CN1268744C - 新的神经营养因子 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及神经胚活素神经营养因子多肽、编码神经胚活素多肽的核酸以及能特异性结合神经胚活素多肽的抗体，以及制备和使用这些物质的方法。

Description

新的神经营养因子
发明领域
本发明涉及神经营养因子多肽、编码神经营养因子多肽的核酸、以及能特异性结合神经营养因子的抗体。
发明背景
神经营养因子为天然生成的蛋白质，能促进存活，保持表型分化，防止变性，以及增强神经细胞及组织的活性。神经营养因子分离自神经组织及受神经系统支配的非-神经组织，并已经被分为功能及结构相关的组，也称为家族，超家族或亚家族。神经营养因子超家族中有成纤维细胞生长因子、神经营养蛋白、转化生长因子-β(TGF-β)超家族。根据它们的物理结构、它们与其复合受体间的相互作用以及它们对不同类型神经细胞的作用，神经营养因子被区分为各不相同的种类。神经胶质细胞系衍生出的神经营养因子配体(“GDNF”；WO 93/06116，在此引入作为参考)被归类入TGF-β超家族(Massague，et al，.1994，Trends in Cell Biology，4：172-178)，所述配体包括GDNF、persephin(“PSP”；Milbrandt et al.，1998，Neuron 20：245253，在此引入作为参考)和neurturin(“NTN”；WO 97/08196，在此引入作为参考)。GDNF亚家族的配体都能够通过RET受体酪氨酸激酶来引发信号传导。GDNF亚家族中的这三种配体与神经营养受体，GFRa受体，间的相对亲和力不同。
由于神经营养因子对神经组织的作用，所以有必要鉴定并定性其他神经营养因子用于诊断和治疗神经系统紊乱。
发明概述
本发明涉及一种在本申请中称之为“神经胚活素(neublastin)”或“NBN”的神经营养因子。神经胚活素由于与其他的GDNF配体(见表3和表4，下文)具有同源区域而被归类于GDNF亚家族，并且由于它能与RET相互作用(参见，例如Airaksinen et al.，Mol.Cell.Neuroscience，13，pp.313-325(1999))，所以神经胚活素是一种新的独特的神经营养因子。与其他GDNF配体不同，神经胚活素表现出对GFRa3-RET受体复合物的高亲和力，而且在其氨基酸序列中具有独特的亚区域。
本发明涉及NBN核酸及其编码的多肽。NBN多肽的活性形式为二聚体，单体基本上没有任何活性。一方面，本发明提供了一种截短的神经胚活素多肽，其中所述的截短的神经胚活素多肽与成熟的神经胚活素多肽相比缺失了1个或多个氨基末端的氨基酸。优选地，所述截短的神经胚活素多肽，以二聚体存在时，能结合RET多肽。优选地，所述截短的活性神经胚活素多肽导致RET多肽的二聚化。
在一些实施方案中，在SEQ ID NO：12所示神经胚活素多肽(成熟的113AA形式)对应的第16，43，47，80，81，109，和111位置处，所述截短的神经胚活素多肽包括7个半胱氨酸残基，对应于例如SEQ ID NO：9的第43，70，74，107，108，136，138位。对SEQ ID NO：9进行编号使得其-80至-1位的残基对应于翻译后NBN多肽的前原部分(prepro section)，残基1-140对应于成熟NBN140的140个氨基酸。这种编号方案仅仅是从便利角度出发，而并不能从其推导出涉及本发明公开的任意一种或多种前原、原、成熟或截短形式NBN。
本发明还涉及一种多肽，其氨基酸序列包括了截短的神经胚活素多肽的氨基酸序列。截短的神经胚活素多肽的氨基酸序列长度小于113氨基酸，并且包括与SEQ ID NO：9中第28-140位氨基酸具有至少70％同源性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述截短的神经胚活素多肽与SEQ ID NO：9中第42-140位氨基酸具有至少80％的同源性。更优选地，所述截短的神经胚活素多肽与SEQ ID NO：9中第42-140位氨基酸具有至少90％的同源性。甚至更优选地，所述截短的神经胚活素多肽与SEQ ID NO：9中第42-140位氨基酸具有至少95％的同源性。在另一实施方案中，所述截短的神经胚活素多肽与SEQ ID NO：9中第42-140位氨基酸具有至少99％的同源性。在最优选的实施方案中，所述截短的神经胚活素多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO：9中的第42-140位的氨基酸。在一些实施方案中，所述截短的神经胚活素多肽的氨基酸序列基本上由SEQ ID NO：48的99个氨基酸组成。
在一些实施方案中，所述截短的神经胚活素多肽与SEQ ID NO：9中第39-140位氨基酸具有至少80％的同源性。优选地，所述截短的神经胚活素多肽与SEQ ID NO：9中第39-140位氨基酸具有至少90％的同源性。更优选地，所述截短的神经胚活素多肽与SEQ ID NO：9中第39-140位氨基酸具有至少95％的同源性。在最优选的实施方案中，所述截短的神经胚活素多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO：9中的第39-140位的氨基酸。在另一实施方案中，所述截短的神经胚活素多肽与SEQ ID NO：9中第39-140位氨基酸具有至少99％的同源性。在一些实施方案中，所述截短的神经胚活素多肽的氨基酸序列基本上由SEQ ID NO：45的102个氨基酸组成。
在其他的实施方案中，所述的截短的神经胚活素多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：9中的第29-140位氨基酸具有至少80％、90％、95％或99％的同一性，基本上由112个氨基酸组成。在其他可选择的实施方案中，上述的同一性或同源性百分比针对的是SEQ ID NO：9中的30-140、SEQ ID NO：9中的31-140、SEQ ID NO：9中的32-140、SEQ ID NO：9中的33-140、SEQID NO：9中的34-140、SEQ ID NO：9中的35-140、SEQ ID NO：9中的36-140、SEQ ID NO：9中的37-140、SEQ ID NO：9中的38-140、SEQ ID NO：9中的40-140或SEQ ID NO：9中的41-140位氨基酸。在这些实施方案中，所述截短的神经胚活素多肽的氨基酸序列分别基本由111、110、109、108、107、106、105、104、103、101或100个氨基酸组成。在具体的实施方案中，所述的截短的神经胚活素多肽为SEQ ID NOS：35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47或48中任一所示的多肽。
所述的截短的神经胚活素多肽可通过下述方法获得：提供一成熟的神经胚活素多肽如NBN113，让该成熟的神经胚活素多肽与至少一种蛋白酶在足以制备出截短的神经胚活素多肽的条件下接触。优选地，所述的截短的神经胚活素多肽的制备方式为通过让成熟的神经胚活素多肽与至少一种外蛋白酶(exoprotease)接触而得到的外蛋白酶神经胚活素多肽消化产物。优选的蛋白酶是氨基肽酶、Endo Lys C及胰蛋白酶中的任一种。在一些实施方案中，所述方法包括进一步让所述外肽酶神经胚活素多肽消化产物与二肽肽酶接触。
在一些实施方案中，所述截短的神经胚活素多肽是一种糖基化多肽。在其他实施方案中，所述截短的神经胚活素多肽未糖基化。
本发明还涉及一种包括多肽的核酸，该多肽包括截短的神经胚活素多肽的氨基酸序列。在一些实施方案中，该核酸能够在高严谨溶液杂交条件下与编码神经胚活素多肽变体的核酸杂交。
所述编码截短的神经胚活素多肽的核酸的使用可以为将该核酸导入细胞从而使得该核酸所编码的多肽在细胞中得以表达。如果需要，该方法可包括下述步骤：将该核酸施用给动物，从而使得所述多肽表达于该动物中。
所述编码截短的神经胚活素多肽的核酸可以以载体的形式提供，例如表达载体。所述载体可用于表达所编码的截短的神经胚活素多肽。
本发明还包括一种用编码多肽的核酸转化后的细胞，该多肽包括截短的神经胚活素多肽。所述细胞可为例如哺乳动物细胞、真菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞及细菌细胞。优选的哺乳动物细胞是中华仓鼠卵巢细胞，或者是衍生自哺乳动物中枢神经系统的细胞。
另一方面，本发明包括一种通过表达编码截短的神经胚活素多肽的核酸制备截短的神经胚活素多肽的方法。优选地，该方法包括将包括所述核酸的细胞培养于培养基中从而使截短的神经胚活素多肽得以产生的步骤。该方法还可包括从培养基回收多肽的步骤。本发明还提供了通过该方法获得的截短的神经胚活素多肽(例如，一种纯化后的蛋白)。
本发明还提供了一种药用组合物，其包括截短的神经胚活素多肽和药物学上可接受的载体。本发明还提供了一种药用组合物，其中包括编码截短的神经胚活素多肽的核酸和药物学上可接受的载体。
在另一方面，本发明提供了一种将多肽输送到分离的细胞或哺乳动物(例如人)体内而施用截短的神经胚活素多肽的方法。优选地，所述的体内施用包括全身施用。所述哺乳动物患有病症，例如缺血性神经元损伤(ischemicneuronal damage)、创伤性脑损伤、外周神经病、神经病性疼痛(neuropathicpain)、阿耳茨海默氏病，亨廷顿舞蹈病，帕金森氏症，肌萎缩性(脊髓)侧索硬化，以及记忆力减退。在一些实施方案中，所述哺乳动物患有外周神经系统、延髓或脊髓神经元紊乱。
本发明还提供了一种通过向哺乳动物施用编码截短的神经胚活素多肽的核酸治疗哺乳动物神经变性疾病或病症的方法。
本发明还提供了一种通过向动物施用截短的神经胚活素多肽治疗动物神经变性疾病或病症的方法。另一方面，本发明提供了一种用于治疗哺乳动物外周神经病的方法，该方法包括向该哺乳动物施用治疗有效量的截短的神经胚活素多肽。所述的外周神经病可为，例如，一种或多种创伤导致的神经病、病毒引发的神经病、化疗导致的神经病、毒素引发的神经病、药物导致的神经病、维生素缺乏导致的神经病、自发性神经病以及糖尿病性神经病。在一些实施方案中，所述截短的神经胚活素多肽被直接递送入中枢神经系统。其他实施方案中，优选通过皮下注射，肌肉内、静脉内施用或者静脉内灌输将截短的神经胚活素多肽输送到全身。
本发明还提供了一种治疗哺乳动物神经病性疼痛的方法，该方法包括向该动物施用治疗有效量的截短的神经胚活素多肽。在一些实施方案中，神经病性疼痛与毒素引发的神经损伤、病原体引发的神经损伤、炎症引发的神经损伤或神经变性相关。
另一方面，本发明描述了一种通过向哺乳动物施用治疗有效量的编码截短的神经胚活素多肽的核酸治疗外周神经病的方法。所述的外周神经病优选是一种或多种创伤导致的神经病、化疗导致的神经病、毒素引发的神经病、病毒引发的神经病、药物导致的神经病、维生素缺乏导致的神经病、自发性神经病以及糖尿病性神经病。优选地，所述编码截短的神经胚活素多肽的核酸被直接输送到中枢神经系统。优选地，所述编码截短的神经胚活素多肽的核酸通过皮下注射，静脉内施用或者静脉内灌输被输送到全身。
本发明还提供了一种试剂盒，其中包括，一个或多个容器，选自截短的神经胚活素多肽或编码截短的神经胚活素多肽的核酸的物质。
本发明使用的“神经胚活素多肽”是指一种具有神经营养活性的多肽(例如，如实施例6，7，8，和9所述)，其中包括具有这样的氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与下列所示的人“神经胚活素”多肽具有至少70％同源性：SEQ ID NO：2中的AA-95-AA105、SEQ ID NO：2中的AA1-AA105、SEQ ID NO：4中的AA-97-AA140、SEQ ID NO：4中的AA-41-AA140(“原(pro)”)、SEQ ID NO：4中的AA1-AA140、SEQ ID NO：9中的AA-80-AA140、(“野生型”前原NBN)、SEQ ID NO：9中的AA-41-AA140(原NBN)、SEQ ID NO：5中的AA1-AA140(成熟的140AA)、SEQ ID NO：6中的AA1-AA116(成熟的116AA)、SEQ ID NO：7中的AA1-AA113(成熟的113AA)、SEQ ID NO：10中的AA1-AA140(成熟的140AA)、SEQ ID NO：11中的AA1-AA116(成熟的116AA)、SEQ ID NO：12中的AA1-AA113(成熟的113AA)，和SEQ ID NOs：35-48变体的截短多肽及其衍生物。此外，本发明还考虑到了那些多肽，其包含与SEQ ID NO：16中AA1-AA224所示小鼠“神经胚活素”多肽和SEQ ID NO：34中AA1-AA224所示大鼠“神经胚活素”多肽具有至少70％的同源性的氨基酸序列。
优选地，上述鉴定到的神经胚活素多肽的C-末端序列具有SEQ ID NO：2中AA72-AA105(即SEQ ID NO：9中的AA107-AA140)所示的氨基酸序列，更优选地，具有SEQ ID NO：2中AA41-AA105(即SEQ ID NO：9中的AA76-AA140)所示的氨基酸序列，或者具有SEQ ID NO：16或34中AA191-AA224所示的氨基酸序列。
另外，可优选所述神经胚活素多肽保留了GDNF家族和TGF-β超家族特征性的7个保守的Cys残基。所述的7个保守半胱氨酸残基位于SEQ IDNO：12所示神经胚活素多肽(成熟的113AA)的第16，43，47，80，81，109及111位。这些位置对应，例如，SEQ ID NO：9中的第43，70，74，107，108，136和138位，或者，例如，SEQ ID NO：16或34中的第127，154，158，191，192，220和222位。
优选地，所述神经胚活素多肽与上述序列具有大于85％的同源性，较优选具有大于90％的同源性，更优选具有大于95％的同源性，最优选具有大于99％的同源性，所述上述序列即，SEQ ID NO：2中的AA-95-AA105、SEQID NO：2中的AA1-AA105、SEQ ID NO：4中的AA-97-AA140、SEQ ID NO：4中的AA-41-AA140、SEQ ID NO：4中的AA1-AA140、SEQ ID NO：9中的AA-80-AA140、(“野生型”前原)、SEQ ID NO：9中的AA-41-AA140(原)、SEQ IDNO：5中的AA1-AA140(成熟的140AA)、SEQ ID NO：6中的AA1-AA116(成熟的116AA)、SEQ ID NO：7中的AA1-AA113(成熟的113AA)、SEQ ID NO：10中的AA1-AA140(成熟的140AA)、SEQ ID NO：11中的AA1-AA116(成熟的116AA)、SEQ ID NO：12中的AA1-AA113(成熟的113AA)、SEQ ID NO：16或34中的AA1-AA224、以及SEQ ID NOs：35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47和48(分别是截短的NBN112～NBN99)。
本发明使用的“神经胚活素的核酸”是指编码神经胚活素多肽的多核苷酸。因此，分离的核酸是一具有核苷酸密码子的开放阅读框的多核苷酸分子，当暴露于翻译所需的合适成分时，这些密码子就编码神经胚活素多肽。本发明的神经胚活素核酸可以是RNA或DNA，例如，基因组DNA，或互补于转录形式的DNA和/或转录形式，神经胚活素mRNA(“cDNA”)。因此，本发明的神经胚活素核酸进一步还包括在高度严谨杂交条件下能与编码神经胚活素多肽的多核苷酸特异性杂交的多核苷酸分子。本发明还涉及一种核酸引物，该引物可用于鉴定、分离及扩增编码神经胚活素多肽的多核苷酸，或其片段。本发明的一些实施方案中，这些引物中的一些是神经胚活素-特异性探针，这些探针能与神经胚活素核酸杂交，但不与编码GDNF家族的其他成员的核酸杂交。“特异性的”，“特异性”，或“特异性地”是指能与神经胚活素核酸杂交而不能与非-神经胚活素核酸杂交，包括不与唯一地编码其他GDNF配体(例如，GDNF，persephin，和neurturin)的核酸杂交。
在另一实施方案中，本发明的神经胚活素核酸为由于具有互补型核酸序列或者能在高度严谨条件下与编码神经胚活素的核酸特异性杂交而被鉴定为与编码神经胚活素多肽的多核苷酸互补的核酸。具体的神经胚活素核酸包括，但不限于，本发明给出的定名为SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3，SEQID NO：8，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30的核酸序列以及引物SEQ ID NOS：17-28，31和32。本发明的神经胚活素核酸进一步还包括神经胚活素核酸的独一无二的亚区域或片段，包括但不限于，图8中的核酸片段。
本发明所述的神经胚活素核酸可用于表达神经胚活素多肽，例如，体内表达神经胚活素多肽，或向动物施用神经胚活素核酸进行体内表达。神经胚活素核酸可包含在核酸载体中，例如，表达载体或克隆载体。神经胚活素核酸可以，但非必须，作为核酸载体的部分被保存、复制、转移或表达。可将含有神经胚活素多核苷酸序列的重组表达载体导入和/或保存在细胞内。可作为神经胚活素载体的宿主的细胞可以是原核细胞。可选择地，可将神经胚活素核酸导入真核细胞，例如，包含翻译后加工多肽为成熟蛋白的合适元件(apparati)，和/或适于分泌多肽入胞外环境的合适元件的真核细胞。
本发明描述了神经胚活素神经营养因子，“神经胚活素”。神经胚活素可以是多肽形式，或者为两个或多个神经胚活素多肽的多聚体，例如，神经胚活素二聚体。神经胚活素多肽通过本领域技术人员已知的分子间结构连接结合为多聚体，所述连接包括但不限于，半胱氨酸-半胱氨酸之间的互相作用，二硫键，和非共价相互作用。具体的神经胚活素多肽包括，但不限于，本发明公开并定名为SEQ ID NO：2；SEQ ID NO：4；SEQ ID NO：5；SEQID NO：6；SEQ ID NO：7；SEQ ID NO：9；SEQ ID NO：10；SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：34和SEQ ID NOS：35-48的氨基酸序列。优选地，本发明所述的神经胚活素多肽，当二聚化时，可结合RET。更优选地，本发明的神经胚活素多肽，当二聚化时，能引发RET的二聚化。细胞表面的RET二聚化能导致RET二聚体的自身磷酸化，并最终活化RET介导的胞内信号级联反应。
本发明的神经胚活素多肽可用于治疗神经元的缺陷，包括但不限于，损伤的神经元和创伤的神经元。遭受创伤的外周神经包括，但不限于，延髓或脊髓的神经。神经胚活素多肽可用于治疗神经变性疾病，例如，脑缺血性神经元损伤(cerebralischemic neuronal damage)；神经病，例如，外周神经病，阿耳茨海默氏病，亨廷顿舞蹈病，帕金森氏症，肌萎缩性(脊髓)侧索硬化(ALS)。另外，期望神经胚活素多肽用于治疗记忆力减退，例如，痴呆相关的记忆力减退。
病症或疾病的其他实例为外周神经系统、延髓或脊髓的紊乱，以及创伤导致的神经病、化疗导致的神经病、毒素引发的神经病、药物导致的神经病、维生素缺乏导致的神经病、自发性神经病以及糖尿病性神经病，与毒素引发的神经损伤、病原体引发的神经损伤、炎症引发的神经损伤或神经变性相关的神经病性疼痛。外周神经病的另外实例包括创伤导致的神经病、化疗导致的神经病、毒素引发的神经病、药物导致的神经病、维生素缺乏导致的神经病、自发性神经病以及糖尿病性神经病。
除非另有说明，本发明中使用的所有技术和科学术语都与本发明所述领域普通技术人员常规理解具有相同的含义。尽管与本发明所述方法和材料等同的方法和材料都可用于本发明的实施或检测，但是下文描述了合适的方法和材料。本申请中提及的所有出版物、专利申请、专利、以及其他参考文献作为一个整体在此引入作为参考。如有抵触，以本说明书，包括定义为准。此外，材料、方法和实施例都只是为了例证，而无意对本发明进行限制。
本发明的其他特点和优势在下文的发明详述及权利要求中将有清楚的体现。
附图简述
图1图示的是用32P-标记的神经胚活素cDNA作探针进行的两个northern印迹试验的结果，对成年人各种组织类型(A区)和成年人脑各区域(B区)中神经胚活素基因的相对表达水平进行了比较。
图2图示的是用32P-标记的神经胚活素cDNA作探针进行northern印迹试验的结果，其中对未经转染的细胞系HiB5、用神经胚活素cDNA转染的细胞系以及用GDNF-cDNA转染的细胞系三者中神经胚活素cDNA表达量进行了比较。
图3图示的是用神经胚活素特异性抗体Ab-2(左侧印迹；A区)或神经胚活素特异性抗体Ab-1(右侧阴极；B区)作探针进行的两个western印迹试验，该试验比较了未经转染的HiB5细胞(泳道1)与用神经胚活素cDNA稳定转染的HiB5细胞系(泳道2)其中神经胚活素蛋白的表达程度。
图4显示了在无血清培养基中，神经胚活素对培养的大鼠胚胎多巴胺腹中脑神经元存活以及对胆碱能颅神经运动神经元中ChAT活性的影响。具体而言，图4A给出的是重组GDNF对ChAT活性影响的剂量应答曲线(dpm/小时)。图4B给出的是使用稀释的来自产神经胚活素或产GDNF的细胞的条件培养基测定的ChAT活性(dpm/小时)。图4C给出的是每孔中酪氨酸羟化酶免疫活性细胞的数目。
图5显示了分泌自HiB5pUbilzNBN22细胞的神经胚活素对猪胚胎多巴胺腹中脑神经元与上述的HiB5pUbilzNBN22细胞(神经胚活素)或HiB5细胞(对照)共培养的切片培养物的功能及存活的影响。图5A和图5B：分别显示的是在DIV12(多巴胺(pmol/ml)-12天)和DIV21(多巴胺(pmol/ml)-21天)时释放至培养基中的多巴胺。图5C显示的是DIV21时，每一培养物中酪氨酸羟化酶免疫活性细胞的数目(每一培养物中的TH-ir细胞)。
图6给出的是慢病毒-产生的神经胚活素对黑质多巴胺神经元的体内作用。
图7为神经胚活素基因的基因组结构图，其中包括可用于鉴定全长神经胚活素基因的核酸引物及其相对于基因组神经胚活素-编码序列(即，基因)的空间定向。
图8显示的是用于鉴定编码人神经胚活素多肽的cDNA克隆的神经胚活素特异性引物，该引物能与编码神经胚活素多肽的核酸杂交，但不能与编码其他已知GDNF家族成员(即，GDNF，Persephin和neurturin)的核酸杂交。
图9给出的是本发明公开的多肽对分离自不同发育阶段的大鼠脊神经节细胞培养物的营养活性与用已知神经营养因子获得试验结果的比较。(0对照试验(无因子)；1存在GDNF；2存在Neurturin；3存在本发明的神经胚活素；E12表示12日龄胚胎；E16表示16日龄胚胎；P0表示出生当天；P7表示出生后第7天；以及P15表示出生后第15天。)。
图10图示了CHO细胞系中的神经胚活素产量。
图11对神经胚活素和GDNF结合GFRα-1和GFRα-3受体情况进行了比较。
图12图示了western印迹试验，该试验显示了R30抗-肽抗体和R31抗-肽抗体结合神经胚活素。
图13为显示通过亲和结合RETL3-Ig提取神经胚活素的凝胶图。
图14为pET19b-神经胚活素的质粒图谱，其中带有神经胚活素的合成基因序列。
图15为pMJB 164-His神经胚活素的质粒图谱，其中带有His神经胚活素的合成基因序列。
图16图示了102个氨基酸形式的截短神经胚活素(NBN)与113个氨基酸形式的神经胚活素在细胞RET活性试验中的比较结果。
图17图示了各种形式神经胚活素或神经胚活素突变蛋白在细胞RET活性试验中的比较结果。
图18图示了各种成熟(113aa)和截短(106aa，104aa或99aa)形式的神经胚活素或神经胚活素R14K突变蛋白在细胞RET活性试验中的比较结果。
发明详述
申请人已经鉴定到一种编码一种新的神经营养因子的核酸，该神经营养因子在本申请中称为“神经胚活素”或“NBN”。神经胚活素为神经营养因子中的转化生长因子-β(TGF-β)超家族中衍生自神经胶质细胞系的神经营养因子亚类中的成员。NBN多肽的生物活性形式为二聚体，单体基本上没有任何活性。因此，除非特别说明，本申请中提到的任一种本发明所述神经胚活素多肽都应当理解为是指名为神经胚活素的同源二聚体形式。
编码神经胚活素的cDNA最初是下述这样鉴定到的。用TBLASTN1.4.11算法(Atschul et al.，Nucl.Acids Res.，25，pp.3389-3402(1997))和人persephin作探寻(query)(GenBank Acc.No.AF040962)，最初从两个GenBank登记号为AC005038和AC005051的人细菌人工染色体(BAC)的高通量基因组测序(HTGS)中鉴定到一290bp的片段。AC005038长约190,000bp由5个无规序列的毗连群(contigs)组成，AC005051长约132,000bp由12个无规序列的毗连群组成。鉴定自这两个BAC克隆的290bp片段被证明具有与神经营养因子人persephin的cDNA编码区域同源但不相同的区域。
从这个290bp片段合成出两个神经胚活素-特异性PCR引物(顶链引物(SEQ ID NO：17)和底链引物(SEQ ID NO：18))。对人胎儿脑cDNA文库进行筛选。初筛包括用上述两PCR引物(SEQ ID NOS.17和18)对来自500,000个cDNA克隆的cDNA文库“主板(Master Plate)”进行96-孔PCR为基础的筛选，约5,000克隆/孔。对人胎儿脑cDNA文库“亚板(Sub-Plate)”进行PCR-为基础的次级筛选，该亚板包含大肠杆菌E.coli甘油原液，约5,000克隆/孔。
在对主板和亚板进行的pCR-为基础的筛选中都鉴定到了102bp的片段(SEQ ID NO：13)。选择阳性的cDNA克隆(含有102bp片段)，涂布在两个含抗生素的LB平板上，培养过夜。从这些平板中挑选总共96个细菌克隆，并将它们单个分别置于一新的96-孔PCR平板的孔中，这些孔中都含有两种PCR引物(SEQ ID NOS.17和18)和所需要的PCR扩增试剂。然后进行PCR扩增，用2％琼脂糖凝胶电泳对这96个单个PCR反应产物进行分析。然后鉴定出含102bp片段的阳性克隆。从这些含102bp片段的阳性克隆中提取质粒DNA并测序。随后的测序试验表明存在有一861bp的全长cDNA(SEQ ID NO：8)。663bp的开放阅读框(ORF)，也称为编码区域(CDS)，命名为SEQ ID NO：8，编码前-原-多肽(命名为“前-原-神经胚活素”)，表示为SEQ ID NO：9。以SEQ ID NO：9为基础，鉴定到神经胚活素多肽的三种变体。这些变体包括：
(i)本发明中称之为NBN140的140个氨基酸的多肽，该多肽具有SEQID NO：10所示的氨基酸序列；
(ii)本发明中称之为NBN116的116个氨基酸的多肽，该多肽具有SEQID NO：11所示的氨基酸序列；以及
(iii)本发明中称之为NBN113的113个氨基酸的多肽，该多肽具有SEQID NO：12所示的氨基酸序列；
神经胚活素的其他变体包括NBN的截短形式。这些形式的实例包括：(iv)本发明中称之为NBN112的112个氨基酸的多肽，该多肽具有神经胚活素多肽中的112个羧基端氨基酸，例如SEQ ID NO：9中的第29-140位氨基酸(SEQ ID NO：35)或SEQ ID NO：16或34中的第113-224位氨基酸。
(v)本发明中称之为NBN111的111个氨基酸的多肽，该多肽具有神经胚活素多肽中的111个羧基端氨基酸，例如SEQ ID NO：9中的第30-140位氨基酸(SEQ ID NO：36)或SEQ ID NO：16或34中的第114-224位氨基酸。
(vi)本发明中称之为NBN110的110个氨基酸的多肽，该多肽具有神经胚活素多肽中的110个羧基端氨基酸，例如SEQ ID NO：9中的第31-140位氨基酸(SEQ ID NO：37)或SEQ ID NO：16或34中的第115-224位氨基酸。
(vii)本发明中称之为NBN109的109个氨基酸的多肽，该多肽具有神经胚活素多肽中的109个羧基端氨基酸，例如SEQ ID NO：9中的第32-140位氨基酸(SEQ ID NO：38)或SEQ ID NO：16或34中的第116-224位氨基酸。
(viii)本发明中称之为NBN108的108个氨基酸的多肽，该多肽具有神经胚活素多肽中的108个羧基端氨基酸，例如SEQ ID NO：9中的第33-140位氨基酸(SEQ ID NO：39)或SEQ ID NO：16或34中的第117-224位氨基酸。
