCl2,0.2μl包含dATP、dGTP、dTTP和dCTP(Pharmacia Biotech公司)各10mM的脱氧核苷酸三磷酸溶液,11μl 4.55pmole/μl引物ZC6704(SEQ ID NO:21),21μl 2.43pmole/μl引物ZC6703(SEQ ID NO:22),50.3μl水,1μl50ng/μl HindIII和XbaI消化的pSLmp1-9,1μl 6U/μl ULTMATMDNA聚合酶(Roche Molecular Systems公司)的混合物中进行。AmpliWaxTM(RocheMolecular Systems公司)按照供应者的说明用于反应中。聚合酶链反应进行3个循环(95℃下1分钟,50℃下1分钟,72℃下2分钟),接着用增加的严格杂交进行11个循环(95℃下1分钟,55℃下30秒,72℃下2分钟),其后在72℃下温育10分钟。扩增的产物用酚/三氯甲烷和三氯甲烷顺序提取,接着通过400孔大小的凝胶过滤柱(Clontech Laboratories公司)色谱。PCR产物在20μg糖原载体和2.5M乙酸铵存在时用乙醇沉淀。把沉淀重新悬浮在32μl水中。向16μl重新悬浮的PCR产物加入2μl 10×H缓冲液(Boehringer Mannheim公司),1μl 10U/μl EcoRI(BoehringerMannheim公司)和1μl 40U/μl XhoI(Boehringer Mannheim公司)。消化反应在37℃下进行1小时。通过加热到65℃下持续15分钟终止消化反应,在0.7%少量熔化的琼脂糖凝胶上纯DNA化。通过用β琼脂糖酶(新英格兰Biolabs)消化凝胶基质完成从少量熔化的琼脂糖凝胶上回收片段。
产生的PCR产物编码小鼠I型MPL受体(SEQ ID NO:7的27到480残基)的N-末端胞外结构域。在推定的受体跨膜结构域(SEQ ID NO:7的483到504残基)缺少的情况下,所表达的蛋白质期望是在适合信号肽存在时分泌的。如上所述,小鼠I型I可溶性MPL受体cDNA使用以上所述的PCR条件获得,除pSLmp1-8用作模板例外。两种受体片段的有效性通过DNA测序确证。
可溶性小鼠I型和I型I MPL受体DNA片段在EcoRI和XhoI消化的载体pOmpA2-5中克隆以分别产生pSLmp1-26和pSLmp1-27。质粒pOmpA2-5是修饰的pOmpA2(Ghrayab等,EMBO杂志2:2437-2442,1984),细菌的表达载体称为周质间隙的靶重组蛋白质。pOmpA2-5通过用合成的42bp序列代替pOmpA2的EcoRI和BamHI位点之间的13bp序列构建。序列通过两种42核苷酸补体寡核苷酸(ZC6707,SEQ ID NO:23;ZC 6706,SEQID NO:24)的退火构建,这些补体寡核苷酸在当基极成对的形成EcoRI和BamHI粘性末端时,促进EcoRI和BamHI消化的pOmpA2的定向克隆。在插入的序列内是关于细菌的领头序列和以上所述的小鼠MPL可溶性受体cDNAs以及定位在XhoI位点3′的6个组氨酸密码子的框内片段,以使重组体蛋白质通过金属螯合环亲和色谱(Houchuli等,Bio/Technol.6:1321-1325,1988)纯化。在编码组氨酸片段的序列之后是符合读框的终止密码子。pOmpA2-5、pSLmp1-26和pSLmp1-27的有效性通过DNA测序确证。
产生可溶性小鼠I型MPL受体多肽的哺乳动物表达质粒pLDmp1-53,通过在表达载体pHZ-200(pHZ-1,其中二氢叶酸还原酶序列用新霉素抗性基因替代)中组合pSLmp1-9和pSLmp1-26的DNA片段构建。pSLmp1-26的1164bp Eco RI/Bam HI cDNA片段替代细菌表达质粒pSLmp1-26构建过程中缺失的哺乳动物信号序列。pSLmp1-26的416bp BamHI片段供给可溶性MPL受体的的羧基末端部分、激酶的标记结构域、多组氨酸片段及翻译终止子的编码序列。两种片段用凝胶纯化,并在pBluescriptKS+(StratageneCloning Systems)的Eco RI/Bam HI位点克隆以产生质粒pBS876LD-5。416bp pSLmp1-26衍生的关于pBS876LD-5中1164bp pSLmp1-9衍生的BamHI片段的BamHI片段的正确方向使用引物ZC6603(SEQ ID NO:20)和ZC6703(SEQ ID NO:22)通过PCR测定。在pBS876LD-5的多接头序列内的XbaI位点能够使重建的受体cDNA作为1.5kb EcoRI/XbaI片段切除以在pHZ-200中克隆,并接着用EcoRI和XbaI消化载体。产生的哺乳动物表达质粒,pLDmp1-53,大规模的制备以在BHK细胞中转染。
20μg纯化的pLDmp1-53质粒使用磷酸钙沉淀方法转染进入BHK570细胞。5小时后,细胞用15%甘油休克3分钟以利于DNA的摄取。加入新鲜的生长培养基过夜。第二天把细胞以不同稀释液分开,并加入包含1μM氨甲蝶呤的选择性培养基。大约两周后,用肉眼可以见到离散的氨甲蝶呤抗性菌落。或收集抗性菌落或作为不同的克隆保持。立即试验收集的菌落中消耗的培养基的可溶性MPL受体多肽的存在。
可溶性MPL受体多肽通过多肽羧基末端上存在的组氨酸片段的相互作用,用包含固定的Ni2+(HIS-BINDTM;Novagen,Madison,WI)的金属螯合树脂分离。pLDmp1-53库中,无血清消耗的培养基通过树脂,结合的多肽用1M咪唑洗脱。SDS-PAGE分析显示了约67kDa处的单一带。这种多肽易于进行N-末端氨基酸分析,并已确证为小鼠MPL受体。
可溶性小鼠MPL受体多肽从BHK转染子库中纯化,其中此BHK转染子用质粒pLDmp1-53转染。纯化的可溶性受体多肽基本上按照制造厂商的指导,固定在CNBr-活化的SEPHAROSETM 4B(Pharmacia Biotech)基质上,用于24-11-5细胞的条件培养基中MPL活性物的亲和纯化。亲和基质用XK16柱(Pharmacia Biotech)中装载。24-11-5细胞的条件培养基在10kD的截断中空纤维膜(A/G Technology公司,Needham,MA)集中,并在MPL受体亲和柱底部以1ml/分钟的流速装载。用包含0.5M NaCl和0.01%叠氮化钠的磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤。用3M硫氰酸钾(Sigma化学公司,St.Louis,MO)以0.5ml/分钟的流速从柱上洗脱MPL活性物(血小板生成素)。通过对PBS的透析除去硫氰酸钾。
使用基于3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基溴化四唑(MTT)(Mosman,J.Immunol.Meth.65:55-63,1983)的代谢降低的比色测定鉴别亲和柱的活性片段。把20μl 10mg/ml MTT(Polyscience公司,Warrington,PA)溶液加入100μl的BaF3/MPLR1.1的测定细胞中,并把细胞在37℃下温育。4小时后,在异丙醇中加入200μl 0.04N HCl,混合溶液,在模型EL320 ELISA读数仪(Bio-Tek仪器公司,Highland Park,VT)的570nm处读出样品的吸收率。实施例6:重组体人TPO的制备
用pZGmp1-124过夜转化的5ml细菌培养物中,用碱性细胞裂解物制备质粒DNA,接着把DNA结合到高盐的树脂(使用Promega公司的MagicMiniprepsTM Sampier试剂盒)上。用75μl pH值8.0,10mM Tris,1mM EDTA洗脱DNA。
