JP2017513861A

JP2017513861A - 末梢性ニューロパチー及び運動ニューロン疾患の治療方法

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Publication number: JP2017513861A
Application number: JP2016563079A
Authority: JP
Inventors: アナ・マリア・ブジュ・ベロ; マーティン・ケー・チルダーズ
Original assignee: ジェネトン; ウェイクフォーレストユニヴァーシティヘルスサイエンシズ
Priority date: 2014-04-18
Filing date: 2015-04-20
Publication date: 2017-06-01
Also published as: CN106488984A; EP3132042A1; CN106488984B; US20170071972A1; EP2933335A1; WO2015158924A1; EP3132042B1; CA2945558A1

Abstract

末梢神経系(PNS)及び/又は中枢神経系(CNS)への分子の送達における使用のためのその分子を含む組成物であって、局部注入により投与される組成物。

Description

末梢神経系(PNS)は、中枢神経系(CNS)の外側に位置するか、脳及び脊髄からCNSの外側へ伸びる、末梢神経及びニューロン神経節を含めた神経及びニューロンからなる。

PNSは、シャルコー・マリー・トゥース病、糖尿病性、感染性、中毒性及び薬物に関連する、又は免疫に関連するニューロパチー等の、数多くの遺伝性又は後天性の神経障害に関与する。

これらの疾患に対する有効な臨床介入は非常に限定されている。遺伝子治療は、PNS疾患に対する新規の治療戦略の代表例である。しかし、遺伝性及び後天性の末梢性ニューロパチーの遺伝子治療には、PNSへの効率的な遺伝子導入が依然として不可欠である。

アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターにより、後根神経節(DRG)ニューロンが効率的に形質導入されうることが報告されている。しかし、DRGにAAVを送達するには精密な微小神経外科的手法が必要である(Glatzelら、2000、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97、442〜447頁)。

Foustら(2008、Hum. Gen. Ther. 19、61〜70頁)は、AAVセロタイプ8ベクターが新生仔マウスの全身に送達されると、DRGへの形質導入を示すことには、後角及び後柱の神経線維がAAVにより形質導入されうることを報告した。しかし、全身経路は特異的でなく、多量の治療遺伝子が必要となる。

Zhengら(2010、Hum. Gen. Ther. 21(1)、87〜97頁)は、新生仔マウスにおいては腹腔内注射による、成体マウスにおいては後肢の前脛骨筋及び腓腹筋への筋肉内注射によるPNSへの形質導入における、AAV8の能力を報告した。両方の場合で、脊髄、DRGニューロン及び末梢神経の白質において、効率的かつ長期的な遺伝子導入が見られた。これらの結果は、血液脳関門の通過ではなく、筋肉から脊髄へのAAVベクターの逆行性輸送機構を支持するものである。しかし、筋肉内送達には、多数の注射部位が必要となり、これには効率の低下が伴う。

Homsら(2011、Gene Therapy 18、622〜630頁)は、坐骨神経へ注射した後の、異なるAAV偽型のトロピズム及び形質導入効率について報告した。AAV8によりシュワン細胞への特異的な形質導入が可能となることが観察され、これは末梢神経再生のための遺伝子治療戦略を提供するものである。しかし、神経における局所投与は、特に安全上の理由で、臨床レベルでは適用できない。

Bevanら(2011、Mol. Therapy 19(11)、1971〜80頁)は、静脈内注射により、あらゆる年齢のマカクにおいて、CNS及び末梢組織へAAV9ベクターが効率的に送達されることを報告している。これは、脊髄性筋萎縮症(SMA)等の小児障害に対する有望な治療的解決策を提供する。末梢器官への毒性を低下させるため、血管内注射中、肝臓に流入する血流の遮断が試みられた。更に、CSF(脳脊髄液)注射は運動ニューロンを標的とし、CSFへの遺伝子発現を制限することが示された。

Weismannら(2013、Mol. Therapy 21、S147〜148頁)は、GM1 (ガングリオシドーシス)マウスモデルにおいてAAV9-βgalを静脈内投与(IV注入)すると、CNSで酵素が発現し、性別による違いはあるものの、疾患の発症が遅れることを報告している。

WO 2010/129021は、神経変性障害、例えばSMA又はALS(筋萎縮性側索硬化症)を治療するための、自己相補的な(sc)AAVベクターの使用に関する。実施例では、脳室内及び脊髄注射を例示している。

Wangら(2014、Human Mol. Genetics 23(3)、668〜81頁)は、AAV(AAVrh10)の髄腔内注射による、ALSの効率的なRNAi治療について報告している。

Dehayら(2012、Scientific Reports 2)は、GFPにより観察したところ、全身性(IV)scAAV9が、新生仔アカゲザルにおける脳への形質導入を媒介することを報告している。Grayら(2011、Molecular Therapy 19(6)、1058〜1069頁)は、成体のマウス及びヒト以外の霊長類におけるニューロン及びグリアへの血管内AAV9(ss及びsc)送達を比較している。WO 2009/043936では、末梢(例えばIV又はIM)投与による運動ニューロン、グリア細胞又は脊髄への遺伝子送達に、二本鎖の自己相補的なAAVベクターを使用することについて開示している。

更に、最近のレビュー(Bourdenxら、2014、Front Mol Neurosci. 7:50頁;Murlidharanら、2014、Front Mol Neurosci. 7:76頁; Kardaら、2014、Front Mol Neurosci. 7:89頁)では、アデノ随伴ウイルスを使用する、中枢神経系(CNS)への遺伝子送達のためのこれら全ての選択肢を列挙している。全身送達、特にIV注射は、侵襲性の脳外科手術を回避するものであるため有望であると思われる。しかし、導入遺伝子発現の制御、細胞特異性及びベクターの最適化に関して、努力が今なお必要とされている。

WO 2010/129021 WO 2009/043936 WO 2005/060746 US 7,282,199 WO2005/033321 US 6,156,303 WO2003/042397 US 7,282,199

Glatzelら、2000、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97、442〜447頁 Foustら(2008、Hum. Gen. Ther. 19、61〜70頁) Zhengら(2010、Hum. Gen. Ther. 21(1)、87〜97頁) Homsら(2011、Gene Therapy 18、622〜630頁) Bevanら(2011、Mol. Therapy 19(11)、1971〜80頁) Weismannら(2013、Mol. Therapy 21、S147〜148頁) Wangら(2014、Human Mol. Genetics 23(3)、668〜81頁) Dehayら(2012、Scientific Reports 2) Grayら(2011、Molecular Therapy 19(6)、1058〜1069頁) Bourdenxら、2014、Front Mol Neurosci. 7:50頁 Murlidharanら、2014、Front Mol Neurosci. 7:76頁 Kardaら、2014、Front Mol Neurosci. 7:89頁 Petrovら(2011、Methods Mol Biol 709:277〜86頁) Arrudaら(2010、Blood 115(23):4678〜88頁) Zheng Fanら(2012、Molecular Therapy 20(2)、456〜461頁) 「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」第4版(Sambrook、2012) 「Oligonucleotide Synthesis」(Gait、1984) 「Culture of Animal Cells」(Freshney、2010) 「Methods in Enzymology」(Weir、1997) 「Handbook of Experimental Immunology」(Weir、1997) 「Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells」(Miller and Calos、1987) 「Short Protocols in Molecular Biology」(Ausubel、2002) 「Polymerase Chain Reaction: Principles, Applications and Troubleshooting」(Babar、2011) 「Current Protocols in Immunology」(Coligan、2002) Beggsら、2010、Proc Natl Acad Sci USA 107(33):14697〜702頁 Yuasaら、2007、Gene Ther 14(17):1249〜60頁

