CN115708866A - 骨源因子rankl在制备调控中枢神经系统稳态的药物或药物组合物中的应用 - Google Patents

骨源因子rankl在制备调控中枢神经系统稳态的药物或药物组合物中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN115708866A
CN115708866A CN202110966854.5A CN202110966854A CN115708866A CN 115708866 A CN115708866 A CN 115708866A CN 202110966854 A CN202110966854 A CN 202110966854A CN 115708866 A CN115708866 A CN 115708866A
Authority
CN
China
Prior art keywords
rankl
bone
central nervous
nervous system
medicine
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202110966854.5A
Other languages
English (en)
Inventor
杨帆
高大双
邵杰
刘运辉
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shenzhen Institute of Advanced Technology of CAS
Original Assignee
Shenzhen Institute of Advanced Technology of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shenzhen Institute of Advanced Technology of CAS filed Critical Shenzhen Institute of Advanced Technology of CAS
Priority to CN202110966854.5A priority Critical patent/CN115708866A/zh
Priority to PCT/CN2021/137976 priority patent/WO2023024339A1/zh
Publication of CN115708866A publication Critical patent/CN115708866A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/55—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having seven-membered rings, e.g. azelastine, pentylenetetrazole
    • A61K31/551—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having seven-membered rings, e.g. azelastine, pentylenetetrazole having two nitrogen atoms, e.g. dilazep
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/22—Anxiolytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/24—Antidepressants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明提供了一种骨源因子RANKL在制备调控中枢神经系统稳态的药物或药物组合物中的应用。本发明通过转基因动物、在体光学成像、脑片电生理、光遗传及药物遗传学、神经示踪技术和外周代谢分析等一系列手段，系统性研究骨源因子RANKL对中枢神经系统在中枢神经系统中的靶点和作用机制，深入解析骨源因子RANKL‑RANK相关通路参与调控神经活动的神经分子机制，发现骨源因子RANKL对脑稳态维持和脑高级功能的正常行使具有重要调控作用。

Description

骨源因子RANKL在制备调控中枢神经系统稳态的药物或药物 组合物中的应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种调控中枢神经系统稳态的药物或药物组合物，尤其涉及骨源因子RANKL在制备调控中枢神经系统稳态的药物或药物组合物中的应用。
背景技术
骨科学领域中，RANKL-RANK通路在正常的骨重建过程中起到核心调节作用，是极其重要的骨重塑调节因子，RANK(TNFRSF11A)和RANKL(TNFSF11)是TNF受体超家族的受体-配体对，被确定为破骨细胞发育和骨代谢的关键调节因子。