用pZGmpl-124 DNA转染具有50,000个细胞/孔的BHK 570细胞培养物。把20μl以1∶10稀释的LIPOFECTAMINETM(GIBCO BRL)加入到20μl质粒DNA和160μl无血清培养基(F/DV培养基[a DMEM和Hams F12的1∶1的混合物]中,所述培养基补充有10μg/ml胎球蛋白、2ng/ml硒、5μg/ml胰岛素、10μg/ml转铁蛋白(transferin)、2mM L-谷氨酰胺、110μg/ml丙酮酸钠、25mM HEPES及0.1mM非必需氨基酸溶液(GIBCO BRL)),这些补充溶液加入BHK570细胞前在室温下放置30分钟,并在37℃下温育4小时。然后,加入200μl生长培养基(DMEM(BioWhittaker公司,Walkersville,MD)用2mM L-谷氨酰胺、110μg/ml丙酮酸钠、0.05mg/ml青霉素、0.05mg/ml链霉素、0.01mg/ml新霉素、25mM HEPES、10%胎胎牛血清补充),并在37℃下培养细胞过夜。然后,把培养基用包含5%胎牛血清的生长培养基替代,在37℃下培养细胞4小时。
然后,在表达小鼠MPL受体的BaF3细胞中测定BHK 570转染子的条件培养基引起细胞增殖的能力。细胞在BaF3培养基(用10%胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、10mM HEPES、57μM β-巯基乙醇、0.05mg/ml青霉素、0.05mg/ml链霉素、0.01mg/ml新霉素和4%V/V得自WEHI-3细胞的培养物(小鼠白介素-3、培养物补充物、Collaborative BiomedicalProducts)的条件培养基补充的RPMI 1640培养基(JRH Biosciences,Lexena,KS)中生长。测定之前,把BaF3细胞稀释,并重新悬浮在无IL-3 BaF3的10,000个细胞/100μl的培养基中。加入100μl得自pZGmpl-124转染的BHK 570细胞的条件培养基,在37℃下温育培养物。然后,在30分钟和24小时之后,肉眼检查细胞延伸。也测定用小鼠TPO DNA转染的由无IL-3的BaF3培养基组成的阴性对照和得自BHK 570细胞的条件培养基的阳性对照。结果显示:阴性对照中BaF3细胞没有细胞延长(elogation),阳性对照中有一些细胞延长,在pZGmp1-124转染的细胞中有明显的细胞延长。实施例7:重组小鼠TPO的制备
用EcoRI和NotI消化质粒pZGmp1-1081,并回收TPO DNA片段。把这种DNA插入EcoRI消化的、碱性磷酸酶处理的具有NotI/EcoRI接头的质粒Zem229R中。将产生的定名为mp1.229R的质粒转染进入BHK 570细胞(ATCC CRL 10314)。使转染子在无血清培养基的10层细胞工厂(Nunc公司;得自VWR Scientific,Seattle,WA)中生长,并在1μM氨甲蝶呤中选择。收集161条件培养基。实施例8:TPO的纯化及特征确定
通过超滤作用、固定的MPL受体上的亲和色谱和离子交换色谱的共同作用从条件细胞培养基纯化人和小鼠TPO。
在大约一升的10,000分子量截断膜上浓缩40升到60升粗提的条件培养基。通过加入4.0M NaCl把浓度调整为0.5M NaCl,且pH值调整到pH8.5。然后,使溶液通过0.22μ的滤膜,并运用于2.5cm(直径)×4.0cm(高度)结合到CNBr活化的琼脂糖凝胶TM(Pharmacia Biotech)(每毫升水涨的树脂约15mg受体)上的可溶性小鼠MPL受体柱上。
使用的流速是5.0ml/分钟,并在4℃的柱上进行。样品上样后,用包含0.5M NaCl的100ml pH值为8.5的20mM Tris洗涤。用20mM Tris,pH值9.5,3.0M KSCN以5.0ml/分钟的流速从柱上洗脱TPO。蛋白质的洗脱通过280nm处的吸光度监测。包含蛋白质洗脱物的部分在pH值8.5,20mMTris中透析以除去KSCN。然后,把透析的洗脱物以2.0ml/分钟的流速用于MonoQHR5/5柱(Pharmacia Biotech),并在20℃下的柱上进行。样品上样后,柱用20ml pH值8.5的20mM Tris洗涤。然后,蛋白质用在pH值8.5的20mM Tris中的0到0.5M NaCl的20分钟梯度洗脱。洗脱物分布可用220nm处的吸光度监测,收集2.0ml此洗脱物。
Western印迹法与十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结合使用以使柱成分可见,对于小鼠TPO,使用抗衍生自小鼠TPO(SEQ ID NO:2的Asp-52到Leu-66)的肽序列所产生的大鼠多克隆抗血清完成Western印迹分析。将20μl的每种组分在变性(降低)样品的缓冲液中的4-20%Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶上电泳。用电印迹将蛋白质转移到硝化纤维上。蛋白质通过时印迹与大鼠抗TPO多肽抗血清反应,接着与兔抗大鼠抗体/辣根过氧物酶缀合物(国际生物源(BioSource International,Camarillo,CA)及ECLTM检测试剂(Amersham公司)反应变得可见。然后,把印迹露置于放射自显影胶片1秒或10秒,以测定各种成分中70kD和≥35kD TPO物种的相对含量。如果露置10秒后≥35kD的片段的带强度远小于相同道中露置1秒的70kD片段的带强度,可确定成分中包含至少90%70kD TPO。通过肉眼观察,可判断有些成分含有>95%的70kD TPO。收集含有>90%的70kD TPO成分。如果露置10秒后70kD片段的带强度远小于相同道中露置1秒的≥35kD的片段的带强度,可确定成分中包含至少90%35kD TPO,也收集这类成分。按照供应厂商的说明,通过在变性条件下的SDS-PAGE(4-20%凝胶)接着使用Daiichi银染试剂盒(目录号为SE140001;IntegratedSeparation Systems,Natick,MA)的银染色来分析10μl(0.83μg 70kDTPO和0.24μg 35kD TPO通过氨基酸组分分析测定)所收集的成分。用银染的凝胶显色后,测定70kD收集的组分的结果基本上与通过肉眼观察凝胶泳道判断结果相同,实质上没有35kD TPO,35kD成分判断为实质上没有无70kD物质。显示将小鼠TPO分离成70kD和较低分子量的物种的Western印迹在图1中说明。
用类似的方法分析纯化的人TPO。使用抗完整的人TPO的兔多克隆抗血清进行Western印迹分析。人TPO组分的纯度类似于观察到的小鼠蛋白质的纯度。图2显示所收集的人TPO组分的银染色的凝胶。70kD组分判断为纯度大于90%,且实质上没有Mr<55kD的TPO物种。
通过活体外BaF3/MPLR1.1细胞(表达稳定地转染的I型小鼠MPL受体的IL-3依赖的细胞;按布达佩斯条约于1994年9月28日保藏在美国典型培养物保藏中心12301 Parklawn Drive,Rockville,MD,指定的保藏号为CRL 11723)上细胞分裂的测定试验纯化的70kD TPO的生物活性。最大活性的1/2点(16条曲线的平均值)为50U/ml值。原始标准溶液(用pZGmp1-1081转染的BHK细胞系的无血清条件培养基)经计算包含26,600U/ml小鼠TPO。TPO样品通常使用8-24倍的稀释液,以用57μM2-巯基乙醇、2mML-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、PSN抗生素混合物、10mM HEPES和10%热灭活的胎牛血清补充的RPMI 1640培养基稀释。简言之,在96孔板的孔中将100μl稀释的试验样品或标准样品与100μl BaF3细胞(最后细胞数量增加约10,000个细胞/孔)混合。内标包括8个2倍稀释的100U/ml小鼠TPO(对小鼠TPO测定)或8个2倍稀释的150U/ml小鼠TPO(对人TPO测定)。向每个孔中加入2μl 3H-胸苷(1μCi/μl;Amersham),并把平板在37℃下温育过夜。使用Packard仪器将每个板中每孔的内含物转移到滤膜/平板上。用水洗涤滤膜8次,风干滤膜并计数。每个样品孔中TPO的活性单位通过与标准曲线的比较确定。总的蛋白质含量通过氨基酸组分分析测定。用这种方法发现纯化的70kD小鼠TPO具有129,000单位/μg的比活性,纯化的70kD人TPO具有5,000单位/μg的比活性。
