JP2010540598A

JP2010540598A - Ａａｖベクターの末梢注入を使用する広範囲におよぶ運動ニューロンへの遺伝子の送達

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Publication number: JP2010540598A
Application number: JP2010527467A
Authority: JP
Inventors: バルカ，マルティーヌ
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date: 2007-10-05
Filing date: 2008-10-03
Publication date: 2010-12-24
Anticipated expiration: 2028-10-03
Also published as: NO2022048I1; EP2527457B1; HRP20220992T3; EP3505635B1; JP6309373B2; PT2527457T; PL3505635T3; US9926574B2; JP2014221789A; PT2212424E; CA2999607A1; US20180066283A1; CN105087650A; ES2924892T3; PL2212424T3; FI2212424T4; DK3505635T3; ES2482094T3; PT3505635T; EP2058401A1

Abstract

本発明は、哺乳動物の中枢神経系の細胞、例えば脳ニューロン又はグリア細胞、特に脊髄の運動ニューロン又はグリア細胞に遺伝子を送達するための、ｒＡＡＶの全身注入に基づいた、組成物及び方法、特に方法に関する。本発明はまた、治療遺伝子の発現による、哺乳動物における運動ニューロン障害の処置法にも関する。本発明は、ＡＡＶベクターの末梢注入により、血液脳関門が迂回され、運動ニューロンに大規模感染するという、予期せぬ発見からもたらされる。本発明は、ヒト被験体を含む任意の哺乳動物に使用し得る。

Description

本発明は、哺乳動物の中枢神経系の細胞に遺伝子を送達するための組成物及び方法に関する。本発明はまた、治療遺伝子の発現による、哺乳動物における運動ニューロン障害の処置法にも関する。本発明は、ＡＡＶベクターの末梢注入により血液脳関門が迂回され、中枢神経系における運動ニューロン並びに他の細胞に大規模に感染するという予期せぬ発見からもたらされる。本発明は、ヒト対象を含む、任意の哺乳動物において用いることができる。

序論
運動ニューロン（ＭＮ）疾病、例えば脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、筋萎縮性側策硬化症（ＡＬＳ)、又はケネディー病は、脊髄、脳幹、及び／又は運動皮質における運動ニューロンの選択的変性により特徴づけられる神経変性疾患である（Monani 2005；Pasinelli及びBrown 2006）；（MacLean, Warne et al.1996）。これらの疾病の処置法はない。なぜなら殆どの場合、全身注入を介した運動ニューロンへの薬物送達は、「血液脳関門」（ＢＢＢ)の存在により妨害されるためである。この解剖学的及び生理学的障壁は、中枢神経系（ＣＮＳ）毛細血管の内皮細胞間の密接な接合により形成され、血液循環とＣＮＳの間を分子が容易に通過することを防いでいる（Scherrmann 2002）。組換えタンパク質を有する運動ニューロンをＣＮＳ実質に直接注入し供給する代替的な方法も、手術手順の侵襲性のために困難であり、臨床適応の可能性を妨げている。

古典的な薬理学では失敗したため、科学社会は、特に、ウイルスベクターを使用した遺伝子導入技術に基づいた新規な治療戦略を開発するに至った。しかしながら、従来のウイルスベクターは一般的にＢＢＢを通過せず、最初に提案された遺伝子導入戦略には、ベクターのくも膜下腔内送達、又は、脊髄実質への直接的注入が含まれていた（Davidson, PNAS 2000）（Azzouz, Hottinger et al.2000）。しかしながら、これらの侵襲的アプローチは、効率的で広範囲におよぶＣＮＳの形質導入をもたらすことはできなかった。脳脊髄液（ＣＳＦ）における治療タンパク質の分泌及びＣＮＳ実質への更なる拡散を介して、脈絡叢及び脳室上皮を上皮細胞に形質導入する目的で、脳室へのウイルスベクターの注入も使用された（Passini and Wolfe 2001）。しかしながら、全神経組織への組換えタンパク質の拡散は、決して最適とは言い難いものであり、ここでも、手術手順に関連したリスクの可能性が、この方法の臨床適用における障害物である。筋肉内（i.m.）注入によるウイルスベクターの運動ニューロンへの逆行性軸索輸送を使用した代替的な非侵襲的戦略が更に開発された。遺伝子ベクター、例えばアデノウイルス、アデノ随伴ベクター（ＡＡＶ）、又は狂犬病Ｇ糖タンパク質で偽型にしたウマ貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）は、実際に、筋肉内注入後に運動ニューロン軸索に沿って逆行性の輸送を受け、実験動物における下位運動ニューロンの形質導入に成功裏に使用された（Finiels et al.、1995；Kaspar et al.、2003；Azzouz et al.、2004）。しかしながら、この方法の臨床的価値は、患者の運動単位の大部分が罹患している病態における運動ニューロンをターゲティングするのに必要とされる、注入部位の数及びウイルス粒子の数がどちらも大きいため、問題が依然として残っている。

これらの困難を克服するために、我々は、マウスにおいて、筋肉内（i.m.）、静脈内（i.v.）、及び腹腔内（i.p.）送達後の、新規なＡＡＶ血清型及びゲノムの運動ニューロン形質導入効率を試験した。特に、我々は、マウスのＣＮＳ形質導入を媒介する際の、血清型１及び９の組換え一本鎖ＡＡＶベクター及び自己相補性ＡＡＶベクター（それぞれ、ｓｓＡＡＶ及びｓｃＡＡＶ）の効率を比較した。

我々の主な結果により、組換えＡＡＶベクター（例えば、ｓｃＡＡＶ９）が、マウスにおいて静脈内送達された後に、脊髄運動ニューロンを形質導入するのに特に効率的であることが実証される。更に、我々は、ＬＩＸ１遺伝子の欠損を伴う、ヒトＳＭＡIII型に類似した常染色体劣性ＳＭＡの大型動物モデルであるイエネコモデルにおいてこの方法が実現可能であることを示す（Fyfe et al.,2006）。我々の方法により、ＣＮＳの他の細胞（グリア細胞、海馬及び手綱核のニューロン、及びアストロサイトを含む）の形質導入も可能となる。本発明は、初めて、対象の遺伝子をマウスへの１回の静脈内注射後に運動ニューロンへと移動させることにより、脊髄及び／又は他の神経細胞への広範囲におよぶ遺伝子の送達が行なわれ、それ故、運動ニューロン疾病の処置に対して新しい手段を提供することができることを示す。

発明の要約
本発明は、組換えＡＡＶベクターを使用して、ＣＮＳへ治療産物を送達するための新規な組成物及び方法に関する。より具体的には、本発明は、ＡＡＶベクターの末梢投与により、哺乳動物被験体の運動ニューロン又はグリア細胞に遺伝子を送達するための組成物及び方法に関する。

本発明の目的は、より具体的には、被験体へのＡＡＶベクターの末梢投与により、中枢神経系の細胞、特に運動ニューロン又はグリア細胞に遺伝子を送達するための医薬品の製造における、対象の遺伝子（例えば、治療産物又は診断産物をコードする）を含む該ＡＡＶベクターの使用に関する。

本発明の他の目的は、被験体へのＡＡＶベクターの末梢投与により、脊髄運動ニューロンに遺伝子を送達するための医薬品の製造における、対象の遺伝子（例えば、治療産物又は診断産物をコードする）を含む該ＡＡＶベクターの使用に関する。

本発明の更なる目的は、哺乳動物における、中枢神経系の細胞、特に運動ニューロン又はグリア細胞に、遺伝子を送達する方法にあり、該方法は、該遺伝子を含むＡＡＶベクターを哺乳動物に末梢経路により投与することを含み、該投与により、中枢神経系の細胞、特に運動ニューロン又はグリア細胞の、該ＡＡＶベクターによる感染が可能となり、これにより、中枢神経系の細胞、特に運動ニューロン又はグリア細胞への該遺伝子の送達が可能となる。

