PL211763B1 - Zastosowanie osteopontyny, cząsteczki kwasu nukleinowego, komórki zmodyfikowanej genetycznie oraz kompozycja farmaceutyczna - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie osteopontyny, cząsteczki kwasu nukleinowego, komórki zmodyfikowanej genetycznie oraz kompozycja farmaceutyczna. Wynalazek ogólnie odnosi się do chorób i zaburzeń neurologicznych. Dotyczy on neuroprotekcji, mielinizacji nerwów i tworzenia lub odtwarzania komórek wytwarzających mielinę. W szczególności dotyczy chorób demielinizacyjnych i przebiegających z degeneracją nerwów, neuropatii, urazowego uszkodzenia nerwów, udaru i chorób neurologicznych spowodowanych wrodzonymi zaburzeniami metabolicznymi. Bardziej szczegółowo, wynalazek niniejszy dotyczy zastosowania osteopontyny do wytwarzania leków do leczenia i/lub zapobiegania chorobom neurologicznym.

Mielinizacja włókien nerwowych jest podstawowym procesem tworzenia i funkcjonowania przedziałów ośrodkowego układu nerwowego (CNS) i obwodowego układu nerwowego (PNS). Osłonka mielinowa wokół aksonów jest niezbędna do prawidłowego przewodzenia impulsów elektrycznych wzdłuż nerwów. Utrata mieliny występuje w wielu chorobach, między innymi w stwardnieniu rozsianym (SM) zajmującym CNS, zespole Guillain-Barre CIDP i innych (zobacz Abramsky i Ovadia, 1997; Trojaborg, 1998, Hartung i in., 1998). Chociaż mają różne etiologie, takie jak zakażenia patogenami lub ataki autoimmunizacyjne, wszystkie choroby demielinizacyjne powodują utratę funkcji neurologicznych i mogą prowadzić do porażeń i śmierci. Chociaż obecne czynniki lecznicze zmniejszają ataki zapalne w SM i opóźniają postęp choroby, istnieje potrzeba rozwinięcia sposobów leczenia, które prowadziłyby do remielinizacji i powrotu funkcji neurologicznych (Abramsky i Ovadia, 1997, Pohlau i in., 1998).

Uszkodzenia CNS wywołane przez ostre incydenty neurologiczne obejmujące urazy, niedotlenienie i niedokrwienie mogą wpływać zarówno na komórki nerwowe jak i na istotę białą. Chociaż najwięcej uwagi poświęcono procesom prowadzącym do śmierci komórek nerwowych, coraz więcej dowodów wskazuje, że uszkodzenie oligodendrocytów, które tworzą mielinę aksonów, jest swoistym elementem uszkodzenia CNS. Zatem patologię oligodendrocytów wykazano na bardzo wczesnym etapie udaru (3 godziny) u szczurów sugerując, że te komórki są jeszcze bardziej wrażliwe na zewnętrzne czynniki uszkadzające niż komórki nerwowe (Pantoni i in., 1996). Jednym z potencjalnych czynników pośredniczących w śmierci komórek jest wyraźne zwiększenie stężenia glutaminianu, które towarzyszy wielu ostrym uszkodzeniom CNS (Lipton i in., 1994). ) Istotnie obok komórek nerwowych znajdowano oligodendrocyty wyrażające czynnościowe receptory glutaminianowe należące do podtypu AMPA/kainate. Ponadto oligodendrocyty wykazują wysoką wrażliwość na podanie glutaminianu (McDonald i in., 1998).

Uraz jest uszkodzeniem lub zniszczeniem nerwu. Może to być uraz rdzenia kręgowego, który jest uszkodzeniem rdzenia kręgowego wpływającym na wszystkie funkcje kontrolowane nerwami na poziomie uszkodzenia i poniżej, włączając w to kontrolę nad mięśniami i czucie lub uraz mózgu taki jak spowodowany zamkniętym urazem czaszki.

Niedotlenienie mózgu jest niedoborem tlenu właściwym dla półkul mózgowych, a bardziej typowo to pojęcie odnosi się do niedoboru tlenu w całym mózgu. Zależnie od stopnia niedotlenienia, nasilenie objawów może zmieniać się od splątania do nieodwracalnego uszkodzenia mózgu, śpiączki i śmierci.

Udar jest zwykle spowodowany niedokrwieniem mózgu. Bywa również nazywany chorobą naczyniową mózgu lub incydentem mózgowym. Jest to grupa zaburzeń mózgu obejmująca utratę funkcji mózgowia, która pojawia się, gdy zostaje odcięte zaopatrzenie w krew jakiejkolwiek części mózgu. Mózg wymaga 20% krwi krążącej w organizmie. Podstawowe zaopatrzenie mózgu w krew odbywa się przez 2 tętnice szyi (tętnice szyjne), które w mózgu rozgałęziają się na liczne tętnice zaopatrujące właściwe okolice mózgu. Nawet krótka przerwa w przepływie krwi może spowodować pogorszenie funkcjonowania mózgu (ubytek neurologiczny). Objawy zależą od dotkniętej okolicy mózgu i zwykle obejmują takie problemy jak zaburzenia widzenia, mowy, zaburzenia ruchowe lub zaburzenia czucia w części ciała lub zaburzenia świadomości. Jeśli przepływ krwi jest zmniejszony przez dłużej niż kilka sekund, komórki mózgowe w tym obszarze ulegają zniszczeniu (zawałowi) powodującemu trwałe uszkodzenie danej okolicy mózgu lub nawet śmierć.

Udar dotyka 4 na 1000 ludzi. Jest 3 główną przyczyną zgonów w krajach rozwiniętych, włączając w to USA. Występowanie udarów zwiększa się dramatycznie z wiekiem, z ryzykiem podwajającym się co dekadę po 35 roku życia. Około 5% ludzi w wieku powyżej 65 roku życia przebyło przynajmniej jeden udar. Zaburzenie to częściej pojawia się u mężczyzn niż u kobiet.

PL 211 763 B1

Jak wspomniano powyżej, udar dotyczy utraty funkcji mózgu (ubytki neurologiczne) spowodowanej utratą krążenia krwi w pewnych okolicach mózgu. Konkretne ubytki neurologiczne mogą zależeć od umiejscowienia, rozmiaru uszkodzenia i przyczyny zaburzenia. Udar może być spowodowany ograniczeniem przepływu krwi (niedokrwienie), którego następstwem jest niewystarczające zaopatrzenie w krew i śmierć tkanek w danej okolicy (zawał). Przyczynami udarów niedokrwiennych są skrzepliny, które tworzą się w mózgu oraz skrzepliny lub fragmenty blaszki miażdżycowej lub innego materiału dostającego się do mózgu z innych okolic (zator). Krwawienie (krwotok) do mózgu może spowodować objawy naśladujące udar.

Najczęstszą przyczyną udaru jest udar wtórny do miażdżycy (zakrzepica mózgowa). Miażdżyca („sztywnienie tętnic) jest stanem, w którym tłuszcze gromadzą się w wewnętrznej warstwie tętnic i rozwija się blaszka miażdżycowa (masa zbudowana z depozytów tłuszczowych i płytek krwi). Zamknięcie tętnicy następuje powoli. Blaszka miażdżycowa niekoniecznie powoduje udar. Istnieje wiele małych połączeń między różnymi tętnicami mózgowymi. Jeśli przepływ krwi zmniejsza się stopniowo, te małe połączenia zwiększą swe rozmiary i wytworzą krążenie oboczne odciętej okolicy. Jeśli krążenie oboczne jest wystarczające, to nawet całkowite zamknięcie tętnicy może nie spowodować ubytków neurologicznych. Drugim mechanizmem bezpieczeństwa w mózgu jest to, że naczynia są na tyle duże, iż nawet 75% światła naczynia krwionośnego może być zamknięte, a przepływ krwi w danej okolicy mózgu będzie ciągle odpowiedni.

Udar zakrzepowy (udar wywołany zakrzepicą) jest najczęstszy u starszych ludzi i często towarzyszy on chorobie wieńcowej lub cukrzycy. Ten typ udaru może się pojawić w dowolnym czasie, nawet w spoczynku. Osoba może zachować lub stracić świadomość.

Udary spowodowane zatorami (przemieszczającymi się skrzepami krwi) są często udarami wtórnymi do zatorów pochodzenia sercowego, skrzepów tworzących się w następstwie zaburzeń rytmu serca, które dostają się do mózgu. Zator może pochodzić też z innych okolic zwłaszcza, jeśli jest tam blaszka miażdżycowa. Czop zatorowy jest przenoszony w strumieniu krwi i zatyka małą tętnicę w mózgu. Ten udar pojawia się nagle z natychmiastowym, maksymalnym ubytkiem neurologicznym. Nie zależy od poziomu aktywności i może pojawić się w dowolnym czasie. Zaburzenia rytmu serca współistnieją z tym zaburzeniem i są często przyczyną zatoru. Uszkodzenie mózgu jest często cięższe niż w przypadku udarów spowodowanych zakrzepicą mózgową. Świadomość może być utracona lub zachowana. Prawdopodobne rokowanie jest gorsze, jeśli naczynie krwionośne uszkodzone przez udar pęka i krwawi (udar krwotoczny).

Neuropatia obwodowa jest zespołem utraty czucia, słabości i zaniku mięśni, osłabionych głębokich odruchów ścięgnistych i objawów naczynioruchowych, występujących pojedynczo lub w połączeniach.

Choroba może dotyczyć jednego nerwu (mononeuropatia), dwóch lub kilku nerwów w określonej lokalizacji (mnoga mononeuropatia) lub wielu nerwów równocześnie (polineuropatia). Pierwotnie uszkodzony może być akson (np. w cukrzycy, chorobie z Lyme lub mocznicy lub przez czynniki toksyczne) lub osłonka mielinowa lub komórki Schwanna (np. w ostrych lub przewlekłych neuropatiach zapalnych, leukodystrofiach lub zespole Guillain-Barre). Uszkodzenie małych zmielinizowanych i niezmielinizowanych włókien pierwotnie skutkuje utratą czucia temperatury i bólu; uszkodzenie grubych zmielinizowanych włókien skutkuje zaburzeniami motorycznymi lub czucia proprioceptywnego. Niektóre neuropatie (np. spowodowane przewlekłym zatruciem, stosowaniem Dapsonu, ukąszeniem przez kleszcza lub zespołem Guillain-Barre) pierwotnie dotykają włókien motorycznych; inne (np. spowodowane rakowym zapaleniem zwojów korzeni grzbietowych rdzenia, kiłą, AIDS, cukrzycą lub przewlekłym zatruciem pirydoksyną) pierwotnie dotykają zwoji korzeni grzbietowych rdzenia i włókien czuciowych, dając objawy czuciowe. Czasami, zajęte są również nerwy czaszkowe (np. w zespole Guillain-Barre, chorobie z Lyme, cukrzycy i błonicy). Identyfikacja zaangażowanych mechanizmów pomoże określić przyczynę.

Uraz jest najczęstszą przyczyną ograniczonego uszkodzenia pojedynczego nerwu. Gwałtowna aktywność mięśniowa lub dokonany siłą przeprost stawu mogą spowodować ogniskową neuropatię, tak jak mogą spowodować powtarzające się małe urazy (mocne chwytanie małych przedmiotów, nadmierne wibracje młotów pneumatycznych). Porażenia uciskowe lub z uwięźnięcia dotykają głównie nerwów powierzchownych (łokciowego, promieniowego, strzałkowego) na wyniosłościach kości (np. podczas głębokiego snu lub podczas znieczulenia osób szczupłych lub wyniszczonych i często u alkoholików) lub nerwów położonych w wąskich kanałach (np. zespół cieśni nadgarstka). Porażenie uciskowe może być również następstwem guzów, wyrośli kostnych, opatrunków unieru4

PL 211 763 B1 chamiających, kul ortopedycznych lub zbyt długiego przebywania w pozycji przykurczonej (np. podczas pracy w ogrodzie). Krwotok do nerwu i ekspozycja na zimno lub promieniowanie może spowodować neuropatię. Mononeuropatia może być następstwem bezpośredniego nacieku nowotworowego nerwu.

Mnoga neuropatia występuje zwykle wtórnie do zaburzeń kolagenu naczyniowego (np. w guzkowym zapaleniu tętnic, toczniu rumieniowatym układowym, zespole Sjogren'a, reumatoidalnym zapaleniu stawów), sarkoidozy, chorób metabolicznych (np. cukrzycy, amyloidozy) lub chorób zakaźnych (np. choroby z Lyme, zakażenia HIV). Mikroorganizmy mogą powodować mnogą mononeuropatię przez bezpośrednie zajęcie nerwu (np. w trądzie).

Polineuropatia w ostrych chorobach gorączkowych może wynikać z działania toksyn (np. w błonicy) lub reakcji autoimmunizacyjnej (np. w zespole Guillain-Barre); polineuropatia występująca czasem po szczepieniach jest najprawdopodobniej uwarunkowana autoimmunologicznie.

Czynniki toksyczne na ogół powodują polineuropatię, czasami mononeuropatię. Obejmują one emetynę, heksobarbital, barbital, chlorobutanol, sulfonamidy, fenytoinę, nitrofurantoinę, alkaloidy barwinka, metale ciężkie, tlenek węgla, fosforan triortokrezylu, ortodinitrofenol, wiele rozpuszczalników, inne trucizny przemysłowe i pewne leki stosowane w AIDS (np. zalcitabina, didanozyna).

Niedobory pokarmowe i zaburzenia metaboliczne mogą powodować polineuropatię. Często przyczyną jest niedobór witaminy B (np. w alkoholizmie, beri-beri, niedokrwistości złośliwej, niedoborze pirydoksyny wywołanym izoniazydem, zespołach złego wchłaniania i niepowściągliwych wymiotach ciężarnych). Polineuropatia również występuje w niedoczynności tarczycy, porfirii, sarkoidozie, amyloidozie i mocznicy. Cukrzyca może powodować obwodową polineuropatię czuciowo-ruchową (najczęściej), mnogą mononeuropatię i ogniskową mononeuropatię (np. nerwów czaszkowych okoruchowego lub odwodzącego).

Zmiany złośliwe mogą powodować polineuropatię poprzez gammapatię monoklonalną (szpiczak mnogi, chłoniak), naciek amyloidowy lub niedobory pokarmowe lub jako zespół paraneoplazmatyczny.

Swoiste mononeuropatie: Pojedyncze lub mnogie mononeuropatie charakteryzują się bólem, słabością i parestezjami w obszarze zaopatrywanym przez dotknięty nerw. Mnoga mononeuropatia jest niesymetryczna: nerwy mogą być zajęte wszystkie na raz lub stopniowo. Rozległe zajęcie wielu nerwów może naśladować polineuropatię.

Porażenie nerwu łokciowego jest zwykle spowodowane jego urazem w rowku łokciowym stawu łokciowego przy powtarzającym się opieraniu na łokciu lub przez niesymetryczny wzrost kości po dziecięcym złamaniu (opóźnione porażenie nerwu łokciowego). Nerw łokciowy może być również uciśnięty w kanale łokciowym. Pojawiają się parestezje w palcu 5 i przyśrodkowej części palca 4; występuje osłabienie i atrofia przywodziciela kciuka, odwodziciela palca 5 i mięśni międzykostnych. Przewlekłe ciężkie porażenie nerwu łokciowego powoduje deformację ręki, tzw. rękę szponiastą. Próba leczenia zachowawczego powinna być podjęta przed próbą leczenia chirurgicznego.

Zespół cieśni nadgarstka jest następstwem ucisku nerwu pośrodkowego po dłoniowej stronie nadgarstka, pomiędzy więzadłem poprzecznym powierzchownym nadgarstka a podłużnymi ścięgnami mięśni przedramienia, które zginają dłoń. Może być jedno- lub dwustronny. Ucisk powoduje parestezje, po stronie promieniowo-dłoniowej ręki i ból w nadgarstku i dłoni; czasem ból pojawia się proksymalnie od miejsca ucisku w okolicy przedramienia lub barku. Ból może być bardzo silny nocą. Mogą wystąpić zaburzenia czucia po stronie dłoniowej trzech pierwszych palców; mięśnie odpowiedzialne za odwodzenie i przeciwstawianie kciuka mogą być słabe i w zaniku. Ten zespół powinien być odróżniany od ucisku korzenia rdzeniowego C-6 spowodowanego chorobami korzeni rdzeniowych na poziomie szyi.

Porażenie nerwu strzałkowego zwykle jest spowodowane przyciśnięciem nerwu do bocznej części szyjki kości piszczelowej. Najczęściej jest to spotykane u pacjentów obłożnie chorych, wyniszczonych lub u osób szczupłych mających zwyczaj krzyżowania nóg. Występuje słabość zgięcia grzbietowego i ewersja stopy. Czasami, zaburzenia czucia pojawiają się na przednio bocznej stronie kończyny dolnej i grzbietowej stronie stopy lub w przestrzeni sieciowej pomiędzy 1 i 2 kością śródstopia. Leczenie neuropatii uciskowych jest zwykle zachowawcze (np. zapobieganie krzyżowaniu nóg). Neuropatie niezupełne są zwykle obserwowane klinicznie i ustępują samoistnie. Gdy nie następuje poprawa, może być wskazane leczenie chirurgiczne.

Porażenie nerwu promieniowego (porażenie sobotniej nocy) jest spowodowane przyciśnięciem nerwu promieniowego do kości ramiennej, np. wtedy, gdy ramię spoczywa na oparciu krzesła podczas intoksykacji lub głębokiego snu. Objawy obejmują słabość nadgarstka i prostowników palców oraz,

PL 211 763 B1 czasami, utratę czucia po grzbietowej stronie nad 1 mięśniem międzykostnym. Leczenie jest podobne do stosowanego w leczeniu neuropatii uciskowej nerwu strzałkowego.

Polineuropatie są względnie symetryczne, zwykle zajmują równocześnie włókna czuciowe, motoryczne i naczynioruchowe. Mogą zajmować włókno osiowe nerwu albo osłonkę mielinową i w obu wypadkach mogą być one ostre (np. zespół Guillain-Barre) lub przewlekłe (np. w niewydolności nerek).

Polineuropatia spowodowana zaburzeniami metabolicznymi (np. cukrzycą) rozwija się powoli, często przez miesiące i lata. Często rozpoczyna się od zaburzeń czucia w kończynach dolnych tak, że dystalnie jest znacznie bardziej zaawansowana niż proksymalnie. Zwykle dominują obwodowe mrowienia, drętwienia, zaburzenia propriocepcji w stawach i czucia wibracji. Ból jest zwykle silniejszy w nocy i może być nasilany dotknięciem zajętej okolicy lub przez zmiany temperatury. W cięższych przypadkach występują objawy obiektywne w postaci utraty czucia, typowo o układzie „skarpetek i „rękawiczek. Odruch ze ścięgna Achillesa i inne głębokie odruchy ścięgniste są osłabione lub zniesione. Gdy utrata czucia jest głęboka, mogą rozwinąć się bezbólowe owrzodzenia palców lub stawy Charcot'a. Upośledzenie czucia i czucia proprioceptywnego może prowadzić do zaburzeń chodu. Zaburzenia motoryczne wywołują dystalnie słabość i zanik mięśni. Autonomiczny układ nerwowy może być zajęty dodatkowo lub wyłącznie, co spowoduje nocne biegunki, nietrzymanie moczu i stolca, impotencję lub niedociśnienie ortostatyczne. Różne są objawy naczynioruchowe. Skóra może być bledsza i bardziej sucha niż normalnie, z ciemnymi przebarwieniami; potliwość może być nadmierna. Zmiany troficzne (gładka i lśniąca skóra, spękane i pobrużdżone paznokcie, osteoporoza) często występują w ciężkich, przedłużających się przypadkach.

Polineuropatie z niedoborów pokarmowych są częste wśród alkoholików i osób źle odżywionych. Pierwotne uszkodzenie aksonu może prowadzić do wtórnej demielinizacji i zniszczenia aksonów w najdłuższych i największych nerwach. Czy przyczyną jest niedobór tiaminy lub innej witaminy (np. pirydoksyny, kwasu pantotenowego, kwasu foliowego) pozostaje niejasne. Neuropatia z niedoboru tiaminy zwykle występuje wyłącznie u ludzi przyjmujących izoniazyd z powodu TB; u dzieci pozbawianych pirydoksyny lub od niej zależnych mogą występować drgawki. Zanik i symetryczne osłabienie w dystalnych kończynach są zwykle podstępne i mogą postępować gwałtownie, czasem z towarzyszeniem utraty czucia, parestezji i bólu. Dotknięcie może nasilać bóle, skurcze, poczucie zimna, palenia i drętwienia w łydkach i stopach.

Rzadko czysta polineuropatia czuciowa zaczyna się od bólów i parestezji obwodowych i postępuje dosiebnie aż do utraty wszystkich postaci czucia. Występuje ona jako odosobniony objaw w rakach (zwłaszcza pochodzenia oskrzelowego), po przyjęciu zbyt dużej dawki pirydoksyny (>0,5 mg/dobę) oraz w amyloidozie, niedoczynności tarczycy, szpiczaku i mocznicy. Odstawienie pirydoksyny rozwiązuje problem neuropatii wywołanej pirydoksyną.

Wrodzone neuropatie są podzielone na neuropatie czuciowo-ruchowe i czuciowe. Choroba Charcot-Marie-Tooth jest najczęstszą wrodzoną neuropatią czuciowo-ruchową. Rzadsze neuropatie czuciowo-ruchowe rozpoczynają się po urodzeniu i powodują większe kalectwo. W neuropatiach czuciowych, występujących rzadko, utrata czucia bólu i temperatury w dystalnych częściach ciała dominuje nad utratą czucia wibracji i położenia. Głównym problemem są urazy stopy spowodowane utratą czucia bólu, z towarzyszącymi im często infekcjami i zapaleniem szpiku.

Wrodzona neuropatia ruchowa i czuciowa typu I i II (choroba Charcot-Marie-Tooth, zanik mięśni łydki) jest względnie częstym, zwykle dziedziczonym autosomalnie dominująco zaburzeniem charakteryzującym się słabością i zanikiem, pierwotnie w łydce i innych mięśniach dystalnych. U pacjenta mogą występować także inne choroby degeneracyjne (np. ataksja Friedreich'a) lub wywiad rodzinny w ich kierunku może być dodatni. Pacjenci z typem I prezentują, w wieku przedszkolnym, opadanie stopy i stopniowo postępujący zanik mięśni, dające objaw „bocianich nóg. Uszkodzenie mięśni wewnętrznych dłoni rozpoczyna się później. Zmniejsza się czucie wibracji, bólu i temperatury dając obraz zaburzenia typu rękawiczki i skarpetki. Zanikają głębokie odruchy ścięgniste. U członków rodziny mniej dotkniętych przez chorobę jedynymi objawami mogą być wysokie podbicie i młotowate palce stóp. Szybkość przewodzenia w nerwach jest niska, a późne potencjały wydłużone. Pojawia się segmentalna demielinizacja i remielinizacja. Powiększone nerwy obwodowe mogą być wyczuwalne palpacyjnie. Choroba postępuje powoli i nie wpływa na długość życia. Typ II choroby rozwija się jeszcze wolniej, ze słabością rozwijającą się w późnym okresie życia. Pacjenci mają względnie prawidłową szybkość przewodzenia w nerwach, ale amplituda potencjałów wywołanych jest niska. W biopsjach odnajduje się zmiany wsteczne typu wallerian.

PL 211 763 B1

Wrodzona neuropatia motoryczna i czuciowa typu III (neuropatia przerostowa śródmiąższowa, choroba Dejerine-Soltas), rzadkie autosomalne recesywne zaburzenie, zaczynające się w dzieciństwie postępującą słabością i utratą czucia i zanikiem głębokich odruchów ścięgnistych. Początkowo, jest ona podobna do choroby Charcot-Marie-Tooth, ale osłabienie motoryczne postępuje szybciej. Występuje demielinizacja i remielinizacja, powodujące pogrubienie nerwów obwodowych i cebulkowate bulwy obserwowane w biopsjach nerwów.

Charakterystyczny rozkład osłabienia motorycznego, deformacje stóp, rodzinne występowanie i zaburzenia elektrofizjologiczne potwierdzają rozpoznanie. Możliwa jest diagnostyka genetyczna, ale nie ma swoistego leczenia. Użyteczne może być poradnictwo zawodowe przygotowujące młodych pacjentów na postęp choroby. Mogą być przydatne pomoce usztywniające do korekcji stopy opadającej; zabiegi ortopedyczne stabilizujące stopę.

Choroby degeneracyjne układu nerwowego obejmują między innymi chorobę Alzheimer'a, Parkinson'a, Huntingtona oraz stwardnienie zanikowe boczne (ALS).

Choroba Alzheimer'a jest zaburzeniem obejmującym pogorszenie funkcji myślowych wynikającym ze zmian w tkance nerwowej mózgowia. Obejmują one obkurczenie tkanki nerwowej mózgowia, nie spowodowane zmianami naczyniowymi, pierwotne otępienie degeneracyjne i rozlany zanik mózgu. Choroba Alzheimer'a bywa nazywana otępieniem starczym typu Alzheimer'a (SDAT). Jest najczęstszą przyczyną osłabienia intelektu z wiekiem. Częstość występowania wynosi około 9 na 10000 ludzi. Choroba ta dotyka nieco częściej kobiety niż mężczyzn i głównie występuje u osobników starszych.

Przyczyna nie jest znana. Czynniki neurochemiczne, które mogą uczestniczyć w powstawaniu choroby, obejmują niedobór substancji stosowanych przez neurony do transmisji impulsów nerwowych (neurotransmiterów), włączając w to acetylocholinę, somatostatynę, substancje P i norepinefrynę. Czynniki środowiskowe obejmują narażenie na glin, mangan i inne substancje. Czynniki zakaźne obejmują infekcje prionami (organizmy podobne do wirusów), które dotykają mózgu i rdzenia kręgowego (ośrodkowego układu nerwowego). W niektórych rodzinach (stanowiących 5 do 10% przypadków) występuje wrodzona predyspozycja do rozwoju choroby, ale nie spełnia ona czystych (Mendlowskich) kryteriów dziedziczności. Rozpoznanie stawia się zwykle po wykluczeniu innych przyczyn otępienia.

Badacze stwierdzili, że w rodzinach, które mają wielu członków z chorobą Alzheimer'a, występuje pewna szczególna odmiana genetyczna powszechna dla osobników z ta chorobą. Gen, produkujący substancję zwaną apolipoproteiną E4, nie jest uważany za przyczynę choroby, jego obecność po prostu zwiększa ryzyko wystąpienia choroby. Wielu ludzi ma gen kodujący apoliproteinę E4, a nigdy nie będą dotknięci chorobą Alzheimer'a.

Wystąpienie choroby charakteryzuje się pogorszeniem pamięci z postępującą utratą funkcji intelektualnych. W miarę postępu choroby mogą wystąpić zmiany nastroju, zasobu słów, chodu i inne. Występuje zmniejszenie wielkości tkanki nerwowej mózgowia (zanik), poszerzenie komór (wewnętrznych przestrzeni mózgu) oraz pojawiają się depozyty w tkance nerwowej mózgowia.

Choroba Parkinsona jest zaburzeniem mózgu charakteryzującym się drżeniami oraz kłopotami w chodzeniu, poruszaniu się i koordynacji. Choroba związana jest z uszkodzeniem części mózgu kontrolującej ruchy mięśni. Bywa nazywana również drżączką poraźną.

Ta choroba występuje u około 2 na 1000 ludzi i zwykle rozwija się po 50 roku życia. Dotyka w równym stopniu kobiety i mężczyzn i jest najczęstszym zaburzeniem neurologicznym występującym w wieku podeszłym. Pojęcie „parkinsonizm odnosi się do dowolnego stanu, który obejmuje kombinacje zmian w poruszaniu obserwowanych w chorobie Parkinson'a, która wydaje się być najczęstszą przyczyną tego typu objawów. Parkinsonizm może być spowodowany przez inne zaburzenia lub czynniki zewnętrzne (parkinsonizm wtórny).

Choroba Parkinsona jest spowodowana postępującym uszkodzeniem neuronów części mózgu, która kontroluje ruchy mięśni (zwoje podstawne i pole pozapiramidowe). Dopamina, jedna z substancji wykorzystywanych przez komórki do przekazywania sygnałów (transmiter), normalnie powstaje w tej okolicy. Zaburzenie tej okolicy mózgu zmniejsza ilość dostępnej dopaminy w organizmie. Niedostateczna ilość dopaminy zaburza równowagę pomiędzy dopaminą a innymi transmiterami, takimi jak acetylocholina. Bez dopaminy, komórki nerwowe nie mogą prawidłowo przekazywać sygnałów i to skutkuje utratą funkcji mięśni. Właściwa przyczyna uszkodzenia komórek mózgu nie jest znana. Zaburzenie może być jedno- lub obustronne, ze zróżnicowanym stopniem utraty funkcji.

PL 211 763 B1

Dodatkowo do utraty kontroli nad mięśniami, niektórzy ludzie z chorobą Parkinsona ulegają głębokiej depresji. Jakkolwiek wczesna utrata zdolności intelektualnych jest rzadka, w ciężkich przypadkach Parkinsonizmu osoba może prezentować wszystkie objawy pogorszenia umysłowego (włączając w to otępienie, omamy i podobne). Otępienie może też być działaniem ubocznym leków, stosowanych do leczenia tej choroby.

Choroba Huntingtona jest wrodzoną, dziedziczoną autosomalnie dominująco chorobą neurologiczną. Jest rzadka, występuje u około 1 osobnika na 1000 (Breighton i Hayden 1981). Choroba zwykle nie ujawnia się przed piątą dekadą życia i powoduje zaburzenia psychiczne, ruchy mimowolne, zmniejszenie funkcji poznawczych, prowadzące nieuchronnie do śmierci, typowo w 17 lat od momentu pojawienia się. Gen odpowiedzialny za chorobę Huntingtona nazywany jest huntingtin. Znajduje się on na chromosomie 4p i daje możliwości diagnostyki przed wystąpieniem objawów klinicznych i diagnostyki prenatalnej. Zaburzenie genetyczne polega na nadmiernej ilości powtarzających się parami sekwencji nukleotydów CAG.

Zwiększenie ilości powtarzających się CAG u osób z chorobą Huntigtona wykazuje wysoką swoistą korelację z okresem życia, w którym występują objawy kliniczne. Ten związek jest szczególnie uderzający u osób z początkiem choroby Huntingtona w młodości, które mają znaczne rozpowszechnienie tej sekwencji, zwykle powyżej 50 powtórzeń. Długość powtórzeń CAG w rodzinach z chorobą Huntingtona wykazuje pewną zmienność, która jest szczególnie zaznaczona, gdy dzieci dziedziczą gen huntingtin od chorych ojców.

Nie wiadomo jak, ten podlegający silnej ekspresji w chorobie Huntingtona gen, powoduje wybiórczą śmierć neuronów. Ponadto, analiza sekwencji nie wykazała żadnych oczywistych homologii z innymi znanymi genami oraz nie zidentyfikowano żadnych elementów strukturalnych lub domen funkcjonalnych, dających jasny wgląd w jego funkcje. W szczególności, pozostaje bez odpowiedzi pytanie, jak te podlegające silnej ekspresji geny powodują wybiórczą śmierć neuronów.

Stwardnienie zanikowe boczne, ALS, jest zaburzeniem powodującym postępującą utratę kontroli nad mięśniami zależnymi od woli, z powodu zniszczenia komórek nerwowych w mózgu i w rdzeniu kręgowym. Stwardnienie zanikowe boczne, zwane również chorobą Lou Gehring'a, jest zaburzeniem obejmującym utratę władzy i kontroli nad mięśniami. Nerwy kontrolujące te mięśnie obkurczają się i zanikają, co powoduje zmniejszenie ilości tkanki mięśniowej, spowodowane brakiem stymulacji nerwowej. Zmniejsza się siła i koordynacja ruchów mięśni, poczynając od mięśni zależnych od woli (tych pod kontrolą świadomości, takich jak mięśnie rąk i nóg). Rozmiary utraty kontroli nad mięśniami ciągle się powiększają i coraz więcej grup mięśniowych jest zajętych. Może dojść do utraty kontroli w mięśniach częściowo zależnych od woli, takich jak mięśnie odpowiedzialne za oddychanie i połykanie. Zdolność myślenia i rozumowania pozostaje nie zmieniona. Przyczyna nie jest znana.

ALS dotyka około 1 na 100000 ludzi. Wydaje się, że w niektórych przypadkach przebiega rodzinnie. Zaburzenie częściej dotyka mężczyzn niż kobiety. Objawy nie rozwijają się przed osiągnięciem dorosłości, często nie wcześniej niż po 50 roku życia.

Urazowe uszkodzenie nerwów może dotyczyć zarówno CNS jak i PNS. Urazowe uszkodzenie mózgu (TBI), również nazywane po prostu urazem głowy lub zamkniętym urazem głowy (CHI), odnosi się do uszkodzenia mózgu, które powstaje na skutek zewnętrznego uderzenia w głowę. Zdarza się to najczęściej podczas wypadków samochodowych lub rowerowych, ale może również wystąpić wskutek tonięcia, ataku serca, udaru i infekcji. Ten rodzaj urazowego uszkodzenia mózgu zależeć zwykle będzie od braku tlenu lub przepływu krwi w mózgu i z tego powodu może być określany jako uszkodzenie z niedotlenienia.

Uszkodzenie mózgu lub zamknięty uraz głowy pojawia się przy uderzeniu w głowę, takim jak w wypadku pojazdu mechanicznego lub upadku. W tym przypadku czaszka jest obiektem nieruchomym, a mózg, który jest wewnątrz czaszki, obraca się i skręca wokół swojej osi (pnia mózgu) powodując uszkodzenia miejscowe lub uogólnione. Poza tym, mózg, miękka masa otoczona przez płyn, który pozwala jej unosić się, może odbić się od czaszki, co może spowodować późniejsze uszkodzenia.

Bezpośrednio po urazie może wystąpić okres utraty świadomości, trwający minuty, tygodnie lub miesiące. Z powodu skręcenia i odbicia, pacjent z urazowym uszkodzeniem mózgu doznaje zazwyczaj uszkodzenia lub stłuczenia wielu okolic mózgu. Określa się to jako uogólniony uraz lub „niepenetrujący uraz mózgu. Rodzaje uszkodzenia mózgu przy urazach niepenetrujących można podzielić na pierwotne lub wtórne.

PL 211 763 B1

Pierwotne uszkodzenie mózgu występuje w momencie urazu, głównie w miejscu uderzenia, szczególnie w sytuacjach obecności złamania czaszki. Duże urazy mogą być połączone z krwotokiem wewnątrzmózgowym lub mogą towarzyszyć im rozerwania kory. Rozsiane uszkodzenia aksonów pojawiają się wskutek odcięcia i nadmiernego rozciągnięcia wypustek neuronów wywołanych przez obrotowe ruchy mózgu wewnątrz czaszki. Mogą występować drobne zmiany krwotoczne lub rozsiane uszkodzenia aksonów, wykrywalne jedynie mikroskopowo.

Wtórne uszkodzenia mózgu pojawiają się jako następstwo komplikacji rozwijających się po momencie urazu. Obejmują one krwotok śródczaszkowy, urazowe uszkodzenie tętnic zew nątrzmózgowych, wgłobienia wewnątrzczaszkowe, uszkodzenie z niedotlenienia lub zapalenie opon mózgowych.

Otwarty uraz głowy jest widocznym atakiem na głowę i może być następstwem postrzału, wypadku lub wtargnięcia obiektu poprzez czaszkę do mózgu („penetrujący uraz mózgu). Ten typ urazu głowy zwykle dotyczy bardziej określonej okolicy mózgu.

Tak zwany łagodny uraz mózgu może pojawić się bez utraty świadomości i dawać jedynie wrażenie oszołomienia i splątania trwające krótko. Jakkolwiek stosowana opieka medyczna może być minimalna, to pacjenci z urazem mózgu bez śpiączki mogą doznać objawów i zaburzeń podobnych do tych, z powodu których cierpią ci, którzy przeżyli uraz ze śpiączką.

W odpowiedzi na uraz występują w mózgu zmiany, które wymagają monitorowania aby zapobiec następnym uszkodzeniom. Wymiary mózgu zwiększają się po ciężkim urazie. Jest to nazywane przekrwieniem mózgu i występuje, gdy przyrasta ilość krwi w mózgu. Następnie w tym schorzeniu w mózgu może się gromadzić woda, co nazywa się obrzękiem. Zarówno przekrwienie jak i obrzęk prowadzą do wzrostu ciśnienia wywieranego na mózg, tak zwanego ciśnienia śródczaszkowego („ICP).

Urazy rdzenia kręgowego zaliczają się do najczęstszych przyczyn hospitalizacji z powodu porażenia kończyn dolnych lub porażenia wszystkich kończyn. Ponad 80% jest następstwem wypadków drogowych. Klinicznie rozpoznaje się dwie główne grupy urazów: urazy zamknięte i otwarte.

Urazy otwarte powodują bezpośrednie uszkodzenie rdzenia kręgowego i korzeni nerwowych. Urazy drążące mogą spowodować zniszczenie i krwawienie. Zamknięte urazy zaliczają się do najczęstszych urazów rdzenia i zwykle są związane ze złamaniem/przemieszczeniem kręgosłupa, które zwykle można wykazać radiologicznie. Uszkodzenie rdzenia zależy od rozmiarów uszkodzenia kości i może być rozważane w dwóch etapach: uszkodzenia pierwotnego - stłuczenia, przecięcia włókien nerwowych i martwicy krwotocznej uszkodzenia wtórnego - krwiaka nadoponowego, zawału, zakażenia i obrzęku.

Późne następstwa uszkodzenia rdzenia kręgowego obejmują: postępującą wstępującą i zstępującą degenerację uszkodzonych włókien nerwowych, po urazową jamistość rdzenia i układowe następstwa porażenia wszystkich kończyn, takie jak zakażenia układu moczowego i płuc, odleżyny i utratę masy mięśniowej.

Zaburzenia neurologiczne ponadto mogą być następstwem zaburzeń metabolicznych. Osłonki mielinowe, które okrywają wiele włókien nerwowych, są zbudowane z warstw lipoprotein wytworzonych we wczesnym etapie życia. Mielina wytworzona przez oligodendroglej w CNS różni się chemicznie i immunologicznie od tej wytworzonej przez komórki Schwann'a na obwodzie, ale oba typy mają taką samą funkcję: ułatwianie przekazywania impulsu nerwowego wzdłuż aksonu.

Wiele wrodzonych zaburzeń metabolicznych (np. fenyloketonuria i inne aminoacydurie; choroba Tay-Schs'a, Niemann-Pick'a, Gaucher'a; zespół Hurler'a; choroba Krabbego i inne leukodystrofie) zaburza rozwój osłonki mielinowej, głównie w CNS. Jeśli defekt biochemiczny nie może być skorygowany lub skompensowany, to wystąpią przewlekłe widoczne ubytki neurologiczne.

Na przykład, choroba Krabbego lub leukodystrofia komórek kulistych jest zaburzeniem obejmującym substancję białą ośrodkowego i obwodowego układu nerwowego. Mutacje w genie dla enzymu lizosomalnego galaktocerebrozydazy (GALC) powodują niską aktywność enzymatyczną i zmniejszoną zdolność do rozkładania galaktolipidów znajdowanych wyłącznie w mielinie. Ciągła mielinizacja i/lub remielinizacja wymaga działania endogennych oligodendrocytów lub przeszczepienia zdrowych oligodendrocytów lub komórek pnia, które mogłyby się różnicować do oligodendrocytów, po to by zapewnić wystarczające wyrażanie GALC. (Wenger i in., 2000).

Nerwiakowłókniakowatość 1 (NF 1) jest pospolitym, dziedziczonym autosomalnie zaburzeniem z szerokim zakresem manifestacji neurologicznych.

PL 211 763 B1

Rozsiana atrofia układowa jest rzadkim, występującym u dorosłych zaburzeniem neurodegeneracyjnym o nieznanej etiologii. To zaburzenie może być wyjątkowe wśród chorób neurodegeneracyjnych ze względu na znaczącą, jeśli nie pierwotną, rolę odgrywaną w jego patogenezie przez komórki oligodendrogleju. Główną różnicą pomiędzy chorobą Parkinsona a MSA, jest to, że pacjenci z MSA nie reagują na leczenie L-dopą.

Demielinizacja w wieku podeszłym jest cechą wielu zaburzeń neurologicznych; może być następstwem uszkodzenia nerwów lub mieliny spowodowanych miejscowym urazem, niedokrwieniem, czynnikami toksycznymi lub zaburzeniami metabolicznymi. Istnieją również dowody na to, że demielinizacja przyczynia się do schizofrenii. Nasilona demielinizacja zwykle poprzedza degenerację aksonów i często degenerację ciał komórek, które obie mogą być nieodwracalne. Jednak, remielinizacja pojawia się w wielu przypadkach, a naprawa, regeneracja i całkowity powrót funkcji nerwowych mogą być szybkie. Ośrodkowa demielinizacja (tj. rdzenia kręgowego, mózgu lub nerwów wzrokowych) jest zjawiskiem pierwotnie dominującym w pierwotnych chorobach demielinizacyjnych, których etiologia nie jest znana. Najlepiej znaną jest SM.

Ostre, rozsiane zapalenie mózgu i rdzenia, pozakaźne zapalenie mózgu i rdzenia charakteryzuje się okołonaczyniową demielinizacją w CNS, która może wystąpić samoistnie ale zwykle występuje po infekcji wirusowej lub szczepionce wirusowej (lub, bardzo rzadko, po szczepionce bakteryjnej), sugerując przyczynę immunologiczną. Ostre obwodowe neuropatie zapalne lub zespół Guillain-Barre są podobnymi zaburzeniami demielinizacyjnymi z przypuszczalnie tą samą immunopatogenezą, ale dotyczą one wyłącznie struktur obwodowych.

Leukodystrofia metachromatyczna dziecięca jest kolejną chorobą demielinizacyjną. Adrenoleukodystrofia i adrenomielopatia są związanymi z chromosomem X recesywnymi zaburzeniami metabolicznymi charakteryzującymi się nieprawidłowym funkcjonowaniem gruczołów nadnerczowych i rozsianą demielinizacja w układzie nerwowym. Adrenoleukodystrofia występuje u młodych chłopców; adrenomieloneuropatia u dorosłych. Może wystąpić upośledzenie umysłowe, spastyczność i ślepota. Adrenoleukodystrofia jest zawsze śmiertelna. Leczenie dietą i immunomodulacyjne jest w trakcie opracowywania.

Wrodzona atrofia wzrokowa Leber'a i związane z nią zaburzenia mitochondrialne charakteryzują się pierwotną, obustronną utratą widzenia centralnego, zwykle dotyczą młodych mężczyzn pod koniec drugiej lub na początku trzeciej dekady życia. Wrodzona atrofia wzrokowa Leber'a może przypominać zapalenie nerwów wzrokowych w SM. Zidentyfikowano mutacje mitochondrialnego DNA pochodzącego od matki.

Mielopatia związana z HTLV, wolno postępująca choroba rdzenia kręgowego, związana z zakażeniem wirusem z powinowactwem do ludzkich limfocytów T (HTLV), charakteryzuje się spastyczną słabością obu kończyn dolnych.

Ponadto neurologiczne zaburzenia obejmują neuropatię z nieprawidłową mielinizacją, których przegląd podano poniżej.

Immunologiczne: Ostre, Gullain-Barre, Przewlekłe, Przewlekła Immunologiczna Polineuropatia Demielinizacyjna (CIDP) Wieloogniskowa Neuropatia Ruchowa (MMN), Zespół anty-MAG, zespół GALOP zespół przeciwciał przeciwko sylatydom (z białkiem M w surowicy), zespół przeciwciał przeciwko GM2, zespół POEMS, Polineuropatia-organomegalia, endokrynopatia lub obrzęk, białko M, zmiany skórne, zapalenie okołonerwowe, zespół przeciwciał IgM anty-GD1b (wyjątkowo).

Toksyny: błonica, Buckthorn, Heksachlorofen, Cyjanek sodu, Tellur.

Leki: Przeważnie demielinizujące: Chlorochina, FK506 (Takrolimus), Perhekselina, Prokainamid, Zimeldina; Mieszane demielinizujące i aksonalne: Amiodaron, zespół Eosynofilii-Myalgi, ZŁoto, Suramin, Taksol.

Wrodzone: Glikoproteina z niedoborem węglowodanów, Zaćma i dysmorfia twarzy, zespół Cockayne, Wrodzona hipomielinizacja, Wrodzona dystrofia mięśniowa: niedobór Merosin, choroba Farber'a (Lipogranulomatosis), HMSN & CMT, Dominujące: IA, IB, III, HNPP, EGR2, ciepło wrażliwy, Recesywne: III (Dejerine-Sottas ); 4A; 4B; 4B2; 4C; 4D (LOM); 4E; 4F; HMSN-R; CNS, związane z chromosomem X: IX, Krabbe, Marinesco-Sjogrena, Leukodystrofia metachromatyczna, Niemann-Pick, Pelizaeus-Merzbache (PLP), Refsum, białko prionowe (PrP27-30): mutacja Glu200Lys, choroba Creutzfeld-Jakoba, model Mysi: nadmierna ekspresja prionów, Choroba Salla, SOX10, Tenascin-XA, Nieregularne ułożenie obwodowych osłonek mielinowych, fenotyp Ehlers-Danlosa.

Metaboliczne (rzadkie): Cukrzyca (z powodu współistniejącej CIPD), Niedoczynność tarczycy, zaburzenia wątroby.

PL 211 763 B1

Mitochondrialne: zespół MNGIE, Miopatia i porażenie mięśni zewnętrznych oka, Neuropatia, Encefalopatia żołądkowojelitowa, zespół NARP, Neuropatia, Ataksja, zapalenie siatkówki, zwyrodnienie barwnikowe.

Zakaźne: choroba Creutzfeld-Jakoba, Błonica, HIV: współistniejące CIPD, Trąd: zapalenie trędowate, Mieszane aksonalno-demielinizujące; kolonizacja komórek Schwana, Odmiana choroby Creutzfeld-Jakoba.

Dalsze szczegóły można pobrać z następującej strony internetowej:

http://www.neuro.wustl.edu/neuromuscular/nother/myelin.html

Stwardnienie rozsiane (SM) jest zapalną, demielinizującą chorobą ośrodkowego układu nerwowego, która ma przebieg zwalniająco-nawrotowy lub postępujący. SM jest nie tylko chorobą demielinizacyjną. Jej odpowiednikiem w obwodowym układzie nerwowym jest (PNS) jest przewlekła, demielinizacyjna poliradikuloneuropatia (CIPD). Dodatkowo, występują ostre, jednofazowe zaburzenia, takie jak zapalna demielinizująca poliradikuloneuropatia w PNS, nazywana zespołem Guillain-Barre (GBS) oraz ostre rozsiane zapalenie mózgu i rdzenia (ADEM) w CNS. Zarówno SM jak i GBS są zespołami heterogennymi. W SM różne czynniki zewnętrzne współdziałają z genetycznymi powodując rozwój choroby, tak że ostatecznie zostają dopełnione kryteria diagnostyczne. W obu chorobach, uszkodzenia aksonów mogą dołączyć się do pierwotnych zmian demielinizacyjnych i powodować trwały ubytek neurologiczny.

SM jest najczęstszą spośród wyżej wymienionych chorób demielinizacyjnych. Jest określane jako zaburzenie autoimmunizacyjne, w którym leukocyty układu immunologicznego rozpoczynają atak na substancję białą ośrodkowego układu nerwowego (CNS). Substancja szara może być również zaatakowana. Jakkolwiek dokładna etiologia SM nie jest znana, czynniki współdziałające mogą obejmować czynniki genetyczne, infekcje bakteryjne i wirusowe. W swej klasycznej postaci (85% przypadków) charakteryzuje się naprzemiennymi okresami zwolnień/nawrotów, którym towarzyszą epizody dysfunkcji nerwowych trwające kilka tygodni z następową zasadniczą lub całkowitą poprawą (Noseworthy, 1999). Okresy remisji stają się z czasem coraz krótsze. Potem, wielu pacjentów wchodzi w ostateczną fazę charakteryzującą się stopniową utratą funkcji neurologicznych z częściową poprawą lub jej brakiem. Jest to nazywane wtórnym postępującym SM. Niewielki procent pacjentów (około 15% pacjentów z SM) cierpi z powodu stopniowego i nieprzerwanego obniżenia funkcji neurologicznych, występującego po początkowym okresie choroby (pierwotnie postępujące SM). Aktualnie nie ma oczywistego, skutecznego leczenia dla najcięższych postaci SM, które są z reguły śmiertelne.

Podstawowym wyznacznikiem SM jest blaszka demielinizacyjna z tworzeniem odczynowej blizny glejowej, widoczna w substancji białej dróg mózgowia i rdzenia kręgowego. Demielinizacja jest związana z funkcjonalnym zmniejszeniem lub zniesieniem przewodzenia impulsów nerwowych. Obserwuje się również rozwarstwienia aksonalne i martwicę u pacjentów z SM (Bjartmar i in., 1999). Badania patologiczne wykazały przewagę zmian ograniczonych do nerwów wzrokowych, okołokomorowej substancji białej, pnia mózgu i rdzenia kręgowego (Storch i in., 1998). Następstwa tych ubytków w CNS obejmują ostre objawy podwójnego widzenia, porażenia i niestabilnego chodu, albo przewlekłe objawy, takie jak porażenie kończyn dolnych i nietrzymanie moczu.

Mechanizmy cząsteczkowe prowadzące do SM wydają się mieć swoje źródło w czynnikach genetycznych i środowiskowych, obejmujących infekcje wirusowe i bakteryjne. Te mechanizmy promują zwiększenie migracji limfocytów T i makrofagów przez barierę krew-mózg do tkanki CNS.

Demielinizacja jest spowodowana atakiem aktywowanych makrofagów na mielinę i mikroglej, jak i przez cytotoksyczne uszkodzenie komórek mielinowych z udziałem układu receptor Fas-ligand i dopełniacza, albo za pośrednictwem przeciwciał. Z tego powodu, demielinizacja występuje zarówno z powodu bezpośredniego ataku na osłonki mielinowe jak i eliminacji komórek wytwarzających i podtrzymujących mielinę.

Czynniki genetyczne i środowiskowe prowadzą do wzrostu napływu komórek zapalnych przez barierę krew-mózg. To powoduje wzrost napływu autoreaktywnych limfocytów T i makrofagów do tkanki CNS. Cytokiny wydzielane przez limfocyty T aktywują komórki prezentujące antygen (APC). Gdy autoreaktywne limfocyty T, w kontekście antygenów MHC klasy II, napotkają przypuszczalne „antygeny SM, zwykle stanowiące białka osłonek mielinowych, mogą ulec aktywacji. Kilka mechanizmów następczych może następnie współgrać w uszkodzeniu oligodendrocytów i mieliny. Cytotksyczność zależna od dopełniacza lub przeciwciał może powodować większość zmian u niektórych pacjentów z SM, podczas gdy układ receptor Fas-ligand i uwolnione pro-zapalne cytokiny, takie jak TNF-a,

PL 211 763 B1 z limfocytów CD4+ mogą atakować substancję białą u innych. Aktywowane makrofagi też mogą odgrywać rolę poprzez nasiloną fagocytozę i wydzielanie czynników. To powoduje uogólnioną demielinizację a następnie utratę wydajności przewodzenia impulsów nerwowych w aksonach CNS. Po rozejściu się zapalenia, jednak, mechanizmy naprawcze mogą rozpocząć remielinizację. Zremielinizowane aksony u pacjentów z SM mogą być rozpoznane histopatologicznie dzięki cieńszej osłonce mielinowej wokół zremielinizowanych aksonów. Dodatkowe kanały sodowe znajdowane w błonie zdemielinizowanych aksonów, wyrównują spadek skuteczności przewodzenia. Komórki prekursorowe oligodendrogleju mogą nasilić remielinizację w zmianach wywołanych SM.

Oligdendrocyty wykazują wiele funkcji związanych z produkcją i podtrzymaniem mieliny. Zapewniają izolację, odżywienie i zwiększenie przewodności aksonów wielu neuronów. Pojedynczy oligodendrocyt może mielinizować do 50 różnych aksonów. Mielinizacja jest ograniczona tylko do głównych, mających dużą średnicę aksonów; dendryty i inne wypustki komórkowe, takie jak u astrocytów, pozostają niezmielinizowane. Aksony wydają się wykazywać kontrolę nad liczbą mielinizujących oligodendrocytów, ponieważ paradygmat przecięcia aksonów nerwów wzrokowych wykazuje odtwarzanie mieliny i prekursorów oligodendrocytów (przedstawione w Barres i Ralf, 1999). Proliferacja i migracja oligodendrocytów może być pobudzana przez czynniki uwalniane z aksonów podczas ich rozwoju. W ten sposób ilości oligodendrocytów i aksonów są starannie dopasowane w CNS.

Oligodendrocyty, są zewnątrzneuronalną podporą komórek CNS, mielinowymi drogami aksonów i służą wzmocnieniu przekazywania impulsu. Odgrywają rolę w utrzymaniu i funkcjonowaniu aksonów. Należy zauważyć, jak pokazano na tym wykresie, że oligodendrocyt wypuszcza tylko jedną wypustkę w kierunku aksonu, który mielinizuje.

Wielowarstwowa osłonka mielinowa jest wyspecjalizowanym rodzajem błony plazmatycznej komórki glejowej, bogatym w tłuszcze i ubogim w białka. Służy ona do podpierania aksonów i wzmacniania przewodzenia sygnału elektrycznego w CNS przez ochranianie ładunku przed wydostaniem się do otaczającej tkanki. Węzły Ranviera są miejscami wzdłuż osłonki aksonu, gdzie występuje skokowe przewodnictwo.

W mózgu osoby dorosłej oligodendrocyty rozwijają się ze słabo, jak dotąd, zdefiniowanych komórek prekursorowych w przestrzeni wewnątrzkomorowej mózgu i rdzenia kręgowego (Nait-Oumesmar i in., 1999). Te prekursory najpierw pojawiają się w obszarze komorowym embrionalnego rdzenia kręgowego na kilka tygodni przed mielinizacją, proliferują i wyrażają transkrypty mielinowe i białka, (Hajihosseini i inn., 1996). Proces mielinizacji zachodzi w mózgu po urodzeniu. Po urodzeniu te prekursory migrują do dróg nerwowych, które mają być zmielinizowane.

Oligodendrocyty dojrzewają z komórek prekursorowych w określony i swoisty sposób (opisane np. w Rogister i in., 1999). Rozwój oligodendrocytów następuje w określony sposób, tak że każdy etap wyróżnia się kilkoma komórkowo-specyficznymi markerami: śródbłonkowa cząsteczka adhezyjna komórek nerwowych (E-NCAM), wimentyna, A2B5, POU czynnik transkrypcyjny Tst-1/Oct6/SCIP, antygen pre-oligodendroblastu (POA), galaktocerebrozyd (GalC), 01, 04 i białko specyficzne dla mieliny PLP, MBP i MOG. Nerwowe komórki macierzyste przekształcają się do komórek dwubiegunowych pre-GD3⁺, które stają się prekursorami O2A. Te komórki mogą przekształcić się albo do oligodendrocytów albo do astrocytów 2 typu. Rozwój trwa przez stadia pre-oligodendrogleju i preGalC⁺, przed rzeczywistym różnicowaniem się do oligodendrocytów. Końcowe stadia różnicowania się oligodendrogleju są wyznaczane przez niezdolność komórek do proliferacji. Dojrzałe oligodendrocyty wyrażają komórkowo swoiste markery GalC i sulfatyd (SUL), oprócz wyrażania białek swoistych dla mieliny.

Oligodendrocyty zatem różnicują się z aktywnych mitotycznie, migrujących komórek prekursorowych. Zaraz po tym, gdy komórki przestają się dzielić, rozpoczynają transkrypcję i translację genów kodujących białka swoiste dla mieliny. Wytwarzanie osłonki mielinowej owijającej akson doprowadza do bezpośredniego połączenia procesu dojrzewania oligodendrocytu i samego aksonu. Pochewka otaczająca akson w CNS jest wykończona przez zagęszczenie osłonki mielinowej, która ostatecznie przypomina ciekły kryształ zawierający złożony układ makrocząsteczek (Scherer, 1997). Sprzyjanie mielinizacji wymaga zwrócenia uwagi na dokładny stosunek stechiometryczny pomiędzy poszczególnymi białkami strukturalnymi osłonki mielinowej, ponieważ zwiększenie lub zmniejszenie ilości jednego składnika może prowadzić do zaburzeń struktury całej osłonki.

Niezdolność oligodendrocytów do podtrzymania naprawy aksonów pozbawionych mieliny przyczynia się do łącznej neurologicznej dysfunkcji charakteryzującej MS. Sprzyjanie remielinizacji u pa12

PL 211 763 B1 cjentów z MS może ochronić przed utratą aksonów i w ten sposób ograniczyć postęp upośledzenia wynikającego ze śmierci aksonów w CNS.

Fenotyp demielinizacyjny SM doprowadził do intensywnych badań nad istotą czynnego uszkodzenia w SM. Nagie aksony i nieobecność tworzących mielinę oligodendrocytów wskazały na zniszczenie prawidłowej mieliny i odchylenia od normy w procesie remielinizacji związanym z MS. W przypadku około 40% zmian w MS wykazano nieskuteczną remielinizację, szczególnie we wczesnych etapach choroby (Prineas i in., 1993). To daje realną szansę na to, że rozwinięcie sposobów sprzyjania naprawie mieliny może zapobiec trwałemu uszkodzeniu układu nerwowego. Sukces prawdopodobnie będzie szczególnie duży w świeżych zmianach CNS gdzie, jak wykazano, zachodzi wczesna remielinizacja.

Jednak, mielinizujący lub remielinizujący oligodendrocyt jest komórką podlegającą maksymalnemu obciążeniu metabolicznemu, która obciążona nawet niewielkim dodatkowym urazem może ulec nieodwracalnemu uszkodzeniu (Scolding i Lassmann, 1996). To obniża prawdopodobieństwo spontanicznej naprawy w czynnym SM, gdzie zapalenie i inne czynniki uszkadzające przeszkadzają w remielinizacji. Zatem, strategie promujące naprawę mieliny mogą zwiększać przewagę remielinizacji i ochrony aksonów w czynnym SM.

Stwierdzono, że CNS osoby dorosłej zawiera komórki prekursorowe dla oligodendrocytów, które są zdolne do proliferacji i które mogą dojrzewać do oligodendrocytów tworzących mielinę. Dodatkowo wydaje się, że populacje prekursorów endogennych oligodendrocytów sąsiadujące z uszkodzeniami SM są naruszone podczas przewlekłej fazy choroby, z powodu hamowania zdolności tych prekursorów do namnażania i różnicowania (Wolswijk, 1998). Takie komórki prekursorowe są na ogół nieaktywne w otoczeniu uszkodzeń w przebiegu przewlekłego SM, chroniąc je przed aktywnym udziałem w remielinizacji. Sytuacja ta w przewlekłej chorobie SM może zatem dotyczyć czynników, które utrudniają regenerację oligodendrogleju lub braku niezbędnych czynników do pobudzania populacji komórek prekursorów oligodendrocytów (Wolswijk, 1998). Ta koncepcja doprowadziła do hipotezy, iż skuteczna terapia SM nie powinna ograniczać się do hamowania zapalenia, lecz również powinna popierać remielinizację.

Komórki remielinizujące mogą pochodzić z różnych źródeł, włączając w to pozostałe przy życiu oligodendrocyty pierwotnie występujące w zmianie, wywodzące się z nich komórki lub przyległe komórki prekursorowe. Wykazano, że dojrzałe oligodendrocyty mogą być pobudzone do zmniejszenia stopnia swojego zróżnicowania i proliferacji, czynnikami takimi jak podstawowy czynnik wzrostowy fibroblastów (bFGF), sugerując mechanizm regeneracji komórek linii oligodendrogleju występującej po chorobie demielinizacyjnej (Grinspan i in., 1996; Grinspan i in., 1993).

Dodatkowych dowodów na korzystny wpływ remielinizacji w chorobach demielinizacyjnych takich jak SM, dostarczyły badania przeprowadzone z czynnikami wzrostowymi dla gleju, stosowanymi jako leczenie w zwierzęcych modelach tej choroby. Wykazano, że czynnik wzrostowy gleju-2 (neuregulin/GGF-2), czynnik wzrostowy CNS znany z promocji proliferacji i przeżycia oligodendrocytów, opóźnia moment wystąpienia choroby, zmniejsza kliniczne nasilenie oraz zmniejsza częstotliwość nawrotów w EAE- mysim modelu SM (Marchionni i in., 1999). Wykazano, że neuregulin ma korzystny wpływ na dojrzałe oligodendrocyty i jest wytwarzany przez aksony (Fernandez i in., 2000).

Wykazano, że inne czynniki wzrostowe, włączając w to pochodzący z płytek czynnik wzrostowy (PDGF) i IGF-1, pobudzają remielinizację i mają działanie lecznicze w modelu EAE (omówione przez Dubois-Dalcq i Murray, 2000). Sukces ze stymulacją remielinizacji, osiągnięty przez pobudzenie komórek z linii oligodendrocytów do proliferacji i/lub różnicowania, wskazuje, że perspektywy dla remielinizacji jako strategii leczniczej dla SM są korzystne. Równie istotna jest identyfikacja cząsteczek, które hamują syntezę mieliny, ponieważ mogą one zmniejszać skuteczność strategii naprawczych takich jak przeszczepianie komórek oligodendrogleju w SM.

Proces remielinizacji może przebiegać w zgodzie ze szlakami przeciwzapalnymi w celu naprawy uszkodzeń i ochrony aksonów przed przecięciem i śmiercią.

Oligodendrocyty mogą zostać pobudzone do remielinizacji szlaków aksonalnych w CNS, a przez to mogą uczestniczyć w polepszeniu stanu pacjenta. Nasilenie remielinizacji może przeciwdziałać pierwotnemu uszkodzeniu wywołanemu naciekiem komórek układu odpornościowego do tkanki CNS i ich atakowi na osłonki mielinowe.

Kilka analiz różnicowania oligodendrogleju i zmian w stwardnieniu rozsianym zostało przeprowadzonych z użyciem obrazowania wzoru ekspresji genu na mikropanelach (DGE, Scariato i in., 2000; Whitney i in., 1999). W technikach tych wykorzystano różne panele do analizy różnych zestaPL 211 763 B1 wów genów. Badania ekspresji genów zarówno w różnicujących się oligodendrocytach i zmianach w stwardnieniu rozsianym, wykazały istotne zmiany w ekspresji genów swoistych dla mieliny. Dodatkowo, wskazano inne geny jako inaczej regulowane, z których wiele było znanych jako zaangażowane w takich procesach jak kontrola cyklu komórkowego, reorganizacja cytoszkieletu i transport błonowy (Scariato i in., 2000).

Osteopontyna (OPN) jest wysoko fosforylowaną sialoproteiną, która jest istotnym składnikiem mineralnej substancji międzykomórkowej kości i zębów. OPN charakteryzuje się obecnością sekwencji kwasu poliasparaginowego i miejscami fosforylacji Ser/Thr, które pośredniczą w wiązaniu hydroksyapatytów i bardzo konserwatywnymi motywami RGD, które pośredniczą w przyleganiu do komórek i przekazywaniu sygnałów. Wyrażanie osteopontyny w różnych tkankach wskazuje na wielość funkcji, w które zaangażowane są te konserwatywne motywy. Podczas gdy brak jasnego fenotypu myszy pozbawionej genu dla OPN nie pozwolił ostatecznie określić roli osteopontyny w żadnej tkance, ostatnie badania dostarczyły nowego i intrygującego wglądu we wszechstronność tego białka w odrębnych biologicznych zdarzeniach, takich jak procesy rozwoju, gojenia ran, odpowiedzi odpornościowej, rozwoju nowotworu, resorpcji i uwapnienia kości. Zdolność osteopontyny do stymulacji aktywności komórek przez wiele receptorów związanych z kilkoma interaktywnymi drogami przekazywania sygnałów, może wyjaśnić tak dużą różnorodność funkcjonalną osteopontyny (Sodek i in.).

Wykazano również, że osteopontyna jest wyrażana w pierwotnych czuciowych neuronach w układzie nerwu trójdzielnego i nerwów rdzeniowych szczura, zarówno w ciałach komórek neuronalnych jak i w aksonach (Ichikawa i in., 2000).

Hybrydyzacją in situ wykazano ekspresję mRNA dla osteopontyny w dojrzałym mózgu. Ekspresję tę stwierdzono w neuronach opuszki węchowej i pnia mózgu, a następnie stwierdzono ją w funkcjonalnie odrębnych okolicach mózgu, takich jak układ czucia i twór siatkowaty (Shin i in., 1999).

Kolejne badanie wykazało przestrzenną i skroniową ekspresję mRNA dla osteopontyny występującą w następstwie przejściowego niedokrwienia przodomózgowia u szczurów. Przejściowa indukcja mRNA dla OPN po uogólnionym niedokrwieniu pojawia się wcześniej w prążkowiu niż w hipokampie. Była ona wyrażana w grzbietowo-przyśrodkowej części prążkowia, blisko komory bocznej i w polu CA1 oraz w podporze hipokampa, zanim komórki mikrogleju stały się bardziej reaktywne. Można było ją wykryć również we wnęce jądra zębatego, w obszarze brzeżnym pola CA3 (Lee MY, Shin SL, Choi YS, Kim EJ, Cha JH, Chun MH, Lee SB, Kim SY, Neurosci Lett, 20 sierpnia 1999, 271: 2 81-4).

Osteopontyna jest również nazywana Eta-1. WO 00/63241 dotyczy sposobów modulowania odpowiedzi odpornościowej, w szczególności do modulowania odpowiedzi typu I, stosując jako modulator Eta-1 (wczesny aktywator limfocytówT)/osteopontyna. Modulatory osteopontynowe są uważane za przydatne w leczeniu infekcji, zaburzeń i chorób immunizacyjnych, zaburzeń autoimmunizacyjnych, włączając w to SM, różne niedobory immunologiczne i raka. Wszystkie modulatory osteopontynowe ujawnione w WO 00/63241, które są rozpatrywane jako przydatne w chorobach autoimmunizacyjnych, włączając w to SM, są inhibitorami osteopontyny/Eta-1, jak wyjaśniono szczegółowo w części V. „Clinical Applications of the Modulatory Methods of the Invention, D. „Autoimmune Dseases, strony od 51 do 53 WO 00/63241.

Interferony są podtypem cytokin, które wykazują działanie przeciwzapalne, przeciwwirusowe i przeciwproliferacyjne. Na podstawie właściwości biochemicznych i immunologicznych, naturalnie występujące ludzkie interferony podzielono na trzy klasy: interferon alfa (leukocyt), interferon beta (fibroblast) i interferon gamma (immunologiczny). Interferon alfa jest aktualnie dopuszczony w Stanach Zjednoczonych i innych krajach do leczenia białaczki włochatokomórkowej, kłykcin konczystych, mięsaka Kapociego (raka zwykle dotykającego pacjentów cierpiącyh z powodu nabytego zespołu niedoboru odporności (AIDS)), przewlekłego zapalenia wątroby typu nie-A, nie-B.

Ponadto interferony (IFN) są glikoproteinami wytwarzanymi przez organizm w odpowiedzi na zakażenie wirusowe. Hamują namnażanie wirusów w chronionych komórkach. Interferony stanowiąc białka o małej masie cząsteczkowej, są znacząco nieswoiste w swoim działaniu, tj. IFN indukowany przez jednego wirusa jest skuteczny przeciwko szerokiemu zakresowi innych wirusów. Jednakże są one gatunkowo swoiste, tj. IFN wytwarzany przez jeden gatunek będzie stymulował aktywność przeciwwirusową tylko w komórkach tego samego lub blisko spokrewnionego gatunku. IFN były pierwszą grupą cytokin wykorzystanych ze względu na swoje potencjalne właściwości przeciwnowotworowe i przeciwwirusowe.

Trzy główne IFN są określane jako IFN-a, IFN-β i IFN-γ. Te główne typy IFN zostały pierwotnie sklasyfikowane na podstawie komórek pochodzenia (leukocyt, fibroblast lub limfocyt T). Jednakże

PL 211 763 B1 stało się oczywiste, że kilka typów może być produkowanych przez jedną komórkę. Stąd IFN leukocytów jest obecnie nazywany IFN-α, IFN fibroblastów IFN-β i IFN limfocytów T IFN-γ. Istnieje również czwarty typ IFN, IFN limfoblastów, wytwarzany przez linię komórkową „Namalwa (wywodzącą się z chłoniaka Burkitta), która wydaje się wytwarzać mieszaninę IFN leukocytów i fibroblastów.

Jednostkę interferonową opisuje się jako miarę aktywności IFN określoną (po części arbitralnie) jako ilość potrzebną do ochrony 50% komórek przed uszkodzeniem wirusowym.

Każda klasa IFN zawiera kilka odrębnych typów. IFN-β i IFN-γ są produktami pojedynczego genu każdy. Różnice pomiędzy poszczególnymi typami wydają się głównie zależne od różnic w glikozylacji.

IFN -a wydaje się najbardziej odrębną grupą, obejmującą około 15 typów. Istnieje zespół genów IFN-a na chromosomie IX, obejmujący co najmniej 23 elementy, z których 15 jest aktywowanych i podlega transkrypcji. Dojrzały IFN-a nie jest glikozylowany.

IFN -a i IFN-β mają tę samą długość (165 lub 166 aminokwasów) oraz podobne właściwości biologiczne. Długość IFN-γ wynosi 146 aminokwasów i w mniejszym stopniu odpowiada on klasie a i β. Tylko IFN-γ może aktywować makrofagi lub indukować dojrzewanie limfocytów T-zabójców. Wobec tego te nowe typy czynników leczniczych mogą być nazywane modyfikatorami odpowiedzi biologicznej (BRM), ponieważ wpływają na odpowiedź organizmu na nowotwór, oddziałując na rozpoznanie przez immunomodulację.

W szczególności interferon ludzkich fibroblastów (IFN-β) posiada właściwości antywirusowe i może stymulować limfocyty NK przeciwko komórkom nowotworowym. Jest polipeptydem o masie cząsteczkowej około 20 000 Da, indukowanym przez wirusy i dwuniciowe RNA. Derynk i in. (Derynk R. i in., 1980) wydedukowali kompletną sekwencję aminokwasową białka z sekwencji nukleotydowej genu dla interferonu fibroblastów, sklonowanego metodą rekombinacji DNA. Długość jej wynosi 166 aminokwasów.

Shepard i in., (Shepard H. M. i in., 1981) opisali mutację 842 zasady (Cys—>Tyr w pozycji 141), która znosi właściwości przeciwwirusowe i klon zmieniony z delecją nukleotydów 1119-1121.

Mark i in., (Mark D.F. i in., 1984) wprowadzili sztuczną mutację polegającą na zamianie 469 zasady (T) na (A), powodując zamianę aminokwasów w pozycji 17 Cys—>Ser. Powstały IFN-β opisano jako mający aktywność natywnego IFN-β i stabilność podczas długotrwałego przechowywania (-70°C).

Rebif® (rekombinowany ludzki interferon β) jest najnowszym osiągnięciem w terapii interferonowej stwardnienia rozsianego (SM) i prezentuje znaczący postęp w leczeniu. Rebif® jest interferonem(IFN)-beta 1a, wytwarzanym przez linię ssaczych komórek i rzeczywiście jest identyczny z naturalnie występującą u ludzi cząsteczką.

Mechanizm, przez który IFN przejawia swoje działanie, nie jest całkowicie zrozumiały. Jednakże, w większości przypadków działa wpływając na indukcję lub transkrypcję pewnych genów, w ten sposób wpływając na układ odpornościowy. Badania in vitro wykazały, że IFN jest zdolny indukować lub hamować produkty około 20 genów.

IFN-β w SM może oddziaływać trzema głównymi drogami:

• przez regulację funkcji limfocytów T, takich jak aktywacja, proliferacja i funkcja supresorowa;

• przez modulację wytwarzania cytokin: zmniejszeniem cytokin pro-zapalnych i zwiększeniem hamujących, przeciwzapalnych;

• przez regulację migracji limfocytów T i ich naciekania do CNS przez BBB (barierę krew-mózg).

Badanie PRISMS określiło skuteczność interferonu beta-1a podawanego podskórnie trzy razy w tygodniu, w leczeniu nawrotowo-zwalniającego stwardnienia rozsianego (RR-SM). To badanie wykazało, że interferon beta-1a może mieć pozytywny wpływ na długotrwały przebieg SM przez zmniejszenie liczby i stopnia nasilenia nawrotów i redukcję nasilenia i aktywności zmian chorobowych widocznych w MRI. („Randomized, Double-Blind, Placebo-Controll Study of Interferon beta-1a in Relapsing-remmiting Multiple Sclerosis, The Lancet 1998; 352 (7 listopada 1998): 1498-1504).

Żadnego z cytowanych tu dokumentów nie uznaje się za najbliższy stan techniki i nie należy go rozważać w kontekście zdolności patentowej żadnego z zastrzeżeń niniejszego zgłoszenia. Wszelkie odniesienia do treści lub daty tych dokumentów oparto na informacjach dostępnych Zgłaszającym w czasie składania niniejszego zgłoszenia, a zatem nie można gwarantować poprawności takiego odniesienia.

Celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie nowych środków do leczenia i/lub zapobiegania chorobom neurologicznym.

PL 211 763 B1

Wynalazek opiera się na ujawnieniu, że białko osteopontyna promuje proliferację i różnicowanie komórek glejowych, w ten sposób promując mielinizację i regenerację nerwów. Zgodnie z niniejszym wynalazkiem, ponadto stwierdzono, że osteopontyna ma korzystne działanie na modelach zwierzęcych stwardnienia rozsianego i neuropatii obwodowych.

Przedmiotem wynalazku jest zatem zastosowanie osteopontyny do wytwarzania leku do leczenia i/lub zapobiegania chorobie neurologicznej wybranej z grupy składającej się z urazowego uszkodzenia nerwu, neuropatii obwodowej, neuropatii cukrzycowej, stwardnienia rozsianego (SM), oraz choroby neurologicznej spowodowanej wrodzonym zaburzeniem metabolicznym, przy czym osteopontyna jest wybrana z grupy składającej się z:

(a) polipeptydu obejmującego SEKW. Nr ID: 1;

(b) polipeptydu obejmującego aminokwasy 1 do 168 lub 170 SEKW. Nr ID: 1;

(c) polipeptydu obejmującego aminokwasy 1 do 16 i 170 do 314 SEKW. Nr ID: 1;

(d) polipeptydu obejmującego aminokwasy 170 do 314 SEKW. Nr ID: 1;

(e) polipeptydu obejmującego SEKW. Nr ID: 2;

(f) polipeptydu obejmującego SEKW. Nr ID: 3;

(g) muteiny dowolnego z (a) do (f), w której sekwencja aminokwasowa jest co najmniej w 90% identyczna z co najmniej jedną z sekwencji z (a) do (f) i która oddziaływuje z integryną av i/lub CD44;

(h) muteiny dowolnego z (a) do (f), która jest kodowana przez sekwencję DNA hybrydyzującą z komplementarną sekwencją do sekwencji natywnego DNA kodującej dowolny z (a) do (f) w wysoce ostrych warunkach i która oddziaływuje z integryną av i/lub CD44;

(i) muteiny dowolnego z (a) do (f), w której dowolna zmiana w sekwencji aminokwasowej jest konserwatywną substytucją aminokwasów w sekwencji aminokwasowej z (a) do (f) i która oddziaływuje z integryną av i/lub CD44;

(j) soli lub izoformy, białka fuzyjnego, funkcjonalnej pochodnej, aktywnej frakcji lub koliście permutowanej pochodnej dowolnego z (a) do (f), które oddziaływują z integryną av i/lub CD44.

Zgodnie z zastosowaniem według wynalazku osteopontyna korzystnie jest przyłączona do cząsteczki nośnika, peptydu lub białka, która wspomaga przechodzenie przez barierę krew-mózg, korzystniej jest modyfikowana PEG lub jest białkiem fuzyjnym obejmującym immunoglobulinę (Ig).

W korzystnej postaci wykonania lek otrzymany zgodnie z zastosowaniem według wynalazku ponadto obejmuje interferon, korzystnie interferon-β, do stosowania jednocześnie, kolejno lub osobno. Ponadto zgodnie z zastosowaniem według wynalazku osteopontyna jest korzystnie stosowana w ilości 0,001 do 100 mg/kg ciężaru ciała lub 1 do 10 mg/kg ciężaru ciała, lub 5 mg/kg ciężaru ciała.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie cząsteczki kwasu nukleinowego do wytwarzania leku do leczenia i/lub zapobiegania chorobie neurologicznej, przy czym cząsteczka kwasu nukleinowego obejmuje sekwencję kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd obejmujący sekwencję aminokwasową osteopontyny określoną w punktach (a) - (j) powyżej. Zgodnie z zastosowaniem cząsteczka kwasu nukleinowego ponadto obejmuje korzystnie sekwencję wektora ekspresyjnego. Korzystniej lek otrzymany zgodnie z zastosowaniem według wynalazku jest przeznaczony do terapii genowej.

Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie komórki zmodyfikowanej genetycznie do wytwarzania osteopontyny do wytwarzania leku do leczenia i/lub zapobiegania chorobie neurologicznej wybranej z grupy składającej się z urazowego uszkodzenia nerwu, neuropatii obwodowej, neuropatii cukrzycowej, stwardnienia rozsianego (SM) oraz choroby neurologicznej spowodowanej wrodzonym zaburzeniem metabolicznym, przy czym osteopontyna jest wybrana z grupy określonej w punktach (a) - (j) powyżej.

Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja farmaceutyczna zawierająca osteopontynę i interferon-β, ewentualnie razem z jedną lub więcej farmaceutycznie dopuszczalnymi zaróbkami, do leczenia i/lub zapobiegania chorobie neurologicznej wybranej z grupy składającej się z urazowego uszkodzenia nerwu, neuropatii obwodowej, neuropatii cukrzycowej, stwardnienia rozsianego (SM) oraz choroby neurologicznej spowodowanej wrodzonym zaburzeniem metabolicznym, przy czym osteopontyna jest wybrana z grupy określonej w punktach (a) - (j) powyżej.

Krótki opis rysunków

Fig. 1A przedstawia histogram opisujący poziomy wyrażania osteopontyny po różnych okresach leczenia kuprizonem (cup.; ang. cuprizone), zmierzone metodą TaqMan®. 3/5w.Cup = trzy lub pięć tygodni leczenia kuprizonem, 5w.cup + 1/3/6w. = pięć tygodni leczenia kuprizonem i po odstawieniu kuprizonu jeden/trzy lub sześć tygodni zdrowienia.

PL 211 763 B1

Fig. 1B przedstawia krotność regulacji osteopontyny, mRNA MBP i PLP w porównaniu do kontrolnych poziomów C1 zmierzonych metodą TaqMan® na różnych etapach rozwoju móżdżku. C1 do 20 = dni móżdżku po urodzeniu od 1 do 20, CA = móżdżek dorosły.

Fig. 2 schematycznie przedstawia strukturę osteopontyny i jej znanych izoform, jak również konstruktów C i N-końcowych.

Fig. 3 schematycznie przedstawia plazmid Pac zawierający sekwencję kodującą osteopontynę.

Fig. 4 przedstawia histogram ilustrujący krotność regulacji „w górę mRNA dla osteopontyny w komórkach oligodendrocytów linii oli-neu traktowanych cAMP przez 6 godzin (1), 2 dni (2), 6 dni (3) lub 10 dni (4), w porównaniu do kontroli. Kolumny 5 i 6 przedstawiają poziomy mRNA dla osteopontyny z eksperymentu z kuprizonem. (5): 3 tygodnie traktowania kuprizonem, (6): 5 tygodni traktowania kuprizonem.

Fig. 5 przedstawia schematycznie plazmid pDEST 12.2 zawierający sekwencję kodującą osteopontynę.

Fig. 6 przedstawia schematycznie plazmid pDEST 12.2 zawierający sekwencję kodującą osteopontynę oraz sekwencję kodującą EGFP, znacznik fluorescencyjny.

Fig. 7 przedstawia schematycznie plazmid pDEST 12.2 zawierający sekwencję kodującą osteopontynę z HIS-tag.

Fig. 8 przedstawia proliferację komórek linii oli-neu po głodzie insulinowym i 24 godzinach traktowania osteopontyną wyrażaną przez baculowirusa (Baculo-OPN) lub komórek HEK wyrażających osteopontynę (HEK-OPN). Odczyt jest fluorescencją Alamar Blue, barwnika do barwienia żywych komórek.

Fig. 9 przedstawia krzywą zależności od dawki proliferacji komórek oli-neu po głodzie insulinowym, po 24 godzinach traktowania baculowirusem wyrażającym osteopontynę (BAC-OPN) lub komórkami HEK wyrażającymi OPN (HEK-OPN).

Fig. 10 przedstawia proliferację komórek oli-neu po głodzie insulinowym i traktowaniu baculowirusem wyrażającym pełnej długości osteopontynę (BacOPN) lub N-końcowy fragment OPN (N-końcowy BacOPN).

Fig. 11 przedstawia immunohistochemię MBP w mieszanej hodowli korowej traktowanej 100 nM baculowirusa wyrażającego rekombinowaną osteopontynę. A= kontrola, B= traktowane OPN, C= powiększenie B, D= kolejne pole mieszanych komórek korowych traktowanych OPN, gdzie nie widać żadnych aksonów.

Fig. 12 przedstawia wzrost białka MBP w mielinizacji, w mieszanych hodowlach korowych po traktowaniu LIF i baculowirusem wyrażającym osteopontynę, zmierzony za pomocą testu ELISA.

Fig. 13 przedstawia proliferację komórek CG4 po leczeniu różnymi dawkami (10 pM, 10 nM, 100 nM) in vitro fosforylowanej E. coli wyrażającej osteopontynę (OPN-E-coli) lub bakulowirusem wyrażającym osteopontynę (OPN Bac).

Fig. 14 przedstawia okołonaczyniowy naciek zapalny obecny w rdzeniu kręgowym myszy z EAE, podskórnie traktowanej vehiculum (PBS), vehiculum + 0,1% BSA, 1, 10 lub 100 ąg/kg AS900011 (osteopontyna) lub kombinacją 100 ąg/kg AS900011 i 20000 U/mysz mysiego interferonu beta (mlFNf) lub 20000 U/mysz samego mIFNf.

Fig. 15 przedstawia procent zdemielinizowanych okolic obecnych w rdzeniu kręgowym EAE myszy traktowanych podskórnie vehiculum (PBS), vehiculum + 0,1% BSA, 1, 10, lub 100 ąg/kg AS900011 (osteopontyny) lub kombinacją 100 ąg/kg AS900011 i 20000 U/mysz mysiego interferonu beta (mlFNf) lub 20000 U/mysz samego mlFNf.

Fig. 16 przedstawia kliniczne wyniki na koniec leczenia, naciek zapalny i demielinizację u myszy z EAE traktowanych podskórnie vehiculum (PBS), vehiculum plus 0,1% BSA, 1, 10, lub 100 ąg/kg AS900011 (osteopontyny) lub kombinacją 100 ąg/kg AS900011 i 20000 U/mysz mysiego interferonu beta (mlFNf) lub 20000 U/mysz samego mlFNf.

Fig. 17 przedstawia ciężar ciała myszy z neuropatią indukowaną zmiażdżeniem nerwu kulszowego z vehiculum, 1, 10 lub 100 ąg/kg osteopontyny (Ost), 10 ąg/kg związku (4-MC) jako kontroli pozytywnej lub 100 ąg/kg denaturowanej osteopontyny (Ost-D).

Fig. 18 przedstawia amplitudę składowej mięśniowej potencjału czynnościowego u myszy z neuropatią traktowanej vehiculum, 1, 10 lub 100 ąg/kg osteopontyny (Ost), 10 ąg/kg związku (4-MC) jako kontroli pozytywnej lub 100 ąg/kg denaturowanej osteopontyny (Ost-D).

PL 211 763 B1

Fig. 19 przedstawia opóźnienie składowej mięśniowej potencjału czynnościowego myszy z neuropatią traktowanej vehiculum, 1, 10 lub 100 μg/kg osteopontyny (Ost), 10 μg/kg związku (4-MC) jako kontroli pozytywnej lub 100 μg/kg denaturowanej osteopontyny (Ost-D).

Fig. 20 przedstawia czas trwania składowej mięśniowej potencjału czynnościowego myszy z neuropatią traktowanej vehiculum, 1, 10 lub 100 μg/kg osteopontyny (Ost), 10 μg/kg związku (4-MC) jako kontroli pozytywnej lub 100 μg/kg denaturowanej osteopontyny (Ost-D).

Fig. 21 przedstawia procent zdegenerowanych włókien u myszy z neuropatią traktowanej vehiculum, 1, 10 lub 100 μg/kg osteopontyny (Ost), 10 μg/kg związku (4-MC) jako kontroli pozytywnej lub 100 μg/kg denaturowanej osteopontyny (Ost-D).

Fig. 22 przedstawia procent całkowitą liczbę włókien widocznych w polu widzenia u myszy z neuropatią traktowanej vehiculum, 1, 10 lub 100 μg/kg osteopontyny (Ost), 10 μg/kg związku (4-MC) jako kontroli pozytywnej lub 100 μg/kg denaturowanej osteopontyny (Ost-D).

Szczegółowy opis wynalazku

Wynalazek niniejszy opiera się na stwierdzeniu, że osteopontyna jest wyrażana w zróżnicowany sposób podczas różnicowania się oligodendrocytów i podczas rozwoju móżdżku. Ponadto stwierdzono, że ekspresja cDNA dla osteopontyny w oligodendrocytach prowadzi do wyróżnicowania fenotypu tych komórek in vitro. Podczas ekspresji osteopontyny, oligodendrocyty wykazują fenotyp podobny do fenotypu różnicujących, mielinizujących komórek. Dodatkowo do tych stwierdzeń in vitro, wykazano, że osteopontyna, a w szczególności kombinacja osteopontyny z interferonem β, ma korzystne działanie w ustalonym modelu stwardnienia rozsianego. W eksperymentalnym modelu neuropatii obwodowej, osteopontyna ujawniała korzystne działanie na aktywność nerwową i znacząco zmniejszyła stopień degeneracji oraz nasiliła zasięg mielinizacji.

Dowody eksperymentalne przedstawione tutaj dostarczają nowej możliwości leczenia chorób neurologicznych, w szczególności związanych z funkcją komórek nerwowych i glejowych. Te stwierdzenia są szczególnie zaskakujące, ponieważ według publikacji WO 00/63241 zalecano blokowanie osteopontyny celem leczenia stwardnienia rozsianego.

Zatem, wynalazek niniejszy odnosi się do zastosowania osteopontyny, lub agonisty jej aktywności, do wytwarzania leku do leczenia i/lub zapobiegania chorobom neurologicznym.

Termin „osteopontyna, w znaczeniu tu stosowanym odnosi się do pełnej długości ludzkiej osteopontyny, mającej sekwencję aminokwasową znaną od późnych lat osiemdziesiątych (Oldberg i in., 1986; Keifer i in., 1989). Sekwencję ludzkiej osteopontyny opisano tutaj jako SEKW Nr ID: 1 w załączonej liście sekwencji. Termin „osteopntyna, w znaczeniu tu stosowanym, ponadto odnosi się do dowolnej osteopontyny pochodzącej od zwierząt, takiej jak osteopontyna mysia, bydlęca lub szczurza, o ile występuje wystarczające prawdopodobieństwo dla podtrzymania aktywności osteopontyny i o ile powstała cząsteczka nie jest immunogenna dla ludzi.

Termin „osteopontyna, w znaczeniu tu stosowanym, ponadto odnosi się do biologicznie aktywnych mutein i fragmentów, takich jak naturalnie występujące izoformy osteopontyny. Osteopontyna jest wyrażana w funkcjonalnie odrębnych postaciach, rozróżnialnych na poziomie transkrypcji (alternatywne składanie RNA) i modyfikacji potranslacyjnych (fosforylacji, glikozylacji). Do tej pory znane są trzy odmiany OPN wynikające z alternatywnego składania RNA, oznaczone jako OPN-a (zwana również osteopontyną pełnej długości), OPN-b i OPN-c (SEKW Nr ID: 1, 2 i 3 w załączonej liście sekwencji, również przedstawione na Fig. 2). Izoformy opisali np. Kon i in., (2000) a scharakteryzowali np. Saitoh i in., (995) i Kon i in., (2002).

Cięcie trombiną prowadzi do powstania in vivo dwóch fragmentów proteolitycznych obejmujących fragmenty N- i C-końcowe białka. Dla działania osteopontyny może być istotna fosforylacja, zwłaszcza C-końcowego fragmentu. Termin „osteopontyna, w znaczeniu tu stosowanym, obejmuje zatem również te fragmenty proteolityczne i odmiennie fosforylowane postaci osteopontyny.

Termin „osteopontyna, w znaczeniu tu stosowanym, ponadto obejmuje izoformy muteiny, białka fuzyjne, pochodne funkcjonalne, aktywne frakcje lub fragmenty lub koliste zmienione pochodne lub ich sole. Te izoformy, muteiny, białka fuzyjne, pochodne funkcjonalne, aktywne frakcje lub fragmenty lub koliste permutacje zachowują biologiczne właściwości osteopontyny. Korzystnie mają właściwości biologiczne, porównywalne z naturalną osteopontyną, w szczególności oddziaływują z integryną av i/lub CD44.

Termin „agonista aktywności osteopontyny, w znaczeniu tu stosowanym, odnosi się do cząsteczki stymulującej lub naśladującej działania osteopontyny, takiej jak agonistyczne przeciwciała przeciwko receptorowi osteopontyny lub agoniści o małej masie cząsteczkowej aktywujący sygnaliza18

PL 211 763 B1 cję przez receptor osteopontyny. Osteopontyna działa przez co najmniej dwie grupy receptorów. Po pierwsze reaguje z receptorami av-integryny (integryn avp3 i avp5) przez motyw przylegania komórek (Arg-Gly-Asp) RGD przy dodatnim wpływie manganu (Kunicki i in., 1997). Po drugie reaguje z odmianą CD44 izoform v6-v10. Uważa się, że C-końcowy fragment osteopontyny jest zaangażowany w interakcje z CD44, podczas gdy N-końcowy fragment osteopontyny uważa się za zaangażowany w interakcje z receptorami dla integryn, proliferację, przeżycie i różnicowanie makrofagów. N-końcowy fragment osteopontyny indukuje również uwalnianie IL-12 i IL-10. Dowolny agonista, stymulator lub wzmacniacz tych receptorów jest objęty, stosowanym tu pojęciem, „agonisty aktywności osteopontyny.

Termin „agonista aktywności osteopontyny, w znaczeniu tu stosowanym, odnosi się ponadto do czynników nasilających działania zachodzące za pośrednictwem osteopontyny, takie jak promowanie przylegania komórek do składników substancji międzykomórkowej, morfogeneza komórek linii oligodendrocytów do komórek wytwarzających mielinę, promocja rekrutacji, proliferacja, różnicowanie lub dojrzewanie komórek linii oligodendrocytów (takich jak komórki progenitorowe lub prekursorowe), zabezpieczanie komórek linii oligodendrocytów przed apoptozą i uszkodzeniem komórkowym.

Terminy „leczenie i „zapobieganie, w znaczeniu tu stosowanym, powinny być rozumiane jako zapobieganie, hamowanie, łagodzenie, polepszanie lub odwracanie jednego lub kilku objawów lub przyczyn choroby neurologicznej, jak również objawów, chorób lub powikłań towarzyszących chorobie neurologicznej. Gdy „leczy się chorobę neurologiczną, substancje podaje się po wystąpieniu choroby, „zapobieganie odnosi się do podawania substancji zanim pacjent zauważy objawy choroby.

Pojęcie „choroby neurologicznej, w znaczeniu tu stosowanym obejmuje wszystkie znane choroby lub zaburzenia neurologiczne, lub uszkodzenie CNS lub PNS, włączając w to te opisane szczegółowo w części opisu poświęconej stanowi techniki.

Choroby neurologiczne obejmują zaburzenia związane z dysfunkcją CNS lub PNS, takie jak choroby związane z neuroprzekaźnictwem, bólem głowy, urazem głowy, infekcji CNS, zaburzeniami nerwów wzrokowych i czaszkowych, funkcją i dysfunkcją płatów mózgowia, zaburzeniami ruchowymi, zamroczeniem i śpiączką, chorobami demielinizacyjnymi, delirium i otępieniem, wadami połączenia czaszkowo-szyjnego, zaburzeń napadowych, zaburzeń rdzenia kręgowego, zaburzeń snu, zaburzeń obwodowego układu nerwowego, choroby naczyń mózgowych lub zaburzeń mięśniowych. Definicje tych zaburzeń są na stronie:

http://www.merck.com/pubs/mmanual/sectionl4/sec.htm.

Korzystnie, choroby neurologiczne są wybrane z grupy obejmującej urazowe uszkodzenie nerwów, udar, choroby demielinizacyjne CNS i PNS i choroby neurodegeneracyjne.

Urazowe uszkodzenie nerwów może dotyczyć CNS i PNS, może być urazem mózgu lub rdzenia kręgowego, włączając w to porażenie kończyn dolnych, jak opisano powyżej.

Udar może być wywołany niedotlenieniem lub niedokrwieniem mózgu. Jest nazywany również chorobą naczyń mózgowych lub incydentem. Udar może obejmować utratę funkcji mózgu (ubytki neurologiczne) spowodowaną zanikiem krążenia w okolicach mózgu. Zanik krążenia może być spowodowany zakrzepami powstającymi w mózgu, lub fragmentami blaszki miażdżycowej lub innego materiału zatorowego, który przedostaje się do mózgu z innych okolic ciała (zator). Krwawienie do mózgu (krwotok) może wywołać objawy naśladujące udar. Najczęstszą przyczyną udaru jest udar wtórny do miażdżycy (zakrzepicy mózgowej) i z tego powodu wynalazek niniejszy dotyczy również leczenia miażdżycy.

Obwodowa neuropatia może być zespołem związanym z utratą czucia, słabością mięśni, osłabieniem głębokich odruchów ścięgnistych i objawów naczynioruchowych, występujących pojedynczo lub w kombinacjach. Neuropatia może dotyczyć jednego nerwu (mononeuropatia), dwu lub kilku nerwów w oddzielnych okolicach (mnoga neuropatia) lub wielu nerwów równocześnie (polineuropatia). Pierwotnie zajęte mogą być aksony (np. w cukrzycy, chorobie z Lyme, mocznicy lub przy czynnikach toksycznych) albo komórki Schwanna (np. w ostrej lub przewlekłej polineuropatii zapalnej, leukodystrofiach lub zespole Guillain-Barre). Ponadto, neuropatie, które mogą być leczone dzięki rozwiązaniom według wynalazku, mogą być spowodowane opóźnioną toksycznością, zastosowaniem dapsonu, ukąszeniem przez kleszcza, porfirią lub zespołem Guillain-Barre oraz mogą one pierwotnie dotyczyć włókien motorycznych. Inne, jak na przykład te spowodowane nowotworowym zapaleniem korzeni grzbietowych rdzenia, trądem, AIDS, cukrzycą lub przewlekłym zatruciem pirydoksyną, mogą pierwotnie dotyczyć korzeni grzbietowych rdzenia lub włókien czuciowych, wywołując objawy czuciowe. Mogą być również zajęte nerwy czaszkowe, tak jak na przykład w zespole Guillain-Barre, chorobie z Lyme, cukrzycy i błonicy.

PL 211 763 B1

Choroba Alzheimera jest chorobą obejmującą pogorszenie funkcji umysłowych na skutek zmian w tkance mózgowej. Mogą one obejmować obkurczenie tkanek mózgu, pierwotne degeneracyjne otępienie i rozlany zanik mózgu. Choroba Alzheimera jest również nazywana otępieniem starczym typu Alzheimera (SDAT).

Choroba Parkinsona jest zaburzeniem mózgu obejmującym drżenia i trudności w chodzeniu, poruszaniu się i koordynacji. Choroba jest związana z uszkodzeniem części mózgu kontrolującej ruchy mięśni i jest również nazywana drżączką poraźną.

Choroba Huntingtona jest wrodzoną, dziedziczoną autosomalnie dominująco chorobą neurologiczną.

Stwardnienie zanikowe boczne, ALS, jest zaburzeniem powodującym postępującą utratę kontroli nerwowej nad mięśniami zależnymi od woli włączając w to zniszczenie komórek nerwowych w mózgu i rdzeniu kręgowym. Stwardnienie zanikowe boczne, nazywane także chorobą Lou Gehriga, jest zaburzeniem obejmującym utratę władzy i kontroli nad mięśniami.

Stwardnienie rozsiane (SM) jest zapalną demielinizacyjną chorobą ośrodkowego układu nerwowego (CNS) charakteryzującą się nawrotowo-zwalniającym lub postępowym przebiegiem. MS jest nie tylko chorobą demielinizacyjną. Jej odpowiednikiem w obwodowym układzie nerwowym (PNS) jest przewlekła demielinizacyjna polineuropatia (CIDP). Dodatkowo występują ostre jednofazowe zaburzenia, takie jak zapalna demielinizacyjna polineuropatia nazwana zespołem Guillain-Barre (GBS) w PNS i ostre rozsiane zapalenie mózgu i rdzenia (ADEM) w CNS.

Dalsze zaburzenia neurologiczne składają się z neuropatii z anormalną mielinizacją, takich jak te wyliczone powyżej, np. zespołu cieśni nadgarstka. Urazowe uszkodzenie nerwu może towarzyszyć powikłaniom ortopedycznym w zakresie kręgosłupa.

Zaburzenia neurologiczne mogą ponadto być następstwem wrodzonych chorób metabolicznych. W korzystnej realizacji wynalazku zaburzenia neurologiczne są zatem spowodowane wrodzonym deficytem metabolicznym.

Wrodzone zaburzenia metaboliczne obejmują np. fenyloketonurię i inne aminoacydurie, chorobę Tay-Sachsa, Niemanna-Picka i chorobę Gauchera, zespół Hurlera; chorobę Krabbego i inne leukodystrofie. Mogą one uszkadzać rozwijającą się osłonkę mielinową głównie w CNS.

Choroby neurologiczne spowodowane wrodzonymi zaburzeniami metabolicznymi również przedstawiono szczegółowo w części opisu dotyczącej stanu techniki.

Słabiej poznane choroby neurologiczne są także w zakresie niniejszego wynalazku, takie jak nerwiakowłóknikowatość lub rozsiana atrofia układowa (MSA). Dalsze zaburzenia, które mogą być leczone dzięki rozwiązaniom według wynalazku, opisano szczegółowo powyżej części poświęconej stanowi techniki.

Chorobą neurologiczną może być obwodowa neuropatia, korzystniej neuropatia cukrzycowa. Chemioterapia skojarzonych neuropatii jest także korzystna.

Określenie „neuropatia cukrzycowa odnosi się do każdego rodzaju neuropatii cukrzycowej lub do jednego lub kilku objawu(ów) lub zaburzenia(ń) towarzyszących lub spowodowanych przez neuropatię cukrzycową lub powikłań cukrzycy dotyczących nerwów, jak szczegółowo opisano powyżej. Neuropatia cukrzycowa może być polineuropatią. W cukrzycowej polineuropatii wiele nerwów jest równocześnie dotkniętych chorobą. Neuropatia cukrzycowa może także być mononeuropatią. W ogniskowej mononeuropatii, na przykład, choroba dotyka pojedynczy nerw, taki jak nerw czaszkowy okoruchowy lub dodatkowy. To może być także mnoga mononeuropatia, gdy dwa lub kilka nerwów jest dotkniętych chorobą w różnych miejscach.

Zaburzeniem neurologicznym może być choroba demielinizacyjna. Choroby demielinizacyjne korzystnie obejmują stany demielinizacyjne w CNS, takie jak ostre rozsiane zapalenie mózgu i rdzenia (ADEM) i stwardnienie rozsiane (SM), jak również choroby demielinizacyjne obwodowego układu nerwowego (PNS). Te ostatnie składają się z takich chorób jak przewlekła zapalna demielinizacyjna polineuropatia (CIDP i ostre, jednofazowe zaburzenia takie jak zapalna demielinizacyjna polineuropatia zwana zespołem Guillain-Barre (GBS).

Ponadto rozwiązania według wynalazku odnoszą się do leczenia i/lub zapobiegania chorobie neurodegeneracyjnej. Choroba neurodegeneracyjna jest wybrana z grupy obejmującej chorobę Alzheimera, chorobę Parkinsona, chorobę Huntingtona i ALS.

Osteopontyna jest peptydem, polipeptydem lub białkiem wybranym z grupy składającej się z:

a) Polipeptydu obejmującego SEKW. Nr ID: 1;

b) Polipeptydu obejmującego aminokwasy 1 do 168 lub 170 SEKW. Nr ID: 1;

PL 211 763 B1

c) Polipeptydu obejmującego aminokwasy 1 do 16 i 170 do 314 SEKW. Nr ID: 1;

d) Polipeptydu obejmującego aminokwasy 170 do 314 SEQ ID NO: 1;

e) Polipeptydu obejmującego SEKW. Nr ID: 2;

f) Polipeptydu obejmującego SEKW. Nr ID: 3;

g) Muteiny dowolnej z (a) do (f),w której sekwencja aminokwasowa jest co najmniej w 40% lub 50% lub 60% lub 70% lub 80% lub 90% identyczna z co najmniej jedną z sekwencji w (a) do (f);

h) Muteiny dowolnej z (a) do (f), która jest kodowana przez sekwencję DNA, która hybrydyzuje z komplentarną sekwencją natywnego DNA kodującym dowolną z (a) do (f) w umiarkowanie ostrych warunkach lub w silnie ostrych warunkach;

i) Muteinę dowolną z (a) do (f), w której każda zmiana w sekwencji aminokwasowej jest substytucją konserwatywną aminokwasu w sekwencji aminokwasowej od (a) do (f);

j) soli lub izoformy, białka fuzyjnego, funkcjonalnej pochodnej, aktywnej frakcji lub kolistej zmienionej pochodnej dowolnej z (a) do (f).

Aktywne frakcje lub fragmenty mogą obejmować różne części lub domeny każdej z izoform osteopontyny, takie jak część N-końcowa lub część C-końcowa lub dowolna z OPN-a, -b, lub -c, jak pokazano na Fig. 2. Motyw GRGDS może być obecny lub nieobecny, lub zmutowany. Miejsce wiążące heparynę może być tak zmutowane, że osteopontyna może być go pozbawiona. Pełnej długości osteopontyna lub jej dowolny aktywny fragment może być fosforylowany w jednej lub wielu resztach serynowych, takich jak reszty w pozycjach: 8, 10, 11, 33, 46, 47, 60, 62, 65, 83, 86, 89, 92, 101, 104,

107, 110, 113, 153, 155, 175, 179, 199, 203, 208, 212, 218, 223, 227, 238, 242, 247, 251, 254, 259,

264, 275, 287, 292, 294, 295. Dodatkowo fosforylacja reszt serynowych może być zmieniona na fosforylację reszt glutaminianowych, w celu naśladowania fosforylacji.

Dla specjalisty jest to zrozumiałe, że nawet mniejsze części osteopontyny mogą być wystarczające do wykazania jej funkcji, takie jak aktywny peptyd obejmujący niezbędne dla funkcji osteopontyny reszty aminokwasowe.

Specjalista dalej oceni, że muteiny, sole, izoformy, białka fuzyjne, funkcjonalne pochodne osteopontyny, aktywne frakcje lub koliste permutacje osteopontyny zachowają podobną lub jeszcze lepszą aktywność biologiczną jak osteopontyna. Biologiczna aktywność osteopontyny i mutein, izoform, białek fuzyjnych lub funkcjonalnych pochodnych, aktywnych frakcji lub fragmentów, kolistych permutacji lub ich soli, może być zmierzona w teście hodowli łączonych, tak jak opisano poniżej w Przykładzie 8. Mieszane hodowle korowe zawierające oligodendrocyty, jak również inne komórki pochodzące z CNS (takie jak neurony, astrocyty, mikroglej) i podczas inkubacji z OPN lub muteiną, izoformą, fragmentem, aktywną frakcją, funkcjonalną pochodną lub solą i indukują lub regulują w górę typowe geny zaangażowane w mielinizację, takie jak PO, MBP lub MAG. Ekspresję tych genów można mierzyć metodą ilościowej analizy RT-PCR w czasie rzeczywistym (TaqMan® RT-PCR), którą wyjaśniono szczegółowo w przykładach poniżej. Kolejnym prostym testem do mierzenia aktywności OPN jest test proliferacji oligodendrocytów, obejmujący inkubację odpowiedniej linii komórkowej oligodendrocytów, takiej jak oli-neu lub komórek CG4, z OPN lub muteiną, izoformą, fragmentem, aktywną frakcją, funkcjonalną pochodną lub solą, jak opisano poniżej na przykład, w Przykładzie 7.

Korzystne aktywne frakcje posiadają aktywność, która jest jednakowa lub większa od aktywności osteopontyny o pełnej długości, lub mają dodatkowe zalety, takie jak lepsza stabilność lub niska toksyczność lub immunogenność, lub są łatwiejsze do produkcji w dużych ilościach, lub łatwiejsze do oczyszczenia. Dla specjalisty jest oczywiste, że muteiny, aktywne fragmenty i funkcjonalne pochodne mogą być wytwarzane przez klonowanie odpowiedniego cDNA we właściwych plazmidach i sprawdzenie ich w teście hodowli łączonych jak opisano powyżej.

Białka mogą być glikozylowane lub nieglikozylowane, mogą pochodzić z naturalnych źródeł, takich jak płyny ustrojowe lub mogą korzystniej być wytwarzane na drodze rekombinacji. Wyrażanie rekombinantów może zachodzić w prokariotycznych układach ekspresyjnych, takich jak E. coli lub eukariotycznych, takich jak komórki owadów i korzystnie w ssaczych układach ekspresyjnych, takich jak komórki CHO lub komórki HEK.

W znaczeniu tu stosowanym termin „muteiny oznacza analogi osteopontyny, w których jedną lub więcej reszt aminokwasowych naturalne osteopontyny zastąpiono innymi resztami aminokwasowymi lub usunięto, lub jedną lub kilka reszt aminokwasowych dodano do naturalnej sekwencji osteopontyny, bez znacznej zmiany aktywności otrzymanych produktów w porównaniu z naturalnym typem osteopontyny. Te muteiny wytwarza się znanymi metodami syntezy i/lub przez miejscowo ukierunkowane techniki mutacji lub każdą inną znaną, nadającą się do tego techniką.

PL 211 763 B1

Muteiny osteopontyny, które mogą być zastosowane w rozwiązaniach według wynalazku lub kodujący je kwas nukleinowy, obejmują skończony zestaw zasadniczo odpowiednich sekwencji jako zastępstwo peptydów lub polinukleotydów, które mogą być rutynowo uzyskane przez specjalistę, bez wykonywania nadmiernych eksperymentów, w oparciu o jego wiedzę i podane tu wskazówki.

Muteiny obejmują białka kodowane przez kwasy nukleinowe, takie jak DNA lub RNA, które hybrydyzują z DNA lub RNA, kodującym OPN, w umiarkowanych lub bardzo ostrych warunkach. Określenie „ostre warunki odnosi się do hybrydyzacji i późniejszych warunków płukania, które specjalista określi zwykle jako „ostre. Patrz Ausubel i inn., Current Protocols in Molecular Biology, supra, Interscience, N.Y., §§6.3 i 6.4 (1987, 1992), i Sambrook i in. (Sambrook, J.C.,Fritsch, E.F., i Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).

Bez ograniczeń, przykłady ostrych warunków obejmują płukanie w 12-20°, poniżej Tm obliczonej dla badanej hybrydy, np., 2 x SSC i 0,5% SDS przez 5 minut, 2 x SSC i 0,1% SDS przez 15 minut; 0,1 x SSC i 0,5% SDS W 37°C przez 30-60 minut, a potem 0,1xSSC i 0,5% SDS w 68°C przez 30-60 minut. Dla specjalisty jest zrozumiałe, że ostrość warunków zależy także od długości sekwencji DNA, sond oligonukleotydowych (takich jak 10-40 zasad) lub mieszanych sond oligonukleotydowych. Jeśli stosuje się mieszane sondy, korzystniej jest zastosować chlorek tetrametyloamoniowy (TMAC) zamiast SSC. Patrz powyżej, Ausubel.

Korzystnie dowolna z mutein może mieć przynajmniej 40% identycznych lub homologicznych sekwencji z sekwencją oznaczoną SEKW Nr Id: 1, 2 lub 3 na załączonej liście sekwencji. Korzystniej, ma ona przynajmniej 50%, przynajmniej 60%, przynajmniej 70%, przynajmniej 80% lub najbardziej korzystnie przynajmniej 90% identycznych lub homologicznych z nią sekwencji.

Identyczność odzwierciedla zależność pomiędzy dwoma lub więcej sekwencjami polipeptydowymi lub dwoma lub więcej sekwencjami polinukletydowymi, określoną przez porównanie sekwencji. Ogólnie „identyczne oznacza dokładne odpowiadanie nukleotydu nukleotydowi lub aminokwasu aminokwasowi w dwóch polinukleotydach lub dwóch sekwencjach polipeptydowych, odpowiednio na całej długości porównywanych sekwencji.

Dla sekwencji, dla których nie znaleziono dokładnego odpowiednika, można określić „% identyczności. Na ogół dwie porównywane sekwencje dopasowuje się tak, aby uzyskać największą zgodność pomiędzy nimi. Może to obejmować wstawienie „przerwy albo do jednej albo do obu sekwencji, w celu zwiększenia stopnia dopasowania. % identyczności może być określony w odniesieniu do całej długości obu porównywanych sekwencji (tak zwana zgodność ogólna), co jest szczególnie odpowiednie dla sekwencji o tej samej lub bardzo podobnej długości lub w odniesieniu do krótszych, określonych długości (tak zwana zgodność lokalna), co jest bardziej odpowiednie dla sekwencji o różnej długości.

Metody porównania identyczności i homologii dwóch lub więcej sekwencji są dobrze znane specjalistom. Tak na przykład, programy dostępne w Wisconsin Sequence Analysis Package, wersja 9.1 (Devereux J i in., 1984), na przykład programy BESTFIT i GAP, mogą być zastosowane do określania % identyczności pomiędzy dwoma polinukleotydami i % identyczności i % homologii pomiędzy dwoma sekwencjami polipeptydowymi. BESTFIT stosuje algorytm „miejscowej homologii Smith'a i Waterman'a (1981) i znajduje pojedynczy region najodpowiedniejszy pod względem podobieństwa pomiędzy dwiema sekwencjami. Inne programy do określenia identyczności i/lub podobieństwa pomiędzy sekwencjami są także znane specjalistom, na przykład grupa programów BLAST (Altschul S F i in., 1990, Altschul S F i in., 1997, dostępne na stronie głównej NCBI w www.ncbi.nlm.nih.gov) i FASTA (Pearson W R, 1990; Pearson 1988).

Korzystnymi zmianami w muteinach są zmiany, nazywane podstawieniami „konserwatywnymi. Podstawienia konserwatywne aminokwasów w polipeptydach osteopontynowych mogą obejmować równoznaczne aminokwasy z grupy o wystarczająco podobnych właściwościach fizykochemicznych, tak że substytucja pomiędzy członkami grupy zachowuje biologiczne funkcje cząsteczki (Grantham, 1974). Jest jasne, że wstawienia i delecje aminokwasów mogą także być wprowadzone w sekwencjach zdefiniowanych powyżej bez zmiany ich funkcji, szczególnie jeśli wstawienia lub delecje dotyczą tylko kilku aminokwasów, np. mniej niż trzydziestu i korzystnie mniej niż dziesięciu i nie usuwają ani nie przemieszczają aminokwasów, które są istotne dla konformacji funkcjonalnej, np. reszt cysteinowych. Białka i muteiny wytwarzane przez takie delecje i/lub wstawienia wchodzą w zakres niniejszego wynalazku.

Korzystnie, równoznaczne grupy aminokwasowe zdefiniowano w tabeli I. Bardziej korzystnie, równoważne grupy aminokwasowe zdefiniowano w tabeli II; i najbardziej korzystnie, równoznaczne grupy aminokwasowe zdefiniowano w tabeli III.

PL 211 763 B1

T A B E L A I Aminokwas	Korzystne Grupy Równoznacznych Aminokwasów Równoznaczna Grupa
Ser	Ser, Thr, Gly, Asn
Arg	Arg, Gln, Lys, Glu, His
Leu	Ile, Phe, Tyr, Met, Val, Leu
Pro	Gly, Ala, Thyr, Pro
Thr	Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gln, Thr
Ala	Gly, Thr, Pro, Ala
Val	Met, Tyr, Phe, Ile, Leu, Val
Gly	Ala, Thr, Pro, Ser, Gly
Ile	Met, Tyr, Phe, Val, Leu, Ile
Phe	Trp, Met, Tyr, Ile, Val, Leu, Phe
Tyr	Trp, Met, Phe, Ile, Val, leu, Tyr
Cys	Ser, Thr, Cys
His	Glu, Lys, Gln, Thr, Arg, His
Gln	Glu, Lys, Asn, His, Thr, Arg, Gln
Asn	Gln, Asp, Ser, Asn
Lys	Glu, Gln, His, Arg, Lys
Asp	Glu, Asn, Asp
Glu	Asp, Lys, Asn, Gln, His, Arg, Glu
Met	Phe, Ile, Val, Leu, Met
Trp	Trp
T A B E L A II Aminokwas	Bardziej Korzystne Grupy Równoznacznych Aminokwasów Równoznaczna Grupa
Ser	Ser
Arg	His, Lys, Arg
Leu	Leu, Ile, Phe, Met
Pro	Ala, Pro
Thr	Thr
Ala	Pro, Ala
Val	Val, Met, Ile
Gly	Gly
Ile	Ile, Met, Phe, Val, Leu
Phe	Met, Tyr, Ile, Leu, Phe
Tyr	Phe, Tyr
Cys	Cys, Ser
His	His, Gln, Arg
Gln	Glu, Gln, His
Asn	Asp, Asn
Lys	Lys, Arg
Asp	Asp, Asn
Glu	Glu, Gln
Met	Met, Phe, Ile, Val, Leu
Trp	Trp

PL 211 763 B1

T A B E L A III

Aminokwas	Najbardziej Korzystne Grupy Równoznacznych Aminokwasów Równoznaczna Grupa
Ser	Ser
Arg	Arg
Leu	Leu, Ile, Met
Pro	Pro
Thr	Thr
Ala	Ala
Val	Val
Gly	Gly
Ile	Ile, Met, Leu
Phe	Phe
Tyr	Tyr
Cys	Cys, Ser
His	His
Gln	Gln
Asn	Asn
Lys	Lys
Asp	Asp
Glu	Glu
Met	Met, Ile, Leu
Trp	Met

Przykłady wprowadzania substytucji aminokwasów, które mogą być stosowane w celu uzyskania mutein osteopontyny, polipeptydów lub protein, w celu zastosowania w niniejszym wynalazku obejmują kilka znanych sposobów, takich jak prezentowane w patencie USA nr 4,959,314, 4,588,585 i 4,737,462, Mark i in., 5,116,943 Koths i in., 4,965,195 Namen i in., 4,879,111 Chong i in., i 5,017,691 Lee i in., i białka podstawione lizyną przedstawione w patencie USA nr 4,904,584 (Shaw i in.).

Termin „białka fuzyjne odnosi się do polipeptydu obejmującego osteopontynę lub muteinę lub ich fragmenty połączone z innymi białkami, które np. mają wydłużony okres pozostawania w płynach ustrojowych. Osteopontyna może także być przyłączona do innego białka, polipeptydu lub tym podobnych np. immunoglobuliny lub jej fragmentów.

„Funkcjonalne pochodne, w znaczeniu tu stosowanym obejmują pochodne osteopontyny i jej muteiny i białka fuzyjne, które mogą być wytworzone z grup funkcyjnych, które występują jako boczne łańcuchy na resztach grup N- lub C-końcowych, środkami znanymi w technice i wchodzą w zakres wynalazku o ile są farmaceutycznie dopuszczalne tzn. nie niszczą aktywności białek, która jest zasadniczo podobna do aktywności osteopontyny i nie nadają kompozycji je zawierającej toksycznych właściwości.

Te pochodne mogą na przykład zawierać boczne łańcuchy z glikolu polietylenowego, które mogą maskować miejsca antygenowe i przedłużać okres przetrwania osteopontyny w płynach ustrojowych. Inne pochodne obejmują estry alifatyczne grup karboksylowych, amidy grup karboksylowych wytworzone w reakcji z amoniakiem lub z pierwszo- lub drugorzędową aminą, N-acylowe pochodne wolnych grup aminowych reszt aminokwasowych wytworzone z resztami acylowymi (np. grupami alkanoilowymi lub aroilokarbocyklicznymi) lub O-acylowe pochodne wolnych grup hydroksylowych (na przykład reszt serylowej lub treonylowej) utworzone z resztą acylową.

Jako „aktywne frakcje osteopontyny, mutein i białek fuzyjnych, niniejszy wynalazek obejmuje każdy fragment lub prekursor łańcucha polipeptydowego samej cząsteczki białka, lub razem z towa24

PL 211 763 B1 rzyszącymi cząsteczkami lub resztami z nią połączonymi np. z resztami cukrowymi lub fosforanowymi lub agregaty cząsteczki białka lub reszt cukrowych połączonych ze sobą, pod warunkiem, że omawiana frakcja ma zasadniczo podobne działanie jak osteopontyna.

Pojęcie „sole, w znaczeniu tu stosowanym, odnosi się zarówno do soli grup karboksylowych i soli addycyjnych z kwasami grup aminowych cząsteczki OPN lub jej analogów. Sole grup karboksylowych mogą być wytwarzane środkami znanymi w technice i mogą obejmować sole nieorganiczne, na przykład sodu, wapnia, amonu, żelaza lub cynku i podobne oraz sole wytworzone z zasadami organicznymi, na przykład z aminami, takimi jak trietanolamina, arginina lub lizyna, piperydyna, prokaina i podobne. Sole addycyjne z kwasami obejmują, na przykład, sole z kwasami mineralnymi, takimi jak na przykład kwas solny lub kwas siarkowy i sole z kwasami organicznymi, takimi jak na przykład kwas octowy lub kwas szczawiowy. Oczywiście każda taka sól musi zachowywać biologiczną aktywność OPN istotną dla niniejszego wynalazku, tj. wywierać działanie nasilające proliferację oligodendrocytów.

W korzystnej postaci wykonania wynalazku osteopontynę przyłączono do cząsteczki nośnika, peptydu lub białka, które poprawiają przepuszczalność bariery krew-mózg („BBB). Służy to właściwemu kierowaniu cząsteczek do miejsca działania w tych przypadkach, w których CNS jest objęty procesem chorobowym. Sposoby dostarczania leku przez BBB pociągają za sobą zakłócenie BBB, albo środkami osmotycznymi albo biochemicznie przy zastosowaniu substancji wazoaktywnych takich jak bradykinina. Inne strategie przenikania przez BBB mogą pociągać za sobą zastosowanie układów transportu endogennego, włączając w to transport zachodzący przy udziale przenośników takich jak glukoza i aminokwasy, transcytoza zależna od receptora dla insuliny lub transferyny; i aktywne transportery wpływu takie jak p-glikoproteiny. Strategie dla dostarczania leku poza BBB ponadto obejmują implantacje wewnątrzmózgowe.

Funkcjonale pochodne osteopontyny mogą być skoniugowane z polimerami w celu poprawy właściwości białka, takich jak stabilność, okres półtrwania, biodostępność, tolerancja przez organizm ludzki lub immunogenność. Dla osiągnięcia tego celu osteopontyna może być połączona np. z glikolem polietylenowym (PEG). Łączenie z PEG może być przeprowadzone za pomocą znanych metod, opisanych na przykład w WO 92/13095.

Zatem w korzystnej postaci wykonania wynalazku, osteopontyna jest połączona z PEG.

Białko fuzyjne może obejmować fuzję z immunoglobuliną (Ig). Fuzja może być bezpośrednia lub przez krótki peptyd łączący, który może być tak krótki jak 1 do 3 reszt aminokwasowych lub dłuższy, na przykład 13 reszt aminokwasowych. Wymieniony łącznik może być na przykład tripeptydem o sekwencji E-F-M (Glu-Phe-Met) lub 13-aminokwasową sekwencją łączącą, składającą się z Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met wprowadzoną na przykład pomiędzy sekwencję osteopontyny i sekwencję immunoglobuliny. Powstałe białko fuzyjne wykazuje lepsze właściwości, takie jak przedłużony okres pozostawania w płynach ciała (okres półtrwania) lub wzrost swoistej aktywności, wzrost poziomu ekspresji. Fuzja Ig może także ułatwiać oczyszczanie białka fuzyjnego.

W jeszcze innej korzystnej postaci wykonania, osteopontyna jest przyłączona do regionu stałego cząsteczki Ig. Korzystnie jest przyłączona do regionów łańcucha ciężkiego, takich jak na przykład domeny CH2 i CH3 ludzkiej IgG1. Inne izoformy cząsteczek Ig także nadają się do wytwarzania białek fuzyjnych, tak jak izoformy IgG2 lub IgG4 lub inne klasy Ig, takie jak na przykład IgM. Białka fuzyjne mogą być monomerami lub multimerami, hetero- lub homomultimerami. Immunoglobulinowa część białka fuzyjnego może być ponadto modyfikowana w taki sposób, aby nie aktywować wiązania dopełniacza lub kaskady dopełniacza lub wiązania do receptorów Fc.

Niniejszym opisano także zastosowanie kombinacji osteopontyny i czynnika immunosupresyjnego do wytwarzania leku do leczenia i/lub zapobiegania chorobom neurologicznym, do jednoczesnego, kolejnego lub oddzielnego stosowania. Czynnikami immunosupresyjnymi mogą być steroidy, metotreksat, cyklofosfamid, przeciwciała przeciw leukocytom (takie jak CAMPATH-1) i tym podobne.

Wynalazek odnosi się także do zastosowania kombinacji osteopontyny i interferonu do wytwarzania leku do leczenia i/lub zapobiegania chorobom neurologicznym, do jednoczesnego, kolejnego i oddzielnego zastosowania.

Termin „interferon, w znaczeniu zastosowanym w niniejszym zgłoszeniu patentowym, obejmuje każdą cząsteczkę określoną jako taką w literaturze, włączając w to dowolny rodzaj IFN, wspomniany powyżej w części dotyczącej stanu techniki. Korzystnie, interferon może być ludzki, ale także pochodzący od innych gatunków, o ile jego biologiczna aktywność jest podobna do ludzkich interferonów i cząsteczka nie jest immunogenna dla człowieka.

PL 211 763 B1

W szczególności, każdy rodzaj IFN-a, IFN-β i INF-γ jest objęty powyższą definicją. IFN-β jest korzystnym IFN zgodnie z niniejszym wynalazkiem.

Termin „interferon-beta (IFN-β), w znaczeniu stosowanym w niniejszym wynalazku, obejmuje interferon ludzkich fibroblastów, uzyskany przez izolację z płynów ustrojowych lub uzyskany za pomocą technik rekombinacji DNA, z prokariotycznych lub eukariotycznych komórek gospodarza, jak również ich soli, funkcjonalnych pochodnych, odmian, analogów i fragmentów.

Termin „funkcjonalne pochodne, w znaczeniu tu stosowanym, obejmuje pochodne, które mogą być wytworzone z grup funkcyjnych, które występują jako łańcuchy boczne reszt lub N- lub C- końcowych grup, za pomocą środków znanych w technice i wchodzą w zakres wynalazku o ile pozostają farmaceutycznie dopuszczalne, tj. nie niszczą aktywności biologicznej białek jak opisana powyżej, takiej jak zdolność do wiązania odpowiedniego receptora i wzbudzenia jego sygnału i nie nadają kompozycji zawierającej je toksycznych właściwości. Pochodne mogą posiadać grupy chemiczne, takie jak reszty wodorowęglanowe i fosforanowe pod warunkiem, że takie pochodne zachowują aktywność biologiczną białka i pozostają farmaceutycznie dopuszczalne.

Na przykład, pochodne mogą obejmować estry alifatyczne grup karboksylowych, amidy grup karboksylowych wytworzone w reakcji z amoniakiem lub z pierwszo- lub drugorzędową aminą, N-acylowe pochodne wolnych grup aminowych reszt aminokwasowych wytworzone z resztami acylowymi (np. grupami alkanoilowymi lub aroilokarbocyklicznymi) lub O-acylowe pochodne wolnych grup hydroksylowych (na przykład grup reszt serylowej lub treonylowej) utworzonych z reszty acylowej. Takie pochodne mogą również obejmować, na przykład boczne łańcuchy glikolu polietylenowego, które mogą maskować miejsca antygenowe i przedłużać okres przetrwania w płynach ustrojowych.

Szczególnie istotne dla przedłużenia aktywności są białka pochodne lub połączone z czynnikiem kompleksującym. Na przykład, mogą być stosowane formy związane z PEG lub skonstruowane genetycznie tak, aby wykazywały przedłużoną aktywność w organizmie.

Termin „pochodne w założeniu obejmuje tylko te pochodne, które nie mają zamienionego jednego aminokwasu na inny, spośród naturalnie występujących dwudziestu aminokwasów.

Termin „sole odnosi się tu zarówno do soli grup karboksylowych, jak i do soli addycyjnych z kwasami grup aminowych białek opisanych powyżej lub ich analogów. Sole grup karboksylowych mogą być wytworzone metodami znanymi w tej dziedzinie i obejmują sole nieorganiczne, na przykład sodu, wapnia, amonu, żelaza lub cynku i podobne i sole z zasadami organicznymi wytworzone na przykład z aminami, takimi jak trietanoloamina, arginina lub lizyna, piperydyna, prokaina i podobne. Sole addycyjne z kwasami obejmują na przykład sole z kwasami mineralnymi, takimi jak na przykład kwas solny lub siarkowy i sole z kwasami organicznymi, takimi jak na przykład kwas octowy lub szczawiowy. Oczywiście, każda taka sól musi zachować aktywność biologiczną białek (odpowiednio osteopontyny i interferonu-beta), związanych z niniejszym wynalazkiem, tj. zdolności wiązania odpowiedniego receptora i wzbudzenia jego sygnału.

Interferony mogą także być skoniugowane z polimerami celem poprawy stabilności białek. Koniugat pomiędzy interferonem-β i poliolem polietylenoglikolem (PEG) był na przykład opisany w WO

099/55377.

W korzystnym wykonaniu wynalazku, interferon jest interferonem-β (IFN-β), a korzystniej IFN^1a.

Osteopontyna korzystnie jest stosowana z interferonem jednocześnie, kolejno lub osobno.

W korzystnym wykonaniu niniejszego wynalazku, osteopontynę stosuje się w ilości około 0,0001 do 100 mg/kg ciężaru ciała lub około 0,01 do 10 mg/kg ciężaru ciała lub około 1 do 5 mg/kg ciężaru ciała lub około 2 mg/kg ciężaru ciała.

Wynalazek ponadto odnosi się do zastosowania cząsteczki kwasu nukleinowego do wytwarzania leku do leczenia i/lub zapobiegania chorobie neurologicznej, przy czym cząsteczka kwasu nukleinowego obejmuje sekwencję kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd osteopontyny zdefiniowany powyżej.

Kwas nukleinowy, np. może być podawany w postaci wolnej cząsteczki, np. w iniekcji domięśniowej.

Może obejmować ponadto sekwencje wektorowe, takie jak sekwencja wirusowa, przydatna do ekspresji genu kodowanego przez cząsteczkę kwasu nukleinowego w organizmie ludzkim, korzystnie we właściwych komórkach lub tkankach.

Dlatego, w korzystnym wykonaniu, cząsteczka kwasu nukleinowego obejmuje ponadto sekwencję wektora ekspresyjnego. Sekwencje wektora ekspresyjnego są dobrze znane w tej dziedzinie, obejmują one ponadto elementy służące do ekspresji przedmiotowego genu. Mogą obejmować sekwencje regulatorowe, takie jak sekwencje promotora i wzmacniające, sekwencje markera selekcyj26

PL 211 763 B1 nego, miejsca rozpoczynające powielanie i podobne. Terapia genowa jest zatem stosowana do leczenia i/lub zapobiegania chorobie. Korzystnie, ekspresja osteopontyny będzie zachodzić in situ.

Wektorem ekspresyjnym może być wektor pochodzący z lentiwirusa. Wektory lentiwirusowe okazały się być bardzo skuteczne w przenoszeniu genów, szczególnie do CNS. Inne przyjęte wektory wirusowe, takie jak wektory pochodzące od adenowirusów, mogą również być stosowane w rozwiązaniach według wynalazku.

Wektory kierujące mogą być zastosowane w celu nasilenia transportu osteopontyny przez barierę krew-mózg. Takie wektory mogą na przykład, wykorzystywać jako cel receptor transferyny lub inne mechanizmy transportu śródbłonkowego.

Wektory ekspresyjne mogą być podawane w iniekcji domięśniowej.

Zastosowanie wektora do wywołania i/lub wzmocnienia wytwarzania osteopontyny w komórkach normalnie niemych pod względem wyrażania osteopontyny lub takich, które wyrażają niewystarczającą ilość osteopontyny, jest także rozpatrywane niniejszym. Wektor może zawierać sekwencje regulatorowe funkcjonujące w komórkach, w których wyrażanie osteopontyny jest pożądane. Takie sekwencje regulatorowe mogą być, na przykład, promotorami lub wzmacniaczami. Sekwencje regulatorowe można następnie wprowadzić do odpowiedniego locus w genomie przez homologiczną rekombinację, łącząc w ten sposób sekwencję regulatorową z genem, którego ekspresja ma ulec wzbudzeniu lub nasileniu. Ta technologia jest zwykle określana jako „endogenna aktywacja genu (EGA) i jest opisana np. w WO 91/09955.

Wynalazek ponadto odnosi się do zastosowania komórek zmodyfikowanych genetycznie do wytwarzania osteopontyny, do wytwarzania leku do leczenia i/lub zapobiegania chorobom neurologicznym.

Niniejszym opisano komórki zmodyfikowane genetycznie do wytwarzania osteopontyny, które mogą być stosowane do wytwarzania leku do leczenia i/lub zapobiegania chorobom neurologicznym. Zatem podejście terapii komórkowej może być zastosowane w celu dostarczania leku do odpowiedniej części ciała ludzkiego.

Wynalazek ponadto odnosi się do kompozycji farmaceutycznych, szczególnie nadających się do zastosowania w zapobieganiu i/lub leczeniu chorób neurologicznych, obejmujących terapeutycznie skuteczną ilość osteopontyny i terapeutycznie skuteczną ilość interferonu. Kompozycja może ewentualnie dodatkowo zawierać terapeutycznie skuteczną ilość leku immunosupresyjnego.

Definicja „farmaceutycznie dopuszczalny w założeniu obejmuje dowolny nośnik, który nie zakłóca skuteczności biologicznego działania aktywnego składnika i nie jest toksyczny dla gospodarza, któremu jest podawany. Na przykład, do podawania pozajelitowego, aktywne białko(-ka) może być formułowane w jednostki dawkowania do iniekcji w takich nośnikach jak sól fizjologiczna, roztwór dekstrozy, albumina surowicy i roztwór Ringera.

Aktywny składnik kompozycji farmaceutycznej może być podawany osobnikowi różnymi drogami. Drogi podawania obejmują drogę śródskórną, przezskórną (np. postaci o powolnym uwalnianiu), domięśniową, dootrzewnową, dożylną, podskórną, doustną, nadtwardówkową, miejscową, międzyosłonkową, doodbytniczą i donosową. Może być zastosowana każda inna terapeutycznie skuteczna droga podawania, na przykład absorpcja przez nabłonek lub tkanki śródbłonka lub przez terapię genową, w której pacjentowi podawana jest cząsteczka DNA kodująca aktywny czynnik (za pomocą wektora), co powoduje wyrażanie i wydzielanie aktywnego czynnika in vivo. Dodatkowo, białko (białka) może być podawane razem z innymi składnikami biologicznie aktywnych czynników, takimi jak farmaceutycznie dopuszczalne surfaktanty, zaróbki, nośniki, rozcieńczalniki i podłoża.

Do podawania pozajelitowego (np. dożylnego, podskórnego, domięśniowego) aktywne białko(ka) może być formułowane jako roztwór, zawiesina, emulsja lub liofilizowany proszek w połączeniu z farmaceutycznie dopuszczalnym podłożem pozajelitowym (np. wodą, solą fizjologiczną, roztworem dekstrozy) i dodatkami podtrzymującymi izotoniczność (np. mannitol) lub stabilność chemiczną (np. konserwanty i bufory). Formulacja jest sterylizowana powszechnie stosowanymi sposobami.

Biodostępność aktywnego białka(ek), może być również poprawiona przez zastosowanie technik koniugacji, które wydłużają okres półtrwania cząsteczki w organizmie człowieka, na przykład przez łączenie cząsteczki z polietylenoglikolem, jak opisano w zgłoszeniu patentowym PCT WO 92/13095.

Terapeutycznie skuteczna ilość aktywnego białka(ek) będzie funkcją wielu zmiennych, obejmujących rodzaj białka, powinowactwo białka, resztkową aktywność cytotoksyczną wykazywaną przez antagonistów, drogę podania, stan kliniczny pacjenta (włączając w to konieczność utrzymania nietoksycznego poziomu aktywności endogennej osteopontyny).

PL 211 763 B1

O „terapeutycznie skutecznej ilości mówimy wtedy, gdy podana osteopontyna ma korzystny wpływ na chorobę neurologiczną. Dawka podana osobnikowi jednorazowo lub kilkakrotnie będzie zależeć od wielu różnych czynników, włączając w to właściwości farmakokinetyczne osteopontyny, drogę podania, stan pacjenta i jego charakterystykę (płeć, wiek, ciężar ciała, zdrowie, wzrost), nasilenie objawów, prowadzone równolegle inne rodzaje leczenia, częstotliwość leczenia i pożądane efekty.

Jak wspomniano powyżej, osteopontyna może być korzystnie stosowana w dawce około 0,0001 do 10 mg/kg ciężaru ciała lub około 0,01 do 5 mg/kg ciężaru ciała lub około 0,01 do 5 mg/kg ciężaru ciała lub około 0,1 do 3 mg/kg ciężaru ciała lub około 1 do 2 mg/kg ciężaru ciała. Ponadto korzystne ilości osteopontyny są ilościami około 0,1 do 1000 pg/kg ciężaru ciała lub około 1 do 100 pg/kg ciężaru ciała lub około 10 do 50 pg/kg ciężaru ciała.

Korzystne jest podawanie drogą podskórną. Ponadto korzystne jest podawanie domięśniowe.

Osteopontyna może być podawana codziennie lub każdego innego dnia.

Dawka dzienna jest zwykle podawana w dawkach podzielonych lub w postaciach, z których jest uwalniana w sposób ciągły tak, by uzyskać pożądany wynik. Drugie lub kolejne podanie można przeprowadzić z taką samą dawką, mniejszą lub większą niż dawka początkowa lub poprzednia. Drugie lub kolejne podanie może być wykonane podczas lub przed wystąpieniem choroby.

Osteopontyna może być podawana osobnikowi profilaktycznie lub terapeutycznie, przed, jednocześnie lub kolejno z innymi schematami lub czynnikami leczniczymi (np. terapia wielolekowa) w ilości terapeutycznie skutecznej, szczególnie z interferonem. Aktywne czynniki, które są podawane równocześnie z innymi czynnikami terapeutycznymi, mogą być podawane w tej samej lub innej kompozycji.

Niniejszym opisano leczenie choroby neurologicznej, obejmujące podawanie pacjentowi tego potrzebującemu, skutecznej ilości osteopontyny lub agonisty jej aktywności, względnie razem z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem.

Leczenia choroby neurologicznej obejmuje podawanie pacjentowi tego potrzebującemu, terapeutycznie skutecznej ilości osteopontyny lub agonisty aktywności osteopontyny i interferonu, ewentualnie razem z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem.

Wszystkie cytowane referencje literaturowe, włączając w to artykuły w czasopismach lub abstrakty, opublikowane lub niepublikowane zgłoszenia patentowe USA lub zagraniczne, wydane patenty USA lub zagraniczne lub każde inne referencje, są w całości włączone tu przez odniesienie, włączając w to wszystkie dane, tabele, figury i tekst przedstawiony w cytowanych referencjach. Dodatkowo, cała treść referencji cytowanych w referencjach tu przytoczonych jest również w całości włączona na drodze odniesienia.

Powyższy opis konkretnych wykonań wynalazku w pełni ujawnia ogólną naturę wynalazku, tak że inni, stosując wiedzę z tej dziedziny (włączając zawartość referencji tu cytowanych), łatwo mogą zmodyfikować i/lub adaptować różne zastosowania takich konkretnych wykonań, bez wykonywania nadmiernych doświadczeń, nie wychodząc poza ogólne założenia niniejszego wynalazku. Zatem, takie adaptacje i modyfikacje przyjmuje się za wchodzące w zakres wynalazku lub odpowiadające ujawnionym wykonaniom, w oparciu o naukę i wskazówki tu przedstawione. Należy zrozumieć, że zawarta tu frazeologia lub terminologia służy opisowi i nie stanowi ograniczenia tak, że terminologia i frazeologia niniejszego opisu powinna być interpretowana przez specjalistę w świetle prezentowanych tu nauk i wskazówek, w połączeniu ze zwykłą wiedzą z tej dziedziny.

Teraz mając opisany wynalazek, będzie łatwo zrozumieć go przez odniesienia do następujących przykładów, które przedstawiono w celu ilustracji a nie w celu jako ograniczenia niniejszego wynalazku.

P r z y k ł a d y

P r z y k ł a d 1: Osteopontyna jest wyrażana w sposób zróżnicowany w modelach chorób demielinizacyjnych in vivo i in vitro

Sposoby

Modelowe układy in vitro

Linia komórek Oil-neu została ustalona przez unieśmiertelnienie prekursorów oligodendrogleju za pomocą defektywnego pod względem replikacji retrowirusa kodującego onkogen t-neu, konstytutywnie aktywną kinazę tyrozynową: wykazano, że ta linia komórkowa jest pobudzana do różnicowania w obecności 1 mM dibutyrylo-cAMP w podłożu hodowli (Jung i in., 1995). Ten sposób dostarczył możliwości badania oligodenrocytów jako wyizolowanego typu komórek.

Morfologia i charakterystyka antygenowa komórek mysiej linii komórkowej oligodendrocytów Oli-neu, wyprowadzonych z prekursora mysich oligodendrocytów A2B5, nietraktowanych i po 6 dniach pobudzającego różnicowanie traktowania 1-5 mM dibutyrylocAMP, różnią się zasadniczo. Podczas

PL 211 763 B1 gdy nietraktowane komórki Oli-neu mają okrągły kształt i są w większości dwubiegunowe, tak jak komórki prekursorowe oligodendrocytów, to komórki traktowane cAMP wytwarzają liczne wypustki, mają płaski fenotyp i nawet wytwarzają płaskie, wydłużone „jakby osłonkowe struktury.

Dodatkowo, test mielinizacji in vitro z zastosowaniem mieszanych hodowli korowych może być zastosowany do uwidocznienia funkcji mieliny in vitro. Ten układ dostarcza możliwości badania tego, jak oligodendrocyty kontaktują się z aksonami i mielinizują je w obecności innych komórek CNS (Lubetzki i in., 1993). W tym układzie, można testować czynniki biologiczne, które mogą wpływać na proliferację prekursorów oligodendrocytów lub działać na różnicowanie i przeżycie oligodendrocytów, takie jak wpływające na tworzenie prawdziwych segmentów mielinowych. Potrzeba badania procesu mielinizacji in vitro doprowadziła do rozwoju zakresu typów testów, włączając w to agregujące hodowle komórek mózgu (Matthieu i in., 1992), hodowle skrawków móżdżku (Notterpek i in., 1993) i układy współhodowli (Shaw i in., 1996; Barres i in., 1993). Zaletą tych modeli jest możliwość badania zachowania oligodendrocytów w połączeniu z innymi typami komórek oraz tego jak te komórki są stymulowane do produkcji mieliny. Demielinizacja również może być wywołana w tych układach swoistymi bodźcami i również możliwość badania odpowiedzi procesu remielinizacji.

Modelowe układy in vivo

Istnieje szeroki zakres modeli doświadczalnych stwardnienia rozsianego in vivo i in vitro. Większość modeli in vivo odnosi się do klasycznego zwierzęcego modelu SM, eksperymentalnego alergicznego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE). Istnieje wiele odmian tego modelu, który został zaadaptowany do stosowania w szerokim zakresie organizmów ssaków, włączając w to mysz, szczura, układy naczelnych (opisane w Petry i in., 2000). Ponadto, sposoby te zostały tak opracowane, aby „naśladowały proponowaną składową wirusową SM w modelach zwierzęcych, takich jak encefalolityczny wirusowy model mysiego SM Theiler'a (Dal Canto i in., 1995).

Zwierzęce modele do wyłącznego badania mielinizacji w CNS lub PNS są rzadziej stosowane. Udowodniono ich użyteczność w obserwacji procesów rozwojowej mielinizacji, prowadzonych celem uzyskania wglądu w mechanizmy leżące u podstaw różnicowania oligodendrogleju lub komórek Schwanna, migracji i proliferacji, zgodnie z „hipotezą rekapitulacji (Franklin i Hinks, 1999). Jednakże, w celu porównania mielinizacji rozwojowej, występującej w czasie, gdy CNS i PNS są ciągle na etapie tworzenia się i remielinizacji zachodzącej w przypadku dojrzałego mózgu, było konieczne stworzenie modeli, konkretnie ukierunkowanych na proces remielinizacji.

Model Kuprizonowy

Jednym z najlepiej poznanych i szeroko stosowanych modeli remielinizacji jest model kuprizonowy remielinizacji u myszy. Obejmuje on podawanie związku organicznego - kuprizonu (angr. cuprisone), chelatującego miedź, który okazał się być wybiórczo toksyczny dla oligodendrocytów (Morell i in., 1998).

Demielinizacja i remielinizacja pojawia się w ciele modzelowatym myszy traktowanej kuprizonem. Ten stan patologiczny może zostać uwidoczniony przez barwienie przeciwciałem przeciwko CNPazie lub przeciwciałem MBP. Mielinę barwi się Luxol Fast Blue-barwnikiem Schiffa (LFB-PAS). Prekursory mielinizujących oligodendrocytów mogą być uwidocznione za pomocą przeciwciał przeciwko receptorowi PDGFa lub NG2.

Podawanie kuprizonu myszy przez okres 3-5 tygodni powoduje wystąpienie rozległej demielinizacji ciała modzelowatego. Równolegle z demielinizacją, po 3 tygodniach podawania kuprizonu, dochodzi do zwiększenia syntezy transkryptów genów swoistych dla mieliny. (Morell i in., 1998).

Następujące potem zakończenie stosowania kuprizonu stwarza warunki dla regeneracji tak, że po 6 tygodniach od odstawienia kuprizonu, mysz wykazuje rozległą remielinizację w ciele modzelowatym. Zatem model kuprizonowy dostarcza kompletnego wzorca do badania aspektów demielinizacji i remielinizacji in vivo. Jego zalety obejmują brak nacieku limfocytów T do tkanki CNS, umożliwiając bardziej wybiórcze badanie procesu mielinizacji, jak i większą powtarzalność wyników (Hiremath i in., 1998).

W modelu traktowania kuprizonem stosowano samice myszy C57BL/6 (8 tygodniowe, 20±3 g), które podzielono na 6 grup, obejmujących po 6 zwierząt.

Grupa 1: grupa kontrolna karmiona normalną sproszkowaną karmą;

Grupa 2: karmione przez 3 tygodnie sproszkowaną karmą zawierającą 0,2% kuprizonu (Cup3w);

Grupa 3: karmiona przez 5 tygodni sproszkowaną karmą zawierającą 0,2% kuprizonu (Cup5w);

Grupa 4: karmiona przez 5 tygodni sproszkowaną karmą zawierającą 0,2% kuprizonu, a następnie w okresie 1 tygodniowej regeneracji normalną sproszkowaną karmą (1wR);

PL 211 763 B1

Grupa 5: karmiona przez 5 tygodni sproszkowaną karmą zawierającą 0,2% kuprizonu, a następnie w okresie 3 tygodniowej regeneracji normalną sproszkowaną karmą (3wR);

Grupa 6: karmiona przez 5 tygodni sproszkowaną karmą zawierającą 0,2% kuprizonu, a następnie w okresie 6 tygodniowej regeneracji normalną sproszkowaną karmą (6wR).

Mózgi pobierano od zwierząt z każdej grupy, na koniec każdego leczenia, w określonych momentach. Myszy były najpierw znieczulane, a następnie perfundowane przez lewą komorę. Mózgi zbierano i wykonywano seryjne przekroje poziome na wysokości ciała modzelowatego - jądra ogoniastego skorupy (prążkowia) i hipokampa. Przekroje mózgu zatapiano w parafinie do badania immunohistochemicznego i hybrydyzacji in situ.

Obróbka histologiczna tkanek

Formalinę przygotowano przez rozcieńczenie 1 objętości aldehydu mrówkowego (Fluka, 36% p.a.) i 1 objętości jałowego PBS, w 8 objętościach jałowej wody. Dren silikonowy przystosowany do pompy perystaltycznej i dopasowany do średnicy 20G, igła 1-1/5 zostały wypełnione 10 ml PBS. Dren następnie wypełniono w sposób ciągły 40 ml formaliny, w sposób bardzo ostrożny, tak by nie dopuścić do tworzenia się pęcherzyków powietrza.

Zwierzęta znieczulano pentobarbitalem sodu (Sanofi®), rozcieńczonym w stosunku 1:1 jałowym PBS w stężeniu 3 mg/100 ml, przed przeprowadzeniem wewnątrzsercowej perfuzji utrwalaczem, prowadzonej dla umożliwienia późniejszych badań histologicznych narządów i tkanek. Każda mysz otrzymywała dootrzewnową iniekcję 0,05 ml (0,75 mg/kg). W momencie gdy zwierzęta stawały się senne, ich kończyny przymocowywano szpilkami (igłami 25G 5/8) przybijanymi przez skórę do płyty styropianowej. Brzuch każdego zwierzęcia przemyto etanolem i za pomocą jałowych nożyczek dokonywano nacięcia skóry na wysokości rękojeści mostka. Następnie brzuch nacinano w lewą i prawą stronę. Mostek unoszono parą kleszczyków i cięciem skośnym otwierano przeponę, a następnie w celu uwidocznienia jamy klatki piersiowej, z bijącym sercem w środku dokonywano dwustronnego pionowego nacięcia aż do żeber. Serce chwytano kleszczykami i natychmiast otwierano prawy przedsionek, aby wywołać krwawienie żylne. W przypadku każdej myszy przeprowadzano perfuzję 10 ml PBS, a następnie 40 ml formaliny. Mózg i rdzeń kręgowy każdego zwierzęcia był ostrożnie wycinany i umieszczany w 10 ml roztworu formaliny w 50 ml rurze Falcon® przez 2 godziny. Roztwór formaliny następnie wymieniano na 10 ml jałowego PBS i materiał pozostawiano w +4°C na noc. PBS ponownie wymieniano i materiał pozostawiano w +4°C na kilka godzin. Mózg i rdzeń kręgowy pocięto na około 5 cm skrawki i umieszczono w plastikowych pojemnikach dopasowanych do zastosowanej maszyny. Zatapianie mózgu i rdzenia kręgowego w parafinie odbywało się za pomocą automatycznego Tissue Tek Vacuum Infiltration Processor E150/E300 (Miles Inc. Diagnostic) według programu opisanego poniżej:

minut w 50% etanolu minut w 70% etanolu minut w 70% etanolu minut w 80% etanolu minut w 80% etanolu minut w 96% etanolu minut w 96% etanolu

120 minut w 96% etanolu minut w 100% ksylenie min w 100% ksylenie

Cztery 60 minutowe inkubacje w parafinie (Histosec, Merck 11609); ostatni etap na zatopienie w parafinie.

Wszystkie roztwory trzymano w 40°C, a parafinę w 65°C. Gdy przekroje tkankowe były gotowe, przekroje mózgu i rdzenia umieszczono w odpowiedniej orientacji w plastikowych komorach, celem zatopienia w bloku parafinowym. Do tych komór wlewano płynną parafinę i pozwalano na szybkie ostygnięcie na zimnej płycie w 0°C. Bloki parafinowe krojono mikrotomem na skrawki (5-10 u.m). Nastęnie skrawki umieszczano na traktowane silanem szkiełka podstawowe (SuperFrost-Plus^TM, Menzel kat. Nr. 041300). Następnie szkiełka przechowywano w środowisku wolnym od pyłów.

Hodowla komórkowa

Oli-neu : Linię oligodendrocytów myszy (Oli-neu) wzbogacono przez wirowanie i ponowne zawieszanie w podłożu Sato (Trotter i in., 1989). Komórki hodowano w 75 ml kolbach w warunkach kontrolowanych, w 37°C i 5% CO2. Różnicowanie przeprowadzono przez dodanie bezpośrednio do podłoża hodowli 1 mM dbcAMP. RNA ekstrahowano metodą Trizol (patrz ponżej).

PL 211 763 B1

Izolacja RNA

Cały RNA izolowano z komórek Oli-neu, ze skrawków mózgów myszy traktowanych kuprizonem i z kompletnych mózgów osesków mysich na różnych etapach rozwoju ekstrahowano metodą TriZOL® (Life Technologies AG, Basel, Switzerland) Poly(A). RNA preparowano z próbek całkowitego RNA z zastosowaniem kolumn Qiagen OLIGOTEX^TM (QIAGEN Inc., 28159 Stanford Avenue, Valencia, CA 91355, USA).

Analiza DGE z zastosowaniem mikropaneli cDNA

Doświadczenia z mikropanelami przeprowadzono w Incyte Genomics (Incyte Genomics Inc., 3160 Porter Drive, Palo Alto, California 94304, USA). Analizę DGE przeprowadzono wykorzystując mikropanel ekspresji 1 genu Incyte Mouse GEM™. (http://www.incyte.com/reagents/gem/products.shtmi).

Chipy Incyte, zastosowane w tych badaniach, były wypełnione cząsteczkami cDNA odpowiadającymi 8734 genów, zarówno znanych jak i nieznanych (sekwencje EST). Technologia Incyte umożliwiła nanoszenie mikropróbek tych genów w postaci kropli na pojedynczy panel. Każda cząsteczka cDNA odpowiadająca znanemu genowi lub sekwencji EST miała długość 500-5000 par zasad. Parametry techniczne podane przez Incyte dają dynamiczny zakres wykrywania od 2 do 2.000 pg dla pojedynczego mRNA w próbce. Ilość RNA potrzebna do każdego doświadczenia z panelem wynosiła 600 ng poli(A)⁺RNA. Określone poziomy wykrywalnych różnic w ekspresji genów były przedstawiane jako stosunki większe niż 1,75.

Normalizacja sygnału i określenie poziomu ekspresji

Stosunki obliczone z 2 intensywności fluorescencji dostarczyły ilościowego pomiaru względnego poziomu ekspresji w 2 analizowanych próbkach komórek. Stosunki przypisane do każdego genu, obliczano w oparciu o znormalizowane poziomy ekspresji. Współczynnik normalizacji oblicza się przez podzielenie całkowitej ekspresji w drugiej próbce (P2) przez całkowitą ekspresję w pierwszej próbce (P1). Ten współczynnik następnie odnosi się do poziomu ekspresji każdego genu w P2. Po przeprowadzeniu etapu normalizacji stosunki dla genów obliczono według następującej reguły:

Niech E1 będzie poziomem ekspresji danego genu w próbce 1 i niech E2 będzie znormalizowanym poziomem ekspresji tego samego genu w próbce 2; jeśli E2 > E1, to stosunek=E2/E1, w innym przypadku stosunek=-E1/E2.

Ponieważ hybrydyzacja próbki jest przeprowadzana równocześnie w konkurencji, technologia chipowa Incyte jest dokładniejsza w określaniu względnych zmian ekspresji, a staje się mniej wiarygodna przy pomiarach bezwzględnych poziomów ekspresji. Niemniej jednak, możliwe jest zastosowanie tych wartości poziomów ekspresji do porównywania par populacji RNA próbek, które nie były chwilowo fizycznie porównywane na chipie. Takie porównania in silico są mniej godne zaufania, ale mogą dostarczyć dodatkowych informacji o mechanizmach, które mogły występować w analizowanych układach.

Wyniki

Modele zastosowane do analizy zróżnicowania ekspresji osteopontyny

Tabela IV przedstawia modele, które zastosowano do ekstrakcji mRNA i hybrydyzacji chipowej (analiza DGE), jak opisano powyżej.

T A B E L A IV: Modele zastosowane w analizie DGE

Modele	Traktowanie	Kontrola
1. Model różnicowania oligodendrocytów in vitro	Komórki Oli-neu+dibutyrylo-cAMP (6 godzin)	Komórki Oli-neu (nietraktowane)
Komórki Oli-neu+dibutyrylo-cAMP (6 dni)	Komórki Oli-neu (nietraktowane)
2. Kuprizonowy model demielinizacji/remielinizacji in vivo	Dojrzałe płaty czołowe mózgu+kuprizon (3 tygodnie)	Nietraktowane płaty czołowe mózgu
Dojrzałe płaty czołowe mózgu+kuprizon (5 tygodni)	Nietraktowane płaty czołowe mózgu
Dojrzałe płaty czołowe mózgu+kuprizon (3 tygodnie)	Dojrzale płaty czolowe mózgu+kuprizon (5 tygodni)
3. Mielinizacja w okresie rozwoju	Móżdżek mysi 10 dni po urodzeniu (P10)	Móżdżek mysi 2 dni po urodzeniu (P2)

PL 211 763 B1

Pozytywna kontrola dla DGE: Regulacja genów swoistych dla mieliny. Jako pozytywną kontrolę najpierw zbadano czy zróżnicowanie regulacji genów swoistych dla mieliny może być wykazane przy zastosowaniu DGE.

Tabela V przedstawia obserwowaną regulację genów swoistych dla mieliny obecnych na mikropanelach Incyte. Zróżnicowane wartości ekspresji każdego genu opisywano zarówno w próbkach pobranych w 3 jak i w 5 tygodniu traktowania kuprizonem. Te dane są pozytywną kontrolą sprawdzającą wiarygodność chipów. Ponieważ regulacja genów strukturalnych mieliny w naszych warunkach eksperymentalnych jest dobrze scharakteryzowana, obserwowana ekspresja tych genów mierzona na chipach może być zastosowana do wykazania a) dokładności technologii i b) powtarzalności naszych modeli.

T A B E L A V. Regulacja in vivo genów swoistych dla mieliny w testach mikropanelami na modelach mielinizacji in vivo

Nazwa genu	Numer dostępu	Cup3w	Cup5w	P2/10*
Podstawowe białko mieliny	AA059540	113,6	11,3	+7,9
Białko pęcherzykowe mieliny/białko mieliny i leukocytów (MVP/MAL)	AA519027	33,5	11,7	0
Fosfodiesteraza cyklicznych nukleotydów (CNP-aza)	W63987	22,9	11,1	+2,9

*Pourodzeniowy móżdżek w 2/10 dniu

Powyższa tabela przedstawia, jak niektóre swoiste dla mieliny geny są regulowane w testach z mikropanelami przeprowadzonych na RNA z różnych modeli in vivo, zastosowanych do badania demielinizacji, remielinizacji i mielinizacji w okresie rozwoju. Zmiany w ekspresji tych swoistych dla mieliny genów wskazują jak proces mielinizacji może być badany na poziomie regulacji transkrypcji z zastosowaniem mikropaneli.

Po 3 tygodniach podawania kuprizonu, wpływ demielinizacyjny traktowania może być uwidoczniony w konkretnych okolicach mózgu myszy. Dlatego w trzecim tygodniu spodziewano się stwierdzenia zmniejszenia aktywności genów związanych z syntezą mieliny i/lub podtrzymaniem mieliny. Obniżenie aktywności genów swoistych dla mieliny, jak stwierdzono za pomocą mikropaneli, służy jako potwierdzenie dokładności i wiarygodności układu doświadczalnego. Dane przedstawione w tabeli V pokazują, że poziomy mRNA dla MBP, były obniżone 13,6 razy a dla fosfodiesterazy cyklicznych nukleotydów 1 (CNP-aza) były obniżone 2,9 razy, w 3 tygodniu traktowania kuprizonem w porównaniu do kontroli. Jednakże, poziomy RNA dla obydwu tych genów wróciły do wartości 1,3 i 1, 1-krotnie niższych od poziomów normalnych, odpowiednio po 5 tygodniach traktowania kuprizonem wskazując, że ustrój biologiczny próbował przeprowadzić remielinizację przez nasilenie syntezy białek strukturalnych mieliny.

Zróżnicowana regulacja osteopontyny

Na chipie, wytwarzanie osteopontyny było zwiększone w 3w (+2,2) i 5w (+2,8) kuprizonu.

P r z y k ł a d 2: Potwierdzenie zróżnicowanej ekspresji genu dla osteopontyny w ilościowej reakcji odwrotnej transkryptazy w czasie rzeczywistym (RT)-PCR (TaqMan®)

Sposoby

Wytwarzanie matryc cDNA

Matryce cDNA do badania TaqMan® wytworzono z próbek całkowitego RNA przez odwrotną transkrypcję (RT) stosując odczynniki TaqMan® do odwrotnej transkrypcji (P/N N808-0234). Wszystkie reakcje RT przeprowadzono w objętości 100 μl zawierającej: 10 μl buforu TaqMan RT, 22 μl 25 mM roztworu MgCl₂ (5,5 mM), 20 μl mieszaniny deoxyNTP (500 μl każdego dNTP), 5 μl losowych heksamerów (2,5 μM), 2 μl inhibitora Rnazy (0,4 μθ, 2,5 μl Odwrotnej Transkryptazy MultiScribe™ (1,25 U/μΟ i 38,5 μl próbki RNA (całkowita masa 1 μg) w wodzie wolnej od RNazy. Reakcje przeprowadzono w Eppendorf MasterCycler w temperaturze 25°C przez 10 minut (etap inkubacji), 48°C przez 30 minut (odwrotna transkrypcja) i 95°C przez 5 minut (etap inaktywacji). Cały zsyntetyzowany cDNA przechowywano w -20°C, w objętościach 20 μΕ

PL 211 763 B1

Projektowanie i weryfikacja starterów

Startery lewy i prawy do reakcji PCR w czasie rzeczywistym z barwnikiem SYBR Green dla wszystkich potwierdzonych genów i GAPDH (kontrola z genami metabolicznymi podstawowymi) zaprojektowano stosując program Primer Express^TM z PE Biosystems zgodnie z opublikowanymi sekwencjami i zamówiono w stężeniu 0,02 μΜ w Interactiva (Interactiva: The Virtual Laboratory, Sedanstrasse 10, D-89077 Ulm). Swoistość i najbardziej korzystne stężenia starterów sprawdzono dla każdego zestawu starterów. Ewentualne zanieczyszczenie genomowym DNA monitorowano przeprowadzając reakcje PCR na próbkach negatywnej kontroli cDNA, które były poddawane reakcjom odwrotnej transkrypcji przy braku enzymu RT. Brak nieswoistej amplifikacji potwierdzano badając produkty PCR elektroforezą na żelu agarowym, stosując 3,5% żele MetaPhor lub gotowe żele NuSieve® 4%.

Poniższa tabela wskazuje sekwencje starterów swoistych dla genów, zaprojektowane do przeprowadzenia badania TaqMan®, w celu potwierdzenia różnej ekspresji genów, dla których na mikropanelach wykazano zróżnicowaną regulację. W tabeli również podano nazwy genów odpowiadających każdej parze starterów oraz numer dostępu w GenBanku sekwencji zastosowanych do projektowania każdego startera za pomocą programu PrimerExpress^TM.

T A B E L A VI: Startery zastosowane do badania RT-PCR

Nazwa genu	Numer dostępu	TaqMan® OLIGO NAZWA	TaqMan® OLIGO SEKWENCJA
Wydzielona fosfoproteina 1 (osteopontyna)	AA108928	Osteopontyna-166F	AGCCTGCACCCAGATCCTATAG
Osteopontyna-235r	GCGCAAGGAGATTCTGCTTCT

Reakcje TaqMan

Reakcję PCR w czasie rzeczywistym z barwnikiem SYBR Green przeprowadzono z 5 μΙ/studzienkę produktów RT (0,5 ng całkowitego RNA), 25 μl/studzienkę mieszanki wzorcowej SYBR Green PCR (Applied Biosystems, CA, USA) z n-glikozylazą uracylową AmpErase (UNG) (0,5 Jednostek/studzienkę) i 20 μl starterów (300 nM). PCR przeprowadzono w 50°C przez 2 minuty (inkubacja AmpErase UNG w celu eliminacji przemieszania zanieczyszczeń, przez usunięcie uracylu wbudowanego w produkty PCR wytworzone w poprzednich cyklach TaqMan), 95°C przez 10 minut (dla aktywacji AmpliTaq Gold). Następnie próbki poddawano 40 cyklom w 95°C przez 15 sekund, 60°C przez 1 minutę w układzie wykrywania sekwencji ABI PRISM® 7700. Próbki odwrotnie transkrybowanego cDNA zostały zatem poddane amplifikacji i określono ich wartości CT (cykl progowy). Wszystkie wartości znormalizowano względem genu metabolicznego podstawowego GAPDH. Gdy było to możliwe, próbki powtarzano dwu- lub trzykrotnie w celu oceny powtarzalności wyników. W badaniu elektroforetycznym stwierdzano pojedyncze swoiste pasmo DNA dla wszystkich potwierdzonych genów i GAPDH.

Obliczanie regulacji genu na podstawie progu cyklu (CT)

Zasada wykrywania w czasie rzeczywistym z zastosowaniem mieszanki wzorcowej SYBR Green PCR oparta jest na bezpośrednim wykrywaniu produktów PCR, przez pomiar wzrostu fluorescencji wywołanej wiązaniem barwnika SYBR Green do dwuniciowego DNA. To pozwala obliczyć względny wzrost produktu amplifikacji specyficznego dla genu, na podstawie krzywych przyrostu dla PCR.

Pomiar ilości specyficznych fragmentów cDNA, w odniesieniu do próbki kontrolnej przeprowadza się przez obliczenie ilości cDNA uzyskanego z mRNA odpowiadającego konkretnym genom, w odniesieniu do próbki kalibracyjnej, przyjmowanej za fizjologiczną referencję. Kalibrację przeprowadza się z próbką z kontroli lub próbką nietraktowania. Względne ustalenia ilości fragmentów cDNA kończy się normalizacją względem endogennej kontroli (w tym przypadku GAPDH), aby uwzględnić każdą zmienność w wyjściowym stężeniu i jakości całkowitego RNA, zastosowanego do wytworzenia matryc cDNA i w skuteczności konwersji reakcji odwrotnej transkrypcji. Obliczanie względnych wartości przeprowadzono biorąc średnią wartość CT dla reakcji replikacji przeprowadzonych w każdej próbce, obliczając różnicę (Δ^) dla średnich C_T pomiędzy próbkami badanymi a endogenną kontrolą, odejmując średnie C_T dla kalibracji próbki badanej od Δ^ próbki badanej (ΔΔ^) i ostatecznie wyrażając względne wartości dla próbki badanej jako 2 ^δδ::' do oceny zakresu zwiększenia lub zmniejszenia ekspresji genu.

Normalizacja Sygnałów Flurescencji w Reakcjach TaqMan®

Sygnały fluorescencji kompleksu SYBR Green-dsDNA normalizowano w odniesieniu do reakcji ślepej próby lub kontroli negatywnej nie zawierających żadnych matryc DNA.

PL 211 763 B1

Normalizację przeprowadzano dzieląc natężenie emisji kompleksu SYBR Green-dsDNA w reakcji eksperymentalnej przez natężenie emisji ślepej próby. To dawało Rn (znormalizowany reporter) wskaźnik dla reakcji:

• wartość Rn⁺ = Rn reakcji zawierającej wszystkie składniki, włączając matryce DNA • wartość Rn^- = Rn w próbce bez reakcji (bez matrycy DNA) • ARn = (Rn+) - (Rn^-) gdzie:

Rn⁺ = (natężenie emisji kompleksu SYBR Green-dsDNA/PCR z matrycą (natężenie emisji ślepej próby)

Rn^- = (natężenie emisji kompleksu SYBR)/bez matrycy (natężenie emisji ślepej próby)

Obliczanie Zwielokrotnienia Regulacji z Wartości Progu Cyklu (CT)

AR_n przedstawia wielkość sygnału wytworzonego przez dany zestaw warunków PCR dla konkretnej reakcji. Parametr progu cyklu stanowi pomiar względnego wzrostu amplifikacji produktu swoistego dla genu, który przedstawia względny nadmiar swoistego transkryptu w eksperymentalnej populacji cDNA. Jest on określony jako moment w cyklu, w którym po raz pierwszy jest wykrywany statystycznie istotny wzrost AR_n. Próg definiuje się jako średnie odchylenie standardowe R_n we wczesnych cyklach, pomnożone przez regulowany czynnik. Parametr progu cyklu jest stosowany do obliczenia zróżnicowania ekspresji genów. Konkretne wartości są obliczane dla każdej krzywej przyrostu swoistej dla genu, w oparciu o moment lub cykl, w którym wykrywa się wzrost natężenia fluorescencji powyżej wartości tła.

Wszystkie obliczenia wartości względnych ilości przeprowadzono biorąc średnią wartość CT dla reakcji replikacji przeprowadzonych dla każdej próbki, obliczając różnicę (AC_T) dla średnich C_T pomiędzy próbkami badanymi a endogenną kontrolą i odejmując średnie CT dla kalibracji próbki badanej od AC_T próbki badanej (AAC_T). Ostatecznie wyrażono względne wartości ilości dla próbki badanej jako 2^-aact do oceny zakresu zwiększenia lub zmniejszenia ekspresji genu.

Wyniki

Reakcja ilościowa odwrotnej transkryptazy w czasie rzeczywistym (RT)-PcR (TaqMan) dostarcza czułego i wiarygodnego podejścia do potwierdzenia i wyjaśnienia zmian w ekspresji genów. Detektor sekwencji TaqMan (układ wykrywania sekwencji ABI PRISM® 7700, Applied Biosystems, Foster City, CA) łączy test oparty na PCR ze sprzętem informatycznym i oprogramowaniem, dostarczając wysoko wydajnego układu do oceny ilościowej sekwencji kwasów nukleinowych. Obejmuje on cykle termiczne, wykrywanie fluorescencji oraz oprogramowanie specyficzne dla zastosowania do wykrywania wzrostu ilości konkretnego produktu PCR w kolejnych cyklach.

Ekspresja kilku wysoko regulowanych genów, wykazana w badaniu z mikropanelami, została zweryfikowana z zastosowaniem systemu TaqMan®. W każdym przypadku, jeśli tylko było to możliwe, włączono przebieg czasowy dla każdego stosowanego modelu. To pozwoliło na zebranie większej ilości danych dotyczących zachowania się konkretnych genów podczas całego procesu:

Zmiany w ekspresji genów można ocenić ilościowo za pomocą TaqMan®, przez bezpośrednie wykrywanie wzrostu ilości produktu PCR, poprzez pomiar fluorescencji wywołanej wiązaniem barwnika SYBR Green z dwuniciowym DNA, reprezentowanym przez produkty amplifikacji, swoiste dla badanych genów. Pomiar ilości konkretnych cDNA, w odniesieniu do próbki kontrolnej przeprowadza się przez obliczenie ilości CDNA uzyskanego z mRNA odpowiadającego konkretnemu genowi, w odniesieniu do próbki kalibracyjnej przyjmowanej za fizjologiczną referencję. Kalibracji dostarcza próbka kontrolna lub próbka nietraktowana. Względną ilość rodzajów cDNA oblicza się przez normalizację względem GAPDH, po to by uwzględnić każdą zmienność w wejściowym stężeniu i jakości całkowitego RNA, zastosowanego do wytworzenia matryc cDNA i skuteczności konwersji reakcji odwrotnej transkryptazy.

Ekspresję genu dl wydzielanej fosfoproteiny 1 (osteopontyny) analizowano podczas badania rozległości demielinizacji/remielinizacji we wzorcu związanym z modelem kuprizonowym.

Wyniki eksperymentów TaqMan dla ekspresji osteopontyny w modelu remielinizacji z kuprizonem są przedstawione na Fig. 1 (A). Poziomy mRNA dla osteopontyny były zwiększone 18-krotnie w płatach czołowych myszy po 3 tygodniach podawania kuprizonu (3w.cup.) i 25-krotnie po 5 tygodniach podawania (5 w.cup.).

Wyrażanie osteopontyny ulegało zmniejszeniu po 1, 3 i 6 tygodniach regeneracji, następujących po 5 tygodniach traktowania kuprizonem (5w. cup. + 1 w., 3 w, i 6w.). Te wyniki wskazują na istotną rolę osteopontyny w fazie demielinizacji i remielinizacji tego modelu, ponieważ remielinizacja rozpoczyna się, gdy demielinizacja nadal zachodzi.

PL 211 763 B1

Fig. 1 (B) przedstawia poziomy wyrażania osteopontyny w rozwijającym się móżdżku. Ilość mRNA dla osteopontyny ulega przejściowemu zwiększeniu podczas wczesnego okresu rozwoju po urodzeniu, w dniach C4 do C8, który to okres zapoczątkowuje mielinizację móżdżku.

Wyniki badań na mikropanelach wskazują na „regulację w górę osteopontyny w płatach czołowych myszy, podczas traktowania ich kuprizonem. To badanie rozszerza profil wyrażania osteopontyny, tak że obejmuje on zarówno fazę demielinizacji, jak i fazę remielinizacji traktowania kuprizonem i wykazuje, że profil wyrażania osteopontyny osiąga szczyt podczas fazy demielinizacji traktowania kuprizonem i w fazie regeneracji wraca prawie do poziomu podstawowego.

Wyniki przedstawiono w poniższej Tabeli VII.

Wyniki badania TaqMan® wyrażania osteopontyny potwierdzają jego wzrost w mózgach myszy karmionych kuprizonem przez 3 i 5 tygodni.

T A B E L A VII: Badanie TaqMan® regulacji osteopontyny w modelu kuprizonowym

Rodzaj tkanki	Eksperyment	Poziom ekspresji	regulacja
Płaty czolowe	Cup. kontrola	1,00	Poziom kontrolny
Płaty czolowe	Cup. kontrola	-1,32	W dół
Płaty czolowe	3 w. Cup.	17,51	W górę
Płaty czolowe	3 w. Cup.	23,43	W górę
Płaty czolowe	5 w. Cup.	20,25	W górę
Płaty czolowe	5 w. Cup.	23,43	W górę
Płaty czołowe	5 w. Cup.+1w.R.	1,79	W górę
Płaty czołowe	5 w. Cup.+1w.R.	3,32	W górę
Płaty czołowe	5 w. Cup.+1w.R.	2,95	W górę
Płaty czołowe	5 w. Cup.+1w.R.	4,56	W górę
Płaty czolowe	5 w. Cup.+1w.R.	-1,16	W dół
Płaty czolowe	5 w. Cup.+1w.R.	1,04	Poziom kontrolny
Płaty czołowe	5 w. Cup.+1w.R.	1,07	Poziom kontrolny

P r z y k ł a d 3: Potwierdzenie zróżnicowania ekspresji osteopontyny metodą Northern Blot

Sposoby

Przygotowanie blotu

Dla konkretnych genów zbadano swoistość tkankową ekspresji z zastosowaniem Wielotkankowych Northern Blotów (Clontech Labs, 1020 East Meadow Circle, Paolo Alto, CA). Zawierały one 2 ąg poli(A)⁺ RNA na ścieżkę, z różnych tkanek dorosłej myszy. Osobne bloty przygotowano do badania zróżnicowania ekspresji genów w sytuacji in vivo i in vitro. RNA izolowane z mózgów myszy traktowanych kuprizonem w 3 i 5 tygodniu traktowania oraz w 1, 3 i 6 tygodniu okresu regeneracji (do 6 tygodni) zastosowano w jednym zestawie blotów. Całe RNA przygotowano z mózgów na różnych etapach rozwoju po urodzeniu, zastosowano do drugiego zestawu. W końcu, sporządzono serie próbek RNA z przebiegu hodowli komórek Oil-neu, hodowanych i traktowanych dibutyrylu-cAMP przez okresy o różnej długości. To RNA zastosowano do sporządzenia trzeciego zestawu blotów. Nowe bloty zastosowano z każdą swoistą dla genu sondą w celu zapewnienia maksymalnej skuteczności wykrywania i zminimalizowania zmienności wyników spowodowanej niedokładnym odczepianiem sond po hybrydyzacji. Wszystkie bloty hybrydyzowano dwukrotnie, raz z sondą przeciwko badanemu genowi, drugi raz - z sondą przeciwko mysiemu gliceroaldehydo-3-fosforanowi (MGAPDH), w celu kontroli różnic w ilości nałożonego RNA.

RNA (10 ąg/studzienkę) nakładano na 1,2% denaturujący żel agarowy zawierający aldehyd mrówkowy i 5X MOPS (209,27 g kwasu 3-(N-morfolino)propanosulfonowego, 20,5 g octanu sodu, 50 ml 0,5 M EDTA pH 8,0 w 51 z jałową H2O, do pH 7,0 z 12 M NaOH). Każdą próbkę RNA mieszano z 2 ąl bromku ethidium (0,01 mg/ml), 2 ąl 5X kwasu 3-(N-morfolino)propanosulfonowego (MOPS), 3,5 ąl 37% aldehydu mrówkowego i 10 ąl formamidu. Następnie próbki ogrzewano w 65°C przez 10 minut i szybko chłodzono w lodzie. Dwa mikrolitry buforu do nakładania RNA (50% glicerolu, 1 mM

PL 211 763 B1

EDTA, 0,4% błękitu bromofenolowego i 0,4% barwnika ksylenocyjanolowego) dodawano do każdej próbki tuż przed nałożeniem żelu.

Każdy żel poddawano elektroforezie przez około 3 godziny w buforze elektroforetycznym 1X

MOPS (11= 330 ml 37% aldehydu mrówkowego, 400 ml 5X MOPS, 270 ml DEPC-traktowanej H2O) -1 przy napięciu 5 V cm^-1 (długość żelu).

Następnie, przez noc RNA przechodził na dodatnio naładowaną błonę nylonową (Hybond^TM-N, Amersham Life Sciences, Amersham Place, Little Chalfont, Buckighamshire, England HP7 9NA), przy zastosowaniu roztworu SSC jak opisano (Terry Brown, Unit 4.9, Current Protocols, 1993 [red. F.M. Ausubel, R. Brent, R.E. Kingston, D.D. Moore, J.G. Seidman, J.A. Smith i K. Strughl]). Skueczność przechodzenia RNA sprawdzano oglądając błonę i spłaszczony żel w świetle ultrafioletowym. RNA sieciowano na błonie za pomocą Stratalinker (Stratagene, USA). Bloty przed hybrydyzacją przechowywano pomiędzy arkuszami bibuły 3MM Whatman, w temperaturze pokojowej.

Przygotowanie sondy

Radioaktywne sondy, znakowane ³²P przygotowano stosując oczyszczone na żelu fragmenty restrykcyjne klonów cDNA (o długości ~500>800 par zasad) odpowiadających badanym genom.

-1 32

Fragmenty DNA losowo znakowano do swoistej aktywności > 10⁹ cpm ml^-1 za pomocą ³²P-dCTP, z zastosowaniem układu znakowania HighPrime^TM (Roche Diagnostic AG, Industriestrasse 7, 6343

Rotkreuz, Szwajcaria). ³²P-dCTP, które nie zostało włączone, usuwano przez wymywanie metodą grawitacyjną, przepuszczając mieszankę sondy przez kolumnę Pharmacia NAP^TM-5, zawierającą Sephadex® G-25 (gatunku dla DNA w wodzie destylowanej zawierającej 0,15% Kathon® CG/ICP Biocide®).

Hybrydyzacja i wykrywania sygnału

Hybrydyzację z sondą wykonywano stosując ExpressHyb^TM (Clontech Labs, 1020 East Meadow Circle, Paolo Alto CA) według zaleceń producenta. Po hybrydyzacji Hyperfilm^TMMP (Amersham Pharmacia Biotech, Anglia) w kasetach autoradiograficznych eksponowano na bloty w -80°C. Odczepianie sond po ekspozycji przeprowadzano przez inkubację blotu przez 10 minut, w jałowym roztworze H2O/0,5% SDS w 90-100°C, a następnie pozostawiano bloty do ostygnięcia, przez 10 minut. Po odczepieniu sond, błony zabezpieczano plastikiem i przechowywano w -20°C, do czasu ponownego sondowania.

Wyniki

Badanie Northern blot już dotychczas było stosowane jako dodatkowy sposób potwierdzania wyników w badaniach zróżnicowania ekspresji genów, prowadzonych na dużą skalę (Chang i in., 2000). Jego czułość i dokładność pozwala ocenić nie tylko swoistość tkankową ekspresji danego badanego genu, ale również wielkość zróżnicowania regulacji pomiędzy warunkami eksperymentalnymi a kontrolnymi. Czyni to je wiarygodnym sposobem do potwierdzenia wyników DGE uzyskanych badaniem na mikropanelach. Również Northern bloty dostarczają informacji odnoszących się do wielkości transkryptów i możliwych izoform powstałych na drodze alternatywnego składania RNA odpowiadających badanemu genowi produktu badanego genu.

Standardowe Northern bloty przygotowano stosując RNA izolowane z mózgów myszy traktowanych kuprizonem i myszy kontrolnych. Sondowano je znakowanymi radioaktywnie fragmentami DNA, pochodzącymi od klonów przesłanych nam przez Incyte Genomics. Zdolność Northern blotów do powtórzenia wyników dotyczących ekspresji genów, uzyskanych za pomocą badania TaqMan, została sprawdzona z zastosowaniem znakowanej radioaktywnie sondy przeciwko mysiej osteopontynie zhybrydyzowanej z blotem RNA izolowanych z mózgów myszy traktowanych kuprizonem. W ten sposób, możliwe było porównanie wyników badania Northern blot z badaniem TaqMan ekspresji osteopontyny w modelu kuprizonowym.

Fig. 3 przedstawia otwartą ramkę odczytu dla mysiej osteopontyny wstawioną do wektora pT7T3D-Pac, zamówionego w Incyte Genomics. Szary region jest sekwencją kodującą a strzałka przedstawia kompletny cDNA dla osteopontyny. Wstawiony klon był flankowany miejscami restrykcyjnymi EcoRI i Notl. W celu przygotowania sondy do zastosowania w Northern blottingu, w celu badania tkankowej ekspresji tego genu, fragment 893-bp odcięto od klonu stosując enzymy restrykcyjne Hincll i Styl. Ten fragment oczyszczono na żelu i znakowano do zastosowania jako sondę.

Ekspresję mysiej osteopontyny stwierdzono za pomocą badania Northern blot, stosując standardowy blot przygotowany z RNA z mózgów myszy z każdego etapu w modelu kuprizonowym, włączając w to etap regeneracji i nietraktowane kontrole. Blot najpierw sondowano znakowanym radioaktywnie fragmentem cDNA dla mysiej osteopontyny, odczepianym po ekspozycji, a następnie ponownie sondowano radioaktywnie znakowanym fragmentem mysiego GAPDH. Stosowano to jako pozytywną

PL 211 763 B1 kontrolę dla oceny różnic w stwierdzonych poziomach ekspresji w oparciu o zmienność ogólnej ilości RNA na każdej ścieżce blotu.

Ekspresja osteopontyny w mózgach myszy traktowanych kuprizonem osiągała szczyt w 3 i 5 tygodniu karmienia kuprizonem, z nieznaczną przewagą w 5 tygodniu. W okresie regeneracji, poziomy RNA dla osteopontyny zmniejszały się względnie szybko, ze znaczącą redukcją ekspresji tydzień po zakończeniu karmienia kuprizonem. Poziomy mRNA dla osteopontyny wracały do prawie normalnych po 6 tygodniach regeneracji. Jest to jakościowo porównywalne z wynikami uzyskanymi w badaniu TaqMan® ekspresji osteopontyny w modelu kuprizonowym (patrz Fig. 1A).

P r z y k ł a d 4: Regulacja osteopontyny w komórkach oli-neu

Ekspresję osteopontyny w oligodendrocytach (oli-neu), traktowanych cAMP, mierzono za pomocą badania TaqMan. Wyniki przedstawiono na Fig. 4. Kolumny 1 do 4 przedstawiają wyniki uzyskane w oligodendrocytach. W porównaniu do kontroli (wartość=1), 6 godzin traktowania cAMP (kol. 1) prowadziło do zwiększania mRNA dla osteopontyny. Po 2 dniach traktowania cAMP (kol. 2), zmierzono 12-krotne zwiększenie ekspresji. Przedłużone traktowanie przez 6 do 10 dni (kol. 3, 4) prowadziło do zmniejszenia poziomów mRNA dla osteopontyny. Porównanie regulacji mRNA dla osteopontyny w modelu kuprizonowym (kol. 5, 6) wykazało, że regulacja „w górę osteopontyny w płatach czołowych, po 3 i 5 tygodniach kuprizonu, była porównywalna do regulacji uzyskanej w oligodendrocytach po 2 dniach traktowania cAMP.

P r z y k ł a d 5: Ekspresja osteopontyny w oligodendrocytach

Sposób

Komórki oli-neu były przejściowo transfekowane według sposobu precipitacji z fosforanem wapnia. Krótko, komórki oli-neu w okresie wzrostu wykładniczego wysiewano (10e5/ml) na 6 studzienkową płytkę, na dzień przed przeprowadzeniem transfekcji. Roztwór 100 pl 250 mM CaCl₂ mieszano z 5 pg plazmidowego DNA. Taką samą objętość (100 pl) roztworu 2X HEPES (140 mM NaCl, 50 mM HEPES pH 7,05) wzbogaconego fosforanem z 300 mM roztworu podstawowego Na2PO4 i NaHPO4 przy pH 7,05 dodawano do roztworu Ca/DNA. Dokładnie minutę później mieszaninę ostrożnie dodawano do płytki hodowlanej i inkubowano 4 godziny w 37°C w inkubatorze z CO2. Potem, wymieniano podłoże na świeże i komórki następnie inkubowano 24-72 godzin przed zebraniem i badaniem metodą Western blotting.

Wyniki

Różne konstrukty mysiej osteopontyny w wektorze pDEST12.2 (pDEST12.2-osteopontyna-EGFP, pDEST12.2-osteopontyna-His6, pDEST12.2-osteopontyna, patrz Fig. 4 do 7 i pCIE-EGFP jako plazmid kontrolny)) transfekowano do komórek oli-neu. Komórki wytwarzały i wydzielały białko, co wykryto swoistym, komercyjnie dostępnym przeciwciałem (R&D Systemy, AF808). Znakowany EGFP konstrukt uprościł monitorowanie transfekcji i 24 godziny po transfekcji można było wykryć konkretną zmianę morfologii komórek (zwiększenie ilości wypustek oligodendrocytów), w porównaniu do kontroli z pCIEGFP (nie przedstawione), co wskazuje, że osteopontyna prowadzi mysie oligodendrocyty linii oli-neu do bardziej dojrzałego morfologicznie fenotypu. Morfologia prezentowana przez transfekowane osteopontyną komórki oli-neu, jest bardzo podobna do morfologii mielinizujących oligodendrocytów.

Te wyniki pokazują, że ekspresja osteopontyny w oligodendrocytach jest korzystna dla doprowadzenia oligodendrocytów do mielinizacji i w ten sposób wskazuje na korzystne działanie osteopontyny w chorobach związanych z dysfunkcją oligodendrocytów.

P r z y k ł a d 6: Wyrażanie białka osteopontyny w swoistych regionach mózgu w modelu kuprizonowym

Badanie immunohistochemiczne na osteopontynę przeprowadzono w różnych momentach podczas demielinizacji i remielinizacji w modelu kuprizonowym. Silne sygnały odnotowano w demielinizowanym ciele modzelowatym i w drodze prążkowiowej w 5 tygodniu traktowania kuprizonem, momentem związanym ze znaczną rekrutacją mikrogleju do miejsc demielinizacji. W celu uwidocznienia aktywnych komórek mikrogleju, przeprowadzono barwienie CD68 na kolejnych przekrojach i podobne wzorce ekspresji sugerują ekspresję osteopontyny w mikrogleju.

Interesujące, że osteopontyna została również znaleziona w komórkach wyściełających komory przednie. Ten region podkomorowy został opisany jako miejsce przetrwania w dojrzałym mózgu multipotentnych komórek pnia, do wytwarzania neuronów, astrocytów i oligodendrocytów. Podwójne barwienie NG2, PSA-NCAM, receptora PDGFa będzie przeprowadzone w celu określenia, czy komórki prekursorowe oligodendrocytów wyrażają osteopontynę.

PL 211 763 B1

P r z y k ł a d 7: Wpływ białka osteopontyny na proliferację oligodendrocytów

W tym eksperymencie zastosowano mysią pierwotną linię komórkową oligodendrocytów unieśmiertelnioną onkogenem t-neu (linia komórkowa „oli-neu). Sposób ustalenia jak i właściwości linii komórkowej oli-neu jak również warunki hodowli opisali Jung i in., (1995).

Celem tego badania był pomiar wpływu OPN na proliferacje oligodendrocytów, w teście proliferacji oli-neu. Komórki hodowano na płytce na granicy zlewności. Głodzono je przez 24 godziny na podłożu wolnym od insuliny przed traktowaniem albo kontrola albo rekombinowanymi białkami. Ilość komórek obliczano za pomocą błękitu Alamar, dającego odczyt fluorescencyjny. Obliczenie nasilenia oparto na porównaniu z krzywą standardową dla IGF1 (kontrola). Obliczenia zahamowania proliferacji oparto na porównaniu z krzywą standardową dla dbcAMP.

Materiał

Sprzęt i oprogramowanie

Licznik wieloznacznikowy Wallac Victor 2 (wzbudzenie przy długości fali 530-560 nm, emisja - 590 nm) program GraphPadPrism

Odczynniki

Linie komórkowe oli-neu (Eur J Neuro 7:125-1265 (1995)) Błękit Alamar (BioSourcelntl. Inc. Camarillo, CA93012)

Składniki podłoża Sato były następujące:

Produkt	Dostawca	Roztwór podstawowy	pl na 500 ml
DMEM	Seromed F0435	500 ml
Transferyna	Sigma T-2252	100 mg/ml (1 mg w 10 ml PBS)	50
Selenian sody	Sigma S-9163	1 mg/2,56 ml PBS	50
Insulina	Sigma I-1882	10 mg/ml (100 mg/10 ml PBS)	500
Putrescyna	Sigma P-7505	80,5 mg/ml (PBS)	500
Progesteron	Sigma P-0130	0,62 mg/ml (EtOH)	50
TIT (trijodotyronina)	Sigma T-5516	1,7 mg/ml (1/3 HCl 1N + 2/3 EtOH)	100
L-Tyroksyna	Sigma T-0397	2,88 mg/ml + 1 kropla 1N NaOH	100
L-Glutamina	Gibco 25030-024	200 mM	5000
Gentamycyna	Gibco 15750-037	50 mg/ml	250
Wodorowęglan sodu	Gibco 25080-052	7,50%	13000
Surowica końska			5000

Płaskodenna płytka BioCoat, pokryta poli D lizyną (356461) z Becton Dickinson; R3-IGF1 (I1146 z Sigmy); DbcAMP (D-0627 z Sigmy).

Sposób

Hodowanie komórek do badań biologicznych in vitro

Komórki oli-neu są adherentnymi komórkami rosnącymi na substracie poli D lizynie. Komórki nanoszono na 96-studzienkowe płytki BioCoatTM pokryte uprzednio poli-lizyną. Komórki dzielono 2-3x/tydzień. W celu podzielenia, komórki najpierw płukano PBS, a następnie odklejano je stosując PBS z 1 mM EDTA. Komórki rosły w wilgotnym inkubatorze w atmosferze 10% CO2.

Zastosowanym podłożem do mrożenia było podłoże Sato z 20% FCS i 10% DMSO. W tym eksperymencie, stosowano komórki oli-neu pasażowane nie więcej niż 16 razy. Komórki stosowano w końcowej gęstości 4000 komórek na studzienkę, w 96-studzienkowej płytce, po 24 godzinach głodzenia na podłożu Sato bez insuliny.

Barwienie błękitem Alamar

Po 48 godzinach w inkubatorze z CO2, dodawano do studzienek 10 pl roztworu podstawowego błękitu Alamar i inkubowano dodatkowo przez 2,5 godziny. Fluorescencję sprawdzano przy długości

PL 211 763 B1 fali 530-560 nm dla wzbudzenia i 590 nm dla emisji. Płytki mogły być odczytywane do 4 godzin i do 1 miliona względnych jednostek fluorescencji.

Projektowanie eksperymentu

Jako kontrolę zastosowano 100 ng/ml R3-IGF-1 (kontrola pozytywna) lub 1 mM dbcAMP (kontrola negatywna) lub podłoże bez insuliny, lub 100 nM gotowanej OPN.

Próbki doświadczalne zawierały 1 nM, 10 pM, 0,1 pM, 0,01 pM lub 100 nM rekombinowanej osteopontyny. Próbki kontrolne i eksperymentalne rozcieńczano do pożądanych stężeń z końcową objętością 50 μl w podłożu Sato bez insuliny i dodawano do studzienek. Komórki oli-neu rosły na podłożu wolnym od insuliny przez 24 godziny, a następnie traktowano je próbkami kontrolnymi lub eksperymentalnymi przez 48 godzin. Odklejone komórki oli-neu, świeżo głodzone na podłożu pozbawionym insuliny, przez 24 godziny, zbierano z kolby hodowlanej za pomocą PBS i 1 mM EDTA. Komórki przygotowano do gęstości 300000 na ml i dodano w 50 μl na studzienkę. Następnie, komórki inkubowano w 37°C przez 48 godzin w wilgotnym inkubatorze z CO2. Do każdej studzienki dodawano 10 μl błękitu Alamar i komórki wkładano z powrotem do inkubatora na 2,5 godziny. N astępnie 70 μl z każdej studzienki przenoszono do 96-studzienkowych płytek do ślepej próby i natychmiast mierzono fluorescencję.

Proliferację niezróżnicowanych komórek oli-neu mierzono po 24 godzinach w odpowiedzi na różne dawki osteopontyny, która była wytwarzana w komórkach owadów (BacOPN) lub w ssaczym układzie ekspresyjnym u ssaków (HEK-OPN). Współczynnik wzrostu określano mierząc aktywność metaboliczną komórek za pomocą fluorometrycznego/kolorymetrycznego wskaźnika wzrostu, błękitu Alamar. Ten czynnik zawiera wskaźnik utleniania-redukcji, który wykazuje zarówno fluorescencję jak i zmianę koloru w odpowiedzi na chemiczną redukcję podłoża wzrostowego spowodowaną wzrostem komórek. Stosowano czynnik i test opisane przez Ahmed i in. (1994) i w patencie USA 5,501,959.

Wyniki

Wyniki pokazano na Fig. 8 do 10.

Odpowiedź zależną od dawki stwierdzono dla rekombinantów osteopontyny, zarówno w przypadku wyrażanej przez baculovirus jak i komórki HEK. Degeneracja białka przez gotowanie zniszczyła jego właściwości biologiczne, jak oczekiwano. Dodanie osteopontyny wyrażanej przez baculovirus (BacOPN) i komórki HEK (HEK OPN) powodowało zależny od dawki wzrost proliferacji komórek (Fig. 8) z Ic50 dla BacOPN 3,7 nM i 0,05 nM dla HekOPN (Fig. 9). Dodatkowo, konstrukt fragmentu N-końcowego OPN odpowiadający aminokwasom 1 do 168 izoforma OPN (patrz Fig. 2, N-końc.OPN-a) był wyrażany w komórkach owadów. Oczyszczone białko badano w teście proliferacji w porównaniu z pełnej długości białkiem. Skrócone białko było aktywne (10 nM, 100 nM), patrz Fig. 10.

P r z y k ł a d 8: Wpływ osteopontyny na wyrażanie markerów mielinizacji w mieszanych hodowlach korowych

Mieszane hodowle korowe, rosnące na szkiełkach nakrywkowych, traktowano BacOPN (100 nM) przez 12 dni w 5-17 DIV (dniu in vitro). 17 dnia in vitro hodowle utrwalano i barwiono przeciwciałem przeciwko-MBP. Wyniki pokazują, że hodowle z BacOPN miały więcej wielowypustkowych MBP dodatnich oligodendrocytów, w porównaniu do kontroli (Fig. 11). Dodatkowo, podczas gdy w hodowlach kontrolnych (Fig. 11A) nie obserwowano mielinizujących oligodendrocytów, hodowle traktowane OPN (Fig. B, c i D) były bogate w oligodendrocyty, które zawijały się wokół aksonów i tworzyły segmenty mieliny i węzły Ranvier'a. (Fig. 11 B do D). Obliczanie skupisk segmentów wykazało, że nie zaobserwowano segmentów w kontroli, natomiast próbki traktowane trzema różnymi OPN wykazały 16, 22 i 18 skupisk segmentów. Te wyniki wskazują, że traktowanie mieszanych komórek korowych osteopontyną prowadzi do różnicowania fenotypu oligodendrocytów, który jest typowy dla mielinizujących oligodendrocytów.

P r z y k ł a d 9: Wpływ osteopontyny na wyrażanie MBP w mieszanych hodowlach korowych, zmierzony metodą ELISA MBP

ELISA MBP zastosowano w celu monitorowania zwiększenia ilości białka MBP, a co za tym idzie mielinizacji w mieszanych hodowlach korowych, traktowanych OPN i LIF.

Hodowle pierwotne

Źródłem materiału była tkanka mózgowa zarodków mysich, izolowana z ciężarnych myszy NMR1 w 16 dniu od zapłodnienia. Zarodki były sekcjonowane według protokołu podanego przez Lubetzki i in., kory oddzielano trawieniem trypsyną a oddzielone komórki (obejmujące neurony, astrocyty, oligodendrocyty, mikroglej i prekursory neuronów) wysiewano z gęstością 1x10⁹ komórek na studzienkę, w 96-studzienkowej płytce uprzednio pokrytej poli-L-lizyną (objętość wyjściowa 50 μ^.

PL 211 763 B1

Traktowanie rekombinowanymi białkami osteopontyny

Traktowanie przeprowadzono z zastosowaniem rekombinowanych białek (kontrola pozytywna, rekombinowany czynnik hamujący białaczkę mysią (LIF) zakupiony od AMRAD Laboratories, w stężeniu 1 μg/ml, 100 ng/ml i 10 ng/ml; mysia osteopontyna pełnej długości wytwarzana przez baculovirus w stężeniach 100 nM, 10 nM i 10 pM). Wszystkie białka rozcieńczano w podłożu hodowlanym do odpowiednich stężeń z materiału podstawowego, przed dodaniem komórek in vitro. Hodowlom pozwalano rosnąć przez 5 dni in vitro, a następnie traktowano je przez 17 kolejnych dni. Podłoże zmieniano co 3 dni.

Protokół zbierania próbek z płytki mikrostudzienkowej

Komórki poddawano lizie i próbki zbierano po 17 dniach in vitro (DIV 17). Lizę komórek przeprowadzono buforem zawierającym trzy detergenty.

Bufor trzech detergentów

Stężenie końcowe ml Tris pH 8,01 1M 50 mM

8,77 g NaCl 150 mM ml NaN3 (10%) 0,02% ml 20% SDS 0,1% ml NP40 1% g deoksycholanu sodu 0,5%

Pojedynczą tabletkę inhibitora proteazy (Roche nr 1836170) proteazy dodano do 10 ml bufora trzech detergentów, przed zastosowaniem.

Podłoże usuwano z próbek mieszanych hodowli korowych, które były wysiane na 96-studzienkowe wstępnie opłaszczone płytki. Komórki delikatnie płukano dwa razy w 50 μl 1xPBS i następnie dodano 50 μl bufora trzech detergentów do każdej studzienki. Wszystkie mikrostudzienkowe płytki zawierające lizowane płytki trzymano potem w -20°C, przed badaniem.

Test białka BCA

Test białka BCA Pierce jest formulacją odpowiadającą detergentom opartą na kwasie bicynchoninowym (BCA) do kolorymetrycznego wykrywania i oznaczania całkowitej ilości białka. Ta metoda +2 +1 łączy dobrze znaną redukcję Cu⁺² do Cu⁺¹ białkiem w zasadowym podłożu, z bardzo czułym i wybiórczym kolorymetrycznym wykrywaniem kationu miedzi (Cu⁺¹) z zastosowaniem unikalnego odczynnika zawierającego kwas bicynchoninowy.

Purpurowo zabarwiony produkt tej reakcji tworzy się przez chelatowanie dwóch cząsteczek BCA z jednym jonem miedziowym. Rozpuszczalny w wodzie kompleks wykazuje wysoką absorbancję przy długości fali 562 nm, która liniowo rośnie wraz ze wzrostem stężenia białka w szerokim roboczym zakresie od 20 μg/ml do 2000 μg/ml. Sposób BCA nie jest prawdziwym sposobem ostatecznego zabarwienia, bo po zakończeniu reakcji nasycenie koloru ciągle rośnie, ale po inkubacji, szybkość zmiany nasycenia koloru spada na tyle skutecznie, że można zbadać bardzo dużą ilość próbek w 1 cyklu. Struktura makrocząsteczkowa białka, ilość wiązań peptydowych oraz obecność czterech aminokwasów (cysteiny, cysteiny, tryptofanu i tyrozyny) są opisywane jako odpowiedzialne za tworzenie się koloru z BCA.

Protokół do określenia całkowitej zawartości białka z zastosowaniem płytki mikrostudzienkowej.

Do każdej studzienki odpowiedniej mikropłytki dodano 25 μl standardu (stężenia BSA: 2000 μg/ml; 1500 μg/ml; 1000 μg/ml; 750 μg/ml; 500 μg/ml; 250 μg/ml; 125 μg/ml; 25 μg/ml) i próbki. 25 μl rozcieńczalnika (bufor z trzema detergentami) użyto do ślepej próby (zakres roboczy 20-2000 μg/ml).

200 μl roboczego odczynnika (mieszanina 50 części odczynnika A BCA z jedną częścią odczynnika B BCA), dodano do każdej studzienki. Płytki wytrząsano przez 30 sekund i inkubowano w 37°C przez 30 minut. Po inkubacji mierzono wartości absorbancji przy 570 nm.

Metoda kanapkowa ELISA dla MBP

Jałowe płaskodenne płytki 96-studzienkowe (Costar) inkubowano przez noc z przeciwciałem przeciwko MBP (Chemicon, MAB5274) rozcieńczonym w 1xPBS, w +4°C, przez noc. Do każdej studzienki dodano 50 μl rozcieńczonego przeciwciała.

Następnego dnia, roztwór przeciwciała usuwano ze wszystkich studzienek na płytkach i przeprowadzono etap blokowania stosując 50 μl 1% roztworu BSA w 1x PBS do każdej studzienki. Blokowanie przeprowadzano przez 1 godzinę w temperaturze otoczenia. Po etapie blokowania płytki były trzykrotnie automatycznie płukane z zastosowaniem PBS/Tween.

Inkubacje przeprowadzano po dodaniu do studzienek na płytkach seryjnych rozcieńczeń standardu peptydu MBP lub próbek w 1% BSA/PBS. Roztwór podstawowy peptydu MBP, o stężeniu

PL 211 763 B1

100 ng/ml został rozcieńczony w stosunku 2:2. Rozcieńczenia stosowane zostały określone po obliczeniu całkowitej ilości białka z zastosowaniem wyników Testu Białkowego BCA. Były one następujące:

100 ąg; 50 ąg; 25 ąg; 12,5 ąg; 6,2 ąg; 3,1 ąg.

Po inkubacji ze standardem MBP i próbkami białka, płytki płukano trzykrotnie w 1% BSA/PBS.

Drugą inkubację przeprowadzano stosując poliklonalne przeciwciało przeciwko-MBP (Zymed 10-0038, 1:300) rozcieńczone w 1% BA/PBS. Płytki inkubowano przez 2 godziny w temperaturze otoczenia. Po inkubacji płytki ponownie trzykrotnie płukano, tak jak powyżej.

Inkubację z kozią przeciwkróliczą biotyną (Wektor BA-1000, 1:10000) dodaną w 50 ąl objętości do wszystkich studzienek po rozcieńczeniu 1% BSA/PBS, przeprowadzono przez 1 godzinę w temperaturze otoczenia. Po inkubacji płytki znów płukano, jak wskazano powyżej.

Końcową inkubację przeprowadzono z 50 ąl peroksydazy chrzanowej skoniugowanej ze streptawidyną (strep-HRP) (Amersham RPN 1051, 1:8000) rozcieńczoną w 1xPBS dodaną do każdej studzienki. Płytki inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze otoczenia.

Po etapie płukania, reakcja została ujawniona z zastosowaniem dichlorowodorku ortofenylodiaminy (OPD) (Sigma, roztwór przygotowany przez dodanie 1 tabletki do 20 ml objętości wody). Ta reakcja została zablokowana poprzez dodanie 3 M HCl lub 30% H2SO4. Gęstość optyczną zmierzono z użyciem czytnika fluoroplate multiscan (Labsystems Multiskan EX) przy długości fali 492 nm.

Wyniki

Jak pokazano na Fig. 12 poziomy białka MBP wzrastały 3-krotnie w hodowlach traktowanych BacOPN (10 nM) w 17 DIV w porównaniu do hodowli kontrolnych. Ta obserwacja potwierdza wcześniejsze wyniki, pokazując pozytywne działanie wyrażanej przez baculovirusa OPN, na proliferację i mielinizację prekursorów oligodendrocytów.

P r z y k ł a d 10: Wpływ osteopontyny na proliferację CG4

Linia komórkowa CG4 jest unieśmiertelnioną linią szczurzych oligodendrocytów, którą samoistnie otrzymano z pierwotnych prekursorów oligodendrocytów A2B5. Komórki CG4 są zwykle stosowaną linią, do badania różnicowania lub przeżycia oligodendrocytów.

Linia CG4 ma następujące zalety:

• Wysoki wskaźnik proliferacji, podobny do tego u progenitorów oligodendrocytów (O2A-podobne) (GD3, A2B5 dodatnie komórki);

• Niski koszt utrzymania na wzbogaconym podłożu (ze skuteczną ilością czynników wzrostowych) uzyskana z linii komórek szczurzego neuroblastoma B104 (Louis J.C. i in., 1992) uzyskanej z ATCC;

• Określone podłoże (bez FBS) może być zastosowane (wzbogacone FGF2+PDGF) zamiast podłoża B104, przez krótki czas, dla proliferacji;

• Różnicowanie do oligodendrocytów (O4, GalC-dodatnie) może być wyzwolone określonym podłożem;

• Różnicowanie do astrocytów może być wyzwolone w obecności FBS.

• Pasaż numer 35 komórek CG4 zastosowano do badania wpływu dwóch białek OPN (wyrażanego w E-coli lub w komórkach owadzich) na proliferację. W tym badaniu zastosowano R&D układ E.coli wytwarzający osteopontynę (Kat.441-OP), którą następnie fosforylowano in vitro kinazą proteinową 2 (fuzja GST) w objętości 60 ąl, następująco:

Bufor kinazowy 6x: Bufor próbkowy 2x pH6

Hepes 50 mM

MgCl2

DTT 1 mM

Wanadan sodu 0,2 mM Beta-glicerofosforan 25 mM Mieszanka ATP (60 ąM) ąl ATP o stężeniu 600 ąM 5 ąL ³²pATP

265 ąl H2O2

Tris-Cl 0,125

20% Glicerol

DTT 0,2 M

Błękit bromofenolowy 0,02%

W celu rozpoczęcia reakcji dodawano mieszankę ATP i przeprowadzano inkubację w 30°C przez 1 godzinę. Po 90 minutach inkubacji w 30°C (z wytrząsaniem), 100 ąl kulek Glutationowych Sepharose (Pharmacia) dodawano do mieszaniny reakcyjnej, którą przedtem płukano w PBS celem eliminacji kinazy proteinowej. Następnie, mieszaninę inkubowano przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej, z delikatnym wytrząsaniem. Zawiesinę wirowano przy 500 g przez 5 minut, aby osadzić

PL 211 763 B1 kulki. Następnie, supernatant dializowano przez noc w 4°C wobec PBS. Białko oznaczano ilościowo przez BCA (Pierce).

Reakcja Kinazy:

pl kinazy kazeinowej w 0,05 pg/pl pl z OPN E.coli w 0,5 pg/pl pl 50 mM Tris-HCl pH 8 pl buforu kinazowego 6X pl mieszanki ATP

Test proliferacji

Badano wpływ Bac OPN i OPN fosforylowanej in vitro, w stężeniach 10 pM, 10 nM, 100 nM, na proliferację komórek cG64. Jako czytnik zastosowano BrdU (Amersham), jak opisano przez Avellana in., 1996. Komórki hodowano w określonym podłożu 70% N1 (DMEM zawierający 4,5 g glukozy, mM glutaminy, 100 U/ml penicyliny, 100 pg/ml streptomycyny i 1 mM progronianu sodu i wzbogacany 5 pg/ml transferyny, 100 mM putrescyny, 30 nM selenitu sodu i 10 ng/ml biotyny) i 30% kondycjonowanym podłożu B104 (N1 bez biotyny) (Louis J.C. i in., 1992). Badanie przeprowadzano na traktowanych poliornityną (100 pg/ml) 24-studzienkowych płytkach z posianymi 3x10⁴ komórkami/na studzienkę. Dodawano 10 nM BrdU w tym samym momencie i komórki inkubowano przez 18 godzin. Po utrwaleniu, przeprowadzano badanie immunocytochemiczne z przeciwciałem przeciwko BrdU, celem wykrycia podziałów komórkowych. Komórki również barwiono barwnikiem Hoechst 44432 (Sigma), aby umożliwić obliczenie całkowitej liczby komórek. Obrazy uzyskiwano i analizowano stosując Leica Qwin Image Analysis System.

Wyniki

Wyniki przedstawiono na Fig. 13.

OPN wyrażona w baculovirusie prowadziła do wzrostu proliferacji komórek CG4. Najbardziej nasilony efekt występował przy stężeniu 10 nM OPN, jakkolwiek 100 nM OPN prowadziło tak samo do proliferacji. Fosforylowana in vitro OPN z E.coli prowadziła do słabszego wzrostu proliferacji komórek CG4.

Badanie morfologii komórek CG4 traktowanych OPN, w porównaniu do komórek nie traktowanych, wykazało, że o ile w kontroli nie można było zaobserwować żadnego różnicowania, o tyle komórki CG4 traktowane OPN różnicowały się tak, że większość komórek miała rozwinięte wypustki. Różnicowanie było wyraźniej zaznaczone w komórkach traktowanych OPN wyrażaną przez baculovirusa, wyrażana w E.coli, fosforylowana in vitro OPN, również prowadziła do różnicowania komórek CG4 (nie przedstawione).

P r z y k ł a d 11: Wpływ osteopontyny na wywołane przez MOG eksperymentalne autoimmunizacyjne zapalenie mózgu i rdzenia kręgowego (EAE) u myszy

Cel badania

Osteopontyna (OPN; AS900011) jest cytokiną o wielokierunkowym działaniu, między innymi na adhezję, migrację, różnicowanie, przeżycia i uwalnianie cytokin wielu rodzajów komórek. OPN została zidentyfikowana w zróżnicowanej ekspresji genów (DGE), której celem było wykrycie genów, które mogłyby regulować remielinizację i funkcję oligodendrocytów (patrz Przykład 1). Traktowanie prekursorów oligodendrocytów OPN wyrażoną w rekombinowanym baculovirusie (AS900011) zwiększa proliferację w sposób zależny od dawki (IC50:3,7 pM, patrz przykład 7). Dodatkowo, AS900011 wykazała wpływ na różnicowanie linii komórkowej CG4 i pierwotnych półkul mózgowych (patrz przykład 8). OPN jest wyrażana w zdemielinizowanym ciele modzelowatym, okolicy mózgu myszy traktowanych kuprizonem, przy czym najsilniej wyrażana była w komórkach mikrogleju (patrz przykład 1). Dodatkowo wyrażanie OPN obserwowano w okolicy podkomorowej (SVZ), która jest sugerowanym źródłem prekursorów oligodendrocytów biorących udział w remielinizacji (patrz przykład 4). Istnieje hipoteza, że OPN, cytokina z różnymi właściwościami immunoregulacyjnymi, odgrywa również rolę jako modulator funkcji neuronów i gleju.

Celem tego badania było zbadanie leczniczego działania OPN w modelu EAE wywołanego przez MOG u myszy.

Sposób badania

Sposób wywołania EAE zastosowany w tym badaniu, został zaadaptowany z protokołu opublikowanego przez Sahrbacher i in., (1998). Zabezpieczenie zwierząt zastosowanych w tym eksperymencie jest zgodne z Dyrektywą 86/609/EEC, wprowadzoną przez Italian D.L. Nr 116 z 27 stycznia 1992 roku. Fizyczne ułatwienia i wyposażenie dla przystosowania do badań i opieki nad zwierzętami są zgodne z warunkami EEC Council Directive 86/609. Instytut jest całkowicie autoryzowany przez

PL 211 763 B1

Właściwe Władze Weterynaryjne. Wszystkie części protokołu obejmujące opiekę nad zwierzętami zostały zatwierdzone przez urzędowego weterynarza. Ten protokół jest autoryzowany przez włoskie Ministerstwo Zdrowia (Decree Nr 51/99-B).

Układ badawczy

Gatunek, rasa, odmiana i płeć:

Samice myszy C57 BL/6JICO zostały dostarczone z hodowli IFFA CREDO (Saint Germain sur l'Arbresle, Francja) przez Charles River Italia (Calco, Lecco, Włochy).

Przyczyny takiego doboru układu badawczego:

Myszy C57 BL/6JICO zostały wybrane jako model doświadczalny; ta wybrana rasa ma udokumentowane skłonności do rozwoju EAE.

Dostawca:

Charles River Italia S.p.A.

Via Indipendeza, 11

23885-Calco (Lecco)

Aklimatyzacja:

Przynajmniej przez 5 dni przed badaniem. W tym okresie zwierzęta będą obserwowane codziennie, aby potwierdzić ich przydatność do badania.

Wiek i ciężar ciała (do doboru losowego):

Około 8 tygodni; 18-22 g.

Warunki bytowania:

zwierząt/klatkę w klimatyzowanych pomieszczeniach.

Temperatura: 22°C±2

Wilgotność względna: 55%±10

Wymiana powietrza: około 15-20/godzinę filtrowanego na HEPA 99,99%.

Światło: cykl 12-godzinny (7 rano-7 wieczorem)

Klatka: klatka Makrolon® 42,5x26,6x15 h, każda zamknięta stalową kratką. Kratka wstawiona na dno klatki. Odpadki, które spadną poprzez pręty kratki na dno klatki, będą usuwane okresowo.

Identyfikacja zwierząt:

Przez plakietkę uszną. Karta klatki będzie zawierała numer doświadczenia, grupę dawkowania i datę podania związku.

Karma:

Wysokiej jakości granulowana karma GLP 4RF25 wytwarzana przez Charles River Italia na licencji Mucedola S.r.1., Settimo Milanese. Celem ułatwienia odżywiania chorym zwierzętom, począwszy od 7 dnia wilgotne granulki karmy układa się na dnie klatki. Producent dostarczył zaświadczenie o badaniu ilości składników odżywczych oraz skażeń, poziomy które były w granicach limitów zaproponowanych przez EPA-TSCA (44FR: 44053-44093, 26 czerwca 1979). RBM badał karmę zwierzęcą przynajmniej dwa razy do roku, pod kątem skażenia bakteriami. Pożywienie było dostępne zwierzętom „ad libitum.

Woda:

Z głównego miejskiego systemu wodociągów. Wodę filtruje się i rozprowadza zwierzętom „ad libitum przez automatyczny układ zastawkowy. Oprócz systemu automatycznego pojenia stosuje się dodatkowo plastikowe butelki. Okresowo woda pitna jest kontrolowana pod kątem zawartości drobnoustrojów, metali ciężkich, innych zanieczyszczeń (np. rozpuszczalników, pestycydów) i innych właściwości fizykochemicznych. Dopuszczalne limity jakości wody pitnej są takie jak określone w Dyrektywie EEC 80/778.

Obecność skażeń, które mogłyby kolidować z celami badania nie jest dopuszczalna w karmie lub wodzie pitnej.

Badane substancje:

Mysia osteopontyna znakowana 6his (AS900011) i mIFN3

Sposób immunizacji:

Myszy immunizowano (dzień=0) przez podskórną iniekcję do lewego boku 0,2 ml emulsji składającej się z 200 μg peptydu MOG_35-55 (Neosystem, Strasbourg, Francja) w Kompletnym Adiuwancie Freunda (CFA, Difco, Detroit, USA) zawierającym 0,5 mg Mycobacterium tuberculosis. Natychmiast potem otrzymywały dootrzewnową iniekcję 500 ng toksyny krztuśćca (List Biological Lab., Campbell, CA, USA) rozpuszczonej w 400 μΙ buforu (0,5 M NaCI, 0,017% Triton Χ-100, 0,015 M Tris, pH=7,5). W 2 dniu zwierzęta otrzymywały drugą dootrzewnową iniekcję 500 ng toksyny krztuśca. W 7 dniu myszy

PL 211 763 B1 otrzymywały drugą dawkę 200 μg peptydu MOG_35-55 w CFA, podanego s.c. w prawy bok. Poczynając od około 8-10 dnia, to działanie powodowało stopniowo postępujące porażenie, zaczynające się od ogona i wstępujące do kończyn przednich.

Projekt badania:

Badanie obejmowało 7 grup po 15 zwierząt każda. Wszystkie grupy immunizowano peptydem MOG35-55 w CFA i toksyną krztuśca, według następującego protokołu immunizacji i traktowania:

Grupa 1; pozytywna kontrola otrzymująca samo podłoże osteopontyny (PBS+ 0,1% BSA) drogą podskórną (s.c.);

Grupa 2; pozytywna kontrola otrzymująca samo podłoże mlFNj: (PBS) drogą podskórną;

Grupa 3; otrzymująca 1 μg/kg s.c. osteopontyny (AS900011)

Grupa 4; otrzymująca 10 μg/kg s.c. osteopontyny (AS900011)

Grupa 5; otrzymująca 100 μg/kg s.c. osteopontyny (AS900011)

Grupa 6; otrzymująca 100 μg/kg s.c. osteopontyny (AS900011) oraz 20000 U/mysz mlFNβ s.c.

Grupa 7; otrzymująca 20000 U/mysz mlFNβ s.c.

Liczba zwierząt w grupie jest minimalana dla właściwej oceny obserwowanych działań farmakologicznych.

Podłoże:

PBS z 0,1% BSA będzie stosowane do rozcieńczania Osteopontyny do odpowiedniego stężenia. PBS będzie stosowany do rozcieńczania mlFNj: do odpowiedniego stężenia.

Droga podania:

Osteopontyna (AS900011) w dawce 1, 10 i 100 μg/kg była podawana s.c. w objętości 10 ml/kg. mIFNj: w dawce 20000 U/mysz będzie podawany s.c. w objętości 200 μl/mysz. Grupa 1 będzie otrzymywała s.c. PBS i 0,1% BSA w objętości 10 ml/kg a grupa 2 będzie otrzymywała s.c. 200 μl PBS/mysz.

Czas trwania leczenia:

Leczenie grup w tym badaniu rozpoczynano dla każdego zwierzęcia w momencie wystąpienia wyniku klinicznego > 1 i następnie kontynuowano przez 35 kolejnych dni.

Postać podawania:

Związek i mlFNj: były podawane w postaci roztworów w odpowiednim podłożu. Właściwe formulacje będą przygotowane według zaleceń Sponsora.

Obserwacje kliniczne:

Począwszy od 7 dnia po immunizacji zwierzęta były indywidualnie badane pod względem obecności porażenia według następującej skali klinicznej:

= bez objawów choroby

0,5 = częściowe porażenie ogona = porażenie ogona

1.5 = porażenie ogona + jednostronne, częściowe porażenie kończyny tylnej = porażenie ogona + słabość kończyn tylnych lub częściowe porażenie kończyn tylnych

2.5 = porażenie ogona + częściowe porażenie kończyn tylnych (obniżenie miednicy) = porażenie ogona + całkowite porażenie kończyn tylnych

3.5 = porażenie ogona + całkowite porażenie kończyn tylnych + nietrzymanie moczu = porażenie ogona + całkowite porażenie kończyn tylnych + słabość lub częściowe porażenie kończyn przednich = agonia lub śmierć

Obserwację zwierząt prowadzono w cichym pomieszczeniu. Objawy kliniczne oceniano codziennie w każdej grupie sposobem ślepej próby przez technika, który nie był świadomy leczenia.

Ciężar ciała zwierząt sprawdzano codziennie.

Zwierzęta podejrzewane o dyskomfort bólowy lub stan agonalny będą badane przez personel weterynaryjny lub uprawnione osoby i jeśli to konieczne, humanitarnie zabijane, aby zminimalizować niepotrzebny ból i cierpienie.

Pobieranie krwi:

Dwadzieścia cztery godziny od ostatniego podania, od każdego zwierzęcia będą pobierane próbki krwi (w znieczuleniu pentobarbitalem). Osocze będzie oddzielone rutynowym sposobem i próbki osocza będą przechowywane w -20°C. Zamrożone osocze zostanie następnie przewiezione do SPRI, w celu względnej oceny stężenia związku w osoczu.

PL 211 763 B1

Badania histopatologiczne:

Po zakończeniu leczenia zwierzęta, w znieczuleniu pentobarbitalem, będą perfundowane przez lewą komorę 4% aldehydem mrówkowym celem utrwalenia. Następnie, ich rdzenie kręgowe będą ostrożnie wycinane i utrwalane formaliną. Skrawki rdzeni kręgowych będą zatopione w blokach parafinowych. Zostanie przeprowadzone krojenie i barwienie hematoksyliną i eozyną na zapalenie oraz Kluver-PAS (Luxol fast blue i barwienie metodą Schiffa) w celu wykrycia demielinizacji.

Ocena danych:

Wyniki badań klinicznych, dla każdej grupy, są wyrażone jako średni wynik (± SEM). Działanie badanej substancji będzie porównane z traktowanymi podłożem grupami pozytywnej kontroli. Różnice pomiędzy klinicznymi wynikami poszczególnych grup będą analizowane testem Kruskal-Wallis, a następnie, w przypadku wykazania istotności, testem sparowanym Wilcoxona, dla każdego czasu pomiaru. Dane dotyczące masy ciała będą ocenione przy pomocy jednokierunkowej ANOVA, a następnie, _® w przypadku istotności, testem Tukeya. Będzie zastosowany program S-Plus^®.

Wyniki:

Wyniki tego badania są pokazane na Fig. 14 do 16.

Badania histologiczne okołonaczyniowego nacieku zapalnego wykazały tendencję do występowania mniejszego nacieku u zwierząt leczonych OPN, zwłaszcza przy najniższej podawanej dawce 1 μg/kg. Kombinacje OPN i IFNβ, który jest związkiem znanym z działania w stwardnieniu rozsianym, było bardziej skuteczne niż podawanie odpowiednio samego OPN lub samego IFNβ (Fig. 14).

Następnie zmierzono procent zdemielinizowanych obszarów (Fig. 15). Znów, u zwierząt otrzymujących OPN można było zaobserwować tendencję do występowania mniejszych obszarów zdemielinizowanych, które były nawet znacznie mniejsze od rozmiarów demielinizacji obserwowanej u zwierząt leczonych samym IFN (Fig. 15).

Fig. 16 przedstawia w sposób sumaryczny wyniki kliniczne obserwowane na zakończenie leczenia, rozmiary nacieku zapalnego i demielinizacji mierzone w tym badaniu. Chociaż wyniki kliniczne obserwowane u myszy leczonych OPN nie były istotnie niższe od kontrolnych, to kombinacja OPN i IFN prowadziła do wyraźnych zmian w wynikach klinicznych, które były tak niskie jak w przypadku kontroli pozytywnej, interferonu-beta. Ta obserwacja pozostaje w zgodzie z pomiarami nacieku zapalnego i rozmiarów demielinizacji. Obydwa te parametry zmniejszały się istotnie po podaniu OPN i IFN β (Fig. 16).

Podsumowując, w tym badaniu uzyskano następujące wyniki:

Osteopontyna (AS900011) badana oddzielnie w dawkach 1, 10 i 100 mg/kg s.c. nie zmniejszała nacieku okołonaczyniowego i demielinizacji w sposób statystycznie istotny. Leczenie mlFNbeta (20000 U/mysz. s.c.) wywoływało redukcję nacieku okołonaczyniowego (55%) i demielinizacji (53%). Gdy mlFNbeta w tej samej dawce był stosowany w połączeniu z AS900011 w dawce 100 mg/kg s.c., to obserwowano istotną i znaczącą redukcję nacieku zapalnego (71%) i demielinizacji (81%).

Dane histologiczne korelują z wynikami klinicznymi obserwowanymi w 35 dniu (koniec leczenia), gdy zwierzęta zabijano i pobierano rdzenie kręgowe do badań histologicznych. Osteopontyna (AS900011) badana oddzielnie w dawkach 1, 10 i 100 mg/kg s.c. nie zmniejszała w istotny sposób, nasilenia choroby. Leczenie mlFNbeta (20.000 U/mysz s.c.) istotnie zmniejszało nasilenie choroby. Gdy mlFNbeta był stosowany w tej samej dawce w połączeniu z AS 900011 w dawce 100 mg/kg s.c., obserwowano statystycznie istotne zmniejszenie objawów klinicznych.

Te dane sugerują, że kombinacja leczenia osteopontyną i mlFNbeta jest skuteczna w redukcji i klinicznych i patologicznych następstw w mysim modelu EAE i z tego powodu może być skutecznym leczeniem w stwardnieniu rozsianym.

P r z y k ł a d 12: Ochronne działanie osteopontyny w neuropatii wywołanej zmiażdżeniem nerwu kulszowego u myszy

Skróty

CMAP: składowa mięśniowa potencjału czynnościowego

EMG: elektromiografia

IGF-1: insulinopodobny czynnik wzrostowy

S.C.: podskórnie

s.e.m: błąd standardowy średniej vs : versus

PL 211 763 B1

Wprowadzenie

Neuropatie są zwykle swoiste dla rodzaju zaatakowanych neuronów PNS (np. czuciowe versus autonomiczne) i również dla podtypu neuronów (małe versus duże). Nacięcie aksonów nerwów obwodowych jest najczęściej stosowanym zwierzęcym modelem, do oszacowania działania neuroprotekcyjnego czynników neurotropowych. Urazowe uszkodzenie nerwów, zmiany splotów i zmiany korzeniowe są poważnymi powikłaniami wypadków. Dodatkowo nacisk na obwodowy nerw może spowodować uszkodzenie mieliny, często obserwowane w zaburzeniach takich jak zespół cieśni nadgarstka lub często jest związany z ortopedycznymi komplikacjami ze strony kręgosłupa. Nacięcie aksonów powoduje objawy takie jak, śmierć komórek, zmniejszenie szybkości przewodzenia w aksonach i zaburzenia poziomu neurotransmiterów w uszkodzonych neuronach. Zmiany zmiażdżeniowe pozwalają na regenerację, proces będący przedmiotem dodatkowego zainteresowania w odniesieniu do neuropatii (McMahon S. I Priestley J.V. 1995).

Fundamentalnym problemem neurobiologii komórkowej jest regulacja regeneracji nerwów po urazie lub chorobie. Funkcjonalna regeneracja nerwów wymaga nie tylko odrastania i wydłużania aksonów, ale również syntezy nowej mieliny. Remielinizacja jest konieczna do odtworzenia normalnego przewodzenia w nerwach i zabezpieczenia aksonów przed nowymi immunogennymi atakami neurodegeneracyjnymi. Pierwotnym celem leczenia chorób neurodegeneracyjnych jest bezwzględne rozwijanie metod zabezpieczających przed martwicą neuronów, podtrzymujących fenotyp neuronów i naprawiająch uszkodzenia neuronów i mieliny. Wiele badań zostało poświęconych rozwikłaniu mechanizmów molekularnych i komórkowych odpowiedzialnych za całkowitą regenerację neuronów motorycznych rdzenia po nacięciu ich aksonów (Fawcett i in., 1990; Funakoshi i in., 1993). Wywołane urazem wyrażanie czynników neurotroficznych i odpowiadających im receptorów może odgrywać istotną rolę w zdolności do regeneracji nerwów. Poprzednie badania wykazały istotną poprawę regeneracji nerwów związaną z różnymi peptydami i niepeptydowymi związkami takimi jak insulinopodobny czynnik wzrostu (IGF-1), ACTH (Lewis i in., 1993; Strand i in., 1980), testosteron (Jones, 1993), SR57746A (Fournier i in., 1993) i 4-metylokatechol (Kaechi K i in., 1993, 1995; Hanaoka Y i in., 1992).

Badanie niniejsze zostało przeprowadzane w celu oceny regeneracji nerwów u myszy leczonej osteopontyną w różnych dawkach. W tym modelu pozytywne działanie OPN na przeżycie i regenerację neuronów i aksonów (neuronów czuciowych i ruchowych), na mielinizację czy naciek makrofagów może prowadzić do odtworzenia funkcji motorycznych. Regeneracja może być mierzona poprzez odtwarzanie funkcji czucioworuchowych i badania morfologiczne. Dlatego w niniejszej pracy zapisy elektrofizjologiczne i badania histomorfometryczne były prowadzone równolegle.

Materiały i Sposoby

Zwierzęta

Zastosowano osiemdziesiąt cztery 8-tygodniowe samice myszy C57bl/6 RJ (Elevage Janvier, Le Genest-St-Isle, Francja). Podzielono je na 7 grup (n=12): (a) grupa pozornie operowana, podłoże; (b) zmiażdżenie nerwu, podłoże; (c) zmiażdżenie nerwu/osteopontyna (1 ąg/kg); (d) zmiażdżenie nerwu/osteopontyna (10 ąg/kg); (e) zmiażdżenie nerwu/osteopontyna (100 ąg/kg); (f) zmiażdżenie nerwu/4-metylokatechol (10 ąg/kg); (g) zmiażdżenie nerwu/zdenaturowana osteopontyna (100 ąg/kg).

Zwierzęta były trzymane w grupach (po 5 zwierząt w klatce) i pozostawione w inkubatorze z kontrolowaną temperaturą (21-22°C) i w warunkach odwróconego cyklu ciemności-jasności (12h/12h) z wodą i karmą dostępnymi ad libitum. Wszystkie eksperymenty przeprowadzono według oficjalnych przepisów.

Uszkodzenie nerwu kulszowego

Zwierzęta znieczulano dootrzewnową iniekcją 60 mg/kg chlorowodzianu ketaminy (Imalgene _®

500^®, Rhone Merieux, Lyon, Francja). Prawy nerw kulszowy odsłaniano chirurgicznie w części środkowej uda i miażdżono do wymiaru 5 mm dosiebnie od miejsca podziału nerwu kulszowego na 3 gałęzie. Nerw miażdżono dwukrotnie na 30 sekund za pomocą kleszczyków hemostatycznych (szerokości

1,5 mm; Koenig; Strasbourg; Francja) z 90 stopniowym obrotem pomiędzy każdym zmiażdżeniem.

Planowanie eksperymentu i leczenia farmakologicznego

Badania elektromiograficzne (EMG) przeprowadzono jeden raz przed zabiegiem operacyjnym (zapis wyjściowy) i w każdym z 3 tygodni po zabiegu.

Dzień zmiażdżenia nerwu został oznaczony jako dzień (D) 0.

Żadnych badań nie przeprowadzano przez 4 dni bezpośrednio po zmiażdżeniu.

Masę ciała i odsetek przeżycia zapisywano codziennie.

PL 211 763 B1

Od dnia urazu do momentu zakończenia badania, osteopontyna i zdenaturyzowana osteopontyna były podawane codziennie S.C., podczas gdy iniekcję 4-metylokatecholu przeprowadzano dootrzewnowo.

W 4 tygodniu, 4 zwierzęta zabijano i wycinano ich nerwy kulszowe celem przeprowadzenia badań morfologicznych.

Zapisy elektrofizjologiczne

Zapisy elektrofizjologiczne przeprowadzano z zastosowaniem elektromiografu Neuromatic

2000M (EMG) (Dantec, Les Ulis, Francja). Myszy znieczulano dootrzewnową iniekcją 100 mg/kg chlo_® rowodzianu ketaminy (Imalgene 500^®, Rhone Merieux, Lyon, Francja). Normalną temperaturę ciała podtrzymywano na 30°C za pomocą lampy grzewczej i kontrolowano termometrem kontaktowym (Quick, Bioblock Scientific, Illkirch, Francja) umieszczonym na ogonie.

Składową mięśniową potencjału czynnościowego (CMAP) mierzono na mięśniu brzuchatym łydki po pojedynczej 0,2 ms stymulacji nerwu kulszowego przy submaksymalnym natężeniu (12,8 mA). Zmierzono amplitudę (mV), opóźnienie (ms) i czas trwania (czas potrzebny na depolaryzację i repolaryzację) potencjału czynnościowego. Amplituda jest wskaźnikiem ilości aktywnych jednostek motorycznych, podczas gdy dystalne opóźnienie pośrednio odzwierciedla przewodność nerwów motorycznych i szybkość transmisji nerwowomięśniowej.

Badania morfometryczne

Badania morfometryczne przeprowadzono 3 tygodnie po zmiażdżeniu nerwu. Do tego badania stosowano cztery losowo wybrane zwierzęta z każdej grupy. Znieczulano je iniekcją IP 100 mg/kg _®

Imalgene 500^®. 5 mm segment nerwu kulszowego wycinano do badania histologicznego. Tkankę utrwalano przez noc w 4% roztworze wodnym glutaraldehydu (Sigma, L'Isle d'Abeau-Chesnes, Francja) w roztworze buforu fosforanowego (pH= 7,4) i przechowywano w 30% roztworze glukozy w +4°C do momentu zastosowania. Nerw był utrwalany czterotlenkiem osmu (Sigma, L'Isle d'Abeau-Chenes, Francja) w buforze fosforanowym przez 2 godziny i odwadniany w seryjnych rozcieńczeniach alkoholu i zatapiany w Epon. Zatopione tkanki następnie umieszczono w 70°C na 3 dni do polimeryzacji. Przekroje poprzeczne o grubości 1,5 ąm wykonywano mikrotomem i barwiono 1% błękitem toluidynowym (Sigma, L'Isle d'Abeau-Chesnes, Francja) przez 2 minuty i odwadniano i umieszczono w Eukitt. Dwadzieścia przekrojów na próbkę badano za pomocą mikroskopu świetlnego (Nikon, Tokyo, Japonia), a badania morfometryczne przeprowadzano na 6 losowo wybranych skrawkach na każdą próbkę nerwu, za pomocą półautomatycznego programu cyfrowej analizy obrazu (Biocom, Francja). Badano dwa pola na skrawek. Obliczano następujące parametry: procent zdegenerowanych włókien (na pole) i całkowitą liczbę włókien.

Analiza danych

Ogólna analiza danych została przeprowadzona z zastosowaniem analizy jednoczynnikowej lub analizy wariancji powtarzalnego pomiaru (anova) i jednokierunkowej anova oraz testów nieparametrycznych (test mann whitney). Ponadto zastosowano test dunnett wtedy, gdy było to konieczne. Poziom istotności przyjęto za p<0,05. Wyniki wyrażono jako średnie ± błąd standardowy średniej (s.e.m.).

Wyniki

Wszystkie zwierzęta przeżyły zabieg zmiażdżenia nerwu. Jedna mysz (zmiażdżenie nerwu/podłoże n°2) zdechła 7 dnia, a 2 myszy (podłoże pozornie operowana n°3 i N°6) 14 dnia, w konsekwencji znieczulenia podczas oceny EMG.

Waga zwierząt

Jak przedstawiono na Fig. 17, istotna współzależność pomiędzy grupami została odnotowana w zmianach ciężaru ciała podczas badania [F(6,132)=1,93 i p<0,001; powtarzane pomiary ANOVA].

Wszystkie grupy wykazały wzrost ciężaru ciała podczas badania.

Pomiary elektrofizjologiczne

Amplituda składowej mięśniowej potencjału czynnościowego (Fig. 18):

Podczas badania stwierdzono istotne różnice pomiędzy grupami, pod względem potencjału czynnościowego [F(6,18)=49,185 i p<0,001; powtarzane pomiary ANOVA] (Fig. 19).

Po uszkodzeniu nerwu, wszystkie zwierzęta poddane zmiażdżeniu wykazały istotne zwiększenie amplitudy CMAP w porównaniu do grupy pozornie operowanej (p<0.001; test Dunnett).

Ponadto, w D 7 i D 14, amplituda CMAP myszy leczonej osteopontyną w dawce 100 ąg/kg lub 4-metylokatecholem w dawce 10 ąg/kg, były istotnie wyższe niż tych ze zmiażdżeniem nerwu/podłożem (p<0,05; test Dunnett).

PL 211 763 B1

Nie stwierdzono istotnych różnic pomiędzy grupą ze zmiażdżeniem/podłożem i zmiażdżeniem/D-osteopontyną 100 pg/kg.

Opóźnienie składowej mięśniowej potencjału czynnościowego

Jak przedstawiono na Fig. 20, stwierdzono istotną różnicę pomiędzy grupami pod względem opóźnienia CMAP [F(6,18)=2,521 i p<0,001; powtarzane pomiary ANOVA]. W D 21, grupy ze zmiażdżeniem wykazały wzrost opóźnienia CMAP w porównaniu z pozornie operowanymi grupami (p<0,001; test Dunnett). Ponadto, leczenie osteopontyną w dawce 10 i 100 pg/kg wykazało istotne działanie, rzeczywiście opóźnienie w tych grupach było istotnie mniejsze niż w tych ze zmiażdżeniem nerwu/podłożem (p=0,017; test Dunnett).

Nie było istotnej różnicy pomiędzy grupami ze zmiażdżeniem nerwu/podłożem a zmiażdżeniem nerwu/D-osteopontyną 100 pg/kg.

Czas trwania składowej mięśniowej potencjału czynnościowego (Fig. 20):

Podczas badania stwierdzono istotne różnice pomiędzy grupami pod względem czasu trwania CMAP [F(6, 18)=25,15 i p<0,001; powtarzane pomiary ANOVA] (Fig. 20).

Od D 7, istotny wzrost czasu trwania CMAP zaobserwowano w grupach ze zmiażdżeniem nerwu (pozornie operowane vs grup ze zmiażdżeniem nerwu: p<0,001; test Dunnett). Ponadto, w D 7 ze zmiażdżeniem nerwu/osteopontyna 100 pg/kg wykazały czas trwania istotnie krótszy, niż ten w grupie ze zmiażdżeniem nerwu/podłożem (p<0,001; test Dunnett).

W D 14 i D 21, trzy grupy prezentowały istotne skrócenie czasu trwania w porównaniu do grupy ze zmiażdżeniem nerwu/podłożem: (a) zmiażdżenie nerwu/osteopontyna 10 pg/kg; (b) zmiażdżenie nerwu/osteopontyna 100 pg/kg; (c) zmiażdżenie nerwu/4-metylokatechol 10 pg/kg.

Ponadto, nie stwierdzono istotnych różnic pomiędzy grupami ze zmiażdżeniem nerwu/podłożem a zmiażdżeniem nerwu/D-osteopontyną 100 pg/kg.

Badania morfometryczne

Procent zdegenerowanych włókien (Fig. 21):

Analizy statystyczne wykazały istotną różnicę pomiędzy grupami w procencie zdegenerowanych włókien przypadającym na jedno pole (p<0,001; jednokierunkowa ANOVA) (Fig. 22). Wszystkie grupy ze zmiażdżeniem nerwu wykazywały istotnie zwiększony procent zdegenerowanych włókien (p<0.001, test Dunnett). Ponadto, myszy ze zmiażdżeniem nerwu/leczone prezentowały procent istotnie mniejszy, niż te ze zmiażdżeniem nerwu/podłożem (p<0.001, test Dunnett).

Ponadto, grupa leczona D-osteopontyną (100 pg/kg) wykazywała wyższy procent zdegenerowanych włókien, niż grupy leczone osteopontyną (p<0,001, test Dunnett).

Całkowita liczba włókien (Fig. 22):

Przekroje oglądano stosując mikroskop optyczny i badania morfometryczne przeprowadzono za pomocą programu Visiolab 2000 (Biocom, Paris, Francja). Analizowano 2 pola na przekrój, po pięć przekrojów na zwierzę. Tylko prawidłowo zmielinizowane włókna były zapisywane przez komputer (wszystkie zdegenerowane włókna, czyli takie z uszkodzoną osłonką mielinową, były pomijane).

Wnioski

Model zmiażdżenia nerwu jest bardzo radykalnym modelem neuropatii obwodowej. Natychmiast po zmiażdżeniu nerwu, większość włókien o dużej średnicy jest stracona z powodu mechanicznego uszkodzenia, co prowadzi do znacznego obniżenia amplitudy CMAP. Opóźnienie CMAP nie jest zmienione natychmiast, ale wykazuje wzrost w 21 dniu z powodu dodatkowej degeneracji włókien o małej średnicy, spowodowanej wtórną, odbywającą się za pośrednictwem układu immunologicznego degeneracji (makrofagi, granulocyty). Czas trwania CMAP jest wydłużony od 7 dnia, ze szczytem w 14 i w 21 wraca do poziomów, które są porównywalne do tych z 7 dnia. Jest to spowodowane tym, że w 21 dniu zmiany zmiażdżeniowe pozwalają na rozpoczęcie regeneracji, dodatkowego procesu będącego źródłem zainteresowania w odniesieniu do stanów neuropatii. To odrastanie aksonów/regeneracja była również widoczna w grupach kontrolnych w trzecim tygodniu badania.

Osteopontyna wykazała działanie ochronne w modelu zmiażdżenia nerwu u myszy. Funkcje czuciowo-ruchowe były przywrócone w znacznym stopniu w 7, 14 i 21 dniu po urazie w stopniu zależnym od dawki, a badania morfologiczne przeprowadzone w 21 dniu po zmiażdżeniu, wykazały znaczne zmniejszenie procentu zdegenerowanych włókien oraz wzrost całkowitej ilości włókien. OPN jest tak skuteczna jak cząsteczka kontrolna zastosowana w tym badaniu, 4-metylokatechol i inaktywowane temperaturą, zdegenerowane białko OPN nie wykazało żadnego istotnego wpływu na parametry funkcjonalne lub histologiczne. Pozytywne działanie OPN na regenerację funkcjonalną i histologiczną może być spowodowane:

PL 211 763 B1

- bezpośrednią ochroną włókien przed wtórną, odbywającą się za pośrednictwem układu immunologicznego degeneracją;

- nasileniem remielinizacji i ochrony aksonów;

- nasileniem regeneracji/odrastania uszkodzonych aksonów;

- zwiększeniem usuwania przez makrofagi fragmentów zniszczonej mieliny.

1. LITERATURA

2. Abramsky, O. and Ovadia, H. (1997) Frontiers in Multiple Sclerosis, dinicał research and therapy. Martin Dunitz publsher, London.

3. Altschul S F et al, J Mol Biol, 215, 403-410. 1990, Alschul S F et al, Nudeic Adds Res.. 25:389-3402, 1997.

4. Barres, B.A., and Raff. MC. Axonal control of oligodendrocyte development. Journal of Cell Biology 147(6): 1123-8, 1999.

5. Barres, BA., Schmid, R., Sendnter, M., and Raff, MC. Multiple extracellular signals are required for long-term oligodendrocyte survival. Development 118(1): 283-95.1993.

6. Bjartmar, C. Yh, X., and Trapp, B.D. Axona pathoogy in myefin disorders. Journal of Neurocytology 28:383-395, 1999.

7. Breighton. B and Hayden, MR: S Afr Med J. 1981 Feb 21; 59(8): 250.

8. Dal Canto, M.C., Melvold, R.W., Kim, B.S., and Mir, SD. Two modes of mutipe scerosis: expehmental allergic encepha)omyeltis (EAE) and Theier*s murine encephaomyeitis virus (TMEV) infection. A pathological and immunologicalcomparison. Microsc. Res. Tech. 32(3): 215-29, 1995.

9. Derynk R. et al., Nature 285. 542-547, 1980.

10. Devereux J etal, Nudeic Adds Res, 12, 387-395, 1984.

11. Dubois-Dalcq, M., Feigenbaum, V., and Aubourg, P. The neurobiology of X-łinked adrenoleukodystrophy, a demyelinating peroxisoma! disorder. Trends in Neurosdences 22(1): 4-12,

1999.

12. Dubois-Dalcq, M., and Murray. K Why are growth factors important in oligodendrocyte physiology? Pathol Biol (Paris) 48(1): 80-6, 2000.

13. Fernάndez, PA., Tang, D.G.. Cheng, L, Prochiantz. A., Mudge, A.W., and Raff. MC. Evidence that axon-derived neuregulin promotes oligodendrocyte survival in the deve!oping rat optic nerve. Neuron 28(1): 81-90, 2000.

14. Franklin, R.J., and Hinks. GL. Understanding CNS remyelination: dues from deve!opmental and regeneration biology. Journal of Neurosdence Research 58(2): 207-13, 1999.

15. Grantham. Science, Voł. 185. pp. 862-864 (1974).

16. Grinspan, J.B., Reeves, M.F.. Coulaloglou, M.J., Nathanson, D.. and Pleasure, D. Re-entry into the cell cycle is required for bFGF-induced oligodendrogtiat dedifferentiattort and survival. Journal of Neuroscience Research 46(4): 456-64, 1996.

17. Grinspan, J.B., Stern. J.L, Franceschini, B., and Pleasure. D. Trophic effects of basie fibrobtast growth factor (bFGF) on differentiated oligodendroglia: a mechanism for regeneration of the oligodendroglial lneage. Journal of Neuroscience Research 36(6): 672-80, 1993.

18. Hajinosseini, M., Tharn, T.N.. and Dubois-Dalcq, M. Origin of oligodendrocytes within the human spinal cord. Journal of Neuroscience 16(24): 7981-94, 1996.

19. Hartung, H.P., van der Meche. F.G/, Pollard. J.D. (1998) Guillain-Barre syndrome, ClDP and other chronic immune-mediated neuropathies. Curr. Opln. Neurol., 11, 497-513

20. Hiremath, M.M., Saito. Y.. Knapp, G.W., Ting, J.P., Suzuki, K., and Matsushima, G.K. Microgltal/macrophage aceumutation during Cuprizone-induced demyelination in C57BL/6 mice. Journal of Neuroimmunology 92(1-2): 38-49, 1998.

21. Ichikawa H, Itota T, Nishitani Y, Torii Y, Inoue K, Sugimoto T. Brain Res 2000 Apr 28;863 (1 -2):276-81.

22. Jung, M., Krśmer, E., Grzenkowski, M., Tang, K., Blakemore. W.F.. Aguzzi, A.. Khazaie, K., Chlichlia. K., von Blankenfeld, G., Kettenmann, H.. and Trotter, J. Lines of murine oligodendroglial precursor cells immortalized by an activated neu tyrosine kinase show distinct degrees of interaction with axons in vitro and in vivo. European Journal of Neuroscience 7(6): 1245-65, 1995.

23. Kiefer et ał. The cDNA and denved amino actd sequence for human osteopontin. Nudeic Adds Res. 1989 Apr 25;17(8), 3306.

PL 211 763 B1

24. Kon S, Maeda M, Segawa T. Hagiwara Y, Horikoshi Y. Chikuma S, Tanaka K. Rashid MM. łnobe M, Chambers AF, Uede T. (2000) Antibodies to different peptides in osteopontin reveal compłexities in the vanous secreted forms. Journal of Cellular Biochemistry 77(3): 487-98.

25. Kon S. Yokosaki Y. Maeda M. Segawa T. Horikoshi Y, Tsukagoshi H, Rashid MM, Morimoto J, Inobe M, Shijubo N. Chambers AF, Uede T. (2002) Mapping of functionał epitopes of osteopontin by monodona! antibodies raised against defined interna! sequences. Journal of Cellular Biochemistry 84(2): 420-32.

26. Kunicki, T.J., Annis, D.S., and Fetding-Habermann, B. Motecuiar determinants of arg-gtyasp ligand specificity for 03 integrins. Journal of Biological Chemistry 272(7): 4103-7, 1997.

27. Lee et al. Transient upregulation of osteopontin mRNA in hippocampus and striatum following gbbal forebrain ischemia in rats. Neurosd Lett 1999 Aug 20;271 (2):81-4.

28. Lipton, S. A., and Rosenberg, P. A. (1994). Excitatory amino adds as a final common pathway for neurologic disorders. N Engl J Med, 330, 613-22.

29. Loius J.C., Magal E., Muir D., Manthorpe M., Varon S. (1992) CG-4 A new bipontiai glial cell line from rat brain. is capable of differentiating in vitro into either mature oligodendrocytes or type-2 astrocytes. J Neuroscience Research 31, 193-204.

30. Lubetzki, C, Demerens, C, Anglade, P.. Villarroya, H., Frankfurter, A., Lee, M.Y., and Zalc, B. Even in cutture, digodendrocytes myelinate solely axons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 90:6820-6824, 1993.

31. Marchionni, M.A., Cannelta, B., Hoban, C, Gao, Y.L., Garda-Arenas, R., Lawson, D.. Happel, E., Noel, F., Tofilon, P., Gwynne, D., and Raine, CS. Neuregulin in neuron/glial interactions in the central nervous system. GGF2 diminishes autoimmune demyelination, promotes oligodendrocyte progenitor expansion, and enhances remyelination. Advances in Expenmentat and Medical Biology 468: 283-95, 1999.

32. Mark et al. (Mark D.F. et ał.. Proc. Natl. Acad. Sd. U.S.A.. 81 (18) 5662-5666.1984).

33. Matthieu, J.M., Comte, V.. Tosie, M.. and Honegger, P. Myelin gene expression during demyelination and remyelination in aggregating brain cell cultures. Journal of Neuroimmunology 40(2-3): 231-4, 1992.

34. McDonald. J. W., Althomsons, S. P.. Hyrc. K L, Choi, D. W., and Goldberg. M. P. (1998). Oligodendrocytes from forebrain are highly vulnerabte to AMPA/kainate receptor-mediated exdtotoxidty. Nat Med. 4, 291-7.

35. Morell. P., Barrett. CV.. Mason. J.L. Toews. A.D.. Hostettler. J.D.. Knapp, G.W., and Matsushima, G.K Gene expression ln brain during Cuprizone-induced demyelination and remyelination. Molecular and Cellular Neurosciences 12(4/5): 220-227, 1998.

36. Nait-Oumesmar, B., Decker. L, Lachapette, F., Avellana-Adalid, V., Bachelin, C. and Van Evercooren, A.B. Progenitor cells of the adult mouse subventricu)ar zone protiferate, migrate and differentiate into oligodendrocytes after demyetination. European Journal of Neuroscience 11(12): 4357-66, 1999.

37. Ng, W.P.. Cartel, N., Roder, J., Roach, A., and Lozano, A. Human centra! nervous system myelin inhibits neurite outgrowth. Brain Research 720(1-2): 17-24, 1996.

38. Noseworthy, J.H. Progress in determining the causes and treatment of multiple sclerosis. Nature 399: A40-A47, 1999.

39. Oldberg et al., Cloning and sequence analysis of rat bone sialoprotein (osteopontin) cDNA reveals an Arg-Gly-Asp cell-binding sequence.Proc Natl Acad Sci U S A. 1986 Dec;83(23):8819-23.

40. Pantoni, L, Garcia, J. H., and Gutierrez, J. A. (1996). Cerebral white matter is highly vulnerabłe to ischemia. Stroke, 27, 1641-6.

41. Pearson W R, Methods in Enzymology. 183, 63-99, 1990.

42. Pearson W R and Lipman D J, Proc Nat Acad Sci USA. 85, 2444-2448, 1988.

43. Petry. K.G.. Boulleme. A.).. Pousset, P., Brochet, B.. Caille. J.M., and Dousset, V. Experimental allergic encephalomyelitis animal models for analyzing features of multiple sclerosis. Pathol. Biol. (Paris) 48(1): 47-53, 2000.

44. Pohlau, D.. Aktas, O., Epplen, C. Hartung. H.P.. Hoffmann, V. and Przuntek, H. (1998) Promoting remyelination as a future therapeutic principle in Multipłe Sclerosis. Nervenarzt, 69, 841-850.

45. Prineas, J.W., Barnard, R.O., Kwon, E.E., Sharer, LR., and Cno. ES. Multiple sclerosis: remyelination of nascent lesions. Annals of Neurołogy 33(2): 137-51, 1993.

PL 211 763 B1

46. Rodriguez-PeRa, A. Oligodendrocyte development and thyroid hormone. Journal of Neurobiology 40(4): 497-512, 1999.

47. Rogister, B., Ben-Hur, T., and Dubois-Dalcq, M. From neural stem cells to myelinating oligodendrocytes. Molecular and Cellular Neurosciences 14(4-5): 287-300, 1999.

48. Sahrbacher. U.C.. Lechner, F.. Eugster, H.P., Freł, K.. Lassmann. H.. and Fontana, A. Mice with an inactivation of the inducibłe nitric oxide synthase gene are susceptibłe to experimentał autoimmune encephaiomyetitis. European Journa) of tmmunołogy 28(4): 1332-8, 1998.

49. Saitoh Y, Kuratsu J, Takeshima H, Yamamoto S, Ushio Y. (1995) Expresston of osteopontin in human gtioma, correiation with the maiignancy. Laboratory Investigations.72(1): 55-63.

50. Scariato, M., Beestey, J., and Pieasure, D. Anałysis of otigodendrogiia) differentiation using cDNA arrays. Journal of Neuroscience Research 59(3): 430-5,2000.

51. Scherer, S.S. Molecular genetics of demyeiination: new wrinktes on an ołd membrane. Neuron 18:13-16, 1997.

52. Scolding, N., and Lassmann, H. Demyelination and remyelination. Trends in Neurosdences 19(1): 1-2, 1996.

53. Shaw, C.E., Milner, R., Compston, A.S., and ffrench-Constant. C. Analysis of integrin expression on oligodendrocytes during axo-glial interaction by using rat-mouse xenocultures. Journał of Neuroscience 16(3): 1163-72, 1996.

54. Shin et al., Expression of osteopontin mRNA in the adult rat brain, Neurosci Lett. 1999 Oct 1;273(2):73-6.

55. Shepard H. M. et al., Nature, 294, 563-565, 1981.

56. Sodek J. Ganss B, McKee MD, Crit Rev Oral Biol Med 2000;11(3):279-303.

57. Smith, P.K., Krohn, R.I., Hermanson, G.T., Mallia, A.K, Gartner, F.H, Provenzano, MD., Fujimoto, E.K., Goeke, N.M., Olson, B.J. and Klenk, D.C. (1985). Measurment of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem.150, 76-85.

58. Smith and Waterman J Mol Biol, 147,195-197, 1981. Advances in Applied Mathematics, 2,482-489, 1981.

59. Storch, M.K., Piddlesden. S., Haltia, M., łivanainen, M., Morgan, P., and Lassmann, H. Multiple sclerosis: in situ evidence for antibody- and complement-mediated demyelination. Annals of Neurology 43(4): 465-71, 1998.

60. Trojaborg W (1998) Acute and chronić neuropathies: new aspects of Guillain-Barre syndrome and chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy, an overview and an update. Electroencephatogr Clin Neurophysol., 107, 303-316.

61. Trotter, J., Bitter-Suermann, D., and Schachner, M. Differentiation-regulated loss of the polysiatylated embryontc form and expression of the different potypeptides of the neurat cell adhesion molecule by cultured oligodendrocytes and myelin. Journal of Neuroscience Research 22(4): 369-83, 1989.

62. Wiechelman, K., Braun, R. and Fitzpatrick, J. (1988). Investigation of the bicinchoninic acid protein assay: Identification of the groups responsibte for coior formation. Anal. Biochem. 175, 231-237. The degenerated fibers and the normal fibers were counted.

63. Whitney. L.W.. Becker, K.G., Tresser, N.J., Caballero-Ramos, C.)., Munson. P.J., Prabhu. V.V., Trent, J.M.. McFahand, H.F., and Biddison, W.E, Anałysis of gene expression in mutiple sclerosis tesbns using cDNA microarrays. Annals of Neurology 46(3): 425-8, 1999.

PL 211 763 B1

Lista sekwencji <110> Applied Research Systems ARS Holding N.V.

<120 > Zastosowanie osteopontyny do leczenia i/lub zapobiegania chorobom neurologicznym

<13 0>	WO 473
<150> < 151 >	01111296 2001-05-17
<160>	5
<170>	Patentln wersja 3.1
<2 10 > <211> <212> <213>	1 314 PRT Homo sapiens
<400>	1

Met Arg Ile Ala Val Ile Cys Phe Cys Leu Leu Gly Ile Thr Cys Ala 1 5 10 15

Ile Pro Val Lys Gin Ala Asp Ser Gly Ser Ser Glu Glu Lys Gin Leu 20 25 30

Tyr Asn Lys Tyr Pro Asp Ala Val Ala Thr Trp Leu Asn Pro Asp Pro 35 40 45

Ser Gin Lys Gin Asn Leu Leu Ala Pro Gin Asn Ala Val Ser Ser Glu 50 55 60

Glu Thr Asn Asp Phe Lys Gin Glu Thr Len Pro Ser Lys Ser Asn Glu 65 70 75 80

Ser His Asp His Met Asp Asp Met Asp Asp Glu Asp Asp Asp Asp His 85 90 95

Val Asp Ser Gin Asp Ser Ile Asp Ser Asn Asp Ser Asp Asp Val Asp 100 105 110

Asp Thr Asp Asp Ser His Gin Ser Asp Glu Ser His His Ser Asp Glu 115 120 125

PL 211 763 B1

Ser

Asp 130

Glu

Leu

Val

Thr Asp 135

Phe

Pro

Thr

Asp

Leu 140

Pro

Ala

Thr

Glu

val

Phe

Thr

Pro

Val

Val Pro

Thr

Val

Asp

Thr

Tyr

Asp

Gly

Arg

Gly

145

150

155

160

Asp

Ser

Yal

Val

Tyr

Gly Leu

Arg

Ser

Lys

Ser

Lys

Lys

Phe

Arg

Arg

1.65

170

175

Pro

Asp

Ile

Gin

Tyr

Pro Asp

Ala

Thr

Asp

Glu

Asp

ile

Thr

Ser

His

180

185

190

Met

Glu

Ser

Glu

Glu

Leu Asn

Gly

Ala

Tyr

Lys

Ala

ile

Pro

Val

Ala

195

200

205

Gin

Asp

Leu

Asn

Ala

Pro Ser

Asp

Trp

Asp

Ser

Arg

Gly

Lys

Asp

Ser

210

215

220

Tyr

Glu

Thr

Ser

Gin

Leu Asp

Asp

Gl n

Ser

Ala

Glu

Thr

His

Ser

His

225

230

235

240

Lys

Gin

Ser

Arg

Leu

Tyr Lys

Arg

Lys

Ala

Asn

Asp

Glu

Ser

Asn

Glu

245

250

255

His

Ser

Asp

Yal

Tle

Asp Ser

Gin

Glu

Leu

Ser

Lys

Yal

Ser

Arg

Glu

2 60

265

2 70

Phe

His

Ser

His

Glu

Phe His

Ser

His

Glu

Asp

Met

Leu

Yal

Yal

Asp

2 75

280

285

Prc

Lys

Ser

Lys

Glu

Glu Asp

Lys

Kis

Leu

Lys

Phe

Arg

Ile

Ser

His

290

295

3 00

Glu

Leu

Asp

Ser

Ala

Ser Ser

Glu

Yal

Asn

305

310

<210>

2

<211>

299

<212>

PRT

<213>

Homo

sapiens

<40

0 >

2

Met

Arg

Ile

Ala

Yal

Ile Cys

Phe

Cys

Leu

Leu

Gly

Ile

Thr

Cys

Ala

1

5

10

15

PL 211 763 B1

Ile Pro Val Lys Gin Ala Asp Ser Gly Ser Ser Glu Glu Lys Gin Leu 20 25 30

Tyr Asn Lys Tyr Pro Asp Ala Val Ala Thr Trp Leu Asn Pro Asp Pro 35 40 45

Ser Gin Lys Gir. Asn. Leu . i-eu 7‘.. a Pro Gin Leu Pro Ser Lys Ser Asn 50 55 60

Glu Ser His Asp His Met Asp Asp Met Asp Asp Glu Asp Asp Asp Aso ⁶⁵ 30 75 8c

His Val Asp Ser Gin Asp Ser Ile Asp Ser Asn Asp Ser Asp Asp Val 85 90 95

Asp Asp Thr Asp Asp Ser His Gin Ser Asp Glu Ser His His Ser Aso 100 105 110 ~

Glu Ser Asp Glu Leu Val Thr Asp Phe Pro Thr Asp Leu Pro Ala Thr 115 120 125

Glu Val Phe Thr Pro Val Val Prc Thr Val Asp Thr Tyr Asp Gly Arg 130 135 140

Gly Asp Ser Val Val Tyr Gly Leu Arg Ser Lys Ser Lys Lvs Phe Arg 145 150 155 ' 160

Arg Pro Asp Ile Gin Tyr Pro Asp Ala Thr Asp Glu Asp Ile Thr Ser 165 170 175

His Met Glu Ser Glu Glu Leu Asn Gly Ala Tyr Lys Ala Ile Pro Val 180 185 190

Ala C-ln Asp Leu Asn Ala Pro Ser Asp Trp Asp Ser Arg Gly Lys Asp 195 200 205

Ser Tyr Glu Thr Ser Gin Leu Asp Asp Gin Ser Ala Glu Thr His Ser 210 215 220

His Lys Gin Ser Arg Leu Tyr Lys Arg Lys Ala Asn Asp Glu Ser Asn 225 230 235 240

PL 211 763 B1

Glu

His

Ser

Asp

Vul 245

Ile

Asp

Ser

Glu

Glu 250

Leu

Ser

Lys

Val

Ser 2 55

Arg

Glu

Phe

His

Ser 260

His

Glu

Phe

His

Ser 265

His

Glu

Asp

Met

Leu 270

Val

Val

Asp

Pro

Lys 275

Ser

Lys

Glu

Glu

Asp 280

Lys

His

Leu

Lys

Phe 295

Arg

Ile

Ser

Hi s

Glu

Leu

Asp

Ser

Ala

Ser

Ser

Glu

Val

Asn

290 295 <21C> 3 <211? 286 <21 2 > PRT

<21 3

> Homo

sapiens

<400

? 3

Met

Arg

Ile

Ala

Val

Ile

Cys

Phe

Cys

Leu

Leu

Gly

Ile

Thr

Cys

A_ a

1

5

10

15

Ile

Pro

Val

Lys

Gin

Ala

Asp

Ser

Gly

Ser

Ser

Glu

Glu

Lys

Asn

Ala

20

25

30

Val

Ser

Ser

Glu

Glu

Thr

Asn

Asp

Phe

Lys

Gin

Glu

Thr

Leu

Pro

Ser

35

40

45

Lys

Ser-

Asn

Glu

Ser

His

Asp

His

Met

Asp

Asp

Met

Asp

Asp

Glu

Asp

SC

55

60

Asp

Asp

Asp

His

Val

Asp

Ser

Gin

Asp

Ser

Ile

Asp

Ser

Asn

Asp

Ser

65

70

75

80

Asp

Asp

Val

Asp

Asp

Thr

Asp

Asp

Ser

His

Gin

Ser

Asp

Glu

Ser

“fis

85

90

95

His

Ser

Asp

Glu

Ser

Asp

Glu

Leu

Val

Thr

Asp

Phe

Pro

Thr

Asp

Leu

100

105

110

Pro

Ala

Thr

Gl u

Val

Phe

Thr

Pro

Val

Val

Pro

Thr

Val

Asp

Thr

Tyr

1 1 5

120

125

Asp

Gly

Arg

Gly

Asp

Ser

Val

Val

Tyr

Gly

Leu

Arg

Ser

Lys

Ser

Lys

130 135 14 0

PL 211 763 B1

Lys Phe Arg Arg Pro Asp Ile Gin Tyr Pro Asp Ala Thr Asp Glu Asp 145 150 155 160

Ile Thr Ser His Met Glu Ser Glu Glu Leu Asn Gly Ala Tyr Lys Ala 165 170 175

Ile Pro Val Ala Gin Asp Leu Asn Ala Pro Ser Asp Trp Asp Ser Arg 180 185 190

Gly Lys Asp Ser Tyr Glu Thr Ser Gin Leu Asp Asp Gin Ser Ala Glu 195 200 205

Thr His Ser His Lys Gin Ser Arg Leu Tyr Lys Arg Lys Ala Asn Asp 210 215 220

Glu Ser Asn Glu His Ser Asp Val Ile Asp Ser Gin Glu Leu Ser Lys 225 230 235 240

Val Ser Arg Glu Phe His Ser His Glu Phe His Ser His Glu Asp Met 245 250 255

Leu Val Val Asp Pro Lys Ser Lys Glu Glu Asp nys His Leu Lys Phe 260 265 270

Arg Ile Ser His Glu Leu Asp Ser Ala Ser Ser Glu Val Asn 275 280 285 <210> 4 <211> 22 <212? DNA <213> homo sapiens <400> 4 agcctgcacc cagatcctat ag 22 <210> 5 <211? 21 <212> DNA c213> homo sapiens <400? 5 gcgcaaggag attctgcttc t 21

PL 211 763 B1

Claims (12)

1. Zastosowanie osteopontyny do wytwarzania leku do leczenia i/lub zapobiegania chorobie neurologicznej wybranej z grupy składającej się z urazowego uszkodzenia nerwu, neuropatii obwodowej, neuropatii cukrzycowej, stwardnienia rozsianego (SM), oraz choroby neurologicznej spowodowanej wrodzonym zaburzeniem metabolicznym, przy czym osteopontyna jest wybrana z grupy składającej się z:

(a) polipeptydu obejmującego SEKW. Nr ID: 1;

(b) polipeptydu obejmującego aminokwasy 1 do 168 lub 170 SEKW. Nr ID: 1;

(c) polipeptydu obejmującego aminokwasy 1 do 16 i 170 do 314 SEKW. Nr ID: 1;

(d) polipeptydu obejmującego aminokwasy 170 do 314 SEKW. Nr ID: 1;

(e) polipeptydu obejmującego SEKW. Nr ID: 2;

(f) polipeptydu obejmującego SEKW. Nr ID: 3;

(g) muteiny dowolnego z (a) do (i), w której sekwencja aminokwasowa jest co najmniej w 90% identyczna z co najmniej jedną z sekwencji z (a) do (f) i która oddziaływuje z integryną av i/lub CD44;

(h) muteiny dowolnego z (a) do (f), która jest kodowana przez sekwencję DNA hybrydyzującą z komplementarną sekwencją do sekwencji natywnego DNA kodującej dowolny z (a) do (f) w wysoce ostrych warunkach i która oddziaływuje z integryną av i/lub CD44;

(i) muteiny dowolnego z (a) do (f), w której dowolna zmiana w sekwencji aminokwasowej jest konserwatywną substytucją aminokwasów w sekwencji aminokwasowej z (a) do (f) i która oddziaływuje z integryną av i/lub CD44 (j) soli lub izoformy, białka fuzyjnego, funkcjonalnej pochodnej, aktywnej frakcji lub koliście permutowanej pochodnej dowolnego z (a) do (f), które oddziaływują z integryną av i/lub CD44.

2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że osteopontyna jest przyłączona do cząsteczki nośnika, peptydu lub białka, która wspomaga przechodzenie przez barierę krew-mózg.

3. Zastosowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że osteopontyna jest modyfikowana PEG.

4. Zastosowanie według zastrz. 2 albo 3, znamienne tym, że białko fuzyjne obejmuje fuzję immunoglobuliny (Ig).

5. Zastosowanie według dowolnego z zastrz. 1-4, znamienne tym, że lek ponadto obejmuje interferon, do stosowania jednocześnie, kolejno lub osobno.

6. Zastosowanie według zastrz. 5, znamienne tym, że interferon jest interferonem-β.

7. Zastosowanie według dowolnego z zastrz. 1-6, znamienne tym, że osteopontyna jest stosowana w ilości 0,001 do 100 mg/kg ciężaru ciała lub 1 do 10 mg/kg ciężaru ciała, lub 5 mg/kg ciężaru ciała.

8. Zastosowanie cząsteczki kwasu nukleinowego do wytwarzania leku do leczenia i/lub zapobiegania chorobie neurologicznej, przy czym cząsteczka kwasu nukleinowego obejmuje sekwencję kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd obejmujący sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z:

(a) polipeptydu obejmującego SEKW. Nr ID: 1;

(b) polipeptydu obejmującego aminokwasy 1 do 168 lub 170 SEKW. Nr ID: 1;

(c) polipeptydu obejmującego aminokwasy 1 do 16 i 170 do 314 SEKW. Nr ID: 1;

(d) polipeptydu obejmującego aminokwasy 170 do 314 SEKW. Nr ID: 1;

(e) polipeptydu obejmującego SEKW. Nr ID: 2;

(f) polipeptydu obejmującego SEKW. Nr ID: 3;

(g) muteiny dowolnego z (a) do (f), w której sekwencja aminokwasową jest co najmniej w 90% identyczna z co najmniej jedną z sekwencji z (a) do (f) i która oddziaływuje z integryną av i/lub CD44;

(h) muteiny dowolnego z (a) do (f), która jest kodowana przez sekwencję DNA hybrydyzującą z komplementarną sekwencją do sekwencji natywnego DNA kodującej dowolny z (a) do (f) w wysoce ostrych warunkach i która oddziaływuje z integryną av i/lub CD44;

(i) muteiny dowolnego z (a) do (f), w której dowolna zmiana w sekwencji aminokwasowej jest konserwatywną substytucją aminokwasów w sekwencji aminokwasowej z (a) do (f) i która oddziaływuje z integryną av i/lub CD44;

(j) izoformy, białka fuzyjnego lub aktywnej frakcji dowolnego z (a) do (f), które oddziaływują z integryną av i/lub CD44;

PL 211 763 B1 przy czym choroba neurologiczna jest wybrana z grupy składającej się z urazowego uszkodzenia nerwu, neuropatii obwodowej, neuropatii cukrzycowej, stwardnienia rozsianego (SM) oraz choroby neurologicznej spowodowanej wrodzonym zaburzeniem metabolicznym.

9. Zastosowanie według zastrz. 8, znamienne tym, że cząsteczka kwasu nukleinowego ponadto obejmuje sekwencję wektora ekspresyjnego.

10. Zastosowanie według zastrz. 8 albo 9, znamienne tym, że lek jest przeznaczony do terapii genowej.

11. Zastosowanie komórki zmodyfikowanej genetycznie do wytwarzania osteopontyny do wytwarzania leku do leczenia i/lub zapobiegania chorobie neurologicznej wybranej z grupy składającej się z urazowego uszkodzenia nerwu, neuropatii obwodowej, neuropatii cukrzycowej, stwardnienia rozsianego (SM) oraz choroby neurologicznej spowodowanej wrodzonym zaburzeniem metabolicznym, przy czym osteopontyna jest wybrana z grupy składającej się z:

(a) polipeptydu obejmującego SEKW. Nr ID: 1;

(b) polipeptydu obejmującego aminokwasy 1 do 168 lub 170 SEKW. Nr ID: 1;

(c) polipeptydu obejmującego aminokwasy 1 do 16 i 170 do 314 SEKW. Nr ID: 1;

(d) polipeptydu obejmującego aminokwasy 170 do 314 SEKW. Nr ID: 1;

(e) polipeptydu obejmującego SEKW. Nr ID: 2;

(f) polipeptydu obejmującego SEKW. Nr ID: 3;

(g) muteiny dowoinego z (a) do (f), w której sekwencja aminokwasową jest co najmniej w 90% identyczna z co najmniej jedną z sekwencji z (a) do (f) i która oddziaływuje z integryną av i/lub CD44;

(h) muteiny dowolnego z (a) do (f), która jest kodowana przez sekwencję DNA hybrydyzującą z komplementarną sekwencją do sekwencji natywnego DNA kodującej dowolny z (a) do (f) w wysoce ostrych warunkach i która oddziaływuje z integryną av i/lub CD44;

(i) muteiny dowolnego z (a) do (f), w której dowolna zmiana w sekwencji aminokwasowej jest konserwatywną substytucją aminokwasów w sekwencji aminokwasowej z (a) do (f) i która oddziaływuje z integryną av i/lub CD44;

(j) soli lub izoformy, białka fuzyjnego, funkcjonalnej pochodnej, aktywnej frakcji lub koliście permutowanej pochdnej dowolnej z (a) do (f), które oddziaływują z integryną av i/lub CD44.

12. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera osteopontynę i interferon-β, ewentualnie razem z jedną lub więcej farmaceutycznie dopuszczalnymi zarobkami, do leczenia i/lub zapobiegania chorobie neurologicznej wybranej z grupy składającej się z urazowego uszkodzenia nerwu, neuropatii obwodowej, neuropatii cukrzycowej, stwardnienia rozsianego (SM) oraz choroby neurologicznej spowodowanej wrodzonym zaburzeniem metabolicznym, przy czym osteopontyna jest wybrana z grupy składającej się z:

(a) polipeptydu obejmującego SEKW. Nr ID: 1;

(b) polipeptydu obejmującego aminokwasy 1 do 168 lub 170 SEKW. Nr ID: 1;

(c) polipeptydu obejmującego aminokwasy 1 do 16 i 170 do 314 SEKW. Nr ID: 1;

(d) polipeptydu obejmującego aminokwasy 170 do 314 SEKW. Nr ID: 1;

(e) polipeptydu obejmującego SEKW. Nr ID: 2;

(f) polipeptydu obejmującego SEKW. Nr ID: 3;

(g) muteiny dowolnego z (a) do (f), w której sekwencja aminokwasową jest co najmniej w 90% identyczna z co najmniej jedną z sekwencji z (a) do (f) i która oddziaływuje z integryną av i/lub CD44;

(h) muteiny dowolnego z (a) do (f), która jest kodowana przez sekwencję DNA hybrydyzującą z komplementarną sekwencją do sekwencji natywnego DNA kodującej dowolny z (a) do (f) w wysoce ostrych warunkach i która oddziaływuje z integryną av i/lub CD44;

(i) muteiny dowolnego z (a) do (f), w której dowolna zmiana w sekwencji aminokwasowej jest konserwatywną substytucją aminokwasów w sekwencji aminokwasowej z (a) do (f) i która oddziaływuje z integryną av i/lub CD44;

(j) soli lub izoformy, białka fuzyjnego, funkcjonalnej pochodnej, aktywnej frakcji lub koliście permutowanej pochdnej dowolnej z (a) do (f) które oddziaływują z integryną av i/lub CD44.