从以上所述可以看出:虽然为了说明的目的,在本文中描述了本发明的特定的实施方案,但可以在不偏离本发明精神和范围的情况下进行各种修改。因此,除所附权利要求外,本发明不受限制。
序列表(1)一般信息:(i)申请人:ZymoGenetics,Inc.
1201 Eastlake Avenue East
Seattle
美国98102(ii)发明名称:纯化的血小板生成素及其制造方法(iii)序列数:24(iv)通讯地址:
(A)收信人:ZymoGenetics,Inc.
(B)街道:1201 Eastlake Avenue East
(C)城市:Seattle
(D)州:WA
(E)国家:美国
(F)邮区代码:98102(v)计算机可读形式:
(A)介质类类型:软盘
(B)计算机:IBM PC兼容机
(C)操作系统:PC-DOS/MS-DOS
(D)软件:PatentIn Release1.0#,版本#1.25(vi)当前的申请数据:
(A)申请号:
(B)申请日:
(C)分类号:(viii)律师/代理人信息:
(A)姓名:Parker,Gary E
(B)登记号:31,648
(C)证书号:94-11PC(ix)电信信息:
(A)电话:206-442-6673
(B)传真:206-442-6678(2)SEQ ID NO:1信息:(i)序列特征:
(A)长度:1486个碱基对
(B)类型:核酸
(C)链型:双链
(D)拓扑结构:线性(ii)分子类型:cDNA(ix)特征:
(A)名称/关键词:CDS
(B)位置:105..1241(xi)序列描述:SEQ ID NO:1:CCTCGTGCCG GTCCTGAGGC CCTTCTCCAC CCGGACAGAG TCCTTGGCCC ACCTCTCTCC 60CACCCGACTC TGCCGAAAGA AGCACAGAAG CTCAAGCCGC CTCC ATG GCC CCA GGA 116
Met Ala Pro Gly
1AAG ATT CAG GGG AGA GGC CCC ATA CAG GGA GCC ACT TCA GTT AGA CAC 164Lys Ile Gln Gly Arg Gly Pro Ile Gln Gly Ala Thr Ser Val Arg His5 10 15 20CTG GCC AGA ATG GAG CTG ACT GAT TTG CTC CTG GCG GCC ATG CTT CTT 212Leu Ala Arg Met Glu Leu Thr Asp Leu Leu Leu Ala Ala Met Leu Leu
25 30 35GCA GTG GCA AGA CTA ACT CTG TCC AGC CCC GTA GCT CCT GCC TGT GAC 260Ala Val Ala Arg Leu Thr Leu Ser Ser Pro Val Ala Pro Ala Cys Asp
40 45 50CCC AGA CTC CTA AAT AAA CTG CTG CGT GAC TCC CAC CTC CTT CAC AGC 308Pro Arg Leu Leu Asn Lys Leu Leu Arg Asp Ser His Leu Leu His Ser
55 60 65CGA CTG AGT CAG TGT CCC GAC GTC GAC CCT TTG TCT ATC CCT GTT CTG 356Arg Leu Ser Gln Cys Pro Asp Val Asp Pro Leu Ser Ile Pro Val Leu
70 75 80CTG CCT GCT GTG GAC TTT AGC CTG GGA GAA TGG AAA ACC CAG ACG GAA 404Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln Thr Glu85 90 95 100CAG AGC AAG GCA CAG GAC ATT CTA GGG GCA GTG TCC CTT CTA CTG GAG 452Gln Ser Lys Ala Gln Asp Ile Leu Gly Ala Val Ser Leu Leu Leu Glu
105 110 115GGA GTG ATG GCA GCA CGA GGA CAG TTG GAA CCC TCC TGC CTC TCA TCC 500Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gln Leu Glu Pro Ser Cys Leu Ser Ser
120 125 130CTC CTG GGA CAG CTT TCT GGG CAG GTT CGC CTC CTC TTG GGG GCC CTG 548Leu Leu Gly Gln Leu Ser Gly Gln Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu
135 140 145CAG GGC CTC CTA GGA ACC CAG CTT CCT CTA CAG GGC AGG ACC ACA GCT 596Gln Gly Leu Leu Gly Thr Gln Leu Pro Leu Gln Gly Arg Thr Thr Ala
150 155 160CAC AAG GAC CCC AAT GCC CTC TTC TTG AGC TTG CAA CAA CTG CTT CGG 644His Lys Asp Pro Asn Ala Leu Phe Leu Ser Leu Gln Gln Leu Leu Arg165 170 175 180GGA AAG GTG CGC TTC CTG CTT CTG GTA GAA GGT CCC ACC CTC TGT GTC 692Gly Lys Val Arg Phe Leu Leu Leu Val Glu Gly Pro Thr Leu Cys Val
185 190 195AGA CGG ACC CTG CCA ACC ACA GCT GTC CCA AGC AGT ACT TCT CAA CTC 740Arg Arg Thr Leu Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Ser Thr Ser Gln Leu
200 205 210CTC ACA CTA AAC AAG TTC CCA AAC AGG ACT TCT GGA TTG TTG GAG ACG 788Leu Thr Leu Asn Lys Phe Pro Asn Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr
215 220 225AAC TTC AGT GTC ACA GCC AGA ACT GCT GGC CCT GGA CTT CTG AGC AGG 836Asn Phe Ser Val Thr Ala Arg Thr Ala Gly Pro Gly Leu Leu Ser Arg
230 235 240CTT CAG GGA TTC AGA GTC AAG ATT ACT CCT GGT CAG CTA AAT CAA ACC 884Leu Gln Gly Phe Arg Val Lys Ile Thr Pro Gly Gln Leu Asn Gln Thr245 250 255 260TCC AGG TCC CCA GTC CAA ATC TCT GGA TAC CTG AAC AGG ACA CAC GGA 932Ser Arg Ser Pro Val Gln Ile Ser Gly Tyr Leu Asn Arg Thr His Gly
265 270 275CCT GTG AAT GGA ACT CAT GGG CTC TTT GCT GGA ACC TCA CTT CAG ACC 980Pro Val Asn Gly Thr His Gly Leu Phe Ala Gly Thr Ser Leu Gln Thr
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295 300 305GCA TTC AAC CTC CAG GGT GGA CTT CCT CCT TCT CCA AGC CTT GCT CCT 1076Ala Phe Asn Leu Gln Gly Gly Leu Pro Pro Ser Pro Ser Leu Ala Pro
310 315 320GAT GGA CAC ACA CCC TTC CCT CCT TCA CCT GCC TTG CCC ACC ACC CAT 1124Asp Gly His Thr Pro Phe Pro Pro Ser Pro Ala Leu Pro Thr Thr His325 330 335 340GGA TCT CCA CCC CAG CTC CAC CCC CTG TTT CCT GAC CCT TCC ACC ACC 1172Gly Ser Pro Pro Gln Leu His Pro Leu Phe Pro Asp Pro Ser Thr Thr
345 350 355ATG CCT AAC TCT ACC GCC CCT CAT CCA GTC ACA ATG TAC CCT CAT CCC 1220Met Pro Asn Ser Thr Ala Pro His Pro Val Thr Met Tyr Pro His Pro
360 365 370AGG AAT TTG TCT CAG GAA ACA TAGCGCGGGC ACTGGCCCAG TGAGCGTCTG 1271Arg Asn Leu Ser Gln Glu Thr
375CAGCTTCTCT CGGGGACAAG CTTCCCCAGG AAGGCTGAGA GGCAGCTGCA TCTGCTCCAG 1331ATGTTCTGCT TTCACCTAAA AGGCCCTGGG GAAGGGATAC ACAGCACTGG AGATTGTAAA 1391ATTTTAGGAG CTATTTTTTT TTAACCTATC AGCAATATTC ATCAGAGCAG CTAGCGATCT 1451TTGGTCTATT TTCGGTATAA ATTTGAAAAT CACTA 1486(2)SEQ ID NO:2信息:(i)序列特征:
(A)长度:379个氨基酸
(B)类型:氨基酸
(D)拓扑结构:线性(ii)分子类型:蛋白质(xi)序列描述:SEQ ID NO:2:Met Ala Pro Gly Lys Ile Gln Gly Arg Gly Pro Ile Gln Gly Ala Thr1 5 10 15Ser Val Arg His Leu Ala Arg Met Glu Leu Thr Asp Leu Leu Leu Ala
20 25 30Ala Met Leu Leu Ala Val Ala Arg Leu Thr Leu Ser Ser Pro Val Ala
35 40 45Pro Ala Cys Asp Pro Arg Leu Leu Asn Lys Leu Leu Arg Asp Ser His
50 55 60Leu Leu His Ser Arg Leu Ser Gln Cys Pro Asp Val Asp Pro Leu Ser65 70 75 80Ile Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys
85 90 95Thr Gln Thr Glu Gln Ser Lys Ala Gln Asp Ile Leu Gly Ala Val Ser
100 105 110Leu Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gln Leu Glu Pro Ser
115 120 125Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gln Leu Ser Gly Gln Val Arg Leu Leu
130 135 140Leu Gly Ala Leu Gln Gly Leu Leu Gly Thr Gln Leu Pro Leu Gln Gly145 150 155 160Arg Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala Leu Phe Leu Ser Leu Gln
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180 185 190Thr Leu Cys Val Arg Arg Thr Leu Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Ser
195 200 205Thr Ser Gln Leu Leu Thr Leu Asn Lys Phe Pro Asn Arg Thr Ser Gly
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260 265 270Arg Thr His Gly Pro Val Asn Gly Thr His Gly Leu Phe Ala Gly Thr
275 280 285Ser Leu Gln Thr Leu Glu Ala Ser Asp Ile Ser Pro Gly Ala Phe Asn
290 295 300Lys Gly Ser Leu Ala Phe Asn Leu Gln Gly Gly Leu Pro Pro Ser Pro305 310 315 320Ser Leu Ala Pro Asp Gly His Thr Pro Phe Pro Pro Ser Pro Ala Leu
325 330 335Pro Thr Thr His Gly Ser Pro Pro Gln Leu His Pro Leu Phe Pro Asp
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355 360 365Tyr Pro His Pro Arg Asn Leu Ser Gln Glu Thr
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(A)长度:1062个碱基对
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(A)名称/关键词:CDS
(B)位置:1..1059(xi)序列描述:SEQ ID NO:3:ATG GAG CTG ACT GAA TTG CTC CTC GTG GTC ATG CTT CTC CTA ACT GCA 48Met Glu Leu Thr Glu Leu Leu Leu Val Val Met Leu Leu Leu Thr Ala1 5 10 15AGG CTA ACG CTG TCC AGC CCG GCT CCT CCT GCT TGT GAC CTC CGA GTC 96Arg Leu Thr Leu Ser Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val
20 25 30CTC AGT AAA CTG CTT CGT GAC TCC CAT GTC CTT CAC AGC AGA CTG AGC 144Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser
35 40 45CAG TGC CCA GAG GTT CAC CCT TTG CCT ACA CCT GTC CTG CTG CCT GCT 192Gln Cys Pro Glu Val His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala
50 55 60GTG GAC TTT AGC TTG GGA GAA TGG AAA ACC CAG ATG GAG GAG ACC AAG 240Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys65 70 75 80GCA CAG GAC ATT CTG GGA GCA GTG ACC CTT CTG CTG GAG GGA GTG ATG 288Ala Gln Asp Ile Leu Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met
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290 295 300Thr Leu Phe Pro Leu Pro Pro Thr Leu Pro Thr Pro Val Val Gln Leu305 310 315 320His Pro Leu Leu Pro Asp Pro Ser Ala Pro Thr Pro Thr Pro Thr Ser
325 330 335Pro Leu Leu Asn Thr Ser Tyr Thr His Ser Gln Asn Leu Ser Gln Glu
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(A)名称/关键词:CDS
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Met Glu Leu Thr
1ACCTGAGGGG CTAGGGCCAT ATGGAAACAT GACAGAAGGG GAGAGAGAAA GGAGACACGC 714TGCAGGGGGC AGGAAGCTGG GGGAACCCAT TCTCCCAAAA ATAAGGGGTC TGAGGGGTGG 774ATTCCCTGGG TTTCAGGTCT GGGTCCTGAA TGGGAATTCC TGGAATACCA GCTGACAATG 834ATTTCCTCCT CATCTTTCAA CCTCACCTCT CCTCATCTAA G AA TTG CTC CTC 886
Glu Leu Leu Leu
5GTG GTC ATG CTT CTC CTA ACT GCA AGG CTA ACG CTG TCC AGC CCG GCT 934Val Val Met Leu Leu Leu Thr Ala Arg Leu Thr Leu Ser Ser Pro Ala
10 15 20CCT CCT GCT TGT GAC CTC CGA GTC CTC AGT AAA CTG CTT CGT GAC TCC 982Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp Ser25 30 35 40CAT GTC CTT CAC AGC AGA CTG GTGAGAACTC CCAACATTAT CCCCTTTATC 1033His Val Leu His Ser Arg Leu
45CGCGTAACTG GTAAGACACC CATACTCCCA GGAAGACACC ATCACTTCCT CTAACTCCTT 1093GACCCAATGA CTATTCTTCC CATATTGTCC CCACCTACTG ATCACACTCT CTGACAAGGA 1153TTATTCTTCA CAATACAGCC CGCATTTAAA AGCTCTCGTC TAGAGATAGT ACTCATGGAG 1213GACTAGCCTG CTTATTAGGC TACCATAGCT CTCTCTATTT CAGCTCCCTT CTCCCCCCAC 1273CAATCTTTTT CAACAG AGC CAG TGC CCA GAG GTT CAC CCT TTG CCT ACA 1322
Ser Gln Cys Pro Glu Val His Pro Leu Pro Thr
50 55CCT GTC CTG CTG CCT GCT GTG GAC TTT AGC TTG GGA GAA TGG AAA ACC 1370Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr
60 65 70CAG ATG GTAAGAAAGC CATCCCTAAC CTTGGCTTCC CTAAGTCCTG TCTTCAGTTT 1426Gln Met75CCCACTGCTT CCCATGGATT CTCCAACATT CTTGAGCTTT TTAAAAATAT CTCACCTTCA 1486GCTTGGCCAC CCTAACCCAA TCTACATTCA CCTATGATGA TAGCCTGTGG ATAAGATGAT 1546GGCTTGCAGG TCCAATATGT GAATAGATTT GAAGCTGAAC ACCATGAAAA GCTGGAGAGA 1606AATCGCTCAT GGCCATGCCT TTGACCTATT CCCGTTCAGT CTTCTTAAAT TGGCATGAAG 1666AAGCAAGACT CATATGTCAT CCACAGATGA CACAAAGCTG GGAAGTACCA CTAAAATAAC 1726AAAAGACTGA ATCAAGATTC AAATCACTGA AAGACTAGGT CAAAAACAAG GTGAAACAAC 1786AGAGATATAA ACTTCTACAT GTGGGCCGGG GGCTCACGCC TGTAATCCCA GCACTTTGGG 1846AGGCCGAGGC AGGCAGATCA CCTGAGGGCA GGAGTTTGAG AGCAGCCTGG CCAACATGGC 1906GAAACCCCGT CTCTACTAAG AATACAGAAT TAGCCGGGCA TGGTAGTGCA TGCCTGTAAT 1966CCCAGCTACT TGGAAGGCTG AAGCAGGAGA ATCCCTTGAA CCCAGGAGGT GGAGGTTGTA 2026GTGAGCTGAG ATCATGCCAA TGCACTCCAG CCTGGGTGAC AAGAGCAAAA CTCCGTCTCA 2086AAAAGAAAAA AAAATTCTAC ATGTGTAAAT TAATGAGTAA AGTCCTATTC CAGCTTTCAG 2146GCCACAATGC CCTGCTTCCA TCATTTAAGC CTCTGGCCCT AGCACTTCCT ACGAAAAGGA 2206TCTGAGAGAA TTAAATTGCC CCCAAACTTA CCATGTAACA TTACTGAAGC TGCTATTCTT 2266AAAGCTAGTA ATTCTTGTCT GTTTGATGTT TAGCATCCCC ATTGTGGAAA TGCTCGTACA 2326GAACTCTATT CCGAGTGGAC TACACTTAAA TATACTGGCC TGAACACCGG ACATCCCCCT 2386GAAGACATAT GCTAATTTAT TAAGAGGGAC CATATTAAAC TAACATGTGT CTAGAAAGCA 2446GCAGCCTGAA CAGAAAGAGA CTAGAAGCAT GTTTTATGGG CAATAGTTTA AAAAACTAAA 2506ATCTATCCTC AAGAACCCTA GCGTCCCTTC TTCCTTCAGG ACTGAGTCAG GGAAGAAGGG 2566CAGTTCCTAT GGGTCCCTTC TAGTCCTTTC TTTTCATCCT TATGATCATT ATGGTAGAGT 2626CTCATACCTA CATTTAGTTT ATTTATTATT ATTATTTGAG ACGGAGTCTC ACTCTATCCC 2686CCAGGCTGGA GTGCAGTGGC ATGATCTCAA CTCACTGCAA CCTCAGCCTC CCGGATTCAA 2746GCGATTCTCC TGTCTCAGTC TCCCAAGTAG CTGGGATTAC AGGTGCCCAC CACCATGCCC 2806AGCTAATTTG TGTATTTGTG GTAGAGATGG GGTTTCACCA TGTTGGGCAG GCTGATCTTG 2866AACTCCTGAC CTCAGGTGAT CCACCTGCCT CAGCCTCCCA AAGTGCTGGG ATTACAGGCG 2926TGAGCCACTG CACCCAGCCT TCATTCAGTT TAAAAATCAA ATGATCCTAA GGTTTTGCAG 2986CAGAAAGAGT AAATTTGCAG CACTAGAACC AAGAGGTAAA AGCTGTAACA GGGCAGATTT 3046CAGCAACGTA AGAAAAAAGG AGCTCTTCTC ACTGAAACCA AGTGTAAGAC CAGGCTGGAC 3106TAGAGGACAC GGGAGTTTTT GAAGCAGAGG CTGATGACCA GCTGTCGGGA GACTGTGAAG 3166GAATTCCTGC CCTGGGTGGG ACCTTGGTCC TGTCCAGTTC TCAGCCTGTA TGATTCACTC 3226TGCTGGCTAC TCCTAAGGCT CCCCACCCGC TTTTAGTGTG CCCTTTGAGG CAGTGCGCTT 3286CTCTCTTCCA TCTCTTTCTC AG GAG GAG ACC AAG GCA CAG GAC ATT CTG GGA 3338
Glu Glu Thr Lys Ala Gln Asp Ile Leu Gly
80 85GCA GTG ACC CTT CTG CTG GAG GGA GTG ATG GCA GCA CGG GGA CAA CTG 3386Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gln Leu
90 95 100GGA CCC ACT TGC CTC TCA TCC CTC CTG GGG CAG CTT TCT GGA CAG GTC 3434Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gln Leu Ser Gly Gln Val
105 110 115CGT CTC CTC CTT GGG GCC CTG CAG AGC CTC CTT GGA ACC CAG 3476Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gly Thr Gln
120 125 130GTAAGTCCCC AGTCAAGGGA TCTGTAGAAA CTGTTCTTTT CTGACTCAGT CCCCCTAGAA 3536GACCTGAGGG AAGAAGGGCT CTTCCAGGGA GCTCAAGGGC AGAAGAGCTG ATCTACTAAG 3596AGTGCTCCCT GCCAGCCACA ATGCCTGGGT ACTGGCATCC TGTCTTTCCT ACTTAGACAA 3656GGGAGGCCTG AGATCTGGCC CTGGTGTTTG GCCTCAGGAC CATCCTCTGC CCTCAG 3712CTT CCT CCA CAG GGC AGG ACC ACA GCT CAC AAG GAT CCC AAT GCC ATC 3760Leu Pro Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Ash Ala Ile
135 140 145TTC CTG AGC TTC CAA CAC CTG CTC CGA GGA AAG GTG CGT TTC CTG ATG 3808Phe Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Met
150 155 160CTT GTA GGA GGG TCC ACC CTC TGC GTC AGG CGG GCC CCA CCC ACC ACA 3856Leu Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr165 170 175 180GCT GTC CCC AGC AGA ACC TCT CTA GTC CTC ACA CTG AAC GAG CTC CCA 3904Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu Leu Pro
185 190 195AAC AGG ACT TCT GGA TTG TTG GAG ACA AAC TTC ACT GCC TCA GCC AGA 3952Asn Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr Asn Phe Thr Ala Ser Ala Arg
200 205 210ACT ACT GGC TCT GGG CTT CTG AAG TGG CAG CAG GGA TTC AGA GCC AAG 4000Thr Thr Gly Ser Gly Leu Leu Lys Trp Gln Gln Gly Phe Arg Ala Lys
215 220 225ATT CCT GGT CTG CTG AAC CAA ACC TCC AGG TCC CTG GAC CAA ATC CCC 4048Ile Pro Gly Leu Leu Asn Gln Thr Ser Arg Ser Leu Asp Gln Ile Pro
230 235 240GGA TAC CTG AAC AGG ATA CAC GAA CTC TTG AAT GGA ACT CGT GGA CTC 4096Gly Tyr Leu Asn Arg Ile His Glu Leu Leu Asn Gly Thr Arg Gly Leu245 250 255 260TTT CCT GGA CCC TCA CGC AGG ACC CTA GGA GCC CCG GAC ATT TCC TCA 4144Phe Pro Gly Pro Ser Arg Arg Thr Leu Gly Ala Pro Asp Ile Ser Ser
265 270 275GGA ACA TCA GAC ACA GGC TCC CTG CCA CCC AAC CTC CAG CCT GGA TAT 4192Gly Thr Ser Asp Thr Gly Ser Leu Pro Pro Asn Leu Gln Pro Gly Tyr
280 285 290TCT CCT TCC CCA ACC CAT CCT CCT ACT GGA CAG TAT ACG CTC TTC CCT 4240Ser Pro Ser Pro Thr His Pro Pro Thr Gly Gln Tyr Thr Leu Phe Pro
295 300 305CTT CCA CCC ACC TTG CCC ACC CCT GTG GTC CAG CTC CAC CCC CTG CTT 4288Leu Pro Pro Thr Leu Pro Thr Pro Val Val Gln Leu His Pro Leu Leu
310 315 320CCT GAC CCT TCT GCT CCA ACG CCC ACC CCT ACC AGC CCT CTT CTA AAC 4336Pro Asp Pro Ser Ala Pro Thr Pro Thr Pro Thr Ser Pro Leu Leu Asn325 330 335 340ACA TCC TAC ACC CAC TCC CAG AAT CTG TCT CAG GAA GGG TAAGGTTCTC 4385Thr Ser Tyr Thr His Ser Gln Asn Leu Ser Gln Glu Gly
345 350AGACACTGCC GACATCAGCA TTGTCTCGTG TACAGCTCCC TTCCCTGCAG GGCGCCCCTG 4445GGAGACAACT GGACAAGATT TCCTACTTTC TCCTGAAACC CAAAGCCCTG GTAAAAGGGA 4505TACACAGGAC TGAAAAGGGA ATCATTTTTC ACTGTACATT ATAAACCTTC AGAAGCTATT 4565TTTTTAAGCT ATCAGCAATA CTCATCAGAG CAGCTAGCTC TTTGGTCTAT TTTCTGCAGA 4625AATTTGCAAC TCACTGATTC TCAACATGCT CTTTTTCTGT GATAACTCTG CAAAGACCTG 4685GGCTGGCCTG GCAGTTGAAC AGAGGGAGAG ACTAACCTTG AGTCAGAAAA CAGAGGAAGG 4745GTAATTTCCT TTGCTTCAAA TTCAAGGCCT TCCAACGCCC CCATCCCCTT TACTATCATT 4805CTCAGTGGGA CTCTGATC 4823(2)SEQ ID NO:6信息:(i)序列特征:
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20 25 30Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser
35 40 45Gln Cys Pro Glu Val His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala
50 55 60Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys65 70 75 80Ala Gln Asp Ile Leu Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met
85 90 95Ala Ala Arg Gly Gln Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly
100 105 110Gln Leu Ser Gly Gln Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln Ser Leu
115 120 125Leu Gly Thr Gln Leu Pro Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp
130 135 140Pro Asn Ala Ile Phe Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Val145 150 155 160Arg Phe Leu Met Leu Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg Ala
165 170 175Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu Thr Leu
180 185 190Asn Glu Leu Pro Asn Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr Asn Phe Thr
195 200 205Ala Ser Ala Arg Thr Thr Gly Ser Gly Leu Leu Lys Trp Gln Gln Gly
210 215 220Phe Arg Ala Lys Ile Pro Gly Leu Leu Asn Gln Thr Ser Arg Ser Leu225 230 235 240Asp Gln Ile Pro Gly Tyr Leu Asn Arg Ile His Glu Leu Leu Asn Gly
245 250 255Thr Arg Gly Leu Phe Pro Gly Pro Ser Arg Arg Thr Leu Gly Ala Pro
260 265 270Asp Ile Ser Ser Gly Thr Ser Asp Thr Gly Ser Leu Pro Pro Asn Leu
275 280 285Gln Pro Gly Tyr Ser Pro Ser Pro Thr His Pro Pro Thr Gly Gln Tyr
290 295 300Thr Leu Phe Pro Leu Pro Pro Thr Leu Pro Thr Pro Val Val Gln Leu305 310 315 320His Pro Leu Leu Pro Asp Pro Ser Ala Pro Thr Pro Thr Pro Thr Ser
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20 25 30Leu Gly Thr Glu Pro Leu Asn Cys Phe Ser Gln Thr Phe Glu Asp Leu
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50 55 60Leu Leu Tyr Ala Tyr Arg Gly Glu Lys Pro Arg Ala Cys Pro Leu Tyr65 70 75 80Ser Gln Ser Val Pro Thr Phe Gly Thr Arg Tyr Val Cys Gln Phe Pro
85 90 95Ala Gln Asp Glu Val Arg Leu Phe Phe Pro Leu His Leu Trp Val Lys
100 105 110Asn Val Ser Leu Asn Gln Thr Leu Ile Gln Arg Val Leu Phe Val Asp
115 120 125Ser Val Gly Leu Pro Ala Pro Pro Arg Val Ile Lys Ala Arg Gly Gly
130 135 140Ser Gln Pro Gly Glu Leu Gln Ile His Trp Glu Ala Pro Ala Pro Glu145 150 155 160Ile Ser Asp Phe Leu Arg His Glu Leu Arg Tyr Gly Pro Thr Asp Ser
165 170 175Ser Asn Ala Thr Ala Pro Ser Val Ile Gln Leu Leu Ser Thr Glu Thr
180 185 190Cys Cys Pro Thr Leu Trp Met Pro Asn Pro Val Pro Val Leu Asp Gln
195 200 205Pro Pro Cys Val His Pro Thr Ala Ser Gln Pro His Gly Pro Val Arg
210 215 220Thr Ser Pro Ala Gly Glu Ala Pro Phe Leu Thr Val Lys Gly Gly Ser225 230 235 240Cys Leu Val Ser Gly Leu Gln Ala Gly Lys Ser Tyr Trp Leu Gln Leu
245 250 255Arg Ser Gln Pro Asp Gly Val Ser Leu Arg Gly Ser Trp Gly Pro Trp
260 265 270Ser Phe Pro Val Thr Val Asp Leu Pro Gly Asp Ala Val Thr Ile Gly
275 280 285Leu Gln Cys Phe Thr Leu Asp Leu Lys Met Val Thr Cys Gln Trp Gln
