CN1270633A - 人氯离子通道zsig44 - Google Patents

Abstract

本发明涉及离子通道家族的新成员zsig44的多核苷酸和多肽分子。多肽和编码它们的多核苷酸可用于诊断与染色体10有关的遗传疾病。本发明也包括抗zsig44多肽的抗体。

Description

人氯离子通道ZSIG44

发明背景

氯离子是介导氯离子和其它阴离子跨脂双分子层被动运输的膜蛋白。它们存在于质膜和各种细胞器中，经常与主动阴离子转运系统有关。综述见Pusch，M.，Jentsch，T.J.，生物学综述74：813-827，1994和Jentsch，T.J.，Gunther，W.，生物分析19：117-126，1997。

几种类型的氯离子通道已得到分离并受到不同调节。配体控制的氯离子通道通过外来配体的结合活化，例如在神经元和骨骼肌中的g-氨基丁酸(GABA)和氨基乙酸活化的通道。3’，5’-环腺苷单磷酸(cAMP)依赖型氯离子通道因为cAMP增加而活化，例如囊性纤维化跨膜转运调节蛋白(CTFR)氯离子通道。这种活化相信是由依赖于cAMP的蛋白激酶A(PKA)的磷酸化作用介导。其它氯离子通道包括通过细胞内钙增加活化的氯离子通道和可以通过酪氨酸磷酸化调节的数量依赖型氯离子通道。

在适当表达系统(例如非洲爪蟾卵母细胞)中表现增加的电压依赖型氯离子转运的质膜氯离子通道分为不同基因家族。电压控制的氯离子通道CLC家族直接作用为氯离子通道；其成员在结构上是相似的大蛋白，含有几个证明功能明显不同的跨膜结构域。其它离子通道如K⁺通道具有相似结构(Hille，B.，可兴奋膜的离子通道，Sinauer Assoc.，Sunderland，MA，1992)。

已发现氯离子通道蛋白的另一家族增加电压依赖型氯离子转运，但不直接作用为氯离子通道；这些蛋白可能作用为离子通道调节剂。这些蛋白结构上与CLC家族不同并且是只具有单一跨膜结构域的小蛋白。此蛋白家族包括大鼠和人phospholemman(PLM)和MAT-8氯离子通道(Chem，L.K.，Genomics，41：435-443，1997；Morrison，B.W.等，生物化学杂志，270：2176-2182，1995)。其它与此家族相关的蛋白是K离子(K⁺)通道蛋白IsK(minK)和大鼠通道诱导因子(CHIF)(Barhanan，J.等，自然，78-80，1996；Sanguinetti，M.C.等，自然，80-83，1996；Attali，B等，美国国家科学院院报，92：6092-6096，1995)。最近证据表明IsK作用为K离子通道调节剂，其本身不能形成离子通道，但在功能性K⁺通道存在的情况下增强电压依赖型转运(Attali，B.，自然，384：24-25，1996；Barhanan，J.等，同上；Sanguinetti，M.C.等，同上)。这些小氯离子通道蛋白是通道调节剂还是真正的通道还不了解。

几种离子通道与人体中的遗传疾病有关(见Ackerman，M.J.，Clapham，D.E.，新英格兰医学杂志336：1575-1586，1997)。CLC-1通道是骨骼肌的主要氯离子通道，其突变与导致肌强直(肌肉僵硬)的超兴奋骨骼肌有关。而且，肾特异的CLC-K1通道在享勒弯曲中有高表达，在脱水大鼠整个肾中表达上调，证明其在尿浓缩中的作用。另一大鼠肾通道CLC-K2在肾内有不同细胞定位并可能有不同的生理作用。大鼠CLC-K形式的人同系物已知。参与心肌细胞膜复极化的IsK K⁺通道调节剂可能在心律不齐中起作用(Attali，B.，同上；Barhanan，J.等， 同上；Sanguinetti，M.C.等， 同上)。CTFR氯离子通道参与囊性纤维化。这些发现加强了离子通道的差异性、它们的组织特异性和它们与人类病理状态的相关性。

新离子通道分子的发现提供了对潜在人类疾病状态的理解，提供了发现新治疗方法要调整的目标并作用为遗传疾病的标记。因此寻求新离子通道的发现。本发明提供这些多肽用于这些用途和其它对于本领域熟练技术人员来说可从本文说明显而易见的用途。

发明概述

本发明满足了提供离子通道蛋白新家族的新人类离子通道的需求。

一方面，本发明提供编码zsig44多肽的分离的多核苷酸，包含与选自以下氨基酸序列的氨基酸序列至少90％同源的氨基酸残基序列：(a)SEQ ID NO：2中所示氨基酸序列的残基数17(Leu)-残基数89(Cys)；并且(b)SEQ ID NO：2中所示氨基酸序列的残基数1(Met)-残基数89(Cys)。在一实施方案中，上面公开的分离的多核苷酸分子选自：(a)SEQ ID NO：1中所示多核苷酸序列的核苷酸52-核苷酸270；以及(b)SEQ ID NO：1中所示多核苷酸序列的核苷酸4-核苷酸270。在另一实施方案中，上面公开的分离的多核苷酸分子包含SEQ ID NO：8的核苷酸1-核苷酸267。在另一实施方案中，上面公开的分离的多核苷酸基本上由与SEQ ID NO：2中所示氨基酸序列的氨基酸数17(Leu)-氨基酸数89(Cys)至少90％同源的氨基酸残基序列组成。在另一实施方案中，上面公开的分离的多核苷酸基本上由SEQID NO：2中所示氨基酸残基序列的氨基酸数17(Leu)-氨基酸数89(Cys)组成。

另一方面，本发明提供含有下列可操作连接元件的表达载体：转录启动子；编码与SEQ ID NO：2中所示氨基酸序列的氨基酸数17(Leu)-氨基酸数89(Cys)至少90％同源的zsig44多肽的DNA片段；以及转录终止子。在一实施方案中，上面公开的表达载体进一步包含与DNA片段可操作连接的分泌信号序列。

另一方面，本发明提供已导入上面公开的表达载体的培养细胞，其中细胞表达DNA片段编码的多肽。

另一方面，本发明提供编码融合蛋白的DNA构建体，此DNA构建体包含：编码与选自以下氨基酸序列的氨基酸残基序列至少90％同源的的多肽的第一个DNA片段：(a)SEQ ID NO：2的氨基酸序列的残基数1(Met)-残基数16(Ala)；(b)SEQ ID NO：2的氨基酸序列的残基数17(Leu)-残基数28(Asp)；(c)SEQ ID NO：2的氨基酸序列的残基数29(Pro)-残基数64(Lys)；(d)SEQ ID NO：2的氨基酸序列的残基数65(Ser)-残基数89(Cys)；(e)SEQ ID NO：2的氨基酸序列的残基数17(Leu)-残基数64(Lys)；(f)SEQ ID NO：2的氨基酸序列的残基数29(Pro)-残基数89(Cys)；(g)SEQ ID NO：2的氨基酸序列的残基数17(Leu)-残基数89(Cys)；以及编码其它多肽的至少一个其它DNA片段，其中第一个和其它DNA片段是框架内连接的；并且编码融合蛋白。在一实施方案中，按以下方法制备融合蛋白，方法包括：培养其中已导入含有以下可操作连接的单元的载体的宿主细胞：(a)转录启动子；(b)编码根据权利要求9所述的融合蛋白的DNA构建体；以及(c)转录终止子；并且回收DNA片段编码的蛋白。

另一方面，本发明提供一种分离的多肽，包含与选自以下氨基酸序列的氨基酸序列至少90％同源的氨基酸残基序列：(a)包含SEQID NO：2中所示氨基酸序列的残基数17(Leu)-残基数89(Cys)；并且(b)包含SEQ ID NO：2中所示氨基酸序列的残基数1(Met)-残基数89(Cys)。在一实施方案中，上面公开的分离的多肽进一步包含在构型M1-{6}-M2-{5}-M3-{1}-M4-{14}-PLITPGSA中从N端到C端间隔开的基序1-4和PLITPGSA基序。在另一实施方案中，上面公开的分离的多肽基本上由与SEQ ID NO：2中所示氨基酸序列的氨基酸数17(Leu)-氨基酸数89(Cys)至少90％同源的氨基酸残基序列组成。在另一实施方案中，上面公开的分离的多肽是SEQ ID NO：2中所示的氨基酸数17(Leu)-氨基酸数89(Cys)。

另一方面，本发明提供合成zsig44多肽多肽的方法，包括：培养根据权利要求8所述的细胞，；并且分离细胞合成的zsig44多肽。

另一方面，本发明提供制备抗zsig44多肽抗体的方法，包括：用选自以下多肽的多肽免疫接种动物：(a)由9-89个氨基酸组成的多肽，其中多肽是与SEQ ID NO：2中连续氨基酸序列的氨基酸数17(Leu)-氨基酸数89(Cys)至少90％同源的多肽；(b)根据权利要求11所述的多肽；(c)具有与SEQ ID NO：2的残基数17(Leu)-残基数28(Asp)至少90％同源的氨基酸序列的多肽；(d)具有与SEQ IDNO：2的残基数29(Pro)-残基数64(Lys)至少90％同源的氨基酸序列的多肽；(e)具有与SEQ ID NO：2的残基数65(Ser)-残基数89(Cys)至少90％同源的氨基酸序列的多肽；其中多肽在动物中引发免疫反应；并且从动物中分离抗体。在一实施方案中，上面公开的抗体与zsig44多肽结合。在另一个实施方案中，上面公开的抗体是单抗体克隆。

另一方面，本发明提供与上面公开的多肽特异结合的抗体。

另一方面，本发明提供在测试样品中检测zsig44蛋白活性调节剂存在的方法，包括：培养其中已导入根据权利要求6所述的表达载体的细胞，其中细胞在含有或不含有测试样品的情况下表达DNA片段编码的zsig44蛋白；并且通过生物学或生物化学分析比较含有或不含有测试样品时zsig44的活性水平；并且从比较中确定测试样品中zsig44活性调节剂的存在。

参照下面本发明的详细描述和附图，本发明的这些和其它方面将变得更清楚。

附图简述

图1表示zsig44(SEQ ID NO：2)，rat CHIF(RATCHI)(SEQ IDNO：3)，人MAT-8(HSMAT8)(SEQ ID NO：4)，人PLM(HSU722)(SEQID NO：5)的多重比较。

发明详述

在详细描述本发明之前，定义下列术语有助于其理解。

术语“亲和标记物”用于此处是指能与第二个多肽结合以提供第二个多肽的纯化或检测或者提供第二个多肽与底物结合的位点的多肽片段。原则上，任何抗体或其它特异结合试剂的肽或蛋白都适于用作亲和标记物。亲和标记物包括多组氨酸臂、蛋白质A(Nilsson等， 欧洲分子生物学组织杂志， 4：1075，1985；Nilsson等，酶学方法198：3，1991)、谷胱甘肽S转移酶(Smith和Jahnson，基因，67：31，1988)、Glu-Glu亲和标记物(Grussenmeyer，等，蛋白表达和纯化2：95-107，1991)。编码亲和标记物的DNA可以从商业供应商(例如Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)获得。

术语“等位变体”用于此处是指占据相同染色体位点的基因的两种或多种可换形式中的任一种。等位变体通过突变自然产生，并在种群内导致表型多态性。基因突变可以是沉默的(编码的多肽中没有变化)或编码含有改变的氨基酸序列的多肽。术语等位变体此处也用于表示由基因的等位变体编码的蛋白。

术语“氨基端”和“羧基端”用于此处是指多肽内的位置。如果上下文允许，参照多肽的特定序列或部分使用这些术语以表示接近或相对的位置。例如，多肽内位于参考序列的羧基端的特定序列是位于接近参考序列的羧基末端，但不一定位于完整多肽的羧基末端。

术语“互补/反互补对”是指在适当条件下形成非共价连接的稳定配对的非相同部分。例如，生物素和抗生物素蛋白(或抗生物素蛋白链霉素)是互补/反互补对的典型成员。其它典型互补/反互补对包括受体/配体对、抗体/抗原(或半抗原或抗原决定基)对、正义/反义多核苷酸对等。在需要互补/反互补对随后解离的地方，互补/反互补对优选地具有小于10⁹M^-1的结合亲和性。

术语“多核苷酸分子的互补”是与参考序列相比，具有互补碱基序列和反方向的多核苷酸分子，例如序列5’ATGCACGGG 3’与5’CCCGTGCAT 3’互补。

术语“重叠群”是指具有与另一多核苷酸相同或互补序列的毗邻片段的多核苷酸。毗邻序列是指与具有在它们的整体上或沿着多核苷酸的部分片段的多核苷酸序列的给定片段重叠。例如多核苷酸序列5’-ATGGCTTAGCTT-3’的相应重叠群是5’-TAGCTTgagtct-3’和3’-gtcgacTACCGA-5’。

术语“简并核苷酸序列”是指包含一个或多个简并密码子的核苷酸序列(与编码多肽的参考多核苷酸分子相比)。简并密码子含有不同的核苷酸三联体，但编码相同的氨基酸残基(即GAU和GAC三联体都编码Asp)。

“DNA片段”是具有指定特征的大DNA分子的部分。例如，编码指定多肽的DNA片段是更大DNA分子如质粒或质粒片段的部分，即在从5’读到3’方向时编码指定多肽的氨基酸序列。

术语“表达载体”用于表示包含与提供用于转录的其它片段可操作连接的编码目的多肽的片段的线性或环状DNA分子。这样的其它片段包括启动子和终止子序列，并且也可以包括一个或多个复制起点、一个或多个选择性标记、增强子、多聚腺苷酸信号等。表达载体一般起源于质粒或病毒DNA，或可以含有两者的元件。

术语“离子通道”广泛用于表示与阴离子、阳离子或其它通道蛋白或它们的公认调节剂同源或实际上就是阴离子、阳离子或其它通道蛋白或它们的公认调节剂的多肽或蛋白。术语离子通道此处也用于表示编码这样的多肽的核苷酸。

术语“分离的”用于多核苷酸时，是指多核苷酸已从其天然的遗传环境中提取出来，因而不含有其它外源或不需要的编码序列，并且是适于遗传工程蛋白合成系统中使用的形式。如此分离的分子是那些与其天然环境分开的分子，包括cDNA和基因组克隆。本发明的分离的DNA分子不含有正常与它们结合的其它基因，但可以包含天然存在的5’和3’非翻译区如启动子和终止子。相关区域的鉴定对于本领域普通技术人员来说是显而易见的(见例如Dynan和Tijan， 自 然 316：774-778，1985)。“分离的”多肽或蛋白是存在于非其天然环境的状态如从血液和动物组织分离的多肽或蛋白。在优选的形式中，分离的多肽基本上不含其它多肽，尤其是其它动物来源的多肽。优选的是提供高度纯化形式即大于95％纯度、更优选地大于99％纯度的多肽。当用于本文的上下文时，术语“分离的”并不排除以可互换的物理形式如二聚体或选择性地糖基化或派生形式存在的相同多肽的存在。

术语“可操作连接”用于DNA片段时，是指对片段进行安排使它们的功能与预期目的相协调，如转录在启动子起始并延伸通过编码片段至终止子。

术语“种同系物(ortholog)”表示从一个种获得的蛋白或多肽是来自不同种的多肽或蛋白的功能对应物。种同系物之间的序列差异是物种形成的结果。

术语“paralog”是生物合成的、不同但结构上相关的蛋白。据认为Paralog是由于基因重复而引起的。例如α-珠蛋白、β-珠蛋白和肌红蛋白互相是Paralog。

术语“多核苷酸”是从5’末端读至3’末端的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的单链和双链多聚体。多核苷酸包括RNA和DNA，可以从天然来源分离、体外合成或由天然和合成分子的组合制备。

多核苷酸的大小表示为碱基对(缩写“bp”)、核苷酸(“nt”)或千碱基(“kb”)。只要上下文允许，后两个术语可以描述单链或双链多核苷酸。当术语用于双链分子时，它用于表示全长并且应理解为与术语“碱基对”相同。本领域熟练技术人员将认识到双链多核苷酸的两条链可能长度不同并且其末端可能因为酶消化而错开；因此，双链多核苷酸分子内可能不是所有的核苷酸都配对。这样的未配对末端长度一般不超过20nt。

“多肽”是天然合成或人工合成的通过肽键连接的氨基酸残基的聚合物。少于10个氨基酸残基的多肽一般称为“肽”。

此处使用术语“启动子”的本领域公认的意义，表示含有提供RNA聚合酶结合和转录起始的DNA序列的基因部分。启动子序列一般但并不总是位于基因的5’非编码区。

“蛋白”是包含一条或多条多肽链的大分子。蛋白也可以包含非肽成分如碳水化合物基团。合成蛋白的细胞可能将碳水化合物和其它非肽取代基加到蛋白上，取代基将随细胞类型变化。此处依据蛋白的氨基酸主链结构来定义蛋白；一般不说明取代基如碳水化合物基团，但这些基团可能存在。

术语“受体”表示与生物活性分子(即配体)结合并在细胞上调节配体效应的细胞相关蛋白。膜结合受体的特征一般在于多结构域结构，包括细胞外配体结合结构域和一般参与信号传导的细胞内效应器结构域。配体和受体结合导致受体构象改变，引起效应器结构域与细胞内其它分子之间的相互作用。此相互作用继而引起细胞代谢的变化。与受体-配体相互作用相关的代谢事件包括基因转录、磷酸化作用、去磷酸化作用、环AMP合成的增加、细胞钙的动员、膜脂的动员、细胞粘附、肌醇脂的水解和磷脂的水解。一般情况下，受体可以是膜结合的、细胞质或细胞核的；单体的(如促甲状腺激素受体、β-肾上腺素能受体)或多聚体的(如PDGF受体、生长激素受体、IL-3受体、GM-CSF受体、G-CSF受体、促红细胞生成素受体和IL-6受体。

术语“分泌信号序列”是指编码作为更大多肽的组成部分指导更大的多肽通过合成此多肽的细胞分泌通路的多肽(“分泌肽”)的DNA序列。在通过分泌通路传递的过程中通常对更大的多肽进行切割以除去分泌肽。

术语“剪切变体”用于此处是指从基因转录的RNA的可变换形式。剪切变化在转录的RNA分子内或更少见的分开的转录RNA分子之间通过使用可变换的剪切位点天然产生，并且可能导致从相同基因转录的几种mRNA。剪切变体可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。术语剪切变体用于此处也表示由从基因转录的mRNA的剪切变体编码的多肽或蛋白。

术语“可溶性蛋白”用于此处是指不与细胞膜结合的蛋白多肽。可溶性蛋白包括天然为细胞内的如胞质的蛋白或从细胞天然分泌的蛋白。很多细胞表面有天然存在的可溶性对应物，它们通过蛋白水解合成或从选择性剪切的mRNA翻译合成。当受体和配体多肽缺乏足够的分别提供膜锚定或信号转导的跨膜和细胞内多肽片段的部分时，它们被认为基本上不含这些片段。可溶性蛋白也包括经遗传加工变成可溶性的膜结合蛋白，例如以常规方法通过去除跨膜区域或仅表达蛋白的可溶性部分。

由不精确分析方法(例如电泳)测定的聚合物分子量和长度应理解为大约的数值。当这样的数值表示为“约”X或“大约”X时，所述数值X应理解为精确到±10％。

本文引用的所有参考文献的说明在此全面引入作为参考。

本发明部分以编码离子通道或通道调节剂的新DNA序列的发现为基础。对应于此DNA的mRNA的组织分布的Northern印迹分析表明表达在肾和骨髓中最高，并且在任何测试的其它组织或转化的细胞中没有可检测的表达水平。推测的剪切变体在脊髓中表达。几个组织的点印迹分析表明心脏中的信号。此肽称为zsig44。

本发明的新zsig44多肽最初通过查询信号序列的同源序列的EST数据库而得到鉴定。发现了一个N-端EST序列并推测与离子通道CHIF/MAT-8家族有关(Attoli，B.等，同上；Morrison，B.W.等，同上)。

全长zsig44的核苷酸序列在SEQ ID NO：1中描述，并且其推测的氨基酸序列在SEQ ID NO：2中描述。多重比较揭示zsig44是离子通道家族的成员，其特征在于它们小而单一的跨膜结构域，可能作用为离子通道调节剂。

编码zsig44多肽的DNA(SEQ ID NO：1)的分析揭示了编码89个氨基酸的开放阅读框架(SEQ ID NO：2)，此开放阅读框架包含19个氨基酸残基[SEQ ID NO：2的残基1(Met)-残基16(Ala)]的信号肽、22个氨基酸的跨膜结构域[SEQ ID NO：2的残基36(Asn)-残基58(Leu)]和73个氨基酸的成熟多肽[SEQ ID NO：2的残基17(Leu)-残基89(Cys)]。zsig44与其它已知离子通道的多重比较揭示对应于SEQ ID NO：2的氨基酸残基29(Pro)至氨基酸残基64(Lys)的相似区域。此区域此后称为“中心区域”或“中心结构域”。在此区域中，有4保守的基序，此后称为“基序1”(SEQ ID NO：6；SEQ IDNO：2的氨基酸29-34)、“基序2”(SEQ ID NO：7；SEQ IDNO：2的氨基酸41-46)、“基序3”(SEQ ID NO：8；SEQ IDNO：2的氨基酸52-57)、“基序4”(SEQ ID NO：9；SEQ IDNO：2的氨基酸59-64)。基序3和4被存在于所示所有离子通道成员中的单一保守丝氨酸残基隔开；此丝氨酸可能作用为PKC磷酸化作用位点。C端“PLITPGSA基序”也存在(SEQ ID NO：10；SEQ IDNO：2的氨基酸79-86)。而且，zsig44多肽不具有作为CHIF/MAT-8类型离子通道特征的PKA磷酸化保守位点(见附图)。

在如下所示的构型中，基序1-4和“PLITPGSA基序”从N端-C端被间隔开：

M1-{6}-M2-{5}-M3-{1}-M4-{14}-PLITPGSA，

其中M#代表上面公开的特定基序(例如M1是基序1等)，

PLITPGSA表示上面公开的PLITPGSA基序；并且

{#}表示基序之间的氨基酸数。

保守基序的存在一般与蛋白中的重要结构区域相关或限定蛋白中的重要结构区域。这些基序之间或侧翼的区域可能是更多变的，但常常是功能上重要的，因为它们与重要结构和活性有关或限定重要结构和活性如结合结构域、生物和酶活性、信号转导、组织定位结构域等。可能功能重要的中心结构域侧翼的区域是SEQ ID NO：2的残基17(Leu)-残基28(Asp)以及残基65(Ser)-残基89(Cys)。

本发明的优选实施方案中，分离的多核苷酸将在严格条件下与SEQ ID NO：1或其互补序列的相似大小区域杂交。一般情况下，选择在指定离子强度和pH下低于特定序列热解链点(Tm)约5℃的严格条件。Tm是50％靶序列与完全匹配探针杂交时的温度(在指定离子强度和pH下)。典型的严格条件是那些pH7时NaCl浓度高达约0.03M并且温度至少约60℃的条件。

如前面所指出的，本发明的分离的多肽包括DNA和RNA。分离DNA和RNA的方法在本领域内众所周知。一般优选的是从肾或骨髓分离RNA，尽管DNA也可以使用来自其它组织、细胞系的RNA制备或分离为基因组DNA。使用异硫氰酸胍抽提，接着在CsCl梯度中离心分离，可以制备总RNA(Chirgwin等，生物化学18：52-94，1979)。Poly(A)⁺RNA使用Aviv和Leder(美国国家科学院院报69：1408-1412，1972)的方法从总RNA制备。使用已知方法从poly(A)⁺RNA制备互补DNA(cDNA)。然后通过例如杂交或PCR鉴定和分离编码zsig44多肽的多核苷酸。

本发明也提供编码此处公开的zsig44多肽的多核苷酸分子，包括DNA和RNA分子。本领域熟练技术人员容易认识到，考虑到遗传密码的简并性，在这些多核苷酸分子中可能有相当多的序列变化。SEQID NO：11是包括所有编码SEQ ID NO：2的zsig44多肽的DNA的简并DNA序列。本领域熟练技术人员将认识到，通过将U替换成T，SEQID NO：2的简并序列也提供所有编码SEQ ID NO：2的RNA序列。因此，编码zsig44多肽的多核苷酸包括SEQ ID NO：11的核苷酸1-核苷酸267，并且本发明包括它们的RNA等价物。表1说明SEQ ID NO：11中表示简并核苷酸位置所用的单字母符号。“分辨”表示符号字母代表的核苷酸。“互补”表示互补核苷酸的符号。例如，符号Y代表C或T，其互补R代表A或G，A与T互补，G与C互补。

                         表1

核苷酸       分辨       互补       分辨

  A            A         T           T

  C            C         G           G

  G            G         C           C

  T            T         A           A

  R            A|G       Y           C|T

  Y            C|T       R           A|G

  M            A|C       K           G|T

  K            G|T       M           A|C

  S            C|G       S           C|G

 C|G           A|T       W           A|T

  H            A|C|T     D           A|G|T

  B            C|G|T     V           A|C|G

  V            A|C|G     B           C|G|T

  D            A|G|T     H           A|C|T

  N            A|C|G|T   N           A|C|G|T

在下面表2中列出了SEQ ID NO：11中所使用的简并密码子，包括对于给定氨基酸的所有可能密码子。

                                 表2

氨基酸    字母      密码子                      简并密码子

Cys        C        TGC TGT                     TGY

Ser        S        AGC AGT TCA TCC TCG TCT     WSN

Thr        T        ACA ACC ACG ACT             ACN

Pro        P        CCA CCC CCG CCT             CCN

Ala        A        GCA GCC GCG GCT             GCN

Gly        G        GGA GGC GGG GGT             GGN

Asn        N        AAC AAT                     AAY

Asp        D        GAC GAT                     GAY

Glu        E        GAA GAG                     GAR

Gln        Q        CAA CAG                     CAR

His        H        CAC CAT                     CAY

Arg        R        AGA AGG CGA CGC CGG CGT     MGN

Lys        K        AAA AAG                     AAR

Met        M        ATG                         ATG

Ile        I        ATA ATC ATT                 ATH

Leu        L        CTA CTC CTG CTT TTA TTG     YTN

Val        V        GTA GTC GTG GTT             GTN

Phe        F        TTC TTT                     TTY

Tyr        Y        TAC TAT                     TAY

Trp        W        TGG                         TGG

Ter        .        TAA TAG TGA                 TRR

Asn|Asp    B                                    RAY

Glu|Gln    Z                                    SAR

Any        X                                    NNN

本领域普通技术人员将会理解在确定简并密码子(代表编码每个氨基酸的所有可能密码子)时引入的某些错读。例如，丝氨酸(WSN)的简并密码子在某些情况下编码精氨酸(AGR)，精氨酸(MGN)的简并密码子在某些情况下编码丝氨酸(AGY)。相似的关系在编码苯丙氨酸和亮氨酸的密码之间也存在。因此，简并序列所包含的某些多核苷酸可能编码不同的氨基酸序列，但本领域普通技术人员参考SEQ IDNO：2的氨基酸序列可以容易地鉴定这样的不同序列。可以容易地对不同序列测定如此处公开的功能性。

本领域普通技术人也将理解不同序列可能表现“偏爱的密码子使用”。一般参见Grantham等，核酸研究8：1893-1912，1980；Haas等，Curr.Biol.6：315-324，1996；Wain-Hobson等，基因13：355-64，1981；Grosjean和Fiers，基因18：199-209，1982；Holm，核酸研究14：3075-3087，1986；Ikemura，分子生物学杂志158：573-597，1982。如此处所用的，术语“偏爱的密码子使用”或“偏爱的密码子”是关于最常用于某些物种细胞的蛋白翻译密码子，因此偏爱编码每个残基的一个或几个代表性的可能密码子的术语(见表2)。例如，残基苏氨酸(Thr)可以由ACA、ACC、ACG或ACT编码，但在哺乳动物中，ACC是最常用的密码子；在其它物种如昆虫细胞、酵母、病毒或细菌中，不同Thr密码子可能是优选的。特定物种的偏爱密码子可以通过本领域已知的各种方法导入本发明的多肽中。将偏爱的密码子序列导入重组DNA可以例如通过使特定细胞类型或物种内的蛋白翻译更有效来增加蛋白合成。因此，SEQ ID NO：11中公开的简并密码子序列作用为优化在本领域常用的和此处公开的各种细胞类型和物种中多核苷酸表达的模板。可以在各种物种中测试含有偏爱密码子的序列并优化表达，并且测试此处公开的功能性。

本发明进一步提供来自其它物种的相似多肽和多核苷酸(种同系物)。这些物种包括但不限于哺乳动物、鸟类、两栖动物、爬行动物、鱼类、昆虫以及其它脊椎动物和无脊椎动物物种。尤其感兴趣的是来自其它哺乳物种包括鼠、大鼠、猪、羊、牛、狗、猫、马和其它灵长类多肽的zsig44多肽。使用本发明提供的信息和组合物结合传统克隆技术可以克隆人zsig44的种同系物。例如使用从表达此处公开的zsig44的组织或细胞类型获得的mRNA可以克隆cDNA。通过使用根据此处公开的序列设计的探针探测Northern印迹可以鉴定mRNA的适当来源。然后从阳性组织或细胞系的mRNA制备文库。然后可以通过一系列方法如通过用完整或部分人cDNA或用基于公开序列的一套或多套简并探针探查来分离编码zsig44的cDNA。zsig44中心结构域中的高度保守残基序列可以用作鉴定新离子通道成员的工具。例如，反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)可使用从各种组织来源得到的RNA扩增编码保守基序1-4和PLITPGSA基序的序列。具体地，从5’信号序列设计的高度简并引物可用于此目的。用根据此处公开的代表性人zsig44序列设计的引物，使用聚合酶链反应或PCR(Mullis，美国专利No.4,683,202)也可以克隆cDNA。在其它方法中，可以使用cDNA文库转化或转染宿主细胞，用抗zsig44的抗体检测目的cDNA的表达。相似的技术也可以应用于基因组克隆的分离。

本领域技术人员将意识到SEQ ID NO：1中公开的序列代表人zsig44的单一等位基因，并且预期会发生的等位变异和可变换的剪接。根据标准方法通过探查来自不同个体的cDNA或基因组文库可以克隆此序列的等位变体。可以使本领域已知的各种分子生物学技术克隆相同或不同细胞类型内的剪切变体。例如cDNA末端的5’和3’快速扩增(RACE)、使用简并寡核苷酸引物的RCR和传统的杂交克隆技术等都可用于鉴定和克隆等位变体和剪切变体cDNA(Sambrook等，分子克隆：实验室手册，第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，NY，1989和Ausubel等(编辑)，分子生物学常用方法，John Wiley和Sons，Inc.，NY，1987)。SEQ ID NO：1中所示的DNA序列的等位变体，包括那些含有沉默突变的变体和那些突变导致氨基酸序列变化的变体，在本发明范围之内，SEQ ID NO：2的等位变体蛋白也在本发明范围之内。从选择性剪切的mRNA产生的、保留了zsig44多肽特性的cDNA也包括在本发明范围之内，由这样的cDNA和mRNA编码的多肽也包括在本发明范围之内。按照本领域已知的标准方法，通过探测来自不同个体或组织的cDNA或基因组文库可以克隆这些序列的等位变体和剪切变体。

本发明也提供了与SEQ ID NO：2的多肽及其种同系物基本上同源的分离的zsig44多肽。术语“基本上同源”用于此处是指与SEQID NO：2中所示的序列或其种同系物有50％、优选60％、更优选至少80％序列相同性的多肽。这样的多肽与SEQ ID NO：2或其种同系物或Paralog将更优选地至少90％相同，并且最优选地95％或更多的相同。通过传统的方法确定序列相同百分率。参见例如Altschul等，Bull.Math.Bio.48：603-616，1986和Henikoff和Henikoff，美国国家科学院院报，89：10915-10919，1992。简单地说，使用缺口开放补偿(gap opening penalty)10、缺口延伸补偿(gapextension penalty)1比较两个氨基酸序列以最优化序列匹配，并且Henikoff和Henikoff(同上)的“blosum 62”评分矩阵在表3中表示(用标准单字母符号表示氨基酸)。然后按以下公式计算相同百分率：

                           表3A  R  N  D  C  Q  E  G  H  I  L  K  M  F  P  S  T  W  Y  VA  4R -1  5N -2  0  6D -2 -2  1  6C  0 -3 -3 -3  9Q -1  1  0  0 -3  5E -1  0  0  2 -4  2  5G  0 -2  0 -1 -3 -2 -2  6H -2  0  1 -1 -3  0  0 -2  8I -1 -3 -3 -3 -1 -3 -3 -4 -3  4L -1 -2 -3 -4 -1 -2 -3 -4 -3  2  4K -1  2  0 -1 -3  1  1 -2 -1 -3 -2  5M -1 -1 -2 -3 -1  0 -2 -3 -2  1  2 -1  5F -2 -3 -3 -3 -2 -3 -3 -3 -1  0  0 -3  0  6P -1 -2 -2 -1 -3 -1 -1 -2 -2 -3 -3 -1 -2 -4  7S  1 -1  1  0 -1  0  0  0 -1 -2 -2  0 -1 -2 -1  4T  0 -1  0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1  1  5W -3 -3 -4 -4 -2 -2 -3 -2 -2 -3 -2 -3 -1  1 -4 -3 -2 11Y -2 -2 -2 -3 -2 -1 -2 -3  2 -1 -1 -2 -1  3 -3 -2 -2  2  7V  0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3  3  1 -2  1 -1 -2 -2  0 -3 -1  4

使用上述比率用相似方法测定多核苷酸分子的序列相同性。

不同的zsig44多肽或基本上同源的zsig44多肽以带有一个或多个氨基酸置换、缺失或增加为特征。这些改变优选的是具次要性质的变化，即保守氨基酸的置换(见表4)和其它不显著影响蛋白或多肽折叠或活性的置换；小的删除，一般1至30个氨基酸；以及小的氨基或羧基末端延伸如氨基末端甲硫氨酸残基、长达20-25个残基的小接头肽或有助于纯化的小延伸如亲和标记物。因此本发明也包括含有标记物如多组氨酸臂、蛋白质A(Nilsson等， 欧洲分子生物学组 织杂志， 4：1075，1985；Nilsson等，酶学方法198：3，1991)、谷胱甘肽S转移酶(Smith和Johnson，基因，67：31，1988)、麦芽糖结合蛋白(Kellerman和Ferenci，酶学方法，90：459-463，1982；Guan等， 基因  67：21-30，1987)、硫氧还蛋白、遍在蛋白、纤维素结合蛋白、T7聚合酶或其它抗原表位或结合结构域的zsig44多肽。一般参见Ford等，蛋白表达和纯化，2：95-107，1991。编码亲和标记物的DNA可以从商业供应商(例如PharmaciaBiotech，Piscataway，NJ；New England Biolabs，Beverly，MA)获得。含有亲和标记物的多肽可以进一步包含zsig44多肽和亲和标记物之间的蛋白水解切割位点。优选的位点是凝血酶切割位点和因子Xa切割位点。另外可以对zsig44的氨基酸残基进行光亲和标记(Brunner等，生物化学年鉴62：483-514，1993和Fedan等，Biochem.Pharmacol.33：1167-1180，1984)。

      表4保守的氨基酸替换

碱性的：               精氨酸

                       赖氨酸

                       组氨酸

酸性的：               谷氨酸

                       天冬氨酸

极性的：               谷氨酰胺

                       天冬酰胺

疏水的：               亮氨酸

                       异亮氨酸

                       缬氨酸

芳香族的：             苯丙氨酸

                       色氨酸

                       酪氨酸

小的：                 甘氨酸

                       丙氨酸

                       丝氨酸

                       苏氨酸

                       甲硫氨酸

本发明的蛋白也可以含有非天然存在的氨基酸残基。非天然存在的氨基酸包括但不限于反-3-甲基脯氨酸、2，4-甲烷脯氨酸、顺-4-羟脯氨酸、反-4-羟脯氨酸、N-甲基甘氨酸、别-苏氨酸、甲基苏氨酸、羟乙基半胱氨酸、羟乙基高半胱氨酸、硝基谷氨酰胺、高谷氨酰胺、六氢吡啶羧酸、四氢噻唑羧酸、脱氢脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸、3，3-二甲基脯氨酸、叔亮氨酸、正缬氨酸、2-重氮苯丙氨酸、3-重氮苯丙氨酸、4-重氮苯丙氨酸和4-氟苯丙氨酸、4-羟脯氨酸、6-N-甲基赖氨酸、2-氨基异丁酸、异缬氨酸和α-甲基丝氨酸。将非天然存在的氨基酸残基掺入蛋白的几种方法在本领域中已知。例如，可以使用其中使用化学氨酰化抑制剂tRNA抑制无义突变的体外系统。合成氨基酸和氨酰tRNA的方法在本领域中已知。在含有大肠杆菌S30提取物和商业可获得的酶及其它试剂的无细胞体系中进行含有无义突变的质粒的转录和翻译。蛋白通过层析得到纯化。参见例如Robertson等，美国化学协会杂志113：2722，1991；Ellman等， 酶学方法 202：301，1991；Chung等，科学 259：806-809，1993和Chung等， 美国国家科学院院报  90：10145-10149，1993)。在第二种方法中，通过微注射突变的mRNA和化学氨酰化抑制剂tRNA在非洲爪蟾卵母细胞中进行翻译(Turcatti等， 生物化学杂志 271：19991-19998，1996)。在第三种方法中，在不含要置换的天然氨基酸和含有所需的非天然存在的氨基酸(如2-重氮苯丙氨酸、3-重氮苯丙氨酸、4-重氮苯丙氨酸或4-氟苯丙氨酸)的条件下培养大肠杆菌细胞。将非天然存在的氨基酸在其天然对应物位置掺入蛋白中。见Koide等，生物化学，33：7470-7476，1994。通过体外化学修饰可以将天然存在的氨基酸残基转变成非天然存在的种类。化学修饰可以与定点诱变结合以进一步扩展替换的范围(Wynn和Richards，蛋白质科学，2：395-403，1993)。

有限数量的非保守氨基酸、不由遗传密码子编码的氨基酸、非天然存在的氨基酸以及非天然的氨基酸可替换zsig44氨基酸残基。

根据本领域已知的方法如定点诱变或丙氨酸扫描诱变，可以鉴定本发明zsig44多肽中的必需氨基酸(Cunningham和Wells，科学，244：1081-1085，1989；Bass等，美国国家科学院院报88：4498-4502，1991)。在后一种技术中，在分子的每个残基处引入单个丙氨酸突变，并检测生成的突变分子的如下公开的生物学活性(例如电压依赖型转运)以鉴定对分子活性关键的氨基酸残基。也参见Hilton等， 生物化学杂志， 271：4699-4708，1996。通过结构的物理分析也可确定蛋白-蛋白和分子内氨基酸相互作用位点，如通过诸如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记的技术并结合推测的接触位点氨基酸的突变测定的。参见例如de vos等，科学，255：306-312，1992；Smith等， 分子生物学杂志  224：899-904，1992；Wlodaver等，FEBS Lett.309：59-64，1992。也可以从与相关蛋白如已知离子通道的同源性分析推测zsig44多肽必需氨基酸的性质。

另外，识别公认的高度抗原性位点的zsig44的疏水性图可用于预测此处公开的允许的氨基酸替换和抗体表位。疏水性图的制备和抗原位点的测定、允许的氨基酸替换和表位为本领域普通技术人员熟知。

使用已知的诱变和筛选方法可以制备和检测多个氨基酸替换。例如参见Reidhaar-Olson和Sauer，科学，241：53-57，1988或Bowie和Sauer，美国国家科学院院报，86：2152-2156，1989。简要地说，这些作者公开了在多肽中同时随机选取两个或多个位置、选择有功能的多肽以及随后对诱变的多肽测序以确定每个位置允许置换的范围的方法。可以使用的其它方法包括噬菌体展示(如Lowman等， 生物化学  30：10832-10837，1991；Ladner等，美国专利No.5,223,409；Huse，WIPO公开文本WO 92/06204)和定区域诱变(Derbyshire等， 基因  46：145，1986；Ner等，DNA，7：127，1988)。

公开的Zsig44 DNA和多肽序列的变体可以通过Stemmer，自然370：389-91，1994；Stemmer，美国国家科学院院报91：10747-10751，1994和WIPO公开文本WO 97/20078公开DNA移动法制备。简而言之，通过亲本DNA的随机片段的体外同源重组，接着用RCR重新装配，得到随机引入的点突变来制备变体DNA。此技术可以通过使用亲本DNA家族如等位变体或来自不同种的DNA来修饰以在此方法中导入额外的可变性。所需活性的选择或筛选、随后诱变的额外重复以及分析通过选择有利突变同时排除有害变化来提供序列的快速“进化”。

此处公开的诱变方法可以与高效率的自动筛选方法结合以在宿主细胞中检测克隆的、诱变的多肽的活性。编码活性多肽(例如在非洲爪蟾卵母细胞或哺乳动物细胞中增加电压依赖型转运或用针对zsig44产生的抗体检测细胞表面上的表达)的诱变的DNA分子可以从宿主细胞得到回收并用现代仪器快速测序。这些方法允许目的多肽中单个氨基酸重要性的快速测定，并可以应用于未知结构的多肽。

使用此处讨论的方法，本领域的普通技术人员可以鉴定和/或制备保留野生型蛋白的离子通道或调节特性的SEQ ID NO：2的各种多肽片段或变体。活性可通过使用此处公开的技术评估。这样的多肽可以包括来自例如跨膜、中心及细胞内结构域的部分或全部的其它氨基酸；其它结构域；亲和标记物等。这些多肽也可以包括如上充分公开的其它多肽片段。

对于任何zsig44多肽，包括变体和融合蛋白，本领域普通技术人员可以容易地使用上表1和2中所示的信息制备编码变体的完全简并多核苷酸序列。

本发明的多肽，包括全长蛋白、其片段、生物活性片段和融合蛋白，可以根据传统技术在遗传工程宿主细胞中合成。适当的宿主细胞是那些可以用外源DNA转化或转染并在培养中生长的细胞类型，包括细菌、真菌细胞和培养的高等真核细胞。优选的是真核细胞，尤其是多细胞生物的培养细胞。操作克隆的DNA分子和将外源DNA导入许多宿主细胞的技术由Sambrook等，分子克隆：实验室手册，第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1989和Ausubel等(编辑)，分子生物学常用方法，John Wiley和Sons，Inc.，纽约，1987公开。

总的来说，将编码zsig44多肽的DNA序列可操作地与其表达所需的其它基因元件，一般包括表达载体内转录启动子和终止子连接。载体一般也将含有一个或多个选择性标记以及一个或多个复制起点，尽管本领域技术人员将认识到在某些系统内也可以在分开的载体上提供选择性标记并且通过整合入宿主细胞基因组提供外源DNA的复制。启动子、终止子、选择性标记、载体和其它元件的选择是本领域普通技术水平内的常规设计。许多这样的元件在文献中得到描述并可通过商业供应商得到。

为了将zsig44多肽导入宿主细胞分泌通路，在表达载体中提供分泌信号序列(也已知为前导序列、早前肽或前肽)。分泌信号序列与Zsig44 DNA序列可操作连接，即两个序列在正确阅读框架中连接并定位以将新合成的多肽导入宿主细胞的分泌通路。分泌信号序列一般定位于编码目的多肽的DNA序列的5’端，尽管某些信号序列可以定位于目的DNA序列的别处(参见例如Welch等，美国专利No.5,037,743；Holland等，美国专利No.5,143,830)。

选择性地，本发明多肽中所含的和此处公开的分泌信号序列可用于将其它多肽导入分泌通路。本发明提供这样的融合多肽。信号融合多肽可以得到制备，其中使用本领域已知的和此处公开的方法，将来自SEQ ID NO：2的残基1(Met)-残基16(Ala)的分泌信号序列与另一多肽可操作连接。优选地，将本发明融合多肽中所含的分泌信号序列与另一多肽的氨基末端融合以将其它肽导入分泌通路。这样的构建体具有在本领域中已知的大量用途。例如，这些新的分泌信号序列融合构建体可介导正常不分泌蛋白的活性成分的分泌。这样的融合可在体内或体外用于介导肽通过分泌通路。

在本发明内，培养的哺乳动物细胞是适当的宿主。将外源DNA导入哺乳动物宿主细胞的方法包括磷酸钙介导的转染(Wigler等，细胞，14：725，1978；Corsaro和Pearson，体细胞遗传学，7：603，1981；Graham和Van der Eb，病毒学，52：456，1973)、电穿孔(Neumann等，欧洲分子生物学杂志，1：841-845，1982)，DEAE-葡聚糖介导的转染(Ausubel等，同上)和脂质体介导的转染(Hawley-Nelson等，焦点，15：73，1993；Ciccarone等，焦点，15：80，1993)以及病毒载体(Miller，A.，Rosman，G.，生物技术7：980-990，1989；Wang，Q.，Finer，M.，Nature Med.2：714-716，1996)。在培养的哺乳动物细胞中重组多肽的合成公开于例如Levinson等，美国专利No.4,713,339；Hagen等，美国专利No.4,784,950；Palmiter等，美国专利No.4,579,821和Ringold，美国专利No.4,656,134。适当的培养的哺乳动物细胞包括COS-1(ATCC No.CRL 1650)、COS-7(ATCC No.CRL 1651)、、BHK(ATCC No.CRL 1632)、BHK570(ATCC No.CRL 10314)、293(ATCC No.CRL 1573；Graham等，遗传病毒学杂志，36：59-72，1977)和中国仓鼠卵巢细胞系(如CHO-K1，ATCC No.CRL 61)。其它适当的细胞系在本领域内已知，并可以从公共保藏单位如美国典型培养物保藏中心，Rockyille，Maryland获得。一般优选的是强转录启动子，例如来自SV-40或巨细胞病毒的启动子。参见例如，美国专利No.4,956,288。其它适当的启动子包括那些来自金属硫蛋白基因(美国专利No.4,579,821和4,601,978)的启动子以及腺病毒主要晚期启动子。

一般药物选择用于选择已插入外源DNA的培养的哺乳动物细胞。这些细胞通常称作“转染子”。在选择性药物存在时培养的并能够将目的基因传递给子代的细胞称为“稳定转染子”。优选的选择性标记是编码对抗生素新霉素抗性的基因。选择在新霉素型药物如G-418等存在时进行。选择系统也可以用于增加目的基因的表达水平，称之为“扩增”的过程。通过在低水平选择药物存在时培养转染子，然后增加选择性药物的量以选择合成高水平导入基因产物的细胞来进行扩增。优选的可扩增的选择性标记是赋予氨甲蝶呤抗性的二氢叶酸还原酶。也可以使用其它药物抗性基因(如潮霉素抗性、多药抗性、嘌呤霉素乙酰转移酶)。导入变化的表型的可选标记，例如绿色荧光蛋白或细胞表面蛋白如CD4、CD8、I类MHC、胎盘碱性磷酸酶可用于通过诸如FACS分选或磁珠分离技术的方法从非转染细胞中选出转染的细胞。

也可以使用其它更高等的真核细胞作为宿主，包括昆虫细胞、两栖动物细胞(例如非洲爪蟾卵母细胞)、植物细胞和鸟类细胞。昆虫细胞的转化和其中外源多肽的合成公开于Guarino等，美国专利No.5,162,222；Bang等，美国专利No.4,775,624和WIPO公开文本WO 94/06463。发根农杆菌作为在植物细胞中表达基因的载体的用途已在Sinkar等，生物科学杂志(Bangalore)，11：47-58，1987中综述。

昆虫细胞可以用一般源于苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)的重组杆状病毒侵染。用两种方法之一将编码zsig44多肽的DNA插入杆状病毒基因组以取代AcNPV多角体蛋白基因编码序列。第一种方法是在野生型AcNPV和在AcNPV侧翼含有zsig44的转化载体之间同源DNA重组的传统方法。适当的昆虫细胞如SF9细胞用野生型AcNPV侵染和用含有与AcNPV多角体蛋白基因启动子、终止子和侧翼序列可操作连接的zsig44多肽的转化载体侵染。参见King，L.A.和Possee，R.D.，杆状病毒表达系统：实验室指南，London，Chapman & Hall；O’Reilly，D.R.等，杆状病毒载体：实验室手册，New York，Oxford University Press，1994以及Richardson，C.D.编辑，杆状病毒表达方法：分子生物学方法，Totowa，NJ，Humana Press，1995。昆虫细胞中的天然重组将形成含有由多角体蛋白启动子启动的zsig44的重组杆状病毒。重组病毒菌种用本领域常用的方法制备。

制备重组杆状病毒的第二种方法是利用Luckow所述的以转座子为基础的系统(Luckow，V.A等，病毒学杂志67：4566-4579，1993)。此系统在Bac-to-Bac^TM试剂盒(Life Technologies，Rockville，MD)中出售。此系统利用含有转座子Tn7的转染载体pFastBacl^TM(Life Technologies)以将编码zsig44多肽的DNA移入在大肠杆菌中保持的杆状病毒基因组成为称作“杆粒”的大质粒。pFastBacl^TM转化载体使用AcNPV多角体蛋白启动子以启动目的基因的表达，在此例中启动zsig44的表达。然而，可以对pFastBacl^TM进行相当程度的修饰。参见Hill-Perkins，M.S.和Possee，R.D.，普通病毒学杂志71：971-976，1990；Bonning，B.C.等，普通病毒学杂志75：1551-1556，1994以及Chazenbalk，G.D.和Rapoport，B.，生物化学杂志270：1543-1549，1995。另外，转化载体可以包含框架内在表达zsig44多肽的DNA的C-或N-末端与编码附加表位如Glu-Glu附加表位的DNA的融合(Grussenmeyer，T.等，美国国家科学院院报82：7952-7954，1985)。使用本领域已知的技术，将含有zsig44的转化载体转化入大肠杆菌并筛选含有重组杆状病毒特征即打断的LacZ基因的杆粒。使用常用技术分离含有重组杆状病毒基因组的杆粒DNA并将其用于转染草地夜蛾细胞如SF9细胞。表达zsig44的重组病毒随后得到制备。重组病毒菌种用本领域常用的方法制备。

重组病毒用于侵染宿主细胞，典型地是源于草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)的细胞系。一般参见Glick和Pasternak，分子生物学：重组DNA的原理和应用，ASM Press，Washington，D.C.，1994。另一适当的细胞系是源于Trichoplusia ni的High Fiveo^TM细胞系(Invitrogen)(美国专利No.5,300,435)。使用商购的无血清培养基培养和保持这些细胞。适当的培养基是用于Sf9细胞的Sf900II^TM(Life Technologies)或ESF 921^TM(Expression Systems)以及用于T.ni细胞的Ex-cell0405^TM(JRH BioSciences，Lenexa，KS)或ExpressFiveO^TM(Life Technologies)。当细胞长到约2-5×10⁵细胞至1-2×10⁶细胞的接种密度时，加入感染复数(MOI)为0.1-10、更典型的接近3的重组病毒菌种。所用的方法广泛描述于可得到的实验室手册(King，L.A.和Possee，R.D.，同上；O’Reilly，D.R.等，同上；Richardson，C.D.，同上)。可以使用此处描述的方法实现zsig44多肽随后从上清液的纯化。

真菌细胞，包括酵母细胞也可在本发明内使用。在此方面特别有利的酵母种包括酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母和PichiaMethanolica。用外源DNA转化酿酒酵母细胞以及从其生产重组多肽的方法公开于例如Kawasaki，美国专利No.4,599,311；Kawasaki等，美国专利No.4,931,373；Brake，美国专利No.4,870,008；Welch等，美国专利No.5,037,743和Murray等，美国专利No.4,845,075。通过由选择性标记，通常是抗药性或在缺少特定营养(如亮氨酸)时生长的能力确定的表型来选择转化的细胞。在酿酒酵母中使用的优选载体系统是由Kawasaki等(美国专利No.4,931,373)公开的POT1载体系统，它允许通过在含葡萄糖的培养基上的生长选择转化的细胞。在酵母中使用的适当启动子和终止子包括那些来自糖酵解基因(参见例如Kawasaki，美国专利No.4,599,311；Kingsman等，美国专利No.4,615,974和Bitter，美国专利No.4,977,092)和醇脱氢酶基因的启动子和终止子。也参见美国专利No.4,990,446；5,063,154；5,139,936和4,661,454。用于其它酵母包括多形汉逊酵母、粟酒裂殖酵母、乳酸克鲁维酵母、脆壁克鲁维酵母、玉蜀黍黑粉菌、巴斯德毕赤酵母、季也蒙毕赤酵母、Pichia methaolica和Candida maltosa的转化系统在本领域内已知。参见例如Gleeson等，遗传微生物学杂志，132：3459-3465，1986和Cregg，美国专利No.4,882,279。根据Mcknight等，美国专利No.4,935,349的方法可以使用曲霉细胞。转化Acremoniumchrysogenum的方法由Sumino等，美国专利No.5,162,228公开。转化脉孢菌的方法由Lambowitz，美国专利No.4,486,533公开。

根据传统方法，在含有营养物和所选宿主细胞生长所需的其它成份的培养基中培养转化或转染的宿主细胞。许多适当的培养基包括确定成分的培养基和复合培养基在本领域内已知并且一般包含碳源、氮源、必需氨基酸、维生素和矿物质。如果需要，培养基也可以含有诸如生长因子或血清的成份。生长培养基一般将例如通过药物选择或缺失必需营养物对含有外源DNA的细胞进行选择，其中缺失的必需营养物可以由表达载体所携带的或共转染进宿主细胞的选择性标记来补偿。

Pichia methanolica用作重组蛋白合成的宿主公开于WIPO公开文本WO 97/17450，WO 97/17451，WO 98/02536和WO 98/02565中。用于转化P.methanolica的DNA分子常制备为双链、环状质粒，在转化之前优选地将质粒线形化。对于P.methanolica中的多肽合成，优选的是质粒中的启动子和终止子是P.methanolica基因如P.methanolica醇利用基因(AUG1或AUG2)的启动子和终止子。其它有用的启动子包括二羟丙酮合酶(DHAS)、甲酸脱氢酶(FMD)、过氧化氢酶(CAT)基因。为有助于DNA整合入宿主染色体，优选的是在质粒完整表达片段两端侧翼含有宿主DNA序列。用于Pichiamethanolica的优选选择性标记是P.methanolica ADE2基因，它编码磷酸核糖基-5-氨基咪唑羧化酶(AIRC；EC 4.1.1.21)，此酶使ade2宿主能在缺少腺嘌呤时生长。对于大量工业生产，优选的是使用已删除两个甲醇利用基因(AUG1和AUG2)的宿主细胞。为生产分泌的蛋白，优选的是使用液泡蛋白酶基因(PEP4和PRB1)缺陷的宿主细胞。使用电穿孔以有助于将含有编码目的多肽的DNA的质粒导入P.methanolica细胞。优选的是通过使用具有2.5-4.5kV/cm、优选地约3.75kV/cm电场和1-40毫秒、最优选地约20毫秒时间常数(t)的指数衰减的脉冲电场电穿孔来转化P.methanolica细胞。

原核宿主细胞包括细菌大肠杆菌、芽孢杆菌和其它属的菌株也可用作本发明的宿主细胞。转化这些宿主和表达外源DNA序列的技术在本领域内已知(参见例如Sambrook等，同上)。当在细菌如大肠杆菌中表达zsig44多肽时，多肽通常可以作为不溶性颗粒存留在胞质中或可以通过细菌分泌序列导入周质间隙。在前一种情况下，裂解细胞并回收颗粒，并且使用例如异硫氰酸胍或尿素等变性。然后变性的多肽可以通过稀释变性剂，例如通过逆着尿素等溶液以及还原的和氧化的谷胱甘肽的混合物透析，接着逆着缓冲盐溶液透析而重新折叠并形成二聚体。在后一种情况下，通过破碎细胞(通过例如超声波处理或渗透休克)释放周质间隙的内容物并回收蛋白可以从周质间隙回收可溶和有功能形式的多肽，从而避免变性和重新折叠的需要。

将P.methanolica细胞于约25℃-35℃温度培养在包含充足碳、氮和微量元素的培养基中。通过传统方法如振荡小培养瓶或发酵罐喷射向液体培养物提供充足的通风。优选的P.methanolica培养基是YEPD[2％D-葡萄糖、2％Bacto^TM蛋白胨(Peptone)(DifcoLaboratories，Detroit，MI)、1％Bacto^TM酵母提取物(DifcoLaboratories)、0.004％腺嘌呤和0.006％L-亮氨酸]。

优选的是将蛋白纯化至＞80％纯度，更优选至＞90％纯度，甚至更优选＞95％，并且特别优选的是药物纯化状态，即就污染的大分子、尤其是其它蛋白和核酸来说，纯度＞99.9％，并且不含感染和致热因子。优选地，纯化的蛋白基本上不含其它蛋白，尤其是动物来源的其它蛋白。

表达的重组zsig44多肽(或嵌合的zsig44多肽)可以使用分级分离和/或传统纯化方法及介质纯化。硫酸铵沉淀和酸或离液剂抽提物可以用作分级分离的样品。典型的纯化步骤可以包括羟基磷灰石层析、大小排阻层析、FPLC和反相高效液相层析。适当的层析介质包括衍生的葡聚糖、琼脂糖、纤维素、聚丙烯酰胺、特殊性能硅石等。优选的是PEI、DEAE、QAE和Q衍生物。典型的层析介质包括那些用苯基、丁基或辛基衍生的那些介质，例如苯基-SepharoseFF(Pharmacia)、东洋珍珠丁基650(Toso Haas，Montgomeryville，PA)、辛基-Sepharose(Pharmacia)等；或聚丙烯树脂如Amberchrom CG 71(Toso Haas)等。适当的固体支持物包括玻璃珠、硅基树脂、纤维素树脂、琼脂糖珠、交联琼脂糖珠、聚苯乙烯珠、交联聚丙烯酰胺树脂等，它们在所用条件下是不可溶的。这些支持物可以用反应性基团进行修饰，反应性基团允许通过氨基、羧基、硫氢基、羟基和/或碳水化合物部分结合蛋白。偶联化学法的例子包括溴化氰活化、N-羟琥珀酰胺活化、环氧化物活化、巯基活化、酰肼活化及对碳二亚胺偶联化学法的羧基和氨基衍生物。这些和其它固体介质在本领域内众所周知并广泛应用，并可以从商业供应商获得。将受体多肽与支持物介质结合的方法在本领域内众所周知。特定方法的选择是一种常规设计，部分决定于所选支持物的特性。参见例如亲和层析：原理和方法，Pharmacia LKBBiotechnology，Uppsala，Sweden，1988。

本发明的多肽也可以利用其结构和物理特性分离。例如，固定金属离子吸附(IMAC)层析可用于纯化富集组氨酸的蛋白，包括那些含有多聚组氨酸标记物的蛋白。简单地说，首先用二价金属离子使凝胶带电以形成螯合物(E.Sulkowski，生物化学趋势，3∶1-7，1985)。取决于所使用的金属离子，富集组氨酸的蛋白以不同的亲和力吸附于此基质上，并通过竞争性洗脱、降低pH值或使用强螯合剂来洗脱。其它纯化方法包括通过凝集素亲和层析和离子交换层析纯化糖基化蛋白(酶学方法，第182卷，“蛋白纯化指南”，M.Deutscher(编辑)，学术出版社，San Diego，1990，第529-539页)。在本发明的另一实施方案中，可以构建目的多肽与亲和标记物(如多聚组氨酸、麦芽糖结合蛋白、免疫球蛋白结构域)的融合体以利于纯化。

而且，利用本领域描述的方法，可以使用本发明的区域或结构域结合其它已知离子通道(如MAT、PLM和IsK)或异源蛋白的区域或结构域构建多肽融合或杂合zsig44离子通道蛋白(Sambrook等，同上；Altschul等，同上；Picard D.，Cur.Opin.，Biology，5.511-515，1994以及其中的参考文献)。这些方法使得可以测定目的多肽中更大结构域或区域的生物学重要性。这样的杂合可改变反应动力学、结合、收缩或扩大底物特异性，或者改变多肽的组织和细胞定位，并可应用于未知结构的多肽。

融合蛋白可用本领域熟练技术人员已知的方法通过制备融合蛋白的每个成分并将它们化学连接来制备。选择性地，编码正确阅读框中的融合蛋白的每个成分的多核苷酸可以用已知技术制备并用此处所述的方法表达。例如，可以在本发明的zsig44和来自另一离子通道如MAT-8或IsK的有功能等价结构域之间交换赋予生物学功能的结构域的部分或全部。这样的结构域包括但不限于此处所述的分泌信号序列、跨膜结构域、中心结构域和中心结构域侧翼的区域。取决于要构建的融合，预计这样的离子通道具有与本发明的多肽或其它已知离子通道蛋白(如MAT-8、CHIF或IsK)相同或相似的生物功能模式。而且，这样的融合蛋白可能表现此处公开的其它特性。

zsig44多肽或其片段也可以通过化学合成制备。zsig44多肽可以是单体或多聚体；糖基化或非糖基化；pegylated或non-pegylated；可以包含或不包含起始的甲硫氨酸残基。

本发明的多肽也可通过固相合成、部分固相方法、片段缩合或传统的溶液合成来合成。合成多肽的方法在本领域众所周知。参见例如，Merrifield，美国化学学会杂志85：2149，1963；Kaiser等，生物化学分析34：595，1970。在固相载体上完全合成目的肽之后，用可从树脂上将多肽切割下来的试剂处理肽-树脂并去除大部分侧链保护基团。这样的方法在本领域内已非常成熟。

本发明分子的活性可以使用许多测定离子通道活性的分析法测定。特别感兴趣的是跨细胞膜的离子转移。这样的分析法在本领域内众所周知。评定新氯离子通道或它们的调节剂的活性的分析法包括但不限于测定非洲爪蟾卵母细胞中电压依赖性转运的生物分析(参见Rudy，B.和Iverson，L.E.编辑，酶学方法，第207卷，AcademicPress，San Diego，CA，1992；Hamill，O.P.等，PfluegersArch.391：85-100，1981；Moorman，J.R.等，生物化学杂志267：14551-14554，1992；Durieux，M.E.等，美国生理学杂志263：C896-C900，1992)。此方法包括将体外表达的mRNA注射入分离的卵母细胞并使用膜片钳技术评估电压依赖型转运。离子通道或其调节剂可以在此分析系统中增加电压依赖型转运。此系统可以应用于其它细胞类型如昆虫细胞和哺乳动物细胞(参见Rudy，B.，Iverson，L.E.编辑，同上)。其它分析包括借助使用螯合剂染料如Fura2间接测定哺乳动物或其它细胞类型中的离子通道活性(参见例如James-Kracke M.R.，普通生理学杂志99：41-62，1992；Raghu，P.等，基因190：151-156，1997)。离子通道活性也可以通过使用放射标记的离子如¹²⁵I流出分析法来监测(Xia，Y.等，膜生物学杂志151：269-279，1996)。其它分析法测定哺乳动物细胞中由离子通量或离子通道磷酸化作用发出信号的基因表达的变化；例如通过在适当启动子如下述启动子下启动可测定报告基因荧光素酶基因的表达。

分析本发明蛋白活性的可选体内方法包括病毒转移系统。用于此目的的病毒例子包括腺病毒、疱疹病毒、牛痘病毒和腺伴随病毒(AAY)。双链DNA病毒腺病毒是目前得到最佳研究的转移外源核酸的基因转移载体(综述参见T.C.Becker等，细胞生物学方法学43：161-89，1994以及J.T.Douglas和D.T.Curiel，科学&医学4：44-53，1997)。腺病毒系统提供几个优点：腺病毒可以(i)容纳相对大的DNA插入；(ii)培养到高滴度；(iii)感染广谱的哺乳动物细胞类型；(iv)与含有不同启动子的大量可用载体一起使用。同时，因为腺病毒在血流中稳定，它们可以通过静脉注射施用。

通过删除腺病毒基因组的部分，可以容纳大的外源DNA插入片段(高达7kb)。这些插入片段可以通过连接或通过用共转染质粒同源重组掺入病毒DNA。在典型的系统中，从病毒载体删除必需E1基因，并且病毒将不会复制，除非宿主提供E1基因(例如人293细胞系)。当静脉注射给完整动物时，腺病毒主要靶向肝。如果腺病毒转移系统缺乏E1基因，病毒就不能在宿主细胞中复制。然而，宿主组织(如肝)将表达和加工(并且如果存在分泌信序列，分泌)外源蛋白。分泌的蛋白将进入高度囊泡化肝中的循环，并且可以测定对侵染的动物的影响。

腺病毒系统也可用于体外蛋白合成。通过在细胞不迅速分化的条件下培养腺病毒侵染的非293细胞，细胞可在延长的时期内合成蛋白。例如，将BHK细胞培养至铺满细胞瓶，然后与编码目的分泌蛋白的腺病毒载体接触。然后在无血清条件下培养细胞，这种条件，使侵染的细胞能在不明显分化的情况下存活几周。选择性地，腺病毒载体侵染的293S细胞可以相当高的细胞密度在悬浮培养物中培养以合成大量蛋白(见Garnier等，细胞技术15：145-55，1994)。用任一方法，都可以从细胞培养物上清液重复分离表达的、分泌的外源蛋白。在感染的293S细胞合成方法中，非分泌的蛋白也可以有效地获得。

zsig44的组织分布表明其在肾或骨髓功能中的作用。zsig44可作用为骨髓、肾或其它组织如心和脊髓中的新氯离子通道或调节已存在或未知的离子通道。例如，已知上面公开的几种CLC氯离子通道或CLC-1和CLC-L人同系物是肾特异的，并且可能受zsig44调节。而且，zsig44可能在与遗传和其它人体疾病状态如糖尿病、肾结石、骨病、造血失调、免疫失调、白血病、高血压、心脏病和神经疾病有关的肾、骨髓、心和/或神经病理学中起作用。zsig44活性的拮抗剂或兴奋剂的发现将提供zsig44多肽的治疗用途。根据所观察到的此zsig44的组织分布，兴奋剂(包括天然配体、底物、辅因子等)和拮抗剂具有体外和体内应用潜力。

本发明的蛋白也用于以细胞为基础筛选zsig44的调节剂(例如拮抗剂和兴奋剂)。拮抗剂和兴奋剂可以几种方式如调节活性、基因表达、与其它离子通道或离子通道亚单位结合影响zsig44(Kim，J.W.等，生物化学和生物物理学报350：133-135，1997)。这样的拮抗剂和兴奋剂可以分别通过降低或增加经离子通道的离子转运；或者通过影响zsig44对其它离子通道的推测调节功能或影响zsig44或其亚基作为直接离子通道的活性来影响zsig44多肽。这种增加或降低通过评估电压依赖型转运或用本领域内已知的另一适当分析系统来测定。在这样的应用中，zsig44单独表达或与由本发明多肽调节的指示剂离子通道共表达。构建这样的细胞的方法在本领域内已知并在此处公开。优选的指示剂离子通道具有可稳定测量的生物学活性如可测量的电压转运或用荧光螯合剂染料如Fura指示的钙通量。这样的活性分析在本领域内已知。通过在与下述各种试剂接触后筛选细胞的电压转运成钙通量来鉴定拮抗剂和兴奋剂。电压转运或指示剂变化反映出相对不用试剂处理对照细胞，试剂通过增强或抑制zsig44活性对zsig44发挥的活性。例如，相对于对照，增加zsig44活性的兴奋剂将导致增加的转运。相反，相对于对照，降低zsig44活性的拮抗剂将引起降低的转运。试剂来源包括任何天然或化学来源，包括但不限于植物、微生物和真菌提取物、化学品库以及组合化学品库等。建立和使用这种以细胞为基础的筛选分析的方法在本领域内已知。

zsig44也可用于鉴定其活性的调节剂(如拮抗剂)。将测试化合物加入此处公开的分析中以鉴定抑制zsig44活性的化合物。除了此处公开的这些分析法，在一系列设计用于测定zsig44结合、寡聚化或zsig44依赖型细胞反应的刺激作用/抑制作用的分析法中，可以对样品进行抑制zsig44活性的测试。例如，可以用对zsig44刺激的细胞通路有反应的报告基因构建体转染zsig44反应性细胞系。此类报告基因构建体在本领域内已知，并且一般将包含与编码分析可检测的蛋白如荧光素酶的基因可操作连接的zsig44-DNA反应元件。DNA反应元件可以包括但不限于环AMP反应元件(CRE)、激素反应元件(HRE)、胰岛素反应元件(IRE)(Nasrin等，美国国家科学院院报87：5273-5277，1990)和血清反应元件(SRE)(Shaw等，Cell56：563-572，1989)。环AMP反应元件综述于Roestler等，生物化学杂志263(190)：9063-9066；1988和Habener，分子内分泌学4(8)：1087-1094；1990。激素反应元件综述于Beato，细胞56：335-344；1989。测试候选化合物、溶液、混合物或提取物由报告基因表达的zsig44刺激作用降低所证明的对靶细胞抑制zsig44活性的能力。此类分析将检测例如通过二聚体形成直接阻断zsig44与细胞表面结合的化合物以及阻断这样的结合之后的细胞通路中进程的化合物。选择性地，使用可检测标记物(如¹²⁵I、生物素、辣根过氧化酶、FITC等)标记的zsig44，可以测试化合物或其它样品对zsig44的直接阻断或对zsig44与其它细胞表面分子结合的阻断。在此类分析中，测试样品抑制标记的zsig44与另一蛋白结合的能力可以作为抑制活性的指示标志，这一点可以通过第二种分析来证实。

zsig44多肽也可用于制备与zsig44表位、肽或多肽特异结合的抗体。将zsig44或其片段作用为抗原(免疫原)接种动物并引发免疫反应。适当的抗原是由SEQ ID NO：2的氨基酸数17(Leu)-氨基酸数89(Cys)编码的成热zsig44多肽或其9-89氨基酸的连续片段。另外，适当的抗原包括中心结构域即SEQ ID NO：2的氨基酸残基30(Pro)-氨基酸残基64(Lys)以及其侧翼序列即SEQ ID NO：2的残基17(Leu)-残基28(Asp)和残基65(Ser)-残基89(Cys)。而且，以zsig44多肽的疏水性图为基础推测的抗原片段也可以作用为制备抗体的适当抗原。从此免疫反应制备的抗体可以如此处公开的得到分离和纯化。制备和分离多克隆和单克隆抗体的方法在本领域内众所周知。参见例如免疫学常用方法，Cooligan等(编辑)，NationalInstitutes of Health，John Willey和Sons，Inc.，1995；Sambrook等，分子克隆：实验室手册，第二版，冷泉港，纽约，1989以及Hurrell，J.G.R.编辑，单克隆杂交瘤抗体：技术和应用，CRC出版社，Inc.，Boca Raton，FL，1982)。

多克隆抗体可以通过用zsig44多肽或其片段免疫接种温血动物如马、牛、山羊、绵羊、狗、鸡、兔、小鼠和大鼠中来制备，这一点对于本领域普通技术人员来说是显而易见的。

通过使用佐剂如明矾(氢氧化铝)或弗氏完全或不完全佐剂可以增加zsig44多肽的免疫原性。对免疫有用的多肽也包括融合多肽如与免疫球蛋白多肽或与麦芽糖结合蛋白触合的zsig44或其部分的融合体。多肽免疫原可以是全长分子或其部分，例如肽或可溶性zsig44蛋白。如果多肽部分是“半抗原样的”，为了免疫接种，此部分可以有利地与大分子载体[如钥孔血蓝素(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)或破伤风类毒素]结合或连接。

如本文所用的，术语“抗体”包括多克隆抗体、亲和纯化的多克隆抗体、单克隆抗体和抗原结合片段如F(ab’)₂和Fab蛋白水解片段。也包括遗传工程的完整抗体或片段如嵌合抗体、Fv片段、单链抗体等以及合成的抗原结合肽和多肽。通过将非人类CDR移植到人构架和稳定区上或通过掺入整个非人类可变结构域(选择性地通过置换暴露的残基用人样表面“覆盖”它们，其中结果是“覆盖的”抗体)使非人类抗体人类化。在一些例子中，人类化抗体可以在人可变区构架区内容留非人残基以增强正确的结合特性。借助人类化抗体，可以提高生物半衰期，并且在施用于人体时减少不利免疫反应的可能。

此处对产生或选择抗体有用的其它技术包括在体外使淋巴细胞与zsig44蛋白或肽接触以及在噬菌体或类似载体中选择抗体展示文库(例如通过固定的或标记的zsig44蛋白或肽的使用)。编码具有潜在zsig44多肽结合结构域的多肽的基因可以通过筛选噬菌体(噬菌体展示)或细菌如大肠杆菌上展示的随机肽文库得到。编码这些多肽的核苷酸序列可以以多种方式，例如通过随机诱变和随机多核苷酸合成得到。一般情况下，这些随机肽展示文库可用于筛选与已知靶相互作用的肽，已知靶可以是蛋白或多肽如配体或受体、生物大分子或合成的大分子、或者有机或无机物质。制备和筛选这样的随机肽展示文库的技术在本领域中已知(Ladner等，美国专利NO.5,223,409；Ladner等，美国专利NO.4,946,778；Ladner等，美国专利NO.5,403,484和Ladner等，美国专利NO.5,571,698)，并且随机肽展示文库和筛选这样的文库的试剂盒可例如从Clontech(Palo Alto，CA)，Invitrogen Inc.(San Diego，CA)，New England Biolabs，Inc.(Beverly，MA)和pharmaciaLKB Biotechnology Inc.(Piscataway，NJ)商业购买。可以使用此处公开的zsig44序列筛选随机肽展示文库以鉴定与zsig44结合的蛋白。这些与zsig44多肽相互作用的“结合蛋白”可用于标记细胞、用于通过亲和纯化分离同系物多肽；它们可直接或间接与药物、毒素、放射性核素等偶联。这些结合蛋白也可用于分析方法如筛选表达文库和中和活性。这些结合蛋白也可用于诊断分析以测定多肽的循环水平；用于检测或定量测定作为潜在病理学或疾病标记的可溶性多肽。这些结合蛋白也可作用为zsig44“拮抗剂”在体内和体外阻断zsig44结合、多聚体形成或zsig44介导的细胞-细胞相互作用以及信号转导。

如果抗体：1)表现结合活性的阈值水平，和/或2)它们不与相关多肽分子显著交叉反应，那么这些抗体可确定为特异地结合。首先，如果抗体与zsig44多肽、肽或表位以至少比与对照(非zsig44)多肽大10倍的亲和性结合，那么此时抗体是特异地结合。优选的是抗体表现10⁶M^-1或更高的、优选地10⁷M^-1或更高的、更优选地10⁸M^-1或更高的、最优选10⁹M^-1或更高的结合亲和性(Ka)。抗体结合亲和性很容易由本领域普通技术测定，例如通过Scatchard分析(Scatchard，G.，Ann.NY Acad.Sci.51：660-672，1949)。

其次，如果抗体不与相关多肽显著交叉反应，那么抗体可确定为特异地结合。例如，如果它们使用Western印迹分析(Ausubel等，同上)检测到zsig44而不是已知的相关蛋白，那么抗体不与相关多肽分子显著交叉反应。已知的相关多肽的例子是种同系物，例如CHIF(SEQ ID NO：3)；Paralog，例如其它已知人离子通道如MAT-8(SEQ ID NO：4)；突变的zsig44多肽以及其它相关离子通道或它们的调节剂。而且可以针对已知相关多肽筛选抗体以分离与本发明多肽特异结合的群体。例如，使针对zsig44产生的抗体吸附在固着在不溶性基质上的相关多肽上。在适当缓冲液条件下，对zsig44特异的抗体将通过基质流出。这样的筛选使得可以分离不与紧密相关多肽交叉反应的多克隆抗体和单克隆抗体(抗体：实验室手册，Harlow和Lane(编辑)，冷泉港实验出版社，1988；免疫学常用方法，Cooligan，等(编辑)，National Institutes of Health，John Wiley和Sons，Inc.，1995)。特异抗体的筛选和分离在本领域众所周知。参见基础免疫学，Paul(编辑)，Raven Press，1993；Getzoff等，免疫学进展43：1-98，1988；单抗体克隆：原理和实践，Goding，J.W.(编辑)，Academic press Ltd.，1996；Benjamin等，免疫学年鉴2：67-101，1984。

本领域技术人员已知的各种分析法可用于检测与zsig44蛋白或肽特异结合的抗体。典型的分析法详细描述于抗体：实验室手册，Harlow和Lane(编辑)，冷泉港实验室出版社，1988。这些分析的代表性例子包括：合并的免疫电泳、放射免疫分析、放射免疫沉淀、酶联免疫吸附分析(ELISA)、点印迹或Western印迹分析、抑制或竞争分析和三明治实验。此外也可以筛选抗体与野生型/突变型zsig44蛋白或多肽的结合。

针对zsig44的抗体可用于标记表达zsig44的细胞；用于通过亲和纯化分离zsig44；用于测定zsig44多肽循环水平的诊断分析；用于检测或定量测定zsig44多核苷酸或多肽作为潜在病理学或疾病的标记；用于采用FACS的分析方法，用于筛选表达文库；用于制备抗基因型抗体；以及用作中和抗体或拮抗剂以在体外和体内阻断zsig44活性。适当的直接标记物或标记包括放射性核素、酶、底物、辅因子、抑制剂、荧光标记、化学发光标记、磁粒子等；间接标记物或标记涉及使用生物素-抗生物素蛋白或其它互补/反互补对作为中间体。此处抗体也可以直接或间接与药物、毒素、放射性核素等偶联，并且将这些偶联物用于体内诊断或治疗应用。而且，抗zsig44的抗体或其片段可在体外使用以在分析法如Western印迹或其它本领域已知分析法中检测变性的zsig44或其片段。

本发明的多核苷酸也可用于检测与疾病或其它人体特性有关的人染色体10上的异常。本发明的多核苷酸定位在人染色体10上的10q11.1区。zsig44基因在WICGR放射杂交图上定位在从人染色体10连锁群顶端的308.19cR_3000。近端和远端构架标记(frameworkmarker)分别是NIB353和AFMB032YH1。使用周围标记将zsig44定位于完整LDB染色体10图谱上的10q11.1区中。

本发明也提供发现可用诊断应用的试剂。例如，zsig44基因、含有zsig44 DNA或RNA或其亚序列的探针可用测定zsig44基因是存在于染色体10上还是缺失或是否出现了突变。在zsig44基因基因座上可检测的染色体异常包括但不限于非整倍性、基因拷贝数变化、插入、缺失、限制性位点改变以及重排。这样的异常可以使用本发明的多核苷酸、通过利用分子遗传技术如限制性片段长度多态性(RFLP)分析、使用PCR技术的短串联重复(STR)分析以及本领域已知的其它遗传连锁分析技术(Sambrook等，同上；Ausubel等，同上；Marian，A.J.，Chest，108：255-265，1995)来检测。

本发明的分子将可用于诊断遗传染色体异常。本发明的多肽、核酸和/或抗体可用于治疗与糖尿病、骨病或白血病有关的疾病。本发明的分子可用于调节其它离子通道或用于治疗在这样的分布组织如肾、骨髓和心脏中的病理学症状或预防其发展。特别是可以对某些遗传综合症和其它人体疾病进行这样的诊断、治疗或预防。

经遗传操作表达zsig44基因的转基因小鼠以及表现完全缺乏zsig44基因功能的、称为敲除小鼠(Snouwaert等，科学257：1083，1992)的小鼠也以得到制备(Lowell等，自然366：740-42，1993)。这些小鼠可以用于在体内系统中研究zsig44基因并由此研究编码的蛋白。

编码zsig44多肽的多核苷酸可用于需要增加或抑制zsig44活性的基因治疗应用。如果哺乳动物已突变或缺失了zsig44基因，那么可以将zsig44基因导入哺乳动物细胞。在一个实施方案中，将病毒载体中编码zsig44多肽的基因导入体内。这样的载体包括减毒的或缺陷型的DNA病毒，例如但不限于单纯疱疹病毒(HSV)、乳头瘤病毒、Epstein Barr病毒(EBV)、腺伴随病毒(AAV)等。优选的是完全或几乎完全缺失本发明病毒基因的缺陷型病毒。缺陷型病毒不形成有活力的侵染性病毒并且不能在导入细胞后再侵染。缺陷型病毒载体允许施用给特定局部区域中的细胞，而不必担心该载体可能侵染其它细胞。特定载体的例子包括但不限于缺陷型简单疱疹病毒1(HSV1)载体(Kaplitt等，Molec.Cell.Neurosci.，2：320-330，1991)，减毒的腺病毒载体如Stratford-Perricaudet等，临床研究杂志90：626-630(1992)所述的载体以及缺陷性腺伴随病毒载体(Samulski等，病毒学杂志61：3096-3101，1987；Samulski等，病毒学杂志63：3822-3828，1989)。

在另一实施方案中，zsig44基因可导入逆转录病毒载体，例如Anderson等，美国专利No.5,399,346；Mann等，细胞33：153，1983；Temin等，美国专利No.4,650,764；Temin等，美国专利No.4,980,289；Markowitz等，病毒学杂志62：1120，1988；Temin等，美国专利No.5,124,263；由Dougherty等于1995年3月16日公开的国际专利公开文本No.WO 95/07358以及Kuo等，血液，82：845，1993中描述。

选择性地，可以使用脂质体通过体内脂转染导入载体。合成的阳离子脂类可用于制备用于编码标记的基因的体内转染的脂质体(参见，Felgner等，美国国家科学院院报84：7413-7417，1987；Mackey等，美国国家科学院院报85：8027-8031，1988)。使用脂转染在体内将外源基因导入特定器官有某些实用的优点。脂质体分子靶向特定细胞代表一个受益的区域。更具体地，将转染导向特定细胞代表一个受益的区域。例如，将转染导向特定细胞类型将在具细胞异质性的组织如胰腺、肝、肾和脑中特别有利。为了靶向的目的，脂类可以与其它分子偶联。可以将定向肽如激素或神经递质和蛋白如抗体或非肽分子与脂质体化学偶联。

从身体中取出靶细胞、将载体作为裸DNA质粒导入、然后再将转化的细胞移入体内是可以的。用于基因治疗的裸DNA载体可以通过本领域已知的方法如转染、电穿孔、微量注射、转导、细胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸钙沉淀、使用基因枪或使用DNA载体运载蛋白导入目的宿主细胞。参见例如Wu等，生物化学杂志，267：963-967，1992；Wu等，生物化学杂志，263：14621-14624，1988以及Johnston和Tang，细胞生物学方法43：353-65(1994)。

本发明的另一方面包括与SEQ ID NO：1中所示多核苷酸的片段互补的反义多核苷酸成分。这样的合成反义多核苷酸设计以结合编码zsig44多肽的mRNA并抑制zsig44转录和这样的mRNA的翻译。这样的反义多核苷酸可用于在细胞培养物或实验对象中抑制编码zsig44多肽的基因的表达。

本发明的分子可用于鉴定和分离与zsig44相关或结合的离子通道蛋白。例如，本发明的蛋白和肽可固定在柱上并使膜制品通过柱(固定层析配体技术，Hermanson等编辑，Academic Press，SanDiego，CA，1992，第195-202页)。也可以对蛋白和肽进行放射性标记(酶学方法，第182卷，“蛋白纯化指南”，M.Deutscher编辑，Acad.Press，San Diego，1990，721-737)或光亲和标记(Brunner等，生物化学年鉴62：483-514，1993和Fedan等，Biochem.Pharmacol.33：1167-1180，1984)，并且特异的细胞表面蛋白可以得到鉴定。

实施例 实施例1  zsig44的鉴定 使用EST序列以得到全长zsig44

使用信号俘获作为查询程序扫描翻译的DNA数据库导致发现与人分泌信号序列同源的已表达序列标志(EST)序列的鉴定。从鉴定的EST序列设计寡核苷酸引物ZC 13，652(SEQ ID NO：12)和ZC 13，653(SEQ ID NO：13)。使用引物在EST中内部结合。组织来源的鉴定：

为鉴定含有EST的全长mRNA在其中表达的组织来源，使用对于EST多核苷酸序列特异的寡核苷酸(oligo)从几个人体组织(胎儿脑、骨髓、HUVEC、胎儿肺、淋巴结、胰腺、小肠、胃)扩增cDNA。约1ng来自不同组织来源的Marathon^TM备好即用cDNA(Clontech Laboratories，Inc.，Palo Alto，CA)用作聚合酶链式反应(RCR)中的模板，PCR反应使用根据EST序列设计的寡核苷酸。

PCR所用的条件是于94℃、5分钟的1个循环；于94℃、30秒，然68℃、4分钟的30个循环；4℃浸泡。在1.5％琼脂糖凝上分析PCR产物并仅在胎儿脑中观察到预期的200bp PCR产物。此组织来源胎儿脑鉴定为具有含有EST序列cDNA的高度可能性。其它测试的cDNA不能用寡核苷酸引物扩增。序列分析证实胎儿脑PCR产物序列是EST的序列。全长zsig44 cDNA的分离：

为得到全长cDNA，采用3’RACE。使用“marathon备好即用”人胎儿脑cDNA作为模板和AP-1(Clontech)和寡核苷酸ZC13，653(SEQ ID NO：13)作为引物制备3’RACE产物。此第一轮3’RACE PCR反应如下进行：于94℃、5分钟的1个循环；于94℃、30秒；然后68℃、4分钟的30个循环；4℃浸泡。取出1份3’RACE PCR产物并在1.5％琼脂糖凝上分析。在胶上看到多条条带。

将剩余的DNA稀释1∶100。进行第二轮嵌套式3’RACE PCR反应以扩增模板cDNA序列。此PCR反应使用设计与ZC 13，653(SEQ IDNO：13)退火的AP-2(Clontech)和寡核苷酸ZC 13，611(SEQ IDNO：14)。

此嵌套式PCR反应作为每个上面公开的第一轮3’RACE反应进行。将产生的DNA产物在1.5％琼脂糖凝胶上电泳并观察到约453bp的明显条带。凝胶纯化DNA条带并对其进行测序。序列分析揭示DNA产物包含EST DNA序列。而且，从3’RACE产物制备的此453bp序列是编码zsig44蛋白的全长cDNA。实施例2  组织分布

使用来自人Clontech(Palo Alto，CA)的多个组织印迹(MTNI，MTNII和MINIII)进行Northern印迹分析。将实施例1所述的453bp产物在1％琼脂糖凝胶上电泳，并将片段电洗脱，然后根据制造商说明用³²P-dCTP、使用随机引物Prime-It II标记系统(Stvatagene克隆系统，LaJolla，CA)对其进行放射性标记。然后根据制造商的说明书，使用Chroma Spin+TE-30 LC柱(Clontech)纯化探针。使用ExpressHyb^TM(Clontech)进行预杂交并作为Northern印迹分析的杂交溶液。杂交使用5×10⁶cpm/ml标记探针于65℃进行过夜。然后在2×SSC/1％SDS中于65℃洗涤印迹，接着在0.1×SSC/0.1％SDS中于55℃洗。在约1.0Kb处检测到一个转录物。肾和骨髓的信号密度最高。在印迹代表的其它任何组织中不存在1.0Kb处的信号。只在脊髓中观察到2.4Kb转录物，可能是zsig44的剪切变体。使用相同探针和Northern印迹分析条件，对来自各种组织的mRNA的点印迹进行分析。在心脏组织观察到最强的信号。

也使用人肿瘤一系列印迹I-VI(Invitrogen，San Diego，CA)进行Northern印迹分析。使用上面公开的453bp探针探测这些印迹。没有在任何肿瘤样品中检测到转录物。实施例3  以PCR为基础的zsig44基因的染色体作图

使用商购的GeneBridge 4放射杂交系列(Research Genetics，Inc.，Huntsville，AL)将zsig44定位到染色体10上。TheGeneBridge 4放射杂交系列含有分别来自93个放射杂交克隆的DNA和两个对照DNA(HFL供体和A23受体)。公众可得到的www服务器( http：//www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/contig/rhmapper.pl)相对于用GeneBridge  4放射杂交系列构建的WhiteheadInstitute/MIT基因组研究中心的人基因组放射杂交图(“WICGR”放射杂交图)来作图。

对于使用GeneBridge 4 RH系列的zsig44的作图，在96孔微量滴定板(Stratagene，La Jolla，CA)中设定20μl PCR反应并在RoboCycler Gradient 96热循环仪(Stratagene)中使用。95个PCR反应中的每一个含有2μl 10X KlenTaq PCR反应缓冲液(Clontech)1.6μl dNTP混合物(各2.5mM，PERKIN-ELMER，Foster City，CA)，1μl有义引物ZC 14，842(SEQ ID NO：15)，1μl反义引物ZC14，838(SEQ ID NO：16)，2μl RediLoad(Research Genetics，Inc.)，0.4μl 50X Advantage KlenTaq聚合酶混合物(Clontech)，25ng来自各个杂交克隆的DNA或对照和水，总体积02μl。用相同量的矿物油覆盖在反应物上并密封。PCR反应如下进行：于95℃变性5分钟的1个起始循环；于95℃变性1分钟，于62℃退火1分钟并于72℃延伸1.5分钟的35个循环；接着于72℃延伸7分钟的最后1个循环。通过在2％琼脂糖凝胶(Life Technologies，Gaithersburg，MD)上电泳分离反应物。

结果表明zsig44在WICGR放射杂交图上定位在从人染色体10连锁群的顶端308.49cR_3000。近端和远端构架标记分别是NIB353和AFMB032YH1。使用周围的标记将zsig44定位在完整LDB染色体10图谱的10q1.1区中(The Genetic Location Database，University of Southhampton，www服务器：http：//cedar.genetics.soton.ac.uk/public_html/)。

从前述应该理解，尽管为了举例说明的目的，本发明的具体实施方案已在此处得到描述，但是可以对其进行各种修饰，而不偏离本发明的精神和范围。因此除了随后的权利要求书所限定的之外，本发明不受其它限制。序列表

<110>ZymoGenetics，Inc.

<120>新的人离子通道ZSIG44

<130>97-45PC

<150>60/053,715

<151>1997-07-25

<160>16

<170>FastSEQ for Windows Version 3.0

<210>1

<211>451

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<220>

<221>CDS

<222>(4)…(270)

<400>1gac atg gag aga gtg acc ctg gcc ctt ctc cta ctg gca ggc ctg act       48

Met Glu Arg Val Thr Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Gly Leu Thr

 1               5                   10                  15gcc ttg gaa gcc aat gac cca ttt gcc aat aaa gac gat ccc ttc tac       96Ala Leu Glu Ala Asn Asp Pro Phe Ala Asn Lys Asp Asp Pro Phe Tyr

             20                  25                  30tat gac tgg aaa aac ctg cag ctg agc gga ctg atc tgc gga ggg ctc       144Tyr Asp Trp Lys Asn Leu Gln Leu Ser Gly Leu Ile Cys Gly Gly Leu

         35                  40                  45ctg gcc att gct ggg atc gcg gca gtt ctg agt ggc aaa tgc aaa tgc       192Leu Ala Ile Ala Gly Ile Ala Ala Val Leu Ser Gly Lys Cys Lys Cys

     50                  55                  60aag agc agc cag aag cag cac agt cct gta cct gag aag gcc atc cca       240Lys Ser Ser Gln Lys Gln His Ser Pro Val Pro Glu Lys Ala Ile Pro

 65                  70                  75ctc atc act cca ggc tct gcc act act tgc tgagcacagg actggcctcc        290Leu Ile Thr Pro Gly Ser Ala Thr Thr Cys80                  85agggatggcc tgaagcctaa cactggcccc cagcacctcc tcccctggga ggccttatcc    350tcaaggaagg acttctctcc aagggcaggc tgttaggccc ctttctgatc aggaggcttc    410tttatgaatt aaactcgccc caccaccccc tcaaaaaaaa a                        451

<210>2

<211>89

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>2Met Glu Arg Val Thr Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Gly Leu Thr Ala1               5                  10                  15Leu Glu Ala Asn Asp Pro Phe Ala Asn Lys Asp Asp Pro Phe Tyr Tyr

        20                  25                  30Asp Trp Lys Asn Leu Gln Leu Ser Gly Leu Ile Cys Gly Gly Leu Leu

    35                  40                  45Ala Ile Ala Gly Ile Ala Ala Val Leu Ser Gly Lys Cys Lys Cys Lys

50                  55                  60Ser Ser Gln Lys Gln His Ser Pro Val Pro Glu Lys Ala Ile Pro Leu65                  70                  75                  80Ile Thr Pro Gly Ser Ala Thr Thr Cys

            85

<210>3

<211>87

<212>PRT

<213>Rattus norvegicus

<400>3Met Glu Gly Ile Thr Cys Ala Phe Leu Leu Val Leu Ala Gly Leu Pro1               5                  10                  15Val Leu Glu Ala Asn Gly Pro Val Asp Lys Gly Ser Pro Phe Tyr Tyr

        20                  25                  30Asp Trp Glu Ser Leu Gln Leu Gly Gly Met Ile Phe Gly Gly Leu Leu

    35                  40                  45Cys Ile Ala Gly Ile Ala Met Ala Leu Ser Gly Lys Cys Lys Cys Arg

50                  55                  60Arg Asn His Thr Pro Ser Ser Leu Pro Glu Lys Val Thr Pro Leu Ile65                  70                  75                  80Thr Pro Gly Ser Ala Ser Thr

            85

<210>4

<211>87

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>4Met Gln Lys Val Thr Leu Gly Leu Leu Val Phe Leu Ala Gly Phe Pro1               5                  10                  15Val Leu Asp Ala Asn Asp Leu Glu Asp Lys Asn Ser Pro Phe Tyr Tyr

        20                  25                  30Asp Trp His Ser Leu Gln Val Gly Gly Leu Ile Cys Ala Gly Val Leu

    35                  40                  45Cys Ala Met Gly Ile Ile Ile Val Met Ser Ala Lys Cys Lys Cys Lys

50                  55                  60Phe Gly Gln Lys Ser Gly His His Pro Gly Glu Thr Pro Pro Leu Ile65                  70                  75                  80Thr Pro Gly Ser Ala Gln Ser

            85

<210>5

<211>92

<212>PRT

<213>Homo Sapiens

<400>5Met Ala Pro Leu His His Ile Leu Val Phe Cys Val Gly Leu Leu Thr1               5                  10                  15Met Ala Lys Ala Glu Ser Pro Lys Glu His Asp Pro Phe Thr Tyr Asp

        20                  25                  30Tyr Gln Ser Leu Gln Ile Gly Gly Leu Val Ile Ala Gly Ile Leu Phe

    35                  40                  45Ile Leu Gly Ile Leu Ile Val Leu Ser Arg Arg Cys Arg Cys Lys Phe

50                  55                  60Asn Gln Gln Gln Arg Thr Gly Glu Pro Asp Glu Glu Glu Gly Thr Phe65                  70                  75                  80Arg Ser Ser Ile Arg Arg Leu Ser Thr Arg Arg Arg

            85                  90

<210>6

<211>6

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>6Pro Phe Tyr Tyr Asp Trp1               5

<210>7

<211>6

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>7Gly Leu Ile Cys Gly Gly1               5

<210>8

<211>6

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>8Gly Ile Ala Ala Val Leu1               5

<210>9

<211>6

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>9Gly Lys Cys Lys Cys Lys1               5

<210>10

<211>8

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>10Pro Leu Ile Thr Pro Gly Ser Ala1               5

<210>11

<211>267

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>从zsig44氨基酸序列推出的简并序列

<400>11atggarmgng tnacnytngc nytnytnytn ytngcnggny tnacngcnyt ngargcnaay    60gayccnttyg cnaayaarga ygayccntty taytaygayt ggaaraayyt ncarytnwsn    120ggnytnatht gyggnggnyt nytngcnath gcnggnathg cngcngtnyt nwsnggnaar    180tgyaartgya arwsnwsnca raarcarcay wsnccngtnc cngaraargc nathccnytn    240athacnccng gnwsngcnac nacntgy                                        267

<210>12

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸引物：ZC13652

<400>12cagtcaggcc tgccagtagg agaa                                            24

<210>13

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸引物：ZC13653

<400>13cgcaggacac tggtgaggga gc                                              22

<210>14

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸引物：ZC13611

<400>14gtgacatgga gagagtgacc ctgg                                            24

<210>15

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸引物：AC14842

<400>15ctgccactac ttgctgag                                                      18

<210>16

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸引物：AC14838

<400>16gcctgccctt ggagagaa                                                     18

Claims (20)

1.编码zsig44多肽的分离的多核苷酸，包含与选自以下氨基酸序列的氨基酸序列至少90％同源的氨基酸残基序列：

(a)SEQ ID NO：2中所示氨基酸序列的残基数17(Leu)-残基数89(Cys)；并且

(b)SEQ ID NO：2中所示氨基酸序列的残基数1(Met)-残基数89(Cys)。

2.根据权利要求1所述的分离的多核苷酸，其中多核苷酸选自：(a)SEQ ID NO：1中所示多核苷酸序列的核苷酸52-核苷酸270；以及

(b)SEQ ID NO：1中所示多核苷酸序列的核苷酸4-核苷酸270。

3.根据权利要求1所述的分离的多核苷酸，其中多核苷酸包含SEQ ID NO：8的核苷酸1-核苷酸267。

4.根据权利要求1所述的分离的多核苷酸，其中zsig44多肽基本上由与SEQ ID NO：2中所示氨基酸序列的氨基酸数17(Leu)-氨基酸数89(Cys)至少90％同源的氨基酸残基序列组成。

5.根据权利要求4所述的分离的多核苷酸，其中zsig44多肽基本上由SEQ ID NO：2中所示氨基酸残基序列的氨基酸数17(Leu)-氨基酸数89(Cys)组成。

6.含有下列可操作连接元件的表达载体：

转录启动子；

编码与SEQ ID NO：2中所示氨基酸序列的氨基酸数17(Leu)-氨基酸数89(Cys)至少90％同源的zsig44多肽的DNA片段；以及

转录终止子。

7.根据权利要求6所述的表达载体，进一步包含与DNA片段可操作连接的分泌信号序列。

8.其中已导入根据权利要求6所述的表达载体的培养细胞，其中细胞表达DNA片段编码的多肽。

9.编码融合蛋白的DNA构建体，此DNA构建体包含：

编码与选自以下氨基酸序列的氨基酸残基序列至少90％同源的多肽的第一个DNA片段：

(a)SEQ ID NO：2的氨基酸序列的残基数1(Met)-残基数16(Ala)；

(b)SEQ ID NO：2的氨基酸序列的残基数17(Leu)-残基数28(Asp)；

(c)SEQ ID NO：2的氨基酸序列的残基数29(Pro)-残基数64(Lys)；

(d)SEQ ID NO：2的氨基酸序列的残基数65(Ser)-残基数89(Cys)；

(e)SEQ ID NO：2的氨基酸序列的残基数17(Leu)-残基数64(Lys)；

(f)SEQ ID NO：2的氨基酸序列的残基数29(Pro)-残基数89(Cys)；

(g)SEQ ID NO：2的氨基酸序列的残基数17(Leu)-残基数89(Cys)；以及

编码其它多肽的至少一个其它DNA片段，

其中第一个和其它DNA片段是框架内连接的；并且

编码融合蛋白。

10.按以下方法制备的融合蛋白，方法包括：

培养其中已导入含有以下可操作连接的单元的载体的宿主细胞：

(a)转录启动子；

(b)编码根据权利要求9所述的融合蛋白的DNA构建体；以及

(c)转录终止子；并且

回收DNA片段编码的蛋白。

11.一种分离的多肽，包含与选自以下氨基酸序列的氨基酸序列至少90％同源的氨基酸残基序列：

(a)包含SEQ ID NO：2中所示氨基酸序列的残基数17(Leu)-残基数89(Cys)；并且

(b)包含SEQ ID NO：2中所示氨基酸序列的残基数1(Met)-残基数89(Cys)。

12.根据权利要求11所述的分离的多肽，其中多肽进一步包含在构型M1-{6}-M2-{5}-M3-{1}-M4-{14}-PLITPGSA中从N端到C端间隔开的基序1-4和PLITPGSA基序。

13.根据权利要求11所述的分离的多肽，其中多肽基本上由与SEQ ID NO：2中所示氨基酸序列的氨基酸数17(Leu)-氨基酸数89(Cys)至少90％同源的氨基酸残基序列组成。

14.根据权利要求13所述的分离的多肽，其中氨基酸残基序列是SEQ ID NO：2中所示氨基酸残基序列的氨基酸数17(Leu)-氨基酸数89(Cys)。

15.合成zsig44多肽多肽的方法，包括：

培养根据权利要求8所述的细胞，；并且

分离细胞合成的zsig44多肽。

16.制备抗zsig44多肽抗体的方法，包括：

用选自以下多肽的多肽免疫接种动物：

(a)由9-89个氨基酸组成的多肽，其中多肽是与SEQ ID NO：2中连续氨基酸序列的氨基酸数17(Leu)-氨基酸数89(Cys)至少90％同源的多肽；

(b)根据权利要求11所述的多肽；

(c)具有与SEQ ID NO：2的残基数17(Leu)-残基数28(Asp)至少90％同源的氨基酸序列的多肽；

(d)具有与SEQ ID NO：2的残基数29(Pro)-残基数64(Lys)至少90％同源的氨基酸序列的多肽；

(e)具有与SEQ ID NO：2的残基数65(Ser)-残基数89(Cys)至少90％同源的氨基酸序列的多肽；

其中多肽在动物中引发免疫反应；并且

从动物中分离抗体。

17.用权利要求16的方法制备的抗体，此抗体与zsig44多肽结合。

18.权利要求16的抗体，其中抗体是单抗体克隆。

19.与权利要求11的多肽特异结合的抗体。

20.在测试样品中检测zsig44蛋白活性调节剂存在的方法，包括：

培养其中已导入根据权利要求6所述的表达载体的细胞，其中细胞在含有或不含有测试样品的情况下表达DNA片段编码的zsig44蛋白；并且

通过生物学或生物化学分析比较含有或不含有测试样品时zsig44的活性水平；并且

从比较中确定测试样品中zsig44活性调节剂的存在。

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