CN106488984A - 一种治疗周围神经病变以及运动神经元疾病的方法 - Google Patents

一种治疗周围神经病变以及运动神经元疾病的方法 Download PDF

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Abstract

含有分子的组合物，用于将所述组合物递送到对象的外周神经系统(PNS)和/或中枢神经系统(CNS)中，其中所述组合物通过局部输注施用。

Description

一种治疗周围神经病变以及运动神经元疾病的方法
发明背景
外周神经系统(PNS)由神经和神经元构成，包括外周神经和位于中枢神经系统(CNS)外或从大脑和脊髓延伸到CNS外的神经节。
PNS涉及到大量遗传或获得性的神经性疾病，例如腓骨肌萎缩症、糖尿病性、感染性、毒性和药物相关性或免疫相关性神经病变。
对那些疾病有效的临床干预非常有限。基因疗法代表了PNS疾病的一种新型治疗策略。然而，有效的PNS转基因仍然对遗传性和获得性周围神经病变的基因疗法而言非常关键。
据报道，腺相关病毒(AAV)载体可有效转导背根神经节(DRG)神经元。然而，这需要精细的显微神经外科技术来将AAV递送至DRG(Glatzel等,2000,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97,442-447)
Foust等(2008,Hum.Gen.Ther.19,61-70)报道，将AAV血清型8载体系统性地递送至新生小鼠时，AAV可转导背角和后索的神经纤维，这表明有DEG的转导。然而，系统性途径是非特异性的，且需要大量的治疗性基因。
Zheng等(2010,Hum.Gen.Ther.21(1),87-97)报道了新生小鼠腹腔注射以及成年小鼠肌肉注射(后肢胫骨前肌和腓肠肌)AAV8转导PNS的能力。在两种情况中，脊髓白质、DRG神经元和外周神经中均找到了有效、长期的转基因。这些结果支持了AAV载体从肌肉向脊髓的逆向转运机制，而不是穿越血脑屏障。然而，肌内递送需要多位点注射且效率较低。
Homs等(2011,Gene Therapy 18,622-630)报道了坐骨神经注射不同AAV假型(pseudotype)后的趋向性和转导效率。观察到AAV8能特异性转导施旺细胞，从而为外周神经的再生提供了基因治疗策略。然而，神经的局部施用在临床水平不可行，尤其是出于安全原因。
Bevan等(2011,Mol.Therapy 19(11),1971-80)报道了对任意年龄猕猴的CNS和外周组织静脉注射AAV9载体的有效递送。这为儿科疾病，如脊髓性肌肉萎缩(SMA)，提供了有前景的治疗方案。为了减少外周组织的毒性，尝试了在静脉注射期间对肝脏进行血流阻断。此外，它显示了CSF(脑脊液)注射靶向于运动神经元且限制了向CSF的基因表达。
Weismann等(2013,Mol.Therapy 21,S147-148)报道了向GM1(神经节苷脂贮积症)小鼠模型静脉内施用(IV注射)AAV9-βgal在CNS有酶表达且随着性别不同而延迟了疾病的发生。
WO 2010/129021涉及了自补性(sc)AAV载体在治疗神经退行性病变中的用途，例如SMA或ALS(肌萎缩性脊髓侧索硬化症)。实施例对脑室内和脊髓注射进行了描述。
Wang等(2014,Human Mol.Genetics 23(3),668-81)报道了鞘内注射AAV(AAVrh10)对ALS的有效RNAi疗法。
Dehay等(2012,科技报告2(Scientific Reports 2))报道通过GFP监测，系统性(IV)(施用)scAAV9从而介导了新生恒河猴的大脑转导。Gray等(2011,分子疗法(MolecularTherapy)19(6),1058-1069)比较了向成年小鼠和非人灵长类神经元和胶质进行的AAV9(ss和sc)静脉递送。WO 2009/043936公开了通过外周(例如IV或IM)施用，采用双股自补AAV载体向运动神经元、胶质细胞、脊髓进行的基因递送。
此外，近期的综述(Bourdenx等，2014,Front Mol Neurosci.7:50；Murlidharan等.2014,Front Mol Neurosci.7:76；Karda等，2014,Front Mol Neurosci.7:89)列举了采用腺病毒向中枢神经系统(CNS)递送基因的所有这些选择。系统性递送，尤其是IV注射，由于它避免了侵入性大脑外科手术而显得很有前景。此外，仍需对控制转基因表达、细胞特异性和载体优化进行努力。
因此，本领域需要对PNS和/或CNS有效、简单、创伤最小化的递送方法。本发明满足了该待满足的需求。
发明概述
本发明基于的观察结果为：在犬的隐静脉局限性输注AAV8载体一年后，在所输注的坐骨神经检测到大量的所述载体。
令人意外的是，目前为止被预见为只能通过肌肉递送且并非用于PNS或CNS疾病的施用途径，对PNS和/或CNS表现出非常有效的递送。
定义
本文所用术语“一”和“一个”指的是一个或一个以上(例如，至少一个)文中的语法对象。例如，“一元素”指的是一个元素或一个以上的元素。
本文所用的“约”指的是一个可测值，例如量、时距等，围绕该具体值±20％或±10％、优选为±5％、更优选为±1％、更为优选的±1％的变化，该变化适用于完成所公开的方法。
范围：全文上下，本发明的多个方面可通过范围形式进行显现。应理解，范围形式的描述仅为方便和简要起见，而不应当被理解为对本发明范围不可改变的限制。因此，对范围的描述应当被认为是具体公开了所有可能的亚范围以及在此范围内个别的数值。例如，对1-6范围的描述应当被认为是具体公开了如1-3、1-4、1-5、2-4、2-6、3-6等的亚范围，以及在该范围中的个别数值，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。这无关范围的大小而均为适用。
“分离的”指的是从自然状态改变的或移出的。例如，在活的动物体内天然存在的核酸或肽不是“分离的”，但从共存材料或其天然状态中部分或完全分开的相同核酸或肽则是“分离的”。分离的核酸或蛋白可以基本纯化的形式存在，或可在非天然环境中存在，例如在宿主细胞中。
在本发明的上下文中，采用了以下常见核酸碱基的简写。“A”指的是腺嘌呤，“C”指的是胞嘧啶，“G”指的是鸟嘌呤，“T”指的是胸腺嘧啶，和“U”指的是尿嘧啶。
除非另行指出，“编码氨基酸序列的核酸”包括所有互为简并形式以及编码相同氨基酸序列的核酸序列。短语，编码蛋白或RNA的核酸序列还可含有内含子，就如同编码蛋白的某些版本核酸序列中含有一个或多个内含子一样。
“编码”指的是多核苷酸中(例如基因、cDNA或mRNA)特定核苷酸序列的固有特性，用于在生物进程中合成具有特定核苷酸序列(如rRNA、tRNA和mRNA)或特定氨基酸序列并具有获自这些序列的生物特性的其它聚合物和大分子的模板。因此，若对应于基因的mRNA转录和翻译在细胞或其它生物系统中产生了蛋白，则该基因编码蛋白。编码链(其核酸序列与mRNA序列相同，通常提供在序列表中)以及非编码链(作为基因或cDNA转录的模板)，可被称为编码该基因或cDNA的蛋白或其它产物。
如本文所用，术语“多核苷酸”被定义为核苷酸链。此外，核酸是核苷酸的聚合物。因此，本文所用的核酸以及多核苷酸可以互相替换。本领域技术人员具有常识：核酸是多核苷酸，可以水解为单体“核苷酸”。单体核苷酸可以水解为核苷。如本文所用，多核苷酸包括(但不限于)，本领域中采用任何可用方法获得的所有核酸序列，包括(不限于)：重组方法，如：通过普通克隆技术和PCR等从重组库或细胞基因组获得的核苷酸序列克隆；以及通过合成的方法。
如本文所用，术语“肽”、“多肽”和“蛋白”可互换使用，均指包含了通过肽键共价连接的氨基酸残基的化合物。蛋白或肽必须包含至少两个氨基酸，蛋白或多肽序列所包含的氨基酸最大数量没有限制。多肽(包括任何肽或蛋白)包括两个或多个通过肽键互相连接的氨基酸。如本文所用，该术语指的是短链，通常在本领域中被称为例如肽、寡肽和寡聚物；以及长链，通常在本领域中被称为蛋白，其有多种类型。“多肽”包括，例如生物活性片段、寡肽、二聚体、异二聚体、多肽的变体、经修饰的肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。所述多肽包括天然的肽、重组肽、合成肽或其组合。
“同源的”或“相同的”指的是两个多肽或两个核酸分子之间的序列相似度或序列相同性。当两个相比较的序列的同一个位置被相同的碱基或氨基酸亚单位单体占用，例如两个DNA分子各自的同一个位置被腺嘌呤所占，则所述分子在该位置为同源的或相同的。两个序列之间同源性/相同性百分比的函数是两个序列共有匹配或同源位置数除以所比较的位置数乘以100。例如，两个序列10个位置中有6个是匹配的或同源的，则两个序列为60％同源/相同。通常，该比较是在两个序列对齐后获得的最大同源性/相同性。
“载体”是一种组合物质，包含了分离的核酸且可以用于将分离的核酸递送至细胞内部。现有技术已知的大量载体包括，但不限于，线性多核苷酸、离子或两性化合物相关的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自动复制质粒或病毒。该术语还应当被理解为包含了非质粒和非病毒的化合物，其有助于将核酸转移入细胞中，例如，如多赖氨酸化合物、脂质体等等。病毒载体的例子包括但不限于，腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体等。
“表达载体”指的是包含重组多核苷酸(包含了可操作的连接于需表达的核苷酸序列的表达控制序列)的载体。表达载体包含了足够的表达用顺式作用元件；表达的其它元件可由宿主细胞或体外表达系统提供。表达载体包括所有现有技术中已知的那些，例如包含了重组多核苷酸的黏粒、质粒(如，裸露的或包含于脂质体内的)以及病毒(例如慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
如本文所用，术语“启动子”被定义为经细胞合成机制识别、或合成机制引入、多核苷酸序列特异性转录启动所必须的DNA序列。
如本文所用，术语“启动子/调节序列”指的表达与启动子/调节序列可操作相连的基因产物所需要的核酸序列。在某些情况下，该序列可以是核心启动子序列，而在另一些情况下，该序列可以包括增强子序列以及其他表达基因产物所需要的调节元件。所述启动子/调节序列可以是，例如以组织特异性方式表达基因产物的那种。
“组成型”启动子是一种可操作地连接于编码或定义基因产物的多核苷酸的核酸序列，其在大部分或所有生理情况下均能在细胞中引起基因产物的产生。
“诱导型”启动子是一种可操作地连接于编码或定义基因产物的多核苷酸的核酸序列，其基本上仅在对应于该启动子的诱导剂存在于细胞中时才能在细胞中引起基因产物的产生。
“组织特异性”启动子是一种可操作地连接于编码或由基因定义的多核苷酸的核酸序列，其基本上仅在细胞是对应于该启动子组织类型的细胞时在细胞中引起基因产物的产生。
当术语“异常”用于生物体、组织、细胞或其组分的上下文时，指的是与各特征表现“正常”(预期的)的生物体、组织、细胞或其组分在至少一个可观察或可检测的特征(例如，年龄、治疗、当日时间等)上不同的那些生物体、组织、细胞或其组分。一个细胞或组织类型正常或可预期的特征对不同细胞或组织类型而言可以是异常的。
术语“患者”、“对象”、“个体”等在本文可互换使用，指的是体外或体内接受本文所述方法的任何动物或其细胞。在某个非限制性的实施方式中，所述患者、对象或个体是人。
“疾病”是动物的一种健康状态，其中所述动物无法维持体内平衡，且如果该疾病没有改善，则所述动物的健康持续恶化。相比之下，“失调”是动物还能够维持该动物体内平衡的健康状态，但该动物的健康状体比没有失调时更为不适。如果不加以治疗，失调未必会引起动物健康状态的进一步下降。
若疾病或失调症状的严重程度、患者所经受该症状的频率、或二者有所下降，则疾病或失调是“缓解的”。若疾病或失调症状的严重程度、患者所经受该症状的频率、或二者消失，则疾病或失调是“治愈”的。
“治疗性”治疗是给予表现出病理性体征的对象的治疗方法，以便减少或消除那些体征。
如本文所述，“治疗疾病或失调”指的是降低对象所经受的至少一种疾病或失调体征或症状的频率或严重程度。在治疗的上下文中，疾病和失调可互换使用。
化合物的“有效量”是足以向施用该化合物的对象提供有益效果的化合物的量。如本文所用，短语“治疗有效量”指的是足以或有效预防或治疗(延缓或预防其发生、预防其进展、抑制、降低或逆转)疾病或失调或病情(包括缓解其症状)的量。递送载体的“有效量”是其足以有效结合或递送化合物的量。
发明详述
本发明涉及一种向对象的外周神经系统(PNS)和/或中枢神经系统(CNS)递送分子的策略。本文所公开的方法通过采用标记物(如GFP蛋白)提供显像的潜能，并由此使组织可见。或者，通过向组织递送治疗性分子，从而可以治疗PNS和/或CNS疾病或失调。
虽然本申请揭示了向PNS进行有效的递送，但据信会如先前报道的通过逆转运而出现向CNS的递送(Zheng等.(2010,Hum.Gen.Ther.21(1),87-97)。
在一实施方式中，本发明提供了向对象的外周神经系统(PNS)和/或中枢神经系统(CNS)递送分子的方法，包括通过局部或局限性注射而向所述对象施用含有所述分子的组合物。换言之，本发明涉及一种含有分子的组合物用于将所述分子向外周神经系统(PNS)和/或中枢神经系统(CNS)递送所述分子，其中，所述组合物通过局部或局限性注射施用。根据另一方面，本发明涉及分子的用途，用于制备通过局部或局限性注射向PNS和/或CNS递送分子的诊断性或治疗性组合物(药物)。
在一优选方式中，所述组合物含有有效量的所述分子。
施用的途径是将药物或其它物质摄入体内的路径。施用途径通常以施用位置的部位分类(例如，口服或静脉施用)。路径也可根据作用靶点而分类。作用可以是外用的(局部)、肠内的(全系统效果，但通过胃肠(GI)道递送)、或胃肠外的(系统性作用，但经过GI通道以外的路径递送)。
胃肠外施用的可用模式包括：
-静脉内(IV，入静脉)或动脉内(入动脉)，通常称为“系统性施用”；
-骨内输注(入骨髓)，是一种间接的静脉通路，因为骨髓直接流入静脉系统；
-肌肉内(IM)；
-进入脑实质的脑内；
-进入椎管的鞘内；
-在皮肤下的皮下(sc)。
术语“注射”(或“输注”或“输入”)包括静脉内(IV)、皮下(SC)以及肌肉内(IM)施用。注射通常通过采用注射器或导管进行。快速进行注射，开始进行的时间，IV为15-30秒，IM为10-20分钟，SC为15-30分钟。血管内注射能在很短的时间内有普遍的分布，会增加过量和/或副作用的风险。与此相反，肌肉内注射有较慢和局部的扩散，会有达不到靶组织或剂量不够的风险。
根据本发明，将含有所需分子的组合物施用于隔离的肢体从而保证局性或局部(局限性)输入或输注。换言之，本发明包括通过压力下血管内施用(例如通过静脉(经静脉的)或动脉)而向腿和/或手臂局部递送所述组合物。通常这通过采用止血带来暂时阻断血循环而使输注的产品进行局部扩散，例如，Petrov等(2011,Methods Mol Biol 709:277-86),Arruda等(2010,Blood 115(23):4678-88)和Zheng Fan等(2012,Molecular Therapy20(2),456-461)的公开。
与“经典的”系统性施用(尤其是IV)相比，当采用局限性施用时，注射物首先在注射点局部扩散，然后(撤去压力时)进入血循环。
这种体内向组织递送多核苷酸的方法主要在WO 2005/060746中公开，其教导了：
a)将含有病毒载体的溶液插入到血管(输入的或输出的)的管腔内；
b)提高组织内血管的通透性；
c)将病毒载体地送到血管外的组织。
实际上，血管通透性的增加可通过注射大容量、快速注射溶液、针对血管壁提高液体静水压(如阻断血管的流出)、提高渗透压、阻断血管的液体流动以及注射含有血管舒张剂的溶液而获得。
该施用途径，通常称为局部(局限性)注射”、“隔离肢体输注施用”或“经静脉高压肢体输注”，已经作为基因递送方法在肌肉萎缩症中成功使用(Zheng等(2012,MolecularTherapy 20(2),456-461)。
根据一个实施方式，本发明涉及含有诊断或治疗性分子的组合物用于将所述分子向对象的外周神经系统(PNS)和/或中枢神经系统(CNS)递送所述分子，其中所述组合物在血管通透性提高的条件下通过血管内路径施用，优选在加压下。
在一实施方式中，所述组合物注射在该对象的肢体上。在一实施方式中，所述对象是哺乳动物，优选为犬、非人灵长类或人。当所述对象为人时，所述肢体可以是手臂或腿。当所述对象为动物时，所述肢体可以是上肢或下肢。
根据一个实施方式，所述组合物施用于所述对象身体的下部，例如，在腹股沟或膝下。
在一实施方式中，所述组合物施用于外周静脉，优选为隐静脉，更优选为隐静脉远端。更普遍的说，所述组合物可注射于：
-通过：浅静脉(如大隐或小隐静脉)；深静脉(如股静脉、腘静脉、胫前或胫后静脉)；动脉(如股动脉、股深动脉、腘动脉、胫前或胫后动脉)向腿输注；
-通过：浅静脉(如指静脉、掌静脉、头静脉、贵要静脉、前臂正中静脉)；深静脉(如指静脉、掌静脉、桡静脉、尺静脉、肱静脉)；动脉(肱动脉、桡动脉和尺动脉及其分支)。
根据一优选实施例，所述组合物通过静脉内注射施用。根据另一实施例，所述组合物在所述对象的肢体血管中施用。
根据一实施例，所述溶液的体积有利于提高血管的通透性。所输注的所述组合物体积可以最高达肢体容量的50％，但可在肢体容量约5-20％的范围内。
犬或人的典型剂量可以在10-20ml/kg体重之间变化，特别地，该剂量被计算为15ml/kg体重。
含有感兴趣分子的所述组合物优选为生理盐水组合物，较佳地为林格氏乳酸溶液，如0.9％的生理盐水。
根据另一实施例，溶液注射的速度有利于提高血管的通透性。在一实施方式中，平均流速在50-150ml/min以内，优选在60-80ml/min以内。
在一实施例中，所施加的压力(止血带压力或最大管路压力)低于100000Pa，优选低于50000Pa。在一优选实施例中，所施加的压力约为300torr(40000Pa)。
在一实施例中，采用止血带停止所述肢体的血循环。优选地，所述止血带置于注射位点之上，例如，高于手腕或高于膝盖。
根据另一实施例，所述止血带绷紧数分钟，具体约为1-20分钟，例如约15分钟。在一优选实施例中，在施用之前和施用期间采用止血带，如在输注以前约10分钟或在输注期间约5分钟。更具体地，所施用的压力持续数分钟，具体在1-20分钟，例如约15分钟。在一优选实施例中，所述压力在施用之前和施用期间施加，例如输注之前约10分钟或在输注期间约5分钟。
根据一具体实施例，将止血带置于腹股沟水平并调整，直至超声无法测得股(动脉)搏动，从而暂时性阻断血流进入目标肢体。在收紧止血带前，在远端放置可松紧绷带，从而向近端方向给肢体排血。将载体悬浮于相当于20％后肢总容量(通过容积排水量测定)的林格氏乳酸溶液中，并通过置于爪部背面外周隐静脉远端分支内的14G导管施用。止血带共收紧15分钟(输注前10分钟，输注时5分钟)。
在本发明框架内，外周神经系统(PNS)包括位于中枢神经(CNS)外或从大脑和脊髓CNS延伸出的神经和神经元。其包括外周神经(如坐骨神经……)、神经节(如背根神经节……)和髓核中的神经元(运动神经元)。
在本发明框架内，中枢神经系统(CNS)包括髓核，尤其是运动神经元(活动神经元)。
意外地，经观察通过本发明方法递送的分子可以在单次局部注射1年后在靶组织内检测到。在一实施例中，本发明提供了一种向对象的外周神经系统(PNS)和/或中枢神经系统(CNS)递送分子的方法，其中所述分子于1天、3天、1周、2周、1个月、3个月、6个月、1年、5年或更长(时间)时可在该对象的PNS和/或CNS中检测到。然而，即便瞬时表达/检测亦可对于组织显影或对于所需对象的治疗有用。
在一具体实施例中，所述方法包括单次施用所述组合物。
本发明可采用本发明公开的方法递送任何种类或类型的分子。所述分子可以是化学分子、抗体、肽或蛋白、核酸或载体，例如病毒载体。所述分子还可以设计用于标记或显影，或可以是治疗性的分子。
在一实施例中，出于标记或诊断性目的，所述分子是采用可用的检测或显影技术(放射性、荧光、MRI……)能够使目标组织可视化的，优选为特异性或选择性可视化的分子。这类分子非限制性的例子包括：对比试剂、荧光团、荧光标记显像剂。
特别感兴趣的是治疗性分子，其能够治疗或缓解PNS和/或CNS疾病或失调。在一实施例中，所述疾病与一个或多个缺陷蛋白相关。
在本文中，所述治疗性分子可以是：
-生物功能性蛋白或其活性片段。正如本领域所理解的那样，活性片段是维持全长序列生物学功能的全长序列的一部分；
-编码所述蛋白或片段的分离的核酸序列，例如，转基因、裸露或包含在表达载体内的。较常见的，它可以是分离的核酸，其编码与本文公开的肽基本同源的肽。优选地，编码本发明肽的分离核酸的核苷酸序列是“基本相同的”，即与编码所述蛋白或片段的分离核酸的核苷酸序列约为60％相同性、更优选约为70％相同性，更优选约为80％相同性，更优选为90％相同性，进一步更优选为95％相同性，乃至更优选为99％相同性；
-可以更正天然蛋白内缺陷的分离的核酸序列，例如，诱导外显子跳跃/包含或沉默基因表达的反义RNA(siRNA、shRNA)、微小RNA(miRNA)、其它RNA和DNA片段。
在一实施例中，分离的核酸序列编码蛋白，该核酸称为转基因。在一具体实施例中，所述转基因对应于开放阅读框并可能通过表达载体由本发明方法进行递送。
在一实施例中，转基因的序列对应于该对象中存在的天然(内源性)序列。在一具体实施例中，所述内源性序列是有缺陷的，例如，表现出一个或多个突变，会导致缺乏相应的蛋白或产生部分或完全失活的蛋白，或对应于获得性功能的蛋白，尤其是在PNS和/或CNS中并与疾病相关。
更普遍地说，所感兴趣的基因可以是治疗性蛋白或上述公开蛋白的编码序列。
其它感兴趣的分子包括神经营养因子(NGF、BDNF、NT3、CNTF、GDNF、神经生长因子(neurturin)、persephin、artemin……)、营养因子(IGF1、IGF2……)、细胞凋亡或细胞死亡诱导基因(如半胱天冬氨酸酶)。
所述核酸序列可以是单链或双链DNA、RNA或cDNA。
在一实施例中，所述核酸可以以裸核酸序列施用。为了有利于细胞转导，可以将核酸序列与多种结构相连，例如，胶体分散体体系(纳米胶囊、微球……)或脂基系统(乳剂、微胶粒、脂质体……)。
在另一实施例中，所述组合物含有质粒或载体。根据一特定实施例，将分离的核酸插入到载体内。简而言之，天然或合成核酸的表达具体通过将核酸或其部分可操作地连接于启动子并将该构建物放入表达载体从而获得。所用的载体适于在真核细胞内复制，以及任选地进行整合。典型的载体含有转录或翻译终止子、起始序列以及有助于调节所需核酸序列表达的启动子。
在一实施例中，所述组合物含有表达载体，优选为病毒载体。在一实施例中，所述病毒载体选自下组：杆状病毒载体、疱疹病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、和腺相关(AAV)病毒载体，优选为腺相关病毒载体。
根据优选的实施例，所述组合物含有AAV载体作为递送感兴趣分子(诊断性或治疗性)的运载体。
在局限性施用的情况下，所注射的剂量可在1012-1015vg/kg患者体重之间变化，优选为1013-1014vg/kg，例如，2.5-5.1013vg/kg。
腺相关病毒(AAV)载体已经成为治疗多种病变的强大基因递送载体。AAV载体具有很多特征使其理想应用于基因治疗，包括无致病性、免疫原性极小且能以稳定、有效的方式转导有丝分裂后的细胞。通过选择AAV血清型、启动子以及递送方式的合适组合，可以将AAV载体内特定基因的表达特异性地靶向于一种或多种细胞内。
在一实施方式中，核酸序列包含在AAV载体中。已知有100种以上天然存在的AAV血清型。AAV衣壳中存在许多天然变体，有助于辨别并利用具有适合PNS和/或CNS具体特性的AAV。AVV病毒可采用常规分子生物技术进行工程化，从而使这些粒子的优化成为可能，将其用于细胞特异性地递送核酸序列、用于使免疫原性最小化、用于调节稳定性和粒子寿命、用于有效降解、用于向核内精准递送。
如上所述，AAV的使用是外源性DNA递送的常见方式，因为它相对无毒、提供有效的基因传递并易于为特定目的而进行优化。在从人或非人灵长类(NHP)分离的AAV血清型中，经过充分表征，人血清型2是第一种开发作为转基因载体的AAV。其它现在用的AAV血清型包括AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11和AAV12。此外，非天然的工程化变体和嵌合AAV也可以是有用的。
用于装配成载体的所需AAV片段包括帽(结构)蛋白，包括vp1、vp2、vp3和高度可变区，rep蛋白，包括rep78、rep68、rep52和rep40，以及编码这些蛋白的序列。这些片段易于在载体系统和宿主细胞中使用。
这些片段可以单独使用，与其它AAV血清型序列或片段联合使用，或与来自其它AAV或非AAV病毒序列的元件联合使用。如本文所用，人造AAV血清型包括(不限于)具有非天然存在衣壳蛋白的AAV。这样的人工衣壳可以通过合适的技术形成，其采用将所选择的AAV序列(vp1衣壳蛋白片段)与获自于所选不同的AAV血清型的异源性序列、相同AAV血清型非连续部分联合，其来源于非AAV病毒来源，或源于非病毒来源。人工AAV血清型可以是(不限于)嵌合衣壳、重组AAV衣壳或“人源化的”AAV衣壳。因此，示例AAV或人工AAV尤其包括AAV2/8(US 7,282,199)、AAV2/5(获自国立健康研究院)、AAV2/9(WO2005/033321)、AAV2/6(US 6,156,303)和AAVrh8(WO2003/042397)。在一实施例中，用于本文所述组合物和方法中的载体至少包括所选AAV血清型衣壳(如AAV8衣壳)或其片段的编码序列。在另一优选例中，有用的载体至少包括，所选AAV血清型rep蛋白(如AAV8rep蛋白)或其片段的编码序列。任选地，这些载体可含有AAV帽状结构(cap)和rep蛋白。在提供有AAV rep和帽状结构的载体中，其中AAV rep和AAV帽状结构序列可以都是同一血清型来源的，例如都是AAV8来源。或者，可采用的载体中，rep序列所来源的AAV血清型与提供帽状结构序列的不同。在一实施例中，rep和帽状结构序列可以由不同的来源所表达(例如不同的载体、或宿主细胞和载体)。在另一实施例中，这些rep序列与不同AAV血清型的帽状结构序列在同一框架下融合从而形成嵌合AAV载体，例如AAV2/8(US 7,282,199)。
在本发明中所采用的AAV载体，AAV的基因组可以是单链(ss)核酸或双链(ds)、自补型(sc)核酸。
根据优选的实施例，所感兴趣的分子是上述定义的核酸序列。
优选地，将感兴趣的核酸序列插入到AAV载体的IRT(《末端反向重复》)序列之间。
本领域所知，重组病毒颗粒可以获自：例如通过三重转染(tri-transfection)293HEK细胞、通过单纯性疱疹病毒系统和通过杆状病毒系统。载体滴度通常表达为病毒基因组/ml(vg/ml)。
在一实施例中，表达载体包括调节序列，尤其是启动子序列。这种启动子可以是天然或合成(人工)启动子，诱导型或组成型。
在一实施例中，启动子是泛素启动子或具有较低的组织特异性。作为示例，表达载体可以含有磷酸甘油酸酯激酶1(PGK)、EF1、β-肌动蛋白、CMV启动子。
在一优选实施例中，选择启动子序列从而充分支配在其控制下的核酸序列在表达水平、组织特异性方面的表达。在一实施例中，表达载体含有PNS和/或CNS特异性启动子，例如P0、NSE、SYN1、Hb9或Thy-1启动子。
其它可能的调节序列的非穷尽性列表为：
-多腺苷酸化信号，例如，感兴趣基因的聚合A、SV40或β-血红蛋白(HBB2)的聚合A，优选在感兴趣序列的3’端；
-稳定转录物的序列，例如血红蛋白内含子1(HBB2)；
-增强子序列；
-miRNA靶序列。
至今为止，已有超过40个基因与腓骨肌肉萎缩症相关，超过15个基因与影响运动神经元的疾病相关。其缺陷影响PNS和/或CNS病变的感兴趣基因有：
-腓骨肌肉萎缩症：PMP22、GJB1、MPZ、LITAF、EGR2、NEFL、GAN1、KIF1B、MFN2、TRPV4、GDAP1、DYNC1H1、RSAM1、GNB4、HSPB1、HSPB3、HSPB8、GARS、YARS、AARS、HARS、KARS、MTMR2、MTMR13、RAB7、SPTLC1、SPTLC2、DNM2、PDK3、SH3TC2、NDRG1、PRX、HK1、FGD4、FIG4、CTDP1、LMNA、MED25、PRPS1、FBLN5、INF2、BSCL2、DCTN1、SLC5A7、SETX、REEP1、IGHMPB2、ATP7A；
-运动神经元疾病：SMN1、SOD1、TARDBP、FUS、C9ORF72、SETX、VAPB.ANG、FIG 4、OPTN、VCP、alsin、spatacsin、UBQLN2、SIGMAR1、DCTN1。
作为示例，肌微管素(MTM1)基因家族包括了15个成员，2个成员(MTMR2、MTMR13)的突变与PNS疾病相关。在本文中，递送功能性(可能是天然的)蛋白或相应基因会治疗或甚至治愈这类疾病。
根据另一方面，本发明提供了一种治疗对象的外周神经系统(PNS)和/或中枢神经系统(CNS)疾病的方法，包括向所述对象通过上文所述的局部或局限性输注而施用含有治疗性分子的组合物。换言之，本发明涉及含有治疗性分子的组合物，用于治疗外周神经系统(PNS)和/或中枢神经系统(CNS)疾病，其中所述组合物通过如上定义的局部或局限性输注而施用。根据另一方面，本发明涉及分子的用途，用于制备治疗外周神经系统(PNS)和/或中枢神经系统(CNS)疾病的药物，其中所述药物通过如上定义的局部或局限性输注而施用。
在一优选实施例中，所述组合物含有治疗有效量的所述分子。
特别让人感兴趣的是外周神经病变和运动神经元疾病。包括了遗传性和获得性疾病。遗传性外周神经病变的例子有腓骨肌萎缩症(CMT)。涉及运动神经元(CNS)神经肌肉失调的例子为脊髓肌肉萎缩(SMA)以及肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)。
腓骨肌萎缩症包括：脱髓鞘型CMT(AD-CMT1和CMT4型)、轴索型CMT(AD-CMT2和AR-CMT2型)、中间型CMT(DI-CMT型)、X-相关CMT(D-CMTX和R-CMTX)、CMT“+(plus)”、dHMN(AD-HMN、R-HMN、X-HMN型)。在该名单中，A指“常染色体”，X指“X-相关”，R指“隐性”，D指“显性”。
根据本发明，所述组合物含有至少一种活性分子，可能是不同的分子。该组合物还可以含有药学上可接受的惰性载体。可设想将本领域技术人员所知的多种赋形剂、稳定剂以及其它合适的化合物用于所述组合物中。
由于本发明组合物通过局限性输注施用，因此它优选为液体形式。确定载体的浓度、所注射的量以及频率是本领域技术人员常规实践的一部分。
根据另一方面，本发明涉及一药盒，其含有上述的组合物以及任何专门用于局限性注射的任何器件，优选的是止血带体系和/或检测注射位点施用压力或注射静脉或动脉搏动的装置(如超声装置)。该药盒还可以含有注射器，例如针筒、针头和/或导管。
本发明方法的实践包括(除非另行定义)，分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，均在本领域技术人员熟知的范围内。这些技术已在文献中有详尽的解释，例如，“分子克隆：实验室手册”，第四版(Molecular Cloning:ALaboratory Manual，Sambrook，2012)；“寡核苷酸的合成”(Oligonucleotide Synthesis，Gait，1984)；“动物细胞的培养”(Culture of Animal Cells，Freshney，2010)；“酶学方法”、“实验免疫学手册”(Methods in Enzymology、Handbook of ExperimentalImmunology，Weir，1997)；“哺乳动物的转基因载体”(Gene Transfer Vectors forMammalian Cells，Miller和Calos，1987)；“精编分子生物学实验指南”(Short Protocolsin Molecular Biology，Ausubel,2002)；“聚合酶链反应：原理、应用和纠错”(PolymeraseChain Reaction:Principles,Applications and Troubleshooting，Babar,2011)、“当代免疫学指南”(Current Protocols in Immunology，Coligan,2002)。这些技术可用于产生本发明的多核苷酸和多肽，由此可用于完成和实践本发明。具体实施例中特别有用的技术将在下文的章节中进行描述。
应理解，无论本文在何处提供数值和范围，这些数值和范围包含的所有数值和范围均包含在本发明的范围中。此外，落在这些范围内的所有值，以及数值范围的上限和下限均可通过本发明预期获得。
以下实施例进一步描述了本发明的各方面。然而，它们并不是对本发明教导或公开内容的限制。
实验实施例
本发明参考以下实验实施例对细节进行进一步描述。除非另行说明，这些实施例仅用于描述目的而非限制。
如非额外描述，应当相信本领域技术人员可以采用先前的描述以及以下实施例，完成并利用本发明的组合物并实践所要求的方法。因此以下工作实施例，特别指出了本发明的优选实施方式，而并非是以任何方法对本发明公开内容进行的限制。
材料和方法：
动物
XLMTM犬如前所述(Beggs等,2010,Proc Natl Acad Sci USA 107(33):14697-702)。如文中所述，将受影响的雄性通过聚合酶链反应基因分型进行鉴定。
在犬种制备并施用rAAV8-MTM1
将含有犬肌微蛋白cDNA的重组腺相关病毒载体在杆状病毒/Sf9系统中生产，其中，所述犬肌微蛋白cDNA经肌间线蛋白启动子，rAAV2/8-p肌间线蛋白-MTM1犬(命名为rAAV8-MTM1)调节。生成两批次的杆状病毒，一批表达rep和帽状结构AAV基因，第二批则承载人肌间线蛋白启动子(pDesmin)下游犬MTM1 cDNA(XM850116,NCBI)。杆状病毒双倍感染了昆虫Sf9细胞后，产生rAAV-MTM1载体颗粒，并采用AVB亲和色谱柱(GE医疗，AVB高性能琼脂糖)将其从总细胞内纯化。如上所述，从DNase-抗性颗粒中测得vg/mL浓度。进行rAAV载体的其它常规质量控制实验，包括无菌和纯度实验(Yuasa等,2007,Gene Ther 14(17):1249-60)。
肢体局部静脉输注
在麻醉的XLMTM犬中，根据(Petrov等2011,Methods Mol Biol 709:277-86；Arruda等2010,Blood 115(23):4678-88)所述，在止血带加压(300torr)下将稀释于磷酸缓冲盐水(PBS)的载体rAAV8-MTM1(2.5x1013vg/kg)输注入隐静脉远端。简而言之，将止血带置于腹股沟水平并调整，直至超声无法测得股(动脉)搏动，从而暂时性阻断血流进入目标肢体。在收紧止血带前，在远端放置可松紧绷带，从而向近端方向给肢体排血。将载体悬浮于相当于20％后肢总容量(通过容积排水量测定)的林格氏乳酸溶液中，并通过置于爪部背面外周隐静脉远端分支内的14号导管施用。止血带共收紧15分钟(输注前10分钟，输注期间5分钟)。一侧后肢输注载体而对侧后肢不输注。
犬组织中病毒滴度的定量测定
采用7900HT热循环仪(应用生物体系-Applied Biosystem，法国)，从80ng的总DNA中通过Taqman实时PCR定量测定每双倍体基因组(dg)中载体基因组(vg)的数量。采用犬β-葡萄糖醛酸酶基因进行标准化。用于载体基因组(MTM1)扩增的引物为：
5′-ATAAGTTTTGGACATAAGTTTGC-3′(正向；SEQ ID NO:1)，
5′-CATTTGCCATACACAATCAA-3′(反向；SEQ ID NO:2)；和
5′-CGACGCTGACCGGTCTCCT-3′(探针；SEQ ID NO:3)。
用于扩增β-葡萄糖醛酸酶的引物和探针为：
5′-ACGCTGATTGCTCACACCAA-3′(forward；SEQ ID NO:4)，
5′-CCCCAGGTCTGCTTCATAGTTG-3′(reverse；SEQ ID NO:5)；和
5′-CCCGGCCCGTGACCTTTGTGA-3′(probe；SEQ ID NO:6)(应用生物体系)。
结果：
局部区域输注AAV8载体导致周围神经的转导提高
在9周龄的XLMTM犬左后肢的上部放置止血带，并在加压下经隐静脉注射rAAV8-Des-cMTM1载体(2.5x1013vg/kg)。
施用载体后一年，将犬进行安乐死，收集大量组织和器官用于载体生物扩散分析。
载体基因组拷贝定量测定显示：
-输注的后肢坐骨神经有16拷贝；
-对侧非输注后肢的坐骨神经有1.8拷贝。
更普遍的说，这些实验显示，所输注的坐骨神经是体内转导得最好的组织，其载体DNA(16vg/dg)比对侧神经(1.8vg/dg)高了约15倍。
与IV(静脉内)注射的比较
在平行实验中，对2条犬用相同量的rAAV8-Des-cMTM1载体(2.5x1013vg/kg)经隐静脉注射进行系统性施用。在坐骨神经中仅检测到1.8-5的载体拷贝。
该数据显示局部输注相比于系统性给药在向外周神经系统尤其是坐骨神经递送重组AAV载体中的优势。据此认为，CNS递送可以通过PNS经由逆向转运而发生。
本文引用的所有专利、专利申请、公开文本各自的公开内容通过引用全文纳入本文。

Claims (16)

1.一种含有诊断性或治疗性分子的组合物的用途，用于将所述的分子递送到对象的外周神经系统(PNS)和/或中枢神经系统(CNS)中，其中：
-所述组合物含有腺相关病毒(AAV)载体；
-所述组合物在血管通透性提高的情况下经血管内途径施用。
2.如权利要求1所述组合物的用途，其特征在于，所述组合物在加压下通过血管内施用。
3.如权利要求1或2所述组合物的用途，其特征在于，所述组合物通过静脉内注射施用。
4.如以上任意权利要求所述组合物的用途，其特征在于，所述组合物施用于所述对象肢体的血管。
5.如以上任意权利要求所述组合物的用途，其特征在于，所述分子选自下组：化学分子、蛋白、抗体、核酸序列。
6.如以上任意权利要求所述组合物的用途，其特征在于，所述治疗性分子用于治疗外周神经系统(PNS)和/或中枢神经系统(CNS)的疾病。
7.如权利要求6所述组合物的用途，其特征在于，所述疾病是周围神经病变或运动神经元疾病。
8.如权利要求6或7所述组合物的用途，其特征在于，所述疾病选自下组：腓骨肌萎缩(CMT)症、脊髓性肌萎缩(SMA)、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)、脱髓鞘型CMT(AD-CMT1和CMT4型)、轴索型CMT(AD-CMT2和AR-CMT2型)、中间型CMT(DI-CMT型)、X-相关CMT(D-CMTX和R-CMTX)、CMT“+”、dHMN(AD-HMN、R-HMN、X-HMN型)。
9.如以上任意权利要求所述组合物的用途，其特征在于，其中所述AAV载体含有核酸序列。
10.如权利要求9所述组合物的用途，其特征在于，所述核酸序列编码PNS和/或CNS疾病相关的治疗性蛋白或其活性片段。
11.如权利要求10所述组合物的用途，其特征在于，所述核酸序列编码选自下组的蛋白：PMP22、GJB1、MPZ、LITAF、EGR2、NEFL、GAN1、KIF1B、MFN2、TRPV4、GDAP1、DYNC1H1、RSAM1、GNB4、HSPB1、HSPB3、HSPB8、GARS、YARS、AARS、HARS、KARS、MTMR2、MTMR13、RAB7、SPTLC1、SPTLC2、DNM2、PDK3、SH3TC2、NDRG1、PRX、HK1、FGD4、FIG4、CTDP1、LMNA、MED25、PRPS1、FBLN5、INF2、BSCL2、DCTN1、SLC5A7、SETX、REEP1、IGHMPB2、ATP7A、SMN1、SOD1、TARDBP、FUS、C9ORF72、SETX、VAPB.ANG、FIG 4、OPTN、VCP、alsin、spatacsin、UBQLN2、SIGMAR1、DCTN1、肌微管素(MTM1)家族，尤其是MTM1R2和MTM1R13。
12.如以上任意权利要求所述组合物的用途，其特征在于，所述病毒载体是具有下组血清型的天然AAV载体：AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12或工程化的人造AAV血清型。
13.如权利要求12所述组合物的用途，其特征在于，所述AAV载体是AAV8载体。
14.如以上任意权利要求所述组合物的用途，其特征在于，所述对象是哺乳动物，优选为犬或人。
15.如以上任意权利要求所述组合物的用途，包括单次施用所述组合物。
16.一种药盒，含有如权利要求1-15任一所述的组合物和至少一件专门用于增加血管通透性的材料，优选为止血带体系。
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