290 295 300Gln Gln Asp Arg Thr Ser Ser Gln Gly Phe Phe Arg His Ser Arg Thr305 310 315 320Arg Cys Cys Pro Thr Asp Arg Asp Pro Thr Trp Glu Lys Cys Glu Glu
325 330 335Glu Glu Pro Arg Pro Gly Ser Gln Pro Ala Leu Val Ser Arg Cys His
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355 360 365Thr Ala Gln Gly Ala Val His Ser Tyr Leu Gly Ser Pro Phe Trp Ile
370 375 380His Gln Ala Val Leu Leu Pro Thr Pro Ser Leu His Trp Arg Glu Val385 390 395 400Ser Ser Gly Arg Leu Glu Leu Glu Trp Gln His Gln Ser Ser Trp Ala
405 410 415Ala Gln Glu Thr Cys Tyr Gln Leu Arg Tyr Thr Gly Glu Gly Arg Glu
420 425 430Asp Trp Lys Val Leu Glu Pro Ser Leu Gly Ala Arg Gly Gly Thr Leu
435 440 445Glu Leu Arg Pro Arg Ala Arg Tyr Ser Leu Gln Leu Arg Ala Arg Leu
450 455 460Asn Gly Pro Thr Tyr Gln Gly Pro Trp Ser Ala Trp Ser Pro Pro Ala465 470 475 480Arg Val Ser Thr Gly Ser Glu Thr Ala Trp Ile Thr Leu Val Thr Ala
485 490 495Leu Leu Leu Val Leu Ser Leu Ser Ala Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu
500 505 510Lys Trp Gln Phe Pro Ala His Tyr Arg Arg Leu Arg His Ala Leu Trp
515 520 525Pro Ser Leu Pro Asp Leu His Arg Val Leu Gly Gln Tyr Leu Arg Asp
530 535 540Thr Ala Ala Leu Ser Pro Ser Lys Ala Thr Val Thr Asp Ser Cys Glu545 550 555 560Glu Val Glu Pro Ser Leu Leu Glu Ile Leu Pro Lys Ser Ser Glu Ser
565 570 575Thr Pro Leu Pro Leu Cys Pro Ser Gln Pro Gln Met Asp Tyr Arg Gly
580 585 590Leu Gln Pro Cys Leu Arg Thr Met Pro Leu Ser Val Cys Pro Pro Met
595 600 605Ala Glu Thr Gly Ser Cys Cys Thr Thr His Ile Ala Asn His Ser Tyr
610 615 620Leu Pro Leu Ser Tyr Trp Gln Gln Pro625 630(2)SEQ ID NO:8信息:(i)序列特征:
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(A)长度:23个碱基对
(B)类型:核酸
(C)链型:单链
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(B)克隆:ZC7423(xi)序列描述:SEQ ID NO:9:AGCCTCCTTG GTACCCAGCT TCC 23(2)SEQ ID NO:10信息:(i)序列特征:
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(A)长度:42个碱基对
(B)类型:核酸
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(B)克隆:ZC6706(xi)序列描述:SEQ ID NO:24:GATCCTCAGT GATGGTGATG GTGATGCTCG AGTCCCATGG CG 42
Claims (20)
1.纯化的哺乳动物血小板生成素,其特征在于:
a)在变性条件下用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定时分子量为Mr=70,000±10,000道尔顿;和
b)用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染测定时就沾染蛋白质而言纯度至少为90%。
2.按照权利要求1的纯化的哺乳动物血小板生成素,其基本上不含有Mr小于55kD的TPO物种。
3.按照权利要求1的纯化的血小板生成素,其是小鼠血小板生成素。
4.按照权利要求3的纯化的血小板生成素,其中所说的血小板生成素包含SEQ ID NO:2所示的从45位残基(丝氨酸)到379位残基(苏氨酸)的氨基酸残基序列。
5.按照权利要求1的纯化的血小板生成素,其是灵长类血小板生成素。
6.按照权利要求1的纯化的血小板生成素,其是人类血小板生成素。
7.按照权利要求6的纯化的血小板生成素,其中所说的血小板生成素包含SEQ ID NO:4所示的从22位残基(Ser)到353位残基(甘氨酸)的氨基酸残基序列。
8.一种从生物液体纯化血小板生成素的方法,该方法包括:
将包含血小板生成素的生物液体加到包含MPL受体之配体-结合结构域的多肽上,该多肽结合在固体支持物上,从而使所说的血小板生成素吸附在所说的多肽上;
洗涤所说的多肽,以洗脱未吸附的物质;
从所说的多肽上洗脱所吸附的血小板生成素;
经阴离子交换色谱分级分离所洗脱的血小板生成素;和
收集分级分离的血小板生成素。
9.按照权利要求8的方法,其中所说的生物液体是条件细胞培养基或牛奶。
10.按照权利要求8的方法,其中所说的生物液体浓缩的条件细胞培养基。
11.按照权利要求8的方法,该方法还包括在将所说的生物液体加到受体多肽上之前浓缩所说的生物液体的步骤。
12.按照权利要求8的方法,其中所说的支持物是交联的琼脂糖小珠。
13.按照权利要求8的方法,其中所收集的血小板生成素的特征为:
a)在变性条件下用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定时分子量为Mr=70,000±10,000道尔顿;和
b)用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染测定时就沾染蛋白质而言纯度至少为90%。
14.按照权利要求13的方法,其中所收集的血小板生成素基本上不含有Mr小于55kD的TPO物种。
15.按照权利要求8的方法,其中所说的血小板生成素是小鼠血小板生成素。
16.按照权利要求8的方法,其中所说的血小板生成素是灵长类血小板生成素。
17.按照权利要求8的方法,其中所说的血小板生成素是人类血小板生成素。
18.按照权利要求8的方法,其中所说的多肽包含小鼠或者人类MPL受体之配体结合结构域。
19.按照权利要求8的方法,其中所说的多肽基本上由SEQ ID NO:7的27-480位残基组成。
20.一种药物组合物,该组合物包含与药学上可接受的体组合在一起的血小板生成素,其中所说的血小板生成素的特征是在变性条件下用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定时分子量为Mr=70,000±10,000道尔顿,其中所说的组合物基本上不含有Mr小于55kD的TPO物种。
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