CN1950397A - 生长因子NsG33的治疗用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及蛋白、基因和细胞的治疗用途领域。更具体的，本发明涉及基于分泌性治疗蛋白NsG33的生物学功能的治疗用途，特别是治疗神经系统疾病。NsG33是一种神经存活和生长因子，对神经细胞系有抗凋亡效应，对神经前体细胞系和原代纹状体培养物有神经保护和/或神经形成效应。本发明还涉及新的生物活性NsG33多肽片段及相应的编码DNA序列。

Description

生长因子NsG33的治疗用途
本申请要求享有2004年5月28日提交的US 60/575,086的权益，在此引入作为参考。本申请要求2004年3月30日提交的丹麦专利申请PA 200 400510和2004年5月28日提交的丹麦专利申请PA 2004 00843的优先权。这些申请以及本申请中提及的参考文献全部引入本文作为参考。
技术领域
本发明涉及蛋白、基因和细胞的治疗用途领域，特别是基于分泌性治疗蛋白NsG33生物学功能的治疗用途，尤其是治疗神经系统疾病和免疫疾病。NsG33是一种神经存活和生长因子，具有神经保护和/或神经发生效应。本发明也涉及生物活性NsG33多肽片段和相应的编码DNA序列。
背景技术
细胞外蛋白对多细胞生物体的形成、分化和维持起着非常重要的作用。许多单个细胞的命运，例如生长，包括增殖、迁移、分化，或与其它细胞之间的相互作用，一般被从其它细胞和/或直接环境获得的信息所控制。这一信息通常通过分泌性多肽传导(例如，促有丝分裂因子、存活因子、细胞毒性因子、分化因子、神经肽和激素)，不同细胞受体或膜结合蛋白依次接收和翻译分泌性多肽。这些分泌性多肽或信号分子通常通过细胞分泌途径到达它们在细胞外环境的作用位点。
如帕金森病，阿耳茨海默氏病，亨延顿氏病，多发肌萎缩性侧索硬化症，中风，精神分裂症，癫痫和外周神经病之类的疾病以及伴随的疼痛，影响数百万人。由于丧失了正常的神经生理功能，导致行为和体格缺陷，这是每种不同神经疾病的特征。除了慢性和急性神经退行性疾病，衰老，神经系统物理伤害和代谢性疾病也可导致神经细胞的损伤，机能障碍，或者退化，并伴随相应的行为和体格缺陷。这些疾病多数在今天还不能被治愈，传统药物治疗常常无效。因此对那些既能治标又能治本的新型治疗性蛋白具有巨大的医疗需求。
在神经系统或相关靶区表达的几种分泌性因子对引起神经功能衰退或丧失的各种神经疾病具有重要的治疗用途。如神经生长因子(NGF)是治疗阿耳茨海默氏病的候选药物，Neublastin(Artemin)是治疗外围神经病的候选药物，GDNF是治疗帕金森氏病的候选药物。
发明概述
本发明第一个方面涉及一种分离的医药用途多肽，所述多肽包括选自如下组的氨基酸序列：
a)选自SEQ ID No.3、4、5、8、9、10、13、14、15、19、20、21、22、23和24的氨基酸序列；
b)选自SEQ ID No.3、4、5、8、9、10、13、14、15、19、20、21、22、23和24的氨基酸序列突变体，突变体与所述SEQ ID No至少有70％序列同一性；和
c)含a)至b)的至少50个连续氨基酸的生物活性片段。
本发明人发现NsG33是一种具有生长因子特性的分泌性蛋白，以高水平选择性地在神经系统和眼睛中表达，特别是在黑质，壳核和脊髓，以及发育中人胚胎的中脑表达。此外本发明人发现NsG33能够阻止神经细胞系凋亡(实施例6)。细胞凋亡促使成熟的神经系统神经细胞丧失，引起各种神经障碍，如缺血性中风，神经变性疾病或外伤性脑损伤(Becker and Bonni、Prog Neurobiol.2004 Jan；72(1)：1-25)。
在来源于人神经祖细胞系和鼠纹状体原代培养物的神经元和星形胶质细胞两个试验中，显示NsG33具有神经保护作用。因此本发明人尝试使用NsG33治疗中枢神经系统疾病，特别是治疗帕金森氏病，亨延顿氏病和脊髓机能障碍，如ALS。由于NsG33具有神经保护作用，并表达在小脑、脊神经后根神经节和视网膜，也尝试用NsG33治疗外周神经病及伴随的疼痛，以及小脑功能紊乱和视网膜病。
在神经系统或亚区表达的其它治疗相关性分泌型生长因子包括，但不限于GDNF、NGF、Neurturin、BDNF、NT4/5、NT3、Neublastin(Artemin)。
基于与WO 93/22437公开的蛋白的序列同一性，NsG33尝试用于治疗免疫疾病。
NsG33通过影响靶细胞生长、存活、再生、功能恢复或改善、和/或分化，而发挥治疗效应。本发明者证实NsG33能保护一种神经细胞类型不发生凋亡(实施例6，图9)。本发明者还证实在对照组条件下，当暴露于NsG33时，人神经祖细胞系和原代鼠纹状体培养物都生成较高比例的神经元(实施例14和15)。后一种效应是由神经元存活情况改善，神经元分化增加和/或神经前体细胞增殖造成的。
基于这些生物学分析鉴定，本发明涉及防止哺乳动物神经细胞凋亡的方法，所述方法包括将所述神经细胞暴露于本发明多肽。本发明还涉及增强哺乳动物神经细胞存活的方法，所述方法包括将所述神经细胞暴露于本发明多肽。本发明另外还涉及合成神经元的方法，所述方法包括将所述神经前体细胞或神经干细胞暴露于本发明多肽中。优选，所述哺乳动物神经细胞和/或哺乳动物神经前体细胞或神经干细胞是人细胞。
本发明另一方面涉及一种分离的医药用途核酸分子，包括编码多肽的核酸序列，或编码序列的互补序列，所述多肽包括选自如下组的氨基酸序列：
a)选自SEQ ID No.3、4、5、8、9、10、13、14、15、19、20、21、22、23和24的氨基酸序列；
b)选自SEQ ID No.3、4、5、8、9、10、13、14、15、19、20、21、22、23和24的氨基酸序列突变体，其中突变体与所述SEQ ID No至少有70％序列同一性；和
c)含a)至b)中的任何的至少50个连续氨基酸的生物活性片段。
本发明另一方面涉及一种分离的医药用途核酸分子，其中核酸分子包括选自如下的核苷酸序列：
a)选自SEQ ID No.1、2、6、7、11、12、16、17和18的核苷酸序列；
b)与选自SEQ ID No.1、2、6、7、11、12、16、17和18的核苷酸序列至少有50％序列同一性的核苷酸序列；
c)选自SEQ ID No.1、2、6、7、11、12、16、17和18的150个连续核苷酸的核酸序列；
c)能与选自SEQ ID No.1、2、6、7、11、12、16、17和18的核酸在高度严谨条件下杂交的互补核酸；和
d)上述任一核酸分子的互补核酸序列。
本发明另一方面涉及包括本发明核酸分子的表达载体。
本发明另一方面涉及包括本发明表达载体的分离宿主细胞。特别是，本发明涉及用于细胞治疗(裸细胞或包膜细胞治疗)的宿主细胞。
本发明另一方面涉及能产生感染性病毒颗粒的包装细胞系，所述病毒颗粒包括逆转录病毒科基因组的5’端逆转录病毒LTR，tRNA结合位点、包装信号、与编码本发明多肽的多核苷酸序列可操作连接的启动子、合成DNA第2条链的起始位点、和3’端逆转录病毒LTR。
本发明另一方面涉及可植入的生物相容性的细胞装置，包括：
i)允许本发明蛋白扩散的半透膜；和
ii)本发明细胞的组合物(composition)，或本发明包装细胞的组合物。
本发明另一方面涉及药物组合物，包括：
i)本发明多肽；或
ii)本发明的分离核酸序列；或
iii)本发明表达载体；或
iv)本发明宿主细胞组合物；或
v)本发明包装细胞系；或
vi)本发明可植入的具有生物相容性的细胞装置；和可药用载体。
本发明另一方面涉及以下组分在制备药物中的用途：
i)本发明多肽；或
ii)本发明的分离核酸序列；或
iii)本发明表达载体；或
iv)本发明宿主细胞组合物；或
v)本发明包装细胞系；或
vi)本发明可植入的具有生物相容性胶囊。
本发明另一方面涉及治疗对象的病理状态的方法，包括给予需要治疗对象治疗有效量的以下组分：
i)本发明多肽；或
ii)本发明的分离核酸序列；或
iii)本发明表达载体；或
iv)本发明宿主细胞组合物；或
v)本发明包装细胞系；或
vi)本发明可植入的具有生物相容性胶囊。
本发明另一方面涉及以下组分作为哺乳动物细胞培养用生长因子的用途：
i)本发明多肽；或
ii)本发明的分离核酸序列；或
iii)本发明表达载体；或
iv)本发明宿主细胞组合物；或
v)本发明包装细胞系。
本发明一方面涉及能结合本发明多肽的抗体。
本发明另一方面涉及包括本发明抗体和选自以下偶联物的免疫偶联物：细胞毒素剂如化疗剂，毒素或放射性同位素；特异结合配对成分如抗生物素蛋白或抗生物素蛋白链菌素或抗原；能够产生可检测产物的酶。
本发明另一方面涉及选自下组的分离多肽：SEQ ID No 3的AA128-AA293，SEQ ID No 3的AA121-AA293，SEQ ID No 8的AA129-AA294，SEQ ID No 8的AA122-AA294，SEQ ID No 13的AA126-AA291，SEQ ID No 13的AA119-AA291，以及所述多肽的突变体，其中所选序列中指定的任一氨基酸可变化成不同氨基酸，条件是序列中不超过15个氨基酸残基发生这样的改变。这些分离的多肽组成NsG33的C末端肽。优选任一改变的氨基酸选自图3a所示的非保守的，低保守的或高度保守的氨基酸。
本发明另一方面涉及NsG33的特定截短形式。在一个方面，这些选自：
1)SEQ ID No 3的AA30-AA288，以及其一端或两端有天然序列的1到5个额外氨基酸，至多形成SEQ ID No 3的AA25-AA293的多肽；
2)SEQ ID No 13的AA28-AA286，以及其一端或两端有天然序列的1到5个额外氨基酸，至多形成SEQ ID No 13的AA23-AA291的多肽；
3)SEQ ID No 8的AA31-AA289，以及其一端或两端有天然序列的1到5个额外氨基酸，至多形成SEQ ID No 8的AA26-AA294的多肽；
4)所述多肽的突变体，其中所选序列中指定的任一氨基酸可变化成不同氨基酸，条件是序列中不超过20个氨基酸残基发生这样的改变。
NsG33的这些截短形式组成了生物活性核心序列，从第一个到最后一个保守半胱氨酸。
本发明另一方面涉及NsG33的特定截短形式，在一个方面，这些选自：
1)SEQ ID No 3的AA171-AA288，以及其一端或两端有天然序列的1到5个额外氨基酸，至多形成SEQ ID No 3的AA165-AA288的多肽；
2)SEQ ID No 13的AA169-AA286，以及其一端或两端有天然序列的1到5个额外氨基酸，即至多形成SEQ ID No 13的AA164-AA291的多肽；
3)SEQ ID No 8的AA172-AA289，以及其一端或两端有天然序列的1到5个额外氨基酸，即至多形成SEQ ID No 8的AA167-AA294的多肽；
4)所述多肽的突变体，其中所选序列中指定的任一氨基酸可变化成不同氨基酸，条件是序列中不超过10个氨基酸残基发生这样的改变。
NsG33的这些截短形式从肽C末端肽的第一个到最后一个保守半胱氨酸组成了NsG33C末端肽的生物活性核心序列。
本发明另一方面涉及NsG33的特定截短形式，在一个方面，这些选自：
1)SEQ ID No 3的AA30-AA118，以及其一端或两端有来自天然序列的1到5个额外的氨基酸，至多构成SEQ ID No 3的AA25-AA123的多肽；
2)SEQ ID No 13的AA28-AA116，以及其一端或两端有来自天然序列的1到5个额外的氨基酸，至多构成SEQ ID No 13的AA23-AA121的多肽；
3)SEQ ID No 8的AA31-AA119，以及其一端或两端有来自天然序列的1到5个额外的氨基酸，至多构成SEQ ID No 8的AA26-AA124的多肽；
4)所述多肽的突变体，其中所选序列中指定的任一氨基酸可变化成不同氨基酸，条件是序列中不超过10个氨基酸残基发生这样的改变。
这些截短形式从肽N末端肽的第一个到最后一个保守半胱氨酸组成了一个NsG33N末端肽的生物活性核心序列。
本发明还涉及编码所述NsG33C末端，N末端和截短NsG33的核酸以及包括编码这些的核酸的载体、产生这些的细胞以及制备所述C末端，N末端和截短NsG33的方法。
附图简要说明
图1.预测人NsG33信号肽的存在和位置。图1a：人NsG33信号P NN(神经网络图)。图1b：人NsG33信号P HMM(隐马尔可夫模型(Hidden MarkovModel))。详细说明参考实施例2。
图2.从ProtFun2.1蛋白功能预测服务器输出的人全长NsG33(SEQ IDNo 3)，人N末端肽(SEQ ID No 19)和人C末端肽(SEQ ID No 5)。详细解释参考实施例2。
图3a：Clustal W(1.82)对人、局部的小鼠和大鼠NsG33多条序列的比对。信号肽序列以粗体标出。推测的弗林蛋白酶切割位点以下划线标出。
图3b：Clustal W(1.82)对人、小鼠和大鼠NsG33多条序列的比对。预测的信号肽序列以粗体标出。
*表示单个、完全保守的残基的位置。
：表示下述“强”基团之一完全保守：-STA、NEQK、NHQK、NDEQ、QHRK、MILV、MILF、HY、FYW。
.表示下述“弱”基团之一完全保守：-CSA、ATV、SAG、STNK、STPA、SGND、SNDEQK、NDEQHK、NEQHRK、VLIM、HFY。
图4：NsG33实时PCR。详细说明见实施例5。
图4上部是NsG33的相对表达(相对于表达最低的组织)，假设从用于cDNA步骤的等量总RNA合成等量cDNA。
图4下部是以β2-微球蛋白为标准的NsG33相对表达(相对于标准化表达最低的组织)。因为不同组织之间β2-微球蛋白表达水平不同，所以应该小心解释。
图5：人全长NsG33多肽与WO 93/22437(Innogenetics SA)公开的人全长多肽(Innog)的Align0比对。得分矩阵BLOSUM50，罚分：-12/-2。10个保守的半胱氨酸以粗体表示，并在比对序列的上面或下面标有星号。
图6：人NsG33cDNA和编码的原NsG33。
图7a：小鼠部分NsG33cDNA和编码的部分原NsG33。
图7b：小鼠全长NsG33cDNA和编码的原NsG33。
图8：大鼠NsG33cDNA和编码的原NsG33。
图9：NsG33对无血清培养基中PC12细胞存活的影响。详细内容见实施例6。细胞以2×104细胞/孔的密度接种在包被胶原的48孔板的生长培养基中。第二天，细胞在含5μg/ml聚凝胺(polybrene)条件下，与105转导单位病毒/孔(MOI＝5)孵育过夜进行转导。转导完，培养基换成无血清DMEM(Invitrogen)，4天后以MTS法测定细胞存活状态。所显示的数据是代表性实验的平均值±SEM(n＝6)，*表示EGFP的cDNA转导的细胞存活状态显著差异(P＜0.05，方差分析，Dunnett′s方法)。LV-EGFP：慢病毒EGFP转导的PC12细胞。LV-NsG33：人全长NsG33转导的PC12细胞。
图10A显示的是以GAPDH为标准，以定量RT-PCR检测胎龄为E10.5、E11.5和E13.5(分别表示受孕后10.5，11.5和13.5天)胚胎中处于发育的脊髓和成人脊髓中mNsG33相对表达水平(相对于表达最低的组织)。详细描述见实施例13。
图10B显示的是处于两个发育年龄阶段(P1＝出生后一天和成年)小鼠脑组织的两个区域中(CTX＝皮质，Cb＝小脑)mNsG33相对表达水平。以标准化表达量最低的组织中mGAPDH的表达水平为标准，以定量RT-PCR检测mNsG33相对表达水平。详细描述见实施例13。
图11A显示的是在分化hNS1培养物的非条件(hNS1)无血清培养基(hNS1)，对照ARPE-19细胞的条件培养基(McC)或NsG33转导的ARPE-19培养物的条件培养基(Mc33)中，GFAP阳性神经胶质细胞(灰色柱形)和β-III-微管蛋白阳性神经元(黑色柱形)的平均百分率。详细内容见实施例14。
图11B显示的是在分化hNS1培养物的非条件(hNS1)无血清培养基(hNS1)，对照ARPE-19细胞的条件培养基(McC)或NsG33转导的ARPE-19培养物的条件培养基(Mc33)中，用40倍放大物镜计数Hoechst染色的核，从而测定每个视野中细胞总数。详细内容见实施例14。
图12显示的是在DIV2，在非条件(UCM)无血清培养基中，在MOCK转染的HEK293T或ARPE-19细胞的稀释的条件培养基中(分别为293T-CM和RPE-CM)，或在平行NsG33转染细胞的稀释的条件培养基中(分别为293T-CM33和RPE-CM33)，大鼠纹状体中β-III-微管蛋白阳性神经元的平均百分数。具体描叙见实施例15。
定义
本文中“NsG33”是指含有基本纯化的NsG33的氨基酸序列的多肽，其能从任何物种获得，特别是哺乳动物，包括猩猩，牛，羊，猪，鼠，马，优选人，能从天然、合成、半合成或重组任意途径获得。这一术语也指从以上任意物种获得的NsG33的生物活性片段，以及这些片段的生物活性序列突变体和翻译后修饰蛋白。
本文中“生长因子特征”是指与经典生长因子相似的序列相关特征，其是分泌性蛋白，通过受体作用于靶细胞，对靶细胞产生一种或更多以下效应：生长，包括增殖、分化、存活、再生、迁移、功能恢复、功能改善。
本文中“等位基因”或“等位序列”是指编码NsG33的可选择基因形式。等位基因可能由核酸序列的至少一个突变所引起，并可能导致mRNAs或多肽改变，而其结构或功能可能改变或不变。任何给定的天然或重组基因可能没有，有一个或多个等位基因形式。产生等位基因的突变通常有天然的核苷酸删除、添加或替代。每一种类型突变可以单独或与其他联合发生，在给定序列中可以发生一次或多次。
本文中“删除”是指氨基酸或核苷酸序列改变，导致一个或多个氨基酸残基或核苷酸缺失。
本文中“插入”或”添加”是指氨基酸或核苷酸序列改变，导致与天然产生的分子相比，分别增加一个或多个氨基酸残基或核苷酸。
本文中术语“特异结合”或“特异性结合”是指蛋白或肽与结合分子之间高亲和力的相互作用，结合分子如抗体和受体或其片段。相互作用取决于被结合分子识别的蛋白的特定结构(即抗原决定簇或表位)。例如，如果抗体特异识别表位“A”，在含有标记的“A”和抗体的反应中，如果存在含有表位A(或游离，未标记A)的蛋白，则抗体与标记的A结合的量减少。
本文中术语“基本纯化”是指从天然环境中提取、分离或分开的核酸或氨基酸序列，至少有60％，优选75％，更优选90％与其天然伴随的其他成分分离。
本文中“取代”是指一个或多个氨基酸或核苷酸分别被不同氨基酸或核苷酸取代。
本文中“序列同一性”是指通过数学算法计算两个序列之间的同源性百分比。用来比较两个序列的数学算法，优选但不限于Karlin和Altschul算法(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-2268，改进的Karlin和Altschul算法(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877。这一种算法被应用到Altschul等的BLASTN和BLASTP程序。Altschul，et al.(1990)J.Mol.Biol.215：403-410。
为了表征同一性，排列目标序列以获得最高次序同源性(匹配)。基于这些普遍规则，两个氨基酸序列的“同一性百分比”可用BLASTP算法获得[Tatiana A.Tatusova、Thomas L.Madden：Blast 2 sequences-a new tool forcomparing protein and nucleotide sequences；FEMS Microbiol.Lett.1999 174247-250]，这一算法可在美国国家生物技术信息中心(the National Center forBiotechnology Information(NCBI)网站( http://www.ncbi.nlm.nih.gov)上获得，并使用其默认设置(即Matrix＝Blosum62；Open gap＝11；Extension gap＝1；Penalties gap x_dropoff＝50；Expect＝10；Word size＝3；Filter on)。BLAST算法执行两步操作，首先根据设置条件比对两个序列，然后在两个比对序列的重叠范围内计算序列同一性百分比。除了序列同一性百分比，BLAST也可以根据设置计算序列相似性百分比。
另一个用来比较序列的数学算法，优选但不限于Myers和Miller算法、CABIOS(1989)。这一算法被应用到ALIGN程序(Version2.0)，ALIGN程序是FASTA序列比对软件包的一部分(Pearson WR、Methods Mol Biol、2000、132：185-219)。Align根据总体序列比对来计算序列同一性。Align0对末端序列不会罚分。当利用ALIGN og Align0程序比较氨基酸序列时，优选使用开放/延伸罚分为-12/-2的BLOSUM50取代矩阵。
发明详述
本发明涉及鉴定为NsG33的多肽和多核苷酸的医药用途。NsG33蛋白在人类(SEQ ID No.3)，小鼠(SEQ ID No.8)和大鼠(SEQ ID No.13)中已被鉴定。
人NsG33以293个氨基酸的前体形式存在，能被加工生成至少一个和几个可能的生物活性肽。NsG33在神经系统和眼睛，特别是脑组织亚区(Fig4A和B)高水平表达。最长的小鼠(SEQ ID No 8)和大鼠(SEQ ID No13)NsG33多肽分别由294和291氨基酸组成，与人NsG33蛋白的同源性百分比分别为80.3和80.2(见实施例2的表1和表2)。需要指出的是预测的小鼠和大鼠全长多肽序列还未被证实，至少小鼠多肽序列只是N末端部分。Nishino等发表了N末端稍微不同的全长小鼠蛋白序列(The EMBO Journal、2004、23：2998-2008)，相应的cDNA序列可由NCBI登记号XM128551获得。从这个小鼠蛋白中切除信号肽可以产生具有SEQ ID No.9的成熟蛋白。
人NsG33包括23个氨基酸的N末端信号肽，此信号肽在ARA-GY基序处被切掉。这一信号肽切割位点通过SignalP方法预测(见实施例2)，输出图表见图1。但是本领域技术人员知道实际切割位点与计算机程序预测的位点有所不同。例如预测大鼠NsG33信号肽时发现在16和20位可能性大致相同。在小鼠NsG33(24位)和大鼠NsG33(16或21位)的相似位置发现了信号肽切割位点。切割信号肽产生人、小鼠和大鼠的多肽，分别为SEQ IDNo.4、9和14。已知信号肽加工过程并不完全按预测方式进行，实际的切割各不相同。因此预计成熟NsG33的N末端切割位点与预测切割位点有1到2个或3个氨基酸不同。通过试验性地C末端标记如组氨酸标记可证实成熟NsG33的实际N末端，随后用多聚组氨酸特异性抗体或Ni柱进行纯化，再对纯化的成熟肽进行N末端测序。
以ProP方法预测人NsG33蛋白的普通前蛋白切割位点在127位(Prediction of proprotein convertase cleavage sites.Peter Duckert、SrenBrunak and Nikolaj Blom.Protein Engineering、Design and Selection：17：107-112、2004)，得分0.831，基序为“WGPRERR-AL”。同样，在小鼠NsG33(128位)和大鼠NsG33(125位)同源位置预测切割位点，得分都是0.831，基序都是“WGPRERR-AL”。在人NsG33 121位的基序“GGRCVR-WG”基序发现可能的弗林蛋白酶前肽切割位点，在小鼠和大鼠NsG33相应位置也发现了这一切割位点。多肽经切割信号肽加工后形成一个C末端肽和一个N末端肽。蛋白是否真正在这些预测的位点进行加工取决于表达基因的细胞类型。C末端加组氨酸标签，纯化，对标记的肽的N末端测序，可对前肽切割位点进行实验证实。
NsG33属于生长因子蛋白种类。ProtFun蛋白功能预测服务器的预测支持这一认识，预测概率在1.0以上，如图2所示。
ProtFun方法预测蛋白功能基于序列特征，这一特征对立于序列相似性。区分“生长因子”种类与其它种类的重要特征是：蛋白分类潜力，蛋白靶向潜力，信号肽潜力，低柔性区域，二级蛋白结构，阴性残基数量和原子数量。一般认为，概率得分为1表明预测结果具有偶然性。概率得分超过1表明蛋白属于预测的基因种类的可能性增加。得分越高，预测的结果越准确。
定量实时PCR的实验结果见图4A和4B。基于这些图，根据NsG33的表达水平对组织进行分类。
高表达水平的组织包括：壳核、黑质和脊髓。
中等表达水平的组织包括大脑、小脑、视网膜★和背根神经节★；
低表达水平的组织包括：心脏、肾、肺、前列腺、唾液腺、骨骼肌、睾丸、胃、胰腺、胎脑★。
极低或不表达的组织包括：胎肝、胎盘、胸腺、气管、脾脏、子宫、结肠、小肠。
参照β2-微球蛋白表达标准化后，分析结果时发现，除标记星号的组织外，其余组织的试验结果基本相同。
小鼠NsG33的实时PCR结果见图10A和10B。CT值范围17-22。从图10A明显看出，在脊髓发育过程中，NsG33的表达受调控，E11.5达到峰值。从图10B可以明显看出，在出生后小脑发育过程中，NsG33的表达也受调控，但皮质中没有。
脊髓中NsG33短暂表达模式提示其对CNS这一区域神经祖细胞的增殖，分化和/或生存起作用。这一作用特点提示NsG33可能用来治疗神经变性疾病和脊髓损伤，包括脊髓损伤，ALS和脊柱肌肉萎缩。而且其还可作为一种体外刺激脊髓神经祖细胞扩增和分化的试剂。
成人小脑中NsG33的上调表达提示其在一种或多种类型小脑细胞的维持和生存中作用。这一作用特点提示NsG33可能用来治疗小脑功能障碍，包括但不仅限于感觉性共济失调，多发性硬化症，神经变性的脊髓小脑功能障碍，遗传性共济失调，小脑萎缩(如橄榄体脑桥小脑萎缩(OPCA)，夏-德综合征(多系统萎缩症)和酒精中毒。
不像结构蛋白，生长因子参与细胞信号和各种功能，如生长、增殖、分化、生存、再生、迁移、功能恢复和改善。因此，生长因子具有治疗作用。
基于NsG33组织表达特异性，并预测NsG33是分泌性生长因子，且具有抗凋亡、神经保护和/或神经形成活性作用(图9，11和12)，尝试将NsG33用于治疗神经系统功能障碍(基于神经系统特异表达)，特别是帕金森(氏)病(基于在黑质的表达)，亨廷顿病(基于在壳核和黑质的表达)，小脑功能障碍(基于在人小脑的表达，在小鼠小脑发育过程中的差异表达)，脊髓损伤(基于在成人脊髓的表达，在小鼠脊髓发育过程中的差异表达)，ALS(基于在成人脊髓的表达，在小鼠脊髓发育过程中的差异表达)，周围神经病(基于在脊根神经节的表达)，和视网膜病(基于在视网膜的表达)。对不同适应症的治疗作用可被实施例中所叙体内外实验所证实。
同样，与治疗有关的分泌性生长因子包括GDNF，NGF和Neublastin(Artemin)，它们在神经机能障碍的相应靶区表达。
NsG33的治疗效应通过影响靶细胞生长所介导，包括靶细胞增殖、再生、功能恢复、功能改善、生存、迁移和(或)分化。
一种已证实的NsG33生物学功能是保护PC12(嗜铬细胞瘤)细胞不发生饥饿诱导的凋亡。嗜铬细胞瘤是肾上腺髓质未成熟和成熟嗜铬细胞肿瘤。嗜铬细胞，感觉和交感神经元，色素细胞(黑色素细胞)起源于神经嵴的共同前体细胞。它们分化成特别系谱时高度依赖外部信号包括分泌的因子。
PC12是一个克隆细胞系，来源于一种可移植的大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤并建系(Greene and Tischler、1976 Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.73、2424)，可从美国典型培养物保藏中心(ATCC，编号CRL-1721)获得。PC12细胞被认为是多能的嗜铬细胞前体细胞，因为它能够依赖不同的培养条件而分化成成熟的嗜铬细胞，交感神经元和黑色素细胞。PC12细胞已被广泛用作研究神经分化和存活的模型系统。在含血清的培养基中，额外添加某种神经营养因子包括NGF，可诱导PC12细胞分化成表型类似于交感神经元的神经细胞。在无血清培养基中，PC12细胞将发生凋亡和坏死，除非提供某些存活因子如生长因子，激素或小分子物质。
能够诱导PC12细胞分化和存活的因子包括某一种NGF和一些胰泌素/胰高血糖素/血管活性肠肽家族(垂体腺苷酸环化酶激活肽，PACAP)在外周和中枢神经系统也显示相似的活性，这提示表达在PC12细胞上的受体和配体，同时也表达在一些其它神经细胞上。
对位于基底前脑的反应性交感和感觉神经元，胆碱能神经元来说，NGF是一种重要的分化和存活因子。PACAP能促进新生背根神经节(DRG)神经元的分化，因为它可以增加神经标记阳性细胞和神经轴突发生的数量而不影响神经祖细胞的增殖(Nielsen et al.、Mol Cell Neurosci.2004Apr；25(4)：629-41)。PACAP还在中枢神经系统所有神经组织中显示相似活性(Vaudry et al.、Proc Natl Acad Sci U S A.2002 Apr 30；99(9)：6398-403；Dicicco-Bloom et al.、Ann N Y Acad Sci.1998 Dec 11；865：274-89)。
细胞凋亡可促使成人神经系统神经细胞消亡，引起不同神经障碍如缺血性发作，神经变性疾病或外伤性脑损伤(Becker and Bonni、Prog Neurobiol.2004 Jan；72(1)：1-25)。一般认为，一种保护神经细胞不发生凋亡的分泌性生长因子是治疗神经系统机能紊乱，特别是神经变性疾病的候选药物。一种分泌性因子具有诱导轴突向外生长和/或促进神经细胞存活的能力，提示其对位于中枢或外周神经系统的其它神经细胞类型有相似的效应，并能作为治疗神经系统机能紊乱，特别是神经变性疾病的候选因子。
NsG33的另一个生物学功能是刺激人神经干细胞系(hNS1、formerlycalled HNSC.100)产生神经元。与收集自非转导ARPE-19细胞的条件培养基培养的hNS1细胞相比，在收集自人NsG33基因转导ARPE-19细胞的条件培养基培养的细胞可产生较多星形胶质细胞样神经元。这一结果与在PC-12细胞中研究抗凋亡效应结果一致。这一效应是通过其对神经元的存活和(或)发生和(或)神经祖细胞增殖的效应而产生的。hNS1细胞系来源于人前脑神经球体培养物而建系的。其它已知具有治疗效应的营养因子已经知道其可增加人neurosphere培养物产生的神经元数量。这些营养因子包括神经营养蛋白(NT3)，NT4/5和血小板衍生的生长因子(PDGF)(Caldwell et al、NatureBiotechnology、2001 May、19(5)：475-9.Growth factors regulate the survival andfate of cells derived from human neurospheres)。当然这些结果也提示NsG33是治疗神经系统机能障碍特别是神经变性疾病的一种候选因子。
更进一步的体外研究，收集自转染编码人NsG33 cDNA序列的两种细胞系的条件培养基可以增加大鼠纹状体原代培养细胞中神经元的数量。这一研究结果与NsG33的神经保护作用一致。这一效应是通过其对神经元的存活和/或形成和/或神经祖细胞增殖效应而产生的。具有治疗效应的其它因子对大鼠纹状体培养物具有相似的效应，这些因子包括重组基本的成纤维细胞生长因子(bFGF)，截短的胰岛素样生长因子-1(tIGF)，神经营养因子-3(NT-3)，脑源性神经营养因子(BDNF)，血小板衍生的生长因子的BB-同工型(PDGF-BB)和神经营养因子-4/5(NT-4/5)。(Nakao等人，Exp Neurol1996，Mar 138(1)：144-57，Differential trophic effects of basic fibroblast growthfactor，insulin-like growth factor-1，and neurotrophin-3 on striatal neurons inculture；Nakao等人，Brain Res Dev Barin Res，1995，Dec 21；90(1-2)：92-101，Trophic and protective actions of brain-derived neurotrophic factor on striatalDARPP-32-containing neurons in vitro；Widmer等人Eur J Neurosci，1994 Nov1；6(11)：1669-79，Neurotrophin 4/5 promotes survival and differentiation of ratstriatal neurons developing in culture)。当然这些结果也提示NsG33是一种治疗神经系统功能障碍特别是神经变性疾病的候选因子。
NsG33与WO93/22437(Innogenetics SA)公开的蛋白在结构上相关，所述蛋白在BLASTP上被确认。这一全长人蛋白见WO93/22437中图2。NsG33与Innogenetics蛋白有42％同源性(以默认设置比对(Align0))，包括10个保守的半胱氨酸残基。在Innogenetics蛋白(NsG34)中预测有一45个残基组成的N末端信号肽。WO93/22437中重组表达实验数据提示这一蛋白不能在所叙条件下进行前肽加工处理，但它能以一个268个氨基酸组成的蛋白进行分泌。这说明当基因表达时，预测的NsG33前肽切割不会发生，至少在引用的专利中是这样报道的。
人NsG33与人Innogenetics蛋白的全长比对见图5。10个保守的半胱氨酸以粗体显示并以星号标记。基于保守的半胱氨酸残基和图5显示的高保守性的延伸，这两种蛋白一起组成一个蛋白家族。这两种蛋白与其它已知任何人的蛋白没有明显的序列同一性。虽然它们是同一小蛋白家族成员，但两种蛋白的结构不同。
由于存在高保守的半胱氨酸，这些氨基酸残基在生物活性蛋白的二级和三级结构中起很重要的作用。一个或多个半胱氨酸将参与形成分子内和(或)分子间的二硫键。
Innogenetics蛋白尤其在活化T、B细胞中发挥重要作用，其可作为免疫抑制细胞的诱导剂。基于与Innogenetics蛋白的同源性，NsG33预测有涉及免疫学的类似功能。
I NsG33多肽
除了全长NsG33、基本全长NsG33、原NsG33、C末端肽、N末端肽和NsG33截短形式之外，本发明提供了多肽的生物活性突变体。如果NsG33多肽或片段能显示天然NsG33的生物活性，那么它就具有NsG33的生物活性。应该理解本发明涉及基本纯化的NsG33。
在受体-结合反应中，NsG33的一种生物活性是指与自然NsG33竞争的能力。
NsG33的另一种生物活性是指结合抗体的能力，这种抗体可以特异识别自然NsG33的一个表位。
通过参考实施例中一个或多个体内外生物学分析测定实验，也可界定具有生物学活性的NsG33突变体。
而其一种优选的生物活性是指在实施例和图9描述的PC12分析测定实验中，可诱导基本上相同反应应答的能力。在此实验中，人全长NsG33编码序列被转导入PC12细胞中(图6)。，PC12细胞中基本上相同反应使产生的神经轴突细胞至少占实施例6中(以人全长NsG33基因转导)所获得的细胞的10％。更优选至少20％、更优选至少30％、更优选至少40％、更优选至少50％、更优选至少60％、更优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％。PC12分析测定实验也可用来研究，相比于对照组实验组存活细胞增加的百分数。实施例6中所获得的细胞中，基本上相同反应使活性至少增加10％(图9)，更优选至少增加20％、更优选至少30％、更优选至少40％、更优选至少50％、更优选至少60％、更优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少90％。NsG33片段或NsG33突变体的生物活性也可能高于自然NsG33的生物活性。其他优先生物活性包括神经保护作用和/或神经发生效应显示详见实施例14和15。
NsG33特定片段包括选自如下的多肽：SEQ ID No 3的AA128-AA293、SEQ ID No 3的AA121-AA293、SEQ ID No 8的AA129-AA294、SEQ ID No 8的AA122-AA294、SEQ ID No 13的AA126-AA291、SEQ ID No 13的AA119-AA291以及所述多肽的突变体，其中所选序列中的任一氨基酸可变化成不同氨基酸，条件是序列中不超过15个氨基酸残基发生这样的改变。这些分离的多肽组成NsG33的C末端肽。优选任一改变的氨基酸选自图3a所示的非保守的，低保守的或高度保守的氨基酸。以ProtFun 2.1预测发现，C末端多肽属于生长因子基因家族(图2)，概率得分8.0。
另一特定多肽选自：SEQ ID No 19、20、21、22、23、和24以及所述多肽的突变体，其中所选序列中的任一氨基酸可变化成不同氨基酸，条件是序列中不超过15个氨基酸残基发生这样的改变。这些分离的多肽组成NsG33的N末端多肽。优选任一改变的氨基酸选自图3a所示的非保守的，低保守的或高度保守的氨基酸。在一个优选实施方案中，不到10个氨基酸发生突变，更优选不到5个氨基酸，更优选1个或2个氨基酸，更优选没氨基酸发生突变。以ProtFun 2.1预测发现，N末端多肽属于生长因子基因家族(图2)，概率得分8.1。
一方面，NsG33特别优选的截短形式选自：
1)SEQ ID No 3的AA30-AA288，以及其一端或两端有天然序列的1到5个额外氨基酸，至多形成SEQ ID No 3的AA25-AA293的多肽；
2)SEQ ID No 13的AA28-AA286，以及其一端或两端有天然序列的1到5个额外氨基酸，至多形成SEQ ID No 13的AA23-AA291的多肽；
3)SEQ ID No 8的AA31-AA289，以及其一端或两端有天然序列的1到5个额外氨基酸，至多形成SEQ ID No 8的AA26-AA294的多肽；
4)所述多肽的突变体，其中所选序列中的任一氨基酸可变化成不同氨基酸，条件是序列中不超过20个氨基酸残基发生这样的改变。
这些NsG33的截短形式构成了一个从首位到末位保守半胱氨酸的核心序列。在一个优选实施例中，不到15个的氨基酸发生突变，更优选不到10个，更优选不到5个(如1到2个氨基酸)氨基酸发生突变，更优选无氨基酸发生突变。
一方面，NsG33特定截短形式选自：
1)SEQ ID No 3的AA171-AA288，以及其一端或两端有天然序列的1到5个额外氨基酸，至多形成SEQ ID No 3的AA165-AA288的多肽；
2)SEQ ID No 13的AA169-AA286，以及其一端或两端有天然序列的1到5个额外氨基酸，至多形成SEQ ID No 13的AA164-AA291的多肽；
3)SEQ ID No 8的AA172-AA289，以及其一端或两端有天然序列的1到5个额外氨基酸，即至多形成SEQ ID No 8的AA167-AA294的多肽；
4)所述多肽的突变体，其中所选序列中指定的任一氨基酸可变化成不同氨基酸，条件是序列中不超过10个氨基酸残基发生这样的改变。
这些NsG33的截短形式在C末端肽构成了一个从首位到末位保守半胱氨酸的核心序列。在一个优选实施方案中，不到10个的氨基酸发生突变，更优选不到5个，更优选不到1或2个氨基酸发生突变，更优选无氨基酸发生突变。
另一方面，NsG33特定截短形式选自：
1)SEQ ID No 3的AA30-AA118，以及其一端或两端有来自天然序列的1到5个额外的氨基酸，至多构成SEQ ID No 3的AA25-AA123的多肽；
2)SEQ ID No 13的AA28-AA116，以及其一端或两端有来自天然序列的1到5个额外的氨基酸，至多构成SEQ ID No 13的AA23-AA121的多肽；
3)SEQ ID No 8的AA31-AA119，以及其一端或两端有来自天然序列的1到5个额外的氨基酸，至多构成SEQ ID No 8的AA26-AA124的多肽；
4)所述多肽的突变体，其中所选序列中的任一氨基酸可变化成不同氨基酸，条件是序列中不超过10个氨基酸残基发生这样的改变。
这些NsG33的截短形式在N末端NsG33肽中构成了一个从首位到第4位保守半胱氨酸的核心序列。在一个优选实施方案中，更优选不到10个的氨基酸发生突变，更优选不到5个、1或2个氨基酸发生突变，更优选无氨基酸发生突变。
NsG33突变体能够以几种方式区别于天然NsG33，如以氨基酸序列方式，或以不涉及序列的方式，或两者兼有之。当天然NsG33中一个或多个氨基酸被不同的天然氨基酸、氨基酸衍生物、非天然氨基酸取代时，就会产生氨基酸序列突变体(“序列突变体”)。尤其优选的突变体包括天然NsG33，或天然NsG33的具有生物活性的片段，突变体序列不同于野生型序列，常发生一个或多个保守和/或半保守氨基酸的取代，这种取代对蛋白或多肽的二级和三级结构以及疏水性影响极小。突变体还可以一个或多个非保守氨基酸取代、删除、插入等方式区别于天然NsG33，这些方式不会消除NsG33的生物活性。图3a或图3b中的Clustal W比对能被用于预测哪些氨基酸残基会被取代，并且这种取代不会实质性地影响蛋白的生物学活性。
根据本发明，在如下基团(Clustal W强保守基团)内发生的取代被认为是保守取代：-STA、NEQK、NHQK、NDEQ、QHRK、MILV、MILF、HY、FYW。
在如下基团(Clustal W弱保守基团)内发生的取代被认为是半保守取代，-CSA、ATV、SAG、STNK、STPA、SGND、SNDEQK、NDEQHK、NEQHRK、VLIM、HFY。
本发明所述其它突变体是通过修饰形成的，这种修饰可增加肽的稳定性。例如，这些突变体在肽序列中可包括一个或多个非肽键(以非肽键取代肽键)。它也包括与天然L氨基酸不同的氨基酸残基，如D-氨基酸、或非天然氨基酸、或合成氨基酸如β或γ-氨基酸和环状突变体。D-氨基酸代替L-氨基酸组成多肽可以增加其对蛋白酶的抵抗力，见US 5,219,990，剪接突变体也特别包括在本发明中。
当不能明确预测一种置换会导致什么结果时，可根据本专利公开的方法对衍生物进行分析，以确定其是否存在或丧失了生物活性。通常在PC-12和/或hNS1和/或鼠纹状体等培养细胞中进行分析。
在一个实施方案中，多肽是选自SEQ ID No.3、4、5、8、9、10、13、14、15、19、20、21、22、23和24序列的天然等位基因突变体。该多肽包括核酸序列翻译而来的氨基酸序列，所述核酸序列与SEQ ID No 1、2、6、7、11、12、16、17和18的核酸序列有单个核苷酸不同。
在一个实施方案中，多肽突变体包括多肽，其中所选序列的任意氨基酸发生保守取代。
信号肽可被一种异源信号肽所代替。
在本发明一个实施方案中，突变体包括蛋白和多肽，所述蛋白和多肽的氨基酸序列与人、小鼠或大鼠的NsG33(SEQ ID NO：5、10、和15)至少具有60％同源性。更优选序列同一性至少为65％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少98％。
在本发明一个实施方案中，优选的突变体包括蛋白和多肽，所述蛋白和多肽的氨基酸序列与含有SEQ ID NO：4，9或14序列的多肽至少具有60％同源性。更优选序列同一性至少为65％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少98％。SEQ ID NO：4，9和14对应于切除信号肽后的成熟蛋白，没有任何前肽切割位点。
在本发明一个实施方案中，突变体包括蛋白和多肽，所述蛋白和多肽的氨基酸序列与含有SEQ ID NO：3，8或13序列的多肽至少具有60％同源性。更优选序列同一性至少为65％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少98％。
在本发明一个实施方案中，突变体包括蛋白和多肽，所述蛋白和多肽的氨基酸序列与含有选自SEQ ID NO：19，20，21，22，23和24的序列组成的蛋白至少具有70％序列同一性。更优选序列同一性至少为75％，更优选至少80％，更优选至少95％，更优选至少98％，更优选至少含有选自SEQID NO：19，20，21，22，23和24的序列的蛋白。
在本发明一个实施方案中，突变体包括蛋白和多肽，所述蛋白和多肽的氨基酸序列与含有SEQ ID NO：19，20，或21序列的多肽至少具有60％同源性。更优选序列同一性至少为65％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少98％。
在本发明一个实施方案中，突变体包括蛋白和多肽，所述蛋白和多肽的氨基酸序列与含有SEQ ID NO：22，23或24序列的多肽至少具有60％同源性。更优选序列同一性至少为65％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少98％。
在一个优选实施方案中，NsG33突变体序列同一性是通过参考人NsG33多肽(SEQ ID No 3、4、5、19或22)来确定的。
用来确定序列同源性的最短比较序列一般至少有8个氨基酸残基，通常至少有12个氨基酸残基。本发明是在至少有25个氨基酸重叠的范围内来计算序列同一性百分数的，更优选的重叠氨基酸数至少是30，更优选至少35，更优选至少40，更优选至少45，更优选至少50，更优选至少55，更优选至少60，如至少70，如至少80，如至少90，如至少100，如至少110，如至少120，如至少130，如至少150，在默认设置下以BLASTP确定重叠范围。
在一个实施方案中，序列同一性百分数通过总体序列比对(GAP或Align)来计算，将突变体和SEQ ID序列进行比对，计算相同的氨基酸残基数，并除以SEQ ID NO的序列长度，便可计算出同源性百分数。
在一个实施方案中，NsG33突变体包括SEQ ID No 3、4、5、8、9、10、13、14和15序列的天然等位基因突变体。所说等位基因突变序列可以是由与选自SEQ ID No 1、2、6、7、11、12、16、17、和18的核酸序列有一个单核苷酸不同的核酸序列翻译而来的氨基酸序列。
在一个实施方案中，突变体包括蛋白和多肽，所述蛋白和多肽的氨基酸序列与序列SEQ ID NO：3至少具有60％序列同一性，更优选序列同一性至少为65％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少98％。
在一个实施方案中，突变体包括蛋白和多肽，所述蛋白和多肽的氨基酸序列与序列SEQ ID NO：4至少具有60％序列同一性，更优选序列同一性至少为65％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少98％。
在一个实施方案中，突变体包括蛋白和多肽，所述蛋白和多肽的氨基酸序列与序列SEQ ID NO：5至少具有60％序列同一性，更优选序列同一性至少为65％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少98％。
在一个实施方案中，突变体包括蛋白和多肽，所述蛋白和多肽的氨基酸序列与序列SEQ ID NO：8至少具有60％序列同一性，更优选序列同一性至少为65％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少98％。
在一个实施方案中，突变体包括蛋白和多肽，所述蛋白和多肽的氨基酸序列与序列SEQ ID NO：9至少具有60％序列同一性，更优选序列同一性至少为65％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少98％。
在一个实施方案中，突变体包括蛋白和多肽，所述蛋白和多肽的氨基酸序列与序列SEQ ID NO：10至少具有60％序列同一性，更优选序列同一性至少为65％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少98％。
在一个实施方案中，突变体包括蛋白和多肽，所述蛋白和多肽的氨基酸序列与序列SEQ ID NO：13至少具有60％序列同一性，更优选序列同一性至少为65％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少98％。
在一个实施方案中，突变体包括蛋白和多肽，所述蛋白和多肽的氨基酸序列与序列SEQ ID NO：14至少具有60％序列同一性，更优选序列同一性至少为65％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少98％。
在一个实施方案中，突变体包括蛋白和多肽，所述蛋白和多肽的氨基酸序列与序列SEQ ID NO：15至少具有60％序列同一性，更优选序列同一性至少为65％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少98％。
在一个实施方案中，突变体包括蛋白和多肽，所述蛋白和多肽的氨基酸序列与序列SEQ ID NO：19至少具有60％序列同一性，更优选序列同一性至少为65％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少98％。
在一个实施方案中，突变体包括蛋白和多肽，所述蛋白和多肽的氨基酸序列与序列SEQ ID NO：20至少具有60％序列同一性，更优选序列同一性至少为65％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少98％。
在一个实施方案中，突变体包括蛋白和多肽，所述蛋白和多肽的氨基酸序列与序列SEQ ID NO：21至少具有60％序列同一性，更优选序列同一性至少为65％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少98％。
在一个实施方案中，突变体包括蛋白和多肽，所述蛋白和多肽的氨基酸序列与序列SEQ ID NO：22至少具有60％序列同一性，更优选序列同一性至少为65％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少98％。
在一个实施方案中，突变体包括蛋白和多肽，所述蛋白和多肽的氨基酸序列与序列SEQ ID NO：23至少具有60％序列同一性，更优选序列同一性至少为65％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少98％。
在一个实施方案中，突变体包括蛋白和多肽，所述蛋白和多肽的氨基酸序列与序列SEQ ID NO：24至少具有60％序列同一性，更优选序列同一性至少为65％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少98％。
在一个实施方案中，突变体包括蛋白和多肽，所述蛋白和多肽的氨基酸序列与序列SEQ ID NO：26至少具有60％序列同一性，更优选序列同一性至少为65％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少98％。
在一个实施方案中，一个NsG33突变体在相应位置包括有如图3a中所示的，用(*)标记的完全保守氨基酸残基，更优选NsG33突变体在相应位置也包括有如图3a中所示的，用(：)标记的强保守氨基酸残基(强保守基团包括：STA、NEQK、NHQK、NEDQ、QHRK、MILV、MILF、HY FYW)；更优选NsG33突变体在相应位置同样也包括有如图3a中所示的，以(.)标记的弱保守氨基酸残基(弱保守基团包括：CSA、ATV、SAG、STNK、STPA、SGND、SNDEQK、NDEQHK、NEQHK、NEQHRK、VLIM、HFY)，尤其值得注意的是，保守半胱氨酸必须定位在NsG33突变体的相应位置(见图5)。
非序列修饰可包括天然NsG33体内外部分化学衍生，乙酰化、甲基化、磷酸化、羧基化、PEG-烃基化或糖基化。它可置换蛋白的取代基团，也可取代功能基团，所述功能基团与带有相似特征基团的蛋白结合。这种修饰不会改变其原始序列。它们最初是保守的，即这些取代基团具有与原始基团相同的大小、形状、疏水性及电荷。
存在于特定多肽内的一些氨基酸，包括末端氨基酸，可以通过如糖基化和其他翻译后修饰或现有的化学修饰技术等自然加工处理进行修饰。本发明涉及的多肽内的修饰方法，以少数几个例子说明：乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共价连接、亚铁红素的共价连接、多聚核苷酸或其衍生物的共价连接、质脂或其衍生物的共价连接、磷酯酸肌醇的共价连接、交联、环化、二硫键的形成、脱甲基作用、共价交联形成、半胱氨酸形成、焦谷氨酸形成、甲酰化、r-羧化、糖化、糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘化作用、甲基化、十四烷酰化、氧化、蛋白酶解加工、磷酸化、异戊烯化、消旋作用、氧硒基化、硫酸化、转运RNA介导氨基酸添加至蛋白如精氨酰化以及遍在蛋白化。
这些修饰技术为本专业领域技术人员所熟知，并且在科学文献中有大量的细节描述。几个比较普通的修饰，如：糖基化、脂质化、硫酸化、谷氨酸残基r-羧化、羟基化、ADP-核糖基化，在大多数教材中均有描述，详见Creighton，Proteins-Structure and Molecular Properties，2nd Ed.，W.H.Freeman and Company，New York，1993。关于该主题很多细节被评述，例如由下列文献提供：Wold、F.，in Posttranslational Covalent Modification ofProteins，B.C.Johnson，Ed.，Academic Press，New York，pp 1-12，1983；Seifter等人，Meth.Enzymol.182：626-646，1990 and Rattan et al.，Protein Synthesis：Posttranslational Modifications and Aging，Ann.N.Y.Acad.Sci.663：48-62，1992。
此外，蛋白可含有蛋白标签，以方便允许随后的纯化和肽链内切酶任选对标签的切除。所述标签还可包括蛋白酶切割位点，以方便随后的标签切除。非限制性实例是亲和标签，包括polyhis标签、GST标签、HA标签、Flag标签、C-myc标签、HSV标签、V5标签、麦芽糖结合蛋白标签、纤维素结合结构域标签。对于制备和纯化优选的是polyhis标签。优选地，该标签位于蛋白C-末端。
为了增加重组产物在其他哺乳动物细胞类型中的蛋白分泌，NsG33的天然信号序列可被置换。
令人高兴的是，已知并且如上所述，多肽不总是完全线性化的。例如，多肽可遍在蛋白化以形成分枝状，翻译后修饰以形成有分枝或无分枝环状结构，包括自然加工处理和非自然的人工加工处理。在本发明的范围内，环状、分枝和分枝环状多肽可以通过非翻译天然加工方式和完全合成的方法合成。
修饰能够发生在多肽的任何位置，包括多肽主链、氨基酸侧链和氨基或羧基端。实际上，本发明中，通过共价修饰来封闭氨基或羧基基团，或同时封闭两个基团，在自然发生过程中是很普遍的，并且合成多肽和这种修饰也存在于本发明的多肽中。例如，大肠杆菌表达的多肽，其氨基末端残基在被蛋白酶解加工处理之前，几乎都变为N-甲酰蛋氨酸。
发生在多肽中的修饰通常是一种功能修饰。例如，对于在宿主细胞中表达克隆基因的多肽，修饰的性质和程度很大程度上取决于宿主细胞翻译后修饰能力和存在于多肽氨基酸序列中的修饰信号。例如，糖基化通常不发生在如大肠杆菌等细菌宿主中。因此，需要糖基化时，多肽应该在糖基化宿主中表达，通常为真核细胞。昆虫细胞一样也能进行翻译后糖基化修饰，为此，昆虫细胞表达系统已被发展为高效表达具有糖基化天然模式的哺乳动物蛋白的表达系统。除此之外，可考虑应用其它修饰方法。
令人兴奋的是，在一个特定多肽的几个位点，同一类型修饰可显示出相同或不同程度。同样，一个特定多肽可包括多种类型修饰。
一般而言，术语多肽包括所有的修饰，特别是那些通过在宿主细胞中表达多聚核苷酸而合成多肽。
本发明还涉及一些试剂(agent)，其可特异结合本发明所述蛋白及其片段。这些试剂包括Ig融合蛋白和抗体(包括单链抗体，双链抗体，Fab片段，以及其他天然抗体、人源化抗体、primatize或嵌合抗体)。该类试剂的详细描述可参考WO 95/16709，引入此处作为参考。
抗体是指完整的分子，也指片段，如能结合表位决定簇的Fab、F(ab′)、和FV片段。制备结合NsG33多肽的抗体时，可以完整的多肽或含有目的小肽的片段作为免疫原。用于免疫动物的多肽或寡肽，来自RNA翻译合成或人工化学合成，如果需要并能与一种载体蛋白偶联。通常使用的，与肽化学偶联的载体包括牛血清白蛋白和甲状腺球蛋白以及匙孔贝血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin)。偶联的多肽然后被用于免疫动物(如小鼠，大鼠或兔子)。
人源化抗体是这样一种抗体分子，为了更接近类似于人类抗体，其非抗原结合区的氨基酸已被置换，但仍旧保留原始结合能力。人源化抗体可被用于治疗病症，可望用于限制或封闭NsG33的活性。
本发明还涉及抗体与选自如下的偶联物免疫偶联：细胞毒素如化疗药物、毒素、或一种放射性同位素；一些特异性结合对如卵白素、或抗生物素蛋白链菌素、或一种抗原；或能产生可检测物的酶。这些免疫交联物可被用于靶向结合至表达NsG33受体的细胞。
针对NsG33的特异性抗体还可用于免疫测定以定量分析给定的抗体具有特异性的物质。NsG33的特异性抗体还可被结合到固相支持物上，如珠状或盘状的固相支持物，用来从溶液中除去其配基，或用于纯化蛋白，或用于从溶液中洁净(clearing)蛋白。这些技术中的任何一项都为免疫学专业技术人员所熟知。
本发明还涉及NsG33融合蛋白。NsG33融合蛋白可被用于对表达NsG33受体的组织进行分析，或用于免疫组化方法或用于NsG33抗体的上述制备方法。含有NsG33的融合蛋白能用于特异性靶向医药治疗的表达NsG33受体的细胞。
II NsG33核酸序列
本发明提供了编码NsG33的基因组DNA和cDNA的医药用途，包括例如人基因组核苷酸序列(SEQ ID NO.1)、小鼠和大鼠基因组序列(SEQ IDNo.6和11)，人、小鼠、大鼠NsG33cDNA核苷酸序列(SEQ ID NO 2、7和12，)，无信号肽的NsG33编码序列(SEQ ID No 2的187-996核苷酸，SEQID No.7的74-883核苷酸，SEQ ID No.12的64-873核苷酸)，编码人、小鼠、大鼠来源的NsG33N末端的序列(SEQ ID NO 16、SEQ ID No.17和SEQID No.18)。本发明还描述了编码全长小鼠NsG33的cDNA序列(SEQ ID No.25)。
以上序列的突变体也包括在本发明范围内。
本发明涉及一种分离的医药用途的核酸分子，包括编码多肽的核酸序列，或编码序列的互补序列，所述多肽包括选自如下的氨基酸序列：
a)选自SEQ ID No.3、4、5、8、9、10、13、14、15、19、20、21、22、23和24的氨基酸序列；
b)选自SEQ ID No.3、4、5、8、9、10、13、14、15、19、20、21、22、23和24的氨基酸序列突变体，其中突变体与所述SEQ ID No至少有70％序列同一性；和
c)含a)至b)中的任何的至少50个连续氨基酸的生物活性片段。
核酸分子可包括自然发生等位基因突变的核酸突变体序列。
本发明描述的核酸分子可编码多肽突变体，其中所述突变体多肽含有自然发生多肽突变体的多肽序列。
在一个实施方案中，核酸分子与选自SEQ ID No.1、2、6、7、11、12、16、17和18的核酸序列仅有单个核苷酸不同。
优选编码的多肽与选自SEQ ID No.5、10、和15的序列至少有60％序列同一性，更优选同一性至少为65％，更优选至少70％序列同一性，更优选至少75％序列同一性，更优选至少80％序列同一性，更优选至少85％序列同一性，更优选至少90％序列同一性，更优选至少95％序列同一性，更优选至少98％序列同一性，更优选其中多肽包括选自所述SEQ ID No.s的序列。
在另一个优选实施方案中，编码的多肽与选自SEQ ID No.3和4的序列至少有60％序列同一性，更优选同一性至少为65％，更优选至少70％序列同一性，更优选至少75％序列同一性，更优选至少80％序列同一性，更优选至少85％序列同一性，更优选至少90％序列同一性，更优选至少95％序列同一性，更优选至少98％序列同一性，更优选其中多肽包括选自所述SEQ ID No.s的序列。所述序列构成人NsG33。
在一个优选实施方案中，编码的多肽与选自SEQ ID No.19和22的序列至少有60％序列同一性，更优选至少为65％序列同一性，更优选至少70％序列同一性，更优选75％序列同一性，更优选至少80％序列同一性，更优选至少85％序列同一性，更优选至少90％序列同一性，更优选至少95％序列同一性，更优选至少98％序列同一性，更优选其中多肽包括选自所述SEQ ID No.s的序列。所述序列组成人NsG33。
在另一个优选实施方案中，编码的多肽与选自SEQ ID No.5的序列至少有60％序列同一性，更优选同源性至少为65％序列同一性，更优选至少70％序列同一性，更优选至少75％序列同一性，更优选至少80％序列同一性，更优选至少85％序列同一性，更优选至少90％序列同一性，更优选至少95％序列同一性，更优选至少98％序列同一性，更优选其中多肽包括选自所述SEQ ID No.s的序列。所述序列组成人N末端NsG33肽。
在另一个优选实施方案中，编码的多肽与选自SEQ ID No.4，9和14的序列至少有60％序列同一性，更优选至少为65％序列同一性，更优选至少70％序列同一性，更优选至少75％序列同一性，更优选至少80％序列同一性，更优选至少85％序列同一性，更优选至少90％序列同一性，更优选至少95％序列同一性，更优选至少98％序列同一性，更优选其中多肽包括选自所述SEQ ID No.s的序列。所述序列组成无信号肽的人NsG33序列。
在一个优选实施方案中，编码的多肽与选自SEQ ID No.3，8和13的序列至少有70％序列同一性，更优选至少为75％序列同一性，更优选至少80％序列同一性，更优选至少95％序列同一性，更优选至少98％序列同一性，更优选其中多肽包括选自SEQ ID No.3，8和13的序列。
在一个优选实施方案中，编码的多肽与选自SEQ ID No.19、20、21、22、23、和24的序列至少有70％序列同一性，更优选至少为75％序列同一性，更优选至少80％序列同一性，更优选至少95％序列同一性，更优选至少98％序列同一性，更优选其中多肽包括选自包括SEQ ID No.19、20、21、22、23、和24的序列。
在另一个实施方案中，编码的多肽与选自SEQ ID No.3的序列至少有70％序列同一性，更优选至少为75％序列同一性，更优选至少80％序列同一性，更优选至少95％序列同一性，更优选至少98％序列同一性，更优选所述多肽包括SEQ ID No.5的序列。
在一个优选实施方案中，编码的多肽与选自SEQ ID No.4的序列至少有70％序列同一性，更优选至少为75％序列同一性，更优选至少80％序列同一性，更优选至少95％序列同一性，更优选至少98％序列同一性，更优选所述多肽包括SEQ ID No.4的序列。
在另一个优选实施方案中，编码的多肽与选自SEQ ID No.19的序列至少有70％序列同一性，更优选至少为75％序列同一性，更优选至少80％序列同一性，更优选至少95％序列同一性，更优选至少98％序列同一性，更优选所述多肽包括SEQ ID No.19的序列。
在另一个优选实施方案中，编码的多肽与选自SEQ ID No.22的序列至少有70％序列同一性，更优选至少为75％序列同一性，更优选至少80％序列同一性，更优选至少95％序列同一性，更优选至少98％序列同一性，更优选所述多肽包括SEQ ID No.22的序列。
一方面，核酸分子包括选自如下的核苷酸序列：
a)选自SEQ ID No.1、2、6、7、11、12、16、17和18的核苷酸序列；
b)与选自SEQ ID No.1、2、6、7、11、12、16、17和18的核苷酸序列至少有70％序列同一性的核苷酸序列；
c)含选自SEQ ID No.1、2、6、7、11、12、16、17和18的150个连续核苷酸的核酸序列；
c)能与包括选自SEQ ID No.1、2、6、7、11、12、16、17和18的序列的核酸在高度严谨条件下杂交的互补核酸分子；
d)上述任一核酸分子的互补核酸序列。
SEQ ID No 16、17和18是分别编码人，小鼠和大鼠NsG33多肽的C末端的序列。为了在真核生物表达系统中重组表达，这些序列最好连接合适的信号肽编码序列，以确保表达的NsG33多肽从细胞中分泌出来。
在一个优选实施方案中，本发明的分离多核苷酸与选自SEQ ID No.2、7、12、16、17、和18的多核苷酸序列至少有50％序列同一性，更优选同一性至少为60％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少98％的序列同一性。
在一个优选实施方案中，本发明的分离多核苷酸与选自SEQ ID No.16、17和18的多核苷酸序列至少有50％序列同一性，更优选同一性至少为60％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少98％。
在一个优选实施方案中，本发明的分离多核苷酸与选自SEQ ID No.2和6的多核苷酸序列至少有50％序列同一性，更优选同一性至少为60％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少98％。
在一个优选实施方案中，本发明的分离多核苷酸与选自SEQ ID No.2的187-996核苷酸，SEQ ID No.7的74-883核苷酸和SEQ ID No.12的64-873核苷酸至少有50％序列同一性，更优选同一性至少为60％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少98％。这些核酸序列片段编码无信号肽的NsG33。
在一个优选实施方案中，本发明的分离多核苷酸与选自SEQ ID No.1的多核苷酸序列至少有60％序列同一性，更优选同一性至少为65％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少98％。
在一个优选实施方案中，本发明的分离多核苷酸与选自SEQ ID No：2的多核苷酸序列至少有50％序列同一性，更优选同源性至少为60％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少98％。
在一个优选实施方案中，本发明的分离多核苷酸与以SEQ ID No.16存在的多核苷酸序列至少有50％序列同一性，更优选同一性至少为60％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少98％。
在一个实施方案中，本发明的分离多核苷酸与以SEQ ID No.6存在的多核苷酸序列至少有50％序列同一性，更优选同一性至少为60％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少98％。
在一个优选实施方案中，本发明的分离多核苷酸与以SEQ ID No.7存在的多核苷酸序列至少有50％序列同一性，更优选同一性至少为60％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少98％序列同一性。
在一个优选实施方案中，本发明的分离多核苷酸与以SEQ ID No.17存在的多核苷酸序列至少有50％序列同一性，更优选同一性至少为60％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少98％序列同一性。
在一个优选实施方案中，本发明的分离多核苷酸与以SEQ ID No.11存在的多核苷酸序列至少有50％序列同一性，更优选同一性至少为60％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少98％序列同一性。
在一个优选实施方案中，本发明的分离多核苷酸与以SEQ ID No.12存在的多核苷酸序列至少有50％序列同一性，更优选同一性至少为60％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少98％序列同一性。
在一个优选实施方案中，本发明的分离多核苷酸与以SEQ ID No.18存在的多核苷酸序列至少有50％序列同一性，更优选同一性至少为60％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少98％序列同一性。
在一个优选实施方案中，本发明的分离多核苷酸与选自以SEQ ID No.25存在的多核苷酸序列至少有50％序列同一性，更优选同一性至少为60％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少98％序列同一性。
一组优选分离多核苷酸，包括SEQ ID No 1、2和16，其为人NsG33多核苷酸。另一组优选分离多核苷酸，包括SEQ ID No 2、7和12，其代表NsG33 cDNA序列。一般说来cDNA序列比基因组序列短得多，更容易插入适当的表达载体，并在体外或体内转导/转染产品细胞或人体细胞。
此外，本发明所述核苷酸序列还包括所述序列的衍生序列。本发明还涉及载体，脂质体及其它载体物质，这些物质能够包裹这些所述序列及其衍生序列。本发明还包括NsG33 cDNA转录、翻译的蛋白，优选是人NsG33cDNA，包括但不仅限于人NsG33及其衍生物和突变体。
在另一个实施方案中，本发明还应用本发明的核算和蛋白设计探针分离另外的基因，这些基因编码具有本发明的NsG33蛋白的结构或功能特征的蛋白。探针碱基对长度不一。例如，核酸探针可在约10-约150个碱基对之间。
有时核酸探针比约150碱基对要长，实验的方法在下列文献详细报道：Ausubel等人，″Current Protocols in Molecular Biology″、J.Wiley(ed.)(1999)，该文献提供了完整的教导，在此引入作为参考。
设计寡核苷酸探针(这里也称核苷酸)最好应该考虑以下这些参数：
i)如果可能，设计的序列区应具有最少的不确定的碱基；并且
ii)应设计成计算Tm温度约为80℃(假定每一个A或T的Tm温度为2℃，每一个G和C的Tm温度为4℃)。
寡核苷酸探针优选应标记以方便杂交结果的检测。通常以T4多核苷酸激酶标记技术将寡核苷酸标记上γ-32P ATP(比放射活性6000Ci/mmole)。也可应用其它标记技术。未标记上的寡核苷酸应优选以凝胶过滤层析或其它建立的方法去除。通过闪烁计数器对探针的放射活性进行定量检测。优选实验结果的探针比活性应为约4×106dpm/pmole。转化有全长克隆的细菌培养物应优选被解冻，并取100μL菌液(stock)接种到25ml含100pg/ml氨苄青霉素的无菌L肉汤培养基中。
在37℃将细菌培养物培养到饱和状态，然后优选以新鲜L肉汤培养基进行稀释。取这些稀释菌液的等分样品接种到含100pg/ml氨苄青霉素，1.5％琼脂的L肉汤固体细菌培养基的150mm的培养皿上，37℃培养过夜，以计算能产生约5000个克隆的稀释度及体积。也可用能获得清楚的、好的分离克隆的已知方法进行该实验。
应用标准的克隆杂交操作程序将克隆转移到硝酸纤维素滤膜上，并裂解、变性和烘焙。高度严谨地(本文也指“高度严谨”)杂交条件是指至少严谨如1×SSC，在约65℃，或1×SSC和50％甲酰胺，在约42℃。“中度严谨”杂交条件是指4×SSC，在约65℃、或4×SSC和50％甲酰胺，在约42℃。“低度严谨”条件是指48SSC，在约50℃，或6×SSC和50％甲酰胺，在40℃。
滤膜然后与含有0.5％SDS、100g/ml酵母RNA和10mMEDTA(约10mL/150mm滤膜)的6×SSC溶液(20×贮存液：175.3g NaCl/升、88.2g Nacitrate/升、NaOH调pH 7.0)在65℃轻轻晃动孵育1小时。优选然后将寡核苷酸探针以浓度高于或等于1×106dpm/mL的量加入到杂交混合液中。然后优选滤膜在65℃轻轻晃动孵育过夜。然后优选滤膜在室温以500mL 2×SSC/0.5％SDS溶液静止漂洗，接着优选在室温以500mL 2×SSC/0.1％SDS溶液轻轻振荡漂洗15分钟。再以0.1×SSC/0.5％SDS溶液在65℃进行第三次漂洗30分钟到1小时。然后将滤膜干燥并进行放射自显影足够长时间，在X-射线感光胶片上可见阳性克隆。也可用其它已知的杂交技术进行该实验。根据实验结果将阳性克隆挑出，培养并用标准操作规程提取质粒DNA。以限制性酶切分析，杂交分析，或DNA测序进行克隆鉴定。
或者，核苷酸探针与同源DNA或RNA序列之间杂交的合适的实验条件如下：含有DNA片段或RNA的滤膜在5x SSC[氯化钠/柠檬酸钠；cf.Sambrook等人；Molecular Cloning：A Laboratory Manual，、Cold SpringHarbor Lab.，Cold Spring Harbor，NY 1989]溶液中预浸处理10分钟，然后在5x SSC、5x Denhardt’s溶液[cf.Sambrook et al.；Op cit.]、0.5％SDS和100μg/ml超声波变性的鲑精DNA[cf.Sambrook et al.；Op cit.]组成的溶液中预杂交，接着在含有10ng/ml随机引物法[Feinberg A P & Vogelstein B； Anal. Biochem.1983 1326-13]32P-dCTP标记的(特异活性＞1×109cpm/μg)探针溶液中45℃杂交12小时。然后滤膜以0.1x SSC、0.5％SDS溶液，在至少60℃(中度严谨条件)，优选在至少65℃(中度/高度严谨条件)，更优选是70℃(高度严谨条件)，甚至75℃(极高度严谨条件)漂洗二次，每次30分钟。与寡核苷酸探针杂交的分子可在X-射线感光胶片上检测到。
在另一个实施方案中，本发明涉及一段能与NsG33核酸杂交的核酸序列(如DNA，RNA)。具体而言，是能与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No 16、SEQ ID No 17、或SEQ ID No 18核酸序列在如上所述的高度，中度或低度严谨条件下杂交的核酸。
在另一个实施方案中，本发明涉及NsG33核酸的互补序列。具体而言，是与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6、SEQ ID No.7、SEQ IDNo 11、SEQ ID NO 12、SEQ ID No 16、SEQ ID No 17、和SEQ ID No 18互补的序列。
在另一个实施方案中，本发明涉及NsG33核酸DNA的RNA副本。具体而言，是SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：12、SEQ ID No 16、SEQ ID No 17和SEQ ID No 18的RNA副本。
为提高在选择的宿主细胞(包括但不仅限于大肠杆菌，酵母类，中国仓鼠，幼仓鼠，昆虫和真菌细胞)的表达水平，对核酸分子进行了密码子优化。
用本领域的诱变技术可构建突变体核酸。可以用小鼠，大鼠或猩猩的编码序列改组人的编码序列的方法。特别地，改组突变体是在SEQ ID No 2的一方面与SEQ ID No 7和/或SEQ ID No 12的另一方面之间。也包括在SEQID No 7和12之间的改组突变体。
III NsG33多肽、多核苷酸及NsG33分泌细胞用于治疗神经系统疾病的用途
在一个实施方案中，天然型，突变型NsG33，及包括NsG33的片段和/或融合蛋白被用于治疗哺乳动物神经系统病症。NsG33可用于刺激神经细胞生长，包括增殖、神经功能、神经再生、神经分化、神经迁移，和/或在神经细胞丧失或损伤的疾病状态下的神经存活。
在一个实施方案中，本发明的多核苷酸和/或多肽也可用于治疗病症或疾病，其中希望细胞生长，包括增殖、分化、功能、存活和/或再生等。本发明多肽可以经由如注射、植入或摄取药物组合物的方式用于治疗与NsG33多肽相关的病理过程。上述应用得到多方面证据的支持：首先，生物信息学分析显示NsG33为一种分泌性的生长因子；NsG33能够避免神经细胞凋亡(实施例6)的事实；人神经祖细胞分化测定和鼠纹状体原代培养细胞中NsG33能够增加神经元细胞的百分比的事实；NsG33优先表达于神经系统的事实，包括眼睛(图4)。NsG33的抗凋亡作用使其成为治疗包括凋亡性细胞死亡在内的神经系统疾病的候选蛋白/基因。这些疾病包括中风、创伤和神经变性疾病。NsG33的神经保护和/或神经形成作用支持其治疗由于神经元丧失、功能障碍或神经元退化或其过程引起的疾病的用途。
NsG33可作用于神经系统的一系列不同类型的细胞。在本发明的上下文中，神经系统包括中枢神经系统、外周神经系统、眼睛和耳蜗前庭复合体。
在一个实施方案中，NsG33多肽可作用于神经元，它包括但不局限于运动神经元和感觉神经元。
在另一个实施方案中，NsG33多肽的治疗作用可经作用于神经胶质细胞，如少突胶质细胞和/或星形细胞而发挥的。通过作用于神经胶质细胞，NsG33多肽可能参与髓鞘的形成，以及维持神经元的功能与生存。
在另一个实施方案中，NsG33多肽可作用于感觉细胞，它包括但不局限于视网膜神经节细胞、视细胞、支持组织如视网膜上皮细胞和耳内毛细胞等。
在又一个实施方案中，NsG33可作用于干细胞和下游前体细胞，它包括但不局限于神经元前体细胞和神经胶质前体细胞。NsG33多肽能够作用于干细胞和/或神经元或神经胶质前体细胞，引起细胞生长包括增殖，引起分化和/或迁移。可以通过体内、体外基因治疗或将蛋白给药于干细胞所在的位置进行干细胞治疗。NsG33在人神经祖细胞系中显示出的效应为这种治疗方法提供了支持。
障碍、疾病或损伤是指神经系统由于外伤、手术、缺血、感染、代谢疾病、营养缺乏、肿瘤或毒性因子，以及遗传或原发性病变等因素造成的损伤。
在本发明方法的一个实施方案中，疾病、障碍或损伤包括脑、脑干，脊髓和/或外周神经系统的损伤，导致病症如中风、外伤性脑损伤(TBI)、脊髓损伤(SCI)、弥散性轴索损伤(DAI)、癫痫、神经病变、周围神经病变和这些症状导致的相关疼痛和其它症状。
在另一个实施方案中，疾病、障碍或损伤包括脑、脑干、脊髓和/或外周神经的退行性过程和/或神经元丧失，例如神经退行性疾病，包括但不限于帕金森病、阿尔兹海默氏病、老年性痴呆、亨廷顿氏病、肌萎缩性(脊髓)侧索硬化(ALS)、多发性硬化症(MS)相关的神经/轴突损伤及相关的症状等。
在另一个实施方案中，疾病、障碍或损伤包括脑、脑干、脊髓和/或外周神经的神经元的机能障碍和/或丧失，例如由代谢性疾病、营养缺乏、中毒性损伤、肿瘤和/或遗传或原发性病症造成的机能障碍和/或丧失，包括但不限于糖尿病、肾功能不全、酒精中毒、化疗、化学试剂、药物滥用、维生素缺乏、感染及其相关症状等。
在另一个实施方案中，疾病、障碍或损伤涉及神经胶质的退行性变或硬化，例如脑、脑干、脊髓和外周神经的少突胶质细胞、星形细胞和Shwann细胞等，包括但不仅限于多发性硬化症(MS)、视神经炎、脑硬化症、传染病后脑脊髓炎、癫痫及其相关症状等。
在另一个实施方案中，疾病、障碍或损伤涉及视网膜、光感受器及其相关神经，包括但不限于色素性视网膜炎、黄斑变性、青光眼及其相关的症状。
在另一个实施方案中，疾病、障碍或损伤涉及感觉上皮及前庭听觉神经复合体相关的神经节，包括但不限于噪声性听力丧失、耳聋、耳鸣、耳炎、迷路炎、遗传性和蜗前庭的萎缩、美尼尔氏病和相关的症状等。
在一个优选的实施方案中，本发明的多肽、核酸、表达载体、胶囊和药物组合物用于治疗帕金森病。上述功能基于以下事实：发现其在中脑中央的黑质和壳核高水平表达(见实施例5)；在人类胚胎发育过程中，表达于中脑(实施例3)；神经祖细胞分化测定实验和原代鼠纹状体培养证实NsG33能够增加神经元细胞的比率；能够抵抗凋亡(实施例6)等。其作用也可通过对多巴胺能神经营养活性检定(实施例11)和体内6-羟基多巴胺注射损毁模型加以证实(实施例12)。
亨廷顿氏病(HD)是一种常染色体显性疾病，导致脑内多种神经元进行性退行性病变，特别是位于尾状核的γ-氨基丁酸能(GABA-ergic)的中间刺状神经元。伴随这种退行性变，皮质谷氨酰胺能的传入神经元同样发生退行性变，两种退行性变结合在一起，共同引起进行性运动障碍和痴呆症的特征性症状。
在一个优选的实施方案中，本发明所述的多肽、核酸、表达载体、胶囊和药物组合物用于治疗亨廷顿氏病。此治疗用途是基于以下事实：发现其在壳核内高表达；以及生物信息学分析结果和NsG33的神经保护/神经形成活性(具体在实施例15中，也包括实施例6和14)。亨廷顿氏病是一种兴奋毒性疾病。对兴奋毒的生物检测在例12中有详细叙述。其它证实NsG33神经保护作用的检测例证包括例如通过原代海马回切片培养生物学检测其对抗NMDA引起的兴奋毒作用(WO 03/004527，实施例5)。
在另一个优选的实施例中，本发明的多肽、核酸、表达载体、胶囊和药物组合物用于治疗周围神经病。此治疗用途是基于以下事实：发现其在背根神经节高表达；以及生物信息学分析结果和NsG33的神经保护/神经形成活性；NsG33的抗凋亡作用(实施例6、14和15)。可以通过实施例9中叙述的背根神经节培养检测证实其上述功能。除了周围神经病，外伤诱导的神经病变也考虑采用本发明的分子进行治疗，这些病变例如物理损伤或病理状态，外周神经如hermited discs和脑部的物理损伤，脊髓的物理损伤，脑损伤相关的中风和神经退行性变相关的神经障碍等引起。除此之外，我们也考虑采用它来治疗化学治疗诱导的神经病变(如由化学治疗药物例如紫杉醇，顺铂等的递送引起)，毒素诱导的神经病变，药物诱导的神经病变，维生素缺乏诱导的神经病变，原发性神经病变和糖尿病性神经病变等。
在另一个优选的实施方案中，本发明的多肽、核酸、表达载体、胶囊和药物组合物用于治疗小脑的障碍、疾病或损伤，包括但不限于感觉性共济失调，多发性硬化症，神经变性的脊髓小脑障碍，遗传性共济失调，小脑萎缩(如橄榄体脑桥小脑萎缩(OPCA)，夏-德综合征(多系统萎缩症))酒精中毒等。此治疗用途是基于以下事实：其在成人小脑高表达，在发育的小鼠小脑呈差异表达；以及生物信息学分析结果和NsG33的神经保护/神经形成活性(实施例6、14和15)。可以通过实施例7和8中叙述的检测方法(在谷氨酸毒性作用和低钾条件下对小脑颗粒细胞的保护作用)证实其上述功能。
在另一个优选的实施方案中，本发明的多肽、核酸、表达载体、胶囊和药物组合物用于治疗肌萎缩性侧索硬化、脊髓性肌萎缩和脊髓损伤(如缺血性和外伤性)。此特异的治疗用途是基于以下事实：其在成人脊髓高表达，在发育的小鼠脊髓呈差异表达；以及生物信息学分析结果和NsG33的神经保护/神经形成活性；NsG33的抗凋亡作用(实施例6、14和15)。可以通过实施例10中叙述的运动神经元检测方法证实其上述功能。
在一个优选的实施方案中，本发明的多肽、核核酸、表达载体、胶囊和药物组合物用于治疗视网膜的疾病、障碍或损伤，包括但不限于色素性视网膜炎、黄斑变性和青光眼。通过生物信息学和实验分析显示NsG33为分泌型生长因子，在视网膜高表达，这为其特异性的治疗作用提供了支持(图4)。
其它生长因子在中枢和外周神经系统，及与视网膜和/或角质层细胞丢失相关的多种眼睛适应症上也有重要的治疗作用。例如，神经生长因子(NGF)是治疗阿尔兹海默氏病，角膜溃疡(US 6,063,757和EP 0 973 872)二者和视网膜病的候选药物；Neublastin(Artemin)是周围神经病变(WO02/078730)和角膜伤口愈合(EP 1 223 966)的候选药物；GDNF是帕金森病，ALS，脊髓损伤和创伤愈合，特别是在角膜中(EP 1 223 966)的候选药物。
这些治疗用途能采用本领域的各种技术水平的体外检测方法(视网膜分离测定，角膜培养)确证。功能也可采用本领域的各种角膜(如家兔的角膜病损)和视网膜损伤(小鼠和大鼠色素性视网膜炎突变模型)的动物模型进行证实。
在另一个实施方案中，神经变性疾病是一种兴奋毒疾病，所述兴奋毒疾病选自由于损伤、心脏骤停或中风引起的缺血、癫痫和损伤。NsG33的神经保护/神经形成活性和抗凋亡作用支持此功能(实施例6、14和15)。上述海马切片培养试验和本发明实施例7的检测均为检测的非限制性实例，可用于证实其生物学功能，预示出其在治疗兴奋毒疾病上的治疗用途。
这里术语“受试体”指任何被给予NsG33多肽、多核苷酸、治疗细胞或生物相容性胶囊的哺乳动物。采用本发明方法进行治疗的受试体包括人，以及非人灵长类动物，绵羊，马，牛、山羊，猪，猫，兔，豚鼠，仓鼠，沙土鼠，大鼠、小鼠以及来源于这些宿主的器官，肿瘤和细胞等。
IV免疫性疾病治疗
在一个实施方案中，NsG33被考虑用于治疗免疫性疾病。这种特殊的作用是基于NsG33与上述专利WO 93/22437中公开的具有免疫功能的蛋白存在结构上的相似性。
根据该实施方案，NsG33可以表现出免疫刺激或免疫抑制活性，包括用于上述各种检测的无限制性活性。NsG33可以在治疗各种免疫缺陷和免疫疾病(包括重度联合免疫缺陷症(SCID))上发挥作用，例如，调节(上调或下调)T和/或B淋巴细胞的生长和增殖，影响NK细胞和其它细胞群的细胞毒活性等。这些免疫缺陷可以是遗传性的，也可由病毒(如HIV)、细菌或真菌感染引起，或者由自身免疫性疾病造成。更具体而言，其中由病毒、细菌、真菌或其它感染引起的感染性疾病可采用NsG33治疗，包括HIV，肝炎病毒、疱疹病毒、分枝杆菌、利什曼原虫(Leishmania spp.)、疟疾感染(Malaria spp.)和各种真菌感染如念珠菌病等。从这一点来说，NsG33也可作为免疫系统增强剂用在如癌症的治疗上。
能够采用NsG33治疗的自身免疫性疾病包括：例如结缔组织病、多发性硬化、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、自身免疫性肺炎、格-巴二氏综合征(Guillain-Barre syndrome)、自身免疫性甲状腺炎、胰岛素依赖性糖尿病、重症肌无力症、移植物抗宿主病和自身免疫性眼疾病等。NsG33蛋白(或其拮抗剂，包括抗体)也可用于治疗过敏反应和病症(如过敏症、血清病、药物反应、食物变态反应、昆虫毒素过敏、肥大细胞增生病、变应性鼻炎、超敏反应性肺炎、荨麻疹、血管性水肿、湿疹、特应性皮炎、过敏性接触性皮炎、多形性红斑、史-约综合征(Stevens-Johnson syndrome)、变应性结膜炎、特应性角膜结膜炎、性病性角膜结膜炎、巨乳头性结膜炎和接触性变态反应)，例如哮喘(特别是过敏性哮喘)或呼吸道疾病。在其它一些需要免疫抑制的病症(包括如器官移植)也可采用NsG33蛋白(或拮抗剂)进行治疗。NsG33多肽或拮抗剂在变态反应时的治疗作用可通过体内的动物模型如蓄积接触增强试验(Lastbom et al.、Toxicology 125：59-66，1998)，皮肤单刺试验(Hoffmann et al.、Allergy 54：446-54，1999)，豚鼠皮肤致敏试验(Vohr et al.、Arch.Toxocol.73：501-9)和鼠局部淋巴结试验(Kimber et al.、J.Toxicol.Environ.Health 53：563-79)等进行评价。
NsG33也可以以多种方式调节免疫应答。对免疫应答的下调是通过抑制或阻断正在发生的免疫应答，或者阻止免疫应答的诱导而实现的。抑制T细胞的应答，诱导特异性的T细胞耐受，或两者一起，能够抑制激活的T淋巴细胞的功能。T细胞应答的免疫抑制总的来说是一个主动的，非抗原特异性的的过程，要求T细胞持续暴露在抑制因子下。而耐受，包括诱导T细胞的无应答性或无反应性，与免疫抑制有着显著区别，区别在于，耐受一般是抗原特异性的，在耐受原停止作用后仍然存在。
一般而言，在缺乏耐受原的情况下，T细胞对再次接触的特异抗原无应答，则证明存在耐受。
下调或者阻止一个或多个抗原功能(不仅包括B细胞抗原功能(如B7))的免疫反应，如阻止活化的T淋巴细胞分泌高水平淋巴毒素，在组织，皮肤和器官移植与移植物抗宿主疾病(GVHD)情况下十分有用，阻断T细胞的功能可以降低组织移植时因免疫反应造成的组织破坏。
在组织移植时，典型的移植物排斥反应源于T细胞将移植物识别为外来物，随后发生免疫反应破坏移植物。给予本发明的药物组合物能够抑制免疫细胞如T细胞等合成细胞因子，从而作为一种免疫抑制剂发挥作用。而且，缺乏共刺激也能导致T细胞无应答，从而在受试体内诱导耐受。采用B淋巴细胞抗原阻断剂诱导长期耐受，可以避免需要多次重复给予这些阻断剂。为了在受试体体内形成充分的免疫抑制或耐受，也必须阻断B淋巴细胞抗原复合物的作用。
可以采用动物模型来评估具体的药物组合物防治器官移植排斥反应或GVHD的效果，从而预测其在人体的有效性。用作评估有效性的系统的实例包括大鼠的同种心脏移植和异种胰岛细胞移植等，两者均已被用于在体内测定CTLA4Ig融合蛋白的免疫抑制效应(Lenschow et al.，Science 257：789-792(1992)和Turka等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA，89：11102-11105(1992))。而且，鼠的移值物抗宿主疾病(GVHD)模型(见Paul ed.、FundamentalImmunology、Raven Press、New York、1989、pp.846-847)也被用于测定本发明的治疗组合物在上述疾病发展过程中的疗效。
阻断抗原的作用对于自身免疫性疾病也有治疗作用。由于抗自身组织的T细胞不恰当的激活，促进涉及疾病病理过程的细胞因子和自身抗体的产生，从而导致许多自身免疫性疾病的发生。避免自身反应性T细胞的活化能够减轻或消除这些疾病的症状。给予能够阻断T细胞激活的药剂可以阻止T细胞的活化，避免参与疾病过程的自身抗体或T细胞来源的细胞因子的产生。而且，阻断剂还能诱导抗原特异性的自身反应性T细胞的耐受，从而使疾病长期缓解。阻断剂预防和减轻自身免疫性疾病的效果可采用人类自身免疫性疾病的一些明确的动物模型进行测定。实例包括鼠实验性自身免疫性脑炎、MRL/lpr/lpr小鼠或NZB杂交小鼠的全身性红斑狼疮、鼠自身免疫性胶原关节炎、NOD小鼠和BB大鼠的糖尿病mellitus、鼠的实验性重症肌无力症等(见Paul ed.、Fundamental Immunology、Raven Press、NewYork、1989、pp.840-856)。
采用上调抗原的作用(如B细胞抗原的作用)的手段上调免疫应答在治疗疾病上也有其作用。可采用两种方式上调免疫应答：增强已有的免疫应答或者引发一个初始的免疫应答。比如说，增强免疫应答的方法对于治疗病毒感染包括全身性病毒疾病如流感，普通感冒和脑炎等疾病是很有用的。
或者，将感染病人的T细胞提取出来，在体外与表达NsG33的或加入本发明所述的可溶性NsG33的经病毒抗原刺激APCs细胞共刺激，然后将体外已活化的T细胞回输病人，能够增强抗病毒的免疫应答反应。另一种能够增强抗病毒的免疫应答反应方法是分离病人的受感染细胞，用编码NsG33的核酸转染细胞，使NsG33蛋白或其一部分表达于细胞表面，再将细胞回输病人体内。这里受感染细胞能够为T细胞提供共刺激信号，从而体内激活T细胞。
NsG33能够为T细胞提供足够的刺激信号，诱导T细胞介导的针对转染的肿瘤细胞的免疫应答。缺乏或不能表达足够的MHC I类和II类分子的肿瘤细胞也可以被转染入编码整个或部分(如胞浆区截短部分)MHC I类分子a链蛋白和β2小球蛋白的核酸或编码MHC II类分子a和β链蛋白的核酸，使其细胞表面表达MHC I或II类分子。表达合适的MHC I或II类分子，与具有B细胞抗原活性的多肽(如B7-1、B7-2、B7-3)一起诱导T细胞介导的针对转染的肿瘤细胞的免疫应答。任选地，将编码能够阻断MHC II类相关蛋白如恒定链表达的反义构建物基因，与编码具有B细胞抗原活性的多肽的DNA序列共转染肿瘤细胞，促进肿瘤细胞呈现肿瘤相关抗原，从而诱导肿瘤特异性免疫反应。因此，在受试体体内诱导T细胞介导的免疫应答能够有效的克服肿瘤特异性耐受。
NsG33的活性可通过下述方法进行测定：
用于测定胸腺细胞或脾细胞细胞毒作用的方法包括但不限于下列方法：Current Protocols in Immunology、Ed by J.E.Coligan、A.M.Kruisbeek、D.H.Margulies、E.M.Shevach、W.Strober、Pub.Greene Publishing Associates和Wiley-Interscience(Chapter 3、In Vitro assays for Mouse LymphocyteFunction 3.1-3.19；Chapter 7、Immunologic studies in Humans)；Herrmann等人、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：2488-2492，1981；Herrmann等人、J.Immunol.128：1968-1974，1982；Handa等人、J.Immunol.135：1564-1572，1985；Takai等人、I.Immunol.137：3494-3500，1986；Takai等人、J.Immunol.140：508-512，1988；Bowman等人、J.Virology 61：1992-1998；Bertagnolli等人、Cellular Immunology 133：327-341，1991；Brown等人、J.Immunol.153：3079-3092、1994。
测定T细胞依赖性免疫球蛋白应答和类型转换(与其它方法一起，用于鉴定调节T细胞依赖的抗体应答和影响Th1/Th2比例的蛋白)的方法包括但不限于下列方法：Maliszewski、J.Immunol.144：3028-3033，1990；和Assays for B cell function：In vitro antibody production、Mond，J.J.andBrunswick，M.In Current Protocols in Immunology.J.E.e.a.Coligan eds.Vol1pp.3.8.1-3.8.16，John Wiley and Sons，Toronto.1994。
混合淋巴细胞反应(MLR)测定(与其它方法一起，用于鉴定产生优势性Th1和CTL应答的蛋白)方法包括但不限于：Current Protocols inImmunology，Ed by J.E.Coligan，A.M.Kruisbeek，D.H.Margulies，E.M.Shevach，W.Strober，Pub.Greene Publishing Associates和Wiley-Interscience(Chapter 3，In Vitro assays for Mouse Lymphocyte Function 3.1-3.19；Chapter 7，Immunologic studies in Humans)；Takai等人，J.Immunol.137：3494-3500，1986；Takai等人，J.Immunol.140：508-512，1988；Bertagnolli等人，J.Immunol.149：3778-3783，1992。
树突状细胞依赖性试验(与其它方法一起，用于鉴定由树突状细胞表达用来活化初始性T细胞的蛋白)包括但不限于：Guery等人，J.Immunol.134：536-544，1995；Inaba等人，Journal of Experimental Medicine 173：549-559，1991；Macatonia等人，Journal of Immunology 154：5071-5079，1995；Porgador等人，Journal of Experimental Medicine 182：255-260，1995；Nair等人，Journal of Virology 67：4062-4069，1993；Huang等人，Science 264：961-965，1994；Macatonia等人，Journal of Experimental Medicine 169：1255-1264，1989；Bhardwaj等人，Journal of Clinical Investigation 94：797-807，1994；and Inaba等人，Journal of Experimental Medicine 172：631-640，1990。
淋巴细胞生存/凋亡测定试验(与其它方法一起，用于鉴定能够防止超抗原诱导后凋亡的蛋白和调节淋巴细胞稳态的蛋白)包括但不限于下列方法：Darzynkiewicz等人，Cytometry 13：795-808，1992；Gorczyca等人，Leukemia 7：659-670，1993；Gorczyca等人，Cancer Research 53：1945-1951，1993；Itoh等人，Cell 66：233-243，1991；Zacharchuk，Journal of Immunology145：4037-4045，1990；Zamai等人，Cytometry 14：891-897，1993；Gorczyca等人，International Journal of Oncology 1：639-648，1992。
测定影响T细胞分型和发育早期阶段的蛋白的方法包括但不限于：Antica等人，Blood 84：111-117，1994；Fine等人，Cellular Immunology 155：111-122，1994；Galy等人，Blood 85：2770-2778，1995；Toki等人，Proc.Nat.Acad Sci.USA 88：7548-7551，1991。
V.多肽给药和制剂
NsG33治疗靶组织是选择对NsG33保持应答性的脑区。在人类，对生长因子保持应答性直到成年期的神经元包括胆碱能基底前脑神经元，内嗅区皮质神经元，丘脑神经元，蓝斑神经元，脊髓感觉神经元，脊髓运动神经元，黑质神经元，交感神经元，后根神经节，视网膜神经元，耳神经元，小脑神经元，睫状神经节。干细胞如室下区的干细胞和神经及神经胶质祖细胞也可对生长因子保持应答性直至成年期。髓鞘形成少突神经胶质细胞也可对生长因子保持应答性直至成年期。
NsG33多肽可通过任何医药可接受的途经给药。所述途经包括注射，胃肠外途径如静脉，血管内，动脉内，皮下，肌肉，瘤体内，腹膜内，心室内，硬膜外腔内(intraepidural)，气管内，鞘膜内(intrathecal)，脑室内，脑半球间，肺脏内，或其它如鼻，眼，直肠，或局部。通过如储库注射(depotinjection)或可侵蚀的植入的这些方式持续释放给药也特别在本发明涉及到。口服给药也被考虑，条件是蛋白在胃里不被降解。
本发明涉及的NsG33给药可采用任何合适的递送方式，包括：
泵(例如见Annals of Pharmacotherapy，27：912(1993)；Cancer，41：1270(1993)；Cancer Research，44：1698(1984)，在此引入作为参考)，
微囊法(例如见United States patents 4,352,883；4,353,888；and 5,084,350，在此引入作为参考)，
连续释放聚合物植入剂(例如见Sabel，United States patent 4,883,666，在此引入作为参考)，
包被细胞(见，X部分)，
植入到CNS的裸细胞或非包被细胞(例如见United States patents5,082,670 and 5,618,531，分别在此引入作为参考)；
注射，经皮下，静脉，动脉内，肌肉，或经其它合适部位；
吸入；和
口服给药，胶囊剂，溶液，片剂，丸剂或缓释剂。
可通过制剂的推注周期注射给药，或通过一外部(如静脉注射包)或内部(如可生物降解的植入物，生物人工器官，NsG33产生细胞的生物相容性胶囊，或植入的NsG33产生细胞的克隆)贮药装置进行静脉或腹膜更持续给药。例如见U.S.专利4,407,957，5,798,113，和5,800,828，分别在此引入作为参考。肺内给药方法和装置也涉及到，例如U.S.专利5,654,007，5,780,014，和5,814,607，分别在此引入作为参考。
除全身递送外，也涉及到通过血脑屏障或血视网膜屏障直接向CNS或眼睛递送。
局部递送可通过导管向一条或多条动脉递送，如通过眼动脉到眼，通过大脑动脉到CNS。通过泵进行蛋白制剂的局部递送方法在US 6,042,579(Medtronic)涉及到。另一种局部递送方式包括通过包被细胞进行递送(见X部分)。还有一种局部递送方式包括将基因治疗载体通过正常注射进行递送。
治疗眼部疾病时，可通过如眼动脉进行全身或局部递送。在另一个实施方案中，是通过包被细胞疗法(Encapsulated Cell Therapy)，将包被细胞植入玻璃体内。通过视网膜下注射，玻璃体内注射或巩膜内注射可进行蛋白制剂或基因治疗载体递送。
治疗帕金森病，可采用不同的递送途径。蛋白制剂可通过泵脑室内或实质内向纹状体和/或黑质，更优选向壳核内递送。但是一种更优选的给药方法包括包被细胞疗法，胶囊被植入脑室内或实质内，优选纹状体和/或黑质内，更优选植入壳核内。在一个实施方案中治疗帕金森病时，基因治疗载体被给药到脑纹状体。向纹状体的注射能够标记位于脑部不同区域的靶点，例如苍白球，杏仁核，丘脑下神经核或黑质。苍白球细胞的转导通常产生丘脑细胞的退化标记。在优选实施方案中(或其中之一)所述靶点是指黑质。
在一个实施方案中，治疗HD时，NsG33施用到纹状体，为了保护神经元不退化，优选施用到尾状核，其能够保护尾状核神经元和皮质输入端神经元。在优选实施方案中，应该在主要退行性变化发生之前开始施用。治疗将涉及到疾病基因诊断，这一诊断是通过分析家族史和局部应用NsG33后的血样DNA实现的。借助可医用输注泵和导管如MedtronicSynchrotron泵经蛋白泵入将NsG33递送到纹状体。第二种策略是直接进行基因治疗，通过病毒或非病毒载体修饰纹状体或其它受影响的神经元宿主细胞并使之表达分泌NsG33。第三种策略是制备基因修饰的并能表达分泌NsG33的裸细胞或包被细胞，这种细胞可通过血脑屏障将NsG33局部投递到病变区，优选的部位是纹状体，更优选尾状核。
ALS患者由于上行和下行运动神经元退化，导致进行性麻痹，最后大都因呼吸并发症而死亡。治疗ALS时，通过将NsG33输注到腰椎鞘膜腔内，从而与的脑脊液(CSF)混合，其通过脑脊液循环到达脊髓和脑，因此将NsG33递送至CNS(包括脊髓)。通过植入输注泵和导管如MedtronicSynchrotron泵或通过在腰椎鞘膜腔内植入包被细胞装置可将NsG33递送。也可通过将携带载体的DNA注射到CSF从而将基因转移至CSF腔内的细胞来直接进行基因治疗。此外基因转移载体可被注射到颈脊神经背根或腰脊髓或大脑内，在含有与运动麻痹和呼吸功能有关的多数运动神经元的解剖区能够分泌NsG33。这些注射方法可借助外科定向手段较安全地实施。
患有神经变性疾病如AD的患者，带有神经生长因子(NGF)受体的Ch4区神经元与正常对照相比有明显的萎缩(见Kobayashi，等人，Mol.Chem.Neuropathol.，15：193-206(1991))。
在正常受试体，神经营养因子在发育期间能够阻止交感和感觉神经元的死亡，阻止成年大鼠和灵长类动物胆碱能神经元变性(Tuszynski，等人，Gene Therapy，3：305314(1996))。基底前脑区功能神经元丧失认为是导致患神经变性疾病如AD患者认知能力下降的原因(Tuszynski，等人，supra and，Lehericy，等人，J.Comp.Neurol.，330：15-31(1993))。
一般考虑将NsG33蛋白制剂递送到脑室或实体内来对AD进行治疗。在实体区内优选的是递送到基底前脑和海马回。
基因治疗载体，分泌NsG33的包被或裸细胞也能够被给药到基底前脑或海马回。
对于治疗脊髓损伤，蛋白，基因治疗载体或能分泌NsG33的包被或裸细胞可被递送到受损部位的髓鞘内，与上述治疗ALS的方法相同。
治疗周围神经病时，或者将蛋白制剂，基因治疗载体，或分泌NsG33的包被或裸细胞进行全身髓鞘给药(使用蛋白制剂)，或者依赖逆向转运到脊髓进行肌肉给药。
治疗癫痫时，NsG33蛋白可通过包被或裸细胞，用导管或泵进行蛋白制剂制剂给药，或基因治疗载体递送到癫痫部位的实体内。
治疗中风或外伤时，膜内给药，脑室内(intracerbroventricular)给药，或优选intralessionar递送。
术语“可药用载体”是指一种或多种有机或无机，天然或合成的成分，与NsG33多肽的结合可方便NsG33的施用。一种合适的载体包括无菌盐水，虽然其它水性溶液和非水性等渗无菌溶液和无菌混悬剂对本领域技术人员来说已知是可药用的。“有效剂量”是指能够改善或延缓疾病及退化或损伤状况进展的给药剂量。有效剂量的高低取决于个体差异，还要部分地考虑治疗的症状以及预期要达到的效果。，采用这些特征并无需再进行例行试验，有效剂量能经本领域技术人员确定。
脂质体系统可以是任何单层脂囊(unilamellar vesicles)，多层脂囊(multilamellar vesicles)或稳定多层脂囊(stable plurilamellar vesicles)，可通过本领域已知的方法制备和给药，例如美国专利5,169,637，4,762,915，5,000,958或5,185,154所公开的技术。此外为了增强结合脂质体的能力，本发明涉及表达新的多肽和其它多肽，如脂蛋白。例如通过免疫亲和层析或其它任何便利方法可将重组的NsG33蛋白从CHO细胞中纯化出来，然后与脂质体混合进行高效率结合。脂质体包被的蛋白将在体外检测其刺激细胞生长的效应。
本发明所述任何NsG33多肽以可药用盐的形式进行使用。适宜的酸和碱包括无机和有机的酸和碱，所述的酸和碱能够与NsG33多肽形成盐。
除活性成分外，药物组合物可含有适宜的成分。制剂和给药的有关详细技术见最新版Remington’s Pharmaceutical Sciences(Maack Publishing Co.，Easton，PA)。
应仔细考虑全身给药的各种剂量用法。在一个实施方案中将包含NsG33的制剂给药至受试体的方法包括将NsG33以每次给药剂量在1-30,000μg/kg受试体的体重之间。在另一个实施方案中，每次给药剂量在10-30,000μg/kg受试体的体重范围内。在又一个实施方案中，每次给药剂量在10-10,000μg/kg受试体的体重范围内。在不同实施方案中，每次给药剂量在25-10000μg/kg受试体的体重范围内。在又一个实施方案中，每次给药剂量在25-3000μg/kg受试体的体重范围内。在最优选的实施方案中，每次给药剂量在50-3000μg/kg受试体的体重范围内。
具体给药剂量和递送方法的指导原则在相关文献中涉及到，如U.S.Pat.Nos.4,657,760；US Pat.Nos.5,206,344或US Pat.Nos.5,225,212。不同的制剂对不同的治疗化合物和不同的疾病有效，靶向一个器官或组织的给药有必要与靶向另一个器官或组织的给药以不同的递送方法进行。
其中NsG33多肽持续释放给药，释放特征在于适于任何可用NsG33多肽给药治疗的疾病或病症，包括微囊化NsG33多肽。重组蛋白微囊化持续释放技术成功应用于人生长激素(rhGH)，干扰素-(rhIFN-)，白介素-2和MN rgp120。参考以下相关文献：Johnson等人，Nat.Med.，2：795-799(1996)；Yasuda，Biomed.Ther.，27：1221-1223(1993)；Hora等人，Bio/Technology，8：755-758(1990)；Cleland，″Design and Production of Single ImmunizationVaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems，″in VaccineDesign：The Subunit and Adjuvant Approach，Powell and Newman，eds，(Plenum Press：New York，1995)，pp.439-462；WO 97/03692，WO 96/40072，WO 96/07399；and U.S.Pat.No.5,654,010。
聚乳酸-共羟乙酸(poly-lactic-coglycolic acid)(PLGA)聚合物具有生物相容和和广泛的生物降解特性，可用来制备这些蛋白的持续释放剂。PLGA的降解产物乳酸和羟乙酸能在人体内被迅速清除。而且该聚合物的降解时间可依赖分子量和组成进行调控，从几个月至几年不等。参考Lewis，″Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolide polymer，″in：M.Chasin and R.Langer(Eds.)，Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems(Marcel Dekker：New York，1990)，pp.1-41。
必须根据被治疗个体的年龄，体重，病症以及给药途径，剂型，给药方案和预期疗效调整给药剂量，准确的给药剂量应由执业医生确定。
VI.基因治疗的药物制备
本发明所述编码表达病毒载体的NsG33可被置入药用悬浮液、溶液或乳剂中，以形成用于基因治疗的NsG33组合物。合适的介质包括盐水(saline)或脂质体制剂。
更具体的可药用载体包括非水溶液、悬浮液或乳剂的无菌含水剂。非水溶剂的实例包括丙二醇，聚乙二醇，植物油例如橄榄油和可注射的有机酯类如油酸乙酯。水性的载体包括水，醇/水溶液，乳剂或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。非胃肠道用的载体介质有氯化钠溶液，Ringer’s葡萄糖，葡萄糖和氯化钠，乳酸林格氏液或固定油。
静脉给药载体包括液体和营养补充剂，电解质补充剂(如那些基于Ringer’s葡萄糖的补充剂)，等等诸如此类。
还可以有诸如抗菌剂，抗氧化剂，鳌合剂，惰性气体等防腐剂和其它的添加剂。而且，根据本发明所述，将NsG33转基因组合物可利用本领域熟知的方法进行冷冻干燥，以用于随后的复溶(reconstitution)和应用。
胶状分散体系也可被用于目的基因的传递。胶状分散体系包括大分子复合物，纳米胶囊，微球，珠和基于液体的体系，包括水包油乳剂，微团，混合微团，和脂质体。脂质体是人工合成的膜囊泡，用作体内和体外的传递载体。大单层脂质体(LUV)，粒径0.2-4.0μm，可以容纳相当大比例的含有大分子的水性缓冲液。RNA，DNA和完整的病毒粒可以被包入水相并以具有生物活性的形式传递到细胞中(Fraley、等人、Trends Biochem.Sci.、6：77，1981)。脂质体不仅用于哺乳动物细胞也被用于编码植物，酵母，细菌细胞的转基因的传递。为了称为有效的转基因载体，脂质体具有以下特征(1)编码NsG33的基因被十分有效的包入脂质体而不破坏它们的生物活性(2)相比于非目的细胞，优先并基本上结合于目的细胞(3)载体中的水性内容物可被高效地传递到目的细胞的细胞质中(4)基因信息被可被有效，准确的表达(Mannino、等人、Biotechniques、6：682，1988)。
脂质体组合物通常是的磷脂组合，尤其是具有高相变温度的磷脂，且通常与甾族化合物特别是胆固醇组合。也有由其它的磷脂或类脂也可使用。脂质体的物理特性取决于pH，离子强度，和二价阳离子的存在。
用于脂质体产品的类脂包括磷脂酰化合物，如磷脂酰甘油，磷脂酰胆碱，磷脂酰丝氨酸，磷酯酰乙醇胺，神经鞘脂类，脑苷脂类，神经节苷酯。尤其是二酰基磷脂酰甘油，其中类脂部分包括14-18个碳原子，特别是16-18个碳原子，并且是饱和的。示例性的磷脂包括卵磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱和二硬脂酰磷脂酰胆碱。
脂质体的靶向可根据解剖学和作用机制因素进行分类。解剖学分类是基于选择性水平，如器官特异性，细胞特异性，和细胞器特异性。作用机制分类是基于它是被动还是主动的作用，被动靶向作用是利用脂质体的天然倾向分散到含窦状毛细管的器官的网状内皮系统细胞中。
主动靶向作用则相反，通过将各类脂质体偶联到特定配体如单克隆抗体，糖，糖脂或蛋白上，或者通过改变脂质体的组成和大小，以作用于目的器官或细胞，而不是作用于定位的天然存在位点。
目的基因传递系统的表面可以用不同的方式修饰。在脂质体传递系统中，为了保证目的基团与脂质双层稳定的结合，类脂基团被整合入脂质双层。不同的连接基团可被用于将脂链与靶向配体联接。
传递系统的另外实例是如本发明所述将能产生载体颗粒的包装细胞(packaging cell)的组合物移植到治疗部位。这样的细胞的包封和移植的方式本专业领域技术人员都熟知。详见WO 97/44065(细胞疗法)。通过选择能产生慢病毒(lentiviral)颗粒的包装细胞株，得到在治疗区域的非分裂细胞的转导。通过使用只能转导分裂细胞的逆转录病毒粒，转导将被限制在治疗区域新生的分化细胞中。
VII.基因治疗的剂量要求和递送方案
NsG33基因治疗载体被递送到靶组织的剂量是一个重要的参数。对于病毒载体，浓度可以通过转导的数量(unit/ml)来定义。任选的情况是每一单位剂量包括2.5到25微升的组合物，其中该组合物包括在可药用的流体中的病毒表达载体，并且每毫升提供108到1010NsG33转导单位。
很重要的一点，选择特异性活体内基因递送位点，以便能在下列区域成簇：损伤、丧失区域、或机能障碍的神经细胞、神经胶质细胞、视网膜细胞、感觉细胞、或干细胞。这些区域可通过包括核磁共振成像(MRI)、活组织检查一系列已知技术来临床确定。对人体来说更倾向于应用对人体无侵害的体内成像技术如MRI。一旦神经元丧失的位点被确定，选择递送位点用于立体定向递送，使得向脑递送每单位剂量NsG33的递送位点在距离靶细胞500μm或500μm之内，距离另一递送位点不超过10mm。
在一个给定的靶点，载体系统可以转导靶细胞。该靶细胞可以是神经组织中的细胞、如神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞、小胶质细胞、干细胞、神经祖细胞或室管膜细胞。
载体系统优选采用直接注射的方法进行给药。向脑组织注射的方法本领域专业技术人员都熟知(Bilang-Bleuel等人(1997)Proc.Acad.Nati.Sci.USA 94：8818-8823；Choi-Lundberg等人(1998)Exp.Neurol.154：261-275；Choi-Lundberg et al(1997)Science 275：838-841；和Mandel等人(1997))Proc.Acad.Natl.Sci.USA 94：14083-14088)。此外，定位注射技术也可被施用。
上述在如脑的组织中进行的转导必需使用很小的体积，因此病毒粒子要用超速离心的方法来浓缩。得到的制剂应该具有至少108t.u./ml，优选108t.u./ml到1010t.u./ml，更优选至少109t.u./ml(滴度以转导单位/ml(t.u./ml)表示，如在实施例6中描述的那样)。已发现通过增加注射位点数和减少注射频率可以增加转基因表达的差量(dispersion)(Horellou和Mallet(1997)，如上所述)。通常使用1-10个注射位点，更通常使用2-6个注射位点。每一剂量包括1-5×109t.u./ml.注射频率通常在0.1到10μl/min之间，通常大约1μl/min。
可通过显微注射、浸润、划痕加载(scrape loading)、电穿孔或通过外科手术切口适于将组合物直接递送到递送位点的其它方法将病毒组合物递送到靶组织中的各递送细胞位点。这种递送方式较慢，如在约5-10分钟期间内完成(取决于被递送病毒组合物的总体积)。
VIII.病毒载体
总的来说，基因治疗就是将新的遗传物质转移到患者的细胞中，并且对患者产生一定治疗益处。所述的益处包括治疗或预防广泛的疾病、障碍和其他病症。
体外基因治疗是将分离的细胞(包括但不限于干细胞，神经细胞，神经胶质前体细胞，胚胎干细胞)进行修饰，然后通过浸入、移植或其它移植方法将它们植入到患者体内。例如详见U.S.Pat.Nos.4,868,116、5,399,346和5,460,959。体内基因治疗则直接靶向宿主患者体内的组织。
病毒是一种十分有效基因转移载体，包括乳头瘤病毒，腺病毒，痘苗病毒，腺伴随病毒，疱疹病毒和逆转录病毒。适宜的逆转录病毒包括HIV、SIV、FIV、EIAV、MoMLV。另一组适宜的逆转录病毒包括HIV、SIV、FIV、EIAV、CIV。又一组优选的病毒载体包括选自甲病毒，腺病毒，腺伴随病毒，杆状病毒，HSV，冠状病毒，牛乳头状瘤病毒、Mo-MLV，腺伴随病毒。
治疗神经系统障碍的优选病毒是慢病毒属和腺伴随病毒。这两种病毒不需细胞分化而可整合进基因组，并且这两种病毒均已进行过临床前动物实验，用于治疗神经系统，尤其是中枢神经系统疾病。
制备AAV的方法在本领域中已报道，例如详细见US 5,677,158.US6,309,634和US 6,683,058，描述了将AAV递送到中枢神经系统的方法。
优选，慢病毒载体是一种复制缺陷型慢病毒颗粒。这种慢病毒颗粒可由慢病毒载体制备，所述载体包括5’端慢病毒LTR，tRNA结合位点，包装信号，与编码所述融合蛋白的多聚核苷酸信号可操作连接的启动子、DNA第二链合成的复制起始位点和3’慢病毒LTR。该病毒的制备和体内给药至神经细胞的方法在US 20020037281(Methods for transducing neural cellsusing lentiviral vectors)中有所描述。
逆转录病毒载体广泛应用于人的临床实验，因为它们可携带7-8kb的外源基因片段，并且能感染细胞，其遗传物质能高效稳定地整合到宿主细胞中。例如详见WO 95/30761；WO 95/24929。致肿瘤病毒亚科在转化整合外源核酸序列进入患者体内至少需一轮的靶细胞增殖。逆转录病毒则随机整合到患者基因组中，因为几乎没有细胞分化发生在神经系统(特别是中枢神经系统)的其它细胞当中，所以逆转录病毒能被靶向递送到神经系统的干细胞。
三种逆转录病毒颗粒已被描述。一是亲嗜性逆转录病毒，它可以有效感染鼠科动物细胞。二是兼嗜性逆转录病毒，可以感染许多种属的细胞。三是异嗜性逆转录病毒，可以感染除产生病毒的细胞以外的另外种属的细胞。它们都只能够整合到分化细胞的基因组当中，这使逆转录病毒在发育研究中标记细胞谱系，向癌或肿瘤组织递送治疗或自杀基因方面具有诱人前景。
在治疗人类患者时，逆转录病毒载体必需是复制缺限型。这防止感染性的逆转录病毒颗粒在靶组织中进一步传代，而复制缺陷型载体则可以“俘获”转基因并将其稳定整合到靶细胞基因组中。典型的复制缺陷型载体，它们的gag、env、和pol基因已被删除(随同病毒基因组其余大部分基因)。异源基因DNA插入到删除的基因的位置。异源基因可内源的异源启动子控制，另外的异源启动子靶细胞内激活，或受逆转录病毒5‘LTR控制(病毒LTR在各种组织具有活性)。逆转录病毒载体可携带转约7-8kb的转基因。
复制缺陷型逆转录病毒载体需要例如包装细胞提供复制所需和反向组装所需的病毒蛋白。包装细胞不能释放有复制能力的病毒或辅助病毒，这一点非常重要。通过提供缺乏ψ信号的RNAs表达的病毒蛋白及独立转录单位表达gag/pol基因和env基因，可以获得病毒颗粒。此外，在一些2代或3代逆转录病毒中，其5’LTR′s被控制这些基因表达的非病毒启动子置换，且3’启动子已被最小化，仅包括邻近启动子。这些设计减少了重组产生有复制能力的载体或辅助病毒的可能性。
IX.表达载体
使用普通的技术可以构建表达NsG33多肽的重组体，这些技术本专业领域技术人员都熟知。这些技术可参考Maniatis等人，in Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，(NY 1982)。表达载体可被用于生产产生医药用NsG33多肽重组体的工程细胞，并制备分泌NsG33多肽的细胞，这些细胞单独(naked)或被包被用于治疗。
简单说来，使用标准的连接技术来构建重组表达载体，并使用如下方法通过测序确认构建载体序列的正确性，详见Messing、等人(Nucleic AcidsRes.、9：309-、1981)、Maxam、等人(Methods in Enzymology、65：499、1980)，或其它本专业领域技术人员都熟知的合适方法。
用如上所述的常规凝胶电泳分离切下的不同大小的片段，例如详见Maniatis、等人(Molecular Cloning、第133-134页，1982)。
为了构建有效的表达载体，在正确的读码框中应该包括编码基因的调控序列。一个基因的表达受到转录，翻译，翻译后修饰三个层次的控制。转录是控制基因表达最早也是最重要的一环。转录的水平受到启动子，增强子序列及与这些序列结合的特异性细胞因子影响。转录单位包括启动子，某些情况下的增强子或调控元件组成的多种基因(Banerji等人、Cell 27：299(1981)；Corden等人，Science 209：1406(1980)；以及Breathnach和Chambon、Ann.Rev.Biochem.50：349(1981))。对于逆转录病毒，涉及逆转录病毒基因组复制的控制元件存在于长末端重复序列(LTR)(Weiss等人、eds.，Themolecular biology of tumor viruses：RNA tumor viruses、Cold Spring HarborLaboratory、(NY 1982))。莫洛尼鼠白血病病毒(MLV)和鲁斯氏肉瘤病毒(RSV)的长末端的LTRs包括启动子和增强子序列(Jolly等人、Nucleic Acids Res.11：1855(1983)；Capecchi等人、In：Enhancer and eukaryotic gene expression，Gulzman和Shenk，eds.、pp.101-102，Cold Spring Harbor Laboratories(NY1991)。其它可能启动子包括来自于巨细胞病毒(CMV)和其它的野生型病毒的启动子。
许多非病毒启动子的启动子和增强子区也已经被描述。(Schmidt等人、Nature 314：285(1985)；Rossi and deCrombrugghe、Proc.Natl.Acad.Sci.USA84：5590-5594(1987))。维持和增加休眠细胞转基因的表达方法包括使用含胶原1型(1和2)的启动子、SV40和LTR启动子(Prockop and Kivirikko，N.Eng.J.Med.311：376(1984)；Smith和Niles，Biochem.19：1820(1980)；de Wet等人、J.Biol.Chem.、258：14385(1983))。
根据本发明的一个实施方案，该启动子是一个组成型启动子，其选自：泛素启动子，CMV启动子，JET启动子(US 6,555,674)、SV40启动子、延伸因子1α启动子(Elongation Factor 1alpha promoter(EF1-alpha))、RSV、Mo-MLV-LTR。诱导/抑制启动子包括：Tet-On、Tet-Off、雷怕霉素可诱导的启动子(Rapamycin-inducible promoter)、Mx1。
优选的启动子有CMV、人UbiC、JeT、RSV、Tet-可调控(regulatable)启动子、Mo-MLV-LTR、Mx1和EF-1α。
除使用病毒和非病毒的启动子启动转基因表达外，增强子序列也可用于增强转基因表达水平。增强子不仅可增加内源基因的转录活性，也可增加外源基因的转录活性(Armelor、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 70：2702(1973))。例如，本发明所述胶原增强子序列可以与胶原启动子2(I)连用来增强转基因的表达。此外，SV40病毒中的增强子元件可用于增强转基因的表达。这个增强子序列由72个碱基对重复组成如下所述：Gruss等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：943(1981))Benoist and Chambon，Nature 290：304(1981，以及Fromm和Berg，J.Mol.Appl.Genetics，1：457(1982)，在此引入，作为参考。该重复序列与不同的启动子组合，可以增强许多不同病毒和细胞基因的转录(Moreau等人，Nucleic Acids Res.9：6047(1981)。
另外一些表达增强序列包括但不限于土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件、WPRE、SP163、CMV增强子、和鸡β-珠蛋白绝缘子和其它绝缘子。
通过使用细胞因子调节启动子活性也可增强转基因长期稳定表达。已报道几种细胞因子调节与胶原2(I)和LTR启动子连接的转基因表达(Chua等人，connective Tissue Res.，25：161-170(1990)；Elias等人，Annals N.Y.Acad.Sci.，580：233-244(1990))；Seliger等人，J.Immunol.141：2138-2144(1988)and Seliger等人，J.Virology 62：619-621(1988))。例如，转化生长因子(TGF)，白细胞介素(IL)-1和干扰素(INF)下调被不同启动子如LTR启动的转基因的表达。肿瘤坏死因子(TNF)和TGF1可上调，并可用于控制被启动子启动的转基因表达。其它有用细胞因子包括基本的成纤维细胞生长因子(bFGF)和表皮生长因子(EGF)。
具有胶原增强子序列(Coll(E))的胶原启动子也可用于通过进一步抑制对载体的免疫应答而增强转基因的表达，该免疫反应可能产生于不抵抗其免疫保护状态(immune-protected status)的被治疗过的脑中。此外，在载体组合物递送和延续之后，包括甾体的抗炎药如地塞米松可以立即给药治疗过的宿主，优选直到任何细胞因子介导的炎症反应消退。也可给药免疫抑制剂(如环孢霉素)用于减少干扰素的产生，而干扰素下调LTR启动子和Coll(E)启动子-增强子、并降低转基因的表达。
载体序列还包括如编码Cre-重组酶蛋白序列和LoxP序列。确保NsG33瞬时表达的另一种方法是通过使用Cre-LoxP系统，该系统导致插入的DNA序列的部分的切除，通过给药Cre-重组酶至细胞(Daewoong et al、NatureBiotechnology 19：929-933)，或整合编码重组酶的基因到病毒结构中(Plück、Int J Exp Path、77：269-278)。带有LoxP位点的病毒结构中重组酶基因与结构基因(本发明中的NsG33)协同作用，通常导致结构基因进行为期大约五天的表达。
X.生物相容性胶囊
包囊细胞疗法是在移植细胞到宿主中之前，通过用生物相容性的半透性材料包围宿主，而从受体宿主免疫系统中隔离细胞。本发明涉及一种设备，通过该设备，表达和分泌NsG33的细胞被包被进免疫隔离的胶囊里。“免疫隔离胶囊”是指移植到受体宿主体内后，减少宿主免疫系统对该装置芯内的细胞的有害作用。通过将细胞包裹入由微孔膜形成的可植入的多聚体胶囊中，使细胞与宿主之间产生免疫隔离。该方法可阻止宿主和移植组织之间细胞的接触，消除直接提呈的抗原识别作用。所用的膜还可被特定以基于分子的分子量来控制它们(如抗体和补体)的扩散(Lysaght等人、56 J.Cell Biochem.196(1996)、Colton、14 Trends Biotechnol.158(1996))。使用包囊技术，细胞可被植入到宿主而无免疫排斥现象，即使是使用了或没使用免疫抑制剂。有用的生物相容性的聚合物胶囊通常含有芯，核含有细胞，细胞悬浮在液体介质种或固定在固定基质中；以及选择性渗透基质或膜的环绕或周边区域，在该区域内不含分离的细胞，并且具有生物相容性，并且足够保护芯内细胞不受有害的免疫学攻击。包囊阻碍了免疫系统的因子进入胶囊，因此保护包囊的细胞不受免疫损伤。胶囊膜的半透性性质也允许感兴趣的生物活性分子从胶囊中扩散到周围的宿主组织中去。
胶囊可由生物相容性材料制成。“生物相容性材料”是这样的材料，当它被移植到宿主中后，例如通过降解，而不会产生足以导致胶囊排斥或不能手术的破坏性宿主应答。该生物相容性材料对大分子物质(如宿主免疫系统的成分)是相对不具渗透性的，而对于小分子物质如胰岛素、NsG33多肽生长因子、和营养物则可渗透，并且充许代谢废物排出。很多生物相容性的材料可通过本发明的组合物适合递送生长因子。很多生物相容性的材料是已知的，具有不同的外表面形态和其他机械和结构特征。本发明所述胶囊优选与下述中的胶囊类似：WO 92/19195或WO 95/05452，引入作为参考；或U.S.专利号5,639,275；US 5,653,975；US 4,892,538，US 5,156,844，US 5,283,187或U.S.5,550,050引入作为参考。这些胶囊允许代谢产物、营养物，治疗用物质的通过，同时最大可能地减少宿主免疫系统的有害影响。生物相容性材料的组分包括外周半透膜和内部细胞支持物。优选地，遗传修饰的细胞接种在支持物上，并被外周的选择性渗透膜所包囊。丝状细胞支持物可由选自下列的任何生物相容性材料制成：丙烯酸树脂，聚脂，聚乙烯，聚丙烯，聚乙腈，聚对苯二甲酸乙酯(polyethylene teraphthalate)，尼龙，聚酰胺，聚氨酯，聚丁烯酯，丝，棉，甲壳质，碳，或生物相容性金属。键合的纤维结构可用于细胞植入(U.S.专利号5,512,600引入作为参考)。生物可降解的聚合物包括聚(乳酸)PLA、聚(乳酸-共乙醇酸)PLGA、和聚(乙醇酸)PGA及它们的等价物。泡沫支架为植入细胞提供黏附表面(WO98/05304、引入作为参考)。针织网状导管可用作血管移植物(WO 99/52573、引入作为参考)。此外，该芯包括由水凝胶形成的固定介质，其可稳定细胞的位置。水凝胶是三维网状交联亲水聚合物，以凝胶形式存在，基本上由水构成。
不同的聚合物和聚合物混合物可用于生产外周半透膜，包括聚丙烯酸酯(包括聚丙烯共聚物)，聚偏乙烯，聚氯乙烯共聚物，聚氨酯，聚苯乙烯，聚酰胺，醋酸纤维素，硝酸纤维素，聚砜类(包括聚醚砜)，聚磷腈、聚丙烯腈、聚(丙烯腈/氯乙烯共聚物)，及其衍生物，共聚物和混合物。优选地，外周半透膜是生物相容性的半透中空纤维膜。这些膜及其制备方法已公开U.S.专利号5,284,761和US 5,158,881。聚醚砜中空纤维形成外周半透膜如U.S.专利号4,976,859或US专利号4,968,733。其他半透膜材料是聚(丙烯腈/氯乙烯共聚物)。
胶囊可以是任何适合保持生物活性以及递送产品或功能的方式的形状，如圆筒状，方形，圆盘状，片状，卵形，星状，球状，而且胶囊可以被卷曲或包装进筛网样或嵌套结构。如果该胶囊在移植后要被回收，那些使胶囊容易移动的形状，如球状胶囊体积小易在宿主血管中移动，是不优选的。而某些形状例如方形，片状，盘状，圆筒状和扁平状提供更完整结构当要求回收时是优选的。
当采用大胶囊时，优选包囊103至108个细胞，最优选每个装置中包囊105到107个细胞。剂量是通过移植或多或少的胶囊来控制的，通常每个病人为1-10个胶囊。
支持物可用细胞外基质(ECM)分子涂布。细胞外基质分子的适合实例包括胶原，层粘连蛋白和纤维连接蛋白。支持物的表面也可用等离子辐照处理，使之带上电荷以增强细胞的黏附。
密封胶囊的任何使用方法都可使用，包括用聚合物粘合或折叠，纽结和加热密封。此外还可以使用任意合适的“干”密封方法，如U.S.专利号5,653,687所述，引入作为参考。
用已知的技术可将包囊好的细胞装置进行移植。许多移植位点可用于本发明的装置和方法。这些移植位点包括但不限于中枢神经系统，包括脑，脊髓，见U.S.专利号5,106,627、US 5,156,844和US 5,554,148、引入作为参考，眼睛的房水和玻璃体，见WO 97/34586、引入作为参考。
将胶囊移植到中枢神经系统的装置和方法在US 5,487,739.中有描述。将胶囊移植到眼的方法和装置在US 5,904,144、US 6,299,895、US 6,439,427和US 20030031700中有描述。
本发明的一个方面涉及具有生物相容性的胶囊，其包括：带有活包装细胞的芯，这些包装细胞能分泌感染靶细胞的病毒载体，所说病毒载体是根据本发明的载体；芯外周的外套，所述套包括渗透性生物相容材料，所述材料具有可允许通过直径大约100nm的逆转录病毒载体的孔隙率，使所述病毒载体从胶囊中释放出来。
优选地，所述芯还含有基质，包装细胞被固定在该基质上。根据一个实施方式所述，套包括水凝胶或热塑性材料。
适宜的包装细胞株的实例包括HEK293、NIH3T3、PG13、和ARPE-19细胞。优选的细胞包括PG13和3T3细胞.
包装细胞株可采用US 6,027,721和WO 97/01357的中公开的方法和组合物进行包囊和植入，其整体引入作为参考。
XI分泌NsG33的细胞的支持基质
本发明还包括在将细胞植入哺乳动物神经系统之前，将NsG33生产细胞在体外支持介质上进行培养。移植前将细胞黏附到微载体上能增强移植细胞长期生存能力及提供长期功效。
为了增强移植细胞即移植的NsG33分泌细胞的长期存活能力，在移植前可将细胞在体外黏附到支持基质中。支持基质材料可包括以下材料，细胞可以黏附其上并在体外培养，在其上生长，可被移植到哺乳动物体内而不产生有害反应，或炎症反应从而导致植入细胞破坏或其他干扰它们的生物活性或治疗活性。这些材料可以是合成的或天然化学物质或具有生物原性的物质。
该基质材料包括但不限于玻璃和其它的氧化硅，聚苯乙烯，聚丙烯，聚乙烯，聚偏乙烯氟化物，聚氨脂，聚藻酸盐，聚砜，聚乙烯醇，丙烯腈聚合体，聚丙烯酰胺，聚碳酸酯，聚戊烯(polypentent)，尼龙，淀粉酶，天然或修饰的凝胶，天然或修饰的胶原，天然或修饰的多糖，包括右旋糖苷和纤维素-如硝酸纤维素，琼脂和磁石。可重吸收或不可重吸收材料也能被使用。也包括细胞外基质材料，其是本领域所熟知的。细胞外基质材料是可商业购买到或通过培养分泌这种基质的细胞来制备，移出该分泌细胞后，再将该要移植的细胞与基质相互作用使之黏附到基质上。将要在其上种植生长细胞或者将与细胞混合的该基质材料可以是RPE细胞的天然产物。因此，例如，该基质材料可以是细胞外基质或基底膜材料，它们可由要植入的RPE细胞分泌和生产。
为了改善细胞的粘附，存活及功能，这些固体介质可任选地在外表面涂布本领域已知的因子以提高细胞粘附、生长及存活。这样的因子包括细胞粘附分子，细胞外基质如纤维结合蛋白，层粘连蛋白，胶原，弹性蛋白，氨基葡聚糖，或蛋白聚糖或生长因子。
或者，如果细胞将要黏附的固体基质由多孔材料组成，所述生长或存活促进因子可被整合进基质材料，并在植入体内后缓慢释放。
根据本发明当粘附到所述支持物时，用于植入的细胞通常在所述支持物的“外表面”。该支持物可以是实心的(solid)或多孔性的。然而，即使在多孔性的支持物中，由于没有隔膜或其它障碍，细胞与外部环境是直接接触的。因此，根据本发明，细胞是黏附在支持物的外表面，即使它们粘附的表面是多孔支持物材料以内折或蜷曲的结构形式存在不在该颗粒或珠本身的外面。
支持物的形状优选是球状的，如珠，但也可以是圆筒状，椭圆形，片状(flat sheet)或条状，针或大头针状等。支持基质优选是玻璃珠。另外优选的珠是聚苯乙烯珠。
珠的尺寸范围可以是从10μm到1mm直径，优选是约90μm到约150μm。不同微载体珠的具体描述可以查阅例如isher Biotech Source 87-88、FisherScientific Co.、1987、pp.72-75；Sigma Cell Culture Catalog、Sigma ChemicalCo.、St、Louis、1991、pp.162-163；Ventrex Product Catalog、VentrexLaboratories、1989；这些文献在此引入作为参考。珠的尺寸的上限可用珠的不期望宿主反应的刺激来要求，该刺激会影响移植细胞的功能或引起周围组织的损伤。珠尺寸的上限也取决于给予方法。本专业领域技术人员可较容易确定珠的上下限。
XII.宿主细胞
本发明一方面涉及用本发明载体将分离的宿主细胞进行了遗传修饰。
根据一个实施方案，宿主细胞可以是诸如大肠杆菌的原核细胞，它们能产生高质量的重组蛋白，并且能容易放大到工业规模级别。使用原核细胞作宿主细胞时，为了得到有生物活性的蛋白，NsG33需要适当的折叠及糖基化。在另一个实施方案中，宿主细胞也可以是来自非哺乳动物的真核细胞，包括但不限于已知的生产细胞如酵母(Saccharomyces cerevisiae)，丝状真菌如曲霉，和昆虫细胞如Sf9。
根据另一个实施方案，细胞优选哺乳动物宿主细胞，因为这种细胞能分泌和产生正确编码的NsG33。优选的物种包括选自人、猫、猪、猿猴、犬、鼠、大鼠、免、小鼠和仓鼠。
用本发明载体转导和转染的原代培养物和细胞系的优良候选物的实例，包括CHO、CHO-K1、HEI193T、HEK293、COS、PC12、HiB5、RN33b、神经细胞、胎儿细胞、ARPE-19、C2C12、HeLa、HepG2、纹状体细胞、神经元、星形胶质细胞，和中间神经元。用于哺乳动物重组产物生产的优选细胞系包括CHO、CHO-1、HEI193T、HEK293、COS、PC12、HiB5、RN33b、和BHK细胞。
用于体外基因治疗的优选细胞包括神经细胞、神经前体细胞、神经祖细胞、干细胞和胎儿细胞。
本发明还涉及适于经由裸露的和包被的细胞生物递送NsG33的细胞，所述细胞经遗传修饰以过度表达NsG33，并能移植到患者内从而定位递送生物活性的NsG33多肽。这些细胞泛指治疗细胞。
在本发明的一个优选实施方案中，所述治疗细胞没有因被插入的异源无限增殖化基因而无限增殖。适合于细胞移植的细胞是指那些无论是非包被或优选在包被状态下，这些无限增殖化细胞系在人体内不会无限传代，也不会导致肿瘤发生。
优选细胞系是一种接触抑制细胞系。当细胞在2-D培养介质上培养到融合状态时，细胞开始停止分化。接触抑制不排除细胞有限两的细胞溢出2D平面。接触抑制也有可能在3D空间内发生(如在胶囊内)。细胞在胶囊内生长到融合状态后，显著减缓增殖或完全停止分化。特别优选的细胞包括上皮细胞，它们具有接触抑制特性，在培养时可形成稳定的单层培养物。
甚至更优选的细胞是视网膜色素细胞(RPE细胞)。RPE细胞来源于分离于哺乳动物视网膜的原代培养细胞。该细胞的分离方法已经被确认并被认为是常规的技术(Li和Turner，1988，Exp.Eye Res.47：911-917；Lopez等人，1989，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.30：586-588)。在RPE细胞的共移植(cotransplantation)的大多数公开报导中，细胞取源于大鼠(Li和Turner，1988；Lopez等人，1989)。本发明涉及的RPE细胞来源于人类。除分离培养的原代RPE细胞外，培养的人RPE细胞系可用于本发明。
为了更好的对细胞进行包被，细胞必需能存活在低氧张力的中枢神经系统中，且能够分泌有活性的NsG33。本发明所述的优选细胞系能在低于5％氧张力条件下存活，更优选在低于2％的条件下存活，更优选在低于1％的条件下。1％的氧张力相当于脑中氧的水平。
对于用于递送系统的包被细胞的平台(platform)细胞系应尽可能的具有以下特征：(1)在应急条件下，细胞应具有极强的活性(包被细胞在有血管和无血管的组织腔内，如中枢神经系统实质内或空腔内或膜内流体腔隙内或眼内，特别是在眼压上升的环境下应具有功能)。(2)细胞应该能被遗传修饰以表达NsG33。(3)细胞应该有相对长的生存期(细胞应该能产生足够的子代以保存，定性，工程化，安全性试验，临床批量生产)。(4)细胞必需是自来于人体器官(这可以增加包被细胞和宿主之间的生物相容性)。(5)在装置内在体内超过一个月的时间细胞应该仍显示80％以上的存活力(这可以确保长期递送)。(6)包被细胞应能够递送足量的NsG33(其确保治疗的有效性)。(7)包被细胞不应该导致明显的宿主的免疫反应(以确保移植物的寿命)。(8)细胞为非致肿瘤性(即使装置泄漏，对宿主是绝对安全的)。
用于包被的优选细胞包括：视网膜色素上皮细胞，包括ARPE-19细胞；人无限增殖化成纤维细胞；和人无限增殖化星形胶质细胞。
ARPE-19细胞系是一个出众的用于基于递送技术的包被细胞的平台细胞，并也用于基于递送技术的非包被细胞。ARPE-19细胞系具有相当的生存能力(即该细胞株在应急条件下仍能生存，如在中枢神经系统中或眼压上升的环境下移植)。ARPE-19细胞可以被遗传修饰以分泌大量治疗活性物质。ARPE-19细胞具有相当长的生命周期。ARPE-19细胞来源于人体。而且，包被的ARPE-19细胞具有较强的体内装置活力。ARPE-19细胞能够递送有效量的生长因子。ARPE-19细胞几乎不产生宿主免疫反应。而且，ARPE-19细胞为非致肿瘤性。ARPE-19的培养和包被方法详见US6,361,771。
在另一个实施方案中，所述治疗用细胞系选自：人成纤维细胞系，人星形胶质细胞系。人中脑细胞系，人内皮细胞系，优选以TERT、SV40T或vmyc转化这些细胞使之无限增殖化。
制备一个无限增殖化的人星形胶质细胞系方法详见(Price TN，BurkeJF，Mayne LV.A novel human astrocyte cell line(A735)with astrocyte-specificneurotransmitter function.In Vitro Cell Dev Biol Anim.1999May；35(5)：279-88.)。该方法可用于制备星形胶质细胞系。
以下三种改进方法优选用来制备另外的人星形细胞系。
以取自5-12周龄胎儿的胎脑组织替代12-16周龄的组织。
以无限增殖化基因v-myc或TERT(端粒酶)替代SV40 T抗原。
以逆转录病毒基因转移基替代通过磷酸钙沉淀技术进行质粒转染。
XIII本发明的NsG33多肽的重组体制备和纯化
本发明的NsG33多肽的制备应用本领域的真核或原核表达系统。标准方法在WO 93/22437(Innogenetics)有详细描述，在此引入作为参考。由于NsG33多肽与在WO 93/22437中描述的多肽结构相似，因此NsG33多肽的生产方法可以使用该公开中报道的方法来进行。在WO 93/22437中描述了具有预测分子量大约为29KDa的蛋白的纯化。至于NsG33片段的表达，由于其前肽的切除，因此NsG33片段更短，在改进方法时应该考虑分子量的大小因素。
这些实例包括大肠杆菌中的表达(WO 93/22437的实施例5)、COS1细胞中的表达(WO 93/22437的实施例6)，杆状病毒中的表达(WO 93/22437的实时例7)、疫苗病毒中的表达(WO 93/22437的实施例8)。各种不同的表达系统表达生产出多肽的量明显不同如WO 93/22437中所述。
NsG33蛋白的纯化方法使用在WO 93/22437中描述的纯化方法。简要来说，收集本发明的cDNA转染COS1细胞48小时后的条件培养基，用0.22um的滤膜过滤除去细胞碎片。典型的纯化由600-1000ml的COS1转染培养基开始。添加氯化镁和葡聚糖硫酸盐500.000(Pharmacia、Uppsala、Sweden)至终浓度分别为60mM和0.02％。4℃孵育1小时后离心沉淀(12.000g、30min.、4℃)。含有NsG33的上清部分在50mM的Hepes pH 7.0溶液中透析，4mM的EDTA，调节至pH8.0，以0.5ml/分钟流速上样到4ml的Phenylboronate agarose(PBA 30、Amicon、MA、USA)柱中，所述柱已用50mM的Hepes(pH 8.5)平衡。NsG33用100mM的山梨醇从基质中洗脱。
然后，山梨醇洗脱峰以0.5ml/分钟的流速通过1ml的FPLC Mono Q离子交换柱(Pharmacia)，该柱用Hepes(pH 8.5)平衡，以0到1M NaCl线性盐梯度洗脱，流速为1ml/分钟。
洗脱液经Centricon 10.000(Amicon)浓缩40倍后，分批上样(3次，0.25ml)至PBS预平衡的SMART Superdex 75凝胶过滤柱(Pharmacia)。此方法可获得高纯度蛋白的洗脱。
其它蛋白纯化方法也可用于提供足够纯的蛋白以便进行实施例中的体内和体外分析。
XIV.NsG33的体外用途
NsG33多肽和/或编码NsG33的多核苷酸在体外可用作生长因子和营养因子。该用途是基于发现NsG33是一个分泌性的蛋白且具有生长因子和激素的结构特征，而且本发明在几个体外检测中发现NsG33能使神经元传代和/或存活，和/或使神经前体细胞增殖。在神经前体细胞系(hNS1)和原代培养细胞(大鼠纹状体培养细胞)中已经发现NsG33具有神经保护作用和/或神经形成作用。另外在具有神经功能的细胞系(PC12)中发现NsG33具有抗凋亡效应。
NsG33可作为蛋白组合物给药到培养物中，或将编码NsG33的cDNA转导或转导到细胞中。本领域的技术人员使用本领域已知的任何多种分析检测方法可确定NsG33在具体类型的细胞或组织中是否能够有效地进行治疗。例如，关于为细胞提供营养支持，营养因子可产生有益的生物化学和生态学效果，在某些情况下，能促进细胞生存。至于神经元，本领域中已知去除神经元的营养支持物可导致其代谢活性的减少，即葡萄糖的摄取，RNA合成和蛋白合成是正常功能和生长所必需的。Deckwerth和Johnson，J.Cell Biol.123：1207-1222，1993.。去除营养支持也可导致神经元细胞体大小的减小。大概由于营养因子的代谢作用的丧失，营养因子缺乏导致生长减缓或停滞，并可导致神经进行过程的回缩。用于神经生物学的这些方面，除了需要营养因子之外，神经元可能需要神经营养因子以维持神经元存活；存活率分析常用来检测或定量分析神经元营养因子的活性。然而，营养支持物也可显示形态，生物化学和功能的改变；这些改变不依赖神经元数量或对存活率的任何影响。
实施例
实施例1，NsG33序列
SEQ ID NO 1，人NsG33基因组序列，在5′和3′末端添加了100个额外碱基对。
SEQ ID NO 2，人NsG33cDNA序列。
SEQ ID NO 3，人NsG33全长氨基酸序列。
SEQ ID NO 4，无信号肽的人NsG33蛋白
SEQ ID NO 5，人NsG33C末端多肽
SEQ ID NO 6，小鼠NsG33基因组序列，在5′和3′末端添加了100个额外碱基对
SEQ ID NO 7，小鼠NsG33部分cDNA
SEQ ID NO 8，小鼠NsG33部分氨基酸序列
SEQ ID NO 9，无信号肽的小鼠NsG33蛋白
SEQ ID NO 10，小鼠NsG33C末端多肽
SEQ ID NO 11，大鼠NsG33基因组序列，在5′和3′末端添加了100个额外碱基对
SEQ ID NO 12，大鼠NsG33cDNA
SEQ ID NO 13，大鼠NsG33全长氨基酸序列
SEQ ID NO 14，无信号肽的大鼠NsG33蛋白
SEQ ID NO 15，大鼠NsG33C末端多肽
SEQ ID NO 16，编码人NsG33C末端肽的核苷酸序列
SEQ ID NO 17，编码小鼠NsG33C末端肽的核苷酸序列
SEQ ID NO 18，编码大鼠NsG33C末端肽的核苷酸序列
SEQ ID NO 19，人N末端肽
SEQ ID NO 20，小鼠N末端肽
SEQ ID NO 21，大鼠N末端肽
SEQ ID NO 22，人N末端肽
SEQ ID NO 23，小鼠N末端肽
SEQ ID NO 24，大鼠N末端肽
SEQ ID NO 25，小鼠cDNA
SEQ ID NO 26，小鼠全长氨基酸序列
在序列表中，内含子以小写字母标记，外显子以大写字母标记。在多肽序列中，信号肽以粗体标记。
人NsG33基因组核苷酸序列(SEQ ID NO 1)
actggccgac acgccgcagg ccccgccccc ttcccgaccc gctccaaggc  0050
ggccccggcg ctggggctgc gcggcaggcg gagcggccgc gggcttgggg  0100
GCTTCGCCGG GGCCGGGCGG CCGGCGCCCC CGGCTGCTCC CGCCGCCGCC  0150
CGGACCCGCG CCCCGCCGGG GCAGCGGTGG TGAGAGCCCC GACTCCCCGG  0200
ACGCCGCCCG CCGTGCCATG GGGTTCCCGG CCGCGGCGCT GCTCTGCGCG  0250
CTGTGCTGCG GCCTCCTGGC CCCGGCTGCC CGCGCCGGCT ACTCCGAGGA  0300
GCGCTGCAGC TGGAGGGGCA Ggtacggtcc ggggggctgt ccccgcactt  0350
aggacggggt gcgctgcggc taggaccccc caggcgcccc tcggagcgcg  0400
cagagcgctg ggccggtttc cccatccgcg aggcggcctc gggagggagc  0450
gggggctgcg ccgggcgggg acccgccccc gtctcagcgc cccgtcccgt  0500
cctgtcccca gCGGCCTCAC CCAGGAGCCC GGCAGCGTGG GGCAGCTGGC  0550
CCTGGCCTGT GCGGAGGGCG CGGTTGAGTG GCTGTACCCG GCTGGGGCGC  0600
TGCGCCTGAC CCTGGGCGGC CCCGATCCCA GAGCGCGGCC CGGCATCGCC  0650
TGTCTGCGGC CGGTGCGGCC CTTCGCGGGC GCCCAGGTCT TCGCGGAGCG  0700
CGCAGGGGGC GCCCTGGAGC TGCTGCTGGC CGAGGGCCCG GGCCCGGCAG  0750
GGGGCCGCTG CGTGCGCTGG GGTCCCCGCG AGCGCCGGGC CCTCTTCCTG  0800
CAGGCCACGC CGCACCAGGA CATCAGCCGC CGCGTGGCCG CCTTCCGCTT  0850
TGAGCTGCGC GAGGACGGGC GCCCCGAGCT GCCCCCGCAG GCCCACGGTC  0900
TCGGCGTAGA CGgtgagtgg cggtctggtt gggacagggt gggagtcccg  0950
aagtcttacc ctgcctgggc ttggcgggaa tgtgccttgt cggccccact  1000
gcagaaggaa aaagtgagct acaagggttg gatgggcttg tcaggccaca  1050
cagcctggga ctgctgggga gggatggcct ccccgccctc ccttcccgat  1100
tcatctctgg aaagagctgg caggggcaga gtggagggaa ggggaggccg  1150
ggcccagcaa tcctgggcct ctggtccctg aacggttggg ggaagagatg  1200
gtggggacag aatcgaagcc tccggccaaa gctgtccggg gctccctggc  1250
ccagcggtga cctctctccc ctcccccagc ccaaccaaca aaagtccagt  1300
gtgcagcccg gtcaccatgg agacgccgct cgcctccctg cagggcacca  1350
ggcccagctc ttgcttggct ctcctggagc ttggcgcctg accctgaaag  1400
ggatgggctc tcgctattct gccccctggc cctgggccag ggaccccaga  1450
ccacccttcc tctgccccca cttcctatca ccctagctgg gctgctgctc  1500
ttcagacctc agatccggga aactagaggg gtcccagatg ctggggtgca  1550
tatgtcagat gggagtgcag gagggcggcc caggacagct gatcgctagg  1600
catggccccc aggcccacgt ctgtgtgcat tcctgccttg gaggtacgcg  1650
cctgcaagtg tgtttcctga gtacaggtgt cgccgagggc gtgcacatct  1700
gctgtgtagc tctctgggac ccccaggtgc catcaggccc tgagcgtggg  1750
ctctgctcat ttgcctgctg cctcctgccg cttgtgcgga caagggacgg  1800
ggcctggggt gatgccggga gagggcaggg cctctcctca ccaccccctc  1850
tgcatgccag GTGCCTGCAG GCCCTGCAGC GACGCTGAGC TGCTCCTGGC  1900
CGCATGCACC AGCGACTTCG gtgagtgtcc ccgccatggg gggagcctgg  1950
agcctgcctt cccctgaatg cctaccgcag ccacatgcct ccccacagTA  2000
ATTCACGGGA TCATCCATGG GGTCACCCAT GACGTGGAGC TGCAGGAGTC  2050
TGTCATCACT GTGGTGGCCG CCCGTGTCCT CCGCCAGACA CCGCCGCTGT  2100
TCCAGGCGGG GCGATCCGGG GACCAGGGGC TGACCTCCAT TCGTACCCCA  2150
CTGCGCTGTG GCGTCCACCC GGGCCCAGGC ACCTTCCTCT TCATGGGCTG  2200
GAGCCGCTTT GGGGAGGCCC GGCTGGGCTG TGCCCCACGA TTCCAGGAGT  2250
TCCGCCGTGC CTACGAGGCT GCCCGTGCTG CCCACCTCCA CCCCTGCGAG  2300
GTGGCGCTGC ACTGAGGGGC TGGGTGCTGG GGAGGGGCTG GTAGGAGGGA  2350
GGGTGGGCCC ACTGCTTTGG AGGTGATGGG ACTATCAATA AGAACTCTGT  2400
TCACGCAAgc tgctgtggac ctggtctcct gtgtccagcc cagccttggg  2450
cctgcctcgc agctgtgagg atggctccaa ttcctgcctc ctggcgggag  2500
actgaggc
人NsG33(1109bp；CDS＝118-999)(SEQ ID NO 2)
＞gi|34147349|ref|NM_024042.2|人假拟蛋白(Homo sapiens hypotheticalprotein)MGC2601(MGC2601)、mRNA
GCTTCGCCGGGGCCGGGCGGCCGGCGCCCCCGGCTGCTCCCGCCGCCGCCCGGACCCGCGCCCCGCCGGG
GCAGCGGTGGTGAGAGCCCCGACTCCCCGGACGCCGCCCGCCGTGCCATGGGGTTCCCGGCCGCGGCGCT
GCTCTGCGCGCTGTGCTGCGGCCTCCTGGCCCCGGCTGCCCGCGCCGGCTACTCCGAGGAGCGCTGCAGC
TGGAGGGGCAGCGGCCTCACCCAGGAGCCCGGCAGCGTGGGGCAGCTGGCCCTGGCCTGTGCGGAGGGCG
CGGTTGAGTGGCTGTACCCGGCTGGGGCGCTGCGCCTGACCCTGGGCGGCCCCGATCCCAGAGCGCGGCC
CGGCATCGCCTGTCTGCGGCCGGTGCGGCCCTTCGCGGGCGCCCAGGTCTTCGCGGAGCGCGCAGGGGGC
GCCCTGGAGCTGCTGCTGGCCGAGGGCCCGGGCCCGGCAGGGGGCCGCTGCGTGCGCTGGGGTCCCCGCG
AGCGCCGGGCCCTCTTCCTGCAGGCCACGCCGCACCAGGACATCAGCCGCCGCGTGGCCGCCTTCCGCTT
TGAGCTGCGCGAGGACGGGCGCCCCGAGCTGCCCCCGCAGGCCCACGGTCTCGGCGTAGACGGTGCCTGC
AGGCCCTGCAGCGACGCTGAGCTGCTCCTGGCCGCATGCACCAGCGACTTCGTAATTCACGGGATCATCC
ATGGGGTCACCCATGACGTGGAGCTGCAGGAGTCTGTCATCACTGTGGTGGCCGCCCGTGTCCTCCGCCA
GACACCGCCGCTGTTCCAGGCGGGGCGATCCGGGGACCAGGGGCTGACCTCCATTCGTACCCCACTGCGC
TGTGGCGTCCACCCGGGCCCAGGCACCTTCCTCTTCATGGGCTGGAGCCGCTTTGGGGAGGCCCGGCTGG
GCTGTGCCCCACGATTCCAGGAGTTCCGCCGTGCCTACGAGGCTGCCCGTGCTGCCCACCTCCACCCCTG
CGAGGTGGCGCTGCACTGAGGGGCTGGGTGCTGGGGAGGGGCTGGTAGGAGGGAGGGTGGGCCCACTGCT
TTGGAGGTGATGGGACTATCAATAAGAACTCTGTTCACGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
编码人NsG33C末端多肽的核苷酸序列(SEQ ID NO 16)
GCCCTCTTCCTGCAGGCCACGCCGCACCAGGACATCAGCCGCCGCGTGGCCGCCTTCCGCTTTGAGCTGC
GCGAGGACGGGCGCCCCGAGCTGCCCCCGCAGGCCCACGGTCTCGGCGTAGACGGTGCCTGCAGGCCCTG
CAGCGACGCTGAGCTGCTCCTGGCCGCATGCACCAGCGACTTCGTAATTCACGGGATCATCCATGGGGTC
ACCCATGACGTGGAGCTGCAGGAGTCTGTCATCACTGTGGTGGCCGCCCGTGTCCTCCGCCAGACACCGC
CGCTGTTCCAGGCGGGGCGATCCGGGGACCAGGGGCTGACCTCCATTCGTACCCCACTGCGCTGTGGCGT
CCACCCGGGCCCAGGCACCTTCCTCTTCATGGGCTGGAGCCGCTTTGGGGAGGCCCGGCTGGGCTGTGCC
CCACGATTCCAGGAGTTCCGCCGTGCCTACGAGGCTGCCCGTGCTGCCCACCTCCACCCCTGCGAGGTGG
CGCTGCAC
人NsG33全长氨基酸序列(SEQ ID NO 3)
＞IPI00031531.1  REFSEQ_NP：NP_076947  TREMBL：Q9UJH9ENSEMBL：ENSP00000219542 Tax_Id＝9606C380A1.2.1(新蛋白)
MGFPAAALLC ALCCGLLAPA ARAGYSEERC SWRGSGLTQE PGSVGQLALA CAEGAVEWLY
PAGALRLTLG GPDPRARPGI ACLRPVRPFA GAQVFAERAG GALELLLAEG PGPAGGRCVR
WGPRERRALF LQATPHQDIS RRVAAFRFEL REDGRPELPP QAHGLGVDGA CRPCSDAELL
LAACTSDFVI HGIIHGVTHD VELQESVITV VAARVLRQTP PLFQAGRSGD QGLTSIRTPL
RCGVHPGPGT FLFMGWSRFG EARLGCAPRF QEFRRAYEAA RAAHLHPCEV ALH
无信号肽的人NsG33蛋白(SEQ ID NO 4)
GYSEERCSWR GSGLTQEPGS VGQLALACAE GAVEWLYPAG ALRLTLGGPD PRARPGIACL
RPVRPFAGAQ VFAERAGGAL ELLLAEGPGP AGGRCVRWGP RERRALFLQA TPHQDISRRV
AAFRFELRED GRPELPPQAH GLGVDGACRP CSDAELLLAA CTSDFVIHGI IHGVTHDVEL
QESVITVVAA RVLRQTPPLF QAGRSGDQGL TSIRTPLRCG VHPGPGTFLF MGWSRFGEAR
LGCAPRFQE F RRAYEAARAA HLHPCEVALH
人NsG33，C末端多肽(SEQ ID NO 5)
ALFLQATPHQ DISRRVAAFR FELREDGRPE LPPQAHGLGV DGACRPCSDA ELLLAACTSD
FVIHGIIHGV THDVELQESV ITVVAARVLR QTPPLFQAGR SGDQGLTSIR TPLRCGVHPG
PGTFLFMGWS RFGEARLGCA PRFQEFRRAY EAARAAHLHP CEVALH
人N末端肽(SEQ ID No 19)
GYSEERCSWR GSGLTQEPGS VGQLALACAE GAVEWLYPAG ALRLTLGGPD PRARPGIACL
RPVRPFAGAQ VFAERAGGAL ELLLAEGPGP AGGRCVRWGP RERR
人N末端肽(SEQ ID No 22)
GYSEERCSWR GSGLTQEPGS VGQLALACAE GAVEWLYPAG ALRLTLGGPD PRARPGIACL
RPVRPFAGAQ VFAERAGGAL ELLLAEGPGP AGGRCVR
小鼠NsG33基因组核苷酸序列(SEQ ID NO 6)
基因组chr17(Genomic chr17)(反义链)：
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn  0050
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnncc cctaaccatg ctggtagcca  0100
CGCTTCTTTG CGCGCTCTGT TGCGGCCTCC TGGCCGCGTC CGCTCACGCT  0150
GGCTACTCGG AAGACCGCTG CAGCTGGAGG GGCAGgtacc aggagggact  0200
gcggggaggg ttgtgggttt atttatttat ttattttatt ttatttactt  0250
cttgggttgg agggttccct cccacttgga actgaggaaa cgcagacttc  0300
aatgtcctgt tacacagagt agaagcagat gttggtagcc gcgggaaaag  0350
ggatgagcgg gctagggaac gagggtcacc cacctgagaa ccaccgtcct  0400
gtccccagCG GTTTGACCCA GGAGCCTGGC AGCGTGGGGC AGCTGACCCT  0450
GGACTGTACT GAGGGCGCTA TCGAGTGGCT GTACCCAGCT GGGGCGCTGC  0500
GCCTGACCCT GGGCGGCCCC GATCCGGGCA CACGGCCCAG CATCGTCTGT  0550
CTGCGCCCAG AGCGGCCCTT CGCTGGTGCC CAGGTCTTCG CTGAACGTAT  0600
GACCGGCAAT CTAGAGTTGC TACTGGCCGA GGGCCCGGAC CTGGCTGGGG  0650
GCCGCTGCAT GCGCTGGGGT CCCCGCGAGC GCCGAGCCCT TTTCCTGCAG  0700
GCCACACCAC ACCGCGACAT CAGCCGCAGA GTTGCTGCCT TCCGTTTTGA  0750
ACTGCACGAG GACCAACGTG CAGAAATGTC TCCCCAGGCT CAAGGTCTTG  0800
GTGTGGATGg tgagtgatta tgagactggc tgggtgtcag aaattggccc  0850
tccacactga cctgatggga ctgggccttg ccaccccatt gcatggagag  0900
tccttctgta gcttgacaga ggccactccg gtggagagca tagtggcttc  0950
caggtcgtaa ggaggtgagt tggaagtgcc cccgcctttc tctcctcctc  1000
ctcttaaaag attcggttta ggaaaagagc aggagggggc aaatgcccga  1050
gaggccagcc ctgggtctct ggtttctgaa ggattggggg aagggttaag  1100
ctgaggcaga atcaaagcct atggccaagg ctgtccaggg ctccctggcc  1150
tggtggtgac ctccttcccc tccccccaag cccagccaac aaaagtccag  1200
tgtgcctctt cgtcaccatg gagactgcct gccctgcctc cctgcagggc  1250
accaggccca gtgctttgct cttctggaac ttgtagcctg accctgcagg  1300
gaatgaatgg ctctctgact gttctgccct agctagagac ccccccgaac  1350
tggagtccac tagaatatcc ctagctagag ctgggaggtc acagaacgtt  1400
tcccagtgtt agtctgagtt tatgagatgg taccaagcct gtgtatgagg  1450
cactgaggtg cccatcagta ggcatgtacc tgcagggtgt cttcaggcta  1500
taggatgctg ggagaagggt ttagtctctt gctcctgtac cttttcctct  1550
tgggaggagc tgtgggctcg tgctgagaga tcacaggcct ggctgatgac  1600
ctgccttgca tgctagGTGC CTGCAGGCCC TGCAGTGATG CCGAGCTCCT  1650
CCTGGCTGCA TGCACCAGTG ATTTTGgtga gtgtttctgt tgcgggagag  1700
cttagggtct gcctcacatt cccacgtgcc caccactggc caccatgtct  1750
cctcgtagTG ATCCACGGGA CCATCCATGG GGTCGCCCAT GACACAGAGC  1800
TGCAAGAATC AGTCATCACT GTGGTGGTTG CTCGTGTCAT CCGCCAGACA  1850
CTGCCACTGT TCAAGGAAGG GAGCTCGGAG GGCCAAGGCC GGGCCTCCAT  1900
TCGTACCTTG CTGCGCTGTG GTGTGCGTCC TGGCCCAGGC TCCTTCCTCT  1950
TCATGGGCTG GAGCCGATTT GGCGAAGCTT GGCTGGGCTG TGCTCCCCGC  2000
TTCCAAGAGT TCAGCCGTGT CTATTCAGCT GCTCTCACGA CCCATCTCAA  2050
CCCATGTGAG ATGGCACTGG ACTGAGAGAC CTGGGAGCAA GCCCTGGATG  2100
GACCTTCTTC TGGAGATGGG GTGTTGGGGA GGGTGATGGG AGGGTGGGTG  2150
AGAAGGGTGT GGCTCGGATG GCATCCTGGT ACCCACAGTG AGCTGGTAGA  2200
ATACTAAGTA ATCTGGACCA TAccagccac tgtagtcatg gtcttctgtg  2250
gcaggcagca tacccagctc tgtgcctgcc tcactttgtc tactctccag  2300
tctgctgccc ttctaaccct tc
小鼠NsG33部分cDNA(1048bp；CDS＝＜2-886)(SEQ ID NO 7)
CCACGCGTCCGCCCACGCGTCCGCGCTTCTTTGCGCGCTCTGTTGCGGCCTCCTGGCCGCGTCCGCTCAC
GCTGGCTACTCGGAAGACCGCTGCAGCTGGAGGGGCAGCGGTTTGACCCAGGAGCCTGGCAGCGTGGGGC
AGCTGACCCTGGACTGTACTGAGGGCGCTATCGAGTGGCTGTACCCAGCTGGGGCGCTGCGCCTGACCCT
GGGCGGCCCCGATCCGGGCACACGGCCCAGCATCGTCTGTCTGCGCCCAGAGCGGCCCTTCGCTGGTGCC
CAGGTCTTCGCTGAACGTATGACCGGCAATCTAGAGTTGCTACTGGCCGAGGGCCCGGACCTGGCTGGGG
GCCGCTGCATGCGCTGGGGTCCCCGCGAGCGCCGAGCCCTTTTCCTGCAGGCCACACCACACCGCGACAT
CAGCCGCAGAGTTGCTGCCTTCCGTTTTGAACTGCACGAGGACCAACGTGCAGAAATGTCTCCCCAGGCT
CAAGGTCTTGGTGTGGATGGTGCCTGCAGGCCCTGCAGTGATGCCGAGCTCCTCCTGGCTGCATGCACCA
GTGATTTTGTGATCCACGGGACCATCCATGGGGTCGCCCATGACACAGAGCTGCAAGAATCAGTCATCAC
TGTGGTGGTTGCTCGTGTCATCCGCCAGACACTGCCACTGTTCAAGGAAGGGAGCTCGGAGGGCCAAGGC
CGGGCCTCCATTCGTACCTTGCTGCGCTGTGGTGTGCGTCCTGGCCCAGGCTCCTTCCTCTTCATGGGCT
GGAGCCGATTTGGCGAAGCTTGGCTGGGCTGTGCTCCCCGCTTCCAAGAGTTCAGCCGTGTCTATTCAGC
TGCTCTCACGACCCATCTCAACCCATGTGAGATGGCACTGGACTGAGAGACCTGGGAGCAAGCCCTGGAT
GGACCTTCTTCTGGAGATGGGGTGTTGGGGAGGGTGATGGGAGGGTGGGTGAGAAGGGTGTGGCTCGGAT
GGCATCCTGGTACCCACAGTGAGCTGGTAGAATACTAAGTAATCTGGACCATAAAAAAAAAAAAAAAA
小鼠NsG33cDNA，1363bp、CDS 84..959(SEQ ID NO 25)
NM_133719.小鼠肌肉meteorin.[gi：56550040]
gggcagccgc gccgcgggct gctcgcgctg cggccccgac cctcccgggg cagcagtccg
aggccccggc gcgtccccta accatgctgg tagccacgct tctttgcgcg ctctgttgcg
gcctcctggc cgcgtccgct cacgctggct actcggaaga ccgctgcagc tggaggggca
gcggtttgac ccaggagcct ggcagcgtgg ggcagctgac cctggactgt actgagggcg
ctatcgagtg gctgtaccca gctggggcgc tgcgcctgac cctgggcggc cccgatccgg
gcacacggcc cagcatcgtc tgtctgcgcc cagagcggcc cttcgctggt gcccaggtct
tcgctgaacg tatgaccggc aatctagagt tgctactggc cgagggcccg gacctggctg
ggggccgctg catgcgctgg ggtccccgcg agcgccgagc ccttttcctg caggccacac
cacaccgcga catcagccgc agagttgctg ccttccgttt tgaactgcac gaggaccaac
gtgcagaaat gtctccccag gctcaaggtc ttggtgtgga tggtgcctgc aggccctgca
gtgatgccga gctcctcctg gctgcatgca ccagtgattt tgtgatccac gggaccatcc
atggggtcgc ccatgacaca gagctgcaag aatcagtcat cactgtggtg gttgctcgtg
tcatccgcca gacactgcca ctgttcaagg aagggagctc ggagggccaa ggccgggcct
ccattcgtac cttgctgcgc tgtggtgtgc gtcctggccc aggctccttc ctcttcatgg
gctggagccg atttggcgaa gcttggctgg gctgtgctcc ccgcttccaa gagttcagcc
gtgtctattc agctgctctc acgacccatc tcaacccatg tgagatggca ctggactgag
agacctggga gcaagccctg gatggacctt cttctggaga tggggtgttg gggagggtga
tgggagggtg ggtgagaagg gtgtggctcg gatggcatcc tggtacccac agtgagctgg
tagaatacta agtaatctgg accataccag ccactgtagt catggtcttc tgtggcaggc
agcataccca gctctgtgcc tgcctcactt tgtctactct ccagtctgct gcccttctaa
cccttcttag cctgctgacc agtgagctca tgttttcctc gaattccagg gtgctgctgg
ggttcagagc aaccgtgccg tagtttggaa gacttgagct aattgttttt tttttgtttg
tttttttgtt tgtttaaagg tggcctgggg ggggcggcaa aca
编码小鼠C末端多肽NsG33的核苷酸序列(SEQ ID NO 17)
GCCCTTTTCCTGCAGGCCACACCACACCGCGACATCAGCCGCAGAGTTGCTGCCTTCCGTTTTGAACTGC
ACGAGGACCAACGTGCAGAAATGTCTCCCCAGGCTCAAGGTCTTGGTGTGGATGGTGCCTGCAGGCCCTG
CAGTGATGCCGAGCTCCTCCTGGCTGCATGCACCAGTGATTTTGTGATCCACGGGACCATCCATGGGGTC
GCCCATGACACAGAGCTGCAAGAATCAGTCATCACTGTGGTGGTTGCTCGTGTCATCCGCCAGACACTGC
CACTGTTCAAGGAAGGGAGCTCGGAGGGCCAAGGCCGGGCCTCCATTCGTACCTTGCTGCGCTGTGGTGT
GCGTCCTGGCCCAGGCTCCTTCCTCTTCATGGGCTGGAGCCGATTTGGCGAAGCTTGGCTGGGCTGTGCT
CCCCGCTTCCAAGAGTTCAGCCGTGTCTATTCAGCTGCTCTCACGACCCATCTCAACCCATGTGAGATGG
CACTGGAC
小鼠NsG33部分NsG33(SEQ ID NO 8)即缺失N末端
＞gi|23274274|gb|AAH37181.1|1810034B16Rik蛋白[小鼠肌肉]
HASAHASALL CALCCGLLAA SAHAGYSEDR CSWRGSGLTQ EPGSVGQLTL DCTEGAIEWL
YPAGALRLTL GGPDPGTRPS IVCLRPERPF AGAQVFAERM TGNLELLLAE GPDLAGGRCM
RWGPRERRAL FLQATPHRDI SRRVAAFRFE LHEDQRAEMS PQAQGLGVDG ACRPCSDAEL
LLAACTSDFV IHGTIHGVAH DTELQESVIT VVVARVIRQT LPLFKEGSSE GQGRASIRTL
LRCGVRPGPG SFLFMGWSRF GEAWLGCAPR FQEFSRVYSA ALTTHLNPCE MALD
小鼠NsG33全长氨基酸序列(SEQ ID NO 26)
ref|NP_598480.1|meteorin[小鼠肌肉]
MLVATLLCAL CCGLLAASAH AGYSEDRCSW RGSGLTQEPG SVGQLTLDCT EGAIEWLYPA
GALRLTLGGP DPGTRPSIVC LRPERPFAGA QVFAERMTGN LELLLAEGPD LAGGRCMRWG
PRERRALFLQ ATPHRDISRR VAAFRFELHE DQRAEMSPQA QGLGVDGACR PCSDAELLLA
ACTSDFVIHG TIHGVAHDTE LQESVITVVV ARVIRQTLPL FKEGSSEGQG RASIRTLLRC
GVRPGPGSFL FMGWSRFGEA WLGCAPRFQE FSRVYSAALT THLNPCEMAL D
无信号肽的小鼠NsG33蛋白(SEQ ID NO 9)
GYSEDRCSWR GSGLTQEPGS VGQLTLDCTE GAIEWLYPAG ALRLTLGGPD PGTRPSIVCL RPERPFAGAQ
VFAERMTGNL ELLLAEGPDL AGGRCMRWGP RERRALFLQA TPHRDISRRV AAFRFELHED QRAEMSPQAQ
GLGVDGACRP CSDAELLLAA CTSDFVIHGT IHGVAHDTEL QESVITVVVA RVIRQTLPLF KEGSSEGQGR
ASIRTLLRCG VRPGPGSFLF MGWSRFGEAW LGCAPRFQEF SRVYSAALTT HLNPCEMALD
小鼠NsG33，C末端多肽(SEQ ID NO 10)
ALFLQATPHR DISRRVAAFR FELHEDQRAE MSPQAQGLGV DGACRPCSDA ELLLAACTSD FVIHGTIHGV
AHDTELQESV ITVVVARVIR QTLPLFKEGS SEGQGRASIR TLLRCGVRPG PGSFLFMGWS RFGEAWLGCA
PRFQEFSRVY SAALTTHLNP CEMALD
小鼠NsG33，N末端多肽(SEQ ID NO 20)
GYSEDRCSWR GSGLTQEPGS VGQLTLDCTE GAIEWLYPAG ALRLTLGGPD PGTRPSIVCL RPERPFAGAQ
VFAERMTGNL ELLLAEGPDL AGGRCMRWGP RERR
小鼠NsG33，N末端多肽(SEQ ID NO 23)
GYSEDRCSWR GSGLTQEPGS VGQLTLDCTE GAIEWLYPAG ALRLTLGGPD PGTRPSIVCL RPERPFAGAQ
VFAERMTGNL ELLLAEGPDL AGGRCMR
大鼠NsG33基因组序列，在5′和3′末端添加了100个额外碱基对(SEQID NO 11)。基因组chr 10(反义链)：
tccccggttg tggggannnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn  15064142
nnnnnnnnnn nnnnnnggca gcagcccgag ccccggcgcg tcccctaacc  15064092
ATGCTGGTAG CGGCGCTTCT CTGCGCGCTG TGCTGCGGCC TCTTGGCTGC  15064042
GTCCGCTCGA GCTGGCTACT CCGAGGACCG CTGCAGCTGG AGGGGCAGgt  15063992
acccaggaga gattttgggg aggatttttg ttatttgtgt tttaaattga  15063942
aatcttgggt tggagggctc cctcccactt ggaactgagg aagcgcagac  15063892
ctcaatgtcc tgttccagag ggtggacgca ggtgttggtg gccgcgggaa  15063842
aagggttgag cgggctaggg aaatgagggc cacccacctg agaaccaccg  15063792
tcctgtcccc agCGGTTTGA CCCAGGAACC TGGCAGCGTG GGGCAGCTGA  15063742
CCCTGGATTG TACTGAGGGT GCTATCGAGT GGCTGTATCC AGCTGGGGCG  15063692
CTGCGCCTGA CTCTAGGCGG CTCTGATCCG GGCACGCGGC CCAGCATCGT  15063642
CTGTCTGCGC CCAACACGGC CCTTCGCTGG TGCCCAGGTC TTCGCTGAAC  15063592
GGATGGCCGG CAACCTAGAG TTGCTACTGG CCGAGGGCCA AGGCCTGGCT  15063542
GGGGGCCGCT GCATGCGCTG GGGTCCTCGC GAGCGCCGAG CCCTTTTCCT  15063492
GCAGGCCACG CCACACCGGG ACATCAGCCG CAGAGTTGCT GCCTTCCAAT  15063442
TTGAACTGCA CGAGGACCAA CGTGCAGAAA TGTCTCCCCA GGCCCAAGGT  15063392
TTTGGTGTGG ATGgtgagtg actagactgg ctggggcgga gctgggtgtc  15063342
agaaactggc cctctacact ggcctgatcc gaatgggcct tgcctcccca  15063292
ctgcaccgaa agccctgtag cttgacggag gctactctgg tggagaacac  15063242
agtggcttcc aggtcatagg gaggtgagtt gagagttctc cctcctttct  15063192
ctcctcctct tcaaggttcg gtttaggaaa agagcgggag ggggcagatg  15063142
ccagagaggc cagccttggg tctctggttt ctgaagggtt ggggggaagg  15063092
gttgggctgg ggcagaatca aagcctatgg ccgaagctgt ccagggctcc  15063042
ctggccttgt ggtgacctcc ttcccctccc cctagcccaa ccaacaaaag  15062992
tccagtgtgc ctcttcgtca ccatggagac tgcctgccct gcctcccggc  15062942
agggcaccag gcccagtgct ttgctcttct ggaacttgtc tcctgaccct  15062892
gcagggaatg gctctctgac tgctctgcca tagacagaga ccccagaagc  15062842
agagtccact agaatatccc tggctggacc tgggaggcag ctctgggagg  15062792
ttacagaaag ttccccagtg ttggtctgag tttctgagat gggtgtgcag  15062742
gaatgtgtcc gaggcactga ggggcccatg agtagtcttc aggcagtgtg  15062692
atgctgggag aagggtttag tcgccagctc ctgtaccttc tcctactgtg  15062642
gggagctgtg ggcttgtgct gagagatcac aggcctgcct gatgacctgc  15062592
cttgcatgct agGTGCCTGC AGGCCCTGCA GTGATGCCGA GCTCCTTCTG  15062542
ACTGCATGCA CCAGTGACTT TGgtgagtgt ttccgtcttg ggagagctta  15062492
gggtctgccc cacattccca cgtgcccacc actggccacc atgtctcttc  15062442
gtagTGATCC ATGGGACCAT CCATGGGGTC GTCCATGACA TGGAGCTGCA  15062392
AGAATCAGTC ATCACTGTGG TGGCCACTCG TGTCATCCGC CAGACACTGC  15062342
CACTGTTCCA GGAAGGGAGC TCGGAGGGCC GGGGCCAGGC CTCCGTTCGT  15062292
ACCTTGTTGC GCTGTGGTGT GCGTCCTGGC CCAGGCTCCT TCCTCTTCAT  15062242
GGGCTGGAGC CGATTTGGCG AAGCTTGGCT GGGCTGCGCT CCCCGCTTCC  15062192
AAGAGTTCAG CCGTGTCTAT TCAGCTGCTC TCGCGGCCCA CCTCAACCCA  15062142
TGTGAGGTGG CACTGGACTG AGAGACCTGG GAGCAAGCCC TGGATGGATC  15062092
TTCCTCTGGG GATGGGGTGT TGGGGAGGGG TGATAGGAGG GTGGGTGGGA  15062042
AGGGTGTGGC TCAGATGGCA TCCTGGTACC CACAGTGAGG TGGTAGAATA  15061992
CTAAATAACC TGGATCACAC Cagccactgt agacatggtc ttctgtgaca  15061942
ggcaggctca ctcagctctg ctcctgcctc actttaccta ctctccagtc  15061892
tgctgccctt ctgacccttc t
SEQ ID NO 12，大鼠NsG33(1026bp；CDS＝1-876)
＞gi|34870570|ref|XM_213261.2|Rattus norvegicus相似于1810034B 16Rik蛋白(LOC287151)、mRNA
ATGCTGGTAGCGGCGCTTCTCTGCGCGCTGTGCTGCGGCCTCTTGGCTGCGTCCGCTCGAGCTGGCTACT
CCGAGGACCGCTGCAGCTGGAGGGGCAGCGGTTTGACCCAGGAACCTGGCAGCGTGGGGCAGCTGACCCT
GGATTGTACTGAGGGTGCTATCGAGTGGCTGTATCCAGCTGGGGCGCTGCGCCTGACTCTAGGCGGCTCT
GATCCGGGCACGCGGCCCAGCATCGTCTGTCTGCGCCCAACACGGCCCTTCGCTGGTGCCCAGGTCTTCG
CTGAACGGATGGCCGGCAACCTAGAGTTGCTACTGGCCGAGGGCCAAGGCCTGGCTGGGGGCCGCTGCAT
GCGCTGGGGTCCTCGCGAGCGCCGAGCCCTTTTCCTGCAGGCCACGCCACACCGGGACATCAGCCGCAGA
GTTGCTGCCTTCCAATTTGAACTGCACGAGGACCAACGTGCAGAAATGTCTCCCCAGGCCCAAGGTTTTG
GTGTGGATGGTGCCTGCAGGCCCTGCAGTGATGCCGAGCTCCTTCTGACTGCATGCACCAGTGACTTTGT
GATCCATGGGACCATCCATGGGGTCGTCCATGACATGGAGCTGCAAGAATCAGTCATCACTGTGGTGGCC
ACTCGTGTCATCCGCCAGACACTGCCACTGTTCCAGGAAGGGAGCTCGGAGGGCCGGGGCCAGGCCTCCG
TTCGTACCTTGTTGCGCTGTGGTGTGCGTCCTGGCCCAGGCTCCTTCCTCTTCATGGGCTGGAGCCGATT
TGGCGAAGCTTGGCTGGGCTGCGCTCCCCGCTTCCAAGAGTTCAGCCGTGTCTATTCAGCTGCTCTCGCG
GCCCACCTCAACCCATGTGAGGTGGCACTGGACTGAGAGACCTGGGAGCAAGCCCTGGATGGATCTTCCT
CTGGGGATGGGGTGTTGGGGAGGGGTGATAGGAGGGTGGGTGGGAAGGGTGTGGCTCAGATGGCATCCTG
GTACCCACAGTGAGGTGGTAGAATACTAAATAACCTGGATCACACC
大鼠C末端多肽NsG33的编码序列(SEQ ID NO 18)
GCCCTTTTCCTGCAGGCCACGCCACACCGGGACATCAGCCGCAGAGTTGCTGCCTTCCAA
TTTGAACTGCACGAGGACCAACGTGCAGAAATGTCTCCCCAGGCCCAAGGTTTTGGTGTG
GATGGTGCCTGCAGGCCCTGCAGTGATGCCGAGCTCCTTCTGACTGCATGCACCAGTGAC
TTTGTGATCCATGGGACCATCCATGGGGTCGTCCATGACATGGAGCTGCAAGAATCAGTC
ATCACTGTGGTGGCCACTCGTGTCATCCGCCAGACACTGCCACTGTTCCAGGAAGGGAGC
TCGGAGGGCCGGGGCCAGGCCTCCGTTCGTACCTTGTTGCGCTGTGGTGTGCGTCCTGGC
CCAGGCTCCTTCCTCTTCATGGGCTGGAGCCGATTTGGCGAAGCTTGGCTGGGCTGCGCT
CCCCGCTTCCAAGAGTTCAGCCGTGTCTATTCAGCTGCTCTCGCGGCCCACCTCAACCCA
TGTGAGGTGGCACTGGAC
大鼠NsG33全长氨基酸序列(SEQ ID NO 13)
＞IPI00369281.1|REFSEQ_XP：XP_213261|ENSEMBL：ENSRNOP00000026676
MLVAALLCAL CCGLLAASAR AGYSEDRCSW RGSGLTQEPG SVGQLTLDCT EGAIEWLYPA
GALRLTLGGS DPGTRPSIVC LRPTRPFAGA QVFAERMAGN LELLLAEGQG LAGGRCMRWG
PRERRALFLQ ATPHRDISRR VAAFQFELHE DQRAEMSPQA QGFGVDGACR PCSDAELLLT
ACTSDFVIHG TIHGVVHDME LQESVITVVA TRVIRQTLPL FQEGSSEGRG QASVRTLLRC
GVRPGPGSFL FMGWSRFGEA WLGCAPRFQE FSRVYSAALA AHLNPCEVAL D
无信号肽的大鼠NsG33蛋白(SEQ ID NO 14)
(ASARA)GYSED RCSWRGSGLT QEPGSVGQLT LDCTEGAIEW LYPAGALRLT LGGSDPGTRP
SIVCLRPTRP FAGAQVFAER MAGNLELLLA EGQGLAGGRC MRWGPRERRA LFLQATPHRD
ISRRVAAFQF ELHEDQRAEM SPQAQGFGVD GACRPCSDAE LLLTACTSDF VIHGTIHGVV
HDMELQESVI TVVATRVIRQ TLPLFQEGSS EGRGQASVRT LLRCGVRPGP GSFLFMGWSR
FGEAWLGCAP RFQEFSRVYS AALAAHLNPC EVALD
大鼠NsG33，C末端多肽(SEQ ID NO 15)
ALFLQATPHR DISRRVAAFQ FELHEDQRAE MSPQAQGFGV DGACRPCSDA ELLLTACTSD
FVIHGTIHGV VHDMELQESV ITVVATRVIR QTLPLFQEGS SEGRGQASVR TLLRCGVRPG
PGSFLFMGWS RFGEAWLGCA PRFQEFSRVY SAALAAHLNP CEVALD
大鼠NsG33，N末端多肽(SEQ ID NO 21)
(ASARA)GYSED RCSWRGSGLT QEPGSVGQLT LDCTEGAIEW LYPAGALRLT LGGSDPGTRP
SIVCLRPTRP FAGAQVFAER MAGNLELLLA EGQGLAGGRC MRWGPRERR
大鼠NsG33，N末端多肽(SEQ ID NO 24)
(ASARA)GYSED RCSWRGSGLT QEPGSVGQLT LDCTEGAIEW LYPAGALRLT LGGSDPGTRP
SIVCLRPTRP FAGAQVFAER MAGNLELLLA EGQGLAGGRC MR
实施例2，生物信息学分析
概述：
人NsG33是一种分泌性生长因子蛋白，以含293个氨基酸的前体形式在中枢神经系统及其亚区，外周神经系统，视网膜和人发育中的中脑内高水平表达。小鼠(SEQ ID No 8)和大鼠(SEQ ID No 13)全长NsG33分别含有294和291个氨基酸，与人NsG33的同源百分比分别为80.3和80.2。
蛋白加工：
人NsG33含有一个由23个氨基酸组成的N末端信号肽序列，此信号肽在序列基序ARA-GY处被切割。这一信号肽切割位点是借助SignalP方法(Nielsen等人，1997)预测的，输出的结果见图1。一个信号肽切割位点在小鼠NsG33(pos.24)和大鼠NsG33(pos.16或21)相似的位置被发现。大鼠NsG33最有可能的切割位点在21位，与人和小鼠NsG33预测的位点一致。这意味着SEQ ID No.14、21和24N末端序列最大可能是序列表中显示的GYSEDRCS而不是ASARAGYSED。
小鼠部分NsG33序列(SEQ ID No.8)和全长NsG33序列(SEQ ID No 26)序列预测的信号肽切割位点相同。
前蛋白加工处理：
以ProP方法预测人NsG33(SEQ ID No 3)的普通型前蛋白切割位点在POS.127位，预测得分0.831，序列基序为“WGPRERR-AL”。同样，预测小鼠NsG33(SEQ ID No 8)的切割位点在POS.128，得分是0.831，序列基序为“WGPRERR-AL”，和大鼠NsG33(SEQ ID No 13)的切割位点在POS.125，得分是0.831，序列基序为“WGPRERR-AL”。
蛋白功能：
NsG33属于作为生长因子蛋白的种类。ProtFun蛋白功能预测服务器(Jensen等人、2002 & 2003)的预测支持这一认识，该种类类型的正确预测概率在1以上，如图2所示。ProtFun方法预测蛋白功能基于序列来源的特征，这一特征对立于序列相似性。区别“生长因子”种类与所有其它种类的重要特征是蛋白分选潜能，蛋白靶向潜能，信号肽潜能，低复杂区，二级蛋白结构，阴性残基数量和原子数(Jensen等人，2003)。
下面的序列同一性运算通过比对程序来执行，应用了BLOSUM50矩阵和-12/-2罚分。
表1 显示人全长NsG33与小鼠和大鼠序列同一性百分比
  序列   同一性(％)
  人   -
  小鼠   80.3
  大鼠   80.2
表2 显示人NsG33与去除N末端信号肽的小鼠和大鼠序列的同一性百分比：
  序列   同一性(％)
  人   -
  小鼠   81.9
  大鼠   79.6
参考文献：
ProP：Prediction of proprotein convertase cleavage sites.Peter Duckert、Sren Brunak和Nikolaj Blom.Protein Engineering，Design and Selection：17：107-112，2004
SignalP：Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides andprediction of their cleavage sites.Henrik Nielsen，Jacob Engelbrecht，SrenBrunakh和Gunnar von Heijne，Protein Engineering 10，1-6(1997).
ProtFun：Ab initio prediction of human orphan protein function frompost-translational modifications and localization features.L.Juhl Jensen，R.Gupta，N.Blom，D.Devos，J.Tamames，C.Kesmir，H.Nielsen，H.H.Strfeldt，K.Rapacki，C.Workman，C.A.F.Andersen，S.Knudsen，A.Krogh，A.Valencia和S.Brunak.J.Mol.Biol.，319：1257-1265，2002.
Prediction of human protein function according to Gene Ontologycategories，L.J.Jensen，R.Gupta，H.H.Strfeldt，S.Brunak，Bioinformatics，19，635-642(2003).
align0 Optimal alignments in linear space.Myers，E.W.和Miller，W.Comput.Appl.Biosci.，4，11-17(1998).
实施例3，基因芯片实验
人材料来自通过常规真空抽吸技术选择性中止妊娠后得到的废弃组织碎片。收集用于研究的此残留组织必须取得Huddinge大学医院，Karolinska研究所(Diary Nr.259/00)和Lund大学(970401)的人类伦理委员会的许可，必须遵循瑞典国立卫生与福利委员会(Swedish National Board of Health andWelfare(Soclialstyrelsen))制定的指导原则，还包括跟孕妇签订知情同意书。回收的神经组织在2小时内进行显微切割，适当大小的组织碎片更进一步用来分离单个细胞。
RNA提取：
用两个圆底皿(rounds)收集人胚胎组织(8周龄)，均为8周孕龄分离的VM和DM区域的组织用于提取总RNA，有好的结果和收率。
从8周孕龄人胚胎组织分离的前侧和背侧中脑区以Trizol试剂(Invitrogen)，按说明书方法提取总RNA。为了富集RNA并去除去痕量染色体DNA，可使用Rneasy柱和无RNase的DNase进行处理。
以5μg的总RNA制备生物素化的cRNA并按Affymetrix方法酶切成片段(GeneChip Expression Analysis，Technical Manual 2000)，然后根据说明书的方法与Affymetrix Human U133B基因芯片(含有约22000个基因)杂交。最后使用GenePublisher分析软件包分析扫描的图像并转换成表达谱值(Knudsen S，Workman C，Sicheritz-Ponten T，Friis C.(2003)“GenePublisher：Automated analysis of DNA microarray data.”，Nucleic Acids Res.31(13)：3471-6.)。
用Affymetrix U133基因芯片分析人NsG33的表达(acc.232269_x_at onU133 B and acc.219051_x_at on U133A GeneChip；Affymetrix，Inc.，SantaClara，Calif.)。在8周龄人胚胎中脑(中脑)组织中观察到人NsG33的表达，说明人NsG33可能对早期胎脑发育有重要作用。在胚胎发育期间，人中脑中生长因子的表达预示其具有治疗帕金森氏病的功能。
实施例4，获得全长编码序列
以获自德国柏林的RZPD，(RZPD克隆ID：IRALp962D105Q2)的一个IMAGE克隆(The I.M.A.G.E.Consortium：“An integrated molecular analysisof genomes and their expression”，Lennon，Auffray，Polymeropoulos，和Soares，[1996]，Genomics 33：151-152)为模板，PCR扩增NsG33基因，引物是：
5’引物：5’-GCGGATCCAGCGGTGGTGAGAGCCCCGAC-3’
3’引物：5’-TATACTCGAGGCCCACCCTCCCTCCTACCAG-3’。
三个相同的PCR反应以50ng/μl的RZPD克隆为DNA模板，反应体积50μl。应用校正聚合酶(pfu-turbo聚合酶，Stratagene)进行PCR扩增，PCR反应步骤为：95℃预变性1分钟，35个循环(95℃变性30秒，57℃退火30秒，72℃延伸90秒)，最后72℃延伸2分钟并冷却至4℃。
将PCR产物电泳，琼脂糖凝胶电泳纯化988bp的NsG33PCR产物片段，并以BamHI和XhoI酶切。电泳纯化976bp的BamHI/XhoI酶切的NsG33PCR片段。5μg的慢病毒转移载体pHsCXW(GenBank accession #：AY468486)以BamHI和XhoI消化并电泳纯化载体骨架。
将BamHI/XhoI内切酶消化的NsG33PCR产物片段连接到pHsCXW慢病毒转移载体的BamHI和XhoI酶切位点，并转化进XL1-B电转化感受态细胞中。
实施例5，NsG33实时PCR
总RNA从以下用来研究NsG33表达的组织中提取：视网膜、全脑、壳核、黑质、神经节、胎肝、小脑、全脑、胎肝、心脏、肾脏、肺脏、胎盘、前列腺、唾液腺、骨骼肌、脾脏、睾丸、胸腺、气管、子宫、结肠、小肠、脊髓、胃、胰腺、胎脑。
按标准操作规程，以HT11V为引物，在Superscript II逆转录酶(LifeTechnologies)作用下将总RNA制备成cDNA第一链。为了进行以实时PCR表达分析，等同于20ng的各RNA量的逆转录产物作为实时PCR反应的模板。
实时PCR在Opticon-2 thermocycler(MJ Research)上进行，使用LightCycler-FastStart DNA Master SYBR Green I试剂盒(Roche)。研究使用5’-CCAGCGACTTCGTAATTCAC-3’(5’引物)和5’-AGCCCATGAAGAGGAAGG-3’(3’引物)双重进行。对于实时PCR，通过使用上述引物扩增的PCR产物经电泳纯化后，进行系列稀释来制备标准曲线。标准曲线是用来验证所有样品在PCR指数范围内的临界值(CT)，并计算出最后的表达水平。所有RT-PCR扩增在总体积为10μl，包含3mMMgCl2、12％蔗糖和LightCycler试剂盒内的1x反应缓冲液中进行。PCR循环步骤由下列组成：98℃预变性10分钟，35个循环(在98℃，10秒；在62℃，20秒；在72℃，20秒)。每一循环延伸反应步骤后进行一次读板(80℃，2秒)以定量新形成的PCR产物。从52℃至95℃缓慢升高温度，持续获得数据以进行PCR片断的解链曲线分析，此曲线用来确认扩增反应的特异性。
为了标化，所有cDNA是依据使用用于β2-微球蛋白的引物(B2M，5’-TGTGCTCGCGCTACTCTCTC-3’和5’-CTGAATGCTCCACTTTTTCAATTCT-3’)实时PCR扩增的。β2-微球蛋白的标准曲线制备同NsG33相似。除最适退火温度是用于看家基因外，看家基因实时PCR使用的试剂盒与靶基因的相同。
看家基因的表达谱借助各自的标准曲线来确定，其相对表达水平用来标化所分析的组织中的靶基因的表达水平。以β2-微球蛋白标化后，靶基因的相对表达水平以该组织的最低表达量作为参考进行计算。以β2-微球蛋白标化的结果应谨慎解释，因为β2-微球蛋白基因可能在所有被检组织的表达水平不同。
总RNA样品分析(见图4A和B)
高表达(C(T)值＜22)
壳核、黑质、脊髓
中等表达(22＜C(T)值＜24)
全脑、小脑、视网膜、DRG
低表达(24＜C(T)值＜26)
心、肾脏、肺脏、前列腺、唾液腺、骨骼肌、睾丸、胃、胰腺、胎脑
极低表达或不表达(C(T)值＞26)
胎肝、胎盘、胸腺、气管、脾脏、子宫、结肠、小肠
基于该组织特异性表达，和预测NsG33是一种分泌性生长因子(见实施例2)的事实，通常NsG33用来治疗神经系统失调(基于其神经系统的特异性表达)、特别是帕金森氏病(基于其在黑质中的表达)、亨廷顿氏病(基于其在壳核中的表达)、小脑失调(基于其在小脑中的表达)、脊髓损伤和ALS(基于其在脊髓中的表达)、周围神经病(基于其在脊根神经中的表达)、视网膜病(基于其在视网膜中的表达)。对各种适应症的治疗作用能在体外和体内实验中加以证实。
实施例6：神经保护作用试验(PC12测定)
病毒株(stock)传代：
使用描述于实施例4的适当限制酶切位点，将NsG33编码序列亚克隆进pHsCXW。为了传代病毒株，构建的慢病毒转移载体与两种辅助质粒(pMD.G和pBR8.91)共转染进293T细胞，所述的两种辅助质粒分别能反向提供必须的病毒基因gag-pol和env基因。简而言之，2×106个293T细胞接种至20个T75培养瓶中的每一个。第2天以Lipofectamine+按说明书方法(Invitrogen)将15μg ppBR8.91、5μg pMD.G和20μg转移载体转染各75培养瓶中的293T细胞。转染后2-3天收获含有病毒的培养基，并以0.45μm醋酸纤维素或聚砜(polysulphonic)滤膜过滤除菌。病毒在4℃，50,000×g两次超速离心90分钟进行沉淀，然后在DMEM培养基中重悬。病毒以反转录法(RT)进行滴定(Current Protocols in Molecular Biology，Editors：Ausubel等人等，Willey)。转导单位(TU)/ml由所得的RT活性和通过用相等的GFP Ientivirus转导293T细胞得到的荧光标记细胞率计算。获得的病毒株分装贮存于-80℃待用。
PC12细胞的转导
PC12细胞(ATCC登记号：CRL-1721)适于DMEM培养基并用于实验。将PC12细胞在Dulbecco’s modified Eagle’s培养基(DMEM)中培养，所述DMEM中添加4.5g/L的葡萄糖及谷氨酰胺(Life Technologies #32430-027)、7.5％的马血清(Life Technologies #16050-098)和7.5％的FBS(LifeTechnologies #16050-098)，在5％CO2，37℃下培养，每2-3天更换一次培养基，每周按1∶3-1∶6将细胞传代2次，该传代通过吹打培养瓶进行，并分配到新的培养瓶中。转导前一天细胞接种至包被胶原的6孔板中。将病毒从储存液中加至1ml细胞培养基中，所述培养基添加或不添加5ug/ml(终浓度)的聚凝胺。该病毒与细胞在CO2孵箱中至少孵育3小时。带有GFP基因的逆转录病毒加入平行试验组培养物中，作为对照估计转导效率。
对PC12细胞分化的影响
在6孔板中进行培养并在2-5天后计数带有神经轴突的细胞数。
对PC12细胞存活的影响：
将6孔板中转导的细胞重新接种到用培养基中的胶原包被的96孔板中。第2天更换成无血清的DMEM培养基，24～72小时后以MTS检测法根据说明书(Promega)测定细胞活性，实验结果见图9。与携带标记基因(EGFP)的慢病毒转导PC12细胞对照组相比，转导了携带有全长NsG33cDNA慢病毒的PC12细胞的MTS活性显著提高。MTS检测总细胞的代谢活性。因此，相对于对照培养物rLVNsG33中的MTS活性增加可以反映培养物中活性细胞的增加量和(或)存活细胞的增加的活性。
无论是神经轴突的长出和/或细胞存活分析的阳性结果显示了NsG33蛋白在治疗神经变性疾病中的潜在的治疗效果。
实施例7：小脑颗粒细胞谷氨酸毒性保护试验
存活影响的检测通过转导小脑颗粒细胞培养物进行，该小脑颗粒细胞随后被暴露于毒性浓度的谷氨酸中，基本上如参考文献所述(Daniels和Brown，2001；J.Biol.Chem.276：22446-22452)。
小脑颗粒神经元(CGN)分离自7-8日龄小鼠仔。新鲜分离的小脑在胰蛋白酶和DNA酶存在下酶消化分离成细胞，将DMEM培养基中的细胞以1-2×106细胞数/cm2密度接种至多聚D赖氨酸预包被的24孔板(Nunc)中，所述DMEM培养基添加10％热灭活胎牛血清。将细胞在37℃湿润气氛下培养，24小时后，向培养基中添加阿糖胞苷(10μM)终止非神经元细胞生长。
在DIV1，通过向含10％胎牛血清及4μg/ml的聚凝胺的DMEM培养基中加入病毒株溶液，将培养物用包含如实施例6制备的慢病毒的NsG33转导。平行对照培养物以携带绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒转导。转导后5小时，用根据CGNs预处理的培养基更换。
在DIV5将谷氨酸(0.1-1mM)添加到培养物中，并在另外的2天后以MTT法检测细胞存活力。以分光光度计在570nm检测MTT还原成甲月替(formazane)的程度。简而言之，移出培养液，以钠盐溶液(140mM NaCl，5mM KCl、1mM MgCl2.6H2O、1mM NaH2PO4、1.5mM CaCl2、5.6mM葡萄糖、20mM HEPES、pH 7.4)洗涤细胞。MTT(终浓度为0.5mg/ml)在使用前用钠盐溶液配制并避光保存，将所述MTT溶液添加到细胞中。37℃培养3小时后，加入等体积酸化的异丙醇(异丙醇溶液含0.04M HCl)，然后在室温彻底混匀直至所有甲月替结晶溶解。细胞活力用对照组细胞的光密度值的百分数表示。平行培养物不作任何处理。
此检测法被认为是用于检测对毒性损伤的保护的常规检测，也是用于预测具有治疗小脑疾病的治疗潜力的特征的检测法。
实施例8，对去钾诱导的小脑颗粒细胞凋亡的保护
通过转导去钾小脑颗粒细胞来进行细胞存活率检测，基本上如参考文献所述(Nomura等人等，2001；Dev.Neurosci.23：145-152)。
小脑颗粒神经元(CGN)取材于8日龄Sprague-Dawley大鼠仔。新鲜分离的小脑在胰蛋白酶和DNA酶存在下酶消化分离成细胞，将Eagle’s的基础培养基中的细胞以3.5×105细胞/cm2密度接种在用多聚L-赖氨酸预包被的96孔板中，所述培养基包含25mM KCl，并添加10％热灭活胎牛血清、2mM谷氨酰胺。细胞在培养37℃湿润气氛下培养，24小时后添加阿糖胞苷(10μM)终止非神经元细胞生长。
在DIV1，通过向含10％胎牛血清及4μg/ml的聚凝胺的DMEM培养基中加入病毒株溶液，将培养物用包含如实施例6[“PC12试验”]制备的慢病毒的NsG33转导。DMEM培养基含10％胎牛血清和4μg/ml polybrene。平行对照培养物用GFP慢病毒转导。转导后5小时，用根据CGNs预处理的培养基更换。
在DIV2，通过将该细胞转到含5mM KCl的无血清培养基中在未成熟培养物中诱导凋亡，而未处理的细胞以含25mM KCl的条件培养基培养。在DIV3用MTS法测定存活率。
在DIV8，将细胞转到含5mM KCl的无血清培养基中在分化的(神经元)培养物中诱导凋亡，而未处理的细胞以含25mM KCl的条件培养基培养。24-72小时后用MTS法测定存活率。
MTS测定法用CellTiter 96 AQueous非放射性的细胞扩增测定试剂盒(The CellTiter 96 AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay)(Promega)按说明书操作方法进行。
此测定法被认为是用于测定神经保护的常规测测定，也是用于预测具有治疗小脑疾病的治疗潜力的特征的测定法。
实施例9，对DRG培养物的作用
从转导的ARPE-19细胞制备条件培养基。以携带有编码NsG33基因cDNA的慢病毒转导ARPE-19细胞，将细胞以1×105细胞/孔接种在6孔板的DMEM/F12培养基中，所述培养基中添加10％胎牛血清。第2天将储备溶液中的病毒与5μg/ml(终浓度)聚凝胺一起加入细胞培养液中。将病毒与细胞在CO2孵箱中培养过夜。将GFP重组的慢病毒加至平行对照组培养物中。第2天培养基更换为无血清的UltraCULTURE培养基(1ml/孔)，再孵育2天，收获条件培养基。
分离培养P1 DRG细胞。DRGs分离自分娩后第1天(P1)的Sprague-Dawley大鼠。以125-250U/ml I型胶原酶(Worthington，Freehold，N.J.)，37℃消化组织30分钟。以巴斯德吸管反复抽吸，70μm无菌筛网过滤获得单个细胞悬液。细胞预接种在未包被的组织培养皿培养2小时以去除非神经细胞。未黏附的细胞以15,000细胞/孔密度接种在已包被多聚d-鸟氨酸(Life Technologies)和层粘连蛋白(Collaborative Biomedical)的24孔板内。阴性对照细胞在含2.5μg/ml羊抗NGF中和性多抗(pAb)(Chemicon，Temecula，CA)的无血清UltraCULTURETM培养基中培养。NGF处理的阳性对照细胞不含中和性抗NGF pAb。不同稀释度的收集自转导NsG33或GFP转导的ARPE-19细胞的条件培养基经离心和0.4μm滤膜过滤后，添加到培养物中。每2天更换培养基来孵育培养物。
免疫组织化学：培养7天后，细胞以4％甲醛在PBS中室温固定10分钟。将细胞以4％山羊血清，0.1％NP40室温封闭30分钟，然后与鼠抗βIII微管蛋白(1∶100)4℃孵育过夜。在封闭液中漂洗后，将培养物与Cy-3偶联的抗鼠二抗室温孵育1小时。最后一次在封闭液中漂洗后将通过各孔中间带(strip)的细胞进行荧光计数。所有βIII-微管蛋白阳性细胞为神经元，并计数每孔神经元数量以计算存活率。所有抗体在封闭液中稀释。
结果解释：
本实验中的保护效应证实了治疗外周神经病和神经性疼痛的治疗潜力。
实施例10，对运动神经元培养物的作用
以NsG33重组的慢病毒对运动神经元培养物的存活力作用进行测定基本上如Cisterni等，200(J.Neurochem.74，1820-1828)中的描述。简而言之，解剖分离Sprague Dawley大鼠14.5日龄胚胎(E14.5)的腹侧脊髓。运动神经元使用基于运动神经元免疫纯化方法通过抗神经营养受体p75胞外域抗体进行纯化，然后使用磁珠进行细胞分选(Arce等人，1999)。纯化的运动神经元以500细胞/孔密度接种在多聚鸟氨酸/层粘连蛋白预包被的4孔组织培养皿中。培养基为Neurobasal culture medium(Life Technologies)，添加B27支持物(Life Technologies)，马血清(2％v/v)，L-谷氨酰胺(0.5mM)，2-巯基乙醇(25μM)。在细胞培养头4天，培养基添加L-谷氨酸(25μM)，随后不用添加。
运动神经元培养16小时后，以如上所述制备的NsG33重组的慢病毒通过将病毒储备溶液添加到培养基中进行转导(相当于MOI＝4)。平行对照培养物以GFP重组的慢病毒转导。转导后8小时更换新鲜培养基(DIV1)。
在DIV3，以两个平皿中央预划的1.5cm2区域里长有长轴突的大的明亮的(phase-bright)神经元数量来计算运动神经元的存活率。
结果解释：
本实验中的保护作用证实治疗运动神经元疾病包括ALS、脊髓损伤、SMA(脊髓性肌萎缩)，DMD(杜氏肌营养不良)的治疗潜力。
实施例11：多巴胺神经营养活性生物检定
培养条件：
参考以前报道的文献(Friedman and Mytilineou 1987 Neurosci.Lett.79：65-72)经较小的修改，制备分离的中脑细胞培养物。简而言之，在孕期的第1-16日，将取自头侧中脑盖组织(rostral mesencephalictegmentum)Sprague-Dawley的大鼠胚胎脑组织在显微镜下无菌环境下将其分离，并收集在无Ca2+和Mg2+Dulbecco’s磷酸缓冲盐溶液(Gibco，Gaithersburg，Md.)，通过温和研磨分离单个细胞。将细胞以每孔100μl接种在含有400μl培养基直径16-mm组织培养孔(Falcon，Lincoln Park，N.J.，24-孔plate)里，使细胞的密度为2.5-3.5×105细胞/孔。培养孔预先用10mM硼砂配制的0.1mg/ml多聚L-鸟氨酸溶液(PH8.4)在37℃.处理3小时，并在milli-Q H2O中洗3次，在Earle’s平衡盐溶液(Gibco)中洗1次。培养基(10/10)包括最小必需培养基(MEMGibco)，补充葡萄糖(33mM)，碳酸氢钠(24.5mM)，谷氨酰胺(2mM)，HEPES(15mM)，青霉素G(5U/ml)，链霉素(5μg/ml)，10％热灭活胎牛血清(Gibco)和10％热灭活马血清(Gibco)。细胞在6.5％CO2，饱和湿度，37℃条件下培养。3小时后，当大多数细胞贴壁后，更换500μl新鲜培养基。此时，将检定多巴胺神经营养活性的系列稀释样品(条件培养基)添加到每孔(设复孔)，继续在37℃孵箱培养。一周后培养细胞以氟尿嘧啶脱氧核苷(13μg/ml)和尿嘧啶核甙(33μg/ml)处理24小时，防止神经胶质过度增殖，随后以无胎牛血清的上述培养基继续培养。每周更换新鲜培养基。
或者使用化学定义的无血清培养基，其中是以蛋白、激素和盐混合物替代血清。已知成份培养液(DM)包括MEM和F12营养素混合物(均来自Gibco，1∶1；体积/体积)，具有葡萄糖(33mM)，谷氨酰胺(2mM)，碳酸氢钠(24.5mM)，HEPES(15mM)，补充有转铁蛋白(100μg/ml)，胰岛素(25μg/ml)，四甲烯二胺(60μM)，黄体酮(20nM)，硒酸钠(30nM)，青霉素G(5U/ml)和链霉素(5μg/ml)。DM的克分子渗透压浓度通过添加milli-Q H2O.(110-125mlH2O/l)调至325。
测定多巴胺通过多巴胺神经元特异“清道夫”转运体的摄取以及免疫组化计数对于多巴胺合成酶-酪氨酸羟化酶阳性神经元数量，可以检定多巴胺神经元的功能状态。(Karlsson等，2002，Brain Res.2002 Nov15；955(1-2)：268-80)。
样品制备：
在检定中脑细胞培养物的多巴胺神经元活性之前，所有条件培养基样品按如下方法脱盐。将100μl培养基10/10(作为载体)加入Centricon-10(Amicon)中，静置10分钟。将待测的等分样品后加入到Centricon中，接着加入1ml无碳酸氢盐但含有10mM HEPES，PH7.2的高葡萄糖的DMEM(溶液A)中，5000×g离心70分钟。将沉淀(约0.1ml)以新鲜溶液A配制到1.1ml，并再离心2次。在添加到培养孔之前，样品以0.11μm的Ultrafree-MC sterileDurapore unit(Millipore，Bedford Mass.)过滤除菌。
3H-多巴胺摄取：
在细胞培养第6或第7天，经较小修改如参考文献所述(Friedman andMytilineou(1987)Neurosci.Lett.79：65-72)进行氚多巴胺(3H-DA)摄取实验，所有溶液保存在37℃。简而言之，移去培养基，以0.25ml摄取缓冲液漂洗2次，所述缓冲液由Krebs-Ringer′s磷酸盐缓冲液组成，PH7.4，含有5.6mM葡萄糖，1.3mMEDTA，0.1mM维生素C，0.5mM优降宁和单胺氧化酶抑制剂。培养物与0.25ml的50nM 3H-DA(New England Nuclear，Boston，Mass.sp.act 36-37Ci/mmol)在37℃孵育15分钟。移去培养混合物中止3H-DA摄取，细胞以0.5ml摄取缓冲液洗2次。为了从细胞里释放3H-DA，细胞与0.5ml的95％乙醇在37℃孵育30分钟，然后添加入10ml的EcoLite(ICN，Irvine，Calif.)，并在闪烁计数仪上计数。往摄取的缓冲液中添加0.5mM的GBR-12909(RBI)，其为一种多巴胺神经元高亲和力摄取泵特异抑制剂，以获取空白值。(Heikkila等人1984 Euro J.Pharmacol.103：241-48)。
与对照处理相比，TH阳性神经元数量增加和/或3H-DA摄取增加证实NsG33在治疗帕金森氏病中的可能功能。
实施例12：在instrastriatal 6--OHDA损伤模型中研究对黑质多巴胺神经元保护作用
VSV-G假型(rLV)载体构建如文献(Zufferey等人，1997，J.Virol，73：2886-2892；Rosenblad等人，In vivo protection of nigral dopamine neuronsby lentiviral gene transfer of the novel GDNF-family member neublastin/artemin.Mol Cell Neurosci.2000 Feb；15(2)：199-214.)所述。简而言之，携带绿色荧光蛋白(GFP)或NsG33的cDNA的转移质粒pHR’CMV-W与辅助质粒pMD.G和pCMVDR8.91共转染进293T细胞。转染后2-3天收集含病毒粒子的上清并116,000g超离心浓缩。以连续稀释293T细胞的浓缩上清液测定rLV-GFP载体株(stock)滴度为1.1×108TU/ml。以文献中描述的RNA条形印迹技术(von Schwedler等，Vif is crucial for human immunodeficiency virus type 1proviral DNA synthesis in infected cells.Virol.1993 Aug；67(8)：4945-55.)测定rLV-NsG33和rLV-GFP病毒株滴度等人并且从TU与rLV-GFP病毒粒子滴度的比值估计rLV-NsG33 vector的滴度为1.2×108TU/ml。
所有涉及实验动物的工作都遵循Lund大学实验动物使用伦理委员会(the Ethical Committee for Use of Laboratory Animals at Lund University)制定的指导原则。动物以12∶12小时的明亮/黑暗周期喂养，给予鼠粮和水。使用雌性Sprague Dawley大鼠(在手术时220g)。将用于立体定位手术的大鼠用海罗芬麻醉，将总量2微升1∶2病毒株(1.0-1.2×105TU)的rLV-GFP(n＝8)或rLV-NsG33按下面坐标注射入右侧纹状体的两条管(tracts)中：(1)AP＝+1.0mm、ML＝-2.6mm、DV＝-5.0和-4.5mm、Tb＝0.0和(2)AP＝0.0mm、ML＝-3.7mm、DV＝-5.0和-4.5mm、Tb＝0.0。两周后动物再被麻醉并放置在立体定位仪上。将6-羟基多巴胺(20μg[以游离碱计算])每3μl载体[含0.2％维生素C的盐溶液]按如下坐标注射入右侧纹状体：AP＝+0.5mm、ML＝-3.4mm、DV＝-5.0和-4.5mm、Tb＝0.0。
损害后第四周，动物以戊巴比妥(70mg/kg，Apoteksbolaget，Sweden)深度麻醉，经颈动脉灌注50ml室温盐溶液，接着灌注200ml冰预冷的含4％多聚甲醛的磷酸盐缓冲液(pH 7.2-7.4)。脑组织以相同固定剂固定3-6小时，再以30％蔗糖处理24小时，在冰冻切片机上切成6片(series)40μm厚的切片。
按文献报道免疫组化检测黑质酪氨酸羟化酶免疫活性(Rosenblad等人，In vivo protection of nigral dopamine neurons by lentiviral gene transfer of thenovel GDNF-family member neublastin/artemin.Mol Cell Neurosci.2000Feb；15(2)：199-214.)。通过在显微镜下计数通过SN的三个连续切片副视束的内侧终核外侧所有具有免疫反应性神经元数量，来计数TH-IR和VMAT-IR黑质神经元数量，如文献描述(Sauer & Oertel，1994，Neuroscience59：401-415)。
相比GFP对照组，TH-IR数量增加证实治疗帕金森氏病的功能。VMAT-IR数量增加进一步证实这一结论。
实施例13：实时PCR分析发育期鼠类CNS组织中NsG33
原材料和方法：
引物：
下列引物用于实时PCR：
mNsG33：
mNsG33 intronspan bp2845′：5′-GTCTTCGCTGAACGTATGAC-3′
mNsG33 intronspan bp6233′：5′-CTGATTCTTGCAGCTCTGTG-3′
GAPDH：
mGAPDH-s904：5′-AACAGCAACTCCCACTCTTC-3′
mGAPDH-as 1067：5′-TGGTCCAGGGTTTCTTACTC-3′
分离发育期和成年鼠不同脑区的组织，并以Trizol提取RNA。随后用Rneasy旋转柱，在柱上进行DNA酶处理以去除痕量gDNA，进一步纯化RNA。将使用2.5μg RNA的等分部分作为模板使用来源于MoMLV的RNAseH缺陷的逆转录酶(SuperScript)和poly-dT引物用于cDNA的合成。。所有样品的cDNA同时用相同的主混合物(mastermix)合成以减少误差。cDNA的最终体积为120μl，并将其分装保存于-80℃以避免反复冻溶。为了分析发育期脊髓(SC)中NsG33的表达，制备来源于10.5、11.5和13.5日龄胚胎(分别是E10.5、E11.5和E13.5)组织和成年小鼠组织中的cDNA。使用来源于P1和成年组织的cDNA，分析小脑(Cb)和皮质(CTX)内NsG33表达的发育调控。
大约20ng各cDNA用作模板进行实时PCR表达分析。实时PCR在Opticon-2 thermocycler中(MJ Research)使用LightCycler-FastStart DNAMaster SYBR Green I试剂盒(Roche)进行。实验设两个平行组，使用上述引物。以系列稀释的凝胶纯化的使用上述引物制备的PCR产物绘制标均曲线。标准曲线是用来确定所有样品在PCR反应的指数范围内的临界值(CT)，计算出最终的表达水平。所有实时PCR扩增在总体积10μl，含3mM MgCl2、12％蔗糖和包含在LightCycler试剂盒中的1x反应缓冲液中进行。PCR循环包括下列步骤：98℃预变性10分钟，35个三步循环(98℃变性10秒，62℃(mGAPDH)或60℃(mNsG33)退火20秒，72℃延伸20秒)。每一循环的延伸反应步骤后进行一次读数(80℃，2秒)以定量新形成的PCR产物。从52℃至95℃缓慢升高温度，持续获得数据以绘制PCR产物的解链曲线，此曲线用来确认扩增反应的特异性。
为了标化，对所有cDNA使用用于看家基因GAPDH的引物进行实时PCR扩增。GAPDH的实时PCR分析如靶基因一样进行。看家基因的表达情况借助各自的标准曲线来分析，并且其相对表达水平用来标化所分析组织中靶基因的表达水平。以GAPDH标化后，靶基因的相对表达水平以该组织的最低表达量作为参考进行计算。
结果：
不同年龄不同组织中相对GAPDH表达水平变化在1.0-1.3之间，说明GAPDH可用作标准控制。
小鼠NsG33的实时PCR结果见图10A和10B。CT值范围从17到22。从图10A可见NsG33在脊髓发育期间的表达受调控，大约E11.5胚胎中表达量达到峰值。从图10B可见NsG33在小脑(而不是皮质)产后发育期间的表达受调控。
NsG33是一种在各物种间高度保守的，具有生长因子或激素特征的分泌性分子与其他特征相结合的表达谱明显预测其可用于治疗神经疾病的治疗用途。
NsG33在脊髓中暂时表达谱表明其对CNS区的神经祖细胞的增殖，分化和/或存活起作用。证实其可用于治疗神经变性疾病和脊髓损伤包括脊髓损伤、ALS和脊髓性肌萎缩的治疗关联性。该表达模式更进一步表明其可作为一种体外刺激脊髓神经祖细胞增殖和/或分化的试剂的潜力。
NsG33在成年小脑组织中表达上调显示其对一种或多种小脑细胞类型的维持和/或存活起作用。表明其可用于治疗小脑疾病包括但不限于感觉性共济失调，多发性硬化症，神经变性脊髓小脑疾病，遗传性共济失调，小脑萎缩(如橄榄体脑桥小脑萎缩(OPCA)，Shy-Drager Syndrome(多系统萎缩(multiple systems atrophy))))和酒精中毒。
实施例14：hNsG33对人神经祖细胞分化的影响
制备条件培养基
以含有hNsG33 cDNA构建物的慢病毒LV-sC.NsG33.W转导ARPE-19细胞获得分泌hNsG33的细胞。简而言之，细胞以1×105细胞/孔密度接种6孔培养板，在补充有10％FCS的DMEM/F12(1∶1)培养基中培养至50-70％汇合状态。培养过夜后向细胞培养液中添加聚凝胺(polybrene)(5μg/ml)和病毒。第二天将细胞传代至T25细胞培养瓶。再次传代扩大培养后将转导细胞分装冷冻保存。
分别从转导和亲本(对照)ARPE-19细胞培养液中收集条件培养基，将细胞接种在T25细胞培养瓶中。培养4天后，培养液更换为无血清HSC培养基。再培养24小时后从对照细胞组和NsG33 ARPE-19细胞组收集条件培养基，加入hNS1培养物之前将其在3,000×g离心5分钟。
hNS1细胞试验
hNS1(以前称HNSC.100)是一种起源于胚胎前脑的神经干细胞的多能的克隆系(Villa等人，Exp Neurol，2000，161(1)：67-84)。Villa等2004，Exp CellRes.Apr 1；294(2)：559-70)。细胞来自Alberto Martinez Serrano，Department ofMolecular Biology，Center of Molecular Biology Severo Ochoa，AutonomousUniversity of Madrid-CSIC，Campus Cantoblanco，Madrid、28049，Spain。hNS1细胞在包被多聚赖氨酸的TC培养瓶中，5％CO2，37℃条件下扩增，无血清的HSC培养基补充了20ng/ml的EGF和bFGF。HSC培养基由DMEM/F12(1∶1)组成并补充N2和1％BSA。对于分化实验，hNS1细胞以105细胞/cm2密度接种到50μg/ml多聚赖氨酸预包被的，无丝裂原的0.5％FBS的HSC培养基的盖玻片上。接种后第1天，分化培养基更换为收集自亲本ARPE-19细胞(Mc C)或转导lenti-viral hNsG33(Mc 33)的ARPE-19细胞的100％条件培养基。对照组更换为非条件HSC培养基。第2天更换三分之二的培养基，接下来每2天或3天更换一次。接种培养后第4天，培养物以4％多聚甲醛固定10分钟并进行免疫组化染色。
免疫组织化学
以10％正常马血清封闭后，细胞与抗GFAP(pAb兔抗牛，1∶1000，DAKO)和β-微管蛋白(mAb克隆SCL：3D10，1∶1000，Sigma)的一抗一起孵育。漂洗后，再与生物素化的马抗小鼠二抗(Vector Laboratories，1∶200)孵育，随后分别用Strep-Cy3(Jackson InmunoResearch，1/200)和Alexa Fluor 488标记的山羊抗兔抗体(Molecular Probes，1∶200)检测。细胞核以0.2μg/ml的Hoechst 33258复染(Villa等人等，2004)。用63×物镜共聚焦显微镜计数总的细胞(细胞核)数量和GFAP及β-微管蛋白阳性细胞数量。
结果：
如图11A所示，添加了来自以含有hNsG33cDNA的构建物的慢病毒转导的ARPE-19细胞(Cm33)的条件培养基实验组比对照组培养物(hNS1)的β-III-微管蛋白阳性神经元数增加了73％，而来自对照ARPE-19细胞(CmC)的条件培养基无作用效果。Cm33培养基中观察到的相对于hNS1培养基和Cm C培养基二者的增加在t-检验中有统计学意义。(P＜0.05)。
与hNS1培养基相比，来自NsG33转导的ARPE-19细胞的条件培养基能显著增加GFAP阳性神经胶质细胞数量(分别为17比11％，)。但是在对照条件(Cm C)培养基也观察到相似的增加(分别为16比11％)，虽然这一结果没有统计学意义。图11B所示，来源于对照ARPE-19细胞(Cm C)和以含有hNsG33 cDNA的构建物的慢病毒转导的ARPE-19细胞的条件培养基没有显著改变细胞总数。
神经元数量增加可能归因于培养物中神经祖细胞分化加强和/或分化的神经元存活数增加。这些数据示NsG33具有神经保护和再生功能一致。
实施例15
检测NsG33对纹状体培养物的作用
检测用条件培养基的制备
以含有hNsG33 cDNA(pHsC.NsG33.W)的表达构建物瞬时转染的ARPE-19和HEK293T细胞以及MOCK转染的ARPE-19和HEK293T细胞制备条件培养基。
ARPE-19细胞接种在6孔板(1×105细胞/孔)中，培养基DMEM∶F12(1∶1)，添加10％FCS。培养过夜后，按照产品说明书以Fugene(Roche)将3μg DNA/孔转染细胞。
HEK293T细胞接种在6孔板(3×105细胞/孔)中，培养基DMEM，添加10％FCS。培养过夜后，按照产品说明书以Lipofectamine+使用2μg DNA/孔转染细胞(Invitrogen)。
转染后当天，培养基更换为无血清DMEM∶F12培养基。24小时条件作用后，从转染细胞收集培养基，并以3000×g离心5分钟。将澄清的条件培养基以DMEM∶F12(6∶16)稀释后添加到纹状体培养物中。用对于hNsG33cDNA的特异引物，定量RT-PCR分析NsG33 mRNA的表达。
定量RT-PCR
以Trizol从转导的培养物中提取细胞总RNA，接着用Rneasy旋转柱，在柱上进行DNA酶处理以去除痕量gDNAgDNA并进一步纯化RNA。使用逆转录酶合成cDNA，以相对于约20ng总RNA的各cDNA为模板，以实施例5中描述的hNsG33特异性引物进行实时PCR分析。
为了标化，所有cDNAs以引物4842和4843进行看家基因GAPDH的实时PCR分析。
[4842：5’-GGAAGGTGAAGGTCGGAGTCAA-3’
4843：5’-GATCTCGCTCCTGGAAGATGGT-3’]用GAPDH标化后，靶基因的相对表达水平以最低hNsG33表达水平的cDNA样品作为参考进行计算。
纹状体细胞培养物的传代和检测
胚胎大鼠纹状体细胞培养物按文献报道的方法进行制备(Nakao等人，1996 Exp.Neurol.138，144-157)。简而言之。从E14.5大鼠胚胎(Sprague-Dawley，B&K Universal，Sweden)选择性分离出外侧和中部神经节隆起。将组织碎片以胰蛋白酶/DNAse在37℃孵育，洗涤并机械分离为单个细胞。将分离的细胞接种在预包被了50μg/ml多聚L-赖氨酸(poly-1-lysine)和10μg/μl层粘连蛋白(laminin)的4孔载玻片(chamber slider)上(100,000细胞/cm2)，培养基DMEM添加15mM HEPES，1mM丙酮酸钠和10％FCS。体外培养2天后，培养基更换为无血清的DMEM∶F12(1∶1)非条件或条件培养基，并添加1.5mM HEPES，1mM丙酮酸钠和B27(1∶50)，所述条件培养基如上所述通过NsG33-或MOCK转染的HEK293T或ARPE-19细胞条件化。在无血清培养基中培养4天后，将培养物进行免疫组化实验。
免疫组化
简而言之，细胞以4％甲醛固定20分钟。以5％封闭血清预孵育后，再以抗β-III微管蛋白抗体在室温孵育过夜(Sigma，1∶333)。漂洗后，细胞与FITC偶联的驴抗小鼠二抗(1∶200，Jackson Lab)在室温孵育2小时。细胞核以DAPI复染。使用40倍放大倍数，在每个试验组(平均细胞总数＝260)16个随机视野中计数细胞(细胞核)总数和β-III微管蛋白阳性细胞数。
结果
定量RT-PCR证实在瞬时转染的细胞内有hNsG33 mRNA的表达。以pHsC.NsG33.W瞬时转染的HEK293T细胞，通过qRT-PCR证实hNsG33mRNA标准化水平比未转染细胞高40-6000倍。在转染的ARPE-19细胞也检测到高水平hNsG33 mRNA(是MOCK转染细胞对照水平的30-35倍)。
如图12所示，相对于收集自MOCK转染的ARPE-19细胞的条件培养基培养的纹状体细胞，收集自含有hNsG33 cDNA表达载体转染的ARPE-19细胞的条件培养基培养的纹状体细胞中，β-III微管蛋白阳性神经元增加了49％(48％比32％)。这一增加在t-检验中具有统计学意义(P＜0.05)。
同样，相对于收集自MOCK转染的HEK293T细胞的条件培养基培养的纹状体细胞，收集自hNsG33cDNA构建物转染的HEK293T细胞的条件培养基培养的纹状体细胞中，神经元增加了34％(50％比37％)，具有统计学意义。
相对于非条件培养基(UCM)培养的对照细胞，收集自任何MOCK转染的细胞的条件培养基培养的细胞中，对神经元没有影响。神经元百分数的增加并不归因于DAPI细胞核染色计数的细胞总数的增加，而是由于添加了含hNsG33的条件培养基而增加了神经元。神经元数量的增加也可能归因于培养细胞中神经祖细胞分化加强和/或分化的纹状体神经元存活数增加。这些数据证实NsG33具有一般的神经保护和再生作用，并且尤其具有用于治疗亨廷顿氏病的潜力。
                             序列表
<110>Ns基因公司(NsGene A/S
     Nordahl Petersen，Thomas
     Blom，Nikolaj
     Grnborg，Mette
     Kusk，Philip
     Johansen，Teit
     Wahlberg，Lars
     Brunak，Sren)
<120>生长因子NsG33的治疗用途
<130>522-204-WO
<150>DK PA 2004 00510
<151>2004-03-30
<150>DK PA 2004 00843
<151>2004-05-28
<150>US 60/575,086
<151>2004-05-28
<160>26
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>2508
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>1
actggccgac acgccgcagg ccccgccccc ttcccgaccc gctccaaggc ggccccggcg      60
ctggggctgc gcggcaggcg gagcggccgc gggcttgggg gcttcgccgg ggccgggcgg     120
ccggcgcccc cggctgctcc cgccgccgcc cggacccgcg ccccgccggg gcagcggtgg     180
tgagagcccc gactccccgg acgccgcccg ccgtgccatg gggttcccgg ccgcggcgct     240
gctctgcgcg ctgtgctgcg gcctcctggc cccggctgcc cgcgccggct actccgagga     300
gcgctgcagc tggaggggca ggtacggtcc ggggggctgt ccccgcactt aggacggggt     360
gcgctgcggc taggaccccc caggcgcccc tcggagcgcg cagagcgctg ggccggtttc     420
cccatccgcg aggcggcctc gggagggagc gggggctgcg ccgggcgggg acccgccccc     480
gtctcagcgc cccgtcccgt cctgtcccca gcggcctcac ccaggagccc ggcagcgtgg     540
ggcagctggc cctggcctgt gcggagggcg cggttgagtg gctgtacccg gctggggcgc     600
tgcgcctgac cctgggcggc cccgatccca gagcgcggcc cggcatcgcc tgtctgcggc     660
cggtgcggcc cttcgcgggc gcccaggtct tcgcggagcg cgcagggggc gccctggagc     720
tgctgctggc cgagggcccg ggcccggcag ggggccgctg cgtgcgctgg ggtccccgcg     780
agcgccgggc cctcttcctg caggccacgc cgcaccagga catcagccgc cgcgtggccg     840
ccttccgctt tgagctgcgc gaggacgggc gccccgagct gcccccgcag gcccacggtc     900
tcggcgtaga cggtgagtgg cggtctggtt gggacagggt gggagtcccg aagtcttacc     960
ctgcctgggc ttggcgggaa tgtgccttgt cggccccact gcagaaggaa aaagtgagct    1020
acaagggttg gatgggcttg tcaggccaca cagcctggga ctgctgggga gggatggcct    1080
ccccgccctc ccttcccgat tcatctctgg aaagagctgg caggggcaga gtggagggaa    1140
ggggaggccg ggcccagcaa tcctgggcct ctggtccctg aacggttggg ggaagagatg    1200
gtggggacag aatcgaagcc tccggccaaa gctgtccggg gctccctggc ccagcggtga    1260
cctctctccc ctcccccagc ccaaccaaca aaagtccagt gtgcagcccg gtcaccatgg    1320
agacgccgct cgcctccctg cagggcacca ggcccagctc ttgcttggct ctcctggagc    1380
ttggcgcctg accctgaaag ggatgggctc tcgctattct gccccctggc cctgggccag    1440
ggaccccaga ccacccttcc tctgccccca cttcctatca ccctagctgg gctgctgctc    1500
ttcagacctc agatccggga aactagaggg gtcccagatg ctggggtgca tatgtcagat    1560
gggagtgcag gagggcggcc caggacagct gatcgctagg catggccccc aggcccacgt    1620
ctgtgtgcat tcctgccttg gaggtacgcg cctgcaagtg tgtttcctga gtacaggtgt    1680
cgccgagggc gtgcacatct gctgtgtagc tctctgggac ccccaggtgc catcaggccc    1740
tgagcgtggg ctctgctcat ttgcctgctg cctcctgccg cttgtgcgga caagggacgg    1800
ggcctggggt gatgccggga gagggcaggg cctctcctca ccaccccctc tgcatgccag    1860
gtgcctgcag gccctgcagc gacgctgagc tgctcctggc cgcatgcacc agcgacttcg    1920
gtgagtgtcc ccgccatggg gggagcctgg agcctgcctt cccctgaatg cctaccgcag    1980
ccacatgcct ccccacagta attcacggga tcatccatgg ggtcacccat gacgtggagc    2040
tgcaggagtc tgtcatcact gtggtggccg cccgtgtcct ccgccagaca ccgccgctgt    2100
tccaggcggg gcgatccggg gaccaggggc tgacctccat tcgtacccca ctgcgctgtg    2160
gcgtccaccc gggcccaggc accttcctct tcatgggctg gagccgcttt ggggaggccc    2220
ggctgggctg tgccccacga ttccaggagt tccgccgtgc ctacgaggct gcccgtgctg    2280
cccacctcca cccctgcgag gtggcgctgc actgaggggc tgggtgctgg ggaggggctg    2340
gtaggaggga gggtgggccc actgctttgg aggtgatggg actatcaata agaactctgt    2400
tcacgcaagc tgctgtggac ctggtctcct gtgtccagcc cagccttggg cctgcctcgc    2460
agctgtgagg atggctccaa ttcctgcctc ctggcgggag actgaggc                 2508
<210>2
<211>1109
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>CDS
<222>(118)..(999)
<400>2
gcttcgccgg ggccgggcgg ccggcgcccc cggctgctcc cgccgccgcc cggacccgcg     60
ccccgccggg gcagcggtgg tgagagcccc gactccccgg acgccgcccg ccgtgcc       117
atg ggg ttc ccg gcc gcg gcg ctg ctc tgc gcg ctg tgc tgc ggc ctc      165
Met Gly Phe Pro Ala Ala Ala Leu Leu Cys Ala Leu Cys Cys Gly Leu
1               5                   10                  15
ctg gcc ccg gct gcc cgc gcc ggc tac tcc gag gag cgc tgc agc tgg      213
Leu Ala Pro Ala Ala Arg Ala Gly Tyr Ser Glu Glu Arg Cys Ser Trp
            20                  25                  30
agg ggc agc ggc ctc acc cag gag ccc ggc agc gtg ggg cag ctg gcc      261
Arg Gly Ser Gly Leu Thr Gln Glu Pro Gly Ser Val Gly Gln Leu Ala
        35                  40                  45
ctg gcc tgt gcg gag ggc gcg gtt gag tgg ctg tac ccg gct ggg gcg      309
Leu Ala cys Ala Glu Gly Ala Val Glu Trp Leu Tyr Pro Ala Gly Ala
    50                  55                  60
ctg cgc ctg acc ctg ggc ggc ccc gat ccc aga gcg cgg ccc ggc atc      357
Leu Arg Leu Thr Leu Gly Gly Pro Asp Pro Arg Ala Arg Pro Gly Ile
65                  70                  75                  80
gcc tgt ctg cgg ccg gtg cgg ccc ttc gcg ggc gcc cag gtc ttc gcg      405
Ala Cys Leu Arg Pro Val Arg Pro Phe Ala Gly Ala Gln Val Phe Ala
                85                  90                  95
gag cgc gca ggg ggc gcc ctg gag ctg ctg ctg gcc gag ggc ccg ggc      453
Glu Arg Ala Gly Gly Ala Leu Glu Leu Leu Leu Ala Glu Gly Pro Gly
            100                 105                 110
ccg gca ggg ggc cgc tgc gtg cgc tgg ggt ccc cgc gag cgc cgg gcc      501
Pro Ala Gly Gly Arg Cys Val Arg Trp Gly Pro Arg Glu Arg Arg Ala
        115                 120                 125
ctc ttc ctg cag gcc acg ccg cac cag gac atc agc cgc cgc gtg gcc      549
Leu Phe Leu Gln Ala Thr Pro His Gln Asp Ile Ser Arg Arg Val Ala
    130                 135                 140
gcc ttc cgc ttt gag ctg cgc gag gac ggg cgc ccc gag ctg ccc ccg      597
Ala Phe Arg Phe Glu Leu Arg Glu Asp Gly Arg Pro Glu Leu Pro Pro
145                 150                 155                 160
cag gcc cac ggt ctc ggc gta gac ggt gcc tgc agg ccc tgc agc gac      645
Gln Ala His Gly Leu Gly Val Asp Gly Ala Cys Arg Pro Cys Ser Asp
                165                 170                 175
gct gag ctg ctc ctg gcc gca tgc acc agc gac ttc gta att cac ggg      693
Ala Glu Leu Leu Leu Ala Ala Cys Thr Ser Asp Phe Val Ile His Gly
            180                 185                 190
atc atc cat ggg gtc acc cat gac gtg gag ctg cag gag tct gtc atc      741
Ile Ile His Gly Val Thr His Asp Val Glu Leu Gln Glu Ser Val Ile
        195                 200                 205
act gtg gtg gcc gcc cgt gtc ctc cgc cag aca ccg ccg ctg ttc cag      789
Thr Val Val Ala Ala Arg Val Leu Arg Gln Thr Pro Pro Leu Phe Gln
    210                 215                 220
gcg ggg cga tcc ggg gac cag ggg ctg acc tcc att cgt acc cca ctg      837
Ala Gly Arg Ser Gly Asp Gln Gly Leu Thr Ser Ile Arg Thr Pro Leu
225                 230                 235                 240
cgc tgt ggc gtc cac ccg ggc cca ggc acc ttc ctc ttc atg ggc tgg      885
Arg Cys Gly Val His Pro Gly Pro Gly Thr Phe Leu Phe Met Gly Trp
                245                 250                 255
agc cgc ttt ggg gag gcc cgg ctg ggc tgt gcc cca cga ttc cag gag      933
Ser Arg Phe Gly Glu Ala Arg Leu Gly Cys Ala Pro Arg Phe Gln Glu
            260                 265                 270
ttc cgc cgt gcc tac gag gct gcc cgt gct gcc cac ctc cac ccc tgc      981
Phe Arg Arg Ala Tyr Glu Ala Ala Arg Ala Ala His Leu His Pro Cys
        275                 280                 285
gag gtg gcg ctg cac tga ggggctgggt gctggggagg ggctggtagg            1029
Glu Val Ala Leu His
    290
agggagggtg ggcccactgc tttggaggtg atgggactat caataagaac tctgttcacg    1089
caaaaaaaaa aaaaaaaaaa                                                1109
<210>3
<211>293
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>3
Met Gly Phe Pro Ala Ala Ala Leu Leu Cys Ala Leu Cys Cys Gly Leu
1               5                   10                  15
Leu Ala Pro Ala Ala Arg Ala Gly Tyr Ser Glu Glu Arg Cys Ser Trp
            20                  25                  30
Arg Gly Ser Gly Leu Thr Gln Glu Pro Gly Ser Val Gly Gln Leu Ala
        35                  40                  45
Leu Ala Cys Ala Glu Gly Ala Val Glu Trp Leu Tyr Pro Ala Gly Ala
    50                  55                  60
Leu Arg Leu Thr Leu Gly Gly Pro Asp Pro Arg Ala Arg Pro Gly Ile
65                  70                  75                  80
Ala Cys Leu Arg Pro Val Arg Pro Phe Ala Gly Ala Gln Val Phe Ala
                85                  90                  95
Glu Arg Ala Gly Gly Ala Leu Glu Leu Leu Leu Ala Glu Gly Pro Gly
            100                 105                 110
Pro Ala Gly Gly Arg Cys Val Arg Trp Gly Pro Arg Glu Arg Arg Ala
        115                 120                 125
Leu Phe Leu Gln Ala Thr Pro His Gln Asp Ile Ser Arg Arg Val Ala
    130                 135                 140
Ala Phe Arg Phe Glu Leu Arg Glu Asp Gly Arg Pro Glu Leu Pro Pro
145                 150                 155                 160
Gln Ala His Gly Leu Gly Val Asp Gly Ala Cys Arg Pro Cys Ser Asp
                165                 170                 175
Ala Glu Leu Leu Leu Ala Ala Cys Thr Ser Asp Phe Val Ile His Gly
            180                 185                 190
Ile Ile His Gly Val Thr His Asp Val Glu Leu Gln Glu Ser Val Ile
        195                 200                 205
Thr Val Val Ala Ala Arg Val Leu Arg Gln Thr Pro Pro Leu Phe Gln
    210                 215                 220
Ala Gly Arg Ser Gly Asp Gln Gly Leu Thr Ser Ile Arg Thr Pro Leu
225                 230                 235                 240
Arg Cys Gly Val His Pro Gly Pro Gly Thr Phe Leu Phe Met Gly Trp
                245                 250                 255
Ser Arg Phe Gly Glu Ala Arg Leu Gly Cys Ala Pro Arg Phe Gln Glu
            260                 265                 270
Phe Arg Arg Ala Tyr Glu Ala Ala Arg Ala Ala His Leu His Pro Cys
        275                 280                 285
Glu Val Ala Leu His
    290
<210>4
<211>270
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>4
Gly Tyr Ser Glu Glu Arg Cys Ser Trp Arg Gly Ser Gly Leu Thr Gln
1               5                   10                  15
Glu Pro Gly Ser Val Gly Gln Leu Ala Leu Ala Cys Ala Glu Gly Ala
            20                  25                  30
Val Glu Trp Leu Tyr Pro Ala Gly Ala Leu Arg Leu Thr Leu Gly Gly
        35                  40                  45
Pro Asp Pro Arg Ala Arg Pro Gly Ile Ala Cys Leu Arg Pro Val Arg
    50                  55                  60
Pro Phe Ala Gly Ala Gln Val Phe Ala Glu Arg Ala Gly Gly Ala Leu
65                  70                  75                  80
Glu Leu Leu Leu Ala Glu Gly Pro Gly Pro Ala Gly Gly Arg Cys Val
                85                  90                  95
Arg Trp Gly Pro Arg Glu Arg Arg Ala Leu Phe Leu Gln Ala Thr Pro
            100                 105                 110
His Gln Asp Ile Ser Arg Arg Val Ala Ala Phe Arg Phe Glu Leu Arg
        115                 120                 125
Glu Asp Gly Arg Pro Glu Leu Pro Pro Gln Ala His Gly Leu Gly Val
    130                 135                 140
Asp Gly Ala Cys Arg Pro Cys Ser Asp Ala Glu Leu Leu Leu Ala Ala
145                 150                 155                 160
Cys Thr Ser Asp Phe Val Ile His Gly Ile Ile His Gly Val Thr His
                165                 170                 175
Asp Val Glu Leu Gln Glu Ser Val Ile Thr Val Val Ala Ala Arg Val
            180                 185                 190
Leu Arg Gln Thr Pro Pro Leu Phe Gln Ala Gly Arg Ser Gly Asp Gln
        195                 200                 205
Gly Leu Thr Ser Ile Arg Thr Pro Leu Arg Cys Gly Val His Pro Gly
    210                 215                 220
Pro Gly Thr Phe Leu Phe Met Gly Trp Ser Arg Phe Gly Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Leu Gly Cys Ala Pro Arg Phe Gln Glu Phe Arg Arg Ala Tyr Glu Ala
                245                 250                 255
Ala Arg Ala Ala His Leu His Pro Cys Glu Val Ala Leu His
            260                 265                 270
<210>5
<211>166
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>5
Ala Leu Phe Leu Gln Ala Thr Pro His Gln Asp Ile Ser Arg Arg Val
1               5                   10                  15
Ala Ala Phe Arg Phe Glu Leu Arg Glu Asp Gly Arg Pro Glu Leu Pro
            20                  25                  30
Pro Gln Ala His Gly Leu Gly Val Asp Gly Ala Cys Arg Pro Cys Ser
        35                  40                  45
Asp Ala Glu Leu Leu Leu Ala Ala Cys Thr Ser Asp Phe Val Ile His
    50                  55                  60
Gly Ile Ile His Gly Val Thr His Asp Val Glu Leu Gln Glu Ser Val
65                  70                  75                  80
Ile Thr Val Val Ala Ala Arg Val Leu Arg Gln Thr Pro Pro Leu Phe
                85                  90                  95
Gln Ala Gly Arg Ser Gly Asp Gln Gly Leu Thr Ser Ile Arg Thr Pro
            100                 105                 110
Leu Arg Cys Gly Val His Pro Gly Pro Gly Thr Phe Leu Phe Met Gly
        115                 120                 125
Trp Ser Arg Phe Gly Glu Ala Arg Leu Gly Cys Ala Pro Arg Phe Gln
    130                 135                 140
Glu Phe Arg Arg Ala Tyr Glu Ala Ala Arg Ala Ala His Leu His Pro
145                 150                 155                 160
Cys Glu Val Ala Leu His
                165
<210>6
<211>2322
<212>DNA
<213>小鼠肌(Mus musculus)
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(78)
<223>n是a，c，g，或t
<400>6
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn     60
nnnnnnnnnn nnnnnnnncc cctaaccatg ctggtagcca cgcttctttg cgcgctctgt    120
tgcggcctcc tggccgcgtc cgctcacgct ggctactcgg aagaccgctg cagctggagg    180
ggcaggtacc aggagggact gcggggaggg ttgtgggttt atttatttat ttattttatt    240
ttatttactt cttgggttgg agggttccct cccacttgga actgaggaaa cgcagacttc    300
aatgtcctgt tacacagagt agaagcagat gttggtagcc gcgggaaaag ggatgagcgg    360
gctagggaac gagggtcacc cacctgagaa ccaccgtcct gtccccagcg gtttgaccca    420
ggagcctggc agcgtggggc agctgaccct ggactgtact gagggcgcta tcgagtggct    480
gtacccagct ggggcgctgc gcctgaccct gggcggcccc gatccgggca cacggcccag    540
catcgtctgt ctgcgcccag agcggccctt cgctggtgcc caggtcttcg ctgaacgtat    600
gaccggcaat ctagagttgc tactggccga gggcccggac ctggctgggg gccgctgcat    660
gcgctggggt ccccgcgagc gccgagccct tttcctgcag gccacaccac accgcgacat    720
cagccgcaga gttgctgcct tccgttttga actgcacgag gaccaacgtg cagaaatgtc    780
tccccaggct caaggtcttg gtgtggatgg tgagtgatta tgagactggc tgggtgtcag    840
aaattggccc tccacactga cctgatggga ctgggccttg ccaccccatt gcatggagag    900
tccttctgta gcttgacaga ggccactccg gtggagagca tagtggcttc caggtcgtaa    960
ggaggtgagt tggaagtgcc cccgcctttc tctcctcctc ctcttaaaag attcggttta    1020
ggaaaagagc aggagggggc aaatgcccga gaggccagcc ctgggtctct ggtttctgaa    1080
ggattggggg aagggttaag ctgaggcaga atcaaagcct atggccaagg ctgtccaggg    1140
ctccctggcc tggtggtgac ctccttcccc tccccccaag cccagccaac aaaagtccag    1200
tgtgcctctt cgtcaccatg gagactgcct gccctgcctc cctgcagggc accaggccca    1260
gtgctttgct cttctggaac ttgtagcctg accctgcagg gaatgaatgg ctctctgact    1320
gttctgccct agctagagac ccccccgaac tggagtccac tagaatatcc ctagctagag    1380
ctgggaggtc acagaacgtt tcccagtgtt agtctgagtt tatgagatgg taccaagcct    1440
gtgtatgagg cactgaggtg cccatcagta ggcatgtacc tgcagggtgt cttcaggcta    1500
taggatgctg ggagaagggt ttagtctctt gctcctgtac cttttcctct tgggaggagc    1560
tgtgggctcg tgctgagaga tcacaggcct ggctgatgac ctgccttgca tgctaggtgc    1620
ctgcaggccc tgcagtgatg ccgagctcct cctggctgca tgcaccagtg attttggtga    1680
gtgtttctgt tgcgggagag cttagggtct gcctcacatt cccacgtgcc caccactggc    1740
caccatgtct cctcgtagtg atccacggga ccatccatgg ggtcgcccat gacacagagc    1800
tgcaagaatc agtcatcact gtggtggttg ctcgtgtcat ccgccagaca ctgccactgt    1860
tcaaggaagg gagctcggag ggccaaggcc gggcctccat tcgtaccttg ctgcgctgtg    1920
gtgtgcgtcc tggcccaggc tccttcctct tcatgggctg gagccgattt ggcgaagctt    1980
ggctgggctg tgctccccgc ttccaagagt tcagccgtgt ctattcagct gctctcacga    2040
cccatctcaa cccatgtgag atggcactgg actgagagac ctgggagcaa gccctggatg    2100
gaccttcttc tggagatggg gtgttgggga gggtgatggg agggtgggtg agaagggtgt    2160
ggctcggatg gcatcctggt acccacagtg agctggtaga atactaagta atctggacca    2220
taccagccac tgtagtcatg gtcttctgtg gcaggcagca tacccagctc tgtgcctgcc    2280
tcactttgtc tactctccag tctgctgccc ttctaaccct tc                       2322
<210>7
<211>1048
<212>DNA
<213>小鼠肌(Mus musculus)
<220>
<221>CDS
<222>(2)..(886)
<400>7
c cac gcg tcc gcc cac gcg tcc gcg ctt ctt tgc gcg ctc tgt tgc ggc     49
  His Ala Ser Ala His Ala Ser Ala Leu Leu Cys Ala Leu Cys Cys Gly
  1               5                   10                  15
ctc ctg gcc gcg tcc gct cac gct ggc tac tcg gaa gac cgc tgc agc       97
Leu Leu Ala Ala Ser Ala His Ala Gly Tyr Ser Glu Asp Arg Cys Ser
            20                  25                  30
tgg agg ggc agc ggt ttg acc cag gag cct ggc agc gtg ggg cag ctg      145
Trp Arg Gly Ser Gly Leu Thr Gln Glu Pro Gly Ser Val Gly Gln Leu
        35                  40                  45
acc ctg gac tgt act gag ggc gct atc gag tgg ctg tac cca gct ggg      193
Thr Leu Asp Cys Thr Glu Gly Ala Ile Glu Trp Leu Tyr Pro Ala Gly
    50                  55                  60
gcg ctg cgc ctg acc ctg ggc ggc ccc gat ccg ggc aca cgg ccc agc      241
Ala Leu Arg Leu Thr Leu Gly Gly Pro Asp Pro Gly Thr Arg Pro Ser
65                  70                  75                  80
atc gtc tgt ctg cgc cca gag cgg ccc ttc gct ggt gcc cag gtc ttc      289
Ile Val Cys Leu Arg Pro Glu Arg Pro Phe Ala Gly Ala Gln Val Phe
                85                  90                  95
gct gaa cgt atg acc ggc aat cta gag ttg cta ctg gcc gag ggc ccg      337
Ala Glu Arg Met Thr Gly Asn Leu Glu Leu Leu Leu Ala Glu Gly Pro
            100                 105                 110
gac ctg gct ggg ggc cgc tgc atg cgc tgg ggt ccc cgc gag cgc cga      385
Asp Leu Ala Gly Gly Arg Cys Met Arg Trp Gly Pro Arg Glu Arg Arg
        115                 120                 125
gcc ctt ttc ctg cag gcc aca cca cac cgc gac atc agc cgc aga gtt      433
Ala Leu Phe Leu Gln Ala Thr Pro His Arg Asp Ile Ser Arg Arg Val
    130                 135                 140
gct gcc ttc cgt ttt gaa ctg cac gag gac caa cgt gca gaa atg tct      481
Ala Ala Phe Arg Phe Glu Leu His Glu Asp Gln Arg Ala Glu Met Ser
145                 150                 155                 160
ccc cag gct caa ggt ctt ggt gtg gat ggt gcc tgc agg ccc tgc agt      529
Pro Gln Ala Gln Gly Leu Gly Val Asp Gly Ala Cys Arg Pro Cys Ser
                165                 170                 175
gat gcc gag ctc ctc ctg gct gca tgc acc agt gat ttt gtg atc cac      577
Asp Ala Glu Leu Leu Leu Ala Ala Cys Thr Ser Asp Phe Val Ile His
            180                 185                 190
ggg acc atc cat ggg gtc gcc cat gac aca gag ctg caa gaa tca gtc      625
Gly Thr Ile His Gly Val Ala His Asp Thr Glu Leu Gln Glu Ser Val
        195                 200                 205
atc act gtg gtg gtt gct cgt gtc atc cgc cag aca ctg cca ctg ttc      673
Ile Thr Val Val Val Ala Arg Val Ile Arg Gln Thr Leu Pro Leu Phe
    210                 215                 220
aag gaa ggg agc tcg gag ggc caa ggc cgg gcc tcc att cgt acc ttg      721
Lys Glu Gly Ser Ser Glu Gly Gln Gly Arg Ala Ser Ile Arg Thr Leu
225                 230                 235                 240
ctg cgc tgt ggt gtg cgt cct ggc cca ggc tcc ttc ctc ttc atg ggc      769
Leu Arg Cys Gly Val Arg Pro Gly Pro Gly Ser Phe Leu Phe Met Gly
                245                 250                 255
tgg agc cga ttt ggc gaa gct tgg ctg ggc tgt gct ccc cgc ttc caa      817
Trp Ser Arg Phe Gly Glu Ala Trp Leu Gly Cys Ala Pro Arg Phe Gln
            260                 265                 270
gag ttc agc cgt gtc tat tca gct gct ctc acg acc cat ctc aac cca      865
Glu Phe Ser Arg Val Tyr Ser Ala Ala Leu Thr Thr His Leu Asn Pro
        275                 280                 285
tgt gag atg gca ctg gac tga gagacctggg agcaagccct ggatggacct         916
Cys Glu Met Ala Leu Asp
    290
tcttctggag atggggtgtt ggggagggtg atgggagggt gggtgagaag ggtgtggctc     976
ggatggcatc ctggtaccca cagtgagctg gtagaatact aagtaatctg gaccataaaa    1036
aaaaaaaaaa aa                                                        1048
<210>8
<211>294
<212>PRT
<213>小鼠肌(Mus musculus)
<400>8
His Ala Ser Ala His Ala Ser Ala Leu Leu Cys Ala Leu Cys Cys Gly
1               5                   10                  15
Leu Leu Ala Ala Ser Ala His Ala Gly Tyr Ser Glu Asp Arg Cys Ser
            20                  25                  30
Trp Arg Gly Ser Gly Leu Thr Gln Glu Pro Gly Ser Val Gly Gln Leu
        35                  40                  45
Thr Leu Asp Cys Thr Glu Gly Ala Ile Glu Trp Leu Tyr Pro Ala Gly
    50                  55                  60
Ala Leu Arg Leu Thr Leu Gly Gly Pro Asp Pro Gly Thr Arg Pro Ser
65                  70                  75                  80
Ile Val Cys Leu Arg Pro Glu Arg Pro Phe Ala Gly Ala Gln Val Phe
                85                  90                  95
Ala Glu Arg Met Thr Gly Asn Leu Glu Leu Leu Leu Ala Glu Gly Pro
            100                 105                 110
Asp Leu Ala Gly Gly Arg Cys Met Arg Trp Gly Pro Arg Glu Arg Arg
        115                120                125
Ala Leu Phe Leu Gln Ala Thr Pro His Arg Asp Ile Ser Arg Arg Val
    130                 135                 140
Ala Ala Phe Arg Phe Glu Leu His Glu Asp Gln Arg Ala Glu Met Ser
145                 150                 155                 160
Pro Gln Ala Gln Gly Leu Gly Val Asp Gly Ala Cys Arg Pro Cys Ser
                165                 170                 175
Asp Ala Glu Leu Leu Leu Ala Ala Cys Thr Ser Asp Phe Val Ile His
            180                 185                 190
Gly Thr Ile His Gly Val Ala His Asp Thr Glu Leu Gln Glu Ser Val
        195                 200                 205
Ile Thr Val Val Val Ala Arg Val Ile Arg Gln Thr Leu Pro Leu Phe
    210                 215                 220
Lys Glu Gly Ser Ser Glu Gly Gln Gly Arg Ala Ser Ile Arg Thr Leu
225                 230                 235                 240
Leu Arg Cys Gly Val Arg Pro Gly Pro Gly Ser Phe Leu Phe Met Gly
                245                 250                 255
Trp Ser Arg Phe Gly Glu Ala Trp Leu Gly Cys Ala Pro Arg Phe Gln
            260                 265                 270
Glu Phe Ser Arg Val Tyr Ser Ala Ala Leu Thr Thr His Leu Asn Pro
        275                 280                 285
Cys Glu Met Ala Leu Asp
    290
<210>9
<211>270
<212>PRT
<213>小鼠肌(Mus musculus)
<400>9
Gly Tyr Ser Glu Asp Arg Cys Ser Trp Arg Gly Ser Gly Leu Thr Gln
1               5                   10                  15
Glu Pro Gly Ser Val Gly Gln Leu Thr Leu Asp Cys Thr Glu Gly Ala
            20                  25                  30
Ile Glu Trp Leu Tyr Pro Ala Gly Ala Leu Arg Leu Thr Leu Gly Gly
        35                  40                  45
Pro Asp Pro Gly Thr Arg Pro Ser Ile Val Cys Leu Arg Pro Glu Arg
    50                  55                  60
Pro Phe Ala Gly Ala Gln Val Phe Ala Glu Arg Met Thr Gly Asn Leu
65                  70                  75                  80
Glu Leu Leu Leu Ala Glu Gly Pro Asp Leu Ala Gly Gly Arg Cys Met
                85                  90                  95
Arg Trp Gly Pro Arg Glu Arg Arg Ala Leu Phe Leu Gln Ala Thr Pro
            100                 105                 110
His Arg Asp Ile Ser Arg Arg Val Ala Ala Phe Arg Phe Glu Leu His
        115                 120                 125
Glu Asp Gln Arg Ala Glu Met Ser Pro Gln Ala Gln Gly Leu Gly Val
    130                 135                 140
Asp Gly Ala Cys Arg Pro Cys Ser Asp Ala Glu Leu Leu Leu Ala Ala
145                 150                 155                 160
Cys Thr Ser Asp Phe Val Ile His Gly Thr Ile His Gly Val Ala His
                165                 170                 175
Asp Thr Glu Leu Gln Glu Ser Val Ile Thr Val Val Val Ala Arg Val
            180                 185                 190
Ile Arg Gln Thr Leu Pro Leu Phe Lys Glu Gly Ser Ser Glu Gly Gln
        195                 200                 205
Gly Arg Ala Ser Ile Arg Thr Leu Leu Arg Cys Gly Val Arg Pro Gly
    210                 215                 220
Pro Gly Ser Phe Leu Phe Met Gly Trp Ser Arg Phe Gly Glu Ala Trp
225                 230                 235                 240
Leu Gly Cys Ala Pro Arg Phe Gln Glu Phe Ser Arg Val Tyr Ser Ala
                245                 250                 255
Ala Leu Thr Thr His Leu Asn Pro Cys Glu Met Ala Leu Asp
            260                 265                 270
<210>10
<211>166
<212>PRT
<213>小鼠肌(Mus musculus)
<400>10
Ala Leu Phe Leu Gln Ala Thr Pro His Arg Asp Ile Ser Arg Arg Val
1               5                   10                  15
Ala Ala Phe Arg Phe Glu Leu His Glu Asp Gln Arg Ala Glu Met Ser
            20                  25                  30
Pro Gln Ala Gln Gly Leu Gly Val Asp Gly Ala Cys Arg Pro Cys Ser
        35                  40                  45
Asp Ala Glu Leu Leu Leu Ala Ala Cys Thr Ser Asp Phe Val Ile His
    50                  55                  60
Gly Thr Ile His Gly Val Ala His Asp Thr Glu Leu Gln Glu Ser Val
65                  70                  75                  80
Ile Thr Val Val Val Ala Arg Val Ile Arg Gln Thr Leu Pro Leu Phe
                85                  90                  95
Lys Glu Gly Ser Ser Glu Gly Gln Gly Arg Ala Ser Ile Arg Thr Leu
            100                 105                 110
Leu Arg Cys Gly Val Arg Pro Gly Pro Gly Ser Phe Leu Phe Met Gly
        115                 120                 125
Trp Ser Arg Phe Gly Glu Ala Trp Leu Gly Cys Ala Pro Arg Phe Gln
    130                 135                 140
Glu Phe Ser Arg Val Tyr Ser Ala Ala Leu Thr Thr His Leu Asn Pro
145                 150                 155                 160
Cys Glu Met Ala Leu Asp
                165
<210>11
<211>2321
<212>DNA
<213>褐鼠(Rattus norvegicus)
<220>
<221>misc_feature
<222>(17)..(66)
<223>n是a，c，g，或t
<400>11
tccccggttg tggggannnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn     60
nnnnnnggca gcagcccgag ccccggcgcg tcccctaacc atgctggtag cggcgcttct    120
ctgcgcgctg tgctgcggcc tcttggctgc gtccgctcga gctggctact ccgaggaccg    180
ctgcagctgg aggggcaggt acccaggaga gattttgggg aggatttttg ttatttgtgt    240
tttaaattga aatcttgggt tggagggctc cctcccactt ggaactgagg aagcgcagac    300
ctcaatgtcc tgttccagag ggtggacgca ggtgttggtg gccgcgggaa aagggttgag    360
cgggctaggg aaatgagggc cacccacctg agaaccaccg tcctgtcccc agcggtttga    420
cccaggaacc tggcagcgtg gggcagctga ccctggattg tactgagggt gctatcgagt    480
ggctgtatcc agctggggcg ctgcgcctga ctctaggcgg ctctgatccg ggcacgcggc    540
ccagcatcgt ctgtctgcgc ccaacacggc ccttcgctgg tgcccaggtc ttcgctgaac    600
ggatggccgg caacctagag ttgctactgg ccgagggcca aggcctggct gggggccgct    660
gcatgcgctg gggtcctcgc gagcgccgag cccttttcct gcaggccacg ccacaccggg    720
acatcagccg cagagttgct gccttccaat ttgaactgca cgaggaccaa cgtgcagaaa    780
tgtctcccca ggcccaaggt tttggtgtgg atggtgagtg actagactgg ctggggcgga    840
gctgggtgtc agaaactggc cctctacact ggcctgatcc gaatgggcct tgcctcccca    900
ctgcaccgaa agccctgtag cttgacggag gctactctgg tggagaacac agtggcttcc    960
aggtcatagg gaggtgagtt gagagttctc cctcctttct ctcctcctct tcaaggttcg    1020
gtttaggaaa agagcgggag ggggcagatg ccagagaggc cagccttggg tctctggttt    1080
ctgaagggtt ggggggaagg gttgggctgg ggcagaatca aagcctatgg ccgaagctgt    1140
ccagggctcc ctggccttgt ggtgacctcc ttcccctccc cctagcccaa ccaacaaaag    1200
tccagtgtgc ctcttcgtca ccatggagac tgcctgccct gcctcccggc agggcaccag    1260
gcccagtgct ttgctcttct ggaacttgtc tcctgaccct gcagggaatg gctctctgac    1320
tgctctgcca tagacagaga ccccagaagc agagtccact agaatatccc tggctggacc    1380
tgggaggcag ctctgggagg ttacagaaag ttccccagtg ttggtctgag tttctgagat    1440
gggtgtgcag gaatgtgtcc gaggcactga ggggcccatg agtagtcttc aggcagtgtg    1500
atgctgggag aagggtttag tcgccagctc ctgtaccttc tcctactgtg gggagctgtg    1560
ggcttgtgct gagagatcac aggcctgcct gatgacctgc cttgcatgct aggtgcctgc    1620
aggccctgca gtgatgccga gctccttctg actgcatgca ccagtgactt tggtgagtgt    1680
ttccgtcttg ggagagctta gggtctgccc cacattccca cgtgcccacc actggccacc    1740
atgtctcttc gtagtgatcc atgggaccat ccatggggtc gtccatgaca tggagctgca    1800
agaatcagtc atcactgtgg tggccactcg tgtcatccgc cagacactgc cactgttcca    1860
ggaagggagc tcggagggcc ggggccaggc ctccgttcgt accttgttgc gctgtggtgt    1920
gcgtcctggc ccaggctcct tcctcttcat gggctggagc cgatttggcg aagcttggct    1980
gggctgcgct ccccgcttcc aagagttcag ccgtgtctat tcagctgctc tcgcggccca    2040
cctcaaccca tgtgaggtgg cactggactg agagacctgg gagcaagccc tggatggatc    2100
ttcctctggg gatggggtgt tggggagggg tgataggagg gtgggtggga agggtgtggc    2160
tcagatggca tcctggtacc cacagtgagg tggtagaata ctaaataacc tggatcacac    2220
cagccactgt agacatggtc ttctgtgaca ggcaggctca ctcagctctg ctcctgcctc    2280
actttaccta ctctccagtc tgctgccctt ctgacccttc t                        2321
<210>12
<211>1026
<212>DNA
<213>褐鼠(Rattus norvegicus)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(876)
<400>12
atg ctg gta gcg gcg ctt ctc tgc gcg ctg tgc tgc ggc ctc ttg gct       48
Met Leu Val Ala Ala Leu Leu Cys Ala Leu Cys Cys Gly Leu Leu Ala
1               5                   10                  15
gcg tcc gct cga gct ggc tac tcc gag gac cgc tgc agc tgg agg ggc       96
Ala Ser Ala Arg Ala Gly Tyr Ser Glu Asp Arg Cys Ser Trp Arg Gly
            20                  25                  30
agc ggt ttg acc cag gaa cct ggc agc gtg ggg cag ctg acc ctg gat      144
Ser Gly Leu Thr Gln Glu Pro Gly Ser Val Gly Gln Leu Thr Leu Asp
        35                  40                  45
tgt act gag ggt gct atc gag tgg ctg tat cca gct ggg gcg ctg cgc       192
Cys Thr Glu Gly Ala Ile Glu Trp Leu Tyr Pro Ala Gly Ala Leu Arg
    50                  55                  60
ctg act cta ggc ggc tct gat ccg ggc acg cgg ccc agc atc gtc tgt       240
Leu Thr Leu Gly Gly Ser Asp Pro Gly Thr Arg Pro Ser Ile Val Cys
65                  70                  75                  80
ctg cgc cca aca cgg ccc ttc gct ggt gcc cag gtc ttc gct gaa cgg       288
Leu Arg Pro Thr Arg Pro Phe Ala Gly Ala Gln Val Phe Ala Glu Arg
                85                  90                  95
atg gcc ggc aac cta gag ttg cta ctg gcc gag ggc caa ggc ctg gct       336
Met Ala Gly Asn Leu Glu Leu Leu Leu Ala Glu Gly Gln Gly Leu Ala
            100                 105                 110
ggg ggc cgc tgc atg cgc tgg ggt cct cgc gag cgc cga gcc ctt ttc       384
Gly Gly Arg Cys Met Arg Trp Gly Pro Arg Glu Arg Arg Ala Leu Phe
        115                 120                 125
ctg cag gcc acg cca cac cgg gac atc agc cgc aga gtt gct gcc ttc       432
Leu Gln Ala Thr Pro His Arg Asp Ile Ser Arg Arg Val Ala Ala Phe
    130                 135                 140
caa ttt gaa ctg cac gag gac caa cgt gca gaa atg tct ccc cag gcc       480
Gln Phe Glu Leu His Glu Asp Gln Arg Ala Glu Met Ser Pro Gln Ala
145                 150                 155                 160
caa ggt ttt ggt gtg gat ggt gcc tgc agg ccc tgc agt gat gcc gag       528
Gln Gly Phe Gly Val Asp Gly Ala Cys Arg Pro Cys Ser Asp Ala Glu
                165                 170                 175
ctc ctt ctg act gca tgc acc agt gac ttt gtg atc cat ggg acc atc       576
Leu Leu Leu Thr Ala Cys Thr Ser Asp Phe Val Ile His Gly Thr Ile
            180                 185                 190
cat ggg gtc gtc cat gac atg gag ctg caa gaa tca gtc atc act gtg       624
His Gly Val Val His Asp Met Glu Leu Gln Glu Ser Val Ile Thr Val
        195                 200                 205
gtg gcc act cgt gtc atc cgc cag aca ctg cca ctg ttc cag gaa ggg       672
Val Ala Thr Arg Val Ile Arg Gln Thr Leu Pro Leu Phe Gln Glu Gly
    210                 215                 220
agc tcg gag ggc cgg ggc cag gcc tcc gtt cgt acc ttg ttg cgc tgt       720
Ser Ser Glu Gly Arg Gly Gln Ala Ser Val Arg Thr Leu Leu Arg Cys
225                 230                 235                 240
ggt gtg cgt cct ggc cca ggc tcc ttc ctc ttc atg ggc tgg agc cga       768
Gly Val Arg Pro Gly Pro Gly Ser Phe Leu Phe Met Gly Trp Ser Arg
                245                 250                 255
ttt ggc gaa gct tgg ctg ggc tgc gct ccc cgc ttc caa gag ttc agc       816
Phe Gly Glu Ala Trp Leu Gly Cys Ala Pro Arg Phe Gln Glu Phe Ser
            260                 265                 270
cgt gtc tat tca gct gct ctc gcg gcc cac ctc aac cca tgt gag gtg       864
Arg Val Tyr Ser Ala Ala Leu Ala Ala His Leu Asn Pro Cys Glu Val
        275                 280                 285
gca ctg gac tga gagacctggg agcaagccct ggatggatct tcctctgggg           916
Ala Leu Asp
    290
atggggtgtt ggggaggggt gataggaggg tgggtgggaa gggtgtggct cagatggcat     976
cctggtaccc acagtgaggt ggtagaatac taaataacct ggatcacacc               1026
<210>13
<211>291
<212>PRT
<213>褐鼠(Rattus norvegicus)
<400>13
Met Leu Val Ala Ala Leu Leu Cys Ala Leu Cys Cys Gly Leu Leu Ala
1               5                   10                  15
Ala Ser Ala Arg Ala Gly Tyr Ser Glu Asp Arg Cys Ser Trp Arg Gly
            20                  25                  30
Ser Gly Leu Thr Gln Glu Pro Gly Ser Val Gly Gln Leu Thr Leu Asp
        35                  40                  45
Cys Thr Glu Gly AlaIle Glu Trp Leu Tyr Pro Ala Gly Ala Leu Arg
    50                  55                  60
Leu Thr Leu Gly Gly Ser Asp Pro Gly Thr Arg Pro Ser Ile Val Cys
65                  70                  75                  80
Leu Arg Pro Thr Arg Pro Phe Ala Gly Ala Gln Val Phe Ala Glu Arg
                85                  90                  95
Met Ala Gly Asn Leu Glu Leu Leu Leu Ala Glu Gly Gln Gly Leu Ala
            100                 105                 110
Gly Gly Arg Cys Met Arg Trp Gly Pro Arg Glu Arg Arg Ala Leu Phe
        115                 120                 125
Leu Gln Ala Thr Pro His Arg Asp Ile Ser Arg Arg Val Ala Ala Phe
    130                 135                 140
Gln Phe Glu Leu His Glu Asp Gln Arg Ala Glu Met Ser Pro Gln Ala
145                 150                 155                 160
Gln Gly Phe Gly Val Asp Gly Ala Cys Arg Pro Cys Ser Asp Ala Glu
                165                 170                 175
Leu Leu Leu Thr Ala Cys Thr Ser Asp Phe Val Ile His Gly Thr Ile
            180                 185                 190
His Gly Val Val His Asp Met Glu Leu Gln Glu Ser Val Ile Thr Val
        195                 200                 205
Val Ala Thr Arg Val Ile Arg Gln Thr Leu Pro Leu Phe Gln Glu Gly
    210                 215                 220
Ser Ser Glu Gly Arg Gly Gln Ala Ser Val Arg Thr Leu Leu Arg Cys
225                 230                 235                 240
Gly Val Arg Pro Gly Pro Gly Ser Phe Leu Phe Met Gly Trp Ser Arg
                245                 250                 255
Phe Gly Glu Ala Trp Leu Gly Cys Ala Pro Arg Phe Gln Glu Phe Ser
            260                 265                 270
Arg Val Tyr Ser Ala Ala Leu Ala Ala His Leu Asn Pro Cys Glu Val
        275                 280                 285
Ala Leu Asp
    290
<210>14
<211>275
<212>PRT
<213>褐鼠(Rattus norvegicus)
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(5)
<223>潜在信号肽部分
<400>14
Ala Ser Ala Arg Ala Gly Tyr Ser Glu Asp Arg Cys Ser Trp Arg Gly
1               5                   10                  15
Ser Gly Leu Thr Gln Glu Pro Gly Ser Val Gly Gln Leu Thr Leu Asp
            20                  25                  30
Cys Thr Glu Gly Ala Ile Glu Trp Leu Tyr Pro Ala Gly Ala Leu Arg
        35                  40                  45
Leu Thr Leu Gly Gly Ser Asp Pro Gly Thr Arg Pro Ser Ile Val Cys
    50                  55                  60
Leu Arg Pro Thr Arg Pro Phe Ala Gly Ala Gln Val Phe Ala Glu Arg
65                  70                  75                  80
Met Ala Gly Asn Leu Glu Leu Leu Leu Ala Glu Gly Gln Gly Leu Ala
                85                  90                  95
Gly Gly Arg Cys Met Arg Trp Gly Pro Arg Glu Arg Arg Ala Leu Phe
            100                 105                 110
Leu Gln Ala Thr Pro His Arg Asp Ile Ser Arg Arg Val Ala Ala Phe
        115                 120                 125
Gln Phe Glu Leu His Glu Asp Gln Arg Ala Glu Met Ser Pro Gln Ala
    130                 135                 140
Gln Gly Phe Gly Val Asp Gly Ala Cys Arg Pro Cys Ser Asp Ala Glu
145                 150                 155                 160
Leu Leu Leu Thr Ala Cys Thr Ser Asp Phe Val Ile His Gly Thr Ile
                165                 170                 175
His Gly Val Val His Asp Met Glu Leu Gln Glu Ser Val Ile Thr Val
            180                 185                 190
Val Ala Thr Arg Val Ile Arg Gln Thr Leu Pro Leu Phe Gln Glu Gly
        195                 200                 205
Ser Ser Glu Gly Arg Gly Gln Ala Ser Val Arg Thr Leu Leu Arg Cys
    210                 215                 220
Gly Val Arg Pro Gly Pro Gly Ser Phe Leu Phe Met Gly Trp Ser Arg
225                 230                 235                 240
Phe Gly Glu Ala Trp Leu Gly Cys Ala Pro Arg Phe Gln Glu Phe Ser
                245                 250                 255
Arg Val Tyr Ser Ala Ala Leu Ala Ala His Leu Asn Pro Cys Glu Val
            260                 265                 270
Ala Leu Asp
        275
<210>15
<211>166
<212>PRT
<213>褐鼠(Rattus norvegicus)
<400>15
Ala Leu Phe Leu Gln Ala Thr Pro His Arg Asp Ile Ser Arg Arg Val
1               5                   10                  15
Ala Ala Phe Gln Phe Glu Leu His Glu Asp Gln Arg Ala Glu Met Ser
            20                  25                  30
Pro Gln Ala Gln Gly Phe Gly Val Asp Gly Ala Cys Arg Pro Cys Ser
        35                  40                  45
Asp Ala Glu Leu Leu Leu Thr Ala Cys Thr Ser Asp Phe Val Ile His
    50                  55                  60
Gly Thr Ile His Gly Val Val His Asp Met Glu Leu Gln Glu Ser Val
65                  70                  75                  80
Ile Thr Val Val Ala Thr Arg Val Ile Arg Gln Thr Leu Pro Leu Phe
                85                  90                  95
Gln Glu Gly Ser Ser Glu Gly Arg Gly Gln Ala Ser Val Arg Thr Leu
            100                 105                 110
Leu Arg Cys Gly Val Arg Pro Gly Pro Gly Ser Phe Leu Phe Met Gly
        115                 120                 125
Trp Ser Arg Phe Gly Glu Ala Trp Leu Gly Cys Ala Pro Arg Phe Gln
    130                 135                 140
Glu Phe Ser Arg Val Tyr Ser Ala Ala Leu Ala Ala His Leu Asn Pro
145                 150                 155                 160
Cys Glu Val Ala Leu Asp
                165
<210>16
<211>498
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>16
gccctcttcc tgcaggccac gccgcaccag gacatcagcc gccgcgtggc cgccttccgc     60
tttgagctgc gcgaggacgg gcgccccgag ctgcccccgc aggcccacgg tctcggcgta    120
gacggtgcct gcaggccctg cagcgacgct gagctgctcc tggccgcatg caccagcgac    180
ttcgtaattc acgggatcat ccatggggtc acccatgacg tggagctgca ggagtctgtc    240
atcactgtgg tggccgcccg tgtcctccgc cagacaccgc cgctgttcca ggcggggcga    300
tccggggacc aggggctgac ctccattcgt accccactgc gctgtggcgt ccacccgggc    360
ccaggcacct tcctcttcat gggctggagc cgctttgggg aggcccggct gggctgtgcc    420
ccacgattcc aggagttccg ccgtgcctac gaggctgccc gtgctgccca cctccacccc    480
tgcgaggtgg cgctgcac                                                  498
<210>17
<211>498
<212>DNA
<213>小鼠肌(Mus musculus)
<400>17
gcccttttcc tgcaggccac accacaccgc gacatcagcc gcagagttgc tgccttccgt     60
tttgaactgc acgaggacca acgtgcagaa atgtctcccc aggctcaagg tcttggtgtg    120
gatggtgcct gcaggccctg cagtgatgcc gagctcctcc tggctgcatg caccagtgat    180
tttgtgatcc acgggaccat ccatggggtc gcccatgaca cagagctgca agaatcagtc    240
atcactgtgg tggttgctcg tgtcatccgc cagacactgc cactgttcaa ggaagggagc    300
tcggagggcc aaggccgggc ctccattcgt accttgctgc gctgtggtgt gcgtcctggc    360
ccaggctcct tcctcttcat gggctggagc cgatttggcg aagcttggct gggctgtgct    420
ccccgcttcc aagagttcag ccgtgtctat tcagctgctc tcacgaccca tctcaaccca    480
tgtgagatgg cactggac                                                  498
<210>18
<211>498
<212>DNA
<213>褐鼠(Rattus norvegicus)
<400>18
gcccttttcc tgcaggccac gccacaccgg gacatcagcc gcagagttgc tgccttccaa     60
tttgaactgc acgaggacca acgtgcagaa atgtctcccc aggcccaagg ttttggtgtg    120
gatggtgcct gcaggccctg cagtgatgcc gagctccttc tgactgcatg caccagtgac    180
tttgtgatcc atgggaccat ccatggggtc gtccatgaca tggagctgca agaatcagtc    240
atcactgtgg tggccactcg tgtcatccgc cagacactgc cactgttcca ggaagggagc    300
tcggagggcc ggggccaggc ctccgttcgt accttgttgc gctgtggtgt gcgtcctggc    360
ccaggctcct tcctcttcat gggctggagc cgatttggcg aagcttggct gggctgcgct    420
ccccgcttcc aagagttcag ccgtgtctat tcagctgctc tcgcggccca cctcaaccca    480
tgtgaggtgg cactggac                                                  498
<210>19
<211>104
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>19
Gly Tyr Ser Glu Glu Arg Cys Ser Trp Arg Gly Ser Gly Leu Thr Gln
1               5                   10                  15
Glu Pro Gly Ser Val Gly Gln Leu Ala Leu Ala Cys Ala Glu Gly Ala
            20                  25                  30
Val Glu Trp Leu Tyr Pro Ala Gly Ala Leu Arg Leu Thr Leu Gly Gly
        35                  40                  45
Pro Asp Pro Arg Ala Arg Pro Gly Ile Ala Cys Leu Arg Pro Val Arg
    50                  55                  60
Pro Phe Ala Gly Ala Gln Val Phe Ala Glu Arg Ala Gly Gly Ala Leu
65                  70                  75                  80
Glu Leu Lau Leu Ala Glu Gly Pro Gly Pro Ala Gly Gly Arg Cys Val
                85                  90                  95
Arg Trp Gly Pro Arg Glu Arg Arg
            100
<210>20
<211>104
<212>PRT
<213>小鼠肌(Mus musculus)
<400>20
Gly Tyr Ser Glu Asp Arg Cys Ser Trp Arg Gly Ser Gly Leu Thr Gln
1               5                   10                  15
Glu Pro Gly Ser Val Gly Gln Leu Thr Leu Asp Cys Thr Glu Gly Ala
            20                  25                  30
Ile Glu Trp Leu Tyr Pro Ala Gly Ala Leu Arg Leu Thr Leu Gly Gly
        35                  40                  45
Pro Asp Pro Gly Thr Arg Pro Ser Ile Val Cys Leu Arg Pro Glu Arg
    50                  55                  60
Pro Phe Ala Gly Ala Gln Val Phe Ala Glu Arg Met Thr Gly Asn Leu
65                  70                  75                  80
Glu Leu Leu Leu Ala Glu Gly Pro Asp Leu Ala Gly Gly Arg Cys Met
                85                  90                  95
Arg Trp Gly Pro Arg Glu Arg Arg
            100
<210>21
<211>109
<212>PRT
<213>褐鼠(Rattus norvegicus)
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(5)
<223>潜在信号肽部分
<400>21
Ala Ser Ala Arg Ala Gly Tyr Ser Glu Asp Arg Cys Ser Trp Arg Gly
1               5                   10                  15
Ser Gly Leu Thr Gln Glu Pro Gly Ser Val Gly Gln Leu Thr Leu Asp
            20                  25                  30
Cys Thr Glu Gly Ala Ile Glu Trp Leu Tyr Pro Ala Gly Ala Leu Arg
        35                  40                  45
Leu Thr Leu Gly Gly Ser Asp Pro Gly Thr Arg Pro Ser Ile Val Cys
    50                  55                  60
Leu Arg Pro Thr Arg Pro Phe Ala Gly Ala Gln Val Phe Ala Glu Arg
65                  70                  75                  80
Met Ala Gly Asn Leu Glu Leu Leu Leu Ala Glu Gly Gln Gly Leu Ala
                85                  90                  95
Gly Gly Arg Cys Met Arg Trp Gly Pro Arg Glu Arg Arg
            100                 105
<210>22
<211>97
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>22
Gly Tyr Ser Glu Glu Arg Cys Ser Trp Arg Gly Ser Gly Leu Thr Gln
1               5                   10                  15
Glu Pro Gly Ser Val Gly Gln Leu Ala Leu Ala Cys Ala Glu Gly Ala
            20                  25                  30
Val Glu Trp Leu Tyr Pro Ala Gly Ala Leu Arg Leu Thr Leu Gly Gly
        35                  40                  45
Pro Asp Pro Arg Ala Arg Pro Gly Ile Ala Cys Leu Arg Pro Val Arg
    50                  55                  60
Pro Phe Ala Gly Ala Gln Val Phe Ala Glu Arg Ala Gly Gly Ala Leu
65                  70                  75                  80
Glu Leu Leu Leu Ala Glu Gly Pro Gly Pro Ala Gly Gly Arg Cys Val
                85                  90                  95
Arg
<210>23
<211>97
<212>PRT
<213>小鼠肌(Mus musculus)
<400>23
Gly Tyr Ser Glu Asp Arg Cys Ser Trp Arg Gly Ser Gly Leu Thr Gln
1               5                   10                  15
Glu Pro Gly Ser Val Gly Gln Leu Thr Leu Asp Cys Thr Glu Gly Ala
            20                  25                  30
Ile Glu Trp Leu Tyr Pro Ala Gly Ala Leu Arg Leu Thr Leu Gly Gly
        35                  40                  45
Pro Asp Pro Gly Thr Arg Pro Ser Ile Val Cys Leu Arg Pro Glu Arg
    50                  55                  60
Pro Phe Ala Gly Ala Gln Val Phe Ala Glu Arg Met Thr Gly Asn Leu
65                  70                  75                  80
Glu Leu Leu Leu Ala Glu Gly Pro Asp Leu Ala Gly Gly Arg Cys Met
                85                  90                  95
Arg
<210>24
<211>102
<212>PRT
<213>褐鼠(Rattus norvegicus)
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(5)
<223>潜在信号肽部分
<400>24
Ala Ser Ala Arg Ala Gly Tyr Ser Glu Asp Arg Cys Ser Trp Arg Gly
1               5                   10                  15
Ser Gly Leu Thr Gln Glu Pro Gly Ser Val Gly Gln Leu Thr Leu Asp
            20                  25                  30
Cys Thr Glu Gly Ala Ile Glu Trp Leu Tyr Pro Ala Gly Ala Leu Arg
        35                  40                  45
Leu Thr Leu Gly Gly Ser Asp Pro Gly Thr Arg Pro Ser Ile Val Cys
    50                  55                  60
Leu Arg Pro Thr Arg Pro Phe Ala Gly Ala Gln Val Phe Ala Glu Arg
65                  70                  75                  80
Met Ala Gly Asn Leu Glu Leu Leu Leu Ala Glu Gly Gln Gly Leu Ala
                85                  90                  95
Gly Gly Arg Cys Met Arg
            100
<210>25
<211>1363
<212>DNA
<213>小鼠肌(Mus musculus)
<220>
<221>CDS
<222>(84)..(959)
<400>25
gggcagccgc gccgcgggct gctcgcgctg cggccccgac cctcccgggg cagcagtccg     60
aggccccggc gcgtccccta acc atg ctg gta gcc acg ctt ctt tgc gcg ctc    113
                          Met Leu Val Ala Thr Leu Leu Cys Ala Leu
                          1               5                   10
tgt tgc ggc ctc ctg gcc gcg tcc gct cac gct ggc tac tcg gaa gac      161
Cys Cys Gly Leu Leu Ala Ala Ser Ala His Ala Gly Tyr Ser Glu Asp
                15                  20                  25
cgc tgc agc tgg agg ggc agc ggt ttg acc cag gag cct ggc agc gtg      209
Arg Cys Ser Trp Arg Gly Ser Gly Leu Thr Gln Glu Pro Gly Ser Val
            30                  35                  40
ggg cag ctg acc ctg gac tgt act gag ggc gct atc gag tgg ctg tac      257
Gly Gln Leu Thr Leu Asp Cys Thr Glu Gly Ala Ile Glu Trp Leu Tyr
        45                  50                  55
cca gct ggg gcg ctg cgc ctg acc ctg ggc ggc ccc gat ccg ggc aca      305
Pro Ala Gly Ala Leu Arg Leu Thr Leu Gly Gly Pro Asp Pro Gly Thr
    60                  65                  70
cgg ccc agc atc gtc tgt ctg cgc cca gag cgg ccc ttc gct ggt gcc      353
Arg Pro Ser Ile Val Cys Leu Arg Pro Glu Arg Pro Phe Ala Gly Ala
75                  80                  85                  90
cag gtc ttc gct gaa cgt atg acc ggc aat cta gag ttg cta ctg gcc      401
Gln Val Phe Ala Glu Arg Met Thr Gly Asn Leu Glu Leu Leu Leu Ala
                95                  100                 105
gag ggc ccg gac ctg gct ggg ggc cgc tgc atg cgc tgg ggt ccc cgc      449
Glu Gly Pro Asp Leu Ala Gly Gly Arg Cys Met Arg Trp Gly Pro Arg
            110                 115                 120
gag cgc cga gcc ctt ttc ctg cag gcc aca cca cac cgc gac atc agc      497
Glu Arg Arg Ala Leu Phe Leu Gln Ala Thr Pro His Arg Asp Ile Ser
        125                 130                 135
cgc aga gtt gct gcc ttc cgt ttt gaa ctg cac gag gac caa cgt gca      545
Arg Arg Val Ala Ala Phe Arg Phe Glu Leu His Glu Asp Gln Arg Ala
    140                 145                 150
gaa atg tct ccc cag gct caa ggt ctt ggt gtg gat ggt gcc tgc agg      593
Glu Met Ser Pro Gln Ala Gln Gly Leu Gly Val Asp Gly Ala Cys Arg
155                 160                 165                 170
ccc tgc agt gat gcc gag ctc ctc ctg gct gca tgc acc agt gat ttt      641
Pro Cys Ser Asp Ala Glu Leu Leu Leu Ala Ala Cys Thr Ser Asp Phe
                175                 180                 185
gtg atc cac ggg acc atc cat ggg gtc gcc cat gac aca gag ctg caa      689
Val Ile His Gly Thr Ile His Gly Val Ala His Asp Thr Glu Leu Gln
            190                 195                 200
gaa tca gtc atc act gtg gtg gtt gct cgt gtc atc cgc cag aca ctg      737
Glu Ser Val Ile Thr Val Val Val Ala Arg Val Ile Arg Gln Thr Leu
        205                 210                 215
cca ctg ttc aag gaa ggg agc tcg gag ggc caa ggc cgg gcc tcc att      785
Pro Leu Phe Lys Glu Gly Ser Ser Glu Gly Gln Gly Arg Ala Ser Ile
    220                 225                 230
cgt acc ttg ctg cgc tgt ggt gtg cgt cct ggc cca ggc tcc ttc ctc      833
Arg Thr Leu Leu Arg Cys Gly Val Arg Pro Gly Pro Gly Ser Phe Leu
235                 240                 245                 250
ttc atg ggc tgg agc cga ttt ggc gaa gct tgg ctg ggc tgt gct ccc      881
Phe Met Gly Trp Ser Arg Phe Gly Glu Ala Trp Leu Gly Cys Ala Pro
                255                 260                 265
cgc ttc caa gag ttc agc cgt gtc tat tca gct gct ctc acg acc cat      929
Arg Phe Gln Glu Phe Ser Arg Val Tyr Ser Ala Ala Leu Thr Thr His
            270                 275                 280
ctc aac cca tgt gag atg gca ctg gac tga gagacctggg agcaagccct        979
Leu Asn Pro Cys Glu Met Ala Leu Asp
        285                 290
ggatggacct tcttctggag atggggtgtt ggggagggtg atgggagggt gggtgagaag   1039
ggtgtggctc ggatggcatc ctggtaccca cagtgagctg gtagaatact aagtaatctg   1099
gaccatacca gccactgtag tcatggtctt ctgtggcagg cagcataccc agctctgtgc   1159
ctgcctcact ttgtctactc tccagtctgc tgcccttcta acccttctta gcctgctgac   1219
cagtgagctc atgttttcct cgaattccag ggtgctgctg gggttcagag caaccgtgcc   1279
gtagtttgga agacttgagc taattgtttt ttttttgttt gtttttttgt ttgtttaaag   1339
gtggcctggg gggggcggca aaca                                          1363
<210>26
<211>291
<212>PRT
<213>小鼠肌(Mus musculus)
<400>26
Met Leu Val Ala Thr Leu Leu Cys Ala Leu Cys Cys Gly Leu Leu Ala
1               5                   10                  15
Ala Ser Ala His Ala Gly Tyr Ser Glu Asp Arg Cys Ser Trp Arg Gly
            20                  25                  30
Ser Gly Leu Thr Gln Glu Pro Gly Ser Val Gly Gln Leu Thr Leu Asp
        35                  40                  45
Cys Thr Glu Gly Ala Ile Glu Trp Leu Tyr Pro Ala Gly Ala Leu Arg
    50                  55                  60
Leu Thr Leu Gly Gly Pro Asp Pro Gly Thr Arg Pro Ser Ile Val Cys
65                  70                  75                  80
Leu Arg Pro Glu Arg Pro Phe Ala Gly Ala Gln Val Phe Ala Glu Arg
                85                  90                  95
Met Thr Gly Asn Leu Glu Leu Leu Leu Ala Glu Gly Pro Asp Leu Ala
            100                 105                 110
Gly Gly Arg Cys Met Arg Trp Gly Pro Arg Glu Arg Arg Ala Leu Phe
        115                 120                 125
Leu Gln Ala Thr Pro His Arg Asp Ile Ser Arg Arg Val Ala Ala Phe
    130                 135                 140
Arg Phe Glu Leu His Glu Asp Gln Arg Ala Glu Met Ser Pro Gln Ala
145                 150                 155                 160
Gln Gly Leu Gly Val Asp Gly Ala Cys Arg Pro Cys Ser Asp Ala Glu
                165                 170                 175
Leu Leu Leu Ala Ala Cys Thr Ser Asp Phe Val Ile His Gly Thr Ile
            180                 185                 190
His Gly Val Ala His Asp Thr Glu Leu Gln Glu Ser Val Ile Thr Val
        195                 200                 205
Val Val Ala Arg Val Ile Arg Gln Thr Leu Pro Leu Phe Lys Glu Gly
    210                 215                 220
Ser Ser Glu Gly Gln Gly Arg Ala Ser Ile Arg Thr Leu Leu Arg Cys
225                 230                 235                 240
Gly Val Arg Pro Gly Pro Gly Ser Phe Leu Phe Met Gly Trp Ser Arg
                245                 250                 255
Phe Gly Glu Ala Trp Leu Gly Cys Ala Pro Arg Phe Gln Glu Phe Ser
            260                 265                 270
Arg Val Tyr Ser Ala Ala Leu Thr Thr His Leu Asn Pro Cys Glu Met
        275                 280                 285
Ala Leu Asp
    290

Claims (121)

1.分离的医药用途的多肽，所述多肽包括选自下列的氨基酸序列：
a)选自SEQ ID No.3、4、5、8、9、10、13、14、15、19、20、21、22、23和24的氨基酸序列；
b)选自SEQ ID No.3、4、5、8、9、10、13、14、15、19、20、21、22、23和24的氨基酸序列突变体，其中突变体与所述氨基酸序列至少有70％序列同一性；和
c)含a)至b)中任何的至少50个连续氨基酸的生物活性片段。
2.权利要求1所述的多肽，是选自SEQ ID No.3、4、5、8、9、10、13、14、15、19、20、21、22、23和24序列的天然产生的等位基因突变体。
3.权利要求2所述的多肽，其中等位基因突变体包括由核酸序列翻译而成的氨基酸序列，所述核酸序列与选自SEQ ID No.1、2、6、7、11、12、16、17和18的序列相比有单个核苷酸不同。
4.权利要求1所述的多肽，是本文所述的多肽突变体，其中所选序列中任一氨基酸发生保守取代。
5.权利要求1所述的多肽，其中信号肽被异源信号肽置换。
6.权利要求1所述的多肽，其与选自SEQ ID No.5、10和15序列的蛋白至少有70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少95％，更优选至少98％的序列同一性，更优选其是具有选自SEQ ID No.5、10和15序列的蛋白。
7.权利要求1所述的多肽，其与选自SEQ ID No.4、9和14的序列的蛋白至少有70％序列同一性，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少95％，更优选至少98％，更优选其是具有选自SEQ ID No.4、9和14的序列的蛋白。
8.权利要求1所述的多肽，其与选自SEQ ID No.3、8和13的序列的蛋白至少有70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少95％，更优选至少98％的序列同一性，更优选其是具有选自SEQ ID No.3、8和13的序列的蛋白。
9.权利要求1所述的多肽，其与选自SEQ ID No.19、20、21，22，23和24的序列的蛋白至少有70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少95％，更优选至少98％的序列同一性，更优选其是具有选自SEQID No.19、20、21，22，23和24的序列的蛋白。
10.权利要求1所述的多肽，其与选自SEQ ID No.3的序列的蛋白至少有70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少95％，更优选至少98％的序列同一性，更优选其是具有选自SEQ ID No.3的序列的蛋白。
11.权利要求1所述的多肽，其与选自SEQ ID No.4的序列的蛋白至少有70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少95％，更优选至少98％的序列同一性，更优选其是具有选自SEQ ID No.4的序列的蛋白。
12.权利要求1所述的多肽，其与选自SEQ ID No.5的序列的蛋白至少有70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少95％，更优选至少98％的序列同一性，更优选其是具有选自SEQ ID No.5的序列的蛋白。
13.权利要求1所述的多肽，其与选自SEQ ID No.19的序列的蛋白至少有70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少95％，更优选至少98％的序列同一性，更优选其是具有选自SEQ ID No.19的序列的蛋白。
14.权利要求1所述的多肽，其与选自SEQ ID No.22的序列的蛋白至少有70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少95％，更优选至少98％的序列同一性，更优选其是具有选自SEQ ID No.22的序列的蛋白。
15.权利要求1所述的多肽，其中片段选自：
i)SEQ ID No 3的AA30-AA288，以及一端或两端有天然序列的1到5个额外氨基酸，至多形成SEQ ID No 3的AA25-AA293的多肽；
ii)SEQ ID No 13的AA28-AA286，以及一端或两端有天然序列的1到5个额外氨基酸，至多形成SEQ ID No 13的AA23-AA291的多肽；
iii)SEQ ID No 8的AA31-AA289，以及一端或两端有天然序列的1到5个额外氨基酸，至多形成SEQ ID No 8的AA26-AA294的多肽；
iv)所述多肽的突变体，其中所选序列中任一氨基酸可变化成不同氨基酸，条件是序列中不超过20个氨基酸残基发生这样的改变。
16.权利要求1所述的多肽，选自：
i)SEQ ID No 3的AA171-AA288，以及一端或两端有天然序列的1到5个额外氨基酸，至多形成SEQ ID No 3的AA165-AA288的多肽；
ii)SEQ ID No 13的AA169-AA286，以及一端或两端有天然序列的1到5个额外氨基酸，至多形成SEQ ID No 13的AA164-AA291的多肽；
iii)SEQ ID No 8的AA172-AA289，以及一端或两端有天然序列的1到5个额外氨基酸，至多形成SEQ ID No 8的AA167-AA294的多肽；
iv)所述多肽的突变体，其中所选序列中任一氨基酸可变化成不同氨基酸，条件是序列中不超过10个氨基酸残基发生这样的改变。
17.权利要求1所述的多肽，其中片断选自：
i)SEQ ID No 3的AA30-AA118，以及一端或两端有来自天然序列的1到5个额外的氨基酸，至多构成SEQ ID No 3的AA25-AA123的多肽；
ii)SEQ ID No 13的AA28-AA116，以及一端或两端有来自天然序列的1到5个额外的氨基酸，至多构成SEQ ID No 13的AA23-AA121的多肽；
iii)SEQ ID No 8的AA31-AA119，以及一端或两端有来自天然序列的1到5个额外的氨基酸，至多构成SEQ ID No 8的AA26-AA124的多肽；
iv)所述多肽的突变体，其中所选序列中任一氨基酸可变化成不同氨基酸，条件是序列中不超过10个氨基酸残基发生这样的改变。
18.权利要求15-17中任一项所述的多肽，其中改变的氨基酸选自图3a所示的非保守的，低保守的或高度保守的氨基酸。
19.前述任一项权利要求的多肽，能够形成至少一个分子内胱氨酸桥。
20.前述任一项权利要求的多肽，包括通过分子内胱氨酸桥连接形成的NsG33二聚体。
21.前述任一权利要求的多肽，还包括亲和标签，如多聚组氨酸标签，GST标签，HA标签，Flag标签，C-myc标签，HSV标签，V5标签，麦芽糖结合蛋白标签，纤维素结合域标签。
22.医药用途的分离的核酸分子，包括编码多肽的核酸序列或其互补序列，所述多肽包括选自下列的氨基酸序列：
a)选自SEQ ID No.3、4、5、8、9、10、13、14、15、19、20、21、22、23和24的氨基酸序列；
b)选自SEQ ID No.3、4、5、8、9、10、13、14、15、19、20、21、22、23和24的氨基酸序列突变体，其中突变体与所述氨基酸序列至少有70％序列同一性；和
c)a)至b)中的任何的至少50个连续氨基酸的生物活性片段。
23.权利要求22所述的核酸分子，其中核酸分子包括天然产生的等位基因突变体的核苷酸序列。
24.权利要求22所述的编码多肽突变体的核酸分子，其中多肽突变体含有天然产生的多肽突变体的多肽序列。
25.权利要求22所述的核酸分子，其中核酸分子与选自SEQ ID No.1、2、6、7、11、12、16、17和18的核酸序列有单个核苷酸不同。
26.权利要求22所述的核酸分子，其中编码的多肽与选自SEQ ID No.5、10和15的序列至少有70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少95％，更优选至少98％的序列同一性，更优选其是具有选自SEQ IDNo.5、10和15的序列的蛋白。
27.权利要求22所述的核酸分子，其中编码的多肽与选自SEQ ID No.4、9和14的序列至少有70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少95％，更优选至少98％的序列同一性，更优选其是具有选自SEQ IDNo.4、9和14的序列的蛋白。
28.权利要求22所述的核酸分子，其中编码的多肽与选自SEQ IDNo.3、8和13的序列至少有70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少95％，更优选至少98％的序列同一性，更优选其是具有选自SEQID No.3、8和13的序列的蛋白。
29.权利要求22所述的核酸分子，其中编码的多肽与选自SEQ ID No.19、20、21、22、23和24的序列至少有70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少95％，更优选至少98％的序列同一性，更优选其是具有选自SEQ ID No.19、20、21、22、23和24的序列的蛋白。
30.权利要求22所述的核酸分子，其中编码的多肽与SEQ ID No.3的序列至少有70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少95％，更优选至少98％的序列同一性，更优选其是具有SEQ ID No.3的序列的蛋白。
31.权利要求22所述的核酸分子，其中编码的多肽与SEQ ID No.4的序列至少有70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少95％，更优选至少98％的序列同一性，更优选其是具有SEQ ID No.4的序列的蛋白。
32.权利要求22所述的核酸分子，其中编码的多肽与SEQ ID No.5的序列至少有70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少95％，更优选至少98％的序列同一性，更优选其是具有SEQ ID No.5的序列的蛋白。
33.权利要求22所述的核酸分子，其中编码的多肽与SEQ ID No.19的序列至少有70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少95％，更优选至少98％的序列同一性，更优选其是具有SEQ ID No.19的序列的蛋白。
34.权利要求22所述的核酸分子，其中编码的多肽与SEQ ID No.22的序列至少有70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少95％，更优选至少98％的序列同一性，更优选其是具有SEQ ID No.22的序列的蛋白。
35.权利要求22所述的核酸分子，其中核酸分子包括选自如下的核苷酸序列：
a)选自SEQ ID No.1、2、6、7、11、12、16、17和18的核苷酸序列；
b)与选自SEQ ID No.1、2、6、7、11、12、16、17和18的核苷酸序列至少有70％序列同一性的核苷酸序列；
c)选自SEQ ID No.1、2、6、7、11、12、16、17和18的序列的至少150个连续核苷酸的核酸序列；
c)能与具有选自SEQ ID No.1、2、6、7、11、12、16、17和18的序列的核酸在高度严谨条件下杂交的互补核酸；
d)上述任一核酸的互补核酸序列。
36.权利要求22所述的核酸分子，包含与选自SEQ ID No.2、7、12、16、17和18的核苷酸序列至少有70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少95％，更优选至少98％序列同一性的核苷酸序列，更优选其是具有SEQ ID No.2、7、12、16、17或18序列的核苷酸序列的核酸。
37.权利要求22所述的核酸分子，包含与选自SEQ ID No.16、17和18的核苷酸序列至少有70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少95％，更优选至少98％序列同一性的核苷酸序列，更优选其是具有SEQID No.16、17或18的核苷酸序列的核酸。
38.权利要求22所述的核酸分子，包含与选自SEQ ID No.2和16的核苷酸序列至少有70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少95％，更优选至少98％序列同一性的核苷酸序列，更优选其是具有SEQ ID No.2和16的核苷酸序列的核酸。
39.权利要求22所述的核酸分子，其与选自SEQ ID No.2的187-996核苷酸、SEQ ID No.7的74-883核苷酸和SEQ ID No.12的64-873的核苷酸的多聚核苷酸序列至少有70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少98％的序列同一性。
40.权利要求22所述的核酸分子，其与具有SEQ ID No.1序列的核酸分子至少有70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少95％，更优选至少98％序列同一性，更优选其是具有SEQ ID No.1序列的核酸。
41.权利要求22所述的核酸分子，其与具有SEQ ID No.2序列的核酸分子至少有70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少95％，更优选至少98％序列同一性，更优选其是具有SEQ ID No.2序列的核酸。
42.权利要求22所述的核酸分子，其与具有SEQ ID No.6序列的核酸分子至少有70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少95％，更优选至少98％序列同一性，更优选其是具有SEQ ID No.6序列的核酸。
43.权利要求22所述的核酸分子，其与具有SEQ ID No.7序列的核酸分子至少有70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少95％，更优选至少98％序列同一性，更优选其是具有SEQ ID No.7序列的核酸。
44.权利要求22所述的核酸分子，其与具有SEQ ID No.11序列的核酸分子至少有70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少95％，更优选至少98％序列同一性，更优选其是具有SEQ ID No.11序列的核酸。
45.权利要求22所述的核酸分子，其与具有SEQ ID No.12序列的核酸分子至少有70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少95％，更优选至少98％序列同一性，更优选其是具有SEQ ID No.12序列的核酸。
46.权利要求22所述的核酸分子，其与具有SEQ ID No.16序列的核酸分子至少有70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少95％，更优选至少98％序列同一性，更优选其是具有SEQ ID No.16序列的核酸。
47.权利要求22所述的核酸分子，其与具有SEQ ID No.17序列的核酸分子至少有70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少95％，更优选至少98％序列同一性，更优选其是具有SEQ ID No.17序列的核酸。
48.权利要求22所述的核酸分子，其与具有SEQ ID No.18序列的核酸分子至少有70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少95％，更优选至少98％序列同一性，更优选其是具有SEQ ID No.18序列的核酸。
49.权利要求22所述的核酸分子，进行了密码子优化以便在大肠杆菌，中国仓鼠，幼仓鼠，酵母，昆虫和/或真菌中表达。
50.权利要求22所述的核酸分子，其中核酸分子是SEQ ID No 2和7和/或12的改组突变体。
51.载体，包括前述权利要求22-50中任一项所述的核酸分子。
52.权利要求51的载体，还包括与核酸分子可操作连接的启动子。
53.权利要求52的载体，其中启动子选自：CMV，人UbiC、JeT、RSV、Tet-可调节启动子、Mo-MLV-LTR、Mx1、EF-1α。
54.权利要求51或52的载体，选自起源于逆转录病毒家族的载体，所述逆转录病毒家族包括慢病毒、HIV、SIV、FIV、EAIV、CIV。
55.权利要求51或52的载体，选自甲病毒，腺病毒，腺相关病毒，杆状病毒，HSV，冠状病毒，牛乳头瘤病毒，Mo-MLV，优选腺相关病毒。
56.分离的宿主细胞，其由权利要求51-55中任一项所述载体所转化或转导。
57.权利要求56的宿主细胞，选自大肠杆菌，酵母，酿酒酵母，曲霉菌，Sf9昆虫细胞。
58.权利要求56的宿主细胞，选自哺乳动物细胞，如人、猫、猪、猿猴、犬、鼠类、大鼠、小鼠和兔。
59.权利要求58的宿主细胞，选自无限增殖化视网膜色素上皮细胞，如ARPE-19细胞，无限增殖化人成纤维细胞和无限增殖化人星形胶质细胞。
60.权利要求59的宿主细胞，其附着在基质上。
61.权利要求58的宿主细胞，选自干细胞，包括人神经干细胞或前体细胞，人神经胶质干细胞或前体细胞和胚胎干细胞。
62.权利要求58的宿主细胞，选自CHO、CHO-K1、HEI193T、HEK293、COS、PC12、HiB5、RN33b、BHK细胞。
63.能够产生感染性病毒颗粒的包装细胞系，所述病毒颗粒包含逆转录病毒科来源的基因组，该基因组包含5’端逆转录病毒LTR、tRNA结合位点、包装信号，与编码权利要求1-21任一项所述多肽的多核苷酸序列可操作连接的启动子，合成DNA第2条链的起始位点和3’端逆转录病毒LTR。
64.权利要求62的包装细胞系，其中基因组是慢病毒来源并且LTR是慢病毒的LTR。
65.一种可植入的生物相容性细胞装置，该装置包括：
i)允许如权利要求1-21中任一项所述蛋白和/或病毒载体扩散的半透膜；和
ii)权利要求56-62中任一项所述的细胞组合物或权利要求63-64中任一项所述的包装细胞系。
66.权利要求65所述的装置，其中半透膜是免疫隔离的。
67.权利要求65所述的装置，其中半透膜是多孔的。
68.权利要求65所述的装置，还包括配置在半透膜内的基质。
69.权利要求65所述的装置，还包括束缚锚。
70.权利要求65所述的装置，其中所述的装置包括核心和围绕所述核心的外壳，所述核心含有分泌病毒载体以感染靶细胞的活的包装细胞，其中病毒载体是逆转录病毒，载体包括编码权利要求1-21中任一项所述多肽的异源基因，并与调节所述多肽在靶细胞中表达的启动子可操纵连接；所述外壳包括可渗透生物相容性材料，所述材料具有选择允许直径约100nm的逆转录病毒载体通过的孔隙度，使所述载体可以从所述胶囊释放。
71.权利要求70所述的装置，其中核心另外包括基质，包装细胞固定在基质上。
72.权利要求70所述的装置，其中外壳包括水凝胶或热塑性材料。
73.一种药物组合物，包括：
i)权利要求1-21中任一项所述的多肽；或
ii)权利要求22-50中任一项所述的分离核酸序列；或
iii)利要求51-55中任一项所述的表达载体；或
iv)权利要求56-62中任一项所述的宿主细胞组合物；或
v)权利要求63-64中任一项所述的包装细胞系；或
vi)权利要求65-72中任一项所述的可植入生物相容性细胞材料；和
可药用载体。
74.如下组分在制备药物中的用途：
i)权利要求1-21中任一项所述的多肽；或
ii)权利要求22-50中任一项所述的分离核酸序列；或
iii)权利要求51-55中任一项所述的表达载体；或
iv)权利要求56-62中任一项所述的宿主细胞组合物；或
v)权利要求65-72中任一项所述的可植入生物相容性细胞材料；或
vi)权利要求63-64中任一项所述的包装细胞系。
75.权利要求74所述的用途，其中所述药物用于治疗免疫疾病。
76.权利要求75所述的用途，其中免疫疾病选自：感染性疾病、免疫缺陷、癌症、自身免疫性疾病，包括多发性硬化症、过敏反应和病症以及移植物抗宿主疾病。
77.权利要求74所述的用途，其中所述药物用于治疗神经系统相关疾病、障碍或损伤。
78.权利要求77所述的用途，其中所述药物用于治疗涉及脑、脑干、脊髓和/或外周神经系统损伤的疾病、障碍或损伤，包括但不限于如中风、外伤性脑损伤、脊髓损伤、弥散性轴索损伤、癫痫、神经病、外周神经病变和伴随的疼痛及其它症状。
79.权利要求77所述的用途，其中神经系统疾病包括神经元退化及其在脑、脑干、脊髓和/或外周神经中的病变，包括但不限于帕金森氏病，阿尔兹海默氏病，老年性痴呆，亨廷顿氏病，肌萎缩性侧索硬化，多发性硬化症相关的神经损伤，及相关症状。
80.权利要求79所述的用途，其中神经退化性疾病是帕金森氏病
81.权利要求79所述的用途，其中神经退化性疾病是亨廷顿氏病。
82.权利要求79所述的用途，其中神经退化性疾病是肌萎缩性侧索硬化症。
83.权利要求77所述的用途，其中神经系统疾病是涉及脑、脑干、脊髓和/或外周神经功能障碍和/或神经元丧失的疾病、障碍或损伤，包括但不限于代谢性疾病、营养缺陷、中毒性损伤、恶性肿瘤，和/或遗传或原发性疾病，包括但不限于糖尿病、肾功能不全、酒精中毒、化疗、化学试剂、药物滥用、维生素缺乏和感染。
84.权利要求83或78所述的用途，其中疾病是外周神经疾病及相关疼痛。
85.权利要求77所述的用途，其中神经系统疾病是涉及脑、脑干、脊髓和外周神经中神经胶质细胞，如少突胶质细胞，星形胶质细胞，施万氏细胞退化或硬化的疾病、障碍或损伤，包括但不限于多发性硬化症，视神经炎，脑硬化症，感染后脑脊髓炎，癫痫及相关症状。
86.权利要求85所述的用途，其中疾病或病变是多发性硬化症，感觉性共济失调，神经变性脊髓小脑病症，遗传性共济失调，小脑萎缩和酒精中毒。
87.权利要求77所述的用途，其中神经系统疾病、障碍或损伤包括视网膜、光感受器及相关神经病变，包括但不限于色素性视网膜炎，黄斑变性，青光眼，糖尿病性视网膜病，和相关症状。
88.权利要求77所述的用途，其中神经系统障碍、疾病或损伤包括感觉上皮及相关前庭听神经神经节病变，包括但不限于噪声引起的听力丧失、耳聋、耳鸣、耳炎、迷路炎、遗传性耳蜗前庭萎缩、美尼尔症，和相关症状。
89.一种治疗待治疗者疾病的方法，包括给予需要治疗的个体治疗有效量的下述组分：
i)权利要求1-21中任一项所述的多肽；或
ii)权利要求22-50中任一项所述的分离核酸序列；或
iii)权利要求51-55中任一项所述的表达载体；或
iv)权利要求56-62中任一项所述的宿主细胞组合物；或
v)权利要求65-72中任一项所述的可植入生物相容性细胞装置；或
vi)权利要求63-64中任一项所述的包装细胞系。
90.权利要求89的方法，其中病理状态是免疫疾病。
91.权利要求90所述的方法，其中免疫疾病选自：感染性疾病、免疫缺陷、癌症、自身免疫性疾病，包括多发性硬化症、过敏反应和病症，以及移植物抗宿主疾病。
92.权利要求89所述的方法，其中所述药物用于治疗神经系统相关疾病、障碍或损伤。
93.权利要求92所述的方法，其中所述药物用于治疗涉及脑、脑干、脊髓和/或外周神经系统损伤的疾病、障碍或损伤，包括但不限于如中风、外伤性脑损伤、脊髓损伤、弥散性轴索损伤、癫痫、神经病、外周神经病和伴随的疼痛及其它症状。
94.权利要求92所述的方法，其中神经系统障碍包括神经元退化及其在脑、脑干、脊髓和/或外周神经的中的病变，包括但不限于帕金森氏病，阿尔兹海默氏病，老年性痴呆，亨廷顿氏病，肌萎缩性侧索硬化，多发性硬化症相关的神经损伤，及相关症状。
95.权利要求94所述的方法，其中神经变性疾病是帕金森氏病。
96.权利要求94所述的方法，其中神经变性疾病是亨廷顿氏病。
97.权利要求94所述的方法，其中神经变性疾病是肌萎缩性侧索硬化症。
98.权利要求92所述的方法，其中神经系统障碍是涉及脑、脑干、脊髓和/或外周神经机能障碍和/或神经元丧失的疾病、障碍或损伤，包括但不限于代谢性疾病，营养缺陷，中毒性损伤，恶性肿瘤，和/或遗传或特发性病症所导致的病症，包括但不限于糖尿病、肾功能不全、酒精中毒、化疗、化学试剂、药物滥用、维生素缺乏和感染。
99.权利要求98的方法，其中疾病是外周神经病及相关疼痛。
100.权利要求92所述的方法，其中神经系统障碍是涉及脑、脑干、脊髓和外周神经中神经胶质细胞，如少突胶质细胞，星形胶质细胞，施万氏细胞退化或硬化的疾病、障碍或损伤，包括但不限于多发性硬化症，视神经炎，脑硬化症，感染后脑脊髓炎，癫痫及相关症状。
101.权利要求100所述的方法，其中疾病或障碍是多发性硬化症，感觉性共济失调，神经变性的脊髓小脑病变，遗传性共济失调，小脑萎缩和酒精中毒。
102.权利要求92所述的方法，其中神经系统疾病、障碍或损伤包括视网膜、光感受器及相关神经病变，包括但不限于色素性视网膜炎，黄斑变性，青光眼，糖尿病性视网膜病，和相关症状。
103.权利要求92所述的方法，其中神经系统疾病、障碍或损伤包括感觉上皮及相关前庭听神经神经节病变，包括但不限于引起的听力丧失、耳聋、耳鸣、耳炎、迷路炎、遗传性耳蜗前庭萎缩、美尼尔症，和相关症状。
104.权利要求89所述的方法，其中受试体是人。
105.一种阻止哺乳动物神经细胞凋亡的方法，所述方法包括将所述神经细胞暴露于权利要求1-21中任一项的多肽中。
106.一种提高哺乳动物神经细胞存活的方法，所述方法包括将所述神经细胞暴露于权利要求1-21中任一项的多肽中。
107.一种产生神经元的方法，所述方法包括将神经前体细胞或神经干细胞暴露于权利要求1-21中任一项的多肽中。
108.一种扩增哺乳动物细胞组合物的方法，包括将权利要求1-21中任一项所述多肽给予所述组合物；或用权利要求51-55中任一项的表达载体转导/转染所述细胞。
109.一种分化哺乳动物细胞组合物的方法，包括将权利要求1-21中任一项所述多肽给予所述组合物；或用权利要求51-55中任一项的表达载体转导/转染所述细胞。
110.抗体，能够与权利要求1-21中任一项的多肽结合。
111.权利要求110所述的抗体，选自多克隆抗体，单克隆抗体，人源化抗体，单链抗体，重组抗体。
112.免疫偶联物，包括权利要求110的抗体和选自如下的偶联物：细胞毒素剂如化疗剂，毒素或放射性同位素；特异结合配对成分如卵白素或抗生物素蛋白链菌素或抗原；能够产生可检测产物的酶。
113.分离多肽以及所述多肽的突变体，所述分离多肽选自：SEQ ID No3的AA128-AA293、SEQ ID No 3的AA121-AA293、SEQ ID No 8的AA129-AA294、SEQ ID No 8的AA122-AA294、SEQ ID No 13的AA126-AA291、SEQ ID No 13的AA119-AA291，其中所选序列中任一氨基酸可变化成不同氨基酸，条件是序列中不超过15个氨基酸残基发生这样的改变。
114.权利要求113所述的分离多肽，其中发生改变的氨基酸选自图3a所示的非保守的，低保守的或高度保守的氨基酸。
115.选自SEQ ID No 19、20、21、22、23和24的分离的多肽以及所述多肽的突变体，其中所选序列中的任一氨基酸可变化成不同氨基酸，条件是序列中不超过15个氨基酸残基发生这样的改变。
116.权利要求115所述的分离多肽，其中发生改变的氨基酸选自图3a所示的非保守的，低保守的或高度保守的氨基酸。
117.分离的多肽，选自：
i)SEQ ID No 3的AA30-AA288，以及其一端或两端有天然序列的1到5个额外氨基酸，至多形成SEQ ID No 3的AA25-AA293的多肽；
ii)SEQ ID No 13的AA28-AA286，以及其一端或两端有天然序列的1到5个额外氨基酸，至多形成SEQ ID No 13的AA23-AA291的多肽；
iii)SEQ ID No 8的AA31-AA289，以及其一端或两端有天然序列的1到5个额外氨基酸，至多形成SEQ ID No 8的AA26-AA294的多肽；
iv)所述多肽的突变体，其中所选序列中的任一氨基酸可变化成不同氨基酸，条件是序列中不超过20个氨基酸残基发生这样的改变
118.一种分离的多肽，选自：
i)SEQ ID No 3的AA171-AA288，以及其一端或两端有天然序列的1到5个额外氨基酸，至多形成SEQ ID No 3的AA165-AA288的多肽；
ii)SEQ ID No 13的AA169-AA286，以及其一端或两端有天然序列的1到5个额外氨基酸，至多形成SEQ ID No 13的AA164-AA291的多肽；
iii)SEQ ID No 8的AA172-AA289，以及其一端或两端有天然序列的1到5个额外氨基酸即，至多形成SEQ ID No 8的AA167-AA294的多肽；
iv)所述多肽的突变体，其中所选序列中的任一氨基酸可变化成不同氨基酸，条件是序列中不超过10个氨基酸残基发生这样的改变。
119.一种分离的多肽，选自：
i)SEQ ID No 3的AA30-AA118，以及其一端或两端有来自天然序列的1到5个额外的氨基酸，至多构成SEQ ID No 3的AA25-AA123的多肽；
ii)SEQ ID No 13的AA28-AA116，以及其一端或两端有来自天然序列的1到5个额外的氨基酸，至多构成SEQ ID No 13的AA23-AA121的多肽；
iii)SEQ ID No 8的AA31-AA119，以及其一端或两端有来自天然序列的1到5个额外的氨基酸，至多构成SEQ ID No 8的AA26-AA124的多肽；
iv)所述多肽的突变体，其中所选序列中的任一氨基酸可变化成不同氨基酸，条件是序列中不超过10个氨基酸残基发生这样的改变。
120.权利要求117，118或119所述的多肽，其中发生改变的氨基酸选自如图3a所示的非保守的、低保守的或高度保守的氨基酸。
121.分离的多聚核苷酸，其编码权利要求113-119任一项所述的多肽。
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