JP6755938B2 - アルツハイマー病の治療におけるPI4KIIIαタンパク質および関連膜タンパク質複合体の利用 - Google Patents
アルツハイマー病の治療におけるPI4KIIIαタンパク質および関連膜タンパク質複合体の利用 Download PDFInfo
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Description
本発明は、これまで、中国の973の科学技術省プログラム(許可番号2013CB530900および2011CBA00408)、国家自然科学財団(許可番号81371400、81071026および81571101)、および上海基本主要プログラム(許可番号06dj14010)によって支持されてきた。
技術分野
本発明は、特に、アルツハイマー病を治療するためにRBF/EFR3/EFR3A/EFR3Bタンパク質とTTC7タンパク質とで形成されたPI4KIIIαキナーゼおよびその膜タンパク質複合体を関連する阻害剤を用いてダウンレギュレーションする方法に関する。別の局面において、本発明は、細胞からのAβ分泌が促進されるか否かに応じて、アルツハイマー病の治療のための医薬および治療標的をスクリーニングする方法に関する。別の態様では、本発明は、細胞からのAβ分泌が促進されるか否かに応じて、アルツハイマー病の治療のための医薬および治療標的をスクリーニングする方法に関する。
1)Aβ42が、脂質膜に挿入され、酸性リン脂質に結合し、Aβ42中のランダムコイルのβ構造への変換を誘発し、膜内または膜上のAβ42凝集を導くこと;
2)血漿ホスファチジルイノシトール-4,5-リン酸(PIP2)レベルが、培養細胞からのAβ42分泌を逆相関させること;
3)Aβ42の発現が、ホスファチジルイノシトール3-キナーゼ(PI3K)の阻害によって救済することができるハエのニューロンの機能不全および学習および記憶機能不全を誘発すること;
4)ホスファチジルイノシトール4-キナーゼ(PI4KIIIα)の産物である、ホスファチジルイノシトール-4-リン酸(PI4P)が、AD患者の大脳皮質において有意に増加し、増加したレベルが、AD患者における認知障害の程度と密接に関連しているという最近の発見(Zhu、L.、et al.、Proc Natl Acad Sci U S A、2015);などのAβとのその相互作用またはAD関連変化への関与を介する種々の細胞および分子プロセスを介してAD病因に寄与し得ることを実証している。
本発明は、ショウジョウバエおよびマウスADモデルにおける神経欠損を改善するために、遺伝的手段または関連する阻害剤を用いて、PI4KIIIαタンパク質、RBO/EFR3/EFR3A/EFR3Bタンパク質、TTC7タンパク質、およびそれらの膜タンパク質複合体の量または関連酵素の活性のダウンレギュレーションが、ニューロン細胞のAβ(特にAβ42)分泌を促進し、それに対応して、ニューロン内Aβ蓄積を減少させることができることを開示する。したがって、本発明は、AD治療におけるニューロンAβ42分泌の本質的役割を明らかにし、AD治療のための新規戦略を提供する;一方、本発明は、ADを治療するための新規な医薬を提供し、ADの治療のための医薬および治療標的のスクリーニングの新たな方向性を指摘する。
明細書および特許請求の範囲を含む本発明において、他に特定されない限り、以下の用語は以下の意味で用いられる:
である。
である。
である。
25℃の一定温度下で培養する標準培地、12時間明期および12時間暗期の交互サイクル。
細胞内での巨大繊維(GF)系における興奮性接合電位(EJP)の記録。特定の日齢の成体雌ハエを、解剖顕微鏡下で低融点ワックスであるタッキーワックス(Boekel Scientific)でガラススライド上に腹側を下にして載せた。記録システムは、腹部内に1つの参照電極、2つの目に挿入された2つの刺激電極、および背側縦筋細胞に挿入された1つの記録電極を包含する。両眼を電気刺激(100Hz、50パルス)に付した。刺激強度は5〜20ボルトであり、持続時間は0.2msであり、閾値刺激強度の約150%である。電気信号をAxonalクランプ900A(Molecular Devices)で記録および増幅し、Digidata 1440A(Molecular Devices)によって周波数10kHzでデジタル化した。データを、pClampソフトウェア(バージョン10.0;Molecular Devices)によって記録および分析した。すべての電極は、3M KCl溶液で満たされたガラス電極である。記録中の環境温度は25℃であった。
チューブクライミング試験:
クライミング能力を、垂直に配置された試験管の底部からの7秒目における10匹のハエの平均クライミング高さを測定することによって調べた。高い再現性を有するミバエのクライミング能力試験装置を開発した。装置は、以下を包含する:1)その中に透明プラスチックチューブ10本が垂直に取り付けられる矩形の金属フレーム(幅32cm、高さ21cm);2)金属フレームの上下動を駆動するための電動モータ;3)金属フレームを所定の高さで1分間間隔で4回上下に迅速に移動させる作業サイクルで電動モータを制御するためのステッピングアクチュエータ;4)クライミングプロセスをビデオ撮影するビデオカメラ;5)ビデオの特定の時間におけるハエのクライミング位置を分析する分析ソフトウェア。実験では、特定の遺伝子型の10匹のハエが各透明プラスチック管に移された。チューブは均一に分配され、金属箱に取り付けられた。金属箱は、基盤上に垂直に取り付けられた2本の金属棒に沿って垂直に摺動することができる。クライミングテストでは、ステッピングアクチュエータが電動機を制御して金属箱を5.8cm持ち上げ、次いで、解放し、金属箱が重力によって元の位置に落ちるようにする。金属箱の動きが止まると、ファイルはチューブの底に落ちる。金属箱の動きが止まると、ハエは、チューブの底に落ちた。金属箱を3秒間で4回上下に動かした後、すべてのハエは、チューブの底にいた。その後、ハエは、チューブの壁に沿って登ることが許された。その後の分析のために全工程を録画した。本発明者らは、チューブクライミングが開始された後の任意の時点におけるハエの高さを測定するためのコンピュータプログラムを開発した。
長寿(寿命)アッセイ:
標準ハエ用食物と乾燥酵母を入れた5本または10本のチューブに、各遺伝子型の100または200匹のハエを均等に分け、25℃で培養した。ハエを3日毎に新鮮な食物と乾燥酵母を入れた試験管に移し、各移送時に死んだハエを数えた。生存率をSPSS 11 Kaplan-Meierソフトウェアで分析した。
野生型Aβ42を発現するハエのシナプス伝達、クライミング能力および寿命におけるrbo遺伝子突然変異の影響に関するさらなる研究が行われ、それは、より良好な改善を示した(図7a-d)。
免疫沈降およびイムノブロット:
全部で300個のハエの頭を収集し、500μLの予め冷却したTris緩衝液中で粉砕することによってホモジナイズした。トリス緩衝液の処方物は、50mM Tris、50mM KCl、1mM EDTA、1%カクテルプロテアーゼ阻害剤(Calbiochem)を含み、pHを7.4に調整したものである。組織ホモジネートを10000gで10分間遠心分離した。上清を回収し、約1μgのRBOに対するマウスモノクローナル抗体またはショウジョウバエPI4KIIIαに対するウサギポリクローナル抗体で免疫沈降またはイムノブロット試験を行った。Abmart(上海)またはAbgent(中国)と共同で2つの抗体が生成された。ショウジョウバエ亜種C RBOタンパク質の251〜500番目のアミノ酸を用いてRBO抗体を作成した;ペプチドNH2-KRSNRSKRLQYQKDSYC-CONH2(配列番号:3)を用いてPI4KIIIα抗体を作成した。イムノブロット試験では、ショウジョウバエRBOおよびPI4KIIIαに対する抗体を1:2000で希釈した。野生型および対応するホモ接合変異体の頭部組織ホモジネートを、それぞれショウジョウバエRBOおよびPI4KIIIαに対する抗体を検出するために用いた。
染色およびイメージング:
ショウジョウバエの中枢神経系は、以下のように染色された。脳および腹側神経節を含む、ハエの全中枢神経系(CNS)を冷PBS中で解剖し、PBS中の4%PFAで約45分間固定した。調製物をPBSで30分間洗浄し、ギ酸(水中、70%)で45分間処理して抗原決定基を再暴露し、0.25%トリトンを補充したPBS溶液中の5%BSAで繰り返し洗浄し、4℃で10-12時間、一次抗体(6E10、1:100希釈)とインキュベートし、再びPBSで洗浄し、最後に、cy3結合二次抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories、1:200希釈)と室温で2時間インキュベートした。ニコンA1R-A1共焦点顕微鏡下で画像を撮影した;ハエCNSの遺伝子型はイメージング要員にはブラインドであった。
ELISA法分析:
ELISAは、Aβ42Human ELISA Kit(Invitrogen)を製造者の仕様書に従って用いて行った。CNSにおけるAβ42レベルを分析するために、1系統あたり25匹のハエの無傷の脳を冷PBS中で解剖し、直ちにカクテルプロテアーゼ阻害剤(Calbiochem)を補充した冷ELISA試料希釈緩衝液に入れた。脳を十分にホモジナイズし、室温で4時間インキュベートし、-20℃で保存した。
HEK293細胞、ショウジョウバエの幼虫および成虫を、PAOまたはA1で処理し、PAO粉末(Sigma-Aldrich、CAS NO.637-03-6)およびA1粉末をDMSOに溶解することによって、10mMおよび0.9mMのA1のストック溶液を別々に作製した。次いで、蒸留水で勾配希釈して所望の濃度にした;実験結果がDMSO変動の影響を受けないことを確実にするために、DMSOの最終濃度を同一レベルに調整した。
Aβ発現幼虫組織の培養:
第3齢幼虫を水で洗浄し、70%アルコールで2分間滅菌し、シュナイダー(Schneider)(Sigma)培養培地中、背側中線に沿って解剖した。幼虫の気管、腸および脂肪体を慎重に除去した。解剖された幼虫をシュナイダー培養培地で洗浄し、ゲンタマイシン(20mg/mL)を補充したSchneider培地150μLを含む2mLの遠心管に移した。各試験管には5匹の解剖された幼虫が含まれた。遠心管を25℃で8時間湿潤で暗い環境に置いた。次いで、各チューブから100μLを採取し、Aβ42のELISA定量化に使用した。Aβ42ヒトELISAキット(Invitrogen)を用いてELISAを行った。
ヒト由来APPを発現するHEK293T細胞の培養:
10%FBS(Gibco)、ペニシリン、ストレプトマイシン、およびG418(100μg/mL)を補充したDMEM(Hyclone)中で、ヒトAPP(ここではHEK293T-APP細胞と称する)で安定にトランスフェクトしたHEK293T細胞を培養した。標的遺伝子の組換えプラスミドpSUPER.basic発現shRNAを、Lipofectamine(商標)2000(Invitrogen)を用いてHEK293Tに一時的にトランスフェクトした。トランスフェクション後2日間、細胞をインキュベートし、その後の実験を続けた。培地中のAβ42濃度のELISA定量化のために、細胞を12時間培養した後に、新たに変更された培地を試験した。
PAOを0、25、50、100、または150nMの濃度で含有する培養液にて、HEK293T-APP細胞を12ウェルプレートでインキュベートした。6〜8時間のインキュベーションの後、同じ量の細胞を別々に集めた。セクレターゼ活性を分析するために、細胞を500μLのTBS緩衝液で別々に溶解し、15分間遠心分離し、上清を回収し、沈殿物を500μLのTBS緩衝液で再懸濁した。αおよびβセクレターゼの活性を分析するために、100μLの上清を10μMのαまたはβセクレターゼ特異的蛍光基質を含む2x反応溶液(50mM Tris-HCl、pH6.8、4mM EDTA、0.5%CHAPSO(w/v))と混合した(Calbiochem、カタログ番号565767/565758);γ-セクレターゼの活性を分析するために、100μLの再懸濁した溶液を、10μMのγセクレターゼの特異的蛍光発生基質を含む2x反応溶液(50mM Tris-HCl、pH6.8、4mM EDTA、0.5%CHAPSO(w/v)(Calbiochem、カタログ番号565764)と混合した。37℃で30分間反応させた後、マイクロプレートリーダー(励起/発光:α/β酵素活性について365/490nm、γ酵素活性について365/440)で分析する。
図14bは、異なる濃度のPAO処理後のAPP-APP細胞を示す代表的な免疫ブロットを示し、実験は3回以上繰り返された。
第2表:PAO、PAO誘導体およびその活性
現在、PI4KIIIαの構造はまだ測定および報告されていない。
本発明者らは、PI4KIIIαの6つの構造モデルを構築するための鋳型としての、PI4KIIIβの報告された4D0L構造、PI3Kαの4YKN構造およびPI3Kγの1e8x構造に関して、2つの一般に使用されるソフトウェア、SWISS-MODELおよびMODELLERを採用する。6つのモデルの構造は互いに非常に一致していることが分かっている;構造間の二乗平均平方根偏差は3Å未満である。PAOとPI4KIIIαの間の相互作用パラメータをシミュレーションし、このモデルで計算した。PAOは、ヒトおよび他の哺乳動物由来のPI4KIIIαの酵素活性中心に結合することができると同時に、文献に仮定されているように、脱水後に隣接するシステインと共有結合を形成するのではなく、PI4KIIIαの酵素活性中心の特徴的な1840番目または1844番目のシステインによる2つの強い水素結合(結合長〜2.03Å)を形成する(図17、左)。さらに、野生型PI4KIIIα、または1844番目のシステインに突然変異を有するPI4KIIIαとの、PAOの結合の動的シミュレーションも実施される。野生型PI4KIIIαによるPAOの結合は、80ナノ秒後に安定する傾向があることが分かった(図17、右)。
レンチウイルスは、EmGFPを有するBLOCK-iT(商標)HiPerform(商標)Lentiviral Pol II miR RNAi発現系を用いてInvitrogen(上海)によって産生された。Efr3aを標的とする4つのmiRNAオリゴを合成し、pcDNA(商標)6.2-GW/EmGFPmiベクターに挿入した。ノックダウン効率を、RT-PCRまたはウエスタンブロット法によって試験した。結果は、ベクターの1つが、EFR3a遺伝子を過剰発現するHEK293T細胞におけるEfr3a発現をノックダウンするのに最も有効であることを示した。最高のノックダウン効率を有するベクターの配列はAGGTATCATTCAGGTTCTGTTである。最も有効なmiRNAベクターをpDONRTM221およびpLenti6/V5 DESTと組換えて、Gateway(登録商標)組換え反応を介して、pLENT6/V5-GW /±EmGFP-miRNAベクターを作製した。レンチウイルスは、pLENT6/V5-GW/±EmGFP-miRNAベクターとパッケージングミックスの同時トランスフェクションによって作製された。ウイルス力価は、HEK293T細胞における連続希釈によって得られた。EGFP陽性細胞を3日ごとに数えた。レンチウイルスをトランスフェクトした初代海馬ニューロンにおいて、ノックダウン効率がさらに得られた。
マウス脳切片におけるGFP染色:
脳スライス(厚さ60μm)をPBS-0.3%トリトン-5%BSAで1時間ブロックした後、ウサギ抗GFP抗体(A11122、Invitrogen、1:100希釈)と共に4℃で一晩インキュベートした。次に、PBSで洗浄し、ビオチン化ヤギ抗ウサギIgG抗体(H+L)(AbboMax、Inc、1:100希釈)と共に4℃で一晩インキュベートする。PBSで再度洗浄し、Cy3-ストレプトアビジン(Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc、1:1000希釈)と共に室温で2時間インキュベートする。画像を、Zeiss LSM 511共焦点顕微鏡で撮影し、AutoQuant X2でデコンボリューションし、NeuronStudioソフトウェアで解析した。脳スライスの遺伝子型および樹状突起の画像は、それぞれ撮像および分析担当者にはブラインドであった。
脳脊髄液の採取:
マウスをケタミンおよびキシラジンで麻酔し、頭部アダプターで固定した。頚部の皮膚を剃毛して切開し、その下にある皮下組織と筋肉を鉗子で側方に分離して、大槽上部の硬膜を露出させた。硬膜を貫通するために、マイクロインジェクションシリンジに接続された平滑末端を備えたシャープチップのガラスキャピラリーを使用した。キャピラリー管挿入への抵抗の顕著な変化に続いて、キャピラリー管を大槽に入れ、約10-20μLが採取されるまで、CSFをキャピラリー管に流入させた。採取したCSFを、プロテアーゼ阻害剤をエッペンドルフチューブに移し、使用するまで-80℃で保存した。
連続抽出により界面活性剤可溶性Aβ42を得る。トリス緩衝化生理食塩水(TBS)のマウス脳半球の5倍量を添加して、磨り潰して、ホモジナイズし、100,000gで60分間遠心分離し、上清をTBS抽出物とした。沈殿物を回収し、磨り潰すために、1%ポリエチレングリコールオクチルフェノールエーテルを含有する5倍量のTBSに添加し、遠心分離し、上清をTBS-トリトン抽出物とした。沈殿物を再び回収し、磨り潰すために、1%SDSを含む5倍量のTBSに添加し、遠心分離し、上清をTBS-SDS抽出物とした。3つの上清すべてを集め、アリコートに分け、ELISAアッセイのために-80℃の冷蔵庫に保存した。
既に確認できる学習および記憶機能不全を有するAPP/PS1マウスにおけるPAOの治療効果を研究するために、8ヶ月齢のAPP/PS1マウスおよび野生型同腹子を、0または0.3mg/kg体重の用量でPAO胃管栄養に付し、毎週月曜日〜金曜日に1日1回、6週連続して投与した。次いで、1週間投与を中止し、新規対象認識試験(NOR)に付した。結果は、PAO処置マウスが、前日に探索された古い対象物よりも新規な対象物を探索するのに有意に多くの時間を費やすことを示した。より老齢の月齢のAPP/PS1マウスに対するPAOの効果およびマウスへの長期投与の毒性を調べるために、18ヵ月齢の20匹のAPP/PS1マウスを各群10匹のマウスで無作為に2つの群に分けた。1群は、毎週月曜日から金曜日まで毎日1回、0.3mg/kg体重の用量でPAO胃管栄養に付し、他の群は水胃管栄養に付した;週末は投与なし。連続8ヶ月の投与後、投与を1週間停止し、マウスをNOR試験に付した。8ヶ月の胃管栄養期間中、各群で2匹のマウスは死亡した。NOR試験は、PAO治療群のマウスが、他の群のマウスよりも新規な対象を探索するのに有意に長い時間を費やすことを示した(図18)。
PI4KIIIα発現レベルの遺伝的ダウンレギュレーションまたはAβ42発現ハエのPAOによるその酵素活性の阻害は両方とも、神経機能不全を改善する;APP/PS1マウスにおけるPAOによるPI4KIIIα酵素活性の阻害はまた、学習および記憶能力を改善する。APP/PS1マウスの神経変性におけるPI4KIIIaの役割をさらに明らかにするために、APP/PS1マウスの水迷路実験におけるPI4KIIIα(Pi4kaGt(RRO073)Byg/+:トランスポゾンpGT2LxfをPI4KA遺伝子の1コピーに挿入すると、遺伝子コピーの転写が妨げられることがあり、得られたmRNAは、PI4KIIIαのN末端上の第1〜265アミノ酸によって形成された切断タンパク質およびレポーター遺伝子によってコードされるタンパク質のみを翻訳する可能性がある)のヘテロ接合突然変異の影響を調べた。Pi4kaGt(RRO073)Byg/+突然変異ヘテロ接合体(MMRRC、カタログ#016351-UCD)をAPP/PS1マウスと交配させて、4つの群の遺伝子型マウスを得た:野生型(WT)、PI4KIIIa突然変異へテロ接合体(PI4K*/+)、APP/PS1(TG)およびPI4KIIIaヘテロ接合突然変異を有するAPP/PS1(TG;PI4K*/+)。4つの群のマウスが5ヶ月齢に達したとき、Vorhees and Williamsに従って水迷路実験を行った。図12に示すように、PI4KIIIaヘテロ接合突然変異は、5ヶ月齢のAPP/PS1マウスの空間学習および記憶欠損を有意に改善することができる。図12の左側は、4つの群の遺伝子型マウスの学習曲線を示し、図12の右側は、4つの群の遺伝子型マウスの訓練1日後の最初の日の合計時間に対する標的象限における遊泳時間の百分率を示す。
1つ少ないコピーを有するPI4KA遺伝子も、APP/PS1マウスの海馬におけるシナプス伝達可塑性障害を有意に改善したが(図19b)、1つ少ないコピーを有するPI4KAは、LTP自体に影響しなかった(図19c)。
リポソーム実験:
1)合成Aβ42を1:1(mg:mL)の比率でヘキサフルオロ-2-プロパノール(HFIP)で溶解し、次いで、室温で15分間超音波処理して均質化する。超音波発生器は、KUDOS超音波装置(モデルSK250HP)である。
2)脂質(第3表)をクロロホルムで別々に溶解して、1:1(mg:mL)の比率でリポソームを生成するために使用される脂質(第1表)を調製し、次いで、室温で15分間超音波処理して均質化する。
3)第3表に示す組成に従って脂質を混合した後、有機溶媒を凍結乾燥機で溶液から除去する。
4)凍結乾燥後、沈殿物を1.0mLトリス緩衝液(50mM Tris、120mM NaCl、pH7.0)で再懸濁し、次いで、氷水中で30分間超音波処理して均質化する。イムノブロット分析のために4℃で48時間静置する(一次抗体は、抗ヒト化Aβモノクローナル抗体6E10、1:1000希釈)。イムノブロット分析の前に、15分間の超音波処理が均質化のために必要である。
酵母EFR3タンパク質は、細胞膜上にPI4KIIIαおよび足場タンパク質YYP1と複合体(2つの相同体TTC7AおよびTTC7Bを含み、哺乳類においてTC7と称される)を形成し、PIKパッチとして凝集し、細胞膜PI4PレベルおよびPI4,5Pレベルさえも共に調節することが報告されている。YYP1は、酵母PI4KIIIaタンパク質のN末端および中央領域と直接相互作用し、したがって、PIKパッチの構築および安定化に重要な役割を果たす(Baird D、Stefan C、et al.、2008、J Cell Biol)。PIKパッチの形成および機能もまた、哺乳類細胞において保存的である(Nakatsu F、Baskin JF、et al.、2012、J Cell Biol)。ハエにおけるTTC7のショウジョウバエ相同体は、致死(2)k14710(1(2)k14710)遺伝子によってコードされる。
Claims (5)
- PI4KIIIαを特異的に標的とするPI4KIIIα阻害剤を含む、アルツハイマー病を治療するための医薬組成物であって、PI4KIIIαを特異的に標的とする該PI4KIIIα阻害剤が、低分子化合物阻害剤である、PAO、PAO誘導体、G1およびA1の1つ以上から選択され、該PAO誘導体が、
- 医薬組成物が、PI4P阻害剤をさらに含み、PI4P阻害剤が、PI4Pに対する抗体、OSH2−PH2X融合タンパク質、またはOSH2−2x−PH融合タンパク質である、請求項1に記載の医薬組成物。
- Aβに対する抗体をさらに含む、請求項2または3に記載の医薬組成物。
- 神経細胞外Aβ沈着物を除去することができる化合物をさらに含み、該神経細胞外Aβ沈着物を除去することができる化合物が、海洋由来硫酸化オリゴ糖HSH971、アカンプロセート、およびエダラボンから選択される、請求項1から3のいずれかに記載の医薬組成物。
- 医薬担体をさらに含む、請求項1から4のいずれかに記載の医薬組成物。
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