CN111388654A - 治疗脊髓损伤的药物、药物试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开过表达促生长因子（OPN、IGF1）联合移植胚胎脊髓神经干细胞(NSCs)及小分子化合物（CLP290）在制备治疗脊髓损伤方面药物的应用。一种用于治疗脊髓损伤的药物试剂盒，包括AAV‑OPN、AAV‑IGF1，NSCs及CLP290。过表达OPN、IGF1联合移植NSCs及小分子CLP290在治疗脊髓损伤方面的应用。本发明中过表达OPN、IGF1，移植NSCs及小分子CLP290干预结合起来用于治疗脊髓损伤，在增强神经元内在再生能力的同时、重建中断的上下游神经环路及调节抑制性神经元兴奋性，促进脊髓损伤后的功能恢复。
Description
技术领域
本发明属于生物医疗技术领域，涉及治疗脊髓损伤的药物、药物试剂盒及方法，具体涉及过表达OPN、IGF1联合移植NSCs及小分子CLP290在制备治疗脊髓损伤方面药物的应用、一种用于治疗脊髓损伤的药物试剂盒及过表达OPN、IGF1联合移植NSCs及小分子CLP290在治疗脊髓损伤方面的应用。
背景技术
随着社会经济水平的不断发展，脊髓损伤发病率呈现逐年升高的趋势。脊髓损伤往往导致损伤节段以下肢体严重的功能障碍，给患者造成极大的痛苦，同时投入到医疗护理的时间与金钱也给患者家庭带来沉重的负担。目前脊髓损伤仍无有效的治疗手段，脊髓损伤后如何重建神经结构的连续性进而恢复其功能是医学界亟待解决的难题。
近年随着可调控脊髓神经元再生的关键基因，如PTEN等的发现，打破了传统的中枢神经系统不可再生的观点。同时，随着干细胞相关研究的推进，干细胞移植技术也为脊髓损伤的治疗提供了另一途径。依赖上述两种途径，许多学者实现了跨越长距离损伤区的轴突再生，但只耦合上述两种途径，所带来的功能恢复依然有限。因此，亟需探索新途径来治疗脊髓损伤。
发明内容
发明目的：本发明要解决的技术问题是提供过表达OPN、IGF1联合移植NSCs及小分子CLP290在制备治疗脊髓损伤方面药物的应用、一种用于治疗脊髓损伤的药物试剂盒及过表达OPN、IGF1联合移植NSCs及小分子CLP290在治疗脊髓损伤方面的应用，提供有效治疗脊髓损伤的药物、方法，为治疗脊髓损伤提供新的方向。
为解决上述技术问题，本发明的实施例提供过表达OPN、IGF1联合移植NSCs及小分子CLP290在制备治疗脊髓损伤方面药物的应用。
进一步的，所述药物中具有过表达OPN、IGF1的腺相关病毒AAV-OPN、AAV-IGF1、所制备的胚胎脊髓神经干细胞及小分子化合物CLP290。
本发明的实施例还提供一种用于治疗脊髓损伤的药物试剂盒，其特征在于，包括用于过表达OPN、IGF1的腺相关病毒AAV-OPN、AAV-IGF1，用于桥接中断的上下游神经环路的胚胎脊髓神经干细胞，及用于平衡局部神经元兴奋性的小分子化合物CLP290。
本发明的实施例还提供一种用于治疗脊髓损伤的药物试剂盒的实验性使用方法，其特征在于，包括以下过程：
S1、神经元中过表达OPN、IGF1并构建T10夹伤模型：健康成年雌性SD大鼠，SPF级，体重220-250 g；大鼠称重后腹腔注射复合麻醉剂，待大鼠完全麻醉后，背侧剃毛，碘伏消毒；依次切开皮肤、肌肉，通过骨性标志定位到脊髓T8节段，去除部分椎板，暴露脊髓，通过大鼠脊髓适配器将上下节段的椎骨固定，将含有OPN、IGF1的腺相关病毒AAV-OPN及AAV-IGF1经数字立体注射仪注射到脊髓实质内，共8个注射点，沿T8节段两侧均匀分布，每个注射点注射3个深度，分别为1.5mm，1.0mm，0.5mm；病毒滴度为1.15×1013 gc/ml，注射体积：200nl/point。病毒注射完成后，从脊髓适配器上取下大鼠，通过骨性标志定位到脊髓T10节段，暴露脊髓，行脊髓夹伤术，夹伤宽度为0.3mm，持续时间为30s，术后依次将肌肉、筋膜、皮肤缝合，局部碘伏消毒；术后每天肌肉注射一次抗生素，持续14天；术后每天进行动物护理，主要是辅助排尿及清洗，每天两次，固定时间点，直至实验结束。
S2、制备胚胎脊髓神经干细胞及移植：孕14天绿色荧光大鼠，深度麻醉后断头处死，腹侧75%酒精消毒后，依次剪开皮肤、肌肉，充分暴露，取出胎鼠，置于含有预冷PBS的培养皿内，利用NightSea荧光检测灯鉴定GFP胎鼠；将鉴定的胎鼠剪掉头、尾后，转移到干净的培养皿内，腹侧朝下放置，四肢舒展开，在解剖镜下找到背侧中线，显微剪由头向尾方向轻轻剪开透明的表面组织，暴露脊髓，将脊髓与周围的组织完全分离、剪断，置于干净的培养皿内，在预冷的生理盐水中洗2-3次；在高倍镜下，将包裹在脊髓表面的硬脊膜、血管以及可能附带的DRG等组织去除，将分离干净的脊髓在预冷的生理盐水中再次漂洗2-3次，随后转移到含有1ml预冷HBSS缓冲液的15ml离心管内，加入1ml 0.25%的Trypsin-EDTA，37℃水浴锅孵育8-15min，然后加入10ml DMEM-10%FBS终止消化，2500rpm离心2min，去上清，加入1mlNMB重悬沉淀，2500rpm再次离心2min，去上清，加入1-2ml NMB重悬沉淀，过40μm筛网后，再次离心，弃上清，用含有神经营养因子的纤维蛋白基质胶重悬细胞，细胞终浓度为2×105个/ul。脊髓损伤14天后，再次将动物麻醉，剃去背侧毛发、消毒，依次切开皮肤、肌肉，在解剖镜下找到脊髓夹伤部位，将大鼠转移至脊髓固定装置上，将备好的神经干细胞悬液缓慢注射到夹伤位置(注射体积10 ul)；细胞移植完成后，依次将大鼠肌肉、筋膜、皮肤缝合，局部消毒；术后每天注射一次抗生素，持续14天。
S3、小分子化合物CLP290干预：术后第4周起，每天腹腔注射0.2ml浓度为7mg/ml小分子化合物CLP290直至实验结束。
本发明的实施例另外还提供过表达OPN、IGF1联合移植NSCs及小分子CLP290在治疗脊髓损伤方面的应用。
进一步的，过表达OPN、IGF1联合移植NSCs及小分子CLP290在治疗脊髓损伤方面的应用，其特征在于，包括以下过程：
（1）神经元中过表达OPN、IGF1并构建T10夹伤模型：健康成年雌性SD大鼠，SPF级，体重220-250 g；大鼠称重后腹腔注射复合麻醉剂，待大鼠完全麻醉后，背侧剃毛，碘伏消毒；依次切开皮肤、肌肉，通过骨性标志定位到脊髓T8节段，去除部分椎板，暴露脊髓，通过大鼠脊髓适配器将上下节段的椎骨固定，将含有OPN、IGF1的腺相关病毒AAV-OPN及AAV-IGF1经数字立体注射仪注射到脊髓实质内，共8个注射点，沿T8节段两侧均匀分布，每个注射点注射3个深度，分别为1.5mm，1.0mm，0.5mm；病毒滴度为1.15×1013 gc/ml，注射体积：200nl/point，病毒注射完成后，从脊髓适配器上取下大鼠，通过骨性标志定位到脊髓T10节段，暴露脊髓，行脊髓夹伤术，夹伤宽度为0.3mm，持续时间为30s，术后依次将肌肉、筋膜、皮肤缝合，局部碘伏消毒；术后每天肌肉注射一次抗生素，持续14天；术后每天进行动物护理，主要是辅助排尿及清洗，每天两次，固定时间点，直至实验结束；
（2）制备胚胎脊髓神经干细胞及移植：孕14天绿色荧光大鼠，深度麻醉后断头处死，腹侧75%酒精消毒后，依次剪开皮肤、肌肉，充分暴露，取出胎鼠，置于含有预冷PBS的培养皿内，利用NightSea荧光检测灯鉴定GFP胎鼠；将鉴定的胎鼠剪掉头、尾后，转移到干净的培养皿内，腹侧朝下放置，四肢舒展开，在解剖镜下找到背侧中线，显微剪由头向尾方向轻轻剪开透明的皮肤层，暴露脊髓，将脊髓与周围的组织完全分离、剪断，置于干净的培养皿内，在预冷的生理盐水中洗2-3次；在高倍镜下，将包裹在脊髓表面的硬脊膜、血管以及可能附带的DRG等组织去除，将分离干净的脊髓在预冷的生理盐水中再次漂洗2-3次，随后转移到含有1ml预冷HBSS缓冲液的15ml离心管内，加入1ml 0.25%的Trypsin-EDTA，37℃水浴锅孵育8-15min，然后加入10ml DMEM-10%FBS终止消化，2500rpm离心2min，去上清，加入1ml NMB重悬沉淀，2500rpm再次离心2min，去上清，加入1-2ml NMB重悬沉淀，过40μm筛网后，再次离心，弃上清，用含有神经营养因子的纤维蛋白基质胶重悬细胞，细胞终浓度为2×105个/ul；脊髓损伤14天后，再次将动物麻醉，剃去背侧毛发、消毒，依次切开皮肤、肌肉，在解剖镜下找到脊髓夹伤部位，将大鼠转移至脊髓固定装置上，将备好的神经干细胞悬液显微缓慢注射到夹伤位置(注射体积10 ul)；细胞移植完成后，依次将大鼠肌肉、筋膜、皮肤缝合，局部消毒；术后每天注射一次抗生素，持续14天；
（3）、小分子化合物CLP290干预：术后第4周起，每天腹腔注射0.2ml浓度为7mg/ml小分子化合物CLP290直至实验结束；
（4）、OPN、IGF1调节神经元内在再生能力情况检测：术后第10周，将所有动物麻醉，常规备皮消毒后，依次剪开皮肤、肌肉，解剖镜下定位到脊髓T8节段，充分暴露脊髓后，将大鼠固定到脊髓固定装置上，0.5ul的神经元示踪剂BDA经数字立体注射仪注射到脊髓实质内，共8个注射点，注射方式同上述病毒注射，进行神经元再生情况追踪；BDA注射两周后，将动物灌注固定，解剖分离脊髓，经组织后固定、梯度脱水后，进行冰冻切片、免疫组织化学染色，借助荧光显微镜观察比较不同组动物的轴突再生情况；
（5）、CLP290平衡局部神经元兴奋性情况检测：通过检测实验组与对照组的KCC2表达及C-Fos在脊髓中的分布，来检测CLP290平衡局部神经元兴奋性的情况；
（6）、上下游神经环路重建检测
（6-1）、行为学评价：所有动物，在术后第3天进行首次BBB功能评分，记作0周，随后每周评分一次，持续12周。具体操作如下：将动物放置在开口的盆中，轻敲盆壁，使其自由活动，参考BBB评分标准，观察动物的髋、膝、踝关节活动，躯干运动及协调情况，每只动物观察4分钟，评分采取双盲方式，由两位对动物分组不知情的观察员进行打分，最终取两者评分结果的均值，记为一只动物的打分情况。
（6-2）、电生理检测：术后12周，所有动物深度麻醉后，剃去头部毛发，常规消毒，依次剪开皮肤、暴露颅骨，将刺激电极植入颅内后肢运动控制脑区，两根记录电极丝分别固定在小腿腓肠肌肌腹及肌腱上，后囟固定一根颅钉，将抗干扰电极固定在颅钉上，通过神经电生理检测电信号经夹伤段向下的传递情况，重复3次以上，然后将T10节段完全横断，再次进行电生理检测，确定电信号是由损伤处重建的信号通路传递下来。
本发明的上述技术方案的有益效果如下：
1、本发明基于前期研究中证实中间神经元兴奋性紊乱是阻碍脊髓损伤后功能恢复的一个重要机制，同时探讨了通过平衡局部抑制性神经元的兴奋性可以有效提高功能性恢复新的治疗策略；本发明旨在将过表达OPN、IGF1、移植NSCs及小分子CLP290结合起来用于治疗脊髓损伤，在增强神经元内在再生能力的同时、重建中断的上下游神经环路及调节抑制性神经元兴奋性，最大程度上促进脊髓损伤后的功能恢复，本发明的药物、试剂盒及应用对脊髓损伤后的临床治疗有着很大的指导意义。
2、本发明利用腺相关病毒载体在神经元中过表达OPN、IGF1，提高神经元内在再生能力；通过在脊髓损伤处移植带有绿色荧光的胎鼠脊髓神经干细胞（GFP-NSCs），改善再生微环境并重建神经电信号传递功能；通过小分子化合物CLP290的干预，平衡局部神经元兴奋性。
3、本发明的实施例的实验性验证方法利用复合的方法修复大鼠脊髓损伤，促进肢体功能改善，为本发明的药物、试剂盒在治疗脊髓损伤提供了理论基础。
附图说明
图1为本发明的实施例中病毒及胚胎脊髓神经干细胞注射示意图。
图2为本发明的实施例中实验组大鼠神经再生情况检测图。
图3为本发明的实施例中对照组和实验组大鼠后肢功能BBB评分情况图。
图4 为本发明的实施例中对照组、实验组和正常大鼠电生理检测情况图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一、神经元中过表达OPN、IGF1及T10夹伤模型构建
健康成年雌性SD大鼠，SPF级，体重220-250 g。大鼠称重后腹腔注射复合麻醉剂（0.3ml/100g），待大鼠完全麻醉后，背侧剃毛，碘伏消毒。依次切开皮肤、肌肉，通过骨性标志定位到脊髓T8节段，去除部分椎板，暴露脊髓，通过大鼠脊髓适配器将上下节段的椎骨固定，将含有OPN、IGF1的腺相关病毒AAV-OPN及AAV-IGF1经数字立体注射仪注射到脊髓实质内，共8个注射点，沿T8节段两侧均匀分布，每个注射点注射3个深度，分别为1.5mm，1.0mm，0.5mm（病毒滴度：1.15×1013 gc/ml，注射体积：200nl/point，如图1所示）。病毒注射完成后，从脊髓适配器上取下大鼠，通过骨性标志定位到脊髓T10节段，暴露脊髓，行脊髓夹伤术，夹伤宽度为0.3mm，持续时间为30s，术后依次将肌肉、筋膜、皮肤缝合，局部碘伏消毒。术后每天肌肉注射一次抗生素，持续14天；术后每天进行动物护理，主要是辅助排尿及清洗，每天两次，固定时间点，直至实验结束。
实施例二、胚胎脊髓神经干细胞（NSCs）制备及移植
孕14天绿色荧光大鼠，深度麻醉后断头处死，腹侧75%酒精消毒后，依次剪开皮肤、肌肉，充分暴露，取出胎鼠，置于含有预冷PBS的培养皿内，利用NightSea荧光检测灯鉴定GFP胎鼠；将鉴定的胎鼠剪掉头、尾后，转移到干净的培养皿内，腹侧朝下放置，四肢舒展开，在解剖镜下找到背侧中线，显微剪由头向尾方向轻轻剪开透明的皮肤层，暴露脊髓，将脊髓与周围的组织完全分离、剪断，置于干净的培养皿内，在预冷的生理盐水中洗2-3次；在高倍镜下，将包裹在脊髓表面的硬脊膜、血管以及可能附带的DRG等组织去除，将分离干净的脊髓在预冷的生理盐水中再次漂洗2-3次，随后转移到含有1ml预冷HBSS缓冲液的15ml离心管内，加入1ml 0.25%的Trypsin-EDTA，37℃水浴锅孵育8-15min，然后加入10ml DMEM-10%FBS终止消化，2500rpm离心2min，去上清，加入1ml NMB重悬沉淀，2500rpm再次离心2min，去上清，加入1-2ml NMB重悬沉淀，过40μm筛网后，再次离心，弃上清，用含有纤维蛋白基质胶(25mg/ml fibrinogen与25 U/ml thrombin)及神经营养因子(50 ug/ml BDNF, 50 ug/ml NT-3, 10 ug/ml IGF-1, 10 ug/ml bFGF, 10 ug/ml GDNF, 50 mM calpain inhibitor)的NMB重悬细胞，细胞终浓度为2×105个/ul。
脊髓损伤14天后，再次将动物麻醉，剃去背侧毛发、消毒，依次切开皮肤、肌肉，在解剖镜下找到脊髓夹伤部位，将大鼠转移至脊髓固定装置上，将备好的神经干细胞悬液显微缓慢注射到夹伤位置(注射体积10 ul，如图1所示)。细胞移植完成后，依次将大鼠肌肉、筋膜、皮肤缝合，局部消毒。术后每天注射一次抗生素，持续14天。
实施例三、小分子化合物CLP290干预
术后第4周起，每天腹腔注射0.2ml小分子化合物CLP290（浓度：7mg/ml）直至实验结束。
实施例四、OPN、IGF1调节神经元内在再生能力情况检测
术后第10周，将所有动物麻醉 (复合麻醉剂, 0.3 ml/100g)，常规备皮消毒后，依次剪开皮肤、肌肉，解剖镜下定位到脊髓T8节段，充分暴露脊髓后，将大鼠固定到脊髓固定装置上，0.5ul的神经元示踪剂BDA (10% in PBS) 经数字立体注射仪注射到脊髓实质内，共8个注射点，注射方式同上述病毒注射，进行神经元再生情况追踪。BDA注射两周后，将动物灌注固定，解剖分离脊髓，经组织后固定、梯度脱水后，进行冰冻切片、免疫组织化学染色，借助荧光显微镜观察比较不同组动物的轴突再生情况。
再生情况检测结果：脊髓损伤后若不给予任何治疗，受损神经元轴突不能再生，经OPN+IGF1联合神经干细胞（GFP-NSCs）移植以及小分子药物（CLP290）介入的复合法治疗后，实验组动物BDA标记的再生轴突可长入移植的干细胞内（图2）。
实施例五、CLP290平衡局部神经元兴奋性情况检测
钾-氯离子转运体2 (KCC2) 在中枢神经系统神经元中特异性表达，对维持神经元内氯离子的浓度具有重要作用。在前期研究中，脊髓损伤后KCC2表达下调，C-Fos分布局限在脊髓背角，抑制性神经元兴奋性紊乱进而影响了脊髓损伤后的功能恢复；小鼠脊髓损伤后，若持续给予KCC2激动剂-小分子化合物CLP290的治疗，可以有效提高动物的肢体功能。因此，通过检测实验组与对照组的KCC2表达及C-Fos在脊髓中的分布，来检测CLP290平衡局部神经元兴奋性的情况。
神经元兴奋性检测情况预测：根据团队前期研究结果（Chen et al, Cell 2018）可初步预测：脊髓损伤后，局部KCC2表达下调，C-Fos分布局限在脊髓背角；经OPN+IGF1联合神经干细胞（GFP-NSCs）移植以及小分子药物（CLP290）介入的复合法治疗后，可上调KCC2的表达，恢复C-Fos在脊髓中的分布情况，最终平衡局部神经元的兴奋性。
实施例六、上下游神经环路重建检测
行为学评价：所有动物，在术后第3天进行首次BBB功能评分，记作0周，随后每周评分一次，持续12周。具体操作如下：将动物放置在开口的盆中 (直径约1米)，轻敲盆壁，使其自由活动，参考BBB评分标准，观察动物的髋、膝、踝关节活动，躯干运动及协调情况，每只动物观察4分钟，评分采取双盲方式，由两位对动物分组不知情的观察员进行打分，最终取两者评分结果的均值，记为一只动物的打分情况。
电生理检测：术后12周，所有动物深度麻醉后，剃去头部毛发，常规消毒，依次剪开皮肤、暴露颅骨，将刺激电极植入颅内后肢运动控制脑区，两根记录电极丝分别固定在小腿腓肠肌肌腹及肌腱上，后囟固定一根颅钉，将抗干扰电极固定在颅钉上，通过神经电生理检测电信号经夹伤段向下的传递情况，重复3次以上，然后将T10节段完全横断，再次进行电生理检测，确定电信号是由损伤处重建的信号通路传递下来。
行为学检测结果：大鼠脊髓T10节段夹伤后，若不给予任何治疗，后肢功能几乎无任何改善，在整个观察期间，BBB评分始终处于较低水平；与对照组相比，实验组动物经OPN+IGF1联合神经干细胞（GFP-NSCs）移植以及小分子药物（CLP290）介入的复合疗法后，后肢功能有明显的改善，BBB评分总体上呈逐渐上升的趋势。初步功能评价结果表明耦合三种治疗方法的复合法可带来更好的治疗效果。从图3中可以看出，OPN+IGF1联合神经干细胞（GFP-NSCs）移植以及小分子药物（CLP290）介入的复合疗法可明显促进脊髓损伤后的肢体运动功能改善。
电生理检测结果：正常大鼠在颅内后肢运动控制脑区给予刺激，可在相应的小腿腓肠肌上记录到电信号；脊髓损伤后12周，对照组不能记录到电信号；实验组动物经OPN+IGF1联合神经干细胞（GFP-NSCs）移植以及小分子药物（CLP290）介入的复合疗法后，可在腓肠肌上记录到明显的电信号。电生理检测结果表明实验组大鼠中断的上下游神经信号传导通路得以重新建立（图4）。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (5)
1.过表达OPN、IGF1联合移植NSCs及小分子CLP290在制备治疗脊髓损伤方面药物的应用。
2.根据权利要求1所述的过表达OPN、IGF1联合移植NSCs及小分子CLP290在制备治疗脊髓损伤方面药物的应用，其特征在于，所述药物中具有过表达OPN、IGF1的腺相关病毒AAV-OPN、AAV-IGF1、所制备的胚胎脊髓神经干细胞及小分子化合物CLP290。
3.一种用于治疗脊髓损伤的药物试剂盒，其特征在于，包括用于过表达OPN、IGF1的腺相关病毒AAV-OPN、AAV-IGF1，用于桥接中断的上下游神经环路的胚胎脊髓神经干细胞，及用于平衡局部神经元兴奋性的小分子化合物CLP290。
4.一种根据权利要求3所述的用于治疗脊髓损伤的药物试剂盒的实验性使用方法，其特征在于，包括以下过程：
S1、神经元中过表达OPN、IGF1并构建T10夹伤模型：选取健康成年雌性SD大鼠，SPF级，体重220-250 g；大鼠称重后腹腔注射复合麻醉剂，待大鼠完全麻醉后，背侧剃毛，碘伏消毒；依次切开皮肤、肌肉，通过骨性标志定位到脊髓T8节段，去除部分椎板，暴露脊髓，通过大鼠脊髓适配器将上下节段的椎骨固定，将含有OPN、IGF1的腺相关病毒AAV-OPN及AAV-IGF1经数字立体注射仪注射到脊髓实质内，共8个注射点，沿T8节段两侧均匀分布，每个注射点注射3个深度，分别为1.5mm，1.0mm，0.5mm；病毒滴度为1.15×1013 gc/ml，注射体积：200nl/point，病毒注射完成后，从脊髓适配器上取下大鼠，通过骨性标志定位到脊髓T10节段，暴露脊髓，行脊髓夹伤术，夹伤宽度为0.3mm，持续时间为30s，术后依次将肌肉、筋膜、皮肤缝合，局部碘伏消毒；术后每天肌肉注射一次抗生素，持续14天；术后每天进行动物护理，主要是辅助排尿及清洗，每天两次，固定时间点，直至实验结束；
S2、制备胚胎脊髓神经干细胞及移植：孕14天绿色荧光大鼠，深度麻醉后断头处死，腹侧75%酒精消毒后，依次剪开皮肤、肌肉，充分暴露，取出胎鼠，置于含有预冷PBS的培养皿内，利用NightSea荧光检测灯鉴定GFP胎鼠；将鉴定的胎鼠剪掉头、尾后，转移到干净的培养皿内，腹侧朝下放置，四肢舒展开，在解剖镜下找到背侧中线，显微剪由头向尾方向轻轻剪开透明的皮肤层，暴露脊髓，将脊髓与周围的组织完全分离、剪断，置于干净的培养皿内，在预冷的生理盐水中洗2-3次；在高倍镜下，将包裹在脊髓表面的硬脊膜、血管以及可能附带的DRG等组织去除，将分离干净的脊髓在预冷的生理盐水中再次漂洗2-3次，随后转移到含有1ml预冷HBSS缓冲液的15ml离心管内，加入1ml 0.25%的Trypsin-EDTA，37℃水浴锅孵育8-15min，然后加入10ml DMEM-10%FBS终止消化，2500rpm离心2min，去上清，加入1ml NMB重悬沉淀，2500rpm再次离心2min，去上清，加入1-2ml NMB重悬沉淀，过40μm筛网后，再次离心，弃上清，用含有神经营养因子的纤维蛋白基质胶重悬细胞，细胞终浓度为2×105个/ul；脊髓损伤14天后，再次将动物麻醉，剃去背侧毛发、消毒，依次切开皮肤、肌肉，在解剖镜下找到脊髓夹伤部位，将大鼠转移至脊髓固定装置上，将备好的神经干细胞悬液显微缓慢注射到夹伤位置(注射体积10 ul)；细胞移植完成后，依次将大鼠肌肉、筋膜、皮肤缝合，局部消毒；术后每天注射一次抗生素，持续14天；
S3、小分子化合物CLP290干预：术后第4周起，每天腹腔注射0.2ml浓度为7mg/ml小分子化合物CLP290直至实验结束。
5.过表达OPN、IGF1联合移植NSCs及小分子CLP290在治疗脊髓损伤方面的应用，其特征在于，包括以下过程：
（1）神经元中过表达OPN、IGF1并构建T10夹伤模型：健康成年雌性SD大鼠，SPF级，体重220-250 g；大鼠称重后腹腔注射复合麻醉剂，待大鼠完全麻醉后，背侧剃毛，碘伏消毒；依次切开皮肤、肌肉，通过骨性标志定位到脊髓T8节段，去除部分椎板，暴露脊髓，通过大鼠脊髓适配器将上下节段的椎骨固定，将含有OPN、IGF1的腺相关病毒AAV-OPN及AAV-IGF1经数字立体注射仪注射到脊髓实质内，共8个注射点，沿T8节段两侧均匀分布，每个注射点注射3个深度，分别为1.5mm，1.0mm，0.5mm；病毒滴度为1.15×1013 gc/ml，注射体积：200nl/point，病毒注射完成后，从脊髓适配器上取下大鼠，通过骨性标志定位到脊髓T10节段，暴露脊髓，行脊髓夹伤术，夹伤宽度为0.3mm，持续时间为30s，术后依次将肌肉、筋膜、皮肤缝合，局部碘伏消毒；术后每天肌肉注射一次抗生素，持续14天；术后每天进行动物护理，主要是辅助排尿及清洗，每天两次，固定时间点，直至实验结束；
（2）制备胚胎脊髓神经干细胞及移植：孕14天绿色荧光大鼠，深度麻醉后断头处死，腹侧75%酒精消毒后，依次剪开皮肤、肌肉，充分暴露，取出胎鼠，置于含有预冷PBS的培养皿内，利用NightSea荧光检测灯鉴定GFP胎鼠；将鉴定的胎鼠剪掉头、尾后，转移到干净的培养皿内，腹侧朝下放置，四肢舒展开，在解剖镜下找到背侧中线，显微剪由头向尾方向轻轻剪开透明的皮肤层，暴露脊髓，将脊髓与周围的组织完全分离、剪断，置于干净的培养皿内，在预冷的生理盐水中洗2-3次；在高倍镜下，将包裹在脊髓表面的硬脊膜、血管以及可能附带的DRG等组织去除，将分离干净的脊髓在预冷的生理盐水中再次漂洗2-3次，随后转移到含有1ml预冷HBSS缓冲液的15ml离心管内，加入1ml 0.25%的Trypsin-EDTA，37℃水浴锅孵育8-15min，然后加入10ml DMEM-10%FBS终止消化，2500rpm离心2min，去上清，加入1ml NMB重悬沉淀，2500rpm再次离心2min，去上清，加入1-2ml NMB重悬沉淀，过40μm筛网后，再次离心，弃上清，用含有神经营养因子的纤维蛋白基质胶重悬细胞，细胞终浓度为2×105个/ul；脊髓损伤14天后，再次将动物麻醉，剃去背侧毛发、消毒，依次切开皮肤、肌肉，在解剖镜下找到脊髓夹伤部位，将大鼠转移至脊髓固定装置上，将备好的神经干细胞悬液显微缓慢注射到夹伤位置(注射体积10 ul)；细胞移植完成后，依次将大鼠肌肉、筋膜、皮肤缝合，局部消毒；术后每天注射一次抗生素，持续14天；
（3）、小分子化合物CLP290干预：术后第4周起，每天腹腔注射0.2ml浓度为7mg/ml小分子化合物CLP290直至实验结束；
（4）、OPN、IGF1调节神经元内在再生能力情况检测：术后第10周，将所有动物麻醉，常规备皮消毒后，依次剪开皮肤、肌肉，解剖镜下定位到脊髓T8节段，充分暴露脊髓后，将大鼠固定到脊髓固定装置上，0.5ul的神经元示踪剂BDA经数字立体注射仪注射到脊髓实质内，共8个注射点，注射方式同上述病毒注射，进行神经元再生情况追踪；BDA注射两周后，将动物灌注固定，解剖分离脊髓，经组织后固定、梯度脱水后，进行冰冻切片、免疫组织化学染色，借助荧光显微镜观察比较不同组动物的轴突再生情况；
（5）、CLP290平衡局部神经元兴奋性情况检测：通过检测实验组与对照组的KCC2表达及C-Fos在脊髓中的分布，来检测CLP290平衡局部神经元兴奋性的情况；
（6）、上下游神经环路重建检测
（6-1）、行为学评价：所有动物，在术后第3天进行首次BBB功能评分，记作0周，随后每周评分一次，持续12周；具体操作如下：将动物放置在开口的盆中，轻敲盆壁，使其自由活动，参考BBB评分标准，观察动物的髋、膝、踝关节活动，躯干运动及协调情况，每只动物观察4分钟，评分采取双盲方式，由两位对动物分组不知情的观察员进行打分，最终取两者评分结果的均值，记为一只动物的打分情况；
（6-2）、电生理检测：术后12周，所有动物深度麻醉后，剃去头部毛发，常规消毒，依次剪开皮肤、暴露颅骨，将刺激电极植入颅内后肢运动控制脑区，两根记录电极丝分别固定在小腿腓肠肌肌腹及肌腱上，后囟固定一根颅钉，将抗干扰电极固定在颅钉上，通过神经电生理检测电信号经夹伤段向下的传递情况，重复3次以上，然后将T10节段完全横断，再次进行电生理检测，确定电信号是由损伤处重建的信号通路传递下来。
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