CN1525866A

CN1525866A - 神经胚活素多肽的治疗作用

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Publication number: CN1525866A
Application number: CNA028104978A
Authority: CN
Inventors: ��ȡ�W��Y��; 黛娜·W·Y·萨
Original assignee: BIOLGEN CORP
Current assignee: Than Ao Gen Ma Co
Priority date: 2001-03-28
Filing date: 2002-02-28
Publication date: 2004-09-01
Anticipated expiration: 2022-02-28
Also published as: ATE526982T1; EP1395279B1; AR033031A1; WO2002078730A3; CN1525866B; WO2002078730A2; AU2002250203B2; CA2442159A1; CA2442159C; EP1395279A2; JP4499362B2; JP2012167119A; MY143470A; ES2374971T3; HK1062805A1; JP2009161515A; NZ529126A; JP2005508842A

Abstract

本发明涉及神经病性疼痛，包括触觉异常性疼痛的治疗，以及用于降低与神经病有关的疼痛敏感性丧失的治疗。本发明的治疗涉及神经胚活素(NBN)多肽的应用。

Description

神经胚活素多肽的治疗作用

技术领域

本发明涉及神经病性疼痛(neuropathic pain)，包括触觉异常性疼痛的治疗，以及降低与神经病有关的疼痛敏感性丧失的治疗。

背景技术

神经病性疼痛是这样一类痛疼，它包括数种形式的慢性疼痛，且由神经组织而不是躯体组织的功能紊乱引起。由中枢神经系统或外周神经系统的功能紊乱所引起的神经病性疼痛还可能是外周神经损伤或中枢神经系统区域的损伤所致，也可以由疾病所致，或者还可以是自发性的。神经病性疼痛的症状包括末梢的灼热感，刺痛感，电感，针感，僵硬，麻木，身体变形感，异常性疼痛(由通常是无害的皮肤刺激所诱发的疼痛)，痛觉过敏(hyperalgesia)(对疼痛异常敏感)以及痛觉增敏(hyperpathia)(疼痛刺激停止后持续长时间的扩大的疼痛应答)。

神经病性疼痛的几个常见原因是糖尿病，癌症化疗，带状疱疹感染，由于退化性脊椎病而导致的颈部或腰部神经根的压迫，神经丛或神经根的恶性病变，神经退化，如由于截肢，HIV感染，中枢疼痛通路，包括脊髓丘脑管，丘脑的病变或丘脑的放射治疗。神经病性疼痛的其他原因包括药物诱导的，或毒素诱导的神经病。例如，抗病毒药物如ddI，ddC和d4T通常引起外周神经病，如苯妥英(phenytoin)(治疗癫痫发作的药物)，异烟肼(isoniazid)(抗结核药)，长春新碱(vincristine)，长春花碱(vinblastine)，紫杉醇(taxol)，脱乙酰基紫杉醇(taxotere)以及顺铂(cisplatin)(癌症化疗剂)，高剂量的维生素以及叶酸拮抗剂。

处理神经病性疼痛的目前的治疗方法对许多患者而言益处是有限的，且还产生人们不期望有的副作用或剂量限制性的毒性。另外，目前的治疗是对症治疗，不是调控(modifying)疾病。所以极需对神经病性疼痛的改进的处理和治疗方法，尤其是针对潜在的病理的那些处理或治疗方法。

发明概述

本发明提供治疗神经病性疼痛、治疗触觉异常性疼痛以及降低与神经病有关的疼痛敏感性丧失的改进的方法。该方法应用神经胚活素(neublastin)(“NBN”)多肽，包括全长神经胚活素多肽或有生物活性的截短的神经胚活素多肽(例如至少包括SEQ ID NOS：2，4，5和11-27)。另外，本发明还提供了药物组合物，该组合物包含全长神经胚活素多肽，或悬浮在，溶解在或分散在药学上可接受的载体中的截短的神经胚活素多肽。

在具体的实施方案中，神经胚活素多肽可以是如下任一种多肽：SEQ IDNO：2的AA_-80-AA₁₄₀，SEQ ID NO：2的AA_-41-AA₁₄₀，SEQ ID NO：2的AA₁-AA₁₄₀，SEQ ID NO：2的AA₂₅-AA₁₄₀，SEQ ID NO：2的AA₂₈-AA₁₄₀，SEQID NO：4的AA_-80-AA₁₄₄，SEQ ID NO：4的AA₁-AA₁₄₄，SEQ ID NO：5的AA₁-AA₂₂₄或SEQ ID NO：5的AA₈₁-AA₂₂₄；可以是包含SEQ ID NO：2的AA₁₀₇-AA₁₄₀或SEQ ID NO：2的AA₇₆-AA₁₄₀中所示的C末端序列，且保留了GDNF家族和TGF-β超家族特征性的7个半胱氨酸残基的至少一种多肽；可以是包含SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：21，SEQID NO：22，SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：27的至少一种多肽；或者可以是与上述所列任一序列具有70％以上的氨基酸同一性的至少一种多肽序列。

神经胚活素多肽可以用衍生的半分子(moiety)进行修饰以使其存留时间延长和/或在体内的浓度增加。所述神经胚活素多肽可以是N-糖基化的神经胚活素多肽。另外，神经胚活素多肽可以用一种或多种半分子来衍生，所述半分子包括，但不限于聚乙二醇半分子，脂肪族酯，酰胺，N-酰基-衍生物或O-酰基衍生物。

在实施方案中，本发明的特征在于一种治疗受试者神经病性疼痛的方法，该方法包括给药受试者有效量的神经胚活素多肽，包括例如，SEQ IDNOS：2，4，5和11-27中的任何一种，它们可以单独给药，或者还给药受试者有效量的选自如下的诱导痛觉丧失的化合物：类鸦片(opioids)，抗心律失常药，局部的(topical)止痛药，局限的(local)止痛药，抗惊厥药，抗抑郁药，皮质类固醇或非类固醇抗炎药(NSAIDS)。在优选实施方案中，诱导痛觉丧失的化合物是抗惊厥药。在另一优选实施方案中，诱导痛觉丧失的化合物是加巴喷丁(gabapentin)(1-(氨甲基)环己烷乙酸)或pregabalin(S-(+)-4-氨基-3-(2-甲基丙基)丁酸)。

在另一优选实施方案中，本发明的特征在于一种治疗受试者触觉异常性疼痛的方法，该方法或者给药受试者有效量的神经胚活素多肽，包括例如，SEQ ID NOS：2，4，5和11-27中的任何一种，或者单独给药，或者和有效量的选自如下的诱导痛觉丧失的化合物来给药受试者有效量的神经胚活素多肽：类鸦片，抗心律失常药，局部的止痛药，局限的止痛药，抗惊厥药，抗抑郁药或NSAIDS。在一个优选实施方案中，所述诱导痛觉丧失的化合物是加巴喷丁(1-(氨甲基)环己烷乙酸)或pregabalin(S-(+)-4-氨基-3-(2-甲基丙基)丁酸)。

神经胚活素多肽可以与治疗剂联合给药，所述治疗剂包括但不限于抗癌药或抗病毒药。抗癌药包括但不限于，紫杉醇，脱乙酰基紫杉醇，顺铂，噻氨酯哒唑(nocodazole)，长春新碱，长春地辛(vindesine)和长春花碱。抗病毒药包括但不限于ddI，DDC，d4T，磷卡萘替(foscamet)，氨苯砜(dapsone)，甲硝唑(metronidazole)或异烟肼。

本发明包括治疗受试者神经病性疼痛的方法。在具体实施方案中，所述神经病性疼痛与糖尿病性神经病有关。在另一实施方案中，所述神经病性疼痛与受试者被病毒感染有关，所述病毒包括但不限于疱疹病毒，人类免疫缺陷病毒(HIV)以及乳头瘤病毒。神经病性疼痛可以与被单纯疱疹病毒感染有关，或尤其与带状疱疹后神经痛(post-herpes neuralgia)有关。在另一实施方案中，所述神经病性疼痛与坐骨神经痛有关。在另一实施方案中，本发明的特征在于一种调节患神经病的受试者痛觉敏感性丧失的方法。在优选实施方案中，所述神经病是糖尿病性神经病。在另一优选实施方案中，所述痛觉敏感性丧失是热痛觉敏感性丧失。

在另一实施方案中，神经病性疼痛是痛觉过敏性疼痛，幻觉痛(phantompain)，热痛觉过敏或由于与外伤有关的损伤。另外，神经病性疼痛也可以与以下疾病有关：先天性神经病(包括但不限于弗里德里希氏共济失调(Friedreich ataxia)，家族性淀粉样多发性神经病(familial amyloidpolyneuropathy)，唐吉尔病(Tangier disease)，法布里氏病(Fabry disease))，代谢性疾病(包括但不限于肾功能不全和甲状腺功能低下)，维生素缺乏(包括但不限于维生素B12缺乏，维生素B6缺乏以及维生素E缺乏)，中毒性神经病和医源性神经病(包括但不限于酒精中毒，维生素B6中毒，六碳化合物中毒(hexacarbon intoxication)，乙胺碘呋酮(amiodarone)，氯霉素(chloramphenicol)，双硫醒(disulfiram)，异烟肼(isoniazide)，金，锂，甲硝唑，米索硝唑(misonidazole)，呋喃妥因(nitrofurantoin))，传染性神经病(包括但不限于麻风病，莱姆病(Lyme disease))，自身免疫性神经病(包括但不限于格-巴综合征(Guillain-Barre syndrome)，慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病，不明意义的单克隆γ球蛋白病(monoclonal gammopathy ofundetermined significance)以及多发性神经病)，三叉神经痛，捕获综合征(entrapment syndromes)(包括但不限于Carpel通道)，外伤后神经痛，假性肢痛(phantom limb pain)，多发性硬化性疼痛，复合型区域性疼痛综合征(complex regional pain syndrome)(包括但不限于交感反射性营养不良，灼痛)，肿瘤，脉管病性/血管病性神经病以及自发性(idiopathic)神经病)。

上述方法涉及以每剂每公斤受试者体重1μg-30,000μg的剂量给药受试者包含神经胚活素多肽的制剂给药，优选全身给药受试者。在选择性的实施方案中，所述剂量是每剂每公斤受试者体重10μg-30,000μg；所述剂量是每剂每公斤受试者体重25μg-10,000μg；所述剂量是每剂每公斤受试者体重25μg-3,000μg；所述剂量是每剂每公斤受试者体重50μg-3,000μg。

前述方法中所用的神经胚活素多肽可通过任何适当的传输系统给药，且优选通过以下传输途径传输：静脉内传输，肌肉内传输，肺内传输，皮下传输或腹膜内传输，最优选通过肌肉内传输或皮下传输给药。前述方法中所用的神经胚活素多肽也可以通过鞘内传输给药。

本发明包含NBN多肽的制剂也可以以定时释放的组合物给药。

除非另有说明，本发明中所用的所有技术和科学术语与该发明所属于的领域的普通技术人员所理解的含义相同。尽管与本发明所述等同的步法和材料可在实践或检验本发明时应用，但本发明以下仍然对适当的方法和材料进行了描述。本文中所提及的所有出版物，专利申请，专利和其他参考文献在此以其全文引入本文作为参考。在发生冲突时，依据包括定义的本说明书。另外，本发明的材料，方法以及实施例仅用于作例证性说明，不构成对本发明的限制。

本发明的其他特征和优点在以下详细的说明和权利要求中是显而易见的。

附图简述

图1的虚线图表示，通过向L5/L6脊神经结扎(SNL)大鼠皮下给药神经胚活素(NBN)，可使触觉异常性疼痛得到几乎完全的预防；

图2的虚线图表示，通过向L5/L6脊神经结扎(SNL)大鼠皮下给药神经胚活素(NBN)，可使热痛觉过敏得到几乎完全的预防；

图3的虚线图表示，通过向L5/L6脊神经结扎(SNL)大鼠皮下给药神经胚活素(NBN)，可使完全确定的触觉异常性疼痛得到几乎完全的逆转；

图4的虚线图表示，通过向L5/L6脊神经结扎(SNL)大鼠皮下给药神经胚活素(NBN)，可使完全确定的热痛觉过敏得到几乎完全的逆转；

图5的条线图表示，通过向STZ(链脲霉素)诱导的神经病大鼠皮下给药神经胚活素(NBN)，可使热痛觉减退得到几乎完全的校正；

图6A和图6B表示，在STZ处理后4周(图6A)和8周(图6B)，向STZ(链脲霉素)诱导的神经病大鼠皮下给药神经胚活素，可预防热痛觉过敏(图6A)，预防热痛觉减退(图6B)，逆转热痛觉过敏(图6B)。

图7的虚线图表示，通过向L5/L6脊神经结扎(SNL)大鼠皮下给药神经胚活素，可使完全确定的触觉异常性疼痛得到神经胚活素剂量依赖性的逆转。

图8的虚线图表示，通过向L5/L6脊神经结扎(SNL)大鼠皮下给药神经胚活素，可使完全确定的热痛觉过敏得到神经胚活素剂量依赖性的逆转。

发明详述

本发明涉及通过给药有患神经病性疼痛危险，或已患神经病性疼痛的受试者神经胚活素多肽，治疗神经病性疼痛，治疗触觉异常性疼痛并降低痛觉敏感性丧失的方法和组合物。

神经胚活素多肽是可提高存活，维持表型分化，防止退化，促进再生并恢复神经细胞和神经组织活性的蛋白。神经胚活素(最初例如在WO00/01815中描述)还可称作“artemin”(参见，例如WO 00/18799)和“enovin”(参见，例如WO 00/04050)。神经胚活素已经被分类作为TGF-β超家族的关系较远的成员(Massague，等，.1994，Trends in Cell Biology，4：172-178)，且是神经胶质细胞系来源的神经营养因子配体家族的一个成员(“GDNF”；WO93/06116，已引入本为作为参考)，在该家族中包括GDNF，persephin(“PSP”；Milbrandt等.，1998，Neuron 20：245-253，已引入本为作为参考)和neurturin(“NTN”；WO 97/08196，已引入本为作为参考)。GDNF亚家族的配体都有通过RET受体酪氨酸激酶诱导信号传导的能力。GDNF亚家族的这三个配体在其对神经营养性受体家族，GFRα受体的相对亲和性方面不同。神经胚活素优选通过α3-RET复合物起作用。Baudet等.，Development，127，pp.4335-44(2000)；Baloh等.，Neuron，21，pp.1291-1302(1998)；Airaksinen等.，Mol.Cell.Neuroscience，13，pp.3 13-325(1999)。

神经胚活素(SEQ ID NO：2)与GDNF亚家族成员Neurturin(SEQ IDNO：6)，Persephin(SEQ ID NO：7)和GDNF(SEQ ID NO：8)的氨基酸序列比较如表1所示。在本发明中应用的神经胚活素多肽优选有GDNF亚家族的指纹结构，即，表1中有下划线的氨基酸残基。

表1：神经胚活素(SEQ ID NO：2)与Neurturin(SEQ ID NO：6)，Persephin(SEQ IDNO：7)和GDNF(SEQ ID NO：8)的氨基酸序列比较
	Neurturin-全长 ------------------MQRWKAAALASVLCSSVLSIWMCREGLLLSHRLGPA神经胚活素 MELGLGGLSTLSHCPWPRRQPALWPTLAALALLSSVAEASLGSAPRSPAPREGPPPPersephin-全长 ---------------------------------------------------------GDNF-人-全长 -----MKLWDVVAVCLVLLHTASAFPLPAGKRPPEAPAEDRSLGRRRAPFALSSDSNeurturin-全长 LVPLHRLPRTLDARIARLAQYRALLQGAPDAMELRELTPWAGRPPGPRRRAGPRRR神经胚活素 VLASPAGHLPGGRTARWCSGRARRPPPQPSRPAPPPPAPPSALPRGGRAARAGGPGPersephin-全长 -MAVGKFLLGSLLLLSLQLGQGWGPDARGVPVADGEFSSEQVAKAGGTWLGTHRPLGDNF-人-全长 NMPEDYPDQFDDVMDFIQATIKRLKRSPDKQMAVLPRRERNRQAAAANPENSRGKGNeurturin-全长 RARARLGARPCGLRELEVRVSE LGLGYASDETVL FRYCAGACEA-AARVYDLGLRR神经胚活素 SRARAAGARGCRLRSQLVPVRA LGLGHRSDRLV RFRFCSGSCRR-ARSPHDLSLASPersephin-全长 ARLRRALSGPCQLWSLTLSVAE LGLGYASEEKVI FRYCAGSCPRGARTQHGLALARGDNF-人-全长 RRGQRGKNRGCVLTAIHLNVTD LGLGYETKEELI FRYCSGSCDA-AETTYDKILKN* * : * ***: :. : *::: * :. Neurturin-全长 LRQRRRLRRE---RVRA QPCCRPTAYEDEVSFLDAHSRYHTVHEL SARECACV-神经胚活素 LLGAGALRPPPGSRPVS QPCCRPTRYE-AVSFMDVNSTWRTVDRL SATACGCLGPersephin-全长 LQGQGRAHGG------ PCCRPTRYT-DVAFLDDRHRWQRLPQL SAAACGCGGGDNF-人-全长 LSRNRRLVSD-----KVG QACCRPIAPDDDLSFLDDNLVYHILRKH SAKRCGCI- **** : ::: . :: : . ** .
^*表示有单个，完全保守的残基。:表示如下‘强’组之一是完全保守的：-STA，NEQK，NHQK，NDEQ，QHRK， MILV，MILF，HY，FYW。.表示如下‘较弱’组之一是完全保守的：

-CSA，ATV，SAG，STNK，STPA，SGND，SNDEQK，NDEQHK，NEQHRK，HFY。

从表1所示的氨基酸序列对比可以看出，神经胚活素在TGF-β超家族中的保守位置处有七个半胱氨酸残基。根据序列对比显示，神经胚活素是神经营养性因子GDNF亚家族(LGLG-FR(Y/F)CSGSC-QxCCRP-SAxxCGC，表1有下划线处所示的GDNF亚家族指纹结构)的一个成员。

本发明所用的神经胚活素多肽可以以任何生物活性形式提供，包括原前蛋白(pre-pro-protein)形式，前蛋白(pro-protein)形式，成熟蛋白形式，糖基化的蛋白形式，磷酸化的蛋白形式，截短的形式，或任何其他翻译后修饰的蛋白形式。推测有生物活性的神经胚活素是每种NBN变体的二聚化形式，因为二聚体的形成对活性而言是必需的。据观察单体的NBN多肽活性极低至无活性。有生物活性的神经胚活素多肽包括二聚化的多肽，该多肽在辅助因子(如GFRα3或RET)存在下，与GFRα3或与GFRα和RET的复合物结合，诱导RET的二聚化以及RET的自动磷酸化。因此，本文所用“神经胚活素多肽”是指具有神经营养活性的多肽(例如，如WO 00/01815所述)，这些多肽如下：

1.野生型神经胚活素

以下“野生型”神经胚活素氨基酸(“aa”或“AA”)序列是可用于本发明的方法和组合物中的那些氨基酸序列的举例：

--SEQ ID NO：2的AA_-80-AA₁₄₀(“野生型”人原前蛋白(prepro))，

--SEQ ID NO：2的AA_-41-AA₁₄₀(人前蛋白(pro))，

--SEQ ID NO：2的AA₁-AA₁₄₀(成熟蛋白140AA(SEQ ID NO：11)；此后称“140NBN”)，

--SEQ ID NO：2的AA₂₅-AA₁₄₀(成熟蛋白116AA(SEQ ID NO：12)；此后称“116NBN”)，

--SEQ ID NO：2的AA₂₈-AA₁₄₀(成熟蛋白113AA(SEQ ID NO：13)；此后称“113NBN”)，

--SEQ ID NO：4的AA₈₀-AA₁₄₄(小鼠原前蛋白)，

--SEQ ID NO：4的AA₁-AA₁₄₄(小鼠成熟蛋白--144AA)，

--SEQ ID NO：5的AA₁-AA₂₂₄(大鼠的原前蛋白)，

--SEQ ID NO：5的AA₈₁-AA₂₂₄(大鼠的成熟蛋白--144AA)，

--具有SEQ ID NO：2的AA₁₀₇-AA₁₄₀所示C末端序列的肽，更优选SEQID NO：2的AA₇₆-AA₁₄₀，且它们保留了GDNF家族和TGF-β超家族特征性的7个Cys残基。

在一个实施方案中，优选的神经胚活素多肽包含如SEQ ID NO：2中位置43，70，74，107，108，136和138处保守的(7个)半胱氨酸。已知这7个保守的半胱氨酸残基是在TGF-β超家族内，以形成三个单体内二硫键(所涉及到的，例如，在SEQ ID NO：2中半胱氨酸残基43-108之间，70-136之间和74-138之间)和一个单体间二硫键(所涉及的，例如在SEQ ID NO：2中半胱氨酸残基107-107之间)，它们与延伸的β链区一起构成TGF-β超家族的保守结构基序。参见，例如Daopin等.，Proteins 1993，17：176-192。

2.截短的神经胚活素(“NBNs”)

可用于在本发明的神经胚活素多肽还包括全长神经胚活素分子的截短形式。在这些截短的分子中，一个或多个氨基酸已从N末端或C末端，优选N末端缺失。截短的神经胚活素多肽可以这样得到，即通过提供成熟的神经胚活素多肽，并使成熟的神经胚活素多肽与至少一种蛋白酶，在足以产生截短的神经胚活素多肽的条件下接触。优选，至少一种蛋白酶是外蛋白酶，且与成熟的神经胚活素多肽接触时形成外肽酶神经胚活素多肽消化产物，该产物能被二肽酶进一步消化。

本文中所描述的截短的神经胚活素多肽优选包括这样的多肽序列，该序列包含在成熟的神经胚活素序列中保守的7个半胱氨酸残基。在某些优选实施方案中，截短的神经胚活素多肽包括成熟113NBN神经胚活素多肽的至少85个羧基末端氨基酸。

神经胚活素的其他变体包括截短的NBN形式。这些实施例包括：

(i)112AA的多肽序列，在本文中称为NBN112，其具有成熟神经胚活素多肽的羧基末端112个氨基酸，例如，SEQ ID NO：2的氨基酸29-140(SEQIDNO：14)。

(ii)111AA的多肽序列，在本文中称为NBN111，其具有成熟神经胚活素多肽的羧基末端111个氨基酸，例如，SEQ ID NO：2的氨基酸30-140(SEQID NO：15)。

(iii)110AA的多肽序列，在本文中称为NBN110，其具有成熟神经胚活素多肽的羧基末端111个氨基酸，例如，SEQ ID NO：2的氨基酸31-140(SEQID NO：16)。

(iv)109AA的多肽序列，在本文中称为NBN109，其具有成熟神经胚活素多肽的羧基末端109个氨基酸，例如，SEQ ID NO：2的氨基酸32-140(SEQID NO：17)。

(v)108AA的多肽序列，在本文中称为NBN108，其具有成熟神经胚活素多肽的羧基末端108个氨基酸，例如，SEQ ID NO：2的氨基酸33-140(SEQID NO：18)。

(vi)107AA的多肽序列，在本文中称为NBN107，其具有成熟神经胚活素多肽的羧基末端107个氨基酸，例如，SEQ ID NO：2的氨基酸34-140(SEQID NO：19)。

(vii)106AA的多肽序列，在本文中称为NBN106，其具有成熟神经胚活素多肽的羧基末端106个氨基酸，例如，SEQ ID NO：2的氨基酸35-140(SEQ ID NO：20)。

(viii)105AA的多肽序列，在本文中称为NBN105，其具有成熟神经胚活素多肽的羧基末端105个氨基酸，例如，SEQ ID NO：2的氨基酸36-140(SEQ ID NO：21)。

(ix)104AA的多肽序列，在本文中称为NBN104，其具有成熟神经胚活素多肽的羧基末端104个氨基酸，例如，SEQ ID NO：2的氨基酸37-140(SEQID NO：22)。

(x)103AA的多肽序列，在本文中称为NBN103，其具有成熟神经胚活素多肽的羧基末端103个氨基酸，例如，SEQ ID NO：2的氨基酸38-140(SEQID NO：23)。

(xi)102AA的多肽序列，在本文中称为NBN102，其具有成熟神经胚活素多肽的羧基末端102个氨基酸，例如，SEQ ID NO：2的氨基酸39-140(SEQID NO：24)。

(xii)101AA的多肽序列，在本文中称为NBN101，其具有成熟神经胚活素多肽的羧基末端101个氨基酸，例如，SEQ ID NO：2的氨基酸40-140(SEQ ID NO：25)。

(viii)100AA的多肽序列，在本文中称为NBN100，其具有成熟神经胚活素多肽的羧基末端100个氨基酸，例如，SEQ ID NO：2的氨基酸41-140(SEQ ID NO：26)。

(xiv)99AA的多肽序列，在本文中称为NBN99，其具有成熟神经胚活素多肽的羧基末端99个氨基酸，例如，SEQ ID NO：2的氨基酸42-140(SEQID NO：27)。

可以理解，本发明所公开的神经胚活素多肽的截短形式(例如，112AA到99AA)具有神经营养活性。

在最优选实施方案中，截短的神经胚活素多肽是成熟的113AA的羧基末端氨基酸99aa，100aa，101aa，102aa，103aa，104aa，105aa，106aa，107aa，108aa，109aa，110aa，111aa或112aa(即，分别为NBN99，NBN100，NBN101，NBN102，NBN103，NBN104，NBN105，NBN106，NBN107，NBN108，NBN109，NBN110，NBN111或NBN112)。这些序列也可以在小鼠和大鼠神经胚活素多肽中找到，分别为SEQ ID NOS：4和5中的羧基末端99aa，100aa，101aa，102aa，103aa，104aa，105aa，106aa，107aa，108aa，109aa，110aa，111aa或112aa。这些最优选的截短的NBN形式的实施例是有生物活性的(称为“具有生物活性的截短的神经胚活素多肽”)，因为在本发明中已经证明它们具有神经营养活性。如上所述，NBN二聚化是生物活性所必需的，因为观察到NBN单体多肽具有极小活性至没有活性。