したがって、PNS及び/又はCNSへの、有効、簡便かつ侵襲性が最小限である送達方法が当技術分野で必要とされている。本発明は、この満たされていない必要性を満足するものである。

本発明は、イヌの伏在静脈にAAV8ベクターを局部領域的に注入した1年後、注入された坐骨神経において多量の前記ベクターが検出されたという観察に基づいている。

思いがけなく、PNS又はCNS障害のためではなく筋肉への送達のみ想定されていたこの投与経路が、PNS及び/又はCNSへの送達に非常に効率的であることが示された。

定義
冠詞「a」及び「an」は、本明細書では1つ又は1つ超(すなわち少なくとも1つ)の、冠詞の文法上の対象物を指すために使用される。例として「an element」は、1つのエレメント又は1つ超のエレメントを意味する。

「約」は、本明細書では、量、時間的な期間等の測定可能な値に言及する際、特定の値から±20%又は±10%、より好ましくは±5%、更により好ましくは±1%、なおより好ましくは±0.1%の変動を、このような変動が、開示される方法を行うのに適切であるように包含することを意味する。

範囲:本開示を通して、本発明の各種態様は範囲形式で提示されうる。範囲形式で記載されることは、単に利便性及び簡潔さのためのものと理解されるべきであり、本発明の範囲を不変に限定するものとして解釈されるべきではない。したがって、範囲の記載は、その範囲内の各数値だけでなく、可能性のある全ての部分範囲を具体的に開示すると考えられるべきである。例えば、1〜6等の範囲についての記載は、その範囲内の各数字、例えば、1、2、2.7、3、4、5、5.3及び6等だけでなく、1〜3、1〜4、1〜5、2〜4、2〜6、3〜6等の部分範囲を具体的に開示すると考えられるべきである。これは、範囲の幅に関わらず適用される。

「単離された」は、天然の状態から変質されたか取り出されたことを意味する。例えば、生きている動物において天然に存在する核酸又はペプチドは「単離された」ものではないが、その天然の状態において、共存する物質から部分的に又は完全に分離された同じ核酸又はペプチドは「単離された」ものである。単離された核酸又はタンパク質は、実質的に精製された形態で存在するか、又は天然でない環境、例えば宿主細胞等において存在していてよい。

本発明の文脈において、一般的に存在する核酸塩基についての以下の略号が使用される。「A」はアデノシンを指し、「C」はシトシンを指し、「G」はグアノシンを指し、「T」はチミジンを指し、「U」はウリジンを指す。

別に指定されない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いに縮重型であり、同じアミノ酸配列をコードする全てのヌクレオチド配列を含む。タンパク質又はRNAをコードするヌクレオチド配列という語は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列がイントロンをいくつかの型で含みうる範囲で、イントロンを含むこともできる。

「コードすること」は、ヌクレオチド(すなわち、rRNA、tRNA及びmRNA)の定義された配列又はアミノ酸の定義された配列のいずれかを有する、生物学的プロセスにおけるその他のポリマー及び高分子の合成用鋳型として機能する、遺伝子、cDNA又はmRNA等のポリヌクレオチドにおける、特定のヌクレオチド配列の固有の特性、及びそこから生じる生物学的特性を指す。したがって、その遺伝子に対応するmRNAの転写及び翻訳により、細胞内又はその他の生物系においてタンパク質が産生される場合、遺伝子はタンパク質をコードしている。mRNA配列と同一であり、配列表で通常示されるヌクレオチド配列であるコード鎖、及び遺伝子又はcDNAの転写の鋳型として使用される非コード鎖の両方を、タンパク質、又はその遺伝子若しくはcDNAのその他の産物をコードすると称することができる。

本明細書では、「ポリヌクレオチド」という語は、ヌクレオチドの鎖と定義される。更に、核酸はヌクレオチドのポリマーである。したがって、核酸及びポリヌクレオチドは、本明細書では互換可能である。核酸がポリヌクレオチドであり、モノマーの「ヌクレオチド」に加水分解されうるという一般的な知識を当業者は有する。モノマーのヌクレオチドはヌクレオシドに加水分解されうる。本明細書では、ポリヌクレオチドは、これに限定されないが、組換え手段、すなわち、通常のクローニング技術及びPCR等を使用する、組換えライブラリー又は細胞ゲノム由来の核酸配列のクローニングを含む、当技術分野で利用可能な任意の手段、及び合成手段により得られる全ての核酸配列を含むが、これに限定されない。

本明細書では、「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」という語は、互換可能に使用され、ペプチド結合により共有結合したアミノ酸残基から構成される化合物を指す。タンパク質又はペプチドは、少なくとも2つのアミノ酸を含んでいなければならず、タンパク質又はペプチドの配列を構成しうるアミノ酸の最大数に制限は設けない。ポリペプチドは、ペプチド結合により互いに結合した2つ以上のアミノ酸を含む、任意のペプチド又はタンパク質を含む。本明細書では、この語は、当技術分野で例えばペプチド、オリゴペプチド及びオリゴマーとも一般的に称される短鎖、並びに多くの種類が存在する、当技術分野でタンパク質と一般的に称される長鎖の両方を指す。「ポリペプチド」は、例えば、生物的に活性断片、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモダイマー、ヘテロダイマー、ポリペプチドの変異体、改変ポリペプチド、誘導体、アナログ、融合タンパク質等を含む。ポリペプチドは、天然ペプチド、組換えペプチド、合成ペプチド又はそれらの組み合わせを含む。

「相同な」又は「同一の」は、2つのポリペプチド間又は2つの核酸分子間の配列が類似であること又は配列が同一であることを指す。比較される2つの配列の両方における位置が同じ塩基又はアミノ酸モノマーサブユニットで占められる場合、例えば、2つのDNA分子それぞれにおける位置がアデニンで占められる場合、それらの分子はその位置において相同又は同一である。2つの配列間の相同性/同一性パーセントは、比較される位置の数で割って100をかけた、2つの配列が共有する、一致している又は相同な位置の数の関数である。例えば、2つの配列における位置10個のうち6個が一致している又は相同である場合、2つの配列は60%相同/同一である。一般的に、比較は、相同性/同一性が最大になるように2つの配列が整列している場合に行われる。

「ベクター」は、単離された核酸を含み、単離された核酸を細胞内部に送達するために使用可能な物質の組成物である。直鎖状ポリヌクレオチド、イオン性又は両親媒性化合物を伴うポリヌクレオチド、プラスミド及びウイルスを含むがこれに限定されない、数多くのベクターが当技術分野で知られている。したがって、「ベクター」という語には、自己複製プラスミド又はウイルスが含まれる。この語には、細胞への核酸の移行を促進する非プラスミド性及び非ウイルス性化合物、例えばポリリジン化合物、リポソーム等も含まれると解釈されるべきである。ウイルスベクターの例には、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター等が含まれるがこれに限定されない。

「発現ベクター」は、発現されるべきヌクレオチド配列に作動可能に連結させた発現制御配列を含む、組換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは、発現させるのに十分なシスエレメントを含み、発現のためのその他のエレメントは、宿主細胞によって又はインビトロ発現系において供給されうる。発現ベクターには、組換えポリヌクレオチドを組み込む、コスミド、プラスミド(例えば裸の又はリポソーム中に含まれる)及びウイルス(例えばレンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス)等、当技術分野で既知の全ての発現ベクターが含まれる。

「プロモーター」という語は、本明細書では、細胞の合成機構により認識されるか合成機構に導入される、ポリヌクレオチド配列の特定の転写を開始させるのに必要なDNA配列として定義される。

本明細書では、「プロモーター/制御配列」という語は、プロモーター/制御配列に作動可能に連結させた、遺伝子産物の発現に必要な核酸配列を意味する。ある例では、この配列はコアプロモーター配列であってよく、その他の例では、この配列は、エンハンサー配列及び遺伝子産物の発現に必要なその他の調節エレメントも含んでいてよい。プロモーター/制御配列は、例えば、組織特異的に遺伝子産物を発現する配列であってよい。

「構成的」プロモーターは、遺伝子産物をコードする又は特定するポリヌクレオチドと作動可能に連結させると、細胞の大部分又は全ての生理的条件下で、細胞内で遺伝子産物の産生を引き起こすヌクレオチド配列である。

「誘導性」プロモーターは、遺伝子産物をコードする又は特定するポリヌクレオチドと作動可能に連結させると、実質的に、そのプロモーターに対応する誘導因子が細胞内に存在する場合にのみ、細胞内で遺伝子産物の産生を引き起こすヌクレオチド配列である。

「組織特異的」プロモーターは、遺伝子によりコードされる又は特定されるポリヌクレオチドと作動可能に連結させると、実質的に、細胞がそのプロモーターに対応する組織の種類の細胞である場合にのみ、細胞内で遺伝子産物の産生を引き起こすヌクレオチド配列である。

「異常な」という語は、生物体、組織、細胞又はそれらの成分についての文脈で使用される場合、少なくとも1つの観察可能な又は検出可能な特性(例えば、年齢、治療、時間帯等)が、「正常な」(予期される)各特性を示す生物体、組織、細胞又はそれらの成分とは異なる、生物体、組織、細胞又はそれらの成分を指す。ある細胞又は組織の種類においては正常な又は予期される特性が、異なる細胞又は組織の種類においては異常である場合がある。

「患者」、「対象」、「個体」等の語は、本明細書で互換可能に使用され、インビトロであれインサイチューであれ、本明細書に記載される方法に適した任意の動物又はその細胞を指す。特定の非限定的な実施形態において、患者、対象又は個体はヒトである。

「疾患」は、動物が恒常性を維持できず、疾患が改善されない場合には動物の健康が悪化し続ける、動物の健康状態である。対照的に、動物における「障害」は、動物が恒常性を維持できるが、動物の健康状態が障害の非存在下よりも好ましくない健康状態である。治療されないままでも、障害は必ずしも動物の健康状態を更に低下させるとは限らない。

疾患若しくは障害の症状の重症度、このような症状を患者が経験する頻度、又は両方が減少した場合、疾患又は障害が「緩和された」となる。疾患若しくは障害の症状の重症度、このような症状を患者が経験する頻度、又は両方が解消された場合、疾患又は障害が「治癒された」となる。

「治療用」治療剤は、病理学的兆候を示す対象に、それらの兆候を弱める又は解消するため投与される治療剤である。

本明細書では、「疾患又は障害を治療すること」は、対象が経験する疾患又は障害の少なくとも1つの兆候又は症状の頻度又は重症度を減少させることを意味する。疾患及び障害は、本明細書では、治療についての文脈において互換可能に使用される。

化合物の「有効量」は、化合物が投与される対象に対し有益な効果をもたらすのに十分な化合物の量である。「治療上有効な量」という語は、本明細書では、疾患又は障害又は状態を、それらの症状を緩和することも含めて、防止する又は治療する(発症を遅らせる又は防止する、進行を防止する、阻害する、低下させる又は反転させる)のに十分な又は有効な量を指す。送達媒体の「有効量」は、化合物を有効に結合する又は送達するのに十分な量である。

詳細
本発明は、対象の末梢神経系(PNS)及び/又は中枢神経系(CNS)に分子を送達する戦略に関する。例えばGFPタンパク質等のマーカーを使用することで、本明細書で開示される方法により、組織を画像化し、それにより組織を可視化する可能性がもたらされる。或いは、組織へ治療分子を送達することで、PNS及び/又はCNSの疾患又は障害を治療することができる。

PNSへの効率的な送達については本出願で示すが、CNSへの送達は、以前に報告されたように、逆行性輸送を介して行われると考えられる(Zhengら(2010、Hum. Gen. Ther. 21(1)、87〜97頁))。

一実施形態において、本発明は、対象の末梢神経系(PNS)及び/又は中枢神経系(CNS)へ分子を送達する方法であって、局部又は局部領域的注入により、前記分子を含む組成物を前記対象へ投与する工程を含む、方法を提供する。言い換えれば、本発明は、末梢神経系(PNS)及び/又は中枢神経系(CNS)への分子の送達に使用するための、前記分子を含む組成物であって、局部又は局部領域的注入により投与される組成物に関する。別の態様によれば、本発明は、局部又は局部領域的注入によりPNS及び/又はCNSへ分子を送達するための診断又は治療組成物(医薬)を調製するための、前記分子の使用に関する。

