SK14232003A3 - Použitie osteopontínu alebo agonistu osteopontínovej aktivity - Google Patents

Description

Oblasť techniky

Predložený vynález sa vo všeobecnosti týka použitia osteopontínu alebo agonistu osteopontínovej aktivity na výrobu lieku na liečenie alebo prevenciu neurologických ochorení a porúch. Týka sa neuroprotekcie, nervovej myelinácie a generovania alebo regenerovania buniek produkujúcich myelín. Konkrétne sa týka demyelinačných a neurodegeneratívnych ochorení, neuropatií, traumatického nervového poškodenia a neurologických ochorení spôsobených kongenitálnymi metabolickými poruchami.

Doterajší stav techniky

Nervová myelinizácia je nevyhnutným procesom pri vytváraní a fungovaní kompartmentov centrálneho nervového systému (CNS) a periférneho nervového systému (PNS). Myelínový obal okolo axónov je potrebný na správne vedenie elektrických impulzov pozdĺž nervov. Strata myelínu nastáva pri množstve ochorení, medzi inými pri skleróze multiplex (MS) postihujúcej CNS, Guillain-Barre syndróme, CIDP a iných (pozri Abramsky a Ovadia, 1997; Trojaborg, 1998, Hartung a ďalší, 1998). Hoci majú rôzny pôvod, ako napríklad infekčné patogény alebo autoimunitné záchvaty, všetky demyelizačné ochorenia spôsobujú stratu neurologickej funkcie a môžu viesť k paralýze a smrti. Hoci súčasné terapeutiká redukujú zápalové záchvaty v MS a spomaľujú postup ochorenia, existuje potreba vyvinutia terapií, ktoré by mohli viesť k remyelinizácii a obnoveniu neurologickej funkcie (Abramsky a Ovadia, 1997, Pohlau a ďalší, 1998).

Poškodenie CNS indukované akútnymi inzultáciami vrátane traumy, hypoxie a ischémie, môže poškodiť tak neuróny, ako aj bielu hmotu. Hoci najväčšia pozornosť bola venovaná procesom vedúcim k smrti neurónov, množiace sa dôkazy naznačujú, že poškodenie oligodendrocytov, ktoré myelinizujú axóny, je tiež špecifickou zložkou CNS poškodenia. Takáto oligodendrocytová patológia bola demonštrovaná vo veľmi skorých fázach po mŕtvici (3 hodiny) u potkanov, čo

-2naznačuje, že tieto bunky sú ešte citlivejšie na excitotoxické javy ako nervové bunky (Pantoni a ďalší, 1996). Jedným potenciálnym kandidátom sprostredkúvajúcim bunkovú smrť je značne zvýšená glutamátová koncentrácia, ktorá sprevádza mnohé akútne CNS poškodenia (Lipton a ďalší, 1994). V skutočnosti sa zistilo, že okrem neurónov, aj oligodendrocyty exprimujú funkčné glutamátové receptory patriace k AMPA/kainátovému podtypu. Navyše, oligodendrocyty vykazujú vysokú náchylnosť ku glutamátovej aplikácii (McDonald a ďalší, 1998).

Trauma je poranenie alebo poškodenie nervu. Môže ňou byť trauma miechy, ktorou je poškodenie miechy, ktoré postihuje všetky nervové funkcie, ktoré riadi v mieste a pod miestom poškodenia, vrátane riadenia svalov a citlivosti, alebo mozgová trauma, ktorou je trauma spôsobená poranením hlavy.

Mozgová hypoxia je nedostatok kyslíka, konkrétne v mozgových hemisférach a typickejšie sa tento výraz používa na označenie nedostatku kyslíka v celom mozgu. V závislosti na závažnosti hypoxie, môžu byť symptómy v rozsahu od zmätenia po nezvratné poškodenie mozgu, kómu a smrť.

Mŕtvica je zvyčajne spôsobená ischémiou mozgu. Je nazývaná aj mozgovocievne ochorenie alebo príhoda. Je skupinou mozgových porúch zahŕňajúcich stratu mozgových funkcií, ktoré nastávajú, keď sa preruší prívod krvi do ktorejkoľvek časti mozgu. Mozog vyžaduje približne 20% cirkuláciu krvi v tele. Primárne sa krv dodáva do mozgu dvoma artériami v krku (karotídové artérie), ktoré sa potom rozvetvujú vo vnútri mozgu na viaceré artérie, z ktorých každá zásobuje špecifickú oblasť mozgu. Aj krátke prerušenie toku krvi môže spôsobiť pokles mozgovej funkcie (neurologický deficit). Symptómy sa menia podľa postihnutej oblasti mozgu a zvyčajne zahŕňajú také problémy, ktorými sú zmeny vo videní, rečové zmeny, zníženie pohyblivosti a citlivosti v časti tela alebo zmeny na úrovni sebauvedomovania. Ak prúdenie krvi poklesne na dlhšie ako niekoľko sekúnd, mozgové bunky v danej oblasti sa zničia (zinfarktujú), čo spôsobí permanentné poškodenie tejto oblasti mozgu alebo aj smrť.

Mŕtvica postihuje približne 4 ľudí z 1000. Je treťou najčastejšou príčinou smrti vo väčšine rozvinutých krajín, vrátane USA. Incidencia mŕtvice sa dramaticky zvyšuje s vekom, pričom riziko sa zdvojnásobuje s každou dekádou po 35. roku. Približne 5% ľudí po 65. roku malo aspoň jednu mŕtvicu. Porucha sa u mužov vyskytuje častejšie ako u žien.

-3Ako je uvedené vyššie, mŕtvica zahŕňa stratu mozgových funkcií (neurologické deficity) spôsobené znížením krvnej cirkulácie v oblastiach mozgu. Špecifické neurologické deficity sa môžu meniť v závislosti na lokalizácii, rozsahu poškodenia a príčine poruchy. Mŕtvica môže byť spôsobená znížením prietoku krvi (ischémia), ktorý vedie k nedostatočnému dodávaniu krvi a smrti tkanív v tejto oblasti (infarkt). Príčinami ischemických mŕtvie sú krvné zrazeniny, ktoré sa tvoria v mozgu (trombus) a krvné zrazeniny alebo kúsky aterosklerotického plaku alebo iného materiálu, ktoré prídu do mozgu z inej lokality (embólia). Krvácanie (hemorhage) vo vnútri mozgu môže spôsobovať symptómy, ktoré sa podobajú mŕtvici.

Najbežnejšou príčinou mŕtvice je mŕtvica sekundárne po ateroskleróze (mozgová trombóza). Ateroskleróza („tvrdnutie artérií“) je stavom, pri ktorom sa na vnútornej obrube artérií nachádzajú tukové depozity a vyvíja sa aterosklerotický plak (masa pozostávajúca z tukových depozitov a krvných doštičiek). Pomaly sa vyvíja upchatie artérie. Aterosklerotický plak nemusí nevyhnutne spôsobovať mŕtvicu. Môže existovať množstvo malých spojení medzi rôznymi mozgovými artériami. Ak prietok krvi postupe klesá, tieto malé spojenia zväčšujú svoju veľkosť a obchádzajú upchatú oblasti (kolaterálna cirkulácia). Ak je dostatočná kolaterálna cirkulácia, aj úplne blokovaná artéria nemusí spôsobovať neurologické deficity. Druhým bezpečnostným mechanizmom v vnútri mozgu je, že artérie sú dostatočne veľké na to, aby mohlo byť upchatých 75 % krvnej cievy, pričom ešte stále je adekvátne prúdenie krvi do takejto oblasti mozgu.

Trombotická mŕtvica (mŕtvica spôsobená trombózou) je najbežnejšia u starých ľudí a často je podložená ateroslerotickým srdcovým ochorením alebo cukrovkou. Tento typ mŕtvice môže nastať kedykoľvek, aj pri odpočinku. Osoba môže alebo nemusí stratiť vedomie.

Mŕtvica spôsobená embóliou (pohybom krvnej zrazeniny) je najčastejšou mŕtvicou sekundárne po kariogénnej embólii, pričom zrazeniny, ktoré sa vyvinú v dôsledku srdcových porúch potom putujú do mozgu. Embólia môže mať pôvod aj v iných oblastiach, najmú v tej, v ktorej je aterosklerotický plak. Embolus putuje krvným riečišťom a uviazne v malej artérii v mozgu. Táto mŕtvica nastáva náhle s okamžitým maximálnym neurologickým deficitom. Nie je asociovaná s úrovňou

-4aktivity a môže nastať kedykoľvek. S touto poruchou sa bežne pozoruje arytmia srdca a často je príčinou embolus. Poškodenie mozgu je často závažnejšie ako pri mŕtvici spôsobenej mozgovou trombózou. Môže, ale nemusí nastať strata vedomia. Pravdepodobný výstup je zhoršený, ak sú krvné cievy poškodené prasknutím a krvácaním pri mŕtvici (hemoragická mŕtvica).

Periférna neuropatia je syndróm straty citlivosti, svalovej slabosti a atrofie, zníženej hĺbky šľachových reflexov a vazomotorických symptómov, samostatne alebo v akejkoľvek kombinácii.

Ochorenie môže postihnúť jediný nerv (mononeuropatia), dva alebo viacero nervov v oddelených oblastiach (viacnásobná mononeuropatia) alebo mnohé nervy simultánne (polyneuropatia). Primárne môže byť postihnutý axón (napr. pri cukrovke, Lymskej borelióze alebo urémii alebo s toxickými činidlami) alebo môže byť primárne postihnutý myelínový obal alebo Schwannové bunky (napr. pri akútnej alebo chronickej zápalovej polyneuropatii, leukodystrofiách alebo Guillain-Barré syndróme). Poškodenie malých nemyelinizovaných a myelinizovaných vlákien vedie primárne k strate citlivosti na teplo a bolesť; poškodenie veľkých myelinovaných vlákien vedie k motorickým a proprioceptívym defektom. Niektoré neuropatie (napr. v dôsledku otravy olovom, použitia dapsónu, poštípania roztočom, porfýrie alebo Guillain-Barré sydrómu) primáre postihujú motorické vlákna; iné (napr. v dôsledku dorzálnej koreňovej ganglionitídy rakoviny, leprózy, AIDS, cukrovky alebo chronickej pyridoxínovej intoxikácie) primárne postihujú dorzálne koreňové gangliá alebo senzorické vlákna, produkujúc senzorické symptómy. Príležitostne sú postihnuté aj kraniálne nervy (napr. pri Guillain-Barré syndróme, Lymskej borelióze, cukrovke a diftérii). Identifikácia podieľajúcich sa modalít pomáha určiť príčinu.

Trauma je najbežnejšou príčinou lokalizovaného poškodenia jediného nervu. Prudká svalová aktivita alebo násilné pretiahnutie kĺbu môže spôsobiť fokálnu neuropatiu, čo môžu aj opakované malé traumy (napr. tesné zovretie malých nástrojov, nadmerná vibrácia vzduchových kladív). Tlaková alebo zvieravá paralýza zvyčajne postihuje povrchové nervy (lakťový, radiálny, fibulárny) najmä pri kostiach (napr. počas hlasného spánku alebo v priebehu anestézie u chudých alebo kachetických osôb a často u alkoholikov) alebo v úzkych kanáloch (napr. pri karpálnom tunelovom syndróme). Tlaková paralýza môže byť aj výsledkom

-5nádorov, kostnej hyperostózy, sadry, bariel alebo dlhšie trvajúcich zohnutých polôh (napr. pri záhradkárčení). Krvácanie do nervu a vystavenie chladu alebo žiareniu môže spôsobiť neuropatiu. Mononeuropatia môže byť spôsobená priamou inváziou nádoru.

Viacnásobná mononeuropatia je zvyčajne sekundárna po kolagénových cievnych poruchách (napr. polyarteritis nodosa, SLE, Sjôgrenov syndróm, RA), sarkoidóze, metabolických ochoreniach (napr. cukrovka, amyloidóza) alebo infekčných ochoreniach (napr. Lymská bolerióza, HIV infekcia). Mikroorganizmy môžu spôsobiť viacnásobnú mononeuropatiu priamou inváziou nervu (napr. pri lepre).

Polyneuropatia spôsobená akútnymi febrilnými ochoreniami môže byť následkom toxínu (napr. pri záškrte) alebo autoimunitnej reakcie (napr. pri GuillainBarré syndróme). Polyneuropatia, ktorá niekedy nasleduje po očkovaniach je pravdepodobne tiež autoimunitná.

Toxické činidlá vo všeobecnosti spôsobujú polyneuropatiu, ale niekedy mononeuropatiu. Tieto zahŕňajú emetín, hexobarbital, barbital, chlórbutanol, sulfónamidy, fenytoín, nitrofurantoín, imelové alkaloidy, ťažké kovy, oxid uhoľnatý, triortokrezylfosfát, ortodinitrofenol, mnohé rozpúšťadlá, iné priemyselné jedy a niektoré AIDS lieky (napr. zalcitabín, didanozín).

Nedostatočná výživa a metabolické poruchy môžu viesť k polyneuropatii. Nedostatok vitamínu B je často príčinou (napr. pri alkoholizme, beriberi, zhubnej anémii, izoniazidom indukovanom nedostatku pyridoxínu, pri syndrómoch nesprávnej absorpcie a pri hyperemesis gravidarum). Polyneuropatia nastáva aj pri hypotyroidizme, porfýrii, sarkoidóze, amyloidóze a urémii. Cukrovka môže spôsobovať senzorimotorickú distálnu polyneuropatiu (najbežnejšie), viacnásobnú mononeuropatiu a fokálnu mononeuropatiu (napr. okulomotorického alebo aducens kraniálneho nervu).

Malignita môže spôsobovať polyneuropatiu prostredníctvom monoklonálnej gamopatie (multiplicitný myelóm, lymfóm), amyloidnej invázie alebo nedostatočnej výživy alebo ako paraneoplastický syndróm.

Špecifické mononeuropatie: Jednoduchá a multiplicitná mononeuropatia sa vyznačujú bolesťou, slabosťou a parestéziou v distribúcii postihnutého nervu.

-6Multiplicitná mononeuropatia je asymetrická. Nervy môžu byť postihnuté všetky naraz alebo postupe. Extenzívne postihnutie mnohých nervov môže simulovať polyneuropatiu.

Paralýza lakťového nervu je často spôsobená traumou nervu v lakťovej jamke opakovaným vychyľovaním lakťa alebo asymetrickým rastom kosti po zlomenine v detstve (oneskorená paralýza lakťa). Lakťový nerv môže byť stlačený aj v kubitálnom tuneli. Nastáva parestéza a senzorický deficit v 5. a v strednej polovici 4. prsta; aduktor palca, abduktor 5. prsta a iterossei svaly sú slabé a atrofizované. Výsledkom závažnej chronickej lakťovej paralýzy je klepetová deformita. Nervové kondukčné štúdie môžu identifikovať miesto lézie. Mala by sa skúsiť konzervatívna liečba pred tým, ako sa pristúpi k chirurgickej oprave.

Zápästný tunelový syndróm je výsledkom stlačenia mediánového nervu v dlaňovej orientácii zápästia medzi transverzným povrchovým zápästným ligamentom a pozdĺžnymi šľachami svalov predlaktia, ktoré ohýnajú ruku. Môže byť unilaterálny alebo bilaterálny. Výsledkom stlačenia je parestézia v radiálne dlaňovej orientácii ruky a bolesť zápästia a dlane. Niekedy sa bolesť vyskytuje proximálne k miestu stlačenia v predlaktí a ramene. Bolesť môže byť silnejšia v noci. Môže nasledovať senzorický deficit v dlaňovej orientácii prvých troch prstov. Svaly, ktoré riadia oddialenie palca a opozíciu, môžu zoslabnúť a atrofizovať. Tento syndróm by sa mal odlíšiť od C-6 koreňovej kompresie v dôsledku krčnej radikulopatie.

Fibulárna nervová paralýza je zvyčajne spôsobená stlačením nervu oproti bočnej orientácii lýtkového krčka. Najbežnejšia je u podvyživených pacientov pripútaných na lôžko a u chudých pacientov, ktorí majú zvyk prekrižovať si nohy. Nastáva slabosť dorsiflexie chodidla a everzie chodidla (pokles chodidla). Občas nastáva senzorický deficit v zadobočnej orientácii spodnej časti nohy a na chrbte chodidla alebo v spletenom priestore medzi 1. a 2. metatarzálnou kosťou. Liečba je zvyčajne konzervatívna pre kompresívne neuropatie (napr. vylúčenie prekrižovania nôh). Neúplné neuropatie sú zvyčajne sledované klinicky a zvyčajne sa zlepšia spontánne. Ak nenastáva zotavenie, môže byť indikované chirurgické preskúmanie.

Paralýza radiálneho nervu (paralýza sobotňajšej noci) je spôsobená stlačením nervu oproti ramennej kosti, napr. keď je rameno prevesené cez chrbát stoličky v priebehu intoxikácie alebo hlbokého spánku. Symptómy zahŕňajú slabosť

-Ί zápästných a prstových extenzorov (poklesnuté zápästie) a príležitostne senzorickú stratu v chrbtovej orientácii 1. chrbtového vnútrokostného svalu. Liečenie je podobné ako pri kompresívnej fibulárej neuropatii.

Polyneuropatie sú relatívne symetrické, často postihujú zároveň senzorické, motorické a vazomotorické vlákna. Môžu postihovať axónový cylinder alebo myelínový obal, a pri oboch formách, môžu byť akútne (napr. Guillain-Barré syndróm), alebo chronické (napr. zlyhanie obličiek).

Polyneuropatia spôsobená metabolickými poruchami (napr. cukrovkou) alebo obličkovým zlyhaním sa vyvíja pomaly, často mesiace alebo roky. Často začína senzorickými abnormalitami na spodných úrovniach, ktoré sú často závažnejšie distálne, ako proximálne. Nápadné je často periférne brnenie, necitlivosť, palivá bolesť alebo deficiencie v kĺbovej propriocepcii a pocit vibrácie. Bolesť je často horšia v noci a môže sa zhoršiť dotknutím sa postihnutej oblasti alebo teplotnými zmenami. V závažných prípadoch sú objektíve známky straty citlivosti, typicky v pančuchovej a rukavícovej distribúcii. Sú znížené alebo chýbajú reflexy achilovej a iných hĺbkových šliach. Keď je senzorická strata značná, môžu sa vyvinúť nebolestivé vredy na prstoch alebo na Charcotových kĺboch. Senzorické alebo proprioceptívne deficity môžu viesť k abnormalitám chôdze. Výsledkom motorického postihnutia je distálna svalová slabosť a atrofia. Dodatočne alebo selektívne môže byť postihnutý autonómny nervový systém, čo vedie k nočnému pomočovaniu, inkontinencii moču a výkalov, impotencii alebo pozičnej hypotenzii. Vazomotorické symptómy varírujú. Koža môže byť bledšia a suchšia ako normálne, niekedy s tmavými škvrnami, môže dôjsť k nadmernému poteniu. V závažných, dlhšie trvajúcich prípadoch sú bežné trofické zmeny (hladká a lesklá koža, jamkovité alebo hrebeňovité nechty, osteoporóza).

Nutričná polyneuropatia je bežná u alkoholikov a podvyživených ľudí. Primárna axonopatia môže viesť k sekundárnej demyelinizácii a deštrukcii axónov v najdlhších a najrozsiahlejších nervoch. Nie je jasné, či príčinou je nedostatok tiamínu alebo iného vitamínu (napr. pyridoxínu, kyseliny pantoténovej, kyseliny listovej). Neuropatia spôsobená nedostatkom pyridoxínu zvyčajne nastáva len u osôb berúcich izoniazid na TB. Deti, ktoré majú nedostatok pyridoxínu, alebo ktoré sú závislé na pyridoxíne, môžu mať kŕče. Vyčerpávajúca a symetrická slabosť

-8distálnych koncov je zvyčajne zákerná, ale môže postupovať rýchlo, niekedy môže byť sprevádzaná senzorickou stratou, parestéziou a bolesťou. Bolenie, kŕče, studenosť, teplo a skrehnutie lýtok a chodidiel sa môže zhoršovať dotykom. Keď je pôvod nejasný, môžu sa podávať viaceré vitamíny, ale nemajú žiadny dokázaný úžitok.

Nie bežne sa exkluzívna senzorická polyneuropatia začína periférnou bolesťou a parestézou a pokračuje centrálne až do straty všetkých foriem citov. Nastáva ako vzdialený účinok karcinómu (najmä bronchogénneho) po nadmernom prijímaní pyridoxínu (>0,5 g/deň) a pri amyloidóze, hypotyroidizme, myelóme a urémii. Pyridoxínom indukovaná neuropatia sa vyrieši, keď sa preruší pyridoxín.

Dedičné neuropatie sú klasifikované ako senzorimotorické neuropatie alebo senzorické neuropatie. Charcot-Marie-Tooth ochorenie je najbežnejšou dedičnou senzorimotorickou neuropatiou. Menej bežné senzorimotorické neuropatie začínajú pri narodení a vedú k väčšej nevládnosti. Pri senzorických neuropatiách, ktoré sú zriedkavé, je markantnejšia strata citlivosti na distálnu bolesť a teplotu, ako strata pocitu vibrácie a polohového zmyslu. Hlavným problémom je mrzačenie chodidla spôsobené necitlivosťou na bolesť s častými infekciami a osteomyelitídami.

Dedičné motorické a senzorické neuropatie typu I a II (Charcot-marie-Tooth ochorenie, fibulárna svalová atrofia) sú relatívne bežnou, zvyčajne autozomálne dominantnou poruchou, ktorá sa vyznačuje slabosťou a atrofiou, primárne fibulárnych svalov a distálnych svalov nohy. Pacienti môžu mať aj iné degeneratívne ochorenia (napr. Friedreichovú ataxiu) alebo ich môžu mať v rodinnej anamnéze. Pacienti s typom I sa v strednom detstve vyznačujú poklesnutou nohou a pomaly postupujúcou atrofiou distálnych svalov, spôsobujúcou „bocianie nohy“. Chradnutie vnútorných svalov v rukách začína neskôr. Citlivosť na vibrácie, bolesť a teplotu klesá pančuchovo rukavičkovým spôsobom. Chýbajú reflexy hlbokých šliach. Jedinými zámkami menej postihnutých členov rodiny, ktorí prenášajú ochorenie, môžu byť vysoké klenby chodidla alebo kladivové prsty. Rýchlosti nervového vedenia sú pomalé a distálne latencie sú predĺžené. Nastáva segmentačná demyelinizácia a remyelinizácia. Je možné nahmatať predĺžené periférne nervy. Ochorenie postupuje pomaly a neovplyvňuje dĺžku života. Pacienti majú relatívne

-9normálne rýchlosti nervového vedenia ale evokované potenciály s nízkou amplitúdou. Biopsie ukazujú wallerian degeneráciu.

Dedičná motorická a senzorická neuropatia typu III (hypertrofická vnútorná neuropatia, Dejerie-Sottas ochorenie), zriedkavá autozomálna recesívna porucha, začína v detstve s postupujúcou slabosťou a senzorickou stratou a absenciou reflexov hlbokých šliach. Na začiatku sa podobá na Charcot-Marie-Tooth chorobu, ale motorická slabosť postupuje rýchlejšie. Nastáva demyelinizácia a remyelinizácia, vytvárajúca predĺžené periférne nervy a cibuľové zakončenia viditeľné na nervovej biopsii.

Diagnózu potvrdzuje charakteristická distribúcia motorickej slabosti, deformity nôh, rodinná anamnéza a elektrofyziologické abnormality. Dostupná je genetická analýza, ale žiadna špecifická liečba. Užitočná môže byť konzultácia týkajúca sa povolania, aby sa mladí pacienti pripravili na progresiu ochorenia. Svorky pomáhajú upraviť pokles chodidla, môže pomôcť ortopedická chirurgia na stabilizáciu chodidla.

Neurodegeneratívne ochorenia zahŕňajú, okrem iných, Alzheimerovu chorobu, Parkinsonovu chorobu, Huntingtonovu chorobu a amyotrofickú laterálnu sklerózu (ALS).

Alzheimerova choroba je poruchou zahŕňajúcou zhoršenie mentálnych funkcií, ktoré je výsledkom zmien v mozgovom tkanive. Toto zahŕňa scvrkávanie mozgových tkanív, ktoré nie je spôsobené poruchami krvných ciev, primárnou degeneratívnou demenciou a difúznou mozgovou atrofiou. Alzheimerova choroba sa označuje aj ako senilná demencia Alzheimerovho typu (SDAT). Je najbežnejšou príčinou intelektuálneho úpadku s vekom. Incidencia je približne 9 na 10000 ľudí. táto porucha postihuje ženy mierne častejšie ako mužov a primáre sa vyskytuje u starých ľudí.

Príčina je neznáma. Neurochemické faktory, ktoré môžu participovať na generovaní ochorenia, zahŕňajú stratu látok používaných nervovými bunkami na prenos nervových impulzov (neurotransmiterov), vrátane acetylcholínu, somatostatínu, látky P a norepinefrínu. Enviromentálne faktory zahŕňajú vystavenie hliníku, mangánu a iným látkam. Infekčné faktory zahŕňajú priónové (organizmy podobné vírusom) infekcie, ktoré postihujú mozog a miechu (centrálny nervový

-10systém). V niektorých rodinách (predstavujúcich 5 až 10 % prípadov) existuje vrodená predispozícia na vývin poruchy, ale neriadi sa presnými (Mendlovými) vzorcami dedičnosti. Diagnostika sa zvyčajne robí prostredníctvom vylúčenia iných príčin demencie.

Výskumníci zistili, že v rodinách, ktoré majú viac členov s Alzheimerovou chorobou, sa vyskytuje konkréta génová odchýlka, ktorá je spoločná u všetkých rodinných príslušníkov s ochorením. Gén, ktorý produkuje látku nazývanú apolipoproteín E4, nie je považovaný za príčinu ochorenia, jeho prítomnosť len zvyšuje pravdepodobnosť, že ochorenie sa môže eventuálne vyskytnúť. Existuje veľa ľudí, ktorý majú E4 gén a nikdy ich nepostihla Alzheimerova choroba.

Nástup sa vyznačuje poškodenou pamäťou s progresívnou stratou intelektuálnej funkcie. Ako choroba postupuje, môžu sa vyskytovať zmeny nálady, zmeny v jazykovej schopnosti, zmeny v spôsobe chôdze a iné zmeny. Vyskytuje sa zníženie veľkosti (atrofia) tkanív mozgu, rozšírenie komôr (priestorov vo vnútri mozgu) a depozity vo vnútri tkanív mozgu.

Parkinsonova choroba je poruchou mozgu, ktorá sa vyznačuje trasením a ťažkosťami s chôdzou, pohybom a koordináciou. Choroba je spojená s poškodením časti mozgu, ktorá riady pohyb svalov. Nazýva sa aj paralysis agitans alebo trasová paralýza.

Ochorenie postihuje približne 2 z 1000 ľudí a najčastejšie sa vyvíja po 50. roku života. Postihuje tak mužov, ako aj ženy, a je jednou z najbežnejších neurologických porúch v starobe. Výraz „parkinsonizmus“ označuje akýkoľvek stav, ktorý zahŕňa kombináciu typov zmien v pohybe pozorovaných pri Parkinsonovej chorobe, ktorá je najbežnejším stavom spôsobujúcim túto skupinu symptómov. Parkinsonizmus môže byť spôsobený inými poruchami alebo externými faktormi (sekundárny parkisonizmus).

Parkinsonova choroba je spôsobená progresívnym poškodením nervových buniek časti mozgu, ktorá riadi svalový pohyb (bazálne gangliá a extrapyramidálna oblasť). Dopamín, ktorý je jednou z látok používaných bunkami na prenos impulzov (transmiterov), sa normálne produkuje v tejto oblasti. Poškodenie tejto oblasti mozgu znižuje množstvo dopamínu dostupného telu. Nedostatok dopamínu narúša rovnováhu medzi dopamínom a inými trasmitermi, ako napríklad acetylcholínom.

-11 Bez dopamínu nemôžu nervové bunky správne prenášať správy a to vedie k strate svalovej funkcie. Presný dôvod, ktorý poškodzuje bunky mozgu, nie je známy. Porucha môže postihovať jednu alebo obe strany tela s rôznymi stupňami straty funkcie.

Okrem zníženia svalovej kontroly sa niektorí ľudia s Parkinsonovou chorobou stávajú ťažko depresívnymi. Hoci skorá strata mentálnych kapacít nie je bežná, pri závažnom priebehu Parkinsonovej choroby môže osoba vykazovať celkový mentálny úpadok (vrátane demencie, halucinácii a tak ďalej). Demencia môže byť aj vedľajším účinkom niektorých liekov používaných na liečenie choroby.

Huntingtonova choroba je vrodeným, autozomálne dominantným neurologickým ochorením. Nie je bežná, postihuje približne 1 z 10 000 jedincov (Breighton a Hayden, 1981). Choroba zvyčajne nie je zjavná klinicky až do piatej dekády života a výsledkom je psychiatrická porucha, nedobrovoľná pohybová porucha a kognitívny úpadok asociovaný s neúprosným postupom až k smrti, typicky 17 rokov po nástupe.

Gén zodpovedný za Huntingtonove ochorenie sa nazýva huntingtín. Je lokalizovaný na chromozóme 4p, predstavujúc účinný prostriedok na predklinickú a atenatálnu diagnostiku. Genetická abnormalita spočíva v nadmernom množstve tandemovo opakujúcich sa CAG nukleotidových sekvencií.

Zväčšená veľkosť CAG opakovania u osôb s Huntingtonových ochorením dokazuje vysoko signifikantnú koreláciu medzi vekom a nástupom klinických znakov. Táto asociácia je zarážajúca najmä u osôb sjuvenilným nástupom Huntingtonovej choroby, ktoré majú veľmi významnú expanziu, zvyčajne viac ako 50 opakovaní. Dĺžka CAG opakovania v rodinách s Huntingtonovou chorobou vykazuje určitú instabilitu, ktorá je značná najmä, keď deti zdedia huntingtínový gén od postihnutých otcov.

Pri HD nie je známe, ako tento široko exprimovaný gén vedie k selektívnej smrti neurónov. Navyše, sekvenčná analýza neodhalila žiadnu zjavnú homológiu s inými známymi génmi a neboli identifikované žiadne štrukturálne motívy alebo funkčné domény, ktoré by jasne poskytovali preniknutie do podstaty jeho funkcie. Najmä otázka ako tieto široko exprimované gény spôsobujú selektívnu smrť neurónov ostáva, nezodpovedaná.

-12Amyotrofická laterálna skleróza, ALS, je poruchou spôsobujúcou progresívnu stratu nervového riadenia vôľou ovládaných svalov, kvôli deštrukcii nervových buniek v mozgu a mieche. Amyotrofická laterálna skleróza, nazývaná aj Lou Gehringova choroba, je porucha zahŕňajúca stratu používania a riadenia svalov. Nervy riadiace tieto svaly sa zmenšujú a miznú, čoho výsledkom je strata svalového tkaniva, kvôli nedostatku nervovej stimulácie. Klesá sila a koordinácia svalov, začínajúc so svalmi riadenými vôľou (tie ktoré sú riadené vedomím, ako napríklad svaly rúk a nôh). Rozsah straty svalovej kontroly pokračuje a postihnutých je stále viac a viac svalových skupín. Môže dôjsť k strate nervovej stimulácie poloovládaných svalov, ako napríklad svalov, ktoré kontrolujú dýchanie a prehítanie. Nie je postihnutá schopnosť myslieť alebo uvažovať. Príčina je neznáma.

ALS postihuje približne 1 zo 100 000 ľudí. Zdá sa, že v niektorých prípadoch sa vyskytuje v rodinách. Porucha postihuje mužov častejšie ako ženy. Symptómy sa zvyčajne nevyvíjajú do dospelosti, často nie skôr ako vo veku 50 rokov.

Traumatické nervové poškodenie sa môže týkať CNS alebo PNS. Traumatické mozgové poškodenie (TBI), označované aj jednoducho poranenie hlavy alebo poranenie zavretej hlavy (CHI), označuje poranenie, ktoré je poškodením mozgu v dôsledku vonkajšieho úderu do hlavy. Najčastejšie sa stáva počas automobilových alebo cyklistických nehôd, ale môže nastať aj ako dôsledok hroziaceho utopenia, infarktu myokardu, mŕtvice a infekcií. Tieto typy traumatického poškodenia mozgu sú zvyčajne následkom nedostatku kyslíka v mozgu alebo zásobovania mozgu krvou, a preto môžu byť označované ako „anoxické poškodenie“.

Poškodenie mozgu alebo poškodenie zavretej hlavy nastáva, pri údere do hlavy, ako napríklad pri nehode motorového vozidla, alebo pri páde. V takom prípade lebka narazí na stacionárny objekt, a mozog, ktorý je vo vnútri hlavy, sa otáča a krúti okolo svojej osi (mozgový kmeň), čo spôsobuje lokalizované alebo rozšírené poškodenie. Taktiež mozog, mäkká hmota obklopená tekutinou, ktorá umožňuje jeho „plávanie“, sa môže odraziť od lebky, čo vedie k ďalšiemu poškodeniu.

Hneď po traume môže nasledovať určitá perióda bezvedomia, ktorá môže trvať minúty, týždne alebo mesiace. V dôsledku otáčania a narážania pacient

- 13s traumatický poškodeným mozgom zvyčajne získa poškodenie alebo otlačenie mnohých častí mozgu. Toto sa nazýva difúzne poškodenie alebo „nie-strelné (nonmissile) poškodenie“ mozgu. Typy poškodenia mozgu, vyskytujúce sa ako niestrelné poranenia môžu byť klasifikované buď ako primárne, alebo ako sekundárne.

Primárne mozgové poškodenie nastáva v čase poranenia, najmä v miestach nárazu, najmä, ked je zlomená lebka. Rozsiahle pomliaždenia môžu byť asociované s vnútromozgovým krvácaním alebo sprevádzanie kortikálnymi laceráciami. Difúzne axonálne poranenia nastávajú ako dôsledok šmykových a ťažných napätí neuronálnych procesov, ktoré sú produkované rotačnými pohybmi mozgu vo vnútri lebky. Môžu to byť malé hemoragické lézie alebo difúzne poškodenie axónov, ktoré môže byť detegované len mikroskopicky.

Sekundárne mozgové poškodenie nastáva ako dôsledok komplikácií vyvíjajúcich sa po momente poranenia. Zahŕňajú intrakraniálne krvácanie, traumatické poškodenie mimomozgových artérií, intrakraniálne prasknutie, hypoxické mozgové poškodenie alebo meningitídu.

Otvorené poranenie hlavy je viditeľný útok na hlavu a môže byť výsledkom strelného poranenia, nehody alebo objektu prechádzajúceho cez lebku do mozgu („strelné poranenie mozgu“). Pri tomto type poranenia hlavy je pravdepodobnejšie, že poškodí špecifickú oblasť mozgu.

Takzvané mierne poranenie mozgu môže nastať bez straty vedomia a môže to byť len omračujúci pocit alebo zmätený stav trvajúci krátky čas. Hoci poskytovaná liečebná starostlivosť môže byť minimálna, osoby s mozgovým poranením bez kómy môžu mať symptómy a poruchy podobné tým, ktorými trpia ľudia, ktorí prežili poranenia s hlbokým bezvedomím.

Ako reakcia na traumu nastávajú v mozgu zmeny, ktoré vyžadujú monitorovanie, aby sa zabránilo ďalšiemu poškodeniu. Po závažnom poranení hlavy sa často zväčšuje veľkosť mozgu. Toto sa nazýva puchnutie mozgu a nastáva, keď dôjde k značnému zvýšeniu množstva krvi v mozgu. Neskôr, sa pri chorobe môže v mozgu zhromažďovať voda, čo sa nazýva mozgový edém. Tak puchnutie mozgu, ako aj edém mozgu, vedú k nadmernému tlaku v mozgu nazývanému intrakraniálny tlak („ICP“).

-14Miechové poranenia sú zodpovedné za väčšinu hospitalizácií v dôsledku paraplégie a tetraplégie. Viac ako 80 % nastáva ako dôsledok cestných nehôd. Klinicky sa rozoznávajú dve hlavné skupiny poranení: otvorené poranenia a uzatvorené poranenia. Otvorené poranenia spôsobujú priamu traumu miechy a nervových koreňov. Perforujúce poranenia môžu spôsobiť nadmerné rozrušenie a krvácanie. Uzavreté poranenia sú zodpovedné za väčšinu miechových poranení a zvyčajne sú spojené so zlomeninou/dislokáciou chrbticového kanála, čo sa zvyčajne demonštruje rádiologický. Poškodenie miechy závisí na rozsahu poranení kostí a môže byť posudzované v dvoch hlavných štádiách: Primárne poškodenie, ktorým sú pomliaždeniny, transekcie nervových vlákien a hemoragické nekrózy, a sekundárne poškodenie, ktorým sú extradurálne hematómy, infarkty, infekcie a edémy.

Neskoré následky poškodenia chordy zahŕňajú: vzostupnú a zostupnú anterogradnú degeneráciu poškodených nervových vlákien, posttraumatickú syringomelyiu a systémové následky paraplégie, ako napríklad močového traktu a hrudníkové infekcie, tlakové podráždenia a chradnutie svalov.

Neurologické poruchy môžu byť spôsobené aj vrodenými metabolickými poruchami. Myelínové obaly, ktoré pokrývajú mnohé nervové vlákna, sú zložené z lipoproteínových vrstiev vytváraných v skorých štádiách života. Myelín vytváraný oligodendrogliami v CNS sa líši chemicky a imunologický od myelínu vytváraného Schwannovými bunkami periférne, ale oba typy majú rovnakú funkciu: napomáhať prenosu nervového impulzu pozdĺž axónu.

Mnohé vrodené metabolické poruchy (napr. fenylketonúria a iné aminokyselinové deficientné ochorenia; Tay-Sachs choroba, Niemann-Pick choroba a Gaucherova choroba; Hurlerov syndróm; Krabbe choroba a iné leukodystrofie) postihujú vyvíjanie myelínového obalu, najmä v CNS. Ak nie je biochemický defekt opravený alebo kompenzovaný, výsledkom sú permanentné, často rozsiahle neurologické deficity.

Napríklad Krabbe choroba alebo globoidná bunková leukodystrofia je poruchou postihujúcou bielu hmotu periférneho a centrálneho nervového systému. Výsledkom mutácií v géne pre lyzozomálnu enzýmovú galaktocerebrozidázu (GALC) je nízka enzymatická aktivita a znížená schopnosť degradovať

-15galaktolipidy, ktoré sa nachádzajú takmer výlučne v myelíne. Kontinuálna myelinácia a/alebo remyelinácia u pacientov vyžaduje funkčné endogénne oligodendrocyty alebo transplantáciu normálnych oligodendrocytov alebo kmeňových buniek, ktoré sa môžu diferencovať na oligodendrocyty, aby sa poskytla dostatočná GALC expresia (Wenger a ďalší, 2000).

Neurofibromatóza 1 (NF1) je bežnou autozomálnou poruchou so širokým rozsahom neurologických prejavov.

Hromadná systémová atrofia je sporadickým neurodegeneratívnym ochorením nastupujúcim v dospelosti, s neznámou etiológiou. Tento stav je ojedinelý medzí neurodegeneratívnymi ochoreniami tým, že prominentnú, ak nie primárnu, úlohu v patogénnom procese hrajú oligodendrogliálne bunky. Hlavným rozdielom oproti Parkinsonovej chorobe je, že MSA pacienti nereagujú na L-dopa liečbu.

Demyelinizácia v neskoršom živote je znakom mnohých neurologických porúch. Môže byť výsledkom poškodenia nervov alebo myelínu v dôsledku lokálneho poranenia, ischémie, toxických činidiel alebo metabolických porúch. Existuje tiež dôkaz, že demyelinizácia sa môže podieľať na schizofrénii. Po extenzívnej strate myelínu zvyčajne nasleduje degradácia axónov a často sprievodná degenerácia bunkového tela, pričom oba procesy môžu byť ireverzibilné. Avšak v mnohých prípadoch nastáva remyelinizácia a oprava, regenerácia a úplné zotavenie neurónovej funkcie môže byť rýchle. Centrálna demyelinizácia (tzn. demyelinizácia miechy, mozgu alebo očných nervov) je prevládajúcim zistením pri primárnych demyelinizačných ochoreniach, ktorých etiológia nie je známa. Najznámejšou je MS.

Akútna roztrúsená encefalomyelitída, postinfekčná encefalomyelitída, sa vyznačuje perivaskulámou CNS demyelinizáciou, ktorá môže nastať spontánne, ale zvyčajne nasleduje po vírusovej infekcii alebo vírusovej vakcinácii (alebo, veľmi zriedkavo, po bakteriálnej vakcinácii), z čoho vyplýva imunologická príčina. Akútne zápalové periférne neuropatie, ktoré nasledujú po vírusovej vakcinácii, alebo Guillain-Barré syndróm, sú podobné s demyelinízačnými poruchami s rovnakou predpokladanou imunopatogenézou, ale postihujú len periférne štruktúry.

-16Metachromatická leukodystrofia je ďalšou demyelinizačnou chorobou. Adrenoleukodystrofia a adrenomyeloneuropatia sú zriedkavými X-spojenými recesívnymi metabolickými poruchami, ktoré sa vyznačujú dysfunkciou nadobličkovej žľazy a rozsiahlou demyelinizáciou nervového systému. Adrenoleukodystrofia nastáva u mladých chlapcov; adrenomyeloneuropatia u adolescentov. Môže nastať mentálne poškodenie, zvýšené svalové napätie a slepota. Adrenoleukodystrofia je nemenne fatálna. Študujú sa dietetické a imunomodulačné liečby.

Leberová dedičná optická atrofia a príbuzné mitochondriálne poruchy sa primárne vyznačujú bilaterálnou stratou centrálneho videnia, zvyčajne postihujúcou mladých mužov na konci tínedžerského veku alebo a začiatku dvadsiatych rokov. Leborová dedičná optická atrofia sa môže podobať na optickú neuritídu pri MS. Boli identifikované mutácie v maternálne dedenej mitochodnriálnej DNA.

HTLV-asociovaná myelopatia, pomaly postupujúce ochorenie miechy asociované s infekciou ľudským T-bunkovým lymfotrofickým vírusom, sa vyznačuje kŕčovitou slabosťou oboch končatín.

Ďalšie neurologické poruchy zahŕňajú neuropatie s abnormálnou myelinizáciou a ich prehľad je uvedený nižšie.

Imunitné: akútne, Guillain Barré, chronické, chronická imunitná demyelinizačná polyneuropatia (CIDP), multifokálna CIDP, multifokálna motorická neuropatia (MMN), anti-MAG syndróm, GALOP syndróm, anti-sulfatidový protilátkový syndróm (so sérovým M-proteínom), Anti-GM2 protilátkový syndróm, POEMS syndróm, polyneuropathy organomegaly, endokrinopatia alebo edém, kožné zmeny, perineuritída, IgM anti-GD1b protilátkový syndróm (občasne).

Toxíny: diftéria, Buckthom, hexachlórfén, kyanan sodný, telúr.

Lieky: predominantne demyelinizujúce: chlorochín, FK506 (takrolimus), perhexilín, prokainamid, zimeldín; zmiešané demyelinizujúce a axonálne: amodarón, eozinophilia-Myalgia syndróm, zlato, suramín, taxol.

Dedičné: glykoproteín bez sacharidovej zložky, kataraktový a faciálny dysmorfizmus, Cockayne syndróm, vrodená hypomyelinizácia, vrodená svalová dystrofia: merozínový deficit, Farberova choroba (lipogranulomatóza), HMSN CMT, Dominantné: IA, IB, III, HNPP, EGR2, termosenzitívne, recesívne: III (Dejerine-17Sottas); 4A; 4B; 42; 4C; 4D (LOM); 4E; 4F; HMSN-R; CNS, X-spojené: IX, Krabbe, Marinesco-Sjôgren, metachromatická leukodystrofia, Niemann-Pick, PelizaeusMerzbacher (PLP), Refsum, priónový proteín (PrP27-30): Glu200Lys mutácia, Creutzfeld-Jakobova choroba, myšací model: priónová nadexpresia, Salla choroba, SOX10, Tenasci-XA, nerovnomerné balenie periférnych myelínových obalov, Ehlers-Danlos fenotyp.

Metabolické (nezvyčajné): cukrovka (v dôsledku paralelnej CIDP), hypotyroidizmus, pečeňové poruchy.

Mitochondriálne: MNGIE syndróm, myopatia a externá oftalmoplégia, neuropatia, gastro-intestinálna encefalopatia, NARP syndróm, neuropatia, ataxia, retinitída, pigmentóza.

Infekcie: Creutzfeld-Jakobova choroba, záškrt, HIV: asociovaná CIDP, lepra: lepromatózne; zmiešané axonálne a demyelinizujúce; kolonizované Schwanové bunky, variantná Creutzfeld-Jakobova choroba.

Ďalšie detaily je možné získať na nasledujúcej internetovej stránke: http://www.neuro-wustl.edu/neuromuscular/nother/mvelin.html.

Skleróza multiplex (MS) je zápalové demyelinizačné ochorenie centrálneho nervového systému (CNS), ktoré má charakter striedania zlepšení a recidív, alebo progresívny charakter. MS nie je len demyelinizačnou chorobou. V periférnom nervovom systéme (PNS) je sprevádzané chronickou zápalovou demyelinizačnou polyradikuloneuropatiou. Okrem toho existujú akútne monofázové poruchy, ako napríklad zápalová demyelinizačná polyradikuloneuropatia označovaná GuillainBarré syndróm (GBS) v PNS, a akútna roztrúsená encefalomyelitída (ADEM) v CNS. Tak MS, ako aj GBS sú heterogénne syndrómy. Pri MS môžu rôzne exogénne inzulty spolu s genetickými faktormi viesť k priebehu ochorenia, ktoré nakoniec spĺňa diagnostické kritériá. Pri oboch ochoreniach sa k primárnym demyelinizačnej lézii môže pridať poškodenie axónov a to môže spôsobiť permanentné neurologické deficity.

MS je najbežnejším z vyššie uvedených demyelinizujúcich ochorení. Je charakterizovaná ako autoimunitná porucha, pri ktorej leukocyty imunitného systému spúšťajú útok na bielu hmotu centrálneho nervového systému (CNS). Postihnutá môže byť aj sivá hmota. Hoci presná etiológia MS nie je známa,

-18podieľajúce sa faktory môžu zahŕňať genetické faktory, bakteriálnu a vírusovú infekciu. Jej klasická manifestácia (85 % všetkých prípadov) sa vyznačuje striedajúcimi sa fázami ochorenia a ozdravenia, ktoré zodpovedajú epizódam neurologickej dysfunkcie trvajúcich niekoľko týždňov, po ktorých nasleduje podstatné alebo úplné zotavenie (Noweworthy, 1999). Periódy remisie sa postupne skracujú. Veľa pacientov potom vstúpi do konečnej fázy ochorenia, ktorá sa vyznačuje postupnou stratou neurologickej funkcie s čiastočným zotavením alebo bez zotavenia. Tento stav sa nazýva sekundárna progresívna MS. Malá časť (približne 15 % všetkých MS pacientov) trpí na postupný a neprerušovaný pokles neurologickej funkcie nasledujúci po nástupe ochorenia (primárna progresívna MS). V súčasnosti neexistuje žiada jasná možnosť vyliečenia najťažších foriem MS, ktoré sú vo všeobecnosti fatálne.

Základným znakom MS je demyelinizovaný plak s vytváraním reaktívnej gliovej jazvy, ktorý sa pozoruje v traktoch bielej hmoty mozgu a miechy. Demyelinizácia je spojená s funkčnou redukciou alebo blokádou vedenia nervových impulzov. U MS pacientov sa pozoruje a transekcia a smrť axónov (Bjartmar a ďalší, 1999). Patologické štúdie ukazujú, že najväčšie postihnutie je obmedzené na očné nervy, periventrikulárnu bielu hmotu, mozgový kmeň a miechu (Storch a ďalší, 1998). Dôsledky týchto CNS deficiencií zahŕňajú akútne symptómy dvojitého videnia, znecitlivenie a neistú chôdzu, ako aj chronické symptómy, ako napríklad kŕčovú paraparézu a inkontinenciu.

Zdá sa, že molekulové mechanizmy, na ktorých je založená MS patogenéza, korenia v genetických a enviromentálnych faktoroch, vrátane vírusových a bakteriálnych infekcií. Tieto mechanizmy podporujú zvýšenú migráciu T lymfocytov a makrofágov cez krvno-mozgovú bariéru a do CNS tkaniva.

Demyelinizácia je spôsobená útokmi na myelín prostredníctvom aktivovaných makrofágov a mikroglií, ako aj poškodením myelinizujúcich buniek, ktoré je spôsobené Fas-ligand signalizáciou a komplementom alebo protilátkami sprostredkovanou cytotoxicitou. Preto demyelinizácia nastáva tak priamym útokom na myelínové obaly, ako aj elimináciou buniek, ktoré produkujú a udržiavajú myelín.

Genetické a enviromentálne elementy vedú k zvýšenému prívalu zápalových buniek cez krvno-mozgovú bariéru. To vedie k zvýšenej migrácii autoreaktívnych T

-19lymfocytov a makrofágov do CNS tkaniva. Vylučovanie cytokínov T bunkami aktivuje antigén-prezentujúce bunky (APCs). Keď autoreaktívne T bunky v kontexte MHC molekúl triedy II na APCs stretnú pravdepodobné „MS antigény“, často proteínové zložky myelínového obalu, môžu sa aktivovať. Niekoľko následných mechanizmov môže potom poškodzovať oligodedrocyty a myelín. Komplementom a protilátkou sprostredkovaná cytotoxicita môže spôsobiť väčšinu poškodenia u niektorých pacientov, zatiaľ čo Fas-ligandová signalizácia a uvoľňovanie prozápalových cytokínov, ako TF-α prostredíctvom CD41 T buniek, môže napádať bielu hmotu u iných. Aktivované makrofágy môžu hrať úlohu aj prostredníctvom posilnenej fagocytózy a vylučovania faktorov. Toto spôsobuje rozsiahlu demyelinizáciu a následnú stratu účinnosti vedenia medzi axónmi CNS. Následné opravne mechanizmy však môžu spôsobiť remyelinizáciu, keď ustúpi zápalový proces. Remyelinizované axóny MS pacientov sú pri patológii rozoznávané prostredníctvom tenkého vzhľadu obalov okolo remyelinizovaných axónov. Ďalšie sodíkové kanály sa často nachádzajú začlenené do demyelinizačnej axónovej membrány, ktoré tak kompenzujú stratu účinnosti vedenia. Oligodendrogliálne prekurzory môžu zosiľňovať remyelinizáciu v MS léziách.

Oligodendrocyty uskutočňujú viaceré funkcie súvisiace s produkciou a udržiavaním myelínového obalu. Tento obal poskytuje izoláciu, podporu a zosilnenie vodivosti pre axóny viacerých neurónov. Jediný oligodendrocyt môže myelinizovať až 50 rôznych axónov. Myelinizácia je obmedzená len na určité axóny s veľkým priemerom; dendrity a iné bunkové procesy, ako napríklad astrocytové, ostávajú nemyelinizované. Zdá sa, že axóny kontrolujú množstvo myelinizujúcich oligodendrocytov, keďže axonálna transekcia v paradigme potkanieho očného nervu inhibuje myelínovú obnovu a oligodendrocytovú prekurzorovú produkciu (zhrnuté vBarres a Raff, 1999). Oligodendrocytová proliferácia a migrácia môže byť stimulovaná faktormi uvoľňovanými z axónov počas vývoja. Takýmto spôsobom sú starostlivo zosúladené počty oligodendrocytov a axónov v CNS.

Oligodendrocyty, perineuronálne podporné bunky CNS, myelinizujú axonálne trakty a slúžia na zosilnenie prenosu impulzov. Hrajú úlohy pri prežívaní a fungovaní axónov. Všimnite si preto, ako je znázornené v tomto diagrame, že oligodendrocyt zasahuje len jeden proces v každom axóne, ktorý myelinizuje.

-20Multilamelový myelínový obal je špecializovaná doména gliovej bunkovej plazmatickej membrány, bohatej na lipidy a s nízkym obsahom proteínu. Slúži na podporu axónov a zlepšuje účinnosť elektrického signálneho vedenia v CNS predchádzaním nabíjaniu z krvácania do obklopujúceho tkaniva. Ranivier uzly sú miestami v obale, pozdĺž axónu, kde nastáva skoková vodivosť.

V dospelom mozgu sa oligodendrocyty vyvíjajú z ešte slabo definovaných prekurzorových buniek v subventrikulárnej zóne mozgu a v mieche (Nait-Oumesmar a ďalší, 1999). Tieto prekurzory sú proliferatívne a exprimujú myelínové transkripty a proteíny, ktoré sa najprv objavujú v komorovej oblasti embryonickej miechy, niekoľko týždňov pred myelinizáciou (Hajihosseini a ďalší, 1996). Proces myelinizácie nastáva v post-natálnom mozgu. V priebehu post-natálneho vývoja tieto prekurzory migrujú do neurónových traktov, ktoré sa majú myelinizovať.

Oligodendrocyty vyzrievajú z ich prekurzorových buniek definovaným a špecifickým spôsobom (zhrnuté napr. v Rogister a ďalší, 1999). Vývoj oligodendrocytov sleduje definovanú dráhu, ktorej každé štádium je ohraničené niekoľkými bunkovo špecifickými markermi: endoteliálnou nervovou bunkovou adhéznou molekulou (E-NCAM), vimetínom, A2B5, POU transkripčným faktorom Tst-1/Oct6/SCIP, pre-oligodendroblastickým antigénom (POA), galaktocerebrozidom (GalC), 01, 04 a myelín špecifickými proteínmi PLP, MBP a MOG. Nervové kmeňové bunky vedú k vzniku bipolárnych pre-GD3+ buniek, ktoré sa stávajú 02A prekurzormi. Tieto bunky môžu viesť k vzniku buď oligodendrocytov, alebo astrocytov typu 2. Progresia pokračuje cez pre-oligodendrogilálne a preGalC+ štádiá, pred skutočnou diferenciáciou na oligodendrocyty. Konečné štádiá oligodendrogliálnej línie sú definované neschopnosťou týchto buniek proliferovať. Zrelé oligodendrocyty exprimujú bunkovo špecifické markery GalC a sulfatid (SUL), okrem exprimovania myelín špecifických proteínov.

Oligodendrocyty sa preto diferencujú z mitoticky aktívnych, migračných prekurzorových buniek. Po tom ako sa tieto bunky stanú post-mitotickými, transkribujú a translatujú gény kódujúce myelín špecifické proteíny. Obalenie myelínového obalu obaľujúceho axón sa uskutočňuje priamym kontaktom medzi procesmi zrelého oligodendrocytu a samotného axónu. Obalenie CNS axónu sa ukončuje spevňovaním myelínového obalu, ktorý sa vo svojej finálnej forme podobá

-21 na kvapalný kryštál obsahujúci makromolekuly v komplexnej formácii (Scherer, 1997). Podpora myelinizácie vyžaduje zváženie presného stechiometického vzťahu medzi jednotlivými štrukturálnymi proteínmi myelínového obalu, keďže zvýšenie alebo zníženie množstva jedného komponentu by mohlo viesť k zmätku v celej obalovej štruktúre.

Neschopnosť oligodendrocytov nepretržite opravovať demyelinizované axóny sa podieľa na kumulatívnej neurologickej dysfunkcii charakteristickej pre MS. Podpora remyelinizácie u MS pacientov by mohla chrániť pred stratou axónov a tak limitovať progresiu k invalidite spojenej so smrťou axónov v CNS.

Demyelinizačný fenotyp MS viedol k extenzívnym štúdiám povahy aktívnej MS lézie. Nahé axóny a absencia myelinizujúcich oligodendrocytov indikovali rozrušenie normálneho myelínu a aberácie v remyelinizujúcom procese spojenom s MS. Ukázalo sa, že približne 40 % MS lézií vykazuje dôkaz abortívnej remyelinizácia, najmä v skorých fázach ochorenia (Prineas a ďalší, 1993). Toto predstavuje realistický predpoklad, že vyvinutie stratégií a podporu myelínovej opravy by zabránilo permanentnému poškodeniu nervového systému. Pravdepodobnosť úspechu je výnimočne vysoká u mladších CNS lézií, kde sa ukázalo, že sa už remyelinizácia uskutočňuje. Avšak myelinizujúci alebo remyelinizujúci oligodendrocyt je bunkou pod extrémnym metabolickým stresom, ktorá môže byť pod tlakom aj minimálnych ďalších inzultácií nezvratné poškodená (Scolding a Lassma, 1996). Toto znižuje pravdepodobnosť spontánnej opravy v aktívnej MS lézii, kde zápal a iné negatíve javy predstavujú prekážky remyelinizácie. Stratégie podporujúce opravu myelínu tak môžu zvýšiť šance v prospech remyelinizácie a ochrany axónov v aktívnych MS léziách.

Ukázalo sa, že dospelý ľudský CNS obsahuje oligodendrocytové prekurzorové bunky, ktoré sú schopné proliferovať, a ktoré by mohli vyzrievať na myelinizujúce oligodendrocyty. Okrem toho sa zdá, že endogénne oligodendrocytové prekurzorové populácie v blízkosti MS lézií sú spotrebované v priebehu chronických fáz ochorenia, v dôsledku inhibície schopnosti týchto prekurzorov proliferovať a diferencovať sa (Wolswijk, 1998). Takéto prekurzorové bunky sú vo všeobecnosti neaktívne v prostredí chronickej MS lézie, čím je zabránené tomu, aby sa aktívne podieľali na remyelinizácii. Situácia v chronických

-22MS léziách by preto mohla zahŕňať faktory, ktoré prekážajú oligodendrogliovej regenerácii alebo nedostatok faktorov nevyhnutných na stimuláciu oligodendrocytovej prekurzorovej bunkovej populácie (Wolswijk, 1998). Tento koncept viedol k hypotéze, že účinná terapia pre MS by nemala byť obmedzená na zastavenie zápalu, ale by mala podporovať remyelinizáciu. Remyelinizujúce bunky by mohli pochádzať z rôznych zdrojov, vrátane prežívajúcich oligodendrocytov nachádzajúcich sa prirodzene v lézií, buniek odvodených z týchto prežívajúcich oligodendrocytov, alebo blízkych prekurzorových buniek. Ukázalo sa, že zrelé oligodendrocyty môžu byť indukované tak, aby sa dediferencovali a proliferovali prostredníctvom takých faktorov, akými sú bázický fibroblastový rastový faktor (bFGF), čo svedčí o mechanizme na regeneráciu oligodendrogliovej línie po demyelinizáčnom ochorení (Grinspan a ďalší, 1996; Grinspan a ďalší, 1993).

Ďalší dôkaz užitočných účinkov remyelinizácie v demyelinizujúcich poruchách, ako napríklad pri MS, je poskytnutý štúdiami uskutočňovanými s gliovými rastovými faktormi na liečenie na živočíšnych modeloch choroby. Gliový rastový faktor 2 (neuregulín/GGF-2), CNS rastový faktor, o ktorom je známe, že podporuje proliferáciu a prežívanie oligodendrocytov, sa ukázal ako odďaľujúci nástup ochorenia, redukujúci klinickú závažnosť a znižujúci frekvenciu recidív na EAE myšacom modeli MS (Marchionni a ďalší, 1999). Ukázalo sa, že neuregulín má užitočný účinok na prežívanie zrelých oligodendrocytov a na ich produkciu axónmi (Fernández a ďalší, 2000).

Demonštrovalo sa, že aj iné rastové faktory, vrátane rastového faktora z krvných doštičiek (PDGF) a IGF-1, podporujú remyelinizáciu a majú terapeutické účinky v EAE modeloch (zhrnuté v Dubois-Dalcq a Murray, 2000). Úspech dosiahnutý so stimuláciou remyelinizácie prostredníctvom indukovania buniek oligodendrocytovej línie k proliferácii a/alebo diferenciácii indikuje, že vyhliadky na remyelinizáciu ako terapeutickú stratégiu pre MS sú priaznivé. Bolo by tiež dôležité identifikovať molekuly, ktoré inhibujú myelínovú syntézu, keďže tieto môžu znižovať účinnosť opravných stratégií, ako napríklad oligodendrogliovej bunkovej transplantácie pri MS.

Proces remyelinizácie by mohol fungovať spolu s protizápalovými dráhami na opravu poškodenia a na ochranu axónov pred transekciou a smrťou.

-23Oligodendrocyty môžu byť indukované, aby remyelinizovaly axonálne trakty v CNS, a tým sa podieľali na zlepšovaní chorobného stavu. Posilnenie remyelinizácie by mohlo pôsobiť proti predchádzajúcej deštrukcii spôsobenej inváziou buniek imunitného systému do CNS tkaniva a ich útokom na myelínové obaly.

Uskutočňovalo sa niekoľko analýz oligodendrogliovej diferenciácie a lézií sklerózy multiplex použitím mikrorádovej vizualizácie rôznej génovej expresie (DGE, Scarlato a ďalší, 2000; Whitne a ďalší, 1999). Tieto využívali významne odlišné rádové technológie na testovanie meniacich sa setov génov. Analýza génovej expresie tak v diferencujúcich sa oligodendrocytoch, ako aj v léziách sklerózy mutiplex, indikovala významné zmeny v expresii myelín špecifických génov. Okrem toho, boli určené iné gény, ako regulované diferenciáciou, z ktorých mnohé sú známe ako podieľajúce sa na takých procesoch, akými sú kontrola bunkového cyklu, cytoskeletová reorganizácia a preprava cez membránu (Scarlato a ďalší, 2000).

Osteopontín je vysoko fosforylovaný sialoproteín, ktorý je prominentnou zložkou mineralizovaných extracelulárnych matríc kostí a zubov. OPN sa vyznačuje prítomnosťou polysekvencie kyseliny asparágovej a miestami Ser/Thr fosforylácie, ktoré sprostredkúvajú hydroxyapatitové viazanie, a vysoko konzervovaným RGD motívom, ktorý sprostredkúva bunkové pripojenie/signalizáciu. Expresia osteopontinu v rôznych tkanivách indikuje multiplicitu funkcií, na ktorých sa podieľa jeden alebo viacero z týchto konzervatívnych motívov. Hoci to, že neexistuje jasný fenotyp v OPN „knockout“ myšiach, spôsobilo, že nie je stanovená definitívna úloha osteopontinu v žiadnom tkanive, súčasné štúdie poskytli niektoré nové a zvláštne pohľady na polyfunkčnosť tohto proteínu v rôznorodých biologických dejoch, vrátane vývojových procesov, hojenia rán, imunologických odpovedí, tumorigenézy, kostnej resorpcie a kalcifikácie. Schopnosť osteopontinu stimulovať bukovú aktivitu cez multiplicitné receptory spojené s niekoľkými interaktívnymi signalizačnými dráhami môže byť zodpovedná za väčšinu funkčnej rôznorodosti (Sodek a ďalší).

Ukázalo sa tiež, že osteopontín sa exprimuje v primárnych senzorických neurónoch potkanieho miechového nervového systému a trigeminálneho nervového

-24systému, tak v telách neurónových buniek, ako aj v axónoch (Ichikawa a ďalší, 2000).

Osteopontínová mRNA sa exprimuje v dospelom mozgu, ako sa ukázalo prostredníctvom in situ hybridizácie. Zistila sa expresia v neurónoch čuchového bulbu a mozgového kmeňa a v mozgovom kmeni sa zistila vo funkčne odlišných oblastiach vrátanie oblastí súvisiacich s motorikou, senzorickým systémom a retikulárnou formáciou (Shin a ďalší, 1999).

Iná štúdia skúmala priestorovú a časovú expresiu osteopontínovej mRNA po prechodnej ischémii predného mozgu u potkanov. Prechodná indukcia OPN mRNA po globálnej ischémii nastala skôr v striatum, ako v hypokampe. Očividná bola v dorzomediálnom striatum v blízkosti bočnej komory a v CA1 suboblasti a v subikule hipokampu pred tým, ako sa mikrogliové bunky stali reaktívnejšie. Mohla byť detegovaná aj v dentate hilus a v okrajovom rozsahu CA3 (Lee MY, Shi SL, Choi YS, Kim EJ, Cha JH, Chun MH, Lee SB, Kim SY, Neurosci Lett 1999 August 20,271:2 81-4).

Osteopontín sa nazýva aj Eta-1. WO 00/63241 sa týka spôsobov modulovania imunitných reakcií, konkrétne spôsobov modulovania imunitných reakcií typu 1 použitím modulátorov Eta-1 (skorá T lymfocytová aktivácia-1)/ osteopontínu. Osteopontínové modulátory sa považujú za užitočné na liečenie infekcií, imunitných porúch a ochorení, autoimunitných porúch vrátane MS, rôznych imunodeficiencií a rakoviny. Všetky modulátory osteopontínu sú opísané vo WO 00/63241, pričom sú predpokladané ako užitočné pri autoimunitných ochoreniach, vrátane MS, a sú nimi inhibítory osteopontínu/Eta-1, ako je podrobne vysvetlené v časti V. „Klinické aplikácie modulačných metód podľa vynálezu“, D „Autoimunitné ochorenia“, na stranách 51 až 53 vo WO 00/63241.

Interferóny sú podtriedou cytokínov, ktoré vykazujú protizápalovú, protivírusovú a antiproliferatívnu aktivitu. Na základe biochemických a imunologických vlastností sa prirodzene sa vyskytujúce ľudské interferóny rozdeľujú do troch tried: interferón alfa (leukocyt), interferón beta (fibroblast) a interferón gama (imunita). Alfa interferón je v súčasnosti povolený v USA a v iných krajinách na liečenie hairy celí leukémie (rakovina lymfocytov (B-buniek)), venerických bradavíc, Kaposhiho

-25sarkómu (rakovina bežne postihuje pacientov trpiacich na syndróm získanej imunitnej nedostatočnosti (AIDS)) a chronickej non-A, non-B hepatitídy.

Ďalej, interferóny (IFNs) sú glykoproteíny produkované telom ako odpoveď na vírusovú infekciu. Inhibujú množenie vírusov v chránených bunkách. Pozostávajúc z proteínu s nižšou molekulovou hmotnosťou, IFNs majú značne nešpecifický účinok, tzn. IF indukovaný jedným vírusom je účinný proti širokému rozsahu iných vírusov. Sú však druhovo špecifické, tzn. IFN produkovaný jedným druhom bude stimulovať protivírusovú aktivitu len v bunkách rovnakého alebo blízko príbuzného druhu. IFNs boli prvou skupinou cytokínov, pri ktorých sa využíva ich potenciál protinádorovej a protivírusovej aktivity.

Tri hlavné IFNs sa označujú ako IFN-a, IFN-β a IFN-γ. Tieto hlavné druhy IFNs boli najprv roztriedené podľa buniek, z ktorých pochádzajú (leukocyt, fibroblast alebo T bunka). Avšak zistilo sa, že niekoľko typov môže byť produkovaných jednou bunkou. Takže leukocytový IFN sa teraz označuje IFN-a, fibroblastový IFN sa označuje IFN-β a T bunkový IFN sa označuje IFN-γ. Existuje aj štvrtý typ IFN, lymfoblastoidový IFN, produkovaný v „Namalwa“ bunkovej línii (odvodenej z Burkitového lymfómu), ktorá sa zdá, že produkuje zmes leukocytového a fibroblastového IFN.

Interferónová jednotka bola zverejnená ako miera IFN aktivity, pričom bola definovaná (trocha ľubovoľne) ako množstvo nevyhnutné na ochranu 50 % buniek proti vírusovému poškodeniu.

Každá trieda IFN obsahuje niekoľko jasne odlíšených typov. IFN-β a IFN-γ je každý produktom jediného génu. Rozdiely medzi jednotlivými typmi sa zdajú spôsobené najmä odchýlkami v glykozylácii.

IFNs-α sú najrôznorodejšou skupinou obsahujúcou približne 15 typov. Existuje klaster IFN-α génov na chromozóme 9, ktorý obsahuje aspoň 23 členov, z ktorých 15 je aktívnych a transkribovaných. Zrelé IFNs-α nie sú glykozylované.

IFNs-α a IFN-β majú všetky rovnakú dĺžku (165 alebo 166 aminokyselín) s podobnými biologickými aktivitami. IFNs-γ majú dĺžku 146 aminokyselín a menej sa podobajú s triedami a a β. Len IFNs-γ môže aktivovať makrofágy alebo indukovať zretie zabíjačských T buniek. Pri účinkovaní sa tieto nové typy terapeutík môžu

-26nazvať modifikátormi biologickej odpovede (BRMs), pretože majú vplyv na reakciu organizmu na nádor, pričom rozoznávanie sa uskutočňuje prostredníctvom imunomodulácie.

Najmä ľudský fibroblastový interferón (IFN-β) má protivírusovú aktivitu a môže tiež stimulovať prirodzené zabíjačské bunky proti neoplastickým bunkám. Je to polypeptid s približne 20000 Da indukovaný vírusmi a dvojvláknovými RNAs. Z nukleotidovej sekvencie génu pre fibroblastový interferón, klonovanej technológiou rekombinantnej DNA, Derynk a ďalší (Derynk a ďalší, 1980) odvodili kompletnú aminokyselinovú sekvenciu proteínu. Je dlhá 166 aminokyselín.

Shepard a ďalší (Shepard H. M a ďalší, 1981) opísali mutáciu bázy 842 (Cys -> Tyr v polohe 141), ktorá ničí protivírusovú aktivitu, a variantový kloň s deléciou nukleotidov 1119-1121.

Mark a ďalší (Mark D.F. a ďalší, 1984) zaviedli umelú mutáciu náhradou bázy 469 (T) za (A), čo spôsobilo aminokyselinovú zámenu Cys->Ser v polohe 17. O výslednom IF-β bolo zverejnené, že je rovnako aktívny ako „natívny“ IFN-β a stabilný pri dlhodobom uskladňovaní (-70 °C).

Rebif® (rekombinantný ľudský interferón-β) je najnovším vývojovým krokom v interferónovej terapii sklerózy multiplex (MS) a predstavuje významný pokrok v liečení. Rebif® je interferón (IFN)-beta 1a, produkovaný cicavčími bunkovými líniami a v skutočnosti identický s prirodzene sa vyskytujúcou ľudskou molekulou.

Mechanizmy, prostredníctvom ktorých IFNs účinkujú, nie sú úplne pochopené. Avšak vo väčšine prípadov účinkujú prostredníctvom ovplyvňovania indukcie alebo transkripcie určitých génov, takže ovplyvňujú imunitný systém. In vitro štúdie ukázali, že IFN sú schopné indukovať alebo suprimovať približne 20 génových produktov.

IFN-β môže pri MS účinkovať troma hlavnými dráhami:

- prostredníctvom regulácie T-bunkových funkcií, ako napríklad aktivácie, proliferácie a supresorovej bunkovej funkcie;

- prostredníctvom modulácie produkcie cytokínov: regulácia na zníženie prozápalových cytokínov a regulácia na zvýšenie inhibičných, protizápalových cytokínov;

-27- prostredníctvom regulácie migrácie a infiltrácie T btiniek do CNS cez BBB (krvno-mozgová bariéra).

PRISMS štúdiou sa stanovila účinnosť interferónu beta-1a podávaného subkutánne trikrát za týždeň pri liečení sklerózy multiplex s periódami recidív a zotavenia (RR-MS). Táto štúdia ukázala, že interferón beta-1a môže mať pozitívny vplyv na dlhotrvajúcu MS prostredníctvom zníženia počtu a závažnosti recidív a redukovaním bremena ochorenia a chorobnej aktivity, ako bolo merané prostredníctvom MRI. (Randomised, Double-Blind, Placebo-Controlled Study of Interferón beta-1a in Relapsing-remitting Multiple Sclerosis“, The Lancet 1998; 352 (7. november 1998): 1498-1504).

Citácia ktoréhokoľvek tu uvedeného dokumentu nie je mienená ako pripustenie, že je takýto dokument relevantný z hľadiska stavu techniky, alebo ako materiál súvisiaci s patentovateľnosťou akéhokoľvek nároku podľa predloženej prihlášky. Akékoľvek stanovisko, čo sa týka obsahu alebo dátumu akéhokoľvek dokumentu je založené na informáciách dostupných prihlasovateľom v čase podania a nepredstavuje pripustenie možnosti zvažovať správnosť takéhoto stanoviska.

Cieľom predloženého vynálezu je poskytnúť nový prostriedok na liečenie a/alebo prevenciu neurologického ochorenia.

Podstata vynálezu

Vynález je založený na zistení, že proteín osteopontín podporuje proliferáciu a diferenciáciu gliových buniek, čím podporuje myelinizáciu a regeneráciu nervov. V súlade s predloženým vynálezom bolo ďalej zistené, že osteopontín má užitočný účinok na sklerózu multiplex a periférne neuropatie na zvieracích modeloch.

Podstatou vynálezu je teda použitie osteopontínu alebo agonistu osteopontínovej aktivity na výrobu lieku na liečenie neurologickej choroby, ako napríklad pri traumatickom nervovom poškodení, mŕtvici, demyelinizujúcich ochoreniach CNS alebo PNS, neuropatiách a neurodegeneratívnych ochoreniach.

V súlade s predloženým vynálezom môže byť osteopontín použitý aj v kombinácii s interferónom na liečenie a/alebo prevenciu neurologických porúch.

-28Použitie nukleokyselinových molekúl a expresných vektorov obsahujúcich osteopontín a buniek exprimujúcich osteopontín na liečenie a/alebo prevenciu neurologického ochorenia je tiež v rozsahu predloženého vynálezu. Vynález ďalej poskytuje farmaceutické prostriedky obsahujúce osteopontín a interferón, voliteľne spolu v jednom alebo vo viacerých farmaceutický prijateľných excipientoch.

Predložený vynález je založený na zistení, že osteopontín sa odlišne exprimuje v priebehu oligodendrocytovej diferenciácie a v priebehu vývoja malého mozgu. Ďalej sa zistilo, že expresia osteopontínovej cDNA v oligodendrocytoch vedie k diferencovanému fenotypu týchto buniek in vitro. Pri expresii osteopontínu oligodendrocyty vykazujú fenotyp, ktorý je podobný s fenotypom diferencujúcej sa, myelinizujúcej bunky. Okrem týchto in vitro zistení sa ukázalo, že osteopotín a najmä kombinácia osteopontínu a interferónu, má užitočný účinok v zavedenom modeli sklerózy multiplex. Na experimentálnom modeli periférnej neuropatie mal osteopontín výrazný užitočný účinok na nervovú aktivitu a významne znižoval percento degenerácie a posiľňoval rozsah myelinizácie.

Tu uvedený experimentálny dôkaz preto poskytuje novú možnosť liečenia neurologických ochorení, najmä tých ochorení, ktoré sú spojené s funkciou nervových a gliových buniek. Tieto zistenia sú výnimočne prekvapujúce, pretože vo WO 0/63241 sa uvádza, že sa inhibuje osteopontín, aby sa liečila skleróza multiplex.

Vynález sa preto týka použitia osteopontínu alebo agonistu osteopontínovej aktivity na výrobu liečiva na liečenie a/alebo prevenciu neurologických ochorení.

Výraz „osteopontín“, tak ako sa používa tu, označuje kompletný ľudský osteopontín majúci aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je známa z konca osemdesiatych rokov (Oldberg a ďalší, 1986; Kiefer a ďalší, 1989). Sekvencia ľudského osteopontínu je tu uvedená ako sekvencia č. 1 na priloženom zozname sekvencii. Výraz „osteopotín“, tak ako sa používa tu, sa ďalej týka akéhokoľvek osteopontínu odvodeného zo zvierat, ako napríklad myšacieho, hovädzieho alebo potkanieho osteopontínu, pokiaľ je dostatočne identický, aby si udržal osteopontínovú aktivitu, a pokiaľ výsledná molekula nebude imunogénna u ľudí.

Výraz „osteopontín“, tak ako sa používa tu, sa ďalej týka biologicky aktívnych muteínov a fragmentov, ako napríklad prirodzene sa vyskytujúcich izoforiem

-29osteopontínu. Osteopontín sa exprimuje vo funkčne heterogénnych formách, ktoré sa líšia úrovňou transkripcie (alternatívny zostrih) a posttranslačnými modifikáciami (fosforyláciou, glykozyláciou). Doteraz sú známe tri zostrihové varianty OPN, označené OPN-a (tu označovaný aj ako „kompletný“ osteopontín), OPN-b a OPN-c (sekv. č. 1, 2 a 3 v priloženom ozname sekvencií, a znázornená aj na obrázku 2). Izoformy boli opísané napr. v Kon a ďalší (2000) a charakterizované napr. v Saitoh a ďalší (1995) a Kon a ďalší (2002).

Trombínové štiepenie vedie k dvom in vivo proteolytickým štiepnym fragmentom obsahujúcim N- a C-terminálne časti proteínu. Pre osteopontínovú funkciu môže byť dôležitá fosforylácia osteopontínu, najmä C-terminálnej časti proteínov. Výraz „osteopontín“, tak ako sa používa tu, je preto mienený aj ako zahŕňajúci tieto proteolytické fragmenty a rozdielne fosforylované osteopontínové formy.

Výraz „osteopontín“, tak ako sa používa tu, ďalej zahŕňa jeho izoformy, muteíny, fúzované proteíny, funkčné deriváty, aktívne frakcie alebo fragmenty alebo cirkulárne permutované deriváty alebo soli. Tieto izoformy, muteíny, fúzované proteíny alebo funkčné deriváty, aktívne frakcie alebo fragmenty alebo cirkulárne permutované deriváty si zachovávajú biologickú aktivitu osteopontínu. Výhodne majú biologickú aktivitu, ktorá je zlepšená v porovnaní so štandardným osteopontínom.

Výraz „agonista osteopontínovej aktivity“, tak ako sa používa tu, sa týka molekuly stimulujúcej alebo imitujúcej osteopontínovú aktivitu, ako napríklad agonistických protilátok osteopontínového receptora alebo agonistov s malou molekulovou hmotnosťou aktivizujúcich signalizáciu cez osteopontínový receptor. Osteopontín sprostredkúva svoju funkciu cez aspoň dve skupiny receptorov. Po prvé interaguje s αν-integrínmi (ανβ3 a ανβ5 integrínovými receptoromi cez RGD (Arg-Gly-Asp)) bunkovým pripájacím motívom pozitívne ovplyvňovaným mangánom (Kunicky a ďalší, 1997). Po druhé, interaguje s CD44 variantovými izoformami v6v10. Verí sa, že C-terminálna časť osteopontínu sa podieľa na interakcii s CD44, zatiaľ čo N-terminálna časť osteopontínu sa podieľa na interakcii s integrínovými receptormi, a proliferácii, prežívaní a diferenciácii makrofágov. N-terminálna časť

-30osteopontínu indukuje aj uvoľňovanie IL-12 a IL-10. Výraz „agonista OPN aktivity“, tak ako sa používa tu, zahŕňa akéhokoľvek agonistu, stimulátor alebo zosilňovač.

Výraz „agonista osteopontínovej aktivity“, tak ako sa používa tu, ďalej označuje činidlá posilňujúce osteopontínom sprostredkúvané aktivity, ako je napríklad podpora pripájania buniek na extracelulárne matricové komponenty, morfogenéza buniek oligodendrocytovej línie na bunky produkujúce myelín, na podporu zhromažďovania, proliferácie, diferenciácie alebo zretia buniek oligodedrocytovej línie (ako napríklad rodičovských alebo prekurzorových buniek), na ochranu buniek oligodendrocytovej línie pred apoptózou a poškodením buniek.

Výraz „liečenie a „prevencia“, tak ako sa používajú tu, by mali byť chápané ako prevencia, inhibovanie, oslabovanie, zlepšovanie alebo reverzia jedného alebo viacerých symptómov alebo príčin neurologického ochorenia, ako aj symptómov, ochorení alebo komplikácií sprevádzajúcich neurologické ochorenie. Keď sa „lieči“ neurologické ochorenie, látky podľa vynálezu sa podávajú po nástupe ochorenia, „prevencia“ sa týka podávania látok pred tým, ako je možné u pacienta spozorovať známky ochorenia.

Výraz „neurologické ochorenia“, tak ako sa používa tu, zahŕňa všetky známe neurologické ochorenia alebo poruchy alebo poranenia CNS alebo PNS, vrátane tých, ktoré sú podrobne opísané v časti Doterajší stav techniky“.

Neurologické choroby zahŕňajú poruchy spojené s dysfunkciou CNS alebo PNS, ako napríklad choroby týkajúce sa neurotransmisie, bolenia hlavy, poranenia hlavy, CNS infekcií, neuro-oftalmologických a kraniálnych nervových porúch, funkcie a dysfunkcie mozgových lalokov, porúch pohybu, letargie a kómy, demyelinizačných ochorení, delíria a demencie, abnormalít kraniocervikálnych spojení, kŕčových porúch, miechových porúch, porúch spánku, porúch periférneho nervového systému, mozgovo cievneho ochorenia alebo svalových porúch. Definície týchto porúch pozri napr. na http://www.merck.com/pubs/mmanual/section 14Zsec14.htm.

Výhodne sú neurologické choroby podľa vynálezu vybrané zo skupiny, ktorá obsahuje traumatické nervové poranenie, mŕtvicu, demyelinizačné ochorenia CNS alebo PNS a neurodegeneratívne ochorenia.

-31 Traumatické nervové poranenie sa môže týkať PNS alebo CNS, môže to byť poranenie mozgu alebo miechy, vrátane paraplégie, ako je opísané vyššie, v časti Doterajší stav techniky.

Mŕtvica môže byť spôsobená hypoxiou alebo ischémiou mozgu. Nazýva sa aj mozgovo cievne ochorenie alebo príhoda. Mŕtvica môže zahŕňať stratu mozgových funkcií (neurologické deficity) spôsobenú nedostatkom cirkulácie krvi v oblastiach mozgu. Nedostatočná cirkulácia krvi môže byť spôsobená krvnými zrazeninami, ktoré sa tvoria v mozgu (trombus), alebo kúskami aterosklerotického plaku alebo iného materiálu, ktorý putuje do mozgu z iných lokalít (embolus). Krvácanie (hemorage) vo vnútri mozgu môže spôsobiť symptómy, ktoré napodobujú mŕtvicu. Najbežnejšou príčinou mŕtvice je mŕtvica sekundárne po ateroskleróze (mozgová trombóza) a preto sa vynález týka aj liečenia aterosklerózy.

Periférna neuropatia sa môže týkať syndrómu straty citlivosti, svalovej slabosti a atrofie, zníženej hĺbky šľachových reflexov a vazomotorických symptómov, samostatne alebo v akejkoľvek kombinácii. Neuropatia môže postihnúť jediný nerv (mononeuropatia), dva alebo viacero nervov v oddelených oblastiach (viacnásobná mononeuropatia) alebo mnohé nervy simultánne (polyneuropatia). Primárne môže byť postihnutý axón (napr. pri cukrovke, Lymskej borelióze alebo urémii alebo s toxickými činidlami) alebo môže byť primárne postihnutý myelínový obal alebo Schwannové bunky (napr. pri akútnej alebo chronickej zápalovej polyneuropatii, leukodystrofiách alebo Guillain-Barré syndróme). Ďalšie neuropatie, ktoré môžu byť liečené podľa predloženého vynálezu, môžu byť spôsobené napr. v dôsledku otravy olovom, poštípania roztočom, porfýrie alebo Guillain-Barré sydrómu, a môžu primáre postihovať motorické vlákna. Iné, napr. v dôsledku dorzálnej koreňovej ganglionitídy rakoviny, lepry, AIDS, cukrovky alebo chronickej pyridoxínovej intoxikácie, môžu primárne postihovať dorzálne koreňové gangliá alebo senzorické vlákna, produkujúc senzorické symptómy. Postihnuté môžu byť aj kraniálne nervy napr. pri Guillain-Barré syndróme, Lymskej borelióze, cukrovke a diftérii.

Alzheimerova choroba je poruchou zahŕňajúcou zhoršenie mentálnych funkcií, ktoré je výsledkom zmien v mozgovom tkanive. Toto môže zahŕňať scvrkávanie mozgových tkanív, primárnu degeneratívnu demenciu a difúznu

-32mozgovú atrofiu. Alzheimerova choroba sa označuje aj ako senilná demencia Alzheimerovho typu (SDAT).

Parkinsonova choroba je poruchou mozgu, ktorá zahŕňa trasenie a ťažkosti s chôdzou, pohybom a koordináciou. Táto choroba je spojená s poškodením určitej časti mozgu, ktorá riadi svalový pohyb, a nazýva sa aj paralysis agitans alebo trasová paralýza.

Huntingtnonova choroba je vrodené, autozomálne dominantné neurologické ochorenie.

Amyotrofická laterálna skleróza, ALS, je poruchou spôsobujúcou progresívnu stratu nervového riadenia vôľou ovládaných svalov, vrátane deštrukcie nervových buniek v mozgu a mieche. Amyotrofická laterálna skleróza, nazývaná aj Lou Gehringova choroba, je poruchou zahŕňajúcou stratu používania a kontroly svalov.

Skleróza multiplex (MS) je zápalovým demyelinizačným ochorením centrálneho nervového systému (CNS), pri ktorom sa striedajú obdobia recidív a remisií, alebo ktoré má progresívny priebeh. MS nie je len demyelinizujúcim ochorením. Jeho náprotivkom v periférnom nervovom systéme (PNS) je chronická zápalová demyelinizačná polyradikuloneuropatia (CIDP). Okrem toho existujú akútne, monofázové poruchy, ako napríklad zápalová demyelinizačná polyradikuloneuropatia označovaná ako Guillain-Barré syndróm (GBS) v PNS, a akútna roztrúsená encefalomyelitída (ADEM) v CNS.

Ďalšie neurologické poruchy zahŕňajú neuropatie s abnormálnou myelinizáciou, ako napríklad neuropatie uvedené vyššie, v časti Doterajší stav techniky, ako aj karpálny tunelový syndróm. Traumatické nervové poranenie môže byť sprevádzané chrbticovými ortopedickými komplikáciami, takže aj tieto spadajú medzi ochorenia podľa predloženého vynálezu.

Neurologické poruchy môžu byť spôsobené aj vrodenými metabolickými poruchami. Vo výhodnom uskutočnení vynálezu je preto neurologická choroba spôsobená vrodeným metabolickým deficitom.

Vrodenými metabolickými poruchami zahrnutými podľa predloženého vynálezu môžu byť napr. fenylketonúria a iné aminokyselinové uriázy, Tay-Sachs choroba, Niemann-Pick choroba a Gaucherova choroba, Hurlerov syndróm,

-33Krabbeho choroba a iné leukodystrofie. Môžu postihovať vyvíjajúci sa myelínový obal, najmä v CNS.

Neurologické ochorenia spôsobené vrodenými metabolickými poruchami sú tiež podrobne diskutované v časti Doterajší stav vynálezu.

Do rozsahu predloženého vynálezu spadajú aj menej známe neurologické ochorenia, ako napríklad neurofibromatóza alebo multiplicitná systémová atrofia (MSA). Ďalšie poruchy, ktoré môžu byť liečené v súlade s predloženým vynálezom, boli podrobne opísané v časti Doterajší stav techniky.

Vo výhodnejšom uskutočnení je neurologickým ochorením periférna neuropatia, najvýhodnejšie diabetická neuropatia. V súlade s predloženým vynálezom sú výhodné aj neuropatie asociované s chemoterapiou.

Výraz „diabetická neuropatia“ sa týka akejkoľvek formy diabetickej neuropatie alebo jedného alebo viacerých symptómov alebo porúch sprevádzajúcich alebo spôsobujúcich diabetickú neuropatiu alebo komplikácií cukrovky postihujúcich nervy, ako je podrobne opísané vyššie, v časti Doterajší stav techniky. Diabetickou neuropatiou môže byť polyneuropatia. Pri diabetickej polyneuropatii je naraz postihnutých veľa nervov. Diabetickou neuropatiou môže byť aj mononeuropatia. Pri fokálnej mononeuropatii napríklad ochorenie postihuje jediný nerv, ako napríklad okulomotorický alebo abducens kraniálny nerv. Môže ňou byť aj multiplicitá mononeuropatia, keď sú postihnuté dva alebo viacero nervov v oddelených oblastiach.

V ešte ďalšom výhodnom uskutočnení je neurologickou poruchou demyelinizujúce ochorenie. Demyelinizujúce ochorenia výhodne zahŕňajú demyelinizujúce stavy CNS, ako je akútna roztrúsená encefalomyelitída (ADEM) a skleróza multiplex (MS), ako aj demyelinizujúce ochorenia periférneho nervového systému (PNS). Tie druhé zahŕňajú ochorenia, akými sú napríklad chronická zápalová demyelinizujúca polydikuloneuropatia (CIDP), a akútne monofázické poruchy, akou je napríklad zápalová demyelinizujúca polyradikuloneuropatia označovaná Guillain-Barré syndróm (GBS).

Ďalšie výhodné uskutočnenie vynálezu sa týka liečenia a/alebo prevencie neurodegeneratívneho ochorenia. Neurodegeneratívne ochorenie je vybrané zo

-34skupiny, ktorá zahŕňa Alzheimerovu chorobu, Parkinsonovu chorobu, Huntingtonovu chorobu a ALS.

Výhodne je osteopontín vybraný spomedzi peptidu, polypeptidu alebo proteínu, ktoré sú vybrané zo skupiny obsahujúcej:

(a) polypeptid obsahujúci sekv. č. 1;

(b) polypeptid obsahujúci aminokyseliny 1 až 168 alebo 170 sekv. č. 1;

(c) polypeptid obsahujúci aminokyseliny 1 až 16 a 170 až 314 sekv. č. 1;

(d) polypeptid obsahujúci aminokyseliny 170 až 314 sekv. č. 1;

(e) polypeptid obsahujúci sekv. č. 2;

(f) polypeptid obsahujúci sekv. č. 3;

(g) muteín ktoréhokoľvek polypeptidu podľa (a) až (f), ktorého aminokyselinové sekvencia je aspoň na 40 % alebo 50 % alebo 60 % alebo 70 % alebo 80 % alebo 90 % zhodná s aspoň s jednou zo sekvencií v (a) až (f);

(h) muteín ktoréhokoľvek polypeptidu podľa (a) až (f), ktorý je kódovaný DNA sekvenciou hybridizujúcou s komplementom natívnej DNA sekvencie kódujúcej ktorýkoľvek polypeptid podľa (a) až (f) v mierne prísnych podmienkach alebo vo veľmi prísnych podmienkach;

(i) muteín ktoréhokoľvek polypeptidu (a) až (f), pričom akákoľvek zmeny v aminokyselinovej sekvencii sú konzervatívne aminokyselinové substitúcie v aminokyselinových sekvenciách v (a) až (f);

(j) soľ alebo izoformu, fúzovaný proteín, funkčný derivát, aktívnu frakciu alebo cirkulárne permutovaný derivát ktoréhokoľvek podľa (a) až (f).

Aktívne frakcie alebo fragmenty môžu obsahovať akúkoľvek časť alebo doménu ktorejkoľvek z osteopontínových izoforiem, ako napríklad N-koncovú časť alebo C-koncovú časť ktoréhokoľvek z OPN-a, -b alebo -c, ako je znázornené na obrázku 2. GRGDS motív môže byť prítomný alebo môže chýbať alebo môže byť mutovaný. Môže byť mutované heparín viažuce miesto, aby nebol osteopontín schopný viazať heparín. Kompletný osteopontín alebo ktorýkoľvek jeho aktívny fragment, môže byť fosforylovaný na jednom alebo viacerých z nasledujúcich serínových zvyškov, ako napríklad na serínových zvyškoch v nasledujúcich polohách: 8, 10, 11, 33, 46, 47, 60, 62, 65, 83, 86, 89, 92 101 104, 107, 110, 113, 153, 155, 175, 179, 199, 203, 208, 212, 218, 223, 227, 238, 242, 247, 251, 254,

-35259, 264, 275, 287, 292, 294, 295. Okrem toho môžu byť serínové fosforylačné miesta mutované zo serínového na glutamátový zvyšok, aby sa napodobnila fosforylácia.

Pre priemerného odborníka v oblasti bude zrejmé, že aj malé časti osteopontínu môžu stačiť na to, aby boli funkčné, ako napríklad aktívny peptid obsahujúci esenciálne aminokyselinové zvyšky potrebné na osteopontínovú funkciu.

Pre priemerného odborníka v oblasti bude ďalej zrejmé, že muteíny, soli, izoformy, fúzované proteíny, funkčné deriváty osteopontínu, aktívne frakcie alebo cirkulárne permutované deriváty osteopontínu si budú zachovávať podobnú, alebo aj lepšiu biologickú aktivitu osteopontínu. Biologická aktivita osteopontínu a jeho muteínov, izoforiem, fúzovaných proteinov alebo funkčných derivátov, aktívnych frakcií alebo fragmentov, cirkulárne permutovaných derivátov alebo solí môže byť meraná kokultivačným testom, ako napríklad testom opísaným v príklade 8. Zmiešané kortikálne kultúry obsahujú oligodendrocyty, ako aj iné bunky odvodené z CNS (ako napríklad neuróny, astrocyty, mikrogliá), a indukujú alebo nadregulujú typické gény podieľajúce sa na myelinizácii, ako napríklad PO, MBP alebo MAG, pri inkubovaní s OPN alebo s jeho muteínom, izoformou, fragmentom, aktívnou frakciou, funkčným derivátom alebo soľou. Expresiu týchto génov je možné merať kvantitatívnou RT-PCR analýzou v reálnom čase (TaqMan® RT-PCR), ktorá je podrobne vysvetlená nižšie, v príkladoch. Ďalším jednoduchým testom na meranie OPN aktivity je oligodendrocytový proliferačný test, ktorý zahŕňa inkubovanie adekvátnej oligodendrocytovej bunkovej línie, ako napríklad oli-neu alebo CG4 buniek, s OPN alebo jeho muteínom, izoformou, fragmentom, aktívnou frakciou, funkčným derivátom alebo soľou, ako je opísané napríklad nižšie, v príklade 7.

Výhodné aktívne frakcie majú aktivitu, ktorá je rovnaká alebo lepšia ako aktivita kompletného osteopontínu, alebo ktoré majú ďalšie výhody, ako napríklad lepšiu stabilitu alebo nižšiu toxicitu alebo imunogénnosť, alebo sa ľahšie produkujú vo veľkých množstvách alebo sa ľahšie purifikujú. Pre priemerného odborníka v oblasti bude zrejmé, že muteíny, aktívne fragmenty a funkčné deriváty sa môžu generovať klonovaním zodpovedajúcej cDNA do príslušných plazmidov a ich testovaním v kokultivačnom teste, ako je uvedené vyššie.

-36Proteíny podľa predloženého vynálezu môžu byť glykozylované alebo neglykozylované, môžu byť odvodené z prirodzených zdrojov, ako napríklad z telesných tekutín, alebo môžu byť výhodne produkované rekombinantne. Rekombinantná expresia sa môže uskutočňovať v prokaryotických expresných systémoch, ako napríklad v E. coli, alebo v eukaryotických, ako napríklad v hmyzích bunkách, a výhodne v cicavčích expresných systémoch, ako napríklad v CHO bunkách a HEK bunkách.

Tak ako sa používa tu, výraz „muteíny“ označuje analógy osteopontínu, v ktorých je jeden alebo viacero aminokyselinových zvyškov prirodzeného osteopontínu nahradených inými aminokyselinovými zvyškami, alebo sú deletované alebo je jeden alebo viacero aminokyselinových zvyškov pridaných do prirodzenej sekvencie osteopontínu bez toho, aby výrazne zmenili aktivitu výsledných produktov v porovnaní so štandardným osteopontínom. Tieto muteíny sa pripravujú známymi syntetickými technikami a/alebo technikami miestne špecifickej mutagenézy alebo akoukoľvek inou známou technikou vhodnou na tento účel.

Muteíny osteopontínu, ktoré môžu byť použité v súlade s predloženým vynálezom, alebo nukleové kyseliny, ktoré ich kódujú, zahŕňajú konečnú sadu v podstate zodpovedajúcich sekvencii ako substitučné peptidy alebo polynukleotidy, ktoré môže priemerný odborník v oblasti rutinne získať bez nadmerného experimentovania na základe tu uvedených vysvetlení a návodu.

Muteíny podľa predloženého vynálezu zahŕňajú proteíny kódované nukleovou kyselinou, ako napríklad DNA alebo RNA, ktorá hybridizuje s DNA alebo RNA, ktorá kóduje OPN podľa predloženého vynálezu, v mierne alebo vo veľmi prísnych podmienkach. Výraz „prísne podmienky“ označuje hybridizačné a následné premývacie podmienky, ktoré priemerný odborník v oblasti bežne označuje ako „prísne“. Pozri Ausubel a ďalší, Current Protocols in Molecular Biology, supra, Iterscience, N.Y., 6.3 a 6.4 (1987, 1992) a Sambrook a ďalší (Sambrook, J.C., Fritch, E.F., a Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).

Bez obmedzenia zahŕňajú príklady prísnych podmienok premývacie podmienky 12 až 20 °C pod vypočítanou Tm študovaného hybridu, napr. 2xSSC a 0,5% SDS 5 minút, 2xSSC a 0,1% SDS 15 minút; 0,1xSSC a 0,5% SDS pri 37 °C

-3730 až 60 minút a potom, 0,1xSSC a 0,5% SDS pri 68 °C 30 až 60 minút. Pre priemerného odborníka v oblasti je zrejmé, že prísnosť podmienok závisí aj na dĺžke DNA sekvencií, oligonukleotidových sond (ako napríklad 10 až 40 báz) alebo zmiešaných oligonukleotidových sond. Ak sa použijú zmiešané sondy, výhodné je použiť tetrametylamóniumchlorid (TMAC) namiesto SSC. Pozri Ausubel, vyššie.

Vo výhodnom uskutočnení má ktorýkoľvek takýto muteín aspoň 40% zhodu alebo homológiu so sekv. č. 1, 2 alebo 3 podľa pripojeného zoznamu sekvencií. Výhodnejšie vykazuje aspoň 50%, aspoň 60%, aspoň 70%, aspoň 80% alebo najvýhodnejšie aspoň 90% zhodu alebo homológiu.

Zhoda odráža vzťah medzi dvoma alebo viacerými polypeptidovými sekvenciami alebo dvoma alebo viacerými polynukleotidovými sekvenciami, ktorý je determinovaný prostredníctvom porovnávania sekvencií. Vo všeobecnosti zhoda označuje presný súlad jednotlivých nukleotidov alebo jednotlivých aminokyselín dvoch polynukleotidových alebo dvoch polypeptidových sekvencií včelej dĺžke porovnávaných sekvencií.

Pre sekvencie, ktoré navzájom presne nezodpovedajú, je možné vypočítať „% zhody“. Vo všeobecnosti, dve sekvencie, ktoré sa majú porovnávať, sa usporiadajú tak, aby bola poskytnutá maximálna korelácia medzi sekvenciami. Môže to zahŕňať začlenenie „medzier“ do jednej alebo oboch sekvencií, aby sa zvýšil stupeň zosúladenia. % zhody môže byť determinované v celej dĺžke každej zo sekvencií, ktoré sa porovnávajú (takzvané globálne usporiadanie), čo je vhodné najmä pre sekvencie s rovnakou alebo veľmi podobnou dĺžkou, alebo aj pre kratšie, definované úseky (takzvané lokálne usporiadanie), čo je vhodnejšie pre sekvencie s nerovnakou dĺžkou.

Spôsoby porovnávania zhody a homológie dvoch alebo viacerých sekvencií sú v oblasti dobre známe. Takže napríklad programy dostupné vo Wisconsin Sekvenčnom Analytickom Balíčku, verzia 9.1 (Devereux J a ďalší, 1984), napríklad programy BESTFIT a GAP, môžu byť použité na determináciu % zhody medzi dvoma polynukleotidmi a % homológie medzi dvoma polypeptidovými sekvenciami. BESTFIT využíva „lokálny homológny“ algoritmus podľa Smitha a Watermana (1981) a nachádza najlepšiu jednoreťazcovú oblasť podobnosti medzi dvoma sekvenciami. Známe sú aj iné programy na determináciu zhody a/alebo podobnosti

-38medzi sekvenciami, napríklad BALST rodinné programy (Altschul S F a ďalší, 1990, Altschul SF a ďalší, 1997, dostupné prostredníctvom domácej stránky NCBI na www.ncbi.nlm.nih.gov) a FASTA (Pearson W R, 1990; Pearson 1988).

Výhodnými zmenami pre muteíny podľa predloženého vynálezu sú zmeny známe ako „konzervatívne“ substitúcie. Konzervatívne aminokyselinové substitúcie osteopontinových polypeptidov alebo proteínov môžu zahŕňať synonymné aminokyseliny v rámci skupiny, ktorá má dostatočne podobné fyzikálno-chemické vlastnosti, tak, že substitúcia medzi členmi skupiny zachováva biologickú funkciu molekuly (Grantham, 1974). Je zrejmé, že inzercie a delécie aminokyselín sa môžu uskutočňovať vo vyššie definovaných sekvenciách bez toho, aby menili ich funkciu, najmä ak inzercie alebo delécie zahŕňajú len niekoľko aminokyselín, napr. menej ako tridsať a výhodne menej ako desať a neodstraňujú ani nepremiestňujú aminokyseliny, ktoré sú kritické pre funkčnú konformáciu, napr. cysteínové zvyšky. Proteíny a muteíny produkované takými deléciami a/alebo inzerciami, spadajú do rozsahu predloženého vynálezu.

Výhodné synonymné aminokyselinové skupiny sú definované v tabuľke I. Výhodnejšie synonymné aminokyselinové skupiny sú definované v tabuľke II a najvýhodnejšie synonymné aminokyselinové skupiny sú definované v tabuľke III.

Tabuľka I

Výhodné synonymné aminokyselinové skupiny

Aminokyselina	Synonymná skupina
Ser	Ser, Thr, Gly, Asn
Arg	Arg, Gin, Lys, Glu, His
Leu	lle, Phe, Tyr, Met, Val, Leu
Pro	Gly, Ala, Thr, Pro
Thr	Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gin, Thr
Ala	Gly, Thr, Pro, Ala
Val	Met, Tyr, Phe, lle, Leu, Val
Gly	Ala, Thr, Pro, Ser, Gly
lle	Met, Tyr, Phe, Val, Leu, lle
Phe	Trp, Met, Tyr, lle, Val, Leu, Phe

Tyr	Trp, Met, Phe, lle, Val, Leu, Tyr
Cys	Ser, Thr, Cys
His	Glu, Lys, Gin, Thr, Arg, His
Gin	Glu, Lys, Asn, His, Thr, Arg, Gin
Asn	Gin, Asp, Ser, Asn
Lys	Glu, Gin, His, Arg, Lys
Asp	Glu, Asn, Asp
Glu	Asp, Lys, Asn, Gin, His, Arg, Glu
Met	Phe, lle, Val, Leu, Met
Trp	Trp

Tabuľka II

Výhodnejšie synonymné aminokyselinové skupiny

Aminokyselina	Synonymná skupina
Ser	Ser
Arg	His, Lys, Arg
Leu	Leu, lle, Phe, Met
Pro	Ala, Pro
Thr	Thr
Ala	Pro, Ala
Val	Val, Met, lle
Gly	Gly
lle	lle, Met, Phe, Val, Leu
Phe	Met, Tyr, lle, Leu, Phe
Tyr	Phe, Tyr
Cys	Cys, Ser
His	His, Gin, Arg
Gin	Glu, Gin, His
Asn	Asp, Asn
Lys	Lys, Arg
Asp	Asp, Asn
Glu	Glu, Gin
Met	Met, Phe, lle, Val, Leu
Trp	Trp

-40Tabuľka III

Najvýhodnejšie synonymné aminokyselinové skupiny

Aminokyselina	Synonymná skupina
Ser	Ser
Arg	Arg
Leu	Leu, lle, Met
Pro	Pro
Thr	Thr
Ala	Ala
Val	Val
Gly	Gly
lle	lle, Met, Leu
Phe	Phe
Tyr	Tyr
Cys	Cys, Ser
His	His
Gin	Gin
Asn	Asn
Lys	Lys
Asp	Asp
Glu	Glu
Met	Met, lle, Leu
Trp	Met

Príklady produkcie aminokyselinových substitúcií v proteínoch, ktoré môžu byť použité na získanie muteínov SARP-1 polypeptidov alebo proteínov, na použitie v predloženom vynáleze, zahŕňajú akékoľvek známe spôsobové kroky, ako napríklad tie prezentované v US patentoch 4959314, 4588585 a 4737462 v mene Mark a ďalší; 5116943 v mene Koths a ďalší, 4965195 v mene Namen a ďalší, 4879111 v mene Chong a ďalší a 5017691 v mene Lee a ďalší; a lyzinom substituované proteíny prezentované v US patente č. 4904584 (Shaw a ďalší).

Výraz „fúzovaný proteín“ označuje polypeptid obsahujúci osteopontín alebo jeho muteín alebo fragment, ktorý je fúzovaný s iným proteínom, ktorý napr. má

-41 predĺžený čas pretrvávania v telesných tekutinách. Osteopontín tak môže byť fúzovaný s iným proteínom, polypeptidom alebo napr. imunoglobulínom alebo jeho fragmentom.

Výraz „funkčné deriváty“, tak ako sa používa tu, zahŕňa deriváty osteopontínu a ich muteíny a fúzované proteíny, ktoré je možné pripraviť z funkčných skupín nachádzajúcich sa na bočných reťazcoch zvyškov alebo na N- alebo C-koncových skupinách, prostriedkami známymi v oblasti, a sú zahrnuté v tomto vynáleze, pokiaľ ostávajú farmaceutický prijateľné, tzn. pokiaľ neporušujú aktivitu proteínu, ktorá je v podstate podobná s aktivitou osteopontínu, a pokiaľ nespôsobujú toxické vlastnosti prostriedkov, ktoré ich obsahujú.

Tieto deriváty môžu napríklad zahŕňať polyetylénglykolové bočné reťazce, ktoré môžu maskovať antigénne miesta a predlžovať rezidenciu osteopoetínu v telesných tekutinách. Iné deriváty zahŕňajú alifatické estery karboxylových skupín, amidy karboxylových skupín prostredníctvom reakcie s amoniakom alebo s primárnym alebo sekundárnym amínom, N-acylované deriváty voľných aminoskupín aminokyselinových zvyškov vytvorené s acylovými skupinami (napr. alkanoylovou alebo karbocyklickou aroylovou skupinou) alebo O-acylové deriváty voľných hydroxylových skupín (napríklad serylového alebo treonylového zvyšku) vytvorené s acylovými skupinami.

„Aktívne frakcie“ osteopontínu, jeho muteínov a fúzovaných proteínov zahŕňajú akýkoľvek fragment alebo prekurzory polypeptidového reťazca proteínovej molekuly, samostatne alebo spolu s asociovanými molekulami alebo na nich pripojenými zvyškami, napr. sacharidovým alebo fosfátovým zvyškom, alebo agregáty proteínovej molekuly alebo sacharidových zvyškov, za predpokladu, že uvedená aktívna frakcia má aspoň v podstatne podobnú aktivitu ako osteopontín.

Výraz „soli“ tu označuje tak soli karboxylových skupín, ako aj kyslé adičné soli aminoskupín OPN molekuly alebo jej analógov. Soli karboxylovej skupiny môžu byť vytvorené spôsobom známym v oblasti a zahŕňajú anorganické soli, napríklad sodné, vápenaté, amónne, železité alebo zinočnaté soli a podobne, a soli s organickými zásadami, ako napríklad soli s amínmi, ako napríklad trietanolamínu, arginínu alebo lyzínu, piperidinu, prokaínu a podobne. Kyslé adičné soli zahŕňajú napríklad soli s minerálnymi aminokyselinami, ako napríklad s kyselinou

-42chlorovodíkovou alebo kyselinou sírovou, a soli s organickými kyselinami, ako napríklad kyselinou octovou alebo kyselinou oxálovou. Samozrejme, že ktorákoľvek takáto soľ si musí zachovávať biologickú aktivitu OPN relevantnú pre predložený vynález, tzn. musia vykazovať proliferatívny vplyv na oligodendrocyty.

Vo výhodnom uskutočnení vynálezu je osteopontín fúzovaný s nosičovou molekulou, peptidom alebo proteínom, ktorý podporuje prechod cez krvno-mozgovú membránu („BBB“). Tento slúži na správne nasmerovanie molekuly na miesto účinku v tých prípadoch, keď je chorobou postihnutá CNS. Modality na dodávanie lieku cez BBB majú za následok porušenie BBB, buď osmotickým spôsobom, alebo biochemický použitím vazoaktívnych látok, ako napríklad bradykinínu. Iné stratégie na prechod cez BBB môžu spočívať v použití endogénnych transportných systémov, vrátane nosičom sprostredkovaných transportérov, ako napríklad glukózy a aminokyselinových nosičov; receptorom sprostredkovanej transcytózy inzulínu alebo transferínu; a použitím aktívnych odtokových transportérov, ako napríklad pglykoproteínu. Stratégie na dodávanie lieku za BBB zahŕňajú aj intracerebrálnu implantáciu.

Funkčné deriváty osteopontínu môžu byť konjugované s polymérmi, aby sa zlepšili vlastnosti proteínu, ako napríklad stabilita, polčas rozpadu, biologická dostupnosť, tolerancia ľudským telom alebo imunogénnosť. Na dosiahnutie tohto cieľa sa osteopontín môže spojiť napr. s polyetylénglykolom (PEG). PEGylácia sa môže uskutočňovať známymi spôsobmi opísanými napríklad vo WO 92/13095.

Preto je vo výhodnom uskutočnení predloženého vynálezu osteopontín PEGylovaný.

V ďalšom výhodnom uskutočnení vynálezu fúzovaný proteín zahŕňa imunoglobulínovú (Ig) fúziu. Fúzia môže byť priama, alebo prostredníctvom krátkeho spojovacieho peptidu, ktorý môže mať len 1 až 3 aminokyselinové zvyšky, alebo môže byť dlhšia, môže mať napríklad 13 aminokyselinových zvyškov. Uvedeným spojovníkom môže byť napríklad tripeptid so sekvenciou E-F-M (Glu-Phe-Met), alebo 13-aminokyselinová spojovníková sekvencia obsahujúca Glu-Phe-Gly-AlaGly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-GIn-Phe-Met začlenená medzi osteopontínovú sekvenciu a imunoglobulínovú sekvenciu. Výsledný fúzovaný proteín má zlepšené vlastnosti, ako napríklad predĺžené zotrvávanie v telesných tekutinách (polčas rozpadu)

-43a zvýšenú špecifickú aktivitu, zvýšenú úroveň expresie. Ig fúzia môže tiež uľahčovať purifikáciu fúzovaného proteínu.

V ešte inom výhodnom uskutočnení je osteopontín fúzovaný s konštantnou oblasťou Ig molekuly. Výhodne je fúzovaný s oblasťami ťažkého reťazca, ako napríklad CH2 a CH3 doménami ľudského lgG1. Aj iné izoformy Ig molekúl sú vhodné na generovanie fúzovaných proteínov podľa predloženého vynálezu, ako napríklad izoformy lgG2 alebo lgG4 alebo iné Ig triedy, ako napríklad IgM. Fúzované proteíny môžu byť monomérne alebo multimérne, hetero- alebo homomultimérne. Imunoglobulínová časť fúzovaného proteínu sa môže ďalej modifikovať, tak, aby neaktivovala viazanie komplementu alebo komplementovú kaskádu alebo viazanie na Fc receptory.

Vynález sa ďalej týka použitia kombinácie osteopontínu a imunosupresíva na výrobu liečiva na liečenie a/alebo prevenciu neurologických porúch, na súčasné, postupné alebo oddelené použitie. Imunosupresívami môžu byť steroidy, metotrexát, cyklofosfamid, anti-leukocytové protilátky (ako napríklad CAMPATH-1) a podobne.

Vynález sa ďalej týka použitia kombinácie osteopontínu a interferónu na výrobu liečiva na liečenie a/alebo prevenciu neurologických ochorení na súčasné, postupné alebo oddelené použitie.

Výraz „interferón“, tak ako sa používa v predloženej prihláške vynálezu, je mienený ako zahŕňajúci akúkoľvek molekulu definovanú takto v literatúre, pričom zahŕňa napríklad akékoľvek druhy IFNs uvedené vyššie, v časti Doterajší stav techniky“. Interferón môže byť výhodne ľudský, ale môže byť odvodený aj z iných druhov, pokiaľ je jeho biologická aktivita podobná aktivite ľudských interferónov a molekula nie je imunogénna pre človeka.

Konkrétne je vo vyššie uvedenej definícii zahrnutý akýkoľvek druh z IFN-a,

IFN-p a IF-γ. IFN-β je výhodným IFN podľa predloženého vynálezu.

Výraz „interferón beta (IF-β)“, tak ako sa používa v predloženom vynáleze, je mienený ako zahŕňajúci ľudský fibroblastový interferón, získaný izoláciou z biologických tekutín alebo získaný DNA rekombinantnými technikami z prokaryotických alebo eukaryotických hostiteľských buniek, ako aj jeho soli, funkčné deriváty, varianty, analógy a fragmenty.

-44Výraz „funkčné deriváty“, tak ako sa používa tu, zahŕňa deriváty, ktoré je možné pripraviť z funkčných skupín nachádzajúcich sa na bočných reťazcoch zvyškov alebo na N- alebo C-koncových skupinách, prostriedkami známymi v oblasti, a sú zahrnuté v tomto vynáleze, pokiaľ ostávajú farmaceutický prijateľné, tzn. pokiaľ neporušujú biologickú aktivitu proteínu, ako je opísaná vyššie, ako napríklad schopnosť viazať sa na príslušný receptor a iniciovať receptorovú signalizáciu, a pokiaľ nespôsobujú toxické vlastnosti prostriedkov, ktoré ich obsahujú. Deriváty môžu mať chemické skupiny, ako napríklad uhľovodíkové alebo fosfátové zvyšky, za predpokladu, že takýto derivát si zachováva biologickú aktivitu proteínu a ostáva farmaceutický prijateľným.

Deriváty môžu zahŕňať napríklad alifatické estery karboxylových skupín, amidy karboxylových skupín prostredníctvom reakcie s amoniakom alebo s primárnym alebo sekundárnym amínom, N-acylované deriváty voľných aminoskupín aminokyselinových zvyškov vytvorené s acylovými skupinami (napr. alkanoylovou alebo karbocyklickou aroylovou skupinou) alebo O-acylové deriváty voľných hydroxylových skupín (napríklad serylového alebo treonylového zvyšku) vytvorené s acylovými skupinami. Takéto deriváty môžu zahŕňať napríklad aj polyetylénglykolové bočné reťazce, ktoré môžu maskovať antigénové miesta a môžu predlžovať zotrvávanie molekuly v telesných tekutinách.

Výnimočne dôležitý je proteín, ktorý môže byť derivatizovaný alebo kombinovaný s komplexačným činidlom na predĺženie trvania. Podľa predloženého vynálezu sa môžu použiť napríklad PEGylované verzie, ako bolo uvedené vyššie, alebo proteíny geneticky skonštruované tak, aby v tele pretrvávali dlhšie.

Výraz „deriváty“, je mienený ako zahŕňajúci len tie deriváty, ktoré nezamieňajú jednu aminokyselinu za inú aminokyselinu z dvadsiatich prirodzene sa vyskytujúcich aminokyselín.

Výraz „soli“ tu označuje tak soli karboxylových skupín, ako aj kyslé adičné soli aminoskupín proteínov opísaných vyššie alebo ich analógov. Soli karboxylovej skupiny môžu byť vytvorené spôsobom známym v oblasti a zahŕňajú anorganické soli, napríklad sodné, vápenaté, amónne, železité alebo zinočnaté soli a podobne, a soli s organickými zásadami, ako napríklad soli s amínmi, ako napríklad trietanolamínu, arginínu alebo lyzínu, piperidínu, prokaínu a podobne. Kyslé adičné

-45soli zahŕňajú napríklad soli s minerálnymi aminokyselinami, ako napríklad s kyselinou chlorovodíkovou alebo kyselinou sírovou, a soli s organickými kyselinami, ako napríklad kyselinou octovou alebo kyselinou oxálovou. Samozrejme, že ktorákoľvek takáto soľ si musí zachovávať biologickú aktivitu proteínov (osteopontinu, respektíve IFN-beta), ktorá je relevantná pre predložený vynález, tzn. schopnosť viazať sa na zodpovedajúci receptor a iniciovať receptorovú signalizáciu.

Interferóny môžu byť konjugované aj s polymérmi, aby sa zlepšila stabilita proteínov. Konjugát medzi interferónom β a polyolom polyetylénglykolom (PEG) bol opísaný napríklad vo WO 99/55377.

V inom výhodnom uskutočnení vynálezu je interferónom interferón-β (IFN-β) a výhodnejšie IFN-βΙ.

Osteopontín sa výhodne používa súčasne, postupne alebo oddelene s interferónom.

Vo výhodnom uskutočnení podľa predloženého vynálezu sa osteopontín používa v množstve približne 0,0001 až 100 mg/kg telesnej hmotnosti, alebo približne 0,01 až 10 mg/kg telesnej hmotnosti alebo približne 1 až 5 mg/kg telesnej hmotnosti alebo približne 2 mg/kg telesnej hmotnosti.

Vynález sa týka použitia nukleokyselinovej molekuly na výrobu lieku na liečenie a/alebo prevenciu neurologického ochorenia, pričom nukleokyselinová molekula obsahuje nukleokyselinovú sekvenciu kódujúcu polypeptid obsahujúci aminokyselinovú sekvenciu vybranú zo skupiny, ktorá zahŕňa:

(a) polypeptid obsahujúci sekv. č. 1;

(b) polypeptid obsahujúci aminokyseliny 1 až 168 alebo 170 sekv. č. 1;

(c) polypeptid obsahujúci aminokyseliny 1 až 16 a 170 až 314 sekv. č. 1;

(d) polypeptid obsahujúci aminokyseliny 170 až 314 sekv. č. 1;

(e) polypeptid obsahujúci sekv. č. 2;

(f) polypeptid obsahujúci sekv. č. 3;

(g) muteín ktoréhokoľvek polypeptidu podľa (a) až (f), ktorého aminokyselinová sekvencia je aspoň na 40 % alebo 50 % alebo 60 % alebo 70 % alebo 80 % alebo 90 % zhodná s aspoň s jednou zo sekvencií v (a) až (f);

-46 (h) muteín ktoréhokoľvek polypeptidu podľa (a) až (f), ktorý je kódovaný DNA sekvenciou hybridizujúcou s komplementom natívnej DNA sekvencie kódujúcej ktorýkoľvek polypeptid podľa (a) až (f) v mierne prísnych podmienkach alebo vo veľmi prísnych podmienkach;

(i) muteín ktoréhokoľvek polypeptidu (a) až (f), pričom akákoľvek zmeny v aminokyselinovej sekvencií sú konzervatívne aminokyselinové substitúcie v aminokyselinových sekvenciách v (a) až (f);

(j) izoformu, fúzovaný proteín, funkčný derivát, aktívnu frakciu alebo cirkulárne permutovaný derivát ktoréhokoľvek podľa (a) až (f).

Nukleová kyselina sa môže podávať napr. ako nahá nukleokyselinová molekula, napr. intramuskulárnou injekciou.

Môže zahŕňať aj vektorové sekvencie, ako napríklad vírusovú sekvenciu, užitočné na expresiu génu kódovaného nukleokyselinovou molekulou v ľudskom tele, výhodne vo vhodných bunkách alebo tkanivách.

Preto vo výhodnom uskutočnení nukleokyselinová molekula ďalej obsahuje expresnú vektorovú sekvenciu. Expresné vektorové sekvencie sú v oblasti dobre známe, obsahujú ďalšie elementy slúžiace na expresiu génu, o ktorý je záujem. Môžu obsahovať regulačnú sekvenciu, ako napríklad promótor a zosilňovacie sekvencie, sekvencie selekčných markerov, počiatky množenia a podobne. Génový terapeutický prístup sa tak používa na liečenie a/alebo prevenciu choroby. Výhodne sa potom expresia osteopontínu bude uskutočňovať in situ.

Vo výhodnom uskutočnení je expresným vektorom vektor odvodený od lentivírusu. Lentivírusové vektory sa ukázali ako veľmi účinné na prenos génov, najmä vo vnútri CNS. Podľa vynálezu sa môžu používať aj iné dobre zavedené vírusové vektory, ako napríklad vektory odvodené od adenovírusov.

Zacieľovací vektor sa môže používať na posilnenie prechodu osteopontínu cez krvno mozgovú bariéru. Cieľom takýchto vektorov môže byť napríklad transferínový receptor alebo iné endoteiiálne transportné mechanizmy.

Vo výhodnom uskutočnení vynálezu sa expresný vektor môže podávať intramuskulárnou injekciou.

Predložený vynález zahŕňa aj použitie vektora na indukciu a/alebo zosilnenie endogénnej produkcie osteopontínu v bunke, ktorá normálne neexprimuje

-47osteopotín, alebo v bunke, ktorá exprimuje osteopontín v nedostatočnom množstve. Vektor môže obsahovať regulačné sekvencie funkčné v bunkách, v ktorých je požadovaná expresia osteopontínu. Takýmito regulačnými sekvenciami môžu byť napríklad promótory alebo zosilňovače. Regulačná sekvencia sa potom môže zaviesť do vhodného lokusu genómu homologickou rekombináciou, čím sa môže operatívne spojiť regulačná sekvencia s génom, ktorého expresia má byť indukovaná alebo zosilnená. Táto technológia sa zvyčajne označuje ako „endogénna génová aktivácia“ (EGA) a je opísaná napr. vo WO 91/09955.

Vynález sa ďalej týka použitia bunky, ktorá bola geneticky modifikovaná na produkciu osteopontínu na výrobu lieku na liečenie a/alebo prevenciu neurologických ochorení.

Vynález sa ďalej týka bunky, ktorá bola geneticky modifikovaná na produkciu osteopontínu na výrobu lieku na liečenie a/alebo prevenciu neurologických ochorení. Takže bunkový terapeutický prístup môže byť použitý na dodávanie lieku do vhodných častí ľudského tela.

Vynález sa ďalej týka farmaceutických prostriedkov, výnimočne užitočných na prevenciu a/alebo liečenie neurologických ochorení, ktoré obsahujú terapeuticky účinné množstvo osteopontínu a terapeuticky účinné množstvo interferónu, voliteľne aj terapeuticky účinné množstvo imunosupresíva.

Definícia „farmaceutický prijateľný“ je mienená ako zahŕňajúca akýkoľvek nosič, ktorý neinterferuje s účinnosťou biologickej aktivity aktívnej zložky, a ktorý nie je toxický pre hostiteľa, ktorému sa podáva. Napríklad na parenterálne podávanie môže byť aktívny proteín (proteíny) formulovaný v jednotkovej dávkovej forme pre injekciu vo vehikulách, akými sú napríklad fyziologický roztok, dextrózový roztok, sérový albumín a Ringerov roztok.

Aktívne zložky farmaceutického prostriedku podľa vynálezu sa môžu jedincovi podávať rôznymi spôsobmi. Spôsoby podávania zahŕňajú intradermálne, transdermálne (napr. v pomaly uvoľňujúcich formuláciách), itramuskuláre, intraperitoneálne, intravenózne, subkutánne, orálne, epidurálne, topické a intranazálne spôsoby. Použitá môže byť akákoľvek iná terapeuticky účinná cesta podania, ako napríklad absorpcia cez epiteliálne alebo endoteliálne tkanivá alebo génová terapia, pri ktorej sa DNA molekula kódujúca aktívne činidlo podáva

-48pacientovi (napr. prostredníctvom vektora), čo spôsobuje, že sa aktívne činidlo exprimuje a vylučuje in vivo. Okrem toho, proteín (proteíny) podľa vynálezu sa môže podávať spolu s inými zložkami biologicky aktívnych činidiel, ako napríklad s farmaceutický prijateľnými povrchovo aktívnymi látkami, excipientami, nosičmi, riedidlami a vehikulami.

Na parenterálne (napr. intravenózne, subkutánne, intramuskulárne) podanie môže byť aktívny proteín (proteíny) formulovaný ako roztok, suspenzia, emulzia alebo lyofilizovaný prášok v asociácii s farmaceutický prijateľným parenteráinym vehikulom (napr. vodou, fyziologickým roztokom, dextrózovým roztokom) a aditívami, ktoré udržiavajú izotonicitu (napr. manitolom) alebo chemickú stabilitu (napr. s konzervačnými látkami a tlmivými roztokmi). Formulácia sa sterilizuje bežne používanými technikami.

Biologická dostupnosť aktívneho proteínu (proteínov) podľa vynálezu môže byť zlepšená aj použitím konjugačných postupov, ktoré predlžujú polčas rozpadu molekuly v ľudskom tele, napríklad pripojením molekuly na polyetylénglykol, ako je opísané v PCT prihláške vynálezu WO 92/13095.

Terapeuticky účinné množstvo aktívneho proteínu (proteínov) bude funkciou mnohých premenných, vrátane typu receptora, afinity látky podľa vynálezu voči jej receptoru, akejkoľvek zvyškovej cytotoxickej aktivity, ktorú vykazuje, spôsobu podávania, klinického stavu pacienta (vrátane požiadavky udržať netoxickú úroveň endogénnej osteopontínovej aktivity).

„Terapeuticky účinné množstvo“ je také množstvo, že keď sa v ňom podáva osteopontín, tak vykazuje užitočný účinok na neurologické ochorenie. Dávka, jednoitá alebo multiplicitná, podávaná jednotlivcovi sa bude meniť v závislosti na rôznych faktoroch, vrátane osteopontínových farmakokinetických vlastnosti, spôsobu podávania, pacientovho stavu a vlastností (pohlavie, vek, telesná hmotnosť, zdravie, veľkosť), rozsahu symptómov, súbežných ošetrení, frekvencii liečenia a požadovaného účinku.

Ako bolo uvedené vyššie, osteopontín sa môže výhodne používať v množstve približne 0,0001 až 10 mg/kg alebo približne 0,01 až 5 mg/kg telesnej hmotnosti alebo približne 0,01 až 5 mg/kg telesnej hmotnosti alebo približne 0,1 až 3 mg/kg telesnej hmotnosti alebo približne 1 až 2 mg/kg telesnej hmotnosti. Ďalšími

-49výhodnými množstvami osteopontínu sú množstvá približne 0,1 až 1000 pg/kg telesnej hmotnosti alebo približne 1 až 100 pg/kg telesnej hmotnosti alebo približne až 50 pg/kg telesnej hmotnosti.

Spôsobom podávania, ktorý je výhodný podľa vynálezu je podávanie subkutánnym spôsobom. Aj intramuskulárne podávanie je výhodným podľa vynálezu.

V ďalších výhodných uskutočneniach sa osteopontín podáva denne alebo každý druhý deň.

Denné dávky sú zvyčajne podávané v rozdelených dávkach alebo vo forme s nepretržitým uvoľňovaním, ktorá je účinná na získanie požadovaných výsledkov. Druhé alebo následné podania sa môžu uskutočňovať v dávke, ktorá je rovnaká, nižšia alebo vyššia ako počiatočná alebo predchádzajúca dávka podávaná jedincovi. Druhé alebo následné podanie sa môže podávať v priebehu alebo pred nástupom ochorenia.

Podľa vynálezu sa osteopontín môže podávať profylaktický alebo terapeuticky jedincovi pred, súčasne alebo postupne s inými terapeutickými režimami (napr. režimami s viacerými liekmi) v terapeuticky účinnom množstve, najmä s interferónom. Aktívne činidlá, ktoré sa podávajú zároveň s inými terapeutickými činidlami, sa môžu podávať v tom istom, alebo v rôznych prostriedkoch.

Vynález sa ďalej týka spôsobu liečenia neurologického ochorenia, ktorý zahŕňa podávanie účinného množstva osteopontínu alebo agonistu osteopontínovej aktivity, voliteľne spolu s farmaceutický prijateľným nosičom, pacientovi, ktorý to potrebuje.

Spôsob liečenia neurologického ochorenia zahŕňa podávanie účinného množstva osteopontínu alebo agonistu osteopontínovej aktivity a interferónu, voliteľne spolu s farmaceutický prijateľným nosičom pacientovi, ktorý to potrebuje, tiež spadá do rozsahu predloženého vynálezu.

Zahrnuté sú tu všetky citované referencie, vrátane časopisových článkov alebo abstraktov, zverejnených alebo nezverejnených US alebo zahraničných prihlášok vynálezov, vydaných US alebo zahraničných patentov alebo akékoľvek iné referencie, prostredníctvom ich citácie, vrátane všetkých údajov, tabuliek, obrázkov

-50a textov, ktoré sa v nich nachádzajú. Okrem toho sú tu prostredníctvom citácie zahrnuté aj kompletné obsahy referencií citovaných v tu uvedených referenciách.

Odvolávanie sa na známe spôsobové kroky, bežné spôsobové kroky, známe metódy alebo bežné metódy nie je v žiadnom prípade mienené ako skutočnosť, že akýkoľvek aspekt, opis aiebo uskutočnenie predloženého vynálezu je opísané, vysvetlené alebo navrhnuté v relevantnom stave techniky.

Vyššie uvedený opis špecifických uskutočnení tak kompletne odhaľuje všeobecnú povahu vynálezu, že ostatní môžu prostredníctvom aplikovania vedomostí spadajúcich do rozsahu vedomostí priemerného odborníka v oblasti (vrátene obsahov tu citovaných referencií) jednoducho modifikovať a/alebo adaptovať rôzne aplikácie takýchto špecifických uskutočnení bez nadmerného experimentovania, bez toho, aby prekročili všeobecný koncept predloženého vynálezu. Preto sú takéto adaptácie a modifikácie mienené ako spadajúce do rozsahu ekvivalentov opísaných uskutočnení na základe tu prezentovaného opisu a návodu. Musí byť zrejmé, že tu použitá frazeológia alebo terminológie je prispôsobená účelu opisu a nie je obmedzujúca, takže terminológia alebo frazeológia predloženého opisu musí byť priemerným odborníkom interpretovaná vo svetle tu prezentovaného opisu a návodu, v kombinácii s vedomosťami priemerného odborníka v oblasti.

Vyššie opísaný vynález bude možné jednoduchšie pochopiť prostredníctvom odvolania sa na nasledujúce príklady, ktoré sú poskytnuté ako ilustrácia, a nie sú mienené ako obmedzujúce predložený vynález.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Na obrázku 1A je histogram znázorňujúci hladiny osteopontínovej expresie po rôznych časoch liečenia s kuprizónom, ako bolo merané TaqMan® analýzou. 3/5 w. Cup znamená tri alebo päť týždňov liečenia s kuprizónom, 5 w. cup + 1/3/6 w. znamená päť týždňov liečenia s kuprizónom a po vysadení kuprizónu jeden/tri alebo šesť týždňov zotavovania.

Obrázok 1B znázorňuje zmiešanú reguláciu osteopontínovej, MBP a PLP mRNA v porovnaní s kontrolnými C1 hladinami, ako bolo merané prostredníctvom

-51 TaqMan® v rôznych štádiách vývoja malého mozgu. C 1 až 20 znamená postnatálny malý mozog v dňoch 1 až 20, CA znamená dospelý malý mozog.

Obrázok 2 schematicky znázorňuje štruktúru osteopontínu a jeho známych izoforiem, ako aj C a N terminálnych konštruktov.

Obrázok 3 schematicky znázorňuje plazmid Pac obsahujúci kódujúcu sekvenciu pre osteopontín.

Obrázok 4 znázorňuje histogram ilustrujúci zmiešanú reguláciu osteopontínovej mRNA v oligodendrocytovej bunkovej línii oli-neu ošetrovanej s cAMP 6 hodín (1), 2 dni (2), 6 dní (3) alebo 10 dní (4), v porovnaní s kontrolou. Stĺpce 5 a 6 znázorňujú osteopontíové mRNA hladiny z kuprizónového experimentu. (5): 3 týždne kuprizónového liečenia, (6): 5 týždňov kuprizónového liečenia.

Obrázok 5 schematicky znázorňuje plazmid pDEST 12.2 obsahujúci sekvenciu kódujúcu osteopontín.

Obrázok 6 schematicky znázorňuje plazmid pDEST 12.2 obsahujúci sekvenciu kódujúcu osteopontín a sekvenciu kódujúcu EGFP - fluorescenčný marker.

Obrázok 7 schematicky znázorňuje plazmid pDEST 12.2 obsahujúci sekvenciu kódujúcu osteopontín s HIS-príveskom.

Obrázok 8 znázorňuje proliferáciu oli-neu buniek po inzulínovom hladovaní a 24 hodinovom pôsobení s osteopontínom exprimovaným v bakulovíruse (BaculoOPN) alebo s osteopontínom exprimovaným v HEK bunkách (HEK-OPN). Odčítava sa fluorescencia Alamar Blue, čo je farbička farbiaca živé bunky.

Obrázok 9 znázorňuje dávkovú responzívnu krivku proliferácie oli-neu buniek po inzulínovom hladovaní po 24 hodinovom pôsobení s osteopontínom exprimovaným bakulovírusom (BAC-OPN) alebo osteopontínom exprimovaným v HEK bunkách (HEK-OPN).

Obrázok 10 znázorňuje proliferáciu oli-neu buniek po inzulínovom hladovaní a pôsobení s kompletným osteopontínom exprimovaným bakulovírusom (BacOP) alebo N-koncovým fragmentom osteopontínu (N-terminálny BacOPN).

Obrázok 11 znázorňuje MBP imunohistochémiu v zmiešaných kortikálnych kultúrach ošetrených so 100 nM rekombinantného osteopontínu exprimovaného

- 52 bakulovírusom. A = kontrola; B = OPN pôsobenie; C = zväčšenie B; D = iné pole OPN ošetrených zmiešaných kortikálnych buniek, kde nie sú viditeľné žiadne axóny.

Obrázok 12 znázorňuje nárast MBP proteínu v myelinizujúcich, zmiešaných kortikálnych kultúrach po LIF a po ošetrení s osteopontínom exprimovaným bakulovírusom, ako bolo merané prostredníctvom ELISA.

Obrázok 13 znázorňuje proliferáciu CG4 buniek po ošetrení s rôznymi dávkami (10 pM, 10 nM, 100 nM) osteopotínu exprimovaného v E. coli a fosforylovaného in vitro (OPN-E-coli) alebo osteopontínom exprimovaným bakulovírusom (OPN Bac).

Obrázok 14 znázorňuje perivaskulárne zápalové infiltráty prítomné v miechách EAE myší ošetrených subkutánne vehikulom (PBS), vehikulom a 0,1% BSA, 1, 10 alebo 100 pg/kg AS900011 (osteopontín) alebo kombináciou 100 pg/kg AS900011 a 20000 U/myš myšacieho interferónu beta (mlFN3) alebo len 20000 U/myš mIFNp.

Obrázok 15 znázorňuje percento demyelizovanej oblasti v miechách EAE myší ošetrených subkutánne vehikulom (PBS), vehikulom a 0,1% BSA, 1,10 alebo 100 pg/kg AS900011 (osteopontín) alebo komináciou 100 pg/kg AS900011 a 20000 U/myš myšacieho interferónu beta (mIFNp) alebo len 20000 U/myš mIFNp.

Obrázok 16 znázorňuje klinické skóre na konci liečenia, zápalové infiltrácie a demyelinizáciu u EAE myší ošetrených subkutánne vehikulom (PBS), vehikulom a 0,1% BSA, 1,10 alebo 100 pg/kg AS900011 (osteopontín) alebo kombináciou 100 pg/kg AS900011 a 20000 U/myš myšacieho interferónu beta (mIFNp) alebo len 20000 U/myš mIFNp.

Obrázok 17 znázorňuje telesnú hmotnosť neuropatických myší indukovaných rozmliaždením sedacieho nervu, ošetrených vehikulom, 1, 10 alebo 100 pg/kg osteopontínu (Ost), 10 pg/kg pozitívnej kontrolnej zlúčeniny (4-MC) alebo 100 pg/kg denaturovaného osteopontínu (Ost-D).

Obrázok 18 znázorňuje amplitúdu zloženého svalového akčného potenciálu neuropatických myší ošetrených vehikulom, 1, 10 alebo 100 pg/kg osteopontínu (Ost), 10 pg/kg pozitívnej kontrolnej zlúčeniny (4-MC) alebo 100 pg/kg denaturovaného osteopontínu (Ost-D).

-53Obrázok 19 znázorňuje latenciu zloženého svalového akčného potenciálu u neuropatických myší ošetrených vehikulom, 1, 10 alebo 100 pg/kg osteopontínu (Ost), 10 pg/kg pozitívnej kontrolnej zlúčeniny (4-MC) alebo 100 μg/kg denaturovaného osteopontínu (Ost-D).

Obrázok 20 znázorňuje trvanie zloženého svalového akčného potenciálu u neuropatických myší ošetrených vehikulom, 1, 10 alebo 100 pg/kg osteopontínu (Ost), 10 pg/kg pozitívnej kontrolnej zlúčeniny (4-MC) alebo 100 pg/kg denaturovaného osteopontínu (Ost-D).

Obrázok 21 znázorňuje percento degenerovaných svalových vlákien u neuropatických myší ošetrených vehikulom, 1, 10 alebo 100 pg/kg osteopontínu (Ost), 10 pg/kg pozitívnej kontrolnej zlúčeniny (4-MC) alebo 100 pg/kg denaturovaného osteopontínu (Ost-D).

Obrázok 22 znázorňuje celkový počet vlákien na oblasť u neuropatických myší ošetrených vehikulom, 1, 10 alebo 100 pg/kg osteopontínu (Ost), 10 pg/kg pozitívnej kontrolnej zlúčeniny (4-MC) alebo 100 pg/kg denaturovaného osteopontínu (Ost-D).

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Osteopontín sa odlišne exprimuje v in vivo a v in vitro modeloch demyelinizačných ochorení

Metódy

In vitro modelové systémy

Oli-neu bunková línia bola zavedená prostredníctvom imortalizácie oligodendrogliových prekurzorov s retrovírusom neschopným replikácie kódujúcim t-neu onkogén, konštitutívne aktívnu tyrozín kinázu: ukázalo sa, že diferenciácia tejto bunkovej línie sa indukuje v prítomnosti 1mM dibutyryl-cAMP v kultivačnom médiu

-54(Jung a ďalší, 1995). To poskytuje možnosť študovať oligodendrocyty ako izolovaný bunkový typ.

Morfológia a antigénové charakteristiky buniek myšacej oligodendrocytovej bukovej línie Oli-neu odvodenej od A2B5 myšacích oiigodendrocytových prekurzorov sa podstatne líšia, keď nie sú ošetrené, a keď sú po 6 dňoch prodiferenciačného ošetrovania s 1 až 5 mM dibutyrylcAMP. Zatiaľ čo neošetrené Olineu bunky majú guľatý tvar a sú poväčšine bipolárne ako oligodendrocytové prekurzorové bunky, bunky ošetrené s cAMP generujú zmnožovacie procesy, majú plochý fenotyp a aj produkujú ploché, predĺžené štruktúry podobné puzdru.

Okrem toho, môže byť na umožnenie vizualizácie funkčného myelínu in vitro použitý in vitro myelinizačný test využívajúci zmiešané kortikálne kultúry. Tento systém poskytuje možnosť študovať, ako oligodendrocyty kontaktujú myelínové axóny v prítomnosti iných typov CNS buniek (Lubetzki a ďalší, 1993). V tomto systéme sa môžu testovať biologické faktory, ktoré by mohli ovplyvňovať proliferáciu oiigodendrocytových prekurzorov, alebo ktoré by mohli vplývať na diferenciáciu a prežívanie oligodendrocytov, ako napríklad faktorov, ktoré by mohli ovplyvňovať formovanie typických myelínových segmentov. Potreba študovať proces myelinizácie in vitro viedla k vývoju celého rádu testovacích typov, vrátane agregačných mozgových bunkových kultúr (Matthieu a ďalší, 1992), kultúr rezov malého mozgu (Notterpek a ďalší, 1993) a kokultivačných systémov (Shaw a ďalší, 1996; Barres a ďalší, 1993). Tieto modely majú tú výhodu, že umožňujú štúdium správania sa oligodendrocytov v spojení s inými bunkovými typmi a to, ako sa tieto bunky stimulujú na produkciu myelínu. Demyelinizácia sa v takýchto systémoch môže vyprovokovať aj špecifickými inzultáciami a môže sa študovať aj proces remyelinizácie.

In vivo modelové systémy

Existuje široký rozsah experimentálnych in vivo a in vitro modelov pre sklerózu multiplex. Väčšina in vivo modelov sa týka klasického zvieracieho modelu MS, experimentálnej alergickej endefalomyelitídy (EAE). Existuje veľa variantov tohto modelu, ktoré boli adaptované na použitie na široký rozsah cicavčích organizmov, vrátane myšacích, potkaních a primátových systémov (zhrnutie v Petry

-55a ďalší, 2000). Okrem toho boli formulované metodológie na „napodobovanie“ navrhnutého vírusového komponentu MS na zvieracích modeloch, ako napríklad encefalitogénny Theilerov myšací vírusový model MS (Dal Canto a ďalší, 1995).

Zvieracie modely na exkluzívne študovanie myelinizácie v CNS alebo PNS sa používajú menej často. Ukázalo sa ako užitočné pozorovať proces vývojovej myelinizácie, aby sa získalo určité pochopenie mechanizmov, ktoré stoja za diferenciáciou, migráciou a proliferáciou oligodendrogliových alebo Schwannových buniek, v súlade s „rekapitulačnou hypotézou“ (Franklin a Hinks, 1999). Avšak na porovnanie vývojovej myelinizácie, ktorá nastáva ešte počas formovania CNS alebo PNS, a remyelinizácie, ktorá nastáva v dospelom paradigme, bolo nevyhnutné formulovať modely, ktoré sa špecificky týkajú procesu remyelinizácie.

Kuprizónový model

Jedným z najznámejších a najviac používaných remyelinizačných modelov je kuprizónový model remyelinizácie u myší. Tento zahŕňa orálne podávanie organickej zlúčeniny, kuprizónu, chelatátora medi, ktorý sa ukázal byť selektívne toxický voči oligodendrocytom (Morell a ďalší, 1998)

Demyelinizácia a remyelinizácia nastáva vo svorovom telese myší ošetrených s kuprizónom. Tieto patologické stavy je možné vizualizovať farbením s anti-CNPázovou protilátkou alebo MBP protilátkou. Myelín sa farbí s Luxol Fast Blue-periodic acid Schiff (LFB-PAS). Remyelinizujúce oligodendrocytové prekurzory je možné vizualizovať použitím protilátok pre PDGFa receptor alebo NG2.

Podávanie kuprizónu myšiam v priebehu 3 až 5 týždňov vedie k extenzívnej demyelinizácii svorového telesa. Po 3 týždňoch podávania kuprizónu sa spolu s demyelinizáciou nadreguluváva syntéza myelín špecifických génových transkriptov (Morell a ďalší, 1998).

Následné ukončenie kuprizónového režimu vytvára prostredie vedúce k zotaveniu, takže po 6 týždňoch od ukončenia podávania kuprizónu myši vykazujú extenzívnu remyelinizáciu vo svorovom telese. Takže kuprizónový model poskytuje kompletný in vivo vzor, na ktorom sa študujú aspekty demyelinizácie a remyelinizácie. Jeho výhody zahŕňajú neprítomnosť T bunkovej infiltrácie do CNS

-56tkaniva, čo umožňuje exkluzívnejšie študovanie myelinizačných procesov, ako aj reproducibilitu výsledkov (Hiremath a ďalší, 1998).

Na kuprizónové ošetrenie sa v štúdii použili C57BL/6 samičky myší (8 týždňové, 20 ± 3g), pričom štúdia zahŕňala 6 skupín po 6 zvierat.

Skupina 1: kontrolná skupina kŕmená normálnym práškovým krmivom;

Skupina 2: kŕmená 3 týždne práškovým krmivom obsahujúcim 0,2% kuprizón (Cup3w);

Skupina 3: kŕmená 5 týždňov práškovým krmivom obsahujúcim 0,2% kuprizón (Cup5w);

Skupina 4: kŕmená 5 týždňov práškovým krmivom obsahujúcim 0,2% kuprizón a potom nasledoval 1 týždeň zotavovania na normálnom práškovom krmive (1wR); Skupina 5: kŕmená 5 týždňov práškovým krmivom obsahujúcim 0,2% kuprizón a potom nasledovali 3 týždne zotavovania na normálnom práškovom krmive (3wR); Skupina 6: kŕmená 5 týždňov práškovým krmivom obsahujúcim 0,2% kuprizón a potom nasledovalo 6 týždňov zotavovania na normálnom práškovom krmive (6wR).

Mozgy sa odoberali zvieratám v každej skupine na konci každého ošetrovania vo fixovaných časoch. Myši sa najprv anestetizovali a perfuzovali prostredníctvom ľavej komory. Odobrali sa mozgy a urobili sa seriálne kronálne rezy na úrovni svorového telesa caudate putamen (striatum) a hypokampu. Rezy mozgového tkaniva sa obalili do parafínu na imunohistochemické študovanie a na in situ hybridizáciu.

Príprava histologického tkaniva

Formalín sa pripravil riedením 1 objemu formaldehydu (Fluka, 36% p.a.) a 1 objemu sterilného PBS s 8 objemami sterilnej vody. Silikónová skúmavka upravená na peristaltickú pumpu a vybavené s 20G 1-1/5 ihlou sa naplnila 10 ml PBS. Skúmavka sa potom kontinuálne napĺňala 40 ml formalínu, pričom sa dávalo pozor na to, aby sa zabránilo vytváraniu vzduchových bublín.

Zvieratá sa anestetizovali s pentobarbitalom sodným (Sanofi®) riedeným v pomere 1:1 so sterilným PBS na koncentráciu 3 mg/100 ml, pred intrakardiálnou perfúzou s fixatívom, aby sa umožnila následná histologická analýza orgánov a tkanív. Každá myš dostala 0,05ml (0,75 mg/kg) intraperitoneálnu injekciu. Keď boli zvieratá ospalé, ich končatiny sa fixovali špendlíkmi (25G 5/8 ihlami) cez kožu na Styrofoam dosku. Brucho každého zvieraťa sa očistilo etanolom a sterilnými nožnicami sa urobil rez na koži na úrovni externo. Brucho sa potom ďalej rozrezalo na pravú a na ľavú stranu. Externo sa potom nadvihlo párom lekárskych klieští a diagonálnym rezom sa otvorila bránica a kolmo na rozštiepenia sa urobil bilaterálny rez, aby sa exponovala hrudná dutina s bijúcim srdcom v strede. Srdce sa držalo lekárskymi kliešťami a prvá predsieň sa hneď narezala, aby sa umožnilo vytekanie krvi z ciev. Umožnila sa cirkulácia 10 ml PBS a následne 40 ml formalínu u každej myši. Mozog a miecha každého zvieraťa sa opatrne vyrezali a umiestnili do 10 ml formalínového roztoku v 50ml Falcon® skúmavke na 2 hodiny. Formalínový roztok sa potom zamenil za 10 ml sterilného PBS a materiál sa nechal cez noc pri +4 °C. PBS roztok sa potom znova vymenil a materiál sa nechal pri +4 °C niekoľko hodín. Mozgové hemisféry a miecha sa porezali na približne 0,5cm rezy a umiestnili sa do plastických košíkov kompatibilných s inklúznym strojom. Zabalenie mozgu a miechy do parafínu sa urobilo použitím automatického Tissue Tek Vacuum Infiltration Processor E150/E300 (Miles Inc. Diagnostics) podľa nižšie opísaného programu:

minút v 50% etanole minút v 70% etanole minút v 70% etanole minút v 80% etanole minút v 80% etanole minút v 96% etanole minút v 96% etanole

120 minút v 96% etanole minút v 100% xyléne minút v 100% xyléne

Štyri 60 minútové inkubácie v parafíne (Histosec, Merck 11609); čo je posledné štádium obaľovania.

Všetky roztoky sa udržiavali pri 40 °C, s parafínom pri 65 °C. Keď boli tkanivové rezy pripravené, mozgové a miechové rezy sa umiestnili v požadovanej

-58orientácii na plastické komory na inklúziu parafínových blokov. Vliala sa parafínová tekutina a nechala sa rýchlo ochladiť na 0 °C na chladenej platni. Parafínové bloky sa spracovali na mikrotome, aby sa pripravili rezy (5 až 10μιτι). Rezy sa potom nasadili na silánom ošetrené sklenené podložné sklíčka (SuperFrost-Plus™, Mezel kat. č. 041300). Po nasadení sa sklíčka uskladnili v bezprašnom priestore.

Bunková kultúra

Oli-neu: Bunky z myšacej oligodendrocytovej bunkovej línie (Oli-neu) sa obohatili prostredníctvom centrifugácie a resuspendovali sa v Sato médiu (Trotter a ďalší, 1989). Bunky sa kultivovali v 75ml fľašiach pri 37 °C a v 5% CO₂ kontrolovaných podmienkach. Diferenciácia sa uskutočňovala s 1mM dbcAMP pridávaným priamo do bunkového kultivačného média. RNA sa extrahovala použitím trizolovej metódy (pozri nižšie).

RNA izolácia

Celková RNA sa izolovala z Oli-neu buniek, z rezov myšacieho mozgu ošetrených kuprizónom a kompletných myšacích mozgov po narodení v rôznych štádiách vývoja použitím Tri-ZOL® extrakčného protokolu (Life Technologies AG, Basel, Švajčiarsko). Poly(A)* RNA sa pripravila izoláciou celkových RNA vzoriek použitím Qiagen OLIGOTEX™ kolón (QIAGEN Inc., 28159 Stanford Avenue, Valencia, CA 91355, USA).

DGE analýza použitím cDNA mikrorádov

Mikrorádové experimenty sa uskutočňovali na Incyte Genomics (Incyte Genomics Inc., 3160 Porter Drive, Palo Alto, California 94304, USA). DGE analýza sa uskutočňovala použitím Incyte’s Mouse GEM™ 1 génového expresného mikrorádu (http://www.incyte.com/reagents/gem/products.shtml).

Na Incyte čipy použité v týchto rádoch sa naniesli cDNA molekuly zodpovedajúce 8734 génom, tak známym, ako aj neznámym (EST sekvencie). Incyte technológia umožňuje, aby sa mikro vzorky každého z týchto génov naniesli na jeden rád. Každá cDNA molekula zodpovedajúca známemu génu alebo EST bola dlhá 500 až 5000 bp. Incyte špecifikácie poskytli detegovateľný dynamický

-59rozsah 2 až 2000 pg na jednotlivú mRNA vo vzorke. Množstvo RNA potrebné pre každý rádový experiment bolo 600 ng poly(A)⁺ RNA. Pomery vyššie ako 1,75 sa určili ako úrovne detegovateľnej rozdielnej expresie.

Normalizácia signálu a determináciu úrovne expresie

Pomery vypočítané z 2 fluorescenčných intenzít poskytujú kvantitatívnu mierku relatívnej úrovne expresie v 2 bunkových vzorkách, ktoré boli analyzované. Pomery priradené každému génu sa vypočítali na základe normalizovaných úrovní expresie. Normalizačný faktor sa vypočítal vydelením celkovej expresie druhej vzorky (P₂) celkovou expresiou prvej vzorky (Pi). Tento faktor sa potom aplikuje na úroveň expresie každého génu v P₂. Po aplikácii tohto normalizačného kroku sa vypočítajú génové pomery podľa nasledujúceho pravidla:

Nech E je úroveň expresie daného génu vo vzorke 1 a E₂ je normalizovaná úroveň expresie rovnakého génu vo vzorke 2; ak E₂ > E₁₍ potom pomer = E₂/Ei, ak nie, potom pomer = E-|/E₂.

Keďže hybridizácia vzoriek sa uskutočňuje simultánne v kompetícii, Incyte čipová technológia je presnejšia pri určovaní relatívnych zmien expresie a stáva sa menej spoľahlivou pri meraní absolútnych úrovní expresie. Napriek tomu je možné použiť tieto hodnoty o úrovni expresie na porovnávanie párov vzoriek RNA populácii, ktoré nie sú v skutočnosti fyzicky porovnávané na čipe. Takéto in silico porovnávania sú menej spoľahlivé, ale poskytujú ďalšiu informáciu o mechanizmoch, ktoré by sa mohli aplikovať na testované systémy.

Výsledky

Modely použité na analýzu heterogénnej osteopontínovej expresie

Tabuľka IV znázorňuje modely, ktoré boli použité na extrakciu mRNA a na čipovú hybridizáciu (DGE analýza), ako bolo opísané vyššie.

Tabuľka IV

Modely používané pri DGE analýze

Modely	Ošetrenia	Kontroly
1. In vitro	Oli-neu bunky + dibutyryl-	Oli-neu bunky
oligodendrocytový	cAMP (6 hodín)	(neošetrené)
diferenciačný model	Oli-neu bunky + dibutyryl-	Oli-neu bunky
	cAMP (6 dní)	(neošetrené)
2. In vivo model	Dospelý frontálny mozog+	neošetrený dospelý
demyelinizácie	kuprizón (3 týždne)	frontálny mozog
kuprizónom a remyelinizácie	Dospelý frontálny mozog+	neošetrený dospelý
	kuprizón (5 týždňov)	frontálny mozog
	Dospelý frontálny mozog+	Dospelý frontálny mozog+
	kuprizón (3 týždne)	kuprizón (5 týždňov)
3. Vývojová myelinizácia	Malý mozog myši 10 dní	Mylý mozog myši dva dni
	po narodení (P10)	po narodení (P2)

Pozitívna kontrola pre DGE: Regulácia myelín špecifických génov.

Ako pozitívna kontrola sa najprv testovalo, či by bolo možné ukázať heterogénnu reguláciu myelín špecifických génov použitím DGE.

Tabuľka V znázorňuje reguláciu pozorovanú pre myelín špecifické gény prezentované na Incyte mikrorádoch. Rôzne hodnoty expresie pre každý gén sú uvedené tak pri 3-týždňových, ako aj pri 5-týždňových časových bodoch ošetrenia kuprizónom. Tento údaj je pozitívnou kontrolou na overenie spoľahlivosti čipu. Keďže je regulácia myelínových štrukturálnych génov v našich experimentálnych podmienkach dobre charakterizovaná, pozorovaná expresia týchto génov meraná na čipoch by mohla byť použitá na a) indikáciu presnosti technológie a b) na indikáciu reprodukovateľnosti našich modelov.

Tabuľka V

In vivo regulácia myelín špecifických génov v mikrorádových testoch na in vivo myelinizačných modeloch

Názov génu	Prístupové číslo	Cup 3 týž.	Cup 5 týž.	P 2/10*
Myelínový základný proteín	AA059540	113,6	11,3	+7,9
Myelínový vesikulárny	AA519027	33,5	11,7	0
proteín/myelín a lymfocytový proteín
(MVP/MAL)
Cyklická nukleotid fosfodiesteráza 1	W63987	22,9	11,1	+2,9

(CNPáza) *Postnatálny malý mozog deň 2/10

Vyššie uvedená tabuľka znázorňuje, ako sa niektoré myelín špecifické gény regulujú v mikrorádových testoch na RNA z rôznych in vivo modelov použitých na štúdium demyelinizácie, remyelinizácie a vývojovej myelinizácie. Zo zmien v expresii týchto myelín špecifických génov vyplýva, ako sa môže študovať proces myelinizácie na úrovni transkripčnej regulácie použitím mikrorádov.

Po troch týždňoch podávania kuprizónu sa môže demyelinizačný efekt pôsobenia vizualizovať v špecifických oblastiach mozgu myši. Preto sa po 3 týždňoch očakávalo pozorovanie zníženej modulácie rôznych génov asociovaných s myelínovou syntézou a/alebo udržiavaním myelínu. Zníženie regulácie myelín špecifických génov sa pozorovalo prostredníctvom mikrorádu slúžiaceho ako potvrdenie presnosti a spoľahlivosti experimentálneho systému. Údaje prezentované v tabuľke V ukazujú, že hladiny mRNA pre MBP sú znížené 13,6násobne a hladiny pre cyklickú nukleotidfosfodiesterázu 1 (CNPázu) sú znížené 2,9 násobne, pričom boli redukované po 3 týždňoch ošetrovania kuprizónom v porovnaní s kontrolami. Avšak RNA hladiny oboch týchto génov sa vrátili na 1,3- a 1,1-násoboch pod normálnymi hladinami po 5 týždňoch ošetrovania s kuprizónom, z čoho vyplýva, že biologický systém sa snažil zaviesť remyelinizáciu zosilnením syntézy štrukturálnych myelínových proteínov.

Heterogénna regulácia osteopontínu

Na čipe bol osteopontín nadregulovaný po 3 týždňoch (+2,2) a po 5 týždňoch (+2,8) pôsobenia kuprizónom.

-62Príklad 2

Potvrdenie heterogénnej génovej expresie osteopontínu prostredníctvom kvantitatívneho reverzného transkriptázového PCR testu v reálnom čase (RT-PCR) (TaqMan®)

Metódy

Generovanie cDNA templátu cDNA templáty pre TaqMan® analýzu sa generovali z celkových RNA vzoriek prostredníctvom reverznej transkriptázy (RT) použitím TaqMan® reverzných transkriptázových reakčných činidiel (P/N N808-0234). Všetky RT reakcie sa uskutočňovali v 10ΟμΙ objeme obsahujúcom: 10 μΙ TaqMan RT tlmivého roztoku, 22 μΙ 25mM MgCb roztoku (5,5 mM), 20 μΙ deoxyNTPs zmesi (500 μΜ z každého dNTP), 5 μΙΙ náhodných hexamérov (2,5 mM), 2 μΙ RNázového inhibítora (0,4 U/μΙ), 2,5 μΙ MultiScribe™ reverznej transkriptázy (1,25 U/μΙ) a 38,5 μΙ RNA vzorky (1 pg celkovo) v H₂O bez RNázy. Reakcie sa uskutočňovali na Eppendorf Master Cykleri pri 25 °C 10 minút (inkubačný krok), pri 48 °C 30 minút (reverzná transkripcia) a pri 95 °C 5 minút (inaktivačný krok). Všetky syntetizované cDNA sa uskladňovali pri -20 °C v 20μΙ objemoch.

Návrh a verifikácia priméru

SYBR Green Reál Time PCR priame a reverzné primery pre všetky potvrdené gény a GAPDH (udržiavací gén ako kontrola) sa navrhli použitím Primer Express™ softwaru od PE Biosystems podľa zverejnených sekvencií a objednali sa v 0,02 μΜ koncentrácii od Interactiva (Interactiva: The Virtual Laboratory, Sedanstrasse 10, D-89077 Ulm). Pre každú primerovú sadu sa testovala špecificita a optimálne primerové koncentrácie. Potenciálna kontaminácia s genomickou DNA sa monitorovala uskutočňovaním PCR reakcií na negatívnych kontrolných cDNA vzorkách, ktoré sa podrobili reverzným transkriptázovým reakciám bez prítomnosti RT enzýmu. Neprítomnosť nešpecifickej amplifikácia sa potvrdila analyzovaním

-63PCR produktov agarózovou gélovou elektroforézou na 3,5% MetaPhor géloch alebo na vopred naliatych NuSieve® 4% géloch.

V nižšie uvedenej tabuľke sú sekvencie génovo špecifických primérov navrhnutých na uskutočňovanie TaqMan® analýzy na potvrdenie heterogénnej expresie génov, ktoré sa ukázali byť heterogénne regulované na mikrorádoch. Mená génov zodpovedajúce každému primerovému páru a GenBank prístupové číslo sekvencie použitej na návrh každého primeru s PrimerExpress™ softwarom sú taktiež uvedené.

Tabuľka VI

Primery použité na RT-PCR analýzu

Názov génu	Prístupové číslo	Názov TaqMan®OLIGO	TaqMan® OLIGO sekvencia
Sekretovaný	AA 108928	Osteopontín-166F	AGCCTGCACCCA
fosfoproteín 1			GATCCTATAG
(osteopontín)
		Osteopontín-235R	GCGCAAGGAGAT
			TCTGCTTCT

TaqMan reakcie

SYBR Green Real-Time PCR sa uskutočňovala s 5 μΙ/jamku RT-produktov (0,5 mg celkovej RNA), 25 μΙ/jamku SYBR Green PCR master zmesi (Applied Biosystems, CA, USA), s AmpErase uracil N-glykozylázou (UNG) (0,5 jednotky/jamku) a 20 μΙ primérov (300 nM). PCR sa uskutočňovala pri 50 °C 2 minúty (na AmpErase UNG inkubovanie, aby sa eliminoval akýkoľvek potenciálny prenos prostredníctvom odstránenia uracilu inkorporovaného do PCR produktov generovaných z predchádzajúcich TaqMan kôl), pri 95 °C 10 minút (na AmpliTaq Gold aktiváciu). Potom vzorky bežali cez 40 cyklov pri 95 °C 15 sekúnd, pri 60 °C 1 minútu na ABI PRISM® 7700 sekvenčnom detekčnom systéme. Reverzne transkribované cDNA vzorky sa tak amplifikovali a determinovali sa ich Ct (prahový

-64cyklus) hodnoty. Všetky CT hodnoty sa normalizovali voči udržiavaciemu génu GAPDH. Kde to bolo možné, vzorky bežali dvojmo alebo trojmo, aby sa posúdila reproducibilita výsledku. Pri elektroforetickej analýze sa pozoroval jediný špecifický DNA pás pre všetky potvrdené gény a pre GAPDH.

Výpočet génovej regulácie prostredníctvom prahovej hodnoty cyku (Ct)

Princíp detekcie v reálnom čase použitím SYBR Green PCR master zmesi je založený na priamej detekcii PCR produktu prostredníctvom merania zvýšenia fluorescencie vytvorenej naviazaním SYBR Green farbičky na dvojvláknovú DNA. To umožňuje kvantifikáciu relatívneho zvýšenia génovo špecificky amplifikovaného produktu na základe PCR rastových kriviek.

Meranie špecifických cDNA druhov vo vzťahu ku kontrolnej vzorke sa uskutočňovalo kvantifikáciou cDNA konvertovanej z mediátorovej RNA zodpovedajúcej špecifickému génu vo vzťahu ku kalibračnej vzorke slúžiacej ako fyziologická referencia. Kalibrácia je poskytnutá prostredníctvom vzorky z kontroly alebo prostredníctvom normalizácie voči endogénnej kontrole (v tomto prípade GAPDH), aby sa započítala akákoľvek variabilita v počiatočnej koncentrácii a kvalite celkovej RNA použitej na generovanie templátových cDNA a pri konverzii účinnosti reverzných transkriptázových reakcií. Výpočet relatívnych kvantitatívnych hodnôt sa uskutočňoval tak, že sa zobrala priemerná Ct hodnota pre replikačné reakcie bežiace pre každú vzorku, vypočítajúc rozdiel (AC_T) v priemernom Ct medzi cieľovými vzorkami a endogénnymi kontrolami, odčítajúc priemer Ct kalibrátora pre cieľovú vzorku od ACt tejto cieľovej vzorky (AACt) a nakoniec sa vyjadrila relatívna kvantifikačná hodnota pre cieľovú vzorku ako 2'^MCt, aby sa posúdil rozsah nadalebo podregulácie génovej expresie.

Normalizácia fluorescenčných signálov v TaqMan® reakciách

SYBR Green-dsDNA komplexné fluorescenčné signály sa normalizovali voči pasívnej referencii alebo reakciám negatívnej kontroly neobsahujúcim žiadnu templátovú DNA. Normalizácia sa uskutočnila vydelením emisnej intenzity SYBR Green-dsDNA komplexu v experimentálnej reakcii emisnou intenzitou pasívnej referencie. Tak sa získal R_n (normalizovaný reporterový) pomer reakcie:

-65- R_n ⁺ = R_n hodnota reakcie zahŕňajúcej všetky komponenty vrátane templátovej DNA

- R_n = R_n hodnota nezreagovanej vzorky (bez templátovej DNA)

- AR_n = (Rn⁺) - (Rn) kde:

R_n ⁺ = (emisná intenzita SYBR Green-dsDNA komplexu)/PCR s templátom (emisná intenzita pasívnej referencie)

R_n = (emisná intenzita SYBR Green-dsDNA komplexu)/žiadny templát (emisná intenzita pasívnej referencie)

Výpočet násobnej regulácie z prahových hodnôt cyklu (Ct)

AR_n predstavuje veľkosť signálu generovaného danou sadou PCR podmienok pre špecifickú reakciu. Prahový parameter cyklu predstavuje mieru relatívneho zvýšenia amplifikácie génovo špecifického produktu, ktorá predstavuje relatívny nadbytok špecifického transkriptu v experimentálnej cDNA populácii. Je fixovaný ako cyklový bod, v ktorom sa prvý krát detegovalo štatisticky významné zvýšenie AR_n. Prahová hodnota je definovaná ako priemerná štandardná odchýlka R_n na skoré cykly, vynásobená nastaviteľným faktorom. Cyklický prahový parameter sa používa na kvantifikáciu heterogénnej génovej expresie. Špecifické hodnoty sa vypočítali pre každú génovo špecifickú rastovú krivku na základe bodu alebo cyklu, v ktorom sa detegovala vyššia fluorescenčná intenzita pozadia.

Všetky výpočty relatívnych kvantitatívnych hodnôt sa uskutočňovali tak, že sa zobrala priemerná Ct hodnota pre replikatívne reakcie bežiace pre každú vzorku, vypočítajúc rozdiel (ACt) v priemernej Ct medzi cieľovými vzorkami a endogénnymi kontrolami a odčítajúc priemernú Ct kalibrátora pre cieľovú vzorku od ACt cieľovej vzorky (AACt). Nakoniec sa relatívna kvantifikačná hodnota pre cieľovú vzorku vyjadrila ako 2^ÄÄCt, aby sa posúdil rozsah nad- a podregulácie génovej expresie.

Výsledky

Kvantitatívna reverzná transkriptázová (RT)-PCR (TaqMan) v reálnom čase poskytuje citlivý a spoľahlivý prístup na potvrdenie a objasnenie zmien v génovej expresii. TaqMan sekvenčný detektor (ABI PRISM® 7700 sekvenčný detekčný

-66systém, Applied Biosystems, Foster City, CA) integruje test založený na PCR s hardware/software prístrojovým vybavením, aby sa poskytol systém na kvantifikáciu nukleokyselinových sekvencií s vysokou účinnosťou. Tento kombinuje termálne cyklovanie, fluorescenčnú detekciu a aplikačný špecifický Software, aby sa umožnila detekcia zvýšenia množstva špecifického PCR produktu z cyklu na cyklus.

Expresia niekoľkých vysoko regulovaných génov identifikovaných mikrorádovou analýzou sa overila použitím TaqMan® platformy. V každom prípade, pokiaľ to bolo možné, bol zahrnutý časový priebeh pre každý modelový systém. Toto umožnilo zachytiť viac údajov týkajúcich sa toho, ako sa špecifické gény správajú v priebehu celého procesu:

Prostredníctvom TaqMan® mohli byť kvantifikované zmeny v génovej expresii priamou detekciou zvýšenia PCR produktu prostredníctvom merania fluorescencie vytvorenej naviazaním SYBR Green farbičky na dvojvláknovú DNA, reprezentovanú amplifikačnými produktmi špecifickými pre gén, ktorý sa testuje. Meranie špecifických cDNA druhov vo vzťahu ku kontrolnej vzorke sa uskutočňuje kvantifikáciou cDNA konvertovanej z mediátorovej RNA zodpovedajúcej špecifickému génu voči kalibrátorovej vzorke slúžiacej ako fyziologická referencia. Kalibrácia je poskytnutá prostredníctvom vzorky z kontroly alebo stavu bez ošetrenia. Relatívna kvantifikácia cDNA druhov sa vypočítava s normalizáciou voči GAPDH, aby sa počítalo s akoukoľvek variabilitou v počiatočnej koncentrácii a s kvalitou celkovej RNA použitej na generovanie templátových cDNA a s konverznou účinnosťou reverzných transkriptázových reakcií.

Expresia génu sekretovaného fosfoproteínu 1 (osteopontínu) sa analyzovala v časovej štúdii zasahujúcej demyelinizačný/remyelinizačný vzor asociovaný s kuprizónovým modelom.

Výsledky TaqMan experimentov pre osteopontínovú expresiu v kuprizónovom remyelinizačnom modeli sú znázornené na obrázku 1(A). Zistilo sa, že mRNA hladiny osteopontínu sú nadregulovaná 18 násobne v myšacích predných mozgoch po 3 týždňoch podávania kuprizónu (3wCup) a 25 krát po 5 týždňovom ošetrovaní (5wCup).

Osteopontínová expresia bola podregulovaná po 1, 3 a 6 týždňoch regenerácie, ktorá nasledovala po 5 týždňoch ošetrovania kuprizónom (5wCup +

-671w, 3w a 6wR). Z týchto zistení vyplýva dôležitá úloha osteopontínu v demyelinizačnej a remyelinizačnej fáze modelu, keďže remyelinizácia začína vtedy, keď ešte prebieha demyelinizácia.

Obrázok 1(B) znázorňuje výsledky osteopontínových expresných hladín vo vyvíjajúcom sa malom mozgu. Osteopontínová mRNA je prechodne nadregulovaná počas skorého postnatálneho vývoja, v dňoch C4 až C8, čo je čas, kedy sa začína myelinizácia v malom mozgu.

Z mikrorádových výsledkov vyplynula nadregulácia osteopontínu v myšacích predných mozgoch počas ošetrovania s kuprizónom. Táto analýza zachytáva profil osteopontínovej expresie tak, aby bola zahrnutá tak demyelinizačná, ako aj remyelinizačná fáza kuprizónového ošetrovania a ukazuje vrcholy osteopontínového expresného profilu v priebehu demyelinizačnej fázy kuprizónového ošetrovania a v priebehu zotavovacej periódy sa vracajú do blízkosti základných hladín.

Výsledky sú uvedené nižšie, v tabuľke VII.

Výsledky TaqMan® analýzy osteopontínovej expresie potvrdili jeho nadreguláciu v mozgoch myší kŕmených kuprizónom 3 a 5 týždňov.

Tabuľka VII

TaqMan® analýza osteopontínovej regulácie v kuprizónovom modeli

Typ tkaniva	Experiment	Expresné hladiny	Regulácia
Predný mozog	Cup. kontrola	1,00	kontrolná hladia
Predný mozog	Cup. kontrola	-1,32	znížená
Predný mozog	3w. Cup.	17,51	zvýšená
Predný mozog	3w. Cup.	23,43	zvýšená
Predný mozog	5w. Cup.	20,25	zvýšená
Predný mozog	5w. Cup.	23,43	zvýšená
Predný mozog	5w. Cup. + 1w. R.	1,79	zvýšená
Predný mozog	5w. Cup. + 1w. R.	3,32	zvýšená
Predný mozog	5w. Cup. + 3w. R.	2,95	zvýšená
Predný mozog	5w. Cup. + 3w. R.	4,56	zvýšená

Predný mozog	5w. Cup. + 5w. R.	-1,16	znížená
Predný mozog	5w. Cup. + 5w. R.	1,04	kontrolná hladina
Predný mozog	5w. Cup. + 5w. R.	1,07	kontrolná hladina

Príklad 3

Potvrdenie heterogénnej osteopontínovej expresie Northern blotom

Metódy

Príprava blotov

Pre špecifické gény sa testovala tkanivová špecificita expresie použitím myšacích multitkanivových Northern blotov (Clontech Labs, 1020 East Meadow Circle, Palo Alto CA). Tieto obsahovali 2 pg poly(A)* RNA na dráhu z rôznych tkanív dospelej myši. Oddelené bloty sa pripravili na analýzu heterogénnej expresie tak v in vitro, ako aj v in vivo situáciách. RNA izolované z mozgov myší ošetrovaných kuprizónom 3 týždne, 5 týždňov a v časových bodoch 1, 3 a 6 týždňov počas zotavovania (až do 6 týždňov) sa použili na jednu sadu blotov. Na druhú sadu sa použila kompletná mozgová RNA z rôznych postnatálnych štádií. Nakoniec sa pripravili časové série RNA z Oli-neu buniek rastúcich v kultúre a ošetrovaných rôzne dlho s dibutyryl-cAMP. Táto RNA sa použila na prípravu tretej sady blotov. Nové bloty sa použili s každou génovo špecifickou sondou, aby sa zaistila maximálna detekčná účinnosť, a aby sa minimalizovali odchýlky vo výsledkoch spôsobené nerovnomerným stripovaním po hybridizácii. Všetky bloty sa hybridizovali dvojmo, najprv so sondou proti génu, o ktorý bol záujem, a potom, po stripovaním, so sondou proti myšaciemu glyceraldehyd-3-fosfátu (mGAPDH), aby sa kontrolovali odchýlky pri RNA nanášaní.

RNA (10 pg/jamku) sa naniesla na 1,2% denaturačný agarózový gél obsahujúci formaldehyd a 5x MOPS (209,27 g kyseliny 3-(/V-morfolino)-propánsulfónovej, 20,5 g octanu sodného, 50 ml 0,5M EDTA pH 8,0 v 5 I sterilnej H₂O, na pH 7,0 s 12M NaOH). Každá RNA vzorka sa zmiešala s 2 μΙ etidiumbromidu (0,01 mg/ml), 2 μΙ 5x kyseliny 3-(/V-morfolino)propánsulfónovej (MOPS), 3,5 μΙ 37%

-69formaldehydu a 10 μΙ formamidu. Vzorky sa potom 10 minút zahrievali pri 65 °C a rýchlo sa zmrazili na ľade. Do každej vzorky sa tesne pred nanesením na gél pridali dva mikrolitre RNA nanášacieho tlmivého roztoku (50% glycerol, 1mM EDTA, 0,4% brómfenolová modrá a 0,4% xylénová kyanolová farbička).

Každý gél bežal približne 3 hodiny v 1x MOPS zbiehacom tlmivom roztoku (11 = 330 ml 37% formaldehydu, 400 ml 5x MOPS, 270 ml DEPO ošetrenej H2O) pri 5

V.cm'¹ (dĺžka gélu). Potom nasledoval transfer RNA, cez noc, na pozitívne nabitú nylonovú membránu (HybondTM-N, Amersham Life Sciences, Amersham Plače, Little Chalfont, Buckinghamshire, England HP7 9 NA) použitím SSC roztoku ako je opísané vTerry Brown, časť 4.9, Current Protocols, 1993 (vyd. F.M Ausubel, R. Brent, R.E. Kingston, D.D. Moore, J.G. Seidman, J.A. Smith a K. Struhl). Účinnosť RNA transferu sa kontrolovala pozeraním membrány a vyhladeného gélu pod UV svetlom. RNA sa zosieťovaním pripojili na membránu prostredníctvom Stratalinker (Stratagene, USA). Bloty sa pred hybridizáciou uskladňovali medzi listami Whatman 3MM filtračného papiera pri laboratórnej teplote.

Príprava sondy

Rádioaktívne ³²P značené sondy sa pripravili použitím gélovo purifikovaných reštrikčných fragmentov cDNA klonov (s dĺžkou približne 500 > 800 bp) zodpovedajúcich génom, o ktoré je záujem. DNA fragmenty sa náhodne značili na špecifickú aktivitu > 10⁹ cpm.ml-1 s ³²P-dCTP použitím HíghPrime™ značkovacieho systému (Roche Diagnostics AG, Idustriestrasse 7, 6343 Rotkreuz, Švajčiarsko). Nezačlenený ³²P-dCTP sa odstránil elúciou sondovej zmesi založenou na gravitačnej sile cez Pharmacia NAPTM 5 kolónu obsahujúcu Sephadex® G-25 médium (DNA stupeň v destilovanej vode obsahujúce 0,15% Kathon® CG/ICP Biocide®).

Hybridizácia a detekcia signálu

Hybridizácia sondy sa uskutočňovala použitím ExpressHyb™ (Clontech Labs, 1020 East Meadow Circle, Palo Alto CA) podľa špecifikácii výrobcu. Po hybridizácii sa bloty exponovali na Hyperfilm™ MP (Amersham Pharmacia Biotech, Anglicko) pri -80 °C v autorádiografických kazetách. Stripovanie sondy po expozícii sa

- 70uskutočňovalo inkubovaním blotu 10 minút v sterilnom H2O/0,5% SDS roztoku pri 90 až 100 °C a potom sa umožnilo, aby sa blot 10 minút ochladzoval. Stripované membrány sa nepriepustné zabalili do plastu a uskladnili sa pri -20 °C, až kým nebolo potrebné opätovné použitie sondy.

Výsledky

Northern blot analýza sa predtým využívala ako sekundárna potvrdzujúca technika pri štúdiách heterogénnej génovej expresie vo veľkom meradle (Chang a ďalší, 2000). Jej citlivosť a presnosť umožňujú nie len analýzu tkanivovej špecificity expresie pre daný gén, o ktorý je záujem, ale aj analýzu rozsahu heterogénnej rozdielnej regulácie medzi experimentálnymi a kontrolnými podmienkami. Toto ju robí spoľahlivou metódou na potvrdenie DGE výsledkov získaných mikrorádovou analýzou. Northern bloty poskytujú aj informácie týkajúce sa veľkosti transkriptu a možných alternatívnych zostrihových izoforiem zodpovedajúcich génu, o ktorý je záujem.

Obvyklé Northern bloty sa pripravili použitím RNA izolovanej z mozgov myší ošetrených kuprizónom a z mozgov kontrolných myší. Tieto sa sondovali s rádioaktívne značenými DNA fragmentmi z klonov, ktoré nám zaslal Incyte Genomics. Schopnosť Northern blotov reprodukovať výsledky pozorované prostredníctvom TaqMan® analýzy génovej expresie sa overila použitím rádioaktívne značenej sondy proti myšaciemu osteopontínu hybridizujúcej s blotmi RNA izlovaných z mozgov myší ošetrených kuprizónom. Týmto spôsobom bolo možné porovnávať Northern blot analýzu s TaqMan® analýzou expresie osteopontínu na kuprizónovom modeli.

Obrázok 3 znázorňuje otvorený čítací rámec myšacieho osteopontínu začleneného do pT7T3D-Pac vektora, ako bol objednaný od Incyte Genomics. Sivá oblasť je kódujúca sekvencia a šípky predstavujú celú cDNA pre osteopontín. Klonový inzert bol ohraničený EcoRI a Notl reštrikčnými miestami. Aby sa vyrobila sonda na použitie v Northern blotingu na analýzu tkanivovej expresie tohto génu, vyštiepil sa z tohto klonu 893bp fragment použitím Hincll a Styl reštrikčných enzýmov. Tento fragment sa gólovo purifikoval a označil sa na použitie ako sonda.

-71 Expresia myšacieho osteopontínu sa zistila prostredníctvom Northern blot analýzy použitím zvyčajného blotu pripraveného s RNAs z mozgov myší z každého štádia kuprizónového modelu, vrátane zotavovacej a neošetrenej kontroly. Blot sa sondoval najprv s rádioaktívne značeným fragmentom myšacej osteopontínovej cDNA, stripoval sa po expozícii a potom sa znova sondoval s rádioaktívne značeným fragmentom myšacieho GAPDH. Tento sa použil ako pozitívna kontrola, aby sa objasnili rozdiely v pozorovaných expresných hladinách založené na odchýlkach v celkových množstvách RNA v každej dráhe blotu.

Expresia osteopontínu v mozgoch kuprizónom ošetrovaných myší dosiahla vrchol v 3. a 5. týždni dodávania kuprizónu, s mierne zvýšenou expresiou v 5. týždni. V priebehu zotavovacej fázy sa hladiny osteopontínovej mRNA znižovali relatívne rýchlo, so zjavnou redukciou v expresii 1 týždeň po ukončení dodávania kuprizónu. Hladiny osteopontínovej mRNA sa vrátili približne na normálne úrovne po 6 týždňoch zotavovania. Toto je kvalitatívne porovnateľné s výsledkami získanými v TaqMan® analýze osteopontínovej expresie na kuprizónovom modeli (pozri obrázok 1A).

Príklad 4

Regulácia osteopontínu v oli-neu bunkách

Expresia osteopontínu v oligodendrocytoch (oli-neu) ošetrovaných s cAMP sa merala TaqMan analýzou. Výsledky sú znázornené na obrázku 4. Stĺpce 1 až 4 znázorňujú výsledky získané v oligodendrocytoch. V porovnaní s kontrolou (hodnota = 1), 6 hodín ošetrovania s cAMP (stĺpec 1) viedlo k nadregulácii osteopontínovej mRNA. Po 2 dňoch ošetrovania s cAMP (stĺpec 2) sa namerala 12 násobná nadregulácia. Predĺžené ošetrovanie počas 6 a 10 dní (stĺpce 3, 4) viedlo k nižším hladinám osteopontínovej mRNA. Porovnanie s reguláciou osteopontínovej mRNA na kuprizónovom modeli (stĺpec 5, 6) ukázalo, že nadregulácia osteopontínu po 3 a 5 týždňoch kuprizónu v prednom mozgu bola porovnateľná s nadreguláciou u oligodendrocytov po 2 dňoch ošetrovania s cAMP.

-72Príklad 5

Expresia osteopontínu v oligodendrocytoch

Metóda

Oli-neu bunky sa prechodne transfekovali použitím precipitačnej metódy s fosforečnanom vápenatým. Stručne, oli-neu bunky vo fáze exponenciálneho rastu sa vysiali (10⁵/ml) na 6-jamkovú platňu deň pred uskutočnením transfekcie. Roztok 100 μΙ 250mM CaCI₂ sa zmiešal s 5 μg plazmidovej DNA. Ku Ca/DNA roztoku sa pridal rovnaký objem (100 μΙ) 2x HEPES roztoku (140mM NaCI, 50 mM HEPES pH 7,05) doplnený s fosfátom z 300mM zásobného roztoku Na₂PO₄ a NaH₂PO₄ s pH 7,05. Presne o minútu sa zmes jemne pridala na kultivačnú platňu a inkubovala sa 4 hodiny pri 37 °C v CO₂ inkubátore. Po tomto čase sa médium nahradilo čerstvým médiom a bunky sa potom inkubovali 24 až 72 hodín pred tým ako sa zobrali a analyzovali Western blotom.

Výsledky

Do oli-neu buniek sa transfekovali rôzne myšacie osteopotínové konštrukty, vpDEST12.2 vektore (pDEST12.2-osteopontín-EGFP, pDEST12.2-osteopontínHis6, pDEST12.2-osteopontín, pozri obrázky 4 až 7, a pCIE-EGFP ako kontrolný plazmid). Proteín bol produkovaný a vylučovaný bunkami, ako sa detegovalo špecifickými komerčnými protilátkami (R&D Systems, AF808). Konštrukt s EGFP príveskom uľahčoval monitoring transfekcie a 24 hodín po transfekcii bolo možné detegovať špecifickú zmenu v bunkovej morfológii (zvýšenie v oligodendrocytových procesoch) v porovnaní s pCIEGFP kontrolou (nie je znázornené), z čoho vyplýva, že osteopontín posúva oligodendrocytovú bunkovú líniu oli-neu k zrelšiemu morfologickému fenotypu. Morfológia oli-neu buniek transfekovaných osteopontínom bola veľmi podobná s morfológiou myelinizujúcich oligodendrocytov.

Tieto výsledky demonštrujú, že expresia osteopontínu v oligodendrocytoch je užitočná na poháňanie týchto buniek smerom k myelinizácii a z toho preto vyplýva užitočný vplyv osteopontínu na ochorenia spojené s oligodendrocytovou dysfunkciou.

-73Príklad 6

Expresia osteopontínového proteínu v špecifických oblastiach mozgu v kuprizónovom modeli

Osteopontínová imunohistochémia sa uskutočňovala v rôznych časových bodoch počas de- a remyelinizácie na kuprizónovom modeli. Silné signály sa zistili v demyelinizovanom svorovom telese a v striatum zväzkoch po 5 týždňoch liečenia kuprizónom, čo je časový bod spojený s prominentným mikrogliálnym zhromažďovaním v miestach demyelinizácie. Na vizualizáciu aktivovaných mikrogliálnych buniek sa uskutočňovalo CD68 farbenie po sebe nasledujúcich rezov a z podobných expresných vzorov vyplýva mikrogliálna expresia osteopontínu.

Je zaujímavé, že osteopotín sa našiel aj v bunkách lemujúcich prednú stranu srdcových komôr. Táto oblasť bola opísaná ako dospelá subventrikulárna zóna nesúca multipotentné kmeňové bunky na produkciu neurónov, astrocytov a oligodendrocytov. Dvojité farbenie s NG2, PSA-CAM, PDGFa receptorom sa uskutočňovalo na determináciu oligodendrocytových prekurzorových buniek exprimujúcich osteopotín.

Príklad 7

Vplyvy osteopontínového proteínu na oligodendrocytovú proliferáciu

V tomto experimente sa použila myšacia primárna oligodendrocytové (oligodendrogliová) bunková línia imortalizovaná st-neu onkogénom („oli-neu“ bunková línia). Zavedenie a vlastnosti oli-neu bunkovej línie, ako aj podmienky jej kultivácie sú opísané vJung a ďalší (1995). Cieľom tejto štúdie bolo meranie účinkov OPN na oligodendrocytovú proliferáciu v oli-neu proliferačnom teste. Bunky sa na platne vysiali subkonfluentne. Nechali sa 24 hodín hladovať v médiu bez inzulínu pred ošetrením buď s kontrolou, alebo s rekombinantnými proteínmi. Počet buniek sa kvantifikoval Alamarovou modrou poskytujúcou možnosť fluorescenčného odčítavania. Výpočty znásobenia boli založené na porovnaní s IGF1 (kontrola) štandardnou krivkou. Výpočty inhibície proliferácie boli založené na porovnaní s dbcAMP štandardnou krivkou.

-74Materiál

Vybavenie a softvéry

Wallac Vietor 2 multiznačkový snímač (excitácia pri 530-560 nm, emisia pri 590 nm) Graph Pad Prism Software

Reakčné činidlá

Oli-neu bunková línia (Eur J Neuro 7: 125-1265 (1995)) Alamar modrá (BioSourceltl. Inc., Camarillo, CA93012)

Zložky Sato média boli nasledujúce:

Produkt	Dodávateľ	Zásoba	μΙ na 500 ml
DMEM	Seromed F0435	500 ml
T ransferín	Sigma T-2252	100 mg/ml (1 mg v 10 ml PBS)	50
Selenid sodný Sigma S-9133	1 mg/2,56 ml PBS	50
Inzulín	Sigma 1-1882	10 mg/ml (100 mg/10ml PBS)	500
Putrescín	Sigma P-7505	80,5 mg/ml (PBS)	500
Progesterón	Sigma P-0130	0,62 mg/ml (EtOH)	50
TIT	Sigma T-5516	1,7 mg/ml (1/3 HCl 1N+2/3 EtOH)	100
(Trijódtyronín)
L-Tyroxín	Sigma T-0397	2,88 mg/ml+1 kvapka NaOH 1N	100
L-Glutamín	Gibco 25030-024 200 mM	5000
Gentamycín	Gibco 15750-37 50 mg/ml	250
Hydrogén-
uhličitan sodný Gibco 25080-052 7,50 %	13000
Konské sérum			5000

BiCoat platňa s plochým dnom pokrytá poly D lyzínom (356461) od Becton Dickinson); R3-IGF1 (11146 od Sigma); DbcAMP (D-0627 od Sigma)

Metóda

Kultivácia buniek na in vitro biotest

-75Oli-neu bunky sú adherenčné bunky rastúce na Poly-L-lyzínovom substráte. Bunky sa naniesli na BioCoat™ poly-lyzínom vopred potiahnuté 96-jamkové platne. Bunky sa delili 2 až 3x za týždeň. Aby sa rozdelili, museli sa najprv premyť s PBS a potom sa odpojili s PBS plus 1Mm EDTA. Bunky rástli vo vlhčenom 10% CO₂ inkubátore.

Ako zmrazovacie médium sa použilo Sato médium s 20% GCS a 10% DMSO. V tomto experimente neboli použité oli-neu bunky s viac ako 16 krát pasážované. Bunky sa používali v konečnej koncentrácii 4000 buniek na jamku v 96-jamkovej platni po 24 hodinovom hladovaní v Sato médiu bez inzulínu.

Almar blue farbenie

Po 48 hodinách v CO₂ inkubátore, sa pridalo 10 μΙ Alamar modrého zásobného roztoku do jamiek a inkubovali sa ďalšie 2,5 hodiny. Fluorescencia sa monitorovala pri 530-560nm excitačnej a 590nm emisnej vlnovej dĺžke. Platne sa mohli odčítavať do 4 hodín a do 1 milióna relatívnych fluorescenčných jednotiek.

Dizajn experimentu

Ako kontrola sa použilo 100 ng/ml R3-IGF-1 (pozitívna kontrola) alebo 1mM dbcAMP (negatívna kontrola) alebo médium bez inzulínu alebo 100 nM povareného OPN. Experimentálnymi vzorkami bolo 1 nM, 10 pM, 0,1 pM, 0,01 pM alebo 100 nM rekombinantného osteopontínu. Kontroly a experimentálne vzorky sa nariedili na požadované koncentrácie s končeným objemom 50 μΙ v Sato médiu bez inzulínu a pridali sa do jamiek. Oli-neu bunky rástli v médiu bez inzulínu 24 hodín a potom sa ošetrovali s kontrolami alebo s experimentálnymi vzorkami 48 hodín. Odpojené olineu bunky, ktoré čerstvo hladovali 24 hodín v médiu bez inzulínu, sa zozbierali z rastovej fľaše pomocou PBS s 1mM EDTA. Bunky sa pripravili v koncentrácii 300000 buniek na ml a pridali sa v objeme 50 μΙ na jamku. Potom sa bunky inkubovali 48 hodín pri 37 °C vo zvlhčenom CO₂ inkubátore. Pridalo sa 10 μΙ alamar modrej a bunky sa vrátili do inkubátora na 2,5 hodiny. Potom sa 70 μΙ z každej jamky prenieslo na čierne 96-jamkové platne a okamžite sa merala fluorescencia.

Proliferácia nediferencovaných oli-neu buniek sa merala po 24 hodinách ako odpoveď na rôzne množstvá osteopontínu, ktoré sa produkovali použitím hmyzích

-76buniek (BacOPN) alebo cicavčieho expresného systému (HEK-OPN). Rastová rýchlosť sa kvantifikovala meraním bunkovej metabolickej aktivity s fluorometrickým/kolorimetrickým rastovým indikátorom, Alamar Blue. Toto činidlo obsahuje oxidačno-redukčný indikátor, ktoré vykazuje tak fluorescenciu, ako aj zmeny farby ako reakciu na chemickú redukciu rastového média, ktorá je výsledkom bunkového rastu. Použité činidlo a test sú opísané v Ahmed a ďalší (1994) a v US patente č. 5501959.

Výsledky

Výsledky sú znázornené na obrázkoch 8 až 10.

S rekombinantným osteopontínom, exprimovaným tak bakulovírusom, ako aj HEK bunkami, sa pozorovala na dávke závislá odpoveď. Degenerovanie proteínu varením zničilo biologickú aktivitu, ako sa očakávalo. Pridanie bakulovírusom exprimovaného osteopontínu (BacOPN) a HEK bunkami exprimovaného OPN (HEK OPN) viedlo k na dávke závislému zvyšovaniu bunkovej proliferácie (obrázok 8) s IC₅₀ 3,7 nM pre BacOPN a 0,05 nM pre HekOPN (obrázok 9). Okrem toho sa Nterminálny OPN konštrukt zodpovedajúci aminokyselinám 1 až 168 OPN izoformy a (pozri obrázok 2, N-koniec, OPN-a) exprimoval v hmyzích bunkách. Purifikovaný proteín sa testoval v proliferačnom teste v porovnaní s kompletným proteínom. Skrátený proteín bol aktívy (10 nM, 100 nM), pozri obrázok 10.

Príklad 8

Účinky osteopontínu na expresiu myelinizačných markerov v zmiešaných kortikálnych kultúrach

Zmiešané kortikálne kultúry, rastúce na krycích sklíčkach, sa ošetrovali s BacOPN (100 nM) 12 dní s DIV (dni in vitro) 5-17. Na 17 deň in vitro sa kultúry fixovali a farbili sa s anti-MBP protilátkou. Výsledky ukazujú, že BacOPN krycie sklíčka mali rozvetvenejšie MBP pozitíve oligodendrocyty ako kontroly (obrázok 11). Okrem toho, zatiaľ čo v kontrolných kultúrach (obrázok 11 A) neboli pozorované žiadne myelinizujúce oligodendrocyty, kultúry ošetrené s OPN (obrázky B, C a D) boli bohaté na oligodendrocyty, ktoré boli obalené okolo axónov a tvorili myelínové

-77segmenty a medziuzly (obrázky 11B až D). Počítanie segmentových klastrov odhalilo, že zatiaľ čo v kontrole nemohli byť pozorované žiadne segmenty, tri rozličné vzorky ošetrené s OPN vykazovali 16, 22 a 18 segmentových klastrov. Z týchto výsledkov vyplýva, že ošetrovanie kortikálnych zmiešaných buniek s osteopotínom vedie k diferencovanému fenotypu oligodendrocytov, ktorý je chrakteristický myelinizujúcimi oligodendrocytmi.

Príklad 9

Účinky osteopontínu na expresiu MBP v zmiešaných kortikálnych kultúrach, abo bolo merané prostredníctvom MBP ELISA

MBP ELISA sa použila na monitorovanie zvýšenia MBP proteínu a tým na monitorovanie myelinizácie v zmiešaných kortikálnych kultúrach ošetrených s OPN a LIF.

Primárne kultúry

Zdrojom materiálu bolo embryonické myšacie mozgové tkanivo z embryí, izolované z tehotných NMR1 samičiek myší 16 dní po koite. Embryá sa rozpitvali v súlade s protokolom podľa Lubetzki a ďalší, mozogové kôry sa disociovali štiepením s trypsínom a disociované bunky (vrátane neurónov, astrocytov, oligodendrocytov, mikroglií a nervových prekurzorov) sa vysiali v koncentrácii 1x10⁵ buniek na jamku do 96-jamkových kultivačných platní vopred pokrytých poly-Llyzínom (v 50μΙ počiatočnom objeme pre každú jamku).

Ošetrovanie s rekombinantným proteínom

Ošetrenia sa uskutočňovali použitím rekombinantných proteínov (pozitívnou kontrolou bol rekombinantný myšací leukemický inhibičný faktor (LIF) kúpený od AMRAD Laboratories v koncentráciách 1 pg/ml, 100 ng/ml a 10 ng/ml; myšací bakulovírusom produkovaný kompletný osteopontín v koncentráciách 100 nM, 10 nM a 10 pM). Všetky proteíny sa nariedili v kultivačnom médiu na vhodné koncentrácie zo zásobného materiálu, predtým ako sa pridali ku bunkám in vitro.

-78 Kultúry sa nechali rásť 5 dní in vitro a potom sa 17 dní ošetrovali. Médium sa menilo každé 3 dni.

Mikrojamkový platňový protokol na zhromažďovanie vzoriek

Bunky sa lyžovali a vzorky sa zhromažďovali po 17 dňoch in vitro (DIV17).

Bunková lýza sa uskutočňovala použitím trojitého detergenčného tlmivého roztoku.

Trojitý detergentný tlmivý roztok

Konečná koncentrácia ml Tris pH 8,0 1M 8,77 g NaCI 2 ml NaN₃(10%) ml SDS 20% ml NP40 g deoxycholátu sodného mM 150 mM 0,02 % 0,1 % %

0,5 %

Pred použitím sa do 10 ml trojitého detergentného tlmivého roztoku pridala jednotková proteázová inhibičná tabletka (Roche č. 1836170).

Zo zmiešaných kortikálnych kultivačných vzoriek sa odstránilo médium a potom boli tieto vysiate na 96-jamkové vopred pokryté platne. Bunky sa jemne dvakrát premyli s 50 μΙ 1x PBS a potom sa do každej jamky pridalo 50 μΙ trojitého detergentného tlmivého roztoku. Všetky mikrojamkové platne obsahujúce lyzované vzorky sa potom pred analýzou uskladnili pri -20 °C.

BCA proteínový test

Pierce BCA proteínový test je detergent kompatibilná formulácia založená na kyseline bicínchonínovej (BCA) na kolorimetrickú detekciu a kvantifikáciu celkového proteínu. Tento spôsob kombinuje dobre známu redukciu Cu⁺² na Cu⁺¹ proteínom v alkalickom médiu s vysoko citlivou a selektívnou kolorimetrickou detekciou meďného katiónu (Cu⁺¹) použitím unikátneho reakčného činidla obsahujúceho kyselinu bicínchonínovú.

-79Purpurový reakčný produkt tohto testu sa vytvára chelatáciou dvoch molekúl BCA s jedným meďným iónom. Tento vo vode rozpustný komplex vykazuje silnú absorbanciu pri 562 nm, ktorá je priamo úmerná zvyšovaniu proteínových koncentrácií v širokom pracovnom rozsahu 20 pg/ml až 2000 gg/ml. BCA metóda nie je v skutočnosti koncovou metódou a farba sa d’alej vyvíja, ale po inkubovaní je rýchlosť vyvíjania farby dostatočne spomalená na to, aby bolo možné urobiť veľké množstvo vzoriek v jednom kole. Makromolekulová štruktúra proteínu, počet peptidových väzieb a prítomnosť štyroch aminokyselín (cysteínu, cysteínu, tryptofánu a tyrozínu) sa uvádzajú ako zodpovedné za vytváranie farby s BCA.

Mikrojamkový platňový protokol na determináciu celkového proteínového obsahu μΙ každého štandardu (BSA koncentrácia: 2000 μg/ml, 1500 μg/ml, 1000 μρ/ηηΙ, 750 μρ/ηηΙ, 500 μς/ιτιΙ, 250 μg/ml, 125 μg/ml, 25 μς/ηπΐ) a vzoriek sa pridalo do príslušných jamiek mikrojamkovej platne. 25 μΙ riedidla (trojitý detergentný tlmivý roztok) sa použilo pre blankové jamky (pracovný rozsah 20 až 2000 μο/ιτιΙ).

Do každej jamky sa pridalo 200 μΙ pracovného reakčného činidla (zmes 50 dielov BCA reagentu A s 1 dielom BCA reagentu B). Platňa sa trepala 30 sekúnd a inkubovala sa pri 37 °C 30 minút. Po inkubovaní sa merali hodnoty absorbancie pri 570 nm.

MBP sendvičová ELISA

96-jamkové sterilné mikroplatne s plochým dnom (Costar) sa inkubovali cez noc pri +4 °C s anti-MBP protilátkou (Chemicon, MAB5274) nariedenou na 1:5000 v 1x PBS. 50 μΙ nariedeného protilátkového roztoku sa pridalo do každej jamky.

Na druhý deň sa protilátkový roztok odstránil zo všetkých jamiek platne a uskutočňoval sa blokovací krok použitím 50 μΙ 1% BSA roztoku v 1x PBS pre každú jamku. Blokovanie sa uskutočňovalo 1 hodinu pri teplote okolia. Platne sa roboticky premývali 3 krát použitím PBS/Tween po blokovacom kroku.

Inkubácia sa uskutočňovala po pridaní seriálnych riedení peptidového štandardu alebo vzoriek v 1% BSA/PBS v mikrojamkových platniach. MBP peptidový 100ng/ml zásobný roztok sa nariedil v pomere 2 v 2. Tu použité riedenia

-80sa determinovali po výpočte celkového proteínového obsahu použitím výsledkov BCA proteínového testu. Boli nasledovné: 100 pg; 50 pg; 25 pg; 12,5 pg; 6,2 pg; 3,1 μο·

Po inkubovani s MBP štandardom a proteínovými vzorkami sa platne znova trikrát premyli v 1% BSA/PBS.

Druhá inkubácia sa uskutočňovala použitím polyklonálnej anti-MBP protilátky (Zymed 10-0038, 1:300) nariedenej v 1% BSA/PBS. Platne sa inkubovali 2 hodiny pri teplote okolia. Po tejto inkubácii sa platne znova trikrát premyli ako bolo opísané vyššie.

Inkubovanie s kozím anti-králičím biotínom (Vector BA-1000, 1:10000) pridávaným v 50pl objemoch do každej jamky sa uskutočňovala hodinu pri teplote okolia. Platne sa po inkubácii znova premyli ako je uvedené vyššie.

Konečná inkubácia sa uskutočňovala s 50 pl chrenovej peroxidázy konjugovanej so streptavidínom (strep-HRP) (Amersham RPN 1051, 1:8000) nariedenými v 1x PBS, ktoré sa pridávali do každej jamky. Platne sa inkubovali hodinu pri teplote okolia.

Po premývacom kroku sa reakčná zmes vyvinula použitím ortofenyléndiamín dihydrochloridu (OPD) (Sigma, roztok pripravený pridaním 1 tabletky ku 20ml objemu vody). Táto reakcia sa blokovala pridaním 3M HCl alebo 30% H2SO4. Optická denzita sa merala použitím muiti-skenovacieho fluoroplatňového snímača (Labsystems Multiskan EX) pri 492 nm.

Výsledky

Ako je znázornené na obrázku 12, hladiny MBP proteínu boli zvýšené trojnásobne v kultúrach ošetrených s bacOPN (10 nM) DIV 17 v porovnaní s kontrolnými kultúrami. Toto pozorovanie podporuje predchádzajúce výsledky ukazujúce pozitívny vplyv OPN exprimovaného bakulovírusom na proliferáciu a myelinizáciu oligodendrocytového prekurzora.

Príklad 10

Účinok osteopontínu na CG4 proliferáciu

-81 CG4 bunková línia je imortalizovaná bunková línia potkaních oligodendrocytov, ktoré sa spontánne získali z primárnych A2B5 oligodendrocytových prekurzorov. CG4 bunky sú bežne používanou bunkovou líniou na študovanie diferenciácie alebo prežívania oligodendrocytov. CG4 bunková línia má nasledujúce výhody:

- vysoká proliferatívna rýchlosť podobná oligodendrocytovým predkom (O2Apodobné) (GD3, A2B5-pozitívne bunky);

- nízke náklady na udržiavanie v kondiciovanom médiu (s účinnými koncentráciami rastových faktorov) získaného zB104 potkanej neuro-blastómovej bunkovej línie (Louis J.C. a ďalší, 1992) získanej z ATCC.

- definované médium (bez FBS) sa môže použiť (obohatené s FGF2+PDGF), namiesto B104 kondiciovaného média, na proliferáciu v priebehu krátkeho času.

- definovaným médiom je možné spustiť diferenciáciu na oligodendrocyty (04, GalC-pozitív).

- v prítomnosti FBS je možné spustiť difrenciáciu na astrocyty (GFAP-pozitív). 35 krát pasážované CG4 bunky sa použili na testovanie účinku dvoch OPN proteínov (exprimované v E. coli alebo v hmyzích bunkách) na proliferáciu. Na tento test sa použil R&D System E. coli produkovaný osteopontín (kat. 441-OP), ktorý sa potom in vitro fosforyloval s proteínkinázou 2 (GST fúzovanou) v 60μΙ objeme nasledovne:

Kinázový tlmivý roztok 6x 50mM Hepes 10mM MgCI₂ ImMDTT

0,2mM vanadan sodný 25mM β-glycerolfosfát

Vzorkový tlmivý roztok 2x pH 6 0,125 Tris-CI 20% glycerol 0,2M DTT

-820,02% brómfenolová modrá

ATP zmes (60 μΜ) μΙ 600μΜ ATP μΙ ³²pATP

265 μΙ H2O2

Na naštartovanie reakcie sa pridala ATP zmes a inkubácia sa uskutočňovala pri 30 °C 1 hodinu. Po 90 minútach inkubovania pri 30 °C (s trepaním) sa do reakčnej zmesi, ktorá sa predtým premyla s PBS, aby sa eliminovala proteín kináza, pridalo 100 μΙ glutatión Sepharose guličiek (Pharmacia). Potom sa zmes inkubovala hodinu pri laboratórnej teplote s jemným pretrepávaním. Suspenzia sa centrifugovala pri 500 ot./min 5 minút, aby sa usadili guľôčky. Potom sa supernatant dialyzoval cez noc pri 4 °C oproti PBS. Proteín sa kvantifikoval prostredníctvom BCA (Pierce).

Kinázová reakčná zmes μΙ 0,05μg/μl kazeín kinázy μΙ 0,5pg/pl E. coli OPN μΙ 50mM Tris-HCI pH 8 μΙ 6x kinázový tlmivý roztok μΙ ATP zmes

Proliferačný test

Bac OPN a in vitro fosforylované OPN proteíny sa testovali v koncentráciách 10 pM, 10 M a 100 nM na proliferáciu CG4 buniek. Na odčítavanie sa použil BrdU (Amersham) ako je opísané v Avellana a ďalší, 1996. Bunky sa kultivovali v 7% N1 definovanom médiu (DMEM obsahujúce 4,5 g/l glukózy, 2mM glutamín, 100 U/ml penicilínu, 100 pg/ml streptomycínu a 1mM pyruvát sodný a doplnené s 5 pg/ml transferínu, 100mM putrescínom, 30nM selenidom sodným a 10 ng/ml biotínu) a v 30% B104 kondicionovanom médiu (N1 bez biotínu) (Louis J.C. a ďalší 1992).

-83Test sa uskutočňoval v 24-jamkových platniach ošetrených poly-ornitínom (100 μρ/ιτιΙ), na ktoré bolo vysiatych 3x10⁴ buniek/jamku. Zároveň sa pridal 10nM BrdU a bunky sa inkubovali 18 hodín. Po fixácii sa uskutočňovala imunocytochémia s anti-BrdU protilátkou, aby sa detegovali bunkové delenia. Bunky sa tiež farbili s Hoechst 44432 farbením (Sigma), aby bolo možné spočítať celkový počet buniek. Obrázky sa získavali a analyzovali použitím Leica Qwin Image Analysis System.

Výsledky

Výsledky sú znázornené na obrázku 13.

Bakulovírusom exprimovaný osteopontín viedol s zvýšeniu proliferácie CG4 buniek. Najvýraznejší účinok bolo možné pozorovať v koncentrácii 10 nM OPN, hoci aj 100nM OPN viedol k proliferácii. In vitro fosforylovaný E. coli exprimovaný OPN viedol k minimálnej proliferácii CG4 buniek.

Analýza morfológie OPN ošetrených v porovnaní s neošetrenými CG4 bunkami odhalila, že v kontrole nebola pozorovaná žiadna diferenciácia, CG4 bunky ošetrené s OPN sa diferencovali ako vo väčšine procesov bunkového vývoja. Hoci diferenciácia bola výraznejšia použitím bakulovírusom exprimovaného OPN, aj E. coli exprimovaný, in vitro fosforylovaný OPN viedol k CG4 bunkovej diferenciácii (nie je ukázané).

Príklad 11

Vplyv osteopontínu na MOG-indukovanú autoimunitnú encefalomyelitídu (EAE) u myší

Účel štúdie

Osteopotín (OPN; AS900011) je cytokín s pleiotropnými funkciami zahŕňajúcimi adhéziu, migráciu, difereciáciu, prežívanie a sekréciu cytokínu rôznymi typmi buniek. OPN sa identifikoval v prístupe heterogénnej génovej expresie (DGE) s cieľom detegovať gény, ktoré by mohli regulovať remyelinizáciu a funkciu oligodendrocytov (pozri príklad 1). Ošetrenie oligodendrocytových prekurzorov s rekombinantným bakulovírusom exprimovaným OPN (AS900011) zvyšovalo proliferáciu na dávke závislým spôsobom (IC₅o: 3,7 pM, pozri príklad 7). Okrem toho

-84vykazoval AS900011 vplyv na diferenciáciu CG4 bunkovej línie a primárnych neurosfér (pozri príklad 8). OPN sa exprimoval v demyelinizovanej mozgovej oblasti svorového telesa u myší ošetrených s kuprizónom, pričom expresia bola najsilnejšia v mikrogliálnych bunkách (pozri príklad 1). Okrem toho, OPN expresia sa pozorovala v subventrikulárnej zóne (SVZ), ktorá bola navrhnutá ako zóna generujúca oligodendrocytové prekurzory, ktoré participujú na remyelinizácii (pozri príklad 4). Existuje hypotéza, že OPN, cytokín s rôznymi imuno-regulačnými vlastnosťami, môže hrať aj úlohu ako modulátor nervovej a gliovej funkcie.

Účelom tejto štúdie bolo testovať terapeutický účinok OPN na modeli MOGindukovanej EAE u myší.

Testovacia metóda

Metóda indukcie EAE použitá v tejto štúdii bola úpravou protokolu publikovaného v Sahrbacher a ďalší (1998). Ochrana zvierat používaných v experimente je v súlade s nariadením 86/609/EEC, ktoré je v súlade s talianskou vyhláškou č. 116 z 27. januára 1992. Materiálové príslušenstvo a vybavenie na chov a starostlivosť o zvieratá je v súlade s ustanoveniami nariadenia č. 86/609 EEC rády. Inštitút je plne oprávnený kompetentnými veterinárnymi autoritami. Všetky časti tohto protokolu týkajúce sa starostlivosti o zvieratá boli schválené úradným veterinárom. Tento protokol je schválený talianskym Ministerstvom zdravotníctva (dekrét č. 51/99-B).

Druh, plemeno, rasa a pohlavie

C57 BL/6JICO samičky myší z IFFA CREDO (Saint Germain sur l'Arbresle, Francúzsko) kolónie boli dodávané firmou Charles River Italia (Calco, Lecco, Taliansko).

Nastavenie na selekciu testovacieho systému

C57 BL/6JICO myš sa vybrala ako experimentálny model; bolo dokumentované, že toto vybrané plemene je náchylné na EAE.

Dodávateľ

-85Charles River Italia S.p.A. Via Indipendenza, 11 23885 - Calco (Lecco)

Aklimatizácia

Začína sa aspoň 5 dní pred štúdiou. V tomto čase sa zvieratá budú denne pozorovať, aby sa určilo, či sú vhodné pre štúdiu.

Vek a telesná hmotnosť (pri randomizácii)

Približne 8 týždňové; 18 až 22 g.

Umiestnenie zvierat v jednej klietke v miestnosti s klimatizáciou.

Teplota: 22 °C ± 2 °C Relatívna vlhkosť: 55 % ± 10

Výmeny vzduchu: približne každých 15 až 20 hodín filtrovaný na HEPA 99,99% Svetlo: 12 hodinový cyklus (7.00 až 19.00)

Klietka

Makrolon® klietka 42,5x26,6x15h každá vybavená s nefarbenými oceľovými krycími mriežkami na kŕmenie. Na dne klietky je umiestnený rošt. Odpad, ktorý padá cez rošt na dno klietky bude periodicky odstraňovaný.

Identifikácia zvierat

Príveskom na uchu. Na klietkovej kartičke sa bude nachádzať číslo experimentu, dávková skupina a dátum podávania zlúčeniny.

Strava

GLP 4RF25 vysoko certifikované peletované krmivo vyrábané firmou Charles River Italia's v licencii Mucedola S.r.l., Settimo Milanese. Na uľahčenie kŕmenia chorých zvierat sa od 7 dňa umiestňovali každý deň na dno klietky mokré pelety. Výrobca dodal certifikovanú analýzu nutričných látok a kontaminantov, ktorých

-86hladina je v rámci limitov navrhnutých EPA-TSCA (44FR: 44053-44093, 26. júl 1979). RBM reanalyzuje zvieracie krmivo dvakrát ročne na kontamináciu baktériami. Krmivo je zvieratám dostupné podľa chuti („ad libitum“).

Voda

Z mestského vodovodu. Voda sa filtrovala a distribuovala sa podľa chuti zvieratám automatickým ventilovým systémom. Pitná voda sa periodicky analyzuje na počet mikroorganizmov, na ťažké kovy, iné kontaminanty (napr. rozpúšťadlá, pesticídy) a z hľadiska iných chemických a fyzikálnych vlastností. Akceptačné limity kvality pitnej vody sú definované v EEC nariadení 80/778.

Neočakáva sa, že by v strave alebo v pitnej vode mohli byť kontaminanty, ktoré by mohli interferovať s cieľmi štúdie.

Testované látky

Myšací osteopontín s 6 his príveskom (AS900011) a mIFNp.

Imunizačný postup

Myši sa imunizovali (deň = 0) s.c. injekciou do ľavého boku s 0,2 ml emulzie zloženej z 200 pg MOG35-55 peptidu (Neosystem, Strasbourg, Francúzsko) v kompletnom Freundovom adjuvans (CFA, Difco, Detroit, USA) obsahujúcom 0,5 mg Mycobacterium tuberculosis. Okamžite potom dostali i.p. injekciu 500 ng pertussis toxínu (List Biological Lab., Campbell, CA, USA) rozpusteného v 400 μΙ tlmivého roztoku (0,5M NaCl, 0,017% Triton X-100, 0,015M Tris, pH=7,5). Na 2. deň zvieratá dostali druhú i.p. injekciu 500 ng pertussis toxínu. Na 7. deň zvieratá dostali druhú dávku 200 pg MOG35.55 peptidu v CFA, podanú s.c., do pravého boku. Začínajúc približne na 8 až 10 deň tento postup vedie k postupne progredujúcej paralýze, začínajúcej od chvosta a postupujúcej až po predné končatiny.

Dizajn štúdie

Štúdia zahŕňala 7 skupín po 15 zvierat. Všetky skupiny sa imunizovali s MOG35.55 peptidom v CFA a pertussis toxínom podľa imunizačného protokolu a ošetrovali sa nasledovne.

-87Skupina 1: pozitívna kontrolná skupina, ktorej sa podalo len samotné OPN vehikulum (PBS + 0,1% BSA) s.c. spôsobom.

Skupina 2: pozitívna kontrolná skupina, ktorej sa podalo len mIFNp vehikulum (PBS) s.c. spôsobom.

Skupina 3: s.c sa podával 1 pg/kg osteopontínu (AS900011)

Skupina 4: s.c. sa podávalo 10 pg/kg osteopontínu (AS900011)

Skupina 5: s.c. sa podávalo 100 pg/kg osteopontínu (AS900011)

Skupina 6: s.c. sa podávalo 100 pg/kg osteopontínu (AS900011) plus s.c. mIFNp 20000 jednotiek na myš.

Skupina 7: s.c. sa podávalo 20 000 jednotiek na myš mIFNp.

Počet zvierat v skupine je minimálnym počtom umožňujúcim presné zhodnotenie pozorovaných farmakologických účinkov.

Vehikulum

PBS plus 0,1% BSA sa použije na riedenie osteopontínu na vhodnú koncentráciu. PBS sa použije na riedenie mIFNp na vhodnú koncentráciu.

Spôsob podávania

Osteopontín (AS900011) vdávke 1, 10 a 100 pg/kg sa podával s.c. v objeme 10 ml/kg. mIFNp vdávke 20000 U/myš sa bude podávať s.c. v objeme 200 pl/myš. Skupina 1 bude dostávať s.c. dávku s PBS plus 0,1% BSA v objeme 10 ml/kg a skupina 2 dostane s.c. dávku s 200 pl PBS/myš.

Trvanie ošetrovania

Ošetrovanie skupín v tejto štúdii začne pre každé zviera pri objavení sa klinického skóre 1 a bude pokračovať 35 po sebe nasledujúcich dní.

Forma podávania

Zlúčenina a mIFNp sa podávali ako roztoky vo vhodnom vehikulu. Príslušné formulácie budú pripravované v súlade s inštrukciami sponzora.

-88Klinické pozorovania

Začínajúc na 7. deň po imunizácii sa zvieratá individuálne skúmali na prítomnosť paralýzy prostredníctvom klinického skóre nasledovne:

= žiadna známka ochorenie

0,5 = čiastočná paralýza chvosta = paralýza chvosta

1.5 = paralýza chvosta + čiastočná unilaterálna paralýza zadných končatín = paralýza chvosta + slabosť zadných končatín alebo čiastočná paralýza zadných končatín

2.5 = paralýza chvosta + čiastočná paralýza zadných končatín (znížená panva) = paralýza chvosta + kompletná paralýza zadných končatín

3.5 = paralýza chvosta + kompletná paralýza zadných končatín + inkontinencia = paralýza chvosta + paralýza zadných končatín + slabosť alebo čiastočná paralýza predných končatín = chabosť alebo smrť

Pozorovanie zvierat sa uskutočňovalo v tichej miestnosti. Klinické známky sa monitorovali denne v každej ošetrovacej skupine slepým spôsobom technickým pracovníkom, ktorý nebol informovaný o ošetreniach.

Denne sa monitorovala telesná hmotnosť zvierat.

Zvieratá považované za trpiace bolesťou alebo v predsmrtnom stave vyšetril veterinár alebo autorizovaný člen personálu a, ak to bolo nevyhnutné, humánne sa usmrtili, aby sa minimalizovala neopodstatnená bolesť alebo utrpenie.

Odoberanie krvi hodín po poslednom ošetrení sa z každého zvieraťa odobrali krvné vzorky (pod pentobarbitálovou anestézou). Sérum sa oddelilo rutinným postupom a sérové vzorky sa udržiavali uskladnené pri -20 °C. Zmrazené séra sa potom zaslali na SPRI na relatívne determinácie sérovej koncentrácie zlúčenín.

Histopatologické vyšetrenia

Na konci ošetrenia sa zvieratá, v pentobarbitálovej anestéze, perfúzne fixovali so 4% formaldehydom cez ľavú komoru. Potom sa opatrne vybrali ich

-89miechy a fixovali sa vo formalíne. Rezy miechy sa zabalili do parafínových blokov. Uskutočnilo sa rezanie a farbenie s hematoxylínom a eozínom pre zápal, a s KluverPAS (Luxol fast blue plus Periodic Acid Schiff farbenie) na detekciu demyelinizácie.

Hodnotenie dát

Výsledky klinických vyšetrení sú vyjadrené ako priemerné (± SEM) skóre v rámci každej skupiny. Účinky testovaných látok boli porovnávané s účinkami vo vehikulom ošetrenej pozitívnej kontrolnej skupine. Rozdiely v hodnotách klinického skóre medzi skupinami sa analyzovali Kruskal-Wallis testom, v prípade významnosti párovým spôsobom, Wilcoxonovým testom, v každom meranom čase. Údaje o telesnej hmotnosti boli hodnotené jednosmernou ANOVA, v prípade významnosti, Tukey testom. Bol použitý S-Plus® Software.

Výsledky

Výsledky tejto štúdie sú znázornené na obrázkoch 14 až 16.

Histologická analýza perivaskulárnych zápalových infiltrátov odhalila, že existuje trend smerom k nižšiemu množstvu perivaskulárnych infiltrátov v OPN ošetrených zvieratách, najmä pri najnižšom podávanom množstve 1 pg/kg. Kombinácia OPN a IFNp, čo je zlúčenina, o ktorej je známe, že je aktívna pri liečení sklerózy multiplex, bola účinnejšia ako podávanie samotného OPN, alebo podávanie samotného IFN (obrázok 14).

Ďalej sa meralo percento demyelinizovaných oblastí (obrázo 15). Znova, u zvierat ošetrených s OPN mohol byť pozorovaný trend smerom k menšiemu počtu demyelinizovaných oblastí. Kombinácia IFN a OPN viedla k veľmi významnej redukcii demyelinizácie, ktorá bola ešte oveľa nižšia ako rozsah demyelinizácie, ktorý bol pozorovaný len so samotným IFN (obrázok 15).

Obrázok 16 sumarizuje klinické skóre pozorované na konci ošetrenia, pričom v tejto štúdii sa merali zápalové infiltráty a demyelinizácia. Hoci klinické skóre pozorované u OPN ošetrených myší nebolo významne nižšie ako pri kontrole, kombinácia OPN a IFN viedla k výnimočnému účinku na klinické skóre, ktoré bolo také nízke, ako pri pozitívnej kontrole, interferón beta. Toto pozorovanie je v súlade

-90s meraniami zápalových infiltrátov a rozsahu demyelinizácie. Oba parametre boli významne redukované po podávaní OPN a IFNp (obrázok 16).

Sumárne sa v tejto štúdii získali nasledujúce výsledky:

Osteopontín (AS900011), testovaný samostatne v dávkach 1, 10 a 100 mg/kg s.c. neredukoval perivaskulárne infiltráty a demyelinizáciu štatisticky významne. Ošetrenie s mIFNbeta (20000 U/myš s.c.) indukovalo redukciu perivaskulárnych infiltrácií (55 %) a demyelinizácie (53 %). Keď sa mlFbeta v rovnakej dávke skombinoval sAS900011 v dávke 100 mg/kg s.c., pozorovala sa významná a značná redukcia v zápalových infiltráciách (71 %) a demyelinizácii (81 %).

Histologické údaje korelovali s klinickým skóre pozorovaným na 35. deň (koniec ošetrovania), keď sa zvieratá usmrtili a izolovala sa miecha na histologickú analýzu. Osteopontín (AS900011) testovaný samostatne v dávkach 1, 10 a 100 mg/kg s.c. neredukoval významne závažnosť ochorenia. Ošetrenie s mIFNbeta (20000 U/myš s.c.) významne redukovalo závažnosť ochorenia. Keď sa mIFNbeta v rovnakej dávke skombinoval s AS900011 v dávke 100 mg/kg s.c., bol pozorovaný štatisticky významný pokles klinických príznakov.

Tieto údaje naznačujú, že kombinované osteopontínové a mIFNbeta ošetrenie je účinné tak na redukciu klinických, ako aj patologických účinkov na myšacom EAE modeli, a preto môže byť účinný na liečenie sklerózy multiplex.

Príklad 12

Ochranný účinok osteopontínu na neuropatiu indukovanú rozmliaždením sedacieho nervu u myší

Skratky

CMAP: svalový akčný potenciál zlúčeniny

EMG: elektromyografia

IGF-1: rastový faktor podobný inzulínu

SC: subkutánny

s.e.m.: štandardná chyba priemeru vs: versus

-91 Úvod

Neuropatie sú zvyčajne selektívne čo sa týka typu postihnutých PNS neurónov (napr. senzorické versus autonómne) a v skutočnosti aj čo sa týka podtypu neurónov (malé versus veľké). Axotómia periférnych nervov je najbežnejšie používaným zvieracím modelom na zhodnotenie neuroprotektívnych účinkov neurotrofných faktorov. Traumatické nervové poškodenie, plexus lézie a koreňové lézie sú vážnou komplikáciou nehôd. Okrem toho je možné často vidieť tlak na periférny nerv, ktorý môže spôsobiť myelínové poškodenie pri poruchách, ako napríklad karpálnom tunelovom syndróme, alebo je tento tlak spojený s miechovými ortopedickými komplikáciami. Axotómia vytvára fenomény akými sú napríklad bunková smrť, znížená axonálna vodivostná rýchlosť, a mení hladinu neurotransmiterov v poškodených neurónoch. Pomiiaždeninové lézie umožňujú regeneráciu, čo je ďalší proces, o ktorý je záujem v súvislosti s neuropatickými stavmi (McMahon S. a Priestley J.V. 1995).

Fundmentálnou otázkou v bunkovej neurobiológii je regulácia nervovej regenerácie po poranení alebo ochorení. Funkčná nervová regenerácia vyžaduje nie len pučanie a predlžovanie axónov, ale aj syntézu nového myelínu. Remyelinizácia je nevyhnutná na obnovenie normálneho nervového vedenia a na ochranu axónov pred novými neurodegeneratívymi imunologickými útokmi. Primárnym cieľom výskumu neurodegeneratívnych porúch je nakoniec vyvinúť intervencie, ktoré zabránia smrti neurónov, udržia fenotyp neurónov a opravia poškodenie neurónov a myelínu. Mnohé štúdie boli venované odhaleniu molekulových a bunkových mechanizmov zodpovedných za úplnú regeneráciu axotomizovaných miechových motorických neurónov (Fawcett a ďalší, 1990; Funakoshi a ďalší, 1993). Poranením indukovaná expresia neurotrofných faktorov a zodpovedajúcich receptorov môže hrať dôležitú úlohu v schopnosti nervovej regenerácie. Predchádzajúce štúdie ukázali významné zlepšenie nervovej regenerácie s rôznymi peptidmi a nepeptidovými zlúčeniami, ako napríklad s rastovým faktorom podobným inzulínu (IGF-1), ACTH (Lewis a ďalší, 1993; Strand a ďalší, 1980), testosterónom (Jones, 1993), SR57746A (Fourier a ďalší, 1993) a 4metylkatecholom (Kaechi K a ďalší, 1993, 1995; Hanaoka Y a ďalší, 1992).

-92Predložená štúdia sa uskutočňovala na zhodnotenie nervovej regenerácie u myší ošetrených s osteopontínom v rôznych dávkach. V tomto modeli by mohol viesť pozitívy účinok OPN na prežívanie a regenerovanie neurónov a axónov (senzorických a motorických neurónov), na myelinizáciu alebo na makrofágový zápal, k obnoveniu motorickej funkcie. Regenerácia môže byť meraná podľa obnovenia senzomotorických funkcií a morfologickými štúdiami. Preto sa v tejto práci uskutočňovali paralelne elektrofyziologické záznamy a histomorfometrická analýza.

Materiály a metódy

Zvieratá

Použilo sa 84 osemtýždňových samičiek C57bl/6 RJ myší (Elevage Janvier, Le Genest-St-lsle, Francúzsko). Boli rozdelené do 7 skupín (n = 12): (a) fingovaná skupina pracujúca s vehikulom; (b) skupina s rozmliaždeným nervom pracujúca s vehikulom; (c) pomliaždený nerv/osteopontín (1 μg/kg); (d) pomliaždený nerv/osteopontín (10 μg/kg); (e) pomliaždený nerv/osteopontín (100 pg/kg); (f) pomliaždený nerv/4-metylkatechol (10 pg/kg); (g) pomliaždený nerv/denaturovaný osteopontín (100 pg/kg).

Boli umiestnené po skupinách (5 zvierat v klietke) a udržiavali sa v inkubátore s kontrolovanou teplotou (21 až 22 °C) a mali otočený cyklus svetla a tmy (12h/12h), pričom potrava a voda boli dostupné podľa chuti. Všetky experimenty sa uskutočňovali v súlade so základnými smernicami.

Lézia sedacieho nervu

Zvieratá sa anestetizovali IP injekciou 60 mg/kg ketamín chlorohydrátu (Imalgene 500®, Rhône Mérieux, Lyon, Franzúzsko). Pravý sedací nerv sa chirurgicky odkryl v strede stehna a mliaždil sa 5 mm proximálne od trojrozkonárenia sedacieho nervu. Nerv sa mliaždil dvakrát 30 sekúnd s hemostatickými lekárskymi kliešťami (šírka 1,5 mm; Koening; Strasbourg; Francúzsko) s 90 stupňovou rotáciou medzi každým mliaždením.

-93Plánovanie experimentov a farmakologického liečenia

Elektromyografické (EMG) testovanie sa uskutočňovalo raz pred dňom chirurgického zákroku (základná úroveň) a každý týždeň počas 3 týždňov po operácii.

Deň chirurgického zákroku mliaždiaceho nerv bol považovaný za deň 0. Žiadny test sa neuskutočňoval počas 4 dní nasledujúcich po pomliaždení.

Každý deň sa zaznamenávala telesná hmotnosť a miera pomliaždenia.

Odo dňa poranenia nervu až po koniec štúdie sa osteopontín a denaturovaný osteopontín podávali denne SC spôsobom, pričom denná injekcia 4-metylkatecholu sa uskutočňovala IP.

Na 4. týždeň sa 4 zvieratá na skupinu usmrtili a vypitval sa sedací nerv, aby sa uskutočnila morfologická analýza.

Elektrofyziologické zaznamenávanie

Elektrofyziologické záznamy sa uskutočňovali použitím Neuromatic 2000M elektromyografu (EMG) (Dantec, Les Ulis, Francúzsko). Myši sa anestetizovali intraperitoneálnou injekciou 100 mg/kg ketamín chlórhydrátu (Imalgene 500®, Rhône Mérieux, Lyon, Francúzsko). Normálna telesná teplota sa udržiavala na 30 °C zahrievacou lampou a kontrolovala sa kontaktným teplomerom (Quick, Bioblock Scientific, lllkirch, Francúzsko) umiestneným na chvoste.

Svalový akčný potenciál zlúčeniny (CMAP) sa meral v gastrocnemius svale po jedinej 0,2 ms stimulácii sedacieho nervu zo supramaximálnou intenzitou (12,8 mA). Merala sa amplitúda (mV), latencia (ms) a trvanie (čas potrebný na zhromaždenie) akčného potenciálu. Z amplitúdy vyplýva počet aktívnych motorických jednotiek, zatiaľ čo distálna latencia nepriamo odráža motorické nervové vedenie a rýchlosti neurosvalovej transmisie.

Morfometrická analýza

Morfometrická analýza sa uskutočňovala 3 týždne po pomliaždení nervu. Na túto analýzu sa použili štyri náhodne vybrané zvieratá na skupinu. Anestetizovali sa s IP injekciou 100 mg/kg Imalgee 500®. 5mm segment sedacieho nervu sa vyrezal na histológiu. Tkanivo sa fixovalo cez noc so 4% vodným roztokom glutaraldehydu

-94(Sigma, L'lsle d'Abeau-Chesnes, Francúzsko) vo fosfátovom tlmivom roztoku (pH = 7,4) a udržiaval sa v 30 % sacharóze pri 4 °C až do použitia. Nerv sa fixoval v 2% oxide osmičitom (Sigma, L'lsle D'Abeau-Chesnes, Francúzsko) vo fosfátovom tlmivom roztoku 2 hodiny a dehydratoval sa v seriálnych alkoholových roztokoch a obalil sa v Epone. Obalené tkanivá sa potom umiestnili na +70 °C počas 3 dní na polymerizáciu. Urobili sa transverzné rezy s hrúbkou 1,5 pm s mikrotomom a farbili sa s 1% toluidínovou modrou (Sigma, L'lsle d'Abeau-Chesnes, Francúzsko) 2 minúty a dehydratovali a zmontovali sa v Eukitte. Pozorovalo sa 20 rezov z každej vzorky na optickom mikroskope (Niko, Tokyo, Japosko) a uskutočnila sa morfometrická analýza na 6 náhodných rezoch pre každú vzorku nervu s poloautomatickým digitálnym obrazovým analyzačným softwarom (Biocom, Francúzsko). Študovali sa dve polia z každého rezu. Vypočítali sa nasledujúce parametre: percento degenerovaných vlákien (na pole) a celkový počet vlákien.

Analýza údajov

Globálna analýza údajov sa uskutočňovala použitím jedného faktora alebo opakovanou mierovou analýzou variancie (anova) a jednosmernou anova, a neparametrickými testami (Mann-Whitney test). Ak to bolo vhodné, použil sa aj Dunetov test. Úroveň významnosti bola nastavená na p < 0,05. Výsledky sú vyjadrené ako priemer ± štandardná chyba priemeru (s.e.m.).

Výsledky

Všetky zvieratá prežili pomliaždenie nervu. Myš (nervové pomliaždenie/vehikulum č. 2) uhynula na 7. deň a 2 myši (fingované vzorky ošetrené vehikulom č. 3 a č. 6) uhynuli na 14. deň, v dôsledku anestézy počas EMG hodnotenia.

Hmotnosť zvierat

Ako je ilustrované na obrázku 17, zaznamenala sa signifikantná medziskupina pri hodnotení telesnej hmotnosti počas štúdie [F (6, 132) = 1,93 ap < 0,001; opakované merania ANOVA].

-95Všetky rozdielne skupiny vykazovali zvýšenie telesnej hmotnosti počas štúdie.

Elektrofyziologické merania

Amplitúda svalového akčného potenciálu zlúčenín (obrázok 18)

Bol pozorovaný významný medziskupinový rozdiel v amplitúde CMAP v priebehu štúdie [F (6, 18) = 49,185 ap < 0,001; opakované merania ANOVA]. (obrázok 19).

Po poranení nervu, všetky zvieratá, ktoré sa podrobili pomliaždeniu nervu, vykazovali významný pokles v CMAP amplitúde v porovnaní s fingovanou skupinou (p < 0,001; Dunnettov test).

Navyše, bola na 7. a 14. deň CMAP amplitúda myší ošetrovaných s osteopontínom v dávke 100 pg/kg alebo so 4-metylkatocholom v dávke 10 pg/kg, významne vyššia ako CMAP amplitúda v skupine pomliaždený nerv/vehikulum (p <0,05; Dunettov test).

Nebol pozorovaný žiadny významný rozdiel medzi skupinou pomliaždený nerv/vehikulum a skupinou pomliaždený nerv/D-osteopontín 100 pg/kg.

Latencia svalového akčného potenciálu zlúčenín (obrázok 19)

Ako je ilustrované na obrázku 20, zistil sa významný medziskupinový rozdiel v CMAP latencii [F (6, 18) = 2,521 a p < 0,001; opakované merania ANOVA]. Na 21. deň skupiny s pomliaždeným nervom prezentovali zvýšenú CMAP latenciu v porovnaní s fingovanou skupinou (p < 0,001; Dunettov test). Navyše, ošetrovanie s osteopontínom v dávkach 10 a 100 pg/kg vykazovalo signifikantný účinok, v skutočnosti bola latencia týchto skupín významne menšia ako latencia skupiny pomliaždený nerv/vehikulum (p = 0,017; Dunnettov test).

Trvanie svalového akčného potenciálu zlúčeniny (obrázok 20)

Pozoroval sa významný medziskupinový rozdiel v CMAP trvaní v priebehu štúdie [F (6, 18) = 25,15 a p < 0,001; opakované merania ANOVA] (obrázok 20).

-96Od 7. dňa sa pozorovalo významné predĺženie CMAP trvania v skupinách s pomliaždeným nervom (fingovaná skupina vs skupiny s pomliaždeným nervom: p <0,001; Dunnettov test). Okrem toho na 7. deň skupina pomliaždený nerv/osteopotín 100 pg/kg vykazovala významne kratšie trvanie ako skupina pomliaždený nerv/vehikulum (p <0,001; Dunnettov test).

Na 14. a 21. deň tri skupiny prezentovali významné skrátenie trvania v porovnaní so skupinou pomliaždený nerv/vehikulum; a to skupiny: (a) pomliaždený nerv/osteopontín 10 pg/kg; (b) pomliaždený nerv/osteopontín 100 pg/kg; (c) pomliaždený nerv/4-metylkatechol 10 pg/kg.

Okrem toho nebol pozorovaný žiadny významný rozdiel medzi skupinou pomliaždený nerv/vehikulum a skupinou pomliaždený nerv/D-osteopontín 100 pg/kg.

Morfometrická analýza

Percento degenerovaných vlákien (obrázok 21)

Štatistická analýza odhalila významný medziskupinový rozdiel v percente degenerovaných vlákien na pole (p < 0,001; jednosmerná ANOVA) (obrázok 22). Všetky skupiny s pomliaždeným nervom vykazovali významne zvýšené percento degenerovaných vlákien (p < 0,001, Dunnettov test). Okrem toho ošetrované myši s pomliaždeným nervom prezentovali významne nižšie percento ako myši v skupine pomliaždený nerv/vehikulum (p < 0,001; Dunnettov test). Okrem toho, skupina ošetrovaná s D-osteopontínom (100 pg/kg) vykazovala vyššie percento degenerovaných vlákien ako skupiny ošetrované s osteopontínom (p <0,001; Dunnettov test).

Celkový počet vlákien (obrázok 22)

Rezy sa pozorovali použitím optického mikroskopu a morfometrická analýza sa uskutočňovala pomocou Visiolab 2000 softwaru (Biocom, Paríž, Frncúzsko). Analyzovalo sa päť rezov z každého zvieraťa a 2 polia z každého rezu. Počítačom sa zaznamenávali len funkčné myelinizované vlákna (nezaznamenávali sa degenerované vlákna, teda vlákna s degeneorvaným myelínovým obalom).

-97Závery

Model pomliaždenia nervu je veľmi dramatickým modelom periférnej neuropatie. Okamžite po pomliaždení nervu sa stráca väčšina vlákien s veľkým priemerom, kvôli mechanickému poškodeniu vedúcemu k silnému poklesu v CMAP amplitúde. CMAP latencia nie je okamžite poškodená, ako vykazuje nárast na 21. deň, v dôsledku ďalšej sekundárnej degenerácie vlákien s malým priemerom, imunitné sprostredkovanej degenerácie (makrofágy, granulocyty). CAMP trvanie sa predlžuje na 7. deň, vrchol dosahuje na 14. deň a na pôvodné úrovne, ktoré sú porovnateľné s úrovňami na 7. deň, sa vracia na 21. deň. To je spôsobené skutočnosťou, že na 21. deň je umožnená regenerácia pomliaždených lézií, čo je ďalší proces, o ktorý je záujem v súvislosti s neuropatickými stavmi. Toto pučanie axónov/regenerácia bolo evidentné v kontrolných skupinách po 3 týždňoch.

Osteopontín vykazoval ochranný účinok na myšacom modeli pomliaždenia nervu. Senzomotorické funkcie boli významne obnovené na 7., 14. a 21. deň po poranení na dávke závislým spôsobom a morfologické štúdie uskutočňované na 21. deň po pomliaždení ukázali významný pokles percenta degenerujúcich vlákien a zvýšenie celkového počtu vlákien. OPN je rovnako účinný ako kontrolná molekula používaná v tejto štúdii, 4-metylkatechol, a tepelne inaktivovaný, degenerovaný OPN proteín nevykazoval žiadny signifikantný vplyv na funkčné alebo histologické parametre. Tento pozitívy vplyv na funkčné a histologické zotavenie môže byť vďaka OPN účinkom na:

- priamu ochranu vlákien pred sekundárnou imunitné sprostredkovanou degeneráciou:

- zrýchlenie remyelinizácie a ochranu axónov;

- zrýchlenie regenerácie/pučania poškodených axónov;

- zvýšenie myelínových úlomkov odstraňovaných makrofágmi.

-98Zoznam sekvencii <110> Applied Research Systems ARS Holding N.V.

<120> Použitie osteopontínu na liečenie a/alebo prevenciu demyelinizujúcich ochorení <130> WO473 <150> 01111296 <151> 2001-05-17 <160> 5 <170> Patentln version 3.1 <210> 1 <211> 314 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1

Met

Arg

íle

Ala

Val

íle

Cys

Phe

Cys

Leu

Leu

Gly

íle

Thr

Cys

Ala

1

5

10

15

íle

Pro

Val

Lys

Gin

Ala

Asp

Ser

Gly

Ser

Ser

Glu

Glu

Lys

Gin

Leu

20

25

30

Tyr

Asn

Lys

Tyr

Pro

Asp

Ala

Val

Ala

Thr

Trp

Leu

Asn

Pro

Asp

Pro

35

40

45

Ser

Gin

Lys

Gin

Asn

Leu

Leu

Ala

Pro

Gin

Asn

Ala

Val

Ser

Ser

Glu

50

55

60

Glu

Thr

Asn

Asp

Phe

Lys

Gin

Glu

Thr

Leu

Pro

Ser

Lys

Ser

Asn

Glu

65

70

75

80

Ser

His

Asp

His

Met

Asp

Asp

Met

Asp

Asp

Glu

Asp

Asp

Asp

Asp

His

Val

Asp

Ser

Gin 100

Asp

Ser

íle Asp Ser 105

Asn

Asp

Ser Asp Asp Val Asp 110

Asp

Thr

Asp

Asp

Ser

His

Gin

Ser

Asp

Glu

Ser

His

His

Ser

Asp

Glu

115

120

125

Ser

Asp

Glu

Leu

Val

Thr

Asp

Phe

Pro

Thr

Asp

Leu

Pro

Ala

Thr

Glu

130

135

140

Val

Phe

Thr

Pro

Val

Val

Pro

Thr

Val

Asp

Thr

Tyr

Asp

Gly

Arg

Gly

145

150

155

160

Asp

Ser

Val

Val

Tyr

Gly

Leu

Arg

Ser

Lys

Ser

Lys

Lys

Phe

Arg

Arg

165

170

175

Pro

Asp

íle

Gin

Tyr

Pro

Asp

Ala

Thr

Asp

Glu

Asp

íle

Thr

Ser

His

180

185

190

Met

Glu

Ser

Glu

Glu

Leu

Asn

Gly

Ala

Tyr

Lys

Ala

íle

Pro

Val

Ala

195

200

205

Gin

Asp

Leu

Asn

Ala

Pro

Ser

Asp

Trp

Asp

Ser

Arg

Gly

Lys

Asp

Ser

210

215

220

Tyr

Glu

Thr

Ser

Gin

Leu

Asp

Asp

Gin

Ser

Ala

Glu

Thr

His

Ser

His

225

230

235

240

Lys

Gin

Ser

Arg

Leu

Tyr

Lys

Arg

Lys

Ala

Asn

Asp

Glu

Ser

Asn

Glu

245

250

255

His

Ser

Asp

Val

íle

Asp

Ser

Gin

Glu

Leu

Ser

Lys

Val

Ser

Arg

Glu

260

265

270

Phe

His

Ser

His

Glu

Phe

His

Ser

His

Glu

Asp

Met

Leu

Val

Val

Asp

275

280

285

Pro

Lys

Ser

Lys

Glu

Glu

Asp

Lys

Eis

Leu

Lys

Phe

Arg

íle

Ser

His

290

295

300

Glu

Leu

Asp

Ser

Ala

Ser

Ser

Glu

Val

Asn

305 310 <210> 2 <211> 299 <212> PRT <213> Homo sapíens <400> 2

Met Arg íle Ala Val íle Cys Phe Cys Leu Leu Gly íle Thr Cys Ala

100 íle Pro

Tyr Asn

Ser Gin

Glu Ser

His Val

Asp Asp

Glu Ser

Glu Val

130 Gly Asp 145

Arg Pro

His Met

Ala Gin

Ser Tyr

210 His Lys 225

Glu His

Glu Phe

Asp Pro

His Glu

Val Lys

Lys Tyr 35

Lys Gin

His Asp

Asp Ser

Thr Asp

100 Asp Glu 115

Phe Thr

Ser Val

Asp íle

Glu Ser

180 Asp Leu 195

Glu Thr

Gin Ser

Ser Asp

His Ser

260 Lys Ser 275

Leu Asp

Gin Ala

Pro Asp

Asn Leu

His Met

Gin Asp 85

Asp Ser

Leu Val

Pro Val

Val Tyr 150

Gin Tyr 165

Glu Glu

Asn Ala

Ser Gin

Arg Leu 230

Val íle

245

His Glu

Lys Glu

Ser Ala

Asp Ser

Ala Val

Leu Ala

Asp Asp

Ser íle

His Gin

Thr Asp 120

Val Pro

135

Gly Leu

Pro Asp

Leu Asn

Pro Ser

200

Leu Asp 215

Tyr Lys

Asp Ser

Phe His

Glu Asp 280

Ser Ser

Gly Ser 25

Ala Thr

Pro Gin

Met Asp

Asp Ser

Ser Asp

105

Phe Pro

Thr Val

Arg Ser

Ala Thr

170 Gly Ala 185

Asp Trp

Asp Gin

Arg Lys

Gin Glu

250

Ser His

265

Lys His

Glu Val

Ser Glu

Trp Leu

Leu Pro

Asp Glu 75

Asn Asp

Glu Ser

Thr Asp

Asp Thr 140

Lys Ser 155

Asp Glu

Tyr Lys

Asp Ser

Ser Ala

220

Ala Asn

235

Leu Ser

Glu Asp

Leu Lys

Asn

Glu Lys

Asn Pro

Ser Lys

Asp Asp

Ser Asp

His His

110

Leu Pro

125

Tyr Asp

Lys Lys

Asp íle

Ala íle

190 Arg Gly 205

Glu Thr

Asp Glu

Lys Val

Met Leu

270 Phe Arg 285

Gin Leu

Asp Pro

Ser Asn

Asp Asp 80

Asp Val 95

Ser Asp

Ala Thr

Gly Arg

Phe Arg 160

Thr Ser

175

Pro Val

Lys Asp

His Ser

Ser Asn

240

Ser Arg

255

Val Val íle Ser

290

295

101 <210> 3 <211> 286 <212> PRT <213> Homo sapiens <210> 3 <211> 286 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3

Met 1	Arg	íle	Ala	Val 5	íle	Cys	Phe
íle	Pro	Val	Lys 20	Gin	Ala	Asp	Ser
Val	Ser	Ser 35	Glu	Glu	Thr	Asn	Asp 40
Lys	Ser 50	Asn	Glu	Ser	His	Asp 55	His
Asp 65	Asp	Asp	His	Val	Asp 70	Ser	Gin
Asp	Asp	Val	Asp	Asp 85	Thr	Asp	Asp
His	Ser	Asp	Glu 100	Ser	Asp	Glu	Leu
Pro	Ala	Thr 115	Glu	Val	Phe	Thr	Pro 120
Asp	Gly 130	Arg	Gly	Asp	Ser	Val 135	Val
Lys 145	Phe	Arg	Arg	Pro	Asp 150	íle	Gin
íle	Thr	Ser	His	Met 165	Glu	Ser	Glu
íle	Pro	Val	Ala 180	Gin	Asp	Leu	Asn
Gly	Lys	Asp 195	Ser	Tyr	Glu	Thr	Ser 200
Thr	His 210	Ser	His	Lys	Gin	Ser 215	Arg
Glu 225	Ser	Asn	Glu	His	Ser 230	Asp	Val
Val	Ser	Arg	Glu	Phe	His	Ser	His

245

Cys Leu Leu Gly íle Thr Cys Ala 10 15

Gly Ser Ser Glu Glu Lys Asn Ala

30

Phe Lys Gin Glu Thr Leu Pro Ser

Met Asp Asp Met Asp Asp Glu Asp 60

Asp Ser íle Asp Ser Asn Asp Ser 75 80

Ser His Gin Ser Asp Glu Ser His 90 95

Val Thr Asp Phe Pro Thr Asp Leu

105 110

Val Val Pro Thr Val Asp Thr Tyr

125

Tyr Gly Leu Arg Ser Lys Ser Lys 140

Tyr Pro Asp Ala Thr Asp Glu Asp 155 160

Glu Leu Asn Gly Ala Tyr Lys Ala 170 175

Ala Pro Ser Asp Trp Asp Ser Arg

185 190

Gin Leu Asp Asp Gin Ser Ala Glu

205

Leu Tyr Lys Arg Lys Ala Asn Asp 220 íle Asp Ser Gin Glu Leu Ser Lys 235 240

Glu Phe His Ser His Glu Asp Met

250

255

102 -

Leu

Val

Val

Asp 260

Pro

Lys

Ser

Lys Glu Glu 265

Asp

Lys

His

Leu Lys 270

Arg

íle

Ser

His

Glu

Leu

Asp

Ser

Ala

Ser

Ser

Glu

Val

Asn

275

280

285

<210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Homosapiens <400> 4 agcctgcacc cagatcctat ag <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Homosapiens <400> 5 gcgcaaggag attctgcttc t

-108<

Zoznam použitej literatúry

1. Abramsky, O. a Ovadia, H. (1997) Frontiers in Multiple Sclerosis, clinical research and therapy. Martin Dunitz publisher, London.

2. Altschul S F a ďalší, J Mol Biol, 215, 403-410, 1990, Altschul S F a ďalší, Nucleic Acids Res., 25:389-3402, 1997

3. Barres, B.A., a Raff, M.C. Axonal control of oligodendrocyte development. Journal of Celí Biology 147(6): 1123-8, 1999.

4. Barres, B.A., Schmid, R., Sendnter, M., a Raff, M.C. Multiple extracellular signals are required for long-term oligodendrocyte survival. Development 118(1): 283-95, 1993.

5. Bjartmar, C., Yin, X., a Trapp, B.D. Axonal pathology in myelin disorders. Journal of Neurocytology 28: 383-395, 1999.

6. Breighton, B a Hayden, MR: S Afr Med J. 1981 Feb 21; 59(8): 250.

7. Dal Canto, M.C., Melvold, R.W., Kim, B.S., a Miller, S.D. Two models of multiple sclerosis: experimental allergic encephalomyelitis (EAE) and Theiler's murine encephalomyelitis vírus (TMEV) infection. A pathological and immunological comparison. Microsc. Res. Tech. 32(3): 215-29,1995.

8. Derynk R. a ďalší., Náture 285, 542-547, 1980

9. Devereux J a ďalší, Nucleic Acids Res, 12, 387-395, 1984.

10. Dubois-Dalcq, M., Feigenbaum, V., a Aubourg, P. The neurobiology of X-linked adrenoleukodystrophy, a demyelinating peroxisomal disorder. Trends in Neurosciences 22(1): 4-12, 1999.

H.Dubois-Dalcq, M., a Murray, K. Why are growth factors important in oligodendrocyte physiology? Pathol Biol (Paris) 48(1): 80-6, 2000.

12. Fernández, P.A., Táng, D.G., Cheng, L., Prochiantz, A., Mudge, A.W., a Raff, M.C. Evidence that axon-derived neuregulin promotes oligodendrocyte survival in the developing rat optic nerve. Neurón 28(1): 81-90, 2000.

13. Franklin, R.J., a Hinks, G.L. Understanding CNS remyelination: clues from developmental and regeneration biology. Journal of Neuroscience Research 58(2): 207-13, 1999.

14. Grantham, Science, Vol. 185, pp. 862-864 (1974).

W

-y&š15. Grinspan, J.B., Reeves, M.F., Coulaloglou, M.J., Nathanson, D., a Pleasure, D. Re-entry into the celí cycle is required for bFGF-induced oligodendroglial dedifferentiation and survival. Journal of Neuroscience Research 46(4): 456-64, 1996.

16. Grinspan, J.B., Stern, J.L., Franceschini, B., a Pleasure, D. Trophic effects of basic fibroblast growth factor (bFGF) on differentiated oligodendroglia: a mechanism for regeneration of the oligodendroglial lineage. Journal of Neuroscience Research 36(6): 672-80, 1993.

17. Hajihosseini, M., Tham, T.N., a Dubois-Dalcq, M. Origin of oligodendrocytes within the human spínal cord. Journal of Neuroscience 16(24): 7981-94, 1996.

18. Hartung, H.P., van der Meche, F.G/, Pollard, J.D. (1998) Guillain-Barre syndróme, CIDP and other chronic immune-mediated neuropathies. Curr. Opin. Neurol., 11,497-513

19. Hiremath, M.M., Saito, Y., Knapp, G.W., Ting, J.P., Suzuki, K., a Matsushima,

G.K. Microglial/macrophage accumulation during Cuprizone-induced demyelination in C57BL/6 mice. Journal of Neuroimmunology 92(1-2): 38-49, 1998.

2O.lchikawa H, Itota T, Nishitani Y, Torii Y, Inoue K, Sugimoto T. Brain Res 2000 Apr 28:863(1-2):276-81

21. Jung, M., Krämer, E., Grzenkowski, M., Táng, K., Blakemore, W.F., Aguzzi, A., Khazaie, K., Chlichlia, K., von Blankenfeld, G., Kettenmann, H., a Trotter, J. Lines of murine oligodendroglial precursor celíš immortalized by an activated neu tyrosine kinase show distinct degrees of interaction with axons in vitro and in vivo. European Journal of Neuroscience 7(6): 1245-65, 1995.

22. Kiefer a ďalší. The cDNA and derived amino acid sequence for human osteopontín. Nucleic Acids Res. 1989 Apr 25;17(8):3306.

23. Kon S, Maeda M, Segawa T, Hagiwara Y, Horikoshi Y, Chikuma S, Tanaka K, Rashid MM, Inobe M, Chambers AF, Uede T. (2000) Antibodies to different peptides in osteopontín reveal complexities in the various secreted forms. Journal of Cellular Biochemistry 77(3): 487-98.

24. Kon S, Yokosaki Y, Maeda M, Segawa T, Horikoshi Y, Tsukagoshi H, Rashid MM, Morimoto J, Inobe M, Shijubo N, Chambers AF, Uede T. (2002) Mapping of ήοζ'

-ji#'functional epitopes of osteopontín by monoclonal antibodies raised against defined internal sequences. Journal of Cellular Biochemistry 84(2): 420-32.

25. Kunicki, T.J., Annis, D.S., a Felding-Habermann, B. Molecular determinante of arg-gly-asp ligand specificity for β3 integrins. Journal of Biological Chemistry 272(7):4103-7, 1997.

26. Lee a ďalší. Transient upregulation of osteopontín mRNA in hippocampus and striatum following global forebrain ischemia in rats. Neurosci Lett. 1999 Aug 20:271(2):81-4.

27. Lipton, S. A., a Rosenberg, P. A. (1994). Excitatory amino acids as a final common pathway for neurológie disorders. N Engl J Med, 330, 613-22.

28. Loius J.C., Magal E., Muir D., Manthorpe M., Varan S. (1992) CG-4 A new bipontial glial celí line from rat brain, is capable of differentiating in vitro into either mature oligodendrocytes or type-2 astrocytes. J Neuroscience Research 31, 193-204.

29. Lubetzki, C., Demerens, C., Anglade, P., Villarroya, H., Frankfurter, A., Lee, M.Y., a Zalc, B. Even in culture, oligodendrocytes myelinate solely axons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 90: 6820-6824, 1993.

30. Marchionni, M.A., Cannella, B., Hoban, C., Gao, Y.L., Garcia-Arenas, R., Lawson, D., Happel, E., Noel, F., Tofilon, P., Gwynne, D., a Raine, C.S. Neuregulin in neuron/glial interactions in the centrál nervous systém. GGF2 diminishes autoimmune demyelination, promotes oligodendrocyte progenitor expansion, and enhances remyelination. Advances in Experimental and Medical Biology 468: 283-95, 1999.

31. Mark a ďalší. (Mark D.F. a ďalší., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81 (18) 56625666, 1984)

32. Matthieu, J.M., Comte, V., Tosic, M., a Honegger, P. Myelin gene expression during demyelination and remyelination in aggregating brain celí cultures. Journal of Neuroimmunology 40(2-3): 231-4, 1992.

33. McDonald, J. W., Althomsons, S. P., Hyrc, K. L., Choi, D. W., a Goldberg, M. P. (1998). Oligodendrocytes from forebrain are highly vulnerable to AMPA/kainate receptor-mediated excitotoxicity. Nat Med, 4, 291-7.

W

- JX34. Morell, P., Barrett, C.V., Mason, J.L., Toews, A.D., Hostettler, J.D., Knapp, G.W., a Matsushima, G.K. Gene expression in brain during Cuprizone-induced demyelination and remyelination. Molecular and Cellular Neurosciences 12(4/5): 220-227, 1998.

35. Nait-Oumesmar, B., Decker, L., Lachapelle, F., Avellana-Adalid, V., Bachelin, C., a Van Evercooren, A.B. Progenitor celíš of the adult mouse subventricular zóne proliferate, migrate and differentiate into oligodendrocytes after demyelination. European Journal of Neuroscience 11(12): 4357-66, 1999.

36. Ng, W.P., Cartel, N., Roder, J., Roach, A., a Lozano, A. Human centrál nervous systém myelin inhibits neurite outgrowth. Brain Research 720(1-2): 17-24, 1996.

37. Noseworthy, J.H. Progress in determining the causes and treatment of multiple sclerosis. Náture 399: A40-A47, 1999.

38.0ldberg a ďalší., Cloning and sequence analysis of rat bone sialoprotein (osteopontín) cDNA reveals an Arg-Gly-Asp cell-binding sequence.Proc Natl Acad Sci USA. 1986 Dec;83(23):8819-23.

39. Pantoni, L., Garcia, J. H., a Gutierrez, J. A. (1996). Cerebral white matter is highly vulnerable to ischemia. Stroke, 27, 1641-6.

40. Pearson W R, Methods in Enzymology, 183, 63-99, 1990

41. Pearson W R a Lipman D J, Proc Nat Acad Sci USA, 85, 2444-2448,1988

42. Petry, K.G., Boullerne, A.I., Pousset, F., Brochet, B., Caille, J.M., a Dousset, V. Experimental allergic encephalomyelitis animal models for analyzing features of multiple sclerosis. Pathol. Biol. (Paris) 48(1): 47-53, 2000.

43. Pohlau, D., Aktas, O., Epplen, C. Hartung, H.P., Hoffmann, V. a Przuntek, H. (1998) Promoting remyelination as a future therapeutic principle in Multiple Sclerosis. Nervenarzt, 69, 841-850.

44. Prineas, J.W., Barnard, R.O., Kwon, E.E., Sharer, L.R., a Cho, E.S. Multiple sclerosis: remyelination of nascent lesions. Annals of Neurology 33(2): 137-51, 1993.

45. Rodriguez-Peňa, A. Oligodendrocyte development and thyroid hormone. Journal of Neurobiology 40(4): 497-512, 1999.

Wl·46.Rogister, B., Ben-Hur, T., a Dubois-Dalcq, M. From neural stem celíš to myelinating oligodendrocytes. Molecular and Cellular Neurosciences 14(4-5): 287-300, 1999.

47.Sahrbacher, U.C., Lechner, F., Eugster, H.P., Frei, K., Lassmann, H., a Fontana, A. Mice with an inactivation of the inducible nitric oxide synthase gene are susceptible to experimental autoimmune encephalomyelitis. European Journal of Immunology 28(4): 1332-8, 1998.

48.Saitoh Y, Kuratsu J, Takeshima H, Yamamoto S, Ushio Y. (1995) Expression of osteopontin in human glioma, correlation with the malignancy. Laboratory lnvestigations.72(1): 55-63.

49.Scarlato, M., Beesley, J., a Pleasure, D. Analysis of oligodendroglial differentiation using cDNA arrays. Journal of Neuroscience Research 59(3): 4305, 2000.

50.Scherer, S.S. Molecular genetics of demyelination: new wrínkles on an old membráne. Neurón 18: 13-16,1997.

51.Scolding, N., a Lassmann, H. Demyelination and remyelination. Trends in Neurosciences 19(1): 1-2, 1996.

52.Shaw, C.E., Milner, R., Compston, A.S., a ffrench-Constant, C. Analysis of integrin expression on oligodendrocytes during axo-glial interaction by using ratmouse xenocultures. Journal of Neuroscience 16(3): 1163-72, 1996.

53.Shin a ďalší., Expression of osteopontin mRNA in the adult rat brain. Neurosci Lett 1999 Oct 1 ;273(2):73-6.

54.Shepard H. M. a ďalší., Náture, 294, 563-565, 1981

55.Sodek J, Ganss B, McKee MD, Crit Rev Oral Biol Med 2000;11(3):279-303. 56.Smith, P.K., Krohn, R.I., Hermanson, G.T., Mallia, A.K., Gartner, F.H.,

Provenzano, MD., Fujimoto, E.K., Goeke, N.M., Olson, B.J. a Klenk, D.C. (1985). Measurment of proteín using bicinchoninic acid. Anál.Biochem.150, 7685.

57.Smith a Waterman J Mol Biol, 147,195-197, 1981, Advances in Applied Mathematics, 2, 482-489, 1981.

Μ

->L358.Storch, Μ.K., Piddlesden, S., Haltia, M., Iívanainen, M., Morgan, P., a

Lassmann, H. Multiple sclerosis: in situ evidence for antibody- and complementmediated demyelination. Annals of Neurology 43(4): 465-71, 1998.

59. Trojaborg W (1998) Acute and chronic neuropathies: new aspects of GuillainBarre syndróme and chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy, an overview and an update. Electroencephalogr Clin Neurophysiol., 107, 303-316.

60. Trotter, J., Bitter-Suermann, D., a Schachner, M. Differentiation-regulated loss of the polysialylated embryonic form and expression of the different polypeptides of the neural celí adhesion molecule by cultured oligodendrocytes and myelin. Journal of Neuroscience Research 22(4): 369-83, 1989.

61. Wiechelman, K., Braun, R. a Fitzpatrick, J. (1988). Investigation of the bicinchoninic acid proteín assay: Identification of the groups responsible for color formation. Anál.Biochem. 175, 231-237. The degenerated fibers and the normál fibers were counted.

62. Whitney, L.W., Becker, K.G., Tresser, N.J., Caballero-Ramos, C.I., Munson, P.J., Prabhu, V.V., Trent, J.M., McFarland, H.F., a Biddison, W.E. Analysis of gene expression in mutiple sclerosis lesions using cDNA microarrays. Annals of Neurology 46(3): 425-8, 1999.

Claims (22)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Použitie osteopontínu alebo agonistu osteopontínovej aktivity na výrobu lieku na liečenie a/alebo prevenciu neurologického ochorenia.
2. 2. Použitie podľa nároku 1, kde neurologické ochorenie je vybrané zo skupiny, ktorá zahŕňa traumatické nervové poranenie, mŕtvicu, demyelinizujúce ochorenia CNS alebo PNS, neuropatie a neurodegeneratívne ochorenia.
3. 3. Použitie podľa nároku 1 alebo 2, kde je neurologické ochorenie spôsobené vrodenou metabolickou poruchou.
4. 4. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 3, kde neurologickým ochorením je periférna neuropatia.
5. 5. Použitie podľa nároku 4, kde neurologickým ochorením je diabetická neuropatia.
6. 6. Použitie podľa nároku 2, kde demyelinizujúcim ochorením je skleróza multiplex (MS).
7. 7. Použitie podľa nároku 2, kde neurodegeneratívne ochorenie je vybrané zo skupiny, ktorá zahrnuje Alzheimerovu chorobu, Parkinsonovu chorobu, Huntingtonovu chorobu a amyotrofickú laterálnu sklerózu (ALS).
8. 8. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 7, kde osteopontín je vybraný zo skupiny, ktorá zahrnuje:

   (a) polypeptid obsahujúci sekv. č. 1;

   (b) polypeptid obsahujúci aminokyseliny 1 až 168 alebo 170 sekv. č. 1;

   (c) polypeptid obsahujúci aminokyseliny 1 až 16 a 170 až 314 sekv. č. 1;

   (d) polypeptid obsahujúci aminokyseliny 170 až 314 sekv. č. 1;

   (e) polypeptid obsahujúci sekv. č. 2;

   ito

   ->04(f) polypeptid obsahujúci sekv. č. 3;

   (g) muteín ktoréhokoľvek polypeptidu podľa (a) až (f), ktorého aminokyselinová sekvencia je aspoň na 40 % alebo 50 % alebo 60 % alebo 70 % alebo 80 % alebo 90 % zhodná s aspoň s jednou zo sekvencií v (a) až (f);

   (h) muteín ktoréhokoľvek polypeptidu podľa (a) až (f), ktorý je kódovaný DNA sekvenciou hybridizujúcou s komplementom natívnej DNA sekvencie kódujúcej ktorýkoľvek polypeptid podľa (a) až (f) v mierne prísnych podmienkach alebo vo veľmi prísnych podmienkach;

   (i) muteín ktoréhokoľvek polypeptidu (a) až (f), pričom akékoľvek zmeny v aminokyselinovej sekvencii sú konzervatívne aminokyselinové substitúcie v aminokyselinových sekvenciách v (a) až (f);

   (j) soľ alebo izoformu, fúzovaný proteín, funkčný derivát, aktívnu frakciu alebo cirkulárne permutovaný derivát ktoréhokoľvek polypeptidu podľa (a) až (f).
9. 9. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 8, kde osteopontín je fúzovaný s nosičovou molekulou, peptidom alebo proteínom, ktorý podporuje prechod cez krvno-mozgovú bariéru.
10. 10. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 8 alebo 9, kde osteopontín je PEGylovaný.
11. 11. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 8 až 10, kde fúzovaný proteín zahŕňa imunoglobulínovú (Ig) fúziu.
12. 12. Použitie podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov 1 až 11, kde liek ďalej obsahuje interferón na súčasné, postupné alebo oddelené použitie.
13. 13. Použitie podľa nároku 12, kde interferónom je interferón-β.
14. 14. Použitie podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, kde osteopontín sa používa v množstve približne 0,001 až 100 mg/kg telesnej hmotnosti

    - Jj&5 alebo približne 1 až 10 mg/kg telesnej hmotnosti alebo približne 5 mg/kg telesnej hmotnosti.
15. 15. Použitie nukleokyselinovej molekuly na výrobu lieku na liečenie a/alebo prevenciu neurologického ochorenia, kde nukleokyselinová molekula obsahuje nukleokyselinovú sekvenciu kódujúcu polypeptid obsahujúci aminokyselinovú sekvenciu vybranú zo skupiny, ktorá zahrnuje:

    (a) polypeptid obsahujúci sekv. č. 1;

    (b) polypeptid obsahujúci aminokyseliny 1 až 168 alebo 170 sekv. č. 1;

    (c) polypeptid obsahujúci aminokyseliny 1 až 16 a 170 až 314 sekv. č. 1;

    (d) polypeptid obsahujúci aminokyseliny 170 až 314 sekv. č. 1;

    (e) polypeptid obsahujúci sekv. č. 2;

    (f) polypeptid obsahujúci sekv. č. 3;

    (g) muteín ktoréhokoľvek polypeptidu podľa (a) až (f), ktorého aminokyselinová sekvencia je aspoň na 40 % alebo 50 % alebo 60 % alebo 70 % alebo 80 % alebo 90 % zhodná s aspoň s jednou zo sekvencií v (a) až (f);

    (h) muteín ktoréhokoľvek polypeptidu podľa (a) až (f), ktorý je kódovaný DNA sekvenciou hybridizujúcou s komplementom natívnej DNA sekvencie kódujúcej ktorýkoľvek polypeptid podľa (a) až (f) v mierne prísnych podmienkach alebo vo veľmi prísnych podmienkach;

    (i) muteín ktoréhokoľvek polypeptidu (a) až (f), pričom akékoľvek zmeny v aminokyselinovej sekvencií sú konzervatívne aminokyselinové substitúcie v aminokyselinových sekvenciách v (a) až (f);

    (j) izoformu, fúzovaný proteín, funkčný derivát, aktívnu frakciu alebo cirkulárne permutovaný derivát ktoréhokoľvek polypeptidu podľa (a) až (f).
16. 16. Použitie podľa nároku 15, kde nukleokyselinová molekula ďalej obsahuje expresnú vektorovú sekvenciu.
17. 17. Použitie vektora na indukciu a/alebo posilnenie endogénnej produkcie osteopontínu alebo agonistu osteopontínovej aktivity v bunke na výrobu lieku na liečenie a/alebo prevenciu neurologického ochorenia.

    ΉΖ.

    - ιρθ*
18. 18. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 15 až 17 na génovú terapiu.
19. 19. Použitie bunky, ktorá bola geneticky modifikovaná na produkciu osteopontínu alebo agonistu osteopontínovej aktivity, na výrobu lieku na liečenie a/alebo prevenciu neurologického ochorenia.
20. 20. Farmaceutický prostriedok na prevenciu a/alebo liečenie neurologického ochorenia, vyznačujúci sa tým, že obsahuje účinné množstvo osteopontínu alebo agonistu osteopontínovej aktivity a interferón, voliteľne spolu s jedným alebo viacerými farmaceutický prijateľnými excipientami.
21. 21. Použitie osteopontínu alebo agonistu osteopontínovej aktivity, voliteľne spolu s farmaceutický prijateľným nosičom na výrobu lieku na liečenie neurologického ochorenia u pacienta, ktorý takúto liečbu potrebuje.
22. 22. Použitie osteopontínu alebo agonistu osteopontínovej aktivity a interferónu, voliteľne spolu s farmaceutický prijateľným nosičom na výrobu lieku na liečenie neurologického ochorenia u pacienta, ktorý takúto liečbu potrebuje.