(ix)本发明中称之为NBN107的107个氨基酸的多肽，该多肽具有神经胚活素多肽中的107个羧基端氨基酸，例如SEQ ID NO：9中的第34-140位氨基酸(SEQ ID NO：40)或SEQ ID NO：16或34中的第118-224位氨基酸。
(x)本发明中称之为NBN106或N-7的106个氨基酸的多肽，该多肽具有神经胚活素多肽中的106个羧基端氨基酸，例如SEQ ID NO：9中的第35-140位氨基酸(SEQ ID NO：41)或SEQ ID NO：16或34中的第119-224位氨基酸。
(xi)本发明中称之为NBN105的105个氨基酸的多肽，该多肽具有神经胚活素多肽中的105个羧基端氨基酸，例如SEQ ID NO：9中的第36-140位氨基酸(SEQ ID NO：42)或SEQ ID NO：16或34中的第120-224位氨基酸。
(xii)本发明中称之为NBN104或N-9的104个氨基酸的多肽，该多肽具有神经胚活素多肽中的104个羧基端氨基酸，例如SEQ ID NO：9中的第37-140位氨基酸(SEQ ID NO：43)或SEQ ID NO：16或34中的第121-224位氨基酸。
(xiii)本发明中称之为NBN103的103个氨基酸的多肽，该多肽具有神经胚活素多肽中的103个羧基端氨基酸，例如SEQ ID NO：9中的第38-140位氨基酸(SEQ ID NO：44)或SEQ ID NO：16或34中的第122-224位氨基酸。
(xiv)本发明中称之为NBN102的102个氨基酸的多肽，该多肽具有神经胚活素多肽中的102个羧基端氨基酸，例如SEQ ID NO：9中的第39-140位氨基酸(SEQ ID NO：45)或SEQ ID NO：16或34中的第123-224位氨基酸。
(xv)本发明中称之为NBN101的101个氨基酸的多肽，该多肽具有神经胚活素多肽中的101个羧基端氨基酸，例如SEQ ID NO：9中的第40-140位氨基酸(SEQ ID NO：46)或SEQ ID NO：16或34中的第124-224位氨基酸。
(xvi)本发明中称之为NBN100的100个氨基酸的多肽，该多肽具有神经胚活素多肽中的100个羧基端氨基酸，例如SEQ ID NO：9中的第41-140位氨基酸(SEQ ID NO：47)或SEQ ID NO：16或34中的第125-224位氨基酸。
(xvii)本发明中称之为NBN99的99个氨基酸的多肽，该多肽具有神经胚活素多肽中的99个羧基端氨基酸，例如SEQ ID NO：9中的第42-140位氨基酸(SEQ ID NO：48)或SEQ ID NO：16或34中的第126-224位氨基酸。
本发明所述的神经胚活素多肽可以任一生物活性形式提供，包括前-原-蛋白、原-蛋白、成熟蛋白、糖基化蛋白、非-糖基化蛋白、磷酸化蛋白、非-磷酸化蛋白的形式，截短形式或者任一其他翻译后修饰蛋白。可以这样认为对于每一NBN变体来说生物活性的神经胚活素都是二聚化形式，二聚体的形式是活性所需。单体NBN多肽基本或根本不表现活性。生物活性的神经胚活素多肽包括一种二聚化多肽，该二聚化多肽在辅因子(cofactor)(例如GFRa3或RET)存在下能结合GFRa3或GFRa3和RET的复合物，导致RET的二聚化和RET的自身磷酸化。应该理解的是本发明公开的神经胚活素截短形式(例如，112AA，111AA，110AA，109AA，108AA，107AA，106AA，105AA，104AA，103AA，102AA，101AA，100AA或99AA形式，分别示为SEQ ID NOS：35-48)，以及其他上述的NBN多肽，都是二聚体，而且每一种二聚体都具有神经营养活性。
含782bp 5′非翻译DNA、663bp编码DNA和447bp 3′非翻译DNA(共1992bp)的完整cDNA已提交GenBank，登记号为AF 120274。
基因组神经胚活素-编码序列按下述方法鉴定：
为了克隆基因组神经胚活素-编码序列，制备另一套引物。具体而言，引物对No.1，包括(SEQ ID NO：23所示的正义引物和SEQ ID NO：24所示的反义引物)和引物对No.2，包括(SEQ ID NO：25所示的正义引物和SEQ IDNO：26所示的反义引物)。
使用引物对No.2，从人基因组DNA制备物中PCR扩增出887bp的DNA片段，将其克隆入pCRII载体(Invitrogen)并转化入大肠杆菌。对得到的质粒测序，预测861bp推定cDNA的序列(编码本发明称之为神经胚活素的蛋白质)(表示为SEQ ID NO：3)。类似地，用引物对No.1，从人基因组DNA中PCR得到870bp的DNA片段。与887bp序列相比，该片段中在开放阅读框(ORF)的3′-末端发现了另一42bp区域。通过绘制外显子-内含子边界，将神经胚活素与其他神经营养因子的核酸序列相比推测神经胚活素基因的基因组结构。该分析表明所述神经胚活素基因具有至少两个外显子，它们被一70bp内含子分隔开来。
该序列也可用于从GenBank中筛选神经胚活素EST序列。这三者的GenBank的登记号为AA844072，AA931637和AA533512，表明神经胚活素核酸已被转录为mRNA。
将得到的完整cDNA序列(AF120274)与GenBank登记号为AC005038和AC005051中的基因组序列进行比较表明：神经胚活素基因由至少5个外显子(包括3个编码区)，被4个内含子分隔(参见，例如，图7)。合在一起，这些外显子具有全长神经胚活素多肽的推测氨基酸序列。还应该注意的是发现在887bp片段含有原-神经胚活素的完整编码区域。推测的cDNA(SEQID NO：3)含编码原-神经胚活素(181个氨基酸残基)的开放阅读框(ORF)，这表明其与三种已知人蛋白-Persephin、Neurturin和GDNF同源。参见实施例部分的表3。
本发明的神经胚活素核酸
另一方面，本发明提供了一种能表达本发明所述多肽的多核苷酸。本发明所述多核苷酸包括DNA，cDNA和RNA序列，以及反义序列，包括天然生成的、合成的和有意制备的多核苷酸。本发明所述多核苷酸还包括遗传密码的简并序列，但是它们仍是表达神经胚活素多肽的密码子。
如本发明所述，“多核苷酸”是指长度为至少10个碱基对的核苷酸多聚形式，优选长度为至少15个碱基对。“分离的多核苷酸”是指与两个编码序列不再紧密邻接的多核苷酸，而在其来源生物体的天然生成基因组中该多核苷酸与这两个编码序列是紧密邻接的(一个在5′末端，一个在3′末端)。因此，该术语包括引入表达载体、自主复制质粒或病毒、或原核或真核细胞的基因组DNA的重组DNA，或者作为独立分子存在的DNA，例如独立于其他序列的cDNA。
本发明所述的多核苷酸还包括与本发明所述核苷酸序列在1个或多个核苷酸位置上不同的等位变体和“突变的多核苷酸”。
在一优选的实施方案中，本发明所述的多核苷酸具有能与下列核苷酸序列在至少中、中/高、高严谨条件下杂交的核酸(DNA)序列：SEQ ID NO：1所示多核苷酸序列、SEQ ID NO：3所示多核苷酸序列、SEQ ID NO：8所示多核苷酸序列或SEQ ID NO：15所示多核苷酸序列，它们的互补链或亚-序列，如下文详述。
在另一优选的实施方案中，本发明所述的分离的多核苷酸有这样的核酸(DNA)序列，该序列与SEQ ID NO：1所示多核苷酸序列、SEQ ID NO：3所示多核苷酸序列、SEQ ID NO：8所示多核苷酸序列或SEQ ID NO：15所示多核苷酸序列的同源性为至少70％、优选至少80％、较优选至少90％、更优选至少95％、最优选至少99％。
在最优选实施方案中，所述多核苷酸具有SEQ ID NO：1所示DNA序列、SEQ ID NO：3所示DNA序列、SEQ ID NO：8所示DNA序列或SEQ IDNO：15所示DNA序列。
本发明还提供了用于鉴定、分离和扩增编码神经胚活素多肽或其片段的神经胚活素多核苷酸的新引物和DNA序列。所述引物包括SEQ ID NOS：17-28和31-32所示的多核苷酸序列。此外，本发明提供了用这些引物制备的神经胚活素DNA序列，包括SEQ ID NOS：13和14所示的序列。另外，本发明提供了来自基因组DNA的3′或5′非翻译区(“UTR”)位于神经胚活素外显子侧翼的DNA序列；该序列可用于鉴定、分离及扩增编码神经胚活素多肽或其片段的神经胚活素多核苷酸。
本发明的3′UTR序列包括下列序列：
SEQ ID NO：1中的第721-865位核苷酸，
SEQ ID NO：3中的第718-861位核苷酸，
SEQ ID NO：8中的第718-861位核苷酸，
SEQ ID NO：15中的第1647-2136位核苷酸，以及
来自(即，落入)上述序列的10-25个核苷酸的毗连序列(可用作，例如引物)。
本发明的5′UTR序列包括下列序列：
SEQ ID NO：1中的第1-10位核苷酸，
SEQ ID NO：8中的第1-57位核苷酸，
SEQ ID NO：15中的第1-974位核苷酸，以及
来自(即，落入)上述序列的10-25个核苷酸的毗连序列(可用作，例如引物)。
优选地，本发明所述多核苷酸可通过克隆方法获得，例如“CurrentProtocols in Molecular Biology”(John Wiley & Sons，Inc.)中所述的方法。在一优选的实施方案中，所述多核苷酸克隆自人基因组DNA或人脑cDNA文库，或在此基础上制得的。
DNA序列的同源性
上述的DNA序列同源性可以测定为两序列之间的同一性程度，表明第一序列源自第二序列。所述同源性可用本领域已知的电脑程序合适测定，如GCG程序包提供的(Needleman，S.B.and Wunsch C.D.，Journal ofMolecular Biology 197048，443-453)。作下列设定用GAP进行DNA序列比较：GAP生成罚分为5.0，GAP延伸罚分为0.3，上述的类似DNA序列的编码区与下列序列之间显示的同一性程度优选为至少70％，较优选至少80％，更优选至少90％，甚至更优选至少95％，最优选至少99％：SEQ ID NO：1所示DNA序列的CDS(编码)部分，或SEQ ID NO：3所示DNA序列的CDS(编码)部分，或SEQ ID NO：8所示DNA序列的CDS(编码)部分，或SEQID NO：15所示DNA序列的CDS(编码)部分。
“序列同一性”是指两个多核苷酸在具体区域对核苷酸进行逐个比较基础上得到的相同程度。“序列同一性百分比”通过下述方法计算而来：对在比较区域上最大限度对齐的两个序列进行比较，测算在两序列都出现相同核酸碱基(例如，A，T，C，G，U，或I，)的位置的数目得到匹配位置的数目，上述匹配位置的数目除以所比较区域中的位置总数(即，窗口大小)，得到的结果乘以100即为序列同一性百分比。本发明使用的“基本同一”代表多核苷酸序列的一个特征，其中所述多核苷酸中包含这样的序列，该序列在比较区域上与标准序列之间具有至少80％的序列同一性，优选至少85％的序列同一性，通常为90～95％序列同一性，更经常为至少99％的序列同一性。测定序列同一性的方法已为本领域所熟知。参见，例如，Needleman and WunschJ.Mol.Biol.197048，443-453所述。
杂交方法
本发明所述的多核苷酸的核酸序列能在至少中度、中度/高度或高度严谨条件下与下列序列杂交：SEQ ID NO：1所示的多核苷酸序列、SEQ ID NO：3所示的多核苷酸序列、SEQ ID NO：8所示的多核苷酸序列、SEQ ID NO：15所示的多核苷酸序列，或它们的互补链，或它们的亚-序列，这些杂交条件在下文详述。
用于测定核苷酸探针与同源DNA或RNA序列杂交的合适试验条件包括：将包含待杂交的DNA片段或RNA的滤膜预-浸泡于5X SSC(氯化钠/柠檬酸钠；参见，Sambrook et al.；Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Lab.，Cold Spring Harbo r，NY 1989)10分钟，用5X SSC，5X Denhardt′s溶液(参见，Sambrook et al.；前面引用的书)，0.5％SDS和100μg/ml超声波变性的鲑鱼精子DNA(参见，Sambrook et al.；前面引用的书)对该滤膜预杂交，然后在含有10ng/ml随机聚合的(FeinbergA P &Vogelstein B；Anal.Biochem.1983 1326-13)32P-dCTP-标记的(比活性＞1×109cpm/μg)探针的相同溶液中在约45℃杂交12小时。然后用0.1×SSC，0.5％SDS洗涤滤膜两次，每次30分钟，温度为至少60℃(中度严谨条件)，优选至少65℃(中/高度严谨条件)，更优选至少70℃(高度严谨条件)，甚至更优选至少75℃(更高度严谨条件)。在这些条件下与寡核苷酸探针杂交的分子可用X-线底片检测。
克隆的多核苷酸
本发明所述的分离的多核苷酸具体情况下可以是克隆的多核苷酸。如本发明所述，“克隆的多核苷酸”是指为了把一DNA节段从其天然位点重置到将在该处复制的不同位点时而按照标准克隆方法所克隆的多核苷酸或DNA序列，所述的DNA节段可以具体为cDNA，即，从RNA酶促反应得到的。本发明所述的克隆的多核苷酸能编码本发明所述的任一NBN多肽，包括但不限于SEQ ID NOS：2，4-7，9-12，16，34和35-48所示的多肽。
克隆可以通过任一合适的途径完成，可以包括反转录酶技术、PCR技术等，以及切割和分离所需的DNA节段。
本发明所述的克隆的多核苷酸可以选择地为“DNA构建体”或“分离的DNA序列”，以及可具体为互补的DNA(cDNA)。
生物来源
本发明的分离的多核苷酸可获自任一来源。
在一优选的实施方案中，本发明所述的多核苷酸克隆自cDNA文库，或在此基础上制得的，如胎儿或成人的脑cDNA文库，具体为前脑、后脑、脑皮层、纹状体、杏仁核、小脑、尾状核、胼胝体、海马、丘脑核、下丘脑核、嗅核、壳核、黑质、脊神经节、三叉神经节、肠系膜上动脉、或丘脑的cDNA文库；脊髓的cDNA文库；心脏的cDNA文库；胎盘的cDNA文库；肺的cDNA文库；肝的cDNA文库；骨骼肌的cDNA文库；肾的cDNA文库；肝的cDNA文库；胰腺的cDNA文库；肠的cDNA文库；眼的cDNA文库；视网膜的cDNA文库；牙髓的cDNA文库；毛囊的cDNA文库；前列腺的cDNA文库；垂体的cDNA文库；或气管的cDNA文库。
商品化的各种组织的cDNA文库，人及非人的，可获自，例如，Stratagene和Clontech。本发明所述的分离的多核苷酸可用标准方法制得，例如操作实施例中描述的方法。
本发明的神经胚活素多肽
如上所述，本发明使用的“神经胚活素多肽”是一种具有神经营养活性的多肽(例如，实施例6，7，8，和9中描述的多肽)，包括那些多肽，该多肽有这样的氨基酸序列，该氨基酸序列与下列序列所示的“神经胚活素”多肽具有至少70％同源性：SEQ ID N：2中的AA-95-AA105、SEQ ID NO：2中的AA1-AA105、SEQ ID NO：4中的AA-97-AA140、SEQ ID NO：4中的AA-41-AA140、SEQ ID NO：4中的AA1-AA140、SEQ ID NO：9中的AA-80-AA140、(“野生型”前原NBN)、SEQ ID NO：9中的AA-41-AA140(原NBN)、SEQ ID NO：5中的AA1-AA140(成熟的140AA)、SEQ ID NO：6中的AA1-AA116(成熟的116AA)、SEQ ID NO：7中的AA1-AA113(成熟的113AA)、SEQ ID NO：10中的AA1-AA140(成熟的140AA)、SEQ ID NO：11中的AA1-AA116(成熟的116AA)、SEQ ID NO：12中的AA1-AA113(成熟113AA)，SEQ ID NO：16中的AA1-AA224(小鼠前原)、SEQ ID NO：34中的AA1-AA224(大鼠前原)、以及截短形式NBN112-NBN99(分别为SEQ ID NOs：35-48)，以及上述每一序列的变体及衍生物。
优选地，上面鉴定的神经胚活素多肽的C-末端序列有SEQ ID NO：2中的AA72-AA105(即，SEQ ID NO：9中的AA107-AA140)，更优选SEQ ID NO：2中的AA41-AA105(即，SEQ ID NO：9中的AA76-AA140)。
另外，优选的所述神经胚活素多肽保留了GDMF家族和TGF-β超家族特征性的7个保守的Cys残基。
优选地，所述神经胚活素多肽与上述序列具有大于85％的同源性，较优选具有大于90％的同源性，更优选具有大于95％的同源性，最优选具有大于99％的同源性，(所述上述序列即，SEQ ID NO：2中的AA-95-AA105、SEQID NO：2中的AA1-AA105、SEQ ID NO：4中的AA-97-AA140、SEQ ID NO：4中的AA-41-AA140、SEQ ID NO：4中的AA1-AA140、SEQ ID NO：9中的AA-80-AA140、(“野生型”前原NBN)、SEQ ID NO：9中的AA-41-AA140(原NBN)、SEQ ID NO：5中的AA1-AA140(成熟的140AA)、SEQ ID NO：6中的AA1-AA116(成熟的116AA)、SEQ ID NO：7中的AA1-AA113(成熟的113AA)、SEQ ID NO：10中的AA1-AA140(成熟的140AA)、SEQ ID NO：11中的AA1-AA116(成熟的116AA)、SEQ ID NO：12中的AA1-AA113(成熟的113AA)、SEQ ID NO：16中的AA1-AA224(小鼠前原)、SEQ ID NO：34中的AA1-AA224(大鼠前原)、以及截短形式NBN112-NBN99(分别为SEQ ID NOs：35-48)，以及优选地，具有上述鉴定的神经胚活素多肽的C-末端序列的任一上述多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO：2中的AA72-AA105(即，SEQ ID NO：9中的AA107-AA140)，更优选SEQ ID NO：2中的AA41-AA105(即，SEQ ID NO：9中的AA76-AA140)或SEQ ID NO：16或34中的AA191-AA224。
此外，本发明期望那些多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：16中AA1-AA224所示的小鼠“神经胚活素”多肽或SEQ ID NO：34中AA1-AA224所示的大鼠“神经胚活素”多肽具有至少70％的同源性。
一个实施方案中的本发明优选多肽为前原序列(分别为SEQ ID NOS：2，4，9，16和34所示的序列)，原序列(SEQ ID NO：2中AA75-AA105或SEQ IDNO：4和9中AA-41-AA140所示的序列)，成熟序列(SEQ ID NOS：5，6，7，10，11或12所示序列，优选SEQ ID NOS：10，11，12所示序列)，以及最优选神经胚活素的截短序列(SEQ ID NOs：35-48)。
本发明的多肽包括变体多肽。本发明上下文中，″变体多肽″是指其氨基酸序列在一个或多个氨基酸位置不同于下列序列的多肽(或蛋白质)：SEQ IDNO：2，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ IDNO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：16，SEQID NO：34或SEQ ID NOS：35-48。所述变体多肽包括上述的修饰后的多肽、以及保守取代、剪接变体、同工型(isoforms)、其他物种的同系物以及多态现象的物质(polymorphisms)。
本发明使用的“保守取代”表示一氨基酸残基被另一生物学上类似的残基代替。例如，本领域技术人员希望保守氨基酸取代对生物活性极小或根本没有影响，特别是如果取代少于多肽或蛋白中残基总数的10％。优选地，保守的氨基酸取代表示变化小于多肽或蛋白的5％，最优选小于多肽或蛋白的2％(例如，当用NBN113计算时，最优选的保守取代为在野生型的氨基酸序列中氨基酸取代少于3个)。在一个特别优选的实施方案中，序列中有单个氨基酸取代，其中被取代及取代氨基酸都是非-环状的。
具体的保守取代的其他实例包括用一个疏水残基如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或蛋氨酸取代另一个疏水残基，或者用一个极性残基取代另一极性残基，例如精氨酸取代赖氨酸、谷氨酸取代天冬氨酸、谷氨酰胺取代天冬酰胺，等。
保守取代还包括用一取代的氨基酸残基代替一非-取代的亲代氨基酸残基，只要取代多肽的抗体也可与非-取代多肽进行免疫反应。
因此，“保守取代变体”是指由于出现至少1个保守性氨基酸取代而不同于野生型或标准神经胚活素多肽的神经胚活素多肽。
神经胚活素初始氨基酸序列的修饰可导致蛋白具有与未修饰的对应多肽基本相同的活性，因此可以认为是亲代蛋白的功能类似物。所述修饰可以是有意为之，例如，通过定点诱变，或者也可以是自发形成的，包括剪接变体、同工型、其他物种的同系物、以及多态现象的物质。所述的功能类似物也是本发明所考虑的。
另外，初始氨基酸序列的修饰还可导致蛋白不再保留有亲代蛋白的生物活性，包括显性失活形式等。显性失活蛋白可通过结合或隔绝(sequestering)例如正常情况下与多肽功能性相互作用上游或下游成分，干扰野生型蛋白。所述的显性失活形式也是本发明所考虑的。
“信号肽”是这样一段肽序列，能够将其结合的新合成多肽定向到内质网(ER)进行进一步的翻译后处理及分布。
针对神经胚活素本发明使用的“异源信号肽”是指非人神经胚活素信号肽，通常为一些除神经胚活素之外的一些哺乳动物蛋白的信号肽。
本领域技术人员应当认识到人神经胚活素DNA序列(cDNA或基因组DNA)，或那些因沉默密码子变化或产生保守氨基酸取代的密码子的变化而不同于人神经胚活素DNA的序列，可以用于基因水平上修饰培养的人细胞以使它们过量表达并分泌酶。
本发明的多肽还包括嵌合多肽或可切割的融合多肽，其中另一种多肽融合于该多肽或其片段的N-末端或C-末端。嵌合多肽可以通过将一编码另一种多肽的核酸序列(或其片段)融合于本发明所述核酸序列(或其部分)制得。
用于制备嵌合多肽的技术为常规技术。这些技术通常需要以一定方式连接序列以使这两序列都位于同一阅读框内，融合多肽在同一启动子和终止子调控下表达。
本发明的多肽还包括神经胚活素多肽的截短形式。在这些截短形式中，从N-末端或C-末端，优选N末端缺失了1个或多个氨基酸。截短的神经胚活素多肽包括在本发明中具有下列命名的人的多肽：NBN112(SEQ ID NO：35)，NBN111(SEQ ID NO：36)，NBN110(SEQ ID NO：37)，NBN109(SEQ IDNO：38)，NBN108(SEQ ID NO：39)，NBN107(SEQ ID NO：40)，NBN106(SEQID NO：41)，NBN105(SEQ ID NO：42)，NBN104(SEQ ID NO：43)，NBN103(SEQ ID NO：44)，NBN102(SEQ ID NO：45)，NBN101(SEQ ID NO：46)，NBN100(SEQ ID NO：47)和NBN99(SEQ ID NO：48)，以及这些截短人神经胚活素多肽的相应同系物，包括但不限于大鼠和小鼠神经胚活素。
例如，本发明包括神经胚活素多肽氨基末端的缺少1个或多个氨基酸的截短神经胚活素多肽。即，截短神经胚活素多肽包含有神经胚活素的7个半胱氨酸的结构域。在一些实施方案中，所述的截短神经胚活素多肽包括与SEQ ID NO：12中12-113位氨基酸，即NBN102(SEQ ID NO：45)具有至少70％同源性的氨基酸序列。优选地，所述的截短神经胚活素多肽至少85％同源于SEQ ID NO：12中12-113位氨基酸。更优选地，所述的截短神经胚活素多肽至少95％同源于SEQ ID NO：12中12-113位氨基酸。最优选地，所述的截短神经胚活素多肽至少99％同源于SEQ ID NO：12中12-113位氨基酸。截短神经胚活素的其他类似实例包括，例如，含有下列氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO：9中42-140位氨基酸，SEQ ID NO：16中113-224位氨基酸，SEQ ID NO：34中113-224位氨基酸。其他具体实例包括但不限于人NBN99(SEQ ID NO：48)，NBN100(SEQ ID NO：47)，NBN101(SEQ IDNO：46)，NBN102(SEQ ID NO：45)，NBN103(SEQ ID NO：44)，NBN104(SEQ ID NO：43)，NBN105(SEQ ID NO：42)，NBN106(SEQ ID NO：41)，NBN107(SEQ ID NO：40)，NBN108(SEQ ID NO：39)，NBN109(SEQ ID NO：38)，NBN110(SEQ ID NO：37)，NBN111(SEQ ID NO：36)和NBN112(SEQ IDNO：35)，如上所述，或其同系物或衍生物。截短的NBN多肽可以是合成的，用克隆DNA构建体表达的，或者酶切成熟NBN多肽得到的。
在优选实施方案中，所述的截短神经胚活素多肽包括至少85个神经胚活素多肽羧基末端氨基酸。优选实施方案中，它包括至少98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111或112个神经胚活素多肽羧基末端氨基酸。
在优选的实施方案中，所述的截短神经胚活素多肽可结合RET多肽，优选所述的RET多肽表达于哺乳动物细胞，如神经元的表面。
截短的神经胚活素可用本领域已知方法和本发明提供的序列重组表达编码截短神经胚活素多肽的核酸制得。
可选择地，所述的截短神经胚活素多肽可通过下述方法制得：提供一成熟神经胚活素多肽，如SEQ ID NO：12所示的NBN113，让该成熟神经胚活素多肽与至少1种蛋白酶在足以制备出截短神经胚活素多肽的条件下接触得到截短的神经胚活素多肽。优选地，至少一种蛋白酶为外蛋白酶，并且与神经胚活素多肽的接触产生外肽酶神经胚活素多肽消化产物，该产物可被二肽酶进一步消化。在可选择实施方案中，所述蛋白酶为氨基肽酶，Endo Lys C或胰蛋白酶。
氨基酸序列的同源性
侯选多肽与本发明神经胚活素多肽之间同源性程度可以测定为两氨基酸序列之间同一性程度。序列的高水平同一性表明第一序列起源于第二序列的可能性。
同一性用电脑分析测定，例如，但不限于，ClustalX电脑对齐程序(Thompson JD，Gibson TJ，Plewniak F，Jeanmougin F，& Higgins DG：TheClustalX windows interface：flexible strategies for multiple sequence alignmentaided by quality analysis tools；Nucleic Acids Res.1997，25(24)：4876-82)，以及本申请建议的缺省值参数(default parameters)。用该程序，本发明的相似DNA序列编码的多肽的成熟部分与下列序列所示的氨基酸序列之间显示的同一程度为至少90％，较优选至少95％，更优选至少98％，最优选至少99％：SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4；SEQ ID NO：5；SEQ ID NO：6；SEQ ID NO：7；SEQ ID NO：9；SEQ ID NO：10；SEQ ID NO：11；SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：34，SEQ ID NO：35，SEQ ID NO：36，SEQ ID NO：37，SEQ IDNO：38，ID NO：39；SEQ ID NO：40；SEQ ID NO：41；SEQ ID NO：42，SEQ IDNO：43，SEQ ID NO：44；SEQ ID NO：45；SEQ ID NO：46；SEQ ID NO：47 orSEQ ID NO：48。
在同源性测定的基础上，已经确证了本发明的神经胚活素多肽属于TGF-β超家族，与GDNF亚家族有关，但是代表该亚家族中的一个独特的成员。
生物活性多肽
本发明所述的多肽可以任何生物活性形式提供，包括前原蛋白、原-蛋白、成熟蛋白、糖基化蛋白，非-糖基化蛋白、磷酸化蛋白、非-磷酸化蛋白截短形式或其他任一翻译后修饰蛋白。生物活性的神经胚活素多肽包括具有下述特性的多肽：即当其二聚化时，单独或有辅因子(例如GFRa3，或RET)存在下能够结合RET，导致RET的二聚化以及RET的自身磷酸化。
本发明所述的多肽具体而言可以为N-糖基化多肽，该多肽优选在序列表中标明的N-残基上的糖基化。
在一优选的实施方案中，本发明所述的多肽具有：SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列，在第122位上含有一糖基化的天冬酰胺残基；SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列，在第122位上含有一糖基化的天冬酰胺残基；SEQ IDNO：11所示的氨基酸序列，在第98位上含有一糖基化的天冬酰胺残基；SEQID NO：12所示的氨基酸序列，在第95位上含有一糖基化的天冬酰胺残基。
本发明还涉及神经胚活素融合蛋白，例如Ig-融合体，例如，美国专利US5,434,131中所述的融合体，在此引入作为参考，或者血清白蛋白融合体。
在一些实施方案中，本发明提供了具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽，或者与SEQ ID NO：2所示序列至少约85％，优选至少约90％，较优选至少约95％，更优选至少约98％，最优选至少约99％，同源的氨基酸序列。
在另一实施方案中，本发明提供了具有SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的多肽，或者与SEQ ID NO：4所示序列至少约85％，优选至少约90％，较优选至少约95％，更优选至少约98％，最优选至少约99％，同源的氨基酸序列。
在第三个实施方案中，本发明提供了具有SEQ ID NO：5所示氨基酸序列的多肽，或者与SEQ ID NO：5所示序列至少约85％，优选至少约90％，较优选至少约95％，更优选至少约98％，最优选至少约99％，同源的氨基酸序列。
在第四个实施方案中，本发明提供了具有SEQ ID NO：6所示氨基酸序列的多肽，或者与SEQ ID NO：6所示序列至少约85％，优选至少约90％，较优选至少约95％，更优选至少约98％，最优选至少约99％同源的氨基酸序列。
在第五个实施方案中，本发明提供了具有SEQ ID NO：7所示氨基酸序列的多肽，或者与SEQ ID NO：7所示序列至少约85％，优选至少约90％，较优选至少约95％，更优选至少约98％，最优选至少约99％同源的氨基酸序列。
本发明所述的神经胚活素多肽包括等位变体，例如具有SEQ ID NOs.5-7所示氨基酸序列的多肽，其中第一个Xaa代表Asn或Thr，第二个Xaa代表Ala或Pro。
在第六个实施方案中，本发明提供了具有SEQ ID NO：9所示氨基酸序列的多肽，或者与SEQ ID NO：9所示序列至少约85％，优选至少约90％，较优选至少约95％，更优选至少约98％，最优选至少约99％同源的氨基酸序列。
在第七个实施方案中，本发明提供了具有SEQ ID NO：10所示氨基酸序列的多肽，或者与SEQ ID NO：10所示序列至少约85％，优选至少约90％，较优选至少约95％，更优选至少约98％，最优选至少约99％同源的氨基酸序列。
在第八个实施方案中，本发明提供了具有SEQ ID NO：11所示氨基酸序列的多肽，或者与SEQ ID NO：11所示序列至少约85％，优选至少约90％，较优选至少约95％，更优选至少约98％，最优选至少约99％同源的氨基酸序列。
在第九个实施方案中，本发明提供了具有SEQ ID NO：12所示氨基酸序列的多肽，或者与SEQ ID NO：12所示序列至少约85％，优选至少约90％，较优选至少约95％，更优选至少约98％，最优选至少约99％同源的氨基酸序列。
在第十个实施方案中，本发明提供了具有SEQ ID NO：16所示氨基酸序列的多肽，或者与SEQ ID NO：16所示序列至少约85％，优选至少约90％，较优选至少约95％，更优选至少约98％，最优选至少约99％同源的氨基酸序列。
在另外一些实施方案中，本发明提供了具有SEQ ID NOS：35-48中任一所示的氨基酸序列，或者与SEQ ID NOS：35-48中任一所示序列至少约85％，优选至少约90％，较优选至少约95％，更优选至少约98％，最优选至少约99％同源的氨基酸序列。
在另一实施方案中，本发明所述的多肽具有GDNF亚家族的指纹，即实施例给出的表3中下划线标出的氨基酸残基。
在另一实施方案中，本发明提供了被能在高度严谨条件下与SEQ IDNO：1所示多核苷酸序列、其互补链或其亚序列杂交的多核苷酸序列编码的多肽。在一优选的实施方案中，本发明所述的多肽是由与SEQ ID NO：1所示多核苷酸序列至少70％同源的多核苷酸序列编码的。在最优选实施方案中，本发明所述的多肽是由SEQ ID NO：1所示多核苷酸序列编码的。
在另一实施方案中，本发明提供了由能在高度严谨条件下与SEQ IDNO：3所示多核苷酸序列、其互补链或其亚序列杂交的多核苷酸序列编码的新的多肽。在一优选的实施方案中，本发明所述的多肽是由与SEQ ID NO：3所示多核苷酸序列至少70％同源的多核苷酸序列编码的。在最优选实施方案中，本发明所述的多肽是由SEQ ID NO：3所示多核苷酸序列编码的。
在一更优选的实施方案中，本发明所述的多肽包括成熟神经胚活素多肽的氨基酸序列。甚至更优选地，本发明包括神经胚活素多肽截短形式的氨基酸序列，所述截短形式中包含有神经胚活素氨基酸序列中存在的7个保守半胱氨酸残基。
在另一实施方案中，本发明提供了由能在高度严谨条件下与SEQ IDNO：8所示多核苷酸序列、其互补链或其亚序列杂交的多核苷酸序列编码的新的多肽。在一优选的实施方案中，本发明所述的多肽是由与SEQ ID NO：8所示多核苷酸序列至少70％同源的多核苷酸序列编码的。在最优选实施方案中，本发明所述的多肽是由SEQ ID NO：8所示多核苷酸序列编码的。
在另一实施方案中，本发明提供了由能在高度严谨条件下与SEQ IDNO：15所示多核苷酸序列、其互补链或其亚序列杂交的多核苷酸序列编码的新的多肽。在一优选的实施方案中，本发明所述的多肽是由与SEQ ID NO：15所示多核苷酸序列至少70％同源的多核苷酸序列编码的。在最优选实施方案中，本发明所述的多肽是由SEQ ID NO：15所示多核苷酸序列编码的。
生物来源
本发明所述的多肽可分离自哺乳动物细胞，优选分离自人细胞或小鼠源细胞。
在最优选实施方案中，本发明所述的多肽可分离自人心脏组织、人骨骼肌、人胰腺、人脑组织、具体分离自尾状核或丘脑，或者它可获自哺乳动物来源的DNA，下文详细描述。
神经营养活性
本发明的神经胚活素多肽，包括截短的神经胚活素多肽，可用于调节神经或神经细胞的代谢、生长、分化或存活。具体而言，神经胚活素多肽可用于治疗或缓解有生命动物，例如人的病症或疾病，所述病症或疾病对神经营养剂的活性有应答。所述治疗及方法在下文详述。
抗体
本发明的神经胚活素多肽或多肽片段可用于制备神经胚活素-特异性的抗体。本发明中的“神经胚活素-特异性抗体”是一种抗体，何如可以是多克隆抗体或单克隆抗体，能与神经胚活素多肽或多肽片段产生免疫反应，或者能特异性结合神经胚活素多肽的表位。
多克隆和单克隆抗体的制备已为本领域熟知。多克隆抗体可以具体通过下文描述的方法得到：例如，Green et al.，：“Production of PolyclonalAntisera”in Immunochemical Protocols(Manson，Ed.)；Humana Press，1992，pages 1-5；Coligan et al.，：“Production of Polyclonal Antisera in Rabbits，Rats，Mice and Hamsters”in Current Protocols in Immunology.1992，第2.4.1部分，Ed Harlow and David Lane(Eds.)in“Antibodies；A laboratory manual”ColdSpring Harbor Lab.Press 1988。这些方法在此引入作为参考。单克隆抗体具体可以通过以下文献所描述的方法得到：例如，Kohler & Milstein，Nature，1975，256：495；Coligan et al.，in Current Protocols in Immunology.1992，Sections 2.5.1-2.6.7；以及Harlow et al.，in Antibodies：A Laboratory Manual；Cold Spring Harbor，Pub.，1988，page 726；这些方法在此引入作为参考。
简而言之，单克隆抗体可通过下述操作获得：用含抗原的组合物注射例如小鼠，通过取血清样品查证抗体的产生，取脾得到B淋巴细胞，将B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合制得杂交瘤，克隆杂交瘤，筛选出能产生针对抗原的抗体的阳性克隆，从杂交瘤培养物分离抗体。
单克隆抗体可通过多种常规技术分离及纯化自杂交瘤培养物，包括用蛋白A Sepharose亲和层析，大小排阻层析和离子交换层析，参见，例如，Coligan et al.in Current Protocols in Immunology.1992，Sections 2.7.1-2.7.12，和Sections 2.9.1-2.9.3；Barnes et al.：“Purification of ImmunoglobulinG(IgG)”in Methods in Molecular Biology；Humana Press，1992，Vol.10，Pages79-104。多克隆抗体或单克隆抗体可任选进一步纯化，例如通过与结合了制备该抗体的多肽的基质结合并从该基质洗脱来制备。
能结合本发明所述神经胚活素多肽的抗体可使用完整多肽或含所需小肽的片段做为免疫原性抗原来制备。用于免疫动物的多肽可用重组DNA技术或化学合成得到，可任选与载体蛋白偶联。通常与肽化学方法偶联时使用的载体蛋白包括匙孔血蓝蛋白(KLH)，甲状腺球蛋白，牛血清白蛋白(BSA)，以及破伤风类毒素。然后，可用偶联后的肽免疫动物，具体可以为小鼠、大鼠、仓鼠或兔。
在一个实施方案中，抗体用下列肽制备：肽1：CRPTRYEAVSFMDVNST(SEQ ID NO：9中的第108-124位氨基酸)；或肽2：ALRPPPGSRPVSQPC(SEQ ID NO：9中的第93-107位氨基酸)。使用这些多肽制备抗体的方法描述见实施例10。
兔多克隆抗体还用下列肽制备：
肽R27：GPGSRARAAGARGC(SEQ ID NO：9中的第30-43位氨基酸)；
肽R28：LGHRSDELVRFRFC(SEQ ID NO：9中的第57-70位氨基酸)；
肽R29：CRRARSPHDLSL(SEQ ID NO：9中的第74-85位氨基酸)；
肽R30：LRPPPGSRPVSQPC(SEQ ID NO：9中的第94-107位氨基酸)；以及
肽R31：STWRTVDRLSATAC(SEQ ID NO：9中的第121-136位氨基酸)。
该组中，只有肽R30和R31，相对靠近于C-末端，在Western印迹试验中还原条件下可识别变性蛋白。
其他的神经胚活素-衍生肽还可出自NBN蛋白，如下详述，根据已知的GDNF结构可推测出为表面暴露的环(Eigenbrot and Gerber，Nat.Struct.Biol.，4，pp.435-438(1997))，因此可用于抗体制备：
区域1：CRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFC(SEQ ID NO：9中的AA43-70)
区域2：CRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPC(SEQ ID NO：9中的AA74-107)
区域3：CRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATAC(SEQ ID NO：9中的AA108-136)
本发明的另一方面，能特异结合神经胚活素或神经胚活素-衍生肽的抗体可用于检测各类介质中这类神经胚活素神经营养因子的存在，具体为用于诊断与本发明所述神经胚活素分子相关的病症或疾病。用于此类检测的多种方法包括ELISA，RIA和FACS，已为本领域已知。
本发明的抗体还可用于阻断神经胚活素神经营养因子的作用，具体可用作中和性抗体。
制备本发明多肽的方法
将包含编码本发明神经胚活素多肽的DNA的细胞培养在允许该多肽生成的条件下，然后从细胞培养物中回收该多肽，详述如下。当为制备神经胚活素多肽而对细胞进行基因修饰时，该细胞可用常规方法或基因活化来修饰。
根据常规方法，可将含神经胚活素cDNA或基因组DNA序列的DNA分子包含在一表达构建体中，然后通过常规方法转染细胞，所述方法包括但不限于脂质体-，polybrene-或DEAE葡聚糖-介导的转染，电穿孔，磷酸钙沉淀，微注射，或高速驱动微粒(velocity driven microprojectiles)(“biolistics”)。可替代地，可使用通过病毒载体递送DNA的系统。已知可用于基因转染的病毒包括腺病毒、腺-相关病毒、慢病毒、疱疹病毒、腮腺炎病毒、脊髓灰质炎病毒、逆转录病毒、新培斯病毒、痘苗病毒如金丝雀痘病毒、以及转染昆虫细胞，具体为SfP9昆虫细胞的杆状病毒。
可替代地，所述细胞可用基因活化(“GA”)方法，例如美国专利US5,733,761和US5,750,376中描述的方法，在此引入作为参考。
因此，本申请在涉及细胞时使用″基因修饰″意指构建细胞，该细胞在导入编码基因产物的DNA分子和/或可对该基因产物编码序列进行调节的调控元件后表达该特定基因产物。所述DNA分子可通过基因靶导入，从而将该DNA分子引入特定的基因组位点。
重组表达载体
本发明的另一方面提供了包含本发明所述多核苷酸的重组表达载体。本发明所述的重组表达载体可为任一合适的真核表达载体。优选的重组表达载体为含泛素启动子的载体pTEJ-8(FEBS Lett.1990267289-294)及其衍生物，例如pUbilZ。一种优选的商品化真核表达载体为，例如，含病毒启动子的载体pcDNA-3(可购自Invitrogen)。另一优选表达载体使用SV40早期及腺病毒主要晚期启动子(衍生自质粒pAD2beta；Norton and Coffin，Mol.Cell.Biol.5：281(1985))。
本发明还提供了原核表达载体以及带有为原核表达而最优化的密码子的合成基因(syngenes)。合成基因用较低含量GC和优选的细菌(例如，大肠杆菌)密码子构建。所述合成基因已克隆入两载体pET19b和pMJB164，pET19b的一种衍生物。pET19b的构建图示于图14。在该构建体中，编码神经胚活素的NBN113结构域的序列被直接融合于启动用的蛋氨酸上。pMJB164的构建图示于图15。
制备细胞
另一方面，本发明提供了基因工程制得的制备细胞，其中含有本发明所述的分离的多核苷酸和/或本发明所述的重组表达载体。本发明所述细胞具体地可通过基因工程操作瞬间或稳定表达、过-表达或共-表达本发明所述多肽。用于制备瞬间及稳定表达的方法已为本领域已知。
本发明所述多核苷酸可插入表达载体，例如质粒、病毒或其他表达载体，并且可操作地以一定方式连接到表达调控序列，该连接方式可实现编码序列在与表达调控序列匹配的条件下的表达。合适的表达调控序列包括启动子、增强子、转录终止子、启动密码子、内含子剪切信号、及终止密码子，这些都包括在本发明所述多核苷酸的正确阅读框内从而保证mRNA能合适翻译。表达调控序列还可包括另外构件如前导序列及融合伴侣序列。
该启动子可具体为组成型或诱导型启动子。当克隆于细菌系统中时，诱导型启动子如噬菌体λ的pL、plac、ptrp、ptac(ptrp-lac杂合启动子)可以使用。当克隆于哺乳动物系统中时，可以使用源自哺乳动物细胞基因组的启动子，例如，泛素启动子、TK启动子、或金属硫蛋白启动子，或者来自哺乳动物病毒的启动子，例如反转录病毒的长末端重复序列、腺病毒晚期启动子或痘苗病毒7.5K启动子。通过重组DNA或合成技术得到的启动子还可用于转录本发明所述的多核苷酸。
通常，合适的表达载体包括表达起点、启动子以及用于转化细胞表型筛选的特异基因，以及包括载体，如用于在细菌中表达的T7-为基础的表达载体(Rosenberg et al；Gene 1987 56 125)，用于在哺乳动物细胞中表达的pTEJ-8、pUbilZ、pcDNA-3和pMSXND(Lee and Nathans，J.Biol.Chem.1988263 3521)，用于昆虫细胞中表达的杆状病毒衍生载体以及卵母细胞表达载体PTLN(Lorenz C，Pusch M & Jentsch T J：Heteromultimeric CLC chloridechannels with novel properties；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1996 9313362-13366)。
在一优选的实施方案中，本发明所述细胞为真核细胞，例如哺乳动物细胞，如人细胞，卵母细胞，或酵母细胞。本发明所述细胞可以为但不限于人胚胎肾(HEK)细胞，如HEK 293细胞；BHK21细胞；中华仓鼠卵巢(CHO)细胞；滑爪蟾卵母细胞(XLO)细胞。在一个实施方案中，本发明的细胞为真菌细胞，例如丝状真菌细胞。在另一个实施方案中，本发明的细胞为昆虫细胞，最优选Sf9细胞。另外的本发明所述哺乳动物细胞为PC12，HiB5，RN33b细胞系，人神经祖细胞，其他的人细胞衍生细胞，尤其是神经细胞。
原代或继代细胞的实例包括成纤维细胞、上皮细胞包括乳腺和肠上皮细胞、内皮细胞、成血因子包括淋巴细胞和骨髓细胞、神经胶质细胞、肝细胞、角化细胞、肌细胞、神经细胞或这些细胞的前体。可用于本发明方法的无限增殖化人细胞系包括但不限于Bowes Melanoma细胞(ATCCAccession No.CRL 9607)，Daudi细胞(ATCC Accession No.CCL 213)，HeLa细胞和HeLa细胞衍生物(ATCC Accession Nos.CCL 2，CCL 2.1，和CCL 2.2)，HL-60细胞(ATCC Accession No.CCL 240)，HT-1080细胞(ATCC AccessionNo.CCL 121)，Jurkat细胞(ATCC Accession No.TIB 152)，KB癌细胞(ATCCAccession No.CCL 17)，K-562白血病细胞(ATCC Accession No.CCL 243)，MCF-7乳腺癌细胞(ATCC Accession No.BTH 22)，MOLT-4细包(ATCCAccession No.1582)，Namalwa细胞(ATCC Accession No.CRL 1432)，Raji细胞(ATCC Accession No.CCL 86)，RPMI 8226细胞(ATCC Accession No.CCL155)，U-937细胞(ATCC Accession No.CRL 1593)，WI-38VA13亚系2R4细胞(ATCC Accession No.CLL 75.1)，和2780AD卵巢癌细胞(Van der Blick etal.，Cancer Res.48：5927-5932，1988)，以及将人细胞和另一物种细胞融合制备的异源杂交瘤细胞。继代人成纤维细胞株，如WI-38(ATCC Accession No.CCL 75)和MRC-5(ATCC Accession No.CCL 171)，也可使用。
当本发明所述细胞为真核细胞时，本发明所述的异源多核苷酸引入的操作可具体通过感染(使用病毒载体)，通过转染(使用质粒载体)，使用磷酸钙沉淀、微注射、电穿孔、脂质体转染、或其他的本领域已知理化方法。
在更优选的实施方案中，本发明所述的分离多核苷酸序列和/或本发明所述的重组表达载体被转染入哺乳动物宿主细胞、神经组细胞、星形胶质细胞、T-细胞、造血干细胞、未-分化细胞、或大脑内皮细胞，其中包含至少一种能介导细胞无限增殖和/或转化的DNA分子。
宿主细胞中内源性基因的活化可通过导入调控元件，具体为导入能影响编码本发明所述神经胚活素多肽的内源基因转录的启动子。
药物组合物
另一方面，本发明提供了新药物组合物，其中包含治疗有效量的本发明所述多肽。
为了用于治疗，本发明所述多肽可以任一常规形式施用。在一优选的实施方案中，本发明所述的多肽与一种或多种佐剂、赋形剂、载体和/或稀释剂一起引入药物组合物，本领域技术人员可使用常规方法制得该药物组合物。
所述药物组合物可包含本发明所述多肽或其抗体。所述组合物可单独或与至少一种或多种其他试剂、药物或激素联合给药。
本发明的药物组合物可通过任一合适途径给药，包括但不限于口服、静脉内、肌肉内、动脉内、髓内、鞘内、心室内、经皮、皮下、腹膜内、鼻内、动脉、局部、舌下或直肠施用，口腔内、阴道内、眼眶内、大脑内、颅内、脊柱内、心室内、脑池内、囊内、肺内、经粘膜或经吸入。
肺内递送的方法、设备及药物制剂的描述，例如，见美国专利US5,785,049，5,780,019和5,775,320，在此引入作为参考。给药可采用定期注射快速灌注剂(bolus)，或者可由一贮器通过静脉内或腹膜内施用而更为连续地给药，该贮器可以是外在的(例如，IV包)或内置的(例如，生物可溶解的植入体、生物人造器官或一植入的产神经胚活素细胞群体)。参见，例如，美国专利4,407,957，5,798,113和5,800,828，在此引入作为参考。肺内递送方法和设备的描述见，例如美国专利5,654,007，5,780,014和5,814,607，在此引入作为参考。
具体而言，本发明中神经胚活素的给药可用任一合适递送手段实现，包括：(a)泵(参见，例如Annals of Pharmacotherapy，27：912(1993)；Cancer，41：1270(1993)；Cancer Research，44：1698(1984)，在此引入作为参考)，(b)微胶囊(参见，例如美国专利4,352,883；4,353,888；和5,084,350，在此引入作为参考)，(c)连续释放的聚合物植入体(参见，例如Sabel，美国专利4,883,666，在此引入作为参考)，(d)大胶囊(macroencapsulation)(参见，例如美国专利5,284,761，5,158,881，4,976,859和4,968,733和公开的PCT专利申请WO92/19195，WO95/05452，在此引入作为参考)；(e)CNS的裸露或非胶囊化细胞移植物(参见，例如美国专利5,082,670 and 5,618,531，each在此引入作为参考)；或(f)注射，皮下、静脉内、动脉内、肌肉内或其他合适位点；(g)口服，以胶囊、液体、片剂、丸剂或缓释剂。
本发明的一个实施方案中，将神经胚活素多肽直接递送入CNS，优选递送给脑室、脑实质、鞘内空间(intrathecal space)或其他合适的CNS位置，最优选鞘内。
在另一优选的实施方案中，本发明的神经胚活素多肽通过肌肉内注射、皮下注射、静脉内注射或静脉内灌注的递送系统给药。
其他有用的肠胃外递送系统包括乙烯-乙酸乙烯酯共聚物颗粒、渗透压泵、可植入灌注系统、泵递送、胶囊化细胞递送、脂质体递送、针-递送注射(needle-delivered injection)、无针注射(needle-less injection)、喷雾器、气雾器(aeorosolizer)、电穿孔以及经皮贴片(transdermal patch)。
制剂及施用技术进一步的细节可见最后一版的Remington′sPharmaceutical Sciences(Maack Publishing Co.，Easton，PA)。
所述活性成分可以每天一个或几个剂量施用。目前期望的合适剂量为每公斤体重每次施用神经胚活素0.5ng～约50μg，以及约1.0ng/kg～约100μg/kg每天。当直接递送给CNS时，所述的神经胚活素药物组合物提供的神经营养因子局部浓度为约5ng/ml脑脊髓液(“CSF”)～25ng/ml CSF。
当然，施用剂量必须要根据年龄、体重和待治疗个体健康状况、以及施用途径、剂型和治疗方案、以及期望结果进行认真调整，当然，确切剂量应由执业医生来确定。
其他实施方案中，本发明所述的神经胚活素多肽可通过基因递送施用，使用下面治疗方法部分中所述的细胞系和载体。为了制备这样的治疗性细胞系，可将本发明所述多核苷酸插入表达载体，例如质粒、病毒或其他表达载体，并且可操作地以一定方式连接到表达调控序列，该连接方式可实现编码序列在与表达调控序列匹配的条件下的表达。合适的表达调控序列包括启动子、增强子、转录终止子、启动密码子、内含子剪切信号、及终止密码子，这些都包括在本发明所述多核苷酸的正确阅读框内从而保证mRNA能合适翻译。表达调控序列还可包括另外构件如前导序列及融合伴侣序列。
该启动子可具体为组成型或诱导型启动子。组成性启动子可以为合成启动子、病毒启动子或者来源于哺乳动物细胞基因组的启动子，例如人泛素启动子。在一个优选的实施方案中，所述治疗性细胞系为表达本发明多肽的人无限增殖神经细胞系。在植入时，我们植入的细胞数为约105-1010个，更优选约106-108个细胞。
治疗方法
本发明涉及多核苷酸和蛋白、多肽、肽片段或由其制备的衍生物、以及抗所述蛋白、肽或衍生物的抗体，它们都可用于治疗或缓解有生命动物体，例如人的病症或疾病，所述病症或疾病响应神经营养剂的活性。
本发明的多肽可通过例如注射的、植入的或摄入的药物组合物直接使用来治疗可对神经胚活素多肽产生应答的病理过程。
本发明所述多核苷酸包括其互补序列，可用于表达本发明的神经营养因子。这一点可通过表达本发明所述蛋白、肽或衍生物的细胞系，或通过编码本发明所述蛋白、肽或衍生物的病毒载体，或通过表达本发明所述蛋白、肽或衍生物的宿主细胞来实现。可将这些细胞、载体和组合物施用到治疗靶区域来影响可对神经胚活素多肽应答的疾病或病症过程。
合适的表达载体可衍生自慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、疱疹或痘苗病毒，或者衍生自各种细菌制备的质粒，可用于体内将核苷酸序列递送到整个生物体或靶器官、靶组织或靶细胞群。其他方法包括但不限于脂质体转染，电穿孔，用含核或其他定位信号的载体肽转染，以及通过缓释系统基因递送。在本发明的另一方面，互补于神经胚活素基因或其部分的“反义”核苷酸序列可用于抑制或增强神经胚活素的表达。
另一方面，本发明涉及治疗或缓解有生命动物体的病症或疾病的方法，包括人，所述病症或疾病响应神经营养剂的活性。
所述病症或疾病可具体为因创伤、手术、缺血、感染、再灌注(reperfusion)、代谢性疾病、营养缺乏、恶性肿瘤或毒性剂导致的神经系统损伤，或者为遗传或自发过程。
具体而言，所述损伤发生于感觉神经元或视网膜神经节细胞，包括脊神经节或下列任一组织中的神经元：膝状神经节、岩神经节和结状神经节；第VIII脑神经的前庭听觉(vestibuloacoustic)复合体；三叉神经节上下颌叶的腹侧极；和中脑三叉神经核。
在本发明方法的优选实施方案中，所述疾病或病症为涉及损伤或创伤神经元的神经变性疾病，例如外周神经、延髓和/或脊髓的创伤性损伤，大脑缺血性神经元的损伤，神经病以及尤其外周神经病，外周神经创伤或损伤，缺血性中风(ischemic stroke)，急性脑损伤，急性脊髓损伤，神经系统肿瘤，多发性硬化症，神经毒素中毒(exposure to neurotoxins)，代谢疾病如糖尿病或肾功能障碍和感染因子导致的损伤，神经变性疾病包括阿耳茨海默氏病，亨廷顿舞蹈病，帕金森氏症，Parkinson-Plus综合症，进行性核上麻痹(Steele-Richardson-Olszewski综合症)，橄榄体脑桥小脑萎缩(OPCA)，夏-德雷综合征(多系统萎缩)，Guamanian帕金森神经功能障碍痴呆综合征，肌萎缩性(脊髓)侧索硬化，或其他任一先天性或神经变性疾病，以及与痴呆关联的记忆力减退。
在一优选的实施方案中，治疗对象为感觉和/或自主系统神经元。在另一优选的实施方案中，治疗对象为运动神经元疾病，例如肌萎缩性(脊髓)侧索硬化(“ALS”)和脊柱肌萎缩(spinal muscular atrophy)。另一优选实施方案中，用本发明所述神经胚活素分子加速神经的创伤性损伤后修复。一个实施方案中，用神经导管(nerve guidance channel)施用含神经胚活素多肽的基质。所述神经导管的描述见，例如，美国专利5,834,029，在此引入作为参考。
在一优选的实施方案中，本发明所述多肽和核酸(以及包含它们的药物组合物)用于治疗外周神经病。在用本发明分子治疗的外周神经病中有创伤导致的神经病，例如物理伤害或疾病状态导致的神经病，脑的物理损伤，脊髓的物理损伤，脑损伤相关的中风以及神经变性相关的神经紊乱。
治疗还可用于化疗-导致的神经病(例如使用化疗药物，例如紫杉醇或顺铂，导致的神经病)；毒素导致的神经病、药物导致的神经病、病原体导致的(例如，病毒导致的)神经病、维生素缺乏导致的神经病、自发性神经病以及糖尿病性神经病。参见，例如，美国专利5,496,804和5,916,555，在此引入作为参考。
本发明的神经胚活素核苷酸及多肽还可用于治疗单(mono)-神经病，单-多重神经病(mono-multiplex neuropathies)以及多(poly)-神经病，包括轴索及脱髓鞘神经病。
在另一优选的实施方案中，本发明的多肽和核酸(及含有它们的药物组合物)还可用于治疗眼睛的各种病症，包括患有黄斑变性的患者视网膜中光感受器丢失，色素性视网膜炎，青光眼以及类似疾病。
此外，本发明还提供了一种用于防止与上述疾病或病症关联的退行性变化的方法，通过向哺乳动物脑内植入能产生生物活性形式神经胚活素或神经胚活素前体的人类的载体或细胞进行，所述神经胚活素前体即一种很容易被机体转化为生物活性形式的神经胚活素的分子，或者另外，还可将分泌神经胚活素的细胞胶囊化，例如封入半透膜内。
合适的细胞包括构建用于制备神经胚活素的细胞，该细胞可体外培养用于移植入包括人的哺乳动物脑中。
在一优选的实施方案中，将编码本发明所述多肽的基因转染入合适的细胞系，例如转染入无限增殖的大鼠神经干细胞系如HiB5和RN33b，或转染入人无限增殖的神经祖细胞系，然后将得到的细胞系植入活体，包括人脑内，以使在CNS中分泌本发明所述治疗用多肽，例如，使用国际专利申请WO98/32869中所述的表达载体。
诊断和筛选方法
神经胚活素核酸可用于确定个体是否有因神经胚活素基因缺陷，例如神经胚活素等位基因缺陷而发生的神经性疾病的倾向，该缺陷是由于例如基因遗传、胚胎发育异常或后天DNA损伤而导致的。该分析可通过，例如，检测神经胚活素基因中的缺失或点突变，或者通过检测所述具有特定限制片段长度多态性(RFLPs)基因缺陷倾向的遗传，通过用特异于神经胚活素基因的核酸探针杂交来自患者的核酸样品检测有无存在正常神经胚活素基因，以及测定探针能否杂交所述核酸。
具体而言，神经胚活素核酸可用作杂交探针。所述杂交试验可用于检测、预测、诊断或监测与神经胚活素编码mRNA水平异常相关的各种病症、紊乱或疾病状态。神经胚活素核酸可构建为神经胚活素神经营养因子-依赖性生理过程的“标记”。这些过程包括但不限于“正常的”生理过程(例如，神经元功能)和病理过程(例如，神经变性疾病)。神经胚活素和/或编码神经胚活素的mRNA水平异常(即升高或不足)的特定患者亚群的特性可导致新的疾病分类。本发明中的“水平异常”是指与通过定量或定性方法确定无病症的对照样本或个体相比水平升高或降低。
本发明的神经胚活素核酸和多肽还可用于筛选及鉴定神经胚活素类似物，包括神经胚活素的小分子模拟物。在一个实施方案中，本发明提供了用于鉴定能引发神经胚活素-介导生物反应的侯选化合物的方法，该方法包括下述步骤：提供一种当接触神经胚活素时可被诱导表达可检测产物的试验细胞，将该细胞暴露于所述侯选化合物，检测所述可检测产物。该可检测产物的表达说明该侯选化合物能诱导神经胚活素-介导的生物效应。
另外，本发明的神经胚活素核酸和多肽可用于DNA芯片或蛋白芯片，或用于鉴定相关新基因序列及其编码蛋白，包括等位变体及单核苷酸多态性(“SNPs”)的电脑程序中。所述方法的描述见，例如，美国专利5,795,716；5,754,524；5,733,729；5,800,992；5,445,934；5,525,464，在此引入作为参考。
实施例
实施例1：分离神经胚活素核酸的方法
方法1：快速筛选人胎儿脑cDNA以寻找神经胚活素基因
通过与人persephin同源性比较，从提交到GenBank的两个高通量基因组序列(HTGS)(登录号为AC005038和AC005051)中鉴定出一290bp的片段。从该290bp片段的核酸序列，合成两个神经胚活素特异性引物。所述的神经胚活素顶(top)链引物(“NBNint.正义”)的序列为5-CCT GGC CAGCCT ACT GGG-3′(SEQ ID NO：17)。所述的神经胚活素底(bottom)链引物(“NBNint.反义”)的序列为5′-AAG GAG ACC GCT TCG TAG CG-3′(SEQ IDNO：18)。用这些引物，进行96-孔PCR反应。
将来自500,000cDNA克隆的质粒DNA，添加入96-孔主板，每孔中大约5000个克隆。96-孔亚板使用大肠杆菌DH10B甘油原液，每孔中大约50个克隆。
用聚合酶链反应(“PCR”)技术通过3轮扩增鉴定神经胚活素核酸；扩增增加了样本中核酸的拷贝数。
主板筛选：用上述的96-孔PCR筛选技术，用基因-特异性引物从人胎儿脑cDNA主板中分离人神经胚活素cDNA。
从主板相应的孔获取30纳克(30ng)人胎儿脑cDNA(6ng/μl；OrigeneTechnologies)，置于含下列试剂的总体积25μl的反应液中：上述两基因特异性引物(即，NBNint.正义和NBNint.反义)各0.2mM，1X标准PCR缓冲液(缓冲液V，Advanced Biotechnologies，UK)，0.2mMdNTPs(Amersham-Pharmacia)，0.1M GC-Melt(Clontech Laboratories，USA)；和0.5单位Taq DNA聚合酶(5U/μl；Advanced Biotechnologies，UK)。
用下述步骤和条件进行PCR热循环反应。首先DNA在94℃下变性3分钟，然后进行35个循环的扩增：94℃变性1分钟，55℃退火1分钟，72℃延伸90秒；最后72℃延伸5分钟。96个独立的PCR反应的产物用含溴化乙锭染料的2％琼脂糖凝胶电泳分析。从一个孔中观察到了102bp的阳性PCR产物，该产物对应于一个独一无二的96-孔亚板。
所述102bp核酸片段具有下列序列(SEQ ID NO：13)：
5′-CCTGGCCAGCCTACTGGGCGCCGGGGCCCTGCGACCGCCCCCGGGCTCCCGGCCCGTCAGCCAGCCCTGCTGCCGACCCACGCGCTACGAAGCGGTCTCCTT-3′
亚板筛选：通过PCR介导的扩增对96-孔人胎儿脑亚板进行筛选，将1μl来自相应亚板孔的甘油原液置于含下列成分的25μl反应液中：两基因特异性引物各0.2mM；1X标准PCR缓冲液(缓冲液V，AdvancedBiotechnologies，UK)；0.2mM dNTPs(Amersham-Pharmacia)，0.1μMGC-Melt(Clontech Laboratories，USA)；和0.5单位Taq DNA聚合酶(5U/l；Advanced Biotechnologies，UK)。
用与主板筛选时相同的PCR热循环反应条件。96个PCR反应产物用含溴化乙锭的2％琼脂糖凝胶电泳分析，鉴定出一阳性孔中生成了102bp的PCR片段。
集落PCR：从上述阳性亚板孔取1ml甘油原液，用Luria肉汤(LB)1：100倍稀释。然后，将上述稀释液1ml和10ml分置于两个含Luria肉汤(″LB″)和100μg/ml羧苄青霉素的琼脂平板。
然后，将LB平板30℃孵育过夜。从这些平板，挑取96个克隆置于一新的含下列成分的96-孔PCR平板：上述两基因特异性引物各0.2mM；1X标准PCR缓冲液(缓冲液V，Advanced Biotechnologies，UK)；0.2mMdNTPs(Amersham-Pharmacia)，0.1M GC-Melt(Clontech Laboratories，USA)；和0.5单位Taq DNA聚合酶(5U/μl；Advanced Biotechnologies，UK)，终体积为25μl。
使用与上述主板筛选时相同的PCR热循环条件。96个PCR反应产物用含溴化乙锭的2％琼脂糖凝胶电泳分析，结果鉴定出一个含102bp片段的阳性集落(colong)。
对从该阳性集落制备的质粒DNA测序发现全长的cDNA为861bp(SEQID NO：8)。该cDNA编码前-原-神经胚活素(SEQ ID NO：9)。使用BigDye终止子循环测序试剂盒(PE Applied Biosystems，USA)进行自动DNA测序。将该测序凝胶置于ABI Prism 377(PE Applied Biosystems，USA)上跑胶。
方法2：从人脑克隆神经胚活素cDNA：
扩增全长神经胚活素cDNA或cDNA片段的另外的方法可以使用RACE(cDNA末端快速扩增)和上述的神经胚活素特异性引物NBNint.正义和NBNint.反义，结合使用载体特异性或衔接子(adapter)特异性引物，例如使用Marathon cDNA扩增试剂盒(Clontech Laboratories，USA，Cat.No.K1802-1)。
可以使用总人脑Marathon-Ready cDNA(Clontech Laboratories，USA，Catalogue.No.7400-1)扩增全长神经胚活素cDNA。可用于扩增的引物包括神经胚活素顶链引物5’-ATGGAACTTGGACTTGG-3’(SEQ ID NO：19)(“NBNext.正义”)，和神经胚活素底链引物5’-TCCATCACCCACCGGC-3’(SEQ ID NO：20)(“NBNext.反义”)，结合使用包含在Marathon-Ready cDNA中的衔接子引物API。还使用了另一种顶链引物5’-CTAGGAGCCCATGCCC-3’(SEQ ID NO：28)。也还使用了另一种底链引物5’--GAGCGAGCCCTCAGCC-3’(SEQ ID NO：33)。同样地，还可以使用其他底链引物SEQ ID NOS.：24和26。
方法3：从人脑克隆神经胚活素cDNA：
另一种克隆神经胚活素cDNA的方法是用一种或多种本发明所述神经胚活素探针筛选成人或人胎儿脑文库(例示于图1)。这些文库包括：λgt 11人脑(Clontech Laboratories，USA，Cat.No.HL3002b)；或λgt 11人胎儿脑(Clontech Laboratories，USA，Cat.No.HL3002b).
方法4：从小鼠胎儿cDNA中快速筛选神经胚活素基因
用下述方式进行神经胚活素基因的快速筛选。将来自500,000cDNA克隆的质粒DNA，添加入96-孔主板，每孔中大约5000克隆。96-孔亚板使用大肠杆菌甘油原液，每孔中大约50克隆。为了鉴定出目的基因(即，神经胚活素)，进行3轮PCR介导的扩增。
主板筛选：用基因-特异性引物通过96-孔PCR从小鼠胎儿脑cDNA主板中分离小鼠神经胚活素cDNA。合成下列两种引物：
(1)神经胚活素C2引物(NBNint.正义)：5′-GGCCACCGCTCCGACGAG-3′(SEQ ID NO：21)；和(2)神经胚活素C2as引物(NBNint.反义)：5′-GGCGGTCCACGGTTCTCCAG-3’(SEQ ID NO：22)。用这两种基因特异性引物鉴定出一220bp的阳性PCR产物。该220bp核酸具有下列序列(SEQ ID NO：14)：
5′-GGCCACCGCTCCGACGAGCTGATACGTTTCCGCTTCTGCAGCGGCTCGTGCCGCCGAGCACGCT CCCAGCACGATCTCAGTCTGGCCAGCCTACTGGGCGCTGGGGCCCTACGGTCGCCTCCCGGGTCCCGGCCGATCAGCCAGCCCTGCTGCCGGCCCACTCGCTATGAGGCCGTCTCCTTCATGGACGTGAACAGCACCTGGAGAACCGTGGACCGCC-3′
然后用下述方式进行96-孔PCR反应。从主板相应的孔获取30纳克(30ng)小鼠胎儿脑cDNA(6ng/μl；Origene Technologies)，置于含下列试剂的总体积25μl的反应液中：上述两基因特异性引物(即，C2引物(NBNint.正义)和C2as(NBNint.反义))各0.2mM，1X标准PCR缓冲液(缓冲液V，AdvancedBiotechnologies，UK)，0.2mM dNTPs(Amersham-Pharmacia)，0.1MGC-Melt(Clontech Laboratories，USA)；和0.5单位Taq DNA聚合酶(5U/ìl；Advanced Biotechnologies，UK)。
使用下述PCR热循环条件：首先DNA在94℃下变性3分钟，然后进行35个循环的扩增：94℃变性1分钟，55℃退火1分钟，72℃延伸90秒；最后72℃延伸5分钟。96个独立的PCR反应的产物用含溴化乙锭的2％琼脂糖凝胶电泳分析。从一个孔中观察到了220bp阳性PCR产物，该产物对应于一个独一无二的96-孔亚板。然后用含溴化乙锭染料的2％琼脂糖凝胶进行凝胶电泳分析。已经鉴定的220bp阳性PCR产物对应于96-孔亚板中的一个独一无二的孔。
亚板筛选：通过PCR介导的扩增对96-孔小鼠胎儿脑亚板进行筛选，将1μl来自相应亚板孔的甘油原液置于含下列成分的最终的总体积25μl反应液中：上述两基因特异性引物各0.2mM；1X标准PCR缓冲液(缓冲液V，Advanced Biotechnologies，UK)；0.2mM dNTPs(Amersham-Pharmacia)，0.1M GC-Melt(Clontech Laboratories，USA)；和0.5单位Taq DNA聚合酶(5U/μl；Advanced Biotechnologies，UK)。用上述主板筛选条件进行PCR热循环。
96个PCR反应产物用含溴化乙锭的2％琼脂糖凝胶电泳分析，鉴定出产生220bp片段的阳性孔。
集落PCR：从上述阳性亚板孔取1ml甘油原液，用Luria肉汤(LB)1：100倍稀释。然后，将上述稀释液1ml和10ml分置于两个含100μg/ml羧苄青霉素的LB平板，30℃下孵育过夜。分离96个克隆，转移到含下列成分的96-孔PCR平板：上述两基因特异性引物各0.2mM；1X标准PCR缓冲液(缓冲液V，Advanced  Biotechnologies，UK)；0.2mMdNTPs(Amersham-Pharmacia)，0.1M GC-Melt(Clontech Laboratories，USA)；和0.5单位Taq DNA聚合酶(5μU/μl；Advanced Biotechnologies，UK)，终体积为25μl。
使用上述(见“主板筛选”部分，上文)条件进行PCR热循环。96个PCR反应产物用含溴化乙锭的2％琼脂糖凝胶进行电泳分析，鉴定出一个含220bp片段的阳性集落。从该阳性集落制备质粒DNA。使用BigDye终止子循环测序试剂盒(PE Applied Biosystems，USA)用AmpliTagDNA聚合酶进行自动DNA测序的方法，对该克隆测序。该测序凝胶在ABI Prism 377(PE AppliedBiosystems，USA)上跑胶。该克隆得到序列为全长2136bp cDNA(SEQ ID NO：15)。该cDNA包括一开放阅读框，其推测的氨基酸序列见SEQ ID NO：16，其编码小鼠前-原-神经胚活素多肽。
实施例2：基因组神经胚活素的克隆
如上所述，申请人从两个已进入GenBank中的人BAC克隆(登录号为AC005038和AC005051)鉴定到一290bp核酸片段，其具有与persephin及persephin侧翼序列同源的区域。申请人用Lasergene软件(DNAStar，Inc.)从上述的861bp推测序列设计另外的引物，用以克隆编码其他神经胚活素核酸的核酸。用两对引物通过PCR反应从基因组DNA克隆神经胚活素基因。这两对引物显示如下。
引物对No.1
5′CCA AgC CCA CCT ggg TgC CCT CTT TCT CC 3′(正义)(SEQ ID NO：23)
5′CAT CAC CCA CCg gCA ggg gCC TCT CAg 3′(反义)(SEQ ID NO：24)
引物对No.2
5′gAgCCCAtgCCCggCCTgATCTCAgCCCgA ggACA 3′(正义)(SEQ ID NO：25)
5′CCCTggCTgAggCCgCTggCTAgTgggACTCTgC 3′(正义)(SEQ ID NO：26)
使用引物对No.1，从购自Clontech Laboratories，(Cat.No.6550-1)的人基因组DNA制品中扩增出一887bp的DNA片段。
PCR方法：使用缓冲液1用ExpandTM High Fidelity PCR系统(Boehringer Mannheim)进行PCR扩增。所述PCR反应混合物含5％二甲基亚砜(DMSO)和每种dNTP各17.5pmol，总体积50μl。进行如下热循环：94℃预变性2分钟，然后进行35个两-步骤循环：分别为94℃，10秒；68℃，1分钟。68℃下孵育5分钟终止热循环。在PTC225 DNA Engine Tetrad热循环仪(MJ Research，MA)中进行热循环反应。用2％琼脂糖(FMC)凝胶电泳分析测序产物，然后拍照。
将使用引物对No.1，从人基因组DNA中扩增的887bp片段克隆入pCRII载体(Invitrogen)，然后转化入XL 1-Blue感受态大肠杆菌细胞(Stratagene)。得到的质粒命名为神经胚活素-2，用热测序酶(AmershamPharmacia Biotech)测序。在ALFExpress自动测序仪(Amersham PharmaciaBiotech)上电泳分析测序产物。
对用第二对引物(上述引物对No.1)PCR扩增人基因组DNA得到的片段进行测序，在开放阅读框的3′引物末端发现另外一42bp的区域。通过与其它神经营养因子核酸序列进行比较，以及通过用基因发现(gene-finding)软件程序进行外显子-内含子边界作图，分析全长序列，该软件程序用Netgene和Gene Mark软件(Brunak et al.，J：Mol.Biol.，220，pp.49-65(1991)；Borodovsky et al.，Nucl.Acids Res.，23，pp.3554-62(1995))能鉴定出可能的剪接接全部及高编码潜能的区域。用上述快速筛选得到的cDNA确证外显子-内含子的边界。
如图7所示，得到的神经胚活素基因具有两个其间被一70bp内含子分隔的外显子。合在一起，这些外显子具有全长神经胚活素多肽的推测氨基酸序列。推测的cDNA(SEQ ID NO：3)包含一编码238个氨基酸残基(SEQ IDNO：4)的开放阅读框(ORF)。神经胚活素-2克隆中包含原-神经胚活素的完整编码序列。所述基因编码的氨基酸序列表明persephin、neurturin和GDNF三种蛋白高度同源。
实施例3：神经胚活素核酸的表达
在各个发育中未成熟阶段和成熟阶段，用下述技术在啮齿类和人的神经及非-神经组织中都进行了神经胚活素RNA表达的检测。
用RT-PCR检测神经胚活素RNA表达的方法：在鉴定为SEQ ID NO：1的神经胚活素DNA序列基础上，合成下列引物：(1)神经胚活素C2引物5′-GGCCACCGCTCCGACGAG-3′(SEQ ID NO：21)，和(2)神经胚活素C2as引物5′-GGCGGTCCACGGTTCTCCAG-3′(SEQ ID NO：22)。用该套引物从成人和胎儿人全-脑mRNA中RT-PCR扩增DNA片段。用该反应从DNA片段中制备到一220bp片段。对220bp DNA片段鉴定证实：神经胚活素基因表达于成人和胎儿脑组织中。用这些引物也从基因组DNA扩增到一220bpDNA片段。
用northern印迹杂交检测神经胚活素RNA表达的方法：
成年人组织的带polyA+RNA的Northern印迹购自商品供货商(Clontech Laboratories，USA)，用32P-标记的神经胚活素cDNA探测。标记的神经胚活素cDNA用上述实施例1所述方法制得。
探针制备：用Rediprime II标记试剂盒(Amersham；Cat No.RPN1633)标记神经胚活素核酸DNA片段(SEQ ID NO：8的296-819位核苷酸)用作杂交探针，遵照厂商推荐方法。简而言之，将DNA样品稀释到浓度为45μl 10mM TE缓冲液(10mM Tris-HCI，pH8.0，1mM EDTA)中含2.5-25ng的浓度。通过在沸水浴中将样品加热到95-100℃使DNA变性5分钟，将样品置于冰上5分钟使其骤冷，然后稍作离心将成分沉淀至反应管底。将全部变性后的DNA与5μl Redivue(32P)dCTP(Amersham Pharmacia Biotech Ltd.)一起加入反应管，该管内含dATP，dGTP，dTTP，无核酸外切酶的Klenow酶以及干燥稳定形式的随机引物的缓冲溶液。通过移液管上下吹打两次，移液枪头在溶液中来回移动，混合该溶液，然后将反应混合物在37℃下孵育10分钟。加入5μl 0.2M EDTA终止反应。为了用作杂交探针，将DNA样品加热至95-100℃5分钟将标记DNA变性为单链，然后在冰上将DNA样品骤冷5分钟。将该管离心，将其内容物充分混合。最后，用核苷酸去除(NucleotideRemoval)试剂盒(Qiagen)纯化单链DNA探针。
杂交技术：制备的northern印迹购自商品供货商(″多组织Northern印迹，Clontech Laboratories，USA，目录号7760-1和7769-1)，用上述方法制备的神经胚活素32P-标记探针按照厂商推荐的方法进行杂交。为了杂交，使用ExpressHyb溶液(Clontech Laboratories，USA)，并使用浓度约3ng/ml的标记探针。将上述ExpressHyb溶液加热至68℃，然后搅拌溶解所有沉淀物。按照厂商推荐的方法，在Hybaid杂交烤箱内，将每一northern印迹膜(10×10cm)在至少5ml ExpressHyb溶液中68℃预杂交30分钟。将神经胚活素32P-标记探针在95-100℃下变性2分钟，然后置于冰上骤冷。将14微升(14μl)标记探针加入5ml新鲜的ExpressHyb，充分混合。通过将含标记的DNA探针的新鲜ExpressHyb溶液5ml均匀分布于印迹上，取代预杂交使用的ExpressHyb溶液。将印迹在Hybaid杂交烤箱中68℃孵育1小时。孵育后，先用低严谨(2x SSC缓冲液，内含0.05％SDS，室温)，然后用高严谨洗液(0.1x SSC，内含0.1％SDS，50℃)(20X SSC为0.3M NaCl/0.3M柠檬酸钠，pH 7.0)，漂洗并冲洗数次。然后，在-80℃下用增光屏，将印迹用HyperfilmMP(Amersham Pharmacia Biotech Ltd.)成像。
Northern印迹杂交试验的结果图示于图1。图1A(左边)和图1B(右边)为polyA+RNA的northern印迹，按实施例3所述用32p标记的神经胚活素cDNA进行探测。标准参照物为大小为1.35千碱基对(“kb”)，2.4kb，4.4kb，7.5kb，和9.5kb的多核苷酸。图1A的膜用来自各种成人组织的mRNA提取物制备而成：从这些northern印迹杂交试验的结果，申请人推断出神经胚活素mRNA表达于多种成人组织。在心脏、骨骼肌和胰腺中检测到的神经胚活素表达水平最高。图1B的膜用来自成人脑不同区域的RNA提取物制备而成。在成人脑内，在尾状核和丘脑中的表达水平最高。约5kb的mRNA转录本是脑中表达的神经胚活素mRNA的主要形式。
用原位杂交检测组织中神经胚活素RNA表达的方法：
用下述技术用神经胚活素反义探针测量动物组织中的神经胚活素RNA表达，例如，啮齿类组织。
小鼠中的表达：
制备组织样本：在受孕第13.5和18.5天，用颈部脱位的方法杀死Time妊娠期小鼠(B & K Universal，Stockholm，Sweden)。在无菌条件下解剖取出胚胎，立即浸入含4％多聚甲醛(“PFA”)的0.1M磷酸盐缓冲液(PB)，24-30小时，然后从PFA中取出置于PBS中。通过将该组织置于30％蔗糖溶液中然后用TissueTech(O.C.T.Compound，Sakura Finetek USA，Torrance，CA)包埋，制备组织切片。在低温切片机上切出六套冠状或矢状切片(都为12μm)，并解冻封固到带正电的玻璃载片上。将同样操作后的新生儿头/脑(P1，P7)固定用于胚胎阶段的检测，解剖成人脑组织立即用干冰冷冻，不进行任何预先包埋直接在低温切片机上切片。
制备神经胚活素核糖探针：反义神经胚活素RNA探针(本申请称为“神经胚活素核糖探针”)按下述方法制备。将小鼠神经胚活素cDNA序列(SEQID NO：15)中1109-1863位核苷酸亚克隆入BlueScript载体(Stratagene)。用EcoRI限制性内切酶将得到的质粒切割成为线性DNA。按照厂商推荐的方法(Boehringer Mannheim)，用T3RNA聚合酶和地高辛(“DIG”)RNA标记试剂盒，将得到的EcoRI DNA片段进行体外转录。
杂交：冷冻切片用4％PFA固定10分钟，用10mg/ml蛋白酶K处理5分钟，接着分别用70％和95％乙醇脱水5和2分钟，然后空气干燥。含1μg/ml地高辛标记探针的杂交缓冲液(50％的去离子甲酰胺，10％的50％葡聚糖硫酸酯溶液，1％的Denhardt′s溶液，250μg/ml酵母tRNA，0.3M NaCl，20mM Tris-HCl(pH8)，5mM EDTA，10mM NaPO4，1％十二烷基肌氨酸钠)80℃下加热2分钟，然后施加到切片上。然后用石蜡包被切片，在55℃孵育16-18小时。
次日，将切片在高严谨(含50％甲酰胺的2x SSC)条件55℃洗涤30分钟，然后用RNase缓冲液洗涤，并用20μg/ml RNaseA 37℃下孵育30分钟。为了检测DIG-标记探针，将切片在封闭液(含0.1％Tween-20和10％热灭活山羊血清的PBS)中预孵育1小时，然后用碱性磷酸酶偶联的抗-DIG抗体(Boehringer Mannheim)的1∶5000稀释液在4℃孵育过夜。次日，用含0.1％Tween20的PBS洗涤4次，每次2小时，然后用NTMT缓冲液(100mM NaCl，100mM Tris-HCl(pH9.5)，50mM MgCl2，0.1％Tween-20)洗涤2次，每次10分钟。然后，将切片孵育在含0.5mg/ml左旋咪唑的BM-紫底物中孵育48小时。用PBS洗涤终止显色反应。空气干燥切片，并用带有DPX的盖玻片(KEBO-lab，Sweden)覆盖。
原位杂交反应的结果列于表1。
表1：神经胚活素在小鼠体内的表达
  结构   E13.5   E18.5   P1   P7   成年
  前脑腹侧中脑脊神经节脊髓视网膜嗅球牙髓三叉神经节纹状体脑皮层齿状回   ++-+++ ++++++++++++ ++++++++++++ ++++++++++++ ++
如表1所示，第13.5天的胚胎(“E13.5”)中，神经胚活素表达于脊髓和后脑，微量表达于前脑。另外，还在发育中的视网膜和感觉神经节(脊神经节和三叉神经节(V))中检测到了神经胚活素的表达。在神经系统之外，在肾、肺和小肠中发现微弱信号，表明神经胚活素还表达于这些组织。
第18.5天胚胎(“E18.5”)中，神经胚活素主要表达于三叉神经节(V)。另外，还在视网膜、纹状体和脑皮质中检测到神经胚活素的表达。此外，表达还见于牙本质(tooth anlage)。
从表1还可以看出，从E 18.5时间点到出生后第1和7天，脑皮质、纹状体三叉神经节(V)中的神经胚活素表达量增加。与脑皮层的内层相比，神经胚活素表达更主要地出现在脑皮层的外层。在出生后的第7天(P7)，第1天出现表达的结构中同样都出现了表达，但是此外神经胚活素的表达还见于海马，特别是齿状回和小脑。在成年小鼠脑内，神经胚活素强表达于齿状回，而在其他测试组织中神经胚活素的表达量极低或者检测不到。
大鼠中的表达：
下列试验描述了用碱性磷酸酶-标记的寡脱氧核苷酸神经胚活素反义探针与大鼠组织的杂交。
制备组织样本：戊巴比妥麻醉后从怀孕的Wistar大鼠(Mlleg rd，Denmark)体内获取大鼠胚胎(E14)。用断头的方法杀死出生后的大鼠(P0，P7，成年)。将剖开的脑和整个头立即浸入冰冷的0.9％NaCl中，新鲜冷冻，在低温切片机上以20μM进行切片(冠状切片和矢状切片，10套)。
原位杂交：其中的两套切片用偶联有碱性磷酸酶(AP)的寡脱氧核苷酸探针(5′-NCA GGT GGT CCG TGG GGG GCG CCA AGA CCG G-3′(SEQ IDNO：27)，Oligo.No.164675，DNA Technology，Denmark，)。该探针互补于小鼠神经胚活素cDNA SEQ ID NO：15中的1140-1169位碱基。
杂交前，将切片在室温下空气干燥，55℃加热10分钟，然后用96％乙醇4℃处理过夜。然后空气干燥该切片，并孵育于杂交介质(5.0μmol探针/ml)39℃过夜(Finsen et al.，1992，Neurosci.47：105-113；West et al.，1996，J.Comp.Neurol.，370：11-22).
杂交后的处理包括：用1X SSC(0.15M NaCl，0.015M柠檬酸钠)55℃漂洗4次，每次30分钟；然后用Tris-HCl，pH9.5室温下漂洗3次，每次10分钟，然后加入AP显色剂。AP显色剂在使用前即时配制，其中包含氮蓝四唑(NBT，Sigma)、5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸(BCIP，Sigma)和Tris-HCl-MgCl2缓冲液，pH9.5(Finsen et al.，Neurosci.1992 47 105-113)。AP显色在室温暗室中进行48小时。用蒸馏水漂洗切片，终止显色反应。切片用等级丙酮脱水，用二甲苯-苯酚木馏油(Allchem，UK)软化，用二甲苯澄清，并用Eukitt(Bie & Berntsen，Denmark)盖片。
对照反应有(1)杂交前用RNase A(50μg/ml，Pharmacia，Sweden)预处理切片；(2)用过量百倍的未标记探针杂交切片；以及(3)单用杂交缓冲液杂交切片。杂交反应结果列于表2。
表2：神经胚活素在大鼠体内的表达
  结构   E14   P0/P1   P7   成年
  前脑腹侧中脑脊神经节脊髓视网膜嗅球小脑三叉神经节纹状体脑皮层海马   ++-++++(+)(+) ++++++++(+) +++++++(+)++++ ++++
第14天的胚胎(E14)中，神经胚活素弱表达于大鼠胚胎的前脑、后脑和脊髓中。另外，还在眼(视网膜)、脊神经节、三叉神经节(V))以及肾、肺、心、肝和小肠中检测到了神经胚活素的表达。新生大鼠(PO)中，神经胚活素在脑皮层和纹状体内有显著的表达。神经胚活素表达还可在嗅球和海马中检测到。7日龄(P7)大鼠中，神经胚活素表达于脑皮质、纹状体、嗅球和小脑中。海马中可见显著信号。成年大鼠中，脑的大多数区域中神经胚活素表达量极低或者检测不到。丘脑核检测到弱信号，海马中检测到显著的神经胚活素表达。
实施例4：神经胚活素多肽
SEQ ID NO：8中鉴定的开放阅读框或编码区(CDS)编码前-原-多肽(命名为“前-原-神经胚活素”).从该开放阅读框推测出的氨基酸序列显示于SEQ ID NO：9。在SEQ ID NO：9基础上，鉴定到神经胚活素多肽的三种变体。这些变体包括：(i)本申请中称为NBN140的多肽，其具有SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列；(ii)本申请中称为NBN116的多肽，其具有SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列；和(iii)本申请中称为NBN113的多肽，其具有SEQ IDNO：12所示的氨基酸序列。
类似地，SEQ ID NO：3中鉴定的编码区(CDS)编码具有氨基酸序列(命名为SEQ ID NO：4)的前-原-多肽。以该编码区为基础，鉴定到神经胚活素的三种变体。这些变体包括：(i)具有SEQ ID NO：5所示氨基酸序列的多肽；(ii)具有SEQ ID NO：6所示氨基酸序列的多肽；和(iii)具有SEQ ID NO：7所示氨基酸序列的多肽。
基于以Clustal W(1.75)为基础的多序列比对，将SEQ ID NO：9(第2行)所示的神经胚活素与neurturin(SEQ ID NO：49；第1行)、persephin(SEQ IDNO：50；第3行)和GDNF(SEQ ID NO：51；第4行)的氨基酸序列进行比对。该比对显示于表3。
                          表3：
神经胚活素与Persephin、Neurturin和GDNF的氨基酸序列对比
Neuturin-完整  --------------------MQRWKAAALASVLCSSVLSIWMCREGLLLSHRLGPA
神经胚活素     MELGLGGLSTLSHCPWPRRQPALWPTLAALALLSSVAEASLGSAPRSPAPREGPPP
Persephin-完整 --------------------------------------------------------
GDNF-人-完整   -----MKLWDVVAVCLVLLHTASAFPLPAGKRPPEAPAEDRSLGRRRAPFALSSDS
Neuturin-完整  LVPLHRLPRTLDARIARLAQYRALLQGAPDAMELRELTPWAGRPPGPRRRAGPRRR
神经胚活素     VLASPAGHLPGGRTARWCSGRARRPPPQPSRPAPPPPAPPSALPRGGRAARAGGPG
Persephin-完整 -MAVGKFLLGSLLLLSLQLGQGWGPDARGVPVADGEFSSEQVAKAGGTWLGTHRPL
GDNF-人-完整   NMPEDYPDQFDDVMDFIQATIKRLKRSPDKQMAVLPRRERNRQAAAANPENSRGKG
Neuturin-完整  RARARLGARPCGLRELEVRVSE LGLGYASDETVL FRYCAGACEA-AARVYDLGLRR
神经胚活素     SRARAAGARGCRLRSQLVPVRA LGLGHRSDELVR FRFCSGSCRR-ARSPHDLSLAS
Persephin-完整 ARLRRALSGPCQLWSLTLSVAE LGLGYASEEKVI FRYCAGSCPRGARTQHGLALAR
GDNF-人-完整   RRGQRGKNRGCVLTAIHLNVTD LGLGYETKEELI FRYCSGSCDA-AETTYDKILKN
                         * *     : *  ****: :.* : **:*:*:*   *   :.  *
Neuturin-完整  LRQRRRLRRE---RVRA QPCCRPTAYEDEVSFLDAHSRYHTVHEL SARECACV-
神经胚活素     LLGAGALRPPPGSRPVS QPCCRPTRYE-AVSFMDVNSTWRTVDRL SATACGCLG
Persephin-完整 LQGQGRAHGG-------- PCCRPTRYT-DVAFLDDRHRWQRLPQL SAAACGCCG
GDNF-人-完整   LSRNRRLVSD----KVG QACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILRKH SAKRCGCI-
                 *                  .****   :   ::*:* .  :: :  . **  *. *
*表示具有单个、全保守残基的位置。
:表示下列“强”基团其中之一是全保守的：-STA，NEQK，NHQK，NDEQ，QHRK，MILV，MILF，HY，FYW。
*表示下列“弱”基团其中之一是全保守的：-CSA，ATV，SAG，STNK，STPA，SGND，SNDEQK，NDEQHK，NEQHRK，HFY。
从表3所示的氨基酸序列比对，可以看出神经胚活素有7个保守的半胱氨酸残基，位于TGF-β超家族的保守位置。在一些实施方案中，优选的神经胚活素多肽含有(7个)保守的半胱氨酸位于SEQ ID NO：2中第8，35，39，72，73，101和103位或者SEQ ID NOS：4和9的第43，70，74，107，108，136和138位。已知TGF-β超家族中的这7个保守的半胱氨酸残基形成3个单体内二硫键(可预想到的有，例如SEQ ID NO：2中半胱氨酸残基8-73、35-101和39-103之间，以及例如SEQ ID NOS：4和9中半胱氨酸残基43-108，70-136，和74-138之间)和1个单体间二硫键(可想到的有，例如SEQID NO：2中半胱氨酸残基72-72之间，以及例如，SEQ ID NOS：4和9中半胱氨酸残基107-107之间)，它们与延伸的β链区域一起形成TGF-β超家族的保守结构基序。参见，例如，Daopin et al.，Proteins 1993 17 176-192。
根据该序列比对，可见神经胚活素是神经营养因子GDNF亚家族的一个成员(LGLG-FR(Y/F)CSGSC-QxCCRP-SAxxCGC，GDNF亚家族指纹，示于表3中的下划线部分)。
优选地，本发明所述的截短的神经胚活素多肽包括在神经胚活素序列中保守的含7个半胱氨酸残基的多肽序列。例如，优选地，截短的神经胚活素多肽包含NBN113多肽的15-113位氨基酸(99AANBN形式)或NBN113多肽12-113位氨基酸(102AANBN形式)。这些氨基酸序列还可见于，例如SEQ ID NO：9所示人NBN多肽序列中的42-140位氨基酸(99AANBN多肽；SEQ ID NO：48)；和SEQ ID NO：9中的39-140位氨基酸(102AA NBN多肽；SEQ ID NO：45)。所述序列还可见于，例如，SEQ ID NO：34中的126-224位氨基酸(大鼠的99AANBN多肽)和SEQ ID NO：34中的123-224位氨基酸(大鼠的102AANBN多肽)。类似地，包括在内的还有截短的神经胚活素序列NBN99，NBN100，NBN101，NBN102，NBN103，NBN 104，NBN105，NBN106，NBN 107，NBN 108，NBN 109，NBN 110，NBN 111和NBN112，如上所述。
计算神经胚活素与GDNF家族其他成员之间的同源性，结果列于下表4。
表4：神经胚活素多肽与GDNF家族其他成员的同源性
  成熟蛋白NBN140   成熟蛋白NBN113
  同源性   全长肽的同源性   同源性   全长肽的同源性
 神经营养因子   同一性   重叠(aa)   强同源   同一性   同一性   重叠   强同源   同一性
 GDNF   34％(47/137)   137   48％(67/137)   31.9％   36％(41/111)   111   52％(59/111)   29.5％
 NTN   48％(61/127)   127   56％(72/127)   36.9％   49％(56/114)   114   57％(66/114)   44.7％
 PSP   44％(55/125)   125   56％(71/125)   36.9   45％(51/111)   111   57％(65/111)   44.3％
 IHA   31％(25/81)   81   -   25.2％   31％(25/81)   81   -   22.5％
 TGF-β2   23％(17/73)   73   -   18.5％   23％(17/73)   73   -   20.2％
GDNF＝胶质细胞系来源的神经营养因子
NTN＝Neurturin
PSP＝Persephin
IHA＝抑制素-αTGF-β2＝转化生长因子-β2
强同源性表明下列“强”基团其中之一是保守的：STA，NEQK，NHQK，NDEQ，QHRK，MILV，MILF，HY，FYW。
实施例5：制备神经胚活素
在真核细胞和原核细胞中都已制备了神经胚活素，如下所述。
表达载体将编码神经胚活素的cDNA插入真核表达载体pUbilZ。该载体是通过将人UbC启动子插入pcDNA3.1/Zeo的一种修饰形式制得的。未经修饰的pcDNA3.1/Zeo可商购(Invitrogen)。修饰后的pcDNA3.1/Zeo较亲本载体小，因为其中的氨苄青霉素基因(3933-5015位)和2838-3134位的氨基酸序列被去除了。在pcDNA3.1/Zeo的该修饰形式中，用来自pTEJ-8的UbC启动子取代CMV启动子(Johansen et al.，FEBS Lett.1990 267289-294)，得到pUbil Z。
哺乳动物细胞表达然后将含有神经胚活素编码序列的pUbilZ载体转染入哺乳动物细胞系HiB5，该细胞系是一种无限增殖的大鼠神经细胞系(Renfranz et al.，Cell，66，pp.713-729(1991))。已经建立了几种能稳定表达神经胚活素的HiB5细胞系(用RT-PCR测定)。在这些稳定细胞系其中之一，通过用32P-标记的神经胚活素探针杂交Northern印迹上的总RNA证实HiB5pUbilzNBN22的表达。这些试验的结果图示于图2。然后HiB5pUbilzNBN22用作一些神经胚活素神经营养活性试验的神经胚活素来源。
图2表明显示的是神经胚活素cDNA在HiB5pUbilzNBN22克隆中的表达(即，用上述的本发明32P-标记神经胚活素cDNA探测Northern印迹)。用分别来自未转染HiB5细胞、HiB5pUbilzNBN22细胞和HiBSpUbilzGDNF14细胞的总RNA提取物制备印迹。如印迹所示，28S和18S rRNA条带的位置分别对应4.1kb和1.9kb。
如图3所示，抗神经胚活素-衍生多肽的抗体还可识别条件培养基中约13千道尔顿(“kD”)的蛋白质，所述条件培养基来自HiBSpUbilzNBN22克隆而不是来自未-转染的HiB5细胞(参见，实施例6)。
未-修饰(即，没有翻译后修饰)的神经胚活素多肽NBN140(SEQ ID NO：10)、NBN116(SEQ ID NO：11)和NBN113(SEQ ID NO：12)的预计分子量分别确定为14.7千道尔顿(“kD”)，12.4kD和12.1kD。
方法：通过0.8％甲醛琼脂糖凝胶电泳然后转印到尼龙膜(Duralone，Stratagene)的方法，制备来自未经转染的HiB5细胞和HiB5pUbilzNBN22克隆的总RNA(10μg)的Northern印迹。按照实施例3所述方法，随机标记覆盖SEQ ID NO：8和来自神经胚活素cDNA 5′UTR和3′UTR的其他核苷酸制备得到1.3kb 32P-标记的探针，用该探针杂交印迹并冲选。在-80℃用增光屏，将印迹用Hyperfilm MP(Amersham)成像。
来自HibSpUbilzNBN22或未转染的HiB5细胞的条件培养基，用添加了N2添加剂(Life Technologies；Cat.No.17502-048)的无血清培养基孵育过夜，然后浓缩并用15％聚丙烯酰胺凝胶(Amersham Pharmacia Biotech；Cat.No.80-1262-01)电泳分离。将蛋白质转移到PVDF-膜(Amersham PharmaciaBiotech；Cat.No.RPN-303F)上，用含0.1％Tween-20的5％脱脂奶粉PBS溶液封闭非特异性蛋白结合位点。膜用多克隆神经胚活素抗体(1∶1000)孵育过夜，然后用偶联有辣根过氧化物酶(1∶2000)的抗-兔IgG二抗(AmershamPharmacia Biotech；Cat.No.NA 934)孵育。按照产品说明书(Amersham)，用增强化学发光(ECL)(Amersham Pharmacia Biotech；目录号RPN2109)或ECL+(Amersham Pharmacia Biotech；目录号RPN2132)显示免疫染色结果。
这些试验结果图示于图3。图3A和3B显示的是神经胚活素蛋白在转染后的HiB5细胞中的表达。从未经转染的HiB5细胞(泳道1)或稳定转染了神经胚活素cDNA的HiB5克隆(泳道2)取出过夜培养基，按上述方法浓缩。然后将该培养基用实施例10所述的两种不同的神经胚活素特异性多克隆抗体Ab-1和Ab-2进行Western印迹分析。在来自转染细胞的培养基中，这两种抗体都能识别一分子量约15kDa的蛋白质。该蛋白未见于未经转染的HiB5细胞。
还可将编码神经胚活素的克隆cDNA插入其他真核表达载体，例如，真核表达载体TEJ-8(Johansen et al.，FEBS Lett.，1990，267：289-294)或pcDNA-3(Invitrogen)，得到的表达质粒转染入另一种哺乳动物细胞系，例如，中华仓鼠卵巢(“CHO”)细胞、HEK293、COS、PC12或RN33b细胞系或人神经干细胞。用表达神经胚活素的稳定细胞系制备，例如，神经胚活素蛋白。
CHO细胞中的表达
构建质粒pJC070.14为了在中华仓鼠卵巢细胞中表达神经胚活素cDNA，将编码人神经胚活素前-原-形式的cDNA片段插入哺乳动物表达载体pEAG347制备质粒pJC070.14。pEAG347包含串联排列的SV40早期及腺病毒主要晚期启动子(衍生自质粒pAD2beta；Norton and Coffin，Mol.Cell.Biol.5：281(1985))，独一无二的NotI克隆位点，随后为SV40晚期转录终止及polyA信号(衍生自质粒pCMVbeta；MacGregor and Caskey，Nucl.Acids.Res.17：2365(1989))。此外，pEAG347包含pUC 19-衍生的质粒骨架和pSV2dhfr-衍生的dhfr用于转染后CHO细胞中MTX筛选及扩增。
质粒pJC070.14的制备分为两步。首先，通过聚合酶链反应从质粒pUbilZ-NBN中将编码人神经胚活素前-原-形式的片段分离出来，使用寡核苷酸引物KD2-824 5’AAGGAAAAAA GCGGCCGCCA TGGAACTTGGACTTGGAGG3’(SEQ ID NO：31)和KD2-8255’TTTTTTCCTTTGGCGGCCGCT CAGCCCAGGC AGCCGCAGG3’(SEQ ID NO：32)和PFU聚合酶。
将该片段克隆入pPCR-Script Amp SK(+)的Srf-1位点制得质粒pJC069。第二步，在质粒pJC069上进行部分的Not-1消化pJC069制得一685bp片段(内含所述的神经胚活素基因)，将该片段克隆入质粒pEAG347的Not-1位点制得质粒pJC070.14。质粒pJC070.14中的神经胚活素基因的转录用腺病毒主要晚期启动子来调控。
制备表达神经胚活素的CHO细胞系取200μg pJC070.14，用限制性内切酶Mlu-1消化使其线性化。用苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提DNA，乙醇沉淀。线性化的DNA重悬于20mM Hepes pH7.05，137mM NaCl，5mMKCl，0.7mM Na2HPO4，6mM葡萄糖(HEBS)，用电穿孔(280V和960μF)方法导入～4E7CHO dukx B1(dhfr-)细胞(p23)。电穿孔后，将该细胞送回添加了10％胎牛血清(FBS)的α+改良Eagle′s培养基(MEM)中培养两天。然后胰蛋白酶消化该细胞，重铺于添加了10％经透析FBS的α-MEM(不含核糖-及脱氧核糖核苷酸)的100mm平板(100,000细胞/平板)，培养5天。接着将这些细胞按100,000细胞/100mm平板的浓度分开，用200nM氨甲蝶呤筛选。挑出抗性克隆，按比例扩大培养到6孔平板；用下述的神经胚活素特异性试验对来自每一克隆的条件培养基进行筛选。将12个表达水平最高的克隆按比例扩大培养到T162培养瓶，然后再分析。如图10所示，CHO细胞系的神经胚活素生产量为25-50ng/ml。
神经胚活素的三重复合实验用Sanicola et al.(Proc Natl Acad Sci USA94：6238(1997)中所述三重复合实验的改良形式，测定CHO细胞系培养物上清中是否存在神经胚活素。
该试验中，可以评估出GDNF-样分子介导RET胞外结构域与各种辅因子GFRα1、GFRα2和GFRα3之间结合的能力。RET可溶形式和辅因子可以制备成融合蛋白。大鼠RET胞外结构域和胎盘碱性磷酸酶(RET-AP)的融合蛋白，以及大鼠GFRα1胞外结构域(公开于公开号为WO9744356的专利申请；1997年11月27，在此引入作为参考)和人IgG1Fc结构域(rGFRα1-Ig)的融合蛋白，描述见(Sanicola et al.Proc Natl Acad Sci USA 94：6238(1997))。
为了制备出小鼠GFRα3胞外结构域和人IgG1 Fc结构域(rGFRα1-Ig)的融合蛋白(mGFRa3-Ig)，将RETL3中1-359位氨基酸的DNA片段与含人IgG1Fc结构域的片段连接，然后克隆入表达载体pEAG347制得质粒pGJ144。将质粒pGJ144转染入中华仓鼠卵巢细胞(CHO)制得产该融合蛋白的稳定细胞系，该融合蛋白用常规方法在蛋白A Sepharose免疫亲和柱上纯化。总之，如果GDNF-样分子能介导该试验中辅因子与RET的结合，那么RET-AP融合蛋白仍将保留在平板上，保留的量可通过化学发光的碱性磷酸酶底物测定出来。
Dynex Microlite-1ELISA平板(Dynex Technologies)用含1μg/ml山羊抗人Fc特异性抗体的50mM重碳酸盐/碳酸盐，pH9.6包被16小时。清空平板，充以300μl含1％I-封闭(Tropix)的TBS/0.5％Tween-20(TBST)1小时。用TBST洗涤三次后，向孔中充入用来自表达RET-AP融合基因的293 EBNA细胞的条件培养基稀释的100μl的1μg/ml rGFRα1-Ig或mGFRa3-Ig。然后向每列孔的头个孔中加入取自CHO神经胚活素克隆的条件培养基100μl，然后随着每行孔作2倍系列稀释，室温孵育1.5小时。然后平板用TBST洗涤3次，用200mMTris pH9.8，10mM MgCl2(CSPD缓冲液)洗涤2次。然后用溶于含1mg/ml Sapphire化学发光增强剂(Tropix)的CSPD缓冲液的425μMCSPD(Tropix)代替洗涤溶液，室温下孵育30分钟。用Dynatech光度计测量化学发光的输出量。
初步试验用来研究CHO细胞系生成的神经胚活素是否调节GFRα1或GFRα3与RET胞外结构域的结合。如图11所示，当三重复合实验中包括mGFRa3-Ig融合蛋白时，来自CHO细胞克隆#53的条件培养基产生强信号，而当包括rGFRα1-Ig融合蛋白时无信号，这表明神经胚活素能结合GFRa3而不能结合GFRα1。这种操作可将神经胚活素同GDNF清楚区分开来；如图11所示，GDNF能结合GFRα1但不能结合GFRα3。当对取自亲代CHO细胞系的条件培养基或连续培养基进行测试时，所有的辅因子融合蛋白都不产生信号。
为了定量CHO细胞系中神经胚活素的表达水平，使用起始浓度为1ng/ml的rGFRα1-Ig和GDNF制备标准曲线。然后用该标准曲线计算出不同CHO细胞系的神经胚活素浓度；图10给出了5个CHO细胞系的产量水平。由于这种估算依赖于未经验证的设想，即GDNF和rGFRα1之间的结合亲和力近似于神经胚活素与GFRa3间的结合亲和力，所以这些水平仅仅是近似的。
测试来自CHO细胞系上清的神经胚活素 为了进一步分析由CHO细胞系产生的神经胚活素，用GFRa3-Ig融合蛋白从培养基中提取出该蛋白，用抗神经胚活素肽的多克隆抗体进行western印迹分析。
在第一个试验中，用吸附到Sepharose微珠上的mGFRa3-Ig提取神经胚活素。用厂商Pharmacia Inc.推荐的方法，将mGFRa3-Ig吸附到Sepharose微珠上，将100μl mGFRa3-Ig-Sepharose加入取自阴性对照CHO细胞系或取自产神经胚活素CHO细胞系#16的条件培养基的1.0mL样本中。将该悬浮液在摇床上孵育2小时。离心每一悬浮液，除去上清，然后用10mMHEPES，100mM NaCl，pH7.5洗涤3次，每次1.0ml。将每一树脂都重悬于100μl 2X还原性样本缓冲液，并加热到100℃5分钟。向10-20％预制的SDS-PAGE凝胶(Owl Scientific)的每一孔中加入2μl样本缓中液上清和10μl标准分子量参照物(FMC)。该凝胶在40mA恒定电流下电泳72分钟。
为了进行western印迹分析，在Hofer Scientific仪器中，将该蛋白电转印到硝酸纤维素膜(Schleicher and Schuell)上，用10mM CAPS，10％甲醇，0.05％SDS，pH11.2缓冲系统(400mA恒定电流下45分钟)。转移后，从盒中取出硝酸纤维素滤膜，用溶有0.1％丽春红的1％乙酸溶液染色60秒，显示标准分子量。将该膜切割为两部分，在蒸馏水中轻微搅动除去过量的染料。用2％脱脂奶粉的TBS溶液封闭该膜，4℃下过夜。上述两块膜分别用两种亲和-纯化的抗-神经胚活素肽抗体(R30和R31)单独孵育，所述抗体以1.0(g/mL的浓度溶于2％脱脂奶粉TBS溶液中。用TBS-Tween洗膜3次，每次10分钟，然后将其在山羊抗-兔IgG-HRP偶联物(Biorad)的1∶5000稀释溶液中孵育30分钟。用TBS-Tween洗膜3次，每次10分钟，用ECL底物(Amersham)显色。如图12所示，当与阴性对照细胞系的提取蛋白(泳道1和3)进行对比时，取自产神经胚活素的CHO细胞系提取的蛋白质，用两种抗体都检测到了特异性条带(泳道2和4)。
较低形式的分子量为约13kD，可能为神经胚活素的成熟结构域，是切割了原(pro)-结构域后产生的。这种切割可能发生在前-原-神经胚活素蛋白中三种切割基序(例如，-RXXR-)任一种内第4位Arg残基后，生成140AA，116AA或113AA中一种形式，分别为SEQ ID NOS：10，11或12所示。未-修饰(即，缺乏翻译后修饰)的神经胚活素多肽NBN140(SEQ ID NO：10)，NBN116(SEQ ID NO：11)和NBN113(SEQ ID NO：12)的预计分子量经测定分别为14.7kD，12.4kD和12.1kD。要确定该形式以及其他神经胚活素特异性条带的结构还需要进一步的试验。
在第二个试验中，用俘获在ELISA平板上的hGFRa3-Ig提取神经胚活素。为了制备人GFRα3胞外结构域(公开于公开号为WO9744356的专利申请；1997年11月27，在此引入作为参考)和人IgG1 Fc结构域的融合蛋白(hGFRa3-Ig)，将GFRa3中1-364位氨基酸的DNA片段与含人IgG1 Fc结构域的片段连接，然后克隆入Sanicola et al.(Proc Natl Acad Sci USA 94：6238(1997))中所述表达载体CH269。该质粒表达的融合蛋白瞬间表达于293-Epstein-Barr病毒-编码的核抗原(EBNA)细胞，按照标准方法用蛋白ASepharose免疫亲和柱纯化。
将96-孔板其中的6个孔用山羊抗-人IgG(Fcγ片段特异性；JacksonImmunulogics)25μg/ml PBS溶液4℃下包被(300μl/孔)。然后用BSA 1％PBS溶液400μl室温下封闭孔。用PBST(PBS+0.05％Tween 20)洗涤3次后，向每一孔中加入300μl hGFRa3-Ig(以10μg/ml浓度溶于含0.1％BSA的PBS)。室温下孵育板1小时，轻微振荡(200次摆动/分钟)使结合最大化。然后，将孔清空，再用PBST洗涤3次。向3个孔每一孔中加入250μl取自阴性对照CHO细胞系或取自产神经胚活素CHO细胞系#25的条件培养基。将板在室温下孵育3小时，轻微振荡(300次摆动/分钟)。然后，用PBST洗孔2次。向第一孔中加入25μl非-还原性Laemli上样缓冲液，将板快速振摇5分钟洗脱结合的蛋白(1300摆动/分钟)。将内容物转移至下一孔，重复操作洗脱第2和第3孔中的结合蛋白。加入β-巯基乙醇(5％终浓度)，样品煮沸5分钟，用10-20％聚丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE分析。
为了进行western印迹分析，将蛋白质转移到尼龙膜上。在5％脱脂奶粉，PBST中封闭和探测膜，用PBST洗涤。用抗两种肽的多克隆抗体(R30和R31)反应(1μl/ml)，接着用偶联有HRP的山羊抗-兔IgG(Biorad)反应，然后通过电化学发光检测神经胚活素。如图13所示，在产神经胚活素的CHO细胞系的提取蛋白(泳道2)中检测到了5个神经胚活素特异性条带。较小的两条条带非常近似于图12中观察到的条带；较小的那条可能是神经胚活素在切割了原-结构域后的成熟结构域。
图13中条带的后续分析(数据未显示)显示：约18kD条带用PGNase F去糖基化后就减小到与图13中最小条带相当大小。这表明在哺乳动物细胞中神经胚活素可以去糖基化蛋白形式生成。
神经胚活素在大肠杆菌中的表达
为了在大肠杆菌中表达神经胚活素基因，构建低GC含量及优选大肠杆菌的密码子的合成基因。将该合成基因克隆入两载体pET19b和pMJB164，它们是pET19b的衍生物。用pET19b的构建图示于图14。在该构建体中，将NBN113的编码序列直接融合于起始蛋氨酸。NBN的其他合成基因构建体见SEQ ID NOS：52-54。用pMJB164的构建图示于图15。在该构建体中，通过一肠激酶切割位点间隔，将NBN113融合于组氨酸标签(即，10个组氨酸)。与组氨酸标签融合的NBN的其他合成基因构建体见SEQ ID NOS：55-57。所述的起始蛋氨酸位列所述组氨酸标签之前。
编码神经胚活素的核苷酸序列见图14
ATGGCTGGAGGACCGGGATCTCGTGCTCGTGCAGCAGGAGCACGTGGCTGTCGTCTGCGTTCTCAACTA
GTGCCGGTGCGTGCACTCGGACTGGGACACCGTTCCGACGAACTAGTACGTTTTCGTTTTTGTTCAGGA
TCTTGTCGTCGTGCACGTTCTCCGCATGATCTATCTCTAGCATCTCTACTAGGAGCCGGAGCACTAAGA
CCGCCGCCGGGATCTAGACCTGTATCTCAACCTTGTTGTAGACCTACTAGATACGAAGCAGTATCTTTC
ATGGACGTAAACTCTACATGGAGAACeGTAGATAGACTATCTGCAACCGCATGTGGCTGTCTAGGATGA
TAATAG(SEQ ID NO：29)
编码his-标记神经胚活素的核苷酸序列见15
ATGGGCCATCATCATCATCATCATCATCATCATCACTCGAGCGGCCATATCGACGACGACGACAAGGCT
GGAGGACCGGGATCTCGTGCTCGTGCAGCAGGAGCACGTGGCTGTCGTCTGCGTTCTCAACTAGTGCCG
GTGCGTGCACTCGGACTGGGACACCGTTCCGACGAACTAGTACGTTTTCGTTTTTGTTCAGGATCTTGT
CGTCGTGCACGTTCTCCGCATGATCTATCTCTAGCATCTCTACTAGGAGCCGGAGCACTAAGACCGCCG
CCGGGATCTAGACCTGTATCTCAACCTTGTTGTAGACCTACTAGATACGAAGCAGTATCTTTCATGGAC
GTAAACTCTACATGGAGAACCGTAGATAGACTATCTGCAACCGCATGTGGCTGTCTAGGATGATAATAG
(SEQ ID NO：30)
实施例6：神经胚活素对大鼠胚胎多巴胺神经元的存活和ChAT活性 的作用。
在这一系列试验中，对来自上述产神经胚活素的HiB5pUbilzNBN22细胞的条件培养基的作用进行了测定。
制备条件培养物：将大鼠E14胚胎的腹侧中脑(Ventral Midbrain)或脊髓解剖入冷的Hanks缓冲盐溶液(HBSS)。将组织切片用过滤除菌的0.1％胰蛋白酶(Worthington)和0.05％DNase(Sigma)HBSS溶液37℃下孵育20分钟。然后用HBSS+0.05％DNase漂洗4次，然后用1ml自动移液管分离。然后悬液以600rpm离心5分钟，沉淀重悬于血清条件培养基(SCM；DMEM添加10％胎牛血清)。用台盼蓝染料排除方法测定细胞总数，以100.000个细胞/cm2浓度铺板于聚-L-赖氨酸包被的8-孔槽式载片(Nunc)测定多巴胺神经元的存活，或以200,000个细胞/cm2浓度铺板于48-孔板(Nunc)进行ChAT活性测量。细胞用SCM在5％CO2/95％O2和95％湿度37℃条件下孵育24-48h，然后改用加有神经营养因子的无血清培养基(SFM)。
将用于测定多巴胺神经元存活的细胞在SFM+营养因子添加物中放置5天，用4％PFA固定5分钟，用酪氨酸羟化酶通过免疫组化方法染色。
将用于测定ChAT活性的细胞在SFM中放置3天，然后用HBSS+0.1％Triton X-100裂解细胞，立即冷冻于干冰直至Chat活性测量。
营养因子添加物：从未经-转染的HiB5对照或产神经胚活素的HiB5(HiB5pUbilzNBN22)或产GDNF的HiB5(HiB5pUbilzGDNF-L17)收集条件的培养基。用GDNF-ELISA对收集自细胞的条件培养基进行测定时，HiB5pUbilzNBN22生成大约20ng GDNF/24小时/105个细胞。各自细胞系用DMEM+1％FCS孵育过夜，取出上清储存于-20℃直至使用。当向细胞添加时，上清用SFM作1∶50稀释。用HiB5对照上清(1∶50)+纯化后的重组大鼠GDNF(0.03-10ng/ml)处理分离的细胞。
这些试验的结果图示于图4。图4A-4C显示了在实施例5.1所述的无血清培养基中，HiB5pUbilzNBN22细胞分泌的神经胚活素对培养的大鼠胚胎多巴胺腹中脑神经元存活及对胆碱能颅神经运动神经元中ChAT活性的影响。
图4A给出的是无血清培养物中DIV5时测定时，重组GDNF对ChAT活性影响的剂量应答曲线(dpm/小时)，该培养物起初是从E14腹中脑建立的(即，HiB5；GDNF 0.03ng/ml；GDNF 0.1ng/ml；GDNF 0.3ng/ml；GDNF 1ng/ml；GDNF 10ng/ml；GDNF 100ng/ml)。
图4B给出的是无血清培养物中DIV5时测定的ChAT活性(dpm/小时)，该培养物起初是从E14腹中脑建立的。将来自产神经胚活素的HiB5pUbilzNBN22细胞(神经胚活素)或产GDNF的HiB5GDNFL-17(GDNFL-17)细胞的条件培养基稀释后加入，如图所示(即，神经胚活素1∶10；神经胚活素1∶50；GDNF L-17 1∶50)。
图4C显示了无血清培养物中DIV7时，每孔中酪氨酸羟化酶免疫活性细胞的数目(No.TH+细胞/孔)，该培养物起初是从E14腹中脑建立的。将来自未-转染HiB5细胞(HiB5)或产神经胚活素的HiB5pUbilzNBN22细胞(神经胚活素)的条件培养基或重组GDNF稀释为不同浓度，如图所示加入(即，HiB5 1∶10；HiB5 1∶40；GDNF 0.1ng/ml；GDNF 10ng/ml；GDNF 100ng/ml；和神经胚活素1∶40)。
1∶40稀释的取自神经胚活素转染的HiB5细胞的条件培养基可显著增加每孔中TH免疫活性细胞的数目，与同等或较低稀释比例(1∶10和1∶40)的对照(未转染)HiB5细胞相比(参见，例如图4B)。TH-免疫活性细胞数目的增加与最大GDNF浓度(10ng/ml)时所见的增加相匹配。这表明分泌到培养基的神经胚活素能影响来自大鼠胚胎腹中脑中多巴胺神经元群的存活。相反，与分泌自转染的HiB5细胞的GDNF不同，来自神经胚活素转染的HiB5细胞的条件培养基对同一培养物中另一神经元群胆碱能神经元无可见影响(参见，例如图4A)。
实施例7：神经胚活素对猪胚胎多巴胺腹中脑神经元切片培养物存活 的影响
该试验测定了将产神经胚活素的HiB5pUbilzNBN22细胞与来自猪胚胎腹中脑切片培养物共培养的结果。
培养物的制备：将分离自猪胚胎(E28；n＝12)的腹中脑(VM)在无菌条件切割为400μm的切片，置于冰冷的添加了葡萄糖(6.5mg/ml)的Gey′s平衡盐溶液(GIBCO)。用界面培养方法(interface culture method)培养组织切片，该方法最初见Stoppini et al.(L.Stoppini，P.A.Buchs，D.Muller，J.Neurosci.Methods 1991 37 173-182)。
简而言之，将切片置于半透膜(Millipore，0.3μm；8个切片/对应1VM的膜)上，这些半透膜作为插入物置于乘有含血清培养基(Gibco BRL)的6-孔平板(Costar)。每孔含1ml培养基(50％Optimem，25％马血清，加有终浓度为25mM D-葡萄糖的25％Hank′s平衡盐溶液(均购自GIBCO))。在第0天，将7000转染的HiB5pUbiIzNBN22(神经胚活素)或7000未转染的HiB5细胞(对照)种植在每一组织切片上。首先在33℃的孵育器中进行48小时共培养，让用温敏的致癌基因无限增殖化的HiB5细胞增殖，然后置于37℃的孵育器，HiB5细胞在其中分化。每周更换两次培养基。任一阶段都不使用抗有丝分裂剂及抗生素。
用HPLC测定多巴胺：在体外第12天和第21天，收集培养基，用带电化学检测的HPLC测定多巴胺(W.N.Slooth，J.B.P.Gramsbergen，J.Neurosci.Meth.199560141-49)。
组织处理及免疫组织化学：第21天，培养物用4％多聚甲醛磷酸盐缓冲液固定60分钟，然后在20％蔗糖溶液中脱水24小时，冷冻，低温以20μm切片(4套)，封固在包被了明胶的显微镜载片上。其中一套用酪氨酸羟化酶(TH)免疫染色。简而言之，切片用含1％Triton X-100的0.05M tris-缓冲盐溶液(TBS，pH7.4)洗涤，3×15分钟，用10％胎牛血清(FBS，Life Technologies)TBS溶液孵育30分钟。然后，将该组织在4℃用加有10％FBS的TBS 1∶600稀释的单克隆小鼠抗-TH抗体(Boehringer Mannheim)孵育24小时。用加有1％Triton X-100的TBS漂洗3×15分钟后，用加有10％FBS的TBS 1∶200稀释生物素抗-小鼠IgG抗体(Amersham)孵育切片60分钟。然后用加有1％Triton X-100的TBS洗涤(3×15分钟)，并用加有10％FBS的TBS 1∶200稀释的链霉亲和素-过氧化物酶(Dako)孵育60分钟。用TBS洗涤(3×15min.)后，用溶于含0.01％H2O2的0.05％3，3二氨基联苯胺(Sigma)处理，使结合的抗体显影。最后，切片用乙醇脱水，二甲苯澄清，用Eukitt盖片。
细胞计数和形态学分析：用明视野显微镜(Olympus)对免疫活性的TH-ir神经元定量。只对显示强染色并且具有完好保存的细胞结构和明显的核的细胞进行计数。每第4个培养物切片用x20-物镜对细胞计数进行评估。根据Abercrombie′s公式(M.Abercrombie，Anat.Rec.1946 94 239-47)双计数校正细胞数目，使用TH-ir神经元中核的平均直径(6.6±0.2μm，n＝30)。用神经元示踪系统(Neurolucida，MicroBrightField，Inc.)评估核的大小。
这些试验的结果图示于图5。图5A-5C显示了分泌自HiB5pUbilzNBN22细胞的神经胚活素对猪胚胎多巴胺腹中脑神经元与上述的HiB5pUbilzNBN22细胞(神经胚活素)或HiB5细胞(对照)共培养的切片培养物的功能及存活的影响。
图5A和图5B：分别显示的是在DIV12(多巴胺(pmol/ml)-12天)和DIV21(多巴胺(pmol/ml)-21天)时分泌至培养基中的多巴胺。图5C显示的是DIV21时，每一培养物中酪氨酸羟化酶免疫活性细胞的数目(每一培养物中的TH-ir细胞)。
在第12天时，HPLC分析表明取自HiB5-神经胚活素共培养物的培养基中含有的多巴胺比取自HiB5-C共培养物的培养基多84％(图5A)。在第21天时，该差异为78％(图5B)，细胞计数显示HiB5-神经胚活素共培养物中含有的酪氨酸羟化酶免疫活性神经元比HiB5-C共培养物多66％(P＜0.05)(图5C)。这表明分泌自HiB5pUbilzNBN22克隆的神经胚活素对胚胎猪多巴胺神经元具有强存活作用。
实施例8：脊神经节在无血清培养基中的存活情况
该实施例显示了与已知神经营养因子相比，神经胚活素多肽的神经营养活性。
用断颈的方法处死妊娠雌性小鼠。按照下述方法将胚胎处理用于培养。
用电解削尖的钨针从所示阶段的C57B16小鼠中剖离出脊神经节(Mollegaard Breeding，Denmark)。胚胎神经节37℃与溶于无钙和镁的Hanks平衡盐溶液中的0.05％胰蛋白酶(Gibco/BRL)孵育5分钟。出生后的神经节用胶原酶/分散酶1mg/ml处理30-45分钟，然后用胰蛋白酶/DNase 0.25％处理15分钟。取出胰蛋白酶溶液后，神经节用10ml含10％热灭活马血清的DMEM洗涤1次，用一火烧平滑的Pasteur移液管研制得到单细胞悬液。
将细胞铺于24孔平板(Nunc)，该平板预先用聚鸟氨酸(0.5mg/ml，过夜)和层粘连蛋白(20mg/ml，4小时；Gibco/BRL)包被过。将该神经元在37℃湿润的5％CO2孵箱中，置于补入下列成分的Hams F14组成的特定培养基中孵育：2mM谷氨酰胺，0.35％牛血清白蛋白，60ng/ml孕酮，16mg/ml腐胺，400ng/ml L-甲状腺素，38ng/ml亚硒酸钠，340ng/ml三碘甲状腺原氨酸，60mg/ml青霉素和100mg/ml链霉素。
孵育48小时后，通过其在相差光学显微镜下的两极形态清楚地识别出神经元。有(在铺板之前以10ng/ml浓度加入培养基)无营养因子存在时神经元存活百分比，或者取自产神经胚活素的HiB5pUbilzNBN22细胞的条件培养基中的神经元存活百分比，通过在48小时时对孔中神经元进行计数测定了出来。
这些试验的结果图示于图9，图中：0代表对照试验(无因子存在)；
1表示有GDNF存在的试验；
2表示有Neuturin存在的试验；
3表示有本发明所述神经胚活素存在的试验；
图9显示的是下述各个时间点分离自发育中的胎儿DRG细胞上进行试验得到的数据：E12表示12日龄胚胎；
E16表示16日龄胚胎；
P0表示出生当天；
P7表示出生后第7天；以及
P15表示出生后第15天。
这些结果清楚表明本发明的神经营养因子显示出的活性相当于，或者甚至强于现有技术中的神经营养因子。
实施例9：神经胚活素对黑质多巴胺神经元的体内作用
为了测试神经胚活素(神经胚活素)保护成年黑质多巴胺(DA)神经元免遭6-羟多巴胺诱导变性的能力，我们使用了帕金森氏病(Sauer and Oertel，Neuroscience 1994 59，401-415)和神经胚活素的慢病毒基因转移的大鼠模型。
慢病毒的制备：为了制备编码神经胚活素的慢病毒转移载体pHR′-神经胚活素，将一来自神经胚活素cDNA的1331bp的BamHI片段亚克隆入pSL301(Invitrogen)的BamHI/Bgl II位点。从该构建体中切出一1519bp的BamHI/Xhol片段，连接入带有土拔鼠(woodchuck)肝炎病毒翻译后片段pHR′的BamHl/Xhol位点(Zufferey R，Donello JE，Trono D，Hope TJ：Woodchuckhepatitis virus posttranscriptional regulatory element enhances expression oftransgenes delivered by retroviral vectors″；J.Virol.1999 73(4)2886-2892)。为了制备pHR-GDNF，将来自pUbilz-GDNF的一701bp的BamHI/Xhol片段连接入pHR′的BamHl/Xhol位点。
慢病毒载体的制备已有描述，例如Zufferey等(Zufferey R，Nagy D，Mandel R J，Naldini L，Trono D：“Multiply attenuated lentiviral vector achievesefficient gene delivery in vivo；Nat.Biotechnol.1997 15(9)871-875)。简而言之，就是将转移构建体和辅助质粒pR8.91和pMDG共转染入293T细胞。在转染后48和72小时，收集释放至培养基内的病毒颗粒。为了浓缩病毒，将培养基以141,000g离心1.5小时，将沉淀溶解于DMEM。通过293T细胞中的GFP荧光，测得带有绿色荧光蛋白(“GFP”)基因的对照物的滴度为108转化单位(TU)/ml。用RNA狭线印迹技术(von Schwedler U，SongJ，Aiken C，Trono D：“Vif is crucial for human immunodeficiency virus type 1 proviral DNAsynthesis in infected cells”；J.Virol.1993 67(8)4945-4955)测定病毒颗粒滴度。GDNF上清和神经胚活素上清中颗粒比GFP上清中少10倍。
外科手术方法：所有涉及动物的操作均遵守伦理委员会在Lund大学制定的试验动物使用规定。
总共使用21个初成年雌性Sprague-Dawley大鼠(B & K Universal，Stockholm，Sweden)，将其圈养在12小时光：暗循环且可自由获得大鼠饲料及水的条件下。在损伤前，根据Sauer and Oertel[Sauer and Oertel，Neuroscience 199459：401-415]进行逆向标记及6-OHDA损伤。简而言之，在Equithesin麻醉法(0.3ml/100g)下，向大鼠两侧注射0.2μl逆向示踪Fluoro-Gold(FG；Fluorochrome，Inc.，Englewood，CO)的2％溶液(溶于0.9％NaCl)。使用2μl Hamilton注射器在下列坐标处注射：相对于前囱AP＝+0.5mm；相对于前囟ML＝±3.4mm；相对于硬脑膜(dura)DV＝-5.0mm以及门齿弓(incisor bar)设定为0.0mm。此外，注射的速度为0.05μl/分钟，并且再停留5分钟后拔出针头。
FG注射后第14天，动物接受总共5种带绿色荧光蛋白(GFP)、神经胚活素或GDNF基因的慢病毒载体的沉淀物(deposit)(1μl/沉淀物)。其中的4个沉淀物在下列坐标处沿两个针孔道进入纹状体：AP＝+1.0mm，ML＝-2.6mm，DV1＝-5.0mm DV2＝-4.5mm以及AP＝0.0mm，ML＝-3.7mm，DV1＝-5.0mm DV2＝-4.5mm。上黑质沉淀物(supranigral deposit)在AP＝-5.2mm，ML＝-2.0mm，DV1＝-6.3mm处进行。牙齿连接杆(Tooth bar)设定为-2.3mm。
逆行标记21天后以及慢病毒注射7天后，将动物再-麻醉，用10μlHamilton注射器，将单一沉淀物20μg 6-OHDA(Sigma；计算游离碱，溶解于3μl冰冷的加0.02％抗坏血酸的盐溶液中)注射入与FG沉淀物相同位置的右侧纹状体。注射速率为1μl/min，停留3分钟后再拔出针头。
组织处理：在6-OHDA注射后的第21天，将动物用水合氯醛深度麻醉，经心脏灌注盐水(pH7.4；室温)1分钟，接着灌注200ml冰冷甲醛溶液(4％多聚甲醛溶于0.1M磷酸盐缓冲液，pH7.4)。解剖脑，用同一种固定剂后固定3-4小时，然后转移入25％蔗糖/0.1M磷酸盐缓冲液中48小时。在冷冻切片机上切出经过纹状体和黑质(SN)的5套40μm切片。
SN中多巴胺的定量测定：通过盲观察者测定出SN致密部中FG-标记的数目，按照此前描述的方法[Sauer and Oertel，Neuroscience 199459，401-415]。简而言之，以副视束的中末核(MTN；Paxinos and Watson(1997)图谱中的-5.3)水平为圆心作三个连续切片，所有标记/染色到MTN上的神经元用40x倍计数(n＝6-7/组)。如果FG-标记的神经元在330nm落射下呈明亮荧光，显示出一神经元轮廓并且向至少1种神经炎过程发展，那么它们就被包括在内。
注射了带GFP的慢病毒的动物的病变侧FG-阳性的黑质神经元的数目减少到完整侧数目的18％。相反，注射了慢-神经胚活素的动物显示了FG阳性黑质神经元近乎完全的保护(89％)。这和慢-GDNF处理的动物效果相同，其中有87％的逆向标记神经元仍保留在病变侧。这表明神经胚活素是病变的成年黑质多巴胺神经元的强效存活因子，其与GDNF等效。
图6给出的是慢病毒-产的神经胚活素对黑质多巴胺神经元的体内作用。在向右侧纹状体单次注射6-羟多巴胺(6-OHDA)前3周，用Fluorogold(FG)逆向标记雌性Sprague Dawley大鼠SN致密部的神经元。在6-OHDA注射前1周，向动物注射表达神经胚活素(神经胚活素)、GDNF(GDNF)或绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒载体，如图所示。在注射6-OHDA后21天，测定纹状体两侧中FG-标记神经元的数目。该图显示了3组动物纹状体病变侧(右侧)内与完整侧(左侧)内FG-标记神经元的百分比(％FG病变/完整)。
实施例10：制备抗体
为了制备抗神经胚活素的抗体，用偶联到载体蛋白上的肽1：CRPTRYEAVSFMDVNST(SEQ ID NO：9中108-124位氨基酸)；或肽2：ALRPPPGSRPVSQPC(SEQ ID NO：9中93-107位氨基酸)免疫动物，间隔为3周。每种肽免疫两只兔子，都是在第0，3，6和10周免疫，在第7和11周采血。第二次采的血通过肽亲和柱进行亲和纯化。根据所述肽，将这两抗体命名为Ab-1和Ab-2。
Western印迹：取2×106个稳定转染了神经胚活素的cDNA(Hib5pUbilzNBN22)HiB5细胞或未经转染的HiB5细胞，在添加有N2添加剂的无血清培养基(GIBCO)中孵育过夜。将培养基用5kDa的截留膜(Millipore，Bedford，MA)在小浓缩器上浓缩。浓缩后的样品加入5x Laemmli样品缓冲液，加热到95℃5分钟。样品在15％的丙烯酰凝胶上进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后转移到PVD膜上。剩余的蛋白结合位点用含0.1％Tween-20的5％脱脂奶粉PBS溶液封闭。膜用多克隆神经胚活素抗体(1∶1000)孵育过夜，然后用偶联有辣根过氧化物酶(1∶2000)的抗-兔或抗-小鼠IgG二抗(Amersham Pharmacia Biotech；Cat.No.NA 934)孵育。
按照产品说明书(Amersham)，用增强的化学发光加(ECL+)显示免疫染色结果。这些试验结果图示于图3和实施例5。
用常规技术，我们还制备了抗下列肽的兔多克隆抗体：
肽R27：GPGSRARAAGARGC(SEQ ID NO：9中的第30-43位氨基酸)；
肽R28：LGHRSDELVRFRFC(SEQ ID NO：9中的第57-70位氨基酸)；
肽R29：CRRARSPHDLSL(SEQ ID NO：9中的第74-85位氨基酸)；
肽R30：LRPPPGSRPVSQPC(SEQ ID NO：9中的第94-107位氨基酸)；以及
肽R31：STWRTVDRLSATAC(SEQ ID NO：9中的第121-136位氨基酸)。
只有相对靠近C-末端的R30和R31才能在Western印迹试验的还原条件下识别变性后的蛋白。
实施例11：含有最后的羧基-末端102个氨基酸的截短大鼠神经胚活 素多肽的生物活性。
大鼠前-原-神经胚活素的氨基酸序列以SEQ ID NO：34提供如下：
  1 MELGLGEPTA LSHCLRPRWQ PALWPTLAAL ALLSSVTEAS LDPMSRSPAS
 51 RDVPSPVLAP PTDYLPGGHT AHLCSERALR PPPQSPQPAP PPPGPALQSP
                 113aa N-7 -9 -11 -14
101 PAALRGARAA R AGTRSSRAR ATDARGCRLR SQLVPVSALG LGHSSDELIR
151  FRFCSGSCRR ARSPHDLSLA SLLGAGALRS PPGSRPISQP CCRPTRYEAV
201  SFMDVNSTWR TVDHLSATAC GCLG(SEQ ID NO：34)
下述的每一神经胚活素截短形式都在标示在相应起始残基上(上列序列中的粗体字母)。113个氨基酸的神经胚活素形式(NBN113)的起始位置也被标记出来。
含大鼠神经胚活素中102个羧基端氨基酸的神经胚活素截短形式的生物活性在细胞内进行了测定。大鼠神经胚活素的113个氨基酸形式中包含SEQ ID NO：34中的111-224位氨基酸(大鼠NBN113，上述的下划线部分)，将其用非特异性氨肽酶(Sigma，MO)室温下消化2小时。消化后，对神经胚活素进行大小排阻层析(SEC)，将其中任一污染成分同蛋白分离开来。截短神经胚活素(命名为“NBN113(N-11)”)的分子量用质谱法确证，测定为10.931kDa，为102个氨基酸多肽(NBN102)的分子量。作为对照，单独用酶缓冲液(25mM Tris pH8.)平行处理大鼠NBN113。该对照未观察到消化，鉴定到适当的12.047kDa多肽。
用细胞RET(c-RET)活化试验，比较NBN113、用酶缓冲液处理的NBN113以及NBN113(N-11)的生物活性。用神经胚活素在NB41A3-mRL3细胞中刺激c-RET磷酸化的能力测定其活性，上述细胞是一种经小鼠GFRa3稳定转染的粘着性小鼠成神经细胞瘤细胞系，表达有RET和GFRa3。将NB41A3-mRL3细胞置于24孔板的加10％FBS的DMEM内，每孔加入2×105个细胞，在37℃5％CO2的条件下培养18小时。除去培养基后，每孔用1ml PBS洗涤细胞，在37℃5％CO2的条件下，用含NBN113或用酶缓冲液处理的NBN113或NBN113(N-11)的DMEM刺激细胞10分钟。为了终止活性，除去培养基，细胞用PBS洗涤后立即用10mM Tris，pH8.0，0.5％NP40，0.2％DOC，50mM NaF，0.1mM Na3VO4和1mM PMSF裂解。4℃孵育1小时后，通过反复吹打来振摇裂解物，然后将其转移(每孔0.25ml)至用抗-RET mAb(AA.GE7.3)包被后的96-孔ELISA板。上述孔在室温下用封闭液(含1％正常小鼠血清的TBST和溶于TBS缓冲液(15mM Tris pH7.4，150mMNaCl)的3％BSA)封闭1小时，然后单用TBST(TBS+0.05％Tween 20)洗涤6次。
通过用4G10(Upstate Biotechnology，NY)和HRP-偶联的磷酸酪氨酸抗体(0.2μg/孔)孵育被俘获的受体2小时，检测磷酸化后的RET。孵育后，用TBST洗孔6次，用比色试验测定450nm处的HRP活性。测量用裂解物处理后的孔或者单用裂解缓冲液处理后的孔的吸收值，背景校正，数据绘制为活性混合物中存在的神经胚活素浓度的函数。结果图示于图16。测量用裂解物或用裂解缓冲液处理后的孔的吸收值，将背景校正后信号绘制为神经胚活素浓度的函数。
这些结果表明神经胚活素的氨基端截短形式(102氨基酸)显示了不同于神经胚活素的NBN113形式的细胞生物活性。
实施例12：三种神经胚活素氨基末端截短形式(99，104和106个氨基 酸)的生物活性。
测定截短神经胚活素多肽(99和106个氨基酸)在细胞RET活化试验中的活性，结果图示于图17。除99和106个氨基酸形式之外，该试验中还包括了两种其他神经胚活素分子进行比较：作为参照物的大鼠NBN113和一个113个氨基酸的大鼠神经胚活素突变蛋白，其中大鼠NBN113序列第14位上的精氨酸被赖氨酸残基所取代(“NBN R14K(N)”)。当在该位点用赖氨酸特异性蛋白酶(Endo Lys C；WAKO，VA)切割时，这种突变蛋白有利于生成缺乏14个氨基端残基的99个氨基酸的形式(“NBN R14K(N-14)”)。106个氨基酸的形式不含7个氨基端残基(“NBN 113(N-7)”)，是大鼠NBN113被胰蛋白酶(Biozyme，San Diego)部分蛋白水解后得到的。所有截短产物用实施例11所述质谱法进行特征分析。
测定浓度分别为0.005nM-100nM，0.05nM-100nM，0.006nM-114nM和0.05nM-107nM的NBN113、NBNR14K(N)、NBN R14K(N-14)和NBN113(N-7)的活性。活性测量为实施例11所述的A450nm处的吸收值。每一种神经胚活素形式在每一测试浓度下都表现出类似活性。这些结果表明：大鼠NBN113的缺乏14或7个氨基端残基的截短形式在KIRA活性试验中的活性与大鼠NBN113相等。
进行图18所示的KIRA活性试验测定104个氨基酸的形式(“NBN104(N-9)”)的生物活性。这种缺失了野生型大鼠NBN113分子9个氨基端残基的多肽是通过用胰蛋白酶处理CHO-表达的大鼠NBN113得到的。如前所述，用质谱法确定分子量。两种多肽(NBN104(N-9)和NBN113)的活性在浓度为0.05-115nM时测定。按照实施例11描述，测量A450nm处的活性。N-9形式的活性至少与大鼠NBN113的活性一样高。这些结果表明在KIRA ELISA活性试验中缺失了野生型大鼠NBN113多肽9个氨基端残基的截短形式(104个氨基酸)具有至少与大鼠NBN113相等的活性。
表5显示了本发明公开的前-原-多肽序列之间的关系。第1行提供的是SEQ ID NO：2的多肽，第2行提供的是SEQ ID NO：4的多肽，以及第3行提供的是SEQ ID NO：9的多肽。那7个保守的半胱氨酸残基用符号(“*”，“#”，“+”和“1”)标示，显示出成熟的二聚化的神经胚活素配体中形成的分子内(*和*，#和#，+和+)和分子间(“1”)二硫键。对于NBN112至NBN99而言，每一截短神经胚活素多肽的氨基末端都分别用“o”表示。
表5 神经胚活素多肽的比对
Figure C0280978500701
等同方案
从上述本发明具体技术方案的详细描述中，显然可知具体的新组合物以及涉及核酸、多肽、抗体、检测和治疗的方法已经得到描述。尽管这些具体技术方案在本申请中已详细公开，但是这些实施例的给出其目的仅仅是为了说明，而不应对后附权利要求范围构成任何限制。具体而言，发明人可以预期到本发明所属技术领域的普通技术人员可以对本发明作出各种替换、改动及修饰而不脱离权利要求限定的本发明的实质和范围。实际上，从上面的说明书和附图得出对本发明所作的除本申请所述之外的各种改动，对于本领域技术人员来说都是显而易见的。这些改动都落在所附权利要求的范围内。
序列表中包含序列的描述
SEQ ID NO：1人神经胚活素核酸。                       865bp
SEQ ID NO：2来自序列1的人神经胚活素多肽。            200aa
SEQ ID NO：3人前-原-多肽的编码区(CDS)。              861bp
SEQ ID NO：4来自序列3的人神经胚活素多肽。            238aa
SEQ ID NO：5序列4中人神经胚活素的变体(Xaa1为Asn或 Thr；Xaa2为 Ala或Pro)。                    140aa
SEQ ID NO：6序列4中人神经胚活素的变体(Xaa1为Asn或 Thr；Xaa2为 Ala  Pro)。                    116aa
SEQ ID NO：7序列4中人神经胚活素的变体(Xaa1为Asn或 Thr；Xaa2为 Ala或Pro)。                    113aa
SEQ ID NO：8人胎儿脑cDNA阳性PCR集落的cDNA。      861bp
SEQ IDNO：9包含“终止”(信号)的人胎儿脑前-原-神经胚活素多肽(对应于seq.8)。                  221aa
SEQ ID NO：10前-原-神经胚活素(seq.9)的变体NBN140，14.7kD。                                     140aa
SEQ ID NO：11前-原-神经胚活素(seq.9)的变体NBN116，12.4kD。                                     116aa
SEQ ID NO：12前-原-神经胚活素(seq.9)的变体NBN113，12.1kD。                                     113aa
SEQ ID NO：13用SEQ ID NOS：17和18作引物筛选人胎儿脑cDNA主板得到的PCR产物。                              102bp
SEQ ID NO：14用SEQ ID NOS：21和22作引物筛选小鼠胎儿脑cDNA主板得到的PCR产物。                              220bp
SEQ ID NO：15全长小鼠神经胚活素cDNA。            2136bp
SEQ ID NO：16小鼠前-原-神经胚活素多肽。          224aa
SEQ ID NO：17″NBNint.正义″人胎儿脑cDNA的NBN上引物，互补于SEQ ID NO：1碱基551-568。              18nt
SEQ ID NO：18″NBNint.反义″人胎儿脑cDNA的NBN下引物，反向互补于SEQ ID NO：1碱基633-652。          20nt
SEQ ID NO：19″NBNext.正义″完整人脑mRNA RT-PCR的上引物，互补于SEQ ID NO：8碱基58-74。                17nt
SEQ ID NO：20″NBNext.反义″完整人脑mRNA RT-PCR的下引物，反向互补于SEQ ID NO：8碱基850-865。          16nt
SEQ ID NO：21″NBNint.正义″筛选小鼠胎儿脑cDNA主板NBN C2引物，互补于SEQ ID NO：15的
碱基1398-1415。                                   18nt
SEQ ID NO：22″NBNint.反义″筛选小鼠胎孔脑cDNA主板NBN C2as引物，反向互补于SEQ ID NO：15碱基1598-1617。                                        20nt
SEQ ID NO：23人基因组DNA扩增用的引物对1正义引物，互补于SEQ ID NO：3中的碱基60-88。                      29nt
SEQ ID NO：24人基因组DNA扩增用的引物对1反义引物，反向互补于SEQ ID NO：3中的碱基835-861。                27nt
SEQ ID NO：25人基因组DNA扩增用的引物对2正义引物，互补于SEQ ID NO：3中的碱基1-35。                       35nt
SEQ ID NO：26人基因组DNA扩增用的引物对2反义引物，反向互补于SEQ ID NO：3中的碱基786-819。                34nt
SEQ ID NO：27反义碱性磷酸酶偶联杂交探针，互补于小鼠神经胚活素cDNA中碱基1140-1169。                        30nt
SEQ ID NO：28″NBNext.正义″完整人脑mRNA RT-PCR的上引物，互补于SEQ ID NO：1碱基1-16。                   16nt
SEQ ID NO：29自图14的神经胚活素合成基因ORF。       351nt
SEQ ID NO：30自图15的神经胚活素合成基因ORF。       414nt
SEQ ID NO：31分离神经胚活素用的引物。              39nt
SEQ ID NO：32分离神经胚活素用的引物。              39nt
SEQ ID NO：33“NBNint.反义”NBN引物；反向互补于
SEQ ID NO：8中碱基8715-730。                       16nt
SEQ ID NO：34大鼠前-原-神经胚活素。                224aa
SEQ ID NO：35人神经胚活素(NBN112)                  112aa
SEQ ID NO：36人神经胚活素(NBN111)                  111aa
SEQ ID NO：37人神经胚活素(NBN110)                  110aa
SEQ ID NO：38人神经胚活素(NBN109)                  109aa
SEQ ID NO：39人神经胚活素(NBN108)                  108aa
SEQ ID NO：40人神经胚活素(NBN107)                  107aa
SEQ ID NO：41人神经胚活素(NBN106，N-7)             106aa
SEQ ID NO：42人神经胚活素(NBN105)                  105aa
SEQ ID NO：43人神经胚活素(NBN104，N-9)                   104aa
SEQ ID NO：44人神经胚活素(NBN103)                        103aa
SEQ ID NO：45人神经胚活素(NBN102)                        102aa
SEQ ID NO：46人神经胚活素(NBN101)                        101aa
SEQ ID NO：47人神经胚活素(NBN 100)                       100aa
SEQ ID NO：48人神经胚活素(NBN99，N-14)                   99aa
SEQ ID NO：49Neurturin-表3                               197aa
SEQ ID NO：50Persephin-表3                               156aa
SEQ ID NO：51GDNF-表3                                    211aa
SEQ ID NO：52神经胚活素的合成基因                        365nt
SEQ ID NO：53神经胚活素的合成基因                        365nt
SEQ ID NO：54合成的神经胚活素                            114aa
SEQ ID NO：55His神经胚活素的合成基因                     442nt
SEQ ID NO：56His神经胚活素的合成基因                     442nt
SEQ ID NO：57合成的His神经胚活素                         135aa
                                序列表
<110>比奥根公司(Biogen，Inc.)
     Ns基因公司(NsGene)
     Johansen，Teit E.
     Sah，Dinah Wen-Yee
<120>新的神经营养因子
<130>00689-511 PCT(C045CIP)NBN
<140>Filed Herewith
<141>2002-02-28
<150>DANISH 1998 00904
<151>1998-07-06
<150>USSN 60/092,229
<151>1998-07-09
<150>DANISH  1998 01048
<151>1998-08-19
<150>USSN 60/097,774
<151>1998-08-25
<150>USSN 60/103,908
<151>1998-10-13
<150>DANISH 1998 01265
<151>1998-10-06
<150>U.S.S.N 09/347,613
<151>1999-07-02
<150>U.S.S.N 09/804,615
<151>2001-03-12
<160>57
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>865
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>CDS
<222>(120)..(719)
<220>
<221>5’UTR
<222>(1)..(119)
<220>
<221>3’UTR
<222>(721)..(865)
<220>
<221>sig_peptide
<222>(120)..(179)
<220>
<221>mat_peptide
<222>(405)..(719)
<220>
<221>misc_structure
<222>(661)..(663)
<223>CARBOHYD：在Asn87处的糖基化的天冬酰胺
<220>
<221>misc_structure
<222>(426)..(623)
<223>DISULFID-Cys8-Cys73二硫键
<220>
<221>misc_structure
<222>(507)..(707)
<223>DISULFID：Cys35-Cys 101二硫键
<220>
<221>misc_structure
<222>(519)..(713)
<223>DISULFID：Cys39-Cys103二硫键
<220>
<221>misc_structure
<222>(616)..(619)
<223>DISULFID：Cys72-Cys72链间二硫键
<400>1
ctaggagccc atgcccggcc tgatctcagc ccgaggacag cccctccttg aggtccttcc 60
tccccaagcc cacctgggtg ccctctttct ccctgaggct ccacttggtc tctccgcgc  119
atg cct gcc ctg tgg ccc acc ctg gcc gct ctg gct ctg ctg agc agc   167
Met Pro Ala Leu Trp Pro Thr Leu Ala Ala Leu Ala Leu Leu Ser Ser
-95                 -90                 -85                 -80
gtc gca gag gcc tcc ctg ggc tcc gcg ccc cgc agc cct gcc ccc cgc   215
Val Ala Glu Ala Ser Leu Gly Ser Ala Pro Arg Ser Pro Ala Pro Arg
                -75                 -70                 -65
gaa ggc ccc ccg cct gtc ctg gcg tcc ccc gcc ggc cac ctg ccg ggg   263
Glu Gly Pro Pro Pro Val Leu Ala Ser Pro Ala Gly His Leu Pro Gly
            -60                 -55                 -50
gga cgc acg gcc cgc tgg tgc agt gga aga gcc cgg cgg ccg cgc cgc   311
Gly Arg Thr Ala Arg Trp Cys Ser Gly Arg Ala Arg Arg Pro Arg Arg
        -45                 -40                 -35
aga cac ttc tcg gcc cgc gcc ccc gcc gcc tgc acc ccc atc tgc tct   359
Arg His Phe Ser Ala Arg Ala Pro Ala Ala Cys Thr Pro Ile Cys Ser
    -30                 -25                 -20
tcc ccg cgg gtc cgc gcg gcg cgg ctg ggg ggc cgg gca gcg cgc tcg   407
Ser Pro Arg Val Arg Ala Ala Arg Leu Gly Gly Arg Ala Ala Arg Ser
-15                 -10                  -5              -1   1
ggc agc ggg ggc gcg ggg tgc cgc ctg cgc tcg cag ctg gtg ccg gtg   455
Gly Ser Gly Gly Ala Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val
              5                  10                  15
tgc gcg ctc ggc ctg ggc cac cgc tcc gac gag ctg gtg cgt ttc cgc   503
Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg
         20                  25                  30
ttc tgc acc ggc tcc tgc ccg cgc gcg cgc tct cca cac gac ctc agc   551
Phe Cys Thr Gly Ser Cys Pro Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser
     35                  40                  45
ctg gcc agc cta ctg ggc gcc ggg gcc ctg cga ccg ccc ccg ggc tcc   599
Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser
 50                  55                  60                  65
cgg ccc gtc agc cag ccc tgc tgc cga ccc acg cgc tac gaa gcg gtc    647
Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val
                 70                  75                  80
tcc ttc atg gac gtc aac agc acc tgg aga acc gtg gac cgc ctc tcc    695
Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser
             85                  90                  95
gcc acc gcc tgc ggc tgc ctg ggc tgagggctcg ctccagggct ttgcagactg   749
Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly
        100                 105
gacccttacc ggtggctctt cctgcctggg accctcccgc agagtcccac tagccagcgg  809
cctcagccag ggacgaaggc ctcaaagctg agaggcccct gccggtgggt gatgga      865
<210>2
<211>200
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>2
Met Pro Ala Leu Trp Pro Thr Leu Ala Ala Leu Ala Leu Leu Ser Ser
-95                 -90                 -85                 -80
Val Ala Glu Ala Ser Leu Gly Ser Ala Pro Arg Ser Pro Ala Pro Arg
                -75                 -70                 -65
Glu Gly Pro Pro Pro Val Leu Ala Ser Pro Ala Gly His Leu Pro Gly
            -60                 -55                 -50
Gly Arg Thr Ala Arg Trp Cys Ser Gly Arg Ala Arg Arg Pro Arg Arg
        -45                 -40                 -35
Arg His Phe Ser Ala Arg Ala Pro Ala Ala Cys Thr Pro Ile Cys Ser
    -30                 -25                 -20
Ser Pro Arg Val Arg Ala Ala Arg Leu Gly Gly Arg Ala Ala Arg Ser
-15                 -10                  -5              -1   1
Gly Ser Gly Gly Ala Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val
              5                  10                  15
Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg
         20                  25                  30
Phe Cys Thr Gly Ser Cys Pro Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser
     35                  40                  45
Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser
 50                  55                  60                  65
Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val
                 70                  75                  80
Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser
             85                  90                  95
Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly
        100                 105
<210>3
<211>861
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>CDS
<222>(7)..(717)
<220>
<221>5’UTR
<222>(1)..(6)
<220>
<221>3’UTR
<222>(718)..(861)
<220>
<221>sig_peptide
<222>(7)..(174)
<220>
<221>mat_peptide
<222>(298)..(717)
<220>
<221>mat_peptide
<222>(370)..(717)
<220>
<221>mat_peptide
<222>(379)..(717)
<220>
<221>misc_structure
<222>(661)..(663)
<223>CARBOHYD：在Asn122处的糖基化的天冬酰胺
<220>
<221>misc_structure
<222>(424)..(621)
<223>DISULFID：Cys43-Cys108二硫键
<220>
<221>misc_structure
<222>(505)..(705)
<223>DISULFID：Cys70-Cys136二硫键
<220>
<221>misc_structure
<222>(517)..(711)
<223>DISULFID：Cys74-Cys138二硫键
<220>
<221>misc_structure
<222>(616)..(618)
<223>DISULFID：Cys107-Cys107链间二硫键
<400>3
gagccc atg ccc ggc ctg ate tca gcc cga gga cag ccc ctc ctt gag    48
       Met Pro Gly Leu Ile Ser Ala Arg Gly Gln Pro Leu Leu Glu
               -95                 -90                 -85
gtc ctt cct ccc caa gcc cac ctg ggt gcc ctc ttt ctc cct gag gct   96
Val Leu Pro Pro Gln Ala His Leu Gly Ala Leu Phe Leu Pro Glu Ala
            -80                 -75                 -70
cca ctt ggt ctc tcc gcg cag cct gcc ctg tgg ccc acc ctg gcc gct   144
Pro Leu Gly Leu Ser Ala Gln Pro Ala Leu Trp Pro Thr Leu Ala Ala
        -65                 -60                 -55
ctg gct ctg ctg agc agc gtc gca gag gcc tcc ctg ggc tcc gcg ccc    192
Leu Ala Leu Leu Ser Ser Val Ala Glu Ala Ser Leu Gly Ser Ala Pro
    -50                 -45                 -40
cgc agc cct gcc ccc cgc gaa ggc ccc ccg cct gtc ctg gcg tcc ccc    240
Arg Ser Pro Ala Pro Arg Glu Gly Pro Pro Pro Val Leu Ala Ser Pro
-35                 -30                 -25                 -20
gcc ggc cac ctg ccg ggg gga cgc acg gcc cgc tgg tgc agt gga aga    288
Ala Gly His Leu Pro Gly Gly Arg Thr Ala Arg Trp Cys Ser Gly Arg
                -15                 -10                  -5
gcc cgg cgg ccg ccg ccg cag cct tct cgg ccc gcg ccc ccg ccg cct    336
Ala Arg Arg Pro Pro Pro Gln Pro Ser Arg Pro Ala Pro Pro Pro Pro
         -1   1               5                  10
gca ccc cca tct gct ctt ccc cgc ggg ggc cgc gcg gcg cgg gct ggg    384
Ala Pro Pro Ser Ala Leu Pro Arg Gly Gly Arg Ala Ala Arg Ala Gly
     15                  20                  25
ggc ccg ggc aac cgc gct cgg gca gcg ggg gcg cgg ggc tgc cgc ctg    432
Gly Pro Gly Asn Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu
 30                  35                  40                  45
cgc tcg cag ctg gtg ccg gtg cgc gcg ctc ggc ctg ggc cac cgc tcc    480
Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser
                 50                  55                  60
gac gag ctg gtg cgt ttc cgc ttc tgc agc ggc tcc tgc cgc cgc gcg    528
Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala
             65                  70                  75
cgc tct cca cac gac ctc agc ctg gcc agc cta ctg ggc gcc ggg gcc    576
Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala
         80                  85                  90
ctg cga ccg ccc ccg ggc tcc cgg ccc gtc agc cag ccc tgc tgc cga    624
Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg
     95                 100                 105
ccc acg cgc tac gaa gcg gtc tcc ttc atg gac gtc aac agc acc tgg    672
Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp
110                 115                 120                 125
aga acc gtg gac cgc ctc tcc gcc aac ccc tgc ggc tgc ctg ggc        717
Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Asn Pro Cys Gly Cys Leu Gly
                130                 135                 140
tgagggctcg ctccagggct ttgcagactg gacccttacc ggtggctctt cctgcctggg  777
accctcccgc agagtcccac tagccagcgg cctcagccag ggacgaaggc ctcaaagctg  837
agaggcccct gccggtgggt gatg                                         861
<210>4
<211>237
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>4
Met Pro Gly Leu Ile Ser Ala Arg Gly Gln Pro Leu Leu Glu Val Leu
        -95                 -90                 -85
Pro Pro Gln Ala His Leu Gly Ala Leu Phe Leu Pro Glu Ala Pro Leu
    -80                 -75                 -70
Gly Leu Ser Ala Gln Pro Ala Leu Trp Pro Thr Leu Ala Ala Leu Ala
-65                 -60                 -55                 -50
Leu Leu Ser Ser Val Ala Glu Ala Ser Leu Gly Ser Ala Pro Arg Ser
                -45                 -40                 -35
Pro Ala Pro Arg Glu Gly Pro Pro Pro Val Leu Ala Ser Pro Ala Gly
            -30                 -25                 -20
His Leu Pro Gly Gly Arg Thr Ala Arg Trp Cys Ser Gly Arg Ala Arg
        -15                 -10                  -5
Arg Pro Pro Pro Gln Pro Ser Arg Pro Ala Pro Pro Pro Pro Ala Pro
 -1   1               5                  10                  15
Pro Ser Ala Leu Pro Arg Gly Gly Arg Ala Ala Arg Ala Gly Gly Pro
                 20                  25                  30
Gly Asn Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser
             35                  40                  45
Gln Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu
         50                  55                  60
Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser
     65                  70                  75
Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg
 80                  85                  90                  95
Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr
                100                 105                 110
Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr
            115                 120                 125
Val Asp Arg Leu Ser Ala Asn Pro Cys Gly Cys Leu Gly
        130                 135                 140
<210>5
<211>140
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<223>其中在134位点的Xaa代表Asn或Thr，在135位点的Xaa代表Ala或Pro
<400>5
Pro Pro Pro Gln Pro Ser Arg Pro Ala Pro Pro Pro Pro Ala Pro Pro
  1                   5              10                  15
Ser Ala Leu Pro Arg Gly Gly Arg Ala Ala Arg Ala Gly Gly Pro Gly
             20                  25                  30
Asn Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln
         35                  40                  45
Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu
     50                  55                  60
Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro
 65                  70                  75                  80
His Asp Leu Ser Leu Ala 5er Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro
                 85                  90                  95
Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg
            100                 105                 110
Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val
        115                 120                 125
Asp Arg Leu Ser Ala Xaa Xaa Cys Gly Cys Leu Gly
    130                 135                 140
<210>6
<211>116
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<223>其中在110的Xaa代表Asn或Thr，在111位的Xaa代表Ala或Pro
<400>6
Ala Ala Arg Ala Gly Gly Pro Gly Asn Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala
  1               5                  10                  15
Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly
             20                  25                  30
Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly
         35                  40                  45
Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu
     50                  55                  60
Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser
 65                  70                  75                  80
Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp
                 85                  90                  95
Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Xaa Xaa Cys
            100                 105                 110
Gly Cys Leu Gly
        115
<210>7
<211>113
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<223>其中在107位的Xaa代表Asn或Thr，在108位的Xaa代表Ala或Pro
<400>7
Ala Gly Gly Pro Gly Asn Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys
  1               5                  10                  15
Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His
             20                  25                  30
Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg
         35                  40                  45
Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala
     50                  55                  60
Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys
 65                  70                  75                  80
Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser
                 85                  90                  95
Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Xaa Xaa Cys Gly Cys Leu
            100                 105                 110
Gly
<210>8
<211>861
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>CDS
<222>(58)..(717)
<220>
<221>5’UTR
<222>(1)..(57)
<220>
<221>3’UTR
<222>(718)..(861)
<220>
<221>sig_peptide
<222>(58)..(174)
<220>
<221>mat_peptide
<222>(298)..(717)
<220>
<221>mat_peptide
<222>(370)..(717)
<220>
<221>mat_peptide
<222>(379)..(717)
<220>
<221>misc_structure
<222>(661)..(663)
<223>CARBOHYD：在Asn122处的糖基化的天冬酰胺
<220>
<221>misc_structure
<222>(424)..(621)
<223>DISULFID：Gly43-Gly108二硫键
<220>
<221>misc_structure
<222>(505)..(705)
<223>DISULFID：Gly70-Gly136二硫键
<220>
<221>misc_structure
<222>(517)..(711)
<223>DISULFID：Gly74-Gly138二硫键
<220>
<221>misc_structure
<222>(616)..(618)
<223>DISULFID：Gly107-Gly107链间二硫键
<400>8
aggagggtgg gggaacagct caacaatggc tgatgggcgc tcctggtgtt gatagag    57
atg gaa ctt gga ctt gga ggc ctc tcc acg ctg tcc cac tgc ccc tgg   105
Met Glu Leu Gly Leu Gly Gly Leu Ser Thr Leu Ser His Cys Pro Trp
-80                 -75                 -70                 -65
cct agg cgg cag cct gcc ctg tgg ccc acc ctg gcc gct ctg gct ctg   153
Pro Arg Arg Gln Pro Ala Leu Trp Pro Thr Leu Ala Ala Leu Ala Leu
                -60                 -55                 -50
ctg agc agc gtc gca gag gcc tcc ctg ggc tcc gcg ccc cgc agc cct   201
Leu Ser Ser Val Ala Glu Ala Ser Leu Gly Ser Ala Pro Arg Ser Pro
            -45                 -40                 -35
gcc ccc cgc gaa ggc ccc ccg cct gtc ctg gcg tcc ccc gcc ggc cac   249
Ala Pro Arg Glu Gly Pro Pro Pro Val Leu Ala Ser Pro Ala Gly His
        -30                 -25                 -20
ctg ccg ggg gga cgc acg gcc cgc tgg tgc agt gga aga gcc cgg cgg   297
Leu Pro Gly Gly Arg Thr Ala Arg Trp Cys Ser Gly Arg Ala Arg Arg
    -15                 -10                  -5              -1
ccg ccg ccg cag cct tct cgg ccc gcg ccc ccg ccg cct gca ccc cca   345
Pro Pro Pro Gln Pro Ser Arg Pro Ala Pro Pro Pro Pro Ala Pro Pro
  1               5                  10                  15
tct gct ctt ccc cgc ggg ggc cgc gcg gcg cgg gct ggg ggc ccg ggc   393
Ser Ala Leu Pro Arg Gly Gly Arg Ala Ala Arg Ala Gly Gly Pro Gly
             20                  25                  30
agc cgc gct cgg gca gcg ggg gcg cgg ggc tgc cgc ctg cgc tcg cag   441
Ser Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln
         35                  40                  45
ctg gtg ccg gtg cgc gcg ctc ggc ctg ggc cac cgc tcc gac gag ctg   489
Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu
     50                  55                  60
gtg cgt ttc cgc ttc tgc agc ggc tcc tgc cgc cgc gcg cgc tct cca   537
Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro
 65                  70                  75                  80
cac gac ctc agc ctg gcc agc cta ctg ggc gcc ggg gcc ctg cga ccg   585
His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro
                 85                  90                  95
ccc ccg ggc tcc cgg ccc gtc agc cag ccc tgc tgc cga ccc acg cgc   633
Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg
            100                 105                 110
tac gaa gcg gtc tcc ttc atg gac gtc aac agc acc tgg aga acc gtg   681
Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val
        115                 120                 125
gac cgc ctc tcc gcc acc gcc tgc ggc tgc ctg ggc tgagggctcg        727
Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly
    130                 135                 140
ctccagggct ttgcagactg gacccttacc ggtggctctt cctgcctggg accctcccgc 787
agagtcccac tagccagcgg cctcagccag ggacgaaggc ctcaaagctg agaggcccct 847
accggtgggt gatg                                                   861
<210>9
<211>220
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>9
Met Glu Leu Gly Leu Gly Gly Leu Ser Thr Leu Ser His Cys Pro Trp
-80                 -75                 -70                 -65
Pro Arg Arg Gln Pro Ala Leu Trp Pro Thr Leu Ala Ala Leu Ala Leu
                -60                 -55                 -50
Leu Ser Ser Val Ala Glu Ala Ser Leu Gly Ser Ala Pro Arg Ser Pro
            -45                 -40                 -35
Ala Pro Arg Glu Gly Pro Pro Pro Val Leu Ala Ser Pro Ala Gly His
        -30                 -25                 -20
Leu Pro Gly Gly Arg Thr Ala Arg Trp Cys Ser Gly Arg Ala Arg Arg
    -15                 -10                  -5              -1
Pro Pro Pro Gln Pro Ser Arg Pro Ala Pro Pro Pro Pro Ala Pro Pro
  1               5                  10                  15
Ser Ala Leu Pro Arg Gly Gly Arg Ala Ala Arg Ala Gly Gly Pro Gly
             20                  25                  30
Ser Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln
         35                  40                  45
Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu
     50                  55                  60
Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro
 65                  70                  75                  80
His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro
                 85                  90                  95
Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg
            100                 105                 110
Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val
        115                 120                 125
Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly
    130                 135                 140
<210>10
<211>140
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(122)
<223>糖基化的天冬酰胺
<400>10
Pro Pro Pro Gln Pro Ser Arg Pro Ala Pro Pro Pro Pro Ala Pro Pro
  1               5                  10                  15
Ser Ala Leu Pro Arg Gly Gly Arg Ala Ala Arg Ala Gly Gly Pro Gly
             20                  25                  30
Ser Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln
         35                  40                  45
Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu
     50                  55                  60
Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro
 65                  70                  75                  80
His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro
                 85                  90                  95
Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg
            100                 105                 110
Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val
        115                 120                 125
Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly
    130                 135                 140
<210>11
<211>116
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(98)
<223>糖基化的天冬酰胺
<400>11
Ala Ala Arg Ala Gly Gly Pro Gly Ser Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala
  1               5                  10                  15
Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly
             20                  25                  30
Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly
         35                  40                  45
Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu
     50                  55                  60
Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser
 65                  70                  75                  80
Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp
                 85                  90                  95
Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys
            100                 105                 110
Gly Cys Leu Gly
        115
<210>12
<211>113
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(95)
<223>糖基化的天冬酰胺
<400>12
Ala Gly Gly Pro Gly Ser Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys
  1               5                  10                  15
Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His
             20                  25                  30
Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg
         35                  40                  45
Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala
     50                  55                  60
Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys
 65                  70                  75                  80
Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser
                 85                  90                  95
Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu
            100                 105                 110
Gly
<210>13
<211>102
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>13
cctggccagc ctactgggcg ccggggccct gcgaccgccc ccgggctccc ggcccgtcag  60
ccagccctgc tgccgaccca cgcgctacga agcggtctcc tt                     102
<210>14
<211>220
<212>DNA
<213>小鼠(Murinae gen.sp.)
<400>14
ggccaccgct ccgacgagct gatacgtttc cgcttctgca gcggctcgtg ccgccgagca  60
cgctcccagc acgatctcag tctggccagc ctactgggcg ctggggccct acggtcgcct  120
cccgggtccc ggccgatcag ccagccctgc tgccggccca ctcgctatga ggccgtctcc  180
ttcatggacg tgaacagcac ctggagaacc gtggaccgcc                        220
<210>15
<211>2136
<212>DNA
<213>小鼠(Murinae gen.sp.)
<220>
<221>CDS
<222>(975)..(1646)
<400>15
gcggccgcga attcggcacg agggcgtctc gctgcagccc gcgatctcta ctctgcctcc 60
tggggtcttc tccaaatgtc tagcccccac ctagagggac ctagcctagc cagcggggac 120
cggatccgga gggtggagcg gccaggtgag ccctgaaagg tggggcgggg cgggggcgct 180
ctgggcccca ccccgggatc tggtgacgcc ggggctggaa tttgacaccg gacggcggcg 240
ggcaggaggc tgctgaggga tggagttggg ctcggccccc agatgcggcc cgcgggctct 300
gccagcaaca agtccctcgg gccccagccc tcgctgcgac tggggcttgg agccctgcac 360
ccaagggcac agaccggctg ccaaggcccc acttttaact aaaagaggcg ctgccaggtg 420
cacaactctg ggcatgatcc acttgagctt cgggggaaag cccagcactg gtcccaggag 480
aggcgcctag aaggacacgg accaggaccc ctttggtatg gagtgaacgc tgagcatgga 540
gtggaaggaa ctcaagttac tactttctcc aaccaccctg gtaccttcag ccctgaagta 600
cagagcagaa gggtcttaga agacaggacc acagctgtgt gagtctcccc cctgaggcct 660
tagacgatct ctgagctcag ctgagctttg tttgcccatc tggagaagtg agccattgat 720
tgaccttgtg gcatcgcgaa ggaacaggtc ctgccaagca cctaacacag agagcaaggt 780
tctccatcgc agctaccgct gctgagttga ctctagctac tccaacctcc tgggtcgctt 840
cgagagactg gagtggaagg aggaataccc caaaggataa ctaactcatc tttcagtttg 900
caagctgccg caggaagagg gtggggaaac gggtccacga aggcttctga tgggagcttc 960
tggagccgaa agct atg gaa ctg gga ctt gca gag cct act gca ttg tcc   1010
                Met Glu Leu Gly Leu Ala Glu Pro Thr Ala Leu Ser
                  1               5                  10
cac tgc ctc cgg cct agg tgg cag tca gcc tgg tgg cca acc cta gct   1058
His Cys Leu Arg Pro Arg Trp Gln Ser Ala Trp Trp Pro Thr Leu Ala
         15                  20                  25
gtt cta gcc ctg ctg agc tgc gtc aca gaa gct tcc ctg gac cca atg   1106
Val Leu Ala Leu Leu Ser Cys Val Thr Glu Ala Ser Leu Asp Pro Met
     30                  35                  40
tcc cgc agc ccc gcc gct cgc gac ggt ccc tca ccg gtc ttg gcg ccc   1154
Ser Arg Ser Pro Ala Ala Arg Asp Gly Pro Ser Pro Val Leu Ala Pro
 45                  50                  55                  60
ccc acg gac cac ctg cct ggg gga cac act gcg cat ttg tgc agc gaa   1202
Pro Thr Asp His Leu Pro Gly Gly His Thr Ala His Leu Cys Ser Glu
                 65                  70                  75
aga acc ctg cga ccc ccg cct cag tct cct cag ccc gca ccc ccg ccg   1250
Arg Thr Leu Arg Pro Pro Pro Gln Ser Pro Gln Pro Ala Pro Pro Pro
             80                  85                  90
cct ggt ccc gcg ctc cag tct cct ccc gct gcg ctc cgc ggg gca cgc   1298
Pro Gly Pro Ala Leu Gln Ser Pro Pro Ala Ala Leu Arg Gly Ala Arg
         95                 100                 105
gcg gcg cgt gca gga acc cgg agc agc cgc gca cgg acc aca gat gcg   1346
Ala Ala Arg Ala Gly Thr Arg Ser Ser Arg Ala Arg Thr Thr Asp Ala
    110                 115                 120
cgc ggc tgc cgc ctg cgc tcg cag ctg gtg ccg gtg agc gcg ctc ggc   1394
Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Ser Ala Leu Gly
125                 130                 135                 140
cta ggc cac agc tcc gac gag ctg ata cgt ttc cgc ttc tgc agc ggc   1442
Leu Gly His Ser Ser Asp Glu Leu Ile Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly
                145                 150                 155
tcg tgc cgc cga gca cgc tcc cag cac gat ctc agt ctg gcc agc cta   1490
Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Gln His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu
            160                 165                 170
ctg ggc gct ggg gcc cta cgg tcg cct ccc ggg tcc cgg ccg atc agc   1538
Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Ser Pro Pro Gly Ser Arg Pro Ile Ser
        175                 180                 185
cag ccc tgc tgc cgg ccc act cgc tat gag gcc gtc tcc ttc atg gac   1586
Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp
    190                 195                 200
gtg aac agc acc tgg agg acc gtg gac cac ctc tcc gcc act gcc tgc   1634
Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp His Leu Ser Ala Thr Ala Cys
205                 210                 215                 220
ggc tgt ctg ggc tgaggatgat ctatctccaa gcctttgcac actagaccca       1686
Gly Cys Leu Gly
tgtgttgccc tacctggaac agctccaccg ggcctcacta accaggagcc tcaactcagc 1746
aggatatgga ggctgcagag ctcaggcccc aggccggtga gtgacagacg tcgtcggcat 1806
gacagacaga gtgaaagatg tcggaaccac tgaccaacag tcccaagttg ttcatggatc 1866
ccagctctac agacaggaga aacctcagct aaagagaact cctctgggag aatccagaaa 1926
tggccctctg tcctggggaa tgaattttga agagatatat atacatatat acattgtagt 1986
cgcgttgctg gaccagcctg tgctgaaacc agtcccgtgt tcacttgtgg aagccgaagc 2046
cctatttatt atttctaaat tatttattta ctttgaaaaa aaacggccaa gtcggcctcc 2106
ctttagtgag ggttaatttg tgatcccggg                                  2136
<210>16
<211>224
<212>PRT
<213>小鼠(Murinae gen.sp.)
<400>16
Met Glu Leu Gly Leu Ala Glu Pro Thr Ala Leu Ser His Cys Leu Arg
  1               5                  10                  15
Pro Arg Trp Gln Ser Ala Trp Trp Pro Thr Leu Ala Val Leu Ala Leu
             20                  25                  30
Leu Ser Cys Val Thr Glu Ala Ser Leu Asp Pro Met Ser Arg Ser Pro
         35                  40                  45
Ala Ala Arg Asp Gly Pro Ser Pro Val Leu Ala Pro Pro Thr Asp His
     50                  55                  60
Leu Pro Gly Gly His Thr Ala His Leu Cys Ser Glu Arg Thr Leu Arg
 65                  70                  75                  80
Pro Pro Pro Gln Ser Pro Gln Pro Ala Pro Pro Pro Pro Gly Pro Ala
                 85                  90                  95
Leu Gln Ser Pro Pro Ala Ala Leu Arg Gly Ala Arg Ala Ala Arg Ala
            100                 105                 110
Gly Thr Arg Ser Ser Arg Ala Arg Thr Thr Asp Ala Arg Gly Cys Arg
        115                 120                 125
Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Ser Ala Leu Gly Leu Gly His Ser
    130                 135                 140
Ser Asp Glu Leu Ile Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg
145                 150                 155                 160
Ala Arg Ser Gln His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly
                165                 170                 175
Ala Leu Arg Ser Pro Pro Gly Ser Arg Pro Ile Ser Gln Pro Cys Cys
            180                 185                 190
Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr
        195                 200                 205
Trp Arg Thr Val Asp His Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly
    210                 215                 220
<210>17
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：PCR引物
<400>17
cctggccagc ctactggg                                            18
<210>18
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：PCR引物
<400>18
aaggagaccg cttcgtagcg                                          20
<210>19
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：PCR引物
<400>19
atggaacttg gacttgg                                             17
<210>20
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：PCR引物
<400>20
tccatcaccc accggc                                              16
<210>21
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：PCR引物
<400>21
ggccaccgct ccgacgag                                              18
<210>22
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：PCR引物
<400>22
ggcggtccac ggttctccag                                            20
<210>23
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：PCR引物
<400>23
ccaagcccac ctgggtgccc tctttctcc                                  29
<210>24
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：PCR引物
<400>24
catcacccac cggcaggggc ctctcag                                    27
<210>25
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：PCR引物
<400>25
gagcccatgc ccggcctgat ctcagcccga ggaca                           35
<210>26
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：PCR引物
<400>26
ccctggctga ggccgctggc tagtgggact ctgc                            34
<210>27
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：杂交探针
<220>
<221>misc_structure
<222>(1)
<223>wherein n represents a conjugant moiety linking其中n代表
     to alkaline phosphatase
<400>27
ncaggtggtc cgtggggggc gccaagaccg g                                31
<210>28
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：PCR引物
<400>28
ctaggagccc atgccc                                                 16
<210>29
<211>351
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>29
atggctggag gaccgggatc tcgtgctcgt gcagcaggag cacgtggctg tcgtctgcgt 60
tctcaactag tgccggtgcg tgcactcgga ctgggacacc gttccgacga actagtacgt 120
tttcgttttt gttcaggatc ttgtcgtcgt gcacgttctc cgcatgatct atctctagca 180
tctctactag gagccggagc actaagaccg ccgccgggat ctagacctgt atctcaacct 240
tgttgtagac ctactagata cgaagcagta tctttcatgg acgtaaactc tacatggaga 300
accgtagata gactatctgc aaccgcatgt ggctgtctag gatgataata g          351
<210>30
<211>414
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>30
atgggccatc atcatcatca tcatcatcat catcactcga gcggccatat cgacgacgac 60
gacaaggctg gaggaccggg atctcgtgct cgtgcagcag gagcacgtgg ctgtcgtctg 120
cgttctcaac tagtgccggt gcgtgcactc ggactgggac accgttccga cgaactagta 180
cgttttcgtt tttgttcagg atcttgtcgt cgtgcacgtt ctccgcatga tctatctcta 240
gcatctctac taggagccgg agcactaaga ccgccgccgg gatctagacc tgtatctcaa 300
ccttgttgta gacctactag atacgaagca gtatctttca tggacgtaaa ctctacatgg 360
agaaccgtag atagactatc tgcaaccgca tgtggctgtc taggatgata atag       414
<210>31
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：PCR引物
<400>31
aaggaaaaaa gcggccgcca tggaacttgg acttggagg                        39
<210>32
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：PCR引物
<400>32
ttttttcctt ggcggccgct cagcccaggc agccgcagg                       39
<210>33
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>33
gagcgagccc tcagcc                                                16
<210>34
<211>224
<212>PRT
<213>Rattus sp.
<400>34
Met Glu Leu Gly Leu Gly Glu Pro Thr Ala Leu Ser His Cys Leu Arg
  1               5                  10                  15
Pro Arg Trp Gln Pro Ala Leu Trp Pro Thr Leu Ala Ala Leu Ala Leu
             20                  25                  30
Leu Ser Ser Val Thr Glu Ala Ser Leu Asp Pro Met Ser Arg Ser Pro
         35                  40                  45
Ala Ser Arg Asp Val Pro Ser Pro Val Leu Ala Pro Pro Thr Asp Tyr
     50                  55                  60
Leu Pro Gly Gly His Thr Ala His Leu Cys Ser Glu Arg Ala Leu Arg
 65                  70                  75                  80
Pro Pro Pro Gln Ser Pro Gln Pro Ala Pro Pro Pro Pro Gly Pro Ala
                 85                  90                  95
Leu Gln Ser Pro Pro Ala Ala Leu Arg Gly Ala Arg Ala Ala Arg Ala
            100                 105                 110
Gly Thr Arg Ser Ser Arg Ala Arg Ala Thr Asp Ala Arg Gly Cys Arg
        115                 120                 125
Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Ser Ala Leu Gly Leu Gly His Ser
    130                 135                 140
Ser Asp Glu Leu Ile Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg
145                 150                 155             160
Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly
                165                 170                 175
Ala Leu Arg Ser Pro Pro Gly Ser Arg Pro Ile Ser Gln Pro Cys Cys
            180                 185                 190
Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr
        195                 200                 205
Trp Arg Thr Val Asp His Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly
    210                   215                   220
<210>35
<211>112
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>35
Gly Gly Pro Gly Ser Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg
  1               5                  10                  15
Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg
             20                  25                  30
Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg
         35                  40                  45
Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly
     50                  55                  60
Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys
 65                  70                  75                  80
Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr
                 85                  90                  95
Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly
            100                   105                   110
<210>36
<211>111
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>36
Gly Pro Gly Ser Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu
  1               5                  10                  15
Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser
             20                  25                  30
Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala
         35                  40                  45
Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala
     50                  55                  60
Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg
 65                  70                  75                  80
Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp
                 85                  90                  95
Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly
            100                   105                   110
<210>37
<211>110
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>37
Pro Gly Ser Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg
  1               5                  10                  15
Ser Gln Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp
             20                  25                  30
Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg
         35                  40                  45
Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu
     50                  55                  60
Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro
 65                  70                  75                  80
Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg
                 85                  90                  95
Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly
            100                 105                 110
<210>38
<211>109
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>38
Gly Ser Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser
  1               5                  10                  15
Gln Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu
             20                  25                  30
Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser
         35                  40                  45
Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg
     50                  55                  60
Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr
 65                  70                  75                  80
Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr
                 85                  90                  95
Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly
            100                 105
<210>39
<211>108
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>39
Ser Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln
  1               5                  10                  15
Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu
             20                  25                  30
Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro
         35                  40                  45
His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro
     50                  55                  60
Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg
 65                  70                  75                  80
Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val
                 85                  90                  95
Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly
            100                 105
<210>40
<211>107
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>40
Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu
  1               5                  10                  15
Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu Val
             20                  25                  30
Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro His
         35                  40                  45
Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro
     50                  55                  60
Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr
 65                  70                  75                  80
Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp
                 85                  90                  95
Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly
            100                 105
<210>41
<211>106
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>41
Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val
  1               5                  10                  15
Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg
             20                  25                  30
Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro His Asp
         35                  40                  45
Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro
     50                  55                  60
Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu
 65                  70                  75                  80
Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg
                 85                  90                  95
Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly
            100                 105
<210>42
<211>105
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>42
Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro
  1               5                  10                  15
Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe
             20                  25                  30
Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu
         35                  40                  45
Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly
     50                  55                  60
Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala
 65                  70                  75                  80
Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu
                 85                  90                  95
Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly
            100                 105
<210>43
<211>104
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>43
Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val
  1               5                  10                  15
Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg
             20                  25                  30
Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser
         35                  40                  45
Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser
     50                  55                  60
Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val
 65                  70                  75                  80
Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser
                 85                  90                  95
Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly
            100
<210>44
<211>103
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>44
Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Arg
  1               5                  10                  15
Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe
             20                  25                  30
Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu
         35                  40                  45
Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg
     50                  55                  60
Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser
 65                  70                  75                  80
Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala
                 85                  90                  95
Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly
            100
<210>45
<211>102
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>45
Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Arg Ala
  1               5                  10                  15
Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys
             20                  25                  30
Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala
         35                  40                  45
Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro
     50                  55                  60
Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe
 65                  70                  75                  80
Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr
                 85                  90                  95
Ala Cys Gly Cys Leu Gly
            100
<210>46
<211>101
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>46
Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Arg Ala Leu
  1               5                  10                  15
Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser
             20                  25                  30
Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser
         35                  40                  45
Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val
     50                  55                  60
Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met
 65                  70                  75                  80
Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala
                 85                  90                  95
Cys Gly Cys Leu Gly
            100
<210>47
<211>100
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>47
Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly
  1               5                  10                  15
Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly
             20                  25                  30
Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu
         35                  40                  45
Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser
     50                  55                  60
Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp
 65                  70                  75                  80
Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys
                 85                  90                  95
Gly Cys Leu Gly
            100
<210>48
<211>99
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>48
Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu
  1               5                  10                  15
Gly His Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser
             20                  25                  30
Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu
         35                  40                  45
Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln
     50                  55                  60
Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val
 65                  70                  75                  80
Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly
                 85                  90                  95
Cys Leu Gly
<210>49
<211>197
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>49
Met Gln Arg Trp Lys Ala Ala Ala Leu Ala Ser Val Leu Cys Ser Ser
  1               5                  10                  15
Val Leu Ser Ile Trp Met Cys Arg Glu Gly Leu Leu Leu Ser His Arg
             20                  25                  30
Leu Gly Pro Ala Leu Val Pro Leu His Arg Leu Pro Arg Thr Leu Asp
         35                  40                  45
Ala Arg Ile Ala Arg Leu Ala Gln Tyr Arg Ala Leu Leu Gln Gly Ala
     50                  55                  60
Pro Asp Ala Met Glu Leu Arg Glu Leu Thr Pro Trp Ala Gly Arg Pro
 65                  70                  75                  80
Pro Gly Pro Arg Arg Arg Ala Gly Pro Arg Arg Arg Arg Ala Arg Ala
                 85                  90                  95
Arg Leu Gly Ala Arg Pro Cys Gly Leu Arg Glu Leu Glu Val Arg Val
            100                 105                 110
Ser Glu Leu Gly Leu Gly Tyr Ala Ser Asp Glu Thr Val Leu Phe Arg
        115                 120                 125
Tyr Cys Ala Gly Ala Cys Glu Ala Ala Ala Arg Val Tyr Asp Leu Gly
    130                 135                 140
Leu Arg Arg Leu Arg Gln Arg Arg Arg Leu Arg Arg Glu Arg Val Arg
145                 150                 155                 160
Ala Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Ala Tyr Glu Asp Glu Val Ser Phe
                165                 170                 175
Leu Asp Ala His Ser Arg Tyr His Thr Val His Glu Leu Ser Ala Arg
            180                 185                 190
Glu Cys Ala Cys Val
        195
<210>50
<211>156
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>50
Met Ala Val Gly Lys Phe Leu Leu Gly Ser Leu Leu Leu Leu Ser Leu
  1               5                  10                  15
Gln Leu Gly Gln Gly Trp Gly Pro Asp Ala Arg Gly Val Pro Val Ala
             20                  25                  30
Asp Gly Glu Phe Ser Ser Glu Gln Val Ala Lys Ala Gly Gly Thr Trp
         35                  40                  45
Leu Gly Thr His Arg Pro Leu Ala Arg Leu Arg Arg Ala Leu Ser Gly
     50                  55                  60
Pro Cys Gln Leu Trp Ser Leu Thr Leu Ser Val Ala Glu Leu Gly Leu
 65                  70                  75                  80
Gly Tyr Ala Ser Glu Glu Lys Val Ile Phe Arg Tyr Cys Ala Gly Ser
                 85                  90                  95
Cys Pro Arg Gly Ala Arg Thr Gln His Gly Leu Ala Leu Ala Arg Leu
            100                 105                 110
Gln Gly Gln Gly Arg Ala His Gly Gly Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg
        115                 120                 125
Tyr Thr Asp Val Ala Phe Leu Asp Asp Arg His Arg Trp Gln Arg Leu
    130                 135                 140
Pro Gln Leu Ser Ala Ala Ala Cys Gly Cys Gly Gly
145                 150                 155
<210>51
<211>211
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>51
Met Lys Leu Trp Asp Val Val Ala Val Cys Leu Val Leu Leu His Thr
  1               5                  10                  15
Ala Ser Ala Phe Pro Leu Pro Ala Gly Lys Arg Pro Pro Glu Ala Pro
             20                  25                  30
Ala Glu Asp Arg Ser Leu Gly Arg Arg Arg Ala Pro Phe Ala Leu Ser
         35                  40                  45
Ser Asp Ser Asn Met Pro Glu Asp Tyr Pro Asp Gln Phe Asp Asp Val
     50                  55                  60
Met Asp Phe Ile Gln Ala Thr Ile Lys Arg Leu Lys Arg Ser Pro Asp
 65                  70                  75                  80
Lys Gln Met Ala Val Leu Pro Arg Arg Glu Arg Asn Arg Gln Ala Ala
                 85                  90                  95
Ala Ala Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly Gln Arg
            100                 105                 110
Gly Lys Asn Arg Gly Cys Val Leu Thr Ala Ile His Leu Asn Val Thr
        115                 120                 125
Asp Leu Gly Leu Gly Tyr Glu Thr Lys Glu Glu Leu Ile Phe Arg Tyr
    130                 135                 140
Cys Ser Gly Ser Cys Asp Ala Ala Glu Thr Thr Tyr Asp Lys Ile Leu
145                 150                 155                 160
Lys Asn Leu Ser Arg Asn Arg Arg Leu Val Ser Asp Lys Val Gly Gln
                165                 170                 175
Ala Cys Cys Arg Pro Ile Ala Phe Asp Asp Asp Leu Ser Phe Leu Asp
            180                 185                 190
Asp Asn Leu Val Tyr His Ile Leu Arg Lys His Ser Ala Lys Arg Cys
        195                 200                 205
Gly Cys Ile
    210
<210>52
<211>365
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：神经胚活素合成基因
<400>52
taccatggct ggaggaccgg gatctcgtgc tcgtgcagca ggagcacgtg gctgtcgtct 60
gcgttctcaa ctagtgccgg tgcgtgcact cggactggga caccgttccg acgaactagt 120
acgttttcgt ttttgttcag gatcttgtcg tcgtgcacgt tctccgcatg atctatctct 180
agcatctcta ctaggagccg gagcactaag accgccgccg ggatctagac ctgtatctca 240
accttgttgt agacctacta gatacgaagc agtatctttc atggacgtaa actctacatg 300
gagaaccgta gatagactat ctgcaaccgc atgtggctgt ctaggatgat aatagggatc 360
cggct                                                             365
<210>53
<211>365
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：神经胚活素合成基因
<400>53
atggtaccga cctcctggcc ctagagcacg agcacgtcgt cctcgtgcac cgacagcaga 60
cgcaagagtt gatcacggcc acgcacgtga gcctgaccct gtggcaaggc tgcttgatca 120
tgcaaaagca aaaacaagtc ctagaacagc agcacgtgca agaggcgtac tagatagaga 180
tcgtagagat gatcctcggc ctcgtgattc tggcggcggc cctagatctg gacatagagt 240
tggaacaaca tctggatgat ctatgcttcg tcatagaaag tacctgcatt tgagatgtac 300
ctcttggcat ctatctgata gacgttggcg tacaccgaca gatcctacta ttatccctag 360
gccga                                                             365
<210>54
<211>114
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：神经胚活素合成基因
<400>54
Met Ala Gly Gly Pro Gly Ser Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly
  1               5                  10                  15
Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly
             20                  25                  30
His Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys
         35                  40                  45
Arg Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly
     50                  55                  60
Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro
 65                  70                  75                  80
Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn
                 85                  90                  95
Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys
            100                 105                 110
Leu Gly
<210>55
<211>442
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：神经胚活素合成基因
<400>55
taccatgggc catcatcatc atcatcatca tcatcatcac tcgagcggcc atatcgacga 60
cgacgacaag gctggaggac cgggatctcg tgctcgtgca gcaggagcac gtggctgtcg 120
tctgcgttct caactagtgc cggtgcgtgc actcggactg ggacaccgtt ccgacgaact 180
agtacgtttt cgtttttgtt caggatcttg tcgtcgtgca cgttctccgc atgatctatc 240
tctagcatct ctactaggag ccggagcact aagaccgccg ccgggatcta gacctgtatc 300
tcaaccttgt tgtagaccta ctagatacga agcagtatct ttcatggacg taaactctac 360
atggagaacc gtagatagac tatctgcaac cgcatgtggc tgtctaggat gataataggg 420
atccggctgc taacaaagcc cg                                          442
<210>56
<211>442
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：神经胚活素合成基因
<400>56
atggtacccg gtagtagtag tagtagtagt agtagtagtg agctcgccgg tatagctgct 60
gctgctgttc cgacctcctg gccctagagc acgagcacgt cgtcctcgtg caccgacagc 120
agacgcaaga gttgatcacg gccacgcacg tgagcctgac cctgtggcaa ggctgcttga 180
tcatgcaaaa gcaaaaacaa gtcctagaac agcagcacgt gcaagaggcg tactagatag 240
agatcgtaga gatgatcctc ggcctcgtga ttctggcggc ggccctagat ctggacatag 300
agttggaaca acatctggat gatctatgct tcgtcataga aagtacctgc atttgagatg 360
tacctcttgg catctatctg atagacgttg gcgtacaccg acagatccta ctattatccc 420
taggccgacg attgtttcgg gc                                          442
<210>57
<211>135
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：神经胚活素合成基因
<400>57
Met Gly His His His His His His His His His His Ser Ser Gly His
  1               5                  10                  15
Ile Asp Asp Asp Asp Lys Ala Gly Gly Pro Gly Ser Arg Ala Arg Ala
             20                  25                  30
Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Arg
         35                  40                  45
Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe
     50                  55                  60
Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu
 65                  70                  75                  80
Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg
                 85                  90                  95
Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser
            100                 105                 110
Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala
        115                 120                 125
Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly
    130                 135

Claims (10)

1.一种多肽，其选自：
(a)SEQ ID NO：9的氨基酸37-140；
(b)SEQ ID NO：9的氨基酸39-140；或
(c)SEQ ID NO：9的氨基酸42-140。
2.权利要求1中多肽，其中所述氨基酸序列由SEQ ID NO：9的氨基酸37-140组成。
3.编码权利要求1或2的多肽的核酸。
4.包含权利要求3的核酸的载体。
5.一种由权利要求4的载体转化的宿主细胞。
6.权利要求5的宿主细胞，其中所述宿主细胞是中华仓鼠卵巢细胞。
7.一种制备权利要求1的多肽的方法，其包括：(a)提供一种由表达载体转化的宿主细胞，该表达载体包含编码权利要求1的多肽的核酸，(b)培养该宿主细胞，和(c)回收该多肽。
8.一种药物组合物，其包含权利要求1的多肽和可药用载体。
9.权利要求8的组合物在制备治疗哺乳动物外周神经病或神经病性疼痛的药物中的用途。
10.权利要求9的用途，其中所述药物是系统给药的药物。
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