KR102425326B1

KR102425326B1 - 알츠하이머병 및 관련 병태의 치료 또는 예방 방법

Info

Publication number: KR102425326B1
Application number: KR1020187037154A
Authority: KR
Inventors: 마야 코론요; 알탄치멕 렌트센도르지; 요세프 코론요; 키이스 엘 블랙
Original assignee: 세다르스-신나이 메디칼 센터
Priority date: 2016-05-20
Filing date: 2017-05-22
Publication date: 2022-07-25
Also published as: JP2019519515A; US20230414658A1; US11058720B2; US11779600B2; EP3458036A4; WO2017201539A1; US20190290687A1; KR20190009374A; EP3458036B1; CN109600992A; US20210290670A1; EP3458036A1

Abstract

본 발명은 OPN 발현을 증가시킴으로써 알츠하이머병 및 관련 병태의 가능성을 치료, 예방, 감소시키거나, 또는 그의 증상을 완화시키는 방법을 기술한다. 본 발명은 인지 기능의 개선을 필요로 하는 대상에서 인지 기능을 개선하는 방법을 추가로 제공한다.

Description

알츠하이머병 및 관련 병태의 치료 또는 예방 방법

본 발명은 알츠하이머병 및 관련 병태의 치료 및 예방에 관한 것이다.

본원에서의 모든 공보들은 각각의 개별 공보 또는 특허 출원이 구체적으로 및 개별적으로 참조로 포함되는 것으로 표시된 것과 동일한 정도로 참조로 포함된다. 하기 설명은 본 발명을 이해하는데 유용할 수 있는 정보를 포함한다. 본원에 제공된 임의의 정보가 선행기술이거나 본원에서 청구된 발명과 관련이 있다고 인정하거나, 명시적으로 또는 암시적으로 언급된 임의의 공보들이 선행기술이라고 인정하는 것은 아니다.

알츠하이머병은 아밀로이드-β 단백질, 특히 신경독성 가용성 아밀로이드-β_1-42 펩타이드의 뇌 축적 및 아밀로이드-β 플라크의 세포외 응집과 밀접한 관련이 있다. 아밀로이드생성(amyloidogenic) 아밀로이드-β 형태의 상당한 증가는 신경염증 및 비정상적인 타우(tau) 단백질(MAPT에 의해 코딩됨)을 함유하는 하류 세포내 신경원섬유 매듭(neurobrillary tangle)과 연관되어 있다. 이들은 인지 저하를 일으키는 시냅스 및 뉴런 손실의 주 원인으로 여겨진다. 산발적 형태의 알츠하이머병에서 뇌 아밀로이드-β의 연령 의존적 축적은, 가족성 알츠하이머병 사례에서 관찰되는 것과 같이, 아밀로이드-β₁ _-42의 과잉생산보다는 그의 불충분한 제거 때문인 것으로 보인다.

따라서, 알츠하이머병의 가능성을 치료, 예방 또는 감소시키는 방법, 및 관련 병리학을 다루는 방법이 당업계에 필요하다.

도면의 간단한 설명

예시적인 구현예가 참조된 도면에 도시되어 있다. 본원에 개시된 구현예 및 도면은 제한적이라기보다는 예시적인 것으로 간주되고자 하는 것이다.

도 1A-1D는 본 발명의 다양한 구현예에 따라 Aβ₁ _-42 어셈블리가 일차 피질 뉴런에서 시냅스 손실을 유도한다는 것을 도시한다.

도 2A-2E는 본 발명의 다양한 구현예에 따라 GA 처리된 MΦ가 일차 피질 뉴런(CN)에서 Aβ₁ _-42 유도 시냅스 및 신경돌기 손실을 방지한다는 것을 보여준다.

도 3A-3E는 본 발명의 다양한 구현예에 따라 AD+ 뇌에서 GA 면역화되고 입양 전달된 Mo에서의 시냅스 보존을 도시한다.

도 4A-4D는 본 발명의 다양한 구현예에 따라 EEA1⁺ 엔도솜에서 잘 정의된 f/pf/oAβ_1-42 어셈블리가 세포내 6E10⁺-Aβ를 갖는 MΦ(CD36, 스캐빈져 수용체)에 의해 유의하게 삼켜진다는 것을 보여준다.

도 5A-5D는 본 발명의 다양한 구현예에 따라 GA가 fAβ₁ _-42의 향상된 세포 흡수와 함께 MΦ에서 OPN 발현을 유도한다는 것을 보여준다.

도 6A-6B는 본 발명의 다양한 구현예에 따라 GA 면역화된 AD+ 마우스 뇌에서 침윤성 MΦ에 의해 유발된 증가된 OPN 수준을 도시한다. 도 6A) PBS 또는 GA 처리된 AD 마우스 뇌의 대표적인 형광 현미경 사진. 도 6B) 정량 다요인 상관도표(Quantitative multifactor correlogram) 분석(피어슨 검정; 동물당)은 GA 면역화되고 GA+Mo^BM 처리된 ADtg 마우스에서 OPN과 증가된 단핵구 침윤 사이의 유의한 선형 연관성, 및 Aβ 플라크 부담(burden)에 대한 역 관계를 입증하였다.

도 7A-7C는 본 발명의 다양한 구현예에 따라 MΦ fAβ₁ _-42식세포 작용(phagocytosis)에 대한 OPN 억제의 효과를 도시한다.

도 8A-8D는 본 발명의 다양한 구현예에 따라 안정화된 Aβ 어셈블리의 생산 및 정제를 도시한다.

도 9A-9B는 본 발명의 다양한 구현예에 따라 A) 시험관내 실험(일 단위 시간표) 및 B) 생체내 실험(월 단위 시간표)의 개략도를 도시한다.

도 10A-10F는 본 발명의 다양한 구현예에 따라 ADtg(AD) 및 야생형(WT) 마우스의 뇌에서의 OPN 발현 패턴을 도시한다. 도 10A) 관상 뇌 절편에 대한 정량화 방안. 브레그마(bregma) -2.65 mm에서 마우스 뇌의 대표적인 니슬(Nissl) 염색 이미지. 척도: 1 mm. 대상 피질(cingulate cortex)(CC)(Comi et al., Journal of Alzheimer's disease: 2010 JAD 19:1143-1148), 해마(HC) 및 내후각 피질(EC)(Comi et al., Journal of Alzheimer's disease: 2010 JAD 19:1143-1148)을 후속 정량 분석에 포함시켰다. 도 10B) 항-OPN, 항-인간 Aβ(6E10), 및 핵(DAPI)에 대해 면역표지된, ADtg 및 연령 일치된 WT 마우스의 뇌의 대표적인 형광 현미경 사진. OPN 면역염색은 모든 AD 연관 뇌 영역에서 ADtg 마우스의 Aβ 플라크 내부 및 주위에서 검출되었다(HC, CC 및 EC - 화살표). WT 동물에서, Aβ 또는 OPN 면역표지화는 검출되지 않았다. 도 10C) ADtg 마우스에서 OPN의 과산화효소 표지화. EC의 II / III 층에 풍부하며 종종 플라크 유사 구조를 형성하는, OPN 면역반응성(DAB). 도 10D) CC 및 EC에서 OPN, NeuN, Tuj1 및 GFAP 발현. 도 10E) CC 및 HC에서 OPN, Iba1 및 DAPI 발현. 도 10F) 13 및 24개월령 마우스의 뇌 샘플에서 OPN ELISA. 척도: 도시되지 않은 경우, 100 μm; 삽도: 10 μm.

도 11A-11L은 본 발명의 다양한 구현예에 따라 ADtg 마우스에서의 GA 면역화가 Aβ 플라크 부담을 감소시키면서 뇌 OPN 발현을 증가시킨다는 것을 도시한다. 도 11A) HC(20x, 상부 행) 및 CC(63x, 중간 행) 영역으로부터의 관상 뇌 절편의 형광 현미경 사진은 모든 실험 그룹인 GA, GA+Mo^BM, 및 PBS 대조군 ADtg 마우스에 대한 OPN 및 Aβ(6E10,) 발현 패턴을 나타내었다. DAPI는 핵을 염색하는데 사용되었다. 하부 행은 OPN(하부 좌측 패널) 및 Aβ(하부 우측 패널)의 단일 채널을 포함한다. 이식된 Mo^BM를 갖거나 갖지 않는 GA 면역화된 그룹은 PBS 대조군과 비교하여 향상된 뇌 OPN 발현 및 감소된 플라크 부담을 나타내었다. 척도: 100 μm. 도 11B-11D) 도 11B) 총 OPN-면역반응성(IR) 면적, 도 11C) 6E10⁺-플라크 면적, 및 도 11D) 각 절편에 대한 OPN-IR 면적 대 6E10⁺-플라크 면적의 비율의 정량 IHC 분석. 도 11E) 각 절편에 대한 OPN 대 4G8의 비율. 도 11F) 각 절편에 대한 OPN 대 Aβ₄₂ 수준의 비율. 도 11G) 뇌에서 OPN ELISA. 도 11H, 11I) 도 11H) 총 뇌 영역 및 도 11I) 피질 영역에서 OPN25 IR 면적과 Aβ 플라크 부담 사이의 상관관계 분석. 도 11J) OPN ELISA 및 Aβ 플라크 면적 사이의 상관관계 분석. 도 11K) OPN ELISA 및 불용성 Aβ₄₂ ELISA 사이의 상관관계 분석. 상관관계 분석은 피어슨 검정으로 수행하였다. 도 11L) WT 및 AD 마우스의 뇌에서의 OPN ELISA. PBS 대조군과 비교한 평균값의 배수 증가 또는 퍼센트 감소가 표시되어 있다. 그룹당 n=5-8 마우스. *p<0.05, ** p<0.001, ***p<0.0001, ****p<0.00001.

도 12A-12F는 본 발명의 다양한 구현예에 따라 ADtg 마우스의 GA 면역화가 혈관 뇌 아밀로이드 혈관병증(CAA) 부담을 감소시킨다는 것을 도시한다. OPN과의 감소된 혈관 Aβ 및 Aβ₁ _- ₄₀ 역 상관관계. 도 12A) PBS 및 GA 면역화된 ADtg 마우스에서의 Thio-S 염색. 도 12B) PBS, GA 처리된 및 GA-Mo^BM 처리된 마우스에서의 CAA 스코어. 마지막 3개의 그래프는 OPN ELISA와 가용성 Aβ₄₀과의 상관관계, OPN ELISA와 불용성 Aβ₄₀과의 상관관계 및 CAA 스코어와 OPN ELISA와의 상관관계를 입증한다. 도 12C-F) CAA 스코어와 불용성 Aβ₄₀과의 상관관계 분석(도 12C)_, CAA 스코어와 가용성 Aβ₄₀과의 상관관계 분석(도 12D), CAA 스코어와 ELISA 불용성 Aβ₄₂와의 상관관계 분석(도 12E) 및 CAA 스코어와 가용성 Aβ₄₂와의 상관관계 분석(도 12F).

도 13A-13G는 본 발명의 다양한 구현예에 따라 Aβ 플라크 제거와 연관된 침윤성 단핵구 유래 대식세포에 의한 뇌 OPN 발현을 도시한다. 도 13A-13C) GA 면역화된 ADtg 마우스의 CC 및 EC 영역으로부터의 관상 뇌 절편의 형광 현미경 사진. 주로 OPN 발현을 담당하는 Mo 유래 대식세포(MΦ)는 Aβ 플라크와 밀접하게 연관되었다. 도 13A) GA 면역화된 ADtg 마우스 뇌에서 조합된 Iba1 및 CD45 바이오마커 면역표지화로 확인된 침윤성 Mo/MΦ. 뇌 OPN, Aβ(6E10) 및 핵(DAPI)이 또한 나타나 있다. 화살표는 Aβ를 삼키는 침윤성 OPN 발현 Iba1⁺CD45^high MΦ를 나타낸다. 도 13B) OPN을 발현하는 EC 침윤성 단핵구가 또한 두 번째 접근법을 통해 GA+Mo^BM 처리된 ADtg 마우스 뇌에서 확인되었다: 증상이 있는 ADtg 마우스의 꼬리 정맥 내로 주사된 GFP 표지된 CD115⁺-단핵구 서브세트의 입양 전달. GFP⁺CD45^high 발현 단핵구는 높은 OPN 발현을 나타내었고, 상주하는 미세아교세포(GFP^-CD45^intermediate ^-low)와 구별될 수 있었다. 도 13C) OPN을 발현하는 Iba-1⁺ 골수단핵구 세포는, 특히 EC의 경계에서, 플라크와 연관되었다. 도 13D-13E) 세포체에 및 Iba1⁺돌기를 따라 소포 구획에서 세포하 OPN의 반점(Puncta) 염색 패턴. 신호는 핵주변 하위영역에서 특히 강하였다. 척도: 10 μm. 도 13F) HC, CC, EC, 및 조합된 뇌 영역(뇌)에서 OPN⁺CD45⁺ 세포수. GA 면역화된 그룹은 침윤성 OPN⁺ 골수단핵구 세포의 수가 상당히 증가하였다. PBS 대조군과 비교한 평균값의 배수 증가가 표시되어 있다. 도 13G) 상관관계 분석(피어슨 검정)은 OPN 발현 및 침윤성 Iba1⁺ CD45high 대식세포 사이의 강한 유의한 선형 연관성을 확인하였다. 그룹당 n=5-8 마우스. *p<0.05, **p <0.001, ***p<0.0001, ****p<0.00001.

도 14A-14J는 본 발명의 다양한 구현예에 따라 GA가 BM 유래 대식세포의 일차 배양액에서 OPN 발현을 상향조절한다는 것을 도시한다. 도 14A) 시험관내 연구의 실험 절차: 골수를 WT 마우스(8- 내지 12주령)로부터 단리하고, MCSF 농축 배지에서 6-7일 동안 배양하여 대식세포(MΦ^BM)로 분화시켰다. 6일에, 세포를 GA, siRNA, 미노사이클린 또는 siRNA와 함께 GA로 밤새 처리하였다. 7일에, 원섬유성 Aβ(fAβ_1-42)를 실험의 서브세트에 첨가하고, 식세포 작용 분석을 수행하였다. 브레펠딘 A(brefeldin A, BFA) 처리를 식세포 작용 3시간 전에 수행하였다. 도 14B-14C) Aβ에 노출하기 전, 및 BFA 처리하지 않거나(도 14B) 또는 BFA로 전처리한(도 14C), 시험관내 MΦ^BM 및 GA-MΦ^BM 세포의 형광 현미경 사진. OPN은 항-OPN 항체로 면역염색된다. MΦ^BM은 OPN을 발현하였고, GA 처리는 OPN 발현을 증가시켰다(도 14B: 삽도). MΦ^BM에서 수송 소포 내부에 위치한 세포하 OPN. 도 14C) OPN 분비의 BFA 억제 후 둥근 모양의 MΦ^BM. 도 14D) OPN-면역반응성 영역의 정량 ICC는 BFA 억제를 갖거나 BFA 억제 없이, Aβ에 노출 전, GA 처리 후 MΦ^BM에서 OPN의 상향조절을 밝혀내었다. 도 14E) GA 처리된 및 처리되지 않은 MΦ^BM으로부터의 세포 용해물에서 OPN 수준의 정량 ELISA. 도 14F) 염소 단클론 항-OPN 항체를 사용한, 전술한 실험 그룹으로부터의 세포 용해물의 대표적인 웨스턴 블롯 이미지. 도 14G) 웨스턴 블롯의 정량화. 결과는 ICC 및 ELISA 데이터를 반영하며, 이는 Aβ 노출에 관계없이 GA가 MΦ^BM에서 OPN 발현을 유의하게 유도하였다는 것을 나타낸다. PBS 대조군과 비교한 평균값의 배수 증가가 나타나 있다. BFA 처리된 및 처리되지 않은 세포 사이의 비교는 단시간 내(1시간 이내)에 OPN의 상당한 축적을 나타내었다. 도 14H) 골지, OPN 및 DAPI 염색의 형광 현미경 사진. 도 14I) OPN, EEA1 및 DAPI 염색의 형광 현미경 사진. 도 14J) 다양한 시점 동안 GA로 처리된 WT 마우스의 OPN ELISA. *p<0.05, ** p<0.001, ***p<0.0001, ****p<0.00001. 척도: 20 μm, 삽도 척도 5 μm.

도 15A-15P는 본 발명의 다양한 구현예에 따라 GA 처리된 대식세포에 의한 Aβ 원섬유(fibril) 흡수의 OPN 의존적 증가를 도시한다. 30분 동안 fAβ₁ _-42로 자극된 일차 배양액에서 MΦ^BM에서의 Aβ 흡수 및 OPN 발현의 대표적인 형광 현미경 사진 및 정량 분석. 도 15A) 세포하 OPN 발현 패턴과 함께 6E10⁺-Aβ의 세포내 흡수를 나타내는 고배율 Z-스택(Z-stack) 이미지. 도 15B-15C) GA 처리된 대 처리되지 않은 MΦ^BM에서 OPN 발현 및 세포내 Aβ의 정량 ICC. GA 처리는 24시간 지속되었다. 증가된 OPN 발현 및 fAβ₁ _-42의 향상된 세포 흡수는 GA 처리 후 발견되었다. 도 15D-15E) GA 처리된 대 처리되지 않은 MΦ^BM에서 OPN 수준 및 세포내 Aβ₁ _-42의 정량 ELISA. 도 15F) WT, KO 및 GA 처리된 WT 및 KO 마우스에서 OPN, CD36, 6E10 및 DAPI 염색의 형광 현미경 사진. 도 15G-15H') (도 15) 처리되지 않거나 또는 (도 15H-15H') GA 처리되고 OPN, CD68, 및 6E10에 대한 항체로 공동 표지된 MΦ^BM의 현미경 사진. 도 15H-15H') 향상된 fAβ₁ _-42 흡수를 나타내는 GA로 전처리된 MΦ^BM. 도 15I-15J) MΦ^BM 및 GA-MΦ^BM로부터의 세포 용해물의 ELISA 분석. 도 15K) GA 처리된 대 처리되지 않은 MΦ^BM에서 Aβ₄₀ 흡수의 정량 ICC. 도 15L) 처리되지 않은 대 siRNA^OPN으로 형질감염되어 fAβ₁ _-42 식세포 작용을 나타내는 MΦ^BM의 대표적인 현미경 사진. 도 15M-15N) 정량 ICC는 MΦ^BM 및 GA-MΦ^BM에서 OPN의 siRNA 매개 넉다운 후 감소된 OPN 발현 및 손상된 fAβ₁ _-42 식세포 작용을 밝혀내었다. 음성 대조군 스크램블된 siRNA(Franzen and Heinegard)는 OPN 발현 또는 Aβ 식세포 작용에 영향을 미치지 않았다. GA 첨가는 OPN 넉다운 후 OPN 발현 또는 Aβ 흡수에 거의 또는 전혀 영향을 미치지 않았다. 도 15O) 처리되지 않은 및 siRNA 형질감염된 것에서 OPN ELISA. 도 15P) 대조군, 넉아웃 및 GA 처리된 넉아웃에서의 Aβ 흡수. PBS 대조군과 비교한 평균값의 배수 증가 또는 퍼센트 감소가 표시되어 있다. 척도: 10μm. *p<0.05, **p<0.001, ***p<0.0001, ****p<0.00001.

도 16A-16J는 본 발명의 다양한 구현예에 따라 OPN이 대식세포에서 GA 획득된 치유촉진 표현형(pro-healing phenotype)을 매개한다는 것을 도시한다. 도 16A) 처리되지 않거나 GA 또는 siRNA^OPN으로 밤새 전처리되고 OPN에 대해 면역화된 일차 배양액에서 MΦ^BM의 형광 현미경 사진. 하부 행은 Zeiss Axiovision 소프트웨어에 의한 MΦ^BM 세포 길이를 나타낸다. 도 16B) 세포 길이 측정의 정량 분석. 항염증성 치유촉진 표현형으로의 MΦ^BM의 분극화는, 증폭된 OPN 발현을 갖는 GA 처리로부터 비롯되는 신장된 세포 모양과 연관되었다. siRNA에 의한 OPN 넉다운은 더 짧은 세포를 생산하였다. 도 16C) 24시간 동안 GA 또는 미노사이클린(M)로 처리된 다음 30분 동안 fAβ₁ _-42에 노출된 MΦ^BM의 형광 이미지. iNOS 및 6E10에 대해 면역염색된 세포. 도 16D-16E) 정량 ICC는 미노사이클린 처리가 iNOS 발현을 증가시켰고, 이는 결국 fAβ₁ _-42 식세포 작용을 감소시켰다는 것을 밝혀내었다. 도 16F) MMP-9, 6E10 및 SCARA-1에 대해 면역염색된 MΦ^BM의 형광 이미지. 도 16G) 정량 ICC는 GA 처리가 시험관내에서 MMP-9 발현을 증가시켰음을 밝혀내었다. 도 16H) WT, OPN KO 및 GA 처리된 OPN KO에서 MMP9 면적(μm²/세포). 도 16I-16J) 토끼-항-OPN 항체를 이용한 웨스턴 블롯 및 그의 각각의 정량 밴드 밀도 분석은 메탈로프로테이나아제(MMP) 단백질분해로부터 유래된 OPN 단편이, 상승된 MMP-9 생산과 일치하게도, GA 처리로 상승되었다는 것을 나타내었다. 증폭된 fAβ₁ _-42 식세포 작용을 야기하는, 항염증성 표현형으로의 MMP 매개 대식세포 분극화에 의한 OPN 분비 및 그의 단백질 분해. PBS 대조군과 비교한 평균값의 배수 증가 또는 퍼센트 감소가 표시되어 있다. 척도: 50μm. *p<0.05, **p<0.001, ***p<0.0001, ****p<0.00001.

도 17A-17C는 본 발명의 다양한 구현예에 따라 AD 병리학과 연관되지 않은 뇌 영역에서의 OPN의 발현 패턴을 도시한다. 도 17A) 항-OPN, Iba1⁺-미세아교세포 및 대식세포, 및 핵(DAPI)에 대해 면역표지된, ADtg 및 연령 일치된 WT 마우스 뇌로부터의 관상 절편의 형광 현미경 사진. OPN-면역염색의 패턴이 WT 및 ADtg 마우스의 선조체에서 검출되었다. OPN은 Iba1⁺ 미세아교세포/대식세포와 함께 공동표지되지 않지만, 뉴런을 면역표지화하였다. 도 17B) WT 대 ADtg 마우스에서 OPN의 과산화효소 이미징. WT 및 ADtg 마우스의 선조체에서의 OPN 면역반응성(DAB)은 뉴런에 선택적이며 미세아교세포 또는 대식세포에서 검출되지 않는다. 도 17C) 항-OPN, Tuj1-뉴런 및 핵(DAPI)에 대해 면역표지된, ADtg 및 연령 일치된 WT 마우스 뇌로부터의 관상 절편의 형광 현미경 사진. 척도: 100 μm.

도 18A-18D는 본 발명의 다양한 구현예에 따라 ADtg 마우스에서 면역 기반 개입 후 침윤성 단핵구에 의한 향상된 뇌 OPN 발현을 도시한다. 도 18A-18B) 뇌 절편(CC, EC 및 HC)의 정량 IHC 분석을 각 절편에 대해 도 18A) OPN-양성 면적, 및 도 18B) OPN-양성 면적 대 6E10⁺ 플라크 면적의 비율에 대해 평가하였다. GA 및 GA+Mo^BM 그룹은 PBS 대조군과 비교하여 모든 뇌 영역에서 증가된 OPN 발현을 나타내었다. 도 18B) 결과는 GA 및 GA+Mo^BM 처리 후 플라크당 유의하게 더 많은 OPN 발현을 나타내었다. 도 18C) CAA 스코어, OPN ELISA와 가용성 Aβ₄₂ ELISA와의 상관관계 분석, HC에서의 CAA 스코어와 OPN ELISA와의 상관관계 분석 및 CC에서의 CAA 스코어와 OPN ELISA와의 상관관계 분석. 도 18D) HC 및 CC에서의 CAA 스코어와 가용성 Aβ₄₀과의 상관관계 분석 및 HC 및 CC에서의 CAA 스코어와 불용성 Aβ₄₀과의 상관관계. PBS 대조군과 비교하여 평균값의 배수 변화가 표시되어 있다. 그룹당 N=5-8 마우스. *p<0.05, **p<0.001, ***p<0.0001, ****p<0.00001.

도 19A-19K는 본 발명의 다양한 구현예에 따라 뇌 OPN이 플라크 부담과 역 상관관계가 있고, 침윤성 단핵구 및 MMP-9와 직접 상관관계가 있다는 것을 도시한다. 도 19A) 향상된 정량 다요인 상관도표 분석은 GA 면역화된 및 GA+Mo^BM 처리된 ADtg 마우스에서 OPN 및 증가된 단핵구 침윤 사이에 유의한 선형 연관성을 입증하였다. OPN 및 Aβ 플라크 부담 사이에 역 관계가 발견되었다(절편당 상관관계 분석이 수행됨). 도 19B) 추가 상관관계 분석은 OPN:6E10 및 CD45hi:6E10(침윤성 단핵구) 사이에 유의한 양성 선형 상관관계를 확인하였다. 도 19C-19D) OPN 및 MMP-9 사이에(도 19) 및 OPN 발현 CD45^hi 단핵구 및 ADtg 마우스에서의 MMP-9 발현 사이의 유의한 선형 연관성을 입증하는 상관관계 분석. 결과는 총 뇌 MMP-9 및 OPN 수준 사이에 직접적인 상관관계 및 침윤성 OPN 발현 단핵구 및 뇌 MMP-9 수준 사이에 더 강한 상관관계를 밝혀내었다. 상관관계 분석은 피어슨 검정을 사용하여 수행하였다. 도 19E-19F) OPN ELISA와 MMP-9(도 19E) 및 MCP-1(도 19F)과의 상관관계 분석. 도 19G) PBS, GA 처리된 및 GA 처리된 Mo^BM에서의 CAA 스코어의 상관관계 분석. 도 19H-19K) 뇌 OPN 발현은 시냅스후 밀도(도 19H-19I) 및 감소된 인지 기능(도 19J-19K)과 상관관계가 있다. 그룹당 N=5-8 마우스. *p<0.05, **p<0.001, ***p<0.0001, ****p<0.00001.

도 20은 본 발명의 다양한 구현예에 따라 GA 면역화 및 ADtg 마우스의 단핵구를 이용한 혈액 농축이 인지 침착(cognitive deposit)을 감소시키고 시냅스후 보존을 증가시킨다는 것을 도시한다.

발명의 내용

본 발명의 다양한 구현예는, 다음을 필요로 하는 대상에서 알츠하이머병의 가능성을 치료, 예방 또는 감소시키거나, 알츠하이머병의 증상을 완화시키거나, 시냅스 구조 및/또는 인지 기능을 구제하거나, 병리학적 아밀로이드-β 형태의 제거를 향상시키거나, 또는 뉴런 구조 및 기능의 쇠퇴를 억제하는 방법으로서, 상기 대상에게 투여될 때 정상 대상에 비해 오스테오폰틴(OPN)의 수준을 증가시키는 조성물을 제공하는 단계; 및 OPN의 상기 수준을 증가시키기에 충분한 양의 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.

다양한 구현예에서, 조성물은 OPN을 발현하는 선천성 면역 세포, 재조합 OPN, OPN 단편, OPN 유도체, OPN 모방체, OPN 유사체, 또는 이들의 조합을 포함한다.

다양한 구현예에서, 조성물은 선천성 면역 세포에서 OPN의 발현을 자극한다. 다양한 다른 구현예에서, 선천성 면역 세포는 단핵구, 대식세포, 또는 이들의 조합을 포함한다.

일부 구현예에서, 단핵구는 골수 유래 단핵구, 비장 유래 단핵구, CD115 양성 단핵구(CD115⁺단핵구), 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 다른 구현예에서, 단핵구는 침윤성 단핵구이며, 뇌에서 OPN을 발현하는 대식세포가 된다. 또 다른 구현예에서, 선천성 면역 세포는 식작용성이다.

다양한 구현예에서, 글라티라머 아세테이트(GA)는 선천성 면역 세포에서 OPN의 발현을 자극하기 위해 투여된다. 일부 구현예에서, 선천성 면역 세포는 생체외 또는 생체내에서 자극된다.

다양한 구현예에서, OPN을 발현하는 선천성 면역 세포는 입양 세포 전달 또는 골수 이식에 의해 대상에게 투여된다. 다양한 구현예에서, 선천성 면역 세포는 OPN을 과발현한다.

다양한 구현예에서, 조성물은 대상으로의 직접 전달, 바이러스 벡터 전달, 리포좀 전달 시스템 또는 나노약물 전달 시스템으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법에 의해 투여된다.

다양한 구현예에서, 알츠하이머병의 증상은 기억 상실, 인지의 비기억 측면의 저하, 손상된 추리 또는 판단, 행동 변화, 다단계 작업의 수행, 환각, 망상, 편집증, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

다양한 구현예에서, 조성물의 투여는 MMP-9를 증가시킨다.

다양한 구현예에서, 상승된 OPN 발현은 대상에서 잘못 접힌(misfolded) 단백질의 수준을 감소시킨다. 다양한 다른 구현예에서, 잘못 접힌 단백질은 아밀로이드 베타(Aβ)이다. 또 다른 구현예에서, Aβ는 Aβ₄₀ 및/또는 Aβ₄₂이다.

본 발명의 다양한 구현예는 또한 상기 대상에게 투여될 때 정상 대상에 비해 오스테오폰틴(OPN)의 수준을 증가시키는 조성물을 제공하는 단계; 및 OPN의 상기 수준을 증가시키기에 충분한 양의 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 인지 기능의 개선을 필요로 하는 대상에서 인지 기능을 개선하는 방법을 제공한다.

일부 구현예에서, 조성물은 선천성 면역 세포에서 OPN의 발현을 자극한다. 다양한 다른 구현예에서, 선천성 면역 세포는 단핵구, 대식세포, 또는 이들의 조합을 포함한다. 다른 구현예에서, 단핵구는 골수 유래 단핵구, 비장 유래 단핵구, CD115 양성 단핵구(CD115+ 단핵구), 또는 이들의 조합을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 단핵구는 침윤성 단핵구이며, 뇌에서 OPN을 발현하는 대식세포가 된다. 특정 구현예에서, 선천성 면역 세포는 식작용성이다.

다양한 구현예에서, 조성물은 글라티라머 아세테이트(GA)를 포함한다. 다양한 다른 구현예에서, 선천성 면역 세포는 생체외 또는 생체내에서 자극된다.

다양한 구현예에서, 조성물의 투여는 MMP-9를 증가시킨다. 다양한 다른 구현예에서, OPN의 증가된 수준은 대상에서 잘못 접힌 단백질 수준의 감소, 대상에서 염증의 감소, 대상에서 시냅스 재생의 증가, 대상에서 아밀로이드 베타(Aβ) 플라크 부위로의 대식세포의 동원, 또는 이들의 조합을 유도한다.

다른 구현예에서, 잘못 접힌 단백질은 Aβ이다. 또 다른 구현예에서, Aβ는 Aβ₄₀ 및/또는 Aβ₄₂이다

다양한 구현예에서, 증가된 OPN 발현을 가진 선천성 면역 세포는 이를 필요로 하는 대상의 혈액 및/또는 뇌에 투여될 수 있다.

본원에 인용된 모든 문헌은 완전히 제시된 것처럼 그 전체가 참조로 포함된다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 문헌[Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 3 ^rd ed., Revised, J. Wiley & Sons (New York, NY 2006); March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 7 ^th ed., J. Wiley & Sons (New York, NY 2013); and Sambrook and Russel, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 4 ^th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (Cold Spring Harbor, NY 2012)]은 당업자에게 본 출원에 사용된 많은 용어에 대한 일반적인 지침을 제공한다. 항체를 제조하는 방법에 관한 문헌은 D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual 2 ^nd ed. (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor NY, 2013); Kohler and Milstein, (1976) Eur. J. Immunol. 6: 511; Queen et al. U. S. Patent No. 5,585,089; and Riechmann et al., Nature 332: 323 (1988); U.S. Pat. No. 4,946,778; Bird, Science 242:423-42 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988); Ward et al., Nature 334:544-54 (1989); Tomlinson I. and Holliger P. (2000) Methods Enzymol, 326, 461-479; Holliger P. (2005) Nat. Biotechnol. Sep;23(9):1126-36)를 참고한다.

당업자는, 본 발명의 실시에 사용될 수 있는, 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 많은 방법 및 물질을 인식할 것이다. 실제로, 본 발명은 기재된 방법 및 물질에 결코 제한되지 않는다.

본원에 사용된 바와 같이, "OPN"은 오스테오폰틴을 지칭하며, 그의 언급은 전장, 기능적 단편, 생물학적 활성 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, OPN 유사체, 유도체 및/또는 모방체가 또한 언급될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, "입양 세포 전달"은 대상 내로 세포를 전달하는 것을 지칭한다. 세포는 대상으로부터 또는 또 다른 개체(공여체)로부터 유래되었을 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, "선천성 면역 세포"는, 비제한적으로 단핵구, 대식세포, 호중구, 호산구, 호염기구 및/또는 자연 살해 세포를 포함하는, 선천성 면역 시스템의 세포를 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같이, 질환, 장애 또는 의학적 병태와 관련하여 사용될 때 용어 "치료하다," "치료," "치료하는," 또는 "개선"은 치료적 치료 및 예방적 조치 모두를 지칭하며, 목적은 증상 또는 병태의 진행 또는 중증도를 예방, 역전, 완화, 개선, 억제, 완화, 지연 또는 정지시키는 것이다. 용어 "치료하는"은 병태의 적어도 하나의 부작용 또는 증상을 감소시키거나 완화시키는 것을 포함한다. 치료는 일반적으로 하나 이상의 증상 또는 임상 마커가 감소되는 경우 "효과적"이다. 대안적으로, 치료는 질환, 장애 또는 의학적 병태의 진행이 감소되거나 중단되는 경우 "효과적"이다. 즉, "치료"는 증상 또는 마커의 개선뿐만 아니라, 치료의 부재시 예상될 증상의 진행 또는 악화의 중지 또는 적어도 지연을 포함한다. 또한, "치료"는 유익한 결과를 추구하거나 얻는 것을 의미하거나, 또는 치료가 궁극적으로 실패한 경우에도 병태를 발병시키는 개체의 가능성을 낮추는 것을 의미할 수 있다. 치료가 필요한 사람들은 이미 병태를 가진 사람들뿐만 아니라 병태에 걸리기 쉬운 사람들 또는 병태가 예방되어야 할 사람들을 포함한다.

용어 "치료적 유효량"은 대상 또는 포유동물에서 질환 또는 장애를 "치료"하는데 효과적인 세포 집단, 자극되거나 유전적으로 변형된 세포, 항체, 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 작은 유기 분자, 또는 다른 약물의 양을 지칭한다. 알츠하이머병의 경우, OPN의 치료적 유효량은 알츠하이머병 증상의 중증도를 감소시킬 수 있다. 이들은, 비제한적으로, 기억 상실, 인지의 비기억 측면의 저하, 손상된 추리 또는 판단, 행동 변화, 다단계 작업의 수행, 환각, 망상, 및 편집증을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같이, "대상"은 인간 또는 동물을 의미한다. 일반적으로, 동물은 영장류, 설치류, 가축 또는 게임 동물과 같은 척추동물이다. 영장류는 침팬지, 시노몰구스 원숭이, 스파이더 원숭이, 및 마카크(macaque), 예컨대, 레서스(Rhesus)를 포함한다. 설치류는 마우스, 랫트, 우드척(woodchuck), 흰담비(ferret), 토끼 및 햄스터를 포함한다. 가축 및 게임 동물은 소, 말, 돼지, 사슴, 들소, 버팔로, 고양이 종, 예컨대, 애완용 고양이, 및 개 종, 예컨대, 개, 여우, 늑대를 포함한다. 용어, "환자", "개체" 및 "대상"은 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 일 구현예에서, 대상은 포유동물이다. 본원에 사용된 바와 같이 "포유동물"은 비제한적으로, 인간 및 비인간 영장류, 예컨대 침팬지 및 다른 유인원 및 원숭이 종; 농장 동물, 예컨대 소, 양, 돼지, 염소 및 말; 애완용 포유동물, 예컨대 개 및 고양이; 설치류, 예컨대 마우스, 랫트 및 기니어 피그를 포함하는 실험실 동물 등을 포함하는 포유류 강(class)의 임의의 구성원을 지칭한다. 용어는 특정 연령 또는 성별을 나타내지 않는다. 따라서, 성인 및 신생 대상뿐만 아니라 태아도 남성이든 여성이든 간에 이 용어의 범위에 속하는 것으로 의도된다.

본원에 기술된 바와 같이, 본 발명자들은 GA 면역화된 ADtg 마우스의 내후각 피질, 대상 피질, 및 해마에서 감소된 아밀로이드 β-단백질(Aβ) 플라크와 함께 오스테오폰틴의 상향조절을 발견하였다. GA 및 CD115⁺ 단핵구의 말초 혈액 농축을 조합하는 처리는 잔여 Aβ 플라크를 둘러싸는 오스테오폰틴 수준을 더 증가시켰다. 오스테오폰틴은 Aβ-플라크 흡수에 관여하는 침윤성 단핵구 유래 대식세포에 의해 주로 발현되었다. 생체내 결과를 확증하는 시험관내 연구는, GA가 골수 유래 대식세포에서 오스테오폰틴 발현을 직접 상향조절하고 Aβ에 매우 식작용성인 항염증성 표현형을 더 촉진한다는 것을 나타내었다. 임의의 특정 이론에 구속되지 않으면서, 이 연구는 AD 모델에서 GA 활성화된 대식세포의 치료적 효과의 매개자로서 오스테오폰틴의 새로운 역할을 시사한다.

본 발명의 다양한 구현예는 적어도 부분적으로 이러한 발견에 기초하며, OPN을 상승시키는 방법, 알츠하이머병의 가능성을 치료, 예방 또는 감소시키는 방법, 및 인지 기능의 개선을 필요로 하는 대상에서 인지 기능을 개선하는 방법에 대한 당업계의 요구를 다룬다.

알츠하이머병의 치료

본 발명의 다양한 구현예는 또한 상기 대상에게 투여될 때 정상 대상에 비해 오스테오폰틴(OPN)의 수준을 증가시키는 조성물을 제공하는 단계; 및 OPN의 상기 수준을 증가시키기에 충분한 양의 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 알츠하이머병을 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명의 다양한 구현예는 또한 상기 대상에게 투여될 때 정상 대상에 비해 오스테오폰틴(OPN)의 수준을 증가시키는 조성물을 제공하는 단계; 및 OPN의 상기 수준을 증가시키기에 충분한 양의 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 알츠하이머병을 예방하는 방법을 제공한다.

본 발명의 다양한 구현예는 또한 상기 대상에게 투여될 때 정상 대상에 비해 오스테오폰틴(OPN)의 수준을 증가시키는 조성물을 제공하는 단계; 및 OPN의 상기 수준을 증가시키기에 충분한 양의 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 알츠하이머병의 가능성을 감소시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 다양한 구현예는 또한 상기 대상에게 투여될 때 정상 대상에 비해 오스테오폰틴(OPN)의 수준을 증가시키는 조성물을 제공하는 단계; 및 OPN의 상기 수준을 증가시키기에 충분한 양의 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 알츠하이머병의 증상을 완화시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 다양한 구현예는 또한 상기 대상에게 투여될 때 정상 대상에 비해 오스테오폰틴(OPN)의 수준을 증가시키는 조성물을 제공하는 단계; 및 OPN의 상기 수준을 증가시키기에 충분한 양의 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 알츠하이머병에서 시냅스 구조를 구제하는 방법을 제공한다.

본 발명의 다양한 구현예는 또한 상기 대상에게 투여될 때 정상 대상에 비해 오스테오폰틴(OPN)의 수준을 증가시키는 조성물을 제공하는 단계; 및 OPN의 상기 수준을 증가시키기에 충분한 양의 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 알츠하이머병에서 인지 기능을 구제하는 방법을 제공한다.

본 발명의 다양한 구현예는 상기 대상에게 투여될 때 정상 대상에 비해 오스테오폰틴(OPN)의 수준을 증가시키는 조성물을 제공하는 단계; 및 OPN의 상기 수준을 증가시키기에 충분한 양의 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 병리학적 아밀로이드-β 형태의 제거를 향상시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 다양한 구현예는 상기 대상에게 투여될 때 정상 대상에 비해 오스테오폰틴(OPN)의 수준을 증가시키는 조성물을 제공하는 단계; 및 OPN의 상기 수준을 증가시키기에 충분한 양의 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 뉴런 구조 및 기능의 쇠퇴를 억제하는 방법을 제공한다.

일부 구현예에서, 단핵구는 골수 유래 단핵구, 비장 유래 단핵구, CD115 양성 단핵구(CD115⁺단핵구), 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 다른 구현예에서, 단핵구는 침윤성 단핵구이며, 뇌에서 OPN을 발현하는 대식세포가 된다. 일부 구현예에서, 단핵구는 OPN을 과발현한다. 다른 구현예에서, 대식세포는 OPN을 과발현한다. 또 다른 구현예에서, 선천성 면역 세포는 식작용성이다.

다양한 구현예에서, 조성물은 글라티라머 아세테이트(GA)를 포함한다. 일부 구현예에서, 선천성 면역 세포는 생체외 또는 생체내에서 자극된다.

다양한 구현예에서, 조성물의 투여는 MMP-9를 증가시킨다.

다양한 구현예에서, 상승된 OPN 발현은 대상에서 잘못 접힌 단백질의 수준을 감소시킨다. 다른 구현예에서, 잘못 접힌 단백질은 아밀로이드 베타(Aβ)이다. 또 다른 구현예에서, Aβ는 Aβ₄₀ 및/또는 Aβ₄₂이다. 다양한 구현예에서, 잘못 접힌 Aβ 단백질은 플라크 및/또는 혈관 Aβ 침착물을 포함한다.

본 발명의 다양한 구현예는 또한 혈액을 단핵구로 농축시키는 단계; 및 단핵구를 자극하여 뇌에서 오스테오폰틴(OPN) 발현을 증가시키는 단계를 포함하는, 알츠하이머병의 가능성을 치료, 예방 또는 감소시키거나, 알츠하이머병의 증상을 완화시키거나, 시냅스 구조 및/또는 인지 기능을 구제하거나, 병리학적 아밀로이드-β 형태의 제거를 향상시키거나, 또는 뉴런 구조 및 기능의 쇠퇴를 억제하는 방법을 제공한다.

다양한 구현예에서, 입양 세포 전달 또는 골수 이식은 단핵구를 투여하고 혈액을 단핵구로 농축시키기 위해 수행된다. 다양한 구현예에서, 단핵구는 OPN을 과발현한다. 일부 구현예에서, 입양 세포 전달을 사용하여 투여된 단핵구는 골수 유래 단핵구, 비장 유래 단핵구, CD115 양성 단핵구(CD115⁺단핵구), 또는 이들의 조합이다. 다른 구현예에서, 단핵구는 글라티라머 아세테이트(GA)로 자극된다. 다양한 구현예에서, 단핵구는 생체외 또는 생체내에서 자극된다.

다양한 구현예에서, 혈액을 단핵구로 농축시키는 것은 골수 및/또는 혈액으로부터 수집된 줄기 세포를 투여햐는 단계를 포함한다. 다양한 다른 구현예에서, 혈액을 단핵구로 농축시키는 것은 CD115 양성 단핵구(CD115⁺단핵구)를 투여하는 단계를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 단핵구는 침윤성 단핵구이며, 뇌에서 OPN을 발현하는 대식세포가 된다. 일부 구현예에서, 단핵구는 OPN을 과발현한다. 다른 구현예에서, 대식세포는 OPN을 과발현한다.

다양한 구현예에서, 알츠하이머병의 증상은 기억 상실, 인지의 비기억 측면의 저하, 손상된 추리 또는 판단, 행동 변화, 다단계 작업의 수행 불능, 환각, 망상, 편집증, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

다양한 구현예에서, 단핵구를 자극하는 것은 MMP-9를 증가시킨다.

본 발명의 다양한 구현예는 또한 알츠하이머병을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명의 다양한 구현예는 알츠하이머병의 증상을 완화시키는 방법을 제공한다. 알츠하이머병의 증상은 비제한적으로 기억 상실, 인지의 비기억 측면의 저하(예컨대, 단어 찾기, 시각/공간 문제), 손상된 추리 또는 판단, 행동 변화, 다단계 작업의 수행, 환각, 망상, 및 편집증을 포함한다. 본 발명의 다양한 구현예는 시냅스 구조 및/또는 인지 기능을 구제하는 방법을 제공한다. 본 발명의 다양한 구현예는 병리학적 아밀로이드-β 형태의 제거를 향상시키고 뉴런 구조 및 기능의 쇠퇴를 억제하는 방법을 제공한다.

다양한 구현예에서, 방법은 대상에서 골수 이식을 수행하는 단계를 포함한다. 추가 구현예에서, 방법은 글라티라머 아세테이트(GA)를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. GA를 투여하는 것은 반드시 골수 이식 후에 발생할 필요는 없다. 실제로, GA는 골수 이식 전에, 실질적으로 골수 이식과 함께, 및/또는 골수 이식 후에 투여될 수 있다.

일부 구현예에서, 골수 이식은 동종이계(allogeneic) 골수 이식이다. 일부 구현예에서, 골수 이식은 자가(autologous) 골수 이식이다. 일부 구현예에서, 골수 이식을 수행하는 것은 골수로부터 수집된 줄기 세포를 투여하는 단계를 포함한다. 다른 구현예에서, 골수 이식을 수행하는 것은 혈액으로부터 수집된 줄기 세포를 투여하는 단계(예컨대, 백혈구성분채집술(leukapheresis)을 통해)를 포함한다.

다양한 구현예에서, 방법은 대상에서 입양 세포 전달을 수행하는 단계를 포함한다.

일부 구현예에서, 입양 세포 전달을 수행하는 것은 대상에게 대식세포를 투여하는 단계를 포함한다. 추가 구현예에서, 방법은 글라티라머 아세테이트(GA)를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. GA를 투여하는 것은 반드시 입양 세포 전달 후에 발생할 필요는 없다. 실제로, GA는 골수 이식 전에, 실질적으로 골수 이식과 함께, 및/또는 골수 이식 후에 투여될 수 있다.

일부 구현예에서, 대식세포는 자가 대식세포이다. 다른 구현예에서, 대식세포는 동종이계 대식세포이다. 일부 구현예에서, 대식세포는 단핵구 유래 대식세포이다. 본원에 사용된 바와 같이 단핵구 유래 대식세포는 단핵구와 구별되는 대식세포를 지칭한다. 특정 구현예에서, 입양 세포 전달을 수행하는 것은 대상에게 단핵구 유래 대식세포를 투여하는 단계를 포함하며, 단핵구는 골수로부터 수득되었다. 일부 구현예에서, 대식세포는 글라티라머 아세테이트(GA)로 처리되었다. 특정 구현예에서, 방법은 GA로 처리된 단핵구 유래 대식세포를 대상에게 투여하는 단계를 포함한다.

일부 구현예에서, 입양 세포 전달을 수행하는 것은 골수 유래 단핵구를 대상에게 투여하는 단계를 포함한다. 추가 구현예에서, 방법은 글라티라머 아세테이트(GA)를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. GA를 투여하는 것은 반드시 입양 세포 전달 후에 발생할 필요는 없다. 실제로, GA는 골수 이식 전에, 실질적으로 골수 이식과 함께, 및/또는 골수 이식 후에 투여될 수 있다.

일부 구현예에서, 골수 유래 단핵구는 자가 골수 유래 단핵구이다. 본원에 사용된 바와 같이 골수 유래 단핵구는 골수로부터 수득된 단핵구를 지칭한다. 다른 구현예에서, 골수 유래 단핵구는 동종이계 골수 유래 단핵구이다. 일부 구현예에서, 골수 유래 단핵구는 CD115 양성 단핵구(CD115⁺단핵구)이다. 일부 구현예에서, 골수 유래 단핵구는 글라티라머 아세테이트(GA)로 처리되었다. 특정 구현예에서, 방법은 GA로 처리된 CD115⁺ 골수 유래 단핵구를 대상에게 투여하는 단계를 포함한다.

오스테오폰틴을 상승시키는 방법

본 발명의 다양한 구현예는 선천성 면역 세포에서 OPN의 발현 증가를 자극하여 OPN을 상승시키는 단계를 포함하는, 오스테오폰틴(OPN)을 상승시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 다양한 구현예는 OPN을 발현하는 선천성 면역 세포를 투여하여 OPN을 상승시키는 단계를 포함하는, 오스테오폰틴(OPN)을 상승시키는 방법을 제공한다.

다양한 구현예에서, OPN은 전장 OPN 또는 이의 기능적 단편이다. 다양한 구현예에서, OPN 발현은 선천성 면역 세포를 글라티라머 아세테이트(GA)로 자극함으로써 증가된다. 일부 구현예에서, 선천성 면역 세포는 생체외 또는 생체내에서 자극된다.

다양한 구현예에서, 방법은 증가된 OPN 발현을 가진 선천성 면역 세포를 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 증가된 OPN 발현을 가진 선천성 면역 세포는 이를 필요로 하는 대상의 혈액 및/또는 뇌에 투여된다.

다양한 구현예에서, 선천성 면역 세포는 식작용성이다. 다른 구현예에서, 선천성 면역 세포는 단핵구, 대식세포, 또는 이들의 조합을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 단핵구는 골수 유래 단핵구, 비장 유래 단핵구, CD115 양성 단핵구(CD115⁺단핵구), 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 다른 구현예에서, 단핵구는 침윤성 단핵구이며, 뇌에서 OPN을 발현하는 대식세포가 된다.

다양한 구현예에서, 방법은 전장 OPN 또는 이의 기능적 단편의 표적화된 전달을 추가로 포함한다. 다양한 구현예에서, 전장 OPN 또는 이의 기능적 단편의 표적화된 전달 방법은 재조합 OPN의 전달, 바이러스 벡터 전달, 리포좀 전달 시스템을 통한 전달, OPN을 함유하는 엑소좀의 전달 및 나노약물 전달 시스템으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

다양한 구현예에서, OPN을 상승시키는 것은 대상에서 알츠하이머병의 가능성의 치료, 예방 또는 감소 및/또는 알츠하이머병 증상의 개선을 초래한다.

다양한 구현예에서, OPN은 전장 OPN 또는 이의 기능적 단편이다. 다양한 구현예에서, OPN 발현은 선천성 면역 세포를 글라티라머 아세테이트(GA)로 자극시킴으로써 증가된다. 일부 구현예에서, 선천성 면역 세포는 생체외 또는 생체내에서 자극된다.

다양한 구현예에서, OPN은 전장 OPN 또는 이의 기능적 단편이다.

다양한 구현예에서, OPN은 전장 OPN 또는 이의 기능적 단편의 표적화된 전달에 의해 상승된다. 다양한 구현예에서, 전장 OPN 또는 이의 기능적 단편의 표적화된 전달 방법은 재조합 OPN의 전달, 바이러스 벡터 전달, 리포좀 전달 시스템을 통한 전달, OPN을 함유하는 엑소좀의 전달 및 나노약물 전달 시스템으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

다양한 구현예에서, OPN의 전달은 뇌에서 OPN을 상승시키고 대상에서 알츠하이머병의 가능성의 치료, 및/또는 예방 또는 감소를 초래한다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 OPN 기반 요법의 치료적 유효량을 포유동물에게 투여함으로써 알츠하이머병을 치료하고 알츠하이머병의 진행을 감소시키는 방법을 포함한다. 본 발명은 또한 알츠하이머병을 갖는 포유동물의 뇌 조직에 OPN을 전달하는 방법을 포함한다. 다양한 구현예에서, 포유동물은 인간이다. 임의의 특정 이론에 구속되기를 바라지 않으면서, OPN 기반 요법의 투여는 뇌에서 아밀로이드 플라크의 수준을 조절하고/하거나 이의 추가 형성을 방지할 것이며, 순환하는 단핵구 및/또는 단핵구 유래 대식세포의 표현형을 유리하게 변형함으로써 알츠하이머병의 치료에 효과적일 수 있다. 본원에 나타난 바와 같이, OPN 기반 요법의 투여는 보다 치유 촉진, 항염증성 및 매우 식작용성인 표현형으로 분극화되는 대식세포를 통한 Aβ 제거를 매개한다. 당업자는 이들 효과가 알츠하이머병의 치료에 유익하다는 것을 쉽게 알 것이다.

OPN을 상승시키는 방법은, 비제한적으로, 1) 내인성 OPN을 상승시키는 GA를 이용한 피하 면역화, 2) 바이러스 벡터(즉, AAV8 또는 AAV9)에서 발현된 재조합 OPN의 말초 혈액 또는 비강 전달, 3) OPN을 함유하는 엑소좀의 말초 주사, 4) OPN을 과발현하기 위해 GA로 전처리된 단핵구의 말초 혈액으로의 입양 전달 및 5) 혈액에 말초적으로 주사되거나 경구 투여되는 리포좀 전달 시스템 내의 캡슐화된 OPN.

다양한 구현예에서, 뇌에서 OPN을 상승시키는 것은 재조합 OPN의 전달, 바이러스 벡터 전달, 리포좀 전달 시스템을 통한 전달, OPN을 함유하는 엑소좀의 전달, 또는 나노약물 전달 시스템에 의해 달성된다.

본 발명의 다양한 구현예는 재조합 OPN의 치료적 유효량을 투여하여 대상의 뇌에 OPN을 전달함으로써 오스테오폰틴(OPN)을 상승시키는 방법을 제공한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "재조합 DNA 분자"는 비제한적으로 유전적 재조합(즉, 분자 클로닝)을 포함하는 당업자에게 공지된 분자 생물학 기술에 의해 연결된 DNA 절편을 포함하는 DNA 분자를 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "재조합 단백질" 또는 "재조합 폴리펩타이드"는 재조합 DNA 분자로부터 발현된 단백질 분자를 지칭한다.

재조합 OPN은 재조합 방법 및 화학적 합성을 포함하는 널리 공지된 방법을 사용하여 합성될 수 있다. 펩타이드를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 적합한 숙주 세포 내로 도입하는 것을 통해 펩타이드를 생산하는 재조합 방법은 당업계에 널리 알려져 있으며 또한 당업계에 널리 알려진 방법을 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Bodanszky, M., Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, New York, NY (1984); W.C. Chan and P.D. White (Eds.) Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, Oxford University Press, Cary, NC (2000); N.L. Benoiton, Chemistry of Peptide Synthesis, CRC Press, Boca Raton, FL (2005); J. Jones, Amino Acid and Peptide Synthesis, 2^nd Ed, Oxford University Press, Cary, NC (2002); and P. Lloyd-Williams, F. Albericio, and E. Giralt, Chemical Approaches to the synthesis of peptides and proteins, CRC Press, Boca Raton, FL (1997)]을 참고하며, 이들 모두의 내용은 본원에 참조로 포함되어 있다.

본 발명의 재조합 단백질/폴리펩타이드를 클로닝하고 발현하기 위한 시스템은 재조합 기술에서 널리 알려진 다양한 미생물 및 세포를 포함한다. 이들은, 예를 들어, 대장균(E. coli), 바실러스(Bacillus), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 및 사카로마이세스(Saccharomyces)의 다양한 균주뿐만 아니라 포유동물, 효모 및 곤충 세포를 포함한다. OPN은 폴리펩타이드 또는 융합 단백질로서 생산될 수 있다. 펩타이드를 생산하기 위한 적합한 벡터는 알려져 있으며 사립 및 공립 연구소 및 기탁기관 및 상업적 판매회사로부터 이용가능하다. 이후, 유전자 산물을 발현할 수 있는 수용 세포가 형질감염된다. 형질감염된 수용 세포는 재조합 유전자 산물의 발현을 허용하는 조건하에 배양되고, 이는 배양액으로부터 회수된다. 숙주 포유동물 세포, 예컨대 차이니즈 햄스터 난소 세포(CHO) 또는 COS-1 세포가 사용될 수 있다. 많은 이러한 비병원성 바이러스는 인간 유전자 요법을 위해, 그리고 다른 백신 제제를 위한 캐리어로서 일반적으로 사용되고, 당업자에게 공지되고 선택될 수 있다. 다른 적합한 숙주 세포의 선택 및 형질전환, 배양, 증폭, 스크리닝 및 생성물 생산 및 정제 방법은 공지된 기술을 참조하여 당업자에 의해 수행될 수 있다.

재조합 OPN은 전장 OPN 또는 이의 기능적 단편을 포함할 수 있다. 생성된 재조합 OPN은 바이러스 벡터에서 발현되거나, 리포좀에 캡슐화되거나, 엑소좀 상에서 발현되거나 또는 나노약물 전달 시스템에 포함될 수 있다.

본 발명의 다양한 구현예는 또한 바이러스 벡터 전달을 사용하여 대상의 뇌에 OPN을 전달함으로써 오스테오폰틴(OPN)을 상승시키는 방법을 제공한다. 다양한 구현예에서, OPN 바이러스 벡터는 대상에게 투여된다.

"벡터"는 적절한 제어 요소와 결합할 때 복제할 수 있고 세포 사이에서 유전자 서열을 전달할 수 있는, 플라스미드, 파아지, 트랜스포손, 코스미드, 염색체, 바이러스, 비리온 등과 같은 임의의 유전적 요소를 지칭한다. 따라서, 용어는 클로닝 및 발현 비히클뿐만 아니라 바이러스 벡터를 포함한다.

다양한 구현예에서, 바이러스 벡터는 AAV 벡터이다. "AAV 벡터"는 임의의 아데노 연관 바이러스 혈청형으로부터 유래된 임의의 벡터를 지칭하며, 비제한적으로, AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-7, AAV-8, AAV-9, 및 AAV-10 등을 포함한다. AAV 벡터는 전체적으로 또는 부분적으로 결실된 하나 이상의 AAV 야생형 유전자, 바람직하게는 Rep 및/또는 Cap 유전자를 갖지만, 기능적 측접 ITR 서열을 보유할 수 있다. 기능적 ITR 서열은 일반적으로 AAV 게놈의 회복, 복제, 패키징 및 잠재적 염색체 통합에 필요하다. 따라서, AAV 벡터는 바이러스의 복제 및 패키징을 위해 cis에서 요구되는 적어도 상기 서열(예컨대, 기능적 ITR)을 포함하는 것으로 본원에서 정의된다. ITR은 야생형 뉴클레오타이드 서열일 필요는 없으며, 서열이 기능적 구제, 복제 및 패키징을 제공하는 한 변경될 수 있다(예컨대, 뉴클레오타이드의 삽입, 결실 또는 치환에 의해).

"재조합 바이러스"는 유전적으로 변경된(예컨대, 이종 핵산 작제물을 입자 내로 부가 또는 삽입함으로써) 바이러스를 지칭한다.

"AAV 비리온"은 야생형("wt") AAV 바이러스 입자(즉, AAV 캡시드 단백질 코트와 결합된 선형, 단일 가닥 AAV 핵산 게놈을 포함함)와 같은 완전한 바이러스 입자를 지칭한다. 이와 관련하여, 상보적 센스의 단일 가닥 AAV 핵산 분자(즉, "센스" 또는 "안티센스" 가닥)는 임의의 하나의 AAV 비리온에 패키징될 수 있고; 두 가닥은 동등하게 감염성이다. 또한, AAV 캡시드 단백질 코트는 AAV 비리온의 표적에 따라 다양한 AAV 혈청형 중 어느 것으로부터 유래될 수 있다.

"재조합 AAV 비리온" 또는 "rAAV 비리온"은 AAV ITR의 양쪽에 측접된 관심 이종 DNA 분자(예컨대, OPN을 코딩하는 유전자)를 캡슐화하는, AAV 단백질 껍질로 구성된 감염성, 복제 결손 바이러스로서 본원에 정의된다. rAAV 비리온은 AAV 벡터, AAV Rep 및 Cap 기능 및 헬퍼 바이러스 기능이 도입된 적합한 숙주 세포에서 생산될 수 있다. 이러한 방식으로, 숙주 세포는 AAV 벡터(즉, 관심 재조합 뉴클레오타이드 서열을 함유함)를 복제하고 후속 유전자 전달을 위한 재조합 비리온 입자에 패키징하는데 필요한 AAV 복제 및 캡시드 단백질을 생산할 수 있게 된다. 완전한 전이유전자(transgene)는 프로모터, 코딩 서열, 일반적으로 cDNA 및 폴리아데닐화 신호로 이루어질 수 있다.

전이유전자는 또한 조절 서열 및 인트론 영역을 포함할 수 있다. 전이유전자 발현을 조절할 프로모터는 항시성, 유도성 및 조직 특이적 프로모터를 포함할 수 있다. 용어 "프로모터 영역"은 그의 통상적인 의미로 DNA 조절 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 영역을 지칭하기 위해 본원에 사용되며, 조절 서열은 RNA 중합효소에 결합하고 하류(3'-방향) 코딩 서열의 전사를 개시할 수 있는 유전자로부터 유래된다.

"유전자" 또는 "코딩 서열" 또는 특정 단백질을 "코딩"하는 서열은 적절한 조절 서열의 제어하에 놓일 때 시험관내 또는 생체내에서 폴리펩타이드로 전사되고(DNA의 경우) 번역되는(mRNA의 경우) 핵산 분자이다.

용어 "형질감염"은 세포에 의한 외래 DNA의 흡수를 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 세포는 외인성 DNA가 세포막 내부로 도입된 경우 "형질감염"되었다. 많은 형질감염 기술은 일반적으로 당업계에 알려져 있다. 예컨대, 문헌[Graham et al. (1973) Virology, 52:456, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Davis et al. (1986) Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier, and Chu et al. (1981) Gene 13:197]을 참고한다. 이러한 기술은 플라스미드 벡터 및 다른 핵산 분자와 같은 하나 이상의 외인성 DNA 모이어티를 적합한 숙주 세포 내로 도입하는데 사용될 수 있다. 용어는 유전적 물질의 안정적인 흡수 및 일시적인 흡수 모두를 지칭한다.

용어 "형질도입"은 바이러스 벡터 전달을 포함하는, 유전자 전달의 임의의 방법을 통해, 생체내 또는 시험관내에서 수용 세포에 DNA 분자를 전달하는 것을 의미한다.

AAV 벡터는 전사의 방향으로 성분들, (a) 전사 개시 영역을 포함하는 제어 요소,(b) 관심 OPN DNA 및(c) 전사 종결 영역을 적어도 제공하는 공지된 기술을 사용하여 제작된다. 또한, OPN 코딩 서열과 실질적으로 유사한 기능적 특성을 나타내기 위해 OPN 코딩 서열과 충분히 상동성인 임의의 코딩 서열이 본 발명의 대안적인 구현예와 관련하여 사용될 수 있다. 제어 요소는 표적화된 세포(들)에서 기능적이도록 선택된다. 성분들을 함유하는 생성된 작제물은 기능적 AAV ITR 서열과 결합될 수 있다(5' 및 3'). 본 발명의 벡터에 사용된 AAV ITR은 야생형 뉴클레오타이드 서열을 가질 필요가 없으며, 변경될 수 있다(예컨대, 뉴클레오타이드의 삽입, 결실 또는 치환에 의해). 또한, AAV ITR은 비제한적으로, AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAVX7, AAV-8, AAV-9, AAV-10 등을 포함하는 몇 개의 AAV 혈청형 중 어느 것으로 유래될 수 있다.

예를 들어, OPN 코딩 서열에 상응하는 이종 DNA를 포함하는 AAV 벡터는 당업계에 알려진 임의의 통상적인 기술에 의해 생성될 수 있다. 다양한 구현예에서, AAV 벡터는 (i) OPN 또는 이의 단편을 포함하는 제1 플라스미드를 제공하는 단계, (ii) 제1 플라스미드에 상보적이고 구제 및 패키징을 위한 성분을 포함하는 제2 플라스미드를 제공하는 단계, (iii) 제1 및 제2 플라스미드를 숙주 세포 내로 공동 형질감염시키는 단계, 및 (iv) 상기 공동 형질감염된 숙주 세포로부터 다량의 상기 AAV 벡터를 생성하는 단계의 과정에 의해 생산되며, 상기 제1 및 제2 플라스미드의 쌍은 상기 rAAV 벡터가 특정 조직 유형에 전달하기 위해 표적화되도록 선택된다. 당업자에 의해 쉽게 인식될 바와 같이, 많은 다른 접근법이 또한 사용될 수 있다.

OPN 유전자의 활성 단편은 OPN 단백질의 동일하거나 실질적으로 동일한 생물학적 활성을 보유하는 OPN의 단편 또는 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 다양한 구현예에서, OPN 단백질은 뇌에 표적화된 프로모터의 제어하에 바이러스 벡터 상에 로딩된다.

본 발명의 다양한 구현예는 또한 리포좀 전달 시스템을 사용하여 대상의 뇌에 OPN을 전달함으로써 오스테오폰틴(OPN)을 상승시키는 방법을 제공한다.

리포좀 전달 시스템은 다양한 범위의 약물이 리포좀에 의해 캡슐화될 수 있게 하는 친유성 및 친수성 화합물 모두를 포획할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이 용어 "리포좀"은 분리된 수성 공간을 둘러싸는 하나 이상의 동심원 지질 이중층으로 구성된 인지질 소포를 지칭한다. 큰 수성 중심 및 생체적합성 지질 외관은 DNA, 단백질 및 이미지화 제제와 같은 다양한 거대 분자의 전달을 허용한다.

약물 전달 시스템으로서, 리포좀은 생체적합성, 자기조립 능력, 큰 약물 탑재량(payload)을 보유하는 능력, 및 그들의 생물학적 특징을 제어하기 위해 변형될 수 있는 광범위한 물리화학적 및 생물물리학적 특성을 포함하는 몇 가지 이점을 제공한다. 리포좀 내의 캡슐화는 순환에서 조기 불활성화, 분해 및 희석으로부터 화합물을 보호한다.

리포좀은 다양한 방법에 의해 생산될 수 있다. 리포좀 전달 시스템을 제조하는 방법은 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Gabizon et al., Cancer Research (1982) 42:4734; Cafiso, Biochem Biophys Acta (1981) 649:129; Szoka, Ann Rev Biophys Eng (1980) 9:467; 미국 특허 제4,882,165호, 및 Deamer and User, "Liposome Preparation: Methods and Mechanisms," in Liposomes, Marcel Dekkev, Inc., New York (1983)]을 참고한다.

다층 소포(multilamellar vesicle, MLV)는 건조 지질 분말의 수화에 의해 형성된다. 탐침형 초음파발생장치를 이용한 초음파 처리 또는 프렌치 프레스(French press)를 통한 처리는 작은 단층 소포(small, unilamellar vesicle, SUV)를 생산한다. 압출 기술은 이들의 생산 용이성, 쉽게 선택할 수 있는 입자 직경, 회분간(batch-to-batch) 재현성, 및 용매 및/또는 계면활성제 오염으로부터의 자유로움으로 인해 시험관내 및 생체내 연구를 위한 SUV 리포좀 생산에 가장 널리 사용되는 방법이다. 리포좀 생산을 위한 용매 주입 및 세제 투석 기술은 입자 크기의 불균일한 분포를 제공하며, 이들 입자 내에 막 불순물을 보유하기 때문에 생물물리학적 또는 생물화학적 실험에 일반적으로 사용되지 않는다. 캡슐화될 물질은 수동적으로 포획되거나 "원격" 로딩될 수 있다.

약물을 리포좀에 로딩하는 방법은 당업계에 알려져 있다. 예를 들어 문헌[Ostro and Cullis, Am. J. Hosp. Pharm. 456:1567-1587 (1989) and Juliano, "Interactions of Proteins and Drugs with Liposomes," in Liposomes, Ibid]을 참고한다. 대부분의 약물은 약물을 출발 물질과 함께 공동 가용화함으로써 리포좀이 형성되는 때에 로딩된다. 약물이 위치한 리포좀(공동(cavity) 또는 막)의 부위는 약물의 특성에 좌우된다.

리포좀 전달 시스템은 다양한 외인성 분자를 세포의 세포질에 전달하는데 이용될 수 있고, 이는 진단제, 세포 기능을 조절하거나 변형할 수 있는 분자, 및 질환의 치료를 위한 분자를 포함한다. 이들 제제/분자는 이들의 수성 공동에 수용성 화합물을 캡슐화함으로써, 또는 막 자체 내부에 지질 가용성 화합물을 보유함으로써 리포좀 소포에 의해 포획될 수 있다. 외인성 분자는, 비제한적으로: 펩타이드, 올리고펩타이드, 단백질, 아포단백질, 당단백질, 항원 및 이에 대한 항체, 수용체 및 다른 막 단백질, 단백질 유사체, 효소, 보조효소, 효소 억제제, 아미노산 및 이들의 유도체, 호르몬, 지질, 및 인지질을 포함할 수 있다. 다른 분자는 뉴클레오타이드; 올리고뉴클레오타이드; 폴리뉴클레오타이드; 및 이들의 당업계에서 인식되고 생물학적으로 기능적인 유사체 및 유도체, 예를 들어; 메틸화된 폴리뉴클레오타이드 및 포스포로티오에이트 연결을 갖는 뉴클레오타이드 유사체; 플라스미드, 코스미드, 인공 염색체, 및 다른 핵산 벡터를 포함한다.

다양한 구현예에서, 제제/분자는 OPN, 이의 기능적/생물학적 활성 단편이다. 다양한 구현예에서, 제제/분자는 알츠하이머병 치료제이다. 알츠하이머의 치료제는, 비제한적으로 콜린에스테라아제 억제제, 예컨대 도네페질(Aricept), 갈란타민(Razadyne) 및 리바스티그민(Exelon); 메만틴(Namenda); 항우울제 및 항불안 약물, 예컨대, 클로나제팜(Klonopin) 및 로라제팜(Ativan)을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 제제/분자는 알츠하이머의 치료제 및 OPN의 조합이다.

다양한 구현예에서, OPN은 그의 대상의 뇌로의 전달을 향상시키기 위해 리포좀 내부에 캡슐화된다. 다양한 다른 구현예에서, 리포좀 OPN의 뇌로의 전달은 대상에서 알츠하이머병의 가능성의 치료 및/또는 예방 또는 감소를 초래한다.

본 발명의 다양한 구현예는 나노약물 전달 시스템을 사용하여 대상의 뇌에 OPN을 전달함으로써 오스테오폰틴(OPN)을 상승시키는 방법을 제공한다.

나노약물 전달 시스템은 이를 필요로 하는 대상을 치료하기 위해 혈액-뇌 장벽을 가로지르는 치료적 활성 분자의 뇌로의 전달에 유용하다.

다양한 구현예에서, 나노약물 전달 시스템은 재조합 OPN 또는 이의 기능적/생물학적 활성 단편을 포함한다. 다양한 구현예에서, 나노약물 전달 시스템은 혈액 뇌 장벽을 가로질러 뇌에 도달하도록 표적화된다. 다양한 다른 구현예에서, 나노약물 전달 시스템은 뇌 내의 아밀로이드 플라크 부위에서 뇌에서 방출된다.

나노약물 전달 방법은, 비제한적으로 치료제, 전구약물, 펩타이드 마스킹, 수용체 매개 투과제, 또는 나노입자를 전달하기 위한 엑소좀의 사용을 포함한다.

엑소좀은 재조합 OPN 또는 이의 기능적/생물학적 활성 단편을 함유하도록 변형될 수 있다. 다양한 구현예에서, OPN은 OPN을 함유하는 엑소좀을 투여함으로써 대상의 뇌에서 상승된다. 일부 구현예에서, OPN을 함유하는 엑소좀은 전신으로(즉, 정맥내로) 주사된다.

전구약물은 혈액-뇌 장벽을 통과할 수 있게 하는 친유성 분자로 위장된 치료 분자이다. 뇌에 있으면, 친유성 분자는 효소 분해 또는 일부 다른 메커니즘에 의해 제거되어 약물을 그의 활성 형태로 방출한다. 다양한 구현예에서, OPN 전구약물은 이를 필요로 하는 대상의 뇌에서 OPN 발현을 상승시키는데 사용된다. 일부 구현예에서, OPN은 재조합 OPN 또는 이의 기능적/생물학적 활성 단편이다.

펩타이드 마스킹은 혈액-뇌 장벽을 통과할 가능성이 높은 분자로 치료 분자를 마스킹하는 방법이다. 혈액-뇌 장벽을 통과할 가능성이 높은 분자의 예는 비제한적으로, 콜레스테릴을 포함한다.

수용체 매개 투과제는 혈액-뇌 장벽의 투과성을 증가시켜 분자가 이를 더 쉽게 통과하게 하는 약물 화합물이다. 다양한 구현예에서, OPN은 수용체 매개 투과제를 이를 필요로 하는 대상에게 투여하여 혈액-뇌 장벽의 투과성을 증가시키고 뇌에서 OPN을 허용함으로써 뇌에서 상승된다.

나노입자는 혈액-뇌 장벽을 횡단할 수 있는 치료 분자에 결합된 입자이다. 비제한적으로 지질 기반, 양이온성 리포좀, 고체 지질, 나노유화액, 중합체 기반, 또는 중합체 분지 나노입자를 포함하는, 사용될 수 있는 다양한 유형의 나노입자가 있다. 통상적인 중합체 물질은, 비제한적으로, 폴리부틸 시아노아크릴레이트(PBCA), 폴리(이소헥실 시아노아크릴레이트)(PIHCA), 폴리젖산(PLA), 또는 폴리락타이드-co-글리콜라이드(PLGA)를 포함한다.

다양한 구현예에서, 나노입자는 생분해성이다. 다양한 다른 구현예에서, 나노입자는 혈액-뇌 장벽을 가로지르는 것을 돕기 위해 계면활성제로 코팅될 수 있다. 계면활성제의 예는, 비제한적으로 폴리소르베이트 80, 20, 40, 60, 및 폴록사머 188을 포함한다. 일부 구현예에서, 나노입자는 뇌에 표적화된다.

인지 기능의 개선

본 발명의 다양한 구현예는 또한 상기 대상에게 투여될 때 정상 대상에 비해 오스테오폰틴(OPN)의 수준을 증가시키는 조성물을 제공하는 단계; 및 OPN의 상기 수준을 증가시키기에 충분한 양의 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 인지 기능의 개선을 필요로 하는 대상에서 인지 기능을 개선시키는 방법을 제공한다.

다양한 구현예에서, OPN을 발현하는 선천성 면역 세포는 입양 세포 전달 또는 골수 이식에 의해 대상에게 투여된다.

다른 구현예에서, 잘못 접힌 단백질은 Aβ이다. 또 다른 구현예에서, Aβ는 Aβ₄₀ 및/또는 Aβ₄₂이다.

다양한 구현예에서, 조성물은 OPN을 발현하는 선천성 면역 세포를 포함한다.

본 발명의 다양한 구현예는 또한, 인지 기능의 향상을 필요로 하는 대상에서 인지 기능을 향상시키는 방법으로서, 상기 대상에게 투여될 때 정상 대상에 비해 오스테오폰틴(OPN)의 수준을 증가시키는 조성물을 제공하는 단계; 및 OPN의 상기 수준을 증가시키기에 충분한 양의 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.

다양한 구현예에서, 조성물은 재조합 OPN, OPN 단편, OPN 유도체, OPN 모방체, OPN 유사체, 또는 이들의 조합을 포함한다.

단핵구 농축

본 발명의 다양한 구현예는 대상으로부터 혈액 샘플을 수득하는 단계, 샘플로부터 혈액 세포를 단리시키는 단계, 및 혈액 세포를 자극하여 OPN 발현을 증가시키는 단계를 포함하는, 단핵구 농축 방법을 제공한다. 다양한 구현예에서, 단리된 혈액 세포는 단핵구를 포함한다. 다른 구현예에서, 단핵구는 글라티라머 아세테이트(GA)로 자극된다. 일부 다른 구현예에서, 단핵구는 생체외에서 자극된다.

일부 구현예에서, 단핵구는 골수 유래 단핵구, 비장 유래 단핵구, 및/또는 CD115 양성 단핵구(CD115⁺단핵구)이다. 다른 구현예에서, 단핵구는 뇌에서 OPN을 발현하는 대식세포가 된다.

다양한 구현예에서, 방법은 농축된 단핵구를 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 다양한 구현예에서, 단핵구는 입양 세포 전달 또는 골수 이식을 통해 투여된다. GA는 입양 세포 전달 또는 골수 전달 전에, 실질적으로 입양 세포 전달 또는 골수 전달과 함께, 및/또는 입양 세포 전달 또는 골수 전달 후에 투여될 수 있다.

MMP

본원에 논의된 바와 같이, OPN은 MMP(MMP-9 포함)에 대한 공지된 기질이다. MMP-9는 반흔 조직 및 Aβ 분해 효소이다. OPN은 면역 세포를 더 식작용성으로 만드는 것으로 알려져 있는 반면, MMP-9는 OPN을 절단하고 Aβ의 분해를 향상시키는 프로테아제이다. GA의 투여는 OPN(전장 OPN 및 그의 MMP 절단된 단편) 및 MMP-9의 증가를 초래하고 Aβ 분해를 초래한다.

본 발명의 다양한 구현예는 이를 필요로 하는 대상에서 선천성 면역 세포를 자극하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.

다양한 구현예에서, 선천성 면역 세포는 글라티라머 아세테이트(GA)로 자극된다. 일부 구현예에서, 선천성 면역 세포는 생체외 또는 생체내에서 자극된다.

다양한 구현예에서, OPN은 GA로 자극시 증가된다. 다양한 구현예에서, MMP-9는 GA로 자극시 증가된다. 다양한 구현예에서, OPN 및 MMP-9는 GA로 자극시 증가된다.

다양한 구현예에서, 선천성 면역 세포는 단핵구, 대식세포, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 단핵구는 골수 유래 단핵구, 비장 유래 단핵구, CD115 양성 단핵구(CD115⁺단핵구), 또는 이들의 조합을 포함한다. 다른 구현예에서, 단핵구는 침윤성 단핵구이며, 뇌에서 OPN을 발현하는 대식세포가 된다.

다양한 구현예에서, 대상은 알츠하이머병을 갖는다.

다양한 구현예에서, 방법은 이를 필요로 하는 대상을 치료하는 단계를 추가로 포함한다. 다양한 구현예에서, OPN 및/또는 MMP-9의 증가는 대상에서 아밀로이드 플라크의 분해를 초래한다.

투여량 및 투여

본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 조성물은, 비제한적으로 뇌에서 OPN을 상승시키는 방법 및 치료적 치료 방법, 예컨대 알츠하이머병의 치료를 포함하는 다양한 응용에서 유용하다. 사용 방법은 시험관내, 생체외, 또는 생체내 방법일 수 있다.

다양한 구현예에서, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 임의의 투여 경로를 통한 전달을 위해 제제화될 수 있다. "투여 경로"는 비제한적으로 에어로졸, 비강, 경구, 경점막, 경피 또는 비경구를 포함하는 당업계에 공지된 임의의 투여 경로를 지칭할 수 있다.

"경피" 투여는 국소 크림 또는 연고를 사용하여 또는 경피 패치에 의해 달성될 수 있다.

"비경구"는 안와내, 주입, 동맥내, 피막내, 심장내, 진피내, 근육내, 복강내, 폐내, 척수내, 흉골내, 척추강내, 자궁내, 정맥내, 지주막하, 피막하, 피하, 경점막, 또는 기관경유를 포함하는, 주사와 일반적으로 연관된 투여 경로를 지칭한다. 비경구 경로를 통해, 조성물은 주입 또는 주사용 용액 또는 현탁액의 형태로, 또는 동결건조 분말로서 존재할 수 있다.

장관 경로를 통해, 약제학적 조성물은 제어 방출을 허용하는 정제, 겔 캡슐, 당 코팅 정제, 시럽, 현탁액, 용액, 분말, 과립, 유화액, 미소구체 또는 나노구체 또는 지질 소포 또는 중합체 소포의 형태일 수 있다.

국소 경로를 통해, 본 발명에 따른 화합물에 기초한 약제학적 조성물은 피부 및 점막을 치료하기 위해 제제화될 수 있고, 연고, 크림, 밀크, 연고(salve), 분말, 함침 패드, 용액, 겔, 스프레이, 로션 또는 현탁액의 형태이다. 이들은 또한 제어 방출을 허용하는 미소구체 또는 나노구체 또는 지질 소포체 또는 중합체 소포체 또는 중합체 패치 및 하이드로겔의 형태일 수 있다. 이들 국소 경로 조성물은 임상 증상에 따라 무수 형태 또는 수성 형태일 수 있다.

안구 경로를 통해, 이들은 점안제의 형태일 수 있다.

다양한 구현예에서, 제제는 시간 경과에 따라 주사 또는 점진적 주입에 의해 정맥내로 투여될 수 있다. 주어진 경로에 대해 적절한 제제를 고려할 때, 예를 들어, 본원에 기재된 방법 및 조성물에서 유용한 제제는 정맥내로, 비강내로, 흡입에 의해, 복강내로, 근육내로, 피하로, 공동내로 투여될 수 있고, 원하는 경우, 연동(peristaltic) 수단에 의해, 또는 당업자에 의해 알려진 다른 수단에 의해 전달될 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에 사용된 화합물은 알츠하이머병을 가진 환자에게 경구로, 정맥내로 또는 근육내로 투여된다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물은 또한 임의의 약제학적으로 허용가능한 담체를 함유할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이 "약제학적으로 허용가능한 담체"는 신체의 하나의 조직, 기관, 또는 부분으로부터 신체의 또 다른 조직, 기관, 또는 부분으로 관심 화합물을 운반 또는 수송하는데 관여하는 약제학적으로 허용가능한 물질, 조성물, 또는 비히클을 지칭한다. 예를 들어, 담체는 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제, 용매, 또는 캡슐화 물질, 또는 이들의 조합일 수 있다. 담체의 각 성분은 제제의 다른 성분과 양립가능해야 한다는 점에서 "약제학적으로 허용가능"해야 한다. 그것은 또한 그것이 접촉할 수 있는 임의의 조직 또는 기관과 접촉하여 사용하기에 적합해야 하며, 이는 그것이 독성, 자극, 알러지 반응, 면역원성, 또는 그의 치료적 이익보다 더 큰 임의의 다른 합병증의 위험성이 없어야 한다는 것을 의미한다.

다양한 구현예에서, 본 발명은 OPN의 치료적 유효량과 함께 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. "약제학적으로 허용가능한 부형제"는 일반적으로 안전하고, 비독성이며, 바람직한, 약제학적 조성물을 제조하는데 유용한 부형제를 의미하며, 수의학 사용뿐만 아니라 인간 약제학적 사용에 허용가능한 부형제를 포함한다. 활성 성분은 약제학적으로 허용가능하고 활성 성분과 양립가능하며, 본원에 기재된 치료적 방법에서 사용하기에 적합한 양의 부형제와 혼합될 수 있다. 이러한 부형제는 고체, 액체, 반고체, 또는, 에어로졸 조성물의 경우, 기체일 수 있다. 적합한 부형제는, 예를 들어, 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 초크, 실리카 겔, 스테아린산 나트륨, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 염화나트륨, 건조 탈지유, 물, 식염수, 덱스트로스, 프로필렌 글리콜, 글리세롤, 에탄올, 만니톨, 폴리소르베이트 등, 및 이들의 조합을 포함한다. 또한, 원하는 경우, 조성물은 활성 성분의 효과를 향상시키거나 유지하는 습윤제 또는 유화제, pH 완충제 등과 같은 소량의 보조 물질을 함유할 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 치료적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 염을 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 염은 무기산, 예를 들어, 염산 또는 인산, 유기산, 예를 들어, 아세트산, 타르타르산 또는 만델산으로부터 형성된 산 부가염, 무기 염기, 예를 들어, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 수산화제이철(ferric hydroxide)로부터 형성된 염, 및 유기 염기, 예컨대 이소프로필아민, 트리메틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 형성된 염을 포함한다. 액체 조성물은 물이 부가된 액체상 및 물이 제외된 액체상, 예를 들어, 글리세린, 식물성 오일, 예컨대 면실유, 및 수중유 유화액을 함유할 수 있다. 생리학적으로 견딜 수 있는 담체는 당업계에 널리 알려져 있다. 특정 장애 또는 병태의 치료에 효과적인 본 발명에 사용된 활성제의 양은 장애 또는 병태의 성질에 좌우될 것이며, 표준 임상 기술을 사용하여 당업자에 의해 결정될 수 있다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물은 또한 캡슐화되거나, 정제화되거나, 경구 투여를 위한 유화액 또는 시럽으로 제조될 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 고체 또는 액체 담체는 조성물을 향상시키거나 안정화시키거나, 또는 조성물의 제조를 용이하게 하기 위해 첨가될 수 있다. 액체 담체는 시럽, 땅콩유, 올리브유, 글리세린, 식염수, 알코올 및 물을 포함한다. 고체 담체는 전분, 락토스, 황산칼슘, 이수화물, 백토(terra alba), 스테아린산 마그네슘 또는 스테아린산, 탈크, 펙틴, 아카시아, 아가 또는 젤라틴을 포함한다. 담체는 또한 서방성 물질, 예컨대 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트를 단독으로 또는 왁스와 함께 포함할 수 있다.

약제학적 제제는 정제 형태의 경우 필요에 따라 분쇄, 혼합, 과립화 및 압축; 또는 경질 젤라틴 캡슐 형태의 경우 분쇄, 혼합 및 충전을 포함하는 통상적인 약학 기술에 따라 제조된다. 액체 담체가 사용되는 경우, 제제는 시럽, 엘릭서, 유화액 또는 수성 또는 비수성 현탁액의 형태일 것이다. 이러한 액체 제제는 직접 경구 투여되거나 연질 젤라틴 캡슐에 충전될 수 있다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물은 치료적 유효량으로 전달될 수 있다. 정확한 치료적 유효량은 주어진 대상에서 치료의 효능의 측면에서 가장 효과적인 결과를 산출할 조성물의 양이다. 이 양은 비제한적으로 치료 화합물의 특성(활성, 약동학, 약력학, 및 생체이용률 포함), 대상의 생리학적 상태(연령, 성별, 질환 유형 및 병기, 일반적인 신체 상태, 주어진 투여량에 대한 반응성, 및 약물의 유형 포함), 제제에서 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 담체들의 특성, 및 투여 경로를 포함하는 다양한 인자에 따라 달라질 것이다. 임상 및 약리학 분야의 당업자는, 예를 들어, 화합물 투여에 대한 대상의 반응을 모니터링하고 이에 따라 투여량을 조절함으로써, 통상적인 실험을 통해 치료적 유효량을 결정할 수 있을 것이다. 추가 지침은 문헌[Remington : The Science and Practice of Pharmacy(Gennaro ed. 20th edition, Williams & Wilkins PA, USA)(2000)]을 참고한다. .

전형적인 투여량은 시험관내 반응 또는 동물 모델에서의 반응에 의해 당업자에게 지시된 바와 같을 수 있다. 이러한 투여량은 관련된 생물학적 활성을 잃지 않고 농도 또는 양이 약 1 자리수까지 감소될 수 있다. 따라서, 실제 투여량은 의사의 판단, 환자의 상태, 및, 예를 들어, 관련된 일차 배양된 세포 또는 조직배양된 조직 샘플, 예컨대 수득된 생물학적 샘플의 시험관내 반응성, 또는 적절한 동물 모델에서 관찰된 반응에 기초한 치료 방법의 효과에 따라 달라질 것이다.

질환의 치료를 위해, 적절한 투여량은 처리될 질환의 유형, 질환의 중증도 및 경과, 질환의 반응성, 항체가 치료적 또는 예방적 목적을 위해 투여되는지 여부, 이전 요법, 및 환자의 임상 병력에 좌우된다. 투여량은 또한 임의의 합병증의 경우 개별 의상에 의해 및 담당 의사의 재량으로 조정될 수 있다. 투여 의사는 최적 투여량, 투약 방법 및 반복률을 결정할 수 있다. 약제학적 조성물은 1회 또는 수일 내지 수개월 동안 지속되는 일련의 치료 동안, 또는 치유가 이루어지거나 또는 질환 상태의 감소가 달성될 때까지(예컨대, 알츠하이머병의 치료 또는 개선) 투여될 수 있다. 치료 기간은 대상의 임상 진행 및 요법에 대한 반응성에 좌우된다. 특정 구현예에서, 투여량은 체중의 kg당 0.01 μg 내지 100 mg이고, 매일, 매주, 매월 또는 매년 1회 이상 투여될 수 있다.

다양한 구현예에서, 재조합 OPN의 치료적 유효량은 당업자에 의해 쉽게 인식될 바와 같이 임의의 적절한 기술에 의해 대상에게 투여된다. 일부 구현예에서, 재조합 OPN은 비강, 비경구 또는 안구 경로를 통해 투여된다. 일부 구현예에서, 비경구 경로는 정맥내 주사이다. 다양한 구현예에서, 안구 경로는 점안제를 통해서이다.

다양한 구현예에서, OPN 바이러스 벡터는 당업자에 의해 쉽게 인식될 바와 같이 임의의 적절한 기술에 의해 투여될 수 있다. 다양한 구현예에서, 조성물을 투여하는 것은 정맥내 주사에 의한 투여를 포함한다. 다양한 구현예에서, 조성물은 근육내 주사에 의해 투여된다. 다양한 구현예에서, 조성물은 비강으로 투여된다. 이들 방법은 OPN 유전자 또는 OPN의 활성 단편을 코딩하는 유전자를 뇌 조직에 전달한다. 이들 방법은 또한 OPN 또는 이의 활성 단편을 직접 순환 내로 분비시킨다. AAV 벡터, AAV 헬퍼 작제물 및 헬퍼 바이러스 또는 보조 기능 벡터(들)가 표준 형질감염 기술을 사용하여 동시에 또는 연속적으로 숙주 세포에 도입될 수 있다. 또한, 바이러스 벡터는 단일 투여로서 또는 치료 요법으로서, 예컨대, 당업자에 의해 쉽게 인식될 바와 같이, 매일, 매주, 또는 임의의 다른 적합한 시간 간격으로 전달될 수 있다. 투여량은 연령, 체중, 혈관 상태의 중증도 및 의사가 확인할 수 있는 다른 요인과 같은 다양한 요인에 좌우된다.

다양한 구현예에서, 리포좀은 OPN 또는 기능적/생물학적 활성 OPN 단편을 포함하도록 변형된다. 일부 구현예에서, 변형된 리포좀은 당업자에 의해 쉽게 인식될 바와 같이 임의의 적절한 기술에 의해 투여될 수 있다. 다양한 구현예에서, 변형된 리포좀은 말초 주사를 통해 혈액에 투여된다. 다양한 다른 구현예에서, 변형된 리포좀은 경구 투여된다.

다양한 구현예에서, 공중합체 GA는 혈액 매개 단핵구의 자연적 동원을 향상시키기 위해 투여된다. 다양한 구현예에서, 혈액 매개 단핵구는 동원되고 병에 걸린 뇌 실질(parenchyma)을 침윤한다. 다른 구현예에서, 침윤성 단핵구는 대식세포가 된다.

일부 구현예에서, 공중합체 GA는 매주 투여된다. 다양한 구현예에서, 공중합체는 최대 10주 동안 투여된다. 다양한 구현예에서, 투여된 GA의 투여량은 약 10 - 150 μg의 범위일 수 있다. 일부 구현예에서, GA의 투여량은 약 10-20 μg, 20-30 μg, 30-40 μg, 40-50 μg, 50-60 μg, 60-70 μg, 70-80 μg, 80-90 μg, 90-100 μg, 100-110 μg, 110-120 μg, 120-130 μg, 130-140 μg 또는 140-150 μg의 범위이다. 일부 구현예에서, GA 투여량은 100 μg이다. 또 다른 구현예에서, 투여량은 30 μg이다.

다양한 구현예에서, GA는 6-48시간 노출 동안 투여된다. 일부 구현예에서, GA 노출은 6-12시간, 12-24시간, 24-36시간, 또는 36-48시간 동안이다. 다른 구현예에서, GA 노출은 12-24시간 동안이다.

다양한 다른 구현예에서, 골수 유래 CD115⁺ 단핵구의 서브세트가 투여된다. 일부 구현예에서, 골수 유래 CD115⁺ 단핵구는 매월 투여된다. 일부 구현예에서, 말초 혈액은 골수 유래 CD115⁺ 단핵구로 농축된다. 다양한 구현예에서, 골수 유래 CD115⁺ 단핵구의 투여는 단핵구 유래 대식세포의 뇌 동원을 증가시킨다.

또 다른 구현예에서, 공중합체 GA 및 골수 유래 CD115⁺ 단핵구의 서브세트가 투여된다. 다른 구현예에서, 조합 투여는 대상에서 더 큰 단핵구 동원을 초래한다.

다양한 구현예에서, 공중합체 GA 및/또는 골수 유래 CD115⁺ 단핵구의 서브세트의 투여는 인지 기능의 유지, 시냅스 보존, 플라크 제거, 별아교세포증(astrogliosis)의 제한, 및 면역 분자 환경의 조절을 초래한다. 당업자는 이를 필요로 하는 대상에게 투여될 선천성 면역 세포의 적절한 양을 결정할 수 있다.

실시예

하기 실시예는 청구된 발명을 더 잘 예시하기 위해 제공되며 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 특정 물질이 언급되는 경우, 그것은 단지 예시하기 위한 것이며 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 당업자는 본 발명의 능력을 발휘하지 않고 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 균등한 수단 또는 반응물을 개발할 수 있다.

실시예 1

마우스

B6.Cg-Tg(APPswe, PSEN1E9) 85Dbo/J 균주로부터의 알츠하이머병 이중 형질전환 APPK595N, M596L + PS1_ΔE9, APP/PS1(ADtg) 마우스 및 이들의 연령 일치된 비형질전환(야생형) 한배 새끼를 잭슨 실험실(스톡 #005864)로부터 구입한 다음, 세다스-시나이(Cedars-Sinai) 의료 센터에서 사육하고 유지하였다. 이들 ADtg 마우스는 인간 전이유전자를 가지며, 이는 항-인간 항체를 사용하여 아밀로이드-β 형태를 검출할 수 있게 해준다. 이 연구에서의 모든 마우스는 C57BL/6 유사유전자형(congenic) 배경을 갖는다. 마우스의 2마리 코호트(모두 수컷)를 행동학적, 조직학적, 및 생화학적 분석에 사용하였다. 유세포분석에 의해 뇌로의 선천성 면역 침윤을 평가하기 위해 추가 ADtg 마우스 코호트(동일한 수의 수컷 및 암컷)를 사용하였다. 자기 활성화된 세포 분류(MACS) 컬럼 선택 이전 및 이후에 단리된 CD115+ 단핵구의 시험관내 연구, 일차 세포 배양, 및 특성 규명을 위해, 골수 공여 마우스는 어린 비형질전환 야생형 한배 새끼(8-10주령)였다. 골수 유래 단핵구의 입양 전달을 위해, 공여 마우스는 인간 유비퀴틴 C 프로모터(스톡 #004353)의 지시하에 향상된 녹색 형광 단백질(GFP)을 발현하는 어린(8-10주령) C57BL/6-형질전환(UBC-GFP) 30 Scha/J 마우스였다. ADtg 뇌로의 단핵구 침윤을 평가하는 유세포분석법 연구를 위해, 공여체는 어린 비형질전환 야생형 마우스(8-10주령)였다. 모든 실험은 승인된 프로토콜하에 세다스-시나이 의료 센터 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 규제에 따라 수행되었다. 또한, 모든 실험은 마우스 유전자형을 모르는 연구자에 의해 수행되고 기록되었다.

유전자형 분석

DNA 추출 키트(Qiagen)를 사용하고 제조사의 프로토콜에 따라 마우스 꼬리의 끝에서 게놈 DNA를 추출하였다. 이중 형질전환 APP_SWE/PS1_ΔE9 마우스 및 비형질전환 야생형 한배 새끼를 이전에 기술된 바와 같이 PCR에 의한 전이유전자의 존재에 대한 유전자형 분석에 의해 확인하였다(Jankowsky et al., Biomol Eng 2001; 17: 157-65, Jankowsky et al., Hum Mol Genet 2004; 13: 159-70.; Butovsky et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2006 103:11784-11789).

글라티라머 아세테이트 면역화

ADtg 마우스(10개월령)에게 GA[Cop-1 및 코팍손®로도 알려짐; 인산 완충 식염수(PBS) 중에 100 μg] 또는 PBS 단독(대조군)의 피하 주사를 1주일 동안 매주 2회 및 8주 동안 매주 1회 투여하였다. 유세포분석법에 의해 뇌로의 선천성 면역 침윤의 평가를 위해, 10개월령 ADtg 마우스에게 GA(PBS 중에 100 mg) 또는 PBS 단독의 피하 주사를 1주일 동안 매주 2회 및 3주 동안 매주 1회 투여하였다. 연구 말기에, 모든 마우스를 마취시킨 다음 0.5 mM EDTA를 갖는 빙냉 PBS로 관류한 후, 이들의 기관을 수집하고 2.5% 파라포름알데하이드(Sigma-Aldrich)에서 분석하거나 고정시키고, 추가 조직학적 분석을 위해 30% 수크로스로 동결보존하였다.

골수 유래 CD115+ 단핵구의 단리 및 입양 전달

마우스 공여체로부터의 CD115⁺ 단핵구를 이전에 보고된 바와 같이 단리하였다(Koronyo et al., Brain: a journal of neurology 2015,138:2399-2422). 요약하면, 골수 세포를 대퇴골(femora), 경골(tibiae), 및 상완골(humeri)로부터 채취하고 Ficoll-Paque® PLUS(17-1440-03, GE Healthcare) 밀도 구배 상에서 단핵 세포를 농축하였다. CD115⁺ 단핵구 집단을 제조사의 프로토콜에 따라 바이오티닐화된 항-CD115 mAb 클론 AFS98(#13-1152; eBioscience) 및 스트렙타비딘 결합된 자기 비드(Miltenyi Biotec)를 사용하여 MACS 농축 컬럼을 통해 단리하였다. 이 절차 후, 단핵구(5-6 x 10⁶세포/마우스)를 10개월령 ADtg 마우스의 꼬리 정맥 내로 2개월 동안 매월 1회 주사하였다. 유세포분석법에 의해 뇌로의 선천성 면역 침윤의 평가를 위해, 10개월령 ADtg 마우스에게 골수 유래 CD115 + 단핵구(상기와 동일한 용량)의 1회 주사를 투여하였다.

골수 유래 CD115 ⁺ 단핵구의 유세포 분석 및 면역조직화학적 특성 규명

골수 세포를 상기에서 상세히 설명한 바와 같이 어린 공여 야생형 마우스(실험당 n=3-4 마우스)로부터 채취하였다. Ficoll® 구배에 의해 단핵 세포를 농축한 후, 세포의 일부분을 수집하고(CD115⁺ 컬럼 전), 세포의 두 번째 부분은 상기에 상세히 설명한 바와 같이 MACS 농축 컬럼을 사용하여 CD115⁺ 단핵구 집단을 추가 단리하였다(CD115⁺ 컬럼 후). CD115 + 컬럼 전 및 후의 두 세포 부분을 즉시 염색하고 유세포분석에 의해 분석하거나 추가 면역조직화학적 분석을 위해 대식세포 배양액을 생성하였다. 유세포분석을 위해, CD115⁺ 컬럼 전 세포를 하기 항체로 염색하였다: 바이오티닐화된 항-CD115 mAb 클론 AFS98(#13-1152; eBioscience), APC 접합된 항-바이오틴 클론 Bio3-18E7(#130-090-856; Miltenyi Biotec), PE 접합된 항-CD36 클론 REA262(#130-102-763; Miltenyi Biotec), Viobright FITC 접합된 항-CD36 클론 REA262(#130-104-889; Miltenyi Biotec), PE 접합된 항-CD204 클론 REA148(#130-102-328; Miltenyi Biotec), 및 Alexa Fluor® 488 접합된 항-MMP9 다클론 항체(#bs-0397R-A488; Bioss). CD115⁺ 컬럼 후 세포의 경우, 상기 명시된 것과 동일한 염색 항체 세트를 사용하였지만 일차 항-CD115 mAb는 제외시켰는데 이 단리 절차가 이미 바이오티닐화된 항-CD115 항체를 세포에 연결하였기 때문이다. 모든 항체 희석은 1:100이었다. 표지된 샘플을 BD FACS Diva 소프트웨어가 장착된 BD LSRFortessaTM 세포 Analyzer 상에서 분석하였고; 데이터를 FlowJo 소프트웨어(vX.0.7r2; Tree Star, Inc.)를 사용하여 추가로 분석하였다.

CD115 + 컬럼 선택 전후의 두 세포 부분을 또한 일차 대식세포 배양물로 분화시키고 면역조직화학에 의해 분석하였다. 요약하면, 세포를 10% 혈청 및 20 ng/ml MCSF(#315-02; PeproTech)를 갖는 완전한 RPMI-1640 배지(#21870; Life Technologies)에서 7일 배양에 의해 대식세포로 분화시켰다. 그리고 나서, 대식세포의 일차 배양액을 유리 커버슬립 상에 24-웰 조직-배양 플레이트에서 웰당 1.2 x 10⁵ 세포(각 조건당 3-4 웰)로 밤새 도말하였다. 20분 동안 -20℃의 메탄올(99.8%)을 사용하여 세포를 고정시킨 다음, PBS로 반복 세척하였다. 그리고 나서, 세포를 랫트 항-CD36 mAb 클론 MF3(1:200; ab80080; Abcam), 랫트 항-CD204 스캐빈져 수용체 유형 I/II(SCARA1) mAb(1:100; MCA1322; AbD Serotec), 및 염소 항-MMP9 pAb(1:100; AF909; R&D systems)을 사용하여 염색하였다. 이차 다클론 항체는 Cy2, Cy3 또는 Cy5로 접합된 당나귀 항-랫트 및 항-염소(1:200; Jackson ImmunoResearch Laboratories)를 포함하였다. 세포를 DAPI를 갖는 ProLong® Gold(Molecular Probes, Life Technologies)를 사용하여 마운팅하였다. 몇 개의 필드(그룹당 무작위로 선택된 최소 n= 4)를 Carl Zeiss Axio Imager Z1 Apotome가 장착된 현미경(각 필드에 평균 120개 세포)을 사용하여 각 웰로부터 수득하였다. 이미지를 각각의 경우에 동일한 노출 시간을 사용하여 수득하였다. 개별 이미지를 그레이 스케일로 변환하고 NIH ImageJ 소프트웨어로 히스토그램 기반 역치를 사용하여 기저선(baseline)에 표준화함으로써 형광 신호 및 그의 총 면적을 결정 및 정량하였다. '면적/세포'는 동일한 필드(이미지)의 세포의 총수(DAPI 수)로 나눈 총 형광 신호(면적)를 측정한다. 모든 실험에 대해, 조사자는 처리 조건을 알지 못하였다.

마우스에서 반스 (Barnes) 미로 행동 시험

반스 미로는 대상이 공간 정보(spatial cue)를 사용하여 가벼운 혐오 환경(빛 투사가 있는 개방된 공간)으로부터 탈출 수단을 찾게 하는 공간 학습 과제이며; 마우스는 탈출 위치를 찾기 위해 공간 정보를 사용할 것이 요구된다. 마우스는 반스 미로 장치에서 9일 동안 탈출 상자의 위치를 학습하는 능력에 대해 평가된다. 이 시기는 야생형 및 PBS 그룹 사이의 유의한 차이를 기반으로 확립되었고, 우리의 처리의 효과를 시험하는데 적합한 것으로 나타났다. 반스 미로 장치는 20개의 구멍이 둘레 주위에 같은 거리로 위치하는 원형 테이블이다. 시험 동안, 탈출 상자는 이들 구멍 중 하나 아래에 위치하는 반면, 너무 작아서 들어갈 수 없는 허위 상자는 다른 19개 구멍 아래에 위치한다. 동물은 처음에 30초 동안 미로 중심에 있는 불투명한 실린더 내에 위치하여 초기 공간 방향감각상실을 촉진한다. 이 시간 후, 실린더가 제거되고 동물은 탈출 상자를 찾고 이에 들어가 홈 우리로 되돌아갈 때까지 미로를 탐사한다. 탈출 대기시간은 실린더 제거 및 탈출 상자로의 동물의 진입 사이의 지속시간이다. 오류(부정확한 항목)는 마우스가 허위 상자에 들어가는 이벤트의 수를 나타낸다. 2개의 밝은 빛이 반스 플랫폼의 중심을 비춘다. 마우스가 5분(300초) 내에 탈출 상자에 들어가지 못하면, 실험자는 이를 탈출 상자로 인도한다. 동물은 추가 30초 동안 탈출 상자에 머문 다음, 꺼내어 홈 우리로 이동한다. 모든 상자 및 미로 표면에 70% 이소프로필 알코올을 뿌리고 비체계적인 방식으로 닦아내어 후속 시험을 위해 냄새 정보를 없앤다. 탈출 상자의 위치는 훈련/획득 단계의 모든 시험 동안 동일하게 유지되고 의도하지 않은 미로내 정보에 대한 가능성을 감소시키기 위해 마우스마다 이동시킨다. 훈련은 하루에 3회 반복하며, 각 시험을 분리하는 15분 간격을 갖는다. 각 시험으로부터의 데이터를 유지하고 평균을 계산한다. 훈련/획득 단계는 4일이다. 이것 다음은 미로에 노출되지 않은 2일 휴식이다. 7일에, 각 동물을 훈련/획득 단계와 동일한 탈출 상자 위치 및 방법을 사용하여 3-시험 세션 동안 재시험한다. 8일에, 기억 유지 단계 후, 역전 단계를 시작한다. 탈출 상자를 원래의 탈출 상자 위치와 다른 사분면에 배치한다. 상기에 상세히 설명한 동일한 절차를 사용하여, 역전 시험을 2일 연속(8일 및 9일) 동안 매일 3회 반복한다. 마우스의 두 번째 코호트는 각 세션 시간이 최대 4분(240초)으로 단축된 것을 제외하고 동일한 반스 미로 시험을 받았는데, 이 시간의 길이는 더 긴 시간(5분)만큼 효과적인 것으로 나타났기 때문이다. 모든 연구자는 마우스 그룹을 알지 못하였다. 데이터를 수동으로, 디지털로, 그리고 미로 위에 위치한 비디오 카메라에 의해 기록하였다.

면역조직화학

뇌 관상 동결절편(30-μm 두께)을 무혈청 단백질 블록(Dako Cytomation)의 적용 전에 항원-회복 용액(DAKO)에서 또는 20% 정상 말 혈청(Invitrogen) 및 0.05% 트리톤TM X-100(Sigma-Aldrich)을 함유하는 투과 차단 용액으로 30분 동안 처리하였다. 그리고 나서, 절편을 혼성화하고 염소 다클론 OPN(R&D systems), 마우스 항-인간 아밀로이드-β[잔기 17-24, mAb 클론 4G8(1:100; SIG-39220; Covance) 및 잔기 1-16, mAb 클론 6E10(1:100; SIG-39320; Covance)], 토끼 항-GFAP pAb(1:100; G926; Sigma-Aldrich), 토끼 항-Iba1 pAb(1:250; #019-19741; Wako Chemicals), 토끼 항-GFP pAb(1:500; #598; MBL), 랫트 항-CD68(1:100; Abcam), 토끼 항-iNOS(1:100; Cell signaling), 랫트 항-CD45 mAb 클론 30-F11(1:25; #550539; BD Pharmingen), 염소 항-IL10 pAb(1:100; AF519; R&D systems), 및 염소 항-MMP9 pAb(1:100; AF909; R&D systems)를 포함하는, PBS 중의 2% 차단 용액에서 하기 일차 항체의 조합으로 4℃에서 밤새 염색하였다. 일차 항체와의 혼성화 후 Cy2, Cy3, Cy5, 또는 DyLightTM 649와 접합된 적절한 호스래디쉬 과산화효소(HRP) 접합된 또는 형광단 접합된 이차 항체(당나귀 항-마우스, 항-랫트, 항-염소, 및 항-토끼; 1:200; Jackson ImmunoResearch Laboratories)를 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 절편을 PBS에서 세척하고 4',6-디아미디노-2-페닐인돌 디하이드로클로라이드(DAPI)(H-1200)를 함유하거나 DAPI(H-1000)를 함유하지 않는 Vectashield(Vector Laboratories), 또는 DAPI를 갖는 ProLong® Gold(Molecular Probes, Life Technologies)를 사용하여 마운팅하였다. 음성 대조군을 일차 항체가 생략된 동일한 프로토콜을 사용하여 처리하여 비특이적 표지화를 평가하였다. 현미경 분석을 위해, ApoTome이 장착된 Carl Zeiss Axio Imager Z1 형광 현미경(Carl Zeiss MicroImaging, Inc.)을 사용하였다. 이미지 처리 및 분석을 위해, AxioVision(release 4.6.3) 소프트웨어(Carl Zeiss)를 사용하였다.

해마에서 시냅스전 표지화 및 시냅스 영역의 정량화

ADtg 및 비형질전환(야생형) 마우스의 해마에서 시냅스 영역을 정의하기 위해, 동물당(그룹당 n=6 마우스) 브레그마(bregma) -2.50, -2.65, 및 -2.80 mm(Liang et al., 2011)에서의 3개의 독립적인 관상 뇌 절편을 시냅스전 마커 VGluT1(Slc17a7에 의해 코딩됨)(Chemicon, 기니어 피그, 1:6000)로 염색하였다. 각 해마 필드에 대해, x 100 오일 대물 렌즈 및 Zeiss ApoTom 모드를 사용하여 고해상도 스캔을 획득하였다. 광학 절편은 15 Z-스택 이미지를 포함하였고, 각각은 0.25-mm 폭이고 3.75 mm의 조직 깊이 내에 초점면을 덮는다. 동일한 수준으로 수득된 5개의 모든 그룹으로부터의 절편을 동일하게 면역염색하였다. 모든 실험 동안, 일차 항체가 없는 대조군 및 이차 항체가 없는 대조군을 동시에 진행시켰다. 이들 대조군에 대해 특정한 염색이 없었다. 해마 영역을 덮기 위해, 15 사각형 필드(각각 90 μm x 70 μm)를 치아 이랑(dentate gyrus)의 측면 및 내측 블레이드 분자 층뿐만 아니라 암몬각 1(cornu ammonis 1, CA1)의 소강분자층(stratum lacunosummoleculare), 방사층(stratum radiatum), 및 지향층(stratum oriens)에서 정확하게 선택하였다. 스캐닝 매개변수들은 처리 조건마다 동일하게 유지하였다. 단일 광학 절편 이미지를 NIH ImageJ 매크로 및 배치 프로세스를 사용하여 분석하여 시냅스 영역(15 광학 절편/필드, 15 필드/뇌 절편, 및 675 총 이미지/뇌)을 정량화하였다. 평균 시냅스 영역 또는 이미지당 영역의 백분율을 각 조건에 대해 계산하였다.

티오플라빈 -S 아밀로이드-β 플라크 염색

이차 항체 염색 후, 뇌 절편을 실온에서 10분 동안 티오플라빈-S(Thio-S, 70% 에탄올 중 1% w/v)(Sigma-Aldrich)로 염색하고, 70% 에탄올에서 3회 세척한 다음, 각각 1분 동안 증류수에서 1회 세척하였다.

정량화 및 입체학적 계수 절차

OPN+ 세포, Iba1⁺CD45^hi 세포, GFAP⁺ 세포, Thio-S⁺ 아밀로이드-β 플라크 및 4G8⁺ 아밀로이드-β 플라크의 수 및 면적(μm²)을 해마 및 피질(내후각 및 대상 피질 포함) 영역 모두를 덮는 영역에 대해 150-μm의 간격으로 마우스당 4개 내지 6개의 관상 절편을 조사함으로써 결정하였다. Iba1⁺ /CD45^hi 정량화를 위해, Iba1^- 세포를 제외하고 CD45 항체로 강하게 표지된 Iba1⁺ 세포만을 선택하였다. CD45⁺ 세포(Iba1⁺ 세포 중)를 그레이 스케일 이미지로 변환하고, 강한/높은 신호에 대한 역치를 ImageJ 소프트웨어에서 한 번 결정하여 CD45^high 정량화를 위한 모든 이미지에 적용하였다. 특정 신호의 형광을 각 이미지에 대해 동일한 노출 시간을 사용하여 캡처하였다. 이미지를 그레이 스케일로 변환하고, PC로 디지털화하고, NIH ImageJ 소프트웨어(버전 1.38x 및 1.46r)로 히스토그램 기반 역치를 사용하여 기저선에 표준화하였다. 또한, OPN⁺/CD45^hi 세포, Iba1⁺ /CD45^hi 세포, GFAP⁺ 세포, 및 아밀로이드-β 플라크의 수동 계수(manual counting)를 '분석' 그리드를 사용하여 ImageJ 소프트웨어의 도움으로 수행하였다. 분석자는 모든 계수를 수행한 마우스 그룹을 알지 못하였다.

뇌 단핵구 침윤의 유세포 분석

실험 ADtg 마우스(n=4-6 마우스/그룹)를 채취 전에 0.5 mM EDTA(pH 8.0, Invitrogen)가 보충된 차가운 식염수로 관류하였다. 그리고 나서, 전체 뇌를 PBS 중의 빙냉 2% 우태아혈청(Atlanta Biological)을 갖는 70-mm 세포 여과기(Falcon; Corning Inc.)에서 기계적으로 분쇄하였다. 원심분리, 균질화 및 세척 후, 펠렛을 40% 멸균 Percoll(GE Healthcare)에 현탁시키고 850g에서 25분간 원심분리하였다. 세포 펠렛을 70% Percoll에 재현탁시키고, 800g에서 20분간 더 원심분리하였다. Percoll 구배 이후에 상부층에 위치한 세포를 수집하고 세척하였다. 그 다음, 세포를 Biolegend로부터 구입한 하기 항체로 염색하였다: FITC 접합된 항-CD11b 클론 M1/70(1:100, #101206); PE 접합된 항-Ly-6C 클론 HK1.4(1:100, #128007); 및 PE/Cy7 접합된 항-CD45.2 클론 104(1:100, #109830). 염색된 샘플을 BD FACS Diva 소프트웨어가 장착된 BD LSRFortessa 세포 분석기 상에서 분석하고, 데이터를 FlowJo 소프트웨어(vX.0.7r2; Tree Star, Inc.)로 추가로 분석하였다.

샌드위치 ELISA에 의한 아밀로이드- β ₁ _-40 , 아밀로이드- β ₁ _-42 , MCP1 , IL10 및 MMP9 수준의 생화학적 결정

뇌 가용성 및 불용성 ELISA 분석을 위해, 뇌 조직을 0.5% 트리톤TM X-100(T8787; Sigma) 및 프로테아제 억제제 칵테일 세트 I(#539131; Calbiochem)을 갖는 PBS 완충액에서 완전히 균질화시켰다(Argos 균질기). 세포 파편을 제거한 후, 균질액을 4℃에서 25분 동안 10,000g에서 원심분리하였다. 상등액을 '가용성' 분획으로 간주하고 가용성 아밀로이드-β₁ _-40, 아밀로이드-β₁ _-42, MCP1(Ccl2에 의해 코딩됨), IL10, 및 MMP9 수준을 평가하는데 사용하였다. 그리고 나서, 펠렛을 희석하고 상기 균질화 완충액으로 균질화시켰다. 이것은 '불용성' 분획이었고, 이를 불용성 아밀로이드-β₁ _-40 및 아밀로이드-β₁ _-42를 평가하는데 사용하였다.

MΦ^BM 세포의 경우, 각 웰 내의 세포를 2mM EDTA-PBS에 의해 들어올리고, 튜브에 수집하고, 원심분리하였다. 세포 펠렛을 용해시키고, 1% 프로테아제 억제제(Thermo Scientific)가 보충된 RIPA 완충액의 칵테일에 재현탁시키고, 사용시까지 -80℃에 보관하였다.

Pierce BCA 단백질 분석 키트(#23227; Thermo Scientic)를 사용하여 단백질 농도를 결정한 후, 가용성 및 불용성 형질전환 유래 아밀로이드-β₁ _-42 및 아밀로이드-β_1-40 수준, 및 OPN을 항-인간 아밀로이드-β₁ _-42 말단 특이적 샌드위치 ELISA 키트(KHB3442, Invitrogen; 마우스 아밀로이드-β 또는 인간 아밀로이드-β40/아밀로이드-β43을 인식하지 못함), 항-인간 아밀로이드-β₁ _-40 말단 특이적 샌드위치 ELISA 키트(KHB3482, Invitrogen; 마우스 아밀로이드-β 또는 인간 아밀로이드-β₄₂/아밀로이드-β₄₃을 인식하지 못함) 및 항-마우스 OPN quantikine ELISA 키트(R&D systems)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 분석하였다.

아밀로이드-β 키트는 아밀로이드-β₁ _-42 또는 아밀로이드-β₁ _-40 서열의 N- 및 COOH-말단에 특이적인 2개의 항체의 조합을 사용한다. 결합된 토끼 항-COOH-말단을 호스래디쉬 과산화효소 표지된 항-토끼 항체를 사용하여 검출하고 마이크로플레이트 판독기(Spectra Max 384 plus, Molecular Devices)를 사용하여 450 nm에서 판독하였다. 가용성 MCP1, IL10, 및 MMP9 수준을 제조사의 지침(R&D systems)에 따라 마우스/랫트 CCL2/JE/MCP1 Quantikine® ELISA 키트(MJE00), 마우스 IL10 Quantikine® ELISA 키트(M1000B), 및 마우스 총 MMP-9 Quantikine® ELISA 키트(MMPT90)를 각각 사용하여 측정하였다. 각 웰의 광학 밀도를 동일한 마이크로플레이트 판독기(Spectra Max 384 plus, Molecular Devices)를 사용하여 450 nm(540 nm 보정으로)에서 판독하였다.

아밀로이드- β ₁ _-42 원섬유의 제조

동결건조된 비플루오로 아밀로이드-β₁ _-42 펩타이드(#20276; Anaspec)를 빙냉 HFIP(헥사플루오로이소프로판올)(#52512; Sigma)에 1 mM의 최종 농도로 용해시켜 최초로 단량체화한 다음, 멸균 실리콘처리된 마이크로원심분리 튜브에 분취한다. HFIP를 먼저 멸균 후드에 있는 동안 그리고 다음으로 SpeedVac에서 2시간 동안 진공 조건하에 증발시켜 HFIP의 임의의 흔적을 제거하고; 펩타이드 필름을 사용할 때까지 -20℃에 보관하였다. 원섬유 형성을 유도하기 위해, 플루오로(HiLyte647; #64161; Anaspec) 및 비-플루오로 아밀로이드-β₁ _-42 필름을 멸균 NaOH 60 mM의 10%가 처음 첨가된 배지에 재현탁시키고 배지를 30초 동안 볼텍싱하였다. 그리고 나서, 멸균 45% H₂O 및 20 mM NaH₂PO₄ + Na₂HPO₄(pH 7.4)의 멸균 45% 용액을 첨가하고, 배지를 다시 볼텍싱하고, 37℃에서 2주 동안 진탕기에서 배양하였다. 그 다음, 미리 형성된 아밀로이드-β₁ _-42 원섬유를 60초 동안 초음파 처리하고, 식세포 작용 분석 전에 동일한 배지를 사용하여 100 nM로 희석하였다.

골수 유래 대식세포의 일차 배양 및 식세포 작용 분석

대식세포에 의한 아밀로이드-β 식세포 작용을 시험하기 위해, 반복된 실험에서 야생형 마우스(n=18 마우스)의 골수로부터 단핵구를 단리하고, 10% 혈청 및 20 ng/ml MCSF(#315-02; PeproTech)를 갖는 완전 RPMI-1640 배지(#21870; Life Technologies)에서 7일 배양하여 대식세포로 분화시켰다. 10% FBS, 100 U/ml 페니실린, 100 μg/ml 스트렙토마이신, 2 mM L-글루타민 및 20 ng/ml MCSF(PeproTech)를 갖는 완전 RPMI 1640 배지(Life Technologies)에서 6-7일 동안 배양한 대퇴골 및 경골로부터 골수 유래 대식세포(MΦBM)를 생성하였다. 그리고 나서, 대식세포의 일차 배양액을 유리 커버슬립 상에 24-웰 조직-배양 플레이트에서 밤새 웰당(각 조건당 3-4웰) 1.2 x 10⁵ 세포로 도말하였다. 그 다음, 대식세포를 30 μg/ml GA(코팍손®; TEVA Neuroscience), 브레펠딘 A(Brefeldin A, BFA; Sigma, 1X), 또는 10 μM 미노사이클린(Sigma)으로 1, 3, 또는 24시간의 지속시간 동안 처리하거나, 또는 처리하지 않았다(대조군). 원섬유성 아밀로이드-β₁ _-42의 첨가 전에, 세포를 4℃ 얼음 수조에서 5분 동안 냉각시키고; 미리 형성된 원섬유성 아밀로이드-β₁ _-42(100 nM)의 첨가 직후, 플레이트를 25℃에서 515g에서 원심분리한 다음 37℃에서 30 또는 60분 동안 배양하였다. 그리고 나서, 세포를 아밀로이드-β가 없는 배지로 헹궈 혼입되지 않은 아밀로이드-β를 제거하고, 이후 PBS로 2회 세척하였다. -20℃에서 20분 동안 메탄올(99.8%) 또는 실온에서 12분 동안 4% 파라포름알데하이드를 사용하여 세포를 고정시킨 다음, PBS로 반복 세척하였다. 면역염색을 위해, 세포를 마우스 항-인간 아밀로이드-β mAb 클론 6E10(1:100; SIG-39320; Covance), 랫트 항-CD68 mAb 클론 FA-11(1:100; ab53444; Abcam), 랫트 항-CD36 mAb 클론 MF3(1:200; ab80080; Abcam), 랫트 항-CD204 스캐빈져 수용체 유형 I/II(SCARA1) mAb(1:100; MCA1322; AbD Serotec), 토끼 항-CD163 pAb(1:100; orb13303; Biorbyt), 및 염소 항-MMP-9 pAb(1:100; AF909; R&D systems)를 사용하여 먼저 염색하였다. 이차 다클론 항체는 Cy2, Cy3 또는 Cy5와 접합된 당나귀 항-마우스, 항-랫트, 항-토끼, 및 항-염소(1:200; Jackson ImmunoResearch Laboratories)를 포함하였다. 세포를 DAPI를 갖는 ProLong® Gold(Molecular Probes, Life Technologies)를 사용하여 마운팅하였다. 여러 필드(그룹당 무작위로 선택된 최소 n= 5)를 Carl Zeiss Axio Imager Z1 ApoTomedl 장착된 현미경(각 필드에서 평균 120개 세포)을 사용하여 각 웰로부터 수득하였다. 이미지를 각 경우에 동일한 노출 시간을 사용하여 수득하였다. 개별 이미지를 그레이 스케일로 변환하고 NIH ImageJ 소프트웨어로 히스토그램 기반 역치를 사용하여 기저선에 표준화함으로써 형광 신호 및 그의 총 면적을 결정 및 정량하였다. '세포당 평균 면적'은 필드당 개별 세포의 면역반응성 면적의 수 평균의 결과였다. '면적/세포'는 동일한 필드(이미지)의 세포의 총수(DAPI 수)로 나눈 총 형광 신호(면적)를 측정한다. 모든 실험에 대해, 조사자는 처리 조건을 알지 못하였다.

웨스턴 블롯팅

MΦ^BM을 2 mM EDTA-PBS에 의해 각 세포로부터 들어올리고, 에펜도르프 튜브에 수집하고, 원심분리하였다. 세포 펠렛을 RIPA 완충액(Thermo Scientific)에서 용해시키고 프로테아제 억제제(Thermo Scientific)의 칵테일을 보충하였다. 단백질 농도를 BCA 단백질 분석 키트(Thermo Scientific)를 사용하여 결정하였다. 단백질 샘플의 분취물을 4-12% Bis-Tris 겔(Invitrogen)을 사용하여 전기영동으로 분리한 다음, 니트로셀룰로오스 막으로 옮기고, 5%(w/v) 비지방 분유를 함유하는 Tris 완충 식염수(TBS)에서 차단시키고, 토끼 다클론 OPN(Abcam), 염소 다클론 OPN(R&D systems), 및 액틴(Abcam)을 포함하는 적절한 일차 항체와 혼성화하였다. 그리고 나서, 막을 적절한 HRP 접합된 이차 항체와 함께 배양한 후 화학발광 기질로 현상하였다. 블롯의 농도 분석을 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 수행하였고, 각 실험 샘플을 액틴에 대해 표준화하였다.

시험관내에서 siRNA에 의한 OPN 넉아웃

25-bp 이합체 올리고리보뉴클레오타이드로 구성된 3개의 스텔스(Stealth) OPN siRNA 세트 각각을 OPN의 센스 및 안티센스 가닥(Invitrogen)에 상응하는 서열과 함께 사용하였다. siRNA의 각각의 양(각각 100 nM)을 혼합하고 100 nmol/L의 최종 농도로 OptiMEM(Gibco)에서 희석한 다음, 제조사의 프로토콜에 따라 리포펙타민® RNAiMAX 형질감염 시약(Invitrogen)을 사용하여 MΦ^BM 내로 일시적으로 형질감염시켰다. 대조군 대식세포를 스텔스 RNAi™ siRNA 음성 대조군으로 형질감염시켰다. MΦ^BM을 형질감염 후 48시간 동안 배양하였고, 후속 실험에 사용하였다.

세포 길이 측정

세포의 길고 짧은 축을 Axiovision Rel. 4.8 소프트웨어 패키지 내의 길이 도구를 사용하여 현미경 이미지로부터 수동으로 μm 단위로 측정하였다(McWhorter et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2013, 110:17253-17258). 적어도 100개의 세포를 각 실험에서 조사하였고, 개별 세포를 현미경에 의해 분석하였다.

통계 분석

GraphPad Prism 6.01(GraphPad 소프트웨어)을 사용하여 데이터를 분석하였다. 며칠 동안 둘 이상의 그룹의 비교(반스 미로 시험)는 이원(two-way) ANOVA 후 쌍을 이룬 그룹의 본페로니 다중 비교 사후 검정(Bonferroni multiple comparison post-test)을 사용하여 수행하였다. 셋 이상의 그룹의 비교는 일원 ANOVA 후 쌍을 이룬 그룹의 투키(Tukey) 또는 본페로니 다중 비교 검정을 사용하여 수행하였다. 두 그룹 비교는 양측(two-tailed) 비쌍 스튜던트 t-검정을 사용하여 분석하였다. 시냅스 면적의 정량화를 위해 투키 사후 검정 비교와 함께 StatPlus 쌍 t-검정 및 일원 ANOVA를 수행하였다. 상관관계 분석을 프리즘 피어슨 검정을 사용하여 수행하였다. 결과가 나타낸 바와 같이 평균 ± 표준 편차(SD) 또는 평균 ± 평균의 표준 오차(SEM)로 표시되어 있다. P-값 < 0.05는 유의한 것으로 간주하였다. 그룹 간의 유의도는 하기와 같이 표시된다: *p<0.05, **p<0.001, ***p<0.0001, 및 ****p<0.00001. 0.05 미만의 p-값은 유의한 것으로 간주하였다. 모든 데이터 분석은 맹검 조사자에 의해 주도되었고; 분석이 끝나면 코드를 공개하였다.

실시예 1

본 발명자들은 글라티라머 아세테이트(GA) 또는 BM-CD115⁺ 단핵구(Mo)의 이식을 통해 달성된 면역 조절이 알츠하이머병(AD) 쥣과 모델에서 시냅스 및 신경돌기 형성 및 인지 기능을 보존할 수 있는지 여부와 방법을 조사하였다. AD 신경병리학은 인지 저하를 유발할 것으로 생각되는 아밀로이드 β-단백질(Aβ), 특히 매우 시냅스독성인 Aβ₁ _-42 알로폼(alloform)의 증가와 밀접하게 연관되어 있다. 일차 배양액에서 골수(BM) 유래 MΦ의 GA 처리는 스캐빈져 수용체 및 Aβ 분해 효소의 상향조절을 통해 fAβ₁ _-42의 식세포 작용 및 분해를 실질적으로 향상시켰다. 가장 신경독성 종인 것으로 여겨지는 비-원섬유성 Aβ 형태, 주로 올리고머성(o) Aβ₁ _-42를 조사하였다. 그러나, 이들이 세포에 미치는 효과는 이들의 매우 준안정한(metastable) 성질과 동적으로 변화하는 혼합물에서의 존재로 인해 크게 알려지지 않은 상태로 있다. 이러한 어려움을 극복하기 위해, 특정 크기(단량체의 수)의 구조적으로 규명된 올리고머의 안정한 집단뿐만 아니라 순수한 원형원섬유성 및 원섬유성 종을 제조하기 위한 기술이 개척되었다. 이것은 독특하게도 시냅스 및 신경돌기 무결성(integrity) 및 뉴런 기능에 미치는 비-원섬유성 Aβ₁ _-42 어셈블리의 영향을 결정할 수 있게 해주며, 뇌에서 이러한 어셈블리를 제거하는 Mo/MΦ의 능력을 탐구할 수 있게 해준다. 임의의 특정 이론에 구속되지 않으면서, AD⁺ 마우스에서의 데이터는 뇌 Aβ₁ _-42의 축적이 시냅스 손실 및 인지 저하를 수반한다는 것을 시사한다. GA 또는 이식된 Mo는 유지된 인지와 연관된 시냅스의 보존을 초래하였다. 연구는 또한 구조적으로 안정하고 정의된 f/oAβ₁ _-42에 반응하여 MΦ 및 뉴런의 일차 공동 배양액에서 GA 처리된 MΦ에 의한 시냅스 밀도 및 신경돌기 길이의 보존을 나타낸다. 본 발명자들은 GA 처리된 MΦ에서 면역 조절제 오스테오폰틴(OPN)의 상향조절이 fAβ₁ _-42식세포 작용의 증가와 연관된다는 것을 확인하였고; OPN 억제는 식세포 작용을 손상시키는 것으로 보인다. 임의의 특정 이론에 구속되기를 바라지 않으면서, 본 발명자들은 병원성 Aβ 종을 제거하고 유해한 염증을 조절하며 신경영양 인자를 분비하는 뇌-침윤성 Mo/MΦ(GA 또는 이식된 Mo에 의해 유도됨)에 의해 시냅스 및 뉴런 활성의 보존이 향상될 수 있다고 믿는다.

본원에서, 본 발명자들은 AD와 연관된 안정하고 구조적으로 정의된 Aβ 어셈블리에 반응하여 MΦ 및 뉴런의 일차 공동 배양액에서 GA 처리된 MΦ에 의한 시냅스 구조 및 기능의 보존을 연구한다. 임의의 특정 이론에 구속되기를 바라지 않으면서, 본 발명자들은 GA 처리된 MΦ가 면역 조절제 OPN의 상향 조절을 통해 신경보호 표현형을 나타내어, 병리학적 Aβ 형태의 효율적인 제거뿐만 아니라 뉴런 구조 및 기능의 향상된 보존을 초래한다고 믿는다.

시냅스전(pre-synaptic), 시냅스후(post-synaptic), 및 신경돌기(neuritic) 길이 손실의 크기뿐만 아니라 o/pf/fAβ₁ _-42 어셈블리에 의해 유도된 뉴런 기능장애가 결정되었다. Aβ₁ _-42 어셈블리에 반응하여 GA 처리된 MΦ에 의한 시냅스 및 신경돌기 보호를 평가하였다. 본 발명자들은 신경독성 Aβ₁ _-42 어셈블리에 반응하여 시냅스 손실 및 뉴런 기능장애를 예방하는 GA 처리된 MΦ의 메커니즘을 결정하였고, Aβ₁ _-42 어셈블리를 내재화하고 분해하는데 있어서 MΦ의 효율을 평가한다. 본 발명자들은 이러한 기능과 관련된 면역 조절제 OPN의 역할에 초점을 맞추어, 면역 조절 및 신경영양 지원과 같은 기능과 관련된 MΦ 신경보호 표현형을 결정하였다.

본 발명자들은 또한 잠재적인 AD 요법으로서, 쥣과 모델에서 GA 또는 BM-CD115⁺ Mo 이식을 통해 달성된 면역 조절에 의한 시냅스 및 인지 기능의 보존을 조사한다. 임의의 특정 이론에 구속되기를 바라지 않으면서, 본 발명자들은 GA 면역화 또는 이식된 Mo가 OPN을 발현하는 뇌 MΦ를 증가시켜, 시냅스 구조를 복원하고 AD의 쥣과 모델에서 독성 Aβ₁ _-42에 의해 유도된 손실 후 인지 기능을 보존할 것으로 믿는다.

인지 장애의 기능으로서, AD⁺ 마우스 모델에서 질환 관련된 뇌 영역에서 생체외 시냅스전 및 시냅스후 마커 및 신경돌기 길이 손실을 측정하였다. GA, 또는 이식된 WT 대 OPN ^KO CD115⁺-Mo를 이용한 면역 조절 후 시냅스 및 인식 보존을 평가하였다. 보존된 시냅스와 연관된 뇌 MΦ 획득 표현형(들)의 조사를 통해 AD⁺ 마우스에서 시냅스 보존의 면역 조절 메커니즘을 확인하였다.

초기에, 일차 피질 뉴런(CN)에서 안정하고 구조적으로 정의된 fAβ₁ _-42 및 oAβ₁ _-42형태에 의해 유도된 시냅스 독성을 시험하였다. 뉴런을 8일의 배양 동안 250 nM의 Aβ어셈블리와 함께 또는 배지 단독(비히클)과 함께 12시간 동안 배양하였다. f/oAβ₁ _- ₄₂ 형태 모두에 의해 유도된, 시냅스전 및 시냅스후(VGluT1 & PSD-95, respectively) 면적 및 수의 광범위한 손실이 명확하게 검출되었다(도 1A-C). 시냅스 밀도 정량화는 fAβ₁ _-42후 공존하는 VGluT1/PSD95⁺ 반점 수의 유의한 50% 감소를 나타내었다. 또한, 본 발명자들은 배지 단독에서의 CN과 비교하여 oAβ₁ _-42에 의한 반점 수의 70% 감소를 검출하였다(도 1D; p <0.0001). fAβ₁ _-42및oAβ₁ _-42 사이의 공존된 시냅스 반점 수의 통계적 차이는 oAβ₁ _-42에 의한 증가된 시냅스독성을 시사한다(도 1D). 다음으로, Aβ 유도 신경돌기 수축을 평가하였다. CN을 항-Tuj1로 면역표지화하고 뉴런당 총 신경돌기 길이를 정확하게 정량화하였다(도 2A-D). f/oAβ₁ _-42의 밤새 배양은 대조군 CN 그룹과 비교하여 거대한 신경돌기 수축을 야기하였다(도 2B 대 2A). 미처리된- 및 GA 처리된 BM 유래 MΦ(CD68⁺ 세포)가 시냅스 및 신경돌기 손실을 예방할 수 있는지 여부를 다음에 시험하였다. 일차 CN 및 MΦ를 48시간 동안 공동배양하고, 마지막 12시간의 공동배양 동안 Aβ₁ _- ₄₂ 형태를 도입하였다. 데이터는 GA 처리된 MΦ가 f/oAβ₁ _-42에 의해 유도된 손실로부터 CN의 Tuj1⁺신경돌기를 광범위하게 보호하였음을 나타낸다(도 2D). 공존한 VGluT1/PSD95⁺ 반점 시냅스 수의 정량 분석은 fAβ₁ _-42또는oAβ₁ _-42에 각각 밤새 노출 후 32% 및 65%의 감소를 확인하였다(도 2E). 흥미롭게도, GA 처리된 MΦ 및 MΦ 단독 모두가 fAβ₁ _-42에 의해 유도된 시냅스 손실을 완전히 보호하였지만, GA 처리된 MΦ는 oAβ₁ _-42에 의해 유도된 시냅스 손실을 방지하는데 유의하게 더 효과적이었다(도 2E; p <0.0001). Aβ 축적이 GA 면역화 또는 이식된 BM-CD115⁺ Mo에 의한 시냅스 뇌질환(synaptopathy) 및 가능한 시냅스 회복에 미치는 생체내 효과를 평가하였다. 이들 면역-조절 개입을 받은 13개월령 AD⁺(ADtg) 마우스의 관상 뇌 절편에서의 시냅스전 및 시냅스후 변경을 정량화하였다(도 3A-D). 해마 및 내후각 피질에서 19개의 미리 정의된 영역으로부터 수득된 고배율 z-스택 이미지를 각각의 브레그마(bregma) 영역에서 캡처하였다(도 3A-D). 데이터는 일치된 WT 한배 새끼와 비교하여 AD⁺ 마우스(PBS 대조군)의 뇌에서의 시냅스전 및 시냅스후 밀도의 유의한 손실을 나타낸다(도 3E). 특히, 면역 조절 요법은 시냅스 형성을 유의하게 회복시켰다(도 3E; p <0.001). 13개월령 AD⁺ 마우스의 뇌로부터의 시험관내 데이터는 시냅스전 및 시냅스후 영역의 유의한 Aβ₁ _-42 유도 손실, 및 GA 면역화 또는 이식된 Mo를 받은 마우스에서 주목할만한 시냅스 회복을 시사한다(도 3E). 이들 결과는 Aβ₁ _-42 어셈블리에 의해 유도된 시냅스 손실이 뉴런 기능장애를 야기하는지, 및 GA 처리된 MΦ에 의한 시냅스 회복이 뉴런 기능 보존에 영향을 미칠지에 관한 의문을 제기한다.

MΦ가 이들의 시냅스보호 효과를 발휘할 수 있는 가능한 메커니즘을 밝히기 위해, MΦ가 Aβ₁ _-42 어셈블리에 결합하고, 이들을 내재화하고, 이들을 엔도솜 내로 전달하는 것을 통해 Aβ₁ _-42 어셈블리를 제거하는 능력을 평가하였다(도 4). MΦ 흡수 15분 후 초기 엔도솜(EEA1⁺ 소포체) 내부에 공존된 Aβ의 정량화는 아마도 fAβ₁ _-42의 향상된 MΦ 제거 메커니즘을 나타내는, fAβ₁ _-42대 oAβ₁ _-42의 유의하게 더 높은 엔도솜 존재를 나타낸다(도 4D). GA 처리 후 MΦ에서 면역 조절제 OPN의 상향조절을 또한 확인하였다(도 5A-D). GA 처리된 MΦ에서 OPN의 2배 증가는 fAβ₁ _-42 흡수에서의 2.8배 증가와 연관되었다(도 5D). GA 면역화 또는 이식된 Mo를 받은 AD⁺ 마우스의 뇌 조직의 조사는 또한 특히 Aβ 플라크에서 그리고 MΦ에 의해 발현된 OPN의 상향조절을 밝혀내었다(도 6A). 뇌 OPN 발현은 6E10⁺ 플라크 면적과 반비례하였고, 침윤된 Mo/MΦ와 양의 상관관계가 있었으며; 상관도표는 OPN 수준 및 Aβ-플라크 부담(R²= -0.58; p= 0.02), 및 OPN 및 침윤성 Mo/MΦ(R²= 0.54; p= 0.04) 사이의 관계를 입증한다(도 6B). siRNA를 통한 OPN 넉다운은 GA 처리된 MΦ에 의한 감소된 fAβ_1-42 식세포 작용을 야기하며, 이는 GA 향상된 Aβ 식세포 작용을 매개하는 OPN의 메커니즘을 시사한다(도 7A-C).

임의의 특정 이론에 의해 구속되기를 바라지 않으면서, 본 발명자들은 GA로 처리된 대식세포(MΦ)가 면역 조절제 OPN의 발현을 증가시켜, 보존된 뉴런 구조 및 기능을 지지하는 병리학적 Aβ 형태 및 면역 프로파일(들)의 향상된 제거를 야기하는 것으로 믿는다. 시험관내 실험 디자인의 개요를 위해 표 1을 참고한다.

표 1

P1 뉴런을 이전에 보고된 바와 같이 제조한다. 요약하면, 피질 뉴런(CN)을 1일령 신생 마우스로부터 수득하고, 해리시키고, 재현탁시키고, 5×10⁴/ml 세포로 24-웰 배양 플레이트에 도말한다. BM-MΦ를 본원에 기재된 바와 같이 수득한다. 요약하면, 단핵 농축된 BM 유래 세포를 C57BL/6 마우스로부터 단리시키고, 7일 동안 MΦ로 분화시킨다. 일차 MΦ를 일차 CN 배양액 내로 현탁(1:1의 비율)하여 뉴런 및 MΦ의 공동 배양을 48시간 동안 제조한다. CN 단독 또는 CN과 MΦ의 공동 배양액을 미리 형성된(정제되고 안정화된) f-, pf- 또는 oAβ₁ _-42와 함께 밤새 배양한다(도 8). GA 효과 및 OPN 억제를 평가하기 위해, MΦ을 공동배양 전 24시간 동안 OPN- 또는 스크램블된-siRNA(Invitrogen, Stealth Select)와 함께 또는 없이 GA(30 mg/ml, TEVA Neuroscience)로 처리한다. 실험은 CN을 시딩한지 9일 후에 수행될 것이다. 배양액을 시냅스 밀도 및 신경돌기 길이의 정량화를 위해 처리한다. 일차 배양액을 시냅스전 VGluT1(Chemicon, 1:6,000), 시냅스후 PSD95(Abcam, 1:600)(시냅스의 경우) 또는 Tuj1(신경돌기의 경우)로 동일하게 염색한다. 음성 대조군을 일차 또는 이차 항체를 제외하고 동일하게 처리한다. 현미경 사진을 Carl Zeiss ApoTome이 장착된 Axio Imager Z1 형광 현미경을 사용하여 촬영한다. 시냅스 반점 수 및 시냅스 면역반응성 면적을 반점 분석기로 정량화한다. 총 신경돌기 길이를 신경돌기 추적자(NeuriteTracer)를 사용하여 측정한다. 각 조건에 대한 적어도 3개의 커버슬립, 36개의 이미지 및 150개의 뉴런을 분석한다. 이미지당 또는 뉴런당 평균 반점 수, 시냅스 면적을 계산할 것이다. 마이크로전극 분석(EMA)을 사용한 CN의 자발적 네트워크 활동을 클리브 스벤드센(Clive Svendsen) 박사의 연구실에서 수행한다. MEA 기록 프로토콜은 공개된 바와 같이 수행될 것이다. 요약하면, 배양 9일에, CN의 자발적 네트워크 활동을 60분 동안 기록하여 기저선을 얻는다. 그리고 나서, f/pf/oAβ_1-42와 함께 배양되고 OPN siRNA과 함께 또는 없이 GA 처리된 MΦ 또는 MΦ 단독과 함께 공동배양된 뉴런을 Axion Maestro MEA 장치를 사용하여 기록한다. 그리고 나서, 총 활동 전위 발화율(total action potential firing rate) 및 평균 뉴런 발화 빈도(mean neuronal firing frequency)를 결정하고 플롯팅한다. MΦ에 의한 세포내 Aβ₁ _-42 흡수를 세포 용해물에서의 Aβ₁ _-40/Aβ₁ _-42 수준의 ELISA에 의해 그리고 본원에 기재된 바와 같이 ICC에 의해 정량적으로 평가한다. 시험관내 실험의 도식을 위해 도 9A를 참고한다.

임의의 특정 이론에 구속되기를 바라지 않으면서, 본 발명자들은 GA 면역화 또는 BM-CD115⁺ Mo를 이용한 혈액 농축이 플라크 병변에서 OPN을 발현하는 MΦ의 증가된 뇌 동원을 통해 그리고 Aβ₁ _-42의 제거 향상을 통해 AD⁺ 마우스에서 시냅스 구조 및 인지 기능을 구제할 것이라고 생각한다. 생체내 실험 디자인의 개요를 위해 표 2를 참고한다.

표 2

AD⁺, OPN 넉아웃(OPN^KO) 및 GFP 주 마우스(Jackson Labs)를 사용한 모든 실험을 세다시-시나이 의료 센터 IACUC의 규정에 따라 수행한다. 마우스 조직을 본원에 기재된 바와 같이 처리할 것이다. 뇌 절편을 VGluT1 및 PSD95(시냅스의 경우) 또는 Tuj1(신경돌기의 경우)로 동일하게 염색하고, 이미지를 상기 기재된 바와 같이 캡처한다. 해마 영역을 커버하기 위해, 100× 대물 렌즈 하에 15개의 동일한 직사각형 필드(90 μm × 70 μm)를 DG의 ML, 및 CA1의 SLM, SR 및 SO에서 각각 정확하게 선택한다. 또한, 4개의 동일한 필드를 내후각 피질 층 2 및 3에서 주의깊게 선택한다. 0.25 μm 간격 및 3.75 μm Zeiss ApoTom 고해상도 스캔에서 단일 광학 절편 이미지를 수행한다(도 3A-D). 시냅스 반점 수/면적 및 총 신경돌기 길이를 반점 분석기 및 신경돌기 추적자를 사용하여 정량화한다. 이미지당 또는 뉴런당 평균 반점 수, 시냅스 면적을 각 조건에 대해 계산한다. 반스 미로 행동 시험을 이전에 설명한 바와 같이 수행한다. 생체내 실험의 도식을 위해 도 9B를 참고한다. 작용 메커니즘을 연구하기 위해, 본 발명자들은, 상기 언급한 바와 같이, Aβ₁ _-42 어셈블리 제거의 효율을 평가하고, 면역 조절, 신경영양 지원과 같은 기능과 연관된 MΦ 신경보호 표현형을 결정할 것을 제안한다. 본 발명자들은 이러한 기능에서 면역 조절제 OPN의 역할을 구체적으로 연구한다. 시험관내 및 생체내 메커니즘 모두를 위한 실험 디자인의 개요를 위해 표 3을 참고한다. 스캐빈져 수용체(Scara-1, CD36, CD163) 및 분해 효소(MMP-9, ACE, neprilysin)의 수준은 또한 제조사의 프로토콜(R&D system)에 따라 샌드위치 ELISA에 의해 결정될 것이다. 전염증성 및 항염증성 사이토카인, OPN, IL-10, TGFβ1, iNOS, 및 TNFα(R&D system)의 발현은 ELISA 및/또는 IHC를 통해 조사될 것이다. TGFβ1 및 OPN 외에도, IGF-1에 의한 신경영양 지원의 측정을 또한 수행한다. GFP-표지화, Iba-1, CD11b, Ly6C 및/또는 CD45를 포함하는 마커를 사용하여, Mo/MΦ 집단의 뇌 침윤을 FACS 및 IHC에 의해 결정한다.

표 3

실시예 3

OPN 발현 패턴은 AD-관련 뇌 영역에서 아밀로이드 플라크와 연관된다

ADtg 및 연령 및 성별 일치된 비-Tg, 야생형(WT) 마우스의 다양한 뇌 영역에서의 OPN 발현 패턴을 분석하였다(도 10). 면역조직화학(IHC)은 Aβ 플라크 내부 또는 이와 근접한 모든 AD 관련 뇌 영역(해마, 대상 피질, 및 내후각 피질; 도 10A)에서 구별되는 OPN 발현 패턴을 밝혀내었다(도 10B). OPN 면역표지화는 대조군 WT 마우스에서 대부분 검출되지 않았다. 유사한 OPN 발현 패턴이 과산화효소 표지화를 가진 ADtg 마우스의 뇌에서 관찰되었다(도 10C). 전형적으로 AD와 연관되지 않은 뇌 영역(즉 선조체)에서, OPN 면역염색은 주로 ADtg 및 WT 마우스 모두의 뉴런에 국한되었다(도 17A-17B). 임의의 특정 이론에 구속되기를 바라지 않으면서, 이들 결과는 ADtg 마우스의 AD 관련 뇌 영역에서, OPN이 Aβ 플라크와 관련된 골수 세포에 의해 선택적으로 발현되었음을 입증한다.

GA 면역화에 의한 뇌 OPN 발현의 상향조절은 Aβ 플라크 부담과 반비례한다

GA 면역화가 뇌에서의 OPN 발현에 미치는 효과를 연구하기 위해, 증상이 있는 ADtg 마우스의 3개의 처리 그룹인 GA 면역화된 처리(2개월 동안 매주 1회 피하), GA+Mo^BM 조합 처리(2개월 동안 매주 피하 GA 및 매월 Mo^BM 서브세트의 정맥내 주사) 및 PBS 대조군(2개월 동안 매월 PBS로 정맥 주사됨)을 분석하였다. 해마(HC) 및 대상 피질 영역을 커버하는 관상 뇌 절편의 대표적인 현미경 사진은 PBS 대조군과 비교하여 GA- 및 GA+Mo^BM 면역화된 마우스에서 감소된 6E10⁺-Aβ 플라크 부담과 함께 상승된 OPN 면역반응성을 밝혀내었다(도 10A). 유사한 결과가 내후각 피질(EC; 나타내지 않음)에서 관찰되었다.

정량 면역조직화학(IHC)은 GA 면역화된 ADtg 마우스 그룹 모두에서 뇌 OPN 발현의 유의한 증가를 확인하였다(도 11B 및 도 18A). PBS 대조군과 비교하여, GA로 처리된 마우스에서의 OPN 발현은 1.5배 더 높았고, EC에서 지속적으로 가장 높았고 HC에서 가장 낮았다. 이 차이는 뇌 OPN이 PBS 대조군의 1.7배였던 GA+Mo^BM 그룹에서 훨씬 더 컸다(도 11B). 동일한 뇌 절편에서 6E10⁺-Aβ 플라크 부담의 평가는 PBS 대조군과 비교하여 GA 면역화된 그룹(GA 및 GA+Mo^BM)에서 실질적인 감소를 나타내었다(도 11C).

다음으로, OPN 발현 수준을 플라크 부담 면적에 대해 측정하였다. 총 뇌 영역에서 총 OPN 면적 대 플라크 면적의 비율을 정량화하였다(도 11D 및 도 19B). GA 면역화된 그룹 모두는 Aβ-플라크 면적당 총 OPN 발현의 유의한 증가(각각 2.6- 및 3.6배)를 나타내었다. 별도의 피질 및 해마 분석은 유사한 결과를 나타내었다(도 18B). Aβ 플라크 내에서 상승된 OPN 발현에 대한 이러한 효과는 조합된 GA+Mo^BM 그룹에서 더 컸다(도 11D). 피어슨 검정을 사용한 상관관계 분석은 OPN 발현 및 6E10 플라크 부담 사이에 유의한 역관계를 나타내었고(도 11H), 피질 영역에서 더 강한 상관관계가 관찰되었다(도 11I). 임의의 특정 이론에 구속되기를 바라지 않으면서, 이들 결과는 집합적으로 ADtg 마우스에서의 GA 면역화가 감소된 아밀로이드 플라크 부담에 부수적인 뇌 OPN 발현의 상향조절을 야기한다는 것을 나타낸다.

OPN은 주로 Aβ 제거에 관여하는 침윤성 단핵구 유래 대식세포에 의해 발현된다

ADtg 마우스 뇌에서 OPN 발현 세포를 확인하기 위해, 2개의 상이한 접근법을 사용하였다. 침윤성 단핵구/대식세포(Mo/MΦ)를 미세아교세포와 구별하기 위해, 조합된 Iba-1 및 CD45 마커를 먼저 사용하였다(도 13A). 대표적인 형광 현미경 사진은 상주하는 Iba1+CD45^int ^-low 미세아교세포와 비교하여 뇌 침윤성 Iba1⁺CD45^high Mo/MΦ에 의한 OPN의 선택적 발현을 밝혀내었다(도 13A). 이러한 침윤성 OPN 발현 Iba1⁺CD45^high Mo/MΦ는 플라크 병변 부위 및 그 주위에 축적되어 Aβ를 직접 삼켰다(도 13A, 화살표). 두 번째 접근법에서, GFP 표지된 CD11b+CD115+-Mo^BM를 어린 공여 WT 마우스로부터 단리시키고 증상을 보이는 10개월령 ADtg 마우스의 꼬리 정맥에 주사하였다(도 13B). 이들 GFP⁺CD45^high 발현 Mo/MΦ는 GFP-미세아교세포와 구별가능하였고, OPN으로 강하게 공동 표지되었다. 높은 OPN을 발현하는 Mo/MΦ는 종종 EC에 집중되어, 플라크 병변 부위 주위의 뇌 실질로 회귀한다(도 13B-13C). ADtg 마우스 뇌에서 침윤성 Mo/MΦ 내부의 OPN의 세포하 국소화를 또한 조사하였다. OPN은 소포 구획과 세포체 및 돌기에 걸쳐 발견되었다(도 13D-13E). OPN 발현은 핵주위 구역에서 특히 강하였다.

다음으로, 상기 언급된 뇌 영역에 걸쳐 절편당 OPN+CD45^high 세포수를 정량화하였다. 침윤성 OPN+CD45^high 세포의 수의 실질적인 1.5배 및 2.2배 증가가 PBS 대조군와 비교하여 GA 및 GA+Mo^BM 그룹에서 각각 검출되었다(도 13F). 상관관계 분석은 ADtg 마우스에서 Iba1⁺CD45^high Mo/MΦ에 의한 OPN 발현 및 침윤 사이의 유의한 직접적인 선형 관계를 입증하였다(도 13G). OPN 사이토카인의 발현과 플라크 주위에 동원된 골수 세포 사이의 더 밀접한 연관성이 6E10 면역반응성 면적당 CD45^high 및 OPN 발현의 비율에 의해 나타났다(도 19B). 다요인 상관도표 분석은, 침윤성 Mo/MΦ 및 OPN 발현 사이의 직접 연관성과 함께, OPN 발현 및 Aβ 플라크 부담 사이의 역관계를 확인하였다(도 6B 및 19A). 임의의 특정 이론에 구속되지 않으면서, 이들 결과는 GA가 ADtg 마우스에서 OPN 발현 Mo/MΦ의 뇌 동원을 유도한다는 것을 시사하며, 이는 OPN 발현이, 주로 뇌 Aβ-플라크 제거에 직접 관여하는 침윤성 Mo/MΦ에서, ADtg 마우스에서의 GA 면역화에 의해 상승된다는 것을 나타낸다.

GA는 BM 유래 대식세포의 일차 배양액에서 OPN 발현을 상향조절한다

GA가 대식세포에서의 OPN 발현에 미치는 영향을 조사하기 위해, 일차 MΦ^BM을 사용한 일련의 시험관내 연구를 수행하였다. BM을 어린 WT 공여 마우스로부터 단리시키고, 성숙한 대식세포로 분화시키고, GA(30 μg/ml; GA-MΦ^BM)로 밤새 전처리하고, 미리 형성된 Aβ₁ _-42 원섬유에 노출시켰다. 대표적인 형광 이미지는 Aβ가 없는 초기 실험에서, OPN이 배양액에서 MΦ^BM에 의해 항시적으로 발현되었고 GA에 노출시 과발현되었음을 보여준다(도 14B). MΦ^BM은 세포외 기질 내로 OPN을 항시적으로 발현하고 분비하므로, 브레펠딘 A(Brefeldin A, BFA) 전처리를 이용한 분비의 억제에 의한 OPN 생산을 평가하였다(도 14C). 실제로, 새로 생성된 OPN은 BFA에 의해 포획되어, 그의 세포내 축적을 증가시켰다. 이후, 이들 세포는 감소된 세포 부착 및 변화된 둥근 형태학을 나타내었다. GA는 BFA 전처리된 MΦ^BM에서 OPN 생산을 더 상승시켰다(도 14C). 정량 면역세포화학(qICC)은 GA-MΦ^BM 대 처리되지 않은 MΦ^BM에서 OPN 생산/발현(각각 BFA를 갖거나 갖지 않음)의 유의한 1.6배 및 2.5배 증가를 확인하였다(도 14D). 세포 용해물의 정량 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA)은 이들 결과를 확인하였으며, 이는 GA 처리 후 증가된 OPN 수준(BFA를 갖거나 갖지 않는 경우, 각각 1.4배 및 2.3배)을 나타낸다(도 14E). BFA 조건은 단시간에(즉, 1-3시간 이내) MΦ^BM에서 OPN의 실질적인 축적을 시사하였다. 종합하면, OPN의 ELISA, qICC, 및 웨스턴 블롯 평가(도 14D-14G)는 우리의 생체내 결과를 반영하였고, 이는 GA가 MΦ^BM에서 OPN 발현 및 생산을 현저하게 유도한다는 것을 나타낸다.

OPN은 GA-활성화된 대식세포에서 Aβ 식세포 작용을 양성 조절한다

이후, GA 활성화로부터 비롯되는 OPN 발현 증가가 병원성 Aβ 응집체를 식균작용하는 대식세포의 능력과 연관되는지 여부를 조사하였다. MΦ^BM을 이전에 기술된 바와 같이 GA로 전처리하고, 100 nM 원섬유성 Aβ₁ _-42로 30분 동안 자극시켰다. 대표적인 고배율 Z-스택 이미지는 MΦ^BM에서의 세포내 OPN 발현이 원섬유성 Aβ₁ _-42의 식세포 작용을 동반하였음을 입증하였다(도 15A). 향상된 Aβ 흡수는 qICC 분석에 의해 검출된 바와 같이 GA 처리된 MΦ^BM에서의 증가된 OPN 발현과 연관되었다(도 15B-15C). 대표적인 이미지는, 반점이 있는 Aβ 표지화를 동반한 강한 핵주변 및 균등하게 분포된 소포 신호와 함께, 체세포 내에서 그리고 CD68⁺식세포의 돌기를 따라 OPN 면역반응성의 뚜렷한 패턴을 보여준다. 이 염색은 GA 처리 후 실질적으로 증가하였다(도 15G-15H'). 세포 용해물의 정량 ELISA 분석은 상기 qICC 결과를 검증하였으며, 이는 GA 처리된 대 처리되지 않은 MΦ^BM에서 증가된 세포내 OPN 및 Aβ₁ _-42를 나타낸다(도 15I-15J). 이들 결과는 GA가 OPN 발현(2.3-2.7배) 및 MΦ^BM에서 원섬유성 Aβ_1-42 흡수(2.5-2.85배) 모두를 증가시킨다는 것을 보여준다.

이전 연구는 대식세포에서의 세포내 OPN 결실이 식세포 활성을 손상시킨다는 것을 시사하였다. 본원에서는, Aβ의 특정 식세포 작용에서의 OPN 관여를 평가하기 위해, OPN 발현을 siRNA를 사용하여 넉다운시켰다(도 15L-15N). MΦ^BM 세포를 siRNA^OPN 또는 대조군 siRNA^Neg로 형질감염시키고, 48시간 후 섬유성 Aβ₁ _-42를 첨가한 다음, 식세포 작용을 분석하였다. 대표적인 형광 이미지는 siRNA-OPN 억제 후 CD68⁺MΦ^BM에 의한 원섬유성 Aβ₁ _-42 흡수의 실질적인 감소를 밝혀내었다(도 15L). 정량 ICC 분석은 관찰을 확인하였고, 82-85% OPN 억제가 Aβ₁ _-42 원섬유의 56-63% 감소된 세포내 흡수와 연관되었음을 나타내었다(도 15M-15N). 이들 결과는 원섬유성 Aβ₁ _-42의 식세포 작용이 OPN의 부재시 손상되었음을 입증한다(도 15N). 음성 대조군 스크램블된 siRNA는 OPN 발현 또는 Aβ 식세포 작용에 영향을 미치지 않았다. 더욱이, OPN이 억제되었을 때 GA는 Aβ를 흡수하는 MΦ^BM 능력에 거의 내지 전혀 영향을 미치지 않았다. 전반적으로, 임의의 특정 이론에 구속되기를 바라지 않으면서, 데이터는 OPN이, GA 매개 OPN 유도에 의해 기능을 얻고 OPN 억제시 기능을 상실하는 활성인, 섬유성 Aβ₁ _-42를 식균 작용하는 대식세포의 능력을 매개한다는 것을 시사한다.

GA는 OPN 및 그의 활성 단편을 유도하여 대식세포 분극을 촉진한다

대식세포는 그들의 미세환경에 따라 구별되는 표현형 및 생물학적 기능을 획득할 수 있다. 지난 연구들은 OPN이 대식세포가 항염증성 M2 표현형으로 전환하는 것을 촉진한다고 보고하였다. 신장된 세포 형태와 연관되었던, 항염증성 표현형으로의 대식세포 분극화에서의 OPN의 가능한 역할을 탐구하였다. 다양한 처리 조건 하에 세포 길이를 분석하였고, 증폭된 OPN 발현을 가진 GA 처리를 겪은 세포에서, 길이가 1.3배 증가하였음을 발견하였다. 대조적으로, siRNA^OPN 넉다운은 GA 효과를 역전시켰고, 세포 길이를 ~30-40%까지 더 감소시켰다(도 16A-16B). OPN 부재하에, GA는 siRNA^OPN 넉다운 후 우리의 Aβ-식세포 작용의 결과(도 15N)와 유사하게, 대식세포 세포 신장에 영향을 미치지 않았다(도 16B).

다음으로, 상이한 치료 그룹에서 전염증성 M1 대식세포 표현형의 특징인 유도성 산화질소 합성효소(iNOS)의 발현을 평가하였다(도 16C-16D). 삼환계 항생제 미노사이클린을 사용하여 OPN 발현을 억제하였다. 미노사이클린은 염증 반응을 조절하고 매트릭스 메탈로프로테이나아제(MMP)-9 활성 및 단백질분해성 OPN 단편의 생성을 감소시키는 것으로 나타났다. MΦ^BM은 GA에 의해 OPN 활성화되었거나 또는 미노사이클린에 의해 OPN 억제된 다음, 원섬유성 Aβ에 30분 동안 노출되었다. 형광 현미경 사진은 GA가 iNOS 발현을 감소시키고 원섬유성 Aβ¹ ^-42 식세포 작용을 증가시킨 반면, 미노사이클린은 반대 효과를 가지고 있었음을 입증하였다. 정량 ICC 분석은 미노사이클린 처리된 대식세포에 의한 iNOS 발현의 유의한 ~1.3배 증가, 및 Aβ¹ ^-42 식세포 작용의 실질적인 48% 감소를 확인하였다. 가장 중요하게도, GA 처리는 iNOS 생산을 28% 감소시켰고, Aβ 식세포 작용을 2.5배 증가시켰다(도 16D-16E). 이들 연구는 GA가 OPN 발현을 유도하였고, 이는 신장된 치유 촉진 세포 형태학, 감소된 iNOS 생산, 및 증가된 Aβ¹ ^-42 식세포 작용을 야기하였음을 입증하였다. 임의의 특정 이론에 구속되기를 바라지 않으면서, 이러한 변화는 AD 모델에서 신경보호와 연관된, 항염증성, 매우 식작용성 대식세포 표현형으로의 전환을 지원할 수 있다.

다음으로, MMP-9 발현 및 OPN 단백질분해성 단편을 분석하였다. 본 발명자들의 이전 결과와 일치하게도, GA 처리는 대식세포에서 MMP-9 발현을 2.7배 유의하게 증가시켰다(도 16F-16G). OPN은 MMP(MMP-9 포함)에 대한 공지된 기질이다. 대식세포에서의 OPN 발현의 상세한 분석을 전장 OPN 및 32 kD 형태를 포함하는 그의 MMP-절단된 단편을 인식하는 다클론 항체를 사용하여 수행하였다. 웨스턴 블롯 분석 및 밴드 밀도의 후속 정량화는 MMP 단백질분해로부터 비롯된 단편을 포함하는 모든 OPN 형태가 상승된 MMP-9 생산과 동시에 GA 처리에 의해 상승되었다는 것을 밝혀내었다(도 16I-16J). 놀랍게도, MMP 생성된 32kD C-말단을 함유하는 펩타이드는 GA 처리 후 12배 상승하였다. 이 단편의 기저 수준은 처리되지 않은 대식세포에서 매우 낮았지만, GA 활성화 후 매우 두드러졌다(도 16I-16J).

마지막으로, ADtg 마우스 뇌에서의 MMP-9 및 OPN 발현의 분석은 뇌 OPN 면역반응성 면적과 MMP-9 단백질 수준 사이의 양의 상관관계를 나타내었다(도 19C). 뇌 침윤성 CD45^hi 대식세포 내의 OPN 발현은 MMP-9 수준과 더 강한 상관관계를 나타내었다(도 19D). 임의의 특정 이론에 구속되기를 바라지 않으면서, 조합된 데이터는 GA가 그의 MMP 절단된 활성화된 단편을 포함하여 OPN 발현을 유도하였고, 치유 촉진, 항염증성, 매우 식작용성 표현형으로의 대식세포의 분극화를 매개하였음을 시사하며, 이는 신경보호에서의 그의 신규한 역할을 시사한다.

이 연구에서, 생체내 및 시험관내 모델 모두를 이용하여 AD에서의 OPN의 신규한 면역조절 역할이 확인되었다. 더욱이, FDA 승인된 약물인 GA는 대식세포에서 그의 발현을 상향조절하는 효과적인 수단이었다. 첫 번째 주요 관찰은 ADtg 마우스 뇌에서의 OPN 패턴이 AD 연관 영역인 해마 및 피질에서 검출되었다는 점이었다. OPN은 Aβ 병변 부위를 둘러싸는 염증성 세포에서 풍부하게 발현되었지만, 손상되지 않은 뇌 영역은 뉴런에서 이 사이토카인을 주로 나타내었다. 염증성 세포 중에서, OPN은 주로 침윤성 Iba1⁺CD45^high 또는 GFP 표지된 단핵구 유래 대식세포에 의해 발현되었다. AD에서 이 사이토카인의 가능한 면역조절 역할은 OPN이 단핵구 침윤 및 Aβ 플라크 제거와 밀접하게 상관관계가 있다는 발견으로부터 나온다. Aβ 흡수에 직접 관여하는 침윤성 Mo/MΦ(즉 내후각 피질)가 풍부한 뇌 영역에서의 증가된 OPN 발현은 OPN이 Aβ의 대식세포 매개 제거에 기여한다는 개념을 더 뒷받침한다.

증가된 OPN 발현이 외상성 뇌 손상 후 반응성 미세아교세포에서 보고되었지만, 여기에서 ADtg 마우스 뇌에서의 OPN 발현이 대식세포에서 선택적으로 발생하였음이 관찰된다. 이러한 관찰은 말초 대식세포가 상주하는 미세아교세포보다 훨씬 더 효과적으로 Aβ 플라크를 식균작용한다는 것을 입증하는 연구와 일치한다. 다양한 표면 인테그린 및 스캐빈져 수용체와의 OPN의 공지된 상호작용은 이들 염증성 세포의 식작용성 활성에 대한 그의 직접적인 효과를 더 뒷받침한다.

또한 GA 면역화 후 뇌 OPN의 현저한 상향조절이 정맥내 단핵구 농축과 조합될 때 훨씬 더 컸다는 점에 유의한다. 이들 결과는 동일한 조합된 면역조절 접근법에 의해 상승적으로 유발된, 본 발명자가 이전에 보고한 뇌로의 증가된 단핵구 동원의 패턴과 유사하였다. OPN이 대식세포에 의해 발현된 인테그린 결합 단백질이라는 점을 고려할 때, 이러한 발견은 옵소닌화 및 염증성 부위로 면역 세포의 동원에서의 그의 작용을 설명할 수 있다. 따라서, 임의의 특정 이론에 구속되지 않으면서, GA가 아밀로이드 플라크로의 말초 식세포의 동원을 유도할 때, 이 면역조절 현상은 OPN에 의해 매개된다고 결론지을 수 있다.

더욱이, 이 연구는 GA가 ADtg 마우스의 뇌에서 관찰된 것과 유사한 방식으로 BM 유래 대식세포에서 OPN 발현을 실질적으로 유도한다는 것을 나타낸다. 본 발명자들은 이들 GA 자극된 일차 배양액에 의한 증가된 OPN 및 미리 형성된 섬유성 Aβ^1-42의 후속 세포내 흡수에 대한 일관된 증거를 입증한다. OPN 발현을 음성 조절하거나(siRNA 또는 미노사이클린) 또는 그것을 양성 유도하는(GA) 시스템을 이용함으로써, 대식세포 매개 Aβ 식세포 작용에서의 OPN의 결정적인 역할이 입증되었다. 이들 결과는, OPN의 다른 식세포작용 활동에의 관여를 기술하는 문헌과 함께, 원섬유성 Aβ^1-42 식세포 작용이 OPN 발현에 직접적으로 의존할 수 있음을 밝힌다.

OPN의 상이한 기능은 그의 복잡한 단백질분해 과정, 예컨대 다양한 세포 상호작용을 허용하는 MMP에 의한 절단을 통해 달성될 수 있다. 특히, MMP-9는 OPN의 기능적이고 보다 신경보호적인 형태를 생성하는데 관여하였다. 데이터는 GA가 MMP-9 발현을 유도하였을 뿐만 아니라, 전장 OPN 및 그의 MMP 절단된 단편의 존재량을 유의하게 증가시켰음을 나타낸다. 특히, GA 활성화된 대식세포 배양은 신경보호와 관련된 OPN의 생성물인 32kD OPN 단편의 수준의 엄청난 12배 증가를 나타낸다. ADtg 마우스 뇌에서 침윤성 Mo/MΦ의 조사는 또한 이들의 밀접한 상관관계 및 GA 면역화 후 증가된 발현에 의해 뒷받침된 MMP-9 및 OPN 사이의 연관성에 대한 추가 뒷받침을 제공하였다. 이러한 발견은 OPN의 기능적 형태를 생성하는 MMP-9의 역할을 나타내는 이전 보고와 일치한다. 미래의 연구는 각 OPN 단편이 AD의 맥락에서 대식세포 표현형에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지 확인해야 하며, 임의의 특정 이론에 구속되지 않으면서, 치료적 대식세포 표현형의 GA의 유도는 이들 MMP 절단된 신경보호성 단편을 상승시킴으로써 매개되었다고 가정할 수 있다.

일반적으로 전염증성 사이토카인으로 간주되긴 하지만, 최근 연구는 OPN이 뇌의 복원 촉진 과정에 기여할 수 있음을 보여주었다. 이 연구는 GA가 대식세포를 매우 식작용성(원섬유성 Aβ₁ _-42의 증가된 흡수), 항염증성(감소된 iNOS 및 증가된 MMP-9), 치유 촉진성(신장된) 표현형으로 분극화하며, 이것이 OPN 발현에 의존적이었음을 예기치 않게 입증하였다. OPN 억제시, 이 표현형 변화는 역전되었다. 임의의 특정 이론에 구속되기를 바라지 않으면서, 데이터는 AD 모델에서 대식세포 표현형 및 Aβ 제거의 핵심적인 면역 조절자로서 OPN의 새로운 역할을 집합적으로 입증한다. GA에 의한 대식세포의 분극화는 OPN에 의해 특이적으로 매개되었고, 이는 AD 관련 병리학에 저항하고 조직 복원을 촉진하는 OPN의 유망한 신경보호 작용을 시사한다.

본 발명의 다양한 구현예가 상세한 설명에 상술되어 있다. 이러한 설명이 상기 구현예를 직접적으로 기술하지만, 당업자는 본원에 나타나고 설명된 특정 구현예에 대한 변형 및/또는 변경을 구상할 수 있는 것으로 이해된다. 이 설명의 범위에 속하는 임의의 이러한 변형 또는 변경도 또한 본원에 포함되는 것으로 의도된다. 명시적으로 언급하지 않는 한, 명세서 및 청구범위 내의 단어 및 어구는 적용가능한 분야(들)의 당업자에게 통상적이며 익숙한 의미로 제공되는 것이 본 발명자들의 의도이다.

출원 시점에 출원인에게 공지된 본 발명의 다양한 구현예에 대한 전술한 설명은 제시되었고, 예시 및 설명의 목적인 것으로 의도된다. 본 발명의 설명은 포괄적이거나 본 발명을 개시된 정확한 형태로 제한하는 것으로 의도되지 않으며, 상기 교시에 비추어 많은 변형 및 변경이 가능하다. 기술된 구현예는 본 발명의 원리 및 그의 실제적인 응용을 설명하고 당업자가 본 발명을 다양한 구현예로 그리고 고려된 특정 용도에 적합한 다양한 변형으로 이용할 수 있게 한다. 따라서, 본 발명은 본 발명을 수행하기 위해 개시된 특정 구현예에 제한되지 않는 것으로 의도된다.

본 발명의 특정 구현예가 나타나고 기술되었지만, 본원의 교시에 기초하여, 본 발명 및 그의 더 광범위한 양태를 벗어나지 않으면서 변화 및 변형이 이뤄지 수 있음이 당업자에게 자명할 것이며, 따라서 첨부된 청구범위는 본 발명의 진정한 사상 및 범위에 속하는 모든 이러한 변화 및 변형을 이들의 범위 내에서 포함한다. 일반적으로, 본원에 사용된 용어는 "개방형" 용어로서 일반적으로 의도된다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다(예컨대, 용어 "포함하는"은 "비제한적으로 포함하는"으로 해석되어야 하며, 용어 "갖는"은 "적어도 갖는"으로 해석되어야 하고, 용어 "포함하다"는 "비제한적으로 포함하다" 등으로 해석되어야 함).

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "포함하는" 또는 "포함하다"는 구현예에 유용하지만 유용하거나 유용하지 않은 불특정 의 포함에 대해 개방된 조성물, 방법, 및 이의 각각의 성분(들)과 관련하여 사용된다. 일반적으로, 본원에 사용된 용어는 "개방형" 용어로서 일반적으로 의도된다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다(예컨대, 용어 "포함하는"은 "비제한적으로 포함하는"으로 해석되어야 하고, 용어 "갖는"은 "적어도 갖는"으로 해석되어야 하며, 용어 "포함하다"는 "비제한적으로 포함하다" 등으로 해석되어야 함). 포함하는(including), 함유하는(containing), 또는 갖는(having)과 같은 용어의 동의어로서 개방형 용어 "포함하는(comprising)"이 본 발명을 설명하고 청구하기 위해 본원에 사용되었지만, 본 발명, 또는 이의 구현예는 "이루어지는" 또는 "본질적으로 이루어지는"과 같은 대안적인 용어를 사용하여 대안적으로 기술될 수 있다.

Claims

대상에서 알츠하이머병의 가능성을 치료, 예방 또는 감소시키거나, 알츠하이머병의 증상을 완화시키거나, 시냅스 구조 또는 인지 기능을 구제하거나, 병리학적 아밀로이드-β 형태의 제거를 향상시키거나, 또는 뉴런 구조 및 기능의 쇠퇴를 억제하는 것, 또는 이들의 조합을 위한 치료적 유효량의 세포 집단을 포함하는 약제학적 조성물로서, 상기 세포 집단은 선천성 면역 세포에서 오스테오폰틴(OPN)의 발현을 증가시키는 조성물로 생체외에서 자극된 선천성 면역 세포를 포함하는 것인 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 선천성 면역 세포는 단핵구, 대식세포, 또는 단핵구와 대식세포를 포함하는 것인 약제학적 조성물.
제2항에 있어서, 선천성 면역 세포는 단핵구를 포함하고, 단핵구는 골수 유래 단핵구, 비장 유래 단핵구, CD115 양성 단핵구(CD115⁺단핵구), 또는 침윤성 단핵구, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 선천성 면역 세포에서 OPN의 발현을 증가시키는 조성물은 글라티라머 아세테이트(GA)를 포함하는 것인 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 대상은 글라티라머 아세테이트(GA)를 투여받는 것인 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 대상은 글라티라머 아세테이트(GA)를 투여받은 적이 있는 것인 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 선천성 면역 세포는 선천성 면역 세포에서 OPN의 발현을 증가시키는 조성물에 의한 자극에 반응하여 OPN의 증가된 발현을 갖는 것으로 결정된 것인 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 입양 세포 전달, 골수 이식, 대상으로의 직접 전달, 바이러스 벡터 전달, 리포좀 전달 시스템, 또는 나노약물 전달 시스템에 의해 대상에게 투여하도록 구성된 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 알츠하이머병의 증상을 완화시키기 위한 것이고, 알츠하이머병의 증상은 기억 상실, 인지의 비기억 측면의 저하, 손상된 추리 또는 판단, 행동 변화, 다단계 작업 수행의 저하, 환각, 망상 또는 편집증, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 세포 집단의 투여가 대상에서 MMP-9를 증가시키는 것인 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 세포 집단의 투여가 대상에서 잘못 접힌 단백질의 수준을 감소시키는 것인 약제학적 조성물.
제11항에 있어서, 잘못 접힌 단백질은 아밀로이드 베타(Aβ)인 약제학적 조성물.
제12항에 있어서, Aβ는 Aβ₄₀ 및/또는 Aβ₄₂인 약제학적 조성물.
대상에서 인지 기능을 개선하기 위한 치료적 유효량의 세포 집단을 포함하는 약제학적 조성물로서, 상기 세포 집단은 선천성 면역 세포에서 오스테오폰틴(OPN)의 발현을 증가시키는 조성물로 생체외에서 자극된 선천성 면역 세포를 포함하는 것인 약제학적 조성물.
제14항에 있어서, 선천성 면역 세포는 단핵구, 대식세포, 또는 단핵구와 대식세포를 포함하는 것인 약제학적 조성물.
제15항에 있어서, 선천성 면역 세포는 단핵구를 포함하고, 단핵구는 골수 유래 단핵구, 비장 유래 단핵구, CD115 양성 단핵구(CD115⁺단핵구), 또는 침윤성 단핵구, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
제14항에 있어서, 선천성 면역 세포는 식작용성인 약제학적 조성물.
제14항에 있어서, 선천성 면역 세포에서 OPN의 발현을 증가시키는 조성물은 글라티라머 아세테이트(GA)를 포함하는 것인 약제학적 조성물.
제14항에 있어서, 대상은 글라티라머 아세테이트(GA)를 투여받는 것인 약제학적 조성물.
제14항에 있어서, 대상은 글라티라머 아세테이트(GA)를 투여받은 적이 있는 것인 약제학적 조성물.
제14항에 있어서, 선천성 면역 세포는 선천성 면역 세포에서 OPN의 발현을 증가시키는 조성물에 의한 자극에 반응하여 OPN의 증가된 발현을 갖는 것으로 결정된 것인 약제학적 조성물.
제14항에 있어서, 입양 세포 전달, 골수 이식, 대상으로의 직접 전달, 바이러스 벡터 전달, 리포좀 전달 시스템, 또는 나노약물 전달 시스템에 의해 대상에게 투여하도록 구성된 약제학적 조성물.
제14항에 있어서, 알츠하이머병의 증상을 완화시키기 위한 것이고, 알츠하이머병의 증상은 기억 상실, 인지의 비기억 측면의 저하, 손상된 추리 또는 판단, 행동 변화, 다단계 작업 수행의 저하, 환각, 망상 또는 편집증, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
제14항에 있어서, 세포 집단의 투여가 대상에서 MMP-9를 증가시키는 것인 약제학적 조성물.
제14항에 있어서, 세포 집단의 투여가 대상에서 잘못 접힌 단백질의 수준을 감소시키는 것인 약제학적 조성물.
제25항에 있어서, 잘못 접힌 단백질은 아밀로이드 베타(Aβ)인 약제학적 조성물.
제26항에 있어서, Aβ는 Aβ₄₀ 및/또는 Aβ₄₂인 약제학적 조성물.
제14항에 있어서, 세포 집단의 투여가, 대상에서 잘못 접힌 단백질 수준의 감소, 대상에서 염증의 감소, 대상에서 시냅스 재생의 증가, 또는 대상에서 아밀로이드 베타(Aβ) 플라크 부위로의 대식세포의 동원, 또는 이들의 조합을 유도하는 것인 약제학적 조성물.
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