本発明の目的はまた、被験体の運動ニューロン障害処置用の医薬品の製造のための治療遺伝子を含むＡＡＶベクターの使用に関し、該ＡＡＶベクターは、末梢注入により該被験体に投与され、該投与により、（脊髄）運動ニューロンの感染及び（脊髄）運動ニューロンにおける該遺伝子の発現が引き起こされる。

本発明の別の目的は、ＡＡＶベクターの末梢注入により被験体の（脊髄）運動ニューロン中に治療タンパク質又はＲＮＡを産生するための医薬品の製造における、該ＡＡＶベクターの使用に関する。

本発明はまた、血液脳関門を通過することにより、中枢神経系の細胞、特に運動ニューロン又はグリア細胞に遺伝子を送達するためのＡＡＶベクターの使用に関する。

本発明はまた、哺乳動物被験体において血液脳関門を通過する遺伝子治療法に関し、該方法は、被験体へのＡＡＶベクターの末梢投与を含む。

本発明の更なる目的は、哺乳動物被験体において中枢神経系の細胞、特に運動ニューロンを遺伝子的に改変する方法に関し、ここで該方法は、被験体へのＡＡＶベクターの末梢投与を含む。

本発明はまた、ＡＡＶベクターの末梢投与により、脊髄に遺伝子を送達するための医薬品の製造における該ＡＡＶベクターの使用に関する。

本発明はまた、被験体の脊髄に遺伝子を送達する方法に関し、該方法は、該遺伝子を含むＡＡＶベクターの被験体への末梢投与を含む。

筋肉内ＡＡＶ注入後の新生仔マウス筋肉及びＣＮＳへの広範囲におよぶ遺伝子送達（青色：ｍＳＥＡＰの組織学的染色）。ｓｓ−又はｓｃＡＡＶ１又はＡＡＶ９の注入から３日後（ＰＮ４）又は７日後（ＰＮ８）の（ａ）腓腹筋、（ｂ）脳（第３脳室）、及び（ｃ）脊髄の代表的な横断面。ＮＩ：注入せず；ＰＮ４、生後４日目；ＰＮ８、生後８日目；ｓｓ、一本鎖；ｓｃ、自己相補性。尺度バー（ｂ、ｃ）１００μm。腹腔内ＡＡＶ注入後の新生仔マウス筋肉及びＣＮＳへの広範囲におよぶ遺伝子送達（青色：ｍＳＥＡＰの組織化学的染色）。（ａ）横隔膜筋、（ｂ）第３脳室（矢印：ｍＳＥＡＰを発現している脈絡叢細胞；矢頭を有する矢印：上衣細胞）、（ｃ）ＣＮＳ実質（矢印：ニューロン細胞）。ＮＩ：注入せず；ＰＮ４、生後４日目；ＰＮ８、生後８日目；ｓｓ、一本鎖；ｓｃ、自己相補性。尺度バー（ａ、ｂ、ｃ）１００μm；（ｄ）４０μm。自己相補性ＡＡＶ９−ＧＦＰの腹腔内送達は、新生仔マウスにおけるＣＮＳ形質導入を媒介する。ＡＡＶ送達から７日後にＧＦＰ免疫組織化学検査のために処理された代表的な脳及び脊髄横断面。導入遺伝子発現は、（ａ）脈絡叢上皮細胞、（ｂ）ニューロン（矢頭を有する矢印及び上のボックス）及びグリア（矢印及び下のボックス）の形態を有する海馬細胞、（ｃ）嗅内皮質細胞（矢印は、典型的なニューロン形態を有する細胞を示す）、（ｄ、ｅ）脊髄細胞（矢印は、運動ニューロン形態を有するＧＦＰ標識細胞を示す）、及び（ｆ）頸髄の感覚神経線維、において検出された。尺度バー４０μm。自己相補性ＡＡＶ９ベクターの筋肉内送達により、新生仔マウスにおけるＣＮＳ細胞の形質導入が可能となる。脳及び脊髄の組織学的切片を、ＡＡＶ注入から７日後にＧＦＰ免疫組織化学検査法で処理した。導入遺伝子発現は、（ａ）脈絡叢（矢印）及び上衣（矢頭を有する矢印）の上皮細胞、（ｂ、ｃ）中隔の神経細胞、及び（ｄ、ｅ）嗅内皮質の神経細胞、及び（ｆ）頸髄の錐体交差準位における皮質脊髄路、において検出された。尺度バー２０μm。自己相補性ＡＡＶ９ベクターの静脈内送達は、新生仔マウスのＣＮＳにおけるＧＦＰ発現を媒介する。ＡＡＶ注入から７日後のＧＦＰ免疫染色で処理された脳及び脊髄の組織学的切片の代表的な顕微鏡写真。ＧＦＰ陽性細胞は、（ａ）脈絡叢（矢印）及び上衣（矢頭を有する矢印）の上皮細胞、（ｃ）脳血管、（ｄ、ｆ）ニューロン（矢印）及びグリア（矢頭を有する矢印）形態を有する海馬細胞、（ｇ）嗅内皮質のニューロン様細胞、において検出された。多くの運動ニューロン様細胞体（矢印）及び線維（矢頭を有する矢印）が、（ｈ）頸髄、（ｉ）胸髄、及び（ｊ）腰髄準位において脊髄全体を通じて効率的に形質転換された。（ｂ）第３脳室、又は（ｅ）海馬、又は（ｋ〜ｍ）脊髄の代表的な切片において示されるように、注入されていないマウスのＣＮＳには染色は観察されなかった。尺度バー（ａ、ｂ）１００μm、（ｃ、ｄ、ｆ）４０μm、（ｅ、ｇ）１００μm、（ｈ〜ｍ）２０μm。ＧＦＰを発現している一本鎖ＡＡＶ９ベクターは、新生仔マウスのＣＮＳにおいて導入遺伝子発現を媒介する。ｓｓＡＡＶ９ベクターの静脈内注入から３週間後にＧＦＰ免疫組織化学検査法で処理した新生仔マウス由来の脳及び脊髄の切片の代表的な顕微鏡写真。（ａ）脈絡叢（アステリスク）、海馬（矢頭を有する矢印及びボックス）、及び手綱核（矢印）、（ｂ）正中隆起、及び（ｃ〜ｅ）腹側脊髄の運動ニューロン様細胞、におけるＧＦＰ陽性細胞。尺度バーパネルｂ：１００μm；ｃ、ｄ、ｅ：２０μm。組換えＡＡＶ９ベクターは、成体マウスＣＮＳにおける導入遺伝子の発現を媒介する。ｍＳＥＡＰを発現しているｓｃＡＡＶ９（ａ、ｃ）、ｓｓＡＡＶ９（ｂ）、ｓｃＡＡＶ１（ｄ）、及びｓｓＡＡＶ１（ｅ）の３×１０^１１（ｂ）又は１×１０^１２（ｃ〜ｈ）個のベクターゲノムの静脈内送達から４週間後の、成体Ｃ５７ｂｌ６マウス由来の代表的な冠状脳切片；尺度バーパネルｇ、ｈ、ｊ：１００μm；パネルｉ、ｋ、ｌ：２０μm。静脈内注入された組換えＡＡＶ９ベクターは、成体マウスの脊髄において導入遺伝子の発現を媒介する。ｍＳＥＡＰを発現しているｓｓＡＡＶ９（ａ、ｂ）、ｓｃＡＡＶ９（ｃ、ｇ）の１×１０^１２個のベクターゲノムの静脈内送達から４週間後の、成体Ｃ５７ｂｌ６マウス由来の代表的な横断脊髄切片。尺度バー（ａ、ｂ、ｅ）：４０μm、ボックス：２０μm；（ｃ、ｄ）：１００μm；（ｆ）：５０μm；（ｇ）：２０μm。ＬＩＸ−１ネコにおけるＡＡＶ９−ＧＦＰの静脈内注入は、脊髄全体を通じた導入遺伝子の発現を媒介する。２日目のＬＩＸ１ヘテロ接合型ネコの代表的な横断脊髄切片を、ＧＦＰ発現ｓｃＡＡＶ９の頸静脈への注入から１０日後に、レーザー走査共焦点顕微鏡を使用して観察したか（図９ａ、ｃ）、又は、ＧＦＰ免疫組織化学検査法で処理した（図９ｂ、ｄ）。尺度バー（ａ）：２００μm；（ｂ、ｄ）：５０μm；（ｃ）：１００μm。ＬＩＸ−１ネコへのＧＦＰ発現ＡＡＶ９（１.５×１０^１２個のベクターゲノムを含むｓｃＡＡＶ９−ＣＭＶ−ｅＧＦＰの粒子）の静脈内注入は、運動ニューロンにおける導入遺伝子の発現を媒介する。ＧＦＰに対する抗体及びコリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）を使用した二重免疫染色解析により、ＳＭＡ罹患子ネコ（ａ〜ｃ）及び非罹患子ネコ（ｄ〜ｆ）の両方において、ＧＦＰ陽性細胞のかなりの部分が運動ニューロンであることが示された。広範囲におよぶ脊髄の形質導入は、成体マウスにおいて高濃度ｓｃＡＡＶ９の静脈内送達により媒介される。２×１０^１２個のウイルスゲノムのｓｃＡＡＶ９の静脈内注入から４週間後の、ＧＦＰ免疫染色のために処理した（ａ〜ｃ）頸髄、及び（ｄ、ｅ）腰髄、（ｆ）後根神経節切片における、ニューロン（矢印）細胞及びグリア（矢頭を有する矢印）細胞におけるＧＦＰの高い発現。（ｇ、ｊ）ＧＦＰ及び（ｈ、ｋ）ＧＦＡＰ（アストロサイトのマーカーであるグリア線維性酸性タンパク質、赤色）のための（ｇ〜ｌ）二重免疫蛍光解析により、いくつかのアストロサイトにおけるＧＦＰの発現が示される（矢頭を有する矢印は、二重標識された細胞を示す）。（ｉ、ｌ）混合。尺度バー（ａ、ｂ、ｄ〜ｌ）：５０μm、（ｃ）：２０μm。