好ましい実施形態において、組成物は有効量の分子を含む。

投与経路は、薬物又はその他の物質が体内に取り入れられる経路である。投与経路は一般的に、物質が施用される部位により分類される(例えば経口又は静脈内投与)。経路は、作用標的がどこであるかに基づいても分類されうる。作用は局所的(局所的)、腸内(全身作用性だが、胃腸(GI)管を介して送達される)又は非経口的(全身作用性だがGI管以外の経路により送達される)であってよい。

利用可能な非経口投与様式には、
- 一般的に「全身投与」と呼ばれる、静脈内(IV、静脈への)又は動脈内(動脈への)、
- 骨髄が静脈系へ直接流出するため間接的静脈アクセスとなる、骨内注入(骨髄への)、
- 筋肉内(IM)、
- 脳実質への脳内、
- 脊柱管への髄腔内、
- 皮膚の下への皮下(sc)
が含まれる。

「注射」(又は「灌流」又は「注入」)という語は、静脈内(IV)、皮下(SC)及び筋肉内(IM)投与を包含する。注射は通常、シリンジ又はカテーテルを使用して行われる。注射は急速に作用し、IVでは15〜30秒、IMでは10〜20分、SCでは15〜30分で作用開始する。血管内注射は、ごく短時間で広範に分布させることができるが、過剰投与及び/又は副作用のリスクが増加する。反対に、筋肉内注射は、ゆっくりと局所的に拡散させることができるが、標的組織に到達しないリスク又は非効率的な用量を伴う。

本発明によれば、確実に局所又は局部(局部領域的)注入又は灌流するため、望ましい分子を含む組成物が四肢の一つのみに投与される。言い換えれば、本発明は、加圧下で行われる、血管内投与による、すなわち静脈(経静脈的)又は動脈を介した、脚及び/又は腕における組成物の局部送達を含む。これは通常、例えばPetrovら(2011、Methods Mol Biol 709:277〜86頁)、Arrudaら(2010、Blood 115(23):4678〜88頁)及びZheng Fanら(2012、Molecular Therapy 20(2)、456〜461頁)で開示されるように、注入された産物を局所的に拡散させつつ血液循環を一時的に停止させるため、止血帯を使用することで実現される。

「伝統的な」全身投与(特にIV)と比較して、このような局部領域的投与を使用すると、注射された産物はまず注射部位で局所的に拡散し、次いで(圧力が解放されると)血液循環に入る。

組織へポリヌクレオチドを送達するための、このようなインビボでの方法は、
a)(輸入又は輸出)血管の管腔内に、溶液中のウイルスベクターを挿入する工程、
b)組織内の血管の透過性を増大させる工程、
c)血管の外側の組織へウイルスベクターを送達する工程
について教示するWO 2005/060746で一般的に開示されている。

実際は、血管の透過性の増大は、大量に注射すること、急速に溶液を注射すること、血管壁に対する静水圧を増大させること(例えば血管からの流出を妨害すること)、浸透圧を増大させること、血管を通る液体の流れを遮断すること、及び血管拡張剤を含む溶液を注射することにより実現可能である。

この投与経路は通常、「局部(局部領域的)注入」、「独立した四肢への灌流による投与」又は「高圧経静脈四肢灌流(high-pressure transvenous limb perfusion)」と呼ばれ、筋ジストロフィーにおける遺伝子送達方法としてうまく使用されている(Zhengら(2012、Molecular Therapy 20(2)、456〜461頁)。

一実施形態によれば、本発明は、対象の末梢神経系(PNS)及び/又は中枢神経系(CNS)への診断又は治療分子の送達における使用のための前記分子を含む組成物であって、血管透過性を増大させる条件下で、有利には加圧下で血管内経路により投与される組成物に関する。

一実施形態において、組成物は対象の四肢に注射される。一実施形態において、対象は哺乳類、好ましくはイヌ、ヒト以外の霊長類又はヒトである。対象がヒトである場合、四肢は腕又は脚でありうる。対象が動物である場合、四肢は上肢又は下肢でありうる。

一実施形態によれば、組成物は対象の下半身、例えば鼠径部又は膝下に投与される。

一実施形態において、組成物は、末梢静脈、有利には伏在静脈、より有利には遠位伏在静脈に投与される。より一般的には、組成物は、
- 脚:表在静脈(すなわち大伏在及び小伏在);深部静脈(すなわち大腿、腋窩、前脛骨静脈又は後脛骨静脈);動脈(すなわち大腿、深部大腿、腋窩、前脛骨動脈又は後脛骨動脈)経由、
- 腕:表在静脈(すなわち指、中手、橈側皮、尺側皮、前腕正中皮静脈);深部静脈(すなわち指、中手、橈骨、尺骨、上腕静脈);動脈(上腕、橈骨及び尺骨動脈及び分枝)経由
で注射可能である。

好ましい実施形態によれば、組成物は静脈内注射により投与される。別の実施形態によれば、組成物は対象の四肢の血管に投与される。

一実施形態によれば、溶液の体積は血管の透過性増大に有利である。注入されるべき組成物の体積は、四肢の体積の最大50%としてよいが、四肢の体積の約5〜20%の間で変化する範囲内であってよい。

イヌ又はヒトにおける典型的な用量は、体重1kgあたり10〜20mlの間で変化してよく、用量は典型的には体重1kgあたり15mlとなるように算出される。

目的の分子を含む組成物は、好ましくは生理食塩水組成物、有利には乳酸リンゲル溶液、例えば0.9%生理食塩水である。

別の実施形態によれば、溶液の注射速度は血管の透過性の増大に有利である。一実施形態において、平均流速は50〜150ml/分の間、有利には60〜80ml/分の間に含まれる。

一実施形態において、加えられるべき圧力(止血帯圧力又は最大流路圧力)は100 000Pa未満、有利には50 000Pa未満である。好ましい実施形態において、加えられる圧力は約300torr(40 000Pa)である。

一実施形態において、四肢の血液循環は止血帯を使用して止められる。有利には、止血帯は注射部位より上部、例えば肘より上部又は膝より上部に配置される。

別の実施形態によれば、止血帯は数分間、典型的には約1〜20分の間、例えば約15分間締められる。好ましい実施形態において、止血帯は投与前及び投与中、例えば注入前約10分間及び注入中約5分間装着される。より一般的には、圧力は数分間、典型的には約1〜20分の間、例えば約15分間加えられる。好ましい実施形態において、圧力は投与前及び投与中、例えば注入前約10分間及び注入中約5分間加えられる。

特定の実施形態によれば、止血帯は、鼠径部のレベルに配置され、超音波によって大腿脈拍がもう検出されなくなるまで、標的の四肢への血液流入を一時的に遮断するように調節される。四肢の血液を排除するように遠位から近位方向に伸張性のラップをきつく装着した後に、止血帯を締める。ベクターは、後肢の総体積(水体積置換により決定)の20%の乳酸リンゲル溶液中に懸濁され、足の背側の末梢伏在静脈の遠位分枝中に配置された14ゲージのカテーテルを介して投与される。止血帯は、合計15分間(注入前10分間及び注入中5分間)締められる。

本発明の範囲において、末梢神経系(PNS)は、中枢神経系(CNS)の外側に位置するか、脳及び脊髄からCNSの外側へ伸びる、神経及びニューロンを含む。末梢神経系は、末梢神経(すなわち坐骨神経等)、ニューロン神経節(すなわち後根神経節等)及び脊髄のニューロン(運動ニューロン)を含む。

本発明の範囲において、中枢神経系(CNS)は、脊髄、特に運動ニューロン(すなわち運動ニューロン)を含む。

思いがけなく、本発明の方法により送達された分子が、1回の局部領域的注入の1年後に標的組織で検出されうることが観察された。一実施形態において、本発明は、対象の末梢神経系(PNS)及び/又は中枢神経系(CNS)に分子を送達する方法であって、分子が、1日間、3日間、1週間、2週間、1ヶ月間、3ヶ月間、6ヶ月間、1年間、5年間又はそれ超の間、対象のPNS及び/又はCNSで検出される、方法を提供する。しかし、一時的な発現/検出であっても、組織の画像化、又はそれを必要とする対象の治療に有用でありうる。

特定の実施形態において、本方法は組成物を1回投与することを含む。

本発明は、本明細書で開示される方法を使用して、任意の種類又はクラスの分子の送達を図る。分子は化学分子、抗体、ペプチド又はタンパク質、核酸又はベクター、例えばウイルスベクター等であってよい。分子は標識及び画像化のために設計されたものであってもよく、治療分子であってもよい。

一実施形態において、標識又は診断のため、分子は、利用可能な検出及び画像化技術(放射能、蛍光、MRI等)を使用して、可視化、有利には標的組織の特異的かつ選択的可視化を可能にする任意の分子である。このような分子の非限定的な例には、造影剤、フルオロフォア又は蛍光標識画像化剤が含まれる。

特に興味深いのは、PNS及び/又はCNSの疾患又は障害を治癒又は緩和することができる治療分子である。一実施形態において、前記疾患は1つ又は複数の不完全なタンパク質と関係している。

この文脈において、治療分子は以下であってよい:
- 生物的機能性タンパク質又はその活性断片。当技術分野で理解されるように、活性断片は、全長配列の生物的機能を維持している、全長配列の部分又は複数の部分である、
- 前記タンパク質又は断片をコードする単離された核酸配列、すなわちヌードの又は発現ベクターに含有される導入遺伝子。より一般的には、これは本明細書で開示されるペプチドに対し実質的な相同性を有するペプチドをコードする単離された核酸であってよい。好ましくは、本発明のペプチドをコードする単離された核酸のヌクレオチド配列は、前記タンパク質又は断片をコードする単離された核酸のヌクレオチド配列に対し「実質的に同一である」、つまり、約60%同一であり、より好ましくは約70%同一であり、更により好ましくは約80%同一であり、より好ましくは約90%同一であり、更により好ましくは約95%同一であり、更により好ましくは約99%同一である、
- 天然のタンパク質における不完全性を修正することができる単離された核酸配列、例えばエキソンのスキッピング/インクルージョンを誘導するか、遺伝子発現をサイレンシングするアンチセンスRNA(siRNA、shRNA)、マイクロRNA(miRNA)、その他のRNA及びDNA断片。

一実施形態において、核酸が導入遺伝子と称される場合、単離された核酸配列はタンパク質をコードしている。特定の実施形態において、前記導入遺伝子はオープンリーディングフレームに相当し、本発明の方法により、場合によって発現ベクターを介して送達される。

一実施形態において、導入遺伝子の配列は、対象において存在する天然の(内因性)配列に対応する。特定の実施形態において、内因性配列は不完全である、すなわち、特にPNS及び/又はCNSにおいて、対応するタンパク質の欠如若しくは部分的に若しくは完全に不活性なタンパク質の産生、又は対応するタンパク質の機能獲得をもたらす、1つ又は複数の突然変異を示し、疾患と関係する。

より一般的には、目的の分子は治療タンパク質又は上記で開示される前記タンパク質をコードする配列であってよい。

その他の目的の分子には、神経栄養因子(NGF、BDNF、NT3、CNTF、GDNF、ニュールツリン、パーセフィン、アルテミン等)、栄養因子(IGF1、IGF2等)、アポトーシス又は細胞死誘導遺伝子(例えばカスパーゼ)が含まれる。

核酸配列は、一本鎖又は二本鎖DNA、RNA又はcDNAであってよい。

一実施形態において、核酸は裸の核酸配列として投与される。細胞形質導入を促進するために、核酸配列は、例えば、コロイド分散体系(ナノカプセル、ミクロスフェア等)又は脂質ベース系(エマルジョン、ミセル、リポソーム等)等の各種構造体を伴っていてもよい。

別の実施形態において、組成物はプラスミド又はベクターを含む。特定の実施形態によれば、単離された核酸がベクターに挿入される。簡潔にまとめると、天然又は合成の核酸の発現が、典型的には核酸又はその部分をプロモーターに作動可能に連結させ、構築物を発現ベクターに組み込むことにより実現される。使用されるべきベクターは、複製及び場合によっては真核細胞における組み込みに適している。典型的なベクターは、望ましい核酸配列の発現調節に有用な、転写及び翻訳ターミネーター、開始配列及びプロモーターを含む。

一実施形態において、組成物は発現ベクター、有利にはウイルスベクターを含む。一実施形態において、ウイルスベクターは、バキュロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター及びアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターからなる群、有利にはAAVベクターから選択される。

好ましい実施形態によれば、組成物は、目的の分子(診断又は治療)の送達媒体としてAAVベクターを含む。

局部領域的投与についての文脈において、注射される用量は、患者の体1kgあたり10¹²〜10¹⁵vgの間、好ましくは1kgあたり10¹³〜10¹⁴vgの間で変化してよく、例えば1kgあたり2.5又は5.10¹³vgである。

アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターは、各種障害の治療のための強力な遺伝子送達手段となっている。AAVベクターは、病原性がないこと、免疫原性が最小限であること、及び安定かつ効率的に分裂終了細胞に形質導入を行う能力を含めた、AAVベクターを遺伝子治療に理想的に適合させる複数の特性を有する。AAVベクター中に含まれる特定の遺伝子の発現は、AAVセロタイプ、プロモーター及び送達方法の適切な組み合わせを選択することで、1つ又は複数の種類の細胞を特異的に標的とすることができる。

一実施形態において、核酸配列はAAVベクター中に含まれる。100を超える、天然に存在するAAVのセロタイプが知られている。AAVカプシドには多くの天然の変異体が存在するため、PNS及び/又はCNSに特に適した特性を有するAAVを特定及び使用することが可能である。AAVウイルスは、従来の分子生物学的技術を使用して操作することができ、それにより、核酸配列を細胞特異的に送達し、免疫原性を最小にし、安定性及び粒子の寿命を調節し、効率的に分解させ、核へ正確に送達されるように、これらの粒子を最適化することが可能となる。

上記の通り、AAVの使用は、比較的毒性がなく、効率的な遺伝子導入をもたらし、特定の目的に容易に最適化することができるため、DNAの外因性送達における一般的な様式である。ヒト又はヒト以外の霊長類(NHP)から単離された、十分に特徴が分かっているAAVのセロタイプのうち、ヒトセロタイプ2は遺伝子導入ベクターとして開発された最初のAAVである。現在使用されているその他のAAVセロタイプには、AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11及びAAV12が含まれる。更に、非天然の操作された変異体及びキメラAAVも有用でありうる。

ベクターを組み立てるうえでの望ましいAAV断片は、vp1、vp2、vp3及び超可変領域を含むcapタンパク質、rep78、rep68、rep52及びrep40を含むrepタンパク質、並びにこれらのタンパク質をコードする配列を含む。これらの断片は、様々なベクター系及び宿主細胞において容易に利用可能である。

このような断片は、単独で、その他のAAVセロタイプ配列若しくは断片と組み合わせて、又はその他のAAV若しくは非AAVウイルス配列由来のエレメントと組み合わせて使用可能である。本明細書では、人工のAAVセロタイプには、これに限定されないが、天然に存在しないカプシドタンパク質を有するAAVが含まれる。このような人工のカプシドは、選択された異なるAAVセロタイプ、同じAAVセロタイプの隣接していない諸部分、非AAVウイルス起源又は非ウイルス起源より得られる異種配列と組み合わせた、選択されたAAV配列(例えば、vp1カプシドタンパク質の断片)を使用して、任意の適切な技術により作製することができる。人工のAAVセロタイプは、これに限定されないが、キメラAAVカプシド、組換えAAVカプシド又は「ヒト化」AAVカプシドであってよい。したがって、例示的なAAV又は人工のAAVには、AAV2/8(US 7,282,199)、AAV2/5(アメリカ国立衛生研究所より入手可能)、AAV2/9(WO2005/033321)、AAV2/6(US 6,156,303)及びAAVrh8(WO2003/042397)等が含まれる。一実施形態において、本明細書で記載される組成物及び方法において有用なベクターは、選択されたAAVセロタイプのカプシド、例えばAAV8カプシド、又はその断片をコードする配列を最小限含む。別の実施形態において、有用なベクターは、選択されたAAVセロタイプのrepタンパク質、例えばAAV8repタンパク質、又はその断片をコードする配列を最小限含む。場合によって、このようなベクターはAAVのcap及びrepタンパク質の両方を含みうる。AAVのrep及びcap両方をもたらすベクターにおいて、AAVのrep及びAAVのcap配列は、両方が1つのセロタイプ起源、例えば全てAAV8起源であってよい。或いは、rep配列が、cap配列をもたらすものとは異なるAAVセロタイプ由来であるベクターも使用可能である。一実施形態において、rep及びcap配列は別々の起源(例えば、別々のベクター、又は宿主細胞及びベクター)より発現される。別の実施形態において、これらのrep配列は、異なるAAVセロタイプのcap配列とインフレームで融合され、AAV2/8等のキメラAAVベクターを形成する(US 7,282,199)。

本発明で使用されるAAVベクターにおいて、AAVゲノムは、一本鎖(ss)核酸又は二本鎖(ds)自己相補的(sc)核酸のいずれかであってよい。

好ましい実施形態によれば、目的の分子は上記で定義される核酸配列である。

有利には、目的の核酸配列は、AAVベクターのITR(<<逆位末端反復>>)配列間に挿入される。

当技術分野で知られているように、組換えウイルス粒子は、例えば、293HEK細胞の三重トランスフェクション、単純ヘルペスウイルス系及びバキュロウイルス系により得られる。ベクター力価は通常、1mlあたりのウイルスゲノム(vg/ml)として表される。

一実施形態において、発現ベクターは制御配列、特にプロモーター配列を含む。このようなプロモーターは、天然でも合成(人工)プロモーターでもよく、誘導性でも構成的でもよい。

一実施形態において、プロモーターは普遍的プロモーターであるか、低い組織特異性を有する。例として、発現ベクターはホスホグリセリン酸キナーゼ1(PGK)、EF1、β-アクチン、CMVプロモーターを含有しうる。

好ましい実施形態において、プロモーター配列は、その制御下に置かれる核酸配列の発現を、発現レベルだけでなく組織特異性に関しても適切に制御するために選択される。一実施形態において、発現ベクターは、例えばP0、NSE、SYN1、Hb9又はThy-1プロモーター等の、PNS及び/又はCNS特異的プロモーターを含む。

可能性のあるその他の制御配列の非包括的なリストは、
- ポリアデニル化シグナル、例えば、有利には目的の配列の3'における、目的の遺伝子のポリA、SV40又はβヘモグロビン(HBB2)のポリA、
- 転写物安定化のための配列、例えばヘモグロビン(HBB2)のイントロン1、
- エンハンサー配列、
- miRNA標的配列
である。

現在までに、40超の遺伝子がシャルコー・マリー・トゥースニューロパチーに関与し、15超の遺伝子が運動ニューロンに作用する疾患に関与している。不完全性がPNS及び/又はCNSの疾患に関与する、目的のタンパク質の中には、
- シャルコー・マリー・トゥースニューロパチー:PMP22、GJB1、MPZ、LITAF、EGR2、NEFL、GAN1、KIF1B、MFN2、TRPV4、GDAP1、DYNC1H1、RSAM1、GNB4、HSPB1、HSPB3、HSPB8、GARS、YARS、AARS、HARS、KARS、MTMR2、MTMR13、RAB7、SPTLC1、SPTLC2、DNM2、PDK3、SH3TC2、NDRG1、PRX、HK1、FGD4、FIG4、CTDP1、LMNA、MED25、PRPS1、FBLN5、INF2、BSCL2、DCTN1、SLC5A7、SETX、REEP1、IGHMPB2、ATP7A、
- 運動ニューロン疾患:SMN1、SOD1、TARDBP、FUS、C9ORF72、SETX、VAPB、ANG、FIG4、OPTN、VCP、alsin、spatacsin、UBQLN2、SIGMAR1、DCTN1
がある。

例として、ミオチューブラリン(MTM1)遺伝子ファミリーは15のメンバーを含み、2つのメンバー(MTMR2、MTMR13)における突然変異が、PNSの疾患に関係する。この文脈において、機能性の、場合によっては天然のタンパク質、又は相当する遺伝子の送達により、これらの疾患が治療されるか更に治癒されるべきである。

別の態様によれば、本発明は、対象の末梢神経系(PNS)及び/又は中枢神経系(CNS)の疾患を治療する方法であって、上記で定義されるように局部又は局部領域的注入により、治療分子を含む組成物を前記対象に投与する工程を含む、方法を提供する。言い換えれば、本発明は、末梢神経系(PNS)及び/又は中枢神経系(CNS)の疾患の治療における使用のための治療分子を含む組成物であって、上記で定義されるように局部又は局部領域的注入により投与される組成物に関する。別の態様によれば、本発明は、末梢神経系(PNS)及び/又は中枢神経系(CNS)の疾患を治療するための医薬の調製のための分子の使用であって、医薬が、上記で定義されるように局部又は局部領域的注入により投与される、使用に関する。

好ましい実施形態において、組成物は治療上有効な量の分子を含む。

特に興味深いのは、末梢性ニューロパチー及び運動ニューロン疾患である。後天性だけでなく遺伝性の疾患も関係する。遺伝性末梢性ニューロパチーの例はシャルコー・マリー・トゥース(CMT)ニューロパチーである。運動ニューロン(CNS)が関与する神経筋障害の例は脊髄性筋萎縮症(SMA)及び筋萎縮性側索硬化症(ALS)である。

シャルコー・マリー・トゥースニューロパチーには、脱髄型CMT(AD-CMT1及びCMT4型)、軸索型CMT(AD-CMT2及びAR-CMT2型)、中間型CMT(DI-CMT型)、X連鎖性CMT(D-CMTX及びR-CMTX型)、CMT「プラス」、dHMN(AD-HMN、R-HMN、X-HMN型)が含まれる。このリストにおいて、Aは「常染色体の」を意味し、Xは「X連鎖性の」を意味し、Rは「劣性の」を意味し、Dは「優性の」を意味する。

本発明によれば、組成物は少なくとも1つの活性な分子、場合によっては異なる分子を含む。このような組成物は、医薬的に許容される不活性な媒体も含んでいてよい。各種賦形剤、安定剤及び当業者に既知のその他の適切な化合物が、このような組成物において想定されうる。

本発明による組成物は局部領域的注入により投与されるべきであるため、好ましくは液状である。ベクター濃度、注射されるべき量及び注射の頻度を決定することは、当業者にとって通常の慣行の一部である。

別の態様によれば、本発明は上記で定義される組成物、並びに局部又は局部領域的注入に特化した任意の材料、有利には止血帯系及び/又は、注射部位に加えられる圧力若しくは注入される静脈若しくは動脈の拍動を監視する装置(例えば超音波装置)を含むキットに関する。このようなキットは、シリンジ、針及び/又はカテーテル等の注射器も含んでいてよい。

本発明の実施では、別に示されない限り、十分に当業者の範囲内である分子生物学(組換え技術を含む)、微生物学、細胞生物学、生化学及び免疫学の従来の技術を使用する。このような技術は、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」第4版(Sambrook、2012);「Oligonucleotide Synthesis」(Gait、1984);「Culture of Animal Cells」(Freshney、2010);「Methods in Enzymology」「Handbook of Experimental Immunology」(Weir、1997);「Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells」(Miller and Calos、1987);「Short Protocols in Molecular Biology」(Ausubel、2002);「Polymerase Chain Reaction: Principles, Applications and Troubleshooting」(Babar、2011);「Current Protocols in Immunology」(Coligan、2002)等の文献で十分に説明される。これらの技術は、本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドの産生に適用可能であり、したがって、本発明の作製及び実施において検討されうる。特定の実施形態において特に有用な技術について、以下のセクションで論じる。

本明細書で値及び範囲が示される場合には、これらの値及び範囲により包含される全ての値及び範囲が、本発明の範囲内に包含されることが意図されると理解されるべきである。更に、これらの範囲内に入る全ての値及び値の範囲の上限又は下限も、本出願により考慮される。

以下の例は、本発明の態様を更に例示する。しかしこれらは、本明細書で示す本発明の教示又は開示を限定するものではない。

実験例
本発明は、以下の実験例を参照することにより更に詳細に記載される。これらの例は例示のためだけに示され、別に指定されない限り、限定なものであると意図されるものではない。

更なる記載なしに、以前の記載及び以下の例示的な例を使用して、当業者の1人は、本発明の組成物を作製及び利用し、主張される方法を実施することができると考えられる。したがって、以下の有用な例は、本発明の好ましい実施形態を具体的に示すものであり、本開示の残りを限定するものとして決して解釈されるべきではない。

材料及び方法
動物
XLMTMイヌについては、以前に記載されている(Beggsら、2010、Proc Natl Acad Sci USA 107(33):14697〜702頁)。罹患したオスを、記載の通りにポリメラーゼ連鎖反応ベースのジェノタイピングにより特定した。

イヌにおけるrAAV8-MTM1の調製及び投与
デスミンプロモーターにより調節されるイヌミオチューブラリンcDNAを含む、組換えアデノ随伴ウイルスベクター、rAAV2/8-pDesmin-MTM1canine(rAAV8-MTM1と呼ぶ)をバキュロウイルス/Sf9系で作り出した。2つのバキュロウイルスバッチを作り出し、1つはrep及びcapAAV遺伝子を発現し、2つ目はヒトデスミンプロモーター(pDesmin)の下流にイヌMTM1cDNA(XM850116、NCBI)を有していた。昆虫Sf9細胞をバキュロウイルスで二重感染させた後、rAAV-MTM1ベクター粒子を作り出し、AVBアフィニティークロマトグラフィーカラム(GE Healthcare社、AVB Sepharose high performance)を使用して全細胞培養物より精製した。vg/mLでの濃度を、上記のようにDNase抵抗性粒子より決定した。rAAVベクターに対し、無菌及び純度試験(Yuasaら、2007、Gene Ther 14(17):1249〜60頁)を含む、その他の通常の品質管理アッセイを行った。

静脈内局部的四肢注入
麻酔下のXLMTMイヌにおいて、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中で希釈したベクターrAAV8-MTM1(2.5x10¹³vg/kg)を、記載の通りに止血帯に対し、加圧下で(300torr)遠位伏在静脈に注入した(Petrovら、2011、Methods Mol Biol 709:277〜86頁;Arrudaら、2010、Blood 115(23):4678〜88頁)。一時的に止血帯を鼠径部のレベルに配置し、超音波によって大腿脈拍がもう検出されなくなるまで、標的の四肢への血液流入を一時的に遮断するように調節した。四肢の血液を排除するように遠位から近位方向に伸張性のラップをきつく装着した後に、止血帯を締めた。ベクターを、後肢の総体積(水体積置換により決定)の20%のPBS中に懸濁させ、足の背側の末梢伏在静脈の遠位分枝中に配置した14ゲージのカテーテルを介して投与した。止血帯を、合計15分間(注入前10分間及び注入中5分間)締めた。一方の後肢にはベクターを注入したが、対側の後肢には注入しなかった。

イヌ組織におけるウイルス力価の定量
二倍体ゲノム(dg)あたりのベクターゲノム(vg)数を、7900HTサーマルサイクラー(Applied Biosystem社、France)を使用するTaqmanリアルタイムPCRにより、総DNA80ngから定量した。イヌβグルクロニダーゼ遺伝子を標準化に使用した。ベクターゲノム(MTM1)増幅に使用したプライマーは、
5'-ATAAGTTTTGGACATAAGTTTGC-3'(フォワード;配列番号1)、
5'-CATTTGCCATACACAATCAA-3'(リバース;配列番号2)、及び
5'-CGACGCTGACCGGTCTCCT-3'(プローブ;配列番号3)
であった。
βグルクロニダーゼ増幅に使用したプライマー及びプローブは、
5'-ACGCTGATTGCTCACACCAA-3'(フォワード;配列番号4)、
5'-CCCCAGGTCTGCTTCATAGTTG-3'(リバース;配列番号5)、及び
5'-CCCGGCCCGTGACCTTTGTGA-3'(プローブ;配列番号6)(Applied Biosystem社)
であった。

結果
AAV8ベクターの局部領域的注入により、末梢神経における形質導入の増大が引き起こされる
9週齢のXLMTMイヌの左の後肢の上部に止血帯を配置し、rAAV8-Des-cMTM1ベクター(2.5x10¹³vg/kg)を、伏在静脈を介して加圧下で注射した。

ベクターを投与した1年後、イヌを安楽死させ、組織及び器官の多くの部分を、ベクターの体内分布を分析するために収集した。

ベクターゲノムコピーの定量により、
- 注入された後肢の坐骨神経では16コピー、
- 注入されなかった後肢の対側の坐骨神経では1.8コピー
であることが明らかになった。

より一般的には、これらの実験により、注入された坐骨神経が、体内で最も良好に形質導入された組織であり、ベクターDNA(16vg/dg)は対側神経(1.8vg/dg)よりも約15倍多かったことが明らかになった。

IV(静脈内)注射との比較
並行実験において、2頭のイヌに、同量のrAAV8-Des-cMTM1ベクター(2.5x10¹³vg/kg)を、伏在静脈における注射により全身投与した。坐骨神経において、ベクターコピーが1.8〜5しか検出されなかった。

これらのデータは、末梢神経系(PNS)、特に坐骨神経へ組換えAAVベクターを送達するのに、全身投与に対して局部領域的注入が優れていることを示している。CNS送達は、PNSを介した逆行性輸送により起こると考えられる。

本明細書で引用されるあらゆる特許、特許出願及び公開の開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。

Claims

対象の末梢神経系(PNS)及び/又は中枢神経系(CNS)への、診断又は治療分子の送達における使用のための前記分子を含む組成物であって、
アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターを含み、
血管透過性を増大させる条件下で血管内経路により投与される組成物。
加圧下で血管内経路により投与される、請求項1に記載のその使用のための組成物。
静脈内注射により投与される、請求項1又は2に記載のその使用のための組成物。
対象の四肢の血管に投与される、請求項1から3のいずれか一項に記載のその使用のための組成物。
分子が、化学分子、タンパク質、抗体、核酸配列からなる群から選択される、請求項1から4のいずれか一項に記載のその使用のための組成物。
治療分子が末梢神経系(PNS)及び/又は中枢神経系(CNS)の疾患の治療用である、請求項1から5のいずれか一項に記載のその使用のための組成物。
疾患が末梢性ニューロパチー又は運動ニューロン疾患である、請求項6に記載のその使用のための組成物。
疾患が、シャルコー・マリー・トゥース(CMT)ニューロパチー、脊髄性筋萎縮症(SMA)、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、脱髄型CMT(AD-CMT1及びCMT4型)、軸索型CMT(AD-CMT2及びAR-CMT2型)、中間型CMT(DI-CMT型)、X連鎖性CMT(D-CMTX及びR-CMTX型)、CMT「プラス」、dHMN(AD-HMN、R-HMN、X-HMN型)からなる群において選択される、請求項6又は7に記載のその使用のための組成物。
AAVベクターが核酸配列を含有する、請求項1から8のいずれか一項に記載のその使用のための組成物。
核酸配列が、PNS及び/又はCNSの疾患に関与する治療タンパク質又はその活性断片をコードする、請求項9に記載のその使用のための組成物。
核酸配列が、PMP22、GJB1、MPZ、LITAF、EGR2、NEFL、GAN1、KIF1B、MFN2、TRPV4、GDAP1、DYNC1H1、RSAM1、GNB4、HSPB1、HSPB3、HSPB8、GARS、YARS、AARS、HARS、KARS、MTMR2、MTMR13、RAB7、SPTLC1、SPTLC2、DNM2、PDK3、SH3TC2、NDRG1、PRX、HK1、FGD4、FIG4、CTDP1、LMNA、MED25、PRPS1、FBLN5、INF2、BSCL2、DCTN1、SLC5A7、SETX、REEP1、IGHMPB2、ATP7A、SMN1、SOD1、TARDBP、FUS、C9ORF72、SETX、VAPB、ANG、FIG4、OPTN、VCP、alsin、spatacsin、UBQLN2、SIGMAR1、DCTN1、ミオチューブラリン(MTM1)ファミリー、特にMTMR2及びMTMR13からなる群において選択されるタンパク質をコードする、請求項10に記載のその使用のための組成物。
ウイルスベクターが、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12又は操作された人工のAAVセロタイプからなる群から選択されるセロタイプを有する天然AAVベクターである、請求項1から11のいずれか一項に記載のその使用のための組成物。
AAVベクターがAAV8ベクターである、請求項12に記載のその使用のための組成物。
対象が哺乳類、有利にはイヌ又はヒトである、請求項1から13のいずれか一項に記載のその使用のための組成物。
組成物の1回の投与を含む、請求項1から14のいずれか一項に記載のその使用のための組成物。
請求項1から15のいずれか一項に記載の組成物、及び血管透過性を増大させるのに特化した少なくとも1つの材料、有利には止血帯系を含むキット。