骨源因子RANKL也被称为TNFSF11、TRANCE、OPGL和ODF，主要在骨、淋巴组织、基质细胞和活化的T淋巴细胞中表达。RANKL最初被认为是T细胞产生的一种细胞因子，在调节T细胞依赖性的免疫反应中发挥着重要作用，是T细胞与树突状细胞相互作用的重要调控因子。在骨代谢方面RANKL扮演着相当重要的角色，是破骨细胞的形成、融合、激活和生存过程中必不可少的因子。RANKL主要由成骨细胞产生，通过与破骨细胞膜上的RANK受体结合，促进破骨细胞成熟，加速破骨细胞骨吸收和重塑，RANKL-RANK通路为骨质更新的重要一环。
RANKL-RANK通路在维持骨代谢和免疫调节中发挥重要作用，如果机体产生过多的RANKL，会引发各种骨骼疾病，如类风湿性关节炎、骨质疏松等。类风湿性关节炎是一种自身免疫性、系统性的慢性炎症性多关节炎，其发病机制为免疫细胞攻击关节腔引起关节炎症，其中，滑膜细胞和活化的T细胞表达RANKL导致骨量减少是本病的特点，同时，类风湿性关节炎还伴随各种细胞因子升高，如IL1和IL17等。因此，RANK是目前治疗骨质疏松和类风湿的重要靶点。
目前，类风湿性关节炎药物治疗主要包括非甾类抗炎药、慢作用抗风湿药、免疫抑制剂、免疫和生物制剂及植物药等。其中，非甾类抗炎药有抗炎、止痛、解热作用，是类风湿关节炎治疗中最为常用的药物，包括双氯芬酸、萘丁美酮、美洛昔康、塞来昔布等。抗风湿药(DMARDs)又被称为二线药物或慢作用抗风湿药物，常用的有甲氨蝶呤、柳氮磺吡啶、羟氯喹、来氟米特、环孢素、金诺芬、白芍总苷等。此外，目前在类风湿关节炎的治疗上已经有几种生物制剂被批准上市，如英利昔单抗、TNF-α嵌合性单克隆抗体、依那西普人重组TNF受体p75和IgGFc段的融合蛋白等，具有一定的疗效，尤其在难治性类风湿关节炎的治疗中发挥了重要作用。
化学遗传学(Chemical genetics)调控技术是近几年快速发展的一种新兴技术，其原理是通过将不同的G蛋白偶联受体进行改造成为DREADDS(Designer ReceptorExclusively Activated by Designer Drugs)后，其只接受外源性的配体的信号，并激活相应的GPCR信号通路，从而引发细胞不同的兴奋性变化。只由特定药物激活的受体，例如由叠氮平-N-氧化物(clozapine-N-oxide，CNO)激活的DREADDs，选择性地作用于不同的GPCR级联反应，包括激活Gq、Gi、Gs、Golf和β-arrestin等，其中应用最广泛的是Gq-DREADD和Gi-DREADD。因此，将DREADDS应用于神经细胞内，会进一步引起钠离子通道、钙离子通道的打开或关闭，从而诱发神经细胞膜电位的变化。
RANKL作为与引发骨丢失相关的细胞因子，人们对RANKL在机体稳态维持研究还不够深入，目前尚未有关于RANKL对中枢神经系统调节机制的研究。深入研究RANKL等骨源因子，对基础研究和生物医药研发都具有重大意义。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种骨源因子RANKL在制备调控中枢神经系统稳态的药物或药物组合物中的应用。本发明中通过研究，将RANKL及受体的作用扩展到中枢神经系统，为研发治疗自身免疫疾病伴发的精神性疾病和骨质疏松药物提供一种新的思路。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种骨源因子RANKL在制备调控中枢神经系统稳态的药物或药物组合物中的应用。
本发明中，发明人发现，类风湿性关节炎等骨病的患者伴发某些精神疾病的患病率增加，在此基础上，发明人通过转基因动物、在体光学成像、脑片电生理、光遗传及药物遗传学、神经示踪技术和外周代谢分析等一系列手段，系统性研究骨源因子RANKL在中枢神经系统中的靶点和作用机制，深入解析骨源因子RANKL-RANK相关通路参与调控神经活动的神经分子机制，发现骨源因子RANKL能对脑稳态维持和脑高级功能的正常行使有重要调控作用。
本发明将RANKL及受体作用扩展到中枢神经系统，证明RANKL及受体可作为治疗自身免疫疾病伴发的精神性疾病和骨质疏松药物开发和作用的潜在靶点。
作为本发明优选的技术方案，所述药物组合物还包括细胞标记物。
优选地，所述细胞标记物包括小胶质细胞标记物、神经胶质细胞标记物、血管内皮细胞标记物、抑制性神经元标记物或兴奋性神经元标记物。
优选地，所述细胞标记物包括IBA-1抗体、CD31抗体、神经胶质纤维酸性蛋白、抑制性神经元标记物GABA或兴奋性神经元标记物vGlut2。
本发明中，通过与不同标记物的联合使用，例如，采用神经元标记物vGlut2标记兴奋性神经元、采用抑制性神经元标记物GABA标记抑制性神经元，采用IBA-1标记小胶质细胞，采用GFAP标记神经胶质细胞，采用CD31标记血管内皮细胞，实现RANKL的定位分析；由分析结果可知，骨源因子RANKL在脑内结合的目标细胞类型主要为GABA能神经元和小胶质细胞。
作为本发明优选的技术方案，所述药物组合物可以是包括骨源因子RANKL和小胶质细胞标记物IBA-1抗体的组合物，作用于中枢神经系统的小胶质细胞。
作为本发明优选的技术方案，所述药物组合物也可以是包括骨源因子RANKL和抑制性神经元标记物GABA的组合物，作用于中枢神经系统的GABA能神经元。
优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的辅料。
作为本发明优选的技术方案，所述药物或药物组合物为调控中枢神经系统中NTS区域稳态的药物或药物组合物。
本发明主要研究了骨源因子RANKL在NTS区的作用，但是其作用的目标脑区并不局限于NTS区，还包括ARC、PVT等脑区。
优选地，所述药物或药物组合物为调控中枢神经系统中GABA能神经元和/或小胶质细胞稳态的药物或药物组合物。
本发明中，所述骨源因子RANKL能够用于制备标记或调控中枢神经系统中GABA能神经元和/或小胶质细胞的药物或药物组合物。
第二方面，本发明提供一种骨源因子RANKL在制备降低GABA能神经元膜电位的药物或药物组合物中的应用。
优选为，在制备降低NTS区GABA能神经元膜电位的药物或药物组合物中的应用。
本发明中，根据膜片钳记录结果可知，RANKL作用于NTS区域，抑制NTS内的GABA能神经元，使其超极化，且通过GABA-A抑制剂可知，RANKL导致的超极化膜电位下降是通过GABA-A受体氯离子通道引起的。
第三方面，本发明中提供一种骨源因子RANKL、包含所述骨源因子RANKL的药物或药物组合物在制备外周骨代谢调控系统、制备治疗骨质疏松的药物或制备治疗抑郁焦虑的药物中的应用。
第四方面，本发明中还提供一种外周骨代谢调控系统，所述外周骨代谢调控系统包括骨源因子RANKL。
所述外周骨代谢调控系统的受体包括RANK受体。
作为本发明优选的技术方案，所述外周骨代谢调控系统还包括氯氮平氮氧化物和药物遗传病毒载体。
优选地，所述药物遗传病毒载体包括药物遗传学调控元件hM3Dq。
第五方面，本发明提供一种非疾病的诊断和治疗目的的、利用中枢神经系统增加外周骨密度的方法，所述方法包括：
利用骨源因子RANKL、氮平氮氧化物和药物遗传病毒载体调控中枢神经系统内NTS脑区GABA神经元兴奋性，所述NTS脑区内GABA神经元与RVL内TH神经元投射联系，进而增加外周骨密度。
本发明中，通过光基因调控技术和药物遗传学技术解析RANKL相关神经环路的功能特征，探讨负责高级脑功能如焦虑抑郁脑区同RANKL-RANKL相关通路的相互作用和神经机制。通过实验结果可知，NTS内GABA神经元与RVL内TH神经元投射联系。
通过药物遗传学手段调节目标脑区内神经元兴奋度，从而实现靶向性，持续性调控表达RANK受体神经元，对外周骨代谢进行检测，阐明中枢内RANK阳性神经对骨代谢调控机制。
本发明中，所述增加外周骨密度的方法不仅能够用于治疗骨质疏松，还能用于科学研究，例如，制备骨质疏松动物模型等用途，并不仅仅局限于疾病的治疗方面。
需要注意的是，本发明中所用英文简称对应的中文释义如下：
RANKL，Receptor Activator of Nuclear Factor-κB Ligand，NF-κB受体活化因子配体；
RANK，Receptor activator of Nuclear Factor-κB，NF-κB受体激活蛋白；
NTS，Solitary nucleus，孤束核；
ARC，Arcuate nucleus，弓状核；
SFO，subfornical organ，穹窿下器官；
Cortex，皮层；
Hippocampus-CA3，海马CA3脑区；
BLA，basolateral amygdala，基底外侧杏仁核；
PVN，Paraventricular nucleus，室旁核；
CNO，Clozapine-N-oxide，叠氮平-N-氧化物；
其余未注明的简写或英文标记均为本领域技术人员知晓的常规释义。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明探讨了RANKL在中枢神经系统中的作用靶点和作用机制，研究了RANKL-RANK相关通路参与调控神经元活动的神经分子机制；同时，本发明中还利用药物遗传学和光遗传学神经调控工具调控RANKL目标神经元兴奋度从而改变外周骨代谢，从而建立了一种利用中枢神经系统调节骨代谢的系统和方法；
(2)本发明中将外源性RANKL注射在脑内后研究其分布情况，并且发现，外源性RANKL与GABA能神经元和小胶质细胞结合，RANKL作用于中枢神经系统的脑区，包括孤束核、弓状核、穹窿下器官；RANK主要的分布脑区主要为皮层、孤束核NTS、弓状核ARC，海马CA3脑区，基底外侧杏仁核等脑区；并且，RANKL作用于脑内RANK受体阳性神经元，通过GABA-A受体氯离子通道引起RANK受体阳性神经元超极化；因此，RANK阳性神经元可作为RANKL及其相关药物发挥作用的靶点；
(3)本发明中还发现NTS内GABA神经元与RVL内TH神经元投射联系，利用药物遗传学调高NTS脑区GABA神经元活性会导致骨密度增加，因此，包括NTS脑区在内的脑内区域中，RANK受体神经元可作为增加外周骨代谢的中枢调控靶点。
附图说明
图1为实施例1中利用免疫组织化学染色研究RANKL-FC在脑内的分布位置的结果图，其中II图(标尺20μm)为I图中方框区域的局部放大图。
图2为实施例1中采用不同神经元标记物标记后获得的标记结果图(标尺20μm)；其中，I图为GABA标记，II图为GFAP标记，III图为IBA-1标记。
图3为实施例2中骨源因子RNNKL的受体RANK在脑内不同区域(包括Hippocampus-CA3、VHM、BLA、NTS、LHB和Cortex)中的分布图。
图4为实施例3中在外周骨髓腔内注射伪狂犬病毒PRV-GFP后在NTS区观察到的PRV分布图，其中II图(标尺50μm)为I图(标尺100μm)中方框区域的局部放大图。
图5为实施例3中在NTS脑区内标记RANK受体阳性神经元、在外周骨髓腔内注射PRV病毒后，在NTS区观察到的RANK和PRV的分布图，其中I图标尺为100μm，II图标尺为50μm。
图6为实施例3中NTS内神经元末梢投射到RVLM后RANK和PRV的分布图。
图7A为实施例4中不同组(包括GABAergic实验组、non-GABAergic对照组和RNAi空白对照组)的膜片钳电生理记录数据图。
图7B为实施例4中不同组(包括GABAergic实验组、non-GABAergic对照组和RNAi空白对照组)的膜片钳电生理数据统计图。
图7C为实施例4中利用GABA-A受体的阻断剂Bicu后不同实验组的膜片钳电生理记录数据图。
图7D为实施例4中利用GABA-A受体的阻断剂Bicu后不同实验组的膜片钳电生理数据统计图。
图8A为实施例5中GAD67小鼠NTS脑区注射AAV9-DIO-mCherry后的切片观察结果图，其中I图为NTS脑区，II图为RVL脑区。
图8B为实施例5中TH-Cre小鼠RVL内注射AAV9-EF1α-DIO-RVG、AAV9-EF1α-DIO-EGFP-TVA和RV-ΔG-dsRed后，RVLM脑区的切片观察结果图(标尺100μm)。
图8C为实施例5中中TH-Cre小鼠RVL内注射AAV9-EF1α-DIO-RVG、AAV9-EF1α-DIO-EGFP-TVA和RV-ΔG-dsRed后NTS脑区的切片观察结果图，其中I图标尺为标尺100μm，II图标尺为标尺50μm。
图8D为实施例5中TH-Cre小鼠RVL内注射AAV9-EF1α-DIO-RVG、AAV9-EF1α-DIO-EGFP-TVA和RV-ΔG-dsRed后NTS脑区GABA能神经元的切片观察结果图，其中II图(标尺20μm)为I图(标尺50μm)中方框区域的局部放大图。
图9A为实施例6中对照组和实验组在注射遗传载体AAV2/9-DIO-hM3Dq后的大脑切片对比图。
图9B为实施例6中实验组注射CNO后NTS脑区内的GABA神经元的电位变化图。
图9C为实施例6中对照组和实验组Micro-CT扫描股骨远端松质骨三维重构图。
图9D为实施例6中对照组和实验组的骨密度(BMD)和骨组织比例(BV/TV)统计图，其中I图为骨密度统计图，II图为骨组织比例统计图。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。
以下实施例中，若无特殊说明，所用试剂及耗材均购自本领域常规试剂厂商；若无特殊说明，所用实验方法和技术手段均为本领域常规的方法和手段。
以下实施例中，深入探讨骨源因子RANKL对中枢神经回路调控的目标脑区及其神经元类型，通过膜片钳技术解析RANKL对神经元调控的神经分子机制，从而阐述中枢神经系统作为RANKL作用的靶点和作用机制，阐述中枢神经系统作为RANKL相关药物开发的相关物理基础和作用机制。
实施例1外源RANKL标记蛋白在脑内分布
(1)本实施例中，将带有标记的外源RANKL-FC蛋白0.1μg注射至小鼠体内，30分钟后牺牲小鼠，对FC标签进行抗体染色，取脑，示踪RANKL蛋白在脑内的分布位置与目标神经元类型。
脑组织进行冰冻切片后，利用免疫组织化学染色，显示RANKL-FC在脑内分布位置，通过分析发现RANKL作用的目标脑区主要为ARC、NTS、PVT等。
其中，所得NTS区域的结果如图1所示，其中II图为I图中方框区域的局部放大图。
(2)采用神经元标记物vGlut2标记兴奋性神经元，采用抑制性神经元标记物GABA标记抑制性神经元，采用IBA-1标记小胶质细胞，采用GFAP标记神经胶质细胞，采用CD31标记血管内皮细胞，从而与外源RANKL进行共定位分析。
分析与外源注射带有FC标记的骨源因子RANKL共标细胞类型，揭示骨源因子RANKL在脑内结合的目标细胞类型。
所得NTS区域的结果如图2所示，其中，I图为GABA标记，II图为GFAP标记，III图为IBA-1标记；通过分析，初步发现RANKL-FC共标的细胞类型主要为GABA能神经元和小胶质细胞。
本实施例所得结果为：
RANKL作用的目标脑区主要为ARC、NTS、PVT等，RANKL-FC共标的细胞类型主要为GABA能神经元和小胶质细胞。
实施例2RANKL受体RANK于脑内表达分布解析
本实施例中，通过RANK-CRE小鼠与Ai14小鼠杂交，显示RNNKL受体RANK在脑内分布情况。
具体原理为：
通过RANK-CRE和Ai14转基因鼠杂交，得到双阳性子代F1；
F1子代中表达有受体RANK的阳性细胞会通过表达的Cre酶，作用于Rosa-CAG-LSL-tdTomato的Rosa位点，使表达受体RANK的细胞表达tdTomato红色荧光蛋白，受体RANK阳性细胞带有红色荧光标记，从而解析受体RANK在脑内表达分布情况。
本实施例利用免疫组化和原位杂交技术将神经细胞特异性标记物与tdTomato阳性神经元共定位，进一步解析RANK在中枢神经系统表达的细胞亚型。
所得结果如图3所示，通过组织切片分析后发现：
RANK主要的分布脑区主要为Hippocampus-CA3、VMH、BLA、NTS、LHB和皮层，实施例1与实施例2共同解析出RANKL受体RANK在中枢神经系统内分布情况，明确RANKL在中枢神经系统的靶点。
实施例3中枢神经系统内与骨相关神经元同时表达RANK受体
本实施例中，利用逆行跨突触的伪狂犬病毒PRV-GFP，在外周骨髓腔内注射PRV病毒1μL，病毒表达3天后，牺牲动物，收取组织样本，进行冰冻切片和免疫组织化学染色实验。
通过跨多级逆向PRV病毒示踪的方法研究骨骼系统通过神经末梢同特定脑区的解剖学联系，研究小鼠的NTS、ARC、室旁核、穹隆下器官内神经元同骨骼系统存在神经回路联系。
在NTS脑区通过注射AAV9-RANK-Cre(150nL)和AAV9-syn-DIO-mCherry(150nL)两种病毒，标记NTS脑区内RANK受体阳性神经元，并且，在外周骨髓腔内注射PRV病毒1μL，病毒表达3天后，牺牲动物，收取组织样本，进行冰冻切片和免疫组织化学染色实验。
如图4所示，在外周骨髓腔内注射伪狂犬病毒PRV-GFP后在NTS区观察到的PRV分布图，其中II图为I图中方框区域的局部放大图；
如图5所示，在外周骨髓腔内注射伪狂犬病毒PRV-GFP后在NTS区观察到的RANK受体阳性神经元分布图，其中II图为I图局部放大图；
由上述结果分析可知，在NTS脑区内，RANK阳性神经元与骨有直接联系，并且NTS内神经元末梢投射到RVLM(如图6所示)，并且，神经元末梢与PRV阳性神经元重叠，说明NTS内RANK阳性神经元与骨直接物理连接，并且NTS内RANK阳性神经元可投射到RVL脑区。
实施例4利用离体脑片膜片钳技术发现RANKL使NTS-GABA能神经元膜电位超极化
RANKL对神经元电生理特征的影响
通过离体灌注骨源因子RANKL(10ng/L)，分析RANKL对中枢神经系统中已发现的NTS、RVL等脑区对不同类型神经元进行膜片钳电生理记录，分析膜电位，动作电位发放等参数；
所得结果如图7A～图7B所示：
其中，GABAergic实验组，即通过离体灌注骨源因子RANKL，同时使用GABA的实验组；non-GABAergic对照组，即通过离体灌注骨源因子RANKL，但是未使用GABA的实验组；RNAi空白对照组，即利用shRNA敲低NTS脑区内RANK受体；
通过分析后初步，发现RANKL骨源因子可使神经元膜电位超极化(膜电位降低3～7mV)；同时，发现当利用shRNA敲低NTS脑区内RANK受体，可使RANKL降低膜电位的现象消失，说明NTS脑区神经元表达的RANK受体是RANKL发挥作用所必须的。
当利用GABA-A受体的阻断剂Bicuculine(Bicu)，所得结果如图7C～图7D所示：
由图可知，阻断剂Bicuculine可以阻断RANKL引起的超极化现象，进一步说明RANKL导致的超极化膜电位下降是通过GABA-A受体氯离子通道引起的。
实施例5通过神经回路示踪手段研究NTS-RVL间神经回路联系
利用GAD67小鼠在NTS内注射AAV9-DIO-mCherry(150nL)，表达21天后，灌流牺牲动物，进行切片观察分析；
所得结果如图8A所示，图中虚线框内为能明显观察到荧光的区域，发现NTS(I图)内抑制性GABA神经元可投射到RVL脑区(II图)；
利用TH-Cre小鼠在RVL内注射AAV9-EF1α-DIO-RVG(150nL)和AAV9-EF1α-DIO-EGFP-TVA(150nL)，21天后，在RVL内注射RV-ΔG-dsRed；
所得结果如图8B、图8C和图8D所示，图中虚线框内为能明显观察到荧光的区域，Helper(TH)表示启动子的辅助病毒标记，发现RVL内TH神经元上游为NTS脑区，并且为抑制性GABA能神经元。
实施例6通过药物遗传学调控NTS脑区神经元干预脑稳态，进而影响外周骨密度
利用药物遗传学持续性作用的优势，利用GAD67-Cre小鼠，通过在NTS脑区注射药物遗传病毒载体，即兴奋性药物遗传载体AAV2/9-DIO-hM3Dq；
病毒表达3周后，腹腔每48小时一次注射CNO(1mg/kg)兴奋NTS脑区内的GABA神经元，持续给药4周后牺牲动物；
取样进行切片观察，并分析外周骨密度参数，所得结果如图9A～图9D所示；
其中，图9A为对照组和实验组在注射遗传载体AAV2/9-DIO-hM3Dq后的大脑切片对比图；
图9B为注射CNO后NTS脑区内的GABA神经元的电位变化；
图9C为对照组和实验组中使用Micro-CT扫描股骨远端松质骨后得到的三维重构图；
图9D为对照组和实验组的骨密度(BMD)(I图)和骨组织比例(BV/TV)(II图)对比，实验组中小鼠的外周骨密度和骨组织比例均明显高于对照组；
由上述结果可知，兴奋NTS脑区内GABA神经元可以增加外周骨密度。
本实施例为通过提高NTS脑区内GABA神经元兴奋性实现外周骨密度增加的环路提供了基础。
综上所述，本发明中提供一种细胞因子RANKL在制备调控中枢神经系统稳态的药物或药物组合物中的应用。所述细胞因子RANKL作用于中枢神经系统的脑区，包括有：孤束核、弓状核和穹窿下器官；RANKL通过GABA-A受体氯离子通道超极化RANK受体阳性神经元，因此，RANK阳性神经元可作为RANKL及其相关药物发挥作用的靶点。
同时，由于NTS内GABA神经元与RVL内TH神经元投射联系，RANK受体神经元作为增加外周骨代谢的中枢调控靶点，所以，细胞因子RANKL可作为调节中枢神经系统内NTS脑区神经元兴奋性的药物调节外周骨代谢，并且通过兴奋NTS脑区GABA神经元可增加外周骨密度。
申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.骨源因子RANKL在制备调控中枢神经系统稳态的药物或药物组合物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物组合物还包括细胞标记物；
优选地，所述细胞标记物包括小胶质细胞标记物、神经胶质细胞标记物、血管内皮细胞标记物、抑制性神经元标记物或兴奋性神经元标记物；
优选地，所述细胞标记物包括IBA-1抗体、CD31抗体、神经胶质纤维酸性蛋白、抑制性神经元标记物GABA或兴奋性神经元标记物vGlut2；
优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的辅料。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药物组合物包括骨源因子RANKL和小胶质细胞标记物IBA-1抗体，作用于中枢神经系统的小胶质细胞。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药物组合物包括骨源因子RANKL和抑制性神经元标记物GABA，作用于中枢神经系统的GABA能神经元。
5.根据权利要求1～4任一项所述的应用，其特征在于，所述药物或药物组合物包括调控中枢神经系统中NTS区域稳态的药物或药物组合物；
优选地，所述药物或药物组合物包括调控中枢神经系统中GABA能神经元和/或小胶质细胞稳态的药物或药物组合物。
6.骨源因子RANKL在制备降低GABA能神经元膜电位的药物或药物组合物中的应用；
优选为在制备降低NTS区GABA能神经元膜电位的药物或药物组合物中的应用。
7.骨源因子RANKL、包含所述骨源因子RANKL的药物或药物组合物在制备外周骨代谢调控系统、制备治疗骨质疏松的药物或制备治疗抑郁焦虑的药物中的应用。
8.一种外周骨代谢调控系统，其特征在于，所述外周骨代谢调控系统包括骨源因子RANKL；
所述外周骨代谢调控系统的受体包括RANK受体。
9.根据权利要求8所述的外周骨代谢调控系统，其特征在于，所述外周骨代谢调控系统还包括氯氮平氮氧化物和药物遗传病毒载体；
优选地，所述药物遗传病毒载体包括药物遗传学调控元件hM3Dq。
10.一种非疾病的诊断和治疗目的的、利用中枢神经系统增加外周骨密度的方法，其特征在于，所述方法包括：
利用骨源因子RANKL、氮平氮氧化物和药物遗传病毒载体调控中枢神经系统内NTS脑区GABA神经元兴奋性，所述NTS脑区内GABA神经元与RVL内TH神经元投射联系，进而增加外周骨密度。
CN202110966854.5A 2021-08-23 2021-08-23 骨源因子rankl在制备调控中枢神经系统稳态的药物或药物组合物中的应用 Pending CN115708866A (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110966854.5A CN115708866A (zh) 2021-08-23 2021-08-23 骨源因子rankl在制备调控中枢神经系统稳态的药物或药物组合物中的应用
PCT/CN2021/137976 WO2023024339A1 (zh) 2021-08-23 2021-12-14 骨源因子rankl在制备调控中枢神经系统稳态的药物或药物组合物中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110966854.5A CN115708866A (zh) 2021-08-23 2021-08-23 骨源因子rankl在制备调控中枢神经系统稳态的药物或药物组合物中的应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN115708866A true CN115708866A (zh) 2023-02-24

Family

ID=85230361

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110966854.5A Pending CN115708866A (zh) 2021-08-23 2021-08-23 骨源因子rankl在制备调控中枢神经系统稳态的药物或药物组合物中的应用

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN115708866A (zh)
WO (1) WO2023024339A1 (zh)

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002024229A1 (fr) * 2000-09-21 2002-03-28 Center For Advanced Science And Technology Incubation, Ltd. Methode de regulation de la formation d'osteoclastes
EP2058401A1 (en) * 2007-10-05 2009-05-13 Genethon Widespread gene delivery to motor neurons using peripheral injection of AAV vectors
CN101845098B (zh) * 2009-03-26 2015-07-01 中国人民解放军总医院 鼠rank/rankl胞外复合体的晶体,制备其的方法及其应用
US20160220639A1 (en) * 2013-09-11 2016-08-04 New York University Methods and compositions for treating bone diseases
CN107929753B (zh) * 2017-11-24 2020-02-07 深圳先进技术研究院 一种药物组合物及其应用
CN111388654A (zh) * 2020-05-22 2020-07-10 南通大学 治疗脊髓损伤的药物、药物试剂盒及方法

Also Published As

Publication number Publication date
WO2023024339A1 (zh) 2023-03-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Wang et al. Pharmaco-genetic therapeutics targeting parvalbumin neurons attenuate temporal lobe epilepsy
Barrientos et al. BDNF mRNA expression in rat hippocampus following contextual learning is blocked by intrahippocampal IL-1β administration
Bandler et al. Columnar organization in the midbrain periaqueductal gray and the integration of emotional expression
Espana et al. Wake-promoting and sleep-suppressing actions of hypocretin (orexin): basal forebrain sites of action
Wild et al. Antibodies to nerve growth factor reverse established tactile allodynia in rodent models of neuropathic pain without tolerance
Zhang et al. Orexin neurons in the hypothalamus mediate cardiorespiratory responses induced by disinhibition of the amygdala and bed nucleus of the stria terminalis
Bączyk et al. Synaptic restoration by cAMP/PKA drives activity-dependent neuroprotection to motoneurons in ALS
DE69821011T2 (de) Verfahren zur Modulierung der Neovaskularisierung und/oder des Wachstums kollateraler Arterien und/oder anderer Arterien aus bestehenden arteriolären Verbindungen
Gao et al. Activation of mGluR1 contributes to neuronal hyperexcitability in the rat anterior cingulate cortex via inhibition of HCN channels
Koliatsos et al. Axotomy as an experimental model of neuronal injury and cell death
Jiang et al. Insulin growth factor-1 (IGF-1) enhances hippocampal excitatory and seizure activity through IGF-1 receptor-mediated mechanisms in the epileptic brain
Jiang et al. Contribution of AMPA receptor-mediated LTD in LA/BLA-CeA pathway to comorbid aversive and depressive symptoms in neuropathic pain
Naik et al. Mechanism of seizure-induced retrograde amnesia
Song et al. CXCR4 antagonist AMD3100 suppresses the long-term abnormal structural changes of newborn neurons in the intraventricular kainic acid model of epilepsy
Oh et al. Overexpression of neurotrophin receptor p75 contributes to the excitotoxin-induced cholinergic neuronal death in rat basal forebrain
Bazaz et al. Oxytocin in dorsal hippocampus facilitates auditory fear memory extinction in rats
Liu et al. Sexual dimorphism of inputs to the lateral habenula in mice
Bhatt et al. Potentiating role of interleukin 2 (IL-2) receptors in the midbrain periaqueductal gray (PAG) upon defensive rage behavior in the cat: Role of neurokinin NK1 receptors
Zellinger et al. Impact of the erythropoietin-derived peptide mimetic Epotris on the histopathological consequences of status epilepticus
Massie et al. Extracellular GABA concentrations in area 17 of cat visual cortex during topographic map reorganization following binocular central retinal lesioning
CN115708866A (zh) 骨源因子rankl在制备调控中枢神经系统稳态的药物或药物组合物中的应用
Hormay et al. The effect of loss of the glucose-monitoring neurons in the anterior cingulate cortex: Physiologic challenges induce complex feeding-metabolic alterations after local streptozotocin microinjection in rats
Hampson et al. An RSPCA/FRAME survey of the use of non-human primates as laboratory animals in Great Britain, 1984–1988
Chameh et al. Distinctive biophysical features of human cell-types: insights from studies of neurosurgically resected brain tissue
Yasuhara et al. Toxicity of semaphorin3A for dopaminergic neurons

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination