CN1219967A - 神经胶质细胞系源性的神经营养因子受体 - Google Patents
神经胶质细胞系源性的神经营养因子受体 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1219967A CN1219967A CN97194013A CN97194013A CN1219967A CN 1219967 A CN1219967 A CN 1219967A CN 97194013 A CN97194013 A CN 97194013A CN 97194013 A CN97194013 A CN 97194013A CN 1219967 A CN1219967 A CN 1219967A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- gdnfr
- gdnf
- neurotrophic factor
- sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
- A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Neurology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Public Health (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Hematology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Psychiatry (AREA)
- Psychology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
Abstract
本发明涉及神经胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF),一种表现出对中枢神经系统和外周神经系统的各种类型的细胞具有广谱生物学活性的神经营养素。本发明涉及克隆和表征GDNF的高亲和性受体。该分子被命名为GDNF受体(GDNFR),因为它是受体系统的第一个已知组分。描述了GDNFR蛋白产物的核酸和氨基酸序列。在氨基末端发现具有信号肽特征的疏水性域,而羧基末端的第二个疏水性域谵语该受体与细胞膜的连接。缺少跨膜域和胞质区表明GDNFR需要一个或多个辅助分子以介导跨膜信号发生。GDNFRmRNA广泛分布于神经系统和非神经组织中,与发现的GDNF的类似分布一致。
Description
1.发明领域
本发明涉及神经胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)受体并提供编码GDNF受体(GDNFR)的核酸序列和氨基酸序列。本发明亦涉及治疗GDNF应答性疾病的治疗技术。
2.发明背景神经胶质细胞系源性神经营养因子
最初神经胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)是做为增强中脑多巴胺能神经元存活的有效神经营养因子从大鼠B49细胞分离和克隆的(Lin等,Science,260,1130-1132,1993)。近期的研究表明该分子表现出各种各样的其它生物学活性,这些活性对中枢神经系统和外周神经系统的几种类型的神经元有影响。在中枢神经系统(CNS)中,已显示GDNF防止轴突切开术诱导的哺乳动物面部和脊柱的运动神经元死亡(Li等,Proceedings Of The National Academy Of Sciences,U.SA.,92,9771-9775,1995;Oppenheim等,Nature,373,344-346,1995;Yan等,Nature,373,341-344,1995;Henderson等,Science,266,1062-1064,1994;Zurn等,Neuroreport,6,113-118,1994)、并从自然程序细胞死亡拯救发育中的鸟类运动神经元(Oppenheim等,1995见上述)。已显示GDNF局部给药保护黑质多巴胺能神经元免受轴突切开术诱导的变性(Kearns和Gash,Brain Research,672,104-111,1995;Beck等,Nature,373,339-341,1995)或神经毒素诱导的变性(Sauer等,Proceedings Of The NationalAcademy Of Sciences U.S.A.,92,8935-8939,1995;Tomac等,Nature,373,335-339,1995)。另外,已显示GDNF局部给药诱导多巴胺能神经元生长、提高多巴胺、去甲肾上腺素、5-羟色胺水平、并改进运动行为(Tomac等,1995见上述)。
最近,已报道GDNF是大脑去甲肾上腺素能神经元和浦肯野细胞的潜在营养因子。移植异位表达GDNF的成纤维细胞防止6-羟基多巴胺诱导的变性和体内促进成人去甲肾上腺素能神经元的表型(Arenas等,Neuron,15,1465-1473,1995),而外源应用的GDNF有效地促进胚性浦肯野细胞体外生存和形态分化(Mount等,Proceedings Of TheNational Academy Of Sciences U.S.A.,92,9092-9096,1995)。在外周神经系统中,已显示GDNF促进结节状、睫状和交感神经节神经元以及脊神经节(DRG)和三叉神经节胚胎感觉神经元小群体的生存(Trupp等,Joumal Of Cell Biology,130,137-148,1995;Ebendal等,Journal OfNeuroscience Research,40,276-284,1995;Oppenheim等,1995见上述;Yan等,1995见上述;Henderson等,1994见上述)。亦有报道GDNF增强培养上颈神经节(SCG)神经元中血管活性肠肽和前速激肽原-AmRNA表达,并因此影响SCG神经元表型和诱导束状生长(Trupp等,1995见上述)。
已在神经系统的多种不同细胞类型和结构中观察到GDNF表达。在CNS中,通过逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)已在发育中的和成熟的大鼠纹状体(黑质多巴胺能神经支配的主要靶)和其它广泛区域(包括海马、皮层、丘脑、隔膜、小脑、脊髓和延髓)中已观察到GDNF mRNA的表达(Arenas等,见上述1995;Poulsen等,Neuron,13,1245-1252,1994;Spinger等,Experimental Neurology,127,167-170,1994;Stroemberg等,Experimental Neurology,124,401-412,1993;Schaar等,Experimental Neurology,124,368-371,1993)。在人体中,也已在纹状体检测到GDNF转录物,在尾中水平最高而在核壳中水平最低。在海马、皮层和脊髓中亦发现可检测的水平,但在小脑中没有(Schaar等,Experimental Neurology,130,387-393,1994;Sprnger等,1994见上述)。在外周神经中,已在出生后1天大鼠的DRG和SCG、坐骨神经和新生儿许旺细胞的原始培养物中报道GDNF mRNA表达(Trupp等,1995见上述;Hoffer等,Neuroscience Letters,182,107-111,1994;Henderson等,1994见上述;Springer等,1994见上述)。另外,近期研究显示GDNF转录物亦于周围非神经元器官中广泛表达,包括出生后睾丸和肾脏、胚胎须垫、胃和皮肤。可以在胚胎肌肉、肾上腺和肢芽和在出生后肺、肝和卵巢中检测到低水平的表达(Trupp等,1995见上述;Henderson等,1994见上述)。然而,迄今不清楚GDNF非神经元表达的生物学重要性。
GDNF蛋白产物的制备和表征的详细描述可以参见于1994年5月23日申请的美国专利申请08/182,183和其原申请(亦可参见于1992年9月17日申请的PCT/US92/07888,WO93/06116和欧洲专利申请92921022.7,公告EP610254号),其说明书通过引用结合到本文中。在于1995年9月28日申请的未决美国专利申请08/535,681描述了其它GDNF蛋白产物,该申请的说明书通过引用结合到本文中。本文使用的术语“GDNF蛋白产物”包括生物学活性的合成或重组GDNF蛋白和类似物以及其化学修饰衍生物。GDNF类似物包括诸如截短的GDNF蛋白的缺失变异体、以及GDNF的插入和置换变异体。亦包括与人GDNF蛋白基本同源的GDNF蛋白。GDNF疗法
GDNF疗法有助于治疗由损害一种或多种类型神经细胞的生存和/或正常功能的疾病引起的神经损害。可以由广泛的各种不同的原因发生这种神经损害。可以由以下原因使一种或多种类型的神经细胞发生神经损害:(1)物理损伤,它导致损伤位点附近的轴索突起和/或神经细胞体变性;(2)如在中风中,血液至该神经系统部分的流动暂时或永久停止;(3)有意或意外对诸如治疗肿瘤的化疗剂(例如顺铂)或治疗AIDS的二脱氧胞苷(ddC)的神经毒素暴露;(4)慢性代谢病,例如糖尿病或肾功能障碍;或(5)神经变性疾病,例如由特定神经元群体变性引起的帕金森病、早老性痴呆和肌萎缩性侧素硬化(ALS)。
几项研究表明GDNF疗法特别有助于治疗神经变性疾病,例如帕金森病中黑质的多巴胺能神经元变性。帕金森病目前唯一治疗是治标剂,目的在于增加纹状体中多巴胺水平。GDNF疗法的预期效果不仅仅是在纹状体的多巴胺能神经终端产生多巴胺能神经传递增加(这将导致症状减轻),而且减缓或甚至停止变性过程的进程并修复黑质纹状体路径并恢复其功能。GDNF亦可以用于治疗人类病人多巴胺能神经细胞的其它形式的损害或功能不正常。这种损害或机能失常可以发生于精神分裂症和其它形式的精神病。目前对这种疾病的唯一治疗是根据症状的并需要作用于多巴胺受体或多巴胺摄入位点的药物,与神经支配这些携带受体的神经元群体的多巴胺能神经元功能不正常参与该疾病过程的观点一致。受体
已经表征和分子克隆许多介导与蛋白因子结合和对其应答的受体,包括胰岛素、血小板源生长因子、表皮生长因子及其相关物、成纤维细胞生长因子、各种白介素、造血生长因子受体和睫状神经营养因子(U.S.5,426,177)的受体。研究结果表明,一些受体可以与多种(相关)生长因子结合,而在其它情况下同一因子可以结合并激活多种(相关)受体(例如Lupu等,Science,249:1552-1555,1990;Dionne等,EMBOJ.,9:2685-2692,1990;Miki等,Science,251:72-75,1991)。大多数受体的广义特征是具有负责特异性结合蛋白因子的胞外部分或结构域、跨越细胞膜的跨膜域和一通常参与该蛋白因子结合至该受体的胞外部分时发动信号传导的胞内域。尽管许多受体由一条多肽链组成,但其它受体明显地需要两个或更多的独立亚基以与它们的蛋白因子以高亲和性结合并在结合后允许功能性应答(例如Hempstead等,Science,243:373-375,1989;Hibi等,Cell,63:1149-1157,1990)。
给定受体的胞外和胞内部分可能与其它受体的对应区域共享共同的结构基序,提示在不同受体之间的进化和功能关系。这些关系常常可能是相相当遥远的并可能简单地反映某些一般域结构的重复应用。例如,与不相关因子结合的各种不同受体在它们的胞外部分中利用“免疫球蛋白”域,而其它受体则在其因子结合区使用“细胞因子受体”域(例如Akira等,The FASEB J.,4:2860-2867,1990)。很多具有独特胞外结合域的受体(它因此结合不同的因子)含有编码对因子结合应答时被激活的酪氨酸特异性蛋白激酶的相关胞质内域(例如Ullrich和Schlessinger,Cell,61:203-212,1990)。对因子结合“激活”信号传导过程的机制了解的很少,即使是在受体酪氨酸激酶的情况下。对胞内域编码未知功能域或结合组分与未知功能的第二个蛋白质相联系的其它受体(例如Hibi等,Cell,63:1149-1157,1990)而言,未有很好地表征信号传导的激活。
在本领域中未清楚地阐明体内GDNF作用的方式,部分是因为缺乏GDNF受体的信息。两个小组独立地发现注射[125I]标记的纹状体可以被黑质的多巴胺能神经元逆行运输(Tomac等,Proceedings Of TheNational Academy Of Sciences Of The United States Of America.92,8274-8278,1995;Yan等,1995见上述)。亦观察到由脊髓运动神经元、DRG感觉神经元和视网膜神经节B层中的神经元进行的[125I]-GDNF逆行运输。这些逆行运输现象可以全部被100倍或更高浓度的未标记GDNF特异性地抑制,提示一可饱和的、受体介导的运输过程。在体外,已显示非常低浓度的重组GDNF增强培养的多巴胺能神经元的生存和促进其多巴胺摄入。观察到的GDNF对这些神经元的半最大有效浓度(EC50)是0.2-1.6pM(Lin等,1993见上述)。亦已显示GDNF在低浓度下支持分离的运动神经元的生存。据报道GDNF对运动神经元的EC50范围是5-10fM,甚至比对多巴胺能神经元的EC50还低(Henderson等,1994见上述)。
综合来看,这些观察表明:在这些细胞中表达的GDNF受体具有非常高的配基结合亲和性。与TGF-β家族的成员类似,GDNF的广泛多样化组织分布和对不同细胞群体的各种生物学功能提示可能存在GDNF的不同受体类型或受体复合体。[125I]-GDNF与E10鸡交感神经元的饱和稳态和竞争性结合已显示这些神经元表达的GDNF结合位点不同于在多巴胺能神经元和运动神经元中观察到的结合位点。GDNF对这些结合位点的半最大饱和浓度和半最大抑制浓度的范围是1-5nM(Trupp等,1995见上述)。类似地,据报道GDNF支持P1大鼠SCG的交感神经元生存的EC50亦在毫微摩尔范围内(Trupp等,1995见上述)。
为更好地理解GDNF激活信号传导以对细胞施加影响的机制,鉴别介导与该蛋白因子结合并对其应答的受体可能是有益的。对GDNF疗法亦可能有益的是鉴别提供或增强GDNF信号传导的辅助分子并使该辅助分子的生产成为可能。另外,GDNF的蛋白受体的鉴别将为诊断用途提供强大的应用,例如做为辅助手段确定个体是否能从GDNF蛋白疗法获益。另外,GDNF的蛋白受体可能是鉴别其它与该受体结合并产生所需生物学活性的分子的检测中的关键组分。
发明概述
本发明提供编码具有图2和图4(SEQ ID NO:2和4)描述的氨基酸序列的神经营养因子受体蛋白及其生物学等效类似物的核酸序列。本文将本发明的神经营养因子受体蛋白和蛋白产物称为神经胶质细胞系源性神经营养因子受体(GDNFR)蛋白和蛋白产物。所述新GDNFR的功能特征为特异性地并以高亲和性与GDNF结合的能力、以及做为介导或增强GDNF信号传导作用的分子复合体的部分起作用。通常以可溶性受体蛋白和基本纯化的形式提供GDNFR蛋白产物。
在一个方面,本发明提供通过重组遗传工程技术生产GDNFR蛋白产物。在另一实施方案中,通过化学技术、或重组和化学技术的结合合成所述GDNFR蛋白。
在本发明的另一方面,可以以糖基化或非糖基化形式制备所述GDNFR蛋白。GDNFR蛋白的衍生物通常涉及将该GDNFR蛋白连接至水溶性聚合物。例如,可以将该GDNFR蛋白结合至一个或多个聚乙二醇分子,以减少该GDNFR蛋白产物在水溶性环境中的沉淀。
本发明的再一方面包括编码GDNFR蛋白的各种多核苷酸。这些核酸序列用于在真核或原核宿主细胞中表达GDNFR,其中该表达产物或其衍生物的特征在于与GDNF结合并因此形成能够介导GDNF活性的能力(例如增加多巴胺能细胞的多巴胺摄入)的复合体。所述多核苷酸亦可以用于细胞治疗或基因治疗应用。适合的核酸序列包括那些在附图中具体描述的序列以及简并序列、自然发生的等位基因变异和在本发明基础上的修饰序列。
典型的核酸序列包括编码神经营养因子受体蛋白及其生物学等效类似物的序列,该蛋白包含图2和图4(SEQ ID NO.2和4)描述的氨基酸序列,并能够与神经胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)复合和介导对GDNF的细胞应答。这种序列包括:(a)在图1(SEQ ID NO.1)中陈述的包含编码Met1至Ser465的核苷酸或图3(SEQ ID NO.3)中陈述的包含编码Met1至Ser468的核苷酸的序列,该序列编码能与神经胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)复合并介导细胞对GDNF应答的神经营养因子受体(GDNFR);(b)一核酸序列,它(1)与(a)的互补序列杂交并(2)编码具有GDNFR活性的氨基酸序列;和(c)一核酸序列,它若不是遗传密码的简并性将会与(a)的互补序列杂交并(2)编码具有GDNFR活性的氨基酸序列。本文亦公开了这种核酸序列的载体,其中所述序列通常可操作地与一个或多个能够实现该核酸序列扩增或表达的操作元件连接。亦考虑了含有这种载体的宿主细胞。该宿主细胞通常选自诸如分别为COS-7细胞或大肠杆菌的哺乳动物细胞或细菌细胞。
本发明的又一方面涉及含有编码GDNFR蛋白的可操作地连接至扩增和/或表达控制序列的多核苷酸的载体。原核和真核宿主细胞都可以用这种载体稳定转化或转染,以表达GDNFR蛋白。本发明另外包括GDNFR蛋白的重组生产,其中将这种转化或转染宿主细胞生长于合适的营养培养基,并可选地所述该宿主细胞和/或该营养培养基分离由所述细胞表达的GDNFR。本发明另外包括编码GDNFR的多核苷酸和含有这种多核苷酸的载体在基因治疗或细胞治疗中的用途。
亦可以根据对人类植入物的合适性选择宿主细胞,其中该植入细胞表达和分泌本发明的神经营养因子受体。亦可以将该宿主细胞封闭于适于人类植入的半透膜中。可以离体转化或转染该宿主细胞。治疗神经损害的典型装置包括:(a)适于植入的半透膜;和(b)包在该膜内的细胞,其中所述细胞表达并分泌本文公开的神经营养因子受体。从可透过该神经营养因子受体蛋白但不能透过对所述囊封的细胞有害的物质的材料选择该膜。
亦公开了重组生产本发明神经营养因子受体的方法。典型的方法包括:(a)培养宿主细胞,所述细胞含有的核酸序列编码本发明神经营养因子受体或其生物学等效类似物,例如图2和4(SEQ ID NO.2和4)描述的氨基酸序列,该序列可以与神经胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)复合并介导细胞对GDNF应答;(b)将所述宿主细胞保持于适于所述宿主细胞表达所述神经营养因子受体的条件下;和(c)可选地,分离由所述宿主细胞表达的所述神经营养因子受体。该宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞。如果涉及细菌表达,该方法还可以包括重折叠该神经营养因子受体的步骤。
本发明包括分离和纯化的蛋白或其生物学等效类似物,该蛋白包含图2和4(SEQ ID NO.2和4)描述的氨基酸序列,该序列能够与神经胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)复合并介导细胞对GDNF应答。典型的类似物包括(但不限于)包含如图2(SEQ ID NO:2)描述的Ser18-Pro446、Asp25-Leu447和Cys29-Cys442的氨基酸序列的蛋白以及如图4(SEQ ID NO:4)描述的Met17-Pro449和Cys29-Cys443的氨基酸序列的蛋白。本发明的蛋白可以糖基化或非糖基化,并可以用重组技术或化学合成生产。本发明另外包括编码包含这种氨基酸序列的受体蛋白的核酸序列。
本文亦公开包含本发明受体蛋白与药学上接受载体载体的药用组合物。可以用各种其它配制材料以促进生产、储存、处理、输送和/或功效。
本发明的另一方面包括GDNFR基因和蛋白的治疗用途。例如,循环性或可溶性GDNFR蛋白产物可以单独使用或与GDNF联用,通过提高GDNF跨膜信号发生的活性治疗神经系统疾病或损伤。因此,本发明的蛋白和药用组合物可以用于治疗功能异常的多巴胺能神经细胞、帕金森病、早老性痴呆和肌萎缩性侧索硬化。或者,可以将重组GDNFR基因插入可能从对GDNF较高的敏感性获益的组织细胞中,例如患肌萎缩性侧索硬化病人的运动神经元。在另一实施方案中,GDNFR可以用于在据信GDNF活性有害的情况下阻断GDNF活性。可以用GDNFR确认观察到的GDNF效果归因于GDNFR。
在本发明的另一方面,GDNFR探针可以用于鉴别在正常或疾病状态下对GDNF应答的细胞和组织。或者,该探针可以用于在患GDNF相关疾病的病人中检测GDNFR表达的异常。
在本发明的另一方面,包括核酸和抗体探针的GDNFR探针可以用于鉴别GDNFR相关分子。例如,本发明提供这种与GDNFR形成复合体并因此参与GDNFR功能的分子。做为另一例子,本发明提供与GDNFR同源或交叉反应性抗原性但与GDNFR不同的受体分子。
本发明亦提供基于该受体的GDNF结合和功能检测的开发。例如,检测GDNF活性的检测系统可以涉及表达高水平GDNFR、并因此对非常低浓度的GDNF或GDNF样分子极端敏感的细胞。在再一实施方案中,可溶性GDNFR可以用于结合GDNF或GDNF样分子或检测GDNF或GDNF样分子的存在。
另外,本发明提供研究GDNF生理作用的实验模型系统。这种系统包括涉及抗GDNFR抗体或寡核苷酸探针以及动物模型的检测,所述动物模型例如为表达高水平GDNFR并因此对GDNF超敏感的转基因动物或用胚胎干细胞技术衍生的动物,其中从其基因组中除去内源GDNFR基因。抗GDNFR抗体将与所述神经营养因子受体蛋白的肽部分结合。抗体包括单克隆抗体和多克隆抗体。或者,抗体已存在的免疫标记可以连接至该GDNFR蛋白以协助检测。这种标记包括(但不限于)Flag序列(IBI/Eastman Kodak)和myc序列。诸如多聚组氨酸的其它标记序列亦已用于检测和在金属螯合柱上的纯化。
在考虑以下详细描述本发明实践的描述的情况下,本发明的其它方面和优点对本领域技术人员是显而易见的。
附图简述
图1描述编码人神经胶质细胞系源性神经营养因子受体(GDNFR)的核酸序列(SEQ ID NO:1)。该全长GDNFR蛋白的氨基酸序列由核酸540-1934编码。
图2描述该全长人GDNFR蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)。
图3描述编码大鼠GDNFR的核酸序列(SEQ ID NO:3)。该全长GDNFR蛋白的氨基酸序列由核酸302-1705编码。
图4描述该全长大鼠GDNFR蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:4)。
图5描述在各种克隆中产生的GDNFR cDNA部分的直线排列和比较,以及人GDNFR的共有序列。
图6描述表达GDNFR的Neuro-2A源细胞系的鉴定。
图7A和7B描述[125I]GDNF与表达GDNFR的细胞平衡结合的结果。
图8描述[125I]GDNF化学交联至GDNFR的细胞中表达的GDNFR和Ret Expressed的结果。
图9描述在表达GDNFR的细胞中GDNF诱导c-Ret自磷酸化的结果。
图10描述GDNF和可溶性GDNFR诱导c-Ret自磷酸化的结果。
图11描述Ret-Fc融合蛋白阻断c-Ret自磷酸化的结果。
图12描述运动神经元中GDNF诱导c-Ret自磷酸化的结果。
图13描述GDNFR和Ret介导的GDNF信号发生的模型。
本发明详细说明
神经胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)是一对中枢和外周神经系统的各种细胞类型表现出广谱生物学活性的有效神经营养因子。它是糖基化的二硫键连接的二聚体,与转化生长因子β(TGF-β)超家族有遥远的联系(低于20%同源性)。GDNF增强多巴胺能神经元和其它神经元群体的能力证明了它治疗帕金森病和其它形式的神经损害或功能失常的治疗潜力。
与对GDNF的分布和生物活性的广泛研究相反,尚未有任何关于鉴别介导GDNF与细胞结合并因此介导胞内信号发生和细胞应答的一种或多种受体的报道。本发明基于在出生后大鼠的培养视网膜细胞表面首次发现的高亲和性受体的发现。这些受体具有的估计GDNF结合亲和性比得上在以下神经元中发现的受体的亲和性:多巴胺能和运动神经元;中脑多巴胺能神经元(Lin等,1993见上述;Sauer等,1995见上述;Kearns和Gash,1995见上述;Beck等,1995见上述;Tomac等,1995a见上述)、面部和脊髓运动神经元(Li等,1995见上述;Oppenheim等,1995见上述;Yan等,1995见上述;Zurn等,1994见上述;Henderson等,1994见上述)。该受体分子已被命名为GDNF受体(GDNFR),因为它是GDNF受体系统的第一个已知组分。本发明亦提供GDNFR蛋白的表达克隆和表征的首次描述。修饰以表达该重组受体的细胞以高亲和性与GDNF结合。
使用多巴胺摄入检测和[125I]-GDNF在培养细胞上的结合,在大鼠感光细胞表面检测到GDNF的高亲和性受体。正如在实施例中进一步描述的,对感光细胞的研究导致通过GDNF受体的表达克隆分离cDNA克隆。GDNFR的核酸序列编码一个具有468个氨基酸、31个半胱氨酸残基和三个潜在N-糖基化位点的蛋白质。接着,用该大鼠cDNA克隆的核酸序列分离其人同源物,发现该同源物在氨基酸水平上与该大鼠受体几乎相同。该人GDNFR cDNA序列编码一个具有465个氨基酸的蛋白,且其中所有半胱氨酸残基和潜在N-糖基化位点相对于该大鼠受体都是保守的。一级序列的高度保守性表明该受体在GDNF生物学功能中的重要作用。
如上所述,许多受体有三个主结构域:负责特异性结合蛋白因子的胞外或细胞表面域;跨越所述细胞膜的跨膜域;和一通常当蛋白因子结合至该受体的胞外域时参与发动信号传导的胞内或胞质域。然而,已确定GDNFR与任何已知蛋白的序列或结构特征(例如在或者受体激酶或细胞因子受体中发现的共有序列)不相关、缺少胞质域、缺少跨膜域的特征性C末端带电荷残基并通过糖基-磷脂酰肌醇(GPI)键连接锚定于细胞膜,正如以下更详细地描述。尽管缺少胞内催化域排除了在跨膜信号发生方面的直接作用,但该高度结合亲和性和强进化序列保守性进一步提示该受体对GDNF功能的重要性。
因为GDNFR缺少胞质域,所以认为该受体一定与一个或多个在跨膜信号发生中起作用的辅助分子联合起作用。然后发现缺少GDNF基因的转基因小鼠死亡并且没有肾脏。发现缺少c-ret原癌基因的转基因小鼠(Schuchardt等,Nature,367,380-383,1994)具有类似的表型。该c-ret原癌基因编码正常功能尚未确定的受体酪氨酸激酶(RTK)。所有的RTK都具有类似的拓扑学:它们具有胞外配基结合域、跨膜域和含有该催化性蛋白-酪氨酸激酶域的胞质部分。配基的结合导致该激酶域激活和所述细胞中介导胞内信号发生的特定底物的磷酸化。本发明涉及发现GDNFR的可溶性形式可以用于介导GDNF与该c-ret原癌基因结合并因此引出对GDNF的细胞应答以及修饰其细胞类型特异性。
类似的称为“受体α”组分的物质提供配基结合特异性,但不具有靠自己传导信号的能力。在睫状神经营养因子(CNTF)和白介素-6(IL-6)受体系统中发现这种组分。与GDNFR类似并与IL-6受体相反,CNTF受体以高亲和性与其配基结合、具有疏水性C末端、没有胞质域并靠GPI连接锚定于细胞膜(Davis等,1991)。为介导信号传导,CNTF首先与CNTF受体结合,产生一个能够与gp130结合的复合体。该无活性复合体然后与LIF受体结合以形成活性信号发生复合体(Davis等,Science,260,1805-1807,1993)。正如与本发明一样,CNTF受体(配基特异性结合组分)必须存在以进行信号发生,但它不必是膜结合的(Economides等,Science,270,1351-1353,1995)。
正如以下进一步所述,GDNFR蛋白可以锚定于细胞表面,或它可以以可溶性形式提供。在这二种情况下,GDNFR蛋白与GDNF形成配基复合体,并且该配基复合体与细胞表面受体结合以实现胞内信号发生。因此,可以使用可溶性形式的GDNFR加强GDNF的作用和/或修饰其细胞类型特异性。
GDNFR与任何已知受体不相关。在GenBank和华盛顿大学-默克数据库中没有相关序列的明显相配物。在华盛顿大学-默克EST数据库中发现的一个表达的序列标记(EST)显示与GDNFR编码区的一小部分(从该克隆5’端产生的序列的521个核苷酸的约340个核苷酸)有75%同源性。该克隆(GenBank登记号码#H12981)系从寡聚-dT引物人婴儿脑文库分离并定向地克隆进入Lafmid BA载体(Hillier,L.等,未出版数据)。该#H12981克隆的3’端已被测序,但是它与该GDNFR的任何部分都没有显示出同源性。该#H12981克隆和GDNFR之间的在一短区上表现出同源性、然后该同源性消失,提示该#H12981克隆代表一未剪接转录物或克隆人工产物,而不是真正的cDNA转录物。
因此,本发明使能够通过提供选择表达GDNFR的靶细胞的方法克隆GDNFR蛋白。通过提供富集GDNFR编码序列的手段,本发明还提供GDNFR蛋白的纯化和GDNFR编码DNA的直接克隆。该GDNFR核酸和氨基酸序列的现行描述提供复制这些实体以及各种GDNFR类似物的必要信息。有了该信息,可以用本领域技术人员已知的任何方法分离或制备GDNFR蛋白产物。公开了重组或合成生产GDNFR蛋白的各种方法。
本文使用的术语“GDNFR蛋白产物”包括生物学活性的纯化的天然、合成或重组GDNFR、GDNFR类似物(即GDNFR同源物和涉及插入、置换和缺失变异的变异体)、及其化学修饰衍生物。GDNFR类似物基本上与图2和4(SEQ ID NO:2和4)陈述的GDNFR氨基酸序列同源。
本文使用的术语“生物学活性”指该GDNFR蛋白产物表现出以高亲和性地与GDNF结合并介导或增强GDNF诱导的信号传导。使用本说明书,本领域一般技术人员有能力确定GDNFR多肽类似物是否具有与图2和4中陈述的GDNFR蛋白产物基本相同的生物学活性。
本文使用的术语“基本同源的”氨基酸序列指与图2和4中陈述的GDNFR氨基酸序列有一定“类似”度或同源的氨基酸序列,使得该同源序列具有的生物学活性或功能与这些GDNFR氨基酸序列描述的类似。本领域技术人员将会理解,在一个氨基酸序列中有相当多的单个或成组的氨基酸残基可以被更换、交换位置(例如反向排列或重新排列)或完全缺失,而不影响该分子的三维构象或活性。按照本说明书,这种修饰完全在本领域技术人员的能力之内。在以下更详细地描述提供这种修饰序列的鉴别和方法。基本同源蛋白(肽)的同源度优选为不低于70%(即同源性范围为70%-100%)。因此,一优选的“基本同源的”GDNFR氨基酸序列与SEQ ID NO:2和4陈述的氨基酸序列的同源性可以大于或等于70%。该同源性更优选地不低于85%。该同源性甚至更优选地不低于90%,或该同源性最优选地不低于95%。
本文描述的同源性百分比是以在一个蛋白序列中发现的氨基酸残基与第二个蛋白序列中的相等或类似氨基酸残基匹配的百分比计算的。因此,有关GDNFR的同源性,可以通过将欲比较分子的氨基酸残基最佳地与参比GDNFR多肽(诸如陈述于SEQ ID NO:2和4的)或附图中陈述的核酸序列编码的氨基酸残基匹配,以使这两个序列之间达到残基的最大匹配。本领域技术人员将会理解这种匹配可以包括适当的保守氨基酸置换,并将按照需要通过引入间隙而不理睬该比较序列的截断和内部缺失或插入;参见例如Dayhoff,蛋白序列和结构图集(Atlas of Protein Sequence and Structure)第五卷,其中在100个氨基酸长度中可以平均导入三或四个间隙以帮助匹配(第124页,国立生化研究基金会,Washington,D.C.,1972;其说明书通过引用结合到本文中)。一旦这样匹配后,将该比较多肽中的匹配残基数量除以该比较多肽中的残基总数确定百分比。另外考虑本发明的GDNFR序列可以用于形成一个具有至少部分GDNFR活性的融合蛋白或嵌合蛋白的部分。使用与GDNFR活性相关的该融合蛋白活嵌合蛋白部分确定这种蛋白的匹配和同源性。
这种基本同源GDNFR蛋白的来源包括预期与该人GDNFR蛋白有高度同源性的其它哺乳动物的GDNFR蛋白。例如,大鼠GDNFR蛋白与本文公开的人GDNFR蛋白的同源性程度为约93%。基本同源的GDNFR蛋白可以借助与SEQ ID NO:2和4的氨基酸序列的抗体的交叉反应性从这种哺乳动物中分离。或者,它们可以由通过与编码SEQID NO:2和4的GDNFR的基因或基因区段杂交分离的核酸序列或与SEQ ID NO:2和4描述的核酸序列的互补序列杂交的核酸序列表达。在以下更详细地描述合适的杂交条件。
通常分离和纯化该新GDNFR蛋白产物,以形成基本上不含会减损本多肽用于预期目的的用途的不需要的物质。例如,优选的GDNFR蛋白产物可以基本上不含其它人(例如非GDNFR)蛋白性材料或病理因子。所述GDNFR蛋白产物优选地约80%不含有因该GDNFR蛋白产物的生产中使用的生产技术而存在的其它蛋白。更优选的是,所述GDNFR蛋白产物约90%不含有其它蛋白,特别优选的是,约95%不含有其它蛋白,更优选的是,约超过98%不含有其它蛋白。另外,本发明提供为同源性GDNFR蛋白生产提供多核苷酸序列的独特优点。
考虑了各种GDNFR变异体,包括添加、缺失和置换变异体。例如,可以通过从该GDNFR蛋白的氨基和/或羧基末端除去一个或多个氨基酸残基制造一系列缺失变异体。使用von Heijne描述的预测信号肽切割的法则(von Heijne,Nucleic Acids Research,14,4683-4690,1986),该GDNFR蛋白的可能参与GDNF结合的第一个氨基酸残基是Ser18,正如图2(SEQ ID NO:2)中的人GDNFR全长氨基酸序列描述的。氨基酸残基Met1-Ser18位于氨基末端疏水区,该区有可能是信号肽序列的一部分,因此未被包括于该受体蛋白的成熟形式中。同样地,该GDNFR蛋白的对GDNF结合有可能是必要的最后一个氨基酸残基是Ser446。氨基酸残基Leu447-Ser465位于参与该蛋白至所述细胞表面的GPI连接的羧基末端疏水性区。因此,考虑从Met1-Ser18和/或Leu447-Ser465(如图2描述的(SEQ ID NO:2))任何残基或所有残基都可以从该蛋白中除去而不影响GDNF与该GDNFR蛋白结合,因此留下一个Ala19-Pro446的“核心”序列。使用已知分析技术,进一步考虑N末端的截短可以包括除去一个或多个氨基酸残基直至并包括Gly24。因此,GDNFR截短类似物亦可以包括从两个末端之一或从两个末端缺失一个或多个氨基酸残基,使得Asp25-Pro446或Leu447的氨基酸序列形成核心分子的基础。考虑其它的GDNFR类似物,它们涉及如图4(SEQ IDNO:4)的GDNFR氨基酸序列描述的Ser18-Pro449的氨基酸残基,即从涉及做为氨基酸残基Met1-Ser18和/或Pro449-Ser468描述的疏水性区的两个末端之一个或两个末端缺失一个或多个氨基酸残基。
另外,考虑可以从氨基和羧基末端之一或这两个末端除去一个或多个氨基酸残基直至到达该全长序列的第一个和最后一个半胱氨酸残基。保持所述半胱氨酸残基对该GDNFR蛋白的正确分子内结合是有利的。正如图2(SEQ ID NO:2)中人GDNFR全长氨基酸序列中描述的,可以从该氨基末端除去Met1-Asp28的任何或所有氨基酸残基,而不除去做为Cys29出现的第一个半胱氨酸残基。类似地,可以从该羧基末端除去Gly443-Ser465的任何或所有氨基酸残基,而不除去做为Cys442出现的最后一个半胱氨酸残基。使用如图4(SEQ ID NO:4)的GDNFR氨基酸序列中描述的氨基酸残基Cys29-Cys443,可以制备其它GDNFR类似物,即除去做为氨基酸残基Met1-Asp28和/或Ser444-Ser468描述的所有或部分该末端区。
本领域技术人员将会理解,由于相同的原因,考虑在不影响该GDNFR蛋白功能的情况下可以置换而不是缺失这些鉴定的氨基酸残基。或者,可以通过残基内插入或末端添加修饰这些鉴定的氨基酸残基,而不影响该GDNFR蛋白的功能。在再一实施方案中,可以制备一个或多个缺失、置换或添加的组合物。
所述GDNFR蛋白或核酸可以用于治疗方法、或用于治疗的药物的生产方法。这种治疗包括以GDNFR蛋白过量产生为特征的疾病,其中本GDNFR、特别是可溶性形式可以用于与这种过量的GDNF蛋白复合并因此将其失活。通过制备可溶性受体(例如使用该GDNF结合域),或通过制备含有这种GDNFR的细胞群并将这种细胞移植入有此需要的个体可以完成这种治疗。本GDNFR蛋白产物亦可以用于治疗具有缺陷GDNF受体的那些患者。例如,可以通过制备并传递可溶性受体,或通过制备含有这种非缺陷GDNFR的细胞群,并将这种细胞移植入个体中治疗具有缺陷GDNFR的个体。或者,个体具有的GDNF受体数量可能不足,可以将含有这种受体的细胞移植以增加个体可获得的GDNF受体数量。这种组合物可以与GDNF传递联用。亦考虑GDNFR蛋白产物可以用于治疗对c-ret受体酪氨酸激酶应答的疾病。
在本发明的再一方面,所述新组合物的另一优点是使用GDNFR稳定GDNF蛋白药用组合物。在本发明的另一方面,可以使用GDNFR筛选拮抗剂活性化合物。
本发明的其它方面和优点对本领域技术人员是显而易见的。例如,其它的用途包括新检测系统、转基因动物和抗体生产。研究模型
本发明提供检测系统,其中由接触肽或非肽化合物引起的GDNF活性或类似GDNF活性的活性,可以通过测定在表达本发明GDNFR分子的细胞或细胞系中引出的生理反应而检测。生理反应可以包含GDNF的任何生物学效应,包括(但不限于)多巴胺摄入、轴突伸展、细胞生存或生长增强、以及某些核酸序列(例如启动子/增强子元件以及结构基因)的转录激活、GDNF相关加工、转译、或磷酸化和诱导对由GDNF直接或间接诱导的过程应答的二级过程,仅提及了几个。
例如,可以创造模型系统,它可以用于研究过量GDNF活性的作用。在这种系统中,通过工程改造使该模型系统细胞上的GDNFR数量相对于未进行这种修饰的细胞增加,增强细胞对GDNF的应答。亦可以开发系统,以选择性地提供正常表达GDNFR的细胞上增加量的GDNFR。为确保表达GDNFR,该GDNFR基因可以置于适当的启动子序列的控制之下。可能需要将该GDNFR基因置于组成型和/或组织特异性启动子(包括但不限于CNS神经元特异性烯醇化酶、神经微丝和酪氨酸羟化酶启动子)、诱导型启动子(例如金属硫蛋白启动子)、人免疫缺陷病毒长末端重复区的UV激活启动子(Valeri等,1988,Nature333:78-81)、或CMV启动子(亦包含于pCMX,见下述)或发育调节启动子的控制之下。
通过增加细胞GDNFR的数量,可以增强对内源GDNF的应答。如果该模型系统几乎不含或不含GDNF,可以将GDNF加入该系统。亦可能需要向该模型系统加入额外的GDNF,以评价过量GDNF活性的效果。过度表达GDNF(或分泌GDNF)可以是研究在已经表达GDNFR的细胞上GDNF较高水平影响的方法。GDNFR疗法
在另一方面中,某些疾病可以从GDNF应答性增强中获益。因此,增加患对GDNF疗法应答疾病的病人中GDNFR数量或GDNFR的结合亲和性可能是有益的。这可以通过基因治疗达到,藉此达到在适当的细胞中选择性表达重组GDNFR,例如,通过使用由组织特异性或诱导型启动子控制的GDNFR基因或通过用携带重组GDNFR基因的复制缺陷型病毒产生局部感染。
预计将从GDNFR或联合GDNF/GDNFR传递获益的疾病包括(但不限于)包括肌萎缩性侧索硬化的运动神经元疾病、糖尿病相关神经病、帕金森病、早老性痴呆和亨廷顿舞蹈病。其它适于GDNFR或联合GDNF/GDNFR传递用途的疾病以上已描述并另外包括以下疾病的治疗:青光眼或涉及视网膜神经节细胞变性的其它疾病和紊乱;由感觉神经元损伤、受危害或变性引起的感觉神经病;病理性疾病,例如遗传性视网膜变性和与年龄、疾病或损伤相关的视网膜病,其中发生感光体变性并导致失明;诸如为防止和/或治疗因各种原因引起的听力丧失的毛细胞和听觉神经元的内耳感觉细胞的损伤或变性。转基因动物
在另一方面,可以用重组GDNFR基因失活或“剔除”该内源基因(例如通过同源重组),并因此创造出GDNFR缺陷细胞、组织或动物。例如,可以工程改造重组GDNFR基因使含有使GDNFR失活的插入突变。这种在适当启动子控制下的构建物可以通过任何常规技术(包括转染、转导、注射等等)导入细胞,例如胚胎性干细胞。可以通过例如G418抗性选择含有该构建物的细胞。然后鉴别缺少完整GDNFR基因的细胞(例如通过Southern印迹法或Northem印迹法或表达检测)。然后将缺少完整GDNFR基因的细胞与早期胚胎细胞融合,以产生GDNFR缺陷的转基因动物。将这种动物与不表达内源GDNF的动物比较将显示或者这二种表型完全匹配或者它们不匹配,暗示其它GDNF样因子或受体的存在。可以用这种动物定义特定神经元群体或通常依赖GDNF的其它体内过程。因此,如果该动物不表达GDNFR并因此不能对GDNF应答,预期这些群体或过程会受影响。诊断应用
按照本发明,可以用GDNFR探针鉴别在正常或疾病状态下对GDNF应答的细胞和组织。本发明提供通过检测这种细胞中的GDNFR鉴别对GDNF应答的细胞的方法。可以通过GDNFR mRNA转录或产生GDNFR蛋白证实GDNFR表达。用鉴别GDNFR核酸或蛋白的探针检测或通过检测人工加入该GDNFR蛋白的“标记”序列检测GDNFR表达。
一种可以用于检测GDNFR表达的探针是核酸探针,它可以通过本领域已知的任何方法(包括但不限于原位杂交、Northern印迹分析或PCR相关技术)用来检测GDNFR编码RNA。本发明的核酸产物可以用可检测标记物(例如放射性标记和例如生物素的非同位素标记)标记并用于杂交过程,以在染色体图谱中确定该人GDNFR基因的位置和/或任何相关基因家族的位置。它们亦可用于鉴别DNA水平上的人GDNFR基因疾病并做为鉴别相邻基因及其疾病的基因标记使用。本文亦考虑含有这种标记材料的药盒。
本发明的多肽产物可以通过与可检测标记物或标记(例如放射性同位素、荧光或化学发光化学药品、酶或其它对本领域技术人员可得到的标记)结合,而提供可以用于在固体组织和诸如血液或尿液的流体样品中GDNF的检测和定量的试剂。这种产物亦可用于检测在正常或疾病状态下对GDNF应答的细胞和组织。
另一可能用于检测测试样品中GDNF的存在或筛选GDNF样分子的存在的检测法,涉及使该测试样品接触固定化于固相的GDNFR肽,因而产生GDNFR结合的GDNF。该GDNFR结合的GDNF可以可选地接触检测试剂,例如GDNF特异性标记抗体,从而形成一个可检测的产物。这种检测法可以以分析测试样品的检测仪器的形式开发。在基本形式下,这种仪器包括含有或包被GDNFR的固相。分析测试样品中GDNF存在的方法涉及将该样品接触包含GDNFR蛋白的检测试剂,其中所述GDNFR蛋白与存在于该测试样品中的GDNF反应并产生表明GDNF存在的可检测反应产物。
本文提供的检测试剂亦可做为药盒或生产的商品的部分体现。考虑一包含包装材料和一种或多种本文提供的核酸序列或氨基酸序列的制备物的生产商品。这种包装材料将包含表明该制备物可以用于检测生物学样品中GDNF、GDNFR或GDNFR缺陷的标签。照这样,该药盒可以可选地包括进行这种测试的材料,例如用于进行血液、尿液或组织样品中蛋白分析、DNA或RNA杂交分析或PCR分析的试剂。抗GDNFR抗体
按照本发明,GDNFR蛋白或其片段或其衍生物可以做为产生抗GDNFR抗体的免疫原使用。为进一步增加产生抗GDNFR免疫应答的可能性,可以分析GDNFR的氨基酸序列,以鉴别可能与增强的免疫原性相关的分子部分。例如,可以对该氨基酸序列进行计算机分析,以鉴别代表计算机产生的GDNFR的亲水性、表面概率、挠性、抗原指数、两亲螺旋、两亲片层和二级结构的表面表位。或者,可以比较来自不同物种的GDNFR的氨基酸序列并鉴别相对非同源区;这些非同源区更有可能在各种物种之间是免疫原性的。
亦包括仅复制GDNFR内连续氨基酸序列或二级构象的一部分的多肽片段,所述片段可以具有哺乳动物GDNFR的一种活性(例如免疫学活性)而不具有其它活性(例如GDNF蛋白结合活性)。因此,抗体的生产可以包括抗肽抗体的生产。以下是用GDNFR序列合成的典型的肽:
表1
GDNFR肽SJP-6 H2N-QSCSTKYRTL-COOH 人GDNFR,AA 40-49(SEQ IDNO:25)SJP-7 H2N-CKRGMKKEKN-COOH 人GDNFR,AA 89-98(SEQ IDNO:26)SJP-8 H2N-LLEDSPYEPV-COOH 人GDNFR,AA 115-124(SEQID NO:27)SJP-9 H2N-CSYEERERPN-COOH 大鼠GDNFR,AA 233-242(SEQ ID NO:28)SJP-10H2N-PAPPVQTTTATTTT-COOH大鼠GDNFR,AA 356-369(SEQ ID NO:29)
肽SJP-6、7和8在大鼠和人GDNFR中是相同的。肽SJP-9和10得自该大鼠序列,每种都有一个氨基酸与人不同。使用这些肽或GDNFR的其它部分,通过本领域已知方法可以制备多克隆抗体和单克隆抗体。
抗GDNFR的单克隆抗体可以通过任何已知的通过培养中的连续细胞系生产抗体分子的技术制备。例如,可以使用首先由Kohler和Milstein发展的产生单克隆抗体的技术(Nature,256:495-497,1975)、以及trioma技术、人B细胞杂交瘤技术(Kozbor等,Immunology Today4:72,1983)、EBV杂交瘤技术(Cole等,载于“单克隆抗体和癌症治疗(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy)”,Alan R.Liss,Inc.第77-96页,1985)等等。
人单克隆抗体或嵌合人-鼠(或其它物种)单克隆抗体亦可以制备用于治疗用途,并通过本领域已知的众多技术的任何技术制备(例如Teng等,Proc.Natl Acad.Sci.U.S.A.,80:7308-7312,1983;Kozbor等,Immunology Today,4:72-79,1983;Olsson等,Meth.Enzymol.,92:3-16,1982)。可以制备含有小鼠抗原结合域与人恒定区的嵌合抗体分子(Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.SA.,81:6851,1984;Takeda等,Nature,314:452,1985)。
亦可以用本领域已知的各种方法生产多克隆抗体。为生产抗体,可以通过注射GDNFR蛋白或其片段或其衍生物免疫各种宿主动物,该宿主动物包括(但不限于)兔子、小鼠、大鼠等。根据选择的宿主物种,可以使用各种佐剂增强该免疫应答。有用的佐剂包括(但不限于)弗氏(完全和不完全)佐剂、例如氢氧化铝的无机凝胶、表面活性物质例如溶血卵磷脂、pluronic多元醇、聚阴离子、肽、油乳液、钥孔_血蓝蛋白、二硝基苯酚和人类佐剂,例如BCG(卡介菌)和粉刺丙酸菌。
亦可以通过已知技术制备GDNFR表位的抗体的分子克隆。可以用重组DNA技术(参见例如Maniatis等,分子克隆,实验室手册,冷泉港实验室,冷泉港,纽约,1982)构建编码单克隆抗体分子或其抗原结合区的核酸序列。
抗体分子可以通过已知方法纯化,例如免疫吸附或免疫亲和层析,诸如高压液相色谱的层析方法或其组合。本发明提供抗体分子以及这种抗体分子的片段。可以通过已知方法制备含有该分子个体基因型的抗体片段。例如,这种片段包括(但不限于):通过胃蛋白酶消化该抗体分子产生的F(ab’)2片段;通过还原该F(ab’)2片段的二硫桥产生的Fab’片段和通过用木瓜蛋白酶和还原剂处理该抗体分子产生的Fab片段。
这种选择性结合分子本身可以做为GDNFR蛋白的替换物,并可以配制成药用组合物。GDNFR蛋白的重组表达
本发明提供编码GDNFR蛋白的各种多核苷酸。该表达产物或其衍生物的特征在于这样一种能力:与GDNF特异性地并高亲和性地结合,以便可以发生与信号发生分子的进一步的相互作用,由此提供或增强诸如增加多巴胺能细胞的多巴胺摄入的GDNF活性。所述多核苷酸亦可以用于细胞治疗或基因治疗应用中。
按照本发明,提供新GDNFR蛋白和编码这种受体的全部或部分的DNA序列。本发明的新核酸序列包括用于在原核或真核宿主细胞中保证表达具有重组人GDNFR的至少一部分一级结构构象和一种或多种生物学性质的多肽产物的序列。可以纯化和分离所述核酸,使得所需编码区可以用于产生本多肽。或者,该核酸可以用于诊断目的,如以下更全面叙述的。本发明的典型DNA序列包含编码图2和4描述并由SEQ ID NO:2和4陈述的GDNFR氨基酸序列的核酸序列。另外,本发明公开的DNA序列具体包含:(a)任何在图1和图3中描述的DNA序列(和互补链);(b)与(a)小节中的DNA序列或其片段杂交(在以下的cDNA文库筛选一节中公开的杂交条件下,或相当的条件或更严格的条件)的DNA序列;和(c)如果不是因为遗传密码的简并性就将会与(a)小节中的DNA序列杂交的DNA序列。(b)和(c)具体地包括编码人GDNFR等位基因变异体形式和/或编码来自其它哺乳动物物种的GDNFR的基因组DNA序列、和编码GDNFR、GENFR片段和GDNFR类似物的制造DNA序列,所述序列可以加入在微生物宿主中促进信使RNA转录和转译的密码子。这种制造序列可以按照本领域已知的方法以及本文描述的方法容易地构建。
可以用按照本文的描述或其它已知方法进行的重组表达技术产生这些多核苷酸并表达所述各种GDNFR蛋白。例如,通过将编码GDNFR蛋白的核酸序列插入适当的载体,本领域技术人员可以容易地生产大量的所需核酸序列。然后可以用所述序列产生检测探针或扩增引物。或者,可以将编码GDNFR蛋白的多核苷酸插入表达载体。通过将该表达载体导入适当宿主,可以大量产生所需GDNFR蛋白。
如本文进一步所述,有许多可以用于增殖核酸序列和/或生产GDNFR蛋白的宿主/载体系统。这些包括(但不限于)质粒、病毒和插入载体、和原核和真核宿主。本领域技术人员可以改造能增殖或表达异源DNA的宿主/载体系统,以生产或表达本发明的序列。
通过这种重组技术,可以容易地生产商业数量且较高纯度的本发明的GDNFR蛋白。另外,本领域技术人员将会理解,鉴于本说明书,所述新核酸序列包括编码附图中具体陈述的GDNFR蛋白的简并核酸序列、编码GDNFR蛋白变异体的序列、和那些最好是在严格杂交条件下与这些核酸序列的互补物杂交核酸序列(参见例如Maniatis等,分子克隆(实验室手册);冷泉港实验室,第387-389页,1982)。典型的严格杂交条件是于62-67℃在4×SSC中杂交,接着于62-67℃在0.1×SSC中清洗约1小时。或者,典型的严格杂交条件是于40-45℃在45-55%甲酰胺、4×SSC中杂交。本文亦包括在松弛的条件下与GDNFR蛋白的互补序列杂交并编码本发明的GDNFR蛋白的DNA序列。这种松弛的严格杂交条件的例子是于45-55℃4×SSC或于40-45℃用30-40%甲酰胺杂交。制备编码GDNFR的多核苷酸
根据本发明的说明书,通过各种方法,包括(但无限制性)化学合成、cDNA或基因组文库筛选、表达文库筛选和/或cDNA的PCR扩增,可以容易地制备或获得编码全长GDNFR多肽或其片段的核酸序列。这些方法和其它用于制备核酸序列的方法均为本领域已知并已由例如Sambrook等(分子克隆:实验室手册,冷泉港实验室出版社,冷泉港,纽约,1989)、Ausubel等编辑(分子生物学现行方法,CurrentProtocols Press,1994)和Berger和Kimmel(酶学方法:分子克隆技术指南,第152卷,Academic Press,Inc.,San Diego,CA,1987)陈述。优选的GDNFR编码核酸序列是哺乳动物序列。
亦可以用本领域已知方法,例如Engels等陈述的方法(Angew.Chem.Intl Ed.,28:716-734,1989),完成编码GDNFR蛋白的核酸序列的化学合成。这些方法特别包括核酸序列合成的磷酸三酯、phosphoramidite和H-膦酸酯法。优选的这种化学合成方法是用标准phosphoramidite化学的聚合物支持合成。通常,编码目的多肽的DNA的长度是数百碱基对(bp)或核苷酸。用这些方法可以以几个片段合成超过100个核苷酸的核酸序列。然后可以将所述片段连接在一起,形成表达全长GDNFR多肽或其部分的序列。
或者,通过筛选适当的cDNA文库(即从据信表达该蛋白的一种或多种组织源制备的文库)或基因组文库(从总基因组DNA制备的文库)可以得到适当的核酸序列。该cDNA文库源通常是据信以合理数量表达GDNFR的组织。该基因组文库源通常是从据信包含GDNFR编码基因的哺乳动物物种的任何一种或多种组织。可以用一种或多种选择性地与该文库中存在的GDNFR cDNA或基因杂交的一种或多种核酸探针(例如基于本说明书序列的寡核苷酸、cDNA或基因组DNA),筛选该文库中该GDNFR cDNA/基因的存在。通常用于这种文库筛选的探针一般编码与制备该文库的物种相同或类似物种GDNFR核酸序列的一小区。或者,所述探针可以是简并的,如本文所讨论的。
通常通过将该寡核苷酸探针或cDNA在严格条件下退火至该文库中的克隆完成文库筛选,该条件防止非特异性结合,但允许与该探针或引物有显著水平同源性的那些克隆的结合(杂交)。典型的杂交和清洗严格条件部分地取决于该cDNA或寡核苷酸探针的大小(即核苷酸长度数目)以及该探针是否是简并的。在设计该杂交溶液时亦考虑了得到克隆的可能性(例如被筛选的是cDNA文库还是基因组文库;如果是cDNA文库,目的cDNA存在的可能性处于较高水平)。
当使用DNA片段做为探针时,典型的杂交条件包括那些在Ausubel等编辑(见上述)中所陈述的。杂交后,将含有该文库的印迹在适当严格条件下清洗,该适当严格条件取决于几个因素,例如探针大小、探针与克隆的预期同源性、被筛选文库的类型、被筛选克隆的数量等等。严格清洗溶液(一般离子强度低并且使用于相对高温)的例子如下述。一种这种严格清洗是于55-65℃的0.015M NaCl、0.005M柠檬酸钠和0.1%SDS。另一这种严格缓冲液是于约40-50℃的1mMNa2EDTA、40mM NaHPO4,pH7.2和1%SDS。另一严格清洗是于约50-65℃的0.2×SSC和0.1%SDS。
亦有用寡核苷酸探针筛选cDNA或基因组文库的严格清洗条件的典型方法。例如,第一种方法使用含有0.05%焦磷酸钠的6×SSC,温度为约35-62℃,取决于该探针的长度。例如,14个碱基的探针于35-40℃清洗,17个碱基的探针于45-50℃清洗,20个碱基的探针于52-57℃、23个碱基的探针于57-63℃清洗。当本底非特异性结合看起来高时,可将温度升高2-3℃。第二个方法使用氯化四甲铵进行(TMAC)清洗。一个这种严格清洗溶液是3M TMAC、50mM Tris-HCl,pH 8.0和0.2%SDS。
另一得到编码GDNFR蛋白的核酸序列的适当方法是聚合酶链式反应(PCR)。在该方法中,从表达GDNFR的组织提取多聚(A)+RNA或总RNA。然后使用逆转录酶从该RNA制备cDNA(即RC-PCR)。然后将通常与GDNFR cDNA的两个独立区互补的两个引物(寡核苷酸)与诸如Taq聚合酶的聚合酶一起加入该cDNA,该聚合酶扩增在这两个引物之间的cDNA区。
如果选择制备编码目的GDNFR蛋白的核酸序列的方法需要使用寡核苷酸引物或探针(例如PCR、cDNA或基因组文库筛选),则选择做为探针或引物的寡核苷酸序列必须具有足够的长度并且充分明确,以将在文库筛选或PCR扩增中发生的非特异性结合量降至最低。所述探针或引物的实际序列通常基于来自另一生物体的相同或类似基因的保守或高度同源序列,例如本发明涉及的大鼠核酸序列。所述探针或引物可选地可以完全或部分简并,即含有探针/引物的混合物,它们都编码同一氨基酸序列,但却使用不同的密码子。制备简并探针的替代方法是将一个肌苷置于一些或所有那些根据物种变化的密码子位置。可以按上述通过DNA化学合成方法制备所述寡核苷酸探针或引物。
本发明的范围亦考虑了基于编码GDNFR的这些核酸序列及其突变体或变异体序列的GDNFR蛋白。突变体或变异体序列包括那些与野生型序列相比含有一个或多个核苷酸置换、缺失和/或插入并导致与野生型氨基酸序列相比表达氨基酸序列变异的序列。在某些情况下,因为天然等位基因变异的存在,可能存在自然发生的GDNFR氨基酸突变体或变异体。基于这种自然发生的突变体或变异体的GDNFR蛋白亦属于本发明范围。合成突变体序列的制备亦为本领域所熟知,并描述于例如Wells等(Gene,34:315,1985)和Sambrook等(见上述)。
在某些情况下,可能希望制备自然发生GDNFR的核酸和/或氨基酸变异体。核酸变异体(其中设计使一个或多个核苷酸不同于野生型或自然发生GDNFR)可以使用其引物具有目的点突变的定点诱变或PCR扩增制备(有关诱变技术的描述,参见Sambrook等,见上述和Ausubel等,见上述)。使用Engels等描述的方法(见上述)的化学合成亦可以用于制备这种变异体。亦可以使用本领域技术人员已知的其它方法。优选的核酸变异体是那些含有在用于重组产生GDNFR的宿主细胞中构成密码子优先的核苷酸置换的变异体。其它优选的变异体是那些与野生型相比编码保守氨基酸变化(例如其中自然发生的氨基酸侧链的电荷或极性基本上未被不同氨基酸置换改变)的变异体,和/或那些设计使其或者在GDNFR上产生新糖基化位点和/或磷酸化位点的变异体、或那些设计以在GDNFR上缺失一已有的糖基化位点和/或磷酸化位点的变异体。载体
将编码目的GDNFR蛋白的cDNA或基因组DNA插入一个载体,以进一步克隆(扩增该DNA)或表达。适当的载体已有市售或可以具体构建该载体。可能的载体包括(但不限于)粘粒、质粒或修饰病毒,但该载体系统必须与选择的宿主细胞匹配。这种载体包括(但不限于)诸如λ衍生物的噬菌体、或诸如pBR322、pUC或Bluescript_质粒衍生物(Stratagene,La Jolla CA)的质粒。可以通过转化、转染、感染、电穿孔或其它已知技术将所述重组分子导入宿主细胞。
例如,将所述GDNFR编码核酸序列插入克隆载体,该载体用于转化、转染或感染适当的宿主细胞以产生许多拷贝的该核酸序列。这可以通过将DNA片段连接入具有互补粘性末端的克隆载体而完成。如果用于片段化该DNA的互补限制位点不存在于该克隆载体,可以对所述DNA分子的末端进行酶法修饰。亦可证明将限制性内切酶酶切位点加入用于聚合酶链式反应的寡核苷酸引物中,以促进将得到的核酸序列插入载体中的优越性。或者,通过将核苷酸序列(接头)连接至该DNA末端可以产生任何需要的位点;这些连接的接头可以包含编码限制性内切酶识别序列的特定化学合成寡核苷酸。在一替代方法中,可以通过同源聚合加尾修饰该酶切的载体和GDNFR编码核酸序列。在具体的实施方案中,用加入分离GDNFR基因、cDNA或合成DNA序列的重组DNA分子转化宿主细胞使得能够产生多拷贝的该基因。由此,通过生长转化体、从所述转化体分离所述重组DNA分子并在需要时从该分离的重组DNA回收该插入基因,可以大量地得到该GDNFR编码核酸序列。
该适当载体的选择或构建将取决于1)它将用于DNA扩增还是DNA表达,2)欲插入该载体的DNA的大小,和3)欲用该载体转化的宿主细胞(例如哺乳动物、昆虫、酵母、真菌、植物或细菌细胞)。每个载体根据其功能(DNA扩张或DNA表达)和它与预期宿主细胞的相容性含有各种组分。对于DNA表达,所述载体组分可以包括(但不限于)下述一种或多种:信号序列、复制起点、一个或多个选择或标记基因、增强子元件、启动子、转录终止序列等等。这些组分可以通过已知方法从天然来源得到或合成。本发明的载体涉及编码目的GDNFR蛋白的核酸序列,该序列可操作地连接至一个或多个扩增、表达控制、调节或能够在选择的宿主细胞中指导、控制或者实现该GDNFR编码核酸序列的扩增或表达的类似操作元件。
含有GDNFR核酸序列插入物的表述载体可以通过三个常规方法鉴别:(a)DNA-DNA杂交;(b)“标记”基因功能的存在或缺乏和(c)插入序列的表达。在第一种方法中,可以通过使用包含与插入的GDNFR编码核酸序列同源的序列的探针的DNA-DNA杂交,检测插入表达载体中的外源核酸序列的存在。在第二个方法中,可以根据由外源核酸序列插入该载体引起的某些“标记”基因功能(例如胸苷激酶活性、对抗生素抗性、转化表型、杆状病毒中闭合体(occlusion body)的形成等)的存在或缺失,鉴定和选择该重组载体/宿主系统。例如,如果将GDNFR编码核酸序列插入该载体的该标记基因序列,则可以通过该标记基因功能的丧失鉴定含有该GDNFR插入物的重组体。在第三个方法中,重组表达载体可以通过检测由该重组核酸序列表达的外源蛋白产物鉴定。这种检测可以基于该表达的GDNFR蛋白产物的物理性质或功能性质,例如通过该GDNFR蛋白与GDNF结合或与直接识别GDNFR的抗体结合。信号序列
信号序列可以是该载体的一个组分,或是插入该载体的GDNFRDNA的部分。天然GDNFR DNA编码一个位于该蛋白氨基末端的信号序列,该序列在该蛋白的转译后加工时被切割以形成成熟GDNFR蛋白。本发明范围包括具有该天然信号序列的GDNFR多核苷酸以及其中该天然信号序列缺失并用异源信号序列取代的GDNFR多核苷酸。该选择的异源信号序列应是由该宿主细胞识别和加工(即被信号肽酶酶切)的信号序列。对于不能识别和加工该天然GDNFR信号序列的原核宿主细胞,该信号序列被选自例如碱性磷酸酶、青霉素酶或热稳定肠毒素Ⅱ前导序列的原核信号序列置换。对于酵母分泌,该天然GDNFR信号序列可以被酵母转化酶、α因子或酸性磷酸酶前导序列置换。在哺乳动物细胞表达中,该天然信号序列是满意的,尽管其它哺乳动物信号序列可能是适当的。复制起点
表达载体和克隆载体一般包括一使该载体能够在一种或多种选择的宿主细胞中复制的核酸序列。在克隆载体中,该序列通常是使得该载体独立于宿主染色体DNA复制的序列并包括复制起点或自主复制序列。各种细菌、酵母和病毒的这种序列是众所周知的。来自质粒pBR322的复制起点适于大多数革兰氏阴性细菌,各种起点(例如SV40、多形瘤、腺病毒、VSV或BPV)可以用于哺乳动物细胞中的克隆载体。一般而言,哺乳动物表达载体不需要复制起点组分(例如经常使用SV40起点仅仅是因为它含有早期启动子)。选择基因
表达载体和克隆载体可以含有选择基因。该基因编码一个“标记”蛋白,该蛋白对所述转化细胞在选择性培养基中生存或生长是必需的。未用该载体转化的宿主细胞将不含有该选择基因,因此在该培养基中不能生存。典型的选择基因编码下述蛋白,所述蛋白(a)赋予对抗生素或其它毒素(例如氨苄青霉素、新霉素、氨甲蝶呤或四环素)的抗性;(b)互补营养缺陷;或(c)提供不能从该培养基中得到的关键营养。
其它选择基因可以用于扩增将要表达的基因。扩增是一过程,其中极度需要的用于产生对生长关键的蛋白的基因在重组细胞连续世代的染色体中串联重复。适于哺乳动物细胞的选择标记的例子包括二氢叶酸还原酶(DHFR)和胸苷激酶。将哺乳动物细胞转化体置于选择压力下,只有转化体由于载体中该标记的存在而独一无二地适应该压力而生存。通过将该转化体细胞在培养基中选择试剂的浓度持续改变的条件下培养而施加选择压力,由此导致该选择基因和编码GDNFR的DNA都扩增。结果,从该扩增DNA合成了较高量的GDNFR。
例如,首先通过将所有的转化体在含有氨甲蝶呤(DHFR的竞争性拮抗剂)的培养基中培养,鉴定用该DHFR选择基因转化的细胞。使用野生型DHFR时,适当宿主细胞是DHFR活性缺陷的中国仓鼠卵巢细胞系(参见例如Urlaub和Chasin,Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.,77(7):4216-4220,1980)。然后将该转化细胞暴露给提高水平的氨甲蝶呤。这导致合成多拷贝的DHFR基因,并同时合成该表达载体中多拷贝存在的其它DNA,例如编码GDNFR蛋白的DNA。启动子
本发明的表达载体和克隆载体将通常含有宿主生物体识别并可操作地连接至编码该GDNFR蛋白的核酸序列的启动子。启动子为位于结构基因起始密码子上游(5’)(一般在100-1000bp之内)的、控制诸如编码GDNFR的特定核酸序列的转录和转译的非转译序列。一般将启动子划归二类中的一类,即诱导型启动子和组成型启动子。诱导型启动子在对培养条件中的某些变化(例如营养的存在或缺失或温度变化)响应时,启动在其控制下的DNA的转录水平增加。由各种潜在宿主细胞识别的大量启动子是众所周知的。通过限制性酶消化将启动子从源DNA取出并将目的启动子序列插入该载体,将这些启动子可操作地连接至编码GDNFR的DNA。可以用天然GDNFR启动子序列指导GDNFR DNA的扩增和/或表达。然而,如果异源启动子比该天然启动子提供更多的转录和该表达蛋白的更高产量,并且如果它与选择使用的宿主细胞系统匹配,则最好是该异源启动子。
适用于原核宿主细胞的启动子包括β内酰胺酶和乳糖启动子系统;碱性磷酸酶,色氨酸(trp)启动子系统;和杂种启动子例如tac启动子。其它已知的细菌启动子亦适用。它们的核苷酸序列已公开,因此使本领域技术人员能够使用需要用于提供需要限制位点的接头或连接物,将它们连接至目的DNA序列。
适用于酵母宿主的启动序列亦是本领域众所周知的。酵母增强子最好与酵母启动子一同使用。适用于哺乳动物宿主细胞的启动子是众所周知,包括从诸如多形瘤病毒、鸟痘病毒、腺病毒(例如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒和最优选的猿猴病毒40(SV40)的病毒基因组得到的那些启动子。其它适用的哺乳动物启动子包括异源哺乳动物启动子,例如热休克启动子和肌动蛋白启动子。可能用于CHO细胞中GDNFR蛋白生产的启动子是SRa(参见Takebe等,Mol.Cell.Biol.,8(1):466-472,1988)。适合的表达载体是pDSRa2。含有适当GDNFR cDNA的pDSRa2质粒构建物可以基本按照在共同拥有和共同未决的于1990年3月29日申请的美国专利申请序号50l,904(亦可参见于1990年5月18日申请的欧洲专利申请90305433号、公告号EP398753和WO90/14363(1990))(其说明书通过引用结合到本文中)中描述的方法制备。
可能有意用于控制GDNFR表达的其它启动子包括(但不限于):SV40早期启动子区(Bernoist和Chambon,Nature,290:304-310,1981);CMV启动子;劳斯肉瘤病毒3’长末端重复内含的启动子(Yamamoto等,Cell,22:787-797,1980);疱疹胸苷激酶启动子(Wagner等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,78:144-1445,1981);金属硫蛋白基因的调节序列(Brinster等,Nature,296:39-42,1982);诸如β内酰胺酶启动子的原核表达载体(Villa-Kamaroff等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,75:3727-3731,1978);或tac启动子(DeBoer等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,80:21-25,1983)。亦有兴趣的是下列动物转录控制区,它们表现出组织特异性并已用于转基因动物中:在胰脏腺泡细胞中有活性的弹性蛋白酶Ⅰ基因控制区(Swift等,Cell,38:639-646,1984;Ornitz等,Cold Spring HarborSymp.Quant.Biol.50:399-409,1986;MacDonald,Hepatology,7:425-515,1987);在胰脏β细胞中有活性的胰岛素基因控制区(Hanahan,Nature,315:115-122,1985);在淋巴细胞中有活性的免疫球蛋白基因控制区(Grosschedl等,Cell,38:647-658,1984;Adames等,Nature,318:533-538,1985;Alexander等,Mol.Cell.Biol.,7:1436-1444,1987);在睾丸细胞、乳腺细胞、淋巴细胞和肥大细胞中有活性的小鼠乳房肿瘤病毒控制区(Leder等,Cell,45:485-495,1986),在肝脏中有活性的白蛋白基因控制区(Pinkert等,Genes and Devel.,1:268-276,1987);在肝脏中有活性的甲胎蛋白基因控制区(Krumlauf等,Mol.Cell.Biol.,5:1639-1648,1985;Hammer等,Science,235:53-58,1987);在肝脏中有活性的α1抗胰蛋白酶基因控制区(Kelsey等,Gene and Devel.,1:161-171,1987);在骨髓细胞中有活性的β珠蛋白基因控制区(Mogram等,Nature,315:338-340,1985;Kollias等,Cell,46:89-94,1986);在大脑少突神经胶质细胞中有活性的髓磷脂碱性蛋白基因控制区(Readhead等,Cell,48:703-712,1987);在骨骼肌中有活性的肌球蛋白轻链-2基因控制区(Saai,Nature,314:283-286,1985);和在下丘脑中有活性的促性腺释放激素基因控制区(Mason等,Science,234:1372-1378,1986)。增强子元件
可以将增强子序列插入该载体,以增加高等真核细胞编码本发明GDNFR蛋白的DNA序列的转录。增强子是DNA的顺式作用元件,其长度通常为10-300bp,并作用于启动子以增强其转录。增强子相对地与定向和位置无关。已发现它们在转录单位的5’和3’。已知可得自哺乳动物基因的几个增强子序列(例如珠蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰岛素)。然而,通常使用来自病毒的增强子。SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、多形瘤增强子和腺病毒增强子是典型的激活真核启动子的增强元件。虽然增强子可以剪接入载体的GDNFR DNA的5’或3’位置,但它通常位于该启动子的5’位点。转录终止
用于真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人、或来自其它多细胞生物体的具核细胞)的表达载体亦含有终止转录和稳定mRNA的必需序列。这种序列通常得自真核DNA或cDNA的5’和有时3’非转译区。这些区含有做为该编码GDNFR的mRNA的非转译部分中的多聚腺苷酸片段转录的核苷酸区段。
通过标准连接技术完成含有一个或多个上述组分及目的GDNFR编码序列的合适载体的构建。将分离的质粒或DNA片段酶切、加工并以所需顺序再连接产生所需的质粒。为确认已构建正确序列,可以用连接混合物转化大肠杆菌,并用已知技术(例如上述氨苄青霉素或四环素抗性)选择成功的转化体。然后可以制备来自所述转化体的质粒,用限制性内切酶消化分析和/或测序以确认目的构建物的存在。
亦可以使用提供在哺乳动物细胞中编码GDNFR的DNA的瞬时表达的载体。一般而言,瞬时表达涉及使用能在宿主细胞中有效复制的表达载体,使得该宿主细胞累积许多拷贝的该表达载体,由此合成高水平的由该表达载体编码的目的蛋白。包含适当表达载体和宿主细胞的瞬时表达系统允许方便地阳性鉴别由克隆DNA编码的蛋白以及快速筛选这种蛋白的所需生物学或生理学性质。因此,瞬时表达系统在鉴别该蛋白的变异体中特别有用。宿主细胞的选择和转化
本发明亦提供用用于表达重组GDNFR蛋白的核酸序列转化的宿主细胞(例如细菌、哺乳动物、昆虫、酵母或植物细胞)。将该转化宿主细胞在允许该核酸序列表达的适当条件下培养。适当宿主细胞的选择和转化、培养、扩增、筛选和产物生产和纯化的方法在本领域是众所周知的。参见例如Gething和Sambrook,Nature,293:620-625(1981),或者参见Kaufman等,Mol.Cell.Biol.,5(7):1750-1759(1985)或Howley等,美国专利4,419,446号。本文讨论了其它典型材料和方法。将转化宿主细胞培养于适当培养基中,然后用本领域技术人员已知的适当手段将表达的GDNFR蛋白从该培养基中(或如果是胞内表达,则从细胞)可选地回收、分离和纯化。
不同的宿主细胞对于蛋白的转译和转译后加工和修饰(例如糖基化、酶切)具有特征性的和特定的机制。可以选择适当的细胞系或宿主系统以确保表达的外源蛋白的所需修饰和加工。例如,可以使用在细菌系统中表达以产生非糖基化核心蛋白产物。可以使用在酵母中表达以产生糖基化产物。可以使用在哺乳动物细胞中表达以确保该异源GDNFR蛋白的“天然”糖基化。另外,不同的载体/宿主表达系统可以实现诸如不同程度的蛋白水解切割的加工反应。
本文公开的适用于克隆载体或表达载体的宿主细胞是原核生物细胞、酵母或高等真核生物的细胞。真核微生物例如丝状真菌或酵母可能是GDNFR蛋白表达的合适宿主。酿酒酵母或普通面包酵母是低等真核宿主微生物中最常用的,但许多其它属、种和菌株是众所周知并可以得到的。
亦从多细胞生物体得到用于表达糖基化GDNFR蛋白的宿主细胞。这种宿主细胞具有复杂加工和糖基化活性的能力。原则上可以使用任何高等真核细胞培养物,不管这种培养物涉及脊椎动物还是无脊椎动物细胞,包括植物和昆虫细胞。在培养中增殖脊椎动物细胞(组织培养)是众所周知的方法。有用的哺乳动物宿主细胞系的例子包括(但不限于)用SV40转化的猴肾CV1系(COS7)、人胚性肾系(293细胞或为在悬浮培养中生长而亚克隆的293细胞)、幼龄仓鼠肾细胞和中国仓鼠卵巢细胞。其它合适的哺乳动物细胞系包括(但不限于)HeLa、小鼠L-929细胞、得自Swiss、Balb-c或NIH小鼠的3T3系、BHK或HaK仓鼠细胞系。
合适的宿主细胞亦包括原核细胞。原核宿主细胞包括(但不限于)诸如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物的细菌细胞(例如大肠杆菌)、诸如枯草杆菌的杆菌、诸如绿脓假单胞菌的假单胞菌属种、鼠伤寒沙门菌或粘质沙雷菌。例如,大肠杆菌的各种菌株(例如HB101、DH5a、DH10和MC1061)在生物技术领域中做为宿主细胞是众所周知的。亦可以采用链霉菌属菌种的各种菌株等等。目前优选的产生GDNFR蛋白的宿主细胞是细菌细胞(例如大肠杆菌)和哺乳动物细胞(例如中国仓鼠卵巢细胞、COS细胞等)。
所述宿主细胞用上述表达载体或克隆载体转染和最好是转化,并培养于常规营养培养基中。可以适当修饰该培养基以诱导启动子、选择转化体或扩增编码所需序列的基因。使用本领域技术人员熟知的并选择适于涉及的宿主细胞的标准技术进行转染和转化。例如,对于无细胞壁的哺乳动物细胞,可以使用磷酸钙沉淀法。亦可以使用电穿孔、微注射和其它已知技术。培养所述宿主细胞
将用于生产本发明的GDNFR蛋白的转化细胞培养于适合培养基中。该培养基可以根据需要添加激素和/或其它生长因子(例如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(例如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲液(例如HEPES)、核苷(例如腺苷和胸苷)、抗生素(例如庆大霉素)、微量元素(定义为通常以最终浓度为微摩尔范围存在的无机化合物)和葡萄糖或其它能源。正如本领域技术人员理解的,亦可包括适当浓度的其它添加物。本领域技术人员亦熟知用于选择宿主细胞的合适培养条件,例如温度、pH等等。
一旦产生该GDNFR蛋白,可以通过标准方法包括层析(例如离子交换层析、亲和层析和筛分柱层析)、离心、差示溶解度或用于蛋白纯化的任何其它标准技术将其分离和纯化。特别是,可以通过将GDNFR蛋白结合至包含结合至固定支持物的GDNF或抗GDNFR抗体的亲和层析而分离。同源重组
另外预期可以通过同源重组或使用采用了导入已含有GDNFR编码DNA的细胞的控制元件的重组生产方法生产GDNFR蛋白。例如,可以使用同源重组方法修饰正常转录沉默的GDNFR基因或表达不足基因的细胞,并由此产生表达GDNFR的细胞。同源重组是一最初开发用于导向基因以在转录活性基因中诱导或纠正突变的技术(Kucherlapati,Prog.in Nucl.Acid Res.and Mol.Biol.36:301,1989)。其基本技术是做为将特定突变导入哺乳动物基因组的特定区域(Thomas等,Cell,44:419-428,1986;Thomas和Capecchi,Cell,51:503-512,1987;Doetschman等,Proc.Natl.Acad.Sci.,85:8583-8587,1988),或在缺陷基因中纠正特定突变(Doetschman等,Nature,330:576-578,1987)的方法开发的。典型的同源重组技术描述于美国专利5,272,071(EP91903051,EP公告505500号;PCT/US90/07642,国际申请WO91/09955),其说明书通过引用结合到本文中。
通过同源重组,可以将欲插入基因组的DNA序列通过与导向DNA连接而导向目的基因的特定区域。该导向DNA是与该基因组DNA的区域互补(同源)的DNA。将与该基因组的特定区域互补的导向DNA的小片段在DNA复制过程中与亲代链接触。杂交并因此通过共有同源区域与内源DNA的其它片段重新结合是已插入细胞的DNA的普遍性质。如果该互补链连接有含有突变或DNA的不同序列的寡核苷酸,则它亦由于重组而被加入该新合成的链。作为校读功能的结果,该DNA新序列可能做为模板起作用。因此,该转移DNA被整合入该基因组。
如果已知特定基因的序列(例如核酸序列),则可以合成或者例如通过于邻接目的区域的特定识别位点对天然DNA进行适当限制,得到与该基因选定区域互补的一段DNA,即本文提出的GDNFR前-原序列或表达控制序列。该片段在插入细胞时做为导向序列,并将与基因组内其同源序列杂交。如果该杂交发生于DNA复制期间,该DNA片段以及与其连接的任何其它序列将做为冈崎片段起作用,并将被倒缝入新合成DNA子链中。
连接至这些导向DNA片段的是可以与GDNFR蛋白表达相互作用的DNA区。例如,将启动子/增强子元件、抑制基因或外源转录调控元件以足以影向编码所需GDNFR蛋白的DNA转录的邻近程度和定向插入预期宿主细胞的基因组。该控制元件不编码GDNFR蛋白,而是控制宿主细胞基因组中存在的DNA部分。因此,GDNFR蛋白的表达可以不通过编码GDNFR基因的DNA自身的转染完成,而是利用偶联DNA调节区段的导向DNA(含有与目的内源基因同源区)完成,该调节区段为内源基因序列提供GDNFR蛋白转录可识别的信号。A.GDNFR变异体
如上所述,本文使用的术语“GDNFR类似物”包括下述多肽,其中的氨基酸已从包括图2和4(SEQ ID NO:2和4)中描述的那些多肽在内的天然发生GDNFR多肽的氨基酸序列内的残基缺失(“缺失变异体”)、插入(“添加变异体”)或置换(“置换变异体”)。通过将适当核苷酸变化导入编码该多肽的DNA或通过体外化学合成所需多肽,制备这种变异体。本领域技术人员将会理解,可以对诸如成熟人GDNFR的氨基酸序列进行缺失、插入和置换的许多组合,只要最终的分子具有GDNFR活性。
基于本文描述的GDNFR氨基酸序列,可以容易地设计和制造各种适用于重组(例如微生物)表达在一个或多个残基的相同性或位置方面具有不同于附图中描述的一级构象的多肽的核酸序列。本领域技术人员已熟知由图2和4中描述的核酸序列编码的一个或多个选定氨基酸残基的置换、插入或缺失的诱变技术(例如美国专利4,518,584号,其说明书通过引用结合到本文中)。在构建置换变异体时有两个主要的变量:突变位点的位置和突变的性质。在设计GDNFR置换变异体时,突变位点和突变性质的选择取决于欲修饰的GDNFR的特征。突变位点可以单独修饰或系列修饰,例如,通过(1)先用保守氨基酸修饰置换,然后根据达到的结果用多个基团选择置换,(2)缺失目标氨基酸残基、或(3)在该确定位点的相邻位置插入氨基酸残基。最好在1-30个邻接氨基酸中的保守变化。亦可以通过蛋白水解酶制备N末端和C末端缺失的GDNFR变异体。
有关GDNFR缺失变异体,缺失范围一般为约1-30个邻接残基,更常见为约1-10个残基,通常为约1-5个邻接残基。考虑了N末端、C末端和内部序列内缺失。可以将缺失导入该分子与非人类GDNFR的同源性低的区域以修饰GDNFR活性。在与非人类GDNFR序列具有基本同源性的区域内缺失将更有可能显著修饰GDNFR的生物学活性。将通常选择保守缺失的数目以保持GDNFR蛋白产物在受影响域的三级结构,例如半胱氨酸交联。非限制性的缺失变异体的例子包括缺失N末端或C末端氨基酸残基的截短的GDNFR蛋白产物。例如,通过消除参与GDNFR受体与细胞质膜的糖基-磷脂酰肌醇(GPI)锚定的肽区可以制备可溶性受体。
有关GDNFR添加变异体,氨基酸序列添加通常包括N末端和/或C末端融合或长度范围为一个残基至含有一百个或更多残基的多肽的末端添加,以及单个或多个氨基酸残基的内部或中间添加。本发明的多肽亦可以包括起始甲硫氨酸残基(位于相对于所需多肽的第一个氨基酸残基的位置1)。内部添加的范围一般可以为约1-10个邻接残基,更通常为1-5个残基,常见为1-3个氨基酸残基。N末端添加变异体的例子包括在GDNFR的N末端包含异源N末端信号序列的GDNFR,以利于从重组宿主细胞中分泌成熟GDNFR并因此便于收获或生物利用度。这种信号序列一般可以从预期宿主细胞物种得到,并因此与预期宿主细胞物种同源。添加亦可以包括得自其它神经营养因子序列的氨基酸序列。例如,考虑可以产生具有或不具有连接序列的GDNF和GDNFR的融合蛋白,由此形成单分子治疗实体。
GDNFR置换变异体有一个或多个GDNFR氨基酸序列的氨基酸残基被除去并在其位置插入不同的残基。这种置换变异体包括等位基因变异体,其特征在于可能导致或不导致氨基酸变化的种群中天然发生的核苷酸序列变化。与其它变异体形式一样,置换变异体可以涉及在一个或多个不同位点上的单个或邻接氨基酸残基的置换。
GDNFR氨基酸序列的特定突变可以涉及修饰糖基化位点(例如丝氨酸、苏氨酸或天冬酰胺)。缺少糖基化或仅仅部分糖基化是于任何天冬酰胺连接的糖基化识别位点或于通过添加O连接的碳水化合物修饰的分子的任何位点的氨基酸置换或缺失造成的。天冬酰胺连接的糖基化识别位点包含一个三肽序列,该序列被适当的细胞糖基化酶特异性识别。这些三肽序列或者是Asn-Xaa-Thr或者是Asn-Xaa-Ser,这里Xaa是除Pro之外的任何氨基酸。在糖基化识别位点的第一或第三氨基酸位置的一个或二者的各种氨基酸置换或缺失(和/或于第二位置的氨基酸缺失)导致在该修饰的三肽序列中无糖基化。因此,适当改变的核苷酸序列的表达产生在该位点未糖基化的变异体。或者,可以修饰该GDNFR氨基酸序列以增加糖基化位点。
鉴别用于诱变的GDNFR氨基酸残基或区域的一种方法称为“丙氨酸扫描诱变”,如Cunningham和Wells所述(Science,244:1081-1085,1989)。在该方法中,鉴别一个氨基酸残基或一组靶残基(例如诸如Arg、Asp、His、Lys和Glu的带电荷残基)并被一中性或带负电荷氨基酸(最优选丙氨酸或多丙氨酸)置换,以影响所述氨基酸与细胞内外的周围水性环境的相互作用。可以接着通过在置换位点导入其它或者候补残基,推敲那些对所述置换表现出功能敏感性的结构域。由此,确定导入氨基酸序列变异的靶位点,在该DNA序列的对应靶密码子或区域上进行丙氨酸扫描或随机诱变,并就所需活性和活性程度的最佳组合筛选表达的GDNFR变异体。
最有兴趣进行置换诱变的位点包括在来自各种物种的GDNFR蛋白中发现的氨基酸在侧链体积、电荷和/或疏水性方面基本不同的位点。其它有兴趣的位点是那些其中得自各种物种的GDNFR样蛋白的特定残基相同的位点。这类位置一般对于蛋白的生物学活性是重要的。开始,以相对保守方式置换这些位点。这种保守置换示于表2的推荐置换项下。如果这种置换导致生物学活性的变化,然后可以导入更加实质性的变化(例证置换),和/或可以产生其它添加或缺失,并筛选得到的产物的活性。
表2
氨基酸置换原始残基 推荐置换 例证置换Ala(A) Val Val;Leu;IleArg(R) Lys Lys;Gln;AsnAsn(N) Gln Gln;His;Lys;ArgAsp(D) Glu GluCys(C) Ser SerGln(Q) Asn AsnGlu(E) Asp AspGly(G) Pro ProHis(H) Arg Asn;Gln;Lys;ArgIle(I) Leu Leu;Val;Met;Ala;Phe;正亮氨酸Leu(L) Ile 正亮氨酸;Ile;Val;Met;Ala;PheLys(K) Arg Arg;Gln;AsnMet(M) Leu Leu;Phe;IlePhe(F) Leu Leu;Val;Ile;AlaPro(P) Gly GlySer(S) Thr ThrThr(T) Ser SerTrp(W) Tyr TyrTyr(Y) Phe Trp;Phe;Thr;SerVal(V) Leu Ile;Leu;Met;Phe;Ala;正亮氨酸
对该氨基酸序列的保守修饰(以及对所述编码核酸序列的对应修饰)预期产生具有与天然发生GDNFR的功能和化学特征类似的GDNFR蛋白产物。与之相反,通过选择在保持(a)置换区域中的多肽主链结构(例如片层或螺旋构象)、(b)该分子在靶位点的电荷或疏水性、(c)侧链体积方面的影响显著不同的置换,完成GDNFR蛋白产物功能和/或化学特征方面的基本修饰。根据常见侧链性质可以将天然发生的残基分组:
1) 疏水性:正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile;
2) 中性亲水性:Cys、Ser、Thr;
3) 酸性:Asp、Glu;
4) 碱性:Asn、Gln、His、Lys、Arg;
5) 影响侧链取向的残基:Gly、Pro;和
6) 芳族:Trp、Tyr、Phe
非保守置换可以涉及这些类中一类的一员与另一组的一员的交换。这种置换的残基可以导入与非人类GDNFR蛋白同源的人GDNFR蛋白区、或导入该分子的非同源区。
因此,GDNFR蛋白、类似物或其衍生物包括(但不限于)那些含有做为一级氨基酸序列在图2和4(SEQ ID NO:2和4)中描述的所有或部分氨基酸序列的生物学活性分子。所述蛋白包括改变的序列,其中用生物学等效氨基酸残基置换该序列内的残基导致沉默改变。例如,该序列内的一个或多个氨基酸残基可以用另一功能相当的类似极性的氨基酸置换导致沉默改变。该序列内一个氨基酸的置换可以选自该氨基酸所属组的其它成员。例如,非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电荷(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带负电荷(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。亦考虑例如通过磷酸化、糖基化、交联、酰化作用、蛋白水解切割、连接至抗体分子、膜分子或其它配基,可以在转录中或转录后差示修饰该GDNFR蛋白、其类似物、其片段或其衍生物。B.GDNFR衍生物
根据本说明书,本领域技术人员可以制备GDNFR或GDNFR类似物的化学修饰衍生物。最适合衍生的化学部分包括水溶性聚合物。水溶性聚合物合乎要求,因为它连接的该蛋白在水性环境(例如生理环境)中不沉淀。最好是,该聚合物对于制备治疗产物或组合物是药学上可接受的。根据诸如该聚合物/蛋白缀合物是否将用于治疗,如果是则根据所需剂量、循环时间、对蛋白水解的抗性的考虑和其它考虑,本领域技术人员可以选择所需的聚合物。该衍生的效力可以通过给与所需形式(例如通过渗透泵,或更优选地通过注射或输注,或进一步配制用于口服、肺部或其它传递路径)的该衍生物并测定其效力而确定。
合适的水溶性聚合物包括(但不限于)聚乙二醇、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯酮、聚1,3-二氧戊环、聚1,3,6-三噁烷、乙烯/马来酸酐共聚物、多聚氨基酸(或者同源聚合物或者随机共聚物)、和葡聚糖或聚(正乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、聚丙二醇(propropylene glycol)均聚物、聚环氧丙烷(prolypropyleneoxide)/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇和它们的混合物。聚乙二醇丙醛由于它在水中的稳定性可能在生产中有优越性。
该聚合物的分子量是任意的可以分枝或不分枝。对于聚乙二醇,推荐分子量为约2kDa至约100kDa以便处理和制造(术语“约”表明在制备聚乙二醇时,一些分子的分子量将大于或小于陈述的分子量)。可以使用其它大小,这取决于所需的治疗特征(例如所需的持续释放时间;对生物学活性的任何影响(如果有的话);处理的容易程度;抗原性的程度或缺失抗原性和聚乙二醇对治疗蛋白或变异体的其它已知效果)。
如此连接的聚合物分子的数目可以变化,本领域技术人员能够确定对功能的影响。使用相同或不同的化学部分(例如聚合物,诸如不同分子量的聚乙二醇),可以单衍生、或提供双、三、四或一些衍生组合。聚合物分子与蛋白(或肽)分子的比例可以变化,它们在反应混合物中的浓度同样可以变化。一般而言,最佳比例(以反应效率而言在反应中没有多余的未反应蛋白或聚合物)可以通过诸如所需衍生程度(例如单、双、三,等)、选定聚合物的分子量、该聚合物是分枝还是不分枝和反应条件的因素确定。
应在考虑对该蛋白的功能域或抗原域的影响下,将聚乙二醇分子(或其它化学部分)连接至该蛋白。有多种本领域技术人员可以利用的连接方法。参见例如EP0401384,其说明书通过引用结合到本文中(将PEG偶联至G-CSF),亦可参见Malik等,Exp.Hematol.,20:1028-1035,1992(报道用tresyl chloride对GM-CSF进行聚乙二醇化)。例如,聚乙二醇可以通过反应基(例如游离氨基或羧基)共价连接至氨基酸残基。反应基是那些活化聚乙二醇分子可以连接的基团。具有游离氨基的氨基酸残基包括赖氨酸残基和N末端氨基酸残基。那些具有游离羧基的氨基酸残基可以包括天冬氨酸残基、谷氨酸残基和C末端氨基酸残基。巯基亦可以用做连接所述聚乙二醇分子的反应基。对于治疗用途,最好是连接至氨基,例如连接至N末端或赖氨酸基团。如果需要受体结合,则应避免连接至对受体结合重要的残基。
可能具体需要N末端化学修饰的蛋白。使用聚乙二醇做为本组合物的说明,可以根据以下因素进行选择:各种聚乙二醇分子(根据分子量、分枝等)、反应混合物中聚乙二醇分子与蛋白(或肽)分子的比例、欲进行的聚乙二醇化反应的类型和得到选定N末端聚乙二醇化的蛋白的方法。得到N末端聚乙二醇化制备物的方法(即如果需要从其它单聚乙二醇化的部分分离该部分)可以是从聚乙二醇化蛋白分子群体中纯化该N末端聚乙二醇化材料。可以通过利用了特定蛋白中可用于衍生的不同类型伯氨基的不同反应性(赖氨酸对N末端)的还原性烷基化,完成选择性的N末端化学修饰。在适当反应条件下,达到该蛋白在N末端带有含有聚合物的羰基的基本选择性衍生。例如,通过在允许利用该蛋白赖氨酸残基的e-氨基和N末端残基的a-氨基之间的pKa差异的pH下进行反应,可以选择性地N末端聚乙二醇化该蛋白。通过这种选择性衍生,控制了水溶性聚合物与蛋白的连接:与该聚合物的缀合主要在该蛋白的N末端发生,并且没有发生其它反应基(例如赖氨酸侧链氨基)的显著修饰。使用还原性烷基化,该水溶性聚合物可以是上述类型并应具有单个反应性醛以偶联至该蛋白。可以使用含有单个反应性醛的聚乙二醇丙醛。
本发明考虑使用与至少一个聚乙二醇分子连接的、为原核生物表达的GDNFR或其变异体的衍生物,以及使用通过酰基或烷基与一个或多个聚乙二醇分子连接的GDNFR或其变异体。
可以通过本领域已知的任何聚乙二醇化反应进行聚乙二醇化。参见例如:Focus on Growth Factors,3(2):4-10,1992;EP0154316,其说明书通过引用结合到本文中;EP0401384;和本文引用的其它有关聚乙二醇化的出版物。通过酰化反应或烷基化反应,用反应性聚乙二醇分子(或类似的反应性水溶性聚合物)进行聚乙二醇化。
