BG108337A - Използване на остеопонтин за лечение и/или профилактика на неврологични заболявания - Google Patents

Abstract

Изобретението се отнася до използване на остеопонтин или агонист на активност на остеопонтин за лечение или профилактика на неврологично заболяване. а

Description

Настоящото изобретение е в областта на неврологичните заболявания и разстройства. То се отнася до предпазване на нервите, миелиниране на нервите и генериране или регенериране на клетките, произвеждащи миелин. По-специално, то се отнася до демиелиниращи и нервнодегенеративни заболявания, невропатии, травматично увреждане на нервите, поддържане на температура и неврологични заболявания, причинени от конгенитални метаболитни разстройства. По-специално настоящото изобретение се отнася до използването на остеопонтин или агонист на остеопонтинната активност за производството на лекарство за лечение и/или профилактика на неврологични заболявания.

ПРЕДШЕСТВАЩО НИВО НА ТЕХНИКАТА

Миелинирането на нервите е съществен процес при образуването и функционирането на отделенията на централната нервна система (CNS) и периферната нервна система (PNS). Миелиновата обвивка около аксоните е необходима за правилното провеждане на електрически импулси по протежение на нервите. Загуба на миелин се наблюдава при редица заболявания, между които са множествена склероза (MS), нанасяща поражение на централната нервна система, синдром на Guillain-Barre, CIDP и други (виж Abramsky и Ovadia, 1997; Trojaborg, 1998, Hartung и сътр., 1998). Макар и с различни етиологии, такива като инфекциозни патогени или автоимунни атаки, всички демилиениращи заболявания причиняват загуба на неврологична функция и може да доведат до парализа и смърт. Докато настоящите терапевтични агенти намаляват възпалителни атаки при множествена склероза и забавят развитието на болестта, съществува необходимост да се развиват терапии, които биха довели до ремиелиниране и възстановяване на неврологичната функция (Abramsky и Ovadia, 1997, Pohlau и сътр., 1998).

Увреждане на централната нервна система, предизвикано от остри инсулти, включително травма, хипоксия и исхемия може да нанесе поражение на двете - на невроните и бялото вещество. Макар че главно внимание е обърнато на процесите, водещи до смърт на невроните, увеличаващи се доказателства навеждат на мисълта, че повреждане на олигодендроцити, които милиенират аксоните, е също специфичен компонент на поражението на централната нервна система. Така олигодендроцитната патология беше демонстрирана при много ранна фаза след удар (3 часа) при плъхове, предполагайки, че тези клетки са даже по-уязвими към ексикотоксични събития отколкото невронните клетки (Pantoni и сътр. 1996). Един потенциален кандидат, посредничещ при клетъчна смърт, е отбелязаното повишение на концентрацията на глутамат, който съпровожда много остри поражения на централната нервна система (Lipton и сътр., 1994). Наистина, освен неврони, също така бяха намерени олигодендроцити, които експресират функционални глутаматни рецептори, принадлежащи на подвида АМРА/каинат. Освен това олигодендроцитите показват висока уязвимост към глутаматно прилагане (McDonald и сътр., 1998).

Травмата е нараняване или повреждане на нерва. Тя може да бъде травма на гръбначния мозък, която представлява повреждане на гръбначния мозък, което засяга цялата нервна функция, контролирана при и под нивото на нараняването, включително мускулния контрол и чувствителност, или мозъчна травма, такава като травма, причинена от нараняване на затворена глава.

Церебрална хипоксия е недостиг на кислород специално към церебралните полусфери и по-широко понятието е използвано за липса на кислород към целия мозък. В зависимост от остротата на хипоксията, симптомите могат да варират от объркване до необратимо увреждане на мозъка, кома и смърт.

Ударът е обикновено причинен от исхемия на мозъка. Той също се нарича цереброваскуларно заболяване или злополука. Това е група от мозъчни разстройства, включващи загуба на мозъчни функции, която настъпва, когато е прекъснато снабдяването с кръв към която и да е част на мозъка. Мозъкът изисква около 20 % от циркулацията на кръвта в тялото. Първичното снабдяване с кръв към мозъка е през 2 артерии във врата (каротидните артерии), които след това се разклоняват по протежение на мозъка в множество артерии, като всяка снабдява специфично пространство на мозъка. Даже кратко прекъсване на кръвния поток може да причини намаляване на мозъчната функция (неврологичен дефицит). Сиптомите варират в зависимост от засегнатото пространство на мозъка и обикновено включват такива проблеми като промени във виждането, промени в говора, намалено движение или чувствителност в част от тялото, или промени в нивото на съзнанието. Ако кръвният поток е намален за по-дълго от няколко секунди, мозъчните клетки в пространството са разрушени (инфарктирани), причинявайки постоянно повреждане на това пространство на мозъка или даже смърт.

Ударът засяга около 4 от 1,000 човека. Това е третата водеща причина за смърт в повечето развити страни, включително САЩ. Разпространението на удара нараства драматично с възрастта, с удвояване на риска с всяко десетилетие след възраст от 35 години.

з

Около 5 % от хората на възраст над 65 години са имали поне един удар. Заболяването се среща по-често при мъжете, отколкото при жените.

Както беше споменато по-горе, удара включва загуба на мозъчни функции (неврологични дефицити), причинени от загуба на циркулация на кръв към пространства на мозъка. Специфичните неврологични дефицити могат да варират в зависимост от местоположението, степента на увреждане и причината за заболяването. Удар може да бъде причинен от намален кръвен поток (исхемия), която има за резултат недостатъчно снабдяване с кръв и умиране на тъкани в това пространство (инфаркт). Причини за исхемични удари са кръвни съсиреци, които се образуват в мозъка (тромби) и кръвни съсиреци или парчета от атерсклеротична плака, или друг материал, който пътува към мозъка от друго местоположение (емболия). Кръвотечение (хеморагия) по протежение на мозъка може да причини симптоми, които наподобяват удар.

Най-обикновената причина за удар е удар, вторичен на атерсклероза (церебрална тромбоза). Атеросклероза (“втвърдяване на артериите”) е състояние, при което се срещат мастни отлагания върху вътрешните стени на артериите и се развива атеросклеротична плака (маса, състояща се от мастни отлагания и кръвни частички. Запушването на артерията се развива бавно. Не винаги атеросклеротичната плака причинява удар. Има много на брой малки свързвания между различните мозъчни артерии. Ако кръвният поток постепенно намалява, тези малки свързвания ще се увеличат по размер и правят “байпас” на запушеното пространство (паралелна циркулация). Ако има достатъчна паралелна циркулация дори изцяло блокирана артерия може да не причини неврологична недостатъчност. Втори безопасен механизъм в мозъка е, че артериите са достатъчно големи, че % от кръвния съд може да бъде запушен и все още ще има адекватен кръвен поток към това пространство на мозъка.

Тромботичен удар (удар, причинен от тромбоза) е най-обичаен

при по-стари хора и често има подчертано атеросклеротично сърдечно заболяване или захарен диабет. Този вид удар може да се случи по всяко време, включително при почивка. Човекът може да загуби или да не загуби съзнание.

Удари, причинени от емболия (движещ се кръвен съсирек) са найвече обикновени удари, вторични на кардиогенния емболизъм, съсиреци, които се развиват поради сърдечни разстройства, които след това се придвижват към мозъка. Емболизъм също така може да се появи в други пространства, по-специално където има атеросклеротична плака. Емболът се придвижва през кръвния поток и навлиза в малка артерия на мозъка. Този удар се случва внезапно с незабавен максимален неврологичен недостиг. Той не е свързван с нивата на активност и може да се случи по всяко време. Обикновено с това заболяване са наблюдавани сърдечни аритмии и често те са причината за ембола. Увреждането на мозъка е често по-остро, отколкото при удар, причинен от церебрална тромбоза. Може да настъпи или да не настъпи загуба на съзнание. Вероятният изход се влошава, ако кръвоносни съдове, повредени от удара, се разкъсват и тече кръв (хеморагичен удар).

Периферната невропатия е синдром на загуба на чувствителни елементи, мускулна слабост и атрофия, намалени дълбоки рефлекси на сухожилията и вазомоторни (съдодвигателни) симптоми, единични или в каквато и да е комбинация.

Заболяването може да засегне отделен нерв (мононевропатия), два или повече нерва в отделни пространства (множествена мононевропатия) или много нерви едновременно (полиневропатия).

Аксонът може да бъде първично засегнат (напр. при захарен диабет, лаймска болест, или уремия, или с токсични агенти), или миелиновата обвивка, или клетки на Schwann (напр. при остра или хронична възпалителна полиневропатия, левкодистрофия, или синдром на Guillain-Barre). Увреждане на малки немиелинирани и миелинирани влакна води до най-напред загуба на температура и чувствителност към болка; увреждане на големи миелинирани влакна води до двигателни и проприоцептивни дефекти. Някои невропатии (напр. дължащи се на отравяне с олово, използване на дапсон, ухапване от кърлеж, порфирия, или синдром на Guillain-Barre) първично засягат двигателните влакна; други (напр. дължащи се на дорзален корен на нервен възел, рак, проказа, СПИН, захарен диабет или хронично пиридоксиново отравяне) първично засягат дорзалния корен на нервните възли или чувствителните влакна, произвеждащи симптоми на чувствителност. Понякога черепните нерви също са засегнати (напр. синдром на Guillain-Barre, лаймска болест, захарен диабет и дифтерия). Установяването на участващите модалности подпомага определяне на причината.

Травмата е най-разпространената причина за локално повреждане на единичен нерв. Бурна мускулна активност или енергично прекомерно разтягане на става може да произведе фокална невропатия, като същия ефект може да предизвикат и повторени малки травми (напр. стегнато стискане на малки инструменти, извънмерна вибрация от въздушни чукове). Налягане или парализа при заплитане обикновено засяга повърхностните нерви (лакътен, радиален, перонеален) на костни издадености (напр. по време на спане на шум или по време на анестезия при слаби и болнави хора и често при алкохолици) или при тесни канали (напр. при китков миньорски синдром). Парализа от налягане може също така да бъде резултат от тумори, костна хиперостоза, отхвърляния, патерици или продължително свита стойка (напр. при работа в градина). Хеморагия в нерв и излагане на студ или радиация може да причини невропатия. Мононевропатията може да е резултат от

директна туморна инвазия.

Множествената мононевропатия обикновено е вторична на колагенови васкуларни разстройства (напр. полиартритна нодоза, SLE, синдром на Sjogren, RA), саркоидоза, метаболитни заболявания (напр. диабет, амилоидоза), или инфекционни заболявания (напр. лаймска болест, HIV инфекция). Микроорганизми може да причинят множествена мононевропатия чрез пряко поражение на нерва (напр. при проказа).

Полиневропатия, дължаща се на остри фебрилни заболявания може да е резултат от токсин (напр. при дифтерия) или автоимунна реакция (напр. при синдром на Guillain-Barre); полиневропатията, която понякога следва имунизации, вероятно също е автоимунна.

Токсични агенти най-общо причиняват полиневропатия, но понякога мононевропатия. Те включват еметин, хексобарбитал, барбитал, хлоробутанол, сулфонамиди, фенитоин, нитрофурантоин,

винка алкалоиди, тежки метали, въглероден монооксид, три-орто-крезил фосфат, орто-динитрофенол, много разтворители, други промишлени отрови и някои лекарства за СПИН (напр. залцитабин, диданозин).

Хранителен недостиг и метаболитни разстройства могат да доведат до полиневропатия. Недостиг на витамин В често е причината (напр. при алкохолизъм, болестта бери-бери, злокачествена анемия, предизвикана от изониазид, недостиг на пиридоксин, синдроми на малабсорбция и повръщане при бременни). Полиневропатия се сереща също така при хипотироидизъм, порфирия, саркоидоза, амилоидоза и уремия. Захарен диабет може да причини сензородвигателна дистална полиневропатия (най-често), множествена мононевропатия и фокална мононевропатия (напр. на двигателните нерви на очите или нервите, отвеждащи импулса към черепа).

Злокачествени заболявания могат да причинят полиневропатия по пътя на моноклонална гамопатия (множествен миелом, лимфом), амилоидна инвазия или хранителен недостиг, или като паранеопластичен синдром.

Специфични мононевропатии: единична и множествена мононевропатии са характеризират с болка, слабост и парестезия в

разпределението на засегнатия нерв. Множествената мононевропатия е асиметрична; нервите могат да бъдат въвлечени всички едновременно или постепенно. Широко участие на много нерви може да симулира полиневропатия.

Улнарната парализа на нерва често е причинена от травма на нерва в улнарния жлеб на лакътя чрез повторно накланяне върху лакътя

или чрез асиметрично нарастване на костта след счупване в детството (късна улнарна парализа). Улнарният нерв може също така да бъде притиснат при предмишечния отвор. Среща се парестезия и недостиг на чувствителност в 5-ия и средната част на 4-ия пръсти; адуктора на палеца, адуктора на 5-ия пръст и междукостните мускули са слаби и атрофирани. Остра хронична улнарна парализа произвежда деформиране на ноктите на ръката. Изследвания на нервното провеждане могат да определят мястото на увреждането. Преди да се опита хирургическо корекция, трябва да се изпробва консервативно лечение.

Миньорски синдром на костта на китката е резултат от притискане на медианния нерв в дланната повърхност на китката между напречната повърхностна връзка на костта на китката и надлъжните сухожилия на мускулите на предната част на ръката, които огъват долната част на ръката. То може да бъде едностранно или двустранно.

Притискането създава парестезия в радиално-дланната област на ръката и болка в китката и дланта; понякога се среща болка проксимално към притиснатото место в предната част на ръката и рамото. Болката може да бъде по-остра през нощта. Може да последва недостиг на чувствителност в областта на дланта на първите три пръста; мускулите, които контролират абдукцията и противоположното положение на палеца може да отслабнат и да атрофират. Този синдром трябва да бъде отличаван от С-6 коренно притискане, дължащо се на цервикална радикулопатия.

Парализа на нерва на малкия пищял е обикновено причинена от притискане на нерва срещу латералната повърхност на фибуларния врат. Това се среща обикновено при измършавяли, приковани към леглото пациенти и при слаби хора, които имат навика да кръстосват краката си. Среща се слабост на дорсифлексията на крака и обръщане (парализа на флексорните мускули на крака). Понякога се наблюдава недостиг на чувствителност по протежение на антеролатералната страна на долната част на крака и гърба на стъпалото или в тъканното пространство между 1-то и 2-то предни ходила. Обикновено за притискателните невропатии, лечението е консервативно (напр. избягване кръстосване на крака). Незавършени невропатии обикновено са следени клинично и обикновено се подобряват от самосебе си. Ако не се извършва възстановяване, може да се наложи хирургическо изследване.

Радиална нервна парализа (съботна нощна парализа) е причинена от притискане на нерва срещу раменната кост, напр. както ръката е увиснала на гърба на стол, при отравяне или дълбок сън. Симптомите включват слабост на мускулите-екстензори на китката и пръстите (отпускане на китката) и понякога загуба на чувствителност по

протежение на дорзалната страна на 1-ия междукостен дорзален мускул. Лечението е подобно на това на притискателна перонеална невропатия.

Полиневропатиите са сравнително симетрични, често засягащи едновременно сензорните, двигателните и съдодвигателните влакна. Те могат да засегнат цилиндъра на аксона или миелиновата обвивка, в която и да е форма, могат да бъдат остри (напр. синдром на GuillainBarre) или хронични (напр. бъбречна недостатъчност).

Полиневропатията, дължаща се на метаболитни разстройства (напр. захарен диабет) или бъбречна недостатъчност, се развива бавно, често в продължение на месеци или години. Тя често започва със сетивна ненормалност в долните крайници, които често са по-остри дистално, отколкото проксимално. Често очебийни симптоми са периферно изтръпване, безчувственост, изгаряща болка или недостиг на ставна проприосепция и усещане за вибрации. Болката е често по-лоша през нощта и може да бъде влошавана при докосване на засегнатото пространство или при промени на температурата. В остри случаи има обективни признаци на загуба на чувствителност, обикновено с разпределение чорапи-и-ръкавици. Рефлексите на ахилесовото или други дълбоки сухожилия са намалени или отсъстват. Когато загубата на сетивност е дълбока, може да се развият безболезнени язви на пръстите или ставите на Charcot. Недостиг на чувствителност или проприецепция може да доведе до ненормалности в ходенето. В резултат на двигателните затруднения се наблюдава дистална мускулна слабост и атрофия. Автономната нервна система може да бъде допълнително или избирателно замесена, което води до нощна диария, уринарно и фекално незадържане, импотентност или постурална хипотензия. Съдодвигателните симптоми варират. Кожата може да бъде по-бледа и по-суха, отколкото е нормално, понякога с тъмни обезцветявания; изпотяването може да бъде прекомерно. При остри, ю

продължителни случаи са обичайни трофични промени (гладка и лъскава кожа, твърди или с ямички нокти, остеопороза).

Хранителната полиневропатия е се среща обикновено при алкохолици и хора, страдащи от недохранване. Първична аксонопатия може да води до вторично демиелиниране и аксонална деструкция в най-дългите и най-големите нерви. Неясно е дали причината е недостиг на тиамин или друг витамин (напр. пиридоксин, пантотенова киселина, фолиева киселина). Невропатия, дължаща се на пиридоксинова недостатъчност обикновено се среща само при пациенти, вземащи изониазид за ТВ; бебета, които са с недостиг или зависими от пиродиксин, може да имат конвулсии. Омършавяването и симетричното отслабване на дисталните крайници е обикновено скрито, но може бързо да напредне, понякога съпроводено със загуба на чувствителност, парестезия и болка. Тъпа продължителна болка, спазми, студенина и безчувственост в прасците и стъпалата могат да бъдат влошени и засилени при докосване. Могат да бъдат давани поливитамини, когато етиологията е неясна, но те нямат доказано благоприятно въздействие.

Необичайно, една изключително сензорна полиневропатия започва с периферни болки и парестезия и напредва централно до загуба на всички форми на чувствителност. Тя се среща като отдалечено въздействие на ракови заболявания (особено бронхогенни), след прекалено поемане на пиридоксин (> 0.5 g/ден) и при амидлоидоза, хипотироидизъм, миелома и уремия. Предизвиканата от пиридоксин невропатия се подбужда, когато се прекъсне пиридоксина.

Наследствените невропатии са класифицирани като сензорнодвигателни невропатии или сензорни невропатии. Болестта на Charcot-Marie-Tooth е най-разпространената наследствена сензорно двигателна невропатия. По-малко разпространените сензорнодвигателни невропатии започват при раждането и водят до по11

голяма недъгавост. В сензорните невропатии, които са редки, загуба на дистална болка и температурна чувствителност е по-очебийна отколкото загубата на чувство за вибрации и място. Главният проблем е осакатяване на краката, дължащо се на нечувствителност към болка, с чести инфекции и остеомиелит.

Наследствената двигателна и сензорна невропатия видове I и II (заболяване на Charcot-Marie-Tooth, перонеална мускулна атрофия) е сравнително обичайно, обикновено автосоматично преобладаващо заболяване, характеризиращо се със слабост и атрофия, първоначално в перинеалните и дистални мускули на краката. Пациентите може да имат също така и други дегенеративни заболявания (напр. атаксия на Friedreich) или подобни случаи в семейството и рода. Пациенти с вид I са имали в средното детство парализа на флексорните мускули на крака и бавно прогресираща дистална мускулна атрофия, водеща до “щъркелови крака”. Съществено мускулно увреждане на ръцете започва по-късно. Чувствителността към вибрации, болка и температура намалява по схемата чорапи-ръкавици. Отсъстват дълбоки рефлекси на сухожилията. Високи арки при крачене или удряне на пръстите на краката може да бъдат единствените признаци при по-малко засегнатите членове на семейства, които носят заболяването. Скоростите на нервна проводимост са бавни и дисталните латентности удължени. Настъпва сегментална демиелинация и ремиелинация. Могат да бъдат напипвани уголемени периферни нерви. Болестта прогресира бавно и не засяга продължителността на живота. Заболяването от II вид се развива побавно, със слабост, обикновено развиваща се по-късно в развитието на пациентал Пациентите имат сравнително нормални скорости на нервна проводимост, но ниски амплитудни потенциали на възбуждане. Биопсиите показват дегенерация на стената.

Наследствената двигателна и сензорна невропатия вид III (хипертрофична интерстициална невропатия, болест на Dejerine-Sottas), рядко автосоматично рецесивно заболяване, започва в детството с прогресивна слабост и загуба на чувствителност и липса на дълбоки рефлекси на сухожилията. Първоначално тя наподобява болестта на Charcot-Marie-Tooth, но двигателната слабост напредва с по-голяма скорост. Настъпва демиелинация и ремиелинация, произвеждащи уголемени периферни нерви и се виждат лукоподобни балончета върху биопсия на нерви.

Характерното разпределение на двигателна слабост, деформирания на стъпалата, фамилната история и електрофизиологичните ненормалности потвърждават диагнозата. Възможен е генетичен анализ, но няма специфично лечение. Може да бъде полезно даването на професионални съвети, които да подготвят младите пациенти за развитието на заболяването. Подпирането помага да се коригира парализата на флексорните мускули на крака; ортопедична хирургия може да помогне да се стабилизират краката.

Невродегенеративните заболявания включват, между другите, болест на Alzheimer, болест на Parkinson, болест на Huntington и миатрофична латерална склероза (ALS).

Болестта на Alzheimer е разстройство, включващо влошаване на мозъчните функции като резултат от промени в мозъчната тъкан. Това включва свиване на мозъчните тъкани, което не е причинено от разстройства на кръвните съдове, първична дегенеративна деменция и дифузна мозъчна атрофия. Болестта на Alzheimer е наричана също така сенилна деменция / Alzheimer-ов вид (SDAT). Тя е найразпространената причина за интелектуално влошаване с остаряването. Разпространението е приблизително 9 от 10,000 души. Това разстройство засяга жените малко по-често от мъжете и се среща предимно при по-възрастни индивиди.

Причината е неизвестна. Неврохимичните фактори, които може да участват в зараждането на болестта, включват липса на веществата,

използвани от нервните клетки за предаване на нервни импулси (невропредаватели), включително ацетилхолин, соматостатин, вещество Р и норпинефрин. Свойствени на дадена среда фактори включват излагане на алуминий, манган и други вещества. Инфекционните фактори включват прионни (подобни на вируси организми) инфекции, които засягат мозъка и гръбначния мозък (централна нервна система). В някои семейства (представляващи 5 до 10 % от случаите) има присъщо предразположение към развитие на разстройството, но това не следва стриктно профила на унаследяване (на Mendel). Обикновено диагнозата се поставя чрез отхвърляне на други причини за деменция.

Изследователите са установили, че в семейства, които имат множество членове с болест на Alzheimer, има особено генно изменение, което е обичайно за всички пациенти с тази болест. Няма съобщения, че генът, който произвежда вещество, наречено аполипротеин Е4, причинява болестта, неговото присъствие просто увеличава шансовете за евентуалното развитие на болестта. Има много хора, които имат гена Е4 и никога не са били засягани от болестта на Alzheimer.

Началото се характеризира с наушена памет, с напредваща загуба на интелектуална функция. Би могло да има промени в настроението, промени в езиковата способност, промени във ходенето и други промени с напредване на заболяването. Има намаление на размера (атрофия) на тъканите на мозъка, уголемяване на вентрикулите (пространствата вътре в мозъка) и отлагания вътре в тъканите на мозъка.

Болестта на Parkinson е разстройство на мозъка, характеризиращо се с тресене и трудност в ходенето, движението и координацията. Болестта е свързана с увреждане на част от мозъка, която контролира движението на мускулите. Тя също е наричана парализа на възбуденост или тресяща парализа.

Болестта засяга приблизително 2 от 1,000 души и най-често се развива след възраст от 50 години. Тя засяга и двата пола - мъже и жени и е една от най-разпространените болести на старостта. Понятието “паркинсонизъм” се отнася до всяко състояние, което включва комбинация от видовете промени в движението, наблюдавани в болестта на Parkinson, са най-разпространеното състояние, причиняващо тази група симптоми. Паркинсонизъм може да бъда причинен от други разстройства или от външни фактори (вторичен паркинсонизъм).

Болестта на Parkinson е причинена от израждане на нервни клетки на част от мозъка, която контролира мускулното движение (базалната гланглия и екстрапирамидалната област). Допамин, който е едно от

веществата, използвани от клетките да предават импулсите (предаватели) нормално е произвеждан в тази област. Израждането на тази област на мозъка намалява количеството на допамина, достъпно до тялото. Недостатъчният допамин нарушава баланса между допамина и други предаватели, такива като ацетилхолин. Без допамин нервните клетки не могат да предават както трябва съобщения и това води до загубата на мускулни функции. Точната причина за израждане на клетките на мозъка е неизвестна. Заболяването може да засегне една от двете страни на тялото с променливи степени на загуба на функция.

В допълнение към загубата на контрол на мускулите, някои хора с болестта на Parkinson стават силно депресирани. Макар че ранна загуба на умствени възможности е необичайна, човек с остра форма на болестта на Parkinson може да покаже цялостно умствено израждане (включително деменция, халюцинации и т.н.). Деменцията може също така да бъде странично въздействие на някои от лекарствата, използвани за лечение на заболяването.

Болестта на Huntington е присъщо, автосоматично, преобладаващо неврологично заболяване. То е необичайно заболяване, засягащо приблизително 1 на 10000 индивида (Breighton и Hayden 1981). Болестта обикновено не става клинично забележима до петото десетилетие на живота и в резултат на нея се наблюдава психично нарушение, разстройство на нежелателно движение и намаляване на познавателната способност, свързано с неумолимо напредване до смърт, обикновено 17 години след началото на заболяването.

Генът, отговорен за болестта на Huntington, е наречен хънтингтин. Той е разположен върху хромозома 4р, което дава възможност за ефективна предклинична и зародишна диагноза. Генетичната анормалност се състои в излишен брой от тандемно повтаряни CAG нуклеотидни последователности.

Увеличението на размера на CAG-повторите в хора с болестта на Huntington показва изключително значима зависимост с възрастта на началото на клиничните белези. Това свързване е особено поразяващо за хора с начало на болестта на Huntington през юношеството, която има значително разширяване, обикновено след 50 години. Дължината на повторите на SAG в семейства с болест на Huntington показва известна нестабилност, която е особено забележима, когато деца унаследяват хънтингтиновия ген от засегнати бащи.

При болест на Huntington не е известно как този широко експресиран ген води до селективна невронна смърт. В допълнение, анализ на последователността не разкри очевидна хомология на други известни гени и не бяха идентефицирани структурни мотиви или функционални домени, които ясно да осигурят вникване в неговата функция. По-специално, въпросът как тези широко експресирани гени причиняват селективна невронна смърт остава без отговор.

Миатрофична латерална склероза, ALS, е заболяване, причиняващо прогресивна загуба на контрол на нервите на волевите мускули поради разрушаване на нервни клетки в мозъка и гръбначния мозък. Миатрофичната латерална склероза, наричана също така болест на Lou Gehrig, е разстройство, включващо загуба на използването и контрола на мускулите. Нервите, контролиращи тези мускули, се свиват и изчезват, което води до загуба на мускулна тъкан, дължащо се на липсата на стимулация на нервите. Силата на мускулите и координацията намаляват, започвайки с волевите мускули за движение (онези под-съзнателни мускули, такива като мускулите на ръцете и краката). Степента на загуба на контрол на мускулите продължава да прогресира и все повече и повече мускулни групи биват обхванати. Може да има загуба на нервна стимулация към полуволевите мускули, такива като мускулите, които контролират дишането и гълтането. Няма въздействие върху способността да се мисли или да се разсъждава. Причината е неизвестна.

ALS засяга приблизително 1 на 100,000 човека. В някои случаи, изглежда че се разпространява бързо в семейства. Разстройството засяга по-често мъже отколкото жени. Обикновено симптомите не се развиват до старческа възраст, често не преди възраст от 50 години.

Травматично поражение на нерви може да засегне централната нервна система или периферната нервна система. Травматичното мозъчно поражение (TBI), наричано просто поражение на главата или поражение на затворена глава (CHI), се отнася до поражение, където има повреждане на мозъка поради външно блъскане на главата. То найчесто се случва по време на нещастни случаи с кола или велосипед, но може също така да се случи като резултат от състояние на прага на

удавяне, сърдечна атака, удар и инфекции. Този вид травматично мозъчно поражение обикновено е резултат на липсата на кислород или снабдяване на мозъка с кръв и следователно може да бъде отнесено като “аноксично поражение”.

Мозъчно поражение или поражение на затворена глава настъпва, когато има блъскане на главата както при злополука с моторно превозно средство или падане. В този случай черепът удря неподвижен обект и мозъкът, който е вътре в черепа, се завърта и се извива по неговите оси (мозъчния ствол), причинявайки локализирано или широко разпространено увреждане. Също така мозъкът, мека маса, заобиколена от течност, която му дава възможност да “плува”, може да рекушира срещу черепа, което води до допълнително увреждане.

Може да има период на безсъзнание, следващ незабавно травмата,

който може да трае минути, седмици или месеци. В резултат на извиването и рекуширането, пациентът с травматично мозъчно поражение обикновено получава увреждане или контузия на много части на мозъка. Това се нарича дифузно увреждане или “не-ракетно увреждане” на мозъка. Видовете мозъчни увреждания, срещащи се при не-ракетни увреждания, могат да бъдат класифицирани като първични или вторични.

Първичното мозъчно увреждане настъпва във времето на поражение, главно при местата на удар, по-специално когато присъства фрактура на черепа. Големи контузии могат да бъдат свързани с вътрешномозъчна хеморагия, или съпроводени от кортикални разкъсвания. Дифузни аксонални поражения се наблюдават като резултат на скъсване или опъване на нервни влакна на невронални процеси, получени от ротационни движения на мозъка вътре в черепа. Може да има малки хеморадични повреждания или дифузно увреждане на аксоните, които могат да бъдат открити само микроскопски.

Вторично мозъчно увреждане се среща като резултат на усложнения, развиващи се след момента на поражение. Те включват • вътрешночерепна хеморагия, травматично повреждане на извънмозъчните артерии, вътрешночерепно образуване на херния, хипоксично мозъчно увреждане или менингит.

Отворено поражение на главата е видимо нападение на главата и може да е резултат от огнестрелна рана, злополука или обект, преминаващ през черепа в мозъка (“ракетно увреждане на мозъка”). Този вид поражение на главата е по-вероятно да увреди специфична област на мозъка.

Така нареченото умерено мозъчно увреждане може да настъпи без загуба на съзнание и е възможно наличието само на чувство на замайване или състояние на объркване с крятка продължителност. Макар прилаганите медицински грижи да бъдат минимални, хора с мозъчно увреждане без кома могат да изпитат симптоми и разстройвания, подобни на пациенти, пострадали от преживяно увреждане с кома.

В отговор на травмата, в мозъка протичат изменения, които изискват наблюдение с цел да се предотврати по-нататъшно увреждане. Размерът на мозъка често се увеличава след силно поражение на главата. Това се нарича мозъчно отичане и се среща, когато има увеличение на количеството кръв към мозъка. По-късно по време на заболяването може да се събере вода в мозъка, която се нарича мозъчна едема. И двете заболявания - мозъчното отичане и мозъчната едема водят до прекалено налягане в мозъка, наричано вътрешночерепно налягане (“ICP”).

Уврежданията на гръбначния мозък са причина за мнозинството болнични приемания за параплегия и тетраплегия. Над 80 % се случват като резултат от пътни злополуки. Клинично са разпознати две главни групи на увреждане: открити увреждания и затворени увреждания.

Откритите увреждания причиняват директно травма на гръбначния мозък и корените на нервите. Перфориращите увреждания могат да причинят разширено разрушаване и хеморагия. Закритите увреждания са причина за повечето гръбначни увреждания и обикновено са свързани с фрактура/разместване на гръбначния стълб, което обикновено се демонстрира радиологично. Повреждането на бялото вещество зависи от степента на костните увреждания и може да бъде разгледано в два главни стадия: Първично повреждане, каквито са контузии, прерязвания на нервни влакна и хеморадична некроза, и вторично повреждане, каквито са екстродурален хематом, инфаркт, инфекция и едема.

Късни последствия от повреждането на връзката включва: възходяща и низходяща антероградна дегенерация на повредени нервни влакна, пост-травматична сирингомелия и системни последствия на параплегия, такива като инфекции на уринарния тракт и гръдния кош, язви от налягания и отслабване на мускулите.

Неврологичните разстройства могат допълнително да се дължат на конгенитални метаболитни разстройства. Миелиновите обвивки, които покриват много нервни влакна, са съставени от липопротеинови слоеве, образувани в ранните стадии на живота. Миелинът, образуван от олигодендроглията в централната нервна система се различава химически и имунологично от този, образуван от клетките на Schwann периферно, но двата вида имат същата функция: да усилят предаването на нервен импулс по дължината на аксона.

Много конгенитални метаболитни разстройства (напр. фенилкетонурея и други аминоацидози; болести на Tay-Sachs, NiemannPick и Gaucher; синдром на Hurler; болест на Krabbe и други левкодистрофии) засягат развиващата се миелинова обвивка, главно в централната нервна система. Независимо, че биохимичният дефект може да бъде коригиран или компенсиран, резултатът е постоянни, често широко разпространени, неврологични дефицити.

Например болестта на Krabbe или глобоидна клетъчна левкодистрофия е разстройство, включващо бялото вещество на периферната и централната нервни системи. Мутации в гена за лизозомната ензимна галактоцеребросидаза (GALC) водят до ниска ензимна активност и намалена способност за разграждане на галактолипидите, установени почти изключително в миелина. Продължително миелиниране и/или демиелиниране в пациенти изисква функционални ендогенни олигодендроцити или трансплантация на нормални олигодендроцити или стъбла на клетки, които могат да се диференцират в олигодендроцити, за да обезпечат достатъчна GALC експресия (Wenger и сътр., 2000).

Неврофиброматоза 1 (NF1) е обичайно автозомно разстройство с

широк диапазон от неврологични прояви.

Множествена системна атрофия е спорадично, започващо при възрастни, невродегенеративно заболяване с неизвестна етиология. Състоянието може да бъде уникално между невродегенеративните болести чрез очебийната, ако не първостепенна, роля, която играят олигодендроглиалните клетки в патогенния процес. Главната разлика спрямо болестта на Parkinson е, че пациентите с множествена системна атрофия не откликват на лечение с L-допамин.

Демиелинация в по-късен стадий на живота е признак на много неврологични разстройства; тя може да е резултат от повреждане на нерви или миелин, дължащи се на местно увреждане, исхемия, токсични агенти или метаболитни разстройства. Също така има доказателства, че демиелинацията може да вземе участие в шизофрения.

Продължителната миелинова загуба е обикновено следвана от аксонална дегенерация и често от дегенерация на телесни клетки, като и двата процеса чогат да бъдат необратими. Обаче ремиелинация се случва при много случаи и може да бъде бързо поправянето, регенерацията и пълното възстановяване на нервните функции. Централната демиелинация (напр. на гръбначния мозък, мозъка или оптичните нерви) е установено предимно при първичните демиелиниращи заболявания, чиято етиология е неизвества. Най-добре познатата е множествената склероза.

Остър дисеминиран енцефаломиелит, слединфекционен енцефаломиелит се характеризира с периваскуларна демиелинация на централната нервна система, която може да настъпи спонтанно, но обикновено следва вирусна инфекция или вирусна ваксинация (или, много рядко, бактериална ваксинация), предполагайки една имунологична причина. Остри възпалителни периферни невропатии, които следват вирусна ваксинация или синдрома на Guillain-Barre, са подобни демиелиниращи разстройства със същата приета предварително имунопатогенеза, но те засягат само периферни структури.

Метахроматична левкодистрофия е друго демиелиниращо заболяване. Адренолевкодистрофия и адреномиелоневропатия са редки Х-свързани рецесивни метаболитни разстройства, характеризирани чрез дисфункция на адреналната жлеза и широко разпространена демиелинация на нервната система. Адренолевкодистрофия се среща при млади момчета; адреномиелоневропатията при младежи. Може да настъпят ментално влошаване, конвулсивност и слепота. Адренолевкодистрофията е фатална. В процес на изследване са хранителни и имуномодулаторни лечения.

Наследствена зрителна атрофия на Leber и сродни митохондриални разстройства са характеризират най-напред с билатерална загуба на централно зрение, обикновено засягащо млади мъже в тяхното късно юношество или в началото на двадесетте им години. Наследствената зрителна атрофия на Leber може да наподобява зрителните неврити при множествена склероза. Идентифицирани са мутации в наследена от майката митохондриална ДНК.

Миелопатия, свързана с HTLV, бавно прогресираща болест на гръбначния мозък, свързана с инфекция от лимфотрофичен вирус на човешки Т-клетки, се характеризира с конвулсивна слабост на двата крака.

Допълнителни неврологични разстройства обхващат невропатии с ненормална миелинация, на които е направен преглед по-долу.

Имунни заболявания: Остра, Guillain-Barre, хронична, хронична имунна демиелинираща невропатия (CIDP), мултифокална CIDP, мултифокална двигателна невропатия (MMN), анти-MAG синдром, синдром GALOP, синдром антисулфатидни антитела (със серумен Мпротеин), синдром на анти-ОМ2 антитела, синдром POEMS, полиневропатийна органомегалия, ендокринопатия или едема, Мпротеин, кожни промени, периневрит, синдром на IgM анти-GDlb антитела (понякога).

Токсини: Дифтерия, зърнастец, хексахлорофен, натриев цианат, телур.

Лекарства: Преимуществено демиелиниращи: хлорохин, FK506 (такролимус), перхексилин, прокаинамид, зимелдин; смесени демиелиниращи и аксонални: амиодарон, синдром на еозинофилиямиалгия, злато, сурамин, таксол.

Наследствени: гликопротеин с въглеводороден недостиг, катаракти и лицев дисморфизъм, кокаинов синдром, конгенитална хипомиелинираща, конгенитална мускулна дистрофия: меросинов недостиг, болест на Farber (липогрануломатоза), HMSN и СМТ, доминанта: IA, IB, III, HNPP, EGR2, термочувствителна, рецесивна: III (Dejerine-Sottas); 4А; 4В; 4В2; 4С; 4D (LOM); 4Е; 4F; HMSN-R; CNS; Xсвързани: IX, Krabbe, Marinesco-Sjogren, метахроматична левкодистрофия, Niemann-Pick, Pelizaeus-Merzbacher (PLP), рефсум, прионен протеин (РгР27-30): мутация Glu200Lys , болест на CreutzfeldJakob, миши модел: прион в процес на експресия, болест на Salla, SOX10, тенасцин-ХА, неравно пакетиране на периферни миелинови обвивки, фенотип на Ehlers-Danlos.

Метаболитни (необичайни): Диабет (дължащ се на конкурентна CIDP), хипотироидизъм, хепатитни разстройства.

Митохондриални: Синдром MNGIE, миопатия и външна офталмоплегия, невропатия, стомашно-чревна енцефалопатия, синдром NARP, невропатия, атаксия, ретинит, пигментоза.

Инфекции: Болест на Creutzfeld-Jakob, дифтерия, СПИН: свързани CIDP, проказа: лепроматоза; смесени аксонално-демиелиниращи; колонизирани клетки на Schwan, вариант на болест на Creutzfeld-Jakob.

Допълнителни подробности могат да бъдат взети от следната интернет страница:

http://www.neuro.wusti.edu/neuromuscular/nother/myelin.html.

Множествената склероза (MS) е възпалително демиелиращо заболяване на централната нервна система (CNS), което има възвръщащ-временно затихващ или прогресиращ курс. Множествената склероза не е единствената демиелинираща болест. Съответната на тази болест в периферната нервна система (PNS) е хронична възпалителна демиелинираща полирадикулоневропатия (CIDP). Освен това, има остри, монофазни разстройства, такива като възпалителна демиелинираща полирадикулоневропатия, наричана с понятието синдром на Guillain-Barre (GBS) в периферната нервна система и остър дисеминиран енцефаломиелит (ADEM) в централната нервна система. И двете заболявания - Множествената склероза и понятието синдром на Guillain-Barre са хетерогенни синдроми. При множествената склероза различни ендогенни атаки заедно с генни фактори могат да доведат до курс на заболяване, което накрая удовлетворява диагностичните критерии. При двете заболявания към първично демиелиниращо увреждане могат да се прибавят аксонално повреждане, което да причини постоянни неврологични дефицити.

Множествената склероза е най-разпространената от горните демиелиниращи болести. Тя се характеризира като автоимунно разстройство, при което левкоцити на имунната система предприемат атака върху бялото вещество на централната нервна система (CNS). Сивото вещество също може да бъде въвлечено в заболяването. Макар

че прецизната етиология на множествената склероза не е известна, участващите фактори могат да включват генетична, бактериална и вирусна инфекция. В нейното класическо проявление (85 % от всички случаи) тя се характеризира чрез изменящи се фази на възвръщане/временно затихване, които съответства на епизоди на неврологична дисфункция, траеща няколко седмици, следвана от значително или пълно възстановяване (Noseworthy, 1999). Периодите на ремисия стават по-кратки с течение на времето. След това много пациенти навлизат във финалната фаза на болестта, характеризираща се чрез постепенна загуба на неврологична функция с частично възстановяване или без такова. Това е наречено с понятието вторична прогресивна множествена склероза. Малка част (~15 % от всички пациенти с множествена склероза) страдат от постепенно и непрекъснато намаляване на неврологична функция, следващо началото на болестта (първична прогресивна множествена склероза).

Понастоящем няма ясно целебно лечение за най-острите форми на множествена склероза, които са общо взето фатални.

Отличителният признак на множествената склероза е демиелинираната плака с реактивно глиално цикатриксно образувание, наблюдавано в системите на бялото вещество на мозъка и на гръбначния мозък. Демиелинацията е свързана с функционално намаляване или блокиране на провеждането на нервните импулси. При пациенти с множествена склероза е наблюдавано аксонално прекъсване и смърт (Bjartmar и сътр., 1999). Патологични изследвания показват множество усложнения, ограничени до оптичните нерви, перивентрикуларното бяло вещество, мозъчния оток и гръбначния мозък (Storch и сътр., 1998). Въздействията на тези дефицити на централната нервна система включват острите симптоми на двойно виждане, вцепененост и неравен вървеж, както също и хронични симптоми , такива като еластична парапареза и изпускане.

Молекулярните механизми, очертаващи патогенезата на множествената склероза, имат вид на стъбло от генетични и свойствени на дадена среда фактори, включително вирусни и бактериални инфекции. Тези механизми способстват за увеличена миграция на Т лимфоцити и макрофаги през кръвно-мозъчната преграда и в тъканта на централната нервна система.

Демиелинацията е причинена от атаки върху миелина чрез активирани макрофаги и микроглии, както също и повреждане на миелиниращите клетки, от произлизащи от Fas-лигандно сигнализиране и осъществявано чрез посредничество на допълнителна- или от антитела- цитотоксичност. Следователно демиелинация настъпва по двата механизма - директна атака върху миелиновите обвивки, както също и елиминиране на клетките, които произвеждат и поддържат миелин.

Генетичните и свойствените на околната среда елементи водят до увеличено втичане на възпалени клетки през мозъчно-кръвната преграда. Това води до увеличената миграция на автореактивни Т лимфоцити и макрофаги в тъканта на централната нервна система. Цитокинна секреция от Т клетки активира антиген-представящите клетки (APCs). Когато автореактивни Т клетки в контекста на МНС клас II молекули върху APCs се натъкват на предполагаеми “антигени на множествена склуроза”, често протеинови съставни части на миелиновата обвивка, те могат да станат активни. След това могат да действат няколко последователни механизми за увреждане на олигодендроцитите и миелина. Управляваната с посредничеството на добавъчна цитоткичност и цитотоксичност с антитела може да предизвика множеството увреждания в някои пациенти, докато Fasлигандното сигнализиране и освобождаване на про-възпалителни цитокини като TNF-β от CD4+ Т клетки могат да атакуват бялото вещество при други. Активирани макрофаги могат също да играят роля през усилена фагоцитозна и факторна секреция. Това причинява широко разпространена демиелинация и последователна загуба на ефикасността на проводимост между аксоните на централната нервна система. Обаче последователни механизми на възстановяване могат да увеличат ремиелинацията след като е решен проблемът с възпалителния процес. Ремиелинираните аксони на пациенти с множествената склероза са разпознавани патологично чрез слабото появяване на обвивки около ремиелинираните аксони. Често са намирани допълнителни натриеви канали, вмъкнати вътре в демиелинираната аксонална мембрана, компенсиращи загубата на ефективност на провеждане. Олигодендроглиални предшественици могат да усилят ремиелинацията в уврежданията от множествена склероза.

Олигодендроцитът извършва многобройни функции, отнасящи се до неговото произвеждане и поддържане на миелиновата обвивка. Това осигурява усилване на изолацията, поддържането и проводимостта на аксоните на множество неврони. Единичен олигодендроцит може да миелинира до 50 различни аксона. Миелинирането е ограничено само до

някои аксони, с голям диаметър; дендрити и други клетъчни процеси, такива като тези на астроцити, остават немиелинирани. Изглежда аксоните упражняват контрол върху броя на миелиниращите олигодендроцити, тъй като аксонално прекъсване на оптичния нерв в проба от плъхове забавя миелиновото обновяване и произвеждането на олигодендроцитни предшественици (разгледани в Barres и Raff, 1999). Олигодендроцитната пролиферация и миграция могат да бъдат стимулирани от фактори, освободени от аксоните по време на развитието. По този начин броят на олигодендроцитите и аксоните внимателно е съчетаван вътре в централната нервна система.

Олигодендроцитите, периневралните поддържащи клетки на централната нервна система, миелинират аксоналните снопове и служат да усилват трансдукцията на импулси. Те играят роли при аксоналното преживяване и функциониране. Отбележете, че, както е показано на ©тази диаграма, един олигодендроцит разпространява един процес към всеки аксон, който се миелинира.

Многостранната миелинова обвивка е специализиран домен на плазмената мембрана на глиалните клетки, богата на липиди и бедна на протеини. Тя служи да поддържа аксоните и подобрява ефективността на провеждането на електрическите сигнали в централната нервна система чрез предотвратяване на натоварването от прекъсване на кървене в околната тъкан. Възлите на Ranvier са местата в обвивката по протежение на аксона, където настъпва скокообразна електропроводимост.

Във възрастен мозък олигодендроцитите се развиват от все още недобре дефинирани клетки предшественици в субвентрикуларната зона на мозъка и на гръбначния мозък (Nait-Oumesmar и сътр., 1999). Тези предшественици са пролиферативни и експресират миелинови копия и протеини, най-напред възникващи във вентралната област на ембрионалния гръбначен мозък няколко седмици преди миелинацията (Hajihosseini и сътр., 1996). Процесът на миелинация протича в следродилния мозък. По време на следродилното развитие тези предшественици мигрират към невронните снопове, които трябва да бъдат миелинирани.

Олигодендроцитите се развиват напълно от техните клетки предшественици по определен и специфичен начин (разгледани напр. в Rogister и сътр., 1999). Олигодендроцитното развитие следва определен път, при който всеки стадий е отбелязан чрез няколко специфични

клетъчни маркери: ендотелиална невронална клетъчна адхезионна молекула (E-NCAM), виментин, А2В5, транскрипционен POU фактор Tst-l/Oct6/SCIP, пред-олигоденробластня антиген (РОА), галактоцереброзида (GalC), 01, 04 и миелин-специфичните протеини PLP, МВР и M0G. Невралните стволови клетки дават увеличение на биполярните npej-GD3⁴ клетки, които стават 02А предшественици. Тези клетки могат да дадат увеличение на двете - олигодендроцитите или астроцитите от вид 2. Напредването продължава през предолигодендроглиалния и пред-GalC* стадии преди действителната диференциация в олигодендроцити. Крайните стадии на олигодендроглиалната линия са дефинирани от способността на тези клетки да пролиферират. Напълно развити олигодендроцити експресират клетъчно-специфичните маркери GalC и сулфатид (SUL) в допълнение към експресиращите миелин-специфични белтъци.

Следователно олигодендроцитите се диференцират от митотично активни, миграторни клетки - предшественици. Веднага след като тези клетки стават след-митотични, те транскрибират и транслират гени, кодиращи миелин-специфични белтъци. Изработването на миелинова обвивка, обгръщаща аксона, се осъществява чрез пряк контакт между процесите на напълно развития олигодендроцит и самия аксон. Обвиването на аксона на централната нервна система завършва чрез уплътняване на миелиновата обвивка, която в нейната окончателна форма наподобява течен кристал, съдържащ макромолекули в комплексно образувание (Scherer, 1997). Поддържането на миелинация изисква отчитане на прецизно стехиометрично отношение между индивидуалните структурни белтъци на миелиновата обвивка, тъй като увеличаване или намаляване количеството на един компонент може да доведе до смущение на цялата структура на обвивката.

Неспособността на олигодендроцитите да поддържат

възстановени или демиелинирани аксони допринася за натрупаното неврологично нефункциониране, характеризиращо множествената склероза. Повишаване на ремиелинацията при пациенти с множествена склероза би могло да предпази аксонална загуба и така да ограничи напредъка на неспособността, свързана със смъртта на аксони в централната нервна система.

Демиелиниращият фенотип на множествената склероза доведе до пространни изследвания на природата на активното увреждане от множествена склероза. Голи аксони и липсата на миелиниращи олигодендроцити показва прекъсването на нормален миелин и отклонения в ремиелиниращия процес, свързан с множествена склероза. Около 40 % от уврежданията на множествена склероза бяха показани като доказателство на атипично ремиелиниране, особено в ранните фази на болестта (Prineas и сътр., 1993). Това представя реалистичното виждане, че развиващите стратегии за повишаване на миелиновото възстановяване би могло да предотврати непрекъснатото увреждане на нервната система. Вероятността за успех е особено висока при по-млади увреждания на централната нервна система, където вече е показано протичането на ранно ремиелиниране. Обаче миелиниращият или ремиелиниращият олигодендроцит е клетка под извънредно метаболитно напрежение, която при налягане или даже малки допълнителни инсулти може да бъде необратимо повредена (Scolding и Lassmann, 1996). Това намалява вероятността от спонтанно възстановяване при активно увреждане от множествена склероза, където възпаление и други увреждания поставят препятствия на ремиелинирането. Следователно, стратегии, повишаващи миелиновото възстановяване, може така да наредят преимуществата по-нататък в полза на ремиелинацията и защита на аксоните при активни увреждания от множествена склероза.

Беше показано, че централната нервна система при възрастни хора съдържа олигодендроцитни клетки-предшественици, които са способни на пролиферация и които биха могли да се развият до зрелост в миелиниращи олигодендроцити. В допълнение, оказва се, че ендогенните олигодендроцитни популации от предшественици, близки до уврежданията на множествената склероза, са изтощени по време на хроничните фази на заболяването, дължащо се на инхибиране на тази способност на предшествениците да пролиферират и да се диференцират (Wolswijk, 1998). Такива клетки-предшественици са общо взето летаргични в обкръжението на хронични увреждания от множествена склероза, предпазвайки ги от активно участие в ремиелинацията. Положението в хроничните увреждания от множествена склероза следователно би могло да въвлече фактори, които затрудняват олигодендроглиалното възстановяване или липса на фактори, необходими за стимулирането на популацията на олигодендроцитните клетки-предшественици (Wolswijk, 1998). Това схващане доведе до хипотезата, че ефикасно лечение на множествена склероза трябва да не бъде ограничавано до подтискане на възпалението, но трябва също да благоприятства ремиелинацията. Ремиелиниращите клетки биха могли да произхождат от различни източници, включително преживели олигодендроцити, присъщи на увреждането, клетки, извлечени от тези преживели, или съседни клеткипредшественици. Показано е, че докарани до състояние на зрелост, олигодендроцити могат да бъдат предизвикани да не се диференцират и пролиферират от фактори, такива като фактора на основен фибробластен растеж (bFGF), предполагащ механизъм за регенерация на олигодендроглиалното родословие, следващо демиелиниращото заболяване (Grinspan и сътр., 1996; Grinspan и сътр., 1993).

Допълнително доказателство за благоприятните ефекти на ремиелинацията в демиелиниращите разстройства, такива като множествена склероза, е осигурено от изследванията, проведени с фактори на глиален растеж като лечения при животински модели на болестта. Показано е, че глиален растежен фактор 2 (неврогулин/GGF2), растежен фактор на централната нервна система, известен с това, че повишава олигодендроцитната пролиферация и преживяване, забавя началото на заболяването, намалява клиничната острота и намалява честотата на връщане на болестта в ЕАЕ моделна множествена склероза при мишки (Marchifhni и сътр., 1999). Беше показано, че неврогулин има благоприятно въздействие върху преживяването на доведен до състояние на зрелост олигодендроцит и е произвеждан от аксоните (Fernandez и сътр., 2000).

Беше показано, че други растежни фактори, включително извлечени от защитните плаки растежни фактори (PDGF) и IGF-1, повишават ремиелинацията и имат лечебни въздействия при ЕАЕ модели (разгледани в Dubois-Dalcq и Murray, 2000). Успехът, постигнат със стимулирането на ремиелинацията, през предизвикани клетки на олигодендроцитното родословие да пролиферират и/или разделят, показва, че изгледите за ремиелинация като лечебна стратегия за множествена склероза са благоприятни. Също би било важно да се идентифицират молекулите, които забавят миелиновия синтез, тъй като те биха могли да намалят ефективността на стратегиите за възстановяване, такива като трансплантация на олигодендроглиални клетки при множествена склероза.

Процесът на ремиелинация би могъл да работи в заедно с противовъзпалителни пътища - да се възстановява повреждането и защита на аксоните от напречно нацепване и смърт.

Олигодендроцитите могат да бъдат предизвикани да ремиелинират аксоналните снопове в централната нервна система, допринасяйки по такъв начин за подобряване на болестното състояние. Ремиелинационното усилване би противодействало на предишно разрушаване, получено в резултат на от инвазия на клетки на имунната система в тъканта на централната нервна система и тяхната атака върху миелиновите обвивки.

Някои анализи на олигодендроглиалното диференциране и уврежданията на множествената склероза бяха проведени, използвайки микроерей визуализиране на диференциална генна експресия (DGE, Scarlato и сътр., 2000; Whitney и сътр., 1999). Те са използвали значително различни ерей технологии за оценка на различни комплекти гени. Анализ на генната експресия в двата разделящи се олигодендроцити и увреждания на множествена склероза показват значителни промени в експресията на миелин-специфичните гени. В допълнение, други гени бяха точно определени като диференциално регулирани, много от които бяха известни като участващи в процеси, такива като контрол на клетъчния цикъл, цитоскелетна реорганизация и мембранно пренасяне (Scarlato и сътр., 2000).

Остеопонтин е високо фосфорилиран сиалопротеин, който е изтъкнат компонент на минерализираните екстрацелуларни матрици на костите и зъбите. OPN се характеризира с присъствието на последователност от полиаспаргинова киселина и местоположения на Ser/Thr фосфорилиране, което посредничи на хидроксиапатитното свързване и високо запазен RGD мотив, който посредничи на клетъчното свързване/сигнализиране. Експресия на остеопонтин в множество тъкани показва разнообразие на функциите, които включват един или повече от тези консервативни мотиви. Докато липсата на чист фенотип в “нокаутирани” с OPN мишки не установи определена роля за остеопонтина, в която и да е тъкан, последни изследвания осигуриха някои нови и интригуващи вниквания в многостранността на този протеин в различни биологични събития, включително процеси на развитието, лекуване на рани, имунологични отговори, произход на тумори, резорбция на кости и калциране. Способността на остеопонтина да стимулира клетъчната активност през множество рецептори, свързани към някои интерактивни сигнални пътища, може да обясни много от функционалните различия (Sodek и сътр.).

Също така беше показано, че остеопонтин може да бъде експресиран в първични сетивни неврони в гръбначно-мозъчната и тригеминална нервни системи при плъхове, в двете - в невроналните клетъчни тела и в аксоните (Ichikawa и сътр.).

Остеопонтин mRNA е експресиран във възрастен мозък, както е показано чрез хибридизация in situ. Експресия беше намерена в неврони в обонятелния продълговат мозък и мозъчното стебло, и в последния той беше намерен във функционално различни области, включително свързани с двигателната способност области, сетивна система и ретикуларно образувание (Shin и сътр., 1999).

Друго изследване проучва пространствената и темпорална експресия на остеопонтин mRNA, следвайки краткотрайна исхемия на предмозъка при плъхове. Краткотрайното въвеждане на OPN mRNA след глобална исхемия се среща по-рано в стриатума, отколкото в хипокампуса. То беше показано в дорсомедиалния стриатум, близо до латералния вентрикул и в подполето СА1 и субикулума на хипокампуса преди микроглиалните клетки да са станали по-реактивоспособни. То също можеше да бъде открито в зъбчатия хилус и до крайна степен в САЗ (Lee MY, Shin SL, Choi YS, Kim EJ, Cha JH, Chun MH, Lee SB, Kim SY, Neeurosci Lett 1999 Aug 20 271:281-4).

Остеопонтинът е наричан също така Eta-1. WO 00/63241 се отнася до методи за модулиране на имунни отговори, по-специално методи за модулиране на имунни отговори вид 1, използвайки модулатори на Eta1 (ранна Т-лимфоцитна активация-1)/остеопонтин. Остеопонтинни модулатори са споменати като полезни за лечение на инфекции, имунни разстройства и заболявания, разстройства на автоимунната система, включително множествена склероза, различни имунни недостатъчности и рак. Всички модулатори на остеопонтин, описани в WO 00/63241, които са предвидени да бъдат полезни при автоимунни заболявания, включително множествена склероза, са инхибитори на остеопонтин/Eta1, както е обяснено подробно в секция V “Клинични приложения на модулаторните методи на изобретението”, D “Автоимунни заболявания”, на стр. 51 до 53 на WO 00/63241.

Интерфероните са подклас на цитокините, които показват противовъзпалителна, противовирусна и противопролиферативна активност. На основата на биохимичните и имунологични свойства, естествено-срещащи се човешки интерферони са групирани в три класа: интерферон алфа (левкоцити), интерферон бета (фибробластен) и интерферон гама (имунен). Алфа-интерферона е понастоящем одобрен в Съединените щати и други страни за лечението на подобна на косми клетъчна левкемия, венерически брадавици, саркома на Kaposi (рак, обикновено засягащ пациенти, страдащи от синдрома на придобита имунна недостатъчност (СПИН)) и хроничен хепатит не от групи А и В.

По-нататък, интерфероните (IFNs) са гликопротеини, произвеждани от тялото в отговор на вирусна инфекция. Те инхибират размножаването на вируси в защитените клетки. Състоят се от белтък с по-ниско молекулно тегло, IFNs са забележително неспецифични в тяхното действие, т.е. IFN, предизвикан от един вирус, е ефективен срещу широк диапазон други вируси. Те обаче са видово-специфични, т.е. IFN, получени от един вид ще стимулират само антивирусна активност в клетки от същия или близкороден вид. IFNs бяха първата група цитокини, които са използвани заради тяхната потенциална противотуморна и противовирусна активности.

Трите главни INFs са означавани като IFN-a, IFN-β и IFN-γ, Такива главни видове интерферони първоначално бяха класифицирани съгласно техните клетки или произход (левкоицитен, фибробластен или Т-клетъчен). Обаче стана ясно, че няколко вида могат да бъдат произвеждани от една клетка. Следователно сега левкоцитен интерферон е наричан IFN-a, фибробластния интерферон е IFN-β и Т клетъчния интерферон е IFN-γ. Също така има и четвърти вид интерферон, лимфобластоиден интерферон, произвеждан в клетъчната линия “Namalwa” (извлечена от лимфома на Burkitt), която изглежда че произвежда смес от двата - левкоцитен и фибробластен интерферони.

Интерферонната единица се използва като мярка на активността на интерферон, дефинирана (до известна степен арбитражно) като количеството, необходимо да предпази 50 % от клетките срещу вирусно увреждане.

Всеки клас от интерферон съдържа отличителни типове. IFN-β и IFN-γ са продукт на единичен отделен ген. Разликите между индивидуалните типове изглежда се дължат главно на различия в гликозилирането.

IFN-α са най-различната група, съдържаща около 15 вида. Има клъстер на IFN-a гени върху хромозом 9, съдържащ най-малко 23 члена, от които 15 са активни и транскрибирани. Напълно развития IFN-a не е гликозилиран.

IFN-a и IFN-β са с еднаква дължина (165 или 166 амино киселини) с подобни биологични активности. IFNs-γ са изградени от 146 амино киселини по дължина и по-малко наподобяват класове а и β. Само IFNsγ могат да активират макрофагите или да предизвикат пълно развитие на килър-Т клетки. Като въздействие тези нови видове лечебни агенти могат да бъдат наречени модификатори на биологичен отговор (BRMs), защото те имат въздействие върху отговора на организма на тумора, засягащ разпознаването по пътя на имуномодулация.

По-специално човешкия фибробластен интерферон (IFN-β) има противовирусна активност и може също да стимулира естествените клетки-убийци против неопластични клетки. Той е полипептид от около 20,000 Da, индуциран от вирусна и двойноверижни РНКи. От нуклеотидната последователност на гена за фибробластния интерферон, клониран чрез рекомбинантна ДНК технология, Derynk и сътр. (Derynk R. и сътр., 1980) изведоха пълната аминокиселинна последователност на белтъка. Той е дълъг 166 аминокиселини.

Shepard и сътр. (Shepard Н.М. и сътр., 1981) описаха мутация на база 842 (Cys П Туг при позиция 141), която анулира неговата противовирусна активност и вариантен клон с делеция на нуклеотиди 1119-1121.

Mark и сътр. (Mark D.F. и сътр., 1984) вмъкнаха изкуствена мутация чрез заместване на база 469 (Т) с (А), причинявайки аминокиселинен ключ от Cys П Ser при позиция 17. Беше съобщено, че полученият IFN-β е толкова активен колкото ‘природния’ IFN-β и стабилен по време на продължително съхранение (-70° С).

Rebif® (рекомбинантен човешки интерферон β) е последното развитие в интерфероновото лечение за множествена склероза (MS) и представлява значителен напредък в лечението. Rebif® е интерферон (IFN)-6eTa la е произведен от клетъчни линии на бозайници и е всъщност еднакъв с естествено срещащи се човешки молекули.

Механизмите, чрез които интерфероните проявяват техните въздействия не са напълно изяснени. Обаче в повечето случаи те действат чрез повлияване на индукцията и транскрибцията на някои гени и така повлияват имунната система. Изследвания in vitro са показали, че интерфероните са способни да индуцират или подтиснат около 20 генни продукта.

IFN-β може да действа чрез три главни пътища в множествена склероза:

регулиране на функциите на Т-клетките, такива като активиране, пролиферация и подтискане на клетъчна функция;

модулиране произвеждането на цитокини: регулираненадолу на провъзпалителни цитокини и регулиране-нагоре на инхибиторните, противовъзпалителни цитокини;

регулиране миграцията на Т-клетките и инфилтриране в централната нервна система през ВВВ (кръвна мозъчна бариера).

Проучването PRISMS установява ефикасността на интерферон бета-1а, даван подкожно три пъти за седмица при лечението на възстановяваща се - временно затихваща множествена склероза (RRMS). Това проучване показа, че интерферон бета-1а може да има положително въздействие на дълготрайна множествена склероза чрез намаляване на броя и остротата на повторните връщания и намаляване на тежестта на болестта и болестната активност както е измервана чрез MRI (Randomised, Double-Blind, Plasebo-Controlled Study of Interferon beta-la in Relapsing-remitting Multiple Sclerosis”, The Lancet 1998; 352 (7 ноември, 1998): 1498-1504.)

Цитирането на какъвто и да е документ тук не се има пред вид като признание, че такъв документ се отнася до предшестващото ниво на техниката, или се счита като материал към патентоспособността, на която и да е претенция на настоящата заявка. Всяко твърдение по отнощение съдържанието или датата на всеки документ се основава на информацията, достъпна на заявителите по времето на подаване на заявката и не представлява признание по отношение на коректността на такова твърдение.

РЕЗЮМЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Обектът на настоящото изобретение е да се осигурят нови средства за лечението и/или профилактиката на неврологични заболявания.

Изобретението се основава на констатацията, че протеинът остеопонтин повишава пролиферацията и диференциацията на глиалните клетки, като по този начин повишава миелинацията и възстановяването на нервите. Съгласно настоящото изобретение понататък беше установено, че остеопонтинът има благоприятно въздействие при животински модели на множествена склероза и периферни невропатии.

Следователно настоящото изобретение се отнася до използването на остеопонтин, или агонист на остепонтиновата активност, при неврологични заболявания, такива като травматично нервно нараняване, удар, демиелиниращи заболявания на централната нервна система или периферната нервна система, невропатии и невродегенеративни заболявания.

Съгласно настоящото изобретение остеопонтин може също така да бъде използван в комбинация с интерферон за лечение и/или профилактика на неврологични заболявания. Използването на молекули на нуклеинови киселини и експресионни вектори, включващи остеопонтин, и на клетки, експресиращи остеопонтин, за лечение и/или профилактика на неврологично заболяване е също в обхвата на настоящото изобретение. Изобретението по-нататък осигурява фармацевтични състави, включващи остеопонтин и интерферон, по избор заедно с един или повече фармацевтично приемливи ексципиенти.

КРАТКО ОПИСАНИЕ НА ФИГУРИТЕ

Фиг. 1 А показва хистограма, изобразяваща нивата на остепонтинната експресия след различни времена на лечение с купризон, измерена чрез TaqMan® анализ. 3/5 w. Cup = три или пет седмици лечение с купризон, 5 w. cup + 1/3/6 w. = пет седмици лечение с купризон и след оттегляне на купризона една/три или шест седмици възстановяване.

Фиг. 1 В показва регулацията на нагъването на остеопонтина, МВР и PLP mRNA, сравнени с контролните С1 нива, измерени чрез TaqMan® в различни стадии на церебрално развитие. С 1 до 20 = life следродилен малък мозък (postnatal cerebelum) при дни 1 до 20, СА =

възрастен малък мозък.

Фиг. 2 схематично изобразява структурата на остепонтин и неговите известни изоморфни форми, както и С и N крайни конструкции.

Фиг. 3 схематично изобразява плазмида Рас, съдържащ кодиращата последователност за остеопонтин.

Фиг. 4 показва хистограма, илюстрираща регулацията на нагъването на остеопонтин mRNA в олигодендроцитна клетъчна линия оли-неу, третирана с сАМР в прродължение на 6 h (1), 2 d (2), 6 d (3) или 10 d (4) като са сравнени спрямо контролата. Колони 5 и 6 изобразяват нивата на остеопонтин mRNA от експеримент с купризон. (5): 3 седмици лечение с купризон, (6): 5 седмици лечение с купризон.

Фиг. 5 показва схематично плазмида pDEST 12.2, включващ кодиращата последователност на остеопонтин.

Фиг. 6 показва схематично плазмида pDEST 12.2, включващ

кодиращата последователност на остеопонтин плюс кодиращата последователност на EGFP, флуоресцентен маркер.

Фиг. 7 показва схематично плазмида pDEST 12.2, включващ кодиращата последователност на остеопонтина с HIS-tag.

Фиг. 8 показва пролиферацията на клетки оли-неу след инсулинов глад и 24 часа третиране с остеопонтин, експресиран в бакуловирус (Baculo-OPN) или остеопонтин, експресиран в НЕК клетки (HEK-OPN). Отчетена е флуоресценция на Alamar синьо, багрило, оцветяващо живи клетки.

Фиг. 9 показва кривата на отговор на дозата на пролиферация на подложени на инсулинов глад клетки оли-неу след 24 часа третиране с бакуловирусно експресиран остеопонтин (BAC-OPN) или експресиран в НЕК клетка остеопонтин (HEK-OPN).

Фиг. 10 показва пролиферацията на оли-неу клетки след инсулинов глад и лечение с едно от двете - бакуловирусно експресиран оостеопонтин с пълна дължина (BacOPN) или N-краен фрагмент на остеопонтин (N-краен BacOPN).

Фиг. 11 показва МВР имунохистохимията в смесени кортикални култури, третирани със 100 пМ бакуловирусно експресиран рекомбинантен остеопонтин. А = контрола; В = третирани с OPN; С = увеличение на В; D = друго поле на третирани с OPN смесени

кортикални клетки, където няма видими аксони.

Фиг. 12 показва увеличението на МВР белтък в милиениращи, смесени кортикални култури след лечение с LIF и бакуловирусно експресиран остеопонтин, измерван чрез ELISA.

Фиг. 13 показва пролиферацията на CG4 клетки след третиране с различни дози (10 рМ, 10 пМ, 100 пМ) на експресиран с in vitro фосфорилирани Е. coli остеопонтин (OPN-E-coli) или бакуловирусно експресиран остеопонтин (OPN Вас).

Фиг. 14 показва околосъдови възпалителни инфилтрати, присъстващи в гръбначните мозъци на ЕАЕ мишки, лекувани подкожно с ексципиент (PBS), ексципиент плюс 0.1 % BSA, 1,10 или 100 pg/kg от AS900011 (остеопонтин) или с комбинация от 100 pg/kg AS900011 и

20000 U/мишка миши интерферон бета (mIFNP) или самостоятелно 20000 U/мишка mIFNp.

Фиг. 15 показва процента на демиелиниращото пространство, присъстващо в гръбначните мозъци на ЕАЕ мишки, лекувани подкожно с ексципиент (PBS), ексципиент плюс 0.1 % BSA, 1,10 или 100 pg/kg от AS900011 (остеопонтин) или с комбинация от 100 pg/kg AS900011 и 20000 U/мишка миши интерферон бета (mIFNP) или самостоятелно 20000 U/мишка mlFNp.

Фиг. 16 показва клинични резултати в края на лечението, възпалителните инфилтрирания и демиелинацията в ЕАЕ мишки, лекувани подкожно с ексципиент (PBS), ексципиент плюс 0.1 % BSA, 1, 10 или 100 pg/kg от AS900011 (остеопонтин) или с комбинация от 100 pg/kg AS900011 и 20000 U/мишка миши интерферон бета (πιΙΕΝβ) или самостоятелно 20000 U/мишка ιηΙΡΝβ.

Фиг. 17 показва телесното тегло на мишки с невропатия, предизвикана чрез смачкване на седалищния нерв, лекувани с ексципиент, 1, 10 или 100 pg/kg от остеопонтин (Ost), 10 pg/kg от положително контролно съединение (4-МС) или 100 pg/kg денатуриран остеопонтин (Ost-D).

Фиг. 18 показва амплитудата на потенциала на сложно мускулно действие в мишки с невропатия, лекувани с ексципиент, 1, 10 или 100 pg/kg от остеопонтин (Ost), 10 pg/kg от положително контролно съединение (4-МС) или 100 pg/kg денатуриран остеопонтин (Ost-D).

Фиг, 19 показва латентността на потенциала на сложно мускулно действие в мишки с невропатия, лекувани с ексципиент, 1, 10 или 100 pg/kg от остеопонтин (Ost), 10 pg/kg от положително контролно съединение (4-МС) или 100 pg/kg денатуриран остеопонтин (Ost-D).

Фиг. 20 показва продължителността на потенциала на сложно мускулно действие в мишки с невропатия, лекувани с ексципиент, 1,10

или 100 pg/kg от остеопонтин (Ost), 10 pg/kg от положително контролно съединение (4-МС) или 100 pg/kg денатуриран остеопонтин (Ost-D).

Фиг. 21 показва процента на дегенерирани нишки в мишки с невропатия, лекувани с ексципиент, 1, 10 или 100 pg/kg от остеопонтин (Ost), 10 pg/kg от положително контролно съединение (4-МС) или 100 pg/kg денатуриран остеопонтин (Ost-D).

Фиг. 22 показва общия брой нишки за поле в мишки с невропатия, лекувани с ексципиент, 1, 10 или 100 pg/kg от остеопонтин (Ost), 10 pg/kg от положително контролно съединение (4-МС) или 100 pg/kg денатуриран остеопонтин (Ost-D).

ПОДРОБНО ОПИСАНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Настоящото изобретение се основава на констатацията, че остеопонтинът е диференциално експресиран по време на олигодендроцитната диференциация и по време на развитието на главния мозък. По-нататък беше установено, че експресия на осетопонтин сДНК в олигодендроцити води до диференциран фенотип на тези клетки in vitro. При експресия на остеопонтин, олигодендроцитите показват фенотип, подобен на фенотипа на диференцираща, миелинираща клетка. В допълнение на тези констатации in vitro, беше показано, че остеопонтин и по-специално комбинацията на остеопонтин и интерферон, имат благоприятно въздействие в установен модел на множествена склероза. В експериментален модел на периферна невропатия, остепонтинът имаше ясно изразено благоприятно въздействие върху нервната активност и значително намали процента на дегенерация и повиши степента на миелинация.

Следователно, експерименталните доказателства, представени тук, осигуряват нова възможност за лечение на неврологични заболявания, по-специално онези, свързани с функцията на нервните и глиални клетки. Тези констатации са особено изненадващи, защото в патентна заявка WO 00/63241 се твърди, че трябва да се инхибира

остеопонтина за да се лекува множествена склероза.

Следователно изобретението се отнася до използването на остеопонтин, или агонист на остеопонтиновата активност, за производството на лекарство за лечение и/или профилактика на неврологични заболявания.

Понятието “остеопонтин”, както е използвано тук, се отнася до човешки остеопонтин с пълна дължина, имащ последователност на амино киселините, която е известна от края на осемдесетте години (Oldberg и сътр., 1986; Kiefer и сътр., 1989). Последователността на човешки остеопонтин е съобщена тук като SEQ ID NO: 1 на приложения списък на последователности. Понятието “остеопонтин”, както е използвано тук, освен това се отнася до всеки остеопонтин, извлечен от животни, такъв като миши, говежди или остеопонтин от плъхове, докато

има достатъчна идентичност за да поддържа остепонтинова активност и докато получената молекула не ще бъде имуногенна при хората.

Понятието “остеопонтин”, както е използвано тук, освен това се отнася до биологично активни мутеини и фрагменти, такива като естествено срещащите се изоформи на остеопонтина. Остеопонтинът е експресиран във функционално далечни форми, които се различават при нивото на транскрибция (алтернативен сплайсинг) и посттранслационни модификации (фосфорилиране, гликозилиране). До сега са известни три сплайс варианта на OPN, означени OPN-a (тук наричан също остеопорин “пълна дължина”), OPN-b и OPN-c (SEQ ID NO: 1, 2 и 3 на приложения списък на последователности, също така изобразени на Фиг. 2). Изоформите бяха описани напр. от Коп и сътр. (2000) и охарактеризирани от например Saitoh и сътр. (1995) и Коп и сътр. (2002).

Тромбинно отцепване води до два in vivo протеолитични фрагмента на отцепване, включващи N- и С-крайни части на белтъка. Фосфорилиране на остеопонтин, особено на С-крайната част на белтъците, може да бъде важно за остеопонтиновата функция. Понятието “остеопонтин”, както е използвано тук, следователно е предназначено да обхваща и тези протеолитични фрагменти и отличителни фосфорилирани форми на остеопонтин.

Понятието “остеопонтин”, както е използвано тук, освен това обхваща изоформи, мутеини, фузирани белтъци, функционални производни, активни фракции или фрагменти, или производни с кръгообразно променен ред, или техни соли. Тези изоформи, мутеини, фузирани белтъци или функционални производни, активни фракции или фрагменти, или производни с кръгообразно променен ред запазват биологичната активност на остеопонтина. Предпочитано те имат биологична активност, която е подобрена, сравнена с дивия вид остеопонтин.

Понятието “агонист на остеопонтинова активност”, както е използвано тук, се отнася до молекула, стимулираща или имитираща остеопонтинова активност, такива като агонистични антитела на остеопонтиновия рецептор, или агонисти с малко молекулно тегло, активиращи сигнализиране през остеопонтинов рецептор. Остеопонтина урежда чрез посредничество неговата функция през поне две групи рецептори. Първо, той взаимодейства с αν-интегрини (ανβ3 и ανβ5 интегринни рецептори през RGD (Arg-Gly-Asp) клетъчно свързан мотив под положителното влияние на манган (Kunicki и сътр., 1997). Второ, той взаимодейства с CD44 вариантни изоформи v6-vl0. Крайната С-част на остеопонтина се предполага че участва във взаимодействието с

CD44, докато N-крайната част на остеопонтина се предполага, че участва във взаимодействие с интегринните рецептори, пролиферацията, преживяването и диференциацията на макрофаги. Nкрайната част на остеопонтина също предизвиква освобождаване на IL12 и IL-10. Всеки агонист, стимулатор или усилител, на който и да е от тези рецептори е обхванат от понятието “агонист на OPN активност”, както е използвано тук.

Понятието “агонист на остеопонтинова активност”, както е използвано тук, освен това се отнася до агенти, усилващи активности, осъществявани с посредничеството на остеопонтин, такива като увеличаване на клетъчното свързване към екстрацелуларните матрични компоненти, морфогенезата на клетките на олигодендроцитната серия в произвеждащите миелин клетки, да увеличават възстановяването, пролиферацията, диференциацията или съзряването на клетките на олигодендроцитната група (такива като родоначалници или клетки предшественици), да увеличават защитаването на клетките на олигодендроцитната група от апоптоза и клетъчно нараняване.

Понятията “лечение” и “профилактика”, както са използвани тук, трябва да бъдат разбирани като предотвратяване, инхибиране, смекчаване, подобряване или обръщане на един или повече симптоми или причина(и) на неврологично заболяване, както също така и симптоми, заболявания или усложнения, съпътстващи неврологичното заболяване. Когато “лекуваме” неврологично заболяване, веществата, съгласно изобретението, са давани след начало на заболяването, “профилактика” се отнася до прилагане на съединения преди да бъдат забелязани признаци на заболяване в пациента.

Понятието “неврологични заболявания”, както е използвано тук, обхваща всички известни неврологични заболявания или разстройства, или наранявания на централната нервна система или периферната нервна система, включително онези, описани подробно в “Предшестващо ниво на изобретението”.

Неврологични заболявания включват заболявания, свързани с нарушена функция на централната нервна система или периферната нервна система, такива като заболявания, свързани с невропредаване, главоболие, травма на главата, инфекции на централната нервна система, невро-офталмологични и черепни нервни разстройства, функция и нарушена функция на церебралните лобове, разстройства на

движението, двигателна подтиснатост и кома, демиелиниращи заболявания, делириум и деменция, анормалности на черепно-шийните връзки, припадъчни разстройства, разстройства на гръбначния мозък, разстройства на съня, разстройства на периферната нервна система, цереброваскуларно заболяване или мускулни разстройства. За дефиниции на тези разстройства виж напр. http:/www.merck.com/pubs/mmanual/section 14/sec. 14.htm.

По-специално, неврологичните заболявания на изобретението са избрани от групата, състояща се от травматично нервно нараняване, удар, демиелиниращи заболявания на централната нервна система или периферната нервна система и невродегенеративни заболявания.

Травматично нервно нараняване може да засегне периферната нервна система и централната нервна система, то може да бъде травма на мозъка или гръбначния мозък, включително параплегия, както е описано в “предшестващо ниво на изобретението” по-горе.

Удар може да бъде причинен от хипоксия или от исхемия на мозъка. Той също се нарича мозъчно-съдово заболяване или инцидент. Ударът може да включва загуба на мозъчни функции (неврологичен недостиг), причинена от загуба на циркулация на кръв към области на мозъка. Загубата на циркулация на кръв може да се дължи на кръвни съсиреци, които се образуват в мозъка (тромби), или парчета от атеросклеротична плака, или други материали, които пътуват към мозъка от друго местоположение (емболия). Кръвотечение (хеморагия) вътре в мозъка може да предизвика симптоми, които наподобяват удар. Най-разпространената причина за удар е удар, вторичен на атерсклерозата (церебрална тромбоза) и следователно изобретението се отнася също така и до лечение на атеросклероза.

Периферната невропатия може да бъде свързана със синдром на загуба на чувствителност, мускулна слабост и атрофия, намалени дълбоки рефлекси на сухожилията и вазомоторни симптоми, единични или в някаква комбинация. Невропатията може да засегне отделен нерв (мононерворатия), два или повече нерва в отделни пространства (множествена мононевропатия) или много нерви едновременно (полиневропатия). Аксонът може да бъде първично засегнат (напр.при захарен диабет, лаймска болест, или уремия или токсични агенти), или миелиновата обвивка, или клетки на Schwann (напр. при остра или хронична възпалителна полиневропатия, левкодистрофия, или синдром на Guillain-Barre). Освен това невропатии, които могат да бъдат лекувани съгласно настоящото изобретение, може напр. да се дължат на отравяне с олово, използване на дапзон, ухапване от кърлеж, порфирия, или синдром на Guillain-Barre и те може първично да засегнат двигателните влакна. Други, такива като онези, дължащи се на дорзален корен на нервен възел на рак, проказа, СПИН, захарен диабет или хронично пиридоксиново отравяне, може първично да засягат дорзалния корен на нервните възли или чувствителните влакна, произвеждащи сиптоми на чувствителност. Също така могат да участват и черепните нерви, такива като напр. нервите, участващи в синдром на GuillainBarre, лаймска болест, захарен диабет и дифтерия.

Болестта на Alzheimer е заболяване, включващо влошаване на умствените функции, резултат от промени в мозъчната тъкан. Това може да включва свиване на мозъчните тъкани, първична дегенеративна деменция и дифузна мозъчна атрофия. Болестта на Alzheimer е наричана също така и старческа деменция / Alzheimer-ов вид (SDAT).

Болестта на Parkinson е заболяване на мозъка, включващо тремор и трудност при ходене, движение и координация. Заболяването е свързано с увреждане на част от мозъка, която контролира мускулното движение и се нарича също така и ажитантна парализа или треморна парализа.

Болестта на Huntington е наследствено, автозомно доминантно неврологично заболяване.

Миатрофична латерална склероза, ALS, е заболяване, причиняващо прогресивна загуба на нервен контрол на волевите мускули, включващо разрушаване на нервните клетки в мозъка и гръбначния мозък. Миатрофичната латерална склероза, наричана също болест на Lou Gehrig, е разстройство, включващо загуба на използването и контрола на мускулите.

Множествената склероза (MS) е възпалително демиелиниращо заболяване на централната нервна система (CNS), което взема релапсиращо-ремисиен или прогресивен курс. Множествената склероза не е единственото демиелиниращо заболяване. Нейният двойник в периферната нервна система (PNS) е хронична възпалителна демиелинираща полирадикулоневропатия (CIDP). В допълнение, има остри, монофазни разстройства, такива като възпалително демилиениращата полирадикулоневропатия, наричана синдром на Guillain-Barre (GBS) в периферната нервна система, и остър дисеминиран енцефаломиелит (ADEM) в централната нервна система.

Освен това, неврологични разстройства включват невропатии с анормална миелинация, такива като тези, описани в “Предшестващо ниво на изобретението” по-горе, както също така и синдрома на миньорската китка. Травматичното нараняване на нерва може да бъде съпроводено от ортопедични усложнения на стълба бяло вещество на гръбначния мозък и те също са в обхвата на заболяванията съгласно настоящото изобретение.

Неврологичните разстройства могат освен това да се дължат на конгенитални метаболитни разстройства. В предпочитано приложение на изобретението, неврологичното заболяване следователно се дължи на конгенитален метаболитен недостиг.

Конгениталните метаболитни разстройства, обхванати от настоящото изобретение, могат да бъдат напр. фенилкетонурея и други аминоацидурии, болести на Tay-Sachs, Niemann-Pick и Gaucher, синдром на Hurler; болест на Krabbe и други левкодистрофии. Те могат да засегнат развиващата се миелинова обвивка, главно в централната нервна система.

Неврологични заболявания, причинени от конгенитални матеболитни разстройства, са също така дискутирани подробно в “Предшестващо ниво на изобретението”.

По-малко известни неврологични заболявания са също в обсега на предмета на настоящото изобретение, такива като неврофиброматоза или множествена системна атрофия (MSA). Освен това разстройства, които могат да бъдат лекувани в съответствие с настоящото изобретение, са описани подробно в “Предшестващо ниво на изобретението” по-горе.

В по-нататъшно предпочитано приложение, неврологичното заболяване е периферна невропатия, най-предпочитано диабетна невропатия. Невропатии, свързани с хемотерапия, са също предпочитани в съответствие с настоящото изобретение.

Понятието “диабетна невропатия” се отнася до която и да е форма на диабетна невропатия, или към един или повече симптом(и) на

разстройство(а), съпровождащи или причинявани от диабетна невропатия, или усложнения на диабети, засягащи нервите, както е подробно описано в “Предшестващо ниво на изобретението” по-горе. Диабетната невропатия може да бъде полиневропатия. В диабетната полиневропатия едновременно са засегнати много нерви. Диабетната невропатия може също така да бъде мононевропатия. Във фокалната мононевропатия, например, заболяването засяга единичен нерв, такъв като очнодвигателния нерв или отвеждащ черепен нерв. Тя също може да бъде множествена мононевропатия, когато два или повече нерва са засегнати в отделни области.

В следващо предпочитано приложение, неврологичното разстройство е демиелиниращо заболяване. Демиелиниращи заболявания предпочитано обхващат демиелиниращи условия на централната нервна система, като остър дисеминиран енцефаломиелит (ADEM) и множествена склероза (MS), както също и демиелиниращи заболявания на периферната нервна система (PNS). Последната обхваща заболявания, такива като хронична възпалителна демилиенираща полирадикулоневропатия, наричана синдром на Guillain-Barre (GBS).

По-нататъшно предпочитано приложение на изобретението се отнася до лечението и/или профилактиката на невродегенеративни заболявания. Невродегенеративното заболяване е избрано от групата, състояща се от болест на Alzheimer, болест на Parkinson, болест на Huntington и ALS.

Предпочитано, остеопонтинът е избран от пептид, полипептид или белтък, избран от групата, състояща се от:

(a) Полипептид, включващ SEQ ID NO: 1;

(b) Полипептид, включващ аминокиселини 1 до 168 или 170 на SEQIDNO: 1;

(c) Полипептид, включващ аминокиселини 1 до 16 и 170 до 314 на SEQIDNO: 1;

(d) Полипептид, включващ аминокиселини 170 до 314 на SEQ IDNO: 1;

(e) Полипептид, включващ SEQ ID NO: 2;

(f) Полипептид, включващ SEQ ID NO: 3;

(g) Мутеин на който и да е полипептид от (а) до (f), в който аминокиселинната последователност има поне 40 %, или 50 %, или 60 %, или 70 %, или 80 %, или 90 % еднаквост на поне една от последователностите в (а) до (f);

(h) Мутеин, на който и да е полипептид от (а) до (f), който е кодиран чрез ДНК последователност, която хибридизира към комплементарната част на нативната ДНК последователност, кодираща който и да е полипептид от (а) до (f) при умерено строги условия или при много строги условия;

(i) Мутеин на който и да е полипептид от (а) до (f), в който всякакви промени в аминокиселинната последователност са консервативни аминокиселинни замествания на аминокиселинните последователности в (а) до (f);

(j) Сол или изоформа, фузантен белтък, функционално производно, активна фракция или кръгообразно разместено производно на който и да е от полипептид от (а) до (f).

Активни фракции или фрагменти могат да включват всяка част на домена на която и да е от изоформите на остеопонтина, такива като Nкрайна част или С-крайна част, или която и да е от OPN-a, -b или с, както е показано на Фиг.2. Мотивът GRGDS може да присъства, да отсъства или да бъде подложен на мутация. Хепариновото място за свързване може да бъде променено така че да лиши остеопонтина от хепариновото свързване. Остеопонтин с пълна дължина или какъвто и да е негов активен фрагмент може да бъде фосфорилиран при един или повече от следните остатъци на серии, такива като сериновите остатъци при следните позиции: 8, 10, 11, 33, 46, 47, 60, 62, 65, 83, 86, 89, 92, 101, 104, 107, 110, 113, 153, 155, 175, 179, 199, 203, 208, 212, 218, 223, 227, 238, 242, 247, 251, 254, 259, 264, 275, 287, 292, 294, 295. В допълнение, фосфорилираните места на серина могат да бъдат подложени на мутация от серин в глутаматни остатъци, за да подражава на фосфорилирането.

Човек, запознат със съществуващото ниво на техниката, ще оцени, че даже по-малки части от остеопонтина могат да бъдат достатъчни да проявяват неговата функция, такива като активен пептид, включващ съществените остатъци от амино киселини, изисквани за остеопонтиновата функция.

Човек, запознат със съществуващото ниво на техниката, понататък ще оцени, че мутеини, соли, изоформи, фузантни белтъци, функционални производни на остеопонтин, активни фракции или кръгообразно разместени производни на остеопонтина, ще запазят подобна или даже по-добра, биологична активност на остеопонтина. Биологичната активност на остеопонтина и мутеини, изоформи, фузантни белтъци или функционални производни, активни фракции или фрагменти, или кръгообразно разместени производни, или техни соли, могат да бъдат измервани чрез анализ на съвместно култивиране, такъв като анализа, описан по-долу в Пример 8. Смесени кортикални култури съдържат олигодендроцити, както също и други извлечени от клетки на централната нервна система (такива като неврони, астроцити, микроглиа) и предизвикват или регулират нагоре типичните гени, участващи в миелинирането, като РО, МВР или MAG, при инкубация с OPN или мутеина, изоформата, фрагменат, функционалното производно или сол. Експресията на тези гени може да бъде измерена чрез количествен анализ в реално време RT-PCR (TaqMan® RT-PCR), който е подробно обяснен в примерите по-долу. Допълнителен прост анализ за измерване на активността на OPN е анализ на олигодендроцитна пролиферация, включващ инкубиране на подходяща олигодендроцитна клетъчна линия, такава като клетки оли-неу или CG4, с OPN или мутеин, изоформа, фрагмент, активна фракция, функционално производно или сол, както е описано, например, по-долу в Пример 7.

Предпочитани активни фракции имат активност, която е еднаква или по-добра от активността на остеопонтин с пълна дължина, или които имат допълнителни предимства, такива като по-добра стабилност, или по-малка токсичност или имуногенност, или по-лесно се продуцират в големи количества, или по-лесно да се пречистват. Човек, запознат със съществуващото ниво на техниката, ще оцени, че мутеини, активни фрагменти и функционални производни могат да бъдат създавани чрез клониране на съответните cDNA в подходящи плазмиди и изпитването им чрез анализ на съвместно култивиране, както беше

споменато по-горе.

Белтъците, съгласно настоящото изобретение, могат да бъдат гликозилирани или не-гликозилирани, те могат да бъдат извлечени от естествени източници, такива като телесни течности, или те могат предпочитано да бъдат произведени рекомбинантно. Рекомбинантна експресия може да бъде осъществена в прокариотни системи на експресия, такива като Е. coli, или в еукариотни, такива като клетки от насекоми и за предпочитане в експресионни системи на бозайници, такива като СНО-клетки или НЕК-клетки.

Както е използвано тук, понятието “мутеини” се отнася до аналози на остеопонтин, в които един или повече аминокиселинни остатъци на естествен остеопонтин са заместени от различни аминокиселинни остатъци, или са отстранени, или един или повече аминокиселинни остатъци са добавени към естествената последователност на остеопонтина без да се промени значително активността на получените продукти, като сравнени с дивия вид остеопонтин. Тези мутеини са получени чрез известна синтеза и/или чрез насочени към определено място мутагенни техники, или каквато и да е друга известна техника, подходяща за това.

Мутеини на остеопонтин, които могат да бъдат използвани съгласно настоящото изобретение, или нуклеинова киселина, кодиращи

ги, включват ограничена редица от по същество съответстващи последователности като заместени пептиди или полинуклеотиди, които могат да бъдат рутинно получени от всеки с опит в съществуващото ниво на техниката, без неоправдано експериментиране, основано на

наученото и ръководството, представени тук.

Мутеини, съгласно настоящото изобретение включват белтъци, кодирани чрез нуклеинова киселина, такава като ДНК или РНК, която се хибридизира до ДНК или РНК, която кодира OPN, съгласно настоящото изобретение, при умерени или много строги условия. Понятието “строги условия” се отнася до условията на хибридизация и следващо промиване, които онези, с опит в съществуващото ниво на техниката обикновено отнасят към “строги”. Виж Ausubel и сътр., Current Protocols in Molecular Biology, Supra, Interscience, N.Y., §§6.3 и 6.4 (1987, 1992) и Sambrook и сътр., (Sambrook, J. C., Frisch, E. F. и Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratoy Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).

Без ограничение, примери на дтроги условия включват условия на промиване 12-20°С под изчислената Тт на изучавания хибрид в, напр., 2 х SSC и 0.5 % SDS в продължение на 5 минути, 2 х SSC и 0.1 % SDS в продължение на 15 минути; 0.1 х SSC и 0.5 % SDS при 37° С в продължение на 30-60 минути и след това 0.1 х SSC и 0.5 % SDS при 68°

С в продължение на 30-60 минути. Онези лица, запознати със съществуващото ниво на техниката разбират, че строгите условия зависят също така от дължината на DNA последователностите, олигонуклеотидните сонди (такива като 40-50 бази) или смесени олигонуклеотидни сонди. Ако са използвани смесени сонди, за предпочитане е да се използва тетраметил амониев хлорид (ТМАС) вместо SSC. Виж Ausubel, supra.

В предпочитано приложение, всеки такъв мутеин има поне 40 % идентичност или хомоложност с последователностите на SEQ IN NO: 1, 2 или 3 на приложения списък на последователностите. Попредпочитано той има поне 50 %, поне 60 %, поне 70 %, поне 80 %, или най-предпочитано 90 % идентичност или хомоложност на тази последователност.

Идентичността отразява сродство между две или повече полипептидни последователности или две или повече полинуклеотидни последователности, определени чрез сравняване на последователностите. Най-общо идентичността се отнася до точно съответствие на нуклеотид към нуклеотид или амино киселина към амино киселина на двата полинуклеотидни или две полипептидни последователности, съответно по протежение на дължината на последователностите, които са били сравнявани.

За последователности, където няма точно съответствие, може да бъде определен “% на идентичност”. Най-общо двете последоветелности, които трябва да бъдат сравнявани, се изравняват да дадат максимално съотношение между последователностите. Това може да включва вмъкване на “пролука”във всяка една от двете последователности, да се усили степента на изравняване. % идентичност може да бъде определен по протежение на цялата дължина на всяка една от последователностите, която е сравнявана (така нареченото глобално сравняване), което е особено подходящо за последователности със същата или много подобна дължина, или по протежение на по-къси, определени дължини (така нареченото локално сравняване), което е по подходящо за последователности с нееднаква дължина.

Методите за сравняване на идентичността и съответствието на две или повече последователности са добре познати в съществуващото ниво

на техниката. Така например програми, достъпни в Wisconsin Sequence Analysis Package, версия 9.1 (Devereux J. и сътр., 1984), например програмите BESTFIT и GAP, могат да бъдат използвани да се определи % на идентичност между два полинуклеотида и % на идентичност и % на хомоложност между две полипептидни последователности. BESTFIT използва алгоритъма за “локално съответствие” на Smith и Waterman (1981) и намира най-добрата единична област на подобие между двете последователности. Други програми за определяне на идентичност и/или подобие между последователности са също известни в съществуващото ниво на техниката, например фамилията програми BLAST (Altschul S. F и сътр., 1990, Altschul S F и сътр., 1997, достъпна

през страница на NCBI на адрес www.ncbi.nlm.nih.gov) и FAST А (Pearson W R, 1990; Pearson 1988).

Предпочитани промени изобретение са тези, които замествания. Консервативни за мутеини съгласно настоящото са известни като “консервативни” аминокиселинни замествания на остеопонтинови полипептиди могат да включват синонимни амино киселини в рамките на група, която има достатъчно подобни физикохимически свойства, така че заместването между членове на групата да запази биологичната функция на молекулата (Grantham,

1974). Ясно е, че инсерции и делеции на амино киселини може също така да бъде направено в дефинираните по-горе последователности без промяна на техните функции, особено ако инсерциите или делециите само включват малко амино киселини, напр. под тридесет и за предпочитане под десет и не премахват или разместват амино киселини, които са критични за функционалния строеж, напр. цистеинови остатъци. Протеини и мутеини, получени чрез такива делеции и/или инсерции влизат в обхвата на сферата на действие на настоящото изобретение.

Предпочитано, синонимните аминокиселинни групи са онези, определени в Таблица I. По-предпочитано синонимните аминокиселинни групи са онези, определени в Таблица II и найпредпочитано синонимните аминокиселинни групи са онези, определени в Таблица III.

ТАБЛИЦА I

Предпочитани групи на синонимни аминокиселини

Аминокиселина	Синонимия група
Ser	Ser, Thr, Gly, Asn
Arg	Arg, Gin, Lys, Glu, His
Leu	lie, Phe, Tyr, Met, Vai, Leu
Pro	Gly, Ala, Thr, Pro
Thr	Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gin, Thr
Ala	Gly, Thr, Pro, Ala
Vai	Met, Tyr, Phe, He, Leu, Vai
Gly	Ala, Thr, Pro, Ser, Gly
lie	Met, Tyr, Phe, Vai, Leu, lie
Phe	Trp, Met, Tyr, He, Vai, Leu, Phe
Tyr	Trp, Met, Phe, He, Vai, Leu, Tyr
Cys	Ser, Thr, Cys

His	Glu, Lys, Gin, Thr, Arg, His
Gin	Glu, Lys, Asn, His, Thr, Arg, Gin
Asn	Gin, Asp, Ser, Asn
Lys	Glu, Gin, His, Arg, Lys
Asp	Glu, Asn, Asp
Glu	Asp, Lys, Asn, Gin, His, Arg, Glu
Met	Phe, lie, Vai, Leu, Met
Trp	Trp

ТАБЛИЦА II

По-предпочитани групи на синонимни аминокиселини

Аминокиселина	Синонимна група
Ser	Ser
Arg	His, Lys, Arg
Leu	Leu, He, Phe, Met
Pro	Ala, Pro
Thr	Thr
Ala	Pro, Ala
Vai	Vai, Met, lie
Gly	Gly
lie	He, Met, Phe, Vai, Leu
Phe	Met, Tyr, He, Leu, Phe
Tyr	Phe, Tyr
Cys	Cys, Ser
His	His, Gin, Arg
Gin	Glu, Gin, His
Asn	Asp, Asn
Lys	Lys, Arg

Asp, Asn

Glu, Gin

Met, Phe, lie, Vai, Leu

Trp

Asp

Glu

Met

Trp

ТАБЛИЦА III

Най-предпочитани групи на синонимни аминокиселини

Аминокиселина	Синонимна група
Ser	Ser
Arg	Arg
Leu	Leu, lie, Met
Pro	Pro
Thr	Thr
Ala	Ala
Vai	Vai
Gly	Gly
lie	He, Met, Leu
Phe	Phe
Tyr	Tyr
Cys	Cys, Ser
His	His
Gin	Gin
Asn	Asn
Lys	Lys
Asp	Asp
Glu	Glu
Met	Met, He, Leu
Trp	Met

Примери на получаване на аминокиселинни замествания в белтъци, които могат да бъдат използвани за получаване на мутеини на остеопонтин, полипептиди или протеини, за използване в настоящото изобретение, включват вскакви известни стадии на методи, такива като представени в патенти на САЩ 4,959,314, 4,588,585 и 4,737,462 на Mark и сътр.; 5,116,943 на Koths и сътр.; 4,965,195 HaNamen и сътр.; 4,879,111 на Chong и сътр. и 5,017,691 на Lee и сътр.; и заместени с лизин протеини, представени в патент на САЩ № 4,904,584 (Shaw и сътр.).

Понятието “фузантен белтък” се отнася до остеопонтин, включващ полипептид, или мутеин или техен фрагмент, фузиран с друг белтък, който, напр., има удължено време на пребиваване в телесните течности. Така остеопонтин може да бъде фузиран към друг белтък, полипептид или подобни на тях, напр. имуноглобулин или негов фрагмент.

“Функционални производни”, както са използвани тук, включват производни на остеопонтин и техни мутеини и фузантни белтъци, които може да бъдат получени от функционалните групи, които се срещат като странични вериги на остатъците или N- или С-крайните групи, чрез

средства, известни в съществуващото ниво на техниката и са включени в изобретението докато те остават фармацевтично приемливи, т. е. те не разрушават активността на белтъка, която е фактически подобна на активността на остеопонтина и не придават токсични свойства на съдържащите го състави.

Тези производни могат, например, да включват полиетилен гликол със странични вериги, които могат да маскират антигенни места и удължават времето на пребиваване на остеопонтин в телесните течности. Други производни включват алифатни естери на карбоксилните групи, амиди на карбоксилните групи чрез реакция с амоняк или с първични или вторични амини, N-ацилни производни на свободни амино групи на аминокиселинните остатъци, образувани с ацилни части (напр. алкалоилни или карбоциклични ароилни групи) или О-ацилни производни на хидроксилни групи (например тази на серинов или треонинов остатъци), образувани с ацилни части.

Като “активни фракции” на остеопонтин, мутеини и фузантни белтъци, настоящото изобретение включва каквито и да са фрагменти или предшественици на полипептидната верига само на белтъчната

молекула самостоятелно или заедно със сродни молекули или остатъци, свързани към тях, напр. захар или фосфатни остатъци, или агрегати на остатъци на белтъчната молекула, или захарните остатъци с тях самите, при условие, че въпросната фракция има фактически подобна активност на остеопонтин.

Понятието “соли” тук се отнася до двете - соли на карбоксилни групи и на киселинни присъединителни соли на амино групи на молекула на OPN или аналози на тях. Соли на карбоксилна група могат да бъдат образувани чрез средства, известни в съществуващото ниво на техниката и включват неорганични соли, например натриеви, калциеви, амониеви, железни или цинкови соли и подобни на тях, и соли с органични бази като онези, образувани, например, с амини, такива като триетаноламин, аргинин или лизин, пиперидин, прокаин и подобни на тях. Киселинни присъединителни соли включват, например, соли с минерални киселини, такива като, например солна киселина или сярна киселина и соли с органични киселини, такива като, например, оцетна киселина или оксалова киселина. Разбира се всички тези соли трябва да запазват биологичната активност на OPN, съответно на настоящото изобретение, т. е., да проявяват пролиферативен ефект на олигодендроцитите.

В предпочитано приложение на изобретението остеопонтин е фузиран към молекула на носител, пептид или белтък, който увеличава преминаването на мозъчната кръвна бариера (“ВВВ”). Това служи за правилно прицелване на молекулата към мястото на действие в онези случаи, в които централната нервна система е включена в заболяването. Модалностите за пренасяне на лекарство през ВВВ имат за последица разкъсване на ВВВ както чрез осмотични средства, така и биохимично чрез използването на вазоактивни вещества, такива като брадикинин. Други стратегии за преминаване през ВВВ могат да имат за последица използването на ендогенни транспортни системи, включително с посредничество на носители- транспортни средства, такива като

глюкоза и аминокиселинни носители; с посредничество на рецептори трансцитоза за инсулин или трансферин; и транспортни средства с активно изтичане, такива като пара-гликопротеин. Стратегиите за доставяне на лекарство зад ВВВ по-нататък включва интрацеребрална

имплантация.

Функционални производни на остеопонтин могат да бъдат свързани към полимери с цел да се подобрят свойствата на белтъка, такива като стабилност, време на полуживот, биопригодност, търпимост от човешкото тяло или имуногенетика. За да се постигне тази цел, остеопонтин може да бъде свързан напр. към полиетиленгликол (PEG). Полиетиленгликолиране може да бъде извършено чрез известни методи, описани, например, в WO 92/13095.

Следователно, в предпочитано приложение на настоящото изобретение остеопонтинът е свързан с полиетилен гликол.

В по-нататъшно предпочитано приложение на изобретението фузантният белтък включва имуноглобулиново (Ig) фузиране. Фузията може да бъде пряко или през къса свръзка от пептид, която може да бъде толкова къса, колкото 1 до 3 аминокиселинни остатъка по дължина, или по-дълга, например, с дължина 13 аминокиселинни остатъка. Въпросната свръзка може да бъде трипептид, например с последователност E-F-M (Glu-Phe-Met), или свръзка от 13 амино киселини с последователност, включваща Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-ValLeu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met, въведена, например, между

последователността на остеопонтина и последователността на имуноглобулина. Полученият фузантен белтък има подобрени свойства, такива като удължено време на пребиваване в телесни течности (време на полуживот), или увеличена специфична активност, увеличено ниво на експресия. Ig фузията може също така да улесни пречистване на фузантния белтък.

В едно друго предпочитано приложение, остеопонтинът е фузиран към постоянната област на Ig молекула. Например предпочитано той се свързва към региони на тежки вериги като СН2 и СНЗ домени на човешки IgGl. Други изоформи на Ig молекули са също подходящи за създаването на фузантни белтъци съгласно настоящото изобретение, такива като изоформи IgG2 или IgG4, или други Ig класове, например като IgM. Фузантните белтъци могат да бъдат мономерни или мултимерни, хетеро- или хомомултимерни. Имуноглобулиновата част на фузантния белтък може да бъде допълнително модифицирана по такъв начин, че да не активира комплементарно свързване или комплементарна каскада или свързване към Fc-рецептори.

Изобретението по-нататък се отнася до използването на комбинация от остеопонтин и имуноподтискащ агент за производството на лекарство за лечение и/или профилактика на неврологични заболявания за едновременно, последователно или отделно използване. Имуноподтискащите агенти могат да бъдат стероиди, метотрексат, циклофосфамид, противолевкоцитни антитела (такива като САМРАТН1) и подобни на тях.

Изобретението освен това се отнася до използването на комбинация на остеопонтин и интерферон за производството на лекарство за лечение и/или профилактика на неврологични заболявания за едновременно, последователно или отделно използване.

Понятието “интерферон”, както е използвано в настоящата патентна заявка, е предназначено да включва всякаква молекула, дефинирана като такава в литературата, включваща, например, всички видове интерферони (INFs), споменати в горния раздел Предшестващо ниво на изобретението“. Интерферонът може предпочитано да бъде човешки, но също така извлечен от други родове, докато биологичната активност е подобна на човешките интерферони и молекулата не е имуногенна на човека.

По-специално, всички видове от IFN-a, IFN-β и IFN-γ са включени в горната дефиниция. IFN-β е предпочитаният интерферон съгласно настоящото изобретение.

Понятието “интерферон-бета (IFN-β)”, както е използвано в настоящото изобретение, е предназначено да включва човешки фибробластен интерферон, както получен чрез изолиране от биологични течности, или като получен чрез ДНК рекомбинантни техники от прокариотни или еукариотни клетки - гостоприемници, както също и техни соли, функционални производни, варианти, аналози и фрагменти.

“Функционални производни”, както е използвано тук, обхваща производни, които могат да бъдат получени от функционалните групи, които се срещат като странични вериги на остатъците на N- или Скрайните групи, чрез средства, известни в съществнуващото ниво на техниката и са включени в изобретението докато те остават фармацевтично приемливи, т. е. те не разрушават биологичната активност на белтъците, както е описано по-горе, такава като способността да свързват съответстващия рецептор и да предизвикват рецепторно сигнализиране и не придават токсични свойства на съдържащите го състави. Производните могат да имат химически части, такива като въглехидратни или фосфатни остатъци, при условие, че такова производно запазва биологичната активност на белтъка и остава фармацевтично приемливо.

Например, производните могат да включват алифатни естери на карбоксилните групи, амиди на карбоксилните групи чрез реакция с амоняк или първични или вторични амини, N-ацилни производни на свободни аминогрупи на аминокиселинните остатъци, образувани с ацилни части (напр. алканоилни или карбоциклични ароилни групи) или О-производни на свободна хидроксилна група (напр. тази от серинови или треонинови остатъци), образувани с ацилни части. Такива производни могат също така да включват, например, полиетилен гликолни странични вериги, които могат да маскират антигенни места и удължат пребиваването на молекулата в телесните течности.

От особена важност е белтък, който е подложен на получаване на производно или комбиниран с комплексообразуващ агент, да бъде дълготраен. Например полиетиленгликолираните версии, както са споменати по-горе, на белтъци, генетично проектирани да показват дълготрайна активност в тялото, могат да бъдат използвани съгласно настоящото изобретение.

Понятието “производни” е предназначено да включва само онези производни, които не сменят една амино киселина към друга от двадесетте обикновено-срещащи се естествени амино киселини.

Понятието “соли” тук се отнася до двете - соли на карбоксилни групи и на киселинни присъединителни соли на амино групи на белтъците, описани по-горе, или техни аналози. Соли на карбоксилна група могат да бъдат образувани чрез средства, известни в съществуващото ниво на техниката и включват неорганични соли, например натриеви, калциеви, амониеви, железни или цинкови соли и подобни на тях, и соли с органични бази като онези, образувани, например, с амини, такива като триетаноламин, аргинин или лизин, пиперидин, прокаин и подобни на тях. Киселинни присъединителни соли включват, например, соли с минерални киселини, такива като, например солна киселина или сярна киселина и соли с органични киселини, такива като, например, оцетна киселина или оксалова киселина. Разбира се всички такива соли трябва да запазват биологичната активност на белтъците (съответно остеопонтин и IFNбета), съответно на настоящото изобретение, т. е., способността да се свързва към съответстващия рецептор и да предизвиква рецепторно сигнализиране.

Интерферони могат също така да бъдат свързани към полимери с цел да се подобри стабилността на белтъците. Свързване между интерферон β и полиола полиетиленгликол (PEG) е описано например в WO 99/55377.

В друго предпочитано приложение на изобретението интерферонът е Интерферон-β (IFN-β) и по-предпочитано IFN-β 1а.

Остеопонтин е предпочитано използван с интерферона едновременно, последователно или отделно.

В предпочитано приложение на настоящото изобретение остеопонтин е използван в количество от около 0.0001 до 100 mg/kg телесно тегло, или около 0.01 до 10 mg/kg телесно тегло, или около 1 до 5 mg/kg телесно тегло, или около 2 mg/kg телесно тегло.

Изобретението освен това се отнася до използването на молекула на нуклеинова киселина за производство на лекарство за лечение и/или профилактика на неврологично заболяване, в което молекулата на нуклеиновата киселина включва последователност на нуклеинова киселина, кодираща полипептид включващ аминокиселинна последователност, избрана от групата, състояща се от:

(а) Полипептид, включващ SEQ ID NO: 1;

(b) Полипептид, включващ аминокиселини 1 до 168 или 170 на SEQIDNO: 1;

(c) Полипептид, включващ аминокиселини 1 до 16 и 170 до 314 на SEQ IDNO: 1;

(d) Полипептид, включващ аминокиселини 170 до 314 на SEQ ID NO: 1;

(e) Полипептид, включващ SEQ ID NO: 2;

(f) Полипептид, включващ SEQ ID NO: 3;

(g) Мутеин на който и да е полипептид от (а) до (f), в който аминокиселинната последователност има поне 40 %, или 50 %, или 60 %, или 70 %, или 80 %, или 90 % еднаквост на поне една от последователностите в (а) до (f);

(h) Мутеин на който и да е полипептид от (а) до (f), който е кодиран чрез ДНК последователност, която се хибридизира към комплементарната на природната ДНК последователност, кодираща който и да е полипептид от (а) до (f) при умерено строги условия или при силно строги условия;

(i) Мутеин на който и да е полипептид от (а) до (f), в който всякакви промени в аминокиселинната последователност са консервативни аминокиселинни замествания на аминокиселинните последователности в (а) до (f);

(j) изоформа, фузантен белтък, функционално производно, активна фракция или кръгообразно разместено производно на който и да е полипептид от (а) до (f).

Нуклеиновата киселина може напр. да бъде прилагана като гола молекула на нуклеинова киселина, напр. чрез мускулна инжекция.

Тя може освен това да включва векторни последователности, такива като вирусна последователност, полезна за експресия на гени, кодирани чрез молекулата на нуклеиновата киселина в човешкото тяло, предпочитано в подходящите клетки или тъкани.

Следователно, в предпочитано приложение, молекулата на нуклеиновата киселина освен това включва експресионна векторна последователност. Експресионни векторни последователности са добре познати в съществуващото ниво на техниката, те включват допълнителни елементи, служещи за експресия на интересуващия ни ген. Те могат да включват регулаторна последователност, такава като промоторна и усилваща последователности, последователности на избран маркер, начало на мултипликация и подобни. Така е използван генно лечебен подход за лечение и/или профилактика на болестта. Благоприятно е, че експресията на остеопонтин след това ще бъде in situ.

В предпочитано приложение експресионният вектор е производен на лентивирус вектор. Беше показано, че лентивирусни вектори са много ефективни при преноса на гени, по-специално в обхвата на централната нервна система. Други добре установени вирусни вектори, такива като произлизащи от аденовируси вектори, могат също така да бъдат използвани съгласно изобретението.

Целеви вектор може да бъде използван за да усили преминаването на остеопонтин през кръвно-мозъчната преграда. Такива вектори например могат да са насочени например към трансфериновия рецептор или други ендотелни транспортни механизми.

В предпочитано приложение на изобретението експресионният вектор може да бъде прилаган чрез мускулна инжекция.

Използването на вектор за индукция и/или усилване на ендогенната продукция на остеопонтин в клетка, нормално тиха за експресия на остеопонтин, или която експресира количества остеопонтин, които не са достатъчни, са също обмислени съгласно

изобретението. Векторът може да включва регулаторни последователности, функционални в клетките, желани да експресират остеопонтин. Такива регулаторни последователности например могат да бъдат например промотори или усилващи последователности. След това регулаторната последователност може да бъде въведена в подходящия локус на генома чрез хомоложна рекомбинация, така оперативно свързвайки регулаторната последователност с гена, експресията на който се изисква да бъде индуцирана или усилена. Обикновено технологията се отнася до “ендогенно генно активиране” (EGA) и е описана напр. в WO 91/09955.

Изобретението освен това се отнася до използването на клетка, която е била генетично модифицирана да продуцира остеопонтин при производството на лекарство за лечение и /или профилактика на неврологични заболявания.

Изобретението освен това се отнася до клетка, която е генетично модифицирана да продуцира остеопонтин за производство на лекарство за лечение и/или профилактика на неврологични заболявания. Така, може да бъде използван клетъчен терапевтичен подход за да се достави

лекарството към подходящите части на човешкото тяло.

Изобретението освен това се отнася до фармацевтични състави, по-специално полезни за профилактика и/или лечение на неврологични заболявания, които включват терапевтично ефективно количество от остеопонтин и терапевтично еефективно количество от интерферон, освен това по избор ефективно количество имуносупресант.

Определението “фармацевтично приемлив” е предназначено да обхваща всеки носител, който не пречи на ефективността на биологичната активност на активната съставки и не е токсичен към гостоприемника, към който той се прилага. Например за парентерално прилагане активният белтък(ци) може да бъде формулирани в единична дозировъчна форма за инжектиране в ексципиент, такъв като физиологичен разтвор, разтвор на глюкоза, серумен албумин и разтвор на Ringer.

Активните съставки на фармацевтичния състав, съгласно изобретението, могат да бъдат прилагани по един или множество пътища. Пътищата на прилагане включват интрадермален, през кожата (напр. при бавно разтворими препарати), мускулен, интраперитонеален,

венозен, подкожен, орален, епидурален, местен, интратекален, ректален и интраназален пътища. Може да бъде използван всеки друг терапевтично ефикасен път за прилагане, например абсорбция през епителни или ендотелни тъкани или чрез генна терапия, при която ДНК молекула, кодираща активния агент, се прилага на пациента (например чрез вектор), което предизвиква експресията на активния агент и секрецията му in vivo. В допълнение, белтъкът(ците), съгласно изобретението, могат да бъдат прилагани заедно с други компоненти на биологично активни агенти като например фармацивтично приемливи повърхностно-активни вещества, ексципиенти, носители, разредители и

транспортни средства.

За парентерално прилагане (например венозно, подкожно, мускулно) активните белтъци могат да бъдат приготвени като разтвор, суспензия, емулсия или лиофилизирано прахообразно вещество заедно с фармацевтично приемливо парентерално транспортно средство (например вода, физиологичен разтвор, разтвор на глюкоза) и добавки, които поддържат изотоничността (например манитол) или химичната стабилност (например консерванти и буфери). Препаратът е стерилизиран чрез широко използвани техники.

Бионаличността на активния(те) белтък(ци), съгласно изобретението, може също да бъде подобрена чрез използване на процедури на конюгация, които увеличават времето на полуживот на молекулата в човешкото тяло, например свързване на молекулата с полиетилен гликол, както е описано в РСТ патентна заявка WO 92/13095.

Терапевтично ефективните количества на активния(те) белтък(ци) ще бъдат функция на много променливи величини, включващи вида на белтъка, афинитета на белтъка, всяка остатъчна цитотоксична активност, проявявена от антагонистите, начина на прилагане, клиничното състояние на пациента (включително желанието за поддъране на нетоксично ниво от ендогенна активност на остеопонтин).

“Терапевтично активно количество” е такова, че когато е приложено, остеопонтинът оказва благотворен ефект върху неврологичното заболяване. Приложената доза като еднократна или многократна доза на даден индивид ще варира в зависимост от различни фактори, включително фармакокинетичните свойства на остеопонтина, пътя на прилагане, състоянието на пациента и характеристиките (пол, възраст, телесно тегло, здравословно състояние, величина), степента на

проява на симптомите, конкурентни лечения, честота на лечение и желания ефект.

Както е споменато по-горе, остеопонтин може предпочитано да бъде използван в количество от около 0.0001 до 10 mg/kg, или около 0.01 до 5 mg/kg телесно тегло, или около 0.01 до 5 mg/kg телесно тегло, или около 0.1 до 3 mg/kg телесно тегло, или около 1 до 2 mg/kg телесно тегло. В допълнение, предпочитани количества от остеопонтин са количества от около 0.1 до 1000 pg/kg телесно тегло, или около 1 до 100 pg/kg телесно тегло, или около 10 до 50 pg/kg телесно тегло.

Начинът на прилагане, който е предпочитан съгласно изобретението, е подкожно прилагане. Освен това предпочитано е мускулно прилагане съгласно изобретението.

В допълнителни предпочитани приложения, остеопонтин се прилага ежедневно или през ден.

Дневните дози обикновено се дават в разделени дози или с препарат с продължително освобождаване, ефективен да се получат желаните резултати. Второ или последващи прилагания могат да бъдат осъществени при дозировка, която е същата, по-малка или по-голяма от първоначалната или предишната доза, прилагана на индивида. Второ или последващи прилагания могат да бъдат приложени по време или преди започване на заболяването.

Съгласно изобретението, остеопонтин може да бъде прилаган профилактично или терапевтично на индивид преди, по време или след други терапевтични режими или агенти (напр. лекарствени режими на множество лекарства) в терапевтично ефективно количество, поспециално с интерферон. Активни агенти, които се прилагат едновременно с други терапевтични агенти, могат да бъдат прилагани в

същия или различни препарати.

Освен това изобретението се отнася до метод за лечение на неврологично заболяване, включващ прилагането на пациент, нуждаещ се от такова лечение, на ефективно количество остеопонтин, или на агонист на активност на остеопонтин, по избор заедно с фармацевтично приемлив носител.

Метод за лечение на неврологични заболявания, включващ прилагането на пациент, нуждаещ се от такова лечение, на ефективно количество от остеопонтин, или на агонист на активност на остеопонтин и на интерферон, по избор заедно с фармацевтично приемлив носител, е също в обхвата на настоящото изобретение.

Всички литературни източници, цитирани тук, включително публикации в списания или резюмета, публикувани или непубликувани патентни заявки на САЩ или чуждестранни патентни заявки, издадени патенти на САЩ или чуждестранни патенти, или каквито и да са други литературни източници, са изцяло включени тук чрез цитиране, включително всички данни, таблици, фигури и текст, представени в цитираните източници. В допълнение цялото съдържание на литературните източници, цитирани в обхвата на литературните източници, цитирани тук, са също изцяло включени в настоящото изобретение чрез цитиране.

Цитиране на стадии на известен метод, стадии на конвенционални методи, известни методи или конвенционални методи, не е по никакъв

начин признание, че каквато и да е страна, описание или приложение на настоящото изобретение е разкрита, научавана или подсказана в съответното съществуващо ниво на техниката.

Гореспоменатото описание на специфичните приложения ще разкрие толкова пълно общата природа на изобретението, че други

могат, чрез прилагане на знания в границите на съществуващото ниво на техниката (включително съдържанието на цитираните тук литературни източници), лесно да променят и/или приспособят за различно прилагане такива специфични приложения, без прекалено експериментиране, без да се напуска общата концепция на настоящото изобретение. Следователно такива приспособявания и промени са предназначени да бъдат в обхвата на еквивалентите на разкритите приложения, основани на представените тук доктрина и ръководство.

Трябва да бъде разбрано, че фразеологията или терминологията тук е за целите на описанието и не на ограничаване, такова, че терминологията или фразеологията на настоящата спецификация трябва да бъде обяснявана от занимаващ се в областта професионалист в светлината на представените тук доктрина и ръководство в комбинация с познанията на човек, запознат със съществуващото ниво на техниката.

Имайки сега описано изобретението, то по-лесно ще бъде разбрано чрез отнасяне към следните примери, които са предоставени като начин за илюстриране и се има пред вид да не са ограничаващи на настоящото изобретение.

ПРИМЕРИ

ПРИМЕР 1; Остеопонтин е диференциално експресиран в модели in vivo и in vitro на демиелиниращи заболявания

Методи

Моделни системи in vitro

Клетъчната линия Oli-neu беше създадена по пътя на умъртвяване

на олигодендроглиални предшественици с репликационно-непълен ретровирус, кодиращ t-неу онкогена, съставна активна тирозин киназа: беше показано, че тази клетъчна линия е индуцирана за диферинциация в присъствието на 1 mM дибутирил-сАМР в културалната среда (Jung и сътр., 1995). Това осигури възможността за изучаване на олигодендроцитите като изолиран клетъчен вид.

Морфологията и антигенните характеристики на клетки на мишата олигодендроцитна клетъчна линия Oli- neu, произлизаща от миши олигодендроцитни предшественици А2В5, при условия без третиране и след 6 дневно про-диференцииращо третиране с 1-5 mM дибутирилсАМР, се различава съществено. Докато нетретирани клетки Oli- neu имат кръгла форма и са най-вече биполярни като олигодендроцитните клетки-предшественици, третираните със сАМР клетки създават множество процеси, имат плосък фенотип и даже произвеждат плоски, удължени “подобни на обвивка” структури.

В допълнение, анализ на in vitro миелинация, използващ смесени кортикални култури, може да бъде използван да даде възможност за визуализиране на функционален миелин in vitro. Тази система осигурява възможността за изучаване как олигодендроцити контактуват и миелинират аксони в присъствието на други клетъчни видове на централната нервна система (Lubetzki и сътр., 1993). В тази система могат да бъдат изпитани биологични фактори, които биха могли да влияят на пролиферацията на олигодендроцитни предшественици или действат на диференцияцията и преживяването на олигодендроцити, такива като влияещи на образуването на реални миелинови части. Необходимостта да се изучава процеса на миелинация in vitro доведе до развитието на област от видове анализи, включително култури, натрупващи мозъчни клетки (Matthieu и сътр., 1992), култури на церебрални дялове (Notterpek и сътр., 1993) и системи за съвместно култивиране (Shaw и сътр., 1996; Barres и сътр., 1993). Тези модели имат предимството да позволяват изучаването на олигодендроцитно

поведение при свързване с други клетъчни видове и как тези клетки са стимулирани да произвеждат миелин, Демиелинация също може да бъде провокирана в такива системи по пътя на специфични инсулти й също може да бъде изучаван процеса на отговор на ремиелинация.

Моделни системи in vivo

Съществува широка област от експериментални модели in vivo и in vitro за множествена склероза. Повечето от моделите in vivo са свързани с класическия животински модел на множествена склероза, експериментален алергичен енцефаломиелит (ЕАЕ). Има много варианти на този модел, които са били приспособени за използване в широка област от организми на бозайници, включително системи от мишки, плъхове и примати (разгледани в Petry и сътр., 2000). В допълнение, формулирани са методологии за “наподобяване” на предложения вирусен компонент на множествена склероза в животински модели, такива като енцефалитогенния миши вирусен модел на Theiler за множествена склероза (Dal Canto и сътр., 1995).

Животински модели за изучаване единствено на миелинацията в централната нервна система или периферната нервна система обикновено са по-малко използвани. Беше доказано, че е полезно да се наблюдава процеса на развитие на миелинацията, за да се получи известен поглед вътре в механизмите, лежащи в основата на диференциацията на олигодендроглиалните клетки или клетки на Schwann, миграцията и пролиферацията, следващи “рекапитулационната хипотеза” (Franklin и Hinks, 1999). Обаче, за да се сравнят развитието на миелинацията, която се среща, докато още се образува централната нервна система и периферната нервна система и ремиелинацията, която се среща във възрастен организъм, е необходимо да се формулират модели, които специфично се отнасят до процеса на ремиелинация.

Купризонов модел

Един от най-добре познатите и широко използвани в моделите на ремиелинация е купризоновия модел за ремиелинация при мишки. Това обхваща орално прилагане на органично съединение, купризон, меден комплексообразуващ агент, за който беше показано, че е избирателно токсичен към олигодендроцити (Morell и сътр., 1998).

Демиелинация и ремиелинация стават в corpus callosum на третирани с купризон мишки. Тези патологични състояния могат да бъдат визуализирани чрез оцветяване с анти-СМР-азно антитяло или МВР антитяло. Миелина се оцветява с Luxol Fast Blue-перйодна киселина Schiff (LFB-PAS). Ремиелиниращи олигодендроцитни предшественици могат да бъдат визуализирани, използвайки антитела за PDGFa рецептор или NG2.

Прилагане на купризон на мишки в течение на период от 3-5 седмици води до в удължена демиелинация на мазолестото тяло. Съпътстващо с демиелинацията, синтеза на миелин-специфични гении копия е повишено регулиран след 3 седмици прилагане на купризон (Morell и сътр., 1998).

Последващо спиране на купризоновия режим създава околна среда, благоприятна за възстановяване, така че 6 седмици след спиране на купризоновото хранене мишките показват удължена ремиелинация в мазолестото тяло. Така купризоновият модел осигурява цялостен in vivo образец, в обхвата на който да се изучават страни на демиелинация и ремиелинация. Неговите предимства включват отсъствието на инфилтрация на Т-клетки в тъканта на централната нервна система, давайки възможност за по-специално изучаване на процесите на миелинация, както и добра възпроизводимост на резултатите (Hiremath и сътр., 1998).

За купризоново лечение, женски мишки C57BL/6 (възраст 8 седмици, 20 ±3 g) бяха използвани в изследването, което включваше 6 групи, всяка съдържаща 6 животни.

Група 1: контролна група, хранена с нормална прахообразна храна;

Група 2: хранени в продължение на 3 седмици с прахообразна храна, съдържаща 0.2 % купризон (Cup3w);

Група 3: хранени в продължение на 5 седмици с прахообразна храна, съдържаща 0.2 % купризон (Cup5w);

Група 4: хранени в продължение на 5 седмици с прахообразна храна, съдържаща 0.2 % купризон, последвано от 1-седмичен възстановителен период на нормална прахообразна храна (1 wR);

Група 5: хранени в продължение на 5 седмици с прахообразна храна, съдържаща 0.2 % купризон, последвано от 3-седмичен възстановителен период на нормална прахообразна храна (3wR);

Група 6: хранени в продължение на 5 седмици с прахообразна храна, съдържаща 0.2 % купризон, последвано от 6-седмичен възстановителен период на нормална прахообразна храна (6wR).

Мозъците бяха събрани от животните във всяка група в края на всяко лечение при определени времена. Мишките най-напред бяха подложени на анестезия и перфузия през левия вентрикул. Мозъците бяха събрани и бяха направени серийни коронарни разрязвания на нивото на мазолесто тяло-каудален путамен (стриатум) и хипокампус. Разрезите на мозъчна тъкан бяха запечатани в парафин за имунохистохимични изследвания и хибридизация in situ.

Подготовка на тъкани за хистологично изследване

Беше получен формалин чрез разреждане на 1 обем формалдехид (Fluka, 36 % р.а.) и 1 обем стерилен PBS с 8 обема стерилна вода. Силиконова тръбичка, нагласена към перисталтична помпа и снабдена с игла 20G, 1-1/5 беше напълнена с 10 ml PBS. След това тръбичката беше пълнена непрекъснато с 40 ml формалин, като бяха взети мерки да се предотврати образуването на въздушно мехурче.

Животните бяха подложени на анестезия с натриев пентобарбитал (Sanofi®), разреден 1:1 със стерилен PBS до концентрация от 3 mg/100 ml преди интракардиална перфузия с фиксаж да позволи последващ хистологичен анализ на органи и тъкани. Всяка мишка получи интраперитонеална инжекция от 0.05 ml (0.75 g/kg). След като животните бяха приспани, техните крайници бяха фиксирани с игли (25G 5/8 игли) през кожата на дъска от пеностирол. Корема на всяко животно беше изчистен с етанол и беше направен разрез в кожата със стерилни ножици на нивото на външната страна. След това коремът беше разрязан по-нататък към дясната и към лявата страна. Външната страна беше повдигната с чифт пинсети и диафрагмата беше отворена през диагонален разрез и беше направен двустранен разрез,

перпендикулярен на разпарянията, така че да се покаже гръдната кухина с биещото сърце в средата. Сърцето беше държано с пинсети и дясното предсърдие незабавно срязано да позволи венозно кръвотечение. Беше позволена циркулация на 10 ml PBS, следвани от 40 ml формалин в случая на всяка мишка. Мозъка и гръбначния мозък на всяко животно бяха внимателно дисектирани и поставени в 10 ml формалинов разтвор в 50 ml епруветка на Falcon® в продължение на 2 часа. След това формалиновият разтвор беше сменен с 10 ml стерилен PBS и материалът оставен при +4°С в продължение на една нощ. След това разтворът на PBS беше сменен отново и материалът беше оставен при +4°С в продължение на няколко часа. Мозъчните полукълба и гръбначния стълб бяха нарязани на срезови приблизително 0.5 cm и поставени в пластмасови кошнички, съвместими с фиксиращата машина. Беше направено фиксиране в парафин на мозъка и гръбначния мозък, използвайки автоматичен Tissue Тек Vacuum Infiltration Processor Е15О/ЕЗОО (Miles Inc. Diagnostics) съгласно програмата, описана по долу:

минути в 50 % етанол минути в 70 % етанол минути в 70 % етанол минути в 80 % етанол

минути в 80 % етанол минути в 96 % етанол минути в 96 % етанол

120 минути в 96 % етанол минути в 100 % ксилол минути в 100 % ксилол

Четири 60 минутни инкубации в парафин (Histosec, Merck 11609); последния стадий е за включване.

Всички разтвори бяха съхранявани при 40°С с парафина при 65° С. След като тъканните части бяха готови, частите на мозъка и гръбначния мозък бяха поставени в желаната ориентация на пластмасови камери за включване в парафинови блокчета. Парафиновата течност беше излята и оставена бързо да се охлади при 0° С върху студена плоча. Парафиновите блокчета бяха обработени с микротом за срязване (5-10 pm). След това срезовете бяха поставени върху обработени със силан стъклени предметни стъкла (SuperFrostPlus™, Menzel катал. № 041300). След монтирането, предметните стъкла бяха съхранявани в свободна от прах околна среда.

Клетъчна култура

Oli-new. Клетки на миша олигодендроцитна клетъчна линия (Olineu) бяха обогатени по пътя на центрофугиране и ресуспендиране в среда на Sato (Trotter и сътр., 1989). Клетките бяха култивирани в 75-ml колби при контролирани условия fj 37° С и 5 % СС>2· Беше извършена диференциация с 1 mM dbcAMP, прибавен директно към средата на клетъчната култура. Беше екстрахирана РНК, използвайки тризолния метод (виж по-долу).

Изолиране на РНК

Тотална РНК беше изолирана от клетки Oli-neu, мозъчни разрези на третирани с купризон мишки и цели миши пост-натални мозъци при различни стадии на умствено развитие, използвайки протокол за изолиране Tri-ZOL® (Life Technologies AG, Базел, Швейцария). Поли(А)⁺ РНК беше получена от цялостни проби РНК, използвайки колони Qiagen OLIGOTEX™ (QIAGEN Inc., 28159 Stanford Avenue, Валенсия, Калифорния 91355, САЩ).

Анализ DGE, използвайки сДНК микроподреждане

Експерименти по микроподреждане бяха направени в Incyte Genomics (Incyte Genomics Inc., 3160 Porter Drive, Пало Алто, Калифорния 94304, САЩ). DGE анализа беше извършен, използвайки микроподреждане на Incyte миша GEM™ експресия на 1 ген (http ://www. incyte. com/reagents/gem/products. shtml).

Частите на Incyte, използвани в тези анализи, бяха заредени с молекули сДНК, съответстващи на 8734 гена, както известни, така и неизвестни (EST последователности). Технологията на Incyte позволи микропроби на всеки от тези гени да бъдат намерени върху единично подреждане. Всяка сДНК молекула, съответстваща на познат ген или EST, беше с дължина 500-5000 Ьр. Спецификациите на Incyte дадоха откриваем динамичен диапазон от 2 до 2,000 pg за индивидуална тРНК в проба. Количеството на РНК, изисквано за всеки експеримент за подреждане, беше 600 ng от поли(А)⁺ РНК. Заявените нива на откриваема диференциална експресия бяха дадени като отношения пого леми от 1.75.

Сигнална нормализация и определяне нивото на експресия Отношенията, изчислени от 2-та флуоресцентни интензитета, осигуряват количествено измерване на относителното ниво на генна експресия в анализираните 2 клетъчни проби. Отношенията, определени

спрямо всеки ген, са изчислени на основата на нормализирани нива на експресия. Изчислен е фактор на нормализация чрез разделяне на общата експресия на втората проба (Р₂) на общата експресия на първата проба (Pi). След това този фактор е приложен към нивото на експресия на всеки ген в Р₂. След като този стадий на нормализация е бил приложен, гениите отношения са изчислени съгласно следното правило:

Нека Е1 да бъде нивото на експресия на даден ген в проба 1 и нека Е₂ да бъде нормализираното ниво на експресия на същия ген в проба 2; ако Е₂ > Е1, тогава отношението = Е₂/Е_ь иначе отношението = - Ει/Ε₂.

Тъй като хибридизацията на проби е извършвана едновременно при конкуренция, технологията на нарязване на късчета на Incyte е по-

прецизна при определяне на относителните експресионни промени и става по-малко надеждна за измерването на абсолютни експресионни нива. Въпреки това е възможно да се използват стойностите на тези нива на експресия за сравняване на двойки РНК популации в пробите, които не бяха в действителност сравнени физически върху късчето. Такива сравнения in silico са по-малко надеждни, но те могат да осигурят допълнителна информация върху механизмите, които биха могли да се прилагат към анализираните системи.

Резултати

Модели, използвани за анализ на диференциална експресия на остеопонтин

Таблица IV показва моделите, които бяха използвани за извличане на тРНК и хибридизация на късчетата (DGE анализ), както е описан погоре.

ТАБЛИЦА IV: Модели, използвани при DGE анализа

Модели	Третиране	Контроли
1. In vitro олигодендроцитен диференциращ модел	Клетки Oli-neu + дибутирил-сАМР (6 часа)	Клетки Oli-neu (нетретирани)
Клетки Oli-neu + дибутирил-сАМР (6 дни)	Клетки Oli-neu (нетритшронш)
2. In vivo купризонов модел демиелинация/ ремиелинация	Фронтален мозък на възрастен индивид + купризон (3 седмици)	Нетретиран фронтален мозък на възрастен индивид
Фронтален мозък на възрастен индивид + купризон (5 седмици)	Нетретиран фронтален мозък на възрастен индивид
Фронтален мозък на възрастен индивид + купризон (3 седмици)	Фронтален мозък на възрастен индивид + купризон (5 седмици)

3. Свързана с растежа миелинация

Малък мозък на мишки 10 дни след раждането (РЮ)

Малък мозък на мишки 2 дни след раждането (Р2)

Положителна контрола за DGE: Регулиране на миелинспецифични гени.

Като положителна контрола най-напред беше изпитано дали би могло да бъде показано регулиране на миелин-специфичните гени, използвайки DGE.

Таблица V показва регулирането, наблюдавано за миелин специфични гени, присъстващи върху микроредиците на Incyte. Стойностите на диференциалната експресия за всеки ген са докладвани от двете - 3-седмичната и 5-седмичната точки на купризоново лечение. Тези данни са положителна контрола за доказване надеждността на късчетата. Тъй като регулирането на миелинови структурни гени при нашите експериментални условия е добре характеризирано, наблюдаваната експресия на тези гени, измервана на късчетата, би могла да бъде използвана да показва а) прецизността на технологията и Ь) възпроизводимостта на нашите модели.

ТАБЛИЦА V: Регулиране in vivo на миелин-специфични гени в анализи на микроредици на in vivo модели на миелинация.

Наименование на гена	Номер на прибавяне	Куп 3w	Куп 5w	Р 2/10
Миелинов базисен белтък	АА059540	113.6	11.3	+7.9

Миелинов везикуларен белтьк/миелин и лимфоцитен белтък (MVP/MAL)	АА519027	33.5	11.7	0
Циклична нуклеотидна фосфодиестераза 1 (CNPase)	W63987	22.9	11.1	+2.9

• Постнатален малък мозък ден 2/10

Посочената по-горе таблица показва как някои миелинспецифични гени бяха регулирани в анализите на микроредици, извършени на РНК от различни модели in vivo, използвани да се изучава демиелинацията, ремиелинацията и свързаната с растежа миелинация. Промените в експресията на тези миелин-специфични гени показва как процесът на миелинация може да бъде изследван на нивото на транскрипционна регулация, използвайки микроредици.

След 3 седмици прилагане на купризон, демиелиниращият ефект на третирането може да бъде визуализиран в специфични области на мозъка на мишките. Следователно при 3 седмици беше очаквано да се наблюдава намаляваща модулация на различни гени, свързани с миелиновата синтеза и/или миелиновото поддържане. Намаляването на регулацията на миелинспецифичните гени, както е наблюдавано чрез микроредиците, служи като потвърждение на точността и надеждността на експерименталната система. Данните, представени в Таблица V, показват, че нивата на тРНК за МВР са регулирани надолу 13.6-кратно и циклична нуклеотидна фосфодиестераза 1 (CNPase), регулирана по87 ниско 2.9-кратно, бяха намалени при 3 седмици купризоново лечение, сравнени с контролите. Обаче нивата на РНК за тези двата гена бяха върнати съответно до 1.3- и 1.1-кратно под нормалните нива след 5 седмици третиране с купризон, показвайки, че биологичната система се опитваше да установи ремиелинация чрез повишаване синтеза на структурни миелинови белтъци.

Диференциална регулация на остеопонтин

На късчетата, остеопонтинът беше регулиран нагоре при 3w (+2.2) и 5w (+2.8) купризон.

ПРИМЕР 2; Потвърждаване на диференциална генна експресия на остеопонтин чрез количествен анализ в реално време с полимеразна верижна реакция с обратна транскриптаза (RT)-PCR (TaqMan®)

Методи

Създаване на шаблони на сДНК

Матриците на сДНК за TaqMan® анализа бяха създадени от пробите с тотална РНК чрез обратна транскрибция (RT), използвайки реагентите за обратна транскрибция TaqMan® (P/N N808-0234). Всички RT реакции бяха извършени в обем 100 μΐ, съдържащи: 10 μΐ TaqMan® RT буфер, 22 μΐ разтвор 25 mM на MgCl₂ (5.5 μΐ), 20 μΐ смес jcokchNTPs (500 μΜ от всяка dNTP), 5 μΐ случайни хексамери (2,5 μΜ), 2 μΐ инхибитор PHKse (0.4 U/μΙ), 2.5 μΐ MultiScribe™ обратна транскриптаза (1.25 U/μΙ) и 38.5 μΐ проба от РНК (1 pg общо ) в свободна от RNase Н₂О. Реакциите бяха проведени на Eppendorf MasterCycler при 25° С в продължение на 10 min (инкубационен стадий), 48° С в продължение на 30 min (обратна транскрипция) и 95° С в продължение на 5 min (стадий на инактивиране). Всички синтезирани сДНКи бяха съхранявани при 20° С в обеми от 20 μΐ.

Проектиране на праймери и потвърждаване

SYBR Green прави и обратни праймери за PCR в реално време за всички потвърдени гени и GAPDH (контрола) бяха проектирани, използвайки програмата Primer Express™ от РЕ Biosystems съгласно публикуваните последователности и поръчани при концентрация 0.02 μΜ от Interactiva (Interactiva: The Virtual Laboratory, Sedanstrasse 10, D89077, Улм). Специфичността и оптималните концентрации на ф праймери бяха изпитани за всеки набор от праймери. Потенциалното геномно ДНК замърсяване беше контролирано чрез провеждане на PCR реакции на отрицателни контролни сДНК проби, които бяха подложени на реакции на обратна транскрипция в отсъствието на RT ензима. Отсъствие на неспецифично увеличаване беше потвърдено чрез анализиране на PCR продукти чрез гел електрофореза на агароза на 3.5 % гелове MetaPhor или предварително изляти 4 % гелове NuSieve®.

Горната таблица показва, че последователностите на генспецифични праймери, проектирани за представяне на TaqMan® © анализа за да потвърдят диференциалната експресия на гени, показа че те са диференциално регулирани върху микроредиците. Включени са също имената на гените, съответстващи на всяка двойка праймери и признатия номер на GenBank на последователността, използвана да се проектира всеки праймер с програмата Primer Express™ .

ТАБЛИЦА VI: Праймери, използвани за RT-PCR анализа

Наименование на гена	Признат номер	TaqMan® ОЛИГО ИМЕ	TaqMan® ОЛИГО ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ
Отделен фосфопротеин 1 (остеопонтин)	АА 108928	Остеопонтин- 166F	AGCCTGCACCCAG ATCCTATAG
Остеопонтин- 23 5R	GCGCAAGGAGATT CTGCTTCT

TaqMan реакции

SYBR Green PCR в реално време бяха извършени с 5 μΐ / гнездо от RT-продукти (0.5 ng тотабна РНК, 25 μΐ / гнездо от експертна смес SYBR Green PCR (Applied Biosystems, Калифорния, САЩ) с AmpErase урацил N-гликозилаза (UNG) (0.5 Unit / гнездо) и 20 μΐ праймери (300 пМ). PCR беше проведена при 50° С в продължение на 2 min (за AmpErase UNG инкубация да се елиминира каквото и да е потенциално пренасяне чрез отстраняване на урацила, включен вътре в PCR продуктите, създадени от предишни TaqMan опити), 95° С за 10 min (за AmpliTaq Gold активация). След това пробите бяха подложени на 40 цикъла при 95° С в продължение на 15 sec, 60° С в продължение на 1 min на ABI PRISM® 7700 Sequence Detection System. Пробите c обратно транскрибирана сДНК бяха умножени и бяха определени техните стойности на Ст (пределен цикъл). Всички стойности на С_т бяха нормализирани спрямо съхранявания в колекцията ген GAPDH. Където беше възможно пробите бяха анализирани в две или три повторения за да се определи възпроизводимостта на резултата. При електрофорезния анализ беше наблюдавана отделна специфична ДНК ивица за всички потвърдени гени и GAPDH.

Изчисляване на генното регулиране чрез предела на цикъла (Ст)

Принципът на откриване в реално време, използвайки експертната смес SYBR Green PCR е основан на директното откриване на продукт PCR чрез измерване на увеличението на флуоресценцията, създадена от свързването на багрило SYBR Green към двойноверижна ДНК. Това

позволява количествено определяне на относителното увеличение на генно-специфичния усилен продукт, основано на кривите на растеж на PCR.

Измерване на специфични сДНК видове, сравнени спрямо контролната проба, е проведено чрез количествено определяне на сДНК, превърната от тРНК, съответстваща на специфичния ген, сравнено спрямо калибровъчна проба, служеща като физиологичен еталон. Калибрирането е осигурено чрез проба от контрола или условия на нетретиране. Сравнително количествено определяне на сДНК видовете е извършено чрез нормализация към ендогенна контрола (в този случай GAPDH) за да се отчете всяко вариране в началната концентрация и качество на общата РНК, използвана за създаване на матрица на сДНКи и в ефективността на превръщане на реакциите на обратна транскрипция. Изчисляване на стойностите на относително количествено определяне беше извършено чрез вземане на средната стойност на С_т за реакциите на репликация, провеждани за всяка проба, изчислявайки разликата (АС_Т) в средната Ст между целевите проби и ендогенните контроли, изваждайки средната Ст на калибратора за целта от АС_Т на онази цел (ААСт) и накрая изразявайки стойността на относителното количествено определяне за целта като 2 , с цел да се измери областта на регулацията нагоре или надолу в генната експресия.

Нормализация на флуоресцентни сигнали в TaqMan® реакции

Флуоресцентните сигнали на комплекса SYBR Green-ds,IJHK са нормализирани спрямо пасивния стандарт или отрицателните контролни реакции, несъдържащи матрична ДНК. Нормализацията беше извършена по пътя на разделяне интензитета на емисията на комплекса SYBR Green-ds/JHK в експерименталната реакция с интензитета на емисията на стандарта. Това дава отношението R_n (нормализиран докладчик) за реакцията:

• R_n ⁺ = R_n стойност на реакция, съдържаща всички компоненти, включително матрична ДНК • R_n = R_n стойност на нереагирала проба (няма матрична ДНК) • AR_n = (R_n ⁺) - (R_n ), където:

R_n ⁺ = (интензитет на емисията на комплекса SYBR GreenбвД1 II<)/PCR с матрица (интензитет на емисията на пасивния стандарт)

R_n = (интензитет на емисията на комплекса SYBR Greends/4HK)/6e3 матрица (интензитет на емисията на пасивния стандарт)

Изчисление на регулирането на нагъването от стойностите Ст на цикъла на пределните стойности

AR_n представлява величината на сигнала, създаден от даден набор от PCR условия за специфична реакция. Пределният параметър на цикъла съдържа измерване на относителното увеличение на амплифицирането на генно-специфичния продукт, който представлява сравнителен излишък на специфичен транскрипт в експериментална популация на сДНК. Тя е фиксирана като точката на цикъла, при която най-напред е открито статистически значимо увеличение на AR_n. Пределният параметър е дефиниран като средно стандартно отклонение на R_n за ранните цикли, умножен по коригиращ фактор. Пределният параметър на цикъла е използван за количествено определяне на диференциална генна експресия. Изчислени са специфични стойности за всяка крива на генно-специфичен растеж, основани на точката на

цикъла, при която е открито увеличение над предшестващия интензитет на флуоресценция.

Цялото изчисление на стойностите на относителното количествено определяне беше извършено чрез вземане на средната стойност на Ст за реакциите на реплициране, проведени за всяка проба, изчислявайки разликата (АС_Т) в средната Ст между целевите проби и ендогенните контроли и изваждайки средната С_т на калибратора за целта от АСт на тази цел (ААСт). Накрая стойността на относителното количествено определяне за целта беше изразена като 2‘^MCl с цел да да измери областта на регулацията нагоре или надолу в генната експресия.

Резултати

Количествена обратна транскрипция в реално време (RT)-PCR (TaqMan®) осигурява чувствителен и надежден подход за потвърждаване и изясняване на промени в генната експресия. Детекторът TaqMan на последователност (ABI PRISM® 7700 Sequence Detection System, Applied Biosystems, Foster City, Калифорния) обединява основан на PCR анализ с хардуерно/програмно обезпечаване, което осигурява система за висококачествено количествено определяне на последователности на нуклеинови киселини. Това комбинира термични цикли, флуоресцентна детекция и специфично-приложими програми, позволяващи откриването цикъл по цикъл на увеличението на количеството специфичен PCR продукт.

Експресията на няколко високорегулирани гени, посочени по пътя на анализ на микроподреждането, беше потвърдена, използвайки платформата TaqMan®. Във всеки случай, доколкото е възможно, беше включено продължителността на всяка използвана моделна система. Това позволи да бъдат събрани повече данни, разглеждайки как специфичните гени се държат по време на цялостен процес: .

Промени в генната експресия биха могли да бъдат количествено определени чрез метода TaqMan® по пътя на директно откриване на увеличение на PCR продукта чрез измерване на флуоресценцията, създадена от свързването на багрило SYBR Green към двойноверижна ДНК, представен чрез продуктите на амплификация, специфични за анализирания ген. Измерване на специфични сДНК видове, сравнени спрямо контролна проба, е проведено чрез количествено определяне на сДНК, превърната от шРНК, съответстваща на специфичния ген, сравнена спрямо калибровъчна проба, служеща като физиологичен стандарт. Калибрирането е осигурено чрез проба от контрола или условия на нетретиране. Относително количествено определяне на сДНК видовете е изчислено с нормализация към GAPDH, отчитайки всяка вариация в началната концентрация и качество на цялата РНК, използвана да се създаде матрица на сДНКи и в ефективността на превръщане на реакциите на обратна транскрипция.

Експресия на отделения ген на фосфопротеин 1 (остеопонтин) беше анализирана по време на протичане на изследването, обхващащо парадигмата на демилинация/ремиелинация, свързана с купризоновия модел.

Резултати на експерименти TaqMan за експресия на остеопонтин в купризоновия модел на ремиелинация са показани на Фиг.1 (А). Беше установено, че нивата тРНК на остеопонтин са регулирани нагоре 18кратно във фронтални миши мозъци след 3 седмици на купризоново прилагане (3w. куп.) и 25-кратно след третиране 5 седмици (5w. куп.).

Експресията на остеопонтин беше регулирана надолу след 1, 3 и 6 седмици на регенерация допълнително към 5 седмици на купризоново лечение (5 w. куп. + lw., 3w. и 6 w.). Тези установени факти показват важна роля на остеопонтин в демиелиниращата и ремиелиниращата фаза на модела, тъй като ремиелинация започва, когато все още протича демиелинация.

Фиг. 1 (В) показва резултатите на нивата на експресия на остеопонтин в развиващ се малък мозък. тРНК на остеопонтина е краткотрайно регулирана нагоре по време на ранно следродилно развитие, дни С4 до С8, което е периода от време на иницииране на миелинация в малкия мозък.

Резултатите от микроредиците (microarray) показаха регулиране нагоре на остеопонтин във фронтални миши мозъци по време на купризоново лечение. Този анализ разширява профила на експресия на остеопонтин да включва и двете - демиелиниращата и ремиелиниращата фази на купризоновото третиране и показва, че профилните пикове на експресията на остеопонтин по време на демиелиниращата фаза на купризоново третиране и по време на възстановителния период се връща приблизително до основните нива.

Резултатите са показани по-долу в Таблица VII.

Резултатите на TaqMan® анализа на експресия на остеопонтин потвърдиха регулирането му нагоре в мозъците на мишки, хранени с купризон в продължение на 3 и 5 седмици.

ТАБЛИЦА VII: TaqMan® анализ на регулиране на остеопонтин в купризоновия модел

Вид тъкан	Експеримент	Нива на експресия	Регулиране
Фронтален мозък	Куп. контрола	1.00	Контролно ниво
Фронтален мозък	Куп. контрола	-1.32	Надолу
Фронтален мозък	3 седмици куп.	17.51	Нагоре
Фронтален мозък	3 седмици куп.	23.43	Нагоре
Фронтален мозък	5 седмици куп.	20.25	Нагоре
Фронтален мозък	5 седмици куп.	23.43	Нагоре
Фронтален мозък	5 седмици куп. + 1 седмица R. възстановяване	1.79	Нагоре
Фронтален мозък	5 седмици куп. + 1 седмица R. възстановяване	3.32	Нагоре
Фронтален мозък	5 седмици куп. + 3 седмици R.	2.95	Нагоре

Фронтален мозък	5 седмици куп. + 3 седмици R. възстановяване	4.56	Нагоре
Фронтален мозък	5 седмици куп. + 5 седмици R. възстановяване	-1.16	Надолу
Фронтален мозък	5 седмици куп. + 5 седмици R. възстановяване	1.04	Контролно ниво
Фронтален мозък	5 седмици куп. + 5 седмици R. възстановяване	1.07	Контролно ниво

ПРИМЕР 3: Потвърждаване на диференциална остеопонтинова експресия чрез блотове на Northern

Методи

Приготвяне на блот'

За специфични гени беше анализирана тъканната специфичност на експресията, използвайки миши многотъканни блотове на Northern (Clontech Labs, 1020 East Meadow Circle, Пало Алто, Калифорния). Те съдържаха 2 pg от poly(A)⁺ РНК за старт от различни тъкани на възрастна мишка. Бяха приготвени отделни блотове за анализ на диференциална генна експресия за двата случая - in vitro и in vivo ситуации. РНК, изолирана от мозъците на третирани с купризон мишки при 3 седмици, 5 седмици и 1, 3 и 6-седмични времеви точки по време на възстановителния процес (до 6 седмици), беше използвана върху един набор блотове. Цялата мозъчна РНК от различни следродилни стадии по дни беше използвана на втори набор. Накрая серия на РНКи беше получена от Oli-neu клетки, култивирани в култура и обработени в различни отрязъци от време с дибутирил-сАМР. Тази РНК беше използвана за получаването на трети набор от блотове. Нови блотове бяха използвани с всяка генно-специфична сонда за да се осигури максимална ефективност на откриване и намали до минимум вариране в резултатите, дължащо се на непостоянно разкриване след хибридизация. Всички блотове бяха хибридизирани двукратно, най-напред със сонда срещу интересуващия ни ген и след това, следвайки разделянето на ивици, хибридизация със сонда срещу миши глицералдехид-3-фосфат (mGAPDH) за да се контролира за вариации в зареждането на РНК.

РНК (10 μg/гнeздo) беше заредена върху 1.2 % денатуриран агарозен гел, съдържащ формалдехид и 5Х MOPS (209.27 g 3-(Nморфолино)-пропансулфонова киселина, 20.5 g натриев ацетат, 50 ml 0.5 М EDTA pH 8.0 в 5 L със стерилна Н₂О, до pH 7.0 с 12 М NaOH). Всяка проба РНК беше смесена с 2 μΐ етилидиев бромид (0.01 mg/ml), 2 μΐ 5Х 3-(И-морфолино)-пропансулфонова киселина (MOPS), 3.5 μΐ 37 % формалдехид и 10 μΐ формамид. След това пробите бяха нагрявани при 65° С в продължение на 10 минути и бързо охладени върху лед. Два микролитра буфер за РНК проба за електрофореза (50 % глицерин, 1 mM EDTA, 0.4 % бромфенолово синьо и 0.4 % ксиленово цианолно багрило) бяха прибавени към всяка проба веднага преди поставянето на пробата върху гела.

Всяка електрофореза беше с продължителност ~ 3 часа в буфер IX MOPS (1L = 330 mL 37 % формалдехид, 400 mL 5Х MOPS, 270 mL обработена с DEPC Н₂О) при 5 V cm'¹ (дължина на гела). След това беше проведено прехвърляне на РНК от гела върху положително заредена найлонова мембрана (Hybond™-N, Amersham Life Sciences,

Amersham Place, Little Chalfont, Buckinghamshire, Англия HP7 9NA), в продължение на една нощ, използвайки разтвор на SSC, както е описано (Terry Brown, Unit 4.9, Current Protocols, 1993 [ изд. F.M. Ausubel, R. Brent, R.E. Kingston, D.D. Moore, J.G. Seidman, J.A. Smith и K. Struhl]). Ефективността на прехвърляне на РНК беше проверена чрез наблюдаване на мембраната и гела под UV светлина. РНКите бяха кръстосано свързани към мембраната чрез Stratalinker (Stratagene, САЩ). Блотовете бяха съхранявани между листа от филтърна хартия Whatman ЗММ при стайна температура преди хибридизация.

Получаване на сонди

Радиоактивни сонди, белязани с Р, бяха получени, използвайки гелно пречистени рестрикционни фрагменти на сДНК клони (-500 > 800 Ьр по дължина), съответстващи на гените, представляващи интерес. Фрагментите на ДНК бяха случайно белязани до специфична активност > 10 cpm ml' с P-dCTP, използвайки системата за белязане HighPrime™ (Roche Diagnostics AG, IndustriestraBe 7, 6343 Rotkreuz, Швейцария). Невключеният P-dCTP беше отстранен чрез основано на гравитацията елуиране на сместа на сондата през 5 колони на Pharmacia NAP™, съдържащи среда Sephadex® G-25 (ДНК Grade в дестилирана вода, съдържаща 0.15 % Kathon® CG/ICP Biocide®).

Хибридизация и детекция на сигнал

Хибридизацията на сондата беше извършена, използвайки ExpressHyb™ (Clontech Labs, 1020 East Medow Circle, Пало Алто, Калифорния) съгласно спецификациите на производителя. След хибридизацията, блотовете бяха експозирани на Hyperfilm™ МР (Amersham Pharmacia Biotech, Англия) при -80° С в авторадиографски касети. След отделяне на сондата, следващо експозиране, беше извършено чрез инкубиране на блота в продължение на 10 минути в стерилна Н₂О/0.5 % разтвор на SDS при 90-100° С и след това блотът беше оставен да се охлади в продължение на 10 минути. Мембраните бяха затворени в пластмасови кутии и съхранявани при -20° С докато се появи нужда от повторно подлагане на реакция съзс сонда.

Резултати

Нортърн блот анализ преди това е бил прилаган като техника за вторично потвърждение при изследвания в голям мащаб на диференциална генна експресия (Chang и сътр., 2000). Неговата чувствителност и точност позволяват анализ не само на тъканната специфичност на експресията на даден ген, който ни интересува, но също величината на диференциалната регулация между експерименталните и контролните условия. Това го прави, надежден метод за потвърждаване на DGE резултатите, получени чрез анализа на микроредиците. Нортърн блотове осигуряват също така информация,

отнасяща се до размерите на транскриптите и възможни алтернативни сплайс изоформи, сътветствещи на гена, който ни интересува.

Обичайни нортърн блотове бяха получени, използвайки РНК, изолирана от мозъците на третирани с купризон и контролни мишки. Те бяха подложени на реакция с радиоактивно белязани ДНК фрагменти от клонове, изпратени ни от Incite Genomics. Способността на нортън блотове да вззпржшзведот резултатите, наблюдавани чрез TaqMan® анализ на генна експресия, беше потвърдена, използвайки радиоактивно белязана сонда срещу миши остеопонтин, хибридизиран към блот на РНКи, изолирани от мозъците на мишки, лекувани с купризон. По този начин беше възможно да се сравни нортърн-блот анализа с TaqMan® анализа на експресията на остеопонтин в купризоновия модел.

100

Фигура 3 показва отворената четяща рамка на миши остеопонтин, въведен в pT7T3D-Pac вектор, както е предписано от Incite Genomics. Сивата област е кодиращата последователност и стрелката показва пълната сДНК за остеопонтин. Вмъкването на клон беше ограничавано от EcoRl и Notl рестрикционните сайтове. Да се направи сонда за използване в нортърн блотинг с цел да се анализира тъканна експресия на този ген, фрагмент 893-Ьр беше отрязан от клона, използвайки рестрикционните ензими на Hindi и Styl. Този фрагмент беше пречистен от гел и белязан за използване като сонда.

Експресията на миши остеопонтин беше установена чрез нортърн блот анализ, използвайки обичаен блот, получен с РНКи от мозъците на мишки от всеки стадий на купризоновия модел, включително възстановяване и нетретирани контроли. Първоначално беше проведена реакция на блота със сонда с радиоактивно белязан фрагмент на миша сДНК на остеоронтин, след експозирането е промит и след това отново подбложен на реакция със сонда радиоактивно белязан фрагмент на миши GAPDH. Това беше използвано като положителна контрола за да се отчетат разлики в наблюдавани нива на експресия, основани на вариации в общите количества на РНК във всеки старт на блота.

Експресията на остеопонтин в мозъците на третирани с купризон мишки достига пик при 3 и 5 седмица на купризоново хранене с малко по-висока експресия при 5 седмица. По време на възстановителната фаза нивата на тРНК на остеопонтина изчезват сравнително бързо със забележимо намаляване в експресията 1 седмица след прекратяване на купризоновото хранене. Нивата на тРНК на остеопонтина се връщат приблизително до нормалните нива след 6 седмици възстановяване. Това е качествено сравнимо с резултатите, получени в TaqMan® анализа на експресия на остеопонтин в купризоновия модел (виж Фигура 1 А).

101

ПРИМЕР 4: Регулиране на остеопонтин в oli-neu клетки

Експресията на остеопонтин в олигодендроцити (oli-neu), третирани с сАМР, беше измерена чрез TaqMan анализ. Резултатите са показани на Фиг. 4. Колони 1 до 4 показват резултатите, получени в олигодендроцитите. Сравнено с контрола (стойност = 1), 6 h третиране сАМР (кол. 1) води до регулиране нагоре на тРНК на остепонтин. След 2 с!(дни) сАМР третиране (кол. 2) беше измерено 12 пъти регулиране нагоре. Удължено третиране в продължение на 6 до 10 б(дни) (кол.З, 4) доведе до по-ниски нива на тРНК на остеопонтинова. Сравнение спрямо регулацията на тРНК на остеоронтин в купризоновия модел (кол. 5, 6) показа, че регулирането нагоре на остеопонтин след 3 и 5 седмици купризон във фронталния мозък беше сравнимо спрямо регулирането нагоре в олигодендроцити след 2 с1(дни) сАМР лечение.

ПРИМЕР 5; Експресия на остеопонтин в олигодендроцити

Метод

Oli-neu клетки бяха краткотрайно трансфектирани, следвайки метода на утаяване с калциев фосфат. Накратко oli-neu клетки от фазата на експоненциален растеж бяха отбрани (10e5/ml) в 6-гнездова плака в деня преди да се извърши трансфекцията. Разтвор от 100 μΐ на 250 пМ СаС12 беше смесен с 5 mg плазмидна ДНК. Еднакъв обем (100 μΐ) на разтвор от 2х HEPES (140 mM NaCl, 50 тМ HEPES pH 7.05), допълнен с фосфат от 300 тМ сток разтвор на Na₂HPO₄ и NaH₂PO₄ при pH 7.05 беше прибавен към Са/ДНК разтвор. Точно след една минута сместа беше внимателно прибавена към културалната плака и инкубирана в

102 продължение на 4 часа при 37° С в СО₂ инкубатор. След това време средата беше заменена със свежа среда и тогава клетките бяха инкубирани в продължение на 24-72 часа преди посяване и анализиране чрез Уестърн блотинг.

Резултати

Различни миши конструкти на остеопонтин във вектор pDEST12.2 (pDEST12.2-ocTeonoHTHH-EGFP, pDEST12.2-ocTeonoHTHH-His6, рОЕ8Т12.2-остеопонтин, виж Фиг. 4 до 7 и pCIE-EGFP като контролен плазмид) бяха трансфектирани в oli-neu клетки. Както беше намерено чрез специфични антитела, налични в търговската мрежа (R&D Systems, AF808), от клетките беше продуциран и отделен белтък. Маркираният с EGFP конструкт направи по-лесно наблюдаването на трансфекцията и 24 часа след трансфекцията можеше да бъде открита специфична промяна в клетъчната морфология (увеличение на олигодендроцитните процеси) в сравнение с pCIEGFP контролата (не е показана), което

показа, че остеопонтинът управлява мишата олигодендроцитна клетъчна линия oli-neu към по-зряло състояние на развитост на морфологичния фенотип. Морфологията, представена от трансфектирани с остеопонтин oli-neu клетки, беше много подобна на морфологията на миелиниращ олигодендроцит.

Тези резултати показват, че експресията на остеопонтин в олигодендроцити е от полза за да се управляват тези клетки по време на миелинация и следователно показват полезно въздействие на остеопонтин в заболявания, свързани с олигодендроцитна дисфункция.

103

ПРИМЕР 6: Експресия на белтък остеопонтин в специфични области на мозъка в купризоновия модел

Имунохистохимия на остеопонтин беше извършена на различни точки по време на де- и ремиелинация в купризоновия модел. Бяха

открити силни сигнали в демиелинираното мазолесто тяло и набраздените снопове при 5 седмици купризоново лечение, точка, свързана с очебийно микроглиално възстановяване към местата на демиелинация. С цел да се визуализират активираните микроглиални клетки беше проведено CD68 оцветяване на последователни секции и подобния профил на експресия предполага микроглиална експресия на остеопонтин.

Интересно е, че остеопонтин беше също така намерен в клетки, нареждащи се в предните вентрикули. Тази област беше описана като възрастова субвентрикуларна зона, съдържаща мултипотентни стволови за продукцията на неврони, астроцити и олигодендроцити. За да се определят олигодендроцитните клетки-предшественици, експресиращи остеопонтин, трябва бъде извършено двойно оцветяване с NG2, PSANCAM, PDGFa рецептор.

ПРИМЕР 7; Въздействия на белтък остеопонтин върху олигодендроцитна пролиферация

В този експеримент беше използвана миша първична олигодендроцитна (олигодендроглиална) клетъчна линия, умъртвена с tneu онкогена (“oli-neu” клетъчна линия). Установяването и свойствата

104 на клетъчната линия oli-neu, както условията на култивиране са описани в Jung и сътр. (1995).

Целта на това изследване беше измерването на въздействията на OPN върху олигодендроцитната пролиферация в oli-neu пролиферационен анализ. Клетки бяха поставени на плака без да се сливат. Те бяха оставени в условия на глад в продължение на 24 часа в среда без инсулин преди третиране с едно от двете - контролни или рекомбинантни белтъци. Броят на клетките беше количествено определен с аламарово синьо, което дава възможност за флуоресцентно отчитане. Изчисленията за усилване бяха основани на сравняването спрямо IGF1 (контрола) стандартна крива. Изчисленията за инхибиране на пролиферацията бяха основани на сравнението спрямо стандартната крива dbcAMP.

Материал

Оборудване и софтуер

Мултибелязан брояч Vallac Victor 2 (възбуждане при 530-560 пгп, емисия при 590 шп)

Софтуер Graph Pad Prism

Реактиви

Клетъчна линия oli-neu (Eur J Neuro 7: 125-1265 (1995))

Аламарово синьо (BioSourcelntl. Inc., Camarillo, CA93012)

Компоненти за среда на Sato бяха както следва:

Продукт	Доставчик	Сток разтвор	μΐ за 5000 ml
DMEM	Seromed F0435	500 ml

105

Трансферни	Sigma Т-2252	100 mg/ml (1 mg в 10 ml PBS)	50
Натриев селенит	Sigma S-9133	1 mg/2.56 ml PBS	50
Инсулин	Sigma 1-1882	10 mg/ml (100 mg/lOmlPBS)	500
Путресцин	Sigma P-7505	80.5 mg/ml (PBS)	500
Прогестерон	Sigma P-0130	0.62 mg/ml (EtOH)	50
TIT (Трийодотиронин)	Sigma T-5516	1.7 mg/ml (1/3 HC1 1N+2/3 EtOH	100
L-тироксин	Sigma T-0397	2.88 mg/ml + 1 капка NaOH IN	100
L-глутамин	Gibco 25030-024	200 mM	5000
Г ентамицин	Gibco 15750-037	50 mg/ml	250
Натриев бикарбонат	Gibco 25080-052	7.50 %	13000
Конски серум			5000

Плаки с плоско дъно BioCoat, покрити с поли D-лизин (356461) от

Becton Dickinson; R3-IGF1 (Il 146 от Sigma); DbcAMP (D-0627 от Sigma).

Метод

Култивиране на клетки за биоанализ in vitro

Oli-neu клетките са клетки, които се прикрепват при растеж на субстрат на поли-Ь-лизин. Клетките бяха нанесени върху предварително

106 покрити с поли-лизин плаки BioCoatTM с 96 гнезда. Клетките бяха разделяни 2-Зх/седмица. За да се разделят те първо бяха промити с PBS и след това отстранени с PBS плюс 1 mM EDTA. Клетките бяха култивирани в условия на влага 10 % СО₂ инкубатор.

Използваната замразяваща среда беше среда на Sato с 20 % FCS и 10 % DMSO. В този експеримент бяха използвани oli-neu клетки не повисоки от пасаж 16. Клетките бяха използвани като крайна концентрация от 4000 клетки за гнездо в плака с 96 гнезда след 24 часа гладуване в среда на Sato без инсулин.

Оцветяване с аламарово синьо

След 48 часа в СО₂ инкубатор към гнездата бяха прибавени 10 μΐ от сток разтвор на аламарово синьо и плаките бяха инкубирани допълнително в продължение на 2.5 часа. Флуоресценцията беше наблюдавана при дължина на вълната при възбуждане 530-560 nm и при емисия 590 nm. Плаките могат да бъдат отчетени до 4 часа след оцветяването и до 1 милион относителни флуоресцентни единици.

Планиране на експериментите

Като контроли бяха използвани 100 ng/ml R3-IGF-1 (положителна контрола), или 1 mM dbcAMP (отрицателна контрола), или среда без инсулин, или 100 пМ разтвор на OPN, загрят до кипене. Експерименталните проби бяха 1 пМ, 10 рМ, 0.1 рМ, 0.01 рМ или 100 пМ рекомбинантен остеопонтин. Контролните и експериментални проби бяха разредени до желаните концентрации с краен обем от 50 μΐ среда на Sato без инсулин и прибавени към гнездата. Клетки oli-neu бяха култивирани в свободна от инсулин среда в продължение на 24 часа и след това обработени с контролни или експериментални проби в продължение на 48 часа. Отделени oli-neu клетки, които бяха оставени в

107 условия на глад в среда без инсулин в продължение на 24 часа, бяха отделени от колбата за култивиране с PBS плюс 1 mM EDTA. Клетките бяха разредени до количество 300,000 клетки за ml и прибавени по 50 μΐ за гнездо. След това клетките бяха инкубирани 48 часа при 37°С в СО₂ инкубатор в условия на влага. Бяха прибавени 10 μΐ аламарово синьо и клетките бяха върнати в инкубатора за 2.5 часа. След това 70 μΐ от всяко гнездо бяха прехвърлени в черни плаки с 96 гнезда и веднага беше измерена флуоресценцията.

Пролиферацията на недиференцирани oli-neu клетки беше измерена след 24 часа в отговор на различни количества остеопонтин, което беше произведено, използвайки клетки от насекоми (BacOPN), или експресионна система от бозайници (НЕК-OPN). Скоростта на култивиране беше количествено определена чрез измерване на клетъчната метаболитна активност с флуорометричен/ колориметричен индикатор на култивиране, аламарово синьо. Този агент съдържа окислително-редукционен индикатор, който показва двете флуоресценцията и промените в неговия цвят в отговор на химическата редукция на средата за култивиране като резултат от клетъчно култивиране. Използваните агент и анализ са описани в Ahmed и сътр. © (1994) и патент на САЩ 5,501,959.

Резултати

Резултатите са показани на Фиг. 8 до 10.

Беше наблюдаван отговор на дозите с рекомбинантен остеопонтин както експресиран в бакуловирус, така и експресиран от НЕК клетки. Дегенерация на белтъка чрез кипене както се очакваше разруши биологичната активност. Прибавяне на експресиран в бакуловирус остеопонтин (BacOPN) и експресиран от НЕК клетки OPN (НЕК OPN) дове до зависимо от дозата увеличение на клетъчна пролиферация (Фиг.

108

8) c IC50 от 3.7 пМ за BacOPN и 0.05 пМ за HekOPN (Фиг. 9). В допълнение конструкция на OPN с N-край, съответстваща на аминокиселини 1 до 168 на изоформа а на OPN (виж Фиг. 2, N-край OPN-a), беше експресирана в клетки на насекоми. Пречистеният белтък беше изпитан при пролиферационен анализ в сравнение с протеин с пълна дължина. Съкратеният протеин беше активен (10 пМ, 100 пМ), виж Фиг. 10.

ПРИМЕР 8: Въздействия на остеопонтин върху експресията на о

маркери на миелинация в смесени кортикални култури.

Смесени кортикални култури, култивирани върху срезове от покритието бяха обработени с BacOPN (100 пМ) в продължение на 12 дни от DIV (дни in vitro) 5-17. На 17 ден in vitro културите бяха фиксирани и оцветени с антитяло анти-МВР. Резултатите показват, че BacOPN срезове от покритие имат по-високоразклонени МВР положителни олигодендроцити отколкото контролите (Фиг. 11). В допълнение докато, в контролни култури (Фиг. 11 А) не бяха ® наблюдавани миелиниращи олигодендроцити, обработените с OPN култури (Фиг. В, С и D) са богати на олигодендроцити, които се обвиват около аксоните и образуват миелинови сегменти и вътрешни възли. (Фиг. 11 В до D). Преброяването на сегментните клъстери показва, че докато в контролата не могат да бъдат наблюдавани в сегменти, три различни, обработени с OPN проби показаха 16, 22 и 18 сегментни клъстери. Тези резултати показват, че третирането на кортикални смесени клетки с остеопонтин води до диференциран фенотип олигодендроцити, което е характерно за миелиниращи олигодендроцити.

109

ПРИМЕР 9: Въздействия на остеопонтин върху експресията на МВР в смесени кортикални култури както са измерени чрез МВР ELISA

МВР ELISA беше използван с цел да се наблюдава увеличаване на МВР белтъка и така миелинация в смесени кортикални култури, обработени с OPN и LIF.

Първични култури

Източникът на материал беше миша мозъчна тъкан от ембриони, изолирана от бременни женски мишки NMR1 16 дни след полов акт. Ембрионите бяха дисектирани съгласно протокола на Lubetzki и сътр., корите бяха разделени по пътя на трипсиново извличане и отделените клетки (включително неврони, астроцити, олигодендроцити, микроглиални и невронални предшественици) бяха разделени при 1 * 10⁵ клетки за гнездо върху предварително покрити с поли-Ь-лизин плаки с 96-гнезда (при първоначален обем 50 μΐ) за всяко гнездо.

Третиране с рекомбинантен белтък

Бяха проведени третирания, използвайки рекомбинантни белтъци (положителна контрола, рекомбинантен фактор на инхибиране на миша левкемия (LIF), закупен от AMRAD Laboratories, при концентрации 1 pg/ml, 100 ng/ml и 10 ng/ml; продуциран в мишки остеопонтин с пълна дължина, експресиран в бакуловирус при концентрации от 100 пМ, 10 пМ и 10 рМ). Всички белтъци бяха разредени в културална среда до подходящите концентрации от сток материал преди прибавяне към клетките in vitro. Културите бяха оставени да се развиват в продължение

110 на 5 дни in vitro и след това бяха обработвани последователно в продължение на 17 дни. Средата беше сменяна всеки 3 дни.

Протокол за отделяне на проби от плаки с микрогнезда

Клетките бяха лизирани и пробите посяти след 17 дни in vitro (DIV 17). Лизисът на клетките беше извършен, използвайки троен буфер с детергент.

Троен буфер с детергент

Крайна концентрация ml Tris, pH 8.0, 1 Μ 50 mM

8.77gNaCl 150 mM

2mlNaN₃(10%) 0.02% ml SDS 20% 0.1%

10mlNP40 1% g натриев деоксихлорат 0.5 %

Непосредствено преди използване беше прибавена една таблета протеазни инхибитори (Roche № 1836170) към 10 ml от разтвора на тройния буфер с детергент.

Средата беше отстранена от смесените проби на кортикални култури, които бяха инокулирани в предварително покритите плаки с 96-гнезда. Клетките бяха внимателно промити двукратно с 50 μΐ от 1 X PBS и след това беше прибавен 50 μΐ троен детергентен буфер към всяко гнездо. Всички плаки с микрогнезда, съдържащи лизираните проби, след това бяха съхранявани при -20° С до анализа.

Белтъчен анализ ВСА

111

Белтъчният ВСА анализ на Pierce е съвместим с детергентен препарат на основата на бихининова киселина (ВСА) за колориметричното откриване и количествено определяне на общ белтък. Този метод обединява добре познатата редукция на Си до Си от белтък в алкална среда с високочувствителна и селективна колориметрична детекция на медния катион (Cu⁺¹), използвайки уникален реагент, съдържащ бихининова киселина.

Пурпурнооцветеният продукт на реакцията при този анализ е образуван чрез хелатиране на две молекули ВСА с един меден йон. Този водоразтворим комплекс показва силна абсорбция при 562 nm, която е линейна с увеличаване концентрациите на белтък в широк работен диапазон от 20 Lig/ml до 2000 pg/ml. Методът ВСА не е истински метод на крайната точка - окончателният цвят продължава да се развива, но, следвайки инкубацията, скоростта на развитие на цвета е забавена достатъчно така че да даде възможност да бъдат направени значителен брой проби в един единичен опит. Има съобщения, че макромолекулната структура на белтъка, броя на пептидните връзки и присъствието на четири аминокиселини (цистеин, цистеин, триптофан и тирозин) са отговорни за образуване на цвят с ВСА.

Протокол за плака с микрогнезда за определяне на общо съдържание на белтък μΐ от всеки стандарт (концентрации на BSA: 2000 pg/ml, 1500 pg/ml, 1000 pg/ml, 750 pg/ml, 500 pg/ml, 250 pg/ml, 125 pg/ml, 25 pg/ml) и проби бяха прибавени в подходяща плака с микрогнезда. 25 μΐ от разредителя (троен детергентен буфер) бяха прибавени към празните гнезда (работен диапазон 20-2000 pg/ml).

към всяко гнездо бяха прибавени 200 μΐ работен реактив (смес на 50 части ВСА реактив А и 1 част ВСА реактив В). Плаката с гнездата

112 беше разклащана в продължение на 30 секунди и инкубирана при 37° С в продължение на 30 минути. След инкубация стойностите на абсорбцията бяха измерени при 570 nm.

МВР сандвич ELISA

Стерилни микроплаки с 96-гнезда с плоско дъно (Costar) бяха инкубирани в течение на нощта при +4° С с анти-МВР антитела (Chemicon, МАВ5274), разредени 1:5000 в IX PBS. Към всяко гнездо бяха прибавени 50 μΐ от разредения разтвор на антитела.

На следващия ден разтворът на антитела беше отстранен от всички гнезда в плаките и беше проведен блокиращ стадий, използвайки 50 μΐ 1 % разтвор на BSA в IX PBS за всяко гнездо. Блокирането беше извършено в продължение на 1 час при стайна температура. След стадия на блокиране, плаките бяха промити 3 пъти с робот, използвайки PBS/Tween.

След прибавянето на серия разреждания на пептидния стандарт на МВР или проби в 1 % BSA/PBS към гнездата на микроплаки беше проведено инкубиране. Сток разтвор на пептид на МВР 100 ng/ml беше разреден 2 в 2. Използваните разреждания бяха определени след изчисляване на общото съдържание на белтък, използвайки резултатите на ВСА анализа на белтък. Те бяха както следва:

100 pg; 50 pg; 25 pg; 12.5 pg; 6.2 pg; 3.1 pg.

След инкубирането c МВР стандартите и белтъчните проби, плаките бяха отново промити 3 пъти с 1 % BSA/PBS.

Беше проведено второ инкубиране, използвайки поликлонални анти-МВР антитела (Zymed 10-038, 1:300), разредени в 1 % BSA/PBS. Плаките бяха инкубирани в продължение на 2 часа при стайна температура. След това инкубиране, плаките бяха отново промити 3 пъти както е описано по-горе.

113

Беше проведено инкубиране с кози анти-заешки биотин (вектор ВА-1000, 1:10,000) прибавен в обеми от 50 μΐ към всички гнезда след разреждане в 1 % BSA/PBS, в продължение на 1 час при стайна температура. След инкубирането, плаките бяха отново промити, както е показано по-горе.

Крайното инкубиране беше извършено с 50 μΐ свързана със стрептавидин пероксидаза от хран (стреп-HRP) (Amersham RPN 1051, 1:8000), разредена в IX PBS, добавен към всяко гнездо. Плаките бяха инкубирани в продължение на 1 час при стайна температура.

След стадия на измиване, реакцията беше проявена, използвайки ортофенилендиамин дихидрохлорид (OPD) (Sigma, разтвор, получен чрез прибавяне на 1 таблета към 20-ml обем вода). Тази реакция беше блокирана чрез прибавяне на 3 М НС1 или 30 % H₂SO₄. Беше измерена оптичната плътност, използвайки мултисканиращ риидер на флуороплаки (Labsystems Multiskan ЕХ) при 492 nm.

Резултати

Както е показано на Фиг. 12, нивата на МВР белтъка бяха увеличени 3 пъти в обработени с bacOPN (10 пМ) култури на DIV 17, сравнени спрямо контролни култури. Това наблюдение подкрепя предишните резултати, показващи положително въздействие на експресиран в бакуловирус OPN върху пролиферацията на олигодендроцитни предшественици и миелинацията.

114

ПРИМЕР 10: Въздействие на остеопонтин върху CG4 пролиферация

Клетъчната линия CG4 е умъртвена олигодендроцитна клетъчна линия от плъхове, която беше спонтанно получена от първични олигодендроцитни предшественици А2В5. Клетки CG4 са обичайно използвана клетъчна линия за изслезване на олигодендроцитна диференциация или преживяване. Клетъчната линия CG4 има следните предимства:

• Висока пролиферативна скорост като олигадендроцитни прогенитори (О2А-подобни) (GD3, А2В5-положителни клетки);

• Ниски разходи за поддържане в кондиционна среда (с концентрации с ефективен растежен фактор), получени от невробластомна клетъчна линия В104 от плъхове (Louis J.C. и сътр. 1992), получени от АТСС.

• Може да бъде използвана дефинирана среда (без FBS) (допълнена с FGF2+PDGF) вместо кондиционна среда В104 за пролиферация по време на къси периоди;

• С определена среда може да бъде предизвикана диференциация в олигодендроцити (О4,Оа1С-положителни);

• В присъствието на FBS, може да бъде предизвикана диференциация в астроцити (GFAP-положителни).

Беше използван пасажен номер 35 на клетките CG4 да се изпита въздействие на два OPN белтъка (експресирани в E-coli или клетки на насекоми) върху пролиферацията. За този анализ беше използван произведен от R&D System E-coli остеопонтин (Кат. 441-ОР), който след това беше фосфорилиран in vitro с протеин киназа 2 (GST кондензирани) в обем 60 μΐ както следва:

115

Киназен буфер 6х:

HEPES 50 mM

MgCl₂10 тМ дитиотреитол 1 mM

Натриев ванадат 0.2 mM

Бета глицерилфосфат 25 шМ

Буфер на пробата 2х рН6

Трис-С1 0.125

Глицерин 20 %

Дитиотреитол 0.2 М

Бромфенол синьо 0.02 %

Смес АТР (60 μΜ) μΐ АТР при 600 μΜ μΐ от ³²рАТР

265 μΐ Н₂О₂

С цел да започне реакцията беше прибавена сместа АТР и инкубирането беше проведено при 30° С в продължение на 1 час. След 90 минути инкубиране при 30° С (с разбъркване) бяха прибавени 100 μΐ перли от Glutathione Sepharose (Pharmacia) към реакционната смес, която преди това беше промита с PBS с цел да се елиминира протеин киназата. След това сместа беше инкубирана в продължение на един час при стайна температура с внимателно разбъркване. Суспензията беше центрофугирана при 500g в продължение на 5 минути за да се утаят перлите. След това супернатантата беше подложена на диализа през нощта при 4° С срещу PBS. Белтъкът беше определен количествено чрез ВСА (Pierce).

Киназна реакция μΐ казеинова киназа при 0.05 pg/μΙ μΐ E-coli ΟΡΝ при 0.5 pg/μΙ μΐ 50 mM Трис-HCl pH 8 μΐ киназен буфер 6х

116 μΐ смес ATP

Пролиферационен анализ

Вас OPN и фосфорилирани in vitro OPN белтъци бяха изпитани при концентрации ЮрМ, 10 пМ и 100 пМ върху пролиферацията на клетки CG4. За отчитане беше използван BrdU (Amersham), както е описано в Avellana и сътр. 1996. Клетките бяха култивирани в 70 % дефинирана среда N1 (DMEM, съдържаща 4.5 g/Ι глюкоза, 2 тМ глутамин, 100 U/ml пеницилин, 100 pg/ml стрептомицин и 1 тМ натриев пируват и допълнени с 5 pg/ml трансферни, 100 шМ путресцин, 30 пМ натриев селенит и 10 ng/ml биотин) и 30 % кондиционирана среда В104 (N1 без биотин) (Louis J.C. и сътр. 1992). Анализът беше извършен в обработени в полиорнитин (100 pg/ml) плаки с 24 гнезда, инокулирани с ЗхЮ⁴ клетки/на гнездо. В същото време беше прибавен 10 пМ BrdU и клетките бяха инкубирани в продължение на 18 часа. След фиксиране беше проведена имуноцитохимия с анти-BrdU антитела да се открият деления на клетки. Клетките бяха също оцветени с оцветител Hoechst 44432 (Sigma), което позволява преброяване на общия брой клетки. Бяха получени и анализирани изображения, използвайки системата за анализ на изображенията Leica QWin.

Резултати

Резултатите са изобразени на Фиг. 13.

Експресиран в бакуловирус остеопонтин води до увеличена пролиферация на клетки CG4. Най-изразено въздействие може да бъде наблюдавано при концентрация 10 пМ OPN, макар че 100 пМ OPN също така води до пролиферация. Фосфорилиран in vitro, експресиран OPN в Е. coli води до по-малка пролиферация на клетки CG4.

117

Анализ на морфологията на третирани с OPN клетки срещу нетретирани клетки CG4 разкрива, че докато в контролата не може да бъде наблюдавана диференциация, третирани с OPN клетки CG4 бяха диференцирани така, че в повечето от клетките да се развият процеси. Докато диференциацията беше по-изразена при използване на експресиран OPN в бакуловирус, експресиран в Е. coli, фосфорилиран in vitro OPN доведе също така до диференциация на клетки CG4 (не е показана).

ПРИМЕР 11: Въздействие на остеопонтин върху предизвикан от MOG експериментален автоимунен енцефаломиелит (ЕАЕ) в мишки

Цел на изследването

Остеопонтин (OPN; AS900011) е цитокин с плейотропни функции, включително такива при адхезия, миграция, диференциация, преживяване и цитокинна секреция на различни клетъчни видове. OPN беше идентифициран по пътя на диференциална генна експресия. (DGE) с цел откриване на гени, които биха могли да регулират ремиелинация и олигодендроцитна функция (виж Пример 1). Третиране на олигодендрцитни предшественици с рекомбинантен OPN (AS900011) експресиран в бакуловирус увеличи пролиферацията по зависим от дозата начин (1С₅о: 3.7 рМ, виж Пример 7). В допълнение AS900011 показа въздействие върху диференциацията на клетъчна линия CG4 и първичните невросфери (виж Пример 8). OPN е експресиран в демиелинираното мазолесто тяло на мозъчната област на мишки, третирани с купризон, където експресията беше най-силна в микроглиални клетки (виж Пример 1). В допълнение OPN експресия беше наблюдавана в субвентрикуларната зона (SVZ), която беше

118 подсказано да създава олигодендроцитни предшественици, които участват в ремиелинацията (виж Пример 4). Изказана е хипотеза, че OPN, цитокин с различни имуно-регулаторни свойства, може също да играе роля като модулатор на невронна и глиална функция.

Целта на това изследване беше да се изпита терапевтичното въздействие на OPN в модела на предизвикана от MOG ЕАЕ в мишки.

Метод на изпитване

Методът на индуциране на ЕАЕ, използван за това изследване, е бил адаптиран от протокола, публикуван от Sahrbacher и сътр. (1998). Защитаването на животните, използвани в експеримента, е съгласно Директива 86/609/ЕЕС, влязла в сила, чрез италианската наредба D.L. № 116 от 27 януари, 1992 г. Физическите удобства и оборудване за настаняване и грижи за животните са съгласно условията на Директива 86/609 на Съвета на EEC. Институцията е изцяло. узаконена от компетентните ветеринарни здравни власти. Всички части на този протокол, отнасящи се до грижата за животни, е била одобрена от официалните ветеринари. Този протокол е узаконен от италианското Министерство на здравеопазването (Постановление № 51/99-В).

Система за изпитване

Вид, разновидност, подразновидност и пол:

Женски мишки С57 BL/6JICO от колонията IFFA CREDO (Saint Germain sur l’Arbesle, Франция) бяха доставени от Charles River Italia (Calco, Lecco, Италия).

Основание за избора на системата за изпитване:

Мишката С57 BL/6JICO беше избрана като експериментален модел; този избран вид има документирана възприемчивост към ЕАЕ.

119

Доставчик:

Charles River Italia S.p.A.

Via Independenza, 11

23885 - Calco (Lecco)

Аклиматизация:

Поне 5 дни преди започване на изследването. В този период животните ще бъдат наблюдавани през деня да се констатира тяхното добро здравословно състояние за изследването.

Възраст и телесно тегло (при случайно подбиране):

На възраст около 8 седмици; 18-22 g.

Жилище:

животни/клетка в стаи с кондициониране на въздуха.

Температура: 22° С ± 2

Относителна влажност: 55 % ± 10

Замяна на въздуха: около 15-20/час, филтруван на НЕРА 99.99 %. Светлина: 12 часов цикъл (7 сутринта - 7 вечерта).

Клетка: Клетка от Makrolon® 42.5x26.6x15 височина, всяка снабдена с покрита хранилка от неръждаема стомана. На дъното на клетката е поставена скара. Отпадъкът, който пада през скарата върху дъното на клетката, ще бъде периодично изхвърлян.

Идентификация на животните:

Чрез етикет на ухото. Картата на клетката ще дава експерименталния номер, дозираща група и дата на прилагане на съединението.

120

Храна:

Храна под формата на пелети GLP 4RF25 със сертификат за найвисоко качество, произведена по лиценз за храни на Charles River Italia от Mucedola S.r.I., Settimo Milanese. Да улесни храненето на болни животни, от 7 ден се поставят влажни пелети всеки ден на дъното на клетката. Производителят осигурява сертификат на анализ на хранителни вещества и замърсявания, нивото на които са в диапазона на границите , предложени от EPA-TSCA (44FR:44053-44093, 26 юли, 1979 г.). RBM анализира повторно животинската храна поне два пъти в годината за бактериално замърсяване. Храната е достъпна на животните “по желание”.

Вода:

От градската главна водоснабдителна система. Водата е филтрувана и разпределяна към животните “по желание” чрез автоматична система от кранове. В допълнение към автоматичната водопроводна система са използвани пластмасови бутилки. Периодично водата за пиене е анализирана за микробиологично преброяване, тежки метали, други замърсители (напр. разтворители, пестициди) и. други химически и физически характеристики. Приетите граници за качество на питейната вода са онези, дефинирани в Наредба 80/778 на EEC.

Замърсители, които биха могли да попречат на обективността на изследването не се очаква да присъстват в храната или питейната вода.

Изпитвани вещества:

Миши, 6 his-tag остеопонтин (AS900011) и mlFNfi

121

Имунизационна процедура:

Мишките бяха имунизирани (ден=0) чрез подкожно инжектиране в левия хълбок на 0.2 ml от емулсия, съставена от 200 pg MOG35.55 пептид (Neosystem, Strasbourg, Франция) в Complete Freund’s Adjuvant (CFA, Difco, Детройт, САЩ), съдържащ 0.5 mg от Mycobacterium tubercolosis. Незабавно след това те получиха интраперинеална инжекция от 500 ng токсин на коклюш (List Biological Lab., Campbell, Калифорния, САЩ), разтворен в 400 μΐ буфер (0.5 М NaCl, 0.017 % Triton Х-100, 0.015 М Tris, рН=7.5). На ден 2 на животните беше дадена втора интраперитонеална инжекция от 500 ng токсин на коклюш. На ден 7 мишките получиха втора доза от 200 pg от MOG35.55 пептид в CFA, инжектиран подкожно в десния хълбок. Започвайки приблизително от ден 8-10, тази процедура доведе до постепенна прогресираща парализа, нарастваща от опашката и възходяща към предните крайници.

Планиране на изследването:

Изследването обхвана 7 групи от по 15 животни всяка. Всички групи бяха имунизирани с MOG35.55 пептид в CFA и токсин на коклюша, съгласно протокола за имутизация и лекувани както следва:

Група 1: положителна контролна група, на която е приложена доза само от ексципиента на OPN (PBS + 0.1 % BSA) чрез подкожна инжекция;

Група 2: положителна контролна група, на която е приложена доза само от ексципиента на mlFNp (PBS) чрез подкожна инжекция;

Група 3: на която е приложена доза от 1 pg/kg остеопонтин (AS900011) подкожно;

Група 4: на която е приложена доза от 10 pg/kg остеопонтин (AS900011) подкожно;

122

Група 5: на която е приложена доза от 100 pg/kg остеопонтин (AS900011) подкожно;

Група 6: на която е приложена доза от 100 pg/kg остеопонтин (AS900011) плюс 20,000 U/мишка mlFNP, подкожно;

Група 7: на която е приложена доза от 20,000 U/мишка mlFNP, подкожно.

Броят на животните за група е минималния брой, позволяващ точна преценка на наблюдаваните фармакологични въздействия.

Ексципиент:

PBS плюс 0.1 % BSA са използвани за разреждане на остеопонтин до подходящата концентрация. PBS е използван за разреждане на ηιΙΕΝβ до подходящата концентрация.

Начин на прилагане:

Остеопонтин (AS900011) при дозите 1, 10 и 100 pg/kg беше прилаган подкожно в обем 10 ml/kg. ιηΙΕΝβ при дозата 20,000 U/мишка е прилаган подкожно в обем 200 pl/мишка. Група 1 е подложена на дозата подкожно с PBS плюс 0.1 % BSA в обем 10 ml/kg и група 2 е подложена на дозата подкожно с 200 pl/PBS/мишка.

Продължителност на третирането:

Третирането на групите в това изследване беше започнато за всяко животно при появата на клиничен резултат > 1 и след това продължено до 35 последователни дни.

123

Форма на прилагане:

Съединението и mlFNP бяха прилагани като разтвори в подходящ ексципиент. Съответни препарати ще бъдат получени съгласно инструкциите на спонсора.

Клинични наблюдения:

Започвайки от 7-ия ден след имунизацията, животните бяха изучавани индивидуално за наличието на парализа посредством клинично отчитане както следва:

= няма призанак за заболяване

0.5 = частична парализа на опашка = парализа на опашка

1.5 = парализа на опашка + частична едностранна парализа на задни крайници = парализа на опашка + слабост на задни крайници или частична парализа на задни крайници

2.5 = парализа на опашка + частична парализа на задни крайници (снизен таз) = парализа на опашка + пълна парализа на задни крайници

3.5 = парализа на опашка + пълна парализа на задни крайници + незадържане = парализа на опашка + пълна парализа на задни крайници + слабост или частична парализа на предни крайници = умиращо или мъртво

Наблюдението на животните беше проведено в тиха стая.

Клинични признаци бяха наблюдавани ежедневно във всяка група на третиране по сляп начин от лаборант, който не е запознат с третирането.

124

Телесното тегло на животните беше наблюдавано ежедневно.

Животни, за които се счита, че са в изтощено от болка или в умиращо състояние, ще бъдат изследвани от ветеринарния екип или упълномощения персонал и, ако е необходимо, хуманно умъртвени за да се намали до минимум прекомерна болка или страдание.

Кръвни проби:

Двадесет и четири часа след последното третиране ще бъдат взети кръвни проби от всяко животно (под анестезия с пентобарбитал). Серумът ще бъде разделен чрез рутинна процедура и серумните проби ще бъдат съхранявани при -20° С. След това замразените серуми ще бъдат превозени с кораб до SPRI за сравнителни определения на концентрацията на съединението в серума.

Хистологични изследвания:

В края на третирането животните под анестезия с пентобарбитал ще бъдат перфузно-фиксирани с 4 % формалдехид през левия вентрикул. След това техните гръбначни мозъци внимателно ще бъдат дисектирани и фиксирани във формалин. Отрязъци от гръбначните мозъци ще бъдат запечатани в парафинови блокове. Ще бъде извършено разрязване и оцветяване с хематоксилин и еозин за възпаление и с Kluver-PAS (Luxol бързо синьо плюс перйодно кисело Schiff-ово оцветяване) за откриването на демиелинация.

Оценка на данните:

Резултатите от клиничните изследвания са изразени като средния (± SEM) резултат в границите на всяка група. Въздействията на изпитаните вещества ще бъдат сравнени с това на третираната с ексципиента положителна контролна група. Разликите в стойностите на

125 клиничните резултати между групите ще бъдат анализирани чрез теста на Kruskal-Wallis, последван, в случай на значимост, от двойнствения тест на Wilcoxon при всяко време на измерване. Данните за телесното тегло ще бъдат оценени чрез еднопосочен ANOVA, следван, в случай на значимост, от тест на Tukey. Ще бъде използвана програма S-Plus®.

Резултати

Резултатите от това изследване са показани на Фиг. 14 до 16.

Хистологичният анализ на периваскуларното възпалително инфилтриране разкри, че имаше тенденция към по-малко количество на периваскуларни инфилтрати в третирани с OPN животни, особено при най-малкото прилагано количество от 1 pg/kg. Комбинацията от OPN и ΙΓ^;Νβ, което е съединение, известно да е активно при лечение на множествена склероза, беше по-ефикасна от единичното прилагане съответно на ΟΡΝ или IFN (Фиг. 14).

След това, беше измерен процентът на демиелинираните области (Фиг. 15). Отново в животни, третирани с ΟΡΝ, можеше да бъде наблюдавана тенденция към по-малко демиелинирани области. Комбинацията на IFN и ΟΡΝ доведе до значително силно намаляване на демиелинацията, която беше дори много по-ниска от степента на демиелинация, която беше наблюдавана само с IFN (Фиг. 15).

Фиг. 16 обобщава клиничните резултати, наблюдавани в края на лечението, възпалителните инфилтрати и демиелинацията, измерени в това изследване. Макар че наблюдаваните клинични резултати при лекувани с ΟΡΝ мишки не бяха значително по-ниски отколкото контролните, комбинацията на ΟΡΝ и INF доведе до изразено въздействие върху клиничните резултати, което беше толкова ниско, колкото с положителната контрола, интерферон бета. Това наблюдение е в съгласие с измерването на възпалителните инфилтрати и степента на

126 демиелинация. Двата параметъра бяха значително намалени след прилагане на OPN и IFN3 (фиг. 16).

Накратко в това изследване бяха получени следните резултати:

Остеопонтин (AS900011), изпитан самостоятелно при дози 1, 10 и 100 mg/kg подкожно не намалява периваскуларни инфилтрати и демиелинация със статистическа значимост. Лечението с IFN6eTa (20,000 U/мишка s.c.) предизвика намаляване на периваскуларната инфилтрация (55 %) и демиелинация (53 %). Когато IFN6eTa при същата доза беше комбиниран с AS900011 при доза от 100 mg/kg подкожно, беше наблюдавано значително и забележимо намаляване на възпалителни инфилтрации (71 %) и демиелинация (81 %).

Хистологичните данни корелират с клничните резултати, наблюдавани на 35-ия ден (край на третирането), когато животните бяха умъртвени и гръбначните мозъци събрани за хистологичен анализ. Остеопонтин (AS900011), изпитан самостоятелно при дозите 1, 10 и 100 mg/kg подкожно не намали значително остротата на заболяване. Лечението с IFN6eTa (20,000 U/мишка подкожно) значително намали остротата на заболяване. Когато IFN6eTa при същата доза беше комбиниран с AS900011 при дозата от 100 mg/kg подкожно, беше наблюдавано статистически значимо намаляване на клиничните признаци.

Тези данни навеждат на мисълта, че комбинираното лечение с остеопонтин и IFN6eTa е ефективно при намаляване на двете клиничното и патологично въздействия при мишия ЕАЕ модел и следователно може да бъде ефикасно лечение на множествена склероза.

127

ПРИМЕР 12: Предпазно въздействие на остеопонтин върху невропатия, предизвикана от разрушаване на седалищния нерв при мишки

Съкращения

СМАР : потенциал на сложно мускулно действие

EMG : електромиография

IGF-1 : подобен на инсулин растежен фактор

SC : подкожен

s.e.m. : стандартна грешка на средната стойност vs : срещу

Въведение

Невропатиите са обикновено селективни както към вида на засегнатите неврони на периферната нервна система (напр.сензорни срещу автономни), така и към подвида на невроните (малки срещу големи). Аксотомията на приферни нерви е най-често използвания животински модел за оценяване на неврозащитните въздействия на невротрофните фактори. Травматично нараняване на нервите, увреждане на сплитове и увреждане на корени са сериозни усложнения при нещастни случаи. В допълнение, налягането върху периферен нерв, което може да причини миелиново повреждане, е често наблюдавано при разстройства, такива като миньорски синдром на китката или е свързано с ортопедични усложнения на гръбначния стълб. Аксотомията произвежда явление, като клетъчна смърт, намалена аксонална скорост на проводимост и изменени невропредавателни нива в повредени неврони. Увреждания от разрушаване дават възможност за регенерация,

128 допълнителен процес, който представлява интерес във връзка с невропатични състояния (McMahon S. и Priestley J.V., 1995).

Фундаментален въпрос в клетъчната невробиология е регулирането на регенерацията на нервите след нараняване или заболяване. Функционалната нервна регенерация изисква не само аксонални изниквания и удължаване, но също нова миелинова синтеза. Ремиелинация е необходима за възстановяване на нормална нервна

проводимост и за предпазване на аксоните от нови невродегенеративни имунологични атаки. Основната цел на научните изследвания на невродегенеративните разстройства е да се разработят интервенции, които предотвратяват невронната смърт, поддържат невронния фенотип и поправят невронните и миелинови повреждания. Много изследвания бяха посветени на разгадаване на молекулните и клетъчни механизми,

отговорни за пълното възстановяване на аксотомизирани двигателни неврони на гръбначния мозък (Fawcett и сътр., 1990; Funakoshi и сътр., 1993). Предизвикана от нараняване експресия на невротрофични фактори и съответни рецептори може да играе важна роля в способността на нервната регенерация. Предишни изследвания показаха значително подобряване на нервното възстановяване с различни пептидни и непептидни съединения като подобен на инсулин растежен фактор (IGF-1), АСТН (Lewis и сътр., 1993; Strand и сътр., 1980), тестостерон (Jones, 1993), SR57746A (Fournier и сътр., 1993) и 4метилкатехол (Kaechi К и сътр., 1993; 1995; Hanaoka Y и сътр., 1992).

Настоящото изследване беше извършено с цел да се оцени нервната регенерация при мишки, третирани с различни дози остеопонтин. В този модел положетелното въздействие на OPN върху невронно и аксонно (сензорни и двигателни неврони) преживяване и ргенерация, върху миелинацията или макрофагното възпаление би могло да доведе до възстановяване на двигателната функция.

129

Регенерацията може да бъде измерена съгласно възстановяването на сензородвигателните функции и морфологичните изследвания. За това в настоящата работа бяха извършени паралелно електрофизиологични записи и хистоморфометричен анализ.

Материали и методи

Животни

Бяха използвани осемдесет и четири 8-седмични женски мишки C57bl/6 RJ (Elevage Janvier, Le Genest-St-Isle, Франция). Те бяха разделени в 7 групи (п = 12) : (а) ексципиентна, престорено оперирана група; (Ь) ексципиентна оперирана група с разрушен нерв; (с) разрушен нерв/остеопонтин (1 pg/kg); (d) разрушен нерв/остеопонтин (10 pg/kg); (е) разрушен нерв/остеопонтин (100 pg/kg); (f) разрушен нерв/4метилкатехол (10 pg/kg); (g) разрушен нерв/денатуриран остеопонтин (100 pg/kg).

Те се помещаваха по групи (5 животни за клетка) и бяха държани в инкубатор с контролирана температура (21-22° С и обратим цикъл светло-тъмно (12 h/12 h) с храна и вода “по желание” (ad libitum). Всички експерименти бяха проведени съгласно установените ръководства.

Увреждане на седалищния нерв

Животните бяха анестезирани с интраперитонеална инжекция от 60 mg/kg кетамин хлорхидрат (Imalgene 500 , Rhone Merieux, Лион, Франция). Десният седалищен нерв беше хирургично показан на ниво на среда на бедрото и разрушен на 5 mm проксимално към тройното раздклонеяване на седалищния нерв. Нервът беше разрушен двукратно в продължение на 30 s с кръвоспиращи щипци (ширина 1.5 mm; Koenig; Страсбург; Франция) с 90 градуса завъртане между всяко разрушаване.

130

Планиране на експериментите и фармакологичното третиране

Електромиографични (EMG) изпитания бяха извършени веднъж преди хирургическия ден (базова линия) и всяка седмица в продължение на 3 седмици, след операцията.

Денят на хирургическо разрушаване на нерва беше считан като ден (D) 0. Не беше извършвано изпитване по време на 4-те дни след разрушаването.

Телесното тегло и скоростта на преживяване бяха записвани всеки

ден.

От деня на нараняване на нерва до края на изследването ежедневно бяха прилагани остеопонтин и денатуриран остеопонтин чрез подкожни инжекции, докато ежедневната инжекция на 4метилкатехол беше извършвана интрахеритонеално.

На 4-та седмица 4 животни за група бяха умъртвени и седалищния нерв беше дисектиран за да се извърши морфологичен анализ.

Електрофизиологично записване

Бяха направени електрофизиологични записи, използвайки електромиограф (EMG) Neuromatic 2000М (Dantec, Les Ulis, Франция). Мишките бяха упоени чрез интерперитонеална инжекция на 100mg/kg кетамин хлорхидрат (Imalgene 500®, Rhone Merieux, Лион, Франция). Нормалната телесна температура беше поддържана 30° С с нагряваща лампа и контролирана чрез контактен термометър (Quick, Bioblock Scientific, Ilkirch, Франция), поставен на опашката.

Потенциал на сложно мускулно действие (СМАР) беше измерван в gastrocnemius мускул след единично стимулиране на седалищния нерв

0.2 ms при най-голям максимален интензитет (12.8 mA). Бяха измервани амплитудата (mV), латентността (ms) и продължителността (времето,

131 необходимо за периода на деполяризация и реполяризация) на потенциала на действие. Амплитудата е показателна за броя на активните двигателни единици, докато дисталната латентност индиректно отразява проводимостта на двигателния нерв и скоростите на невромускулно предаване.

Морфометричен анализ

Морфометричният анализ беше извършен 3 седмици след разрушаването на нерва. За анализа бяха използвани четири случайно избрани животни от групите. Те бяха анестезирани с интраперитонеална инжекция от 100 mg/kg Imalgene 500®. За хистология беше изрязан 5 mm сегмент от седалищния нерв. Тъканта беше фиксирана в продължение на една нощ с 4 % воден разтвор на глутаралдехид (Sigma, L’Isle d’Abeau-Chesnes, Франция) в разтвор на фосфатен буфер (pH = 7.4) и държан в 30 % захароза при + 4° С до използването й. Нервът беше фиксиран в 2 % осмиев тетроксид (Sigma, L’Isle d’Abeau-Chesnes, Франция) във фосфатен буфер в продължение на 2 h и дехидратиран в серия алкохолни разтвори и капсулован в Epon. След това капсулираните тъкани бяха поставени при + 70° С в продължение на 3 дни за полимеризация. Бяха направени напречни разрези с микротом с дебелина 1.5 pm и оцветени с 1 % толуидиново синьо (Sigma, L’Isle d’Abeau-Chesnes, Франция) в продължение на 2 min и дехидратирани и монтирани в Eukitt. Бяха наблюдавани двадесет срязвания за проба, използвайки оптичен микроскоп (Nikon, Токио, Япония) и беше извършен морфометричен анализ на 6 случайно подбрани срезове за проба от нерва с полуавтоматична програма за цифров анализ на изображение (Biocom, Франция). Бяха изследвани две полета на срез. Бяха изчислени следните параметри: процента на дегенерирани влакна (за поле) и общ брой на влакната.

132

Анализ на данните

Беше извършен глобален анализ на данните, използвайки един фактор или анализ на повторно измерване на отклонение от дадения тип (anova) и еднопосочна anova, и непараметрични изпитания (mann свидетелски тест). Допълнително, когато е подходящо, беше използван тест Dunnett. Нивото на значимост беше установено при р < 0.05. Резултатите бяха изразени като средна стойност ± стандартната грешка на средната стойност (s.e.m.).

Резултати

Всички животни преживяха след процедурите по разрушаване на нерва. Една мишка (разрушаване на нерва/ексципиент №2) умря на 7-ия ден и 2 (ексципиент, престорено оперирани № 3 и № 6) на 14-ия ден като последствие от анестезията по време на EMG оценяването.

Теглона животните

Както е илюстрирано на Фиг.17, беше забелязано значително

вътрешно групиране в развитието на телесното тегло по време на изследването [F(6, 132) = 1.93 и р < 0.001; повторни измервания ANOVA],

Всички различни групи показаха увеличение на телесното тегло по време на изследването.

133

Електрофизиологични измервания

Амплитуда на потенциала на сложно мускулно действие (Фиг. 18)

Имаше значителна вътрешно-групова разлика в амплитудата на СМАР по време на изследването [F(6, 18) = 49.185 и р < 0.001; повторно измерване ANOVA] (Фиг. 19).

След нараняването на нерва, всички животни, подложени на

разрушаване на нерва, показаха значително намаляване на амплитудата на СМАР в сравнение с престорено оперираната група (р < 0.001; тест на Dunnett).

Освен това, на 7-ия О(ден) и 14-ия О(ден) СМАР амплитудата на мишки, третирани с остеопонтин при 100 pg/kg или 4-метилкатехол при 10 pg/kg бяха значително по-високи от разрушаване на нерва/ексципиент едно (р < 0.05; тест на Dunnett).

Не беше забелязана значителна разлика между групата разрушен нерв/ексципиент и разрушен нерв/О-остеопонтин 100 pg/kg.

Латентност на потенциала на съединението за сложно мускулно действие(Фиг. 19):

Както е илюстрирано на Фиг. 20, беше намерена значителна вътрешногрупова разлика в латентността на СМАР [F(6, 18) = 2.521 и р < 0.001; повторни измервания ANOVA]. На 21-ия О(ден) групите с разрушен нерв представиха увеличена латентност на СМАР в сравнение с привидно оперираната група (р < 0.001; тест на Dunnett). Освен това, лечение с остеопонтин при 10 и при 100 pg/kg показа значително въздействие, наистина латентността на тези групи беше значително помалка отколкото група с разрушен нерв/ексципиент едно (р = 0.017; тест на Dunnett).

134

Нямаше значителна разлика между групите разрушен нерв/ексципиент и разрушен нерв/О-остеопонтин 100 pg/kg.

Продължителност на потенциала на съединението за сложно мускулно действие (Фиг. 20):

Имаше значително вътрешногрупова разлика в продължителността на СМАР по време на изследването [F(6, 18) = 25.15 и р < 0.001; повторни измервания ANOVA].

От 7-ия О(ден) беше наблюдавано значително увеличение на продължителността на СМАР в групите с разрушен нерв (привидно оперираната група срещу групите с разрушаване на нерва: р < 0.001; тест на Dunnett). Освен това на 7-ия О(ден) разрушаване на нерва/остеопонтин 100 pg/kg показа продължителност, значително помалка отколкото тази на групата разрушен нерв/ексципиент (р < 0.001; тест на Dunnett).

На 14-ия и 21-ия О(ден) три групи представиха значително

намаление на продължителността в сравнение с групата разрушен нерв/ексципиент: (а) разрушен нерв/остеопонтин 10 pg/kg ; (b) разрушен нерв/остеопонтин 100 pg/kg ; разрушен нерв/4-метилкатехол 10 pg/kg.

Освен това не беше наблюдавана значителна разлика между групите разрушен нерв/ексципиент и разрушен нерв/О-остеопонтин 100 gg/kgМорфометричен анализ

Процент на дегенерирани влакна

Статистически анализ разкри значителна вътрешногрупова разлика в процента на дегенерирани влакна за поле (р < 0.001;

еднопътна ANOVA) (Фиг. 22). Всички групи с разрушен нерв показаха значително увеличен процент на дегенерирани влакна (р < 0.001; тест на

135

Dunnett). Освен това разрушен нерв/лекувани мишки представляваха

значително по-малък процент от този на групата разрушен нерв/ексципиент (р < 0.001; тест на Dunnett). Освен това групата, лекувана с D-остеопонтин (100 pg/kg) показа по-висок процент на дегенерирани влакна, отколкото лекуваните с остеопонтин групи (р < 0.001; тест на Dunnett).

Общ брой на влакната (Фиг. 22).

Разрезите бяха наблюдавани, използвайки оптичен микроскоп и беше извършен морфологичен анализ с помощта на програмата Visiolab 2000 (Biocom, Париж, Франция). Бяха анализирани пет разреза за животно, бяха анализирани 2 полета за разрез. Чрез компютъра бяха регистрирани само функционално миелинираните влакна (значението на всички дегенерирани влакна с дегенерация на миелиновата обвивка не са регистрирани).

Изводи

Моделът на разрушаване на нерва е много драматичен модел на периферна невропатия. Веднага след разрушаването на нерва повечето от влакната с голям диаметър са загубени, което се дължи на механичното увреждане, водещо до силно намаляване на СМАР амплитудата. СМАР латентността не е засегната веднага, но показва увеличение при 21 дни, дължащо се на допълнителна дегенерация на влакна с малък диаметър от вторична дегенерация, дегенерация, осъществявана с имунно посредничество (макрофаги, гранулоцити). Продължителността на СМАР е увеличена на 7-ия ден, достига върхове на 14-ия ден и на 21-ия ден се връща до нива, които са сравними с точката от 7-ия ден. Това се дължи на факта, че на 21-ия ден разрушаващите разрези дават възможност за регенерация, един допълнителен процес от интерес във връзка със състоянията на

136 невропатия. Това аксонално появяване на издънки/регенерация беше също доказано в контролни групи при триседмичния период от време.

Остеопонтин показа защитаващо въздействие в модела на разрушаване на нерва при мишки. Сензорно-двигателните функции бяха възстановени значително на 7, 14 и 21 дни след увреждането по зависещ от дозата начин и морфологичните изследвания, извършени на 21-ия ден

след разрушаването, показват значително намаляване на процента дегенерирани влакна и увеличение на общия брой влакна. OPN е толкова ефективен, колкото използваната в това изследване контролна молекула, 4-метилкатехол и топлинно дезактивиран, дегенериран OPN белтък не покзват каквото и да е значително въздействие върху функционалните или хистологични параметри. Това положително въздействие върху функционалното и хистологично възстановяване може би се дължи на въздействията на OPN:

директно защитаване на влакната от вторична, осъществявана чрез имунно посредничество дегенерация; ускорена ремиелинация и защитаване на аксоните;

ускорена регенерация/появяване на издънки на повредени аксони;

увеличено почистване на миелинови остатъци чрез макрофаги.

137

ЛИТЕРАТУРА

2. Abramsky, О. и Ovadia, Η. (1997) Frontiers in Multiple Sclerosis, clinical research and therapy. Martin Dunitz publisher, london

3. Altschul S F и сътр., J Mol Biol, 215, 403-410, 1990, Altschul S F и сътр., Nucleic Acids Res., 25: 389-3402, 1997

4. Barres, B.A. и Raff, M.C. Axonal Control of oligodendrocyte development. JouPHKl of Cell Biology 147(6): 1123-8, 1999.

5. Barres, B.A., Schmid, R., Sendnter, M. и Raff, M.C. Multiple extracellular signals are required for long-term oligodendrocyte survival. Development 118(1): 283-95, 1993.

6. Bjartmar, C, Yin, X. и Trapp, B.D. Axonal pathology in myelin disorders. Journal ofNeurocytology 28: 383-395, 1999.

7. Breighton, В. и Hayden, MR: S. Aff. Med. J. 1981, Feb. 21; 59(8): 250.

8. Dal Canto, M.C, Melvold, R.W, Kim, B.S. и Miller, S.D.. Two models of multiple sclerosis: experimental allergic encephalomyelitis (EAE) and Theiler’s murine encephalomyelitis virus (TMEV) infection. A pathological and immunological comparison. Microsc. Res. Tech. 32(3): 215-29, 1995.

9. Derink R. и сътр. Nature 285, 542-547, 1980

10. Devereux J и сътр. Nucleic Acids Res, 12, 387-395, 1984.

l.Dubois-Dalcq, M, Feigenbaum, V. и Aubourg, P. The neuroiology of X-linked adrenoleukodystrophy, a demyelinating peroxisomal disorder. Trends in Neurosciences 22(1): 4-12, 1999.

12.Dubois-Dalcq, M. и Murray, K. Why are growth factors important in oligodendrocyte physiology? Pathol Biol (Paris) 48(1): 80-6, 2000.

138

13. Fernandez, P.A., Tang, D.G., Cheng, L., Prochintz, A., Murge, A.W. и Raff, M.C. Evidence that axon-derived neuregulin ptomotes oligodendrocyte survival in the developing rat optic nerve. Neuron 28(1): 81-90, 2000.

14. Franklin, R.J. и Hinks, G.L. Understanding CNS remyelination: clues from developmental and regeneration biology. Journal of Neurosciende Research 58(2): 207-13, 1999.

15. Grantham, Science, Vol. 185, стр. 862-864 (1974).

16. Grinspan, J.B., Reeves, M.F., Coulaloglou, M.J., Nathonson, D. и Pleasure, D. Re-entry into the cell cycle is required for bFGFinduced oligodendroglial dedifferrentiation and survival. Journal of Neuroscience Research 46(4): 456-64, 1996.

17. Grinspan, J.B., Stem, J.L., Franceschini, В. и Pleasure, D. Trophic effects of basic fibroblast growth factor (bFGF) on differentiated oligodendroglia: a mechanism for regeneration of the oligodendroglial leneage. Journal of Neuroscience Research 36(6): 672-80, 1993.

18. Hajihosseini, M., Tham, T.N. и Dubois-Dalcq, M. Origin of oligodendrocytes within the human spinal cord. Journal of Neuroscience 16(24): 7981-94, 1996.

19. Hartung, H.P., van der Meche, F.G/, Pollard, J. D. (1998) GullainBarre syndrome, CIDP and other chronic immune-mediated neuropathies. Curr. Opin. Neurol., 11, 497-513

20. Hiremath, M.M., Saito, Y., Knapp, G.Q., Ting, J.P., Suzuki, K. и Matsushima, G.K. Microglial/macrophage accumulation during Cuprizone-induced demyelination in C57BL/6 mice. Journal of Neuroimmunology 92(1-2): 38-49, 1998.

21.Ichikawa H., Itota T., Nishitani Y, Torii Y, Inoue K, Sugimoto T.

Brain Res 2000 Apr 28; 863(1-2): 276-81.

139

22. Jung, M., Kramer, E., Grzenkowski, M., Tang, K., Blakemore, W.F., Aguzzi, A., Khazaie, K., Chlichlia, K., von Blankenfeld, G., Kettenmann, H. и Trotter, J. Linnes of murine oligodendroglial precursor cells immortalized by an activated neu tyrosine kinase show distict degrees of interaction with axons in vitro and in vivo. European Journal of Neuroscience 7(6): 1245-65, 1995.

23. Kiefer и сътр. The cDNA and derived amino acid sequence for human osteopontin. Nucleic Acids Res. 1989 Apr 25; 17(8):3306.

24. Kon S, Maeda M, Segawa T, Hagiwara Y, Horicoshi Y, Chicuma S, Tanaka K, Rashid MM, Inobe M, Chambers AF, Uede T. (2000) Antibodies to different peptides in osteopontin reveal complexities in the various secreted forms. Journal of Cellular Biochemistry 77(3): 487-98.

25. Kon S, Yokosaki Y, Maeda M, Segawa T, Horicoshi Y, Tsukagoshi H, Rashid MM, Motimoto J, Inobe M, Shijubo N, Chambers AF, Uede T. (2002) Mapping of functional epitopes of osteopontin by monoclonal antibodies raised against defined internal sequences. Journal of Cellular Biochemistry 84(2): 420-32.

26. Kunicki, T.J., Annis, D.S. и Felding-Tabermann, B. Molecular determinants of arg-gly-asp ligand specifity for β3 integrins. Journal of Biological Chemistry 272(7): 4103-7,1997.

27. Lee и сътр. Transient upregulation of osteopontin mPHK in hippocampus and striatum following global forebrain ischemia in rats. Neurosci Lett. 1999 Aug 20; 271(2):81-4.

28. Lipton, S.A. и Rosenberg, P.A. (1994). Excitatory amino acids as a final common pathway for neurologic disorders. N Engl J Med, 330,613-22.

29. Louis J.C, Magal E., Muir D., Manthorpe M., Varon S. (1992) CG4 A new bipontial glial cell line from rat brain, is capable of

140

differentiating in vitro into either mature oligodendrocytes or type-2 astrocytes. J Neuroscience Research 31,193-204.

3O.Lubetzki, C., Demerens, C., Anglade, P., Villaroya, H., Frankfurter, A., Lee, M.Y. и Zalc, B. Even in culture, oligodendrocytes myelinate solely axons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 90; 6820-6824, 1993.

.Marchionni, M.A., Cannella, B., Hoban, C., Gao, Y.L., GarciaArenas, R., Lawson, D., Happel, E., Noel, F., Tofilon, P., Gwinne, D. и Raine, C.S. Neurogulin in neuron/glial interactions in the central nervous system. GGF2 diminishes autoimmune demyelination, promotes oligodendrocyte progenitor expansion, and enhances remyelination. Advances in Experimental and Medical Biology 468: 283-95, 1999.

32. Mark и сътр. (Mark D.F. и сътр., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81(18)5662-5666, 1984)

33. Mattieu, J.M., Comte, V., Tosic, M. и Honegger, P. Myelin gene expression during demyelination and remyelination in aggregating brain cell cultures. Journal of Neuroimmunology 40(2-3): 231-4, 1992.

34. McDonalds, J.W., Althomsons, S.P., Hyrc, K.L., Choi, D.W. и Goldberg, M.P. (1998). Oligodendrocytes from forebrain are highly vulnerable to AMPA/kainate receptor-mediated excitotoxicity. Nat Med, 4, 291-7.

35. Morell, P., Barrett, C.V., Mason, J.L., Toews, A.D., Hostettler, J.D., Knapp, G.W. и Matsushima, G.K. Gene expression in brain during Cuprizone-induced demyelination and remyelmation. Molecular and Cellular Neurosciences 12(4/5): 220-227, 1998.

36. Nait-Oumesmar, B., Decker, L., Lachapelle, F., Avellana-Adalid, V., Bachelin, C. и Van Evercooren, A.B. Progenitor cells of the

141

adult mouse subventricullar zone proliferate, migrate and differentiate into oligodendrocytes after demyelination. European Journal of Neuroscience 11(12): 4357-66, 1999.

37. Ng, W.P., Cartel, N., Roder, J., Roach, А. и Lozano, A. Human central nervous system myelin inhibits neurite outgrowth. Brain Research 720(1-2): 17-24, 1996.

38. Noseworthy, J.H. Progress in determing the causes and treatment of multiple sclerosis. Nature 399: A40-A47, 1999.

39.01dberg и сътр. Cloning and sequence analysis of rat bone sialoprotein (osteopontin) cDNA reveals an Arg-Gly-Asp cellbinding sequence. Proc Natl Acad Sci USA. 1986 Dec; 83(23):8819-23.

40. Pantoni, L., Garcia, J.H. и Gutierrez, J.A. (1998). Cerebral white matter is higly vulnerable to ischemia. Stroke, 27, 1641-6.

41. Pearson W R, Methods in Enzimology, 183, 63-99, 1990.

42. Pearson W R и Lipman D J, Proc Nat Acad Sci U S A, 85, 24442448,1988.

43. Petry, K.G., Boulleme, A.I., Pousset, F., Brochet, B., Caille, J.M. и Dousset, V. Experimental allergic encephalomyelitis animal models for analyzing featurs of multiple sclerosis. Pathol. Biol. (Paris) 48(1):47-53,2000.

44. Pohlau, D., Aktas, 0., Eppllen, C. Hartung, H.P., Hoffmann, V. и Przuntek, H. (1998) Promoting remyelination as a future therapeutic principle in Multiple Sclerosis. Nervenarzt, 69, 841-850.

45. Pineas, J.W., Barnard, R.O., Kwon, E.E., Sharer, L.R. и Cho, E.S. Multiple Sclerosis: remyelination of nascent lesions. Anais of Neurology 33(2): 137-51, 1993.

46. Rodriguez-Pena, A. Oligodendrocyte development and thyroid hormone. Journal of Neurobiology 40(4): 497-512, 1999.

142

47.Rogister, B., Ben-Hur, T. и Dubois-Dalcq, М. From neural stem cells to myelinating oligodendrocytes. Molecular and Cellular Neurosciences 14(4-5):287-300, 1999.

48.Sahrabacher, U.C., Lechner, F., Eugster, H.P., Frei, K,, Lassmann, H. и Fontana, A. Mice with an inactivation of the inducible nitric oxide synthase gene are susceptible to experimental autoimmune encephalomyelitis. Europian Journal of Immunology 28(4): 1332-8, 1998.

49.Saitoh Y, Kuratsu J, Takeshima H, Yamamoto S, Ushio Y. (1995) Expression of osteopontin in human glioma, correlation with the mdlrgnancy. Laboratory Investigations. 72(1): 55-63.

50.Scarlato, M., Beesley, J. и Pleasure, D. Analysis of oligodendroglial differentiation using cDNA arrays. Journal of Neuroscience Research 59(3): 430-5, 2000.

51. Scherer, S.S. Molecular genetics of demyelination: new wrinkles on anoldmembrane. Neuron 18: 13-16, 1997.

52. Scolding, N. и Lassmann, H. Demyelination and remyelination. Trends in Neurosciences 19(1): 1-2, 1996.

53.Shaw, C.E., Milner, R., Compston, A.S. и ffrench-Constant, C. Analysis of integrinexpression on oligodendrocytes during axo-glial interaction by using rat-mouse xenocultures. Journal of Neuroscience 16(3): 1163-72, 1996.

54.Shin и сътр., Expression of osteopontin mRNA in the adult rat brain. Neurosci Lett. 1999 Oct 1; 273(2): 73-6.

55.Shepard H.M. и сътр., Nature, 294, 563-565, 1981

56.Sodek J, Ganss B, McKee MD, Crit Rev Oral Biol Med 2000; 11(3):279-303.

57.Smith, P.K., Krohn, R.I., Hermanson, G.T., Mallia, A.K., Gartner, F.H.,Provenzano, MD., Fujimoto, E.K., Goeke, N.M., Olson, B.J. и

143

Klenk, D.C. (1985). Measurment of protein, using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150, 76-85.

58.Smith and Waterman J Mol Biol, 147q 195-197, 1981, Advances in Applied Mathematics, 2, 482-489, 1981.

59.Storch, M.K., Piddlesden, S., Haltia, M., Iivanainen, M., Morgan, P. и Lassmann, H. Multiple sclerosis: in situ evidence for antibodyand comp;ement-mediated demyelination. Annals of Neurology 43(4): 465-71, 1998.

60. Trojaborg W (1998) Acute and chronic neuropathies: new aspects of Guillain-Barre syndrome and chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy, an overview and an update. Electroencephalogr Clin Neurophysiol., 107, 303-316.

61. Trotter, J., Bitter-Suermann, D. и Schachner, M. Differentiationregulated loss of the polysialylated embryonic form and expression of the different polypeptides of the neural cell adhesion molecule by cultured oligodendroytes and muelin. Journal of Neuroscience Research 22(4): 369-83,1989.

62. Wiechelman, K., Braun, R. и Fitzpatrick, J. (1988). Investigation of the bicinchoninic acid protein assay: Identification of the groups responsible for color formation. Anal. Biochem. 175, 231-237. Преброени са изродените влакна и нормалните влакна?ТЬе degenerated fibers and the normal fibers were counted? .

63. Whitney, L.W., Becker, K.G., Tresser, N.J., Caballero-Ramos, C.I., Munson, P.J., Prabhu, V.V., Trent, J.M., McFarland, H.F. и Biddison, W.E. Analysis of gene expression in multiple sclerosis lesions using cDNA microarrays. Annals of Neurology 46(3): 4258, 1999.

Claims (22)

1. Използване на остеопонтин или агонист на активност на остеопонтин за производзството на лекарство за лечение и/или профилактика на неврологично заболяване.

2. Използване, съгласно претенция 1, характеризиращо се с това, че неврологичното заболяване е избрано от групата, състояща се от травматично нервно увреждане, удар, демиелиниращи заболявания на централната нервна система или периферната нервна система, невропатии и невродегенеративни заболявания.

3. Използване, съгласно претенции 1 и 2, характеризиращо се с това, че неврологичното заболяване е причинено от вродено метаболитно разстройство.

4. Използване, съгласно която и Да е от предходните претенции, характеризиращо се с това, че неврологичното заболяване е периферна невропатия.

5. Използване, съгласно претенция 4, характеризиращо се с това, че неврологичното заболяване е диабетна невропатия.

6. Използване, съгласно претенция 2, характеризиращо се с това, че демиелиниращото заболяване е множествена склероза (MS).

7. Използване, съгласно претенция 2, характеризиращо се с това, че невродегенеративното заболяване е избрано от болест на Алцхаймер, болест на Паркинсон, болест на Хънтингтън и миатрофична латерална (ALS).

8. Използване, съгласно която и да е от претенции 1 до 7, характеризиращо се с това, че остеопонтинът е избран от групата, състояща се от:

(а) Полипептид, включващ SEQ ID NO: 1;

145 (b) Полипептид, включващ аминокиселини 1 до 168 или 170 на SEQIDNO:1;

(c) Полипептид, включващ аминокиселини 1 до 16 и 170 до 314 на SEQIDNO: 1;

(d) Полипептид, включващ амино киселини 170 до 314 на SEQ ID NO: 1;

(e) Полипептид, включващ SEQ ID NO: 2;

(f) Полипептид, включващ SEQ ID NO: 3;

(g) MyTenH на който и да е полипептид от (а) до (f), характеризиращ се с това, че аминокиселинната последователност има поне 40 %, или 50 %, или 60 %, или 70 %, или 80 %, или 90 % идентичност към поне една от последователностите в (а) до (f);

(Ь)Мутеин на който и да е полипептид от (а) до (f), който е кодиран чрез ДНК последователност, която се хибридизира към комплемента на природната ДНК последователност, кодираща който и да е от полипептиди от (а) до (f) при умерено строги условия или при силно строги условия;

(i) Мутеин на който и да е полипептид от (а) до (f), характеризиращ се с това, че всякакви промени в аминокиселинната последователност са консервативни аминокиселинни замествания към аминокиселинните последователности в (а) до (f);

(j) сол или каквато и да е изоформа, фузантен белтък, функционално производно, активна фракция или кръгообразно променено производно на който и да е полипептид от (а) до (f).

9. Използване, съгласно която и да е от претенции от 1 до 8, характеризиращо се с това, че остеопонтин е фузиран към молекула на

146 носител, пептид или белтък, който увеличава преминаването на кръвната мозъчна бариера.

10. Използване, съгласно която и да е от претенции от 8 или 9, характеризиращо се с това, че остеопонтинът е свързан с полиетилен гликол.

11. Използване, съгласно която и да е от претенции от 8 до 10, характеризиращо се с това, че фузантният белтък включва фузия с имуноглобулин (lg).

12. Използване, съгласно която и да е от предходните претенции, характеризиращо се с това, че лекарството допълнително включва интерферон за едноврменно, последователно или отделно използване.

13. Използване, съгласно претенция 12, характеризиращо се с това, че интерферонът е интерферон-β.

14. Използване, съгласно която и да е от предходните претенции, характеризиращо се с това, че остеопонтинът е използван в количество от около 0.001 до 100 mg/kg телесно тегло, или около 1 до 10 mg/kg телесно тегло, или около 5 mg/kg телесно тегло.

15. Използване на молекула на нуклеинова киселина за производство на лекарство за лечение и/или профилактика на неврологично заболяване, характеризиращо се с това, че молекулата на нуклеиновата киселина включва последователност на нуклеинова киселина, кодираща полипептид, включващ аминокиселинна последователност, избрана от групата, състояща се от:

(k) Полипептид, включващ SEQ ID NO: 1;

(l) Полипептид, включващ аминокиселини 1 до 168 или 17 HaSEQIDNO:l;

(m) Полипептид, включващ аминокиселини 1 до 16и 170 до 314 на SEQ ID NO: 1;

147 (η) Полипептид, включващ аминокиселини 170 до 314 на SEQIDNO: 1;

(o) Полипептид, включващ SEQ ID NO: 2;

(p) Полипептид, включващ SEQ ID NO: 3;

(q) Мутеин на който и да е полипептид от (а) до (f), характеризиращ се с това, че аминокиселинната последователност има поне 40 %, или 50 %, или 60 %, или 70 %, или 80 %, или 90 % идентичност към поне една от последователностите в (а) до (f);

(г ) Мутеин на който и да е полипептид от (а) до (f), който е кодиран чрез ДНК последователност, която се хибридизира към комплемента на природната ДНК последователност, кодираща, който и да е полипептид от (а) до (f) при умерено строги условия или при силно строги условия;

(s) Мутеин, на който и да е полипептид от (а) до (f), характеризиращ се с това, че всякакви промени в аминокиселинната последователност са консервативни аминокиселинни замествания към аминокиселинните последователности в полипептиди от (а) до (f);

(t) изоформа, фузантен белтък, функционално производно, активна фракция или кръгообразно променено производно, на който и да е полипептид от (а) до (f).

16. Използване, съгласно претенция 15, характеризиращо се с това, че молекулата на нуклеиновата киселина допълнително включва последователност на експресионен вектор.

17. Използване на вектор за индукция и/или усилване на ендогенната продукция на остеопонтин, или агонист на активност на остеопонтин в клетка, при производството на лекарство за лечение и/или профилактика на неврологично заболяване.

148

18. Използване, съгласно която и да е от претенции 15 до 17 за генна терапия.

19. Използване на клетка, която е била генетично променена да продуцира остеопонтин, или агонист на активност на остеопонтин, при производството на лекарство за лечение и/или профилактика на неврологично заболяване.

20. Фармацевтичен състав, включващ остеопонтин, или агонист на активност на остеопонтин и интерферон, по избор заедно с един или повече фармацевтично приемливи ексципиенти, за лечение и/или профилактика на неврологично заболяване.

21. Метод за лечение на неврологично заболяване, включващ прилагане на пациент, нуждаещ се от такова лечение на ефективно количество остеопонтин, или агонист на активност на остеопонтин, по избор заедно с фармацевтично приемлив носител.

22. Метод за лечение на неврологично заболяване, включващ прилагане на пациент, нуждаещ се от такова лечение на ефективно количество остеопонтин, или агонист на активност на остеопонтин и интерферон, по избор заедно с фармацевтично приемлив носител.