CN1533283A - 骨桥蛋白用于治疗和/或预防神经疾病 - Google Patents

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Abstract

本发明设计骨桥蛋白或骨桥蛋白活性激动剂在治疗或预防神经疾病中的应用。

Description

骨桥蛋白用于治疗和/或预防神经疾病
发明领域
本发明一般涉及神经疾病及神经失调领域。本发明与神经保护、神经髓鞘化及髓磷脂产生细胞的生成与再生有关。本发明特别涉及脱髓鞘和神经变性疾病、神经病、创伤性神经损伤、脑卒中以及先天性代谢失调而引起的神经疾病。本发明尤其涉及利用骨桥蛋白或其活性激动剂制备药物用于治疗和/或预防神经疾病。
发明背景
神经髓鞘化是在中枢神经系统(CNS)和外周神经系统(PNS)的形成及行使功能过程中的一种基本过程。轴突周围的髓鞘是电脉冲信号沿神经正确传导所必须的。在许多疾病中都会出现髓磷脂的丢失，其中包括影响中枢神经系统的多发性硬化症(MS)，格-巴综合征(急性感染性多神经炎)，CIDP及其它疾病(见Abramsky和Ovadia，1997；Trojaborg，1998，Hartung等，1998)。虽然脱髓鞘疾病有各种原因，如感染性病原体或自身免疫性攻击，但都可以引起神经功能受损，甚至可能导致瘫痪和死亡。尽管现有的治疗药物可以多发性硬化症中的炎性攻击延缓疾病的进展，但是依然需要开发出新的治疗措施以使髓鞘再生并且使神经功能恢复(Abramsky和Ovadia，1997，Pohlau等，1998)。
由急性刺激如创伤、缺氧和缺血引起的中枢神经系统损伤对神经元和白质都有影响。虽然多数注意力都集中在导致神经元死亡的过程上，但越来越多的证据表明使轴突髓鞘化的少突胶质细胞受损也是中枢神经系统损伤的特异组成部分。实验证实大鼠脑卒中(3小时)后很快就会出现少突胶质细胞的病理学改变，说明这些细胞比神经元细胞更容易受兴奋毒性的损害(Pantoni等，1996)。另外一个介导细胞死亡的潜在候选者是谷胺酰胺浓度的显著升高，一般都伴随有急性中枢神经损伤(Lipton等，1994)。事实上，神经元周围的少突胶质细胞也表达功能性的谷胺酰胺受体，这些受体属于α-氨基羟甲基恶唑丙酸/红藻氨酸盐亚型。而且少突胶质细胞也表现出对谷胺酰胺的高度敏感性(McDonald等，1998)。
创伤是指神经的损伤或损坏。可以是脊索创伤，即对脊索的损伤而影响损伤水平或以下的所有神经系统功能，包括肌肉控制和感觉，或脑创伤，如闭合脑损伤引起的创伤。
脑缺氧这个术语是特指大脑半球缺氧，更典型的用法是指整个脑缺氧。根据缺氧严重程度的不同，症状可以包括从思维混乱到不可逆的脑损伤、昏迷及死亡。
脑卒中通常是由脑缺血引起的。可以被称为脑血管病或脑血管事故。这是一组脑障碍，包括脑的任何一部分血液供应中断而导致的脑功能丧失。脑大约需要整个身体血液循环供应的20％。对脑的血液供应主要通过颈部的两条动脉(颈动脉)，其在脑内分支成多条动脉，分别供应脑的不同区域。即使一个短暂的血流中断也可以引起脑功能的下降(神经缺损)。所影响的脑区域不同出现的症状也不同，通常出现的问题包括视觉的改变，语言能力的改变，身体某一部分的运动功能或感觉功能降低，或者意识水平的改变。如果血流降低的时间超过数秒，该区域的脑细胞就会收到损伤(血管梗塞)，从而引起该区域的永久性改变甚至死亡。
每千人内大约有4人会出现脑卒中。在大多数发达国家包括美国中是第三位的死亡原因。随着年龄的增加，脑卒中发生的几率迅速增加，35岁后每10年发生的几率增加一倍。65岁以上的人中大约有5％的至少会出现一次脑卒中。男性发生的几率通常大于女性。
如上面所提到的，脑卒中包括脑的某些区域血液循环丢失而导致的脑功能丧失(神经缺损)。损伤的位置、程度及引发障碍的原因不同所导致的神经缺损也不同。脑卒中发生的原因可以是血流减少(缺血)而导致的血液供应不足从而引发该区域脑组织的死亡(梗死)。缺血性脑卒中可以是由在脑内形成的血凝块引起的，也可以是由在其它位置形成的血凝块、动脉粥样硬化斑块或其它物质到达脑部而引起的。脑内出血(脑出血)所引起的症状与脑卒中相似。
最常见的脑卒中是由动脉粥样硬化(脑血栓形成)引起的脑卒中。动脉粥样硬化(动脉的硬化)是指这样一种病理状态，其中在动脉的内壁形成脂肪沉淀，并且逐渐形成动脉粥样硬化斑块(由脂肪沉淀和血小板组成的块状物)。动脉阻塞的形成是非常缓慢的。动脉粥样硬化不一定就会导致脑卒中。在各个脑动脉之间有许多小的动脉相连。如果血流逐渐减弱，这些小的连接动脉就会逐渐增大从而绕过阻塞区域(侧循环)。如果有足够的侧循环，即使出现一个完全阻塞的动脉也不会引起神经缺损。脑内的第二中安全保障机制是动脉都足够大，即使75％的血管闭塞也可以保证脑内的相应区域有足够的血流供应。
血栓性脑卒中(由血栓引起的脑卒中)在老年人中是最常见的，这些老年人通常都有动脉粥样硬化性心脏病或糖尿病。这类脑卒中在任何时候都有可能发生，包括在休息时。发生脑卒中的人可能丧失意识，也可能不丧失。
由栓塞引起的脑卒中(流动性血凝块)是最常见的，通常由心源性栓塞、由于心脏功能障碍而形成血凝块然后会到达脑部而引起。栓塞也可能起源于其它部位，特别是那些具有动脉粥样硬化斑块的区域。血栓随血流运动，在脑内的小动脉中变成棒状。这种脑卒中会突然发生，并且会立刻引起最严重的神经缺损。这种脑卒中与运动是否剧烈没有关系，在任何时间内都可能发生。与这种障碍相伴随的常常是心率失常，并且是血栓产生的原因。对脑造成的损伤常比由脑血栓形成导致的脑卒中严重的多。意识可能丧失，也可能不丧失。如果栓塞破裂造成血管损伤而出血(出血性脑卒中)则后果可能更严重。
周围神经病是一种综合征，包括感觉丧失、肌无力和肌萎缩、深度腱反射减弱、血管舒张症状的一种或几种症状的综合。
这种疾病可以影响单个神经(单一精神病变)，两个或多个分离区域的神经(多发性单一精神病变)，或者同时影响多个神经(多神经病)。最初主要是轴突受影响(如糖尿病，莱姆病，或尿毒症或毒性药物引起的疾病)，或者是髓鞘或施万细胞(如急性或慢性感染性多神经病，脑白质营养不良，或格-巴综合征)。对小的无髓或有髓神经纤维造成的损伤主要是导致温度及疼痛感觉丧失；对大的有髓神经纤维造成的损伤主要是会导致运动及本体感觉障碍。某些神经障碍(如由于铅中毒，氨苯砜的应用，蜱叮咬，卟啉病或格-巴综合征)主要影响运动纤维；其它的神经障碍(如由于肿瘤引起的背根神经节炎，麻风病，AIDS，糖尿病，或慢性吡哆醇中毒)主要影响背根神经节或感觉纤维，产生感觉症状。有时候颅侧神经也可能收到影响(如格-巴综合征，莱姆病，糖尿病，以及白喉)。确定那些神经受影响有助于判断病因。
创伤是导致单个神经纤维收到局部损伤的最常见原因。剧烈的肌肉运动或关节的强迫过度伸张可能会造成局部神经病，重复的小创伤也可能造成局部神经病(如紧握小的工具，来自汽锤的过度振荡)。压力或内陷麻痹通常影响骨隆突(如在深度睡眠时，瘦弱或恶病质病人感觉缺失时，以及酒醉时)或狭窄管道(如腕管综合征)处的浅表神经(尺骨的，桡骨的，腓侧的)。压力造成的麻痹也可能是由于肿瘤、骨肥厚、拄拐杖、或长时间保持非正常姿势(如在维护庭园时)而引起的。血液流出后进入神经以及暴露于寒冷或辐射中也可能引发神经疾病。单一精神病变也可能是由于肿瘤的直接侵润造成的。
多发性单一精神病变通常是由胶原性血管病(如结节性多发性动脉炎，系统性红斑狼疮，斯耶格伦综合征(口眼干燥、关节炎综合征)、结节病、代谢性疾病(如糖尿病，淀粉样变性)、或感染性疾病(如莱姆病，HIV感染)引发的。微生物如果直接侵入神经(如麻风病)也可以引起多发性单一精神病变。
由急性发热病引起的多神经病通常都是由毒素(如白喉)或自身免疫反应(如格-巴综合征)造成的；有时伴随免疫接种而出现的多神经病可能也是自身免疫疾病。
毒性药物通常造成的是多神经病，但有时也会引发单一精神病变。这些药物包括吐根碱、环几巴比妥、巴比妥、三氯叔丁醇、磺胺类药物、苯妥英、硝基呋喃妥英、长春花生物碱、重金属、一氧化碳、三邻羟甲苯基磷酸、正二硝基苯酚、多种溶剂、其它工业毒物、以及某些抗AIDS药物(如扎西他宾，二脱氧肌苷)。
营养缺乏和代谢障碍也可能引发多神经病。维生素B缺乏就是一种常见的原因(如酒精中毒，脚气病，恶性贫血，异烟肼诱导的吡哆醇缺乏，吸收不良综合征，以及孕期呕吐)。多神经病也可能发生于甲状腺功能减退症、卟啉病、结节病、淀粉样变性以及尿毒症时。糖尿病也可以引起感觉运动远端多神经病(最常见)、多发性单一精神病变、以及局部单一精神病变(如动眼神经或外展脑神经所发生的局部单一精神病变)。
恶性肿瘤也可以引发多神经病，主要是通过单株性丙球蛋白病(多发性骨髓瘤，淋巴瘤)，淀粉样侵润，或营养缺乏，或者肿瘤相关病症而引发。
特异性单一精神病变：单发的和多发的单一精神病变的特征是疼痛、虚弱、以及受影响神经分布区域内的感觉异常。多发性单一精神病变是不对称分布的；受影响的神经可以是起始就是全部，也可以是逐渐增多的。如果许多神经都收到影响可能会引发多神经病。
尺骨神经麻痹通常是由肘部尺骨沟内的神经创伤引起的，持续重复依靠肘部或儿童时期骨折后骨不对称生长(慢尺骨麻痹)都可以造成肘部尺骨沟内的神经创伤。尺骨神经在肘管处也容易受到挤压。第五手指或第四手指中间半截会出现感觉异常和感觉缺陷；拇指内收肌、第五手指外展肌以及骨间肌肉变弱和萎缩。严重的慢性尺骨麻痹会导致爪形手畸形。神经传导检查可以确定损伤的位置。在进行外科手术修复前应保守治疗。
腕管综合征是由于正中神经受压迫引起的，该神经位于横向浅表腕韧带和屈伸手掌的前臂肌肉的纵向肌腱之间的腕关节掌侧。可以是单侧或双侧。该神经受压迫会导致手掌的桡骨掌侧感觉异常以及腕和手掌的疼痛；有时疼痛发生在靠近前臂和肩部的受压迫位置。疼痛可能在夜间更剧烈。然后前三个手指的掌侧可能会出现感觉缺陷；控制拇指外展和内屈的肌肉可能变弱和萎缩。这种综合征应该和颈神经根病导致的C-6神经根受压区别开来。
腓神经麻痹通常是由于靠腓骨颈侧面的神经受压迫而引起的。这种情况常见于瘦弱的长期卧床的病人或习惯性交叉双腿的瘦人。足的背屈及外翻能力减弱(足下垂)。偶尔会有小腿和足背的前面偏一侧及第一和第二跖之间的空隙出现感觉缺失。压迫性神经病的治疗一般是保守的(如避免腿部交叉)。通常随后出现不完全临床神经病，但一般都会自然消失。如果难以恢复可以考虑进行手术探察。
桡神经麻痹(周末晚麻痹)是由于压迫背靠肱骨的神经造成的，例如中毒或深度睡眠时将手臂靠在椅子背上。症状包括腕和手指的伸肌无力(腕下垂)，偶尔会有第一背骨间肌肉的背侧感觉消失。治疗方法与压迫性腓侧神经障碍一样。
多神经病一般是相对对称的，通常同时影响感觉、运动和血管舒张神经纤维。可能影响轴突柱或髓鞘，或者同时受影响，可能是急性的(如格-巴综合征)，也可能是慢性的(如肾衰竭)。
由代谢障碍(如糖尿病)或身衰竭造成的多神经病进展缓慢，一般要经过数月或数年。通常首先出现下肢的感觉异常，一般来说远端比近端严重。外周麻刺感、麻木、烧灼感、关节本体感觉及震动感消失是比较突出的。夜间一般疼痛比较严重，碰到受影响区域或温度改变会导致症状加重。严重的病人出现感觉丧失的信号，呈典型的长袜-手套(stocking-and-glove)分布。跟腱反射和其它深度腱反射减弱或消失。如果感觉缺失加重会导致指(跖)无痛溃疡或夏氏关节(Charcot’s joint)。感觉或本体感觉缺失会造成步态异常。运动神经受影响则会造成远端肌无力和萎缩。自主神经系统也可能被包括在内，导致夜间腹泻、大小便失禁、阳痿或体位性低血压。血管舒张症状有多种多样。皮肤变得苍白干燥，有时甚至灰暗；极易出汗。严重的慢性病人常会出现与营养有关的症状(光滑而有光泽的皮肤，痘痕或脊状指甲，骨质疏松)。
营养性多神经病通常出现于酒精中毒和营养不良的人中。最初的轴突病变会导致长大神经纤维脱髓鞘和轴突损坏。原因是缺乏维生素B1或其它维生素(如维生素B6，泛酸，叶酸)还不清楚。维生素B6缺乏导致的神经病常常只发生在使用异烟肼治疗结核的病人身上；缺乏或依赖维生素B6的婴幼儿可能会出现惊厥。远端肢体残疾或对称性无力通常是隐袭的并且快速发展，有时会伴随感觉丧失、感觉异常和疼痛。触碰时腓及足的疼痛、痉挛、冷感、烧灼感以及麻木等感觉会加重。当病因不清时可以给予多种维生素，但其是否有效还未被证实。
很少的情况下，感觉神经多神经病从外周疼痛和感觉异常开始，从中央到所有形式的感觉丧失。其发生与癌症的远期效应类似(特别是支气管的)，症状一般出现在过量摄入维生素B6(＞0.5克/天)，以及在淀粉样变性、甲状腺功能低下、骨髓瘤和尿毒症中。在停止摄入维生素B6时也可能出现维生素B6诱导的神经病。
遗传性神经病分为感觉运动神经病和感觉神经病。夏-马-图病(进行性神经性肌萎缩)是最常见的遗传性感觉运动神经病。很少见感觉运动神经病起始于出生时期并导致严重的残疾。感觉神经病是很少见的，远端疼痛及温度感觉丧失出现的几率要大于震动和位置感觉丧失的几率。主要的问题是由于对疼痛不敏感而造成的足部残疾，并且常常发生感染和骨髓炎。
遗传性运动和感觉神经病I型和II型(夏-马-图病，腓侧肌肉萎缩)相对较常见，通常是常染色体显性遗传病，其症状是肌无力和萎缩，主要影响腓侧的和下肢肌肉。病人还可能患有其它退化性疾病(如弗氏共济失调(Friedreich’s ataxia))或具有家族史。I型病人一般出现在儿童中期，有足下垂，并且伴有缓慢的进行性远端肌肉萎缩，导致“鹮形腿”。稍后会出现手部的内在肌肉萎缩。出现长袜-手套(stocking-glove)模式的震动、疼痛及温度感觉减弱。深度腱反射缺失。高足弓或锤状趾可能只是患有该病的家族成员受影响轻微的标志。神经传导速度缓慢，远端潜伏期延长。出现节段性的脱髓鞘和髓鞘再生。增大的外周神经可以通过触诊查到。病程进展缓慢缓慢并且不影响寿命。II型神经病进展更缓慢，在其生命晚期通常会出现肌无力。病人具有相对正常的神经传导速度，但其激发势能的振幅较低。活组织检查发现有wallerian变性。
遗传性运动和感觉神经病III型(肥大性间质性神经病，代-索病(进行性肥大性间质性神经病))是一种少见的常染色体隐性遗传病，从儿童期开始出现进行性肌无力、感觉丧失及深度腱反射缺乏。开始时类似于夏-马-图病，但其运动功能减弱速度很快。发生脱髓鞘和髓鞘再生现象，导致外周神经膨大，神经活组织检查可见洋葱泡。
根据运动性肌无力的特征性分布、足畸形、家族史及电生理异常可确诊此病。可以通过基因分析，但无特异的治疗措施。年轻病人通过专业咨询以了解病程进展情况可能会有帮助。安装矫形支架有助于矫正足下垂；通过矫形外科手术以稳定足部也可能有帮助。
神经变性疾病包括阿尔茨海默病，帕金森病，亨庭顿舞蹈病和肌萎缩性侧索硬化症(ALS)。
阿尔茨海默病是一种由脑组织改变而引起的心里功能衰退障碍。其中包括非血管病变引起的脑组织萎缩、初级变性性痴呆及弥散性脑萎缩。阿尔茨海默病也叫老年痴呆/阿尔茨海默型(SDAT)。是老年人智力下降的最常见原因。每10000人中大约有9人会有此病。这种疾病对女性的影响比男性稍弱并且主要发生在老年人身上。
引起该病的原因还部清楚。造成此疾病的神经化学因素包括神经细胞传输神经冲动的物质(神经递质)的缺乏，如乙酰胆碱、生长抑素、P物质及去甲肾上腺素。环境因素包括与铝、锰及其它物质接触。感染性因素包括影响脑和脊索(中枢神经系统)的朊病毒(病毒样微生物)感染。在某些家族中(代表5-10％的病例)具有遗传性的易感性而发生这种疾病，但并不符合遗传法则(孟德尔定律)。通常是排除痴呆的其它原因才能诊断为这种疾病。
研究人员发现在一个多位成员患有阿尔茨海默病的家族中出现一种特异的基因变异，该变异几乎发生在所有患此疾病的成员身上。这个基因编码一种叫载脂蛋白E4的物质，但并不是说这个基因是引起此病的原因，只是它的存在可以增加最终患此病的几率。因为有许多具有E4基因的人并没有受阿尔茨海默病的折磨。
患者最初的特征是记忆损害，伴有进行性智力减退。随着疾病的进展会出现情绪改变、语言能力改变、步态的改变及其它变化。还会出现脑组织变小(脑萎缩)、脑室(脑内腔隙)扩大、以及脑组织内出现沉淀物。
帕金森病是一种脑病，其特征是摇摆及行走、运动和协调困难。该病与控制肌肉运动的脑组织受损有关。也叫震颤麻痹或震颤性麻痹。
每1000人中大约有2人受此病影响，大多数在50岁以后患病。对男性和女性都有影响，是老年人最常见的一种神经障碍。术语“帕金森氏综合征”是指具有帕金森氏病所表现出的运动变化类型群的任何状态，帕金森氏病恰好是引起这群症状的最常见疾病。帕金森氏综合征也可由其它疾病或外部因素引起(继发性帕金森氏综合征)。
帕金森氏病是由于脑控制肌肉运动部分(基底核和锥体束外区域)的神经细胞进行性退变引起的。多巴胺是细胞用来传导脉冲信号的一种物质(神经递质)，通常在此区域产生。该区域的退变会减少体内多巴胺的含量。
多巴胺含量的不足会破坏多巴胺与其它神经递质如乙酰胆碱之间的平衡。没有多巴胺神经细胞无法正确传递信号，这会导致肌肉功能的丧失。脑细胞退变的准确原因还不清楚。这种疾病会影响一侧或双侧身体，其功能丧失的程度千变万化。
除了肌肉控制功能丧失外，有些帕金森氏病病人还可能变得严重抑郁。尽管早期精神异常还不常见，但严重的帕金森氏病病人可能会表现出全面的精神颓废(包括痴呆、幻觉等等)。痴呆也可能是某些治疗药物的副作用。
亨庭顿舞蹈病是一种遗传性常染色体显性神经疾病。这种疾病不常见，发生的几率大约为万分之一(Breighton和Hayden，1981)。该疾病在50岁以前通常不会出现临床症状，主要表现为精神紊乱、不随意运动障碍及认知能力下降知道死亡。典型的病程是从开始发病到死亡约为1 7年。
与亨庭顿舞蹈病相关的基因叫亨庭顿基因(huntingtin)。它位于4号染色体的长臂，是潜伏期诊断及产前诊断的有效方式。基因异常是一种大量的随机CAG重复核苷酸序列。
亨庭顿舞蹈病病人染色体上CAG重复序列长度的增加与开始出现临床症状的年龄高度相关。这种相关程度在那些在青少年时期就开始出现亨庭顿舞蹈病症状的病人身体表现的尤其突出，其重复序列的数目通常超过50个。亨庭顿舞蹈病家族成员的CAG重复序列数目也表现出某些程度的不稳定，尤其是当孩子从其父亲那里遗传到亨庭顿基因时特别明显。
还不清楚亨庭顿舞蹈病病人中这个广泛表达的基因是如何选择性地导致神经元死亡的。而且序列分析也没有发现该基因与其它已知基因具有明显的同源性，还没有鉴别出结构基序和功能域来研究其功能。特别是这个广泛表达的基因是如何选择性地导致神经元死亡的问题还没有答案。
肌萎缩性侧索硬化症是一种由神经对随意运动肌肉的控制进行性丧失所引起的，其主要原因是脑和脊索的神经细胞受到破坏。肌萎缩性侧索硬化症也叫LouGehrig病，是一种包括使用及控制肌肉功能丧失的疾病。这些神经控制的肌肉萎缩或消失，结果肌肉组织由于缺乏神经刺激而消失。肌肉强度和协调能力下降，开始是随意肌肉(那些受意识控制的肌肉，如臂和腿上的肌肉)。肌肉控制丧失的范围持续扩大，越来越多的肌肉群受到影响。刺激半随意肌肉的神经也可能受影响，如那些控制呼吸和吞咽的肌肉。但对其思维和推理能力没有影响，其原因还不清楚。
ALS发病的几率大约为十万分之一。某些病例具有家族性。这种疾病发生的几率男性大于女性。成年时期一般不发病，通常是在50岁以后。
创伤性神经损伤可能涉及中枢神经系统，也可能涉及外周神经系统。创伤性脑损伤(TBI)也被简单地称为头损伤或闭合性头损伤(CHI)，是指由于外力击打头部造成脑受损的损伤。最常见的是汽车或自行车事故，但也可能是近乎溺死、心急梗死、脑卒中及感染的结果。这类创伤性脑损伤通常都是由于缺氧或脑供血不足引起的，因此也被称为“缺氧损伤”。
脑损伤或闭合头损伤是在头部受到打击的情况下发生的，比如机动车车祸或从高空坠下。在这种情况下，头颅撞击到静止的物体上，头颅内的脑沿枢椎(脑干)转动扭曲，造成局部或广泛损伤。由于脑组织是由使其漂浮的液体包围着的一大团软组织，因此在撞到物体上后可能会反弹从而使损伤加重。
在受到创伤后可能会立即出现一段意识丧失期，可能持续数分钟、数周或数月。由于扭曲和反弹，病人的受创伤脑组织通常会受到损坏或挫伤脑的大部分组织。这就是所谓的脑弥漫性损伤，或“非枪弹伤”。这类非枪弹类脑损伤可以分类为初级或次级。
初级脑损伤发生在损伤时，主要是位于受撞击位点，特别是在有颅骨破裂时。大的挫伤一般有大脑内出血或皮质撕裂伤。弥散性轴索损伤是由于颅内脑旋转造成神经束断裂或拉伸而形成的。轴突也会有小的出血性损伤或弥漫性损伤，但只有在显微镜下才能观察到。
次级脑损伤是损伤瞬间过后并发症的结果。其中包括脑内出血、对大脑外动脉的创伤性损坏、颅内疝出、缺氧性脑损伤、或者脑膜炎。
开放性头损伤在检查头部时可以看到，可能是枪伤、事故、或物体穿过颅骨到达脑组织(脑枪弹伤)。这类头损伤比较容易伤及脑的特定区域。
所谓的轻微脑损伤可能不会有意识的丧失，只是持续一小段时间的茫然感觉或混乱状态。虽然所能采取的医疗措施很少，但未昏迷的脑损伤病人可能也会有一些与昏迷创伤存活者相似的症状及缺陷。
对于创伤来说需要检测脑的变化以防止进一步的损伤。严重头损伤后脑通常会变大。这就是所谓的脑肿胀，是由于脑内的血量增加引起的。病程的后期脑内可能会出现积水，被称为脑水肿。脑肿胀和脑积水都会导致颅内压升高，被称为颅内压(ICP)。
脊索损伤占到因截瘫和四肢麻痹而住院病人的大多数。超过80％的是因为车祸。损伤可在临床上分为两组：开放性损伤及闭合性损伤。
开放性损伤直接损坏脊索和神经根。贯穿伤可能导致广泛的断裂和出血。闭合性损伤占脊索损伤的大多数，并且通常与脊柱的骨折脱位有关，一般通过放射检查就可以证实。对脊髓的损伤依赖于骨损伤的程度，可以分为两个阶段：初级损伤是挫伤，神经纤维横切和出血坏死；次级损伤是硬膜外肿瘤(extradural heamatoma)、梗死、感染和水肿。
脊索损伤的晚期效应包括：受损神经纤维的上行和下行顺向变性、创伤后脊髓空洞症以及截瘫的全身效应，如尿道及胸腔感染、褥疮和肌肉萎缩。
神经障碍还可以由先天性的代谢疾病引起。髓鞘包裹这许多神经纤维，是由生命早期形成的脂蛋白层组成的。中枢神经系统中的少突胶质细胞形成的髓磷脂在化学及免疫学意义上与外周神经系统中施万细胞形成的髓磷脂是不同的，但其功能是相同的：促进神经脉冲沿轴突传递。
许多先天性代谢病(如苯丙酮尿症和其它氨基酸尿症；泰-萨病，尼-皮病(类脂组织细胞增多症)和高歇病；胡尔勒综合征；克拉伯病和其它脑白质营养不良)都可以影响髓磷脂的发育，主要是位于中枢神经系统。除非其生化缺陷得到矫正或补偿，否则就会造成永久性的并且常常是广泛的神经缺陷。
例如，克拉伯病或球状体细胞白质营养不良是一种涉及外周及中枢神经系统白质的疾病。编码溶酶体酶半乳糖脑苷脂酶(GALC)的基因突变，结果导致酶活性降低，其降解脑苷脂的能力下降，这些脑苷脂几乎都存在于髓磷脂中。病人体内持续的髓鞘化和/或髓鞘再生需要具有功能的内源性少突胶质细胞，或者将正常少突胶质细胞或能分化成少突胶质细胞的干细胞植入以提供足量的GALC表达(Wenger等，2000)。
神经纤维瘤病1(NF1)是一种常见的染色体异常疾病，具有多种神经学上的临床症状。
多系统萎缩是一种偶发的成年开始发病的神经变性疾病，其病因还不清楚。少突胶质细胞在病理遗传学过程中所起的作用如果说不是唯一的也是极其突出的，这一特征在神经变性疾病中是很独特的。其与帕金森病的主要区别在于多系统萎缩用L-多巴治疗无效。
在生命晚期脱髓鞘是许多神经疾病的一个特征；这可能是由于局部创伤、毒性药物或代谢障碍损伤神经或髓磷脂造成的。也有证据表明精神分裂症也可能导致脱髓鞘。大面积的髓磷脂丢失通常会导致轴突和胞体退化，二者都是不可逆的。但是，在许多情况下髓鞘可以再生，因而神经功能得以迅速修复、再生乃至完全恢复。中枢神经系统(即脊索、脑或视神经)脱髓鞘在初级脱髓鞘病中是最常见的，但其病因还不清楚。了解最多的是MS。
急性播散性脑脊髓炎和感染后脑脊髓炎的特征是血管周围的中枢神经脱髓鞘，这种脱髓鞘可能会自然发生，但多数情况下是在病毒感染或病毒疫苗接种后(极少情况下是在细菌疫苗接种后)，说明是免疫学的因素在起作用。病毒疫苗接种后或患有格-巴综合征后出现的急性炎性周围神经病具有相同脱髓鞘病症，因此推测也有免疫发病机理，但它只影响周围神经。
异染性脑白质营养不良是另外一种脱髓鞘疾病。脑白质肾上腺萎缩症和肾上腺脊髓神经病是少见的性染色体连锁隐性代谢疾病，其特征是肾上腺功能障碍和广泛的神经脱髓鞘。脑白质肾上腺萎缩症发生在年轻男性身上；肾上腺脊髓神经病发生在青少年时期。精神颓废、痉挛及失明可能发生。脑白质肾上腺萎缩症常常是致命的。饮食疗法及免疫调节疗法正在研究中。
Leber遗传性视神经萎缩及其相关的线粒体疾病的主要特征是双侧中央视觉丧失，通常是影响二十岁左右的年轻人。Leber遗传性视神经萎缩类似于MS所导致的视神经炎。通过母系遗传的线粒体DNA上的突变已被鉴定出来。
HTLV相关的脊髓病是一种与人T淋巴病毒感染相关的慢性进行性脊索疾病，其特征是双腿强直性肌无力。
其它的神经疾病包括异常髓鞘化神经病，下面对其作一概述。
免疫性的：急性多神经病、格-巴多神经病、慢性多神经病、慢性免疫脱髓鞘性多神经病(CIDP)、多病灶的CIDP、多病灶的运动神经病(MMN)、抗髓磷脂相关蛋白综合征、抗硫脑酯抗体综合征(含有血清M-蛋白)、抗神经节苷脂2(GM2)抗体综合征、POEMS综合征、多神经病器官巨大症(Polyneuropathy Organomegaly)、内分泌病或水肿、M蛋白、皮肤变化、神经束膜炎、IgM抗GD1b抗体综合征(偶发)。
毒素：白喉，药鼠李，六氯酚，氰酸钠，碲。
药物：主要是脱髓鞘：氯喹，FK506(免疫抑制剂)，哌克昔林，普鲁卡因胺，齐美定；混和脱髓鞘及轴突：胺碘酮，嗜酸细胞增多性即痛综合征，金，苏拉明，紫杉醇。
遗传性的：碳水化合物缺乏性糖蛋白，白内障及面部畸形，科凯恩综合征(侏儒-视网膜萎缩-耳聋综合征)，先天性髓鞘化程度低，先天性肌营养不良：分层蛋白缺乏，法伯病(脂肪肉芽肿病)，遗传性运动感觉神经病和夏-马-图三氏综合征，显性遗传的：IA，IB，III，HNPP，EGR2，热敏性的，隐性遗传的：III(代-索病)；4A；4B；4B2；4C；4D(LOM)；4E；4F；HMSN-R；CNS，性染色体连锁的：IX，克拉伯病，马-斯综合征(遗传性共济失调、白内障、侏儒及智力缺陷综合征)，异染性脑白质营养不良，尼-皮病，佩-梅病(家族性脑白质病)(PLP)，雷夫叙姆病(植烷酸贮积症)，朊病毒蛋白(PrP27-30)：Glu200Lys突变，克-雅病(传染性海绵样脑病)，鼠模型：朊病毒过表达，Salla病，SOX10，细胞粘合素-XA，周围髓鞘不均匀包裹，Ehlers-Danlos表型。
代谢性的(不常见)：糖尿病(由于并发CIDP)，甲状腺功能低下，肝病。
线粒体性的：MNGIE综合征，肌病及外眼肌麻痹，神经病，胃肠脑病，NARP综合征，共济失调，视网膜炎，色素性视网膜炎(Pigmentosa)。
感染性的：克-雅病，白喉，HIV：相关性CIDP，麻风病：麻风结节(Lepromatous)；混合型轴突脱髓鞘化；克隆化的施万细胞，变异的克-雅病。
其它详细内容可在下列网址中查到：
http：//www.neuro.wustl.edu/neuromuscular/nother/myelin.html
多发性硬化症(MS)是一种中枢神经系统的炎症性脱髓鞘疾病，具有复发-缓和(relapsing-remitting)或进行性疾病过程。MS不仅仅是一种脱髓鞘疾病，其在外周神经系统中所对应的是慢性炎症性脱髓鞘多发性神经根性神经病(CIDP)。另外，还有急性单相病变，如外周神经系统的炎症性脱髓鞘多发性神经根性神经病也叫做格-巴综合征(GBS)，以及中枢神经系统的急性散播性脑脊髓炎(ADEM)。MS和GBS都是异质性综合征。对于MS来说，外源性攻击加上遗传因素就会导致疾病发生并最终达到该病的诊断标准。在这两个疾病中，除了主要的脱髓鞘损伤外还都有轴突的损伤，最终导致永久性的神经缺损。
在上述脱髓鞘疾病中MS是最常见的一种。其特征与自身免疫疾病相类似，其中免疫系统的白细胞攻击中枢神经系统分白质。灰质也可能被攻击。尽管MS发病的准确机制还不清楚，但致病因子可能包括遗传因素，细菌及病毒感染。其典型的临床表现(超过85％的病例)是发作/缓解相发生改变，相应的模式是神经障碍发作先持续数周，然后明显缓解或完全恢复(Noseworthy，1999)，随着得病时间的延长缓解期逐渐缩短。然后许多病人进入疾病后期，临床表现为神经功能逐渐丧失，有部分恢复或者无法恢复。这被称为次级进行性MS。只有一小部分MS病人(大约15％)从开始发病后逐渐而持续的出现神经功能下降(初级进行性MS)。从严格意义上来说到目前为止MS还没有明确的治愈措施，因此MS常常是致命的。
MS的基本标志是带有神经胶质斑的脱髓鞘斑块形成，见于脑和脊索的白质束。与脱髓鞘相联系的是神经脉冲传导出现功能性的减弱或阻断。MS病人也可能出现轴突横断和死亡(Bjartmar等，1999)。病理学研究表明受影响的主要限于视神经，脑室周围白质，脑干和脊索(Storch等，1998)这些中枢神经受损所产生效应包括急性症状如复视、麻木和不稳定步态，还有一些慢性症状如强直性下身轻瘫和不能自制。
MS发病的分子机制好像是有遗传及环境因素，包括病毒和细菌感染。这些因素促使T淋巴细胞和巨噬细胞穿过血脑屏障进入中枢神经组织。
脱髓鞘是由于活化的巨噬细胞和小胶质细胞攻击髓磷脂造成的，Fas-Fas配基信号和补体或抗体介导的细胞毒作用对髓磷脂生成细胞的损害也是造成脱髓鞘的原因。因此对髓鞘的直接攻击以及产生和维护髓磷脂的细胞减少都可以造成脱髓鞘。
遗传和环境因素可以导致通过血脑屏障进入大脑的炎症细胞增多。这会使进入中枢神经组织的自身活化T淋巴细胞和巨噬细胞增多。T细胞分泌的细胞因子活化抗原提呈细胞(APCs)。在APC上MHC II类分子存在的情况下当自身活化T细胞遇到推断的MS蛋白时，这些T细胞就被活化了，MS蛋白常常是髓鞘的蛋白组分。还有几种次要机制参与对少突胶质细胞和髓磷脂造成损伤。补体或抗体介导的细胞毒作用在某些病人中可能是引起损伤的主要因素，而在另外一些病人中，Fas-Fas配基信号和CD4+T细胞释放的前炎症因子如TNF-α可能会攻击白质。活化的巨噬细胞通过其增强的吞噬作用以及因子分泌也发挥重要作用。这会造成广泛的脱髓鞘从而导致神经脉冲沿中枢神经系统的轴突传导的效率下降。但是一旦炎症反应消失随后的修复机制可能会使髓鞘再生。MS病人再生的轴突在病理学上的表现为沿再生的轴突周围出现一层薄的鞘。在脱髓鞘的轴突膜上常常可以看到插有附加的钠离子通道以补偿传导效率的下降。少突胶质细胞的前体细胞可以促进MS损伤的髓鞘再生。
少突胶质细胞具有与髓鞘的生成及维护相关的多种功能。它可以绝缘、支持和传导维护多种神经元的轴突。一个少突胶质细胞就可以使多达50不同的轴突髓鞘化。髓鞘化只限于某些大直径的轴突；树突及其它细胞的突起如星形胶质细胞依然是无髓鞘的。轴突好像具有控制少突胶质细胞数目的能力，因为大鼠视神经轴突横断模型中髓磷脂的再生及少突胶质细胞前体细胞的生成都受到抑制(Barres和Raff的综述，1999)。在发育过程中轴突释放的因子可以刺激少突胶质细胞的增殖和迁移。少突胶质细胞和轴突以这种方式在中枢神经系统内密切配合。
少突胶质细胞是中枢神经系统内神经细胞周围的支持细胞，可以使轴突束髓鞘化从而促进神经脉冲的传导。他们在轴突的存活以及发挥功能中发挥作用。如这个图中所显示的那样，一种少突胶质细胞一般只使一种轴突髓鞘化。
在某些神经胶质细胞浆膜的某些特殊区域髓鞘是多层的，富含脂质而蛋白较少。它主要是通过组织电荷进入周围组织来支持轴突和促进中枢神经系统内的电信号传导。神经纤维结是沿轴突髓鞘的位点，在该位点出现跳跃性传导。
在成年脑中，少突胶质细胞来自于脑和脊索亚脑室区的还未准确定义的前体细胞(Nait-Oumesmar等，1999)。这些前体细胞是可以增殖的，并且表达髓磷脂转录子和蛋白，首先出现在髓鞘化前数周的胚胎脊索的腹侧区域(Hajihosseini等，1996)。髓鞘化的过程发生在出生后的脑中。在出生后发育过程中这些前体细胞迁移到已髓鞘化的神经元束中。
少突胶质细胞已一种已详细定义的特定的方式由其前体细胞发育成熟(综述见Rogister等，1999)。少突胶质细胞按照下列确定的途径发育，其中每一阶段由几种细胞特异性的标记物来划分：内皮神经细胞粘附分子(E-NCAM)，波形蛋白，A2B5，POU转录因子Tst-1/Oct6/SCIP，原少突胶质母细胞抗原(POA)，半乳糖脑苷脂(GalC)，O1，O4，以及髓磷脂特异性担保PLP、MBP和MOG。神经干细胞生成双极性的pre-CD3+细胞，后者再变成O2A前体细胞。这些细胞分化成少突胶质细胞或2型星形胶质细胞。在最终分化成少突胶质细胞前还要经过原少突胶质细胞和原半乳糖脑苷脂阳性细胞阶段。在少突胶质细胞发育体系的最后阶段其特征是这些细胞不再增殖。成熟的少突胶质细胞表达细胞特异性标记物半乳糖脑苷脂和硫酸脑苷脂(SUL)，还表达髓磷脂特异性蛋白质。
因此少突胶质细胞是从处于有丝分裂状态的迁移的前体细胞分化而来的。一旦这些细胞进入有丝分裂后阶段，他们就会转录和表达编码髓磷脂特异性蛋白的基因。包裹髓鞘的轴突是通过成熟的少突胶质细胞和轴突自身直接接触而形成的。通过髓鞘压紧中枢神经的轴突而完成髓鞘化，最后形成一种复合物形式的含大分子的液晶态髓鞘(Scherer，1997)。促进髓鞘化需要考虑髓鞘各个结构蛋白之间的精确化学计量关系，因为一个组分的增加和减少就可能导致整个髓鞘结构的改变。
维持脱髓鞘轴突修复功能的少突胶质细胞的不稳定会导致神经功能障碍的累积，形成MS。促进MS病人髓鞘再生可以避免轴突丧失从而限制由中枢神经轴突死亡而导致的功能障碍的进一步发展。
MS出现的脱髓鞘表型引起了对活动MS损伤性质的多方面研究。裸露的轴突及产生髓鞘的少突胶质细胞的缺乏说明正常的髓磷脂分解以及髓鞘再生过程的畸变。大约由40％的MS损伤表现出髓鞘再生障碍，特别是在疾病的早期(Prineas等，1993)。这为我们提供了一个现实的前景就是开发促进髓磷脂修复的治疗措施可能能够组织神经系统的永久性损伤。年轻的中枢神经损伤患者中成功的可能性特别高，因为这些患者在早期髓鞘再生现象确实存在。但是负责髓鞘化和髓鞘再生的少突胶质细胞处于极端的代谢压力下，在这种压力下即使再加上一些微小的刺激就可能导致不可逆损伤(Scolding和Lassmann，1996)。这就会使对活动MS损伤的任意修复的可能性下降，其中一些炎症及其它因素会阻碍髓鞘再生。因此促进活动MS损伤髓磷脂修复的策略要综合考虑髓鞘的再生和轴突的保护。
成年人中枢神经系统含有能增殖的少突胶质细胞的前体细胞，这些细胞成熟分化成负责髓鞘化的少突胶质细胞。另外，MS损伤在其慢性期内源性的少突胶质细胞前体细胞表现出衰竭的现象，这是因为这些前体细胞的增殖和分化能力受到抑制(Wolswijk，1998)。在慢性MS损伤的环境中这些前体细胞一般处于静止状态，因此使其无法进行髓鞘再生。因此慢性MS损伤可能包含阻止少突胶质细胞再生的因子或缺乏刺激少突胶质细胞前体细胞群增殖所必须的因子(Wolswijk，1998)。这一概念导致形成了一种假说，对MS的有效治疗不应仅仅限于抑制炎症还应该促进髓鞘的再生。髓鞘再生细胞有各种来源，包括损伤中存活下来的少突胶质细胞、来源于这些幸存者的细胞、或邻近的前体细胞。实验表明成熟的少突胶质细胞在细胞因子如碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的诱导下可以从新分化和增殖，说明发生了脱髓鞘疾病后体内依然存在使少突胶质细胞链再生的机制(Grinspan等，1996；Grinspan等，1993)。
通过用神经胶质生长因子治疗动物模型的研究还发现了一些证据证明髓鞘再生对脱髓鞘疾病具有有益的效果。神经胶质生长因子2(神经调节蛋白/GGF-2)是一种已知的能促进少突胶质细胞增殖和存活的中枢神经系统生长因子，在MS的EAE鼠模型中它可以延迟疾病的起始，缓解临床症状以及降低疾病发作的频率(Marchionni等，1999)。实验还证实神经调节蛋白是由轴突产生的，具有促进成熟少突胶质细胞存活的功能(Fernandez等，2000)。
其它生长因子如血小板源性生长因子(PDGF)和胰岛素样生长因子-1在EAE模型中也被证实具有促军髓鞘再生的功能以及具有治疗作用(综述见Dubois-Dalcq和Murray，2000)。通过诱导少突胶质细胞链上细胞的增殖和/或分化从而成功地刺激了髓鞘的再生，说明以髓鞘再生作为MS的治疗策略还是具有良好前景的。另外确定抑制髓磷脂合成的分子也是非常重要的，因为这些分子可能会降低修复策略如MS的少突胶质细胞移植的效果。
髓鞘再生策略可以抗炎症策略一起使用以修复损伤和保护轴突以免断裂和死亡。
少突胶质细胞可以被诱导使中枢神经轴突束从新髓鞘化，因此可以改善病症。促进髓鞘再生可以抵消如上面所述的免疫细胞进入中枢神经组织攻击髓鞘而导致的损伤。
利用检测不同基因表达的芯片已经分析了少突胶质细胞的分化以及多发性硬化症(DGE，Scarlato等，2000；Whitney等，1999)。这种芯片利用不同的微阵列技术分析不同族基因的表达。分化少突胶质细胞和多发性硬化症的基因表达分析表明髓磷脂特异性基因的表达出现明显的变化。另外，所分析的一些其它基因也出现表达的变化，其中许多都是已知的参与细胞活动如细胞周期的调控、细胞骨架的再造和膜运输的基因(Scarlato等，2000)。
骨桥蛋白是一种高度磷酸化的唾液蛋白，是骨和牙齿矿化的细胞外基质的主要组成成分。OPN的特征是具有多聚天冬氨酸序列和介导羟磷灰石结合的Ser/Thr磷酸化位点，以及具有一个介导细胞黏附和信号传导的高度保守的RGD基序。由于还没有一个OPN敲除小鼠模型因此还无法确定骨桥蛋白在各种组织中的功能，最近的研究发现了一些新的有趣的现象可以使我们了解这个蛋白在各种生物学事件包括发育过程、创伤修复、免疫反应、肿瘤发生、骨吸收以及骨钙化中功能的多样性。骨桥蛋白通过几个相互作用的信号通路中的多个受体刺激细胞的活动，可以解释这个蛋白功能的多样性(Sodek等)。
骨桥蛋白在大鼠的脊索和三叉神经系统的初级感觉神经元中有表达，其中神经元胞体和轴突上都有表达(Ichikawa等，2000)。
通过原位杂交发现成年人脑中有骨桥蛋白mRNA的表达。在嗅球和脑干的神经元中都有表达，在脑干中发现mRNA表达于各种功能区包括运动相关区、感觉系统区以及网状结构区(Shin等，1999)。
另外的研究发现大鼠前脑一过性缺血模型中有骨桥蛋白mRNA的空间及瞬时表达。球形缺血后出现的OPN mRNA瞬时表达出现在纹状体的时间比出现在海马的时间要早。实验还发现在微神经胶质细胞变得更活跃前在靠近侧脑室的背内侧纹状体和海马下下托有OPN mRNA的表达。另外在齿状门到CA3边缘的区域也有表达(LeeMY，Shin SL，Choi YS，Kim EJ，Cha JH，Chun MH，Lee SB，Kim SY，Neurosci Lett1999年8月20日271：2 81-4)。
骨桥蛋白也叫Eta-1。WO 00/63241描述了调节免疫反应的方法，特别是利用Eta-1(早期T淋巴细胞活化因子-1)/骨桥蛋白调节I型免疫反应的方法。骨桥蛋白调节子据说可用于治疗感染、免疫失调和疾病、自身免疫疾病包括MS、各种免疫缺陷以及癌症。骨桥蛋白的所有调节子在WO 00/63241中都有描述，这些调节子被用于治疗自身免疫疾病，包括MS，这些调节子是骨桥蛋白/Eta-1的抑制剂，该专利说明书的V部分“本发明调节方法的临床应用”和D部分″自身免疫疾病″有详细说明，见WO 00/63241的51-53页。
干扰素是一类具有抗炎、抗病毒和抗增殖活性的细胞因子。根据其生物化学和免疫学特性天然人干扰素可以分为三类：干扰素α(白细胞型)、干扰素β(成纤维细胞型)和干扰素γ(免疫型)。α干扰素现在在美国及其它国家已被批准用于治疗毛细胞白细胞、性病疣、卡波西肉瘤(一种恶性肿瘤，常见于获得性免疫缺陷综合征(AIDS)病人)和慢性非A、非B型肝炎。
干扰素还是肌体应对病毒感染而产生的一种糖蛋白。可以抑制病毒在被保护细胞内的复制。干扰素是有低分子量组成的蛋白质，其作用是非特异性的，也就是说一种病毒诱导产生的干扰素可以有效对抗多种其它病毒的感染。但是干扰素也是种特异性的，也就是说一个物种产生的干扰素只能在同种或近似物种的细胞内刺激产生抗病毒活性。干扰素是第一组被发现具有抗肿瘤和抗病毒活性的细胞因子。
三类主要的干扰素被称为干扰素α、干扰素β和干扰素γ。这些主要种类的划分最初是根据其细胞来源(白细胞、成纤维细胞或T细胞)。但是现在越来越清楚地显示一种细胞可以产生几种类型的干扰素。因此白细胞干扰素现在被称为干扰素α，成纤维细胞干扰素被称为干扰素β，T细胞干扰素被称为干扰素γ。干扰素还有第四种类型，淋巴浆细胞型干扰素，是由″Namalwa″细胞系产生的(来源于Burkitt淋巴瘤)，该细胞好像能产生白细胞型干扰素和成纤维细胞型干扰素的混合物。
据报道干扰素的一个活性单位被定义(有些武断的)为能保护50％的细胞免受病毒损伤所需要的量。
每一类干扰素又包括几种不同的亚类。干扰素β和干扰素γ是单基因产物。每一类之间的差别主要在于其糖基化的不同。
干扰素α包括的亚类最多，大约有15个。9号染色体上有一簇干扰素α基因，至少含有23个成员，其中25个是活动的，可以被转录。成熟的干扰素α是没有糖基化的。
干扰素α和干扰素β具有相同的长度(165或166个氨基酸)及相同的生物学活性。干扰素γ含有146个氨基酸，与干扰素α和干扰素β的相似程度较低。只有干扰素γ能活化巨噬细胞或诱导杀伤性T细胞的成熟。效果上这些新型的治疗药物被称为生物学反应调节剂(BRMs)，因为他们在有机体对肿瘤的反应过程中发挥效应，通过免疫调节影响肌体对肿瘤细胞的识别。
特别是人成纤维细胞型干扰素(干扰素β)具有抗病毒活性，能够刺激天然杀伤细胞对抗恶性肿瘤细胞。它是一种由病毒和双链RNA诱导产生的分子量大约为20000Da的多肽。根据成纤维细胞型干扰素基因的核苷酸序列，通过重组DNA技术进行克隆，Derynk等人(Derynk R等，1980)推算出该蛋白的完整氨基酸序列。它是166个氨基酸长度的蛋白质。
Shepard等人(Shepard H.M.等，1981)描述了一个在842位碱基突变的突变体(141位氨基酸由Cys变成Tyr)，该突变体的抗病毒活性消失，还描述了一个1119-1121位核苷酸缺失的突变克隆。
Mark等人(Mark D.F.等，1984)通过将469位的T替换成A插入了一个人工突变，使17位的氨基酸由Cys变成Ser。所得到的IFN-β的活性与天然IFN-β一样，并且在-70℃条件下长期储存更稳定。
Rebif(重组人干扰素β)是最新开发出的用于治疗多发性硬化症(MS)的一种干扰素，其治疗效果显著提高。Rebif是IFN-β 1a，从哺乳动物细胞系中制备，与天然人干扰素基本一致。
IFN发挥作用的机制还不是完全清楚。但是在大多数情况下他们是通过影响某些特定基因的诱导与表达进而调节免疫系统而发挥作用的。体外实验结果表明IFN能够诱导或抑制大约20种基因产物。IFN-β在MS中可能通过三种途径发挥作用：
■调节T细胞的功能如活化、增殖或抑制细胞功能；
■调节细胞因子的产生：下调炎症前细胞因子的表达和上调抑制、抗炎症细胞因子的表达；
■调节T细胞通过BBB(血脑屏障)迁移和渗入中枢神经系统。
通过PRISMS研究确立了利用干扰素β-1a每周三次皮下注射治疗发作/缓解型多发性硬化症(RR-MS)的有效性。本研究表明干扰素β-1a对长病程MS具有积极的疗效，通过MRI检测发现可以减少疾病的发作次数和发作的严重程度，并且可以减轻疾病的负担和疾病的活动(“干扰素β-1a治疗发作/缓解型多发性硬化症的随机、双盲、安慰剂对照研究”(Randomised，Double-Blind，Placebo-Controlled Studyof Interferon beta-la in Relapsing-remitting Multiple Sclerosis))，TheLancet 1998；352(11月7日，1998)：1498-1504.)。
本文对任何文献的引用都不代表承认该文献在本领域中是更重要的，也不是为了说明该申请书的权利要求的专利性。对任何文献的内容及日期的陈述都是基于申请人填写时所提供的信息，并不表示承认该陈述的正确性。
发明概述
本发明的目的在于提供一种治疗和/或预防神经疾病的新方法。
本发明是基于这样的发现：蛋白质骨桥蛋白可以促进神经胶质细胞的增殖和分化，因而促进神经的髓鞘化和再生。与本发明相一致的是还发祥骨桥蛋白在多发性硬化症和周围神经病的动物模型中有积极的治疗效果。
因此，本发明涉及骨桥蛋白或其活性的激动剂用于神经疾病如创伤性神经损伤、脑卒中、中枢神经系统或外周神经系统的脱髓鞘疾病、神经病以及神经变性疾病的治疗。
根据本发明的描述，骨桥蛋白还可以和干扰素联合以治疗和/或预防神经疾病。利用核酸分子、含有骨桥蛋白基因的表达载体以及能表达骨桥蛋白的细胞治疗和/或预防神经疾病也包括在本发明的范围之内。本发明还提供含有骨桥蛋白和干扰素以及一种或多种药学上可接受的赋形剂的药用组合物。
附图简述
图1A显示的是用直方图描述的cuprizone治疗后不同时间点上骨桥蛋白的表达水平，测量方法是用TaqMan分析。3/5w.Cup＝cuprizone治疗3周或5周，5w.cup+1/3/6w.＝cuprizone治疗5周然后cuprizone减少到三分之一或在6周后恢复。
图1B显示的是在小脑发育的不同阶段用TaqMan检测骨桥蛋白、MBP和PLP mRNA与对照C1水平相比所达到的调节倍数。C1至20＝出生后1到20天的小脑，CA＝成年小脑。
图2用示意图描述了骨桥蛋白的结构和已知的亚型以及其C端和N端显示的是结构。
图3描述了含骨桥蛋白编码序列的质粒Pac的示意图。
图4用直方图说明了用cAMP处理少突胶质细胞系oli-neu 6小时(1)，2天(2)，6天(3)或10天(4)后骨桥蛋白mRNA的表达水平与对照相比上调的倍数。柱5和6描述了cuprizone实验的骨桥蛋白mRNA水平。(5)：cuprizone治疗3周，(6)：cuprizone治疗5周。
图5是含有骨桥蛋白编码序列的质粒pDEST 12.2的示意图。
图6是含有骨桥蛋白编码序列和荧光标记物EGFP编码序列的质粒pDEST 12.2的示意图。
图7是含有带HIS-tag的骨桥蛋白编码序列的质粒pDEST 12.2的示意图。
图8显示的是胰岛素饥饿及用杆状病毒表达的骨桥蛋白(Baculo-OPN)或表达骨桥蛋白的HEK细胞(HEK-OPN)处理24小时后oli-neu细胞的增殖情况。所读取的是活细胞染料Alamar蓝所发出的荧光。
图9显示的是用表达骨桥蛋白的杆状病毒(Baculo-OPN)或表达骨桥蛋白的HEK细胞(HEK-OPN)处理24小时后胰岛素饥饿的oli-neu细胞增殖的剂量效应曲线。
图10显示的是胰岛素饥饿及用杆状病毒表达的全长骨桥蛋白(Baculo-OPN)或骨桥蛋白的N端片段(N端BacOPN)处理后oli-neu细胞的增殖情况。
图11显示的是用100nM的杆状病毒表达的骨桥蛋白处理混和皮质培养物的MBP免疫组化结果。A＝对照；B＝OPN处理；C＝B的放大；D＝另一个视野的OPN处理混和皮质培养物，此视野内看不见轴突。
图12显示的是用ELISA方法检测到的髓鞘化混和皮质培养物内的MBP蛋白增加情况，该培养物是用LIF和表达骨桥蛋白的杆状病毒处理过的。
图13显示的是用不同剂量(10pM，10nM，100nM)的表达骨桥蛋白的大肠杆菌(OPN-E-coli)或杆状病毒(OPN Bac)处理后的CG4细胞的增殖情况。
图14显示的是EAE小鼠脊索内血管周围的炎症浸润情况，该小鼠皮下分别注射溶剂(PBS)，溶剂加0.1％BSA，1、10或100μg/kg的AS900011(骨桥蛋白)或100μg/kg的AS900011(骨桥蛋白)加上20000U/每只鼠鼠干扰素β(mIFNβ)，或者单独的20000U/每只鼠mIFNβ。
图15显示的是EAE小鼠脊索内脱髓鞘面积的百分数，该小鼠皮下分别注射溶剂(PBS)，溶剂加0.1％BSA，1、10或100μg/kg的AS900011(骨桥蛋白)或100μg/kg的AS900011(骨桥蛋白)加上20000U/每只鼠鼠干扰索β(mIFNβ)，或者单独的20000U/每只鼠mIFNβ。
图16显示的是治疗结束后的临床积分、EAE小鼠炎症浸润以及脱髓鞘情况，该小鼠皮下分别注射溶剂(PBS)，溶剂加0.1％BSA，1、10或100μg/kg的AS900011(骨桥蛋白)或100μg/kg的AS900011(骨桥蛋白)加上20000U/每只鼠鼠干扰素β(mIFNβ)，或者单独的20000U/每只鼠mIFNβ。
图17显示的是通过压迫坐骨神经诱导产生的神经病小鼠的体重，这些小鼠分别用溶剂，1、10或100μg/kg的骨桥蛋白(Ost)，10μg/kg的阳性对照化合物(4-MC)或100μg/kg变性骨桥蛋白(Ost-D)处理。
图18显示的是神经病小鼠复合肌肉动作潜势的振幅，这些小鼠分别用溶剂，1、10或100μg/kg的骨桥蛋白(Ost)，10μg/kg的阳性对照化合物(4-MC)或100μg/kg变性骨桥蛋白(Ost-D)处理。
图19显示的是神经病小鼠复合肌肉动作潜势的潜伏期，这些小鼠分别用溶剂，1、10或100μg/kg的骨桥蛋白(Ost)，10μg/kg的阳性对照化合物(4-MC)或100μg/kg变性骨桥蛋白(Ost-D)处理。
图20显示的是神经病小鼠复合肌肉动作潜势的持续时间，这些小鼠分别用溶剂，1、10或100μg/kg的骨桥蛋白(Ost)，10μg/kg的阳性对照化合物(4-MC)或100μg/kg变性骨桥蛋白(Ost-D)处理。
图21显示的是神经病小鼠内变性纤维的百分数，这些小鼠分别用溶剂，1、10或100μg/kg的骨桥蛋白(Ost)，10μg/kg的阳性对照化合物(4-MC)或100μg/kg变性骨桥蛋白(Ost-D)处理。
图22显示的是神经病小鼠内每个区域内神经纤维的总数，这些小鼠分别用溶剂，1、10或100μg/kg的骨桥蛋白(Ost)，10μg/kg的阳性对照化合物(4-MC)或100μg/kg变性骨桥蛋白(Ost-D)处理。
本发明的详细描述
本发明的基础在于发现在少突胶质细胞分化及小脑发育过程中骨桥蛋白表达是不同的这一现象。本发明还发现在少突胶质细胞内导入骨桥蛋白的cDNA使其表达可以导致这些细胞在体外呈现出不同的表型。只要有骨桥蛋白的表达，少突胶质细胞就会呈现出与分化的髓鞘形成细胞相同的表型。除此以外还发现在体外骨桥蛋白，尤其是骨桥蛋白与干扰素联合使用时对已知的多发性硬化症模型具有有益的效果。在一个周围神经病实验模型中，骨桥蛋白对神经活性具有显著的疗效，可以明显降低变性的百分率，增加髓鞘化的程度。
因此本文的实验结果提供了一种新的治疗神经疾病的可能性，特别是对于那些与神经及神经胶质细胞功能相关的疾病。这些发现是十分令人惊奇的，因为WO00/63241是通过抑制骨桥蛋白来治疗多发性硬化症的。
因此本发明涉及利用骨桥蛋白或骨桥蛋白活性激动剂来制备治疗和/或预防神经疾病药物的方法。
本文中的术语“骨桥蛋白”是指全长人骨桥蛋白，含有已知的从后80个氨基酸开始的氨基酸序列(Oldberg等，1986；Kiefer等，1989)。人骨桥蛋白的序列在本文中用附加序列表中的SEQ ID NO：1表示。本文中的术语“骨桥蛋白”还表示任何动物来源的骨桥蛋白，如鼠、牛或大鼠骨桥蛋白，只要其序列足以维持其骨桥蛋白活性，以及得到的分子在人体内无免疫原性。
本文中的术语“骨桥蛋白”还表示具有生物活性的突变蛋白及蛋白片段，如骨桥蛋白的天然亚型。骨桥蛋白通过在转录水平(选择性剪接)及翻译后修饰(磷酸化，糖基化)可以表达出具有不同功能的形式。现在已知有三个剪接突变体，分别命名位OPN-a(本文也称为“全长”骨桥蛋白)、OPN-b和OPN-c(附加序列表中的SEQ IDNO：1，2和3，在图2中也有描述)。Kon等人(2000)描述了其亚型，Saitoh等(1995)和Kon等(2002)描述了亚型的特征。
凝血酶在体内可以将骨桥蛋白裂解为含有N端部分和C端部分的蛋白片段。骨桥蛋白，特别是其C端部分的磷酸化对于骨桥蛋白的功能维持是十分重要的。因此本文所用的术语“骨桥蛋白”也包含那些蛋白裂解片段及具有不同磷酸化的形式。
本文所用的术语“骨桥蛋白”还包括亚型、突变蛋白质、融合蛋白质、功能衍生物、活性部分或片段、或者环行排列的衍生物及其盐。这些亚型、突变蛋白质、融合蛋白质、功能衍生物、活性部分或片段、或者环行排列的衍生物保持了骨桥蛋白的生物学活性。较好的是其生物学活性与野生型的骨桥蛋白一样。
本文所用的术语“骨桥蛋白活性激动剂”是指能刺激或模仿骨桥蛋白活性的分子，如骨桥蛋白受体的拮抗性抗体，或能通过骨桥蛋白受体激活信号的小分子激动剂。骨桥蛋白通过两类抗体介导其功能。首先它通过RGD(Arg-Gly-Asp)细胞附着基序在锰的正信号影响下与αv-整合素(αvβ3和αvβ5整合素)受体相互作用(Kunicki等，1997)。其次，它与CD44变异体亚型v6-v10相互作用。骨桥蛋白的C端部分被认为是参与和CD44相互作用的部分，而其N端部分被认为是参与和整合素受体相互作用以及参与巨噬细胞的增殖、存活和分化的部分。骨桥蛋白的N端部分也可以诱导IL-12和IL-10的释放。这些受体的任何激动剂、刺激因子或增强因子都包括在本文所用术语“OPN活性激动剂”的范围之内。
本文所用的术语“骨桥蛋白活性激动剂”还指能增强骨桥蛋白所介导活性的因子，如促进细胞黏附到细胞外基质上，促进少突胶质细胞链上的细胞分化成髓磷脂生成细胞，促进少突胶质细胞链上细胞(如祖细胞或前体细胞)的充实、增殖、分化或成熟，阻止少突胶质细胞链上的细胞调亡或受损。
本文所用的术语“治疗”和“预防”应该被理解为阻止、抑制、减轻、改善或逆转神经疾病的一种或多种症状或病因，或者神经疾病所导致的症状、疾病或并发症。当治疗神经疾病时，在疾病开始后给予本发明的物质，而预防是指在病人出现症状前给予本发明的物质。
本文所用的术语“神经疾病”包括所有已知的神经疾病或神经障碍，或者中枢神经系统及外周神经系统的损伤，包括本发明背景部分所详细描述的那些疾病。
神经疾病包括与中枢神经系统及外周神经系统功能障碍有关的疾病，如与神经传导有关的疾病、头疼、头部创伤、CNS感染、神经-眼科及颅神经病症、脑叶的运动功能障碍、木僵和昏迷、脱髓鞘疾病、谵语和痴呆、颅颈接合异常、癫痫、脊索障碍、睡眠障碍、周围神经系统障碍、脑血管疾病或肌肉疾病。这些疾病的定义参加网址： http：//www.merck.com/pubs/mmanual/section14/sec14.htm
本发明的神经疾病优选自下列疾病：创伤性神经损伤、脑卒中、中枢神经系统或外周神经系统的脱髓鞘疾病以及神经变性疾病。
创伤性神经损伤可以涉及外周神经系统，也可以涉及中枢神经系统，可以是脑或脊索的创伤，包括本发明背景部分所描述的截瘫。
脑卒中是由脑缺氧或缺血引起的。也叫脑血管病或脑血管意外。脑卒中可能会由于脑内某些区域血液供应不足而导致脑功能丧失。脑血液供应不足可以是由脑内形成的血栓(脑血栓)、或其它部位形成的运行到脑部的动脉粥样斑块或其它物质(血栓)引起的。脑内出血(脑出血)可能会导致与脑卒中相似的症状。脑卒中最常见的原因是动脉粥样硬化引起的脑卒中(脑血栓形成)，因此本发明也涉及动脉粥样硬化的治疗。
周围神经病可能会导致感觉丧失、肌无力和萎缩、深度腱反射减弱以及血管舒张症状的一种或多种。神经病可能影响单个神经(单一精神病变)、不同区域的两个或多个神经(多发性单一精神病变)或多个神经同时受影响(多神经病)。受影响的可能主要是轴突(如糖尿病，莱姆病，或尿毒症及其它毒性药物导致的损伤)，或者是髓鞘或施万细胞(如急性或慢性炎症性多神经病，脑白质营养不良，或格-巴综合征)。按照本发明的方法还可以治疗由下列原因引起的神经病：铅中毒、氨苯砜的使用、蜱咬、卟啉病或格-巴综合征，这些疾病可能主要影响运动纤维。其它的如由肿瘤的背根神经节炎、麻风病、AIDS、糖尿病或慢性维生素B6中毒引起的疾病可能主要影响背根神经节或感觉神经纤维，导致感觉障碍。脑神经也可能被影响，如格-巴综合征、莱姆病、糖尿病和白喉。
阿尔茨海默病是一种由脑组织改变而引起的心里功能衰退障碍。其中包括脑组织萎缩、初级变性性痴呆及弥散性脑萎缩。阿尔茨海默病也叫老年痴呆/阿尔茨海默型(SDAT)。
帕金森病是一种脑病，其特征是摇摆及行走、运动和协调困难。该病与控制肌肉运动的脑组织受损有关。也叫震颤麻痹或震颤性麻痹。
亨庭顿舞蹈病是一种遗传性常染色体显性神经疾病。
肌萎缩性侧索硬化症(ALS)是一种由神经对随意运动肌肉的控制进行性丧失所引起的，其主要原因是脑和脊索的神经细胞受到破坏。肌萎缩性侧索硬化症也叫Lou Gehrig病，是一种包括使用及控制肌肉功能丧失的疾病。
多发性硬化症(MS)是一种中枢神经系统的炎症性脱髓鞘疾病，具有发作/缓解或进行性疾病过程。MS不仅仅是一种脱髓鞘疾病，其在外周神经系统中所对应的是慢性炎症性脱髓鞘多发性神经根性神经病(CIDP)。另外，还有急性单相病变，如外周神经系统的炎症性脱髓鞘多发性神经根性神经病也叫做格-巴综合征(GBS)，以及中枢神经系统的急性散播性脑脊髓炎(ADEM)。
其它的神经疾病还有异常髓鞘化引起的神经病如上面发明背景中所列出的那种，以及腕管综合征。脊柱矫形并发症可能会伴有创伤性神经损伤，这些损伤也在本发明所包括的范围之内。
神经疾病还可以是由先天性代谢障碍引起的。因此本发明的一个优选实施方式就描述了这种由先天性代谢缺损引起的神经疾病。
本发明所包括的先天性代谢障碍可以是苯丙酮尿症和其它氨基酸尿症、泰-萨病、尼-皮病和高歇病；胡尔勒综合征；克拉伯病和其它脑白质营养不良。这些疾病可以影响髓鞘的发育，主要是影响CNS的髓鞘发育。
先天性代谢障碍引起的神经疾病已在发明背景中作了详细描述。
那些不太被人熟知的神经疾病也在本发明的范围之内，如神经纤维瘤病或多系统萎缩(MSA)。其它的一些疾病也可以根据本发明的方法进行治疗，这些疾病已在发明背景中作了详细描述。
在另外一个优选实施方式中神经疾病是指周围神经病，最优选的是糖尿病性神经病。与化疗相关的神经病也是本发明所优选的。
术语“糖尿病性神经病”是指糖尿病性神经病的任何形式，或者指糖尿病性神经病伴随的或由其引起的一种或多种症状或障碍，或者指上述发明背景所详细描述的影响神经的糖尿病并发症。在糖尿病性多神经病中，许多神经同时受损。糖尿病性神经病也可以是单一精神病变。例如在局部单一精神病变中疾病只累及单个神经，如动眼神经或外展脑神经。如果是不同区域的两个或多个神经受损也可以是多发性单一精神病变。
在另一个优选实施方式中，神经疾病是指脱髓鞘疾病。优选的脱髓鞘疾病包括CNS的脱髓鞘疾病，如急性散播性脑脊髓炎(ADEM)和多发性硬化症(MS)，也包括周围神经系统的脱髓鞘疾病。后者有慢性炎症性脱髓鞘疾病多发性神经根性神经病(CIDP)及急性单相疾病如炎症性脱髓鞘疾病多发性神经根性神经病也叫格-巴综合征(GBS)。
本发明还有一个优选实施方式涉及神经变性疾病的治疗和/或预防。神经变性疾病选自阿尔茨海默病、帕金森病、亨庭顿舞蹈病和ALS。
优选的骨桥蛋白选自下列肽、多肽或蛋白：
(a)含有SEQ ID NO：1的多肽；
(b)含有SEQ ID NO：1的1到168或1到170氨基酸的多肽；
(c)含有SEQ ID NO：1的1到16和170到314氨基酸的多肽；
(d)含有SEQ ID NO：1的170到314氨基酸的多肽；
(e)含有SEQ ID NO：2的多肽；
(f)含有SEQ ID NO：3的多肽；
(g)(a)到(f)的任何一个突变体，其中的氨基酸序列与(a)到(f)中至少一个序列至少有40％、50％、60％、70％、80％或90％的同一性；
(h)(a)到(f)的任何一个突变体，该突变体是由在温和条件或严格条件下能与编码(a)到(f)任何一个突变体的天然DNA序列的互补序列杂交的DNA序列编码的；
(i)(a)到(f)的任何一个突变体，其中，所述氨基酸序列的任何改变都是用保守性氨基酸取代(a)到(f)任何一个突变体的氨基酸；
(j)(a)到(f)任何一个突变体的盐或亚型、融合蛋白、功能衍生物、活性片段或环形排列的衍生物。
活性部分或片段可以指任何一个骨桥蛋白亚型的任一部分或区域，如N端部分或C端部分、以及如图2所显示的OPN-a、OPN-b或OPN-c的任何一个。GRGDS基序可以存在、可以缺失或突变。可以将肝索结合位点突变以使骨桥蛋白无法与肝素结合。而且全长骨桥蛋白或任一活性片段都可以在下列丝氨酸残基上有一个或多个被磷酸化：8，10，11，33，46，47，60，62，65，83，86，89，92，101，104，107，110，113，153，155，175，179，199，203，208，212，218，223，227，238，242，247，251，254，259，264，275，287，292，294，295。另外，丝氨酸磷酸化位点可以从丝氨酸突变成谷氨酸以模拟磷酸化。
本领域的技术人员优选即使是骨桥蛋白的一小部分也能足以维持其功能的分子，如含有维持骨桥蛋白基本功能所需的必须氨基酸残基的活性肽。
本领域的技术人员还优选与骨桥蛋白活性一样、甚至更好的骨桥蛋白的突变蛋白质、盐、亚型、融合蛋白质、功能衍生物、活性部分或片段、或者环行排列的衍生物。骨桥蛋白及其突变蛋白质、亚型、融合蛋白质、功能衍生物、活性部分或片段、或者环行排列的衍生物的活性可以用共培养分析检测，如实施例8所描述的检测方法。含有少突胶质细胞和其它中枢神经系统源细胞(如神经元，星形胶质细胞，小胶质细胞)的混和皮质培养物与OPN或其突变体、亚型、片段、活性部分、功能衍生物及其盐共孵育后可以上调典型髓鞘化基因的表达，如PO、MBP或MAG。基因的表达可以通过定量实时RT-PCR(TagManRT-PCR)检测，该方法在下面的实施例中有详细解释。还有一种简单的分析OPN活性的方法是少突胶质细胞增殖试验，该方法是将适当的少突胶质细胞株如oli-neu或CG4细胞与OPN或其突变体、亚型、片段、活性部分、功能衍生物及其盐共孵育，详细描述见下面的实施例7。
优选的活性片段是具有和全长骨桥蛋白一样或更好活性的片段，或者还有其它的优点，如更好的稳定性或更低的毒性或免疫原形，或者易于大量制备，或易于纯化。本领域的技术人员优选那些能通过插入到适当载体中的相应cDNA克隆技术制备的并且能用上述共培养分析方法检测的骨桥蛋白的突变体、活性片段及功能衍生物。
本发明所涉及的蛋白质可以是糖基化的，也可以是非糖基化的，可以来自天然资源如体液，也可以通过重组制备。重组表达可以在原核表达系统如大肠杆菌中进行，也可以在真核表达系统如昆虫细胞中进行，优选哺乳动物表达系统，如CHO细胞或HEK细胞。
本文所用的术语“突变体”是指骨桥蛋白的类似物，其中天然骨桥蛋白的一个或多个氨基酸残基被不同的氨基酸残基替代，或者缺失，或者将一个或多个氨基酸残基添加到骨桥蛋白的天然序列上，但与野生型的骨桥蛋白相比其活性无明显改变。这些突变体可以通过已知的合成技术和/或位点突变技术，或者其它任何已知的合适技术制备。
按照本发明的方法能够使用的骨桥蛋白突变体或编码这些突变体的核酸包括一组有限的实质一致的序列作为替代多肽或多聚核苷酸，这些多肽或多聚核苷酸可以按照本文所提供的指导不需过度的实验通过本领域的任一普通技术制备。
本发明的突变体包括核酸如DNA或RNA编码的蛋白质，根据本发明这些核酸在温和的或严格的条件下能与编码OPN的DNA或RNA杂交。术语“严格条件”是指杂交和随后的洗涤条件，本领域的普通技术人员通常将这些田间称为“严格的”。见Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，同上，Interscience，N.Y.，§§6.3 and 6.4(1987，1992)，和Sambrook等(Sambrook，J.C.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)。
严格的条件包括而不限于洗涤条件：杂交Tm计算值下12-20℃，2×SSC和0.5％SDS洗涤5分钟，2×SSC和0.1％SDS洗涤15分钟；0.1×SSC和0.5％SDS 37℃洗涤30-60分钟，然后用0.1×SSC和0.5％SDS 68℃洗涤30-60分钟。本领域的普通技术人员所谓的严格条件也要考虑DNA序列、寡核苷酸探针(如10-40个碱基)或混和寡核苷酸探针的长度。如果用混和探针，优选用四甲基氯化铵(TMAC)代替SSC。见Ausubel，同上。
在一个优选实施方式中，任何一个这种突变体与附加序列表的序列SEQ IDNO：1、2或3至少都有40％的一致性或同源性。更好的是至少有50％、60％、70％、80％的一致性或同源性，最好的是有90％的一致性或同源性。
通过比较确定的一致性反映了两个或多个多肽序列或多聚核苷酸序列之间的关。一般来说一致性是指在所比较的序列长度上两个多聚核苷酸的核苷酸对核苷酸的精确性，或两个多肽序列的氨基酸对氨基酸的精确性。
对于不是精确一致的序列来说可以确定其“％一致性”。通常情况下将所要比较的两个序列排列在一起来得出两个序列之间的最大相关性。可以通过在一个或两个序列上插入“空格”来增加排列的整齐程度。％一致性可以在所比较的每一序列的全长上确定(所谓的通用排列)，这种排列方法特别适于长度一致或很接近的序列，或者在较短的特定的长度上确定(所谓的局部排列)，这种排列方法比较适于长度不同的序列。
比较两个或多个序列一致性和同源性的方法是本领域所熟知的。因此Wisconsin序列分析软件包，9.1版(Devereux J等，1984)中的程序如BESTFIT和GAP可用于确定两个多聚核苷酸的％一致性和两个多肽序列的％一致性及％同源性。BESTFIT利用的是Smith和Waterman(1981)的“局部同源性”算法，找出两个序列之间的最简单区域的相似性。其它确定序列一致性和/或相似性的程序也是本领域所熟知的，如BLAST家族的程序(Altschul S F等，1990，Altschul S F等，1997，可以通过NCBI的主页查到，网址是www.ncbi.nlm.nih.gov)和FASTA(PearsonW R 1990；Pearson 1988)。
根据本发明突变体优选的变化是已知的“保守替代”。骨桥蛋白多肽的保守氨基酸取代可以包括同组氨基酸内的同义氨基酸取代，同组氨基酸内的氨基酸具有相似的物理化学性质，其成员之间的替代可以保持分子的生物学功能(Grantham，1974)。现在已经清楚氨基酸的插入和缺失也可以在预先确定的序列上进行而不改变蛋白质的功能，特别是插入或缺失的只是少量氨基酸，如30个以内，优选10个以内，以及不删除或替换维持功能的关键氨基酸，如半胱氨酸残基。通过这种缺失和/或插入得到的蛋白质和突变体也包括在本发明的范围之内。
优选的同义氨基酸组是表I所列的那些氨基酸。更优选的是表II所列的那些氨基酸；最优选的是表III所列的那些氨基酸。
表I
优选的氨基酸组
氨基酸                       同义氨基酸组
Ser                Ser，Thr，Gly，Asn
Arg                Arg，Gln，Lys，Glu，His
Leu                Ile，Phe，Tyr，Met，Val，Leu
Pro                Gly，Ala，Thr，Pro
Thr                Pro，Ser，Ala，Gly，His，Gln，Thr
Ala                Gly，Thr，Pro，Ala
Val                Met，Tyr，Phe，Ile，Leu，Val
Gly                Ala，Thr，Pro，Ser，Gly
Ile                Met，Tyr，Phe，Val，Leu，Ile
Phe                Trp，Met，Tyr，Ile，Val，Leu，Phe
Tyr                Trp，Met，Phe，Ile，Val，Leu，Tyr
Cys                Ser，Thr，Cys His Glu，Lys，Gln，Thr，Arg，His
Gln                Glu，Lys，Asn，His，Thr，Arg，Gln
Asn                Gln，Asp，Ser，Asn
Lys                Glu，Gln，His，Arg，Lys
Asp                Glu，Asn，Asp
Glu                Asp，Lys，Asn，Gln，His，Arg，Glu
Met                Phe，Ile，Val，Leu，Met
Trp                Trp
表II
更优选的氨基酸组
氨基酸                      同义氨基酸组
Ser                    Ser
Arg                    His，Lys，Arg
Leu                    Leu，Ile，Phe，Met
Pro                    Ala，Pro
Thr                    Thr
Ala                    Pro，Ala
Val                    Val，Met，Ile
Gly                    Gly
Ile                    Ile，Met，Phe，Val，Leu
Phe                    Met，Tyr，Ile，Leu，Phe
Tyr                    Phe，Tyr
Cys                    Cys，Ser
His                    His，Gln，Arg
Gln                    Glu，Gln，His
Asn                    Asp，Asn
Lys                    Lys，Arg
Asp                    Asp，Asn
Glu                    Glu，Gln
Met                    Met，Phe，Ile，Val，Leu
Trp                    Trp
表3
最优选的氨基酸组
氨基酸                    同义氨基酸组
Ser                        Ser
Arg                       Arg
Leu                       Leu，Ile，Met
Pro                       Pro
Thr                       Thr
Ala                       Ala
Val                       Val
Gly                       Gly
Ile                       Ile，Met，Leu
Phe                       Phe
Tyr                       Tyr
Cys                       Cys，Ser
His                       His
Gln                       Gln
Asn                       Asn
Lys                       Lys
Asp                       Asp
Glu                       Glu
Met                       Met，Ile，Leu
Trp                       Met
在蛋白质上进行氨基酸替换以获得用于本发明的骨桥蛋白突变体、多肽或蛋白质可以通过任何已知的方法步骤，如Mark等人的美国专利4,959,314、4,588,585和4,737,462号；Koths等人的5,116,943号；Namen等人的4,965,195号；Chong等人的4,879,111号和Lee等人的5,017,691号；以及美国专利4,904,584号中所描述的赖氨酸替代蛋白质(Shaw等)。
术语“融合蛋白”是指由骨桥蛋白或其突变体及片段和其它蛋白融合而成的多肽，这种融合蛋白在体液内的滞留期延长。因此骨桥蛋白可与其它蛋白质、多肽及其类似物质如免疫球蛋白或其片段融合。
本文所用的术语“功能衍生物”涵盖骨桥蛋白及其突变体和融合蛋白的衍生物，这些衍生物可以用本领域的已知技术通过改变残基的侧链上的功能基团或N末端及C末端基团来制备，只要其保留药用特性，即不破坏蛋白质的活性，其活性与骨桥蛋白实质上一致，并且不会导致含有该衍生物的组合物出现毒性就可以包括在本发明中。
例如，这些衍生物可以包括能遮蔽抗原位点并且能延长骨桥蛋白在体内治滞留期的聚乙二醇侧。其它衍生物包括羧基的脂肪酯，通过与氨或者初级胺或次级胺反应形成的羧基的酰胺，氨基酸残基的游离氨基与酰基(烷基或环碳芳基)形成的N酰基衍生物，以及游离羟基(如丝氨酸或苏氨酸残基的羟基)与酰基形成的O酰基衍生物。
本发明所述的骨桥蛋白及其突变体和融合蛋白的“活性片段”涵盖蛋白分子或者蛋白分子与其相连的分子或残基如糖链或磷酸基的多肽链的任何片段或前体，或者蛋白分子或糖链自身的聚集物，所述片段的活性与骨桥蛋白实质上是一样的。
本文的术语“盐”是指羧基盐和OPN分子及其类似物的氨基酸加成盐。羧基盐可以通过本领域已知的方式形成，包括有机盐如钠盐、钙盐、铵盐、铁盐或锌盐，以及类似的盐，有机碱盐如与氨(如三乙醇胺，精氨酸或赖氨酸，哌啶，普如卡因及类似物质)形成的盐。酸加成盐包括与矿酸如盐酸或硫酸形成的盐，与有机酸如醋酸或草酸形成的盐。当然，所有这些盐都必须保持本发明所需要的OPN的生物学活性，即刺激少突胶质细胞增殖的效应。
在本发明的一个优选实施方式中，骨桥蛋白与载体分子、肽或蛋白融合以促进其穿过血脑屏障(“BBB”)。这样可以是这些分子具有正确的靶向作用以到达病人体内的作用位点，这些病人所患疾病包括CNS的损伤。因为药物需要通过血脑屏障，因此给药方式要求能透过血脑屏障，通过渗透的方式或用一些具有血管作用的物质如缓激肽通过生物化学方式透过。通过血脑屏障的其它策略可以利用内源性的转运系统，包括载体介导的转运子，如葡萄糖载体和氨基酸载体；胰岛素或运铁蛋白的受体介导的内吞作用；以及活性射流转运子如p-糖蛋白。通过BBB的药物运输策略还包括脑内植入。
骨桥蛋白的衍生物可以共价连接到多聚物上以改善蛋白的特性，如稳定性、半衰期、生物利用度、人体的耐受性或免疫原性。为了达到这一目的，骨桥蛋白可以连接到聚乙二醇(PEG)上。PEG化可以通过已知的方法进行，如WO 92/13095所描述的方法。
因此，在本发明的一个优选实施方式中，骨桥蛋白是PEG化的。
在本发明的另一个优选实施方式中，融合蛋白是一个免疫球蛋白融合子。融合可以是直接的，也可以同一个短连接肽，可以短到1至3个氨基酸残基或更长，例如13个氨基酸残基。所谓的连接物是位于骨桥蛋白序列与免疫球蛋白序列之间的具有E-F-M(Glu-Phe-Met)的三肽，或者是含有Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met的13氨基酸连接序列。所得到的融合蛋白特性得以改善，如在体液中的滞留期延长，特异性增高、表达水平升高等。免疫球蛋白融合子还有利于融合蛋白的纯化。
在另外一个优选实施方式中，骨桥蛋白与免疫球蛋白的恒定区融合。优选与重链区如人IgG1的CH2和CH3区融合。免疫球蛋白分子的其它亚型也适于按照本发明的方法制备融合蛋白，如IgG2或IgG4亚型，以及其它类的免疫球蛋白如IgM。融合蛋白可以是单体，也可以是多聚体，可以是异源多聚体，也可以是同源多聚体。融合蛋白中的免疫球蛋白部分可以进一步修饰以避免激活补体结合或补体级联反应，或者结合到Fc受体上。
本发明还涉及联合使用骨桥蛋白和免疫抑制剂制造治疗和/或预防神经疾病的药物，二者可以连续使用，也可以分别使用。免疫抑制剂可以是类固醇、氨甲蝶呤、环磷酰胺、抗白细胞抗体(如CAMPATH-1)以及类似药物。
本发明还涉及联合使用骨桥蛋白和干扰素制造治疗和/或预防神经疾病的药物，二者可以连续使用，也可以分别使用。
本专利申请书中所用的术语“干扰素”包括文献中所定义为干扰素的任何分子，例如包括上述“发明背景”部分所提到的任何种类的IFN。优选的是人源干扰素，但其它物种来源的干扰素也可以，只要其生物学活性与人源干扰素一样，并且在人体内没有免疫原性。
特别是IFN-α、IFN-β和IFN-γ都包括在上述定义中。其中IFN-β是本发明优选的干扰素。
本发明所用的术语“干扰素β(IFN-β)”指人成纤维细胞干扰素，通过从生物液体分离得到或通过DNA重组技术从原核或真核宿主细胞中获得，也指干扰素的盐、功能衍生物、突变体、类似物和片段。
本文所用的术语“功能衍生物”涵盖用本领域的已知技术通过改变残基侧链上的功能基团或N末端及C末端基团来制备的衍生物，只要其保留药用特性，即不破坏如上所述的蛋白质的活性，如与相应受体的结合能力和启动受体信号的能力，不会导致含有该衍生物的组合物出现毒性就可以包括在本发明中。衍生物可以有化学基团，如糖链或磷酸基，只要该衍生物保持蛋白的生物学活性并且可以作药用。
例如，这些衍生物可以包括能遮蔽抗原位点并且能延长骨桥蛋白在体内治滞留期的聚乙二醇侧。其它衍生物包括羧基的脂肪酯，通过与氨或者初级胺或次级胺反应形成的羧基的酰胺，氨基酸残基的游离氨基与酰基(烷基或环碳芳基)形成的N酰基衍生物，以及游离羟基(如丝氨酸或苏氨酸残基的羟基)与酰基形成的O酰基衍生物。这种衍生物也可以含有能遮蔽抗原位点的聚乙二醇侧链以延长其在体液内的滞留期。
那些能在体内滞留较长时间的衍生蛋白或与复合药物结合的蛋白是特别重要的。例如上面所提到的PEG化的衍生物，或在体内能长期保持活性的基因工程蛋白都可以应用到本发明中。
术语“衍生物”只包括那些20种常见天然氨基酸不发生改变的衍生物。
本文的术语“盐”既指羧基盐也指上述蛋白质或其类似物氨基的酸加成盐。羧基盐可以通过本领域已知的方式形成，包括有机盐如钠盐、钙盐、铵盐、铁盐或锌盐，以及类似的盐，有机碱盐如与氨(如三乙醇胺，精氨酸或赖氨酸，哌啶，普如卡因及类似物质)形成的盐。酸加成盐包括与矿酸如盐酸或硫酸形成的盐，与有机酸如醋酸或草酸形成的盐。当然，所有这些盐都必须保持本发明所需要的蛋白质(骨桥蛋白和IFN-β)的生物学活性，如与相应受体结合的能力及启动受体信号的能力。
干扰素也可以被连接到多聚物上以增加蛋白质的稳定性。IFN-β和聚乙二醇(PEG)的连接在WO99/55377中已有描述。
本发明另外一个优选实施方式中，干扰素是干扰素β(IFN-β)，更优选的是IFN-β1a。
骨桥蛋白优选与干扰素同时、连续或分别使用。
在本发明的一个优选实施方式中，干扰素的用量大约为每千克体重0.0001-100毫克、每千克体重0.01-10毫克、每千克体重1-5毫克、或每千克体重2毫克。
本发明还涉及利用核酸分子制备治疗和/或预防神经疾病的药物，其中核酸分子含有的核酸序列能编码具有如下氨基酸序列之一的多肽：
(a)含有SEQ ID NO：1的多肽；
(b)含有SEQ ID NO：1的1到168或1到170氨基酸的多肽；
(c)含有SEQ ID NO：1的1到16和170到314氨基酸的多肽；
(d)含有SEQ ID NO：1的170到314氨基酸的多肽；
(e)含有SEQ ID NO：2的多肽；
(f)含有SEQ ID NO：3的多肽；
(g)(a)到(f)的任何一个突变体，其中的氨基酸序列与(a)到(f)中至少一个序列至少有40％、50％、60％、70％、80％或90％的同一性；
(h)(a)到(f)的任何一个突变体，该突变体是由在温和条件或严格条件下能与编码(a)到(f)任何一个突变体的天然DNA序列的互补序列杂交的DNA序列编码的；
(i)(a)到(f)的任何一个突变体，其中，所述氨基酸序列的任何改变都是用保守性氨基酸取代(a)到(f)任何一个突变体的氨基酸；
(j)(a)到(f)任何一个突变体的盐或亚型、融合蛋白、功能衍生物、活性片段或环形排列的衍生物。
核酸可以裸核酸分子的形式通过肌肉注射给予。
核酸还可以包含载体序列，如病毒序列，以利于核酸分子编码的基因在人体内表达，优选在适当细胞和组织内表达。
因此在一个优选实施方式中，核酸还包括表达载体。表达载体序列是本领域熟知的，可以包含调控目的基因表达的元件。表达载体可以含有调节序列如启动子和增强子序列、筛选标记物序列、复制起点以及类似序列。因此基因治疗方法可用于疾病的治疗和/或预防。比较好的是骨桥蛋白在原位表达。
在一个优选实施方式中，表达载体是豆状病毒来源的载体。豆状病毒载体已被证实用于基因转移是十分高效的，尤其是在CNS内。其它已知的病毒载体如腺病毒载体也可用于本发明中。
可以用靶向性载体以提高骨桥蛋白通过血脑屏障的能力。这种载体可以靶向如运铁蛋白受体或其它内源性转运蛋白。
在本发明的一个优选实施方式中，表达载体通过肌肉注射的方式给予。
利用载体诱导和/或增加在正常情况下骨桥蛋白表达停止或骨桥蛋白表达量不足的细胞内内源性骨桥蛋白的表达也是本发明所涉及的范围。载体含有调节骨桥蛋白表达的调节序列。这种调节序列可以是启动子或增强子。将调节序列通过同源重组插入到基因组的适当位点，人为的使调节序列与要诱导或要增强表达的基因相连。该技术通常被称为“内源性的基因活化(EGA)”，见WO 91/09955的描述。
本发明还涉及利用经过基因改造的细胞产生骨桥蛋白用于制备治疗和/或预防神经疾病的药物。
本发明还涉及能产生用于制备治疗和/或预防神经疾病的药物-骨桥蛋白的经过基因改造的细胞。因此细胞治疗方法也可用于将药物运送到人体的适当位置。
本发明还涉及药用组合物，特别使用于预防和/或治疗神经疾病的药用组合物，该组合物含有有效治疗量的骨桥蛋白和有效治疗量的干扰素，还可以选择添加有效治疗量的免疫抑制剂。
术语“药用的”的意思包括任何载体，这些载体不会干扰活性组分生物学活性的效果，对于所给予的宿主也没有毒性。例如，对于胃肠道外给药途径来说，活性蛋白质可以制成包含在载体如盐水、葡萄糖溶液、血清白蛋白和Ringer溶液中的适于注射的单位剂量形式。
根据本发明，药用组合物的活性成分可以通过各种途径给予个体。给药途径包括真皮内注射、皮下埋植(即缓释形式)、肌肉注射、腹腔注射、静脉注射、皮下注射、口服、硬脑膜外注射、滴眼、鞘内注射、直肠内给药以及鼻内给药、其它任何有效的给药途径都可以使用，如通过上皮组织或内皮组织吸收，或通过基因治疗，其中编码活性药物的DNA分子注射给病人(如通过载体)使活性药物在体内表达和分泌。另外，本发明的蛋白质也可以和生物活性药物其它组分如药用表面活性剂、赋形剂、载体、稀释剂和运载媒介一起注射。
对于胃肠道外给药途径(如静脉、皮下、肌肉注射)来说，活性蛋白质可以制备成溶液、悬液、乳剂或冻干粉，这种冻干粉能溶于药用胃肠外给药途径载体(如水、盐水、葡萄糖溶液)并且含有能维持等渗性(如甘露醇)或化学稳定性(如防腐剂和缓冲液)的添加剂。
本发明所涉及蛋白质的生物利用度也可以通过能提高分子在人体内半衰期的接合作用来改善，例如在分子上连接聚乙二醇，见PCT专利申请WO 92/13095。
活性蛋白质的有效治疗剂量根据各种因素可以变化，其中包括蛋白质类型、蛋白质的亲核性、激动剂所表现出的残留毒性、给药途径、病人的临床状况(包括希望所要维持的内源性骨桥蛋白活性的非毒性水平)。
因此“有效治疗剂量”是指给药后骨桥蛋白能对神经疾病产生积极疗效的剂量。给药剂量，不论单次剂量或重复给药剂量，都依赖与各种因素，其中包括骨桥蛋白的药代动力学特性、给药途径、病人的状况和特征(性别、年龄、体重、健康状况、身高)、症状的范围、当前的治疗措施、治疗的频率及所要达到的效果。
如上所述，优选骨桥蛋白的剂量是约为每千克体重0.0001-10毫克、0.01-5毫克、0.01-5毫克、0.1-3毫克或1-2毫克。更优选骨桥蛋白的剂量是约为每千克体重0.1-1000微克、1-100微克或10-50微克。
本发明优选的给药途径是皮下注射。更优选的是肌肉注射。
在另一个优选实施方式中，骨桥蛋白每日给药或隔日给药。
每日的剂量通常分次给药或制成缓释剂型以达到所预期的效果。第二次给药或随后的给药可以给予同样的剂量、小于或大于初次或前次给药的剂量。第二次给药或随后的给药可以在发病开始时或发病前。
根据本发明，骨桥蛋白可以在实施有效剂量的其它治疗方案或给予有效剂量的其它治疗药物(多要治疗方案)特别是干扰素前、同时或以后进行预防性或治疗性给药。与其它治疗药物同时给予的活性药物可以在一个组合物中，也可以在不同的组合物中。
本发明还涉及治疗神经疾病的方法，该方法包括给予需要的病人以有效剂量的骨桥蛋白或骨桥蛋白活性激动剂，可以选择性地添加药学上可接受的载体。
本发明还涉及治疗神经疾病的方法，该方法包括给予需要的病人以有效剂量的骨桥蛋白或骨桥蛋白活性激动剂，以及干扰素，可以选择性地添加药学上可接受的载体。
本文所引用的所有文献，包括杂志的文章或摘要、出版的或未出版的美国或其它国家的专利申请，已公布的美国或其它国家的专利或其它任何文献，都已完整地纳入本文作为参考，其中包括引用文献中的所有数据、表格、附图及文字。另外，本文所引用参老文献内的完整内容也被全部纳入本文作为参考。
对已知方法步骤、常规方法步骤、已知方法或常规步骤的参考并不是表示承认本发明的的任何方面、任何描述或实施方式在相关领域内被包括、被指导或被建议。
前面对特定实施方式的描述可以全面地阐释本发明的基本性质，因此，在不需要额外实验及不背离本发明的基本概念的前提下，其它人通过运用本领域的知识(包括本文所引用的参考文献的内容)可以很容易地修改和/或应用这些特定实施方式。
因此，在本文的说明和指导的基础上可以在所描述的实施方式等效的范围内进行这些应用和修改。很容易理解的是本文的措辞和术语是为了描述而不是限制，因此熟练技术人员应按照本文的说明和指导，结合本领域普通技术人员已有的知识来阐释本说明书的措辞和术语。
根据到目前所描述的发明内容，可以很容易地理解下面的实施例，这些实施例是以说明的方式来提供的，并不意味着对本发明进行限定。
实施例
实施例1：骨桥蛋白在脱髓鞘疾病的体内和体外模型中的不同表达。
方法：
体外模型系统
通过用编码t-neu癌基因，一种活化的酪氨酸激酶，的复制子缺失的逆转录病毒处理少突胶质细胞前体细胞而使之永生化建立起Oli-neu细胞系：该细胞系在培养液中存在1mM双丁酰环磷腺苷的情况下能被诱导分化(Jung等，1995)。这就是使以该细胞作为体外细胞模型来研究少突胶质细胞称为可能。
A2B5鼠少突胶质细胞前体细胞来源的鼠少突胶质细胞系Oli-neu在未处理的条件下与用1-5mM双丁酰环磷腺苷预分化处理6天后相比其细胞的形态及抗原性发生明显变化。未处理的Oli-neu细胞是圆形的，与少突胶质细胞前体细胞一样主要呈双极性，而cAMP处理的细胞发生多形性的变化，呈扁平状，甚至会出现扁平的伸展的“鞘状”结构。另外，通过混和皮质培养进行的体外髓鞘化分析可用于观察体外功能性髓磷脂。这个系统使我们有可能研究少突胶质细胞在其它类型的CNS细胞存在的情况下是如何与轴突接触并使之髓鞘化的(Lubetzki等，1993)。本系统可用于检测影响少突胶质细胞前体细胞增殖或少突胶质细胞分化和存活如影响髓磷脂片段形成的生物因子。研究体外髓鞘化过程的需要导致了一系列分析方法的出现，其中包括聚集脑细胞培养(Matthieu等，1992)、小脑切片培养(Notterpek等，1993)、以及共培养系统(Shaw等，1996；Barres等，1993)。这些模型的优点在于可以研究少突胶质细胞与其它类型细胞的接触行为以及这些细胞是如何被刺激产生髓磷脂的。脱髓鞘现象在这种系统中也可以通过特异性的刺激来观察，髓鞘再生过程也可用本系统进行研究。
体内模型系统
现在已有各种各样的多发性硬化症的体内及体外实验模型。大多数体内模型与经典的MS及实验性变应性脑脊髓炎(EAE)动物模型有关。对这种模型也作了许多改进，运用到各种哺乳动物上，其中包括小鼠、大鼠以及灵长类动物(综述见Petry等，2000)。另外，模拟MS病毒组分动物模型的方法学已经建立，如MS的致脑炎Teiler鼠病毒模型(Dal Canto等，1995)。
研究CNS或PNS髓鞘化的专用动物模型是不常见的。这些模型已被证明可用于观察髓鞘化的发育过程以便了解其中的少突胶质细胞或施万细胞的分化、迁移以及增殖机制，就是所谓的“重演假说”(Franklin和Hinks，1999)。但是要比较CNS或PNS形成过程中发生的髓鞘发育和成年后发生的髓鞘再生就需要制备能特异地观察髓鞘再生过程的动物模型。
Cuprizone模型
最著名的并且是应用最广泛的一种髓鞘再生模型是小鼠的Cuprizone髓鞘再生模型。其中包括口服给予一种有机化合物Cuprizone，这是一种对少突胶质细胞有选择性毒性的铜鳌合剂(Morell E T，1998)。
Cuprizone处理小鼠的胼胝体会出现脱髓鞘化和髓鞘再生现象。这些病理学变化可以通过抗-CNPase抗体和MBP抗体染色观察到。髓磷脂可以用Luxol Fast Blue-高碘酸Schiff(LFB-PAS)染色。能使髓鞘再生的少突胶质细胞前体细胞可以通过PDGFα受体或NG2的抗体染色来观察。
给予小鼠3-5周的Cuprizone就可以导致小鼠胼胝体出现广泛的脱髓鞘现象。Cuprizone给药3周后，与脱髓鞘现象相伴随的是髓磷脂特异性基因转录子的合成增加(Morell等，1998)。
停止给予Cuprizone能创造一个有利于恢复的环境，因此停止Cuprizone给药6周后，小鼠的胼胝体出现广泛的髓鞘再生现象。因而Cuprizone模型提供了一个完整的研究脱髓鞘和髓鞘再生的体内模型。其优点在于CNS组织内无T细胞侵润，因此可以比较专一地研究髓鞘化过程，并且结果的重复性较好(Hiremath等，1998)。
Cuprizone处理的小鼠用C57BU6雌性鼠(8周龄，20±3g)，共分为6组，每组6只。
第1组：对照组，喂养正常的粉状饲料；
第2组：喂养3周的含0.2％Cuprizone的粉状饲料(Cup3w)；
第3组：喂养5周的含0.2％Cuprizone的粉状饲料(Cup3w)；
第4组：喂养5周的含0.2％Cuprizone的粉状饲料，然后喂养1周的正常粉状饲料(1wR)；
第5组：喂养5周的含0.2％Cuprizone的粉状饲料，然后喂养3周的正常粉状饲料(3wR)；
第6组：喂养5周的含0.2％Cuprizone的粉状饲料，然后喂养6周的正常粉状饲料(6wR)；
在预定的处理时间结束时收集每组动物的脑组织。小鼠首先被麻醉后通过左侧脑室灌注。取脑组织后在胼胝体-纹状核(纹状体)及海马回水平上制作一系列的皮质切片。脑组织切片用石蜡包埋进行免疫组化检测和原位杂交。
组织学组织的制备
1个体积的甲醛(Fluka，36％p.a.)和1个体积的无菌PBS用8个体积的无菌水稀释制备成福尔马林溶液。将10ml PBS加入到蠕动泵能适用的能安装20G、1-1/5针头的硅管内，然后连续地加入40ml福尔马林，小心加入以避免形成气泡。
在贲门内灌注固定剂以便进行随后的器官和组织的组织学分析前，用无菌PBS1∶1稀释的浓度为3mg/100ml的戊巴比妥钠(Sanofi)麻醉动物。每只鼠腹膜内注射0.05ml(0.75mg/kg)。一旦动物出现昏睡就用针头(25G 5/8 needles)穿过皮肤将动物的四肢固定在泡沫聚苯乙烯板上。用酒精清洁每只动物的腹部，用无菌剪在外皮的水平上切开皮肤。然后向右侧和左侧进一步切开。用一副镊子提起外皮，切开对角以露出腹膜，在与切口垂直的方向上再向两侧切开以暴露胸腔正中跳动的心脏。用镊子提起心脏，立刻切开右心房，让血液流出。让10ml PBS和40ml福尔马林循环流过每只小鼠。每只动物的脑和脊髓小心取下后放置到装有10ml福尔马林溶液的50ml硅管中浸泡2小时。然后用10ml无菌PBS替换福尔马林溶液，置于4℃过夜。然后再更换PBS溶液置于4℃数小时。
脑半球和脊髓切成约0.5cm切片，置于包埋机配套的塑料盒中。脑和脊髓的石蜡包埋用自动的Tissue Tek Vacuum Infiltration Processor E150/E300(MilesInc.Diagnostics)按照下列程序进行：
50％乙醇中30分钟
70％乙醇中60分钟
60％乙醇中60分钟
80％乙醇中60分钟
80％乙醇中90分钟
96％乙醇中30分钟
96％乙醇中90分钟
96％乙醇中120分钟
100％二甲苯30分钟
100％二甲苯60分钟
石蜡中孵育4次，每次60分钟，最后一次用于包埋。
所有的溶液都维持在40℃，石蜡维持在65℃。一旦组织切片准备好，就将脑和脊髓的切片按照预定的方位放置到制备石蜡包埋块的塑料盒内。导入石蜡液体，置于冷却板上使其快速冷却到0℃。石蜡块在切片机上切成5-10μm的切片。然后将切片放置到硅烷处理的玻璃载玻片上(SuperFrost-PlusTM，Menzelcat.no.041300)。切片放置好以后将载玻片置于无尘的环境中。
细胞培养
Oli-neu：鼠少突胶质细胞系(Oli-neu)细胞通过离心富集，然后重悬于Sato培养液中(Trotter等，1989)。细胞在75ml培养瓶中置于37℃、5％CO2环境下培养。在细胞培养液中直接加入1mM dbcAMP使其分化。用Trizol试剂提取RNA(见下)。
RNA提取
用Trizol提取试剂盒(Life Technologies AG，巴塞尔，瑞士)从cuprizone处理的鼠脑切片及不同发育阶段的出生后小鼠的全脑中提取总RNA。然后用QiagenOligotexTM columns(QIAGEN Inc.，28159 Stanford Avenue，Valenncia，CA 91355，USA)从总RNA样品中制备多聚(A)+RNA。
利用cDNA芯片进行DGE分析
芯片实验是在Incyte Genomics(Incyte Genomics Inc.，3160 Porter Drive，Palo Alto，California 94304，USA)进行的。利用Incyte的鼠GEMTM 1基因表达芯片进行DGE分析(http：//www.incyte.com/reagents/gem/products.shtml).
用于这些分析实验的Incyte芯片加载了8734个基因的相应cDNA分子，包括已知的和未知的(EST序列)。Incyte的技术可以使每种基因的微量样品点到一个芯片上。已知基因或EST相应的每一种cDNA分子的长度为500-500bp。Incyte的说明书给出的一个样品中每种mRNA的动态检测范围为2-2000pg。每次芯片实验所需要的RNA量为600ng多聚(A)+RNA。可检测的差异表达水平是比例大于1.75。
信号的标准化和表达水平的确定
两种荧光强度的比例定量地提供了被分析的两个细胞样品内相关基因的表达水平。每种基因的比例是在标准化表达水平的基础上计算出来的。标准化系数是通过将第二个样品(P2)的总表达量除以第一个样品(P1)而得到的。这个系数可被用于计算P2中每个基因的表达水平。一旦经过标准化步骤，基因比例就可以按照下列规则来计算：
E1代表样品1中给定基因的表达水平，E2代表样品2中同一基因的标准化表达水平；如果E2＞E1，则比例＝E2/E1，否则比例＝-E1/E2。
由于样品的杂交是竞争性的同时进行的，因此Incyte芯片技术在确定表达量的相对变化方面是比较精确的，但在测量绝对表达水平方面就不太可信。然而，可以用这些表达水平值来比较样品RNA群体对，这些样品RNA群体实际上没有在芯片上进行比较。这种原位比较不十分可信，但它们可提供额外的机制信息，这些信息可用于被测定的系统。
结果
用于分析骨桥蛋白不同表达水平的模型
表IV所列的是各种模型，用于如上所述的mRNA提取和芯片杂交(DGE分析)。
表IV：用于DGE分析的模型
模型 处理方案 对照
1.少突胶质细胞体外分化模型 Oli-neu细胞+双丁酰环磷腺苷(6小时) Oli-neu细胞(未处理)
Oli-neu细胞+双丁酰环磷腺苷(6天) Oli-neu细胞(未处理)
2.Cuprozone脱髓鞘/髓鞘再生体内模型 成年前脑+Cuprizone(3周) 未处理的成年前脑
成年前脑+Cuprizone(5周) 未处理的成年前脑
成年前脑+Cuprizone(3周) 成年前脑+Cuprizone(5周)
3.发育阶段的髓鞘化 出生后10天(P10)的鼠小脑 出生后2天(P2)的鼠小脑
DGE阳性对照：髓磷脂特异性基因的调节
作为阳性对照，如果髓磷脂特异性基因的不同调节能用DGE来分析则首先检测它。
表V所列的是Incyte芯片上髓磷脂特异性基因的调节。每个基因的不同表达水平值都是cuprizone治疗3周和5周后得到的。这个数据是阳性对照以证明芯片的可靠性。由于在我们的实验条件下髓磷脂结构基因的调节是已被很好特征化的，因此在芯片上所观察到的这些基因的表达可用于说明，a)该技术的准确度，和b)我们模型的可重复性。
表V：基因芯片分析髓磷脂体内模型中髓磷脂特异性基因在体内的调节。
基因名称   序列号   Cup 3w   Cup 5w    P 2/10*
髓磷脂基本基因   AA059540   113.6   11.3     +7.9
髓磷脂小囊状蛋白/髓磷脂和淋巴细胞蛋白(MVP/MAL)   AA519027   33.5   11.7     0
环核苷酸磷酸二酯酶1(CNPase)   W63987   22.9   11.1     +2.9
*出生后2/10天的小脑
上表显示的是某些髓磷脂特异性基因是如何被调节的，所用的分析方法是RNA基因芯片，所用的RNA来源于不同的研究脱髓鞘、髓鞘再生以及髓鞘发育体内动物模型。这些髓磷脂特异性基因表达的变化说明可以利用基因芯片技术在转录调节水平研究髓鞘化过程。
Cuprizone处理3周后在鼠脑内的特定区域可以观察到脱髓鞘效应。因此在3周的时候预计可以检测到与髓磷脂合成和/或髓磷脂维持相关的各种基因的下调表达。通过基因芯片分析所观察到的髓磷脂特异性基因表达的下调可以作为本实验系统精确度和可靠性的确证。表V中的数据表明，与对照组相比，cuprizone处理3周后在mRNA水平上MBP表达下调13.6倍，环核苷酸磷酸二酯酶1(CNPase)表达下调2.9倍。但是cuprizone处理5周后这两个基因RNA水平的表达只比正常水平分别低1.3倍和1.1倍，说明生物系统在试图通过促进髓磷脂结构蛋白的合成来建立髓鞘再生机制。
骨桥蛋白的不同变化
通过芯片分析，cuprizone处理3周时骨桥蛋白上调2.2倍，处理5周时骨桥蛋白上调2.8倍。
实施例2：通过实时定量反转录酶(RT)-PCR分析(TagMan)确证骨桥蛋白基因的不同表达水平
方法：
cDNA模板的制备
TagMan分析所用的cDNA模板是用TagMan反转录试剂(P/N N808-0234)通过反转录(RT)反应从总RNA样品中制备的。所有的RT反应都在100μl体系中进行，该体系含有：10μl TagMan RT缓冲液，22μl 25mM的MgCl2溶液(5.5mM)，20μl脱氧核苷三磷酸混合物(每种dNTP 500μM)，5μl随机引物(2.5μM)，2μlRNA酶抑制剂(0.4U/μl)，2.5μl MultiScribeTM反转录酶(1.25U/μl)和38.5μl溶于无RNA酶水中的RNA样品(共1μg)。反应在Eppendorf MasterCycler上进行，反应条件为：25℃10分钟(孵育步骤)，48℃30分钟(反转录)，以及95℃5分钟(灭活步骤)。所有合成的cDNA都分装成20μl的体积储存在-20℃条件下。
引物的设计和确证
所有要检测的基因和GAPDH基因(对照的看家基因)的SYBR Green Real Time PCR正向和反向引物都是用PE Biosystems的Primer Express软件根据所发表的序列设计的，从Interactiva(Interactiva：The Virtual Laboratory，Sedanstrasse 10，D-89077Ulm)定购，浓度为0.02μM。每一引物对的特异性及最佳浓度都经过了验证。基因组DNA的潜在污染通过PCR反应监测，该PCR反应所用的模板为在无RT酶的条件下进行反转录反应得到的阴性对照cDNA样品。是否存在非特异性的扩增是通过在3.5％MetaPhor凝胶或预成形的NuSieve4％凝胶上进行PCR产物的凝胶电泳确定的。
上表所显示的是基因特异性引物的序列，这些引物用于TagMan分析来确证那些经芯片检测发现其表达出现变化的基因表达水平。该表还列出了每一引物对相应的基因名称及用Primer Express软件涉及每对引物时所依据的序列的GenBank序列号。
表VI：用于RT-PCR分析的引物
基因名称 序列号   TagMan寡核苷酸名称   TagMan寡核苷酸序列
分泌的磷酸蛋白1(骨桥蛋白) AA108928   骨桥蛋白-166F   AGCCTGCACCCAGATCCTATAG
  骨桥蛋白-235R   GCGCAAGGAGATTGCTTCT
TagMan反应
SYBR Green Real-Time PCR反应体系如下：每孔5μl RT产物(0.5ng总RNA)，25μl SYBR Green PCR主混合物(master mix)(Applied Biosystems，CA，USA)和AmpErase Uracil N-糖基化酶(UNG)(0.5U/孔)和20μl引物(300nM)。PCR反应条件是：50℃2分钟(AmpErase UNG孵育以消除任何由于去除前面TagMan循环中产生的PCR产物中掺入的尿嘧啶而造成的污染)，95℃10分钟(AmpliTag Gold活化)。然后将样品放入ABI PRISM7700序列检测系统(Sequence Detection System)中，运行40个循环，条件是95℃15秒，60℃1分钟。反转录初的cDNA样品进行扩增并确定其CT(阈循环)值。所有的CT值都用看家基因GADPH进行标准化。如果可能，样品应设2个复孔或3个复孔以检测结果的可重复性。通过电泳分析可以看到所有的待测基因和GADPH都是单一的特异性条带。
通过循环阈值(CR)计算基因表达的变化
利用SYBR Green PCR主混合物进行实时检测原理的基础在于直接测量SYBRGreen染料与双链DNA结合而产生的荧光强度的增加值。这就可以根据PCR产物增加曲线来定量地计算出基因特异性扩增产物的相对增加量。
某种特定cDNA相对于对照样品的定量是根据该特异性基因的mRNA所转录出的cDNA相对于作为生理参考的校正样品的量来计算的。校正值是从对照或未处理样品中得到的。某种特定cDNA的相对量是通过与内源性对照(本例中是GADPH)相比后进行标准化而得到的，并且考虑到各种因素的变化，如用于制备模板cDNA的总RNA的初始浓度和质量，以及反转录反应的转化效率。相对值的计算方法如下：取各个样品进行复制反应时的平均CT值计算出靶样品与内源性对照样品之间平均CT值的差值(CT)，靶基因的CT减去靶基因校正子的平均CT就得到CT，最后，靶基因的相对值就用2-CT表示，以代表基因表达上调或下调的水平。
TagMan反应中荧光信号的标准化
SYBR Green-双链DNA复合物荧光信号是通与被动参照或不含模板DNA的阴性对照反应比较而标准化的。实验组反应中SYBR Green-双链DNA复合物所发射的荧光强度除以被动参照组所发射的荧光强度而标准化的。这样就得到了反应的Rn比率(标准化报告因子)：
Rn +＝含有包括模板DNA在内的所有组分的反应的Rn值
Rn -＝未反应样品(不包括模板DNA在内)Rn值
Rn＝(Rn +)-(Rn -)，其中
Rn +＝(SYBR Green-双链DNA复合物所发射的荧光强度)/含有模板的PCR(被动参照组所发射的荧光强度)
Rn -＝(SYBR Green-双链DNA复合物所发射的荧光强度)/无模板的PCR(被动参照组所发射的荧光强度)
从循环阈值(CT)计算调节的倍数
Rn代表了在一组给定PCR条件下进行特异性反应所产生的信号强度。循环阈值这个参数表示一个基因特异性扩增产物的相对增加值，代表了该基因的特异性转录子在试验组cDNA群中丰度。它代表了一个固定的循环点，在这点上可以最先检测到  Rn出现统计学意义上的显著升高。阈值定义为早期循环的Rn的平均标准差，再乘以校正因子。循环阈值这个参数可被用于表示基因表达量的差异。每一个基因特异性增长曲线都有一个特异性的阈值，根据曲线上的点或循环就可以计算出来，在该点上可以检测到荧光强度明显升高到背景水平以上。
所有相对值的计算方法如下：取各个样品进行复制反应时的平均CT值计算出靶样品与内源性对照样品之间平均CT值的差值(CT)，靶基因的CT减去靶基因校正子的平均CT就得到CT，最后，靶基因的相对值就用2-CT表示，以代表基因表达上调或下调的水平。
结果
实时定量反转录酶(RT)-PCR(TagMan)提供了一种灵敏而且可靠的确定和检测基因表达变化的方法。TaqMan序列检测器(ABI PRISM7700序列检测系统，AppliedBiosystems，Foster City，CA)集成了PCR分析和硬件/软件装置，组成了一个高通量的核酸定量系统。它结合了热循环、荧光检测及程序特异性的软件，使每一个循环中特异性PCR产物的增加量都能被检测到。
通过芯片分析找到的几个表达变化很大的基因用TagMan检测平台得到了进一步的验证。在每一个案例中，所用模型系统的时间过程都被包括在内。这使我们可以收集到更多关于特异性基因在整个过程中的行为的数据：
利用TagMan系统可以定量地检测基因表达的变化，该系统通过测定SYBRGreen染料与双链DNA结合后产生的荧光直接检测PCR产物的增加量，这些双链DNA代表了所要分析的基因的特异性扩增产物。某种特定cDNA相对于对照样品的定量是根据该特异性基因的mRNA所转录出的cDNA相对于作为生理参考的校正样品的量来计算的。校正值是从对照或未处理样品中得到的。某种特定cDNA的相对量是通过与GADPH相比后进行标准化而得到的，并且考虑到各种因素的变化，如用于制备模板cDNA的总RNA的初始浓度和质量，以及反转录反应的转化效率。
分泌型磷蛋白1(骨桥蛋白)基因表达的分析是在一个跨越脱髓鞘/髓鞘再生cuprizone模型的时间段内进行的。
Cuprizone髓鞘再生模型中骨桥蛋白表达的TagMan实验结果如图1(A)所示。Cuprizone处理3周(3w.Cup.)后鼠前脑内骨桥蛋白mRNA的表达水平上调18倍，处理5周(5w.Cup.)后上调25倍。
Cuprizone处理5周后分别停止1、3和6周(5w.cup.+1w，3w.和6w.)，骨桥蛋白的表达下调。这些结果说明骨桥蛋白在模型的脱髓鞘及髓鞘再生过程中发挥重要作用，因为脱髓鞘过程还在持续时髓鞘再生就已经开始了。
图1(B)显示的是孵育的小脑内骨桥蛋白的表达水平变化结果。出生后发育的早期，C4到C8天，是小脑髓鞘化的起始阶段，骨桥蛋白的mRNA表达出现瞬时上调。
芯片分析结果表明cuprizone处理后鼠的前脑内骨桥蛋白的表达上调。这一结果进一步证实了cuprizone处理模型的脱髓鞘期和髓鞘再生期都有骨桥蛋白的表达，显示cuprizone处理模型的脱髓鞘期骨桥蛋白的表达出现峰值，而在恢复期其表达又下降到接近基线水平。这些结果列在下面的表VII中。
TagMan分析结果证实了cuprizone喂养3周和5周的小鼠脑内骨桥蛋白的表达上调。
表VII：cuprizone处理模型中骨桥蛋白表达的TagMan分析结果
组织类型        试验组            表达水平         变化
前脑            Cup.对照           1.00            对照水平
前脑            Cup.对照          -1.32            下调
前脑            3w.Cup.            17.51           上调
前脑            3w.Cup.            23.43           上调
前脑            5w.Cup.            20.25           上调
前脑            5w.Cup.            23.43           上调
前脑            5w.Cup.+1w.R.      1.79            上调
前脑            5w.Cup.+1w.R.      3.32            上调
前脑            5w.Cup.+3w.R.      2.95            上调
前脑            5w.Cup.+3w.R.      4.56            上调
前脑            5w.Cup.+5w.R.     -1.16            下调
前脑            5w.Cup.+5w.R.      1.04            对照水平
前脑            5w.Cup.+5w.R.      1.07            对照水平
实施例3：RNA印迹确证骨桥蛋白表达的变化
方法
杂交的准备
利用鼠多组织Northern杂交实验(Clontech Labs，1020 East Meadow Circle，Palo Alto CA)分析特定基因的组织表达特异性。每个泳道含2μg成年小鼠不同组织的多聚(A)+RNA。体内和体外基因表达的变化分别用不同的杂交实验来分析。一组杂交都包括从cuprizone处理3周、5周以及处理后1周、3周和6周(最多达6周)的小鼠脑组织提取的RNA。第二组杂交包括出生后不同时间的小鼠全脑组织RNA。最后，从双丁酰-cAMP处理不同时间的体外培养的Oli-neu细胞中提取RNA，这些RNA用于第三组杂交。用每种基因的特异性探针进行新的杂交以达到最大的检测效率并且使杂交后不均匀洗涤造成结果变异达到最小。所有的杂交都进行两次，首先与待测基因的探针杂交，洗涤后与鼠甘油醛-3-磷酸酯(mGADPH)的探针杂交以控制RNA上样量的变化。
RNA(10μg/上样孔)上样到1.2％变性琼脂糖凝胶上，该凝胶含有甲醛和5×MOPS(209.27g 3-(N-吗啉代)-丙磺酸，20.5g醋酸钠，50mL 0.5M EDTA pH8.0，溶于5L无菌水中，然后用12M的NaOH将pH调节到7.0)。每种RNA样品都和2μl溴化乙啶(0.01mg/ml)、2μl 5×3-(N-吗啉代)-丙磺酸(MOPS)、3.5μl37％甲醛和10μl甲酰胺混和。然后将样品在65℃加热10分钟，迅速置于冰上。2μlRNA上样缓冲液(50％甘油，1M EDTA，0.4％溴酚蓝和二甲苯蓝)在上样前立即加入到每个样品中。
每个凝胶在1×MOPS电泳缓冲液(1L＝330ml 37％的甲醛，400ml 5×MOPS，270mlDEPC处理的水)中电泳约3小时，所用的电压为5V cm-1(凝胶长度)。然后在SSC溶液(Terry Brown，UNIT 4.9，Current Protocols，1993[ed.F.M.Ausubel，R.Brent，R.E.Kingston，D.D.Moore，J.G.Seidman，J.A.Smith和K.Struhl])中过夜将RNA转移到带正电荷的尼龙膜上(HybondTM-N，Amersham Life Sciences，AmershamPlace，Little Chalfont，Buckinghamshire，England HP7 9NA)。通过在紫外灯下观察膜和凝胶检查RNA转移的效率。RNA是通过Stratalinker(Stratagene，USA)与膜交联的。杂交膜放在两层Whatman 3MM滤纸中间置于室温中直到进行下一步的杂交实验。
探针的制备
放射性同位素32P标记的探针是用凝胶纯化的待测基因cDNA限制性酶切片段(约500～800bp)制备的。DNA片段用HighPrimeTM标记系统(Roche Diagnostics AG，Industriestraβe 7，6343 Rotkreuz，瑞士)进行32p-dCTP随机标记，其特异性活性应＞109cpm ml-1。未掺入的32p-dCTP用含Sephadex G-25介质的Pharmacia NAP-5柱(含有0.15％KathonxCG/ICP Biocide的蒸馏水中的DNA等价)通过离心从探针混合物中去除。
杂交和信号检测
用ExpressHybTM(Clontech Labs，1020 East Meadow Circle，Palo Alto CA)按照操作说明书进行探针杂交。杂交后将膜与HyperfilmTMMP(Amersham PharmaciaBiotech，England)压在一起放到放射自显影盒中-80℃曝光。将膜置于无菌H2O/5％SDS溶液中90-100℃孵育10分钟然后使膜冷却10分钟来洗脱曝光后的探针。洗脱的膜用塑料薄膜封存，置于-20℃保存直到再次杂交。
结果
Northern杂交分析以前就被作为一种辅助的确证技术用在大规模的基因表达差异研究中。(Chang等，2000)。其所具有的高敏感性和精确度使之不仅可用于分析给定基因在各种组织中表达的特异性，而且还可用于比较实验组和对照组基因表达水平变化的幅度。这使其称为确证基因芯片分析出的DGE结果的一种可靠方法。而且，Northern杂交技术还可以提供与转录子大小有关的信息及与可能出现的待测基因相应的选择性剪切亚型有关的信息。
本发明中Northern杂交所用的RNA是从cuprizone处理鼠及对照鼠脑组织中提取的。这些RNA与放射性标记DNA片段杂交，该DNA片段是从Incyte Genomics提供给我们的克隆中制备的。Northern杂交技术重现TagMan分析所得到的结果的能力通过鼠骨桥蛋白的放射性标记探针与从cuprizone处理鼠的脑组织中分离出的RNA杂交得到证实。
通过这种方式，可以比较用Northern杂交分析及TagMan分析所得到的cuprizone模型中骨桥蛋白表达的结果。
图3显示的是插入到pT7T3D-Pac载体中的鼠骨桥蛋白基因的开放阅读框架，该载体是从Incyte Genomics定购的。灰色区代表编码区，箭头代表骨桥蛋白的完整cDNA序列。克隆片段插入到EcoRI和NotI限制性酶切位点之间。用HincII和StyI限制性内切酶消化该载体切下一个893bp的片段制备杂交用的探针以分析该基因在组织中的表达情况。这个片段经过凝胶纯化，标记后用作探针。
鼠骨桥蛋白的表达通过Northern杂交进行检测，杂交所用的RNA来自cuprizone处理鼠模型各个阶段的脑组织，其中包括恢复期的和未处理对照组脑组织。首先用鼠骨桥蛋白cDNA的放射性标记片段作为探针进行杂交，杂交膜曝光后洗涤，然后用鼠GADPH的放射性标记片段作为谈政再次杂交。这个杂交作为阳性对照来说明所观察到的表达差异变化基于印迹上各个泳道中RNA的总量。
Cuprizone处理鼠脑组织中骨桥蛋白的表达在处理后3周和5周达到高峰，其中5周时表达更高一些。在恢复期，骨桥蛋白mRNA表达水平快速下降，在停止cuprizone处理1周后出现明显减少。在6周后骨桥蛋白mRNA的水平恢复到接近正常水平。这个结果与用TaqMan分析所得到的cuprizone处理模型中骨桥蛋白表达水平结果(见图1A)实质一致。
实施例4：Oli-neu细胞中骨桥蛋白表达的变化。
用TaqMan分析来检测cAMP处理的少突胶质细胞(Oli-neu)中骨桥蛋白的表达情况。结果显示在图4中。柱1到柱4代表了少突胶质细胞内的结果。与对照组(值＝1)相比，cAMP处理6小时(柱1)就会导致骨桥蛋白mRNA表达水平的上调。cAMP处理2天(柱2)，表达上调12倍。延长处理6天到10天(柱3和柱4)确导致骨桥蛋白mRNA的低水平表达。通过与cuprizone模型中骨桥蛋白mRNA表达水平(柱5和柱6)的比较发现cuprizone处理3周和5周后前脑内骨桥蛋白的表达水平与cAMP处理2天后少突胶质细胞内的骨桥蛋白表达水平相似。
实施例5：骨桥蛋白在少突胶质细胞内的表达
方法
Oli-neu细胞用磷酸钙沉淀法瞬时转染。主要过程是：在转染前一天将处于指数生长期的oli-neu细胞接种到6孔培养板上(105个细胞/孔)。将100μl 250mM的CaCl2溶液与5μg质粒DNA混和。将等量的(100μl)添加磷酸盐(从300mM的pH＝7.05的Na2HPO4和NaH2PO4储存液中稀释得到的)的2×HEPES溶液(140mM NaCl，50mM HEPES，pH7.05)加到上述Ca/DNA溶液中。1分钟后，将混合物缓慢加入培养板内，在37℃的CO2培养箱内孵育4小时。然后用新鲜的培养基替换转染液，细胞继续孵育24-72小时，然后收获细胞用于Western杂交分析。
结果
插入到pDEST12.2载体中的不同鼠桥接素基因构建体(pDEST12.2-骨桥蛋白-EGFP，pDEST12.2-骨桥蛋白-His6，pDEST12.2-骨桥蛋白，见图4-7，和空白载体pCIE-EGFP)转染到oli-neu细胞中。带有EGFP尾巴的构建体使监测更容易，转染24小时后，与转染pCIE-EGFP的对照组细胞相比，转染细胞的形态出现特异性变化(少突胶质细胞突起增加)，这说明骨桥蛋白诱导鼠少突胶质细胞株oli-neu向更成熟的形态变化。骨桥蛋白转染oli-neu细胞的形态与髓磷脂形成细胞少突胶质细胞的形态十分相似。
这些结果证明骨桥蛋白在少突胶质细胞内的表达有助于细胞向髓鞘化的方向发育，因而提示骨桥蛋白在治疗与少突胶质细胞功能丧失有关的疾病时具有积极的效果。
实施例6：cuprizone模型中脑内特定区域的骨桥蛋白表达水平
取cuprizone处理模型脱髓鞘及髓鞘再生期间各个时间点的脑组织进行免疫组织化学分析。结果发现cuprizone处理5周后在脱髓鞘的胼胝体和纹状体区域出现强信号，在这个时间点上脱髓鞘区域内会出现明显的小胶质细胞再生。为了观察活化的小胶质细胞，在一个连续的区域内进行CD68染色，结果发现同样的表达模式，说明骨桥蛋白在小胶质细胞内有表达。
令人感兴趣的是在前脑室上分布的细胞内也有骨桥蛋白的表达。这个区域被称为成年亚脑室区，含有能分化成神经元、星型胶质细胞和少突胶质细胞的多潜能干细胞。用NG2、PSA-NCAM、PDGFα受体双染色来观察少突胶质细胞前体细胞内骨桥蛋白的表达。
实施例7：骨桥蛋白蛋白对少突胶质细胞增殖的影响
用t-neu癌基因进行永生化处理的鼠初级少突胶质细胞系(Oli-neu细胞系)用于本实验。Oli-neu细胞系的建立、特性及培养条件参见Jung等(1995)的描述。
本实验的目的在于用oli-neu细胞增殖实验分析OPN对少突胶质细胞增殖的影响。将细胞接种到培养板上。在用对照蛋白或重组蛋白处理前加入无胰岛素的培养液使细胞饥饿24小时。根据Alamar蓝染色后所发出的荧光估计细胞数目。增加值的计算是基于和IGF1(对照)标准曲线的比较。增殖抑制率的计算是基于与dbcAMP标准曲线的比较。
材料
仪器设备和软件
Wallac Victor 2多标记计数器(激发波长530-560nm，发射波长590nm)
Graph Pad Prism软件
试剂
oli-neu细胞系(Eur J Neuro 7：125-1265(1995))
Alamar蓝(Biosourcelntl.Inc.，Camarillo，CA93012)
Sato培养液的成分如下：
产品            生产厂商            储存液                       μl/500
                                                                  ml
DMEM            Seromed F0435       500ml
运铁蛋          Sigma T-2252        100mg/ml(1mg溶于10ml PBS中)   50
亚硒酸钠        Sigma S-9133        1mg/2.56ml PBS                50
胰岛素          Sigma I-1882        10mg/ml(100mg/10ml PBS)       500
四甲烯二胺      Sigma P-7505        80.5mg/ml(PBS)                500
黄体酮          Sigma P-0130        0.62mg/ml(乙醇)               50
TTT(三碘甲状    Sigma T-5516        1.7mg/ml(1/3HCl 1N+2/3 EtOH)  100
腺氨酸)
L-甲状腺素      Sigma T-0397        2.88mg/ml+1滴NaOH 1N          100
L-谷胺酰胺      Gibco 25030-024     200mM                         5000
庆大霉素        Gibco 15750-037     50mg/ml                       250
钠              Gibco 25080-052                                   13000
碳酸氢盐
马血清                                                            5000
BioCoat平底板分别用多聚D赖氨酸(356461，Becton Dickinson)；、R3-IGF1(11146，Sigma)；DbcAMP(D-0627，Sigma)包被。
方法
用于体外生物分析的细胞的培养
oli-neu细胞是能在多聚L赖氨酸基质上生长的粘附细胞。将细胞接种到BioCoatTM多聚赖氨酸预包被96孔板上。细胞每周传代2-3次。为了传代，先用PBS洗涤细胞，然后用PBS加上1mM EDTA使细胞分离。细胞在湿润的10％CO2孵箱中培养。
所用的冻存液是含20％FCS和10％DMSO的Sato培养基。本实验中所用的oli-neu细胞传代不超过16代。所用细胞的终浓度为96孔板中每孔加入4000个细胞，用无胰岛素的Sato培养基培养使之饥饿24小时。
Alamar蓝染色
在CO2孵箱中孵育48小时后，每孔中加入10μl Alamar蓝，继续孵育2.5小时。在530-560nm激发波长和590nm反射波长下监测其荧光强度。培养板最多可在4小时时读数，最大读数可达1000000相对荧光单位。
实验设计
作为对照的是100ng/ml R3-IGF-1(阳性对照)、1mM dbcAMP(阴性对照)、无胰岛素的培养液、或100nM煮沸灭活的OPN。实验样品分别为1nM，10pM，0.1pM，0.01pM or 100nM的重组骨桥蛋白。对照样品和实验样品都用无胰岛素的Sato培养基稀释成期望浓度的终体积为50μl的液体然后加入到孔中。Oli-neu细胞在无胰岛素的培养基终生长24小时，然后用PBS加1mM EDTA消化收获细胞。将细胞稀释到300000/ml，每孔加50μl。然后在37℃湿润CO2孵箱中培养48小时。加入10μl Alamar蓝，然后再放入孵箱中培养2.5小时。每孔取70μl转移到黑色96孔板中，立刻测定荧光强度。
加入不同剂量的骨桥蛋白后24小时测定未分化的oli-neu细胞的增殖情况，所加入的骨桥蛋白是用昆虫细胞(BacOPN)或哺乳动物表达系统(HEK OPN)制备的。用荧光生长测定/比色生长测定指示剂，Alamar蓝测定细胞的代谢活性来量化细胞的生长率。该指示剂含有一种氧化-还原指示剂，当细胞生长使培养基化学分解时可以出现荧光及颜色变化。该试剂及实验方法见Ahmed等(1994)和美国专利5,501,959中的描述。
结果
结果显示在图8到图10中。
杆状病毒和HEK细胞表达的重组骨桥蛋白都表现出剂量效应。将蛋白煮沸降解后会如预期的那样破坏其生物学活性。加入杆状病毒表达的骨桥蛋白(BacOPN)和HEK细胞表达的OPN(HEK OPN)都会导致细胞出现剂量依赖性的增殖(图8)，BacOPN的IC50为3.7nM，HekOPN的IC50为0.05nM(图9)。另外，具有1-168位氨基酸的OPN亚型a的N末端OPN构建体(见图2，N-term.OPN-a)也可以在昆虫细胞中表达。用增殖实验将纯化出的蛋白与全长蛋白作了比较。这种截短的蛋白也是有活性的(10nM，100nM)，见图10。
实施例8：骨桥蛋白对混和皮质培养物中髓鞘化标记物表达的影响
在盖玻片上生长的混和皮质培养物用Bac OPN(100nM)处理12天，从DIV(体外培养天数)的5天开始到17天结束。在体外培养的第17天，将培养物固定，然后用抗MBP抗体染色。结果表明BacOPN盖玻片与对照相比具有更多的高度分支的MBP阳性少突胶质细胞(图11)。另外，虽然在对照培养物中(图11A)没有看到髓鞘化的少突胶质细胞，但OPN处理的培养物(图B、C和D)中富含少突胶质细胞，这些细胞包裹在轴突周围，形成髓磷脂片段和结间段(图11B和D)。通过对片段簇计数发现对照组没有片段出现，而三个不同OPN剂量处理组出现16，22和18个片段簇。这些结果说明骨桥蛋白处理皮质混和细胞可以使少突胶质细胞出现分化表型，这些表型使髓磷脂化少突胶质细胞的特征。
实施例9：MBP ELISA检测骨桥蛋白对混和皮质培养物中MBP表达的影响
MBP ELISA方法用于监测OPN和LIF处理的混和皮质培养物中MBP蛋白表达的增加及因此而产生的髓鞘化。
初级培养
材料来源于小鼠胚胎脑组织，这些胚胎是从交配后16天的怀孕NMR1雌性小鼠中分离的。按照Lubetzki等的方法剪开胚胎，用胰蛋白酶消化皮质分离出细胞(包括神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞、小胶质细胞和神经元前体细胞)，然后将细胞接种到多聚L赖氨酸包被的96孔培养板中，每孔加入105个细胞，体积为50μl。
重组蛋白处理
处理所用的是重组蛋白(阳性对照，重组鼠白细胞抑制因子(LIF)购自AMRAD实验室，浓度分别为1μg/ml、100ng/ml和10ng/ml；杆状病毒表达的全长骨桥蛋白，浓度分别为100nM、10nM和10pM)。所有的蛋白质在加到细胞培养物前都用培养液稀释到适当浓度。培养物在体外生长5天然后处理17天。每3天更换一次培养液。
从微孔板上收获细胞样品的操作方法
在体外培养17天(DIV17)后将细胞裂解并收集样品。细胞裂解所用的试剂为三倍去污剂缓冲液。
三倍去污剂缓冲液
                                终浓度
        50ml Tris pH8.0 1M      50mM
        8.77g NaCl              150mM
        2ml NaN3(10％)         0.02％
        5ml SDS 20％            0.1％
        10ml NP40               1％
        5g去氧胆酸钠            0.5％
在使用前将一粒蛋白酶抑制剂(Roche no.1836170)加到三倍去污剂缓冲液中。
将已接种到96孔预包被培养板中的混和皮质培养物的培养基去除。细胞用50μl1×PBS温和洗涤两次，然后每孔中加入50μl三倍去污剂缓冲液。所有含裂解样品的微孔板都储存于-20℃直到进行下一步的分析。
BCA蛋白质测定
Pierce BCA蛋白质测定是一种基于二金鸡钠酸(BCA)的通过比色法检测和定量总蛋白质的去污剂相容性分析方法。该方法结合了已知的碱性介质中蛋白质对Cu+2到Cu+1的还原作用和利用含二金鸡钠酸的独特试剂高敏感性高选择性地比色检测一价铜阳离子(Cu+1)。
本分析方法中紫色反应产物是通过BCA与一价铜离子两个分子的鳌合作用形成的。这个水溶性的复合物在562nm处有很强的吸收，并且在20μg/ml到2000μg/ml之间蛋白浓度与吸光度值成良好的线性关系。BCA方法不是一种真正的端点方法—最终颜色继续加深，但是随着孵育时间的延长，颜色深度变化速度放缓到足以在一轮反应中完成大量样品的测定。据报道，蛋白质的大分子结构、肽键的数目以及四种氨基酸的存在(半胱氨酸、半胱氨酸、色氨酸和酪氨酸)对与BCA形成的颜色有影响。
微孔板法确定总蛋白含量
标准品(BSA浓度：2000μg/ml、1000μg/ml、750μg/ml、500μg/ml、250μg/ml、125μg/ml、25μg/ml)和样品各取25μl加入到微孔板的适当孔中。空白孔中加入25μl稀释剂(三倍去污剂缓冲液)(工作范围20-2000μg/ml)。
200μl工作试剂(50份BCA试剂A和1份BCA试剂B的混合物)加入到每个孔中。微孔板振荡30秒，37℃孵育30分钟。孵育结束后测定570nm处的吸光度值。
MBP夹心ELISA
96孔平底无菌微孔板(Costar)与1×PBS 1∶5000稀释的抗MBP抗体(Chemicon，MAB5274)在4℃孵育过夜。每孔中加入50l稀释的抗体。
第二天，将微孔板所有孔中的抗体溶液去除，每孔中加入50μl用1×PBS稀释的1％BSA溶液进行封闭。在室温下封闭1小时。封闭结束后用PBS/Tween机械洗涤3次。
用1％BSA/PBS稀释样品和一系列浓度的MBP肽标准品，加入到微孔板中进行孵育。100ng/ml的MBP肽储存液进行倍比稀释。本实验所用的稀释度是根据BCA蛋白质测定结果计算出总蛋白含量后确定的。其含量如下：
100μg；50μg；25μg；12.5μg；6.2μg；3.1μg.
与MBP标准品和蛋白样品孵育后，微孔板再用1％BSA/PBS洗涤3次。1％BA/PBS稀释的抗MBP多克隆抗体与微孔板在室温下进行2小时的第二次孵育。孵育后再将微孔板用上述的方法洗涤3次。
将羊抗兔生物素(Vector BA-1000，1∶10000)用1％BSA/PBS稀释，然后每孔中加入50μl，室温下孵育1小时。孵育后再将微孔板用上述的方法洗涤3次。
最后一步孵育是用50μl 1×PBS稀释的链亲和素连接的辣根过氧化物酶(strep-HRP)(Amersham RPN 1051，1∶8000)。微孔板在室温下孵育1小时。
经过洗涤后，加入邻苯二胺二盐酸(OPD)(Sigma，将1粒溶解到20ml水中配制成的溶液)开始反应。通过加入3M HCl或30％H2SO4终止反应。用多扫描荧光板阅读器(multi-scan fluoroplate reader)(Labsystems Multiskan EX)测定492nm处的光密度值。
结果如图12所示，与对照组相比，DIV17时bacOPN(10nM)处理的培养物中MBP蛋白的水平增高3倍。这一结果支持前面所得到的杆状病毒表达的OPN对少突胶质细胞前体细胞的增殖和髓鞘化具有促进效应的结果。
实施例10：骨桥蛋白对CG4细胞增殖的影响
CG4是一种永生化的大鼠少突胶质细胞系，该细胞系是从初级A2B5少突胶质细胞前体细胞自然演变而成的。CG4细胞是一种研究少突胶质细胞分化或存活的常用细胞系。它具有下列特征：
●如少突胶质细胞祖细胞(O2A-样)一样具有高增殖活性(GD3、A2B5阳性细胞)；
●在条件培养基(含有有效浓度的生长因子)中培养费用低，条件培养基来自于ATCC的B104大鼠神经母细胞瘤细胞系(Louis J.C.等，1992)。
●短期内的增殖实验用确定成分的培养基(不含FBS)(添加FGF2+PDGF)代替B104条件培养基；
●在确定成分的培养基中可以被诱导分化成少突胶质细胞(O4，GalC阳性)；
●培养基中存在存在FBS时被诱导分化成星形胶质细胞(GFAP阳性)。
传到35代的CG4细胞用于测定两种骨桥蛋白(大肠杆菌表达的和昆虫细胞表达的)对其增殖的影响。R&D系统的大肠杆菌表达的骨桥蛋白(Cat.441-OP)用于本实验，在体外用蛋白激酶2(GST融合的)将其磷酸化，60μl的反应反应体系含有下列成分：
激酶缓冲液6×：
Hepes 50mM
MgCl2 10mM
DTT 1mM
钒酸钠0.2Mm
β磷酸甘油25mM
样品缓冲液2×pH6：
Tris-Cl 0.125
甘油20％
DTT 0.2M
溴酚蓝0.02％
ATP混合物(60μM)：
30μl 600μM的ATP
5μl 32pATP
265μl H2O2
加入ATP混合物以启动反应，在37℃孵育1小时。在30℃孵育(加搅拌)90分钟后将100μl谷胱甘肽琼脂糖颗粒(Pharmacia)加入到反应混和液中，在加入前先有PBS洗涤反应混和液以去除蛋白激酶。然后将混合物在室温下温和振荡孵育1小时。悬液500g离心5分钟将琼脂糖颗粒沉淀下来。然后用PBS在4℃将上清液透析过夜。蛋白用BCA(Pierce)定量。
激酶反应：
10μl酪蛋白激酶0.05μg/μl
10μl大肠杆菌OPN 0.5μg/μl
20μl 50mM Tris-Cl pH8
10μl激酶缓冲液6×
10μl ATP混合物
增殖实验
检测10pM、10nM、100nM的Bac OPN和体外磷酸化的OPN蛋白对CG4细胞的增殖作用。如Avellana等(1996)所描述的用BrdU(Amersham)作为读出器。细胞培养液分别用70％N1确定成分的培养基(DMEM，含有4.5g/l葡萄糖，2mM谷胺酰胺，100U/ml青霉素，100pg/ml链霉素和1mM丙酮酸钠，并添加5pg/ml运铁蛋白，100mM四甲烯二胺，30nM亚硒酸钠和10ng/ml生物素)和30％B104条件培养基(无生物素的N1)(Louis J.C.等，1992)。实验在多聚鸟氨酸(100μg/ml)处理的24孔板上进行，每孔加入3×104个细胞。同时加入10nM BrdU，然后孵育18小时。固定后用抗BrdU抗体进行免疫组化检测以观察细胞的分裂情况。细胞液可用Hoechst44432(Sigma)染色以计数总的细胞数目。照相后用Leica QWin图象分析系统分析所得到的照片。
结果
结果描述在图13中。
杆状病毒表达的骨桥蛋白可以使CG4细胞的增殖能力提高。尽管100nM的OPN也可以使细胞增殖，但最大效应出现在OPN为10nM时。经过体外的磷酸化，大肠杆菌表达的OPN也可以使CG4细胞出现微小的增殖。
将OPN处理的CG4细胞形态与未处理的做了比较，结果发现OPN处理的细胞大部分都出现的分化，而未处理的细胞没有观察到分化现象。用杆状病毒表达的OPN处理细胞的分化现象更明显，而经体外磷酸化的大肠杆菌OPN也可以使CG4细胞出现分化(数据未显示)。
实施例11：骨桥蛋白在MOG诱导的实验性自身免疫脑脊髓炎小鼠模型上的效应
实验目的
骨桥蛋白(OPN；AS900011)是一种具有多种功能的细胞因子，其中包括对各种类型细胞的黏附、迁移、分化、存活及细胞因子分泌的调节。利用差异基因表达技术对OPN进行检测发现其具有调节髓鞘再生和少突胶质细胞功能的效应(见实施例1)。重组的杆状病毒表达的OPN(AS900011)可以剂量依赖的方式促进少突胶质细胞前体细胞的增殖(IC50：3.7pM，见实施例7)。另外，AS900011还具有使CG4细胞和初级神经球分化的作用(见实施例8)。Cuprizone处理鼠脑部脱髓鞘的胼胝体区域有OPN的表达，其中小胶质细胞上表达最强(见实施例1)。另外，在亚脑室区(SVZ)也观察到了OPN的表达，以前的研究已经证实这一区域能产生参与髓鞘化的少突胶质细胞前体细胞(见实施例4)。从这些结果中可以推测出具有多种免疫调节功能的细胞因子骨桥蛋白也有调节神经元和神经胶质细胞功能的作用。
本实验的目的在于检测OPN对MOG诱导EAE小鼠模型的治疗效果。
试验方法
用于本实验的诱导EAE模型的方法在Sahrbacher等(1998)描述的说明书中已经被采用。对本实验动物的保护是按照Italian D.L.于1992年1月27日颁布的86/609/EEC第116号管理规程执行的。动物饲养的场地和设备是按照EEC委员会86/609管理规程设置的。研究所是被Competent Veterinary Health Authorities授权的。本说明书涉及动物的所有部分已被官方兽医批准。本说明书已被意大利卫生部授权(51/99-B号令)。
实验系统
动物种类，品系，亚系和性别：
来源于IFFA CREDO(Saint Germain sur I”Arbresle，France)的C57 BL6/JICO雌性小鼠，由Charles River Italia(Calco，Lecco，Italy)提供。
选择本实验系统的理由：
C57 BU6/JICO小鼠选为实验模型；该品系小鼠已被文献证实对EAE敏感。
动物提供者：
Charles River Italia S.p.A.
Via Indipendenza，11
23885-Calco(Lecco)
动物对环境的适应：
在实验开始前至少5天开始饲养。在此期间每天观察以确定其是否适合于本实验。
年龄和体重：
约8周龄；18-22g。
动物饲养场地：
空调房间，每笼10只动物。
温度：22±2℃
相对湿度：55％±10
空气变化：约15-20/小时过滤HEPA 99.99％
灯光：12小时轮换(7a.m.-7p.m.)
笼子：Makrolon笼子，42.5×26.6×15h，每只配备一个带不锈钢盖的饲料盒。笼子底部是网格状的。通过网格漏到笼子底部的废物定期清理。
动物鉴别：
打耳号。笼子的标牌标出实验编号、剂量组和给药时间。
食物：
Charles River Italia’s feed licensee Mucedola S.r.l.，Settimo Milanese生产的GLP 4RF25 top certificate颗粒状食物。为了增加生病动物的营养，从第7天开始每天在笼子底部放置湿的颗粒。生长厂商提供食物营养及污染的分析证明，污染物的含量要在EPA-TSCA(44FR：44053-44093，1979年7月26日)建议的范围之内。RBM每年至少再分析两次动物食物内的细菌污染。动物随意进食。
水：
水取自市政主要水系统。水经过过滤，并且通过一个自动阀门系统使动物随意饮水。在自动供水系统上加装塑料瓶。定期分析水内微生物的含量、重金属含量、其它物质的污染(如溶媒，杀虫剂)以及其它化学和物理特征。饮水的可接受限度是根据EEC 80/778号管理规程的要求执行的。
可能会对本实验目的产生干扰的污染物都不应该出现在食物和饮水中。
实验材料
含6组氨酸尾巴的鼠骨桥蛋白(AS900011)和mIFNβ。
免疫过程：
在小鼠左腹部皮下注射(0天)0.2ml乳剂进行免疫，该乳剂含有200μg溶于含0.5mg结核杆菌的完全福氏佐剂(CFA，DIFCO，Detroit，U.S.A.)中的MOG35-55肽(Neosystem，Strasbourg，France)。免疫立刻在腹膜内注射500ng百日咳毒素(ListBiological Lab.，Campbell，CA，U.S.A.)，毒素溶于400μl缓冲液(0.5M NaCl，0.017％Triton X-100，0.015M Tris，pH＝7.5)中。第2天再再腹膜内注射500ng百日咳毒素。第7天，在小鼠右腹部皮下注射溶于CFA中的200μg MOG35-55肽进行第二次免疫。大约从8-10天开始，动物出现进行性的麻痹，从尾巴开始逐渐上升到前肢。
实验设计：
实验分为7组，每组15只动物。所有组动物都按照免疫操作说明书用溶于CFA的MOG35-55肽和百日咳毒素进行免疫，各组的处理方案如下：
第1组：阳性对照组，OPN溶剂(PBS+0.1％BSA)皮下注射。
第2组：阳性对照组：mIFNβ(PBS)，皮下注射。
第3组：皮下注射1μg/kg骨桥蛋白(AS900011)。
第4组：皮下注射10μg/kg骨桥蛋白(AS900011)。
第5组：皮下注射100μg/kg骨桥蛋白(AS900011)。
第6组：皮下注射1μg/kg骨桥蛋白(AS900011)加上20000U/1只鼠mIFNβ。
第7组：皮下注射20000U/1只鼠mIFNβ。
每组动物的数目是能够准确评价所得到的药理学效果的最小数目。
载体：
PBS+0.1％BSA用于将骨桥蛋白稀释到适当浓度。PBS用于将mIFNβ稀释到适当浓度。
给药途径：
剂量分别为1、10和100μg/kg的骨桥蛋白(AS900011)以10ml/kg的体积皮下注射。剂量分别为20000U/1只鼠的mIFNβ以200μl/kg的体积皮下注射。第1组皮下注射10ml/kg的PBS+0.1％BSA，第2组皮下注射200μl/PBS/1只鼠。
实验周期：
本实验中各组开始治疗的时间是在每只动物的临床分数1时，然后连续治疗35天。
给药剂型：
化合物和mIFNβ都是以溶于适当载体中的溶液形式注射的。按照Sponsor指导手册制备各自的制剂。
临床表现：
从免疫后7天开始观察每只动物的麻痹出现情况，以临床分数的形式表示：
0＝无发病迹象
0.5＝部分尾出现麻痹
1＝尾麻痹
1.5＝尾麻痹+单侧后肢部分麻痹
2＝尾麻痹+后肢弱麻痹或部分麻痹
2.5＝尾麻痹+后肢部分麻痹(低位骨盆)
3＝尾麻痹+后肢完全麻痹
3.5＝尾麻痹+后肢完全麻痹+失禁
4＝尾麻痹+后肢麻痹+前肢弱麻痹或部分麻痹
5＝垂死或死亡
在安静的室内观察动物。每天由技术人员双盲监测每个治疗组动物的临床表现，技术人员不知道每组动物治疗的情况。
每天测量动物的体重。
由专业兽医师或权威人士判断动物是否处于痛苦或垂死状态。如果需要就人道地处死以使动物免受过度的痛苦或折磨。
血样采集：
最后一次治疗后24小时，采集每只动物的血样(戊巴比妥麻醉)。按常规操作分离血清，储存在-20℃。然后将冷冻的血清送到SPRI确定血清中化合物的浓度。
组织病理学检测：
在治疗结束后，动物用戊巴比妥麻醉，通过左心室灌注4％甲醛进行固定。然后小心地分离出骨髓并用福尔马林固定。脊髓切片用石蜡块包埋。石蜡块切片后分别用苏木精和伊红检查炎症反应，用Kluver-PAS(LUXOL速蓝(fast blus)加Periodic Acid Schiff染色)以检查脱髓鞘情况。
数据分析：
临床检测结果用每组内的分数均值(±SEM)表示。检测物的疗效与载体处理阳性对照组的疗效进行比较。组间临床分值的差异通过Kruskal-Wallis检验进行分析，如果有明显差异再用Wilcoxon配对检验分析每个测量时间点的数据。体重数据的评价用单向ANOVA，有明显差异的数据再用Tukey检验。所用的分析软件是S-Plus。
结果：
本实验的结果显示在图14到图16中。
通过血管周围炎症侵润的组织学分析发现OPN治疗动物血管周围炎症侵润有减轻的趋势，特别是最低剂量组(1μg/kg)的动物。IFNβ是一种已知的具有多发性硬化症治疗效果的化合物，当OPN与其联合使用时，比单独使用OPN或IFN的治疗效果更好(图14)。
另外，也测量了脱髓鞘区域所占的百分率(图15)。OPN治疗组的动物其脱髓鞘区域也有减少的趋势。联合使用IFN和OPN可以使脱髓鞘区域明显减少，甚至比IFN单独治疗组低很多(图15)。
图16总结了本实验中在治疗结束时所观测到的临床分数、炎症侵润和脱髓鞘区域。尽管OPN治疗组的临床分数与对照组相比没有显著的降低，但OPN和IFN联合治疗确实可以使脱髓鞘区域明显减少，与阳性对照干扰素治疗组一样。这一结果与所观察到的炎症侵润及脱髓鞘范围一致。用OPN和IFNβ治疗后这两个指标都显著降低(图16)。
总之，本实验可以得到下列结果：单独皮下注射1、10、100mg/kg的骨桥蛋白(AS900011)不能使血管周围炎症侵润和脱髓鞘区域出现统计学意义上的显著降低。用mIFNβ治疗(20000U/1只鼠，皮下注射)可以诱导血管周围炎症侵润降低(55％)和脱髓鞘区域减少(53％)。当相同剂量的mIFNβ与100mg/kg的AS900011联合进行皮下注射时，可以观察到炎症侵润显著降低(71％)，脱髓鞘区域明显减少(81％)。
在35天(治疗结束时)将动物处死收集脊髓后进行组织学分析，所观察到的数据与临床分数一致。单独皮下注射1、10、100mg/kg的骨桥蛋白(AS900011)不能显著减轻疾病的严重程度。用mIFNβ治疗(20000U/1只鼠，皮下注射)可以显著减轻疾病的严重程度。当相同剂量的mIFNβ与100mg/kg的AS900011联合进行皮下注射时，可以观察到统计学意义上的临床症状缓解。
这些结果说明骨桥蛋白和mIFNβ联合治疗可以有效减轻鼠EAE模型的临床症状和病理效应，因而可以有效治疗多发性硬化症。
实施例12：骨桥蛋白对坐骨神经压迫诱导的小鼠神经病的保护性效应
缩写词
CMAP：混和肌肉动作电位
EMG：肌电描记法
IGF-1：胰岛素样生长因子
SC：皮下的
s.e.m.：均值的标准差
vs：对
前言
神经病通常是选择性的，根据受影响的外周神经元类型(如感觉神经对迷走神经)或神经元亚型(小神经对大神经)的不同而不同。外周神经的Axotomy是一种最常用的评价神经营养因子神经保护效应的动物模型。创伤性神经损伤、神经丛损伤记背根神经损伤是意外事故最严重的并发症。另外，能造成髓磷脂损伤的周围神经压迫在神经疾病中也很常见，如腕管综合征或与脊柱矫形并发症有关的疾病。Axotomy出现的变化有细胞死亡、轴突传导速度下降及损伤神经元神经递质的改变等。压迫造成的损伤可以恢复，另一个感兴趣的过程与神经病变的状态有关(McMahon S.和Priestly J.V.1995)。
细胞生物学的一个基本问题就是损伤或疾病后神经再生的调节。功能性的神经再生不仅需要轴突的发芽和延伸，而且还需要有新的髓磷脂合成。髓鞘再生对正常神经传导的恢复及保护轴突免受新的神经变性性免疫攻击是必须的。研究神经变性疾病的主要目标是最终开发出能预防神经死亡、维持神经元的表型及修复神经元和髓磷脂损伤的干预措施。已有许多研究致力于解释axotomized脊髓运动神经元完全再生的分子及细胞机制(Fawcett等，1990；Funakoshi等，1993)。损伤所诱导的神经营养因子及相应受体的表达可能在神经再生过程中发挥重要作用。以前的研究已经证明各种肽类或非肽类化合物能明显促进神经的再生，如胰岛素样生长因子(IGF-1)、ACTH(Lewis等，1993；Strand等，1980)，睾丸酮(Jones，1993)，SR57746A(Fournier等，1993)和4-甲基儿茶酚(Kaechi K等，1993，1995；Hanaoka Y等，1992)。
本实验的目的在于评价不同剂量骨桥蛋白治疗小鼠内的神经再生情况。在本模型中，OPN对神经元及轴突(感觉和运动神经元)的存活和再生，对髓鞘化或巨噬细胞侵润的积极疗效可以使运动功能得以恢复。神经再生是根据感觉运动功能的恢复情况及形态学研究来评价的。因此本研究中电生理学记录和组织形态学分析同时进行。
材料和方法
动物
84只8周龄的C57bl/6 RJ小鼠(levage Janvier，Le Genest-St-Isle，France)分为7组(n＝12)：(a)载体假处理组；(b)载体神经压迫组；(c)神经压迫/骨桥蛋白组(1μg/kg)；(d)神经压迫/骨桥蛋白组(10μg/kg)；(e)神经压迫/骨桥蛋白组(100μg/kg)；(f)神经压迫/4-甲基儿茶酚组(10μg/kg)；(g)神经压迫/变性骨桥蛋白组(100μg/kg)。
小鼠分组饲养(每只笼子5只小鼠)，置于恒温(21-22℃)的饲养室内，白天和黑夜颠倒(12h/12h)，随意进食和饮水。所有操作都按照研究指导手册进行。
坐骨神经的损伤
动物腹膜内注射60mg/kg盐酸氯胺酮(Imalgéne 500，Rhóne Mérieux，Lyon，France)使之麻醉。在大腿中部手术暴露右侧坐骨神经，在离其三根分叉部约5mm压迫。用止血钳(1.5mm宽；Koenig；Strasbourg；France)夹住坐骨神经90度旋转压迫两次，每次30秒。
实验计划及药物治疗
在手术前记录一次肌电图(基线)，在手术后3周内每周再记录一次。
神经压迫手术的当天为0天(D)。手术后4天内不再进行实验。
每天几率动物体重和存活率。
从手术当天开始到实验结束，每天皮下注射骨桥蛋白和变性的骨桥蛋白，腹膜内注射4-甲基儿茶酚。
在第4周每组处死4只小鼠，分离坐骨神经，观察其形态学的改变。
电生理记录
用Neuromatic 2000M电生理记录仪(EMG)(Dantec，Les Ulis，France)记录电生理信号。小鼠腹膜内注射100mg/kg盐酸氯胺酮(Imalgéne 500，Rhóne Mérieux，Lyon，France)使之麻醉。用加热灯加热使其维持正常的30℃体温，在尾巴上放置一个接触温度计(Quick，Bioblock Scientific，Illkirch，France)控制温度。
以超极限强度(12.8mA)的电流给予坐骨神经一个0.2ms的刺激后测量腓肠肌的混和肌肉动作电位(CMAP)。记录动作电位的幅度(mV)、潜伏期(ms)和持续时间(去极化和复极化所需要的时间)。幅度是反映活性运动单位数目的指标，而远端潜伏期间接反映了运动神经传导和神经肌肉传递速率。
形态学分析
压迫神经后3周进行形态学分析。每组随机挑选4只动物用于本实验。小鼠腹膜内注射100mg/kg盐酸氯胺酮使之麻醉。取5mm的坐骨神经片段用于组织学分析，组织用溶于磷酸缓冲液(pH＝7.4)中的4％戊二醛水溶液(Sigma，L’lsled’Abeau-Chesnes，France)固定过夜，戊二醛水溶液使用前保存在30％蔗糖中，于4℃储存。神经在磷酸缓冲液溶解的2％四氧化锇(Sigma，L’Isle d’Abeau-Chesnes，France)固定2小时，然后用一系列乙醇溶液脱水，再用环氧树脂包被。包被的组织置于70℃使之聚合3天。用切片机切出1.5μm的横切面，用1％甲苯胺蓝(Sigma，L’Isle d’Abeau-Chesnes，France)染色2分钟，脱水后置于Eukitt上。每个样品切20个切片，用光学显微镜(Nikon，Tokyo，Japan)观察，每个样品随机取6个切片用半自动数码影像分析软件(Biocom，France)进行形态学分析。每个切片分析两个视野。计算下列参数：变性纤维百分率(每个视野)和总纤维数。
数据分析
对数据进行Gglobal分析时用一种因素或重复测量对方差的分析(anova)以及用单向anova和非-参数实验(mann whitney实验)。适当时可进一步进行dunnett实验。显著性差异的水平设定为p＜0.05。结果以均值的平均标准差(s.e.m.)表示。
结果
经神经压迫处理后所有的动物都存活下来。一只鼠(神经压迫/载体n°2)死于第7天，2只鼠(载体假处理n°3和N°6)死于第14天，死亡是在进行EMG评价期间由麻醉造成的。
动物体重
如图17所示，整个实验中体重增加量在组间存在显著性差异[F(6，132)＝1.93和p＜0.001；重复测量ANOVA]。
在整个实验过程中所有组的动物体重都有所增加。
电生理学检测
混和肌肉动作电位的幅度(图18)：
整个实验中CMAP的幅度在组间存在显著性差异[F(6，18)＝49.185和p＜0.001；重复测量ANOVA](图19)。
神经损伤后，所有经过神经压迫手术的动物与假处理组的动物相比其CMAP幅度明显下降(p＜0.001；Dunnett实验)。
而且，在第7天和第14天，100μg/kg骨桥蛋白处理组小鼠或10μg/kg 4-甲基儿茶酚处理组小鼠的CMAP幅度比神经压迫/载体组小鼠的CMAP幅度显著升高(p＜0.05；Dunnett实验)。
神经压迫/载体组与神经压迫/变性骨桥蛋白100μg/kg组之间无显著性差异。
混和肌肉动作电位的潜伏期(图19)：如图20所示，CMAP的潜伏期在组间存在显著性差异[F(6，18)＝2.521和p＜0.001；重复测量ANOVA]。在第21天，神经压迫组的CMAP潜伏期比假处理组显著延长(p＜0.001；Dunnett实验)。而且，10μg/kg和100μg/kg的骨桥蛋白表现出显著的治疗效果，这两组的CMAP潜伏期比神经压迫/载体组显著缩短(p＝0.017；Dunnett实验)。
神经压迫/载体组与神经压迫/变性骨桥蛋白100μg/kg组之间无显著性差异。
混和肌肉动作电位的持续时间(图20)：CMAP的持续时间[F(6，18)＝25.15和p＜0.001；重复测量ANOVA](图20)。
从第7天开始，神经压迫组的CMAP持续时间显著延长(假处理组对神经压迫组：p＜0.001；Dunnett实验)。而且在第7天，神经压迫/骨桥蛋白100μg/kg组的CMAP持续时间比神经压迫/载体组的CMAP持续时间明显缩短(p＜0.001；Dunnett实验)。在第14天和第21天，有三组的CMAP持续时间比神经压迫/载体组显著缩短：(a)神经压迫/骨桥蛋白10μg/kg组；(b)神经压迫/骨桥蛋白100μg/kg组；(c)神经压迫/4-甲基儿茶酚10μg/kg组。
然而神经压迫/载体组与神经压迫/变性骨桥蛋白100μg/kg组之间无显著性差异。
形态学分析变性纤维的百分率(图21)：
统计学分析表明每个区域内变性纤维的百分率在组间存在显著性差异(p＜0.001；单向ANOVA)(图22)。所有神经压迫组的变性纤维百分率都显著增加(p＜0.001，Dunnett实验)。而且神经压迫/治疗组的小鼠变性纤维百分率与神经压迫/载体组的小鼠相比显著降低(p＜0.001；Dunnett实验)。
另外，变性骨桥蛋白(100μg/kg)处理组与骨桥蛋白处理组相比其变性纤维百分率显著升高(p＜0.001；Dunnett实验)。
纤维总数(图22)：
神经纤维切片用光学显微镜观察，通过Visiolab 2000软件(Biocom，Paris，France)进行形态学分析。每只动物分析5个切片，每个切片分析两个视野。只有功能性髓鞘化的纤维才被计算机记录(所有髓鞘变性的变性纤维不记录在内)。
结论
通过神经压迫可以造成很好的周围神经病模型。神经被压迫后大多数大直径的神经纤维立刻就会失去功能，由于机械损伤其CMAP幅度显著下降。CMAP潜伏期不会立刻受到影响，但是在21天时会延长，这是由于受次级的免疫介导的变性作用(巨噬细胞、粒细胞)影响小直径纤维出现变性。CMAP持续时间在第7天时开始延长，14天达到高峰，21天时又恢复到第7天的水平。这是由于在21天时压迫所造成的损伤得以恢复，另一个感兴趣的过程与神经病变的状态有关。在3周时对照组的轴突发芽/再生现象也是很明显的。
骨桥蛋白对神经压迫模型鼠具有保护作用。感觉运动功能在损伤后7、14和21天时以剂量依赖的方式明显恢复，压迫后21天的形态学分析表明变性纤维的百分率显著降低，总纤维数显著增加。骨桥蛋白作为一个对照分子用在本实验中被证明是有效的，4-甲基儿茶酚和热灭活的变性OPN对功能性或组织学指标无任何有显著意义的影响。这种对功能性或组织学指标的正效应是由于OPN具有以下效应：
-直接保护纤维免受次级免疫介导变性损伤的影响；
-加速髓鞘再生和保护轴突；
-加速受损轴突的再生/发芽；
-促进巨噬细胞清除髓磷脂碎片。
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序列表
<110>应用研究系统ARS股份公司(Applied Research Systems ARS Holding N.V.)
<120>骨桥蛋白用于治疗和/或预防神经疾病
<130>WO 473
<150>01111296
<151>2001-05-17
<160>5
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>314
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>1
Met Arg Ile Ala Val Ile Cys Phe Cys Leu Leu Gly Ile Thr Cys Ala
1               5                   10                  15
Ile Pro Val Lys Gln Ala Asp Ser Gly Ser Ser Glu Glu Lys Gln Leu
            20                  25                  30
Tyr Asn Lys Tyr Pro Asp Ala Val Ala Thr Trp Leu Asn Pro Asp Pro
        35                  40                  45
Ser Gln Lys Gln Asn Leu Leu Ala Pro Gln Asn Ala Val Ser Ser Glu
    50                  55                  60
Glu Thr Asn Asp Phe Lys Gln Glu Thr Leu Pro Ser Lys Ser Asn Glu
65                  70                  75                  80
Ser His Asp His Met Asp Asp Met Asp Asp Glu Asp Asp Asp Asp His
                85                  90                  95
Val Asp Ser Gln Asp Ser Ile Asp Ser Asn Asp Ser Asp Asp Val Asp
            100                 105                 110
Asp Thr Asp Asp Ser His Gln Ser Asp Glu Ser His His Ser Asp Glu
        115                 120                 125
Ser Asp Glu Leu Val Thr Asp Phe Pro Thr Asp Leu Pro Ala Thr Glu
    130                 135                 140
Val Phe Thr Pro Val Val Pro Thr Val Asp Thr Tyr Asp Gly Arg Gly
145                 150                 155                 160
Asp Ser Val Val Tyr Gly Leu Arg Ser Lys Ser Lys Lys Phe Arg Arg
                165                 170                 175
Pro Asp Ile Gln Tyr Pro Asp Ala Thr Asp Glu Asp Ile Thr Ser His
            180                 185                 190
Met Glu Ser Glu Glu Leu Asn Gly Ala Tyr Lys Ala Ile Pro Val Ala
        195                 200                 205
Gln Asp Leu Asn Ala Pro Ser Asp Trp Asp Ser Arg Gly Lys Asp Ser
    210                 215                 220
Tyr Glu Thr Ser Gln Leu Asp Asp Gln Ser Ala Glu Thr His Ser His
225                 230                 235                 240
Lys Gln Ser Arg Leu Tyr Lys Arg Lys Ala Asn Asp Glu Ser Asn Glu
                245                 250                 255
His Ser Asp Val Ile Asp Ser Gln Glu Leu Ser Lys Val Ser Arg Glu
            260                 265                 270
Phe His Ser His Glu Phe His Ser His Glu Asp Met Leu Val Val Asp
        275                 280                 285
Pro Lys Ser Lys Glu Glu Asp Lys His Leu Lys Phe Arg Ile Ser His
    290                 295                 300
Glu Leu Asp Ser Ala Ser Ser Glu Val Asn
305                 310
<210>2
<211>299
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>2
Met Arg Ile Ala Val Ile Cys Phe Cys Leu Leu Gly Ile Thr Cys Ala
1               5                   10                  15
Ile Pro Val Lys Gln Ala Asp Ser Gly Ser Ser Glu Glu Lys Gln Leu
            20                  25                  30
Tyr Asn Lys Tyr Pro Asp Ala Val Ala Thr Trp Leu Asn Pro Asp Pro
        35                  40                  45
Ser Gln Lys Gln Asn Leu Leu Ala Pro Gln Leu Pro Ser Lys Ser Asn
    50                  55                  60
Glu Ser His Asp His Met Asp Asp Met Asp Asp Glu Asp Asp Asp Asp
65                  70                  75                  80
His Val Asp Ser Gln Asp Ser Ile Asp Ser Asn Asp Ser Asp Asp Val
                85                  90                  95
Asp Asp Thr Asp Asp Ser His Gln Ser Asp Glu Ser His His Ser Asp
            100                 105                 110
Glu Ser Asp Glu Leu Val Thr Asp Phe Pro Thr Asp Leu Pro Ala Thr
        115                 120                 125
Glu Val Phe Thr Pro Val Val Pro Thr Val Asp Thr Tyr Asp Gly Arg
    130                 135                 140
Gly Asp Ser Val Val Tyr Gly Leu Arg Ser Lys Ser Lys Lys Phe Arg
145                 150                 155                 160
Arg Pro Asp Ile Gln Tyr Pro Asp Ala Thr Asp Glu Asp Ile Thr Ser
                165                 170                 175
His Met Glu Ser Glu Glu Leu Asn Gly Ala Tyr Lys Ala Ile Pro Val
            180                 185                 190
Ala Gln Asp Leu Asn Ala Pro Ser Asp Trp Asp Ser Arg Gly Lys Asp
        195                 200                 205
Ser Tyr Glu Thr Ser Gln Leu Asp Asp Gln Ser Ala Glu Thr His Ser
    210                 215                 220
His Lys Gln Ser Arg Leu Tyr Lys Arg Lys Ala Asn Asp Glu Ser Asn
225                 230                 235                 240
Glu His Ser Asp Val Ile Asp Ser Gln Glu Leu Ser Lys Val Ser Arg
                245                 250                 255
Glu Phe His Ser His Glu Phe His Ser His Glu Asp Met Leu Val Val
            260                 265                 270
Asp Pro Lys Ser Lys Glu Glu Asp Lys His Leu Lys Phe Arg Ile Ser
        275                 280                 285
His Glu Leu Asp Ser Ala Ser Ser Glu Val Asn
    290                 295
<210>3
<211>286
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>3
Met Arg Ile Ala Val Ile Cys Phe Cys Leu Leu Gly Ile Thr Cys Ala
1               5                   10                  15
Ile Pro Val Lys Gln Ala Asp Ser Gly Ser Ser Glu Glu Lys Asn Ala
            20                  25                  30
Val Ser Ser Glu Glu Thr Asn Asp Phe Lys Gln Glu Thr Leu Pro Ser
        35                  40                  45
Lys Ser Asn Glu Ser His Asp His Met Asp Asp Met Asp Asp Glu Asp
    50                  55                  60
Asp Asp Asp His Val Asp Ser Gln Asp Ser Ile Asp Ser Asn Asp Ser
65                  70                  75                  80
Asp Asp Val Asp Asp Thr Asp Asp Ser His Gln Ser Asp Glu Ser His
                85                  90                  95
His Ser Asp Glu Ser Asp Glu Leu Val Thr Asp Phe Pro Thr Asp Leu
            100                 105                 110
Pro Ala Thr Glu Val Phe Thr Pro Val Val Pro Thr Val Asp Thr Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Arg Gly Asp Ser Val Val Tyr Gly Leu Arg Ser Lys Ser Lys
    130                 135                 140
Lys Phe Arg Arg Pro Asp Ile Gln Tyr Pro Asp Ala Thr Asp Glu Asp
145                 150                 155                 160
Ile Thr Ser His Met Glu Ser Glu Glu Leu Asn Gly Ala Tyr Lys Ala
                165                 170                 175
Ile Pro Val Ala Gln Asp Leu Asn Ala Pro Ser Asp Trp Asp Ser Arg
            180                 185                 190
Gly Lys Asp Ser Tyr Glu Thr Ser Gln Leu Asp Asp Gln Ser Ala Glu
        195                 200                 205
Thr His Ser His Lys Gln Ser Arg Leu Tyr Lys Arg Lys Ala Asn Asp
    2l0                 215                 220
Glu Ser Asn Glu His Ser Asp Val Ile Asp Ser Gln Glu Leu Ser Lys
225                 230                 235                 240
Val Ser Arg Glu Phe His Ser His Glu Phe His Ser His Glu Asp Met
                245                 250                 255
Leu Val Val Asp Pro Lys Ser Lys Glu Glu Asp Lys His Leu Lys Phe
            260                 265                 270
Arg Ile Ser His Glu Leu Asp Ser Ala Ser Ser Glu Val Asn
        275                 280                 285
<210>4
<211>22
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>4
agcctgcacc cagatcctat ag                                        22
<210>5
<211>21
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>5
gcgcaaggag attctgcttc t                                         21

Claims (22)

1.骨桥蛋白或骨桥蛋白活性激动剂在制备用于治疗和/或预防神经疾病的药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其中，所述神经疾病选自创伤性神经损伤、脑卒中、CNS或PNS的脱髓鞘疾病、神经病和神经变性疾病。
3.如权利要求1或2所述的应用，其中，所述神经疾病是由先天性代谢障碍引起的。
4.如上述任一权利要求所述的应用，其中，所述神经疾病是周围神经病。
5.如权利要求4所述的应用，其中，所述神经疾病是糖尿病性神经病。
6.如权利要求2所述的应用，其中，所述脱髓鞘疾病是多发性硬化症(MS)。
7.如权利要求2所述的应用，其中，所述神经变性疾病选自阿尔茨海默病、帕金森病、亨庭顿舞蹈病和肌萎缩性侧索硬化症(ALS)。
8.如权利要求1-7中任一项所述的应用，其中，所述骨桥蛋白选自：
(a)含有SEQ ID NO：1的多肽；
(b)含有SEQ ID NO：1的1到168或1到170氨基酸的多肽；
(c)含有SEQ ID NO：1的1到16和170到314氨基酸的多肽；
(d)含有SEQ ID N0：1的170到314氨基酸的多肽；
(e)含有SEQ ID NO：2的多肽；
(f)含有SEQ ID NO：3的多肽；
(g)(a)到(f)的任何一个突变体，其中的氨基酸序列与(a)到(f)中至少一个序列至少有40％、50％、60％、70％、80％或90％的同一性；
(h)(a)到(f)的任何一个突变体，该突变体是由在温和条件或严格条件下能与编码(a)到(f)任何一个突变体的天然DNA序列的互补序列杂交的DNA序列编码的；
(i)(a)到(f)的任何一个突变体，其中，所述氨基酸序列的任何改变都是用保守性氨基酸取代(a)到(f)任何一个突变体的氨基酸；
(j)(a)到(f)任何一个突变体的盐或亚型、融合蛋白、功能衍生物、活性片段或环形排列的衍生物。
9.如权利要求1-8中任一项所述的应用，其中，所述骨桥蛋白与一种能促进透过血脑屏障的载体分子、肽或蛋白质融合。
10.如权利要求8或9所述的应用，其中，所述骨桥蛋白是PEG化的。
11.如权利要求8-10中任一项所述的应用，其中，所述融合蛋白含有一个免疫球蛋白(Ig)融合子。
12.上述任一权利要求所述的应用，其中，所述药物还含有同时、相继或分别使用的干扰素。
13.如权利要求12所述的应用，其中，所述干扰素是干扰素β。
14.如上述任一权利要求所述的应用，其中，所述骨桥蛋白的用量约为每千克体重0.001-100毫克，或每千克体重1-10毫克，或每千克体重5毫克。
15.核酸分子在制备用于治疗和/或预防神经疾病的药物中的应用，其中，所述核酸分子含有编码多肽的核酸序列，该多肽含有选自以下的氨基酸序列：
(k)含有SEQ ID NO：1的多肽；
(l)含有SEQ ID NO：1的1到168或1到170氨基酸的多肽；
(m)含有SEQ ID NO：1的1到16和170到314氨基酸的多肽；
(n)含有SEQ ID NO：1的170到314氨基酸的多肽；
(o)含有SEQ ID NO：2的多肽；
(p)含有SEQ ID NO：3的多肽；
(q)(a)到(f)的任何一个突变体，其中的氨基酸序列与(a)到(f)中至少一个序列至少有40％、50％、60％、70％、80％或90％的同一性；
(r)(a)到(f)的任何一个突变体，该突变体是由在温和条件或严格条件下能与编码(a)到(f)任何一个突变体的天然DNA序列的互补序列杂交的DNA序列编码的；
(s)(a)到(f)的任何一个突变体，其中，所述氨基酸序列的任何改变都是用保守性氨基酸取代(a)到(f)任何一个突变体的氨基酸；
(t)(a)到(f)任何一个突变体的盐或亚型、融合蛋白、功能衍生物、活性片段或环形排列的衍生物。
16.如权利要求15所述的应用，其中，所述核酸分子还含有表达载体序列。
17.能诱导和/增强内源性骨桥蛋白或骨桥蛋白活性激动剂产生的细胞内载体在制备用于治疗和/或预防神经疾病的药物中的应用。
18.如权利要求15-17中任一项的所述应用用于基因治疗。
19.经过基因改造能产生骨桥蛋白或骨桥蛋白活性激动剂的细胞在制备用于治疗和/或预防神经疾病的药物中的应用。
20.含有骨桥蛋白或骨桥蛋白活性激动剂及干扰素的药用组合物，可选择性添加一种或多种药学上可接受的赋形剂，该组合物用于治疗和/或预防神经疾病。
21.一种治疗神经疾病的方法，所述方法包括给予需要治疗的病人有效剂量的骨桥蛋白或骨桥蛋白活性激动剂，再选择性添加药学上可接受的载体。
22.一种治疗神经疾病的方法，该方法包括给予需要治疗的病人有效剂量的骨桥蛋白或骨桥蛋白活性激动剂及干扰素，再选择性添加药学上可接受的载体。
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