発明の詳細な説明
脊髄への広範囲におよぶ遺伝子送達は、運動ニューロン（ＭＮ）疾病、例えば脊髄筋硬化症（ＳＭＡ）又は筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の処置に対する重要な挑戦である。本明細書において、我々は、１回の組換えＡＡＶベクターの末梢注入後に効率的な運動ニューロン形質導入を可能とする、新規な遺伝子導入法を記載する。我々は、血清型１及び９の組換え一本鎖（ｓｓ）ＡＡＶベクター及び自己相補性（ｓｃ）ＡＡＶベクターを、新生仔又は成体マウスに腹腔内、筋肉内、又は静脈内（i.v.）注入し、中枢神経系（ＣＮＳ）における導入遺伝子の発現を解析した。組換えｓｓ−及びｓｃＡＡＶ９ベクターの両方が、神経細胞及び上皮脳細胞、重要なことには、脊髄における運動ニューロン及びグリア細胞をターゲティングすることが判明した。背側感覚神経線維及び後根神経節もまた高度に形質導入された。最も印象的な形質導入効率は、ｓｃＡＡＶ９ベクターの静脈内注入により得られた。我々は更に、ネコのＳＭＡモデルにおいて静脈内注入されたｓｃＡＡＶ９が血液脳関門を迂回し、下位運動ニューロンを形質導入することができることを確認した。この戦略は、脊髄への広範囲におよぶ導入遺伝子の送達を達成した最初の非侵襲的な手順を示し、運動ニューロン疾病の処置のための新規な手段を提供するものである。

ＡＡＶベクター
本発明の内容において、用語「ＡＡＶベクター」は、ＡＡＶの成分を含むか、又はＡＡＶの成分から得られ、そして哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞を感染するのに適切である、任意のベクターのことをいう。用語ＡＡＶベクターは、典型的には、治療タンパク質をコードする少なくとも１種類の核酸分子を含む、ＡＡＶ型ウイルス粒子（又はビリオン）のことをいう。以下に考察されているように、ＡＡＶは、様々な血清型（血清型の組合せ（すなわち「偽型」ＡＡＶ）を含む）、又は様々なゲノム（例えば一本鎖又は自己相補性）から得られる。更に、ＡＡＶベクターは、複製欠損でもよく、そして／又はターゲティングされていてもよい。

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、約２０nmのサイズの依存性パルボウイルスである。他のパルボウイルスと同様に、ＡＡＶは、２つのオープンリーディングフレームを含む、約５０００ヌクレオチド長のゲノムを有する、一本鎖でエンベロープを持たないＤＮＡウイルスである。左手オープンリーディングフレームは、複製（Ｒｅｐ）に関与するタンパク質をコードし、一方、右手オープンリーディングフレームは、カプシド（Ｃａｐ）の構造タンパク質をコードする。オープンリーディングフレームは、２つのＩＴＲ配列によりフランキングされており、この配列は、ウイルスゲノムの複製起点として働く。更に、ゲノムはまた、ウイルスゲノムがＡＡＶカプシドにパッケージングされることを可能とする、パッケージング配列も含む。

ＡＡＶは、培養細胞中で産生的な感染を受けるために、同時ヘルパー機能（例えばアデノウイルスにより、又は適切なパッケージング細胞もしくはヘルパープラスミドにより提供され得る）を必要とする。このようなヘルパー機能がなければ、ＡＡＶビリオンは本質的に細胞に侵入し、一本鎖ＤＮＡ分子として核に移動し、細胞のゲノムに組み込まれる。ＡＡＶは、感染する宿主範囲が広範であり（ヒト細胞を含む）、ヒトにおいて遍在性であり、完全に非病原性である。

ＡＡＶベクターは、ヒト被験体において遺伝子送達を媒介するために（治療目的を含む）、設計され、作製され、使用されてきた。ＡＡＶベクターを使用した臨床試験が現在、様々な国において進行中である。典型的には、遺伝子導入に使用されるＡＡＶベクターには、機能的Ｒｅｐ及びＣａｐコードウイルス配列を欠失した複製欠損ＡＡＶゲノムが含まれる。このような複製欠損ＡＡＶベクターは、より好ましくは、Ｒｅｐ及びＣａｐコード配列の殆ど又は全てを欠失し、本質的に１つ又は２つのＡＡＶＩＴＲ配列及びパッケージング配列を保持している。

パッケージング細胞、補助ウイルスもしくはプラスミド、及び／又はバキュロウイルス系の使用を含む、このようなＡＡＶベクターの作製法は文献に開示されている（Samulski et al.,(1989)J.Virology 63、3822；Xiao et al.,(1998)J.Virology 72,2224；Inoue et al.,(1998)J.Virol.72,7024；国際公開公報第９８／２２６０７号；国際公開公報２００５／０７２３６４号）。偽型ＡＡＶベクターの作製法（例えば国際公開公報第００／２８００４号）、並びに、インビボでの投与時にその免疫原性を低減させるためのＡＡＶベクターの様々な改変又は調合が報告されている（例えば、国際公開公報第０１／２３００１号；国際公開公報第００／７３３１６号；国際公開公報第０４／１１２７２７号；国際公開公報第０５／００５６１０号；国際公開公報第９９／０６５６２号を参照）。

ＡＡＶベクターは、様々な血清型のＡＡＶから調製又は誘導し得、これらを一緒に又は他の型のウイルスと混合して、キメラ（例えば偽型）ＡＡＶウイルスを作製してもよい。

特定の態様において、本発明で使用されるＡＡＶベクターは、ヒトＡＡＶウイルスに由来する。このようなヒトＡＡＶ（カプシド及びＩＴＲ）は、任意の既知の血清型から、例えば血清型１〜１１のいずれか１つ、好ましくはＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、及びＡＡＶ９、より好ましくはＡＡＶ６、ＡＡＶ８、及びＡＡＶ９、更により好ましくはＡＡＶ９から得られる。このようなＡＡＶベクターの具体例は、ＡＡＶ２由来カプシド中にＡＡＶ２由来ゲノム（治療タンパク質をコードする核酸に作動可能に連結された、ＡＡＶ２由来ＩＴＲ及びＡＡＶ２由来パッケージング配列、好ましくは２つのＡＡＶ２由来ＩＴＲにフランキングされたＡＡＶ２由来パッケージング配列及び治療タンパク質をコードする核酸を含む、核酸分子）を含むベクター；ＡＡＶ４由来カプシド中にＡＡＶ４由来ゲノムを含むベクター；ＡＡＶ６由来カプシド中にＡＡＶ６由来ゲノムを含むベクター；ＡＡＶ８由来カプシド中にＡＡＶ８由来ゲノムを含むベクター；ＡＡＶ９由来カプシド中にＡＡＶ９由来ゲノムを含むベクターである。

別の特定の態様において、ＡＡＶベクターは、偽型ＡＡＶベクターであり、すなわち、少なくとも２つの異なるＡＡＶ血清型を起源とする配列又は成分を含む。特定の態様において、偽型ＡＡＶベクターは、あるＡＡＶ血清型（例えばＡＡＶ２）から得られたＡＡＶゲノムと、別個のＡＡＶ血清型から少なくとも一部は得られたカプシドとを含む。このような偽型ＡＡＶベクターの具体例には、ＡＡＶ４由来カプシド中にＡＡＶ２由来ゲノムを含むベクター；又は、ＡＡＶ６由来カプシド中にＡＡＶ２由来ゲノムを含むベクター；又は、ＡＡＶ８由来カプシド中にＡＡＶ２由来ゲノムを含むベクター；又は、ＡＡＶ９由来カプシド中にＡＡＶ２由来ゲノムを含むベクターが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。

更に特定の態様（これは、上記のいずれかの態様と組合せ得る）において、ＡＡＶベクターは、ベクターの指向性を変化させるための、改変されたカプシド（ウイルス起源ではないか又は構造的に改変されたタンパク質又はペプチドを含む）を含み得る。特定の例としては、カプシドは、特定のレセプター又は特定のリガンドを発現している細胞型にベクターをターゲティングさせるための、それぞれ、該レセプターのリガンド、又は該リガンドのレセプターを含み得る。

本発明に使用されるＡＡＶベクターにおけるＡＡＶゲノムは、一本鎖核酸又は二本鎖の自己相補性核酸（McCarty et al.,Gene Therapy,2001)、より好ましくは自己相補性核酸であり得る。

前記で考察したように、ＡＡＶ由来ゲノムは、治療タンパク質をコードする核酸を含む。典型的には、該核酸はまた、コードされたタンパク質、例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）をコードする配列などの、発現、好ましくは分泌を可能とする、調節配列も含む。これに関して、該核酸は、最も好ましくは、感染細胞において治療タンパク質の発現を引き起こすか又は向上させる、コード配列に作動可能に連結された、プロモーター領域を含む。このようなプロモーターは、感染組織におけるタンパク質の効率的かつ適切な産生を可能とするように、遍在的、組織特異的、強い、弱い、調節された、キメラなどであり得る。プロモーターは、コードされたタンパク質と相同でも、又は異質でもよく、これには、細胞性、ウイルス性、真菌性、植物性、又は合成のプロモーターが挙げられる。本発明に使用される最も好ましいプロモーターは、神経細胞、特にヒト細胞、より好ましくは運動ニューロンにおいて機能的であろう。このような調節されたプロモーターの例には、Ｔｅｔオン／オフエレメント含有プロモーター、ラパマイシン誘導性プロモーター、及びメタロチオネインプロモーターが挙げられるがそれらに限定されるわけではない。運動ニューロンに特異的なプロモーターの例には、公知の運動ニューロン由来因子であるカルシトニン遺伝子関連ペプチド（Calcitonin Gene-Related Peptide、ＣＧＲＰ）のプロモーターが挙げられる。運動ニューロンにおいて機能的である他のプロモーターには、コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）プロモーター、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター、シナプシンプロモーター、又は遍在性プロモーター（ニューロン特異的サイレンサーエレメント（ＮＲＳＥ）を含む）が挙げられる。遍在性プロモーターの例には、ウイルスプロモーター、特にＣＭＶプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーターなど、及び細胞性プロモーター、例えばＰＧＫ（ホスホグリセレートキナーゼ）プロモーターが挙げられる。

好ましい態様において、該核酸は、コードされたタンパク質の分泌を可能とするリーダー配列を含む。対象の導入遺伝子を、分泌シグナルペプチドをコードする配列（通常、分泌ポリペプチドのＮ末端に位置する）と融合することにより、形質導入細胞からＣＳＦ中に分泌され得る形態で治療タンパク質を産生することが可能となる。このようなシグナルペプチドの例には、アルブミン、β−グルクロニダーゼ、アルカリプロテアーゼ、又はフィブロネクチン分泌シグナルペプチドが挙げられる。

別の具体的な態様によると、導入遺伝子を、ＰＴＤ配列、例えばＴａｔ又はＶＰ２２配列と融合することにより、形質導入細胞からの治療タンパク質の分泌、及び、隣接細胞による再取り込みを引き起こすか又は向上させる。

特定の態様において、該核酸は、コードされたタンパク質の発現及び分泌を可能とする、作動可能なリンカー、プロモーター、及びリーダー配列を含む。

更に特定の態様において、該核酸は、コードされたタンパク質の発現及び分泌を可能とする、作動可能なリンカー、プロモーター、リーダー配列、及びＰＴＤ配列を含む。

最も好ましい態様において、プロモーターは、運動ニューロンにおいて特異的又は機能的であり、すなわち、該細胞における導入遺伝子の（優先的な）発現を可能とするものである。

前記に考察したように、ＡＡＶベクターは、実施例において更に例示されているように、当技術分野においてそれ自体公知である技術により作製され得る。

末梢投与
本発明は、運動ニューロン又はグリア細胞における遺伝子の効率的かつ広範囲におよぶ発現は、ＡＡＶベクターの末梢投与により、非侵襲的な技術を用いて達成することができるという予期せぬ発見に基づいている。このような末梢投与には、脳への直接注入を意味しない任意の投与経路が含まれるがそれらに限定されるわけではない。より特定すると、末梢投与には、全身注入、例えば筋肉内（i.m.）、静脈内（i.v.）、腹腔内（i.p.）、動脈内、皮下、又は経皮注入が含まれる。末梢投与には、ＡＡＶベクターの経口投与（国際公開公報第９６／４０９５４号）、インプラントを使用した送達（国際公開公報第０１／９１８０３号）、又は、例えばスプレー、エアゾール、もしくは任意の他の適切な製剤を使用した、呼吸器系を通した滴下による投与も含まれる。

最も好ましい末梢投与には、末梢注入、特に全身注入、最も好ましくは筋肉内、腹腔内、又は静脈内注入が含まれる。

ＡＡＶベクターの用量は、例えば、疾病容態、被験体、処置計画などに応じて、当業者により容易に適応され得る。典型的には、マウスにおいて１用量あたり、１０^９〜１０^１４個のウイルスゲノム（形質導入単位）、好ましくは１０^１１〜１０^１３個のウイルスゲノムが投与される。典型的には、ヒトに投与されるＡＡＶベクターの用量は、１０^１１〜１０^１７、好ましくは１０^１３〜１０^１６個のウイルスゲノムの範囲であり得る。本発明の内容において好ましい有効量は、脊髄細胞（運動ニューロン及び／又はグリア細胞）の最適な形質導入を可能とする用量である。

ＡＡＶベクターは、任意の適切な形態で、液状溶液又は懸濁液のいずれかとして、注入前の液体中の溶液又は懸濁液に適した固体形として、ゲル又はエマルションとして投与され得る。ＡＡＶベクターは、典型的には、任意の適切で薬学的に許容され得る賦形剤、担体、補助剤、希釈剤などと共に調合される。注入用の賦形剤は、液状で等張な溶液、緩衝液、例えば、滅菌された発熱物質を含まない水、又は滅菌された発熱物質を含まないリン酸緩衝生理食塩水であり得る。吸入用の賦形剤は、粒子形であり得る。

ＡＡＶベクターは、典型的には、「治療有効」量で、すなわち、疾病状態に関連した症状の少なくとも１つを軽減（例えば減少、低減）するに十分な量、又は、被験体の容態を改善するに十分な量で投与される。必要であれば、同じもしくは異なる末梢投与経路及び／又は同じもしくは異なるＡＡＶ血清型を使用して、反復投与を行なってもよいことを指摘する。

本発明者らは初めて、末梢投与されたＡＡＶベクター、特にｓｃＡＡＶベクターが血液脳関門を通過し、実質的にＣＮＳ細胞への感染を引き起こすことを示した。この効果は、血液脳関門破壊剤の使用を必要とせずに得られるものである。高熱、マンニトール、ブラジキニン、及びＮＳ１６１９は、例示的な血液脳関門破壊剤である。

従って、特定の態様において、本発明は、ＡＡＶベクター、好ましくはｓｃＡＡＶベクター、より好ましくはｓｃＡＡＶ９ベクターの末梢投与を含み、血液脳関門破壊剤が全く用いられていない、前記に定義されたような使用又は方法に関する。更に、本発明は、マンニトールが被験体に全く注入されない、前記で定義されたような使用又は方法に関する。

又は、別の特定の態様において、本発明は、本発明で実施されるｓｃＡＡＶベクターの血液脳関門の通過を更に増加させるために、血液脳関門破壊剤又は破壊方法を用いて血液脳関門を破壊することを更に含む、前記で定義したような使用又は方法に関する。

運動ニューロン障害
本発明は、初めて、末梢に投与されたＡＡＶベクターが血液脳関門を通過し、ＣＮＳ細胞、特に脊髄全体におよぶ運動ニューロンへの実質的な感染を引き起こすことを示す。提示された結果により、感染が、脊髄の頸髄セグメントから腰髄セグメントまで効果を及ぼし、これにより運動ニューロンへの広範囲におよぶ遺伝子の送達がなされたことが示される。

本発明を使用して、治療産物をＣＮＳ細胞（運動ニューロンを含む）へ送達することにより、様々な疾患を処置し得る。治療産物は、細胞もしくは被験体におけるタンパク質の不在もしくは欠損から生じる症状を軽減もしくは低減し得るか、又は、別の点で被験体に利点を付与し得る、任意のタンパク質、ペプチド、又はＲＮＡであり得る。治療タンパク質の例には、成長因子、サイトカイン、ホルモン、神経伝達物質、酵素、抗アポトーシス因子、血管新生因子、及び、「生存運動ニューロン」タンパク質（ＳＭＮ）などの病的疾患において突然変異していることが知られている任意のタンパク質が挙げられる。治療ＲＮＡの例には、本明細書で後述するいずれかの疾病おいて治療的関心を有するタンパク質をコードする、アンチセンスＲＮＡ又はＲＮＡｉターゲティングメッセンジャーＲＮＡが挙げられる。例えば、ＡＬＳ処置の観点では、スーパーオキシドジスムターゼ酵素をターゲティングしたＲＮＡｉが、前記に定義したようなＡＡＶベクターによりコードされ得る。

治療産物に応じて、本発明を使用することにより、様々な疾病を処置することができ、これには、治療タンパク質を神経組織に発現することにより処置又は予防し得る任意の疾病が含まれる。このような疾病には、ＣＮＳ疾患、好ましくは、神経変性疾病、神経筋疾病、リソソーム病、外傷、骨髄損傷、疼痛（神経障害性疼痛を含む）、神経系の癌、脱髄疾病、神経系の自己免疫疾病、神経毒症候群、睡眠障害から選択されたＣＮＳ疾患が含まれる。

疾病の具体例には、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、トゥレット症候群、統合失調症、スライ病、ハンター病、痴呆、妄想性障害、強迫性障害、学習障害、筋萎縮性側索硬化症、脊髄性筋萎縮症、シャルコー・マリー・トゥース病、脊髄小脳失調症、痙性麻痺、ケネディ病、神経膠芽腫、神経芽細胞腫、自閉症、ゴーシュ病、ハーラー病、クラッベ病、及び挙動変化（例えば睡眠障害、知覚障害、又は認知障害）が挙げられる。

本発明は、予防処置又は治癒処置のために、任意の哺乳動物、特にヒト被験体（成人を含む）において使用され得る。

本発明はまた診断法において使用することにより、哺乳動物被験体における運動ニューロンの状態又は活性又は成長を検出することもできる。このような適用では、ベクターは、典型的には、検出可能な遺伝子（蛍光、発光など）を含み、そしてマーカーとして使用される。

本発明はまた動物被験体において使用することにより、例えば、ＣＮＳ疾患を処置するための候補薬物の研究を支援したり、そして／又は運動ニューロンの成長、分化、活性などのメカニズムを解明することもできる。

本発明の更なる局面及び利点は、以下の実験の章で開示されており、これは、単なる例示として捉えるべきであり、本発明の範囲を限定するものと捉えるべきではない。

実施例
材料及び方法
動物。妊娠した成体（６〜８週令の雌）のＣ５７Ｂｌ／６マウスは、Charles River Laboratories（Les Oncins, France）から購入した。新生仔に誕生日（生後１日目、ＰＮ１)に注入した。ＳＭＡネコブリーダー（ヘテロ接合性で冒された動物）はFyfe博士（米国ミシガン州所在、Laboratory of Comparative Medical Genetics）から入手し、ナント（Nantes）獣医学校のCenter of Boisbonneで飼育した。ＳＭＡ子ネコの遺伝子型同定は、以前に記載されているように実施した（Fyfe、Menotti-Raymond et al.2006）。実験は、地域倫理委員会（ＣＲＥＥＡ）により承認された。全ての動物実験は、人間による実験動物の世話及び使用に関する欧州ガイドラインに従って実施した。

ベクター調製。
偽型ＡＡＶ２／１及びＡＡＶ２／９ベクターは、ＡＡＶ２＿をベースとした組換え一本鎖（ｓｓ）及び自己相補性（ｓｃ）ゲノムをＡＡＶ１及び９カプシドにパッケージングすることにより作製された。簡潔には、ベクターは、（１）アデノウイルスヘルパープラスミド、（２）ｒｅｐ２及びｃａｐ１もしくは９遺伝子をコードするＡＡＶパッケージングプラスミド（ＡＡＶ１ではｐＬＴＲＣ０２、ＡＡＶ９ではｐ５Ｅ１８−ＶＤ２／９）、（３）ｓｓ又はｓｃゲノムとしてｍＳＥＡＰ又はＧＦＰ（サイトメガロウイルス最初期（ＣＭＶＩＥ）プロモーターの制御下）を含むＡＡＶ２ベクタープラスミド（Xiao,Li et al.1998）を用いて、ＨＥＫ２９３細胞におけるヘルパーウイルスを含まない３種プラスミド同時トランスフェクションを使用して作製された。この後者のプラスミドは、逆位末端配列の１つから、Ｄ配列及び末端分離部位（ｔｒｓ）を欠失させることにより作製された。組換えベクターは、二回のＣｓＣｌ超遠心分離にかけ、その後、リン酸緩衝食塩水に対して透析することにより精製した。物理的粒子は、マウスに注入されたベクターについてはリアルタイムＰＣＲにより、ネコに注入されたベクターについてはドットブロットハイブリダイゼーションにより定量し、ベクター力価は、ウイルスゲノム/ml（vg/ml）として表現した。

ＡＡＶベクターのインビボでの注入
新生仔マウスに、誕生日（生後１日目、ＰＮ１）に注入した。筋肉内注入では、ｍＳｅＡＰ又はＧＦＰをコードするＡＡＶベクター溶液（ｓｓＡＡＶ２/１（ｎ＝２）、ｓｓＡＡＶ２/９（ｎ＝２）、ｓｃＡＡＶ２/１（ｎ＝２）、又はｓｃＡＡＶ２/９（ｎ＝３））を、三頭筋及び腓腹筋の両方に注入した（１筋肉あたり１か所の注入部位、１回の注入につき５μl、マウス１匹あたり８×１０^９〜２×１０^１０個のウイルスゲノム）。腹腔内注入では、ｍＳｅＡＰ又はＧＦＰをコードするウイルス溶液（ｓｓＡＡＶ２/１、ｎ＝２、ｓｓＡＡＶ２/９、ｎ＝１、ｓｃＡＡＶ２/１、ｎ＝１、及びｓｃＡＡＶ２/９、ｎ＝２）を、１日令のＣ５７Ｂｌ/６マウスの腹腔に注入した（１００μl、マウス１匹あたり３×１０^１０〜１０^１１個のウイルスゲノム）。静脈内注入では、１日令のＣ５７Ｂｌ/６マウスの側頭静脈に、ｓｃＡＡＶ２/９−ＧＦＰベクターを注入した（５０μl、マウス１匹あたり１.５×１０^１０個のウイルスゲノム、ｎ＝３）。成体Ｃ５７Ｂｌ/６マウスの尾静脈に、ｓｃＡＡＶ２/９−ｍＳｅＡＰ又はｓｃＡＡＶ２/９−ＧＦＰベクターを注入した（５００μl、マウス１匹あたり３×１０^１１個のウイルスゲノム）。生誕２日後、合計で１.５×１０^１２個のベクターゲノムを含むｓｃＡＡＶ９−ＣＭＶ−ｅＧＦＰの粒子を、１匹のＳＭＡ罹患ネコ及び１匹のＳＭＡヘテロ接合性ネコの頸静脈に注入した。

組織学的検査のための灌流及び組織加工
筋肉、脳、及び脊髄を、新生仔マウスから注入の１日後（ＰＮ２）、３日後（ＰＮ４）、もしくは７日後（ＰＮ８）に、又は、成体マウスから注入の７日後及び３５日後に取り出した。成体Ｃ５７Ｂｌ６マウスを麻酔し（キシラジン１０mg/kg、ケタミン１００mg/kg）、０.１Ｍリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で、次いでＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を用いて心内を灌流した。組織を取り出し、４時間、同溶液中で後固定し、その後、一晩４℃で脳及び筋肉については１５％スクロースに移し、脊髄については３０％スクロースに移した。新生仔を断頭し、組織を４％ＰＦＡ中に４時間浸漬し、その後４℃で一晩凍結保護した。試料を冷イソペンタン（−５０℃）中で凍結させ、連続切片をクリオスタットで切り出し、更なる解析のために−８０℃で保存した。

注入から１０日後、ネコを麻酔し（メデトミジン１５０μg/kg、ケタミン１０mg/kg）、１０mlのリン酸緩衝食塩水で、次いで１００mlの４％ＰＦＡを用いて経心的に灌流した。脳及び脊髄を取り出し、切り出して冠状の５mmの平板とし、次いで、４％ＰＦＡで後固定し、その後、３０％スクロース中で一晩凍結保護し、その後、ＯＣＴ化合物中でドライアイス上で凍結させた。脊髄切片は、１×１００μmの間隔で切り出し、その後、クリオスタットで５×１０μmの間隔で切り出した。共焦点顕微鏡によるＧＦＰシグナルの検査に１００μmの厚さの切片が使用され、免疫細胞化学検査には１０μmの厚さの切片が使用された。

導入遺伝子発現の評価
ｍＳｅＡＰ組織化学的検査では、新生仔マウスの筋肉、脳、及び脊髄を、注入から１日後、３日後、及び７日後に取り出し、冷イソペンタン（−５０℃）中で凍結させ、即時使用のために−８０℃で維持した。成体動物の脳及び脊髄は、注入から３５日後に収集し、同条件下で処理した。脳及び脊髄では１６μmの厚さの組織切片を、筋肉では８μmの厚さの組織切片をクリオスタットで作製し、その後、導入遺伝子発現のために加工した。該切片を、０.５％グルタルアルデヒドで固定し、ＰＢＳで洗浄し、内因性アルカリホスファターゼを３０分間６５℃で熱により失活させた。その後、切片を、一晩３７℃で、０.１６５mg/mlの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート及び０.３３mg/mlのニトロブルーテトラゾリウムの、１００mMトリス−ＨＣｌ、１００mMのＮａＣｌ及び５０mMのＭｇＣｌ_２溶液中でインキュベートし、ヘマトキシリン−エオシンで対比染色し、Eukitを用いてマウントした。

マウスにおけるＧＦＰ免疫組織化学的検査においては、切片をＰＢＳ中で洗浄し、内因性ペルオキシダーゼを阻害するために過酸化水素溶液（ペルオキシダーゼ遮断溶液、Dako）中で３０分間インキュベートした。ＰＢＳ中で洗浄した後、切片を、１０％ヤギ血清（Dako）及び０.４％Tritonを含むＰＢＳ中で室温で１時間かけて遮断し、その後、ウサギポリクローナル抗ＧＦＰ（Abcam；１：３０００）と共に一晩インキュベートした。ビオチンにコンジュゲートさせた二次抗体（Vectastain、１：２００）及びVectastain Elite ABCキットを使用し、ＤＡＢ基質キット（Vector Laboratories）を用いてペルオキシダーゼについてのＤＡＢの染色を明らかにした。切片をアルコール及びキシレン中で脱水し、Eukitを用いてマウントした。

ネコにおけるＧＦＰ免疫細胞化学的検査は、１０μmの脊髄凍結切片で行なった。簡潔には、脊髄切片を、ＰＢＳ中０.２％Tween20（ｐＨ７.４）を用いて透過処理し、５％ヤギ血清を用いて遮断し、ポリクローナル抗体ＡＢ３０８０：ＧＦＰ（Chemicon、１：５０）と共に二晩４℃でインキュベートし、ビオチニル化ヤギ抗ウサギ抗体と共にインキュベートした。ジアミノベンジジン基質のペルオキシダーゼを使用することにより、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ複合体と共にインキュベートした後に免疫標識が明らかになった。切片を、ヘマトキシリンを用いて対比染色した。

運動ニューロンのコリンアセチルトランスフェラーゼを、コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）ヤギポリクローナルＣｈＡＴ抗体（ＡＢ１４４Ｐ、Chemicon、フランス、１：１００）を用いて標識した。簡潔には、脊髄切片を、１％ウサギ血清のＰＢＳ/Ｔ×１０００.４％溶液中で遮断し、一次抗体と共に一晩室温でインキュベートし、ビオチニル化ウサギ抗ヤギ抗体と共にインキュベートした。免疫標識は、ストレプトアビジンアレクサ５５５蛍光と共にインキュベートした後に明らかとなり、切片を、共焦点顕微鏡下で観察するためにMowiol媒体（Calbiochem, USA）を加えてカバーガラスをかけた。

レーザー共焦点走査顕微鏡
ＧＦＰの発現及び免疫細胞化学的検査は、４８８nm（緑）及び５４３nm（赤）でそれぞれ単色光線を放出するブルーアルゴンイオンレーザー及びヘリウムネオンレーザーを備えた、倒立ニコンＴＥ−２０００レーザー走査共焦点顕微鏡を用いて観察した。スライドを、油浸２０倍の対物レンズを使用して連続的に走査した。各画像を別々のチャネルで記録し（ＧＦＰではチャネル緑で、ストレプトアビジン５５５ではチャネル赤）、同所に局在する蛍光シグナルの検出が可能となるように重層させた。

実施例１．ｍＳＥＡＰ発現ＡＡＶベクターの新生仔マウスの筋肉内への注入
我々は初めに、血清型１及び９ｓｓ−又はｓｃＡＡＶベクターが、筋肉内注入後にＣＮＳ細胞を形質導入できるかについて評価した。サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター下のマウス分泌アルカリホスファターゼ（ｍＳＥＡＰ）をコードするｓｓＡＡＶ１、ｓｓＡＡＶ９、ｓｃＡＡＶ１、又はｓｃＡＡＶ９を、１日令のＣ５７Ｂｌ６マウスの三頭筋及び腓腹筋の両方に注入した（マウス１匹あたり８×１０^９〜２×１０^１０個のウイルスゲノム、１群あたり３匹のマウス）。注入された筋肉、脳、及び脊髄組織を、注入から１日後、３日後、又は７日後に取り出し、組織化学的検査を使用してｍＳＥＡＰ発現について解析した。

ｍＳＥＡＰ発現は、ｓｓＡＡＶ９以外の、各ＡＡＶ血清型の注入から３日後及び７日後に、注入された筋肉において検出され、発現レベルは時間と共に劇的に増加した（図１ａ）。ＣＮＳでは、導入遺伝子の発現は、ｓｃＡＡＶ９の筋肉内注入後のみで検出された。興味深いことに、ｍＳＥＡＰの発現は、脳脊髄液（ＣＳＦ）において多くのタンパク質及び毒素の分泌及び排除に重要な役割を果たしている（Redzic, 2005）、脈絡叢の上皮細胞において検出された（図１ｂ）。脈絡叢におけるｍＳＥＡＰ発現は、注入から早くも３日後（ＰＮ４）に見出され、発現レベルはここでも時間と共に増加した。ｓｃＡＡＶ９ベクターの筋肉内注入後、弱い導入遺伝子の発現もまた、脳血管中又は脳血管周辺及び脊髄に位置していた（図１ｃ）。

実施例２．ｍＳＥＡＰ発現ＡＡＶベクターの新生仔マウスの腹腔内への注入
我々は、その後、ｓｓＡＡＶ１、ｓｓＡＡＶ９、ｓｃＡＡＶ１、及びｓｃＡＡＶ９の、１日令のＣ５７Ｂｌ６マウスの腹腔内への投与（１００μl、マウス１匹あたり３×１０^１０〜１×１０^１１個のウイルスゲノム）により、注入から１日後、３日後、又は７日後にＣＮＳにおいて導入遺伝子の発現が媒介され得るかどうかを解析した。

低いレベルのｍＳＥＡＰ発現が、ｓｓＡＡＶ１を注入したマウスの横隔膜筋線維において、注入から３日後までに検出され、これは、ｓｃＡＡＶ１で観察されたものと類似しており（図２ａ）、注入から７日後の両方のベクターで観察されたものとも類似していた（図２ａ）。ｓｓＡＡＶ９は、注入から２１日後のみにおいて、いくつかの筋肉線維を形質導入したが、一方、ｓｃＡＡＶ９を使用した場合、注入から３日後の横隔膜において強力なｍＳＥＡＰ染色が判明した（図２ａ）。この高レベルの形質導入は、上腕三頭筋及び腓腹筋などの他の筋肉においても観察された（データは提示せず）。

脈絡叢及び上衣の上皮細胞は、ｓｃＡＡＶ９の注入後に明瞭に標識されたようであった（図２ｂ）。注入から７日後にこれらの領域において頑強な形質導入が更に観察された（図２ｂ）。導入遺伝子の発現は、注入から７日後に脳及び脊髄全体の両方における髄膜及び血管内に観察され、筋肉内注入後に観察されたものよりも高かった（図２ｃ）。興味深いことに、ｍＳＥＡＰ発現はまた、脳及び脊髄中のいくつかの神経細胞にも検出された（図２ｄ）。共に合わせて考えると、これらの結果により、ｍＳＥＡＰタンパク質を発現する、筋肉内又は腹腔内注入されたｓｃＡＡＶ９ベクターは、ＣＮＳ、特に脈絡叢及び上衣の上皮細胞を効率的にターゲティングできることが示される。

実施例３．ｓｃＡＡＶ９−ＧＦＰの新生仔マウスの筋肉内又は腹腔内注入後のＣＮＳにおける導入遺伝子の発現
ｍＳＥＡＰは分泌されたタンパク質であるので、ＡＡＶの末梢注入後にＣＮＳにおいて観察された導入遺伝子発現は、ＡＡＶ細胞形質導入からではなくむしろ、タンパク質経細胞輸送から生じた可能性があった。それ故、我々は、分泌されないタンパク質を使用して類似の結果を得ることができるかどうかを確かめた。

「緑蛍光タンパク質」（ＧＦＰ）を発現している組換えｓｃＡＡＶ９ベクターを、新生仔マウスの腹腔内（マウス１匹あたり３×１０^１０個のウイルスゲノム、１００μl）又は筋肉内（マウス１匹あたり、２０μl中８×１０^９個のウイルスゲノム、１つの筋肉あたり５μl）に注入した。７日後、ｓｃＡＡＶ９−ｍＳＥＡＰで観察されたのと同様に、ＧＦＰの発現は、脳室に位置する脈絡叢及び上衣細胞において観察された（図３ａ及び図４ａ）。更に、我々は、この場合、いくつかの脳領域における多くのＧＦＰ陽性神経細胞が、特に、脳室の近くに位置することを見出した。海馬中の細胞体及び線維（図３ｂ）、中隔（図４ｂ、ｃ）、及び嗅内皮質（図３ｃ、図４ｄ〜ｅ）が効率的に形質導入されたようであった。

重要なことには、ＧＦＰ発現は、ＡＡＶ投与から７日後に脊髄細胞（運動ニューロン様の表現型を有する細胞を含む）において検出された（図３ｄ、ｅ）。強力なＧＦＰ発現がまた、頸髄準位で横断する皮質脊髄路の線維にも見出された（図３ｆ及び４ｈ）。これらの線維の形質導入は、上位運動ニューロン（その細胞体は運動皮質に位置し、これもＧＦＰ免疫陽性のようであった）へのターゲティングから生じたようである（図３ｄ）。全般的に、多数のＧＦＰ免疫陽性細胞が、筋肉内注入後よりも腹腔内注入後にＣＮＳにおいて検出され、これは、注入経路間の効力の差、又は、腹腔内手順で使用されたベクターが高い力価であったことに起因していた。

実施例４．ＧＦＰ発現ｓｃＡＡＶ９の新生仔マウスの静脈内への注入後のＣＮＳにおける導入遺伝子の発現
組換えｓｃＡＡＶ９ベクターは、筋肉内又は腹腔内送達後にＣＮＳ細胞形質導入を媒介する上で最も効率的なベクターであるように思われたので、我々は、静脈内投与経路を使用することによりこのベクターを改善することができるかどうかを評価した。

従って、ＧＦＰ発現ｓｃＡＡＶ９ベクターを、１日令のＣ５７Ｂｌ６マウスの側頭静脈に注入し（５０μl、マウス１匹あたり１.５×１０^１０個のウイルスゲノム）、ＣＮＳ組織を取り出し、その７日後に免疫染色のために加工した。強力なＧＦＰ発現が、脈絡叢及び上衣細胞の両方（図５ａ）及び脳血管（図５ｃ）において検出された。ここでも、我々は、脳全体におよぶニューロン様及びグリア様表現型の両方の細胞内に、特に嗅内皮質（図５ｄ）及び海馬（図５ｅ、ｆ）においてＧＦＰ発現を見出した。

非常に高いレベルの導入遺伝子発現が、脊髄全体に（頸髄セグメントから腰髄セグメントにかけて）、運動ニューロン様表現型及び位置（腹側脊髄）を有する細胞において見られた（図５ｈ〜ｉ）。これはおそらく、ベクターが、血管を通して血液循環から脳実質へと拡散、又は／及び、上位ＣＮＳ領域からの軸索順行輸送により拡散することから生じる。

その後、我々は、ｓｓＡＡＶ９もまたＢＢＢを通過し、静脈内送達後にＣＮＳ細胞を形質導入できるかどうか、又は、この特性が二本鎖ゲノムに特異的であるかどうかを決定する。この目的では、ＧＦＰ発現ｓｓＡＡＶ９ベクターを、新生仔マウスの側頭静脈に注入し、ＧＦＰ発現を３週間後（ゲノムが二本鎖ＤＮＡへと変換されるように）に解析した。
ｓｃＡＡＶ９で観察されたのと同じように、ｓｓＡＡＶ９−ＧＦＰは、静脈内送達後にＣＮＳ細胞の形質導入を媒介することが判明したが、その効力は、ｓｃＡＡＶ９の効力よりも低かった。ここでも、脈絡叢及び上衣細胞が大量のＧＦＰを発現し、脳室に近い多くの脳領域が形質導入されたことが判明した（図６ａ）。例えば、ＧＦＰ陽性ニューロンは、海馬及び手綱核（図６ａ）並びに正中隆起（図６ｂ）において検出された。興味深いことに、いくつかの運動ニューロン様細胞は、腹側脊髄においてＧＦＰを発現することが判明した（図６ｃ〜ｅ）。数個のＣＮＳ細胞もまた、組換えｓｓＡＡＶ９の筋肉内又は腹腔内送達後にＧＦＰを発現することが判明した（データは提示せず）。

共に合わせて考えると、これらのデータにより、血清型９ＡＡＶベクター（通常形態又は自己相補性形態）が、新生仔マウスへの１回の静脈内注入後に、ＢＢＢを通過し、新生仔マウスにおけるＣＮＳ細胞（下位運動ニューロンを含む）を形質導入することができるという予期せぬ能力が示唆される。

実施例５．成体マウスにおけるｓｓ及びｓｃＡＡＶ９ベクターの静脈内注入
ＢＢＢは新生仔マウスにおいて不完全に形成されているので、我々は、ＡＡＶ９ベクターが新生仔マウスの神経細胞を形質導入する能力が、成体マウスでも保存されているかどうかを評価した。ｍＳＥＡＰをコードするｓｓ及びｓｃＡＡＶベクター（マウス１匹あたり、３×１０^１１個又は１×１０^１２個のウイルスゲノム）を成体マウスの尾静脈に注入し、ＣＮＳにおける導入遺伝子の発現を、その４週間後に解析した。ｓｃＡＡＶ９−ｍＳＥＡＰの静脈内送達後、導入遺伝子の発現持続が、多くの脳領域、例えば正中隆起（図７ｆ）、海馬（図７ｇ）、又は脳梁（図７ｈ）において見られた。

重要なことは、組換え血清型９ＡＡＶベクターの静脈内送達後に、脊髄全体を通じて多くのｍＳＥＡＰ陽性の細胞及び線維が存在していたことであった（図８ａ〜ｇ）。ここでも、従来のｓｓＡＡＶ９ベクターを用いた場合よりも、ｓｃＡＡＶ９ベクターを使用した場合の方が、より高いレベルの導入遺伝子発現が観察された（図８ａ、ｂ対８ｃ〜ｇ）。

ｓｃＡＡＶ９−ＧＦＰを使用した類似の注入により、脊髄への全身からの遺伝子の送達における、ｓｃＡＡＶ９の優位性が実証された。２×１０^１２個のウイルスゲノムのｓｃＡＡＶ９の静脈内注入から４週間後に多くが発現することが判明し、ＧＦＰは、脊髄の神経細胞及びグリア細胞の両方において発現しており、これはアストロサイトのマーカーであるグリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）の免疫染色を使用して実証された（図１１）。

従って、我々の結果により、ＢＢＢが完全に形成されている成体マウスへの組換えＡＡＶ９ベクターの静脈内送達後における、ＣＮＳ細胞（下位運動ニューロン及びグリア細胞を含む）の効率的な形質導入が示される。これは、これらのベクターが、血液循環からＢＢＢを通ってＣＮＳ実質へと通過し、神経細胞への広範囲におよぶ遺伝子導入を達成するという特異な特性を強調するものである。

実施例６．大型動物モデルにおけるＡＡＶ９−ＧＦＰの静脈内注入
大型動物モデルにおけるこの新規なＣＮＳ遺伝子導入戦略の検証は、ヒトへの臨床応用に必須である。我々は、組換えｓｃＡＡＶ９ベクターの静脈内送達後に、ＬＩＸ−１ネコの脊髄における導入遺伝子の発現を評価した。２日令のネコ（１匹はホモ接合型、１匹はヘテロ接合型）の頸静脈に、ＧＦＰ発現ｓｃＡＡＶ９を注入した。１０日後、脊髄組織切片を、レーザー走査共焦点顕微鏡を使用してＧＦＰ発現について解析した。強力なＧＦＰシグナルが、脊髄に沿って頸部から馬尾までの灰白質及び白質の両方において観察され、発現パターンは、ヘテロ接合型動物及び罹患動物の両方において類似していたようであった。薄束及び楔状背側感覚路の神経線維は、高レベルのＧＦＰを発現していた（図９ａ）。更に、ＧＦＰ発現は、ＧＦＰの蛍光（図９ａ、ｃ）及び免疫組織化学的解析（図９ｂ〜ｄ）の両方の観察後に、腹側脊髄の多くの細胞体で検出された。ＧＦＰに対する抗体及びコリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）を使用した二重免疫染色解析により、ＳＭＡ罹患ネコ及び非罹患ネコの両方において、ＧＦＰ陽性部分のかなりの部分が、運動ニューロンであることが示された（図１０）。

Claims

対象の遺伝子を含むＡＡＶベクターの被験体への末梢投与により該遺伝子を運動ニューロン又はグリア細胞に送達するための医薬品の製造のための該遺伝子を含むＡＡＶベクターの使用であって、該ＡＡＶベクターは二本鎖自己相補性ＡＡＶベクターである、該使用。
対象の遺伝子を含むＡＡＶベクターの被験体への末梢投与により該遺伝子を脊髄に送達するための医薬品の製造のための該遺伝子を含むＡＡＶベクターの使用であって、該ＡＡＶベクターは二本鎖自己相補性ＡＡＶベクターである、該使用。
被験体における運動ニューロン障害を処置するための医薬品の製造のための治療遺伝子を含むＡＡＶベクターの使用であって、該ＡＡＶベクターは、該被験体への末梢注入により投与され、該投与により、運動ニューロン又はグリア細胞の感染と、運動ニューロン又はグリア細胞における該遺伝子の発現が引き起こされ、該ＡＡＶベクターは、二本鎖自己相補性ＡＡＶベクターである、該使用。
ＡＡＶベクターを末梢注入することにより被験体の運動ニューロンにおいて治療タンパク質又はＲＮＡを産生するための医薬品の製造のための該ＡＡＶベクターの使用であって、該ＡＡＶベクターは二本鎖自己相補性ＡＡＶベクターである、該使用。
末梢注入には、腹腔内（i.p.）、筋肉内（i.m.）又は静脈内（i.v.）注入、好ましくは静脈内注入が含まれる、請求項１〜４のいずれか１項記載の使用。
該ＡＡＶベクターは、ヒト血清型ＡＡＶベクター、好ましくは、血清型３、４、５、６、７、８、９、１０及び１１から選択され、より好ましくはＡＡＶ６、ＡＡＶ８、及びＡＡＶ９から選択され、最も好ましくはＡＡＶ９である、請求項１〜５のいずれか１項記載の使用。
ＡＡＶベクターは、偽型ＡＡＶベクター、好ましくはＡＡＶ２／９ベクターである、請求項１〜６のいずれか１項記載の使用。
ＡＡＶベクターは、機能的Ｒｅｐ及びＣａｐコードウイルス配列を欠損した複製欠損ＡＡＶゲノムを含む、請求項１〜７のいずれか１項記載の使用。
ＡＡＶベクターは、偽型であり得るｓｃＡＡＶ９である、請求項１〜８のいずれか１項記載の使用。
遺伝子は、治療ＲＮＡ、又は、成長因子、サイトカイン、ホルモン、神経伝達物質、酵素、抗アポトーシス因子、血管新生因子、「運動ニューロンの生存」タンパク質（ＳＭＮ）などの病的疾患において突然変異していることが知られている任意のタンパク質から選択された治療タンパク質をコードする、請求項１〜９のいずれか１項記載の使用。
疾患は、神経変性疾病、神経筋疾病、疼痛、リソソーム病、外傷、骨髄損傷、神経系の癌、脱髄疾病、神経系の自己免疫疾病、神経毒性症候群、睡眠障害から選択される、請求項１〜１０のいずれか１項記載の使用。
ベクターにおける治療タンパク質の発現は、遍在的な、調節された、及び／又は組織特異的なプロモーターにより制御される、請求項１〜１１のいずれか１項記載の使用。