3.具有基本类似性或同一性的神经胚活素(“NBNs”)变体

可用于本发明的NBNs也包括与前述各种原前，前，成熟和截短的“神经胚活素”多肽有基本类似性或同一性的氨基酸序列。优选所用的神经胚活素多肽与SEQ ID NO：2，4，5或11-27所示的神经胚活素多肽有至少70％，更优选85％，甚至更优选90％，或甚至更优选95％的同一性或类似性。最优选，所用的神经胚活素多肽与SEQ ID NOS：2，4，5或11-27所示的神经胚活素多肽有至少99％的类似性或同一性。

侯选多肽与本发明的神经胚活素多肽之间的同源性程度被确定为这两个氨基酸序列之间的类似性或同一性的程度。

高水平的序列同一性提示第一个序列是衍生于第二个序列的可能性。氨基酸序列的同一性要求在两个被对比的序列之间有相同的氨基酸序列。因此，与参考序列有70％氨基酸同一性的侯选序列要求的条件是，进行对比后，侯选序列中70％的氨基酸与参考序列中相应的氨基酸相同。由计算机分析确定同一性，例如，但不限于，ClustalX计算机对比程序(Thompson JD，Gibson TJ，Plewniak F，Jeanmougin F，&Higgins DG：″The ClustalX windowsinterface：flexible strategies for multiple sequence alignment aided by qualityanalysis tools″；Nucleic Acids Res.1997，25(24)：4876-82)和其中所建议的缺省参数。应用该程序，由本发明类似的DNA序列编码的多肽的成熟部分，与本发明SEQ ID NO：2所示氨基酸序列(人NBN)，SEQ ID NOS：4和5(啮齿类NBN)或SEQ ID NOS：11-27(成熟和截短的NBN)显示至少70％，更优选85％，甚至更优选90％，或甚至更优选95％，最优选至少99％的同一性程度。

其他对比工具是已知的，如Needleman等，J.Mol.Biol.48：443(1970)中所描述的动态规划算法，以及Align Program，一种由DNAstar，Inc.生产的商业软件包，其说明已引入本文作参考。一旦进行侯选序列和参考序列之间的对比和改进，便可计算百分同源性的记分。将每一序列的单个的氨基酸根据它们彼此之间的类似性顺序对比。

类似性因素包括类似的大小，形状和电荷。确定氨基酸类似性的一个尤其优选的方法是Dayhoff等，在ATLAS OF PROTEIN SEQUENCE ANDSTRUCTURE 345-352(1978，如上)中描述的PAM250矩阵，在此引入本文作参考。首先计算类似性记分为所对比的成对的氨基酸类似性记分的总数。用于百分同源性和同一性目的时忽略插入或缺失。因此，该计算中不用缺口罚分。将最初的记分除以侯选化合物和神经胚活素多肽的7个半胱氨酸骨架的记分的几何平均数来校正该记分。所述几何平均数是这些记分的乘积的平方根。经校正的最初记分是百分同源性。

如上所述，本发明的神经胚活素多肽包括多肽变体。在本发明的上下文中，术语“多肽变体”包括具有与SEQ ID NO：2(人NBN)，或SEQ IDNOS：4和5(啮齿类NBN)，或SEQ ID NOS：11-27(成熟和截短的NBN)所示氨基酸序列，在一个或多个氨基酸位置上不同的氨基酸序列的多肽(或蛋白)。这样的的多肽变体包括以上所述的修饰的多肽，和保守取代物，剪接变体，同种型(isoform)，来自其他种属的同系物，以及多态物(polymorphisms)。

如本文以上所定义的，术语“保守取代”是指一个氨基酸残基被另一个生物学类似的残基取代。通常，生物学的类似性，如上所述，反映在野生型序列上保守氨基酸的取代。例如，人们可以预测，保守的氨基酸取代对生物活性有极小影响或没有影响，尤其是这些取代占多肽或蛋白中残基总数的10％以下时。优选，保守的氨基酸取代表示多肽或蛋白的5％以下的变化，最优选多肽或蛋白的2％以下的变化。例如，当按照例如人113NBN计算时，最优选的保守取代表示在野生型成熟氨基酸序列中的三个以下的氨基酸取代。在尤其优选的实施方案中，在成熟序列中有单个氨基酸取代，其中被取代的氨基酸和取代的氨基酸都是非环状的。

特定的保守取代的其他实施例包括一个疏水性残基被另一个残基，如异亮氨酸，缬氨酸，亮氨酸或蛋氨酸取代，或一个极性残基被另一个残基取代，如精氨酸被赖氨酸取代，谷氨酸被天冬氨酸取代，或谷氨酰胺被天冬酰胺取代等等。

所述保守取代的术语也包括用被取代的氨基酸残基代替非被取代的亲代氨基酸残基，条件是针对被取代的多肽的抗体也与非被取代的多肽有免疫反应。

对最初的氨基酸序列的修饰可产生与未被修饰的对应多肽相比具有实质上相同活性的蛋白，因此它可以被看作是亲代蛋白的功能类似物。这样的修饰可以是例如通过点突变预先计划的，或它们也可以是自然发生的，并包括剪接变体，同种型，来自其他种属的同系物。这样的功能类似物也包括在本发明中。

另外，对最初的氨基酸序列的修饰也可以产生不保持亲代蛋白生物活性的蛋白，包括显性失活形式等等。显性失活蛋白通过结合，或隔绝调节剂，如上游或下游成分(它们通常与所述多肽功能性地相互作用)来干扰野生型蛋白。这样的显性失活形式也包括在本发明中。

4.衍生物或修饰的NBNs

本发明的多肽也包括嵌合多肽或可裂解的融合多肽，其中另一多肽被融合在所述多肽或其片段的N末端或C末端。嵌合多肽可以通过将编码另一多肽的核酸序列(或其部分)与本发明的核酸序列(或其部分)融合来生产。生产嵌合多肽的技术是标准技术。该技术通常需要将序列进行连接以使它们处于同一读框中，且在相同启动子和终止子的调控下表达所述融合多肽。

神经胚活素多肽可以是N-糖基化的多肽。在一个实施方案中，SEQ IDNO：2的位置122处的Asn残基被糖基化。

本发明也包括神经胚活素融合蛋白，如Ig-融合物，例如在美国专利5,434,131；5,565,335；5,541,087和5,726,044中所描述的(它们都引入本文作参考)，或优选血清白蛋白融合物。

本发明可用的神经胚活素多肽包括定时释放的组合物和用衍生半分子(优选聚乙二醇半分子)修饰的神经胚活素多肽，以延长存留时间和/或增加在体液中的浓度。另外，所述神经胚活素多肽也可以用选自如下的半分子衍生：脂肪族酯，酰胺，N-酰基衍生物，或O-酰基衍生物。

下面表2显示人(SEQ ID NO：2)，小鼠(SEQ ID NO：4)和大鼠(SEQ IDNO：5)原前神经胚活素之间的ClustalW对比。成熟NBN多肽NBN140，NBN116，NBN113和NBN99用“*”表示。NBN112的N末端到NBN100用连续的“:”符号表示。下面表3显示野生型人，小鼠和大鼠神经胚活素多肽(SEQ ID NOS：2，4和5)之间距离的对比。

表2.人，小鼠和大鼠神经胚活素的ClustalWd对比

表3.人，小鼠和大鼠神经胚活素的距离对比

神经胚活素多肽的生产方法

本发明中所用的神经胚活素多肽可分离自哺乳动物细胞，优选分离自人细胞或小鼠源的细胞。在最优选的实施方案中，所述神经胚活素多肽可分离自人心脏组织，分离自人骨骼肌，自人胰腺，或自人脑组织，尤其分离自尾状核或丘脑，或者其可得自哺乳动物源的DNA，这在以下将予以详述。

或者，可以通过表达编码该神经胚活素多肽的多核苷酸的表达来获得所述神经胚活素多肽。这样的多核苷酸包括DNA，cDNA和RNA序列，且在本领域中可得到。参见，例如，WO 00/01815，WO 00/04050和WO00/18799，在此引入本文作为参考。尤其有用的多核苷酸有SEQ ID NO：1所示的DNA序列(人NBN cDNA)，和SEQ ID NO：3所示的DNA序列(小鼠NBN cDNA)。另外，人NBN的基因组序列也可以应用(参见GenBank，登录号为AC 005038)。

更具体的，本发明所用的神经胚活素多肽可通过在允许神经胚活素多肽产生的条件下培养包含编码神经胚活素多肽的核酸序列的细胞，然后从该培养基中回收所述神经胚活素多肽。编码神经胚活素多肽的核酸序列可以是通常情况下内源于细胞的核酸序列，或是被导入到“生产”细胞中的外源衍生的核酸序列。当为了生产神经胚活素多肽而对细胞进行基因修饰时，所述细胞可以通过常规方法或通过基因活化进行修饰。

根据常规方法，包含神经胚活素cDNA或基因组DNA序列的DNA分子可被包含在表达构建体中，并通过标准方法转染进入细胞中，所述标准方法包括，但不限于，脂质体-，1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物(polybrene)-，或DEAE葡聚糖-介导的转染，电穿孔，磷酸钙沉淀，微注射，或高速驱动的微粒(“biolistics”)。或者，人们可以用通过病毒载体传输DNA的系统。已知用于基因传输的病毒包括腺病毒，腺相关病毒，慢病毒，疱疹病毒，腮腺病毒，脊髓灰质炎病毒，逆转录病毒，新培斯病毒和痘苗病毒，如金丝雀痘病毒，以及昆虫细胞，尤其是Sf9昆虫细胞的杆状病毒感染。

或者，可以用基因活化(“GA”)的方法来修饰所述细胞以产生神经胚活素多肽，所述方法如美国专利5,733,761和5,750,376(它们已引入本为作为参考)中所描述的。

因此，在指细胞时本文所用的术语“基因修饰的”包含这样的细胞，即在导入编码基因产物的核酸分子和/或控制基因产物的内源性编码序列表达的调控元件后，表达特定基因产物的细胞。所述核酸分子可通过基因打靶，允许所述核酸分子在特定基因组位点掺入而被导入。

在一个实施方案中，所述神经胚活素多肽在细菌细胞中生产，优选在大肠杆菌细胞中。在不同的实施方案中，所述神经胚活素多肽在昆虫衍生的细胞中，尤其是在Sf9中生产。

在另一实施方案中，所述神经胚活素多肽在例如哺乳动物细胞中，例如，人细胞，卵母细胞或酵母细胞中生产。本发明的细胞可以是，但不限于，人胚胎肾(“HEK”)细胞，例如，HEK293细胞，BHK21细胞，中国仓鼠卵巢(“CHO”)细胞，滑爪蟾(Xenopus laevis)卵母细胞(“XLO”)或巴斯德毕赤(酵母)。在一个实施方案中，本发明的细胞是真菌细胞，例如，丝状真菌细胞。在另一实施方案中，所述细胞是昆虫细胞，最优选Sf9细胞。本发明其他的哺乳动物细胞是PCl2，HiB5和RN33b细胞系，人神经先祖细胞以及来源于人细胞的其他细胞，尤其是神经细胞。

初级或次生细胞的实施例包括成纤维细胞，上皮细胞包括乳腺的和小肠的上皮细胞，内皮细胞，形成血液的成份，包括淋巴细胞和骨髓细胞，神经胶质细胞，肝细胞，角质细胞，肌细胞，神经细胞，或这些细胞类型的前体细胞。可用于本方法的永生化人细胞系的实施例包括但不限于，Bowes黑色素瘤细胞(ATCC登录号CRL9607)，Daudi cells(ATCC登录号CCL213)，HeLa细胞以及其衍生物(ATCC登录号CCL2，CCL2.1和CCL2.2)，HL-60细胞(ATCC登录号CCL240)，HT-1080细胞(ATCC登录号CL121)，Jurkat细胞(ATCC登录号TIB 152)，KB癌细胞(ATCC登录号CCL17)，K-562白血病细胞(ATCC登录号CCL 243)，MCF-7乳腺癌细胞(ATCC登录号BTH 22)，MOLT-4细胞(ATCC登录号1582)，Namalwa细胞(ATCC登录号CRL 1432)，Raji细胞(ATCC登录号CCL86)，RPMI 8226细胞(ATCC登录号CCL155)，U-937细胞(ATCC登录号CRL1593)，WI-38VA13亚系2R4细胞(ATCC登录号CLL 75.1)，以及2780AD卵巢癌细胞(Van der Blick等.，Cancer Res.48：5927-5932，1988)，以及由人细胞和其他种属的细胞融合的异种杂交瘤细胞。次生人成纤维细胞株如WI-38(ATCC登录号CCL75)和MRC-5(ATCC登录号CCL 171)也可应用。

当所述细胞是真核细胞时，本发明异源多核苷酸的掺入可特别通过感染(使用病毒载体)，转染(使用质粒载体)，应用磷酸钙沉淀，微注射，电穿孔，脂质转染或本领域已知的其他物理化学方法。

从生产细胞的培养物中，或从生产细胞的条件培养基中，应用标准的蛋白纯化技术，包括重折叠(如果可应用的话)，来分离NBN多肽。适当的技术在以下实施例中描述。

治疗的受试者

本发明可用于治疗或预防哺乳动物受试者神经病性疼痛，包括触觉异常性疼痛，以及降低与神经病有关的痛觉敏感性丧失，所述受试者患有上述疾病，或有患这些疾病的危险。有发生神经病危险的受试者和有与该神经病有关的痛觉敏感性丧失危险的受试者包括，患糖尿病的受试者，接受化疗的受试者，经历过一些创伤的受试者，摄入了各种毒素或药物的受试者，经历某些维生素缺乏的受试者，感染某些病毒性病原体的受试者，患各种自身免疫性疾病和代谢性疾病的受试者，以及经历某些神经损伤或神经退化的受试者。哺乳动物受试者包括羊，马，狗，猫，猪，兔，豚鼠，大鼠，仓鼠，杀鼠以及小鼠，但最优选是人。

通常，在人受试者中，所述患者或者难以用其他传统疼痛疗法医治，或者受试者对其他这样的能提供满意的疼痛控制的疼痛疗法应答不充分。

一般而言，该方法的特征在于预防性治疗和治疗目的性治疗的方案。在预防性治疗中，将神经胚活素多肽给药有神经病性疼痛危险的受试者或出现疼痛敏感性丧失的受试者；预计这样的受试者是患有早期阶段神经病的受试者。在这种情况下用神经胚活素进行的治疗可用来预防性治疗有危险的患者。

在治疗目的性治疗中，将神经胚活素多肽给药已患神经病性疼痛或已患由神经病所导致的疼痛敏感性丧失的受试者；预计这样的受试者是患晚期神经病的受试者。在这种情况下用神经胚活素进行的治疗用来缓解神经病性疼痛和/或恢复受试者的适当的疼痛敏感性。这样的晚期患者可能已接受过从自我医治开始(如非类固醇抗炎药物，例如，布洛芬)的多种治疗。这样的治疗可以逐步上升到抗抑郁药(例如，三环的抗抑郁药，vanlafaxine，以及选择性的5-羟色胺再摄取抑制剂-具体药物包括阿米替林(amitriptyline)，去甲丙咪嗪(desipramine)，丙咪嗪(imipramine)以及去甲替林(nortriptyline)，或抗惊厥药(例如加巴喷丁，卡马西平(carbamazepine)，拉莫三嗪(lamotrigine)，托吡酯(topiramate)和苯妥英。其他药疗法包括局部止痛药(例如，辣椒辣素(capsaicin)和lidoderm)，抗心律失常药和类鸦片。严重神经病的病例可以进行外科手术。研究提示有50％以下的患者对局部止痛药，抗心律失常药，类鸦片或外科手术有效。

方法以及药物组合物

本发明提供治疗神经病性疼痛，治疗触觉异常性疼痛的方法，以及降低与神经病有关的痛觉敏感性丧失的方法。本发明使用神经胚活素多肽，包括全长神经胚活素多肽或具有生物活性的截短的神经胚活素多肽。另外，本发明还提供包含悬浮，溶解或分散在可药用载体中的全长神经胚活素多肽或截短的神经胚活素多肽的药物组合物。

1.神经病性疼痛的治疗

在一个实施方案中，本发明的特征在于治疗受试者神经病性疼痛的方法，包括给药受试者有效量的神经胚活素多肽。所述神经胚活素多肽可单独给药(单一(mono)-治疗)或作为联合治疗方案的一部分。优选的联合治疗包括给药受试者有效量的选自以下的诱导痛觉丧失的化合物：类鸦片，抗心律失常药，局部的止痛药，局限的止痛药，抗惊厥药，抗抑郁药，皮质类固醇或非类固醇抗炎药(NSAIDS)。

本发明的神经胚活素多肽和核酸(以及包含它们的药物组合物)用于治疗与外周神经病有关的疼痛的治疗。依照本发明可治疗的外周神经病是创伤诱导的神经病，例如，由物理损伤或疾病状态所导致的那些，对大脑的物理损伤，对脊髓的物理损伤，与大脑损伤有关的休克以及与神经退化有关的神经性疾病。

本发明还提供对以下神经病的治疗：化疗诱导的神经病(如由化疗制剂，如紫杉醇或顺铂的传输诱导的神经病)；毒素诱导的神经病，药物诱导的神经病，病原体诱导的(例如病毒诱导的)神经病，维生素缺乏诱导的神经病；自发性神经病和糖尿病性神经病。参见，例如，美国专利5,496,804和5,916,555，它们都引入本文作参考。本发明还可进一步用本发明的神经胚活素核苷酸和多肽治疗单(mono)-神经病，单-多发性神经病(mono-multiplex neuropathies)，以及多发性神经病(poly-neuropathies)，包括轴突和脱髓鞘性神经病。

所述神经病性疼痛可以与多种外周神经病有关，包括：

(a)创伤诱导的神经病，

(b)化疗诱导的神经病，

(c)毒素诱导的神经病(包括但不限于由酒精中毒，维生素B6中毒，六碳化合物中毒，乙胺碘呋酮，氯霉素，双硫醒，异烟肼，金，锂，甲硝唑，米索硝唑，呋喃妥因诱导的神经病)，

(d)药物诱导的神经病，包括治疗性药物诱导的神经病性疼痛(如由抗癌药尤其是选自如下的抗癌药所导致的神经病疼痛：紫杉醇，脱乙酰基紫杉醇，顺铂，噻氨酯哒唑，长春新碱，长春地辛和长春花碱；以及如抗病毒剂，尤其是选自如下的抗病毒剂导致的神经病性疼痛：ddI，DDC，d4T，磷卡萘替，氨苯砜，甲硝唑和异烟肼，

(e)维生素缺乏诱导的神经病(包括但不限于维生素B12缺乏，维生素B6缺乏以及维生素E缺乏)，

(f)自发性神经病，

(g)糖尿病性神经病，

(h)病原体诱导的神经损伤，

(i)炎症诱导的神经损害，

(j)神经退化，

(k)先天性神经病(包括但不限于弗里德里希氏共济失调，家族性淀粉样多发性神经病，唐吉尔病，法布里氏病)，

(l)代谢性疾病(包括但不限于肾功能不全和甲状腺功能低下)，

(m)传染性和病毒性神经病(包括但不限于与麻风病，莱姆病有关的神经病性疼痛，与病毒感染，尤其是与选自如下的病毒感染有关的神经病性疼痛：疱疹病毒(例如，可导致带状疱疹后神经痛的带状疱疹病毒)，人免疫缺陷病毒(HIV)，以及乳头瘤病毒)，

(n)自身免疫性神经病(包括但不限于格-巴综合征，慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病，不明意义的单克隆γ球蛋白病以及多发性神经病)，

(o)三叉神经痛和捕获综合征(包括但不限于Carpel通道)，

(p)其他神经病性疼痛综合征包括创伤后神经痛，假性肢痛，多发性硬化性疼痛，复合型区域性疼痛综合征(包括但不限于交感反射性营养不良，灼痛)，肿瘤相关的疼痛，脉管病性/血管病性神经病以及坐骨神经痛。

神经病性疼痛可表现为异常性疼痛，痛觉过敏性疼痛，热性痛觉过敏或假性肢痛。

2.触觉异常性疼痛的治疗

术语“触觉异常性疼痛”通常是指受试者的一种病症，其中的疼痛是由通常无害的皮肤刺激(例如触觉)所诱导的。本发明的特征在于治疗受试者触觉异常性疼痛的方法。

在一个实施方案中，触觉异常性疼痛是通过单独给药受试者有效量的神经胚活素多肽来治疗的。

在另一实施方案中，触觉异常性疼痛是通过将有效量的神经胚活素多肽和有效量的选自如下诱导痛觉丧失的化合物联合给药受试者来治疗的：类鸦片，抗心律失常药，局部的止痛药，局限的止痛药，抗惊厥药，抗抑郁药，皮质类固醇或NSAIDS。在优选实施方案中，所述诱导痛觉丧失的化合物是抗惊厥药。在另一实施方案中，所述诱导痛觉丧失的化合物是加巴喷丁(1-(氨甲基)环己烷乙酸)或pregabalin(S-(+)-4-氨基-3-(2-甲基丙基)丁酸)。

3.降低疼痛敏感性丧失的治疗

在另一实施方案中，本发明的特征在于降低患神经病的受试者痛觉敏感性丧失的方法。在优选实施方案中，所述神经病是糖尿病性神经病。在优选实施方案中，所述痛觉敏感性丧失是热的痛觉敏感性丧失。本发明既包括预防性治疗又包括治疗目的性治疗。

在预防性治疗中，将神经胚活素多肽给药有神经病性疼痛危险的受试者或出现疼痛敏感性丧失的受试者；预计这样的受试者是患有早期阶段神经病的受试者。在这种情况下用神经胚活素进行的治疗可用来预防性治疗有危险的患者。

在治疗目的性治疗中，将神经胚活素多肽给药已患神经病性疼痛或已患由神经病所导致的疼痛敏感性丧失的受试者；预计这样的受试者是患晚期神经病的受试者。在这种情况下用神经胚活素进行的治疗用来缓解神经病性疼痛和/或恢复受试者的适当的疼痛敏感性。

4.病毒感染与和病毒有关的神经病的治疗

对传染性和病毒性神经病的预防性治疗也包括在本发明中。预防性治疗是指在确定病毒感染后神经病性疼痛发作前进行的治疗。在治疗期间，给药NBN多肽以预防神经病性疼痛的出现，所述神经病性疼痛包括但不限于与麻风病，莱姆病有关的神经病性疼痛，与病毒感染，尤其与选自如下的病毒感染有关的神经病性疼痛：疱疹病毒(尤其是带状疱疹病毒，其引起带状疱疹后神经痛)，人免疫缺陷病毒(HIV)，以及乳头瘤病毒。在另一实施方案中，给药NBN多肽以降低神经病性疼痛的严重性，如果神经病性疼痛出现的话。

急性病毒感染的症状通常包括皮疹的出现。其他的症状包括，例如，在身体的患病区域出现持续的疼痛，而这是带状疱疹(单纯性的)感染的常见主诉。带状疱疹后神经痛可持续一个月或更长时间，且可在任何皮疹样症状消失以后几个月出现。带状疱疹后神经痛可非常严重且持续很长时间，而且可能对治疗是非常抵抗的。

5.糖尿病性神经病的治疗

糖尿病有关的神经病的预防性治疗也包括在本发明中。糖尿病性神经病的预防性治疗可以在确定糖尿病的初步诊断或糖尿病相关症状后，神经病性疼痛发作前开始。糖尿病性神经病的预防性治疗也可在确定受试者有发展成糖尿病或糖尿病相关症状的危险时开始。在治疗期间，给药NBN多肽以预防神经病性疼痛的出现，或降低神经病性疼痛的严重性，如果出现神经病性疼痛的话。

图6A和图6B的结果与需要此治疗的人患者的糖尿病性神经病的治疗相关。对热痛觉减退的预防和对热痛觉过敏的预防和逆转，如实施例6所述，也包括在本发明中。

6.剂量

前述方法涉及给药，优选全身给药受试者包含神经胚活素多肽的制剂，给药剂量在每剂每公斤受试者体重1μg-30,000μg；优选所述剂量是每剂每公斤受试者体重10μg-10,000μg；最优选所述剂量是每剂每公斤受试者体重25μg-3,000μg。

用于治疗或预防触觉异常性疼痛的各种剂量方案都包括在本发明中。在一个实施方案中，给药受试者包含神经胚活素多肽的制剂的方法包括以每剂每公斤受试者体重1μg-30,000μg的剂量给药NBN。在另一实施方案中，所述剂量是每剂每公斤受试者体重10μg-30,000μg。在另一实施方案中，所述剂量是每剂每公斤受试者体重10μg-10,000μg。在不同的实施方案中，所述剂量是每剂每公斤受试者体重25μg-10,000μg。在另一实施方案中，所述剂量是每剂每公斤受试者体重25μg-3,000μg。在最优选实施方案中，所述剂量是每剂每公斤受试者体重50μg-3,000μg。

同样，调节痛觉敏感性丧失的治疗的各种剂量方案也包括在本发明中。给药受试者包含神经胚活素多肽的制剂的方法包括，以每剂每公斤受试者体重1μg-30,000μg的剂量给药NBN；优选所述剂量是每剂每公斤受试者体重10μg-10,000μg；最优选所述剂量是每剂每公斤受试者体重25μg-3,000μg。

7.传输

用于前述方法中的神经胚活素多肽可由任何合适的传输系统给药，所述传输系统优选选自：静脉内传输，肌肉内传输，肺内传输，皮下传输或腹膜内传输，最优选由肌肉内传输，静脉内传输或皮下传输给药。前述方法中所用的神经胚活素多肽也可以通过鞘内传输给药。

8.药物配制

本发明也提供新的包含治疗有效量的神经胚活素多肽的药用组合物，所述神经胚活素多肽悬浮，溶解或分散在可药用载体中。

为在治疗中应用，本发明的多肽可以任何方便的形式给药。在优选实施方案中，本发明的多肽与一种或多种佐剂，赋形剂，载体和/或溶剂一起掺入到药物组合物中，且所述药物组合物用本领域已知的常规方法为技术人员所制备。配制和给药技术方面的详细描述可参见最新版的REMINGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCES(Maack Publishing Co.，Easton，PA)。可接受的溶剂，载体和赋形剂通常不对接受者的内环境，尤其是对电解质平衡产生不良的影响。可接受的载体可包括生物相容性的，惰性的或生物可吸收的盐，缓冲剂，寡-或多糖，多聚体，粘度改善剂，防腐剂等等。一例证性载体包含标准的生理盐水(0.15M NaCI，pH7.0至7.4)。另一例证性载体包含50mM磷酸钠，100mM氯化钠。

9.药疗方案

给药本发明神经胚活素多肽的频率属于医生的技术和临床判断范围内。通常给药方案通过临床试验来确定，所述临床试验可确定最佳的给药参数。然而，从业者可依照受试者的年龄，健康状况，体重，性别和医疗状况改变这种给药方案。给药的频率也可视神经病的急性和慢性治疗而不同。另外，给药的频率也可根据该治疗是治疗目的性还是预防性而不同。

实施例

实施例1：神经胚活素多肽的表达

A.在大肠杆菌中的表达

为在细菌中表达和纯化，使编码大鼠神经胚活素的质粒在大肠杆菌中作为有His标签的融合蛋白表达，该蛋白在紧邻成熟的113个氨基酸的NBN序列起始处有肠激酶切割位点。大肠杆菌细胞在500L的发酵罐中生长，并提供冷冻的细胞团。在Manton GaulinPress中裂解大肠杆菌细胞，并从不溶性的洗涤后的沉淀部分回收大鼠的NBN。

用盐酸胍从沉淀中提取NBN，进行重折叠，并用肠激酶除去His-标签。为进行进一步纯化，将产物在Ni NTA琼脂(Qiagen)上层析，再在BakerbondWP CBX阳离子交换树脂上层析。

将所得产物进行进一步定性，包括以下的分析：SDS-PAGE，大小排阻层析(SEC)，反相HPLC，基质辅助的激光解吸/离子化质谱(MALD/IMS)，肽图，在KIRA ELISA中进行活性评估以及内毒素含量的确定。用SDS-PAGE和SEC检测的NBN产物的纯度在95％以上。在非还原条件下迁移的NBN产物是二聚体，这与其所预计的结构相一致。该物质中的内毒素含量常规少于1EU/mg。在KIRA ELISA中的NBN的比活性大约为10nM。所述产物用PBS pH6.5配制成1mg/ml。该物质也可储存在-70℃，作为冷冻液体提供。

类似的表达系统也可构建用于人NBN。从这些构建体，已在大肠杆菌中表达了人NBN。

B.哺乳动物细胞中的表达

质粒pJC070.14的构建为在中国仓鼠卵巢细胞中表达神经胚活素cDNA，将编码人神经胚活素原前形式的cDNA片段插入到哺乳动物表达载体pEAG347中，来产生质粒pJC070.14。pEAG347包含串联的SV40早期启动子和腺病毒的主要晚期启动子(来源于质粒pAD2β；Norton and Coffin，Mol.Cell.Biol.5：281(1985))，唯一的NotI克隆位点，其后是SV40晚期转录终止和PolyA信号(来源于质粒pCMVβ；MacGregor and Caskey，Nucl.Acids.Res.17：2365(1989))。另外，pEAG347包含pUC19来源的质粒骨架和pSV2dhfr来源的dhfr，用于进行MTX选择和在转化的CHO细胞中扩增。

质粒pJC070.14以二步产生。首先，编码人神经胚活素原前形式的片段，用寡核苷酸KD2-824 5′AAGGAAAAA GCGGCCGCCA TGGAACTTGGACTTGGAGG3′(SEQ ID NO：9)，KD2-825 5′TTTTTTCCTT GGCGGCCGCTCAGCCCAGGC AGCCGCAGG3′(SEQ ID NO：10)和PFU聚合酶，通过聚合酶链反应分离自质粒pUbilZ-NBN。所述片段克隆到pPCR-Script Amp SK(+)的Srf1位点，以产生质粒pJC069。第二步，在质粒pJC069上进行部分Not-1消化，以产生685bp的片段(包含神经胚活素基因)，将该片段克隆到质粒pEAG347的Not-1位点，以产生质粒pJC070.14。在质粒pJC070.14中的神经胚活素基因的转录受控于腺病毒主要晚期启动子。

表达神经胚活素的CHO细胞系的产生200μg的pJC070.14通过限制性内切酶Mlu-1的消化被线性化。用苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)提取DNA，并用乙醇沉淀。将线性化的DNA重悬在20mM Hepes pH7.05，137mMNaCI，5mM KCI，0.7mM Na₂HPO₄，6mM葡萄糖(HEBS)中，并通过电穿孔(280V和960μF)导入到～4E7 CHO dukx B1(dhfr-)细胞(p23)中。电穿孔后，在补充了10％胎牛血清(FBS)的α+改良Eagle′s培养基(MEM)中继续培养两天。然后使所述细胞受胰蛋白酶作用，并重铺板于100mm的皿(100,000细胞/板)，在补充了10％经透析的FBS的α-MEM(没有核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸)中，培养5天。之后将所述细胞以100,000细胞/100mm板的密度分开，并在200nM氨甲喋呤中进行选择。挑出抗性克隆并扩充至6孔的培养板中；来自各克隆的条件培养基用以下描述的神经胚活素的特异性检测来筛选。将表达最高水平神经胚活素的十二个克隆扩充至T162瓶中，然后进行再测定。这些CHO细胞系在25至50ng/ml/天的范围内产生神经胚活素。

神经胚活素的三重复合体检测CHO细胞系培养基的上清液中神经胚活素的存在用Sanicola等(Proc Natl Acad Sci USA 94：6238(1997)描述的三重复合体检测法(ternary complex assay)修改后的形式进行评估。

类似的哺乳动物表达构建体已经制备，且对于人NBN和大鼠NBN的类似的研究已经进行。已经在大鼠体内检测NBN的活性。大鼠的研究几乎都是用大鼠NBN进行的。

实施例2：全长神经胚活素在神经病性疼痛的神经结扎动物模型中的效力-对神经病性疼痛的预防

神经胚活素对触觉异常性疼痛和人痛觉过敏的预防作用在ChungL5/L6脊神经结扎(″SNL″)模型(Kim and Chung(1992)Pain 50：355-363)中被研究。将Sprague-Dawley雄性大鼠(250-300g)分成四组。一组大鼠(n＝7)接受模拟(sham)手术，并皮下注射给药载体。第二组大鼠(n＝7)接受模拟手术，并皮下注射给药大鼠神经胚活素(1mg/kg)。第三组大鼠(n＝7)接受脊神经结扎，并皮下注射给药载体。第四组大鼠(n＝7)接受脊神经结扎，并皮下注射给药大鼠神经胚活素(1mg/kg)。所述载体在pH 6.5由5mM磷酸盐和150mM氯化钠组成。在脊神经结扎或模拟手术前30分钟，然后在结扎或手术后(SNL后)2，4，7，9，11和14天注射神经胚活素或载体。Von Frey(Chaplan等.(1994)，J.Neurosci.Meth.53：55-63)和Hargreave′s(Hargreaves等.(1988)，Pain 32：77-88)行为测试分别用来监测触觉和热应答。在脊神经结扎或模拟手术前监测对疼痛的应答以确立基线应答，然后手术后二周每天监测。

所得结果以均值的平均值±标准误差显示在图1和2中。皮下给药神经胚活素(由图1和图2中向下的箭头表示)可导致脊神经结扎大鼠的两类(触觉性的见图1，热性的见图2)神经病性疼痛近乎完全的正常化。在进行模拟手术的大鼠中，皮下给药神经胚活素没有明显改变触觉敏感性(图1)或热敏感性(图2)。在脊神经结扎大鼠中，神经胚活素对热敏感性的作用在开始给药神经胚活素后3天首次(first)变得明显，但对触觉异常性疼痛的作用首次变得明显的时间会稍稍推后，在开始给药神经胚活素后4-5天。在开始给药神经胚活素多肽后约7-8天神经胚活素对热敏感性的作用达到平台期，而在开始给药神经胚活素多肽后约10-11天神经胚活素对热敏感性的作用达到平台期。在给药之间的2-3天的间隙期间，神经胚活素的作用不减弱。实际上，在第4天和第7天给药神经胚活素之间两种疼痛行为都有了实质的校正，如在给药第5天和第6天所检测到的那样。在第11天给药神经胚活素后，对两种疼痛行为的尚存的最大校正保持恒定，这提示神经胚活素对神经病性疼痛的校正作用可持续至少3天。

实施例3：用截短的神经胚活素多肽治疗神经病

包含成熟大鼠神经胚活素羧基末端102个氨基酸的多肽在治疗触觉异常性疼痛，热痛觉过敏，两种外周神经病性疾病方面的预防作用，用ChungL5/L6脊神经结扎(″SNL″)模型来说明。

将Sprague-Daley雄性大鼠(约250-300克)分成四组。一组大鼠(n＝6)接受模拟手术并皮下注射给药载体。第二组大鼠(n＝6)接受模拟手术，并皮下注射给药截短的神经胚活素(1mg/kg)。第三组大鼠(n＝6)接受脊神经结扎，并通过皮下结扎给药载体。第四组大鼠(n＝6)接受脊神经结扎，并皮下注射给药截短的神经胚活素(1mg/kg)。所述载体在pH6.5包括5mM磷酸盐和150mM氯化钠。截短的神经胚活素或载体在0，2，4，7，9，11和14天给药。在0天，在脊神经结扎或模拟手术前30分钟给药截短的神经胚活素。用Chaplan等(1994)，J.Neurosci.Meth.53：55-63 and Hargreaves等.(1988)，Pain 32：77-88描述的行为测试法测定疼痛应答。这些测试分别监测触觉应答和热应答。在脊神经结扎或模拟手术前监测疼痛应答以确立基线应答。手术后二个星期每天监测疼痛应答。

预计皮下给药截短的神经胚活素会校正脊神经结扎大鼠的两类精神病性疼痛。在模拟手术大鼠中，预计皮下给药截短的神经胚活素不会明显改变触觉或热敏感性。预计神经胚活素对热敏感性的作用会在给药神经胚活素后约3天变得明显，而预计对触觉异常性疼痛的作用首次变得明显会稍晚些。

实施例4：神经胚活素在神经病性疼痛的神经结扎动物模型中的效力-神经病性疼痛的逆转

神经胚活素对触觉异常性疼痛和热痛觉过敏的逆转效果用ChungL5/L6脊神经结扎(″SNL″)模型研究。将Sprague-Dawley雄性大鼠(270-275g)分成四组。一组大鼠(n＝8)接受模拟手术，并皮下注射给药载体。第二组大鼠(n＝8)接受模拟手术，并皮下注射给药大鼠神经胚活素(1mg/kg)。第三组大鼠(n＝8)接受脊神经结扎，并皮下注射给药载体。第四组大鼠(n＝8)接受脊神经结扎，并皮下注射给药大鼠神经胚活素(1mg/kg)。所述载体在pH6.5由5mM磷酸盐和150mM氯化钠组成。Von Frey(Chaplan等.(1994)，J.Neurosci.Meth.53：55-63)和Hargreave′s(Hargreaves等.(1988)，Pain 32：77-88)行为测试分别用来监测触觉和热应答。在脊神经结扎或模拟手术前监测对这些疼痛的应答以确立基线应答，然后手术后二周每天监测。在行为测试前60分钟注射神经胚活素或载体，在结扎或手术后(SNL后)3，5，7，10，12和14天注射神经胚活素或载体。

所得结果以均值的平均值±标准误显示在图3和4中。正如所预计的那样，两类神经病性疼痛行为(触觉异常性疼痛示于图3，热痛觉过敏示于图4)在第3天完全出现。皮下给药神经胚活素(由图3和图4中向下的箭头表示)可导致脊神经结扎大鼠两类神经病性疼痛(触觉性的见图3，热性的见图4)几乎完全的逆转，这样触觉和热应答得到了校正。在进行模拟手术的大鼠中，皮下给药神经胚活素没有明显改变触觉敏感性(图3)或热敏感性(图4)。在脊神经结扎大鼠中，神经胚活素对热敏感性和触觉异常性疼痛的作用在给药神经胚活素后2-3天首次变得明显。在开始给药神经胚活素多肽后约7-8天神经胚活素对热敏感性和触觉异常性疼痛的作用达到平台期。在给药之间的2-3天的间隙期间，神经胚活素的作用不减弱。实际上，在第3，第5，第7和第10天给药神经胚活素之间两种疼痛行为都有了实质的校正。

实施例5：在神经病性疼痛的链脲霉素动物模型中神经胚活素的效力-预防疼痛敏感性的丧失

神经胚活素对热敏感性丧失(热痛觉减退)的预防作用在糖尿病性神经病的链脲霉素(″STZ″)模型进行研究。将Sprague-Dawley雌性大鼠(250-275g)分为四组，每组包括10个动物。一组大鼠不接受STZ；这些大鼠皮下注射载体。三组大鼠接受一次STZ注射(无菌盐水中含50mg/kg)，随后用分光光度检测法检测血样品，以确定高血糖。3组高血糖大鼠中，1组皮下注射载体，第二组皮下注射大鼠神经胚活素(0.1mg/kg)，第三组大鼠皮下注射大鼠神经胚活素(1mg/kg)。所述载体在pH6.5由5mM磷酸盐和150mM氯化钠组成。每周给药神经胚活素或载体3次(时间表星期一，星期三，星期五)，给药8周，在STZ诱导了高血糖时开始给药。8周后如Calcutt等(2000)，Anesthesiology 93：1271-1278中所述，评估热应答潜伏期。简言之，将发光的热源作用于爪的底部表面，使温度在20秒钟内由30℃升高到38.5℃，测定开始加热到爪回缩之间的潜伏时间来评估热应答潜伏期。爪回缩潜伏期的延长表示热敏感性的损失(热痛觉减退)。

所得结果以均值的平均值±标准误显示在图5中。正如所预料的那样，在给予STZ后8周，在载体处理的STZ大鼠中爪回缩潜伏期与正常大鼠相比延长，这表示STZ注射已诱导了热痛觉减退。给药神经胚活素可预防高血糖(STZ)大鼠中热应答潜伏期的延长。每周给药3次，给药8周后，神经胚活素的两种剂量(1mg/kg和0.1mg/kg)都几乎完全校正了热敏感性。这些结果表明神经胚活素可预防热痛觉减退，糖尿病性神经病的STZ大鼠模型中发生的热敏感性的丧失。

实施例6：神经胚活素在链脲霉素大鼠中，对热痛觉减退的预防，以及对热痛觉过敏的预防和逆转

如实施例1在大肠杆菌中所述的制备大鼠NBN113。神经胚活素对热敏感性丧失(热痛觉减退)的预防作用，以及神经胚活素对热敏感性增强(热痛觉过敏)的预防和逆转，如实施例5所述，在糖尿病性神经病的链脲霉素″STZ″)大鼠模型进行研究。实施例5描述的剂量研究被确认并扩展。所得结果示于突6A和6B中。

图6A和图6B中的结果以均值的平均值±标准误表示。正如所预料的那样，在给予STZ后4周，在载体处理的STZ大鼠中爪回缩潜伏期与正常大鼠相比缩短，这表示STZ注射已诱导了热痛觉过敏。如图6A所示，每周给药3次，给药4周后，皮下注射所有剂量(0.03mg/kg和0.1mg/kg)的神经胚活素都对STZ大鼠中热痛觉过敏起到了预防作用。如图6B所示，每周给药3次，给药8周后，皮下注射所有剂量(0.03mg/kg和0.1mg/kg)的神经胚活素都对STZ大鼠中热痛觉减退起到了预防作用。另外，如图6B所示，在8周处理(veh；0.1mg/kgNBN)研究的第二个4周期间，皮下给药神经胚活素(0.1mg/kg)不仅逆转了STZ处理后4周出现的热痛觉过敏，而且还预防了在8周在STZ大鼠中热痛觉减退的发生。这些结果表明神经胚活素可预防和逆转糖尿病性神经病的STZ大鼠模型中的热痛觉过敏，而且还可预防糖尿病性神经病的STZ大鼠模型中发生的热敏感性的丧失(热痛觉减退)。

实施例7：神经胚活素在神经病性疼痛的神经结扎动物模型中的效力-对神经病性疼痛的逆转是剂量依赖性的。

如实施例1所述在大肠杆菌中制备大鼠NBN113。NBN113对触觉异常性疼痛和热痛觉过敏的剂量依赖性逆转的分析，在用Chung L5/L6脊神经结扎(″SNL″)动物模型的大鼠进行，如实施例4所述，NBN的剂量为0.03mg/kg，0.1mg/kg，0.6mg/kg和2mg/kg。显示在图3和4中的试验结果被证实并扩展。结果显示在图7和图8中。

图7和图8中的结果以均值的平均值±标准误表示。BL表示基线应答。两类神经病性疼痛行为(触觉异常性疼痛在图7显示，热痛觉过敏在图8显示)如预计的那样在第2天完全显现。每周皮下给药2mg/kg神经胚活素(NBN)3次(如箭头所示)可导致脊神经结扎大鼠中两种类型神经病性疼痛的几乎完全的逆转(触觉异常性疼痛在图7显示，热痛觉过敏在图8显示)，触觉和热应答得到了校正。如图7所示，神经胚活素对脊神经结扎诱导的触觉异常性疼痛的逆转是剂量依赖性的。神经胚活素(NBN)的剂量在0.1mg/kg s.c.或0.6mg/kg s.c.时，每周给药3次，9天(以及11天)后，触觉异常性疼痛被部分逆转，而NBN的剂量在2mg/kg s.c.时，每周3次给药，7天(以及9和11天)后，触觉异常性疼痛被明显逆转，每周3次给药，9和11天后，触觉异常性疼痛被几乎完全逆转。而且，随着将神经胚活素的皮下给药剂量从0.1mg/kg增加至0.6mg/kg，增加至2mg/kg，对脊神经结扎诱导的触觉异常性疼痛的平均逆转在SNL后14天会更高。神经胚活素(NBN)在0.03mg/kg s.c.时，在每周3次给药的11天期间，没有明显逆转脊神经结扎诱导的触觉异常性疼痛。

如图8所示，神经胚活素(NBN)对脊神经结扎(SNL)诱导的热痛觉过敏的逆转也是剂量依赖性的。神经胚活素的剂量在0.1mg/kg时，每周给药3次，9天(以及11天)后，热痛觉过敏被明显逆转，NBN的剂量在0.6mg/kg时，每周3次给药，7天(以及9和11天)后，热痛觉过敏被明显逆转，NBN的剂量在2mg/kg时，每周3次给药，4天(以及7，9和11天)后，热痛觉过敏被明显逆转。而且，随着将神经胚活素的皮下给药剂量从0.1mg/kg增加至0.6mg/kg，增加至2mg/kg，对脊神经结扎诱导的热痛觉过敏的平均逆转在SNL后14天会更高。NBN在0.03mg/kg s.c.时，在每周3次给药的11天期间，没有明显逆转脊神经结扎诱导的热痛觉过敏。

等同情况

尽管本发明详细地公开了具体的实施方案，但这只是为了描述的目的而进行的举例，不构成对所附权利要求范围的限制。具体地，在不背离本发明的精神和不超出本发明所定义的权利要求范围内，可以对本发明作各种替代，变更以及修改。

序列表

<110>比奥根公司(Biogen，Inc.)

Sah，Dinah Wen-Yee

<120>神经胚活素多肽的治疗作用

<130>00689-507(A118)utility

<140>Filed Herewith

<141>2002-02-28

<150>USSN 06/287,554

<151>2001-03-28

<160>27

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>861

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<220>

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<220>

<221>5′UTR

<222>(1)..(57)

<220>

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<220>

<221>sig_peptide

<222>(58)..(174)

<220>

<221>mat_peptide

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<220>

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<220>

<221>mat_peptide

<222>(379)..(717)

<220>

<221>misc_structure

<222>(661)..(663)

<223>CARBOHYD：在Asn122处的糖基化天冬酰胺

<220>

<221>misc_structure

<222>(424)..(621)

<223>DISULFID：Gly43-Gly108二硫键

<220>

<221>misc_structure

<222>(505)..(705)

<223>DISULFID：Gly70-Gly136二硫键

<220>

<221>misc_structure

<222>(517)..(711)

<223>DISULFID：Gly74-Gly138二硫键

<220>

<221>misc_structure

<222>(616)..(618)

<223>DISULFID：Gly107-Gly107链内二硫键

<400>1

aggagggtgg gggaacagct caacaatggc tgatgggcgc tcctggtgtt gatagag 57

atg gaa ctt gga ctt gga ggc ctc tcc acg ctg tcc cac tgc ccc tgg 105

Met Glu Leu Gly Leu Gly Gly Leu Ser Thr Leu Ser His Cys Pro Trp

-80 -75 -70 -65

cct agg cgg cag cct gcc ctg tgg ccc acc ctg gcc gct ctg gct ctg 153

Pro Arg Arg Gln Pro Ala Leu Trp Pro Thr Leu Ala Ala Leu Ala Leu

-60 -55 -50

ctg agc agc gtc gca gag gcc tcc ctg ggc tcc gcg ccc cgc agc cct 201

Leu Ser Ser Val Ala Glu Ala Ser Leu Gly Ser Ala Pro Arg Ser Pro

-45 -40 -35

gcc ccc cgc gaa ggc ccc ccg cct gtc ctg gcg tcc ccc gcc ggc cac 249

Ala Pro Arg Glu Gly Pro Pro Pro Val Leu Ala Ser Pro Ala Gly His

-30 -25 -20

ctg ccg ggg gga cgc acg gcc cgc tgg tgc agt gga aga gcc cgg cgg 297

Leu Pro Gly Gly Arg Thr Ala Arg Trp Cys Ser Gly Arg Ala Arg Arg

-15 -10 -5 -1

ccg ccg ccg cag cct tct cgg ccc gcg ccc ccg ccg cct gca ccc cca 345

Pro Pro Pro Gln Pro Ser Arg Pro Ala Pro Pro Pro Pro Ala Pro Pro

1 5 10 15

tct gct ctt ccc cgc ggg ggc cgc gcg gcg cgg gct ggg ggc ccg ggc 393

Ser Ala Leu Pro Arg Gly Gly Arg Ala Ala Arg Ala Gly Gly Pro Gly

20 25 30

agc cgc gct cgg gca gcg ggg gcg cgg ggc tgc cgc ctg cgc tcg cag 441

Ser Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln

35 40 45

ctg gtg ccg gtg cgc gcg ctc ggc ctg ggc cac cgc tcc gac gag ctg 489

Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu

50 55 60

gtg cgt ttc cgc ttc tgc agc ggc tcc tgc cgc cgc gcg cgc tct cca 537

Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro

65 70 75 80

cac gac ctc agc ctg gcc agc cta ctg ggc gcc ggg gcc ctg cga ccg 585

His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro

85 90 95

ccc ccg ggc tcc cgg ccc gtc agc cag ccc tgc tgc cga ccc acg cgc 633

Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg

100 105 110

tac gaa gcg gtc tcc ttc atg gac gtc aac agc acc tgg aga acc gtg 681

Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val

115 120 125

gac cgc ctc tcc gcc acc gcc tgc ggc tgc ctg ggc tgagggctcg 727

Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly

130 135 140

ctccagggct ttgcagactg gacccttacc ggtggctctt cctgcctggg accctcccgc 787

agagtcccac tagccagcgg cctcagccag ggacgaaggc ctcaaagctg agaggcccct 847

accggtgggt gatg 861

<210>2

<211>220

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>2

Met Glu Leu Gly Leu Gly Gly Leu Ser Thr Leu Ser His Cys Pro Trp

-80 -75 -70 -65

Pro Arg Arg Gln Pro Ala Leu Trp Pro Thr Leu Ala Ala Leu Ala Leu

-60 -55 -50

Leu Ser Ser Val Ala Glu Ala Ser Leu Gly Ser Ala Pro Arg Ser Pro

-45 -40 -35

Ala Pro Arg Glu Gly Pro Pro Pro Val Leu Ala Ser Pro Ala Gly His

-30 -25 -20

Leu Pro Gly Gly Arg Thr Ala Arg Trp Cys Ser Gly Arg Ala Arg Arg

-1S -10 -5 -1

Pro Pro Pro Gln Pro Ser Arg Pro Ala Pro Pro Pro Pro Ala Pro Pro

1 5 10 15

Ser Ala Leu Pro Arg Gly Gly Arg Ala Ala Arg Ala Gly Gly Pro Gly

20 25 30

Ser Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln

35 40 45

Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu

50 55 60

Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro

65 70 75 80

His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro

85 90 95

Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg

100 105 110

Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val

115 120 125

Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly

130 135 140

<210>3

<211>2136

<212>DNA

<213>小鼠种属(Murinae gen.sp.)

<220>

<221>CDS

<222>(975)..(1646)

<220>

<221>5′UTR

<222>(1)..(974)

<220>

<221>3′UTR

<222>(1647)..(2136)

<220>

<221>sig_peptide

<222>(975)..(1091)

<220>

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<220>

<221>mat_peptide

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<220>

<221>mat_peptide

<222>(1299)..(1646)

<400>3

gcggccgcga attcggcacg agggcgtctc gctgcagccc gcgatctcta ctctgcctcc 60

tggggtcttc tccaaatgtc tagcccccac ctagagggac ctagcctagc cagcggggac 120

cggatccgga gggtggagcg gccaggtgag ccctgaaagg tggggcgggg cgggggcgct 180

ctgggcccca ccccgggatc tggtgacgcc ggggctggaa tttgacaccg gacggcggcg 240

ggcaggaggc tgctgaggga tggagttggg ctcggccccc agatgcggcc cgcgggctct 300

gccagcaaca agtccctcgg gccccagccc tcgctgcgac tggggcttgg agccctgcac 360

ccaagggcac agaccggctg ccaaggcccc acttttaact aaaagaggcg ctgccaggtg 420

cacaactctg ggcatgatcc acttgagctt cgggggaaag cccagcactg gtcccaggag 480

aggcgcctag aaggacacgg accaggaccc ctttggtatg gagtgaacgc tgagcatgga 540

gtggaaggaa ctcaagttac tactttctcc aaccaccctg gtaccttcag ccctgaagta 600

cagagcagaa gggtcttaga agacaggacc acagctgtgt gagtctcccc cctgaggcct 660

tagacgatct ctgagctcag ctgagctttg tttgcccatc tggagaagtg agccattgat 720

tgaccttgtg gcatcgcgaa ggaacaggtc ctgccaagca cctaacacag agagcaaggt 780

tctccatcgc agctaccgct gctgagttga ctctagctac tccaacctcc tgggtcgctt 840

cgagagactg gagtggaagg aggaataccc caaaggataa ctaactcatc tttcagtttg 900

caagctgccg caggaagagg gtggggaaac gggtccacga aggcttctga tgggagcttc 960

tggagccgaa agct atg gaa ctg gga ctt gca gag cct act gca ttg tcc 1010

Met Glu Leu Gly Leu Ala Glu Pro Thr Ala Leu Ser

-80 -75 -70

cac tgc ctc cgg cct agg tgg cag tca gcc tgg tgg cca acc cta gct 1058

His Cys Leu Arg Pro Arg Trp Gln Ser Ala Trp Trp Pro Thr Leu Ala

-65 -60 -55

gtt cta gcc ctg ctg agc tgc gtc aca gaa gct tcc ctg gac cca atg 1106

Val Leu Ala Leu Leu Ser Cys Val Thr Glu Ala Ser Leu Asp Pro Met

-50 -45 -40

tcc cgc agc ccc gcc gct cgc gac ggt ccc tca ccg gtc ttg gcg ccc 1154

Ser Arg Ser Pro Ala Ala Arg Asp Gly Pro Ser Pro Val Leu Ala Pro

-35 -30 -25

ccc acg gac cac ctg cct ggg gga cac act gcg cat ttg tgc agc gaa 1202

Pro Thr Asp His Leu Pro Gly Gly His Thr Ala His Leu Cys Ser Glu

-20 -15 -10 -5

aga acc ctg cga ccc ccg cct cag tct cct cag ccc gca ccc ccg ccg 1250

Arg Thr Leu Arg Pro Pro Pro Gln Ser Pro Gln Pro Ala Pro Pro Pro

-1 1 5 10

cct ggt ccc gcg ctc cag tct cct ccc gct gcg ctc cgc ggg gca cgc 1298

Pro Gly Pro Ala Leu Gln Ser Pro Pro Ala Ala Leu Arg Gly Ala Arg

15 20 25

gcg gcg cgt gca gga acc cgg agc agc cgc gca cgg acc aca gat gcg 1346

Ala Ala Arg Ala Gly Thr Arg Ser Ser Arg Ala Arg Thr Thr Asp Ala

30 35 40

cgc ggc tgc cgc ctg cgc tcg cag ctg gtg ccg gtg agc gcg ctc ggc 1394

Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Ser Ala Leu Gly

45 50 55 60

cta ggc cac agc tcc gac gag ctg ata cgt ttc cgc ttc tgc agc ggc 1442

Leu Gly His Ser Ser Asp Glu Leu Ile Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly

65 70 75

tcg tgc cgc cga gca cgc tcc cag cac gat ctc agt ctg gcc agc cta 1490

Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Gln His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu

80 85 90

ctg ggc gct ggg gcc cta cgg tcg cct ccc ggg tcc cgg ccg atc agc 1538

Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Ser Pro Pro Gly Ser Arg Pro Ile Ser

95 100 105

cag ccc tgc tgc cgg ccc act cgc tat gag gcc gtc tcc ttc atg gac 1586

Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp

110 115 120

gtg aac agc acc tgg agg acc gtg gac cac ctc tcc gcc act gcc tgc 1634

Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp His Leu Ser Ala Thr Ala Cys

125 130 135 140

ggc tgt ctg ggc tgaggatgat ctatctccaa gcctttgcac actagaccca 1686

Gly Cys Leu Gly

tgtgttgccc tacctggaac agctccaccg ggcctcacta accaggagcc tcaactcagc 1746

aggatatgga ggctgcagag ctcaggcccc aggccggtga gtgacagacg tcgtcggcat 1806

gacagacaga gtgaaagatg tcggaaccac tgaccaacag tcccaagttg ttcatggatc 1866

ccagctctac agacaggaga aacctcagct aaagagaact cctctgggag aatccagaaa 1926

tggccctctg tcctggggaa tgaattttga agagatatat atacatatat acattgtagt 1986

cgcgttgctg gaccagcctg tgctgaaacc agtcccgtgt tcacttgtgg aagccgaagc 2046

cctatttatt atttctaaat tatttattta ctttgaaaaa aaacggccaa gtcggcctcc 2106

ctttagtgag ggttaatttg tgatcccggg 2136

<210>4

<211>224

<212>PRT

<213>小鼠种属(Murinae gen.sp.)

<400>4

Met Glu Leu Gly Leu Ala Glu Pro Thr Ala Leu Ser His Cys Leu Arg

-80 -75 -70 -65

Pro Arg Trp Gln Ser Ala Trp Trp Pro Thr Leu Ala Val Leu Ala Leu

-60 -55 -50

Leu Ser Cys Val Thr Glu Ala Ser Leu Asp Pro Met Ser Arg Ser Pro

-45 -40 -35

Ala Ala Arg Asp Gly Pro Ser Pro Val Leu Ala Pro Pro Thr Asp His

-30 -25 -20

Leu Pro Gly Gly His Thr Ala His Leu Cys Ser Glu Arg Thr Leu Arg

-15 -10 -5 -1

Pro Pro Pro Gln Ser Pro Gln Pro Ala Pro Pro Pro Pro Gly Pro Ala

1 5 10 15

Leu Gln Ser Pro Pro Ala Ala Leu Arg Gly Ala Arg Ala Ala Arg Ala

20 25 30

Gly Thr Arg Ser Ser Arg Ala Arg Thr Thr Asp Ala Arg Gly Cys Arg

35 40 45

Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Ser Ala Leu Gly Leu Gly His Ser

50 55 60

Ser Asp Glu Leu Ile Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg

65 70 75 80

Ala Arg Ser Gln His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly

85 90 95

Ala Leu Arg Ser Pro Pro Gly Ser Arg Pro Ile Ser Gln Pro Cys Cys

100 105 110

Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr

115 120 125

Trp Arg Thr Val Asp His Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly

130 135 140

<210>5

<211>224

<212>PRT

<213>大鼠(Rattus sp.)

<220>

<221>SIGNAL

<222>(1)..(39)

<220>

<221>PROPEP

<222>(40)..(80)

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(81)..(224)

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(109)..(224)

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(112)..(224)

<220>

<221>CARBOHYD

<222>(206)

<220>

<221>DISULFID

<222>(127)..(192)

<220>

<221>DISULFID

<222>(154)..(220)

<220>

<221>DISULFID

<222>(158)..(222)

<220>

<221>DISULFID

<222>(191)

<223>链内二硫键

<400>5

Met Glu Leu Gly Leu Gly Glu Pro Thr Ala Leu Ser His Cys Leu Arg

1 5 10 15

Pro Arg Trp Gln Pro Ala Leu Trp Pro Thr Leu Ala Ala Leu Ala Leu

20 25 30

Leu Ser Ser Val Thr Glu Ala Ser Leu Asp Pro Met Ser Arg Ser Pro

35 40 45

Ala Ser Arg Asp Val Pro Ser Pro Val Leu Ala Pro Pro Thr Asp Tyr

50 55 60

Leu Pro Gly Gly His Thr Ala His Leu Cys Ser Glu Arg Ala Leu Arg

65 70 75 80

Pro Pro Pro Gln Ser Pro Gln Pro Ala Pro Pro Pro Pro Gly Pro Ala

85 90 95

Leu Gln Ser Pro Pro Ala Ala Leu Arg Gly Ala Arg Ala Ala Arg Ala

100 105 110

Gly Thr Arg Ser Ser Arg Ala Arg Ala Thr Asp Ala Arg Gly Cys Arg

115 120 125

Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Ser Ala Leu Gly Leu Gly His Ser

130 135 140

Ser Asp Glu Leu Ile Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg

145 150 155 160

Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly

165 170 175

Ala Leu Arg Ser Pro Pro Gly Ser Arg Pro Ile Ser Gln Pro Cys Cys

180 185 190

Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr

195 200 205

Trp Arg Thr Val Asp His Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly

210 215 220

<210>6

<211>197

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>6

Met Gln Arg Trp Lys Ala Ala Ala Leu Ala Ser Val Leu Cys Ser Ser

1 5 10 15

Val Leu Ser Ile Trp Met Cys Arg Glu Gly Leu Leu Leu Ser His Arg

20 25 30

Leu Gly Pro Ala Leu Val Pro Leu His Arg Leu Pro Arg Thr Leu Asp

35 40 45

Ala Arg Ile Ala Arg Leu Ala Gln Tyr Arg Ala Leu Leu Gln Gly Ala

50 55 60

Pro Asp Ala Met Glu Leu Arg Glu Leu Thr Pro Trp Ala Gly Arg Pro

65 70 75 80

Pro Gly Pro Arg Arg Arg Ala Gly Pro Arg Arg Arg Arg Ala Arg Ala

85 90 95

Arg Leu Gly Ala Arg Pro Cys Gly Leu Arg Glu Leu Glu Val Arg Val

100 105 110

Ser Glu Leu Gly Leu Gly Tyr Ala Ser Asp Glu Thr Val Leu Phe Arg

115 120 125

Tyr Cys Ala Gly Ala Cys Glu Ala Ala Ala Arg Val Tyr Asp Leu Gly

130 135 140

Leu Arg Arg Leu Arg Gln Arg Arg Arg Leu Arg Arg Glu Arg Val Arg

145 150 155 160

Ala Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Ala Tyr Glu Asp Glu Val Ser Phe

165 170 175

Leu Asp Ala His Ser Arg Tyr His Thr Val His Glu Leu Ser Ala Arg

180 185 190

Glu Cys Ala Cys Val

195

<210>7

<211>156

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>7

Met Ala Val Gly Lys Phe Leu Leu Gly Ser Leu Leu Leu Leu Ser Leu

1 5 10 15

Gln Leu Gly Gln Gly Trp Gly Pro Asp Ala Arg Gly Val Pro Val Ala

20 25 30

Asp Gly Glu Phe Ser Ser Glu Gln Val Ala Lys Ala Gly Gly Thr Trp

35 40 45

Leu Gly Thr His Arg Pro Leu Ala Arg Leu Arg Arg Ala Leu Ser Gly

50 55 60

Pro Cys Gln Leu Trp Ser Leu Thr Leu Ser Val Ala Glu Leu Gly Leu

65 70 75 80

Gly Tyr Ala Ser Glu Glu Lys Val Ile Phe Arg Tyr Cys Ala Gly Ser

85 90 95

Cys Pro Arg Gly Ala Arg Thr Gln His Gly Leu Ala Leu Ala Arg Leu

100 105 110

Gln Gly Gln Gly Arg Ala His Gly Gly Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg

115 120 125

Tyr Thr Asp Val Ala Phe Leu Asp Asp Arg His Arg Trp Gln Arg Leu

130 135 140

Pro Gln Leu Ser Ala Ala Ala Cys Gly Cys Gly Gly

145 150 155

<210>8

<211>211

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>8

Met Lys Leu Trp Asp Val Val Ala Val Cys Leu Val Leu Leu His Thr

1 5 10 15

Ala Ser Ala Phe Pro Leu Pro Ala Gly Lys Arg Pro Pro Glu Ala Pro

20 25 30

Ala Glu Asp Arg Ser Leu Gly Arg Arg Arg Ala Pro Phe Ala Leu Ser

35 40 45

Ser Asp Ser Asn Met Pro Glu Asp Tyr Pro Asp Gln Phe Asp Asp Val

50 55 60

Met Asp Phe Ile Gln Ala Thr Ile Lys Arg Leu Lys Arg Ser Pro Asp

65 70 75 80

Lys Gln Met Ala Val Leu Pro Arg Arg Glu Arg Asn Arg Gln Ala Ala

85 90 95

Ala Ala Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly Gln Arg

100 105 110

Gly Lys Asn Arg Gly Cys Val Leu Thr Ala Ile His Leu Asn Val Thr

115 120 125

Asp Leu Gly Leu Gly Tyr Glu Thr Lys Glu Glu Leu Ile Phe Arg Tyr

130 135 140

Cys Ser Gly Ser Cys Asp Ala Ala Glu Thr Thr Tyr Asp Lys Ile Leu

145 150 155 160

Lys Asn Leu Ser Arg Asn Arg Arg Leu Val Ser Asp Lys Val Gly Gln

165 170 175

Ala Cys Cys Arg Pro Ile Ala Phe Asp Asp Asp Leu Ser Phe Leu Asp

180 185 190

Asp Asn Leu Val Tyr His Ile Leu Arg Lys His Ser Ala Lys Arg Cys

195 200 205

Gly Cys Ile

210

<210>9

<211>39

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>9

aaggaaaaaa gcggccgcca tggaacttgg acttggagg 39

<210>10

<211>39

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>10

ttttttcctt ggcggccgct cagcccaggc agccgcagg 39

<210>11

<211>140

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>CARBOHYD

<222>(122)

<223>糖基化天冬氨酰

<400>11

Pro Pro Pro Gln Pro Ser Arg Pro Ala Pro Pro Pro Pro Ala Pro Pro

1 5 10 15

Ser Ala Leu Pro Arg Gly Gly Arg Ala Ala Arg Ala Gly Gly Pro Gly

20 25 30

Ser Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln

35 40 45

Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu

50 55 60

Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro

65 70 75 80

His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro

85 90 95

Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg

100 105 110

Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val

115 120 125

Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly

130 135 140

<210>12

<211>116

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>CARBOHYD

<222>(98)

<223>糖基化天冬氨酰

<400>12

Ala Ala Arg Ala Gly Gly Pro Gly Ser Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala

1 5 10 15

Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly

20 25 30

Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly

35 40 45

Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu

50 55 60

Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser

65 70 75 80

Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp

85 90 95

Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys

100 105 110

Gly Cys Leu Gly

115

<210>13

<211>113

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>CARBOHYD

<222>(95)

<223>糖基化天冬氨酰

<400>13

Ala Gly Gly Pro Gly Ser Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys

1 5 10 15

Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His

20 25 30

Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg

35 40 45

Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala

50 55 60

Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys

65 70 75 80

Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser

85 90 95

Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu

100 105 110

Gly

<210>14

<211>112

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>14

Gly Gly Pro Gly Ser Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg

1 5 10 15

Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg

20 25 30

Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg

35 40 45

Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly

50 55 60

Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys

65 70 75 80

Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr

85 90 95

Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly

100 105 110

<210>15

<211>111

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>15

Gly Pro Gly Ser Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu

1 5 10 15

Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser

20 25 30

Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala

35 40 45

Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala

50 55 60

Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg

65 70 75 80

Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp

85 90 95

Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly

100 105 110

<210>16

<211>110

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>16

Pro Gly Ser Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg

1 5 10 15

Ser Gln Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp

20 25 30

Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg

35 40 45

Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu

50 55 60

Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro

65 70 75 80

Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg

85 90 95

Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly

100 105 110

<210>17

<211>109

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>17

Gly Ser Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser

1 5 10 15

Gln Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu

20 25 30

Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser

35 40 45

Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg

50 55 60

Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr

65 70 75 80

Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr

85 90 95

Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly

100 105

<210>18

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>18

Ser Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln

1 5 10 15

Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu

20 25 30

Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro

35 40 45

His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro

50 55 60

Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg

65 70 75 80

Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val

85 90 95

Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly

100 105

<210>19

<211>107

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>19

Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu

1 5 10 15

Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu Val

20 25 30

Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro His

35 40 45

Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro

50 55 60

Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr

65 70 75 80

Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp

85 90 95

Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly

100 105

<210>20

<211>106

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>20

Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val

1 5 10 15

Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg

20 25 30

Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro His Asp

35 40 45

Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro

50 55 60

Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu

65 70 75 80

Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg

85 90 95

Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly

100 105

<210>21

<211>105

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>21

Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro

1 5 10 15

Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe

20 25 30

Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu

35 40 45

Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly

50 55 60

Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala

65 70 75 80

Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu

85 90 95

Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly

100 105

<210>22

<211>104

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>22

Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val

1 5 10 15

Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg

20 25 30

Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser

35 40 45

Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser

50 55 60

Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val

65 70 75 80

Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser

85 90 95

Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly

100

<210>23

<211>103

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>23

Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Arg

1 5 10 15

Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe

20 25 30

Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu

35 40 45

Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg

50 55 60

Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser

65 70 75 80

Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala

85 90 95

Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly

100

<210>24

<211>102

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>24

Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Arg Ala

1 5 10 15

Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys

20 25 30

Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala

35 40 45

Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro

50 55 60

Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe

65 70 75 80

Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr

85 90 95

Ala Cys Gly Cys Leu Gly

100

<210>25

<211>101

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>25

Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Arg Ala Leu

1 5 10 15

Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser

20 25 30

Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser

35 40 45

Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val

50 55 60

Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met

65 70 75 80

Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala

85 90 95

Cys Gly Cys Leu Gly

100

<210>26

<211>100

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>26

Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly

1 5 10 15

Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly

20 25 30

Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu

35 40 45

Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser

50 55 60

Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp

65 70 75 80

Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys

85 90 95

Gly Cys Leu Gly

100

<210>27

<211>99

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>27

Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu

1 5 10 15

Gly His Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser

20 25 30

Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu

35 40 45

Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln

50 55 60

Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val

65 70 75 80

Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly

85 90 95

Cys Leu Gly

Claims

1.一种治疗受试者神经病性疼痛的方法，该方法包括以每剂每公斤受试者体重1μg-30,000μg的剂量给药受试者包含神经胚活素多肽的制剂。

2.权利要求1的方法，其中所述神经病性疼痛与带状疱疹后神经痛，糖尿病性神经病或坐骨神经痛有关。

3.一种治疗受试者触觉异常性疼痛的方法，该方法包括以每剂每公斤受试者体重10μg-30,000μg的剂量给药受试者神经胚活素多肽。

4.权利要求1或3的方法，其中所述神经胚活素多肽使用选自如下的传输系统给药：静脉内传输，肌肉内传输，肺内传输，皮下传输或腹膜内传输。

5.权利要求1或3的方法，其中所述神经胚活素多肽经肌肉内传输或皮下传输给药。

6.权利要求1或3的方法，其中所述剂量是每剂每公斤受试者体重10μg-10,000μg。

7.权利要求1或3的方法，其中所述剂量是每剂每公斤受试者体重25μg-3,000μg。

8.权利要求1或3的方法，其中所述神经胚活素多肽的所述氨基酸序列包含选自如下的多肽：

(a)至少一种多肽，该多肽包括SEQ ID NO：2的AA_-80-AA₁₄₀，SEQID NO：2的AA_-41-AA₁₄₀，SEQ ID NO：2的AA₁-AA₁₄₀，SEQ ID NO：2的AA₂₅-AA₁₄₀，SEQ ID NO：2的AA₂₈-AA₁₄₀，SEQ ID NO：4的AA_-80-AA₁₄₄，SEQ ID NO：4的AA₁-AA₁₄₄，SEQ ID NO：5的AA₁-AA₂₂₄或SEQ ID NO：5的AA₈₁-AA₂₂₄；

(b)至少一种多肽，该多肽包含SEQ ID NO：2的AA₁₀₇-AA₁₄₀或SEQ ID NO：2的AA₇₆-AA₁₄₀中所示的C末端序列，且其保留了GDNF家族和TGF-β超家族特征性的7个半胱氨酸残基；

(c)至少一种多肽，该多肽包含SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：19，SEQID NO：20，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：23，SEQ IDNO：24，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：27；和

(d)至少一种多肽序列，该序列与上述(a)-(c)中任一序列具有70％以上的氨基酸序列同一性。

9.权利要求1或3的方法，其中所述神经胚活素多肽以定时释放的组合物给药。

10.权利要求1或3的方法，其中所述神经胚活素多肽用衍生的半分子修饰以在体液中具有延长的存留时间和/或有增加的浓度。

11.权利要求10的方法，其中所述衍生的半分子是聚乙二醇半分子。

12.权利要求10的方法，其中所述衍生的半分子选自脂肪族酯，酰胺，N-酰基-衍生物或O-酰基衍生物。

13.一种治疗受试者神经病性疼痛的方法，该方法包括：

a)给药受试者有效量的神经胚活素多肽；和

b)给药受试者有效量的选自如下的诱导痛觉丧失的化合物：类鸦片，抗心律失常药，局部的止痛药，局限的止痛药，抗惊厥药，抗抑郁药，皮质类固醇或NSAIDS。

14.权利要求13的方法，其中所述神经病性疼痛与带状疱疹后神经痛，糖尿病性神经病或坐骨神经痛有关。

15.一种治疗受试者触觉异常性疼痛的方法，该方法包括：

a)给药受试者有效量的神经胚活素多肽；和

16.权利要求13或15的方法，其中(b)中诱导痛觉丧失的化合物是抗惊厥药。

17.权利要求13或15的方法，其中(b)中诱导痛觉丧失的化合物是加巴喷丁(1-(氨甲基)环己烷乙酸)或pregabalin(S-(+)-4-氨基-3-(2-甲基丙基)丁酸)。

18.权利要求13或15的方法，其中所述神经胚活素多肽使用选自如下的传输系统给药：静脉内传输，肌肉内传输，肺内传输，皮下传输或腹膜内传输。

19.权利要求13或15的方法，其中所述神经胚活素多肽通过肌肉内传输或皮下传输给药。

20.权利要求13或15的方法，其中所述神经胚活素多肽的剂量是每剂每公斤受试者体重10μg-10,000μg。

21.权利要求13或15的方法，其中所述神经胚活素多肽的剂量是每剂每公斤受试者体重25μg-3,000μg。

22.权利要求13或15的方法，其中所述神经胚活素多肽的所述氨基酸序列包含选自如下的多肽：

23.权利要求13或15的方法，其中所述神经胚活素多肽以定时释放的组合物给药。

24.权利要求13或15的方法，其中所述神经胚活素多肽用衍生的半分子修饰以在体液中具有延长的存留时间和/或有增加的浓度。

25.权利要求24的方法，其中所述衍生的半分子是聚乙二醇半分子。

26.权利要求24的方法，其中所述衍生的半分子选自脂肪族酯，酰胺，N-酰基-衍生物或O-酰基衍生物。

27.权利要求13或15的方法，其中所述神经病性疼痛与所述受试者被病毒感染有关。

28.权利要求27的方法，其中所述病毒选自：疱疹病毒，人免疫缺陷病毒(HIV)或乳头瘤病毒。

29.权利要求1或13的方法，其中所述神经病性疼痛是与给药治疗剂有关的神经病性疼痛。

30.权利要求29的方法，其中所述治疗剂是抗癌剂。

31.权利要求30的方法，其中所述抗癌剂选自：紫杉醇，脱乙酰基紫杉醇，顺铂，噻氨酯哒唑，长春新碱，长春地辛或长春花碱。

32.权利要求29的方法，其中所述治疗剂是抗病毒剂。

33.权利要求32的方法，其中所述抗病毒剂选自：ddI，DDC，d4T，磷卡萘替，氨苯砜，甲硝唑或异烟肼。

34.权利要求1或13的方法，其中所述神经病性疼痛是由于与外伤有关的损伤所致。

35.权利要求1或13的方法，其中所述神经病性疼痛是异常性疼痛。

36.权利要求1或13的方法，其中所述神经病性疼痛是痛觉过敏性疼痛。

37.权利要求36的方法，其中所述痛觉过敏性疼痛是热性痛觉过敏。

38.权利要求1或13的方法，其中所述神经病性疼痛是幻觉痛。

39.权利要求1或13的方法，其中所述神经病性疼痛与以下疾病有关：先天性神经病(包括但不限于弗里德里希氏共济失调，家族性淀粉样多发性神经病，唐吉尔病，法布里氏病)，代谢性疾病(包括但不限于肾功能不全和甲状腺功能低下)，维生素缺乏(包括但不限于维生素B12缺乏，维生素B6缺乏以及维生素E缺乏)，中毒性神经病和医源性神经病(包括但不限于酒精中毒，维生素B6中毒，六碳化合物中毒，乙胺碘呋酮，氯霉素，双硫醒，异烟肼，金，锂，甲硝唑，米索硝唑，呋喃妥因)，传染性神经病(包括但不限于麻风病，莱姆病)，自身免疫性神经病(包括但不限于格-巴综合征，慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病，不明意义的单克隆γ球蛋白病以及多发性神经病)，三叉神经痛，捕获综合征(包括但不限于Carpel通道)，创伤后神经痛，假性肢痛，多发性硬化性疼痛，复合型区域性疼痛综合征(包括但不限于交感反射性营养不良，灼痛)，肿瘤，脉管病性/血管病性神经病以及特发性神经病。

40.一种降低患神经病的受试者疼痛敏感性丧失的方法，该方法包括以每剂每公斤受试者体重1μg-30,000μg的剂量给药受试者包含神经胚活素多肽的制剂。

41.权利要求40的方法，其中所述神经病是糖尿病性神经病。

42.权利要求40的方法，其中所述疼痛敏感性的丧失是热性疼痛敏感性的丧失。

43.权利要求40的方法，其中所述神经胚活素多肽使用选自如下的传输系统给药：静脉内传输，肌肉内传输，肺内传输，皮下传输或腹膜内传输。

44.权利要求40的方法，其中所述神经胚活素多肽经肌肉内传输或皮下传输给药。

45.权利要求40的方法，其中所述剂量是每剂每公斤受试者体重10μg-10,000μg。

46.权利要求40的方法，其中所述剂量是每剂每公斤受试者体重25μg-3,000μg。

47.权利要求40的方法，其中所述神经胚活素多肽的所述氨基酸序列包含选自如下的多肽：

48.权利要求40的方法，其中所述神经胚活素多肽以定时释放的组合物给药。

49.权利要求40的方法，其中所述神经胚活素多肽用衍生的半分子修饰以在体液中具有延长的存留时间和/或有增加的浓度。

50.权利要求40的方法，其中所述衍生的半分子是聚乙二醇半分子。

51.权利要求40的方法，其中所述衍生的半分子选自脂肪族酯，酰胺，N-酰基-衍生物或O-酰基衍生物。

52.一种治疗，预防或延缓受试者神经病性疼痛的方法，该方法包括以每剂每公斤受试者体重1μg-30,000μg的剂量给药受试者包含神经胚活素多肽的制剂，其中给药神经胚活素多肽是预防性的。

53.权利要求52的方法，其中所述神经胚活素多肽使用选自如下的传输系统给药：静脉内传输，肌肉内传输，肺内传输，皮下传输或腹膜内传输。

54.一种治疗受试者糖尿病性神经病的方法，该方法包括以每剂每公斤受试者体重1μg-30,000μg的剂量给药受试者包含神经胚活素多肽的制剂。

55.权利要求52或54的方法，其中所述神经胚活素多肽使用选自如下的传输系统给药：静脉内传输，肌肉内传输，肺内传输，皮下传输或腹膜内传输。

56.权利要求52或54的方法，其中所述神经胚活素多肽的所述氨基酸序列包含选自如下的多肽：