KR20230020946A - 중수소화 옥소페닐아르신 화합물 및 이의 용도 - Google Patents

중수소화 옥소페닐아르신 화합물 및 이의 용도 Download PDF

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푸데 후앙
웨난 왕
펭 홍
완구오 웨이
지안강 장
창핑 지아오
루시앙 카오
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누오-베타 파마슈티컬 테크놀로지 (상하이) 씨오., 엘티디.
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Abstract

중수소화 옥소페닐아르신 또는 이의 약제적으로 허용되는 염, 및 약제적으로 허용되는 담체 및 중수소화 옥소페닐아르신을 포함하는 약제학적 조성물을 개시한다. 상기 중수소화 옥소페닐아르신은 암 및 관련 질환을 치료하고 예방하는 데 사용될 수 있다.

Description

중수소화 옥소페닐아르신 화합물 및 이의 용도
본 발명은 화학 합성 분야에 속하며, 특히 신규의 중수소화 옥소페닐아르신 화합물 및 이의 제조(preparation) 방법 및 용도에 관한 것이다.
옥소페닐아르신(페닐아르신 옥사이드, PAO)은 공지된 생물학적 억제제이다. 옥소페닐아르신 중의 비소 원자는 생체 분자 중의 설프히드릴의 황 원자에 높은 친화력을 가지고 있다. 최근 연구에 따르면 옥소페닐아르신은 알츠하이머병 치료에 사용될 수 있는 PI4KIIIα 억제제이다.
중수소(deuterium)는 수소의 안정한 동위 원소이다. 수소와 비교할 때 중수소는 더 안정적인 화학 결합을 형성할 수 있으며, 이는 약물(drug) 분자를 더 안정적으로 만든다. 인간 대상 연구에 따르면 중수소 치환은 약물의 반감기를 변경시키고 원래의 활성과 선택성을 유지하면서 투여 빈도를 줄일 수 있는 것으로 밝혀졌다. 중수소화 약물은 신약 연구 개발의 새로운 방향과 모드가 되었다. 2017년 미국 식품의약국(FDA)은 세계 최초의 중수소화 약물, 즉 중수소화 테트라베나진(AUSTEDOTM, 헌팅턴병 및 관련 운동이상증 치료용)을 승인하였다. 현재, 다수의 중수소화 약물이 임상 연구에 들어갔다.
하나의 양태에서, 본 발명은 하기 화학식 I의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공한다:
[화학식 I]
Figure pct00001
여기서 R1, R2, R3, R4 및 R5는 수소, 중수소, 할로겐, 메틸, 일-중수소화 메틸(mono-deuterated methyl), 이-중수소화 메틸 또는 삼-중수소화 메틸 중에서 독립적으로 선택되고, R1, R2, R3, R4 및 R5 중 적어도 하나는 중수소이거나 중수소화된다.
하나의 구현예에서, R1, R2, R3, R4 및 R5는 수소 또는 중수소 중에서 독립적으로 선택되고, R1, R2, R3, R4 및 R5 중 적어도 하나, 적어도 2개, 및 바람직하게는 적어도 3개, 4개 또는 5개는 중수소이다.
특정 구현예에서, 화합물은 하기로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다:
Figure pct00002
,
Figure pct00003
,
Figure pct00004
,
Figure pct00005
,
Figure pct00006
,
Figure pct00007
,
Figure pct00008
,
Figure pct00009
,
Figure pct00010
,
Figure pct00011
,
Figure pct00012
,
Figure pct00013
,
Figure pct00014
,
Figure pct00015
,
Figure pct00016
,
Figure pct00017
,
Figure pct00018
,
Figure pct00019
및
Figure pct00020
.
또 다른 양태에서, 본 발명은 대상체에서 질환 또는 병리학적 반응(pathological reaction)을 예방 또는 치료하기 위한 약물의 제조에서 상기 언급한 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염의 용도를 개시한다.
하나의 구현예에서, 질환은 종양(tumor), 악액질(cachexia), 예를 들어 종양의 치료를 위한 화학요법 약물(chemotherapeutic drug)에 의해 야기된 암(malignancy) 또는 악액질, 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 세포내 단백질 미스폴딩(misfolding)과 관련된 질환, 리소좀 축적 질환(lysosomal storage disease), 염증 반응, 조직 및 기관 섬유증(tissue and organ fibrosis), 바이러스에 의해 야기된 감염성 질환 및 신경증(neurosis) 중에서 선택된다.
하나의 구현예에서, 대상체는 인간 또는 비-인간 포유동물이다.
특정한 구현예에서, 종양은 림프종(lymphoma), 자궁경부암(cervical cancer), 간암(liver cancer), 삼중 음성 유방암(triple negative breast cancer)과 같은 유방암, 비-소세포 폐암(non-small cell lung cancer) 또는 소세포 폐암(small cell lung cancer)과 같은 폐암, 결장직장암(colorectal cancer), 위암(gastric cancer), 흑색종(melanoma)과 같은 피부암(skin cancer), 골암종(osteocarcinoma), 골육종(osteosarcoma), 골수종(myeloma), 백혈병(leukemia) 또는 난소암(ovarian cancer) 중에서 선택된다.
특정 구현예에서, 세포내 단백질 미스폴딩과 관련된 질환은 파킨슨병(Parkinson's disease), 루이소체 치매(Lewy body dementia), 다계통 위축(multiple system atrophy), 봉입체 근육염(inclusion body myositis), 전두측두엽 치매(frontotemporal dementia), 헌팅톤병(Huntington's disease), 폴리글루타민병(polyglutamine disease), 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis) 또는 프리온병(prion disease)이다.
특정 구현예에서, 리소좀 축적 질환은 스핑고지질 대사 장애, 예를 들어 고셔병(Gaucher disease), C형 니만-픽병(Niemann-Pick disease), 점액다당류증(mucopolysaccharidosis), 글리코겐 축적 질환(glycogen storage disease), 당단백질 축적 질환(glycoprotein storage disease), 지질 축적 질환(lipid storage disease), 번역-후 변형 결핍증(post-translational modification deficiency), 통합 막 단백질 결핍 장애(integral membrane protein deficiency disorder), 신경지방갈색소증(neuronal ceroid lipofuscinosis) 또는 리소좀-관련 소기관 장애이다.
특정 구현예에서, 염증 반응은 국소 조직 또는 전신 혈액 중의 TNF-α 또는 IL-6과 같은 염증 인자의 증가에 의해 나타난다.
특정 구현예에서, 조직 및 기관 섬유증은 폐 섬유증(pulmonary fibrosis) 또는 간 섬유증(hepatic fibrosis) 중에서 선택된다.
특정 구현예에서, 바이러스는 코로나바이러스 및 비-코로나바이러스를 포함하고, 바람직하게 상기 코로나바이러스는 조류 감염성 기관지염 바이러스, 돼지 유행성 설사 바이러스, 돼지 전염성 위장염 바이러스, 돼지 혈구응집성 뇌척수염 바이러스, 돼지 델타 코로나바이러스, 개 호흡기 코로나바이러스, 마우스 간염 바이러스, 고양이 코로나바이러스, 인간 코로나바이러스, 중증 급성 호흡기 증후군 바이러스, 중동 호흡기 증후군 바이러스 또는 신종 코로나바이러스 중에서 선택되며, 상기 비-코로나바이러스는 C형 간염 바이러스 또는 HIV 중에서 선택된다.
특정 구현예에서, 신경증은 신경쇠약(neurasthenia), 불안증(anxiety), 우울증(depression) 또는 조증(mania) 중에서 선택된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 대상체에서 질환을 예방 또는 치료하기 위한 약물의 제조에 있어서 상기 언급된 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염의 용도를 개시하며, 상기 용도는 제2 제제(second agent)를, 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 추가로 포함한다. 본 발명은 대상체의 질병을 예방 또는 치료하기 위한 병용 투여에서 약물의 제조에 있어서 상기 언급된 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 및 제2 제제의 용도를 개시한다.
하나의 구현예에서, 질환은 종양 중에서 선택되고, 제2 제제는 종양 치료제이다.
특정 구현예에서, 질환은 폐 섬유증 중에서 선택되고, 제2 제제는 폐 섬유증 치료제, 예를 들어 혈관 내피 성장 인자 수용체 티로신 키나제 억제제, 바람직하게는 닌테다닙이다.
특정 구현예에서, 제2 제제는 종양 치료제이고, 종양 치료제는 파클리탁셀, 젬시타빈, 사이클로포스파미드 및 테모졸로미드 중 적어도 하나로부터 선택된다.
하나의 구현예에서, 상기 언급된 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염은 제2 제제의 투여 전에, 투여 후에 또는 투여와 동시에 투여된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 상기 언급된 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 및 약제학적으로 허용되는 담체(carrier)를 포함하는 약제학적 조성물을 개시한다.
하나의 구현예에서, 약제학적 조성물은 종양 치료용 약물을 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, 종양 치료용 약물은 파클리탁셀, 젬시타빈, 사이클로포스파미드 및 테모졸로미드 중 적어도 하나로부터 선택된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 상기 언급된 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염의 제조 방법을 개시한다:
Figure pct00021
1) 0 내지 10℃에서 화학식 I에 상응하는 구조를 갖는 아닐린 또는 이의 염의 수용액에 농축된 염산 및 아질산나트륨의 수용액을 첨가하고, 5℃ 미만의 온도를 유지시키는 단계;
2) 탄산나트륨, 삼산화비소 및 황산구리 수용액을 90℃-100℃로 가열하고, 이어서 상기 수용액을 냉각시키고, 상기 냉각된 수용액에 단계 1)에서 제조된 용액을 첨가하고, 생성 혼합물을 교반 및 여과하고, 산을 첨가하여 여액의 pH 값을 조절하고, 침전된 고체를 분리시키는 단계; 및
3) 상기 침전된 고체, 요오드화칼륨, 아황산수소나트륨 또는 염산 및 이산화황을 메탄올 중에서 반응이 완료될 때까지 교반하고, 이어서 후-처리를 수행하여 화합물을 수득하는 단계.
하나의 구현예에서, 단계 3)의 후처리는 산 또는 염기를 사용하여 pH 값을 적합한 값으로 조절하고, 에틸 아세테이트로 추출하고, 유기상을 합한 다음, 증발 건조시키는 것을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 폐 섬유증 또는 간 섬유증과 같은 조직 및 기관 섬유증을 예방 또는 치료하기 위한 약물의 제조에 있어서의, 옥소페닐아르신 및 이의 유도체의 용도를 개시한다.
본 발명은 염증 반응을 예방 또는 치료를 위한 약물의 제조에 있어서의, 옥소페닐아르신 및 이의 유도체의 용도를 개시하며, 여기서 상기 염증 반응은 국소 조직 또는 전신 혈액 중의 TNF-α 또는 IL-6과 같은 염증 인자의 증가에 의해 나타난다.
본 발명은 종양을 치료하기 위한 화학요법 약물에 의해 야기된 암 또는 악액질과 같은 악액질을 예방 또는 치료를 위한 약물의 제조에 있어서의, 옥소페닐아르신 및 이의 유도체의 용도를 개시한다.
본 발명은 종양을 예방 또는 치료를 위한 약물의 제조에 있어서의, 옥소페닐아르신 및 이의 유도체의 용도를 개시한다.
하나의 구현예에서, 옥소페닐아르신 및 이의 유도체는 하기 화학식 II의 구조 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 갖는다:
[화학식 II]
Figure pct00022
상기식에서, (a) R6은 각각 독립적으로 H, 할로겐, 니트로, 시아노, 하이드록실, 아미노, 카바모일, C1-6 알킬설푸릴, C1-6 알킬, C1-6 사이클로알킬, C2-6 알키닐, C2-6 알케닐, C1-6 알콕시, C1-6 할로알킬, C1-6 알킬렌-NH2, C1-6 알킬렌-NH-C(O)H, -As(O), -N=NH, N-(C1-6 알킬)아미노, N,N-(C1-6 알킬)2아미노, -NH-C(O)H, -NH-S(O)2H, -C(O)OH, -OC(O)H, -SH, -S(O)2H, -S(O)2-NH2 또는 헤테로사이클릴 중에서 선택되고 R7 또는 R8로 임의로 치환되고, 여기서 R7 및 R8은 각각 독립적으로 아미노, C1-6 알킬, C1-6 알콕시, C1-6 할로알킬, N-(C1-6 알킬)아미노, N-(6 내지 12-원 아릴)아미노, N,N-(C1-6 알킬)2아미노, C3-6 사이클로알킬, 6-12원 아릴 또는 3-12원 헤테로사이클릴 중에서 선택되고 할로겐, 니트로, 시아노, 하이드록실, 아미노, 카바모일, -NH-C(O)-R10, -C(O)OR9, 6-12원 아릴, C1-6 알킬, C2-6 알키닐, C2-6 알케닐, C1-6 알콕시, C1-6 할로알킬, 3-6원 헤테로사이클릴, C3-6 사이클로알킬 또는 Bn-O- 중 하나 이상으로 임의로 치환되고, 여기서 R9는 C1-6 알킬이고 할로겐, 니트로, 시아노, 하이드록실, 아미노, 카바모일, 6-12원 아릴, C1-6 알킬, C2-6 알키닐, C2-6 알케닐, C1-6 알콕시, C1-6 할로알킬, 3-6원 헤테로사이클릴, C3-6 사이클로알킬 또는 Bn-O- 중 하나 이상으로 임의로 치환되고, 여기서 R10은 H, C1-6 알킬, C2-6 알키닐, C2-6 알케닐, C1-6 알콕시 또는 C1-6 할로알킬 중에서 선택되고; 및/또는
(b) 2개의 인접한 탄소 원자상의 R6은 5-12원 사이클로알킬, 아릴 또는 헤테로사이클릴을 형성하고, 이는 할로겐, 니트로, 시아노, 하이드록실, 아미노, 카바모일, 6-12원 아릴, C1-6 알킬, C2-6 알키닐, C2-6 알케닐, C1-6 알콕시, C1-6 할로알킬, 3-6원 헤테로사이클릴, C3-6 사이클로알킬 또는 Bn-O- 중 하나 이상으로 임의로 치환되고,
여기서 n은 0 내지 5의 정수이다.
하나의 구현예에서, n은 0 내지 2의 정수이고, R6은 각각 독립적으로 H, 할로겐, 니트로, 시아노, 하이드록실, 아미노, 카바모일, C1-6 알킬설푸릴, C1-6 알킬, C1-6 사이클로알킬, C1-6 알콕시, C1-6 할로알킬, -As(O), N-(C1-6 알킬)아미노, N,N-(C1-6 알킬)2아미노, -NH-C(O)H 또는 -NH-S(O)2H 중에서 선택되고, R7 또는 R8로 임의로 치환된다.
하나의 구현예에서, n은 0 내지 2의 정수이고, R6은 각각 독립적으로 H, 할로겐, 니트로, 시아노, 하이드록실, 아미노, C1-6 알킬설푸릴, C1-6 알킬, C1-6 사이클로알킬, C1-6 알콕시, C1-6 할로알킬, -As(O), -NH-C(O)H 또는 -NH-S(O)2H 중에서 선택되고, R7 또는 R8로 임의로 치환된다.
하나의 구현예에서, n은 1 또는 2이고, R6은 각각 독립적으로 H, 할로겐, 아미노, C1-6 알킬설푸릴, C1-6 사이클로알킬, C1-6 알콕시, C1-6 할로알킬, -NH-C(O)R7 또는 -NH-S(O)2R8 중에서 선택되고, 여기서 R7은 C1-6 알킬이고, 이는 6-12원 아릴로 임의로 치환되고, R8은 6-12원 아릴이고, 이는 할로겐, C1-6 알콕시 또는 C1-6 할로알킬 중 하나로 임의로 치환된다.
하나의 구현예에서, R6 은 -As(O) 기에 대해 오르토 위치 및/또는 파라 위치에 위치한다.
하나의 구현예에서, n은 0이다.
하나의 구현예에서, 화합물은 하기로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다:
Figure pct00023
,
Figure pct00024
,
Figure pct00025
,
Figure pct00026
,
Figure pct00027
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Figure pct00028
,
Figure pct00029
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Figure pct00030
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Figure pct00031
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Figure pct00032
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Figure pct00033
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Figure pct00034
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Figure pct00035
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Figure pct00036
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Figure pct00037
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Figure pct00038
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Figure pct00039
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Figure pct00040
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Figure pct00041
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Figure pct00042
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Figure pct00043
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Figure pct00044
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Figure pct00045
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Figure pct00046
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Figure pct00047
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Figure pct00048
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Figure pct00049
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Figure pct00050
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Figure pct00051
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Figure pct00052
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Figure pct00053
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Figure pct00054
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Figure pct00055
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Figure pct00057
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Figure pct00058
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Figure pct00060
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Figure pct00061
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Figure pct00063
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Figure pct00064
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Figure pct00065
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Figure pct00066
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Figure pct00067
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Figure pct00068
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Figure pct00069
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Figure pct00070
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Figure pct00071
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Figure pct00073
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Figure pct00089
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Figure pct00090
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Figure pct00094
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Figure pct00095
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Figure pct00096
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Figure pct00097
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Figure pct00098
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Figure pct00099
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Figure pct00100
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Figure pct00101
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Figure pct00102
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Figure pct00103
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Figure pct00104
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Figure pct00105
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Figure pct00106
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Figure pct00107
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Figure pct00108
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Figure pct00109
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Figure pct00110
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Figure pct00111
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Figure pct00112
,
Figure pct00113
및
Figure pct00114
.
하나의 구현예에서, 대상은 인간 또는 포유동물이다.
하나의 구현예에서, 종양은 림프종, 자궁경부암, 간암, 삼중 음성 유방암과 같은 유방암, 비-소세포 폐암 또는 소세포 폐암과 같은 폐암, 결장직장암, 위암, 흑색종과 같은 피부암, 골암종, 골육종, 골수종, 백혈병 또는 난소암 중에서 선택된다.
하나의 구현예에서, 용도는 제2 제제를 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 추가로 포함하며, 여기서 제2 제제는 바람직하게는 종양 치료제이다.
하나의 구현예에서, 제2 제제는 종양 치료제이다.
하나의 구현예에서, 화합물은 제2 제제의 투여 이전에, 이후에 또는 투여와 동시에 투여된다.
하나의 구현예에서, 종양 치료제는 파클리탁셀, 젬시타빈, 사이클로포스파미드 및 테모졸로미드 중 적어도 하나로부터 선택된다.
본 발명은 또한 질환의 예방 또는 치료를 위한 약물을 스크리닝하는 방법을 개시하며, 상기 방법은 후보 약물을 PI4KIIIα 단백질 또는 핵산 또는 PI4KIIIα와 접촉시키고, 상기 후보 약물이 PI4KIIIα의 형성 또는 활성을 억제할 수 있는지 여부를 검출하는 것을 포함하며, 여기서 질환은 조직 또는 기관 섬유증, 염증 반응, 악액질 및 종양 중에서 선택된다.
하나의 구현예에서, 조직 및 기관 섬유증은 폐 섬유증 또는 간 섬유증 중에서 선택된다.
하나의 구현예에서, 염증 반응은 국소 조직 또는 전신 혈액 중의 TNF-α 또는 IL-6과 같은 염증 인자의 증가에 의해 나타난다.
하나의 구현예에서, 종양은 림프종, 자궁경부암, 간암, 삼중 음성 유방암과 같은 유방암, 비-소세포 폐암 또는 소세포 폐암과 같은 폐암, 결장직장암, 위암, 흑색종과 같은 피부암, 골암종, 골육종, 골수종, 백혈병 또는 난소암 중에서 선택된다.
도 1은 수컷 SD 래트에서 0.1 ㎎/㎏ PAO 또는 d5PAO의 단일 용량 정맥내 주사 후 약동학에 대한 혈장 약물 농도-시간 곡선을 나타낸다.
도 2는 수컷 SD 래트에서 0.2 ㎎/㎏ PAO 또는 d5PAO의 단일 용량 경구 세척 후 약동학에 대한 혈장 약물 농도-시간 곡선을 나타낸다.
도 3은 α-시누클레인 과발현 플라스미드의 벡터 지도를 나타낸다.
도 4는 α-시누클레인 ELISA의 표준 제조 다이어그램을 나타낸다.
도 5는 SH-sy5y 세포의 아팝토시스(apoptosis)에 대한 d5PAO 및 PAO의 억제 효과를 나타낸다. 도 5A는 MTT에 의해 검출된 바와 같은 SH-sy5y 세포의 생존력(viability)에 대한 특정 농도의 d5PAO 및 PAO의 효과를 나타낸다(n = 5; 평균 ± SEM; 일원 ANOVA; ***p < 0.0001 대 ctrl; 및 ###p < 0.0001 대 ctrl). 도 5B는 면역형광 염색 이미지를 나타내며, 여기서 배양액에 프로피디움 요오다이드(PI)를 첨가하고 혼합물을 15분간 공-배양한 다음 Ki67을 면역형광 염색한다.
도 6은 안정하게-형질전환된 APP(SW) HEK293 세포의 생존력 개선 및 Aβ 방출 촉진에 대한 d5PAO 및 PAO의 효과를 나타낸다. 도 6A는 MTT에 의해 검출된 바와 같은 안정하게-형질전환된 APP(SW) HEK293 세포의 생존력에 대한 특정 농도의 d5PAO 및 PAO의 효과를 나타낸다(n = 5; 평균 ± SEM; 일원 ANOVA; 및 **p < 0.001, ***p < 0.0001 대 ctrl). 도 6B는 ELISA 키트에 의해 검출된 바와 같은 상등액 중의 Aβ 함량을 나타내며, 여기서 각 그룹의 Aβ 값은 표준 곡선에 따라 계산된다. 도 6C는 각 그룹에서 Aβ 함량의 변화 배수를 나타낸다(데이터를 ctrl로 1로서 정규화한다; n = 3; 평균 ± SEM; 일원 ANOVA 및 *p < 0.03, **p < 0.001, ***p < 0.0001 대 Ctrl).
도 7은 Aβ 방출 촉진에 대한 구조식을 갖는 중수소화 화합물 PAO의 효과의 비교를 나타낸다. 도 7A는 ELISA 키트에 의해 검출된 바와 같은 상등액 중의 Aβ 함량을 나타내며, 여기서 각 그룹의 Aβ 값은 표준 곡선에 따라 계산된다. 도 7B는 각 그룹에서 Aβ 함량의 변화 배수를 나타낸다(데이터를 ctrl로 1로서 정규화한다; n = 3; 평균 ± SEM; 일원 ANOVA; *p < 0.03, **p < 0.001, ***p < 0.0001 대 ctrl; 및 ##p < 0.001, ###p < 0.0001 대 50 nM d5PAO).
도 8은 α-시누클레인 과발현에 의해 야기된 SH-sy5y 세포의 손상 감소 및 α-시누클레인 방출 촉진에 대한 d5PAO 및 PAO의 효과를 나타낸다. 도 8A는 MTT에 의해 검출된 바와 같은 일시적으로-형질전환된 α-시누클레인 세포의 생존력에 대한 특정 농도의 d5PAO 및 PAO의 효과를 나타낸다(n = 5; 평균 ± SEM; 일원 ANOVA; 및 *p < 0.03, **p < 0.001, ***p < 0.0001 대 ctrl). 도 8B는 ELISA 키트에 의해 검출된 바와 같은 상등액 중의 α-시누클레인 함량을 나타내며, 여기서 각 그룹의 α-시누클레인 값은 표준 곡선에 따라 계산된다(n = 3; 평균 ± SEM; 일원 ANOVA; 및 *p < 0.03 대 Ctrl). 도 8C는 각 그룹에서 α-시누클레인 함량의 변화 배수를 나타낸다(데이터는 α-syn OE 그룹으로 1로서 정규화된다; n = 3; 평균 ± SEM; 일원 ANOVA; 및 *p < 0.03 대 ctrl).
도 9는 CBE에 의해 구성된 SH-SY5Y 세포 모델에서 d5PAO 및 PAO의 보호 효과를 나타낸다. 도 9A는 MTT에 의해 검출된 바와 같은 48h 동안 CBE로 처리된 SH-SY5Y 세포의 생존력을 나타낸다. 도 9B는 MTT에 의해 검출된 바와 같은, 먼저 24h 동안 100 μM의 CBE로 처리한 