通过酰化作用的聚乙二醇化一般涉及将聚乙二醇(PEG)的活性酯衍生物与该GDNFR蛋白或变异体反应。任何已知或后续发现的反应性PEG分子都可以用于进行GDNFR蛋白或变异体的聚乙二醇化。推荐的活化PEG酯是酯化至N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的PEG。如本文所用的“酰化作用”考虑包括(无限制性)该治疗蛋白与诸如PEG的水溶性聚合物的下列连接类型:酰胺、氨基甲酸酯、尿烷等等。参见Bioconjugate Chem.,5:133-140,1994。反应条件可以从在聚乙二醇化领域已知的条件或后续发展的条件选择,但应避免会可能失活欲修饰的该GDNFR或变异体的诸如温度、溶剂和pH的条件。
通过酰化作用的聚乙二醇化一般产生多聚聚乙二醇化GDNFR蛋白或变异体。该连接键最好为酰胺键。产生的产物亦最好为基本上仅(例如>95%)单、双或三聚乙二醇化。然而,一些具有更高程度聚乙二醇化的种类可以形成,其量取决于使用的的特定反应条件。如果需要,通过标准纯化技术,包括透析、盐析、超滤、离子交换层析、凝胶过滤层析和电泳,可以从该混合物特别是未反应种类中分离更加纯化的聚乙二醇化种类。
通过烷基化的聚乙二醇化一般涉及将PEG的末端醛衍生物与该GDNFR蛋白或变异体在还原剂的存在下反应。通过烷基化的聚乙二醇化亦可产生聚乙二醇化GDNFR蛋白或变异体。另外,可以操纵反应条件以利于基本上仅在该GDNFR蛋白或变异体N末端的a-氨基聚乙二醇化(即单聚乙二醇化蛋白)。在单聚乙二醇化或多聚乙二醇化二种情况下,该PEG基团最好通过-CH2-NH-基团连接至该蛋白。特别关于该-CH2-基团,这类型键在本文中称为“烷基键”。
通过还原性烷基化产生单聚乙二醇化产物的衍生利用了可用于衍生的不同类型伯氨基的不同反应性(赖氨酸对N末端)。在允许利用该蛋白所述赖氨酸残基的e-氨基和N末端残基的a-氨基的pKa差异的pH下进行反应。通过这种选择性衍生,控制含有诸如醛的反应基的水溶性聚合物与蛋白的连接:与该聚合物的连接主要在该蛋白的N末端发生,并且没有发生其它反应基(例如赖氨酸侧链氨基)的显著修饰。在一个重要方面,本发明考虑使用单聚合物/GDNFR蛋白(或变异体)缀合分子的基本均一的制备物(指聚合物分子连接的GDNF蛋白或变异体基本上仅(即>95%)在单一位置)。更具体地说,如果使用聚乙二醇,本发明亦包括使用缺乏可能的抗原连接基团并具有直接偶联至该GDNFR蛋白或变异体的聚乙二醇分子的聚乙二醇化蛋白或变异体。
因此,按照本发明的GDNFR蛋白产物包括聚乙二醇化GDNFR蛋白或变异体,其中所述PEG基团通过酰基或烷基连接。如上所述,这种产物可以是单聚乙二醇化或多聚乙二醇化(例如含有2-6、最好为2-5个PEG基团)。所述PEG基团一般于氨基酸的a或e氨基连接至该蛋白,但亦考虑所述PEG基团连接至该蛋白上的任何氨基,该氨基在合适反应条件下有足够的反应性以连接至PEG基团。
在酰化作用和烷基化方法中使用的聚合物分子可以从上述水溶性聚合物中选择。应修饰选择的聚合物,以具有单个反应基,例如最好是用于酰化作用的活性酯或用于烷基化的醛,使得聚合度可以按照本方法控制。典型的反应性PEG醛是水溶性的聚乙二醇丙醛或其C1-C10烷氧基或芳氧基衍生物(参见美国专利5,252,714)。该聚合物可以分枝或不分枝。对于酰化反应,选择的聚合物应具有单个反应性酯基。对于本还原性烷基化,选择的聚合物应具有单个反应性醛基。一般而言,不从天然发生的糖基残基选择水溶性聚合物,因为这些可以由哺乳动物重组表达系统更方便地制备。该聚合物可以具有任意分子,它可以分枝或不分枝。
本文使用的典型的水溶性聚合物是聚乙二醇。如本文所用,聚乙二醇是指包括已用于衍生其它蛋白的PEG的任何形式,例如单(C1-C10)烷氧基或芳氧基聚乙二醇。
一般而言,可以在任何用于将生物学活性物质与活化聚合物分子反应的适合条件下进行化学衍生。制备聚乙二醇化GDNFR蛋白产物的方法一般包括步骤(a)将GDNFR蛋白产物与聚乙二醇(例如PEG的反应性酯或醛衍生物)在该蛋白变为连接至一个或多个PEG基团的条件下反应,和(b)获得该反应产物。一般而言,酰化反应的最佳反应条件将根据已知参数和需要的结果具体确定。例如,PEG:蛋白的比例越高,则多聚乙二醇化产物的百分比越高。
制备单聚合物/GDNFR蛋白产物的基本均一群体的还原性烷基化一般包含步骤:(a)将GDNFR蛋白或变异体与反应性PEG分子在还原性烷基化条件下,在允许选择性修饰所述GDNFR蛋白或变异体的氨基末端的a-氨基的合适pH下进行反应;和(b)得到所述反应产物。
对于单聚合物/GDNFR蛋白产物的基本均一群体,所述还原性烷基化反应条件是那些允许将该水溶性聚合物部分选择性连接至GDNFR蛋白或变异体的N末端的条件。这种反应条件一般提供赖氨酸的氨基与N末端a-氨基之间的pKa差异(pKa是50%的氨基质子化而50%的氨基未质子化时的pH)。pH亦影响欲使用的聚合物与蛋白的比例。一般而言,如果pH较低,在需要聚合物超出蛋白很多(即N末端a-氨基的反应性越低,则需要越多的聚合物以达到最佳条件)。如果pH较高,则聚合物∶蛋白的比例不需要那么高(即可用的反应基越多,需要的聚合物分子越少)。为了本发明的目的,pH范围一般为3-9,最好为3-6。
另一重要的考虑是聚合物的分子量。一般而言,聚合物的分子量越高,能连接至该蛋白的聚合物越少。类似地,当优化这些参数时,应考虑这些聚合物的分枝。一般而言,分子量越高(或分枝越多),则聚合物∶蛋白比例越高。一般而言,对于本文考虑的聚乙二醇化反应,推荐的平均分子量是约2kDa至约100kDa。优选的平均分子量是约5kDa至约50kDa,特别优选的是约12kDa至约25kDa。水溶性聚合物对GDNF蛋白或变异体的比例的一般范围是1∶1至100∶1,优选为(对于多聚乙二醇化)1∶1至20∶1和(对于单聚乙二醇化)1∶1至5∶1。
采用上述表明的条件,还原性烷基化提供将聚合物选择性地连接至在氨基末端具有a-氨基的任何GDNFR蛋白或变异体,并提供单聚合物/GDNFR蛋白(或变异体)缀合物的基本均一的制备物。此处使用的术语“单聚合物/GDNFR蛋白(或变异体)缀合物”指由连接至一分子GDNFR蛋白或GDNFR变异体蛋白的单个聚合物分子组成的组合物。该单聚合物/GDNFR蛋白(或变异体)缀合物通常具有一位于N末端而不是赖氨酸氨基侧基的聚合物分子。该制备物一般是高于90%的单聚合物/GDNFR蛋白(或变异体)缀合物,更经常是高于95%的单聚合物/GDNFR蛋白(或变异体)缀合物,而余下的观察到的分子均未反应(即缺少该聚合物部分的蛋白)。亦预期该GDNFR蛋白产物可以涉及制备涉及融合蛋白或连接的GDNFR和GDNF分子的聚乙二醇化分子。
对于本还原性烷基化,该还原剂必须在水溶液中稳定,最好能够仅还原在还原性烷基化的起始过程中形成的席夫碱。合适的还原剂选自硼氢化钠、氰基硼氢化钠、二甲胺硼烷、三甲胺硼烷和吡啶硼烷。特别合适的还原剂是氰基硼氢化钠。诸如溶剂、反应时间、温度等的其它反应参数和产物纯化方法可以根据已发表的有关用水溶性聚合物衍生蛋白的资料(参见本文引用的出版物)具体确定。C.GDNFR蛋白产物药用组合物
GDNFR蛋白产物药用组合物通常包括与一种或多种药学上和生理上可接受的选择适合于给药方式的配制材料混合的治疗或预防有效量的GDNFR蛋白产物。合适的配制材料包括(但不限于)抗氧化剂、防腐剂、着色剂、调味剂和稀释剂、乳化剂、悬浮剂、溶剂、填充剂、膨胀剂、缓冲液、传递载体、稀释剂、赋形剂和/或药用辅助剂。例如,合适的载体可以是注射用水、生理盐水溶液或人造脑脊髓液,可能添加了通常用于非肠道给药组合物的其它材料。中性缓冲盐水或与血清白蛋白混合的盐水是其它典型的载体。本文使用的术语“药学上可接受的载体”或“生理上可接受的载体”指适于完成或增强做为药用组合物的该GDNFR蛋白产物传递的配制材料。
载体中的主要溶剂的特性可以或者是水性或者是非水性。另外,该载体可以含有其它修饰或保持该制剂的pH、渗透性、粘度、澄清度、颜色、无菌性、稳定性、溶解速率或气味的配制材料。类似地,该载体可以含有修饰或保持GDNFR蛋白产物释放速率、或促进GDNFR蛋白产物越过血脑屏障吸收或透过的其它配制材料。
一旦配制好该治疗药用组合物,可以将其做为溶液、悬浮液、凝胶、乳液、固体、或脱水或冻干粉末储存于无菌西林瓶中。这种制剂可以即用形式或在给药前需复制的形式(例如冻干)储存。
本领域技术人员可以根据预期给药途径和需要的剂量确定最佳药用制剂。参见例如Remington’s Pharmaceutical Sciences,第18版(1990,Mack Publishing Co.,Easton,PA 18042)第1435-1712页,其说明书通过引用结合到本文中。这种组合物可以影响所述蛋白和衍生物的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。
预期了有效给药形式,例如(1)缓释制剂,(2)吸入雾剂,或(3)口服活性制剂。该GDNFR蛋白产物药用组合物亦可配制用于非肠道给药。这种非肠道给药治疗组合物通常是无热原、非肠道可接受的水溶液形式,它包含在药学上可接受载体中的该GDNFR蛋白产物。一种推荐的载体是生理盐水。所述GDNFR蛋白产物药用组合物亦可以包括诸如聚乳酸、聚乙醇酸等的聚合化合物的颗粒制剂或包入脂质体中。亦可以使用透明质酸,这可以具有促进在循环中延长时间的效果。
特别合适于非肠道注射的载体是无菌蒸馏水,其中该GDNFR蛋白配制成无菌的等渗溶液并适当地防腐。再一制剂可以涉及将该GDNFR蛋白产物与例如可注射微球体或脂质体的试剂一同配制,所述试剂提供该蛋白的缓释或持久释放,该蛋白然后将做为储存注射液而传递。其它合适导入GDNFR蛋白产物的方法包括含有该GDNFR蛋白产物的可植入药物传递装置。
正如本领域熟知的,本发明的制剂可以包括其它组分,例如非肠道可接受的防腐剂、张力剂、共溶剂、湿润剂、络合剂、缓冲剂、抗微生物剂、抗氧化剂和表面活性剂。例如,合适的张力增强剂包括碱金属卤化物(最好为氯化钠或氯化钾)、甘露醇、山梨醇等等。合适的防腐剂(但不限于)氯苄烷胺、硫柳汞、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟苯甲酸丙酯、氯醛己醇、山梨酸等等。亦可以用过氧化氢做为防腐剂。合适的共溶剂是例如甘油、丙二醇和聚乙二醇。合适的络合剂是例如咖啡因、聚乙烯吡咯酮、β-环糊精或羟丙基-β-环糊精。合适的表面活性剂或湿润剂包括山梨聚糖酯、诸如聚山梨醇酯80的聚山梨醇酯、氨丁三醇(tromethamine)、卵磷脂、胆固醇、四丁酚醛(tyloxapal)等等。缓冲液可以是常规缓冲液,例如硼酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐、碳酸氢盐或Tris-HCl。
该配方组分存在的浓度是给药位点可接受的。例如,使用缓冲液保持该组合物于生理pH或略低的pH,通常的pH范围为约pH5至约pH8。
可以配制用于吸入的药用组合物。例如,可以将该GDNFR蛋白产物配制成吸入用的干粉。亦可以在气溶胶传递用的液化发射剂中配制GDNFR蛋白产物吸入溶液。在再一配方中,可以喷雾溶液。
亦考虑将口服含有GDNFR蛋白产物的某些制剂。以这种方式给药的GDNFR蛋白产物可以连同或不连同那些常用于混合诸如片剂和胶囊的固体剂量形式的载体配制。例如,可以设计胶囊使其在胃肠道中当生物利用度最大而前系统降解最低的点释放该制剂的活性部分。可以包括其它配制材料以便于GDNFR蛋白产物的吸收。亦可以使用稀释剂、调味剂、低熔点蜡、植物油、润滑剂、悬浮剂、片剂崩解剂和粘合剂。
另一制剂可以包括与无毒的适于制造片剂的赋形剂混合的有效量的GDNFR蛋白产物。通过将该片剂溶于无菌水中或其它适当的载体中,可以制备单位剂量形式的溶液。合适的赋形剂包括(但不限于)惰性稀释剂,例如碳酸钙、碳酸钠或碳酸氢钠、乳糖或磷酸钙;或粘合剂,例如淀粉、明胶或阿拉伯胶;或润滑剂例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石粉。
其它GDNFR蛋白产物配方对本领域技术人员是明显的,包括涉及GDNFR蛋白产物与GDNF蛋白产物组合的配方。本领域技术人员亦熟知配制各种其它延迟或控制传递手段(例如脂质体载体、生物可腐蚀微颗粒或多孔珠和储存注射液)的技术。参见,例如,Supersaxo等有关传递药用组合物的控释多孔聚合物微颗粒的描述(国际公告WO93/15722号;国际申请PCT/US93/00829),其说明书通过引用结合到本文中。D.GDNFR蛋白产物的给药
可以通过各种途径将GDNFR蛋白产物给药,所述途径包括皮下、肌内、静脉内、经肺、经皮、鞘内和大脑内传递。另外,不容易越过血脑屏障的蛋白因子可以直接大脑内给药或者与将它们运过该屏障的其它成分相结合。例如,该GDNFR蛋白产物可以脑室内给药或给药进入大脑或脊髓蛛网膜下的空间。GDNFR蛋白产物亦可以大脑内给药直接进入大脑实质。GDNFR蛋白产物可以以已化学修饰或包装使其通过血脑屏障的形式、或与一种或多种能够促进GDNFR蛋白产物透过血脑屏障的药剂一起大脑外给药。例如,NGF和单克隆抗转铁蛋白受体抗体的缀合物已显示通过结合至转铁蛋白受体运输至大脑。
为达到GDNFR蛋白产物的需要水平,可以每天重复或频率略低地注射给药,或者GDNFR蛋白产物可以从恒定或可编程流动植入泵连续或周期性地输注。含有包埋于生物可降解聚合物基质中的该神经营养因子的缓释植入物亦可以传递GDNFR蛋白产物。给药频率将取决于如此配制的该GDNFR蛋白产物的药物动力学参数以及给药途径和位点。
不管给药方式如何,都可以根据体重、体表面积或器官大小计算具体的剂量。确定涉及上述每个配方的治疗的适当剂量的必需计算的进一步精细化可以由本领域一般技术人员常规进行,并属于他们日常进行的工作的范围。通过使用适当的剂量反应数据可以确定适当的剂量。
涉及治疗特定损伤或疾病的方法的最终剂量制度将由主治医师确定。一般而言,通过考虑修饰药物作用的各种因素,例如病人的年龄、病情、体重、性别和饮食、任何感染的严重性、给药时间和其它临床因素确定本GDNFR多肽的有效量。参见Remington’sPharmaceutical Sciences,见上述,第697-773页,通过引用结合到本文中。亦考虑如果GDNFR用于增强GDNF的作用,则选择该GDNFR剂量使其与GDNF治疗所需的类似;如果GDNFR用于拮抗GDNF的作用,则该GDNFR剂量将是GDNF剂量的几倍。给药可以一天一次或多次或更少,并可以与本文所述的其它组合物联用。应注意本发明不限于本文列举的剂量。
预期连续给药或延迟传递GDNFR蛋白产物对给定治疗可能是有利的。虽然可以通过诸如输注泵的机械手段完成连续给药,但亦考虑可以使用其它方式的连续或接近连续给药。例如,化学衍生或包胶囊可以产生该蛋白的缓释形式,它具有基于确定剂量模式的以预期量在血液中连续存在的效果。因此,GDNFR蛋白产物包括衍生的或者配制的以实现这种连续给药的蛋白。将配制GDNFR蛋白产物的缓释形式以提供所需的每天或每周的有效剂量。
另外考虑该GDNFR蛋白产物可以以与GDNF联合的形式给药。或者,所述GDNFR和GDNF蛋白产物可以或者顺序或者同时独立地给药。
在治疗神经疾病中,本发明的GDNFR蛋白产物亦可以单独使用或与其它生长因子联合使用。另外,其包括化学组合物的它因子或其它分子可以与GDNFR蛋白产物一同使用。在治疗帕金森病中,考虑可以使用GDNFR蛋白产物自身或与左旋多巴联用,其中该GDNFR会增强内源GDNF的活性,并因此增强神经元摄入较高浓度的多巴胺。
如上所述,亦考虑其它神经营养因子或神经元营养因子会对治疗一些神经元细胞群或一些类型的损伤或疾病有用或必需。其它可以与GDNFR或GDNFR和GDNF的组合物联用的因子包括(但不限于):粗促细胞分裂剂,例如胰岛素、胰岛素样生长因子、表皮生长因子、血管活性生长因子、垂体腺苷酸环化酶激活多肽、干扰素和生长激素释放抑制因子;神经营养因子,例如神经生长因子、大脑源神经营养因子、神经营养素(neurotrophin)-3、神经营养素-4/5、神经营养素-6、胰岛素样生长因子、睫状神经营养因子、酸性和碱性成纤维细胞生长因子、成纤维细胞生长因子-5、转化生长因子-β、可卡因-苯异丙胺调节转录物(CART);和其它生长因子例如表皮生长因子、白血病抑制因子、白介素、干扰素和集落刺激因子;以及与这些因子的功能相同的分子和物质。GDNFR蛋白产物的细胞治疗和基因治疗
亦考虑了GDNFR蛋白产物的细胞治疗,例如大脑内植入产生GDNFR蛋白产物的细胞。该实施方案涉及向病人植入能够合成和分泌生物学活性形式的GDNFR蛋白产物的细胞。这种产生GDNFR蛋白产物的细胞可以是GDNFR蛋白产物的天然产生者或是重组细胞,该重组细胞产生GDNFR蛋白产物的能力通过用编码所需GDNFR蛋白产物的基因转化所增强。通过适于传递该基因并促进其表达和分泌的载体可以完成这种修饰。为最大限度地降低给与异源物种GDNFR蛋白产物的病人中潜在的免疫反应,最好是产生GDNFR蛋白产物的天然细胞来源于人并产生人GDNFR蛋白产物。类似地,最好是产生GDNFR蛋白产物的重组细胞用含有编码人GDNFR蛋白产物基因的表达载体转化。
可以将植入的细胞包囊,以避免周围组织浸润。可以将人或非人类动物细胞在生物相容的、半透性聚合物包被或膜中植入病人,该包被或膜允许释放GDNFR蛋白产物,但防止细胞被病人免疫系统或被周围组织的其它有害因子破坏所述细胞。或者,可以将在活体外转化以产生GDNFR蛋白产物的病人自身的细胞直接植入病人中,不而需这种包囊。
本领域一般技术人员熟悉活细胞的包囊技术,不需过度试验就可以完成该包囊细胞的制备并植入病人。例如,Baetge等(国际公告WO95/05452号;国际申请PCT/US94/09299,其说明书通过引用结合到本文中)描述了用于生物学活性分子有效传递的含有遗传工程化的细胞的生物相容性胶囊。另外,参见美国专利4,892,538、5,011,472和5,106,627号,每个都具体地通过引用结合到本文中。在Aebischer等的PCT申请WO91/10425(具体地通过引用结合到本文中)中描述了包囊活细胞的系统。亦参见Aebischer等的PCT申请WO91/10470、Winn等,Exper.Neurol.,113:322-329,1991、Aebischer等,Exper.Neurol.,111:269-275,1991;Tresco等,ASAIO,38:17-23,1992,每个都具体地通过引用结合到本文中。
亦预期了体内和体外基因治疗传递GDNFR蛋白产物。通过局部注射核酸构建物或其它适当载体将编码GDNFR蛋白产物的基因导入靶细胞,可以完成体外基因治疗。(Hefti,J.Neurobiol.,25:1418-1435,1994)。例如,编码GDNFR蛋白产物的核酸序列可以包含于腺相关病毒载体中以传递入靶细胞(例如Johnson,国际公告WO95/34670号;国际申请PCT/US95/07178,其说明书通过引用结合到本文中)。替代的病毒载体包括(但不限于)逆转录病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒和乳头瘤病毒载体。亦可以通过脂质体介导的转移、直接注射(裸DNA)、受体介导的转移(配基-DNA复合物)、电穿孔、磷酸钙沉淀或微粒轰击(基因枪)达到或者体内或者活体外适当的物理传递。
亦考虑GDNFR蛋白产物的基因治疗或细胞治疗可以另外包括传递GDNFR蛋白产物。例如,可以修饰宿主细胞以同时表达和释放GDNFR蛋白产物和GDNF蛋白产物。或者,可以从独立的细胞中表达和释放所述GDNFR和GDNF蛋白产物。这种细胞可以独立地导入病人或者所述细胞可以包含于单个可植入装置,例如上述包囊膜。
应注意本文描述的GDNFR蛋白产物制剂可以用于兽医和人类应用,该术语“病人”应不受限制。在兽医应用的情况下,可以按照上述确定剂量范围。
实施例
实施例1
表达高亲和性GDNF结合位点细胞的鉴定
表达克隆涉及选择有可能含有显著水平目标转录物的mRNA源。鉴别出视网膜感光细胞对极低浓度GDNF应答,提示存在功能性的、高亲和性的受体。为确认大鼠感光细胞的确表达高亲和性GDNF受体,进行了[125I]GDNF结合和照相乳胶分析。大鼠视网膜细胞培养
将5天的的C57B1/6鼠幼鼠或3天的的Sprague-Dawley大鼠幼鼠(Jackson Laboratories,Bar Harbor,MA)的神经视网膜小心地取出并将色素上皮切除干净,然后切成1mm2的块并置于冰冻磷酸缓冲盐水(PBS)中。然后将视网膜转移至含有120单位木瓜蛋白酶和2000单位DNA酶的10ml Hank平衡盐溶液(HBSS)中,并于37℃在旋转平台摇床上于约200rpm培育20分钟。然后通过经火抛光Pasteur移液管的研磨以分散细胞、通过20μm Nitex尼龙网筛分并于200xg离心5分钟。将得到的细胞沉淀再悬浮于含有1%卵清蛋白和500单位DNA酶的HBSS中并铺于4%卵清蛋白溶液(在HBSS中)之上,于500xg离心10分钟。将最终的沉淀再悬浮于完全培养基中(见下述),调整至约15,000细胞/ml,以90μl的等份接种于如前述(Louis等,Journal OfPharmacology And Experimental Therapeutics,262,1274-1283,1992)包被了聚鸟氨酸和层粘连蛋白的组织培养平板。
该培养基由1:1Dulbecco修改的Eagle培养基(DMEM)和F12培养基混合物组成,并添加了2.5%热灭活马血清(Hyclone,Logan,UT)、B27培养基补充物(GIBCO,Grand Island,NY)、D-葡萄糖(最终浓度:5mg/ml)、L-谷氨酰胺(最终浓度:2mM)、20mM HEPES、牛胰岛素和人转铁蛋白(最终浓度:分别为2.5和0.1mg/ml)。感光细胞的免疫细胞化学识别
通过免疫染色制动蛋(arrestin)(视杆细胞特异性抗原)识别感光细胞。将感光细胞的培养物于室温用PBS中的4%多聚甲醛,pH7.4固定30分钟,接着在PBS中清洗三次。然后将固定的培养物在Superblock封闭缓冲液(Pierce,Rockford,IL)培育,该缓冲液含有1%Nonidet P-40以增强抗体渗透。然后在同一缓冲液中以1∶2000以内的稀释度加入抗制动蛋白抗体(多克隆抗制动蛋白的合成肽序列兔抗体,其序列为:Val-Phe-Glu-Glu-Phe-Ala-Arg-Gln-Asn-Leu-Lys-Cys),该培养物于37℃在旋转摇床上培育1小时。用PBS洗三次后,将该培养物与1∶500稀释的山羊抗兔IgG(Vectastain药盒,得自Vector Laboratories,Burlingame,CA)一同于37℃培育1小时。用PBS洗三次后,然后将第二抗体用1∶500稀释的抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶复合物标记(37℃ 45分钟)。用PBS洗三次以上后,将该标记细胞培养物在含有0.04%3’,3’-二氨基苯胺-(HCl)4、0.06%NiCl2和0.02%过氧化氢的0.1M Tris-HCl,pH7.4的溶液中反应5-20分钟。根据制动蛋白-免疫反应性,培养物中约90%的细胞是杆状感光细胞。
通过用200倍放大亮光光学镜片检查制动蛋白染色的培养物以测定感光细胞的存活。在一个代表6mm孔约总表面积的20%、沿直径方向的1×6mm条中计数制动蛋白阳性感光细胞的数量。活感光细胞的特征是具有规则形状的细胞体,具有一通常为短的类似轴突突起。从计数中除去显示变性迹象(例如具有不规则、空泡化的核周体或片段化的轴突)的感光细胞(而绝大多数变性感光细胞都从培养基质上脱落)。用细胞/6-mm孔,表达细胞数量。
用人重组GDNF(从10ng/ml-1g/ml十倍连续稀释)处理增加感光细胞(10,000/6-mm孔)的培养大鼠的视网膜细胞。6天后固定培养物并对制动蛋白(杆状感光细胞特异性抗原)免疫染色。在未用GDNF处理的培养物中,感光细胞数目持续稳定地下降并在培养6天后到达原始数目的约25%。用GDNF处理培养物导致在培养6天后有约二倍高数量的活制动蛋白阳性感光细胞。GDNF的效果在约200pg/ml时最大,ED50为约30pg/ml。除了促进感光细胞存活外,加入GDNF亦刺激其类轴突突起的伸长,由此证明对该感光细胞形态发育的影响(与对照培养物中的27±18μm对比,在GDNF中感光细胞的平均轴突长度:68μm)。
为确认大鼠视网膜细胞表达高亲和性GDNF受体,进行了[125I]GDNF结合和照相乳胶分析。将出生后的大鼠感光细胞在试验前3-4天以2800细胞/mm2的密度接种于塑料玻片小瓶(Nunc)中。用冰冻清洗缓冲液(含有25mM N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸(HEPES),pH7.5的Dulbecco的修改的Eagle培养基(DMEM))清洗细胞一次。关于竞争性结合,将细胞与结合缓冲液(含有25mM HEPES,pH7.5和2mg/ml牛血清白蛋白(BSA)的DMEM)中的各种浓度的[125I]GDNF在500nM未标记GDNF存在或不存在的条件下于4℃培育4小时。用冰冻清洗缓冲液清洗细胞四次,在1M NaOH中裂解并用伽吗计数器测定与细胞结合的放射性。甚至在低配体浓度(低至30pM)下有显著数量的[125I]GDNF与感光细胞结合,并且这种结合被过量存在的未标记GDNF彻底抑制。
关于照相乳胶检测,将细胞与结合缓冲液中的50pM的[125I]GDNF在500nM未标记GDNF存在或不存在的条件下于4℃培育4小时。将细胞用冰冻清洗缓冲液清洗6次,用2.5%戊二醛固定并相继用50%和70%乙醇脱水,并浸入NTB-2照相乳胶又取出(EastmanKodak,Rochester NY)。曝光5天后,将玻片显影并检查。照相乳胶分析证明[125I]GDNF与一些感光细胞结合,由此表明存在GDNF受体。然而,这种结合被加入未标记GDNF有效阻断。
实施例2
来自感光细胞的GDNFR的表达克隆
选择大鼠感光细胞作为GDNF高亲和性受体的可能来源,是基于如实施例1所述它们的细胞表面结合放射性标记GDNF和它们对很低浓度配体应答的能力。为鉴别该受体,通过下述方法,用哺乳动物表达载体(pSR的衍生物,Takebe等,1988见上述)和从培养出生后大鼠感光细胞分离的mRNA,构建约50,000独立克隆的选择大小cDNA文库。将该文库分成约1,500至2,000个独立克隆的库并用已建立的表达克隆方法(Gearing等,EMBO Jounal,8,3667-3676,1989)筛选。制备代表该文库的每个库的质粒DNA并转染入在塑料显微镜玻片小瓶(Nunc,Naperville,IL)上生长的COS7细胞中。
该转染细胞用[125I]GDNF处理,用戊二醛固定,脱水并蘸照相乳胶做放射自显影。曝光5天后,将玻片显影并检查由银粒覆盖细胞的存在,该银粒表明作为细胞表达GDNF受体的结果,[125I]GDNF与细胞表面结合。以[125I]EGF处理的EGF受体转染细胞用作阳性对照。
以这种方式筛选的27个库(F8-11)中的一个库在转染后表现出19个阳性细胞。因此,鉴别出一个单cDNA文库库,其含有表达GDNFR的cDNA克隆。将该库分成60个较小的100个克隆/库的亚库,并用上述同样方法再筛选。这些库中的5个被鉴定为阳性,这5个中的2个库又进一步再划分以产生对该GDNF结合活性负责的单个克隆。将来自该单个克隆的质粒DNA转染入COS7细胞导致[125I]GDNF与约15%的细胞结合。这种结合被过量的未标记GDNF特异性地竞争抑制。表达cDNA文库的构建
从出生后3-7天的大鼠收获大鼠视网膜细胞并以约5700细胞/mm2的密度种入用层粘连蛋白和聚鸟氨酸包被的培养皿中。培养3-4天后,估计群体含有约80%的感光细胞。通过标准方法从该培养物制备总RNA,并用polyA束(polyA-tract)药盒(Promega,Madison,WI)纯化Po1yA+RNA。用Gibco Superscript选择系统(Gibco/BRL,Gaithersburg,MD)由该大鼠感光细胞多聚A+RNA构建cDNA文库。将2μg的多聚A+RNA与50ng随机六聚物混合,加热至70℃10分钟并接着在冰上快速冷却。用400U SuperscriptⅡRT于37℃进行1小时的第一链合成。在加入dNTPs、10U大肠杆菌DNA连接酶、40U大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ和2U大肠杆菌RNA酶H后,在同一试管中进行第二链合成。在16℃ 2小时后,通过用10UT4聚合酶于16℃处理另外5分钟将该cDNA末端变成平端。用异丙醇沉淀后,通过与10μg的未磷酸化EcoRⅠ接头寡核苷酸连接过夜,将EcoRⅠ克隆位点加到该cDNA上。
然后将该连接了EcoRⅠ的cDNA磷酸化并上sephacryl S-500 HR大小分级柱。上样后,用100μl等份的TEN缓冲液(10mM Tris-HCl pH7.5,0.1mM EDTA,25mM NaCl)清洗该柱,并收集30μl分部收集液。合并含有约34ng高分子量cDNA的6-8分部收集液并沉淀。将回收的连接了EcoRⅠ的cDNA与50ng EcoRⅠ切割载体pBJ5连接过夜。将每个含有约15ng cDNA的该连接混合物等份通过电穿孔转化进入感受态细胞(大肠杆菌菌株DH10B;GIBCO/BRL,Gaithersburg,MD)。测定该转化混合物的效价并接着以1500菌落/平板的密度铺板于27个Amp/LB平板。从每个平板刮下菌落并收集入10mL Luria肉汤(LB)中,以产生每个有1500个独立克隆的27个库。将每个库的部分细胞冷冻于甘油中,剩余的细胞则用于采用Qiagen tip-500药盒(Qiagen Inc.,Chatsworth,CA)分离质粒DNA。COS细胞转染和照相乳胶分析
在转染前一天将COS7细胞接种于(220,000细胞/玻片)包被了ProNectin(10μg/ml在磷酸缓冲盐水PBS中)的塑料玻片小瓶(Nunc)上。对于转染,将含有2μg cDNA的700μl Opti MEMI(GIBCO/BRL,Gaithersburg,MD)与35μl DEAE葡聚糖溶液(10mg/ml,Sigma,St.Louis,MO)在Eppendorf管中温和混合。细胞用PBS清洗二次,并与该转染混合物于37℃在5%CO2空气中培育30分钟。培育后,向每个小瓶中加入含有10%胎牛血清(FCS)和80nM氯喹(Sigma,St.Louis,MO)的3mL DMEM培养基。将细胞再培养3.5小时,用溶于DMEM的10%二甲基亚砜于室温振荡2分钟,用PBS清洗一次并使之在含有10%FCS的DMEM中生长。48小时后,将该转染COS7细胞用冰冻清洗缓冲液(含有25mM HEPES,pH7.5的DMEM)清洗一次,并在添加了50pM[125I]GDNF的冰冻结合缓冲液(含有25mM HEPES,pH7.5和2mg/mlBSA的DMEM)中于4℃培育4小时。将细胞在冰冻清洗缓冲液中清洗6次,用2.5%戊二醛于室温固定5分钟,相继用50%和70%乙醇脱水,然后浸入NTB-2照相乳胶(Eastman Kodak)。于4℃黑暗中曝光4-5天后,将玻片显影并通过亮视场和暗视场显微镜术筛选。阳性库的亚分割
鉴定了一个单一的库,它含有假定的GDNF受体克隆。将该库的克隆以100个菌落/平板的密度接种于60个平板上。从每个平板刮下细胞并收集于LB中,并使之于37℃生长4-5小时。如前,从每个库制备冷冻储存菌株和DNA制备物,以产生各含有100个独立克隆的60个亚库。通过上述方法鉴定这些60个亚库中的2个为阳性,将那些库的克隆以允许分离单菌落的低密度于平板接种。从这两个亚库中每个库挑选单菌落(384)并在96孔平板中的200μl LB中生长6小时。为选择表达GDNFR的单个克隆,将这四个96孔平板排成由16行和24列组成的单个大矩阵。将每行和每列孔中的细胞混合以总共产生40个混合物。将这些混合物在10mL LB/Amp(100μg/mL)中生长过夜,并用Qiagen tip-20药盒制备DNA。当分析假定GDNF受体克隆时,三个行混合物和三个列混合物给出阳性信号,提示九个潜在阳性单个克隆。制备每个潜在阳性单个克隆的DNA并用EcoRⅠ和PstⅠ消化。这九个单个克隆中的三个的DNA表现出相同的限制内切酶类型,而其它六个则不相关,提示该三个代表了含有GDNFR的真正克隆。
实施例3
DNA测序和序列分析
从阳性单个克隆制备DNA并按照制造商说明书,用自动ABI373ADNA测序仪(Perkin/Elmer Applied Biosystems,Santa Clara,CA)和双脱氧染色终止子测序。使用在威斯康辛大学遗传学计算机组软件包(威斯康辛软件包程序手册,第8版,1994年9月,Genetics Computer Group,Madison,Wisconsin)中描述的FASTA(Pearson和Lipman,Proceedings OfThe National Academy of Sciences U.S.A.,85,2444-2448,1988)程序算法,将GDNF受体序列与所有可得公共数据库进行比较。大鼠GDNFR的序列特征
从上述实施例2中描述的克隆制备质粒DNA并提交DNA序列分析。该克隆的2138bp大鼠cDNA的核苷酸序列分析展现一编码468个氨基酸残基的转译蛋白的单个大开放阅读框架(图3)。
该编码序列的侧面是5’端301bp的非转译区和不含有潜在多聚腺苷酸化位点的3’端430bp的非转译区。在位于碱基对302的第一个ATG的上游存在一个框内终止密码子和其周围核苷酸前后的关系的表明该甲硫氨酸密码子是最有可能的转译起始子位点(Kozak,NucleicAcids Research.15,8125-8148,1987)。
在该大鼠cDNA克隆的3’端非转译序列的430个核苷酸中未发现多聚腺苷酸化信号。这不奇怪,因为Northern印迹分析数据显示最短的mRNA转录物约为3.6kb。
该GDNFR多肽序列具有一约19个残基(甲硫氨酸-1至丙氨酸-19,图3)的N末端疏水区,具有分泌信号肽的特征(von Heijne,ProteinSequences And Data Analysis,1,41-42,1987;von Hijne,Nucleic AcidsResearch.14,4683-4690,1986)。未发现可以做为跨膜域的内部疏水性域。但是,存在一个21个残基的羧基末端疏水性区(图3中亮氨酸-448至丝氨酸-468)并可能参与该受体糖基-磷脂酰肌醇(GPI)锚定至细胞质膜上。除三个潜在N连接糖基化位点之外,未发现保守序列或基序。该蛋白极富有半胱氨酸(该468个氨基酸残基中有31个),但是它们的间隔与在已知受体的胞外部分中发现的富含半胱氨酸域的间隔是不一样的。
使用FASTA将该GDNFR序列与可得到的公共数据库中的序列进行了比较。该检索未发现与其它已公开序列的显著同源性。一旦得到该大鼠cDNA克隆后,如以下实施例5中所述,将其进行放射性标记并用于检测从人脑黑质制备的cDNA文库。
实施例4
GDNF与表达GDNFR细胞的结合
按照先前由Jing等描述的检测方法(Journal Of Cell Biology,110,283-294,1990)进行结合检测。该检测涉及[125I]GDNF结合至大鼠感光细胞、已被转染表达GDNFR的COS7细胞或293T细胞。在293T细胞表面表达的重组GDNFR可以特异性地结合GDNF,并且结合的亲和性可以与在大鼠视网膜细胞上观测到的与GDNF结合位点结合的亲和性相比拟。
按照以上实施例1所述制备大鼠感光细胞,并在检测前2-3天以5.7×105细胞/cm2的密度接种于用聚鸟氨酸和层粘合蛋白预包被的24孔Costar组织培养平板上。将COS7细胞于检测前1天以2.5×104细胞/cm2的密度种入并采用DEAE-葡聚糖-氯喹法(Aruffo和Seed,Proceedings Of The National Academy Of Sciences U.S.A.,84,8573-8577,1987)用10-20μg质粒DNA转染。移出每个平板中的细胞并于转染后24小时再接种于24孔Costar组织培养平板的30个孔中,并使之再生长48小时。然后将细胞置于冰上5-10分钟,用冰冻清洗缓冲液清洗一次并与含有各种浓度的[125I]GDNF及含或不含未标记GDNF的0.2mL结合缓冲液于4℃培育4小时。用0.5mL冰冻清洗缓冲液清洗细胞四次并用0.5mL 1M NaOH裂解。将裂解液在1470Wizard自动伽马计数器中计数。
对一些结合试验,使用瞬时转染的293T细胞(参见以下有关293T细胞转染)。转染后二天,用2×versine从皿中移出细胞。将细胞沉淀、用冰冻结合缓冲液清洗一次并以3×105细胞/mL的密度再悬浮于冰冻结合缓冲液中。将该细胞悬液分成含有1.5×105细胞/样品的等份。然后将细胞沉淀并与含有各种浓度的[125I]GDNF在有或没有500nM未标记GDNF于4℃温和搅拌培育4小时。用冰冻清洗缓冲液清洗细胞四次并再悬浮于0.5mL清洗缓冲液中。将两个0.2mL等份的该悬浮液在伽马计数器中计数以确定与细胞连接[125I]GDNF的量。
在全部的检测中,通过使用双份样品(其中之一含有500nM未标记GDNF)测定非特异性结合。非特异性结合的水平为在没有未标记GDNF的情况下测定的特异性结合的10%-20%,并从特异性结合中减去。该检测证明细胞不结合GDNF,除非该细胞已用GDNFR cDNA克隆转染。
实施例5
GDNFR mRNA的组织分布
通过Northern印迹分析检查胚胎小鼠、成年小鼠、大鼠和人组织中GDNFR mRNA表达的形式。按照制造商程序,用随机引物DNA标记药盒(Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)标记克隆的大鼠GDNFR cDNA。将大鼠、小鼠和人组织RNA印迹(购自Clontech,PaloAlto,CA)与该探针杂交并按照制造商说明书使用ExpressHyb药盒(Clontech)试剂清洗。
从成年大鼠、小鼠和人组织制备的组织Northern印迹表明:GDNFR mRNA主要在肝脏、大脑和肾脏中高度表达。在肺中亦检测到mRNA高表达,在脾脏、肠、睾丸和骨骼肌中量较低或未能检测到。在从小鼠胚胎分离的mRNA制备的印迹中,于胚胎7天时不能检测到表达,在胚胎11天时表达变得明显,到胚胎17天时表达非常高。在从成人大脑的几个亚区分离的组织中GDNFR mRNA以相对平稳的水平表达。GDNFR mRNA在成人大脑中的表达对任何特定区域几乎都未显示特异性。
在大多数组织中,存在两个不同大小的转录物。在小鼠和人组织中,发现8.5和4.4kb的转录物,而在大鼠中该转录物是8.5和3.6kb。较大和较小转录物的相对量随组织类型变化,该较小的转录物主要在肝脏和肾脏中,该较大转录物在大脑中更丰富。通过Scatchard分析检测GDNF与用在pBKRSV载体中克隆的GDNFR cDNA转染的293T细胞的结合。检测到二类结合位点,一类的结合亲和性在低pM范围,而另一类的亲和性为约500pM。
实施例6
重组的人GDNFR
用实施例1的大鼠GDNFR cDNA克隆做为探针筛选克隆于噬菌体gt10中的成人黑质cDNA文库(5’端加附加物伸长的cDNA文库,Clontech,Palo Alto,CA)。按照制造商说明书使用随机引物DNA标记药盒(Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN),将该探针用[32P]-dNTP标记。将来自该人黑质cDNA文库的约1.2×106gt10噬菌体接种于15cm琼脂糖平板上并在双层硝酸纤维素滤膜上复制。然后用该放射性标记探针通过杂交筛选该滤膜。将该滤膜在200mL的6×SSC、1×Denhardts、0.5%SDS、50μg/mL鲑鱼精DNA中于55℃预杂交3.5小时。加入2×108cpm放射性标记的该探针后,继续杂交18小时。然后将滤膜在0.5×SSC、0.1%SDS中于55℃中清洗二次,每次30分钟,并用增强屏对X光胶片曝光过夜。
分离出5个阳性噬菌斑,其cDNA插入物代表该人GDNFR cDNA的一部分。与图3(bp 0-2140)中描述的大鼠GDNFR核酸序列相比较,发现这5个人GDNFR克隆含有以下序列:
表3
克隆2 1247至2330(SEQ ID NO:21)
克隆9 1270至2330(SEQ ID NO:23)
克隆21-A -235至1692(SEQ ID NO:9)
克隆21-B -237至1692(SEQ ID NO:11)
克隆29 805至2971(SEQ ID NO:15)
如图5描述将这些序列对齐并比较,提供了人GDNFR的共有序列。根据该人cDNA序列预测的转译产物由465个氨基酸组成并与大鼠GDNFR有93%相同。
为产生编码全长GDNFR的人cDNA,将克隆21B和2的部分于一个内部BglⅡ位点剪接在一起并亚克隆入哺乳动物表达载体pBKRSV(Stratagene,La Jolla,CA)。
可以制备重组的人GDNFR表达载体以在哺乳动物细胞中表达。如上表明,亦可以在诸如细菌细胞的非哺乳动物细胞中表达。可以将本文公开的核酸序列置于市售哺乳动物载体(例如CEP4,Invitrogen)以在哺乳动物细胞中表达,包括市售的人胚胎肾细胞系“293”。为在细菌细胞中表达,可以通常除去编码前导序列的部分(例如图1的核酸1-590)。可以在N末端添加一额外的甲硫氨酰用于细菌表达。另外,可以用不同的前导序列或其它为便于表达而切割的序列置换天然的前导序列。
实施例7
可溶性GDNFR构建物
制备了可溶性人GDNFR蛋白产物。以下例子提供四种不同形式,仅在羧基末端不同,由图2中提供的残基号码表明。两种是于紧靠疏水性尾上游和最后一个半胱氨酸残基下游的不同位点截短的可溶性形式。另两种是同样截短蛋白的但添加了“FLAG”序列,它是有市售抗体的一个八肽(Eastman Kodak)。该FLAG序列是H2N-DYKDDDDK-COOH。方法
用EcoRⅠ消化含有几乎整个人GDNFR编码区的λ噬菌体克隆#21以切下该cDNA插入物。将该片段纯化并连接进入EcoRⅠ切割的pBKRSV载体(Stratagene,La Jolla,CA)以制备克隆21-B-3/pBKRSV。以该人GDNFR克隆21-B-3/pBKRSV做为模板,在PCR反应中使用如下所示的引物1和2。PCR条件是94℃5分钟,接着是25个周期的94℃1分钟;55℃1分钟;72℃2分钟和于72℃最后延伸5分钟。这样产生了一个由该人GDNFR克隆的核苷酸1265-1868加上由引物2提供的终止密码子和HindⅢ限制位点所组成的片段。该片段用限制性酶HindⅢ(含于引物2中)和BglⅡ(在人GDNFR中的位置为1304)消化,产生的572核苷酸的片段用凝胶电泳分离。该片段含有从异亮氨酸-255至甘氨酸-443的该hGDNFR编码区。使用类似的策略,用引物1和3制备具有BglⅡ和HindⅢ末端、编码异亮氨酸-255至脯氨酸-446的片段。设计引物4和5以产生编码hGDNFR相同区域和引物1和3、但添加了该Flag肽编码序列(IBI/Kodak,New Haven,CN)的片段。该Flag肽序列由8个氨基酸(H2N-Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-COOH)组成,有其市售抗体。引物1和4或1和5被用于使用如前的同样模板PCR反应中,并如前用HindⅢ和BglⅡ消化。该方法产生了编码异亮氨酸-255至甘氨酸-443和异亮氨酸-255至脯氨酸-446但在其羧基末端添加了该Flag肽的片段。引物1) 5′-CTGTTTGAATTTGCAGGACTC-3′(SEQ ID NO:30)2) 5′-CTCCTCTCTAAGCTTCTAACCACAGCTTGGAGGAGC-3′(SEQID NO:31)3) 5′-CTCCTCTCTAAGCTTCTATGGGCTCAGACCACAGCTT-3′(SEQ ID NO:32)4) 5′-CTCCTCTCTAAGCTTCTACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCACCACAGCTTGGAGGAGC-3′(SEQ ID NO:3 3)5) 5′-CTCCTCTCTAAGCTTCTACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCTGGCTCAGACCACAGCTT-3′(SEQ ID NO:3 4)
将如上述制备的所有四个片段转移回21B3/pBKRSV。该21B3/pBKRSV克隆用BglⅡ和HindⅢ消化并用小牛肠碱性磷酸酶(CIAP)处理。将含有该载体和人GDNFR编码区直至该BglⅡ位点的大片段进行凝胶纯化并从凝胶提取。将如上述制备的四个BglⅡ/HindⅢ片段的每一个都连接到该载体上,以产生在该pBRSV载体中的下列构建物:
表41)GDNFR/gly-443/pBKRSV hGDNFR终止于甘氨酸443,后接终
止密码子2)GDNFR/pro-446/pBKRSV hGDNFR终止于脯氨酸446,后接终
止密码子3) GDNFR/gly-443/Flag/pBKRSV hGDNFR终止于甘氨酸443并带C末
端Flag标记,后接终止密码子4)GDNFR/pro-446/Flag/pBKRSV hGDNFR终止于脯氨酸446并带C末
端Flag标记,后接终止密码子
通过DNA测序确认所有克隆的正确构建。使用在下述pBKRSV多接头序列中的酶位点,将来自该pBKRSV克隆的插入物转移至其它表达载体。亦已将可溶性GDNFR(例如sGDNFR/gly和sGDNFR/pro)转移进入瞬时表达载体并进入pDSR-2中以在CHO细胞中稳定表达。pDSRα2+PL克隆:
将适当的pBKRSV克隆用XbaⅠ和SalⅠ消化。将插入片段连接至用同样的酶切割并用CIAP处理的pDSRα2+PL。该构建物可以用于在CHO细胞中稳定表达GDNFR。pCEP4克隆:
将适当的pBKRSV克隆用SpeⅠ和XhoⅠ消化。将插入片段连接至用NheⅠ(SpeⅠ末端)和XhoⅠ消化并用CIAP处理的pCEP4(Invitrogen,SanDiego,CA)。该构建物可以用于瞬时表达GDNFR。
基本上按照于1990年3月29日提交的共同拥有和共同未决美国专利申请序号501,904(亦可参见于1990年5月18日提交的欧洲专利申请90305433,公告EP398 753号和WO 90/14363(1990))(其说明书通过引用结合到本文中)中描述的方法制备质粒构建物pDSR-2。本领域技术人员会理解可以用各种编码GDNFR类似物的核酸序列。
另一构建物是pDSRα2,它是质粒pCD(Okayama&Berg,Mol.CellBiol.3:280-289,1983)的衍生物,具有三个主要修饰:(ⅰ)SV40多聚腺苷酸化信号已被来自牛滤泡刺激激素的α亚基α-bFSH(Goodwin等,Nucleic Acids Res.11:6873-6882,1983)的信号取代;(ⅱ)已在该表达盒的下游插入小鼠二氢叶酸还原酶小基因(Gasser等,Proc.Natl.Acad.Sci.79:6522-6526,1982)以选择和扩增该转化体;和(ⅲ)已克隆了267 bp含有人I型T-细胞白血病病毒(HTLV-I)长末端重复(LTR)的“R元件”和部分“U5”序列的片段,并按照前述(Takebe等,Mol.Cell Biol.8:466-472,1988)插入到该SV40启动子和该剪接信号之间。
碘处理的GDNF与细胞表面的结合确认了GDNFR在CHO细胞中的表达。如上讨论,可以用该重组表达的可溶性GDNFR蛋白产物增强GDNF的活性或细胞特异性。亦可以将连接了可检测标记的可溶性GDNFR如上述用于诊断应用。
实施例8
GDNF与GDNFR的化学交联
为研究其结合特性和分子特征,通过转染该大鼠cDNA克隆将GDNFR瞬时表达于293T细胞表面。按照制造商说明书使用磷酸钙转染系统(GIBCO/BRL,Gaithersburg,MD)进行293T细胞转染。转染2天后,通过2xversine处理移出细胞,用清洗缓冲液清洗一次,然后以2×106细胞/mL的密度再悬浮于清洗缓冲液中。将完全一样的一组细胞与0.5u/mL PI-PLC在[125I]GDNF结合前于37℃培养30分钟。将这些细胞用冰冻结合缓冲液清洗三次,然后用1-3nM[125I]GDNF与其它细胞一起于4℃培养4小时。将细胞用冰冻清洗缓冲液清洗四次,再悬浮于添加了用于交联的1mM双辛二酸(BS3Pierce,Rockford,IL)的清洗缓冲液并于室温培育30分钟。用TBS清洗三次后,将完全一样的一组样品用0.5u/mL PI-PLC于37℃处理30分钟。将这些细胞沉淀并收集上清液。然后用清洗缓冲液清洗细胞并与其它细胞一起用2×SDS-PAGE样品缓冲液裂解。将细胞裂解液和收集的上清液在7.5%SDS-PAGE上分辨。
将细胞悬液分成含有1.5×105细胞/样品的等份。然后沉淀细胞,并与含有各种浓度的[125I]GDNF在有或没有500nM未标记GDNF条件下于4℃温和搅拌培育4小时。用冰冻清洗缓冲液清洗细胞四次并再悬浮于0.5mL清洗缓冲液中。将两个0.2mL等份的该悬浮液在伽马计数器中计数以确定与细胞连接[125I]GDNF的量。
尽管模拟转染的293T细胞未展示任何GDNF结合能力,但GDNFR转染的细胞甚至在pM浓度时强烈结合[125I]GDNF。这种结合几乎完全被500nM未标记GDNF抑制,表明天然GDNF对该表达受体的特异性结合。
由293T细胞表达的GDNFR可以通过用磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC,Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)处理从细胞释放。在配体结合前用PI-PLC处理转染细胞,几乎完全消除了该细胞的GDNF结合能力。另外,在交联后处理该转染细胞把大多数交联产物释放到培养基中。这些结果强有力地提示GDNFR通过GPI键合固定于细胞膜上。
交联数据进一步表明GDNFR的分子量为约50-65kD,提示有低水平的糖基化。尽管主要交联种类具有的分子量与该受体的单体一致,但已发现一小类具有约为预期为二聚体的质量。
实施例9
GDNF信号发生由GDNFR和Ret受体蛋白
酪氨酸激酶的复合物介导
前言
在GDNF基因中携带定向无效突变的小鼠在得自神经脊细胞的组织、自主神经系统、三叉及脊髓运动神经元中展示出各种缺陷。最严重的缺陷是缺少肾脏和在消化道中完全没有肠神经元。GDNF剔除小鼠的表现型与c-ret剔除动物的表现型(Schuchardt等1 994)惊人地相似,提示在GDNF和c-ret信号传导通道之间可能的联系。
用得自基因转移实验中分离的癌基因的探针鉴别了原癌基因c-ret(Takahashi等,Cell.42,581-588,1985;Takahashi和Cooper,Mol.Cell.Biol.,7,1378-1385,1987)。该c-ret cDNA的序列分析揭示编码新受体蛋白酪氨酸激酶(PTK)的大开放阅读框。已将受体PTKS家族按照胞外域结构和与胞内激酶域内的序列同源性分组为亚家族(van der Geer等,1994)。Ret的独特胞外域结构使其置于任何其它已知受体PTK亚家族之外,它包括一个信号肽、一个类钙粘连素基序和一个富含半胱氨酸区(van Heyningen,Nature,367,319-320,1994;Iwamoto等,1993)。原位杂交和免疫组织化学分析显示在小鼠胚胎的发育中的中枢及外周神经系统和排泄系统中有ret mRNA和蛋白的高水平表达(Pachnis等,1993;Tsuzuki等,Oncogene,10,191-198,1995),提示该Ret受体或者在这些组织的发育或者在这些组织的功能中起作用。由于尚未识别出该Ret受体的功能配体,因此限制了对Ret信号发生的分子机制的深入理解。在该c-ret基因中的突变与在家族性髓状甲状腺癌(FMTC)和2A型(MEN2A)和2B型(MEN2B)多发性内分泌腺瘤形成中的遗传性的易患癌症相关。这些疾病可能是由组成型地激活该Ret激酶的“功能增加”突变引起。(Donis-Keller等,Hum.Molec.Genet.2,851-856,1993;Hofstra等,Nature.367,375-376,1994;Mulligan等,Nature.363,458-460,1993;Santoro等,Science.267,381-383,1995)。它们特异地赋予衍生自神经脊突的组织易发恶性肿瘤,在该组织中ret在早期发育中正常表达。另一与ret相关的遗传性疾病先天性巨结肠(HSCR)的特征在于在下消化道中先天性缺乏副交感神经支配(Edery等,Nature.367,378-380,1994;Romeo等,1994)。HSCR最可能的原因是导致产生缺失激酶域的截短Ret蛋白的无义突变或灭活该Ret激酶的错义突变。如上述,小鼠中该c-ret原癌基因的定向破坏导致肾发育不全或严重发育不全和在消化道中缺乏肠神经元(Schuchardt等,1994)。这种表现型与GDNF剔除小鼠的表现型密切地相似。综合起来,这些数据提示Ret和GDNF均参与对肾脏和肠道神经系统发育关键的信号传导通道。然而不知道Ret和GDNF是怎样参与的。
如上述通过表达克隆,对GDNFR cDNA的分离和表征导致在转化的人胚胎肾细胞系293T中表达GDNFR。转化导致出现高(Kd约为2PM)和低(Kd约为200pM)亲和性的结合位点。所述高亲和性位点可以由GDNFR自身的同源二聚体或同源寡聚体组成、或由GDNFR与其它分子的异源二聚体或畀源寡聚体组成。如上所述,因为GDNFR缺失细胞质域,它必须通过一个或多个辅助分子发挥功能,以便在GDNF信号传导中起作用。在本研究中我们确认在GDNFR的存在下,GDNF与Ret蛋白酪氨酸激酶受体相结合,并快速诱导Ret自磷酸化。
结果表达与GDNF以高亲和性结合的GDNFR的Neuro-2a细胞
Neuro-2a是内源表达高水平Ret蛋白的小鼠成神经纤维瘤细胞系(Ikeda等,Oncogene.5,1291-1296,1990;Iwamoto等,Oncogene.8,1087-1091,1993;Takahashi和Cooper,1987),但不表达Northem印迹评价的可检测水平的GDNFR mRNA。为确定Ret是否能在GDNFR存在下与GDNF结合,进行一项研究以测定[125I]GDNF与工程化改造的表达GDNFR的Neuro-2a细胞的结合。用含有该大鼠GDNFR cDNA的哺乳动物表达载体(例如上述表达质粒)转染Neuro-2a细胞。检测了三个克隆系NGR-16、NGR-33和NGR-38结合[125I]GDNF的能力。在培育末期除去未结合的[125I]GDNF,并按照实验程序测定与细胞结合的放射性活性的量。所有三个系都能特异性地结合[125I]GDN,而亲代Neuro-2a细胞几乎没有或没有表现出与[125I]GDNF结合(图6)。通过加入500nM未标记GDNF可以有效地竞争结合。这些结果证明Neuro-2a细胞上表达的Ret受体不能在缺乏GDNFR的情况下结合GDNF,并且与以前的GDNFR在Neuro-2a细胞中没有可以观察到的水平的表达的观察一致。
在很宽的配基浓度范围(存在或缺乏500nM未标记GDNF的情况下0.5pM至1nM[125I]GDNF)测定[125I]GDNF与NGR-38细胞的平衡结合(图7A)。培育后,除去未结合[125I]GDNF并按照实验程序所述测定与细胞结合的放射性活性。结果描述于图7中:(A)[125I]GDNF与NGR-38细胞(圆圈)和Neuro-2a细胞在未标记GDNF存在下(空心圆和空心方块)或不存在下(实心圆和实心方块)的平衡结合;(B)[125I]GDNF与NGR-38细胞结合的Scatchard分析。Neuro-2a细胞甚至在[125I]GDNF为1nM浓度下没表现出多少的结合,并且这种结合不为加入过量未标记的GDNF所影响。如图7B所示通过Sccatchard作图,分析NGR-38细胞的结合。检测到二类结合位点,一类的Kd=1.5±0.5pM,而另一类的Kd=332±53pM。这些解离常数与如上述瞬时表达GDNFR的293T细胞中的高和低亲和性结合位点得到的值非常相似。GDNF与表达GDNFR的Neuro-2a细胞中的Ret结合
为确定该Ret受体PTK是否可以在表达GDNFR的细胞中与GDNF结合,使用NGR-38和亲代Neuro-2a细胞进行交联试验。将NGR-38细胞与[125I]GDNF培育,用交联试剂处理,然后或者直接在SDS-PAGE样品缓冲液中裂解或者在Triton X-100裂解缓冲液中裂解,并按照实验程序描述进一步用抗Ret抗体免疫沉淀。在不存在(NR)或存在(R)巯基乙醇的情况下通过SDS-PAGE分析该免疫沉淀物。裂解物用Ret特异性抗体处理、免疫沉淀并在还原条件下通过SDS-PAGE分析(参见图8,如下标记条带:~75kD,实心三角;~150kD,空心三角;~185kD,实心箭头;~250kD,星号;~400kD,空心箭头)。最显著交联的种类位于~75kD和~185kD,而低强度的条带为~150kD和~250kD。亦可见到非常弱的~400kD条带(图8,泳道2)。当用非还原性SDS-PAGE分析免疫沉淀物时,该~75kD、~150和~185kD条带以与在还原胶中约同样的强度存在,但是该~400kD条带的量显著增加(图8,泳道4)。位于~250kD的条带亦变得显著。
在还原和非还原条件下,当使用亲代Neuro-2a细胞而不是NGR-38(图8,泳道1和3)时,观察到类似分子量但强度急剧减弱的条带。~75kD和~150kD种类可能代表GDNF和GDNFR的交联复合物,因为具有相等分子量的种类是在不表达Ret的293T细胞中由交联产生的。此外,因为Ret的分子量是170kD,任何包括Ret的复合物至少必须是这个大小。
这些复合物被抗Ret抗体免疫沉淀的事实表明:它们是Ret和在该凝胶分析条件下被破坏的该GDNF/GDNFR复合物之间的结合的产物。预期位于~185kD的宽条带可能由一个Ret分子(170kD)与一个分子单体重组GDNF(15kD)交联组成,尽管可以包括一些二聚体GDNF。通过一个独立的实验证实了Ret在该种类中的存在,其中当未标记GDNF与NGR-38细胞交联并用Western印迹结合抗Ret抗体检测该产物时,观察到同样分子量的条带(未给出数据)。
未可靠地鉴别该~400kD条带,部分是因为难以估计其分子量。它只在非还原条件下显著的事实表明它是在还原条件下观察到的一种或多种种类的二硫键连接的二聚体。最有可能的解释是它是代表该185kD种类的二聚体,尽管它可能是由两个Ret、一个或两个GDNFR和一个或两个GDNF分子组成的高分子量复合物的混合物。尚未确定该~250kD条带的准确身份。一种可能是它代表该~75kD(GDNF+GINFR)和~185kD(GDNF+Ret)复合物的交联异源二聚体。GDNF刺激在表达GDNFR的Neuro-2a细胞中的Ret自磷酸化
在GDNFR存在的情况下该Ret蛋白酪氨酸激酶受体与GDNF结合的能力导致研究GDNF刺激的Ret的自磷酸化。NGR-38细胞用GDNF处理、裂解并将该裂解物用抗Ret抗体免疫沉淀。按照实验程序所述用抗磷酸酪氨酸抗体通过Western印迹分析该免疫沉淀物。当用产生于或者哺乳动物(CHO细胞,图9A,泳道4)或者大肠杆菌细胞(图9A,泳道1、3)的纯化的重组GDNF处理NGR-38细胞(图9A,泳道2-4)时,在170kD观察到一条强烈的条带,表明在Ret的成熟形式上的酪氨酸残基的自磷酸化。在GDNF处理的Neuro-2a细胞中观察到一个弱得多的对应条带(图9A,泳道1)。在另一糖基化的Ret150kD前体形式上未观察到磷酸化作用(图9A)。由GDNF诱导的Ret自磷酸化是剂量依赖的。在NGR-38细胞中的GDNF诱导的Ret酪氨酸磷酸化作用的剂量反应和动力学示于板B和C中。在所有的板中,用实心箭头标明该酪氨酸磷酸化的170 kD Ret条带。由用抗Ret抗体(SantaCruz,C-19,Cat.#sc-167)重新探测该免疫印迹测定的每个泳道中Ret蛋白的上样量示于板A的右侧。位于~150kD的条带代表未进行自磷酸化的另一糖基化未成熟形式的Ret。如图9B中所示,在NGR-38细胞中的Ret自磷酸化的刺激可以用50pg/mL的GDNF检测,并且该反应于20-50ng/mL的GDNF时饱和。处理后0-20分钟在NGR-38细胞中由纯化的重组GDNF对Ret自磷酸化的刺激示于图9C中。在GDNF处理一分钟内可以观察到Ret自磷酸化水平提高,并于处理10分钟时最高(图9C)。GDNF和可溶性GDNFR在Neuro-2A细胞中诱导Ret自磷酸化
如上讨论的,GDNFR通过GPI键合固定于细胞质膜上,并可以通过用磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)处理而释放。当将NGR-38细胞与PI-PLC培育时,在这些细胞中GDNF诱导的Ret受体自磷酸化被消除(图10A;PI-PLC处理(泳道1)或未处理(泳道2和3)NGR-38细胞与GDNF(泳道1和3)或不与GDNF(泳道2)培育,并按照实验程序描述的通过免疫印迹分析Ret自磷酸化)。
图10B描述了按照实验程序所述,通过免疫印迹分析Ret自磷酸化:在从Neuro-2a或NGR-38细胞得到的PI-PLC/CM存在下(泳道5-8)或不存在下(泳道1-4)用GDNF处理(泳道2、4、6、8)或不用GDNF处理(泳道1、3、5、7)的亲代Neuro-2a细胞。在板A和B中,用实心箭头标记自磷酸化的170kD Ret条带。当将含有通过PI-PLC(PI-PLC/CM)处理NGR-38细胞释放的可溶性GDNFR的条件培养基与GDNF一起加入亲代Neuro-2a细胞时,观察到与GDNF处理NGR-38细胞所得到的相比拟的Ret受体的自磷酸化(图10B,泳道2和8)。当未加入GDNF时,或当测试得自PI-PLC处理的Neuro-2a细胞的条件培养基时,仅观察到本底水平的Ret自磷酸化(图10B,泳道3-7)。Ret-Fc融合蛋白阻断由GDNF和可溶性GDNFR诱导的Ret磷酸化
为确认在GDNFR存在的情况下由GDNF诱导的Ret磷酸化是受体自磷酸化的结果,进行了一项研究以确定Ret胞外域/免疫球蛋白Fc融合蛋白(Ret-Fc)是否可以阻断Ret活化。由于阻断在NGR-38细胞上表达的大量GDNFα受体存在技术困难,因而使用Neuro-2a做为靶细胞,并从用PI-PLC处理的NGR-38细胞液中移出的培养基做为GDNFR源进行Ret磷酸化检测。用包括GDNF(50ng/mL)、含有可溶性GDNFR的培养基(例如得自NGR-38细胞的PI-PLC/CM)和或者单独或者如图11中表明的各种组合的不同浓度的Ret-Fc融合蛋白的各种组合的混合物处理细胞。用GDNF、含有可溶性GDNFR的培养基、Ret-Fc或预培育的混合物处理Neuro-2a细胞。然后裂解该细胞,并按照实验程序描述,用抗Ret抗体通过免疫沉淀分析裂解物的c-Ret自磷酸化。用抗磷酸酪氨酸抗体通过Western印迹分析该免疫沉淀物。
GDNF和含有可溶性GDNFR培养基的预培育混合物诱导在Neuro-2a中表达的Ret受体的酪氨酸磷酸化,其水平可以与GDNF处理的NGR-38对照细胞的水平相当(图11,泳道7和2)。自磷酸化170kD Ret条带的位置用实心箭头标记。当将Ret-Fc融合蛋白包括于该预培育GDNF/GDNFR混合物中时,Ret磷酸化以剂量依赖方式被抑制(图11,泳道8-10)。这表明Ret磷酸化是由GDNFR介导的GDNF/Ret相互作用的结果。在未处理的Neuro-2a细胞或在不存在GDNFR的情况下用GDNF或Ret-Fc融合蛋白的任何组合处理的细胞中,仅观察到本底水平的Ret磷酸化(图11,泳道3-6)。GDNF诱导在胚胎运动神经元中表达的c-RET的自磷酸化
脊髓运动神经元是GDNF体内作用的主要靶之一(Henderson等,Science.266,1062-1064,1994;Li等,Proceedings Of The NationalAcademy Of Sciences,U.S.A.92,9771-9775,1995;Oppenheim等,Nature.373,344-346,1995;Yan等,Nature.373,341-344,1995;Zurn等,Neuroreport.6,113-118,1995)。为测试GDNF诱导这些细胞中Ret自磷酸化的能力,用(泳道2和4)和不用(泳道1和3)20ng/mL GDNF处理胚胎大鼠脊髓运动神经元并接着裂解细胞,用抗Ret抗体免疫沉淀,并按照实验程序描述的,用抗磷酸酪氨酸抗体通过Western印迹进行分析。在用GDNF处理细胞的裂解物中,观察到分子质量为~170kD的酪氨酸磷酸化蛋白条带(图12,泳道2)。在仅用结合缓冲液处理的细胞中未观察到这种信号(图12,泳道1)。当将同一Western印迹滤膜剥离并用抗Ret抗体重新探测(即在每条泳道中上样的c-Ret蛋白量用抗Ret抗体重新探测该免疫印迹而测定)时,具有同样分子量和类似强度的条带在两个样品中都出现(图12,泳道3和4)。在GDNF处理细胞中的磷酸酪氨酸条带与该Ret蛋白条带共迁移,表明GDNF刺激Ret的自磷酸化。该自磷酸化Ret条带(泳道1和2)和对应的蛋白条带(泳道3和4)用实心箭头标记。
讨论
多肽生长因子通过和与其相关的细胞表面受体结合而引起生物学效应。受体可以根据其结构和作用机制分成几个组。这些分类包括蛋白酪氨酸激酶(PTK)、丝氨酸/苏氨酸激酶和细胞因子受体。受体PTK信号发生由与配基的直接相互作用启动,它诱导受体二聚体化或寡聚化,由此依次导致受体自磷酸化。该激活的受体接着吸收并磷酸化胞内底物,启动达到生物学反应顶点的级联事件(Schlessinger和Ullrich,Neuron 9,383-391,1992)。对比之下,通过丝氨酸/苏氨酸激酶或细胞因子受体的信号传导通常涉及形成多组分受体复合物,其中配基结合和信号传导组分是独特的。实例是TGF受体复合物、由独立的结合组分(Ⅱ型)和信号(Ⅰ型)组分组成对丝氨酸/苏氨酸激酶受体和CNTF家族。CNTF、白介素-6(IL-6)和白细胞抑制因子(LIF)分别在其各自的受体复合物中共享共同的信号发生组分gp130和/或LIFR。虽然这些复合物的配基特异性是由各个单独配基的特异性结合亚基决定的,但信号传导需要配基和配基结合亚基的初始复合物与不能直接结合配基的其它受体亚基的结合(Ip等,Cell.69,1121-1132,1992)。在CNTF受体复合物中,该配基结合组分是CNTF受体(CNTFR),它象GDNFR一样,是GPI固定的膜蛋白。本发明涉及受体PTK的第一个例子的描述,该受体PTK的自磷酸化依赖于与独立的配基特异性结合组分的结合。
本研究确认需要GDNFR这种GPI连接的与GDNF以高亲和性结合的膜蛋白,以使GDNF与该Ret受体PTK有效地结合。缺乏GDNFR时,GDNF不能与Ret结合或刺激Ret受体自磷酸化。存在GDNFR时,GDNF与Ret结合并以剂量依赖方式快速诱导Ret自磷酸化。GDNFR能够如上述以膜固定形式或可溶性形式而起作用(图11)。浓度为50pg/mL(1.7pM)的GDNF能够在表达GDNFR的细胞中激活Ret酪氨酸激酶。这与在NGR-38细胞上发现的高亲和性GDNF结合位点的解离常数(1.5pM)相一致。GDNF对Ret磷酸化的快速诱导(处理1分钟后即可检测到)和Ret-Fc阻断自磷酸化的能力提示Ret是直接被激活,而不是做为某些其它受体磷酸化的下游结果。
交联研究支持Ret与GDNF的有效结合取决于GDNFR的假设。虽然GDNF与表达高水平GDNFR的NGR-38细胞中的Ret的交联是坚固的,但是在亲代Neuro-2a细胞中几乎检测不到交联产物。尽管难以最终识别所有交联复合物,但该数据清楚地证明Ret与GDNF的结合取决于GDNFR的存在,并证明GDNFR被包埋于一些交联产物中。不清楚Neuro-2a细胞中较少的交联种类存在的原因。尽管通过Northern印迹不能检测到Neuro-2a细胞中GDNFR mRNA的表达,但GDNFR以非常低的水平在这些细胞中表达是可能的。
在培养的大鼠胚胎脊髓运动神经元中Ret可以被GDNF激活的事实进一步证明该Ret/GDNF相互作用的生物学联系。这些细胞是GDNF在体内的基本靶,并已显示在体外对低剂量GDNF的应答(Henderson等,1994)。当用PI-PLC预处理该运动神经元细胞时,Ret磷酸化刺激被取消(数据未显示),提示Ret被GDNF的激活需要GDNFR。
尽管配基与受体胞外域的结合是激活其它已知受体PTK的第一步,本数据已显示GDNF和Ret并非这种情况。图13描述GDNF与GDNFR和Ret结合的模型,以及接着对GDNF应答激活Ret PTK。在该过程中的初始事件是二硫键连接的二聚体GDNF与或者单体或者二聚体形式的GDNFR结合。尽管目前没有二聚体GDNFR存在的直接证据,但用GDNFR cDNA转染293T细胞时,出现二类结合位点。对此观察的最简单解释是存在单体和二聚体GDNFR,各有其自己的配基结合亲和性。这与GDNF结合亲和性明显地不受Ret存在的影响的发现一致。因为本实验不论及是否在不存在GDNF的情况下二聚体GDNFR与其单体平衡的问题或二聚体化是否由GDNF结合诱导的问题,所以提出这些可能性做为另一种路径。由二聚体GDNFR和二聚体GDNF组成的复合物可以结合两个Ret分子,形成活性信号发生复合物。至于其它PTK,两个Ret分子细胞内催化域之间的紧密接触有可能导致受体自磷酸化。引起Ret稳态二聚体化的MEN2A突变,导致该Ret激酶的组成型激活的事实(Santoro等,1995)支持Ret通过这种机制起作用的这种概念。
已报道运动神经元以低至5fM的ED50对GDNF应答(Henderson等,1994)。尽管难以用生物学反应的ED50比较结合亲和性,但有在这些细胞上可能存在很高亲和性的GDNF结合位点。已报道诸如胚胎小鸡交感神经元的其它细胞以1-5nM的Kd与GDNF结合(Trupp等,Journal Of Cell Biology.130,137-148,1995)。GDNFR不太可能涉及如此低亲和性位点的受体复合物,但可能存在GDNF和Ret之间的弱直接相互作用。
在发育中的中枢神经和外周神经系统的许多细胞谱系(包括肠神经系统的细胞)中的胚胎发生中观察到c-ret的表达(Pachnis等,Development,119,1005-1017,1993;Tsuzuki等,1995)。在神经系统之外,已在肾脏的中肾管、输尿管芽上皮和集合管中检测到c-ret表达(Pachnis等,见上述;Tsuzuki等,1995)。亦在得自神经脊突(Ikeda等,1990)和得自外科切除成神经细胞瘤(Nagao等,1990;Takahashi和Cooper,1987)的所有成神经细胞瘤细胞系中检测到Ret表达。在中枢神经系统和外周神经系统中、以及在胚胎发育的非神经元组织中都已观察到GDNF表达。在许多非神经元组织中发现的GDNF表达水平比在神经系统中的高(Choi-Lundberg和Bohn,Brain Res.Dev.Brain Res.85,80-88,1995)。尽管未广泛研究GDNFR的表达,初步的Norther印迹分析在成年大鼠和小鼠的肝脏、大脑和肾脏中检测到高水平的GDNFR mRNA的存在。ret、GDNF和GDNFR在发育中的神经系统和肾中的表达类型的相似性与它们在发育中的联合作用相一致。
已假设哺乳动物肾脏的发育发生于后肾和发育中的输尿管(从中肾管的尾部发育的分枝)之间的交互式相互作用(Saxen,Organogenesisof the kidney.Development and Cell Biology series,Cambridge UniversityPress,Cambridge,England,1987)。尽管在发育胚胎的输尿管芽而不是在周围间质中发现Ret表达,在肾脏的未分化而不是成熟的后肾帽中检测到GDNF表达。这些观察提示GDNF与Ret之间的相互作用对启动输尿管结构的发育负责。GDNF和ret基因的定向破坏对此假设提供了进一步的支持,这种破坏导致肾脏的很相似的表现型缺陷(Schuchardt等,Nature.367,380-383,1994;Sanchez,正在出版中)。在GDNF剔除(-/-)和ret剔除(-/-)的动物中观察到的另一主要表现型缺陷是在消化道中完全丧失肠神经元。已把先天性巨结肠(特征在于在下消化道中先天性缺乏副交感神经支配的遗传性疾病)也与ret中“功能丧失”突变相联系(Romeo等,Nature.367,377-378,1994.Edery等,1994)。一个较近的报道(Angrist等,Hum.Mol.Genet.4,821-830,1995)表明与较早的观察相反,一些先天性巨结肠病人并不携带ret中的突变。现在预期这种病人可能携带GDFN、GDNR或该信号发生路径的一些其它关键组分中的突变。
实验程序[125I]GDNF与表达GDNFR的Neuro-2a细胞的结合
如上述按照制造商说明书使用磷酸钙转染系统(GIBCO/BRL),用表达质粒转染Neuro-2a细胞(ATCC#CCL131)。将转染的细胞通过在400μg/mL G418抗生素(Sigma)中生长以选择质粒表达。扩增G418抗性克隆并通过与[125I]GDNF(Amersham,Inc.,dy定制的碘化,目录#IMQ1057)结合检测GDNFR表达。以3×104细胞/cm2的密度将各个克隆的细胞接种于用聚鸟氨酸预包被的24孔组织培养平板(BectonDickinson)的双份孔中。用冰冻清洗缓冲液(含有25mM HEPES的DMEM,pH7.5)清洗细胞一次,然后与结合缓冲液(清洗缓冲液加0.2%BSA)中的50pM的[125I]GDNF在500mM未标记GDNF存在或不存在的情况下于4℃培育4小时。用冰冻清洗缓冲液清洗细胞四次并在1M NaOH中裂解,在1470 Wizard自动伽马计数器(Wallac Inc.)中测定细胞结合的放射性标记的量。通过在缺乏和存在未标记GDNF的情况下[125I]GDNF与细胞结合的比例,估计由单个克隆表达的GDNFR量。选择三个克隆做为高、中、低水平GDNFR表达者的代表以用于结合实验。在缺乏和存在未标记GDNF的情况下这些克隆与[125I]GDNF结合的比例是:NGR-38)16:1、NGR-16)12.8:1和NGR-33)8:1。如上述进行[125I]GDNF与NGR-38细胞的平衡结合,只是标记GDNF的浓度范围为0.5pM至1nM。在所有的检测中,从缺乏未标记GDNF的结合中减去非特异性结合(通过在有500pM未标记GDNF的情况下与细胞结合的放射性标记数量估计)。通过Scatchard作图分析结合数据。化学交联
将Neuro-2a或NGR-38细胞用磷酸缓冲盐水(PBS,pH7.1)清洗一次,然后用结合缓冲液中的1或3nM[125I]GDNF在有或没有500nM未标记GDNF的情况下于4℃处理4小时。结合后,将细胞用冰冻清洗缓冲液清洗四次,用在清洗缓冲液中的1mM双辛二酸(BS3 Pieree)于室温培育45分钟。通过用Tris缓冲盐水(TBS,pH7.5)清洗细胞三次,抑制该交联反应。然后将这些细胞或者在SDS-PAGE样品缓冲液(80 mM Tris HCl[pH 6.8],10%甘油,1%SDS,0.025%溴酚蓝)或在Triton X-100裂解缓冲液(50mM Hepes,pH7.5,1%Triton X-100,50mM NaCl,50mM NaF,10mM焦磷酸钠,1%抑肽酶(Sigma,目录#A-6279),1mM PMSF(Sigma,目录#P-7626),0.5mM Na3VO4(Fisher目录#S454-50))中直接裂解。通过离心澄清裂解液,与5μg/mL抗Ret抗体(Santa Cruz Antibody,C-19,Cat.#SC-167)一起培育,通过与蛋白A-Sepharose CL-4B(Pharmacia)一起沉淀收集产生的免疫复合物。用该裂解缓冲液清洗该免疫沉淀物三次,用含有50mM NaCl和20mMTris-Cl,pH7.5的0.5%NP-40清洗一次,然后再悬浮于SDS-PAGE样品缓冲液中。将全部细胞裂解液和该免疫沉淀物都用比例为1∶200的双:丙烯酰胺通过7.5%SDS-PAGE分级分离。Western印迹分析
通过Western印迹分析检测Ret受体的自磷酸化。简言之,将细胞于检测前24小时以1.5×106细胞/孔的密度接种于6孔组织培养皿中。将细胞用结合缓冲液清洗一次,并用结合缓冲液中的或者单独或者组合的各种浓度的不同试剂(包括GDNF、PI-PLC、PI-PLC/CM和Ret-Fc融合蛋白)处理各种时间。将处理的细胞和未处理的对照在Triton X-100裂解缓冲液中裂解并用该抗Ret抗体(Santa Cruz,C-19,Cat.#SC-167)和蛋白A-Sepahrose如上所述免疫沉淀。将免疫沉淀物通过SDS-PAGE分级分离,并按照Harlow和Lane所述(Antibodies:ALaboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory:Cold Spring Harbor,New York,1988)转移至硝酸纤维素膜上。该膜预先用5%BSA(Sigma)封闭,通过用抗磷酸酪氨酸单克隆抗体4G10(UBI,Cat.#05-321)于室温2小时在该膜形成印迹,以测定该受体酪氨酸磷酸化的水平。通过剥离同一膜并用该抗Ret抗体重新检测该膜,以测定每个泳道包括的蛋白量。最终,按照制造商说明书用化学发光试剂(ECL,Amersham)处理该膜,并对X光胶片(Hyperfilm-ELC,Amersham)曝光。用PI-PLC处理细胞和制备PI-PLC处理的条件培养基
为从细胞表面释放GPI连接的GDNFR,将细胞用清洗缓冲液清洗一次,然后与结合缓冲液中的1U/mL磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC,Boehringer Mannheim,Cat.#1143069)于37℃培育45分钟。然后将细胞用清洗缓冲液清洗三次,并进一步为Ret自磷酸化检测或交联进行加工。为制备PI-PLC处理的条件培养基(PI-PLC/CM),通过用含有2mM EDTA的PBS于37℃处理细胞5-10分钟,从组织培养皿中移出8×106细胞。将细胞用清洗缓冲液清洗一次,再悬浮于含有1U/mL PI-PLC的1mL结合缓冲液中,并于37℃培育45分钟。将细胞离心沉淀,并收集该PI-PLC/CM。制备Ret-Fc融合蛋白
用对应于小鼠c-Ret的前20个氨基酸的寡核苷酸探针从17天大的鼠胎盘cDNA文库中分离了包含整个c-Ret编码区的cDNA(Iwamoto等,1993;van Heyningen,1994)。将编码该Ret受体胞外域的编码区(以最后一个氨基酸结束,R636)与编码人IgG(IgG1)的Fc区的编码DNA在框内融合,并如前述亚克隆到表达载体pDSR2中(Bartley等,Nature.368,558-560,1994)。将该ret-Fc/pDSRa2质粒转染入中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中,并使用Ni++柱(Qiagen)通过亲和层析纯化该重组Ret-Fc融合蛋白。制备胚胎大鼠脊髓运动神经元培养物
在实验前24小时从完整的E15 Sprague-Dawley大鼠胎儿脊髓制备富集胚胎大鼠脊髓运动神经元培养物。解剖脊髓,除去脑脊膜和脊神经节(DRGs)。将脊髓切成小块并用L15培养基中的木瓜蛋白酶(木瓜蛋白酶药盒,Worthington)消化。使用6.8%甲泛葡胺梯度(Camu和Henderson,J Neuroscience.44,59-70,1992)富集在该分离的细胞悬浮液中大于其它细胞类型的运动神经元。收集位于甲泛葡胺垫和细胞悬浮液之间的界面处富集的运动神经元并清洗,以~9×104细胞/cm2的密度接种于预先包被了聚-L-鸟氨酸和层粘合蛋白的组织培养皿中并于37℃培育。
本文引用了各种参考文献,其说明书通过引用全部结合到本文中。
虽然已经以推荐实施方案和示范性的核酸和氨基酸序列描述本发明,本领域技术人员理解可以发生变例证核酸和氨基酸序列描述本发明,本领域技术人员会理解可以发生变化和修饰。因此,预期所附的权利要求书覆盖所有这种属于如要求保护的本发明范围的相等变化。
参考文献Angrist,M.,Bolk,S.,Thiel,B.,Puffenberger,E.G.,Hofstra,R.M.,Buys,C.H.,Cass,D.T.和Chakravarti,A.(1995).Hirschsprung病中RET受体酪氨酸激酶的突变分析.Hum.Mol.Genet.4,82l-830.Arenas,E.,Trupp,M.,Akerud,P.和Ibanez,C.F.(1995).GDNF在体内防止脑去甲肾上腺素能神经元变性并促进其表型.Neuron 15,1465-1473.Aruffo,A和Seed,B.(1987).用高效COS细胞表达系统分子克隆CD28cDNA.Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The UnitedStates Of America.84,8573-8577.Bartley,T.D.,Hunt,R.W.,Welcher,A.A.,Boyle,W.J.,Parker,V.P.,Lindberg,R.A.,Lu,H.S.,Colombero,A.M.,Elliott,R.L.,Guthrie,B.A.,Holst,P.L.,Skrine,J.D.,Toso,R.J.,Zhang,M.,Fernandez,E.,Trail,G.,Varnum,B.,Yarden,Y.,Hunter,T.,and Fox,G.M.(1994).B61是ECK受体蛋白-酪氨酸激酶的配基.Nature.368,558-560.Beck,KD.,Valverde,J.,Alexi,T.,Poulsen,K.,Moffat,B.,Vandlen,R.A.,Rosenthal,A.和Hefti,F.(1995).在成人大脑中来自轴突切开术诱导的变性的DGNF保护的中脑多巴胺能神经元.Nature.373,339-341.Camu,W.和Henderson,C.(1992).通过淘选抗低亲和性NFG受体的单克隆抗体纯化大鼠胚胎运动神经元.J Neuroscience.44,59-70.Choi-Lundberg,D.L.和Bohn,M.C.(1995).大鼠神经胶质细胞源神经营养因子(GDNF)mRNA的个体发育和分布.Brain Res.Dev.Brain Res.85,80-88Davis,S.,Aldrich,T.H.,Valenzuela,D.M.,Wong,V.V.,Furth,M.E.,Squinto,S.P.和Yancopoulos,G.D.(1991).睫状神经营养因子的受体.Science.253.59-63.
84Donis-Keller,H.,Dou,S.,Chi,D.,Carlson,K.,Toshima,K.,Lairmore,T.,Howe,J.,Moley,J.,Goodfellow,P.和Wells,S,(1993).ret原癌基因中的突变与MEN 2A和FMTC有关.Hum.Molec.Genet.2,851-856.Ebendal,T.,Tomac,A,Hoffer,B.J.和Olson,L.,(1995).神经胶质细胞系源神经营养因子在培养的来自外周轴突切开的神经节的神经元中刺激纤维形成和存活.Journal Of Neuroscience Research.40,276-284.Economides,A.N.,Ravetch,J.V.,Yancopoulos,G.D.和Stahl,N.(1995).设计者细胞因子(Designer cytokines):导向选择细胞的作用.Science 270,1351-1353.Edery,P.,Lyonnet,S.,Mulligan,L.,Pelet,A.,DoW,E.,Abel,L.,Holder,S.,Nihoul-Fekete,C.,Ponder,B.和Munnich,A,(1994).Hirschsprug病中ret原癌基因的突变.Nature.367,378-380.Gearing,D.P.,King,J.A.,Gough,N.M.和Nicola,N.A.(1989).人粒细胞-巨噬细胞集刺激基因子受体的表达克隆.EMBO Journal 8,3667-3676.Henderson,C.E.,Phillips,H.S.,Pollock,R.A.,Davies,A.M.,Lemeulle,C.,Armanini,M.,Simpson,L.C.,Moffet,B.,Vandlen,R.A.,Koliatsos,V.E.等(1994).GDNF:存在于外周神经和肌肉的有效存活因子,Science.266,1062-1064Hoffer,B.J.,Hoffman,A.,Bowenkamp,K.,Huettl,P.,Hudson,J.,Manrtin,D.,Lin,L.F.和Gerhardt,G.A.(1994).神经胶质细胞系源神经营养因子体内逆转毒素诱导的中脑多巴胺能神经元损伤.Neuroscience Letters.182,107-111.Hofstra,R.,Landsvater,R.,Ceecherini,I.,Stulp,R.,Stelwagen,T.,Luo,Y.,Pasini,B.,Hoppener,J.,van Amstel,H.,Romeo,G.,Lips,C.和Buys,C.(1994).ret原癌基因中的突变与2B型多发性内分泌腺瘤形成和散发性髓样甲状腺癌有关.Nature.367,375-376.Ikeda,I.,Ishizaka,Y.,Tahira,T.,Suzuki,T.,Onda,M.,Sugimura,T.和Nagao,M.(1990).人成神经细胞瘤细胞系中ret原癌基因的特异性表达.Oncogene.5,1291-1296.Ip,N.Y.,Nye,S.H.,Boulton,T.G.,Davis,S.,Yasukawa,K.,Kishimoto,T.,Anderson,D.J.等(1992).CNTF和LIF通过共享的涉及IL-6信号传导受体组分gp130的信号发生途径作用于神经元细胞.Cell.69,1121-1132.Iwamoto,T.,Taniguchi,M.,Asia,N.,Ohkusu,K.,Nakashima,I.和Takahashi,M.(1993).小鼠ret原癌基因的cDNA克隆及其与钙粘连素超家族的序列相似性.Oncogene.8,1087-1091.Jing,S.Q.,Spencer,T.,Miller,K.,Hopkins,C.和Trowbridge,I.S.(1990).人运铁蛋白受体胞质域在胞吞中的作用:特定内在化信号序列的定位.Journal Of Cell Biology.110,283-294.Kearns,C.M.和Gash,D.M.(1995).GDNF体内保护黑质多巴胺神经元抵抗6-羟基多巴胺.Brain Research.672,104-111.Kozak,M.(1987).来自699种脊椎动物信使RNA的5’-非转译区的分析.Nucleic Acids Research.15,8125-8148.Li,L.,Wu,W.,Lin,L.F.,Lei,M.,Oppenheim,R.W.和Houenou,L.J.(1995).用神经胶质细胞系源神经营养因子营救成年小鼠运动神经元脱离损伤诱导的死亡.Proceedings Of The National Academy Of SciencesOf The United States Of America,92,9771-9775.Lin,L-F.H.,Doherty,D.H.,Lile,JD.,Bektesh,S.和Collins,F.(1993).GDNF:中脑多巴胺能神经元的神经胶质细胞系源神经营养因子.Science.260,1130-1132.Louis,J.C.,Magal,E.和Varon,S.(1992).去甲肾上腺素对培养的大鼠脑干儿茶酚胺能神经元的受体介导的毒性.Journal Of PharmacologyAnd Experimental Therapeutics.262,1274-1283.Mount,HT.,Dean,D.O.,Alberch,J.,Dreyfus,C.F.和Black,I.B.(1995).神经胶质细胞系源神经营养因子促进Purkinje细胞的存活和形态分化.Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United StatesOf America.92,9092-9096.Mulligan,L.,Kwok,J.,Healey,C.,Elsdon,M.,Eng,C.,Gardner,E.,Love,D.,Mole,S.,Moore,J.,Papi,L.,Ponder,M.,Telenius,H,Tunnacliffe,A和Ponder,A.(1993).2A型多发性内分泌腺瘤形成中ret原癌基因的种系突变.Nature.363,458-460.Oppenheim,R.W.,Houenou,L.J.,Johnson,J.E.,Lin,L.F.,Li.L.,Lo,A.C.,Newsome,A.L,Prevette,D.M.和Wang,S.(1995).用GDNF从程序性细胞死亡和轴突切开术诱导的细胞死亡中营救的发育中的运动神经元.Nature.373,344-346.Pachnis,V.,Mankoo,B.和Costantini,F.(1993).c-ret原癌基因在小鼠胚胎发生期间的表达.Development,119,1005-1017.Pearson,W.R.和Lipman,D.J.(1988).用于生物学序列比较的改进工具.Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United StatesOf America.85,2444-2448.Poulsen,K.T.,Armanini,M.P.,Klein,R.D.,Hynes,M.A.,Phillips,H.S.和Rosenthal,A.(1994).TGFβ2和TGFβ3是中脑多巴胺能神经元的有效存活因子.Neuron.13,1245-1252.Romeo,G.,Patrizia,R,Luo,Y.,Barone,V.,Seri,M.,Ceccherini,I.,Pasini,B.,Bocciardi,R.,Lerone,M.,Kaariainen,H.和Maartucciello,G.(1994).Hirschsprung病中ret原癌基因的酪氨酸激酶域的点突变Nature.367,377-378.Santoro,M.,Carlomagno,F.,Romeo,A.,Bottaro,D.,Dathan,N.,Grieco,M.,Fusco,A.,Vecchio,G.,Matoskova,B.,Kraus,M.和Di Fiore,P.(1995).MEN2A和MEN2B的种系突变激活作为显性转化基因的ret.Science.267,38l-383.Sauer,H.,Rosenblad,C.和Bjoerklund,A.(1995).神经胶质细胞系源神经营养因子而不是转化生长因子β3防止黑质多巴胺能神经元在纹状体6-羟基多巴胺损害后的迟发性变性.Proceedings Of The NationalAcademy Of Sciences Of The United States Of America.92,8935-8939.Saxen,L.(1987).肾脏的器官发生.Development and Cell Biology Series,Cambridge University Press,Cambridge,England.Schaar,D.G.,Sieber,B.A.,Dreyfus,C.F.和Black,I.B.(1993).GDNF在大鼠脑中的区域特异性和细胞特异性表达.Experimental Neurology.124,368-371.Schaar,D.G.,Sieber,B.A.,Sherwood,A.C.,Dean,D.,Mendoza,G.,Ramakrishnan,L.,Dreyfus,C.F.和Black,I.B.(1994).多个星形细胞转录物在大鼠和人中编码黑质营养因子.Experimental Neurology 130,387-393.Schlessinger,J.和Ullrich,A.(1992).通过受体酪氨酸激酶的生长因子信号发生.Neuron 9,383-391.Schuchardt,A.,D’Agati,V.,Larsson-Blomberg,L.,Costantini,F.和Pachnis,V.(1994).缺乏酪氨酸激酶受体ret小鼠的肾脏和肠神经系统的缺陷.Nature.367,380-383.Segarini,PR.,Ziman,J.M.,Kane,C.J.和Dasch,JR.(1992).转化生长因子β(TGF-β)结合细胞表面蛋白的两种新形式取决于TGF-β1的结合,并表明阳性协同性.Journal Of Biological Chemistry.267,1048-1053.Springer,J.E.,Mu,X.,Bergmann,L.W.和Trojanowski,J.Q.(1994).GDNF mRNA在大鼠和人神经组织中的表达.Experimental Neurology.127,167-170.Stroemberg,I.,Bjoerklund,L.,Johansson,M.,Tomac,A.,Collins,F.,Olson,L.,Hoffer,B.和Humpel,C.(1993).神经胶质细胞系源神经营养因子在发育中的而非成年纹状体中表达并在体内刺激发育中的多巴胺神经元.Experimental Neurology.124,401-412.Takahashi,M.,Ritz,J.和Cooper,G.(1985).DNA重排刺激新的类转化基因ret.Cell.42,581-588.Takahashi,M.和Cooper,G.(1987).Ret转化基因编码与酪氨酸激酶同源的融合蛋白.Mol.Cell.Biol.,7,1378-1385.Takebe,Y.,Seiki,M.,Fujisawa,J.,Hoy,P.,Yokota,K.,Arai,K.,Yoshida,M.和Arai,N.(1988).SRa启动子:由猿猴病毒40早期启动子和人1型T细胞白血病病毒长末端重复的R-U5区段组成的有效的通用哺乳动物cDNA表达系统.Mol.Cell.Biol.8,466-472.Tomac,A.,Lindqvist,E.,Lin,L.F.,Ogren,S.O.,Young,D.,Hoffer,B.J.和Olson,L.(1995a).用GDNF在体内保护和修复黑质纹状体多巴胺能系统.Nature.373,335-339.Tomac,A.,Widenfalk,J.,Lin,L.F.,Kohno,T.,Ebendal,T.,Hoffer,B.J.和Olson,L.(1995b).神经胶质细胞系源神经营养因子在成年黑质纹状体系统中的逆行和运输提示在该成体中的营养作用.Proceedings Of TheNational Academy Of Sciences Of The United States Of America.92,8274-8278.Trupp,M.,Ryden,M.,Joemvall,H.,Funakoshi,H.,Timmusk,T.,Arenas,E.和Ibanez,C.F.(1995).GDNF的外周表达和生物学活性,一种鸟类和哺乳动物外周神经元的营养因子.Journal Of Cell Biology.130,137-148.Tsuzuki,T.,Takahashi,M.,Asai,N.,Iwashita,T.,Matsuyama,M.和Asai,J.(1995).ret原癌基因产生在胚胎、婴儿和成体大鼠组织中的空间和瞬时表达.Oncogene,l0,191-198.Ullrich,A和Schlessinger,J.(1990).具有酪氨酸激酶活性的受体进行的信号传导.Cell,61,203-211.van der Geer,P.,Hunter,T.和Lindberg,R.A.(1994).受体酪氨酸激酶及其信号传导途径.10,251-337.van Heyningen,V.(1994).一个基因-四种综合症.Nature,367,319-320.von Heijne,G.(1986).预测信号序列酶切位点的新方法.Nucleic AcidsResearch.14,4683-4690.Yan,Q.,Matheson,C.和Lopez,O.T.(1995).GDNF对新生儿和成体面部运动神经元的体内圣经营养作用.Nature.373,341-344.Zum,A.D.,Baetge,E.E.,Hammang,J.P.,Tan,S.A.,和Aebischer,P.(1994).神经胶质细胞系源神经营养因子(GDNF),一种运动神经元的新神经营养因子.Neuroreport.6,113-118.
序列表
(1)一般资料
(ⅰ)申请人:Fox,Gary M
Jing,Shuqian
Wen,Duanzhi
(ⅱ)发明名称:神经胶质细胞系源性神经营养因子受体
(ⅲ)序列数:34
(ⅳ)通信地址:
(A)收信人:AMEGE INC
(B)街道:1840 DeHavilland Drive
(C)城市:Thousand Oaks
(D)州:CA
(E)国家:美国
(F)邮政编码:91320-1789
(ⅴ)计算机可读形式
(A)媒体类型:软盘
(B)计算机:IBM PC兼容机
(C)操作系统:PC-DOS/MS-DOS
(D)软件:PatentIn Release#1.0,版本1.30
(ⅵ)当前申请数据
(A)申请号:US未知
(B)提交日期:1997年4月14日
(C)分类:
(ⅶ)在先申请数据
(A)申请号:US 60/017,221
(B)提交日期:1996年5月9日
(ⅶ)在先申请数据
(A)申请号:US 60/015,907
(B)提交日期:1996年4月22日
(ⅷ)代理律师/代理人资料
(A)姓名:Curry,Daniel R.
(B)注册号:32,727
(C)参考/档案号:A-401A
(2)SEQ ID NO:1的信息:
(ⅰ)顺序特征:
(A)长度:2568个碱基对
(B)类型:核酸
(C)链型:单链
(D)拓扑学:线性
(ⅱ)分子类型:cDNA
(ⅸ)特征:
(A)名称/关键词:CDS
(B)位置:540…1934
(ⅹⅰ)顺序描述:SEQ ID NO:1:AATCTGGCCT CGGAACACGC CATTCTCCGC GCCGCTTCCA ATAACCACTA ACATCCCTAA 60CGAGCATCCG AGCCGAGGGC TCTGCTCGGA AATCGTCCTG GCCCAACTCG GCCCTTCGAG 120CTCTCGAAGA TTACCGCATC TATTTTTTTT TTCTTTTTTT TCTTTTCCTA GCGCAGATAA 180AGTGAGCCCG GAAAGGGAAG GAGGGGGCGG GGACACCATT GCCCTGAAAG AATAAATAAG 240TAAATAAACA AACTGGCTCC TCGCCGCAGC TGGACGCGGT CGGTTGAGTC CAGGTTGGGT 300CGGACCTGAA CCCCTAAAAG CGGAACCGCC TCCCGCCCTC GCCATCCCGG AGCTGAGTCG 360CCGGCGGCGG TGGCTGCTGC CAGACCCGGA GTTTCCTCTT TCACTGGATG GAGCTGAACT 420TTGGGCGGCC AGAGCAGCAC AGCTGTCCGG GGATCGCTGC ACGCTGAGCT CCCTCGGCAA 480GACCCAGCGG CGGCTCGGGA TTTTTTTGGG GGGGCGGGGA CCAGCCCCGC GCCGGCACC 539ATG TTC CTG GCG ACC CTG TAC TTC GCG CTG CCG CTC TTG GAC TTG CTC 587Met Phe Leu Ala Thr Leu Tyr Phe Ala Leu Pro Leu Leu Asp Leu Leu1 5 10 15CTG TCG GCC GAA GTG AGC GGC GGA GAC CGC CTG GAT TGC GTG AAA GCC 635Leu Ser Ala Glu Val Ser Gly Gly Asp Arg Leu Asp Cys Val Lys Ala
20 25 30AGT GAT CAG TGC CTG AAG GAG CAG AGC TGC AGC ACC AAG TAC CGC ACG 683Ser Asp Gln Cys Leu Lys Glu Gln Ser Cys Ser Thr Lys Tyr Arg Thr
35 40 45CTA AGG CAG TGC GTG GCG GGC AAG GAG ACC AAC TTC AGC CTG GCA TCC 731Leu Arg Gln Cys Val Ala Gly Lys Glu Thr Asn Phe Ser Leu Ala Ser
50 55 60GGC CTG GAG GCC AAG GAT GAG TGC CGC AGC GCC ATG GAG GCC CTG AAG 779Gly Leu Glu Ala Lys Asp Glu Cys Arg Ser Ala Met Glu Ala Leu Lys65 70 75 80CAG AAG TCG CTC TAC AAC TGC CGC TGC AAG CGG GGT ATG AAG AAG GAG 827Gln Lys Ser Leu Tyr Asn Cys Arg Cys Lys Arg Gly Met Lys Lys Glu
85 90 95AAG AAC TGC CTG CGC ATT TAC TGG AGC ATG TAC CAG AGC CTG CAG GGA 875Lys Asn Cys Leu Arg Ile Tyr Trp Ser Met Tyr Gln Ser Leu Gln Gly
100 105 110AAT GAT CTG CTG GAG GAT TCC CCA TAT GAA CCA GTT AAC AGC AGA TTG 923Asn Asp Leu Leu Glu Asp Ser Pro Tyr Glu Pro Val Asn Ser Arg Leu
115 120 125TCA GAT ATA TTC CGG GTG GTC CCA TTC ATA TCA GAT GTT TTT CAG CAA 971Ser Asp Ile Phe Arg Val Val Pro Phe Ile Ser Asp Val Phe Gln Gln
130 135 140GTG GAG CAC ATT CCC AAA GGG AAC AAC TGC CTG GAT GCA GCG AAG GCC 1019Val Glu His Ile Pro Lys Gly Asn Asn Cys Leu Asp Ala Ala Lys Ala145 150 155 160TGC AAC CTC GAC GAC ATT TGC AAG AAG TAC AGG TCG GCG TAC ATC ACC 1067Cys Asn Leu Asp Asp Ile Cys Lys Lys Tyr Arg Ser Ala Tyr Ile Thr
165 170 175CCG TGC ACC ACC AGC GTG TCC AAC GAT GTC TGC AAC CGC CGC AAG TGC 1115Pro Cys Thr Thr Ser Val Ser Asn Asp Val Cys Asn Arg Arg Lys Cys
180 185 190CAC AAG GCC CTC CGG CAG TTC TTT GAC AAG GTC CCG GCC AAG CAC AGC 1163His Lys Ala Leu Arg Gln Phe Phe Asp Lys Val Pro Ala Lys His Ser
195 200 205TAC GGA ATG CTC TTC TGC TCC TGC CGG GAC ATC GCC TGC ACA GAG CGG 1211Tyr Gly Met Leu Phe Cys Ser Cys Arg Asp Ile Ala Cys Thr Glu Arg
210 215 220AGG CGA CAG ACC ATC GTG CCT GTG TGC TCC TAT GAA GAG AGG GAG AAG 1259Arg Arg Gln Thr Ile Val Pro Val Cys Ser Tyr Glu Glu Arg Glu Lys225 230 235 240CCC AAC TGT TTG AAT TTG CAG GAC TCC TGC AAG ACG AAT TAC ATC TGC 1307Pro Ash Cys Leu Asn Leu Gln Asp Ser Cys Lys Thr Asn Tyr Ile Cys
245 250 255AGA TCT CGC CTT GCG GAT TTT TTT ACC AAC TGC CAG CCA GAG TCA AGG 1355Arg Ser Arg Leu Ala Asp Phe Phe Thr Asn Cys Gln Pro Glu Ser Arg
260 265 270TCT GTC AGC AGC TGT CTA AAG GAA AAC TAC GCT GAC TGC CTC CTC GCC 1403Ser Val Ser Ser Cys Leu Lys Glu Asn Tyr Ala Asp Cys Leu Leu Ala
275 280 285TAC TCG GGG CTT ATT GGC ACA GTC ATG ACC CCC AAC TAC ATA GAC TCC 1451Tyr Ser Gly Leu Ile Gly Thr Val Met Thr Pro Asn Tyr Ile Asp Ser
290 295 300AGT AGC CTC AGT GTG GCC CCA TGG TGT GAC TGC AGC AAC AGT GGG AAC 1499Ser Ser Leu Ser Val Ala Pro Trp Cys Asp Cys Ser Asn Ser Gly Asn305 310 315 320GAC CTA GAA GAG TGC TTG AAA TTT TTG AAT TTC TTC AAG GAC AAT ACA 1547Asp Leu Glu Glu Cys Leu Lys Phe Leu Asn Phe Phe Lys Asp Asn Thr
325 330 335TGT CTT AAA AAT GCA ATT CAA GCC TTT GGC AAT GGC TCC GAT GTG ACC 1595Cys Leu Lys Asn Ala Ile Gin Ala Phe Gly Asn Gly Ser Asp Val Thr
340 345 350GTG TGG CAG CCA GCC TTC CCA GTA CAG ACC ACC ACT GCC ACT ACC ACC 1643Val Trp Gln Pro Ala Phe Pro Val Gln Thr Thr Thr Ala Thr Thr Thr
355 360 365ACT GCC CTC CGG GTT AAG AAC AAG CCC CTG GGG CCA GCA GGG TCT GAG 1691Thr Ala Leu Arg Val Lys Asn Lys Pro Leu Gly Pro Ala Gly Ser Glu
370 375 380AAT GAA ATT CCC ACT CAT GTT TTG CCA CCG TGT GCA AAT TTA CAG GCA 1739Asn Glu Ile Pro Thr His Val Leu Pro Pro Cys Ala Asn Leu Gln Ala385 390 395 400CAG AAG CTG AAA TCC AAT GTG TCG GGC AAT ACA CAC CTC TGT ATT TCC 1787Gln Lys Leu Lys Ser Asn Val Ser Gly Asn Thr His Leu Cys Ile Ser
405 410 415AAT GGT AAT TAT GAA AAA GAA GGT CTC GGT GCT TCC AGC CAC ATA ACC 1835Asn Gly Asn Tyr Glu Lys Glu Gly Leu Gly Ala Ser Ser His Ile Thr
420 425 430ACA AAA TCA ATG GCT GCT CCT CCA AGC TGT GGT CTG AGC CCA CTG CTG 1883Thr Lys Ser Met Ala Ala Pro Pro Ser Cys Gly Leu Ser Pro Leu Leu
435 440 445GTC CTG GTG GTA ACC GCT CTG TCC ACC CTA TTA TCT TTA ACA GAA ACA 1931Val Leu Val Val Thr Ala Leu Ser Thr Leu Leu Ser Leu Thr Glu Thr
450 455 460TCA TAGCTGCATT AAAAAAATAC AATATGGACA TGTAAAAAGA CAAAAACCAA 1984Ser465GTTATCTGTT TCCTGTTCTC TTGTATAGCT GAAATTCCAG TTTAGGAGCT CAGTTGAGAA 2044ACAGTTCCAT TCAACTGGAA CATTTTTTTT TTTNCCTTTT AAGAAAGCTT CTTGTGATCC 2104TTNGGGGCTT CTGTGAAAAA CCTGATGCAG TGCTCCATCC AAACTCAGAA GGCTTTGGGA 2164TATGCTGTAT TTTAAAGGGA CAGTTTGTAA CTTGGGCTGT AAAGCAAACT GGGGCTGTGT 2224TTTCGATGAT GATGATNATC ATGATNATGA TNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 2284NNNNNNNNNN GATTTTAACA GTTTTACTTC TGGCCTTTCC TAGCTAGAGA AGGAGTTAAT 2344ATTTCTAAGG TAACTCCCAT ATCTCCTTTA ATGACATTGA TTTCTAATGA TATAAATTTC 2404AGCCTACATT GATGCCAAGC TTTTTTGCCA CAAAGAAGAT TCTTACCAAG AGTGGGCTTT 2464GTGGAAACAG CTGGTACTGA TGTTCACCTT TATATATGTA CTAGCATTTT CCACGCTGAT 2524GTTTATGTAC TGTAAACAGT TCTGCACTCT TGTACAAAAG AAAA 2568(2)SEQ ID NO:2的信息:
(ⅰ)顺序特征:
(A)长度:465个氨基酸
(B)类型:氨基酸
(D)拓扑学:线性
(ⅱ)分子类型:蛋白质
(ⅹⅰ)顺序描述:SEQ ID NO:2:Met Phe Leu Ala Thr Leu Tyr Phe Ala Leu Pro Leu Leu Asp Leu Leu1 5 10 15Leu Ser Ala Glu Val Ser Gly Gly Asp Arg Leu Asp Cys Val Lys Ala
20 25 30Ser Asp Gln Cys Leu Lys Glu Gln Ser Cys Ser Thr Lys Tyr Arg Thr
35 40 45Leu Arg Gln Cys Val Ala Gly Lys Glu Thr Asn Phe Ser Leu Ala Ser
50 55 60Gly Leu Glu Ala Ly5 Asp Glu Cys Arg Ser Ala Met Glu Ala Leu Lys65 70 75 80Gln Lys Ser Leu Tyr Asn Cys Arg Cys Lys Arg Gly Met Lys Lys Glu
85 90 95Lys Asn Cys Leu Arg Ile Tyr Trp Ser Met Tyr Gln Ser Leu Gln Gly
100 105 110Asn Asp Leu Leu Glu Asp Ser Pro Tyr Glu Pro Val Asn Ser Arg Leu
115 120 125Ser Asp Ile Phe Arg Val Val Pro Phe Ile Ser Asp Val Phe Gln Gln
130 135 140Val Glu His Ile Pro Lys Gly Asn Asn Cys Leu Asp Ala Ala Lys Ala145 150 155 160Cys Asn Leu Asp Asp Ile Cys Lys Lys Tyr Arg Ser Ala Tyr Ile Thr
165 170 175Pro Cys Thr Thr Ser Val Ser Asn Asp Val Cys Asn Arg Arg Lys Cys
180 185 190His Lys Ala Leu Arg Gln Phe Phe Asp Lys Val Pro Ala Lys His Ser
195 200 205Tyr Gly Met Leu Phe Cys Ser Cys Arg Asp Ile Ala Cys Thr Glu Arg
210 215 220Arg Arg Gln Thr lle Val Pro Val Cys Ser Tyr Glu Glu Arg Glu Lys225 230 235 240Pro Asn Cys Leu Asn Leu Gln Asp Ser Cys Lys Thr Asn Tyr Ile Cys
245 250 255Arg Ser Arg Leu Ala Asp Phe Phe Thr Asn Cys Gln Pro Glu Ser Arg
260 265 270Ser Val Ser Ser Cys Leu Lys Glu Asn Tyr Ala Asp Cys Leu Leu Ala
275 280 285Tyr Ser Gly Leu Ile Gly Thr Val Met Thr Pro Asn Tyr Ile Asp Ser
290 295 300Sar Ser Leu Ser Val Ala Pro Trp Cys Asp Cys Ser Asn Ser Gly Asn305 310 315 320Asp Leu Glu Glu Cys Leu Lys Phe Leu Asn Phe Phe Lys Asp Asn Thr
325 330 335Cys Leu Lys Asn Ala Ile Gln Ala Phe Gly Asn Gly Ser Asp Val Thr
340 345 350Val Trp Gln Pro Ala Phe Pro Val Gln Thr Thr Thr Ala Thr Thr Thr
355 360 365Thr Ala Leu Arg Val Lys Asn Lys Pro Leu Gly Pro Ala Gly Ser Glu
370 375 380Asn Glu Ile Pro Thr His Val Leu Pro Pro Cys Ala Asn Leu Gln Ala385 390 395 400Gln Lys Leu Lys Ser Asn Val Ser Gly Asn Thr His Leu Cys Ile Ser
405 410 415Asn Gly Asn Tyr Glu Lys Glu Gly Leu Gly Ala Ser Ser His Ile Thr
420 425 430Thr Lys Ser Met Ala Ala Pro Pro Ser Cys Gly Leu Ser Pro Leu Leu
435 440 445Val Leu Val Val Thr Ala Leu Ser Thr Leu Leu Ser Leu Thr Glu Thr
450 455 460Ser465(2)SEQ ID NO:3的信息:
(ⅰ)顺序特征:
(A)长度:2138个碱基对
(B)类型:核酸
(C)链型:单链
(D)拓扑学:线性
(ⅱ)分子类型:cDNA
(ⅸ)特征:
(A)名称/关键词:CDS
(B)位置:302…1705
(ⅹⅰ)顺序描述:SEQ ID NO:3:AGCTCGCTCT CCCGGGGCAG TGGTGTGGAT GCACCGGAGT TCGGGCGCTG GGCAAGTTGG 60GTCGGAACTG AACCCCTGAA AGCGGGTCCG CCTCCCGCCC TCGCGCCCGC CCGGATCTGA 120GTCGCTGGCG GCGGTGGGCG GCAGAGCGAC GGGGAGTCTG CTCTCACCCT GGATGGAGCT 180GAACTTTGAG TGGCCAGAGG AGCGCAGTCG CCCGGGGATC GCTGCACGCT GAGCTCTCTC 240CCCGAGACCG GGCGGCGGCT TTGGATTTTG GGGGGGCGGG GACCAGCTGC GCGGCGGCAC 300C ATG TTC CTA GCC ACT CTG TAC TTC GCG CTG CCA CTC CTG GAT TTG 346Met Phe Leu Ala Thr Leu Tyr Phe Ala Leu Pro Leu Leu Asp Leu
1 5 10 15CTG ATG TCC GCC GAG GTG AGT GGT GGA GAC CGT CTG GAC TGT GTG AAA 394Leu Met Ser Ala Glu Val Ser Gly Gly Asp Arg Leu Asp Cys Val Lys
20 25 30GCC AGC GAT CAG TGC CTG AAG GAA CAG AGC TGC AGC ACC AAG TAC CGC 442Ala Ser Asp Gln Cys Leu Lys Glu Gln Ser Cys Ser Thr Lys Tyr Arg
35 40 45ACA CTA AGG CAG TGC GTG GCG GGC AAG GAA ACC AAC TTC AGC CTG ACA 490Thr Leu Arg Gln Cys Val Ala Gly Lys Glu Thr Asn Phe Ser Leu Thr
50 55 60TCC GGC CTT GAG GCC AAG GAT GAG TGC CGT AGC GCC ATG GAG GCC TTG 538Ser Gly Leu Glu Ala Lys Asp Glu Cys Arg Ser Ala Met Glu Ala Leu
65 70 75AAG CAG AAG TCT CTG TAC AAC TGC CGC TGC AAG CGG GGC ATG AAG AAA 586Lys Gln Lys Ser Leu Tyr Asn Cys Arg Cys Lys Arg Gly Met Lys Lys80 85 90 95GAG AAG AAT TGT CTG CGT ATC TAC TGG AGC ATG TAC CAG AGC CTG CAG 634Glu Lys Asn Cys Leu Arg Ile Tyr Trp Ser Met Tyr Gln Ser Leu Gln
100 105 110GGA AAT GAC CTC CTG GAA GAT TCC CCG TAT GAG CCG GTT AAC AGC AGG 682Gly Asn Asp Leu Leu Glu Asp Ser Pro Tyr Glu Pro Val Asn Ser Arg
115 120 125TTG TCA GAT ATA TTC CGG GCA GTC CCG TTC ATA TCA GAT GTT TTC CAG 730Leu Ser Asp Ile Phe Arg Ala Val Pro Phe Ile Ser Asp Val Phe Gln
130 135 140CAA GTG GAA CAC ATT TCC AAA GGG AAC AAC TGC CTG GAC GCA GCC AAG 778Gln Val Glu His Ile Ser Lys Gly Asn Asn Cys Leu Asp Ala Ala Lys
145 150 155GCC TGC AAC CTG GAC GAC ACC TGT AAG AAG TAC AGG TCG GCC TAC ATC 826Ala Cys Asn Leu Asp Asp Thr Cys Lys Lys Tyr Arg Ser Ala Tyr Ile160 165 170 175ACC CCC TGC ACC ACC AGC ATG TCC AAC GAG GTC TGC AAC CGC CGT AAG 874Thr Pro Cys Thr Thr Ser Met Ser Asn Glu Val Cys Asn Arg Arg Lys
180 185 190TGC CAC AAG GCC CTC AGG CAG TTC TTC GAC AAG GTT CCG GCC AAG CAC 922Cys His Lys Ala Leu Arg Gln Phe Phe Asp Lys Val Pro Ala Lys His
195 200 205AGC TAC GGG ATG CTC TTC TGC TCC TGC CGG GAC ATC GCC TGC ACC GAG 970Ser Tyr Gly Met Leu Phe Cys Ser Cys Arg Asp Ile Ala Cys Thr Glu
210 21 5 220CGG CGG CGA CAG ACT ATC GTC CCC GTG TGC TCC TAT GAA GAA CGA GAG 1018Arg Arg Arg Gln Thr Ile Val Pro Val Cys Ser Tyr Glu Glu Arg Glu
225 230 235AGG CCC AAC TGC CTG AGT CTG CAA GAC TCC TGC AAG ACC AAT TAC ATC 1068Arg Pro Asn Cys Leu Ser Leu Gln Asp Ser Cys Lys Thr Asn Tyr Ile240 245 250 255TGC AGA TCT CGC CTT GCA GAT TTT TTT ACC AAC TGC CAG CCA GAG TCA 1114Cys Arg Ser Arg Leu Ala Asp Phe Phe Thr Asn Cys Gln Pro Glu Ser
260 265 270AGG TCT GTC AGC AAC TGT CTT AAG GAG AAC TAC GCA GAC TGC CTC CTG 1162Arg Ser Val Ser Asn Cys Leu Lys Glu Asn Tyr Ala Asp Cys Leu Leu
275 280 285GCC TAC TCG GGA CTG ATT GGC ACA GTC ATG ACT CCC AAC TAC GTA GAC 1210Ala Tyr Ser Gly Leu Ile Gly Thr Val Met Thr Pro Asn Tyr Val Asp
290 295 300TCC AGC AGC CTC AGC GTG GCA CCA TGG TGT GAC TGC AGC AAC AGC GGC 1258Ser Ser Ser Leu Ser Val Ala Pro Trp Cys Asp Cys Ser Asn Ser Gly
305 310 315AAT GAC CTG GAA GAC TGC TTG AAA TTT CTG AAT TTT TTT AAG GAC AAT 1306Asn Asp Leu Glu Asp Cys Leu Lys Phe Leu Asn Phe Phe Lys Asp Asn320 325 330 335ACT TGT CTC AAA AAT GCA ATT CAA GCC TTT GGC AAT GGC TCA GAT GTG 1354Thr Cys Leu Lys Asn Ala Ile Gln Ala Phe Gly Asn Gly Ser Asp Val
340 345 350ACC ATG TGG CAG CCA GCC CCT CCA GTC CAG ACC ACC ACT GCC ACC ACT 1402Thr Met Trp Gln Pro Ala Pro Pro Val Gln Thr Thr Thr Ala Thr Thr
355 360 365ACC ACT GCC TTC CGG GTC AAG AAC AAG CCT CTG GGG CCA GCA GGG TCT 1450Thr Thr Ala Phe Arg Val Lys Asn Lys Pro Leu Gly Pro Ala Gly Ser
370 375 380GAG AAT GAG ATC CCC ACA CAC GTT TTA CCA CCC TGT GCG AAT TTG CAG 1498Glu Asn Glu Ile Pro Thr His Val Leu Pro Pro Cys Ala Asn Leu Gln
385 390 395GCT CAG AAG CTG AAA TCC AAT GTG TCG GGT AGC ACA CAC CTC TGT CTT 1546Ala Gln Lys Leu Lys Ser Asn Val Ser Gly Ser Thr His Leu Cys Leu400 405 410 415TCT GAT AGT GAT TTC GGA AAG GAT GGT CTC GCT GGT GCC TCC AGC CAC 1594Ser Asp Ser Asp Phe Gly Lys Asp Gly Leu Ala Gly Ala Ser Ser His
420 425 430ATA ACC ACA AAA TCA ATG GCT GCT CCT CCC AGC TGC AGT CTG AGC TCA 1642Ile Thr Thr Lys Ser Met Ala Ala Pro Pro Ser Cys Ser Leu Ser Ser
435 440 445CTG CCG GTG CTG ATG CTC ACC GCC CTT GCT GCC CTG TTA TCT GTA TCG 1690Leu Pro Val Leu Met Leu Thr Ala Leu Ala Ala Leu Leu Ser Val Ser
450 455 460TTG GCA GAA ACG TCG TAGCTGCATC CGGGAAAACA GTATGAAAAG ACAAAAGAGA 1745Leu Ala Glu Thr Ser
465ACCAAGTATT CTGTCCCTGT CCTCTTGTAT ATCTGAAAAT CCAGTTTTAA AAGCTCCGTT 1805GAGAAGCAGT TTCACCCAAC TGGAACTCTT TCCTTGTTTT TAAGAAAGCT TGTGGCCCTC 1865AGGGGCTTCT GTTGAAGAAC TGCTACAGGG CTAATTCCAA ACCCATAAGG CTCTGGGGCG 1925TGGTGCGGCT TAAGGGGACC ATTTGCACCA TGTAAAGCAA GCTGGGCTTA TCATGTGTTT 1985GATGGTGAGG ATGGTAGTGG TGATGATGAT GGTAATTTTA ACAGCTTGAA CCCTGTTCTC 2045TCTACTGGTT AGGAACAGGA GATACTATTG ATAAAGATTC TTCCATGTCT TACTCAGCAG 2105CATTGCCTTC TGAAGACAGG CCCGCAGCCG TCG 2138(2)SEQ ID NO:4的信息:
(ⅰ)顺序特征:
(A)长度:468个氨基酸
(B)类型:氨基酸
(D)拓扑学:线性
(ⅱ)分子类型:蛋白质
(ⅹⅰ)顺序描述:SEQ ID NO:4:Met Phe Leu Ala Thr Leu Tyr Phe Ala Leu Pro Leu Leu Asp Leu Leu1 5 10 15Met Ser Ala Glu Val Ser Gly Gly Asp Arg Leu Asp Cys Val Lys Ala
20 25 30Ser Asp Gln Cys Leu Lys Glu Gln Sar Cys Ser Thr Lys Tyr Arg Thr
35 40 45Leu Arg Gln Cys Val Ala Gly Lys Glu Thr Asn Phe Ser Leu Thr Ser
50 55 60Gly Leu Glu Ala Lys Asp Glu Cys Arg Ser Ala Met Glu Ala Leu Lys65 70 75 80Gln Lys Ser Leu Tyr Asn Cys Arg Cys Lys Arg Gly Met Lys Lys Glu
85 90 95Lys Asn Cys Leu Arg Ile Tyr Trp Ser Met Tyr Gln Ser Leu Gln Gly
100 105 110Asn Asp Leu Leu Glu Asp Ser Pro Tyr Glu Pro Val Asn Ser Arg Leu
115 120 125Ser Asp Ile Phe Arg Ala Val Pro Phe Ile Ser Asp Val Phe Gln Gln
130 135 140Val Glu His Ile Ser Lys Gly Asn Asn Cys Leu Asp Ala Ala Lys Ala145 150 155 160Cys Asn Leu Asp Asp Thr Cys Lys Lys Tyr Arg Ser Ala Tyr Ile Thr
165 170 175Pro Cys Thr Thr Ser Met Ser Asn Glu Val Cys Asn Arg Arg Lys Cys
180 185 190His Lys Ala Leu Arg Gln Phe Phe Asp Lys Val Pro Ala Lys His Ser
195 200 205Tyr Gly Met Leu Phe Cys Ser Cys Arg Asp Ile Ala Cys Thr Glu Arg
210 215 220Arg Arg Gln Thr Ile Val Pro Val Cys Ser Tyr Glu Glu Arg Glu Arg225 230 235 240Pro Asn Cys Leu Ser Leu Gln Asp Ser Cys Lys Thr Asn Tyr Ile Cys
245 250 255Arg Ser Arg Leu Ala Asp Phe Phe Thr Asn Cys Gln Pro Glu Ser Arg
260 265 270Ser Val Ser Asn Cys Leu Lys Glu Asn Tyr Ala Asp Cys Leu Leu Ala
275 280 285Tyr Ser Gly Leu Ile Gly Thr Val Met Thr Pro Asn Tyr Val Asp Ser
290 295 300Ser Ser Leu Ser Val Ala Pro Trp Cys Asp Cys Ser Asn Ser Gly Asn305 310 315 320Asp Leu Glu Asp Cys Leu Lys Phe Leu Asn Phe Phe Lys Asp Asn Thr
325 330 335Cys Leu Lys Asn Ala Ile Gln Ala Phe Gly Asn Gly Ser Asp Val Thr
340 345 350Met Trp Gln Pro Ala Pro Pro Val Gln Thr Thr Thr Ala Thr Thr Thr
355 360 365Thr Ala Phe Arg Val Lys Asn Lys Pro Leu Gly Pro Ala Gly Ser Glu
370 375 380Asn Glu Ile Pro Thr His Val Leu Pro Pro Cys Ala Asn Leu Gln Ala385 390 395 400Gln Lys Leu Lys Ser Asn Val Ser Gly Ser Thr His Leu Cys Leu Ser
405 410 415Asp Ser Asp Phe Gly Lys Asp Gly Leu Ala Gly Ala Ser Ser His Ile
420 425 430Thr Thr Lys Ser Met Ala Ala Pro Pro Ser Cys Ser Leu Ser Ser Leu
435 440 445Pro Val Leu Met Leu Thr Ala Leu Ala Ala Leu Leu Ser Val Ser Leu
450 455 460Ala Glu Thr Ser465(2)SEQ ID NO:5的信息:
(ⅰ)顺序特征:
(A)长度:3209个碱基对
(B)类型:核酸
(C)链型:单链
(D)拓扑学:线性
(ⅱ)分子类型:cDNA
(ⅸ)特征:
(A)名称/关键词:misc feature
(B)位置:1…539
(C)其它信息:/注释=“1-539为图5 Gdnfr的-237至
301”
(ⅹⅰ)顺序描述:SEQ ID NO:5:AATCTGGCCT CGGAACACGC CATTCTCCGC GCCGCTTCCA ATAACCACTA ACATCCCTAA 60CGAGCATCCG AGCCGAGGGC TCTGCTCGGA AATCGTCCTG GCCCAACTCG GCCCTTCGAG 120CTCTCGAAGA TTACCGCATC TATTTTTTTT TTCTTTTTTT TCTTTTCCTA GCGCAGATAA 180AGTGAGCCCG GAAAGGGAAG GAGGGGGCGG GGACACCATT GCCCTGAAAG AATAAATAAG 240TAAATAAACA AACTGGCTCC TCGCCGCAGC TGGACGCGGT CGGTTGAGTC CAGGTTGGGT 300CGGACCTGAA CCCCTAAAAG CGGAACCGCC TCCCGCCCTC GCCATCCCGG AGCTGAGTCG 350CCGGCGGCGG TGGCTGCTGC CAGACCCGGA GTTTCCTCTT TCACTGGATG GAGCTGAACT 420TTGGGCGGCC AGAGCAGCAC AGCTGTCCGG GGATCGCTGC ACGCTGAGCT CCCTCGGCAA 480GACCCAGCGG CGGCTCGGGA TTTTTTTGGG GGGGCGGGGA CCAGCCCCGC GCCGGCACC 539ATG TTC CTG GCG ACC CTG TAC TTC GCG CTG CCG CTC TTG GAC TTG CTC 587Met Phe Leu Ala Thr Leu Tyr Phe Ala Leu Pro Leu Leu Asp Leu Leu1 5 10 15CTG TCG GCC GAA GTG AGC GGC GGA GAC CGC CTG GAT TGC GTG AAA GCC 635Leu Ser Ala Glu Val Ser Gly Gly Asp Arg Leu Asp Cys Val Lys Ala
20 25 30AGT GAT CAG TGC CTG AAG GAG CAG AGC TGC AGC ACC AAG TAC CGC ACG 683Ser Asp Gln Cys Leu Lys Glu Gln Ser Cys Ser Thr Lys Tyr Arg Thr
35 40 45CTA AGG CAG TGC GTG GCG GGC AAG GAG ACC AAC TTC AGC CTG GCA TCC 731Leu Arg Gln Cys Val Ala Gly Lys Glu Thr Asn Phe Ser Leu Ala Ser
50 55 60GGC CTG GAG GCC AAG GAT GAG TGC CGC AGC GCC ATG GAG GCC CTG AAG 779Gly Leu Glu Ala Lys Asp Glu Cys Arg Ser Ala Met Glu Ala Leu Lys65 70 75 80CAG AAG TCG CTC TAC AAC TGC CGC TGC AAG CGG GGT ATG AAG AAG GAG 827Gln Lys Ser Leu Tyr Asn Cys Arg Cys Lys Arg Gly Met Lys Lys Glu
85 90 95AAG AAC TGC CTG CGC ATT TAC TGG AGC ATG TAC CAG AGC CTG CAG GGA 875Lys Asn Cys Leu Arg Ile Tyr Trp Ser Met Tyr Gln Ser Leu Gln Gly
100 105 110AAT GAT CTG CTG GAG GAT TCC CCA TAT GAA CCA GTT AAC AGC AGA TTG 923Asn Asp Leu Leu Glu Asp Ser Pro Tyr Glu Pro Val Asn Ser Arg Leu
115 120 125TCA GAT ATA TTC CGG GTG GTC CCA TTC ATA TCA GAT GTT TTT CAG CAA 971Ser Asp Ile Phe Arg Val Val Pro Phe Ile Ser Asp Val Phe Gln Gln
130 135 140GTG GAG CAC ATT CCC AAA GGG AAC AAC TGC CTG GAT GCA GCG AAG GCC 1019Val Glu His Ile Pro Lys Gly Asn Asn Cys Leu Asp Ala Ala Lys Ala145 150 155 160TGC AAC CTC GAC GAC ATT TGC AAG AAG TAC AGG TCG GCG TAC ATC ACC 1067Cys Asn Leu Asp Asp Ile Cys Lys Lys Tyr Arg Ser Ala Tyr Ile Thr
165 170 175CCG TGC ACC ACC AGC GTG TCC AAN GAT GTC TGC AAC CGC CGC AAG TGC 1115Pro Cys Thr Thr Ser Val Ser Xaa Asp Val Cys Asn Arg Arg Lys Cys
180 185 190CAC AAG GCC CTC CGG CAG TTC TTT GAC AAG GTC CCG GCC AAG CAC AGC 1163His Lys Ala Leu Arg Gln Phe Phe Asp Lys Val Pro Ala Lys His Ser
195 200 205TAC GGA ATG CTC TTC TGC TCC TGC CGG GAC ATC GCC TGC ACA GAG CGG 1211Tyr Gly Met Leu Phe Cys Ser Cys Arg Asp Ile Ala Cys Thr Glu Arg
210 215 220AGG CGA CAG ACC ATC GTG CCT GTG TGC TCC TAT GAA GAG AGG GAG AAG 1259Arg Arg Gln Thr Ile Val Pro Val Cys Ser Tyr Glu Glu Arg Glu Lys225 230 235 240CCC AAC TGT TTG AAT TTG CAG GAC TCC TGC AAG ACG AAT TAC ATC TGC 1307Pro Asn Cys Leu Asn Leu Gln Asp Ser Cys Lys Thr Asn Tyr Ile Cys
245 250 255AGA TCT CGC CTT GCG GAT TTT TTT ACC AAC TGC CAG CCA GAG TCA AGG 1355Arg Ser Arg Leu Ala Asp Phe Phe Thr Asn Cys Gln Pro Glu Ser Arg
260 265 270TCT GTC AGC AGC TGT CTA AAG GAA AAC TAC GCT GAC TGC CTC CTC GCC 1403Ser Val Ser Ser Cys Leu Lys Glu Asn Tyr Ala Asp Cys Leu Leu Ala
275 280 285TAC TCG GGG CTT ATT GGC ACA GTC ATG ACC CCC AAC TAC ATA GAC TCC 1451Tyr Ser Gly Leu Ile Gly Thr Val Met Thr Pro Asn Tyr Ile Asp Ser
290 295 300AGT AGC CTC AGT GTG GCC CCA TGG TGT GAC TGC AGC AAC AGT GGG AAC 1499Ser Ser Leu Ser Val Ala Pro Trp Cys Asp Cys Ser Asn Ser Gly Asn305 310 315 320GAC CTA GAA GAG TGC TTG AAA TTT TTG AAT TTC TTC AAG GAC AAT ACA 1547Asp Leu GIu Glu Cys Leu Lys Phe Leu Asn Phe Phe Lys Asp Asn Thr
325 330 335TGT CTT AAA AAT GCA ATT CAA GCC TTT GGC AAT GGC TCC GAT GTG ACC 1595Cys Leu Lys Asn Ala Ile Gln Ala Phe Gly Asn Gly Ser Asp Val Thr
340 345 350GTG TGG CAG CCA GCC TTC CCA GTA CAG ACC ACC ACT GCC ACT ACC ACC 1643Val Trp Gln Pro Ala Phe Pro Val Gln Thr Thr Thr Ala Thr Thr Thr
355 360 365ACT GCC CTC CGG GTT AAG AAC AAG CCC CTG GGG CCA GCA GGG TCT GAG 1691Thr Ala Leu Arg Val Lys Asn Lys Pro Leu Gly Pro Ala Gly Ser Glu
370 375 380AAT GAA ATT CCC ACT CAT GTT TTG CCA CCG TGT GCA AAT TTA CAG GCA 1739Asn Glu Ile Pro Thr His Val Leu Pro Pro Cys Ala Asn Leu Gln Ala385 390 395 400CAG AAG CTG AAA TCC AAT GTG TCG GGC AAT ACA CAC CTC TGT ATT TCC 1787Gln Lys Leu Lys Ser Asn Val Ser Gly Asn Thr His Leu Cys Ile Ser
405 410 415AAT GGT AAT TAT GAA AAA GAA GGT CTC GGT GCT TCC AGC CAC ATA ACC 1835Asn Gly Asn Tyr Glu Lys Glu Gly Leu Gly Ala Ser Ser His Ile Thr
420 425 430ACA AAA TCA ATG GCT GCT CCT CCA AGC TGT GGT CTG AGC CCA CTG CTG 1883Thr Lys Ser Met Ala Ala Pro Pro Ser Cys Gly Leu Ser Pro Leu Leu
435 440 445GTC CTG GTG GTA ACC GCT CTG TCC ACC CTA TTA TCT TTA ACA GAA ACA 1931Val Leu Val Val Thr Ala Leu Ser Thr Leu Leu Ser Leu Thr Glu Thr
450 455 460TCA TAG CTGCATTAAA AAAATACAAT ATGGACATGT AAAAAGACAA AAACCAAGTT 1987Ser *465ATCTGTTTCC TGTTCTCTTG TATAGCTGAA ATTCCAGTTT AGGAGCTCAG TTGAGAAACA 2047GTTCCATTCA ACTGGAACAT TTTTTTTTTT NCCTTTTAAG AAAGCTTCTT GTGATCCTTC 2107GGGGCTTCTG TGAAAAACCT GATGCAGTGC TCCATCCAAA CTCAGAAGGC TTTGGGATAT 2167GCTGTATTTT AAAGGGACAG TTTGTAACTT GGGCTGTAAA GCAAACTGGG GCTGTGTTTT 2227CGATGATGAT GATCATCATG ATCATGATNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 2287NNNNNNNGAT TTTAACAGTT TTACTTCTGG CCTTTCCTAG CTAGAGAAGG AGTTAATATT 2347TCTAAGGTAA CTCCCATATC TCCTTTAATG ACATTGATTT CTAATGATAT AAATTTCAGC 2407CTACATTGAT GCCAAGCTTT TTTGCCACAA AGAAGATTCT TACCAAGAGT GGGCTTTGTG 2467GAAACAGCTG GTACTGATGT TCACCTTTAT ATATGTACTA GCATTTTCCA CGCTGATGTT 2527TATGTACTGT AAACAGTTCT GCACTCTTGT ACAAAAGAAA AAACACCTGT CACATCCAAA 2587TATAGTATCT GTCTTTTCGT CAAAATAGAG AGTGGGGAAT GAGTGTGCCG ATTCAATACC 2647TCAATCCCTG AACGACACTC TCCTAATCCT AAGCCTTACC TGAGTGAGAA GCCCTTTACC 2707TAACAAAAGT CCAATATAGC TGAAATGTCG CTCTAATACT CTTTACACAT ATGAGGTTAT 2767ATGTAGAAAA AAATTTTACT ACTAAATGAT TTCAACTATT GGCTTTCTAT ATTTTGAAAG 2827TAATGATATT GTCTCATTTT TTTACTGATG GTTTAATACA AAATACACAG AGCTTGTTTC 2887CCCTCATAAG TAGTGTTCGC TCTGATATGA ACTTCACAAA TACAGCTCAT CAAAAGCAGA 2947CTCTGAGAAG CCTCGTGCTG TAGCAGAAAG TTCTGCATCA TGTGACTGTG GACAGGCAGG 3007AGGAAACAGA ACAGACAAGC ATTGTCTTTT GTCATTGCTC GAAGTGCAAG CGTGCATACC 3067TGTGGAGGGA ACTGGTGGCT GCTTGTAAAT GTTCTGCAGC ATCTCTTGAC ACACTTGTCA 3127TGACACAATC CAGTACCTTG GTTTTCAGGT TATCTGACAA AGGCAGCTTT GATTGGGACA 3187TGGAGGCATG GGCAGGCCGG AA 3209(2)SEQ ID NO:6的信息:
(ⅰ)顺序特征:
(A)长度:466个氨基酸
(B)类型:氨基酸
(D)拓扑学:线性
(ⅱ)分子类型:蛋白质
(ⅹⅰ)顺序描述:SEQ ID NO:6:Met Phe Leu Ala Thr Leu Tyr Phe Ala Leu Pro Leu Leu Asp Leu Leu1 5 10 15Leu Ser Ala Glu Val Ser Gly Gly Asp Arg Leu Asp Cys Val Lys Ala
20 25 30Ser Asp Gln Cys Leu Lys Glu Gln Ser Cys Ser Thr Lys Tyr Arg Thr
35 40 45Leu Arg Gln Cys Val Ala Gly Lys Glu Thr Asn Phe Ser Leu Ala Ser
50 55 60Gly Leu Glu Ala Lys Asp Glu Cys Arg Ser Ala Met Glu Ala Leu Lys65 70 75 80Gln Lys Ser Leu Tyr Asn Cys Arg Cys Lys Arg Gly Met Lys Lys Glu
85 90 95Lys Asn Cys Leu Arg Ile Tyr Trp Ser Met Tyr Gln Ser Leu Gln Gly
100 105 110Asn Asp Leu Leu Glu Asp Ser Pro Tyr Glu Pro Val Asn Ser Arg Leu
115 120 125Ser Asp Ile Phe Arg Val Val Pro Phe Ile Ser Asp Val Phe Gln Gln130 135 140Val Glu His Ile Pro Lys Gly Asn Asn Cys Leu Asp Ala Ala Lys Ala145 150 155 160Cys Asn Leu Asp Asp Ile Cys Lys Lys Tyr Arg Ser Ala Tyr Ile Thr
165 170 175Pro Cys Thr Thr Ser Val Ser Xaa Asp Val Cys Asn Arg Arg Lys Cys
180 185 190His Lys Ala Leu Arg Gln Phe Phe Asp Lys Val Pro Ala Lys His Ser
195 200 205Tyr Gly Met Leu Phe Cys Ser Cys Arg Asp Ile Ala Cys Thr Glu Arg
210 215 220Arg Arg Gln Thr Ile Val Pro Val Cys Ser Tyr Glu Glu Arg Glu Lys225 230 235 240Pro Asn Cys Leu Asn Leu Gln Asp Ser Cys Lys Thr Asn Tyr Ile Cys
245 250 255Arg Ser Arg Leu Ala Asp Phe Phe Thr Asn Cys Gln Pro Glu Ser Arg
260 265 270Ser Val Ser Ser Cys Leu Lys Glu Asn Tyr Ala Asp Cys Leu Leu Ala
275 280 285Tyr Ser Gly Leu Ile Gly Thr Val Met Thr Pro Asn Tyr Ile Asp Ser
290 295 300Sar Ser Leu Ser Val Ala Pro Trp Cys Asp Cys Ser Asn Ser Gly Asn305 310 315 320Asp Leu Glu Glu Cys Leu Lys Phe Leu Asn Phe Phe Lys Asn Asn Thr
325 330 335Cys Leu Lys Asn Ala Ile Gln Ala Phe Gly Asn Gly Ser Asp Val Thr
340 345 350Val Trp Gln Pro Ala Phe Pro Val Gln Thr Thr Thr Ala Thr Thr Thr
355 360 365Thr Ala Leu Arg Val Lys Asn Lys Pro Leu Gly Pro Ala Gly Ser Glu
370 375 380Asn Glu Ile Pro Thr His Val Leu Pro Pro Cys Ala Asn Leu Gln Ala385 390 395 400Gln Lys Leu Lys Ser Asn Val Ser Gly Asn Thr His Leu Cys Ile Ser
405 410 415Asn Gly Asn Tyr Glu Lys Glu Gly Leu Gly Ala Ser Ser His Ile Thr
420 425 430Thr Lys Ser Met Ala Ala Pro Pro Ser Cys Gly Leu Ser Pro Leu Leu
435 440 445Val Leu Val Val Thr Ala Leu Ser Thr Leu Leu Ser Leu Thr Glu Thr
450 455 460Ser *465(2)SEQ ID NO:7的信息:
(ⅰ)顺序特征:
(A)长度:508个碱基对
(B)类型:核酸
(C)链型:单链
(D)拓扑学:线性
(ⅱ)分子类型:cDNA
(ⅸ)特征:
(A)名称/关键词:misc_feature
(B)位置:1…508
(C)其它信息:/注释=“1-508为图5 Hsgr-21af的-237
至272”
(ⅹⅰ)顺序描述:SEQ ID NO:7:TCTGGCCTCG GAACACGCCA TTCTCCGCGC CGCTTCCAAT AACCACTAAC ATCCCTAACG 60AGCATCCGAG CCGAGGGCTC TGCTCGGAAA TCGTCCTGGC CCAACTCGGC CCTTCGAGCT 120CTCGAAGATT ACCGCATCTA TTTTTTTTTT CTTTTTTTTC TTTTCCTAGC GCAGATAAAG 180TGAGCCCGGA AAGGGAAGGA GGGGGCGGGG ACACCATTGC CCTGAAAGAA TAAATAAGTA 240AATAAACAAA CTGGCTCCTC GCCGCAGCTG GACGCGGTCG GTTGAGTCCA GGTTGGGTCG 300GACCTGAACC CCTAAAAGCG GAACCGCCTC CCGCCCTCGC CATCCCGGAG CTGAGTCGCC 360GGCGGCGGTG GCTGCTGCCA GACCCGGAGT TTCCTCTTTC ACTGGATGGA GCTGAACTTT 420GGGCGGCCAG AGCAGCACAG CTGTCCGGGG ATCGCTGCAC GCTGAGCTCC CTCGGCAAGA 480CCCAGCGGCG GCTCGGGATT TTTTTGGG 508(2)SEQ ID NO:8的信息:
(ⅰ)顺序特征:
(A)长度:510个碱基对
(B)类型:核酸
(C)链型:单链
(D)拓扑学:线性
(ⅱ)分子类型:cDNA
(ⅸ)特征:
(A)名称/关键词:misc_feature
(B)位置:1…510
(C)其它信息:/注释=“1-510为图5 Hsgr-21bf的-237
至272”
(ⅹⅰ)顺序描述:SEQ ID NO:8:AATCTGGCCT CGGAACACGC CATTCTCCGC GCCGCTTCCA ATAACCACTA ACATCCCTAA 60CGAGCATCCG AGCCGAGGGC TCTGCTCGGA AATCGTCCTG GCCCAACTCG GCCCTTCGAG 120CTCTCGAAGA TTACCGCATC TATTTTTTTT TTCTTTTTTT TCTTTTCCTA GCGCAGATAA 180AGTGAGCCCG GAAAGGGAAG GAGGGGGCGG GGACACCATT GCCCTGAAAG AATAAATAAG 240TAAATAAACA AACTGGCTCC TCGCCGCAGC TGGACGCGGT CGGTTGAGTC CAGGTTGGGT 300CGGACCTGAA CCCCTAAAAG CGGAACCGCC TCCCGCCCTC GCCATCCCGG AGCTGAGTCG 360CCGGCGGCGG TGGCTGCTGC CAGACCCGGA GTTTCCTCTT TCACTGGATG GAGCTGAACT 420TTGGGCGGCC AGAGCAGCAC AGCTGTCCGG GGATCGCTGC ACGCTGAGCT CCCTCGGCAA 480GACCCAGCGG CGGCTCGGGA TTTTTTTGGG 510(2)SEQ ID NO:9的信息:
(ⅰ)顺序特征:
(A)长度:1927个碱基对
(B)类型:核酸
(C)链型:单链
(D)拓扑学:线性
(ⅱ)分子类型:cDNA
(ⅸ)特征:
(A)名称/关键词:CDS
(B)位置:538…1926
(ⅹⅰ)特征:
(A)名称/关键词:misc_feature
(B)位置:1…537
(C)其它信息:/注释=“1-537为图521acon的-235至
301”
(ⅹⅰ)顺序描述:SEQ ID NO:9:TCTGGCCTCG GAACACGCCA TTCTCCGCGC CGCTTCCAAT AACCACTAAC ATCCCTAACG 60AGCATCCGAG CCGAGGGCTC TGCTCGGAAA TCGTCCTGGC CCAACTCGGC CCTTCGAGCT 120CTCGAAGATT ACCGCATCTA TTTTTTTTTT CTTTTTTTTC TTTTCCTAGC GCAGATAAAG 180TGAGCCCGGA AAGGGAAGGA GGGGGCGGGG ACACCATTGC CCTGAAAGAA TAAATAAGTA 240AATAAACAAA CTGGCTCCTC GCCGCAGCTG GACGCGGTCG GTTGAGTCCA GGTTGGGTCG 300GACCTGAACC CCTAAAAGCG GAACCGCCTC CCGCCCTCGC CATCCCGGAG CTGAGTCGCC 360GGCGGCGGTG GCTGCTGCCA GACCCGGAGT TTCCTCTTTC ACTGGATGGA GCTGAACTTT 420GGGCGGCCAG AGCAGCACAG CTGTCCGGGG ATCGCTGCAC GCTGAGCTCC CTCGGCAAGA 480CCCAGCGGCG GCTCGGGATT TTTTTGGGGG GGCGGGGACC AGCCCCGCGC CGGCACC 537ATG TTC CTG GCG NCC CTG TAC TTC GCG CTG CCG CTC TTG GAC TTG CTC 585Met Phe Leu Ala Xaa Leu Tyr Phe Ala Leu Pro Leu Leu Asp Leu Leu1 5 10 15CTG TCG GCC GAA GTG AGC GGC GGA GAC CGC CTG GAT TGC GTG AAA GCC 633Leu Ser Ala Glu Val Ser Gly Gly Asp Arg Leu Asp Cys Val Lys Ala
20 25 30AGT GAT CAG TGC CTG AAG GAG CAG AGC TGC AGC ACC AAG TAC CGC ACG 681Ser Asp Gln Cys Leu Lys Glu Gln Sar Cys Ser Thr Lys Tyr Arg Thr
35 40 45CTA AGG CAG TGC GTG GCG GGC AAG GAG ACC AAC TTC AGC CTG GCA TCC 729Leu Arg Gln Cys Val Ala Gly Lys Glu Thr Asn Phe Ser Leu Ala Ser
50 55 60GGC CTG GAG GCC AAG GAT GAG TGC CGC AGC GCC ATG GAG GCC CTG AAG 777Gly Leu Glu Ala Lys Asp Glu Cys Arg Ser Ala Met Glu Ala Leu Lys65 70 75 80CAG AAG TCG CTC TAC AAC TGC CGC TGC AAG CGG GGT ATG AAG AAG GAG 825Gln Lys Ser Leu Tyr Asn Cys Arg Cys Lys Arg Gly Met Lys Lys Glu
85 90 95AAG AAC TGC CTG CGC ATT TAC TGG AGC ATG TAC CAG AGC CTG CAG GGA 873Lys Asn Cys Leu Arg Ile Tyr Trp Ser Met Tyr Gln Ser Leu Gln Gly
100 105 110AAT GAT CTG CTG GAG GAT TCC CCA TAT GAA CCA GTT AAC AGC AGA TTG 921Asn Asp Leu Leu Glu Asp Ser Pro Tyr Glu Pro Val Asn Ser Arg Leu
115 120 125TCA GAT ATA TTC CGG GTG GTC CCA TTC ATA TCA GAT GTT TTT CAG CAA 969Ser Asp Ile Phe Arg Val Val Pro Phe Ile Ser Asp Val Phe Gln Gln
130 135 140GTG GAG CAC ATT CCC AAA GGG AAC AAC TGC CTG GAT GCA GCG AAG GCC 1017Val Glu His Ile Pro Lys Gly Asn Asn Cys Leu Asp Ala Ala Lys Ala145 150 155 160TGC AAC CTC GAC GAC ATT TGC AAG AAG TAC AGG TCG GCG TAC ATC ACC 1065Cys Asn Leu Asp Asp Ile Cys Lys Lys Tyr Arg Ser Ala Tyr Ile Thr
165 170 175CCG TGC ACC ACC AGC GTG TCC AAC GAT GTC TGC AAC CGC CGC AAG TGC 1113Pro Cys Thr Thr Ser Val Ser Asn Asp Val Cys Asn Arg Arg Lys Cys
180 185 190CAC AAG GCC CTC CGG CAG TTC TTT GAC AAG GTC CCG GCC AAG CAC AGC 1161His Lys Ala Leu Arg Gln Phe Phe Asp Lys Val Pro Ala Lys His Ser
195 200 205TAC GGA ATG CTC TTC TGC TCC TGC CGG GAC ATC GCC TGC ACA GAG CGG 1209Tyr Gly Met Leu Phe Cys Ser Cys Arg Asp Ile Ala Cys Thr Glu Arg
210 215 220AGG CGA CAG ACC ATC GTG CCT GTG TGC TCC TAT GAA GAG AGG GAG AAG 1257Arg Arg Gln Thr Ile Val Pro Val Cys Ser Tyr Glu Glu Arg Glu Lys225 230 235 240CCC AAC TGT TTG AAT TTG CAG GAC TCC TGC AAG ACG AAT TAC ATC TGC 1305Pro Asn Cys Leu Asn Leu Gln Asp Ser Cys Lys Thr Asn Tyr Ile Cys
245 250 255AGA TCT CGC CTT GCG GAT TTT TTT ACC AAC TGC CAG CCA GAG TCA AGG 1353Arg Ser Arg Leu Ala Asp Phe Phe Thr Asn Cys Gln Pro Glu Ser Arg
260 265 270TCT GTC AGC AGC TGT CTA AAG GAA AAC TAC GCT GAC TGC CTC CTC GCC 1401Ser Val Ser Ser Cys Leu Lys Glu Asn Tyr Ala Asp Cys Leu Leu Ala
275 280 285TAC TCG GGG CTT ATT GGC ACA GTC ATG ACC CCC AAC TAC ATA GAC TCC 1449Tyr Ser Gly Leu Ile Gly Thr Val Met Thr Pro Asn Tyr Ile Asp Ser
290 295 300AGT AGC CTC AGT GTG GCC CCA TGG TGT GAC TGC AGC AAC AGT GGG AAC 1497Ser Ser Leu Ser Val Ala Pro Trp Cys Asp Cys Ser Asn Ser Gly Asn305 310 315 320GAC CTA GAA GAG TGC TTG AAA TTT TTG AAT TTC TTC AAG GAC AAT ACA 1545Asp Leu Glu Glu Cys Leu Lys Phe Leu Asn Phe Phe Lys Asp Asn Thr
325 330 335TGT CTT AAA AAT GCA ATT CAA GCC TTT GGC AAT GGC TCC GAT GTG ACC 1593Cys Leu Lys Asn Ala Ile Gln Ala Phe Gly Asn Gly Ser Asp Val Thr
340 345 350GTG TGG CAG CCA GCC TTC CCA GTA CAG ACC ACC ACT GCC ACT ACC ACC 1641Val Trp Gln Pro Ala Phe Pro Val Gln Thr Thr Thr Ala Thr Thr Thr
355 360 365ACT GCC CTC CGG GTT AAG AAC AAG CCC CTG GGG CCA GCA GGG TCT GAG 1689Thr Ala Leu Arg Val Lys Asn Lys Pro Leu Gly Pro Ala Gly Ser Glu
370 375 380AAT GAA ATT CCC ACT CAT GTT TTG CCA CCG TGT GCA AAT TTA CAG GCA 1737Asn Glu Ile Pro Thr His Val Leu Pro Pro Cys Ala Asn Leu Gln Ala385 390 395 400CAG AAG CTG AAA TCC AAT GTG TCG GGC AAT ACA CAC CTC TGT ATT TCC 1785Gln Lys Leu Lys Ser Asn Val Ser Gly Asn Thr His Leu Cys Ile Ser
405 410 415AAT GGT AAT TAT GAA AAA GAA GGT CTC GGT GCT TCC AGC CAC ATA ACC 1833Asn Gly Asn Tyr Glu Lys Glu Gly Leu Gly Ala Ser Ser His Ile Thr
420 425 430ACA AAA TCA ATG GCT GCT CCT CCA AGC TGT GGT CTG AGC CCA CTG CTG 1881Thr Lys Ser Met Ala Ala Pro Pro Ser Cys Gly Leu Ser Pro Leu Leu
435 440 445GTC CTG GTG GTA ACC GCT CTG TCC ACC CTA TTA TCT TTA ACA GAA 1926Val Leu Val Val Thr AIa Leu Ser Thr Leu Leu Ser Leu Thr Glu
450 455 460
1927(2)SEQ ID NO:10的信息:
(ⅰ)顺序特征:
(A)长度:463个氨基酸
(B)类型:氨基酸
(D)拓扑学:线性
(ⅱ)分子类型:蛋白质
(ⅹⅰ)顺序描述:SEQ ID NO:10:Met Phe Leu Ala Xaa Leu Tyr Phe Ala Leu Pro Leu Leu Asp Leu Leu1 5 10 15Leu Ser Ala Glu Val Ser Gly Gly Asp Arg Leu Asp Cys Val Lys Ala
20 25 30Ser Asp Gln Cys Leu Lys Glu Gln Ser Cys Ser Thr Lys Tyr Arg Thr
35 40 45Leu Arg Gln Cys Val Ala Gly Lys Glu Thr Asn Phe Ser Leu Ala Ser
50 55 60Gly Leu Glu Ala Lys Asp Glu Cys Arg Ser Ala Met Glu Ala Leu Lys65 70 75 80Gln Lys Ser Leu Tyr Asn Cys Arg Cys Lys Arg Gly Met Lys Lys Glu
85 90 95Lys Asn Cys Leu Arg Ile Tyr Trp Ser Met Tyr Gln Ser Leu Gln Gly
100 105 110Asn Asp Leu Leu Glu Asp Ser Pro Tyr Glu Pro Val Asn Ser Arg Leu
115 120 125Ser Asp Ile Phe Arg Val Val Pro Phe Ile Ser Asp Val Phe Gln Gln
130 135 140Val Glu His Ile Pro Lys Gly Asn Asn Cys Leu Asp Ala Ala Lys Ala145 150 155 160Cys Asn Leu Asp Asp Ile Cys Lys Lys Tyr Arg Ser Ala Tyr Ile Thr
165 170 175Pro Cys Thr Thr Ser Val Ser Asn Asp Val Cys Asn Arg Arg Lys Cys
180 185 190His Lys Ala Leu Arg Gln Phe Phe Asp Lys Val Pro Ala Lys His Ser
195 200 205Tyr Gly Met Leu Phe Cys Ser Cys Arg Asp Ile Ala Cys Thr Glu Arg
210 215 220Arg Arg Gln Thr Ile Val Pro Val Cys Ser Tyr Glu Glu Arg Glu Lys225 230 235 240Pro Asn Cys Leu Asn Leu Gln Asp Ser Cys Lys Thr Asn Tyr Ile Cys
245 250 255Arg Ser Arg Leu Ala Asp Phe Phe Thr Asn Cys Gln Pro Glu Ser Arg
260 265 270Ser Val Ser Ser Cys Leu Lys Glu Asn Tyr Ala Asp Cys Leu Leu Ala
275 280 285Tyr Ser Gly Leu Ile Gly Thr Val Met Thr Pro Asn Tyr Ile Asp Ser
290 295 300Ser Ser Leu Ser Val Ala Pro Trp Cys Asp Cys Ser Asn Ser Gly Asn305 310 315 320Asp Leu Glu Glu Cys Leu Lys Phe Leu Asn Phe Phe Lys Asp Asn Thr
325 330 335Cys Leu Lys Asn Ala Ile Gln Ala Phe Gly Asn Gly Ser Asp Val Thr
340 345 350Val Trp Gln Pro Ala Phe Pro Val Gln Thr Thr Thr Ala Thr Thr Thr
355 360 365Thr Ala Leu Arg Val Lys Asn Lys Pro Leu Gly Pro Ala Gly Ser Glu
370 375 380Asn Glu Ile Pro Thr His Val Leu Pro Pro Cys Ala Asn Leu Gln Ala385 390 395 400Gln Lys Leu Lys Ser Asn Val Ser Gly Asn Thr His Leu Cys Ile Ser
405 410 415Asn Gly Asn Tyr Glu Lys Glu Gly Leu Gly Ala Ser Ser His Ile Thr
420 425 430Thr Lys Ser Met Ala Ala Pro Pro Ser Cys Gly Leu Ser Pro Leu Leu
435 440 445Val Leu Val Val Thr Ala Leu Ser Thr Leu Leu Ser Leu Thr Glu
450 455 460(2)SEQ ID NO:11的信息:
(ⅰ)顺序特征:
(A)长度:1929个碱基对
(B)类型:核酸
(C)链型:单链
(D)拓扑学:线性
(ⅱ)分子类型:cDNA
(ⅸ)特征:
(A)名称/关键词:CDS
(B)位置:540…1928
(ⅸ)特征
(A)名称/关键词:misc_feature
(B)位置:1…539
(C)其它信息:/注释=“1-539为图5 21bcon的-237至
301”
(ⅹⅰ)顺序描述:SEQ ID NO:11:AATCTGGCCT CGGAACACGC CATTCTCCGC GCCGCTTCCA ATAACCACTA ACATCCCTAA 60CGAGCATCCG AGCCGAGGGC TCTGCTCGGA AATCGTCCTG GCCCAACTCG GCCCTTCGAG 120CTCTCGAAGA TTACCGCATC TATTTTTTTT TTCTTTTTTT TCTTTTCCTA GCGCAGATAA 180AGTGAGCCCG GAAAGGGAAG GAGGGGGCGG GGACACCATT GCCCTGAAAG AATAAATAAG 240TAAATAAACA AACTGGCTCC TCGCCGCAGC TGGACGCGGT CGGTTGAGTC CAGGTTGGGT 300CGGACCTGAA CCCCTAAAAG CGGAACCGCC TCCCGCCCTC GCCATCCCGG AGCTGAGTCG 360CCGGCGGCGG TGGCTGCTGC CAGACCCGGA GTTTCCTCTT TCACTGGATG GAGCTGAACT 420TTGGGCGGCC AGAGCAGCAC AGCTGTCCGG GGATCGCTGC ACGCTGAGCT CCCTCGGCAA 480GACCCAGCGG CGGCTCGGGA TTTTTTTGGG GGGGCGGGGA CCAGCCCCGC GCCGGCACC 539ATG TTC CTG GCG ACC CTG TAC TTC GCG CTG CCG CTC TTG GAC TTG CTC 587Met Phe Leu Ala Thr Leu Tyr Phe Ala Leu Pro Leu Leu Asp Leu Leu1 5 10 15CTG TCG GCC GAA GTG AGC GGC GGA GAC CGC CTG GAT TGC GTG AAA GCC 635Leu Ser Ala Glu Val Ser Gly Gly Asp Arg Leu Asp Cys Val Lys Ala
20 25 30AGT GAT CAG TGC CTG AAG GAG CAG AGC TGC AGC ACC AAG TAC CGC ACG 683Ser Asp Gln Cys Leu Lys Glu Gln Ser Cys Ser Thr Lys Tyr Arg Thr
35 40 45CTA AGG CAG TGC GTG GCG GGC AAG GAG ACC AAC TTC AGC CTG GCA TCC 731Leu Arg Gln Cys Val Ala Gly Lys Glu Thr Asn Phe Ser Leu Ala Ser
50 55 60GGC CTG GAG GCC AAG GAT GAG TGC CGC AGC GCC ATG GAG GCC CTG AAG 779Gly Leu Glu Ala Lys Asp Glu Cys Arg Ser Ala Met Glu Ala Leu Lys65 70 75 80CAG AAG TCG CTC TAC AAC TGC CGC TGC AAG CGG GGT ATG AAG AAG GAG 827Gln Lys Ser Leu Tyr Asn Cys Arg Cys Lys Arg Gly Met Lys Lys Glu
85 90 95AAG AAC TGC CTG CGC ATT TAC TGG AGC ATG TAC CAG AGC CTG CAG GGA 875Lys Asn Cys Leu Arg Ile Tyr Trp Ser Met Tyr Gln Ser Leu Gln Gly
100 105 110AAT GAT CTG CTG GAG GAT TCC CCA TAT GAA CCA GTT AAC AGC AGA TTG 923Asn Asp Leu Leu Glu Asp Ser Pro Tyr Glu Pro Val Asn Ser Arg Leu
115 120 125TCA GAT ATA TTC CGG GTG GTC CCA TTC ATA TCA GAT GTT TTT CAG CAA 971Ser Asp Ile Phe Arg Val Val Pro Phe Ile Ser Asp Val Phe Gln Gln
130 135 140GTG GAG CAC ATT CCC AAA GGG AAC AAC TGC CTG GAT GCA GCG AAG GCC 1019Val Glu His Ile Pro Lys Gly Asn Asn Cys Leu Asp Ala Ala Lys Ala145 150 155 160TGC AAC CTC GAC GAC ATT TGC AAG AAG TAC AGG TCG GCG TAC ATC ACC 1067Cys Asn Leu Asp Asp Ile Cys Lys Lys Tyr Arg Ser Ala Tyr Ile Thr
165 170 175CCG TGC ACC ACC AGC GTG TCC AAC GAT GTC TGC AAC CGC CGC AAG TGC 1115Pro Cys Thr Thr Ser Val Ser Asn Asp Val Cys Asn Arg Arg Lys Cys
180 185 190CAC AAG GCC CTC CGG CAG TTC TTT GAC AAG GTC CCG GCC AAG CAC AGC 1163His Lys Ala Leu Arg Gln Phe Phe Asp Lys Val Pro Ala Lys His Ser
195 200 205TAC GGA ATG CTC TTC TGC TCC TGC CGG GAC ATC GCC TGC ACA GAG CGG 1211Tyr Gly Met Leu Phe Cys Ser Cys Arg Asp Ile Ala Cys Thr Glu Arg
210 215 220AGG CGA CAG ACC ATC GTG CCT GTG TGC TCC TAT GAA GAG AGG GAG AAG 1259Arg Arg Gln Thr Ile Val Pro Val Cys Ser Tyr Glu Glu Arg Glu Lys225 230 235 240CCC AAC TGT TTG AAT TTG CAG GAC TCC TGC AAG ACG AAT TAC ATC TGC 1307Pro Asn Cys Leu Asn Leu Gln Asp Ser Cys Lys Thr Asn Tyr Ile Cys
245 250 255AGA TCT CGC CTT GCG GAT TTT TTT ACC AAC TGC CAG CCA GAG TCA AGG 1355Arg Ser Arg Leu Ala Asp Phe Phe Thr Asn Cys Gln Pro Glu Ser Arg
260 265 270TCT GTC AGC AGC TGT CTA AAG GAA AAC TAC GCT GAC TGC CTC CTC GCC 1403Ser Val Ser Ser Cys Leu Lys Glu Asn Tyr Ala Asp Cys Leu Leu Ala
275 280 285TAC TCG GGG CTT ATT GGC ACA GTC ATG ACC CCC AAC TAC ATA GAC TCC 1451Tyr Ser Gly Leu Ile Gly Thr Val Met Thr Pro Asn Tyr Ile Asp Ser
290 295 300AGT AGC CTC AGT GTG GCC CCA TGG TGT GAC TGC AGC AAC AGT GGG AAC 1499Ser Ser Leu Ser Val Ala Pro Trp Cys Asp Cys Ser Asn Ser Gly Asn305 310 315 320GAC CTA GAA GAG TGC TTG AAA TTT TTG AAT TTC TTC AAG GAC AAT ACA 1547Asp Leu Glu Glu Cys Leu Lys Phe Leu Asn Phe Phe Lys Asp Asn Thr
325 330 335TGT CTT AAA AAT GCA ATT CAA GCC TTT GGC AAT GGC TCC GAT GTG ACC 1595Cys Leu Lys Asn Ala Ile Gln Ala Phe Gly Asn Gly Ser Asp Val Thr
340 345 350GTG TGG CAG CCA GCC TTC CCA GTA CAG ACC ACC ACT GCC ACT ACC ACC 1643Val Trp Gln Pro Ala Phe Pro Val Gln Thr Thr Thr Ala Thr Thr Thr
355 360 365ACT GCC CTC CGG GTT AAG AAC AAG CCC CTG GGG CCA GCA GGG TCT GAG 1691Thr Ala Leu Arg Val Lys Asn Lys Pro Leu Gly Pro Ala Gly Ser Glu
370 375 380AAT GAA ATT CCC ACT CAT GTT TTG CCA CCG TGT GCA AAT TTA CAG GCA 1739Asn Glu Ile Pro Thr His Val Leu Pro Pro Cys Ala Asn Leu Gln Ala385 390 395 400CAG AAG CTG AAA TCC AAT GTG TCG GGC AAT ACA CAC CTC TGT ATT TCC 1787Gln Lys Leu Lys Ser Asn Val Ser Gly Asn Thr His Leu Cys Ile Ser
405 410 415AAT GGT AAT TAT GAA AAA GAA GGT CTC GGT GCT TCC AGC CAC ATA ACC 1835Asn Gly Asn Tyr Glu Lys Glu Gly Leu Gly Ala Ser Ser His Ile Thr
420 425 430ACA AAA TCA ATG GCT GCT CCT CCA AGC TGT GGT CTG AGC CCA CTG CTG 1883Thr Lys Ser Met Ala Ala Pro Pro Ser Cys Gly Leu Ser Pro Leu Leu
435 440 445GTC CTG GTG GTA ACC GCT CTG TCC ACC CTA TTA TCT TTA ACA GAA 1928Val Leu Val Val Thr Ala Leu Ser Thr Leu Leu Ser Leu Thr Glu
450 455 460
1929(2)SEQ ID NO:12的信息:
(ⅰ)顺序特征:
(A)长度:463个氨基酸
(B)类型:氨基酸
(D)拓扑学:线性
(ⅱ)分子类型:蛋白质
(ⅹⅰ)顺序描述:SEQ ID NO:12:Met Phe Leu Ala Thr Leu Tyr Phe Ala Leu Pro Leu Leu Asp Leu Leu1 5 10 15Leu Ser Ala Glu Val Ser Gly Gly Asp Arg Leu Asp Cys Val Lys Ala
20 25 30Ser Asp Gln Cys Leu Lys Glu Gln Ser Cys Ser Thr Lys Tyr Arg Thr
35 40 45Leu Arg Gln Cys Val Ala Gly Lys Glu Thr Asn Phe Ser Leu Ala Ser
50 55 60Gly Leu Glu Ala Lys Asp Glu Cys Arg Ser Ala Met Glu Ala Leu Lys65 70 75 80Gln Lys Ser Leu Tyr Asn Cys Arg Cys Lys Arg Gly Met Lys Lys Glu
85 90 95Lys Asn Cys Leu Arg Ile Tyr Trp Ser Met Tyr Gln Ser Leu Gln Gly
100 105 110Asn Asp Leu Leu Glu Asp Ser Pro Tyr Glu Pro Val Asn Ser Arg Leu
115 120 125Ser Asp Ile Phe Arg Val Val Pro Phe Ile Ser Asp Val Phe Gln Gln
130 135 140Val Glu His Ile Pro Lys Gly Asn Asn Cys Leu Asp Ala Ala Lys Ala145 150 155 160Cys Asn Leu Asp Asp Ile Cys Lys Lys Tyr Arg Ser Ala Tyr Ile Thr
165 170 175Pro Cys Thr Thr Ser Val Ser Asn Asp Val Cys Asn Arg Arg Lys Cys
180 185 190His Lys Ala Leu Arg Gln Phe Phe Asp Lys Val Pro Ala Lys His Ser
195 200 205Tyr Gly Met Leu Phe Cys Ser Cys Arg Asp Ile Ala Cys Thr Glu Arg
210 215 220Arg Arg Gln Thr Ile Val Pro Val Cys Ser Tyr Glu Glu Arg Glu Lys225 230 235 240Pro Asn Cys Leu Asn Leu Gln Asp Ser Cys Lys Thr Asn Tyr Ile Cys
245 250 255Arg Ser Arg Leu Ala Asp Phe Phe Thr Asn Cys Gln Pro Glu Sar Arg
260 265 270Ser Val Ser Ser Cys Leu Lys Glu Asn Tyr Ala Asp Cys Leu Leu Ala
275 280 285Tyr Ser Gly Leu Ile Gly Thr Val Met Thr Pro Asn Tyr Ile Asp Ser
290 295 300Ser Ser Leu Ser Val Ala Pro Trp Cys Asp Cys Ser Asn Ser Gly Asn305 310 315 320Asp Leu Glu Glu Cys Leu Lys Phe Leu Asn Phe Phe Lys Asp Asn Thr
325 330 335Cys Leu Lys Asn Ala Ile Gln Ala Phe Gly Asn Gly Ser Asp Val Thr
340 345 350Val Trp Gln Pro Ala Phe Pro Val Gln Thr Thr Thr Ala Thr Thr Thr
355 360 365Thr Ala Leu Arg Val Lys Asn Lys Pro Leu Gly Pro Ala Gly Ser Glu
370 375 380Asn Glu Ile Pro Thr His Val Leu Pro Pro Cys Ala Asn Leu Gln Ala385 390 395 400Gln Lys Leu Lys Ser Asn Val Ser Gly Asn Thr His Leu Cys Ile Ser
405 410 415Asn Gly Asn Tyr Glu Lys Glu Gly Leu Gly Ala Ser Ser His Ile Thr
420 425 430Thr Lys Ser Met Ala Ala Pro Pro Ser Cys Gly Leu Ser Pro Leu Leu
435 440 445Val Leu Val Val Thr Ala Leu Ser Thr Leu Leu Ser Leu Thr Glu
450 455 460(2)SEQ ID NO:13的信息:
(ⅰ)顺序特征:
(A)长度:699个碱基对
(B)类型:核酸
(C)链型:单链
(D)拓扑学:线性
(ⅱ)分子类型:cDNA
(ⅸ)特征:
(A)名称/关键词:misc_feature
(B)位置:1…699
(C)其它信息:/注释=“1-699为图5 Hsgr-29a的814-
1512”
(ⅸ)特征:
(A)名称/关键词:CDS
(B)位置:2…697
(ⅹⅰ)顺序描述:SEQ ID NO:13:G TCG GCG TAC ATC ACC CCG TGC ACC ACC AGC GTG TCC AAT GAT GTC 46Ser Ala Tyr Ile Thr Pro Cys Thr Thr Ser Val Ser Asn Asp Val
1 5 10 15TGC AAC CGC CGC AAG TGC CAC AAG GCC CTC CGG CAG TTC TTT GAC AAG 94Cys Asn Arg Arg Lys Cys His Lys Ala Leu Arg Gln Phe Phe Asp Lys
20 25 30GTC CCG GCC AAG CAC AGC TAC GGA ATG CTC TTC TGC TCC TGC CGG GAC 142Val Pro Ala Lys His Ser Tyr Gly Met Leu Pha Cys Ser Cys Arg Asp
35 40 45ATC GCC TGC ACA GAG CGG AGG CGA CAG ACC ATC GTG CCT GTG TGC TCC 190Ile Ala Cys Thr Glu Arg Arg Arg Gln Thr Ile Val Pro Val Cys Ser
50 55 60TAT GAA GAG AGG GAG AAG CCC AAC TGT TTG AAT TTG CAG GAC TCC TGC 238Tyr Glu Glu Arg Glu Lys Pro Asn Cys Leu Asn Leu Gln Asp Ser Cys
65 70 75AAG ACG AAT TAC ATC TGC AGA TCT CGC CTT GCG GAT TTT TTT ACC AAC 286Lys Thr Asn Tyr Ile Cys Arg Ser Arg Leu Ala Asp Phe Phe Thr Asn80 85 90 95TGC CAG CCA GAG TCA AGG TCT GTC AGC AGC TGT CTA AAG GAA AAC TAC 334Cys Gln Pro Glu Ser Arg Ser Val Ser Ser Cys Leu Lys Glu Asn Tyr
l00 105 110GCT GAC TGC CTC CTC GCC TAC TCG GGG CTT ATT GGC ACA GTC ATG ACC 382Ala Asp Cys Leu Leu Ala Tyr Ser Gly Leu Ile Gly Thr Val Met Thr
115 120 125CCC AAC TAC ATA GAC TCC AGT AGC CTC AGT GTG GCC CCA TGG TGT GAC 430Pro Asn Tyr Ile Asp Ser Ser Ser Leu Ser Val Ala Pro Trp Cys Asp
130 135 140TGC AGC AAC AGT GGG AAC GAC CTA GAA GAG TGC TTG AAA TTT TTG AAT 478Cys Ser Asn Ser Gly Asn Asp Leu Glu Glu Cys Leu Lys Phe Leu Asn
145 150 155TTC TTC AAG GAC AAT ACA TGT CTT AAA AAT GCA ATT CAA GCC TTT GGC 526Phe Phe Lys Asp Asn Thr Cys Leu Lys Asn Ala Ile Gln Ala Phe Gly160 165 170 175AAT GGC TCC GAT GTG ACC GTG TGG CAG CCA GCC TTC CCA GTA CAG ACC 574Asn Gly Ser Asp Val Thr Val Trp Gln Pro Ala Phe Pro Val Gln Thr
180 185 190ACC ACT GCC GCT ACC ACC ACT GCC CTC CGG GTT AAG AAC AAG CCC CTG 622Thr Thr Ala Ala Thr Thr Thr Ala Leu Arg Val Lys Asn Lys Pro Leu
195 200 205GGG CCA GCA GGG TCT GAG AAT GAA ATT CCC ACT CAT GTT TTG CCA CCG 670Gly Pro Ala Gly Ser Glu Asn Glu Ile Pro Thr His Val Leu Pro Pro
210 215 220TGT GCA AAT TTA CAG GCA CAG AAG CTG AA 699Cys Ala Asn Leu Gln Ala Gln Lys Leu
225 230(2)SEQ ID NO:14的信息:
(ⅰ)顺序特征:
(A)长度:232个氨基酸
(B)类型:氨基酸
(D)拓扑学:线性
(ⅱ)分子类型:蛋白质
(ⅹⅰ)顺序描述:SEQ ID NO:14:Ser Ala Tyr Ile Thr Pro Cys Thr Thr Ser Val Ser Asn Asp Val Cys1 5 10 15Asn Arg Arg Lys Cys His Lys Ala Leu Arg Gln Phe Phe Asp Lys Val
20 25 30Pro Ala Lys His Ser Tyr Gly Met Leu Phe Cys Ser Cys Arg Asp Ile
35 40 45Ala Cys Thr Glu Arg Arg Arg Gln Thr Ile Val Pro Val Cys Ser Tyr
50 55 60Glu Glu Arg Glu Lys Pro Asn Cys Leu Asn Leu Gln Asp Ser Cys Lys65 70 75 80Thr Asn Tyr Ile Cys Arg Ser Arg Leu Ala Asp Phe Phe Thr Asn Cys
85 90 95Gln Pro Glu Ser Arg Ser Val Ser Ser Cys Leu Lys Glu Asn Tyr Ala
100 105 110Asp Cys Leu Leu Ala Tyr Ser Gly Leu Ile Gly Thr Val Met Thr Pro
115 120 125Asn Tyr Ile Asp Ser ger Ser Leu Ser Val Ala Pro Trp Cys Asp Cys
130 135 140Ser Asn Ser Gly Asn Asp Leu Glu Glu Cys Leu Lys Phe Leu Asn Phe145 150 155 160Phe Lys Asp Asn Thr Cys Leu Lys Asn Ala Ile Gln Ala Phe Gly Asn
165 170 175Gly Ser Asp Val Thr Val Trp Gln Pro Ala Phe Pro Val Gln Thr Thr
180 185 190Thr Ala Ala Thr Thr Thr Ala Leu Arg Val Lys Asn Lys Pro Leu Gly
195 200 205Pro Ala Gly Ser Glu Asn Glu Ile Pro Thr His Val Leu Pro Pro Cys
210 215 220Ala Asn Leu Gln Ala Gln Lys Leu225 230(2)SEQ ID NO:15的信息:
(ⅰ)顺序特征:
(A)长度:2157个碱基对
(B)类型:核酸
(C)链型:单链
(D)拓扑学:线性
(ⅱ)分子类型:cDNA
(ⅸ)特征:
(A)名称/关键词:CDS
(B)位置:2…886
(ⅸ)特征:
(A)名称/关键词:misc_feature
(B)位置:1…2157
(C)其它信息:/注释=“1-2157为图5 29brc的814-
2971”
(ⅹⅰ)顺序描述:SEQ ID NO:15:G TCG GCG TAC ATC ACC CCG TGC ACC ACC AGC GTG TCC AAT GAT GTC 46Ser Ala Tyr Ile Thr Pro Cys Thr Thr Ser Val Ser Asn Asp Val
1 5 10 15TGC AAC CGC CGC AAG TGC CAC AAG GCC CTC CGG CAG TTC TTT GAC AAG 94Cys Asn Arg Arg Lys Cys His Lys Ala Leu Arg Gln Phe Phe Asp Lys
20 25 30GTC CCG GCC AAG CAC AGC TAC GGA ATG CTC TTC TGC TCC TGC CGG GAC 142Val Pro Ala Lys His Ser Tyr Gly Met Leu Phe Cys Ser Cys Arg Asp
35 40 45ATC GCC TGC ACA GAG CGG AGG CGA CAG ACC ATC GTG CCT GTG TGC TCC 190Ile Ala Cys Thr Glu Arg Arg Arg Gln Thr Ile Val Pro Val Cys Ser
50 55 60TAT GAA GAG AGG GAG AAG CCC AAC TGT TTG AAT TTG CAG GAC TCC TGC 238Tyr Glu Glu Arg Glu Lys Pro Asn Cys Leu Asn Leu Gln Asp Ser Cys
65 70 75AAG ACG AAT TAC ATC TGC AGA TCT CGC CTT GCG GAT TTT TTT ACC AAC 286Lys Thr Asn Tyr Ile Cys Arg Ser Arg Leu Ala Asp Phe Phe Thr Asn80 85 90 95TGC CAG CCA GAG TCA AGG TCT GTC AGC AGC TGT CTA AAG GAA AAC TAC 334Cys Gln Pro Glu Ser Arg Ser Val Ser Ser Cys Leu Lys Glu Asn Tyr
100 105 110GCT GAC TGC CTC CTC GCC TAC TCG GGG CTT ATT GGC ACA GTC ATG ACC 382Ala Asp Cys Leu Leu Ala Tyr Ser Gly Leu Ile Gly Thr Val Met Thr
115 120 125CCC AAC TAC ATA GAC TCC AGT AGC CTC AGT GTG GCC CCA TGG TGT GAC 430Pro Asn Tyr Ile Asp Ser Ser Ser Leu Ser Val Ala Pro Trp Cys Asp
130 135 140TGC AGC AAC AGT GGG AAC GAC CTA GAA GAG TGC TTG AAA TTT TTG AAT 478Cys Ser Asn Ser Gly Asn Asp Leu Glu Glu Cys Leu Lys Phe Leu Asn
145 150 155TTC TTC AAG GAC AAT ACA TGT CTT AAA AAT GCA ATT CAA GCC TTT GGC 526Phe Phe Lys Asp Asn Thr Cys Leu Lys Asn Ala Ile Gln Ala Phe Gly160 165 170 175AAT GGC TCC GAT GTG ACC GTG TGG CAG CCA GCC TTC CCA GTA CAG ACC 574Asn Gly Ser Asp Val Thr Val Trp Gln Pro Ala Phe Pro Val Gln Thr
180 185 190ACC ACT GCC GCT ACC ACC ACT GCC CTC CGG GTT AAG AAC AAG CCC CTG 622Thr Thr Ala Ala Thr Thr Thr Ala Leu Arg Val Lys Asn Lys Pro Leu
195 200 205GGG CCA GCA GGG TCT GAG AAT GAA ATT CCC ACT CAT GTT TTG CCA CCG 670Gly Pro Ala Gly Ser Glu Asn Glu Ile Pro Thr His Val Leu Pro Pro
210 215 220TGT GCA AAT TTA CAG GCA CAG AAG CTG AAA TCC AAT GTG TCG GGC AAT 718Cys Ala Asn Leu Gln Ala Gln Lys Leu Lys Ser Asn Val Ser Gly Asn
225 230 235ACA CAC CTC TGT ATT TCC AAT GGT AAT TAT GAA AAA GAA GGT CTC GGT 766Thr His Leu Cys Ile Ser Asn Gly Asn Tyr Glu Lys Glu Gly Leu Gly240 245 250 255GCT TCC AGC CAC ATA ACC ACA AAA TCA ATG GCT GCT CCT CCA AGC TGT 814Ala Ser Ser His Ile Thr Thr Lys Ser Met Ala Ala Pro Pro Ser Cys
260 265 270GGT CTG AGC CCA CTG CTG GTC CTG GTG GTA ACC GCT CTG TCC ACC CTA 862Gly Leu Ser Pro Leu Leu Val Leu Val Val Thr Ala Leu Ser Thr Leu
275 280 285TTA TCT TTA ACA GAA ACA TCA TAG CTGCATTAAA AAAATACAAT ATGGACATGT 916Leu Ser Leu Thr Glu Thr Ser *
290 295AAAAAGACAA AAACCAAGTT ATCTGTTTCC TGTTCTCTTG TATAGCTGAA ATTCCAGTTT 976AGGAGCTCAG TTGAGAAACA GTTCCATTCA ACTGGAACAT TTTTTTTTTT CCTTTTAAGA 1036AAGCTTCTTG TGATCCTTCG GGGCTTCTGT GAAAAACCTG ATGCAGTGCT CCATCCAAAC 1096TCAGAAGGCT TTGGGATATG CTGTATTTTA AAGGGACAGT TTGTAACTTG GGCTGTAAAG 1156CAAACTGGGG CTGTGTTTTC GATGATGATG ATCATCATGA TCATGATNNN NNNNNNNNNN 1216NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNGATT TTAACAGTTT TACTTCTGGC CTTTCCTAGC 1276TAGAGAAGGA GTTAATATTT CTAAGGTAAC TCCCATATCT CCTTTAATGA CATTGATTTC 1336TAATGATATA AATTTCAGCC TACATTGATG CCAAGCTTTT TTGCCACAAA GAAGATTCTT 1396ACCAAGAGTG GGCTTTGTGG AAACAGCTGG TACTGATGTT CACCTTTATA TATGTACTAG 1456CATTTTCCAC GCTGATGTTT ATGTACTGTA AACAGTTCTG CACTCTTGTA CAAAAGAAAA 1516AACACCTGTC ACATCCAAAT ATAGTATCTG TCTTTTCGTC AAAATAGAGA GTGGGGAATG 1576AGTGTGCCGA TTCAATACCT CAATCCCTGA ACGACACTCT CCTAATCCTA AGCCTTACCT 1636GAGTGAGAAG CCCTTTACCT AACAAAAGTC CAATATAGCT GAAATGTCGC TCTAATACTC 1696TTTACACATA TGAGGTTATA TGTAGAAAAA AATTTTACTA CTAAATGATT TCAACTATTG 1756GCTTTCTATA TTTTGAAAGT AATGATATTG TCTCATTTTT TTACTGATGG TTTAATACAA 1816AATACACAGA GCTTGTTTCC CCTCATAAGT AGTGTTCGCT CTGATATGAA CTTCACAAAT 1876ACAGCTCATC AAAAGCAGAC TCTGAGAAGC CTCGTGCTGT AGCAGAAAGT TCTGCATCAT 1936GTGACTGTGG ACAGGCAGGA GGAAACAGAA CAGACAAGCA TTGTCTTTTG TCATTGCTCG 1996AAGTGCAAGC GTGCATACCT GTGGAGGGAA CTGGTGGCTG CTTGTAAATG TTCTGCAGCA 2056TCTCTTGACA CACTTGTCAT GACACAATCC AGTACCTTGG TTTTCAGGTT ATCTGACAAA 2116GGCAGCTTTG ATTGGGACAT GGAGGCATGG GCAGGCCGGA A 2157(2)SEQ ID NO:16的信息:
(ⅰ)顺序特征:
(A)长度:295个氨基酸
(B)类型:氨基酸
(D)拓扑学:线性
(ⅱ)分子类型:蛋白质
(ⅹⅰ)顺序描述:SEQ ID NO:16:Ser Ala Tyr Ile Thr Pro Cys Thr Thr Ser Val Ser Asn Asp Val Cys1 5 10 15Asn Arg Arg Lys Cys His Lys Ala Leu Arg Gln Phe Phe Asp Lys Val
20 25 30Pro Ala Lys His Ser Tyr Gly Met Leu Phe Cys Ser Cys Arg Asp Ile
35 40 45Ala Cys Thr Glu Arg Arg Arg Gln Thr Ile Val Pro Val Cys Ser Tyr
50 55 60Glu Glu Arg Glu Lys Pro Asn Cys Leu Asn Leu Gln Asp Ser Cys Lys65 70 75 80Thr Asn Tyr Ile Cys Arg Ser Arg Leu Ala Asp Phe Phe Thr Asn Cys
85 90 95Gln Pro Glu Ser Arg Ser Val Ser Ser Cys Leu Lys Glu Asn Tyr Ala
100 105 110Asp Cys Leu Leu Ala Tyr Ser Gly Leu Ile Gly Thr Val Met Thr Pro
115 120 125Asn Tyr Ile Asp Ser Ser Ser Leu Ser Val Ala Pro Trp Cys Asp Cys
130 135 140Ser Asn Ser Gly Asn Asp Leu Glu Glu Cys Leu Lys Phe Leu Asn Phe145 150 155 160Phe Lys Asp Asn Thr Cys Leu Lys Asn Ala Ile Gln Ala Phe Gly Asn
165 170 175Gly Ser Asp Val Thr Val Trp Gln Pro Ala Phe Pro Val Gln Thr Thr
180 185 190Thr Ala Ala Thr Thr Thr Ala Leu Arg Val Lys Asn Lys Pro Leu Gly
195 200 205Pro Ala Gly Ser Glu Asn Glu Ile Pro Thr His Val Leu Pro Pro Cys
210 215 220Ala Asn Leu Gln Ala Gln Lys Leu Lys Ser Asn Val Ser Gly Asn Thr225 230 235 240His Leu Cys Ile Ser Asn Gly Asn Tyr Glu Lys Glu Gly Leu Gly Ala
245 250 255Ser Ser His Ile Thr Thr Lys Ser Met Ala Ala Pro Pro Ser Cys Gly
260 265 270Leu Ser Pro Leu Leu Val Leu Val Val Thr Ala Leu Ser Thr Leu Leu
275 280 285Ser Leu Thr Glu Thr Ser *
290 295(2)SEQ ID NO:17的信息:
(ⅰ)顺序特征:
(A)长度:659个碱基对
(B)类型:核酸
(C)链型:单链
(D)拓扑学:线性
(ⅱ)分子类型:cDNA
(ⅸ)特征:
(A)名称/关键词:CDS
(B)位置:2…658
(ⅸ)特征:
(A)名称/关键词:misc_feature
(B)位置:1…659
(C)其它信息:/注释=“1-659为图5 Hsgr-21ar的
1033-1691”
(ⅹⅰ)顺序描述:SEQ ID NO:17:G AAT TTG CAG GAC TCC TGC AAG ACG AAT TAC ATC TGC AGA TCT CGC 46Asn Leu Gln Asp Ser Cys Lys Thr Asn Tyr Ile Cys Arg Ser Arg
1 5 10 15CTT GCG GAT TTT TTT ACC AAC TGC CAG CCA GAG TCA AGG TCT GTC AGC 94Leu Ala Asp Phe Phe Thr Asn Cys Gln Pro Glu Ser Arg Ser Val Ser
20 25 30AGC TGT CTA AAG GAA AAC TAC GCT GAC TGC CTC CTC GCC TAC TCG GGG 142Ser Cys Leu Lys Glu Asn Tyr Ala Asp Cys Leu Leu Ala Tyr Ser Gly
35 40 45CTT ATT GGC ACA GTC ATG ACC CCC AAC TAC ATA GAC TCC AGT AGC CTC 190Leu Ile Gly Thr Val Met Thr Pro Asn Tyr Ile Asp Ser Ser Ser Leu
50 55 60AGT GTG GCC CCA TGG TGT GAC TGC AGC AAC AGT GGG AAC GAC CTA GAA 238Ser Val Ala Pro Trp Cys Asp Cys Ser Asn Ser Gly Asn Asp Leu Glu
65 70 75GAG TGC TTG AAA TTT TTG AAT TTC TTC AAG GAC AAT ACA TGT CTT AAA 286Glu Cys Leu Lys Phe Leu Asn Phe Phe Lys Asp Asn Thr Cys Leu Lys80 85 90 95AAT GCA ATT CAA GCC TTT GGC AAT GGC TCC GAT GTG ACC GTG TGG CAG 334Asn Ala Ile Gln Ala Phe Gly Asn Gly Ser Asp Val Thr Val Trp Gln
100 105 110CCA GCC TTC CCA GTA CAG ACC ACC ACT GCC ACT ACC ACC ACT GCC CTC 382Pro Ala Phe Pro Val Gln Thr Thr Thr Ala Thr Thr Thr Thr Ala Leu
115 120 125CGG GTT AAG AAC AAG CCC CTG GGG CCA GCA GGG TCT GAG AAT GAA ATT 430Arg Val Lys Asn Lys Pro Leu Gly Pro Ala Gly Ser Glu Asn Glu Ile
130 135 140CCC ACT CAT GTT TTG CCA CCG TGT GCA AAT TTA CAG GCA CAG AAG CTG 478Pro Thr His Val Leu Pro Pro Cys Ala Asn Leu Gln Ala Gln Lys Leu
145 150 155AAA TCC AAT GTG TCG GGC AAT ACA CAC CTC TGT ATT TCC AAT GGT AAT 526Lys Ser Asn Val Ser Gly Asn Thr His Leu Cys Ile Ser Asn Gly Asn160 165 170 175TAT GAA AAA GAA GGT CTC GGT GCT TCC AGC CAC ATA ACC ACA AAA TCA 574Tyr Glu Lys Glu Gly Leu Gly Ala Ser Ser His Ile Thr Thr Lys Ser
180 185 190ATG GCT GCT CCT CCA AGC TGT GGT CTG AGC CCA CTG CTG GTC CTG GTG 622Met Ala Ala Pro Pro Ser Cys Gly Leu Ser Pro Leu Leu Val Leu Val
195 200 205GTA ACC GCT CTG TCC ACC CTA TTA TCT TTA ACA GAA A 659Val Thr Ala Leu Ser Thr Leu Leu Ser Leu Thr Glu
210 215(2)SEQ ID NO:18的信息:
(ⅰ)顺序特征:
(A)长度:219个氨基酸
(B)类型:氨基酸
(D)拓扑学:线性
(ⅱ)分子类型:蛋白质
(ⅹⅰ)顺序描述:SEQ ID NO:18:Asn Leu Gln Asp Ser Cys Lys Thr Asn Tyr Ile Cys Arg Ser Arg Leu
1 5 10 15Ala Asp Phe Phe Thr Asn Cys Gln Pro Glu Ser Arg Ser Val Ser Ser
20 25 30Cys Leu Lys Glu Asn Tyr Ala Asp Cys Leu Leu Ala Tyr Ser Gly Leu
35 40 45Ile Gly Thr Val Met Thr Pro Asn Tyr Ile Asp Ser Ser Ser Leu Ser
50 55 60Val Ala Pro Trp Cys Asp Cys Ser Asn Ser Gly Asn Asp Leu Glu Glu65 70 75 80Cys Leu Lys Phe Leu Asn Phe Phe Lys Asp Asn Thr Cys Leu Lys Asn
85 90 95Ala Ile Gln Ala Phe Gly Asn Gly Ser Asp Val Thr Val Trp Gln Pro
100 105 110Ala Phe Pro Val Gln Thr Thr Thr Ala Thr Thr Thr Thr Ala Leu Arg
115 120 125Val Lys Asn Lys Pro Leu Gly Pro Ala Gly Ser Glu Asn Glu Ile Pro
130 135 140Thr His Val Leu Pro Pro Cys Ala Asn Leu Gln Ala Gln Lys Leu Lys145 150 155 160Ser Asn Val Ser Gly Asn Thr His Leu Cys Ile Ser Asn Gly Asn Tyr
165 170 175Glu Lys Glu Gly Leu Gly Ala Ser Ser His Ile Thr Thr Lys Ser Met
180 185 190Ala Ala Pro Pro Ser Cys Gly Leu Ser Pro Leu Leu Val Leu Val Val
195 200 205Thr Ala Leu Ser Thr Leu Leu Ser Leu Thr Glu
210 215(2)SEQ ID NO:19的信息:
(ⅰ)顺序特征:
(A)长度:630个碱基对
(B)类型:核酸
(C)链型:单链
(D)拓扑学:线性
(ⅱ)分子类型:cDNA
(ⅸ)特征:
(A)名称/关键词:CDS
(B)位置:3…629
(ⅸ)特征:
(A)名称/关键词:misc_feature
(B)位置:1…630
(C)其它信息:/注释=“1-630为图5 Hsgr-21br的
1062-1691”
(ⅹⅰ)顺序描述:SEQ ID NO:19:AC ATC TGC AGA TCT CGC CTT GCG GAT TTT TTT ACC AAC TGC CAG CCA 47Ile Cys Arg Ser Arg Leu Ala Asp Phe Phe Thr Asn Cys Gln Pro
1 5 10 15GAG TCA AGG TCT GTC AGC AGC TGT CTA AAG GAA AAC TAC GCT GAC TGC 95Glu Ser Arg Ser Val Ser Ser Cys Leu Lys Glu Asn Tyr Ala Asp Cys
20 25 30CTC CTC GCC TAC TCG GGG CTT ATT GGC ACA GTC ATG ACC CCC AAC TAC 143Leu Leu Ala Tyr Ser Gly Leu Ile Gly Thr Val Met Thr Pro Asn Tyr
35 40 45ATA GAC TCC AGT AGC CTC AGT GTG GCC CCA TGG TGT GAC TGC AGC AAC 191Ile Asp Ser Ser Ser Leu Ser Val Ala Pro Trp Cys Asp Cys Ser Asn
50 55 60AGT GGG AAC GAC CTA GAA GAG TGC TTG AAA TTT TTG AAT TTC TTC AAG 239Ser Gly Asn Asp Leu Glu Glu Cys Leu Lys Phe Leu Asn Phe Phe Lys
65 70 75GAC AAT ACA TGT CTT AAA AAT GCA ATT CAA GCC TTT GGC AAT GGC TCC 287Asp Asn Thr Cys Leu Lys Asn Ala Ile Gln Ala Phe Gly Asn Gly Ser80 85 90 95GAT GTG ACC GTG TGG CAG CCA GCC TTC CCA GTA CAG ACC ACC ACT GCC 335Asp Val Thr Val Trp Gln Pro Ala Phe Pro Val Gln Thr Thr Thr Ala
100 105 110ACT ACC ACC ACT GCC CTC CGG GTT AAG AAC AAG CCC CTG GGG CCA GCA 383Thr Thr Thr Thr Ala Leu Arg Val Lys Asn Lys Pro Leu Gly Pro Ala
115 120 125GGG TCT GAG AAT GAA ATT CCC ACT CAT GTT TTG CCA CCG TGT GCA AAT 431Gly Ser Glu Asn Glu Ile Pro Thr His Val Leu Pro Pro Cys Ala Asn
130 135 140TTA CAG GCA CAG AAG CTG AAA TCC AAT GTG TCG GGC AAT ACA CAC CTC 479Leu Gln Ala Gln Lys Leu Lys Ser Asn Val Ser Gly Asn Thr His Leu
145 150 155TGT ATT TCC AAT GGT AAT TAT GAA AAA GAA GGT CTC GGT GCT TCC AGC 527Cys Ile Ser Asn Gly Asn Tyr Glu Lys Glu Gly Leu Gly Ala Ser Ser160 165 170 175CAC ATA ACC ACA AAA TCA ATG GCT GCT CCT CCA AGC TGT GGT CTG AGC 575His Ile Thr Thr Lys Ser Met Ala Ala Pro Pro Ser Cys Gly Leu Ser
180 185 190CCA CTG CTG GTC CTG GTG GTA ACC GCT CTG TCC ACC CTA TTA TCT TTA 623Pro Leu Leu Val Leu Val Val Thr Ala Leu Ser Thr Leu Leu Ser Leu
195 200 205ACA GAA A 630Thr Glu(2)SEQ ID NO:20的信息:
(ⅰ)顺序特征:
(A)长度:209个氨基酸
(B)类型:氨基酸
(D)拓扑学:线性
(ⅱ)分子类型:蛋白质
(ⅹⅰ)顺序描述:SEQ ID NO:20:Ile Cys Arg Ser Arg Leu Ala Asp Phe Phe Thr Asn Cys Gln Pro Glu1 5 10 15Ser Arg Ser Val Ser Ser Cys Leu Lys Glu Asn Tyr Ala Asp Cys Leu
20 25 30Leu Ala Tyr Ser Gly Leu Ile Gly Thr Val Met Thr Pro Asn Tyr Ile
35 40 45Asp Ser Ser Ser Leu Ser Val Ala Pro Trp Cys Asp Cys Ser Asn Ser
50 55 60Gly Asn Asp Leu Glu Glu Cys Leu Lys Phe Leu Asn Phe Phe Lys Asp65 70 75 80Asn Thr Cys Leu Lys Asn Ala Ile Gln Ala Phe Gly Asn Gly Ser Asp
85 90 95Val Thr Val Trp Gln Pro Ala Phe Pro Val Gln Thr Thr Thr Ala Thr
100 105 110Thr Thr Thr Ala Leu Arg Val Lys Asn Lys Pro Leu Gly Pro Ala Gly
115 120 125Ser Glu Asn Glu Ile Pro Thr His Val Leu Pro Pro Cys Ala Asn Leu
130 135 140Gln Ala Gln Lys Leu Lys Ser Asn Val Ser Gly Asn Thr His Leu Cys145 150 155 160Ile Ser Asn Gly Asn Tyr Glu Lys Glu Gly Leu Gly Ala Ser Ser His
165 170 175Ile Thr Thr Lys Ser Met Ala Ala Pro Pro Ser Cys Gly Leu Ser Pro
180 185 190Leu Leu Val Leu Val Val Thr Ala Leu Ser Thr Leu Leu Ser Leu Thr
195 200 205Glu(2)SEQ ID NO:21的信息:
(ⅰ)顺序特征:
(A)长度:1075个碱基对
(B)类型:核酸
(C)链型:单链
(D)拓扑学:线性
(ⅱ)分子类型:cDNA
(ⅸ)特征:
(A)名称/关键词:CDS
(B)位置:2…445
(ⅸ)特征:
(A)名称/关键词:misc_feature
(B)位置:1…1075
(C)其它信息:/注释=“1-1075为图5 Hsgr-2的1255-
2330”
(ⅹⅰ)顺序描述:SEQ ID NO:21:T GGG AAC GAC CTA GAA GAG TGC TTG AAA TTT TTG AAT TTC TTC AAG 46Gly Asn Asp Leu Glu Glu Cys Leu Lys Phe Leu Asn Phe Phe Lys1 5 10 15GAC AAT ACA TGT CTT AAA AAT GCA ATT CAA GCC TTT GGC AAT GGC TCC 94Asp Asn Thr Cys Leu Lys Asn Ala Ile Gln Ala Phe Gly Asn Gly Ser
20 25 30GAT GTG ACC GTG TGG CAG CCA GCC TTC CCA GTA CAG ACC ACC ACT GCC 142Asp Val Thr Val Trp Gln Pro Ala Phe Pro Val Gln Thr Thr Thr Ala
35 40 45ACT ACC ACC ACT GCC CTC CGG GTT AAG AAC AAG CCC CTG GGG CCA GCA 190Thr Thr Thr Thr Ala Leu Arg Val Lys Asn Lys Pro Leu Gly Pro Ala
50 55 60GGG TCT GAG AAT GAA ATT CCC ACT CAT GTT TTG CCA CCG TGT GCA AAT 238Gly Ser Glu Asn Glu Ile Pro Thr His Val Leu Pro Pro Cys Ala Asn
65 70 75TTA CAG GCA CAG AAG CTG AAA TCC AAT GTG TCG GGC AAT ACA CAC CTC 286Leu Gln Ala Gln Lys Leu Lys Ser Asn Val Ser Gly Asn Thr His Leu80 85 90 95TGT ATT TCC AAT GGT AAT TAT GAA AAA GAA GGT CTC GGT GCT TCC AGC 334Cys Ile Ser Asn Gly Asn Tyr Glu Lys Glu Gly Leu Gly Ala Ser Ser
100 105 110CAC ATA ACC ACA AAA TCA ATG GCT GCT CCT CCA AGC TGT GGT CTG AGC 382His Ile Thr Thr Lys Ser Met Ala Ala Pro Pro Ser Cys Gly Leu Ser
115 120 125CCA CTG CTG GTC CTG GTG GTA ACC GCT CTG TCC ACC CTA TTA TCT TTA 430Pro Leu Leu Val Leu Val Val Thr Ala Leu Ser Thr Leu Leu Ser Leu
130 135 140ACA GAA ACA TCA TAG CTGCATTAAA AAAATACAAT ATGGACATGT AAAAAGACAA 485Thr Glu Thr Ser *
145AAACCAAGTT ATCTGTTTCC TGTTCTCTTG TATAGCTGAA ATTCCAGTTT AGGAGCTCAG 545TTGAGAAACA GTTCCATTCA ACTGGAACAT TTTTTTTTTT CCTTTTAAGA AAGCTTCTTG 605TGATCCTTCG GGGCTTCTGT GAAAAACCTG ATGCAGTGCT CCATCCAAAC TCAGAAGGCT 665TTGGGATATG CTGTATTTTA AAGGGACAGT TTGTAACTTG GGCTGTAAAG CAAACTGGGG 725CTGTGTTTTC GATGATGATG ATCATCATGA TCATGATNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 785NNNNNNNNNN NNNNNNGATT TTAACAGTTT TACTTCTGGC CTTTCCTAGC TAGAGAAGGA 845GTTAATATTT CTAAGGTAAC TCCCATATCT CCTTTAATGA CATTGATTTC TAATGATATA 905AATTTCAGCC TACATTGATG CCAAGCTTTT TTGCCACAAA GAAGATTCTT ACCAAGAGTG 965GGCTTTGTGG AAACAGCTGG TACTGATGTT CACCTTTATA TATGTACTAG CATTTTCCAC 1025GCTGATGTTT ATGTACTGTA AACAGTTCTG CACTCTTGTA CAAAAGAAAA 1075(2)SEQ ID NO:22的信息:
(ⅰ)顺序特征:
(A)长度:148个氨基酸
(B)类型:氨基酸
(D)拓扑学:线性
(ⅱ)分子类型:蛋白质
(ⅹⅰ)顺序描述:SEQ ID NO:22:Gly Asn Asp Leu Glu Glu Cys Leu Lys Phe Leu Asn Phe Phe Lys Asp1 5 10 15Asn Thr Cys Leu Lys Asn Ala Ile Gln Ala Phe Gly Asn Gly Ser Asp
20 25 30Val Thr Val Trp Gln Pro Ala Phe Pro Val Gln Thr Thr Thr Ala Thr
35 40 45Thr Thr Thr Ala Leu Arg Val Lys Asn Lys Pro Leu Gly Pro Ala Gly
50 55 60Ser Glu Asn Glu Ile Pro Thr His Val Leu Pro Pro Cys Ala Asn Leu65 70 75 80Gln Ala Gln Lys Leu Lys Ser Asn Val Ser Gly Asn Thr His Leu Cys
85 90 95Ile Ser Asn Gly Asn Tyr Glu Lys Glu Gly Leu Gly Ala Ser Ser His
100 105 110Ile Thr Thr Lys Ser Met Ala Ala Pro Pro Ser Cys Gly Leu Ser Pro
115 120 125Leu Leu Val Leu Val Val Thr Ala Leu Ser Thr Leu Leu Ser Leu Thr
130 135 140Glu Thr Ser *145(2)SEQ ID NO:23的信息:
(ⅰ)顺序特征:
(A)长度:1059个碱基对
(B)类型:核酸
(C)链型:单链
(D)拓扑学:线性
(ⅱ)分子类型:cDNA
(ⅸ)特征:
(A)名称/关键词:CDS
(B)位置:3…428
(ⅰⅹ)特征:0
(A)名称/关键词:misc_feature
(B)位置:1…1059
(C)其它信息:/注释=“1-1059为图5 Hsgr-9的1059-
1272”
(ⅹⅰ)顺序描述:SEQ ID NO:23:AG TGC TTG AAA TTT TTG AAT TTC TTC AAG GAC AAT ACA TGT CTT AAA 47Cys Leu Lys Phe Leu Asn Phe Phe Lys Asp Asn Thr Cys Leu Lys
1 5 10 15AAT GCA ATT CAA GCC TTT GGC AAT GGC TCC GAT GTG ACC GTG TGG CAG 95Asn Ala Ile Gln Ala Phe Gly Asn Gly Ser Asp Val Thr Val Trp Gln
20 25 30CCA GCC TTC CCA GTA CAG ACC ACC ACT GCC ACT ACC ACC ACT GCC CTC 143Pro Ala Phe Pro Val Gln Thr Thr Thr Ala Thr Thr Thr Thr Ala Leu
35 40 45CGG GTT AAG AAC AAG CCC CTG GGG CCA GCA GGG TCT GAG AAT GAA ATT 191Arg Val Lys Asn Lys Pro Leu Gly Pro Ala Gly Ser Glu Asn Glu Ile
50 55 60CCC ACT CAT GTT TTG CCA CCG TGT GCA AAT TTA CAG GCA CAG AAG CTG 239Pro Thr His Val Leu Pro Pro Cys Ala Asn Leu Gln Ala Gln Lys Leu
65 70 75AAA TCC AAT GTG TCG GGC AAT ACA CAC CTC TGT ATT TCC AAT GGT AAT 287Lys Ser Asn Val Ser Gly Asn Thr His Leu Cys Ile Ser Asn Gly Asn80 85 90 95TAT GAA AAA GAA GGT CTC GGT GCT TCC AGC CAC ATA ACC ACA AAA TCA 335Tyr Glu Lys Glu Gly Leu Gly Ala Ser Ser His Ile Thr Thr Lys Ser
100 105 110ATG GCT GCT CCT CCA AGC TGT GGT CTG AGC CCA CTG CTG GTC CTG GTG 383Met Ala Ala Pro Pro Ser Cys Gly Leu Ser Pro Leu Leu Val Leu Val
115 120 125GTA ACC GCT CTG TCC ACC CTA TTA TCT TTA ACA GAA ACA TCA TAG 428Val Thr Ala Leu Ser Thr Leu Leu Ser Leu Thr Glu Thr Ser *
130 135 140CTGCATTAAA AAAATACAAT ATGGACATGT AAAAAGACAA AAACCAAGTT ATCTGTTTCC 488TGTTCTCTTG TATAGCTGAA ATTCCAGTTT AGGAGCTCAG TTGAGAAACA GTTCCATTCA 548ACTGGAACAT TTTTTTTTTT TCCTTTTAAG AAAGCTTCTT GTGATCCTTT GGGGCTTCTG 608TGAAAAACCT GATGCAGTGC TCCATCCAAA CTCAGAAGGC TTTGGGATAT GCTGTATTTT 668AAAGGGACAG TTTGTAACTT GGGCTGTAAA GCAAACTGGG GCTGTGTTTT CGATGATGAT 728GATGATCATG ATGATGATCA TCATGATCAT GATGATGATC ATCATGATCA TGATGATGAT 788TTTAACAGTT TTACTTCTGG CCTTTCCTAG CTAGAGAAGG AGTTAATATT TCTAAGGTAA 848CTCCCATATC TCCTTTAATG ACATTGATTT CTAATGATAT AAATTTCAGC CTACATTGAT 908GCCAAGCTTT TTTGCCACAA AGAAGATTCT TACCAAGAGT GGGCTTTGTG GAAACAGCTG 968GTACTGATGT TCACCTTTAT ATATGTACTA GCATTTTCCA CGCTGATGTT TATGTACTGT 1028AAACAGTTCT GCACTCTTGT ACAAAAGAAA A 1059(2)SEQ ID NO:24的信息:
(ⅰ)顺序特征:
(A)长度:142个氨基酸
(B)类型:氨基酸
(D)拓扑学:线性
(ⅱ)分子类型:蛋白质
(ⅹⅰ)顺序描述:SEQ ID NO:24:Cys Leu Lys Phe Leu Asn Phe Phe Lys Asp Asn Thr Cys Leu Lys Asn1 5 10 15Ala Ile Gln Ala Phe Gly Asn Gly Ser Asp Val Thr Val Trp Gln Pro
20 25 30Ala Phe Pro Val Gln Thr Thr Thr Ala Thr Thr Thr Thr Ala Leu Arg
35 40 45Val Lys Asn Lys Pro Leu Gly Pro Ala Gly Ser Glu Asn Glu Ile Pro
50 55 60Thr His Val Leu Pro Pro Cys Ala Asn Leu Gln Ala Gln Lys Leu Lys65 70 75 80Ser Asn Val Ser Gly Asn Thr His Leu Cys Ile Ser Asn Gly Asn Tyr
85 90 95Glu Lys Glu Gly Leu Gly Ala Ser Ser His Ile Thr Thr Lys Ser Met
100 105 110Ala Ala Pro Pro Ser Cys Gly Leu Ser Pro Leu Leu Val Leu Val Val
115 120 125Thr Ala Leu Ser Thr Leu Leu Ser Leu Thr Glu Thr Ser*
130 135 140(2)SEQ ID NO:25的信息:
(ⅰ)顺序特征:
(A)长度:10个氨基酸
(B)类型:氨基酸
(C)链型:单链
(D)拓扑学:线性
(ⅱ)分子类型:肽
(ⅹⅰ)顺序描述:SEQ ID NO:25:
Gln Ser Cys Ser Thr Lys Tyr Arg Thr Leu
1 5 10(2)SEQ ID NO:26的信息:
(ⅰ)顺序特征:
(A)长度:10个氨基酸
(B)类型:氨基酸
(C)链型:单链
(D)拓扑学:线性
(ⅱ)分子类型:肽
(ⅹⅰ)顺序描述:SEQ ID NO:26:
Cys Lys Arg Gly Met Lys Lys Glu Lys Asn
1 5 10(2)SEQ ID NO:27的信息:
(ⅰ)顺序特征:
(A)长度:10个氨基酸
(B)类型:氨基酸
(C)链型:单链
(D)拓扑学:线性
(ⅱ)分子类型:肽
(ⅹⅰ)顺序描述:SEQ ID NO:27:
Leu Leu Glu Asp Ser Pro Tyr Glu Pro Val
1 5 10(2)SEQ ID NO:28的信息:
(ⅰ)顺序特征:
(A)长度:10个氨基酸
(B)类型:氨基酸
(C)链型:单链
(D)拓扑学:线性
(ⅱ)分子类型:肽
(ⅹⅰ)顺序描述:SEQ ID NO:28:
Cys Ser Tyr Glu Glu Arg Glu Arg Pro Asn
1 5 10(2)SEQ ID NO:29的信息:
(ⅰ)顺序特征:
(A)长度:14个氨基酸
(B)类型:氨基酸
(C)链型:单链
(D)拓扑学:线性
(ⅱ)分子类型:肽
(ⅹⅰ)顺序描述:SEQ ID NO:29:Pro Ala Pro Pro Val Gln Thr Thr Thr Ala Thr Thr Thr Thr1 5 10(2)SEQ ID NO:30的信息:
(ⅰ)顺序特征:
(A)长度:21个碱基对
(B)类型:核酸
(C)链型:单链
(D)拓扑学:线性
(ⅱ)分子类型:cDNA
(ⅹⅰ)顺序描述:SEQ ID NO:30:CTGTTTGAAT TTGCAGGACT C 2(2)SEQ ID NO:31的信息:
(ⅰ)顺序特征:
(A)长度:36个碱基对
(B)类型:核酸
(C)链型:单链
(D)拓扑学:线性
(ⅱ)分子类型:cDNA
(ⅹⅰ)顺序描述:SEQ ID NO:31:CTCCTCTCTA AGCTTCTAAC CACAGCTTGG AGGAGC 36(2)SEQ ID NO:32的信息:
(ⅰ)顺序特征:
(A)长度:37个碱基对
(B)类型:核酸
(C)链型:单链
(D)拓扑学:线性
(ⅱ)分子类型:cDNA
(ⅹⅰ)顺序描述:SEQ ID NO:32:CTCCTCTCTA AGCTTCTATG GGCTCAGACC ACAGCTT 37(2)SEQ ID NO:33的信息:
(ⅰ)顺序特征:
(A)长度:60个碱基对
(B)类型:核酸
(C)链型:单链
(D)拓扑学:线性
(ⅱ)分子类型:cDNA
(ⅹⅰ)顺序描述:SEQ ID NO:33:CTCCTCTCTA AGCTTCTACT TGTCATCGTC GTCCTTGTAG TCACCACAGC TTGGAGGAGC 60(2)SEQ ID NO:34的信息:
(ⅰ)顺序特征:
(A)长度:60个碱基对
(B)类型:核酸
(C)链型:单链
(D)拓扑学:线性
(ⅱ)分子类型:cDNA
(ⅹⅰ)顺序描述:SEQ ID NO:34:CTCCTCTCTA AGCTTCTACT TGTCATCGTC GTCCTTGTAG TCTGGCTCAG ACCACAGCTT 60
Claims (50)
1.分离和纯化的蛋白,它包含如图2或4(SEQ ID NO:2或4)描述的氨基酸序列及其类似物,其中该蛋白能够与神经胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)复合并由此介导细胞对GDNF的应答。
2.权利要求1的蛋白,它包含描述于图2(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列。
3.权利要求1的蛋白,它包含描述于图4(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列。
4.权利要求1的蛋白,它包含描述于图2(SEQ ID NO:2)的Ser18至Pro446的氨基酸序列。
5.权利要求1的蛋白,它包含描述于图2(SEQ ID NO:2)的Asp25至Leu447的氨基酸序列。
6.权利要求1的蛋白,它包含描述于图2(SEQ ID NO:2)的Cys29至Cys442的氨基酸序列。
7.权利要求1的蛋白,它包含描述于图4(SEQ ID NO:4)的Ala19至Val450的氨基酸序列。
8.权利要求1的蛋白,它包含描述于图4(SEQ ID NO:4)的Cys29至Cys443的氨基酸序列。
9.糖基化的权利要求1的蛋白。
10.非糖基化的权利要求1的蛋白。
11.权利要求1-10的蛋白,它通过重组技术或化学合成产生。
12.包含权利要求1-10中任一项的蛋白与药学上可接受载体联合的药用组合物。
13.分离的核酸序列,它编码包含权利要求1-8中任一项的氨基酸序列的神经营养因子受体。
14.分离的核酸序列,它编码包含如图2或4(SEQ ID NO:2或4)描述的氨基酸序列的神经营养因子受体蛋白及其类似物,其中该蛋白能够与神经胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)复合,并由此介导细胞对GDNF的应答。
15.权利要求14的核酸序列,它编码包含如图2(SEQ ID NO:2)描述的氨基酸序列的神经营养因子受体蛋白。
16.权利要求14的核酸序列,它编码包含如图4(SEQ ID NO:4)描述的氨基酸序列的神经营养因子受体蛋白。
17.包含以下的分离核酸序列:
(a)陈述于图1(SEQ ID NO:1)包含编码Met1至Ser465的核苷酸或陈述于图3(SEQ ID NO:3)包含编码Met1至Ser468的核苷酸的序列,其中所述序列编码能与神经胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)复合并因此介导细胞对GDNF应答的神经营养因子受体蛋白(GDNFR);
(b)核酸序列,它(1)与(a)的互补序列杂交和(2)编码具有GDNFR活性的氨基酸序列;和
(c)核酸序列,它如果不是因为遗传密码的简并性将会与(a)的互补序列杂交和(2)编码具有GDNFR活性的氨基酸序列。
18.包含按照权利要求14-17的任何一项的核酸序列的载体,该核酸序列可操作地连接至一个或多个能够实现所述核酸序列扩增或表达的操作元件。
19.包含编码包含图2或4(SEQ ID NO:2或4)中描述的氨基酸序列的神经营养因子受体蛋白的核酸序列的载体,该核酸序列可操作地连接至一个或多个能够实现所述核酸序列扩增或表达的操作元件。
20.用权利要求18的载体转化或转染的宿主细胞。
21.用权利要求19的载体转化或转染的宿主细胞。
22.权利要求20的宿主细胞,选自哺乳动物细胞和细菌细胞。
23.权利要求22的宿主细胞,它是COS-7细胞或大肠杆菌。
24.权利要求20的宿主细胞,其中所述细胞适于人类植入,而且其中所述细胞表达和分泌所述神经营养因子受体。
25.权利要求21的宿主细胞,其中所述细胞适于人类植入并且其中所述细胞表达和分泌所述神经营养因子受体。
26.权利要求20的宿主细胞,其中所述细胞在活体外转化或转染。
27.权利要求20的宿主细胞,其中所述细胞封闭于适于人类植入的半透膜中。
28.包含如下步骤的神经营养因子受体蛋白的生产方法:
(a)在适于由所述宿主细胞表达所述神经营养因子受体蛋白的条件下培养宿主细胞,该宿主细胞含有编码包含描述于图2或4(SEQ IDNO:2或4)的氨基酸序列的神经营养因子受体蛋白及其类似物的核酸序列,其中该蛋白能够与神经胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)复合并因此介导细胞对GDNF的应答;和
(b)可选地,分离由所述宿主细胞表达的神经营养因子受体蛋白。
29.权利要求28的方法,其中所述核酸序列编码包含描述于图2(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列的神经营养因子受体蛋白。
30.权利要求28的方法,其中所述核酸序列编码包含描述于图4(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列的神经营养因子受体蛋白。
31.包含以下步骤的神经营养因子受体蛋白的生产方法:
(a)培养用按照权利要求17的核酸序列转化或转染的宿主细胞,其培养条件适于由所述宿主细胞表达所述神经营养因子受体蛋白;和
(b)可选地,分离由所述宿主细胞表达的所述神经营养因子受体蛋白。
32.权利要求28或31的方法,另外包含重折叠的该分离的神经营养因子受体。
33.权利要求28或31的方法,其中所述宿主细胞是原核细胞。
34.权利要求28或31的方法,其中所述宿主细胞是真核细胞。
35.按照权利要求28-31的任一项的方法制备的基本纯化的神经营养因子受体蛋白。
36.权利要求1的神经营养因子受体蛋白用于制造药用组合物的用途。
37.通过给与权利要求1的神经营养因子受体蛋白治疗功能不正常的多巴胺能神经细胞的方法。
38.通过给与权利要求1的神经营养因子受体蛋白治疗帕金森病的方法。
39.通过给与权利要求1的神经营养因子受体蛋白治疗早老性痴呆的方法。
40.通过给与权利要求1的神经营养蛋白治疗肌萎缩性侧索硬化的方法。
41.与包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的氨基酸序列的神经营养因子受体蛋白结合的抗体。
42.权利要求41的抗体,其中所述抗体是单克隆抗体。
43.权利要求41的抗体,其中所述抗体是多克隆抗体。
44.通过用包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的氨基酸序列的神经营养因子受体蛋白免疫动物产生的抗体。
45.杂交瘤,它产生与包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的氨基酸序列的神经营养因子受体蛋白结合得单克隆抗体。
46.治疗神经损害的装置,它包含:
(a)适于植入的半透膜;和
(b)包囊于所述膜中的细胞,其中所述细胞分泌按照权利要求1的神经营养因子受体蛋白;所述膜可透过该神经营养因子受体蛋白、并不可透过对所述细胞有害的材料。
47.权利要求46的装置,其中所述细胞是分泌所述神经营养因子受体蛋白的天然发生的细胞。
48.权利要求46的装置,其中所述细胞已通过核酸修饰以分泌所述神经营养因子受体蛋白,该核酸序列包含:
(a)陈述于图1(SEQ ID NO:1)包含编码Met1至Ser465的核苷酸或陈述于图3(SEQ ID NO:3)包含编码Met1至Ser468的核苷酸的序列,该序列编码能与神经胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)复合并介导细胞对GDNF应答的神经营养因子受体蛋白(GDNFR);
(b)核酸序列,它(1)与(a)的互补序列杂交和(2)编码具有GDNFR活性的氨基酸序列;和
(c)核酸序列,它如果不是因为遗传密码的简并性将会与(a)的互补序列杂交和(2)编码具有GDNFR活性的氨基酸序列。
49.检测装置,用于分析测试样品中神经胶质细胞系源性神经营养因子的存在,包含:含有或由GDNFR蛋白包被的固相,其中所述GDNFR蛋白与该测试样品种的GDNF反应,并产生可检测的表明GDNF存在的反应产物。
50.分析测试样品中神经胶质细胞系源性神经营养因子的方法,包括:将该样品与包含GDNFR蛋白的检测试剂接触,其中所述GDNFR蛋白与该测试样品中的GDNF反应,并产生可检测的表明GDNF存在的反应产物。
Applications Claiming Priority (6)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US1590796P | 1996-04-22 | 1996-04-22 | |
US60/015,907 | 1996-04-22 | ||
US1722196P | 1996-05-09 | 1996-05-09 | |
US60/017,221 | 1996-05-09 | ||
US08/837,199 US6455277B1 (en) | 1996-04-22 | 1997-04-14 | Polynucleotides encoding human glial cell line-derived neurotrophic factor receptor polypeptides |
US08/837,199 | 1997-04-14 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN1219967A true CN1219967A (zh) | 1999-06-16 |
Family
ID=27360445
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN97194013A Pending CN1219967A (zh) | 1996-04-22 | 1997-04-15 | 神经胶质细胞系源性的神经营养因子受体 |
Country Status (19)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US6455277B1 (zh) |
EP (1) | EP0909316B1 (zh) |
JP (1) | JP2000509271A (zh) |
KR (1) | KR20000010571A (zh) |
CN (1) | CN1219967A (zh) |
AT (1) | ATE338115T1 (zh) |
AU (1) | AU720092B2 (zh) |
BR (1) | BR9708959A (zh) |
CA (1) | CA2250704C (zh) |
CZ (1) | CZ324598A3 (zh) |
DE (1) | DE69736597T2 (zh) |
EA (1) | EA002924B1 (zh) |
ES (1) | ES2271968T3 (zh) |
HU (1) | HUP9902640A3 (zh) |
IL (1) | IL126553A0 (zh) |
NO (1) | NO984757L (zh) |
NZ (1) | NZ332256A (zh) |
SK (1) | SK140398A3 (zh) |
WO (1) | WO1997040152A1 (zh) |
Families Citing this family (21)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6696259B1 (en) * | 1995-11-13 | 2004-02-24 | Licentia Ltd. | Assays using glial cell line-derived neurotrophic factor receptors |
CN1163509C (zh) * | 1996-05-08 | 2004-08-25 | 拜奥根有限公司 | 刺激神经和肾生长的RET配体(RetL) |
US6677135B1 (en) * | 1996-05-08 | 2004-01-13 | Biogen, Inc. | Ret ligand (RetL) for stimulating neutral and renal growth |
US20020068361A1 (en) * | 1997-04-08 | 2002-06-06 | Douglas Clary | Methods of evaluating specific cellular functions of receptor protein tyrosine kinases in a ligand independent manner |
JP2002505576A (ja) * | 1997-05-30 | 2002-02-19 | アムジエン・インコーポレーテツド | 神経栄養因子レセプター |
US20010003580A1 (en) | 1998-01-14 | 2001-06-14 | Poh K. Hui | Preparation of a lipid blend and a phospholipid suspension containing the lipid blend |
DE19816186A1 (de) * | 1998-04-14 | 1999-10-21 | Univ Muenchen L Maximilians | GDNF-kodierende DNA, Teile davon und GDNF-Varianten |
FI20000394A0 (fi) * | 2000-02-21 | 2000-02-21 | Airaksinen Matti | GFRa4:n sukuisia tai siitä johdettuja aineita sekä niiden käyttö |
PL1606409T3 (pl) | 2003-03-19 | 2011-02-28 | Biogen Ma Inc | Białko wiążące receptor Nogo |
CN1897977A (zh) * | 2003-10-20 | 2007-01-17 | Ns基因公司 | 帕金森氏病的体内基因治疗 |
JP4960865B2 (ja) | 2004-06-24 | 2012-06-27 | バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド | 脱髄に関連する状態の処置 |
EP1807506B1 (en) * | 2004-10-08 | 2013-04-17 | Georgia Tech Research Corporation | Microencapsulation of cells in hydrogels using electrostatic potentials |
SI1904104T1 (sl) | 2005-07-08 | 2013-12-31 | Biogen Idec Ma Inc. | Protitelesa SP35 in njihova uporaba |
JP2009517340A (ja) * | 2005-11-04 | 2009-04-30 | バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド | ドーパミン作動性ニューロンの神経突起成長および生存を促進するための方法 |
CA2729961C (en) | 2008-07-09 | 2018-05-01 | Biogen Idec Ma Inc. | Li113, li62 variant co2, anti-lingo antibodies |
MX2014013950A (es) | 2012-05-14 | 2015-02-17 | Biogen Idec Inc | Antagonistas de proteina que interactua con el receptor nogo 2 que contiene repeticion rica en leucina y dominio de inmunoglobulina (lingo-2) para el tratamiento de afecciones que involucran neuronas motoras. |
CA2973266A1 (en) | 2015-01-08 | 2016-07-14 | Biogen Ma Inc. | Lingo-1 antagonists and uses for treatment of demyelinating disorders |
EP3538560A4 (en) | 2016-11-10 | 2020-06-17 | Keros Therapeutics, Inc. | GDNF FUSION POLYPEPTIDES AND METHODS OF USE |
RU2690498C1 (ru) * | 2018-05-17 | 2019-06-04 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Медико-генетический научный центр" | Способ получения ноотропной композиции на основе полипептидных комплексов, выделенных из нейронов и глиальных клеток, полученных методом направленной дифференцировки индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека |
RU2752906C2 (ru) * | 2019-12-26 | 2021-08-11 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Медико-генетический научный центр имени академика Н.П. Бочкова" | Ноотропная композиция на основе полипептидных комплексов, выделенных из нейрональных прогениторных клеток в условиях теплового шока, и способ ее получения |
RU2732600C1 (ru) * | 2019-12-26 | 2020-09-21 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Медико-генетический научный центр имени академика Н.П. Бочкова" | Ноотропная композиция на основе полипептидных комплексов, выделенных из нейрональных прогениторных клеток в условиях гипоксии, и способ ее получения |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4518584A (en) | 1983-04-15 | 1985-05-21 | Cetus Corporation | Human recombinant interleukin-2 muteins |
US4892538A (en) | 1987-11-17 | 1990-01-09 | Brown University Research Foundation | In vivo delivery of neurotransmitters by implanted, encapsulated cells |
US5106627A (en) | 1987-11-17 | 1992-04-21 | Brown University Research Foundation | Neurological therapy devices |
US5011472A (en) | 1988-09-06 | 1991-04-30 | Brown University Research Foundation | Implantable delivery system for biological factors |
ATE135370T1 (de) | 1988-12-22 | 1996-03-15 | Kirin Amgen Inc | Chemisch modifizierte granulocytenkolonie erregender faktor |
AU648505B2 (en) | 1989-05-19 | 1994-04-28 | Amgen, Inc. | Metalloproteinase inhibitor |
GEP20002243B (en) | 1991-09-20 | 2000-09-25 | Amgen Inc | Glial Derived Neurotrophic Factor |
US5658785A (en) | 1994-06-06 | 1997-08-19 | Children's Hospital, Inc. | Adeno-associated virus materials and methods |
-
1997
- 1997-04-14 US US08/837,199 patent/US6455277B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-04-15 SK SK1403-98A patent/SK140398A3/sk unknown
- 1997-04-15 EA EA199800933A patent/EA002924B1/ru not_active IP Right Cessation
- 1997-04-15 CN CN97194013A patent/CN1219967A/zh active Pending
- 1997-04-15 BR BR9708959A patent/BR9708959A/pt not_active Application Discontinuation
- 1997-04-15 JP JP9538155A patent/JP2000509271A/ja not_active Ceased
- 1997-04-15 ES ES97921203T patent/ES2271968T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-04-15 AT AT97921203T patent/ATE338115T1/de not_active IP Right Cessation
- 1997-04-15 DE DE69736597T patent/DE69736597T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-04-15 NZ NZ332256A patent/NZ332256A/xx unknown
- 1997-04-15 WO PCT/US1997/006281 patent/WO1997040152A1/en active IP Right Grant
- 1997-04-15 CZ CZ983245A patent/CZ324598A3/cs unknown
- 1997-04-15 HU HU9902640A patent/HUP9902640A3/hu unknown
- 1997-04-15 IL IL12655397A patent/IL126553A0/xx unknown
- 1997-04-15 AU AU27309/97A patent/AU720092B2/en not_active Ceased
- 1997-04-15 EP EP97921203A patent/EP0909316B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-04-15 KR KR1019980708430A patent/KR20000010571A/ko active IP Right Grant
- 1997-04-15 CA CA002250704A patent/CA2250704C/en not_active Expired - Fee Related
-
1998
- 1998-10-12 NO NO984757A patent/NO984757L/no not_active Application Discontinuation
-
2002
- 2002-05-24 US US10/155,693 patent/US20030175876A1/en not_active Abandoned
-
2006
- 2006-01-12 US US11/332,638 patent/US20060166325A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP0909316A1 (en) | 1999-04-21 |
AU720092B2 (en) | 2000-05-25 |
NO984757L (no) | 1998-12-21 |
IL126553A0 (en) | 1999-08-17 |
US6455277B1 (en) | 2002-09-24 |
ES2271968T3 (es) | 2007-04-16 |
HUP9902640A2 (hu) | 1999-11-29 |
DE69736597T2 (de) | 2006-12-21 |
US20060166325A1 (en) | 2006-07-27 |
EA199800933A1 (ru) | 1999-04-29 |
WO1997040152A1 (en) | 1997-10-30 |
CA2250704C (en) | 2005-04-12 |
ATE338115T1 (de) | 2006-09-15 |
EP0909316B1 (en) | 2006-08-30 |
DE69736597D1 (de) | 2006-10-12 |
BR9708959A (pt) | 1999-08-03 |
HUP9902640A3 (en) | 2001-11-28 |
US20030175876A1 (en) | 2003-09-18 |
NZ332256A (en) | 2000-03-27 |
CZ324598A3 (cs) | 1999-01-13 |
SK140398A3 (en) | 1999-04-13 |
JP2000509271A (ja) | 2000-07-25 |
CA2250704A1 (en) | 1997-10-30 |
NO984757D0 (no) | 1998-10-12 |
AU2730997A (en) | 1997-11-12 |
EA002924B1 (ru) | 2002-10-31 |
KR20000010571A (ko) | 2000-02-15 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN1219967A (zh) | 神经胶质细胞系源性的神经营养因子受体 | |
CN1283659C (zh) | 截短的神经胶质细胞系来源的神经营养因子 | |
US8344110B2 (en) | Antibodies to thymic stromal lymphopoietin (TSLP) receptor molecules and uses thereof | |
US20070010662A1 (en) | VGF fusion polypeptides | |
CN1268744C (zh) | 新的神经营养因子 | |
CN1182452A (zh) | 促骨生长素 | |
CN1214050A (zh) | 人肿瘤坏死因子δ和ε | |
CN1272884A (zh) | 脂肪细胞特异性蛋白质同系物 | |
CN1378595A (zh) | 作为zalpha受体之配体的人细胞因子及其用途 | |
JP2003527858A (ja) | 線維芽細胞増殖因子レセプター様分子およびその使用 | |
CN1201003C (zh) | 脂肪细胞特异性蛋白质同系物 | |
CN1133049A (zh) | 黑素瘤抑制蛋白质 | |
JP2008167750A (ja) | B7関連タンパク質−2分子およびその使用 | |
EP1196442B1 (en) | Vgf polypeptides and methods of treating vgf-related disorders | |
WO2002000723A2 (en) | Thymic stromal lymphopoietin receptor molecules and uses thereof | |
CN1195853C (zh) | 神经营养因子nnt-1 | |
AU779614B2 (en) | VGF selective binding agents and methods of treating VGF-related disorders | |
CN1433431A (zh) | 白介素-1受体拮抗剂样分子及其应用 | |
CN101035803A (zh) | Nogo-a多肽片段、变异nogo受体-1多肽、及其应用 | |
TW509696B (en) | Glial cell line-derived neurotrophic factor receptor | |
WO2003033652A2 (en) | TUMOR ENDOTHELIAL MARKER 5α MOLECULES AND USES THEREOF | |
CN1311818A (zh) | 神经营养因子 | |
KR100399377B1 (ko) | Gdnf 단백질의 분석방법 및 검정 기구 | |
MXPA02005659A (es) | Moleculas similares a cordina y usos de las mismas. | |
CN1270633A (zh) | 人氯离子通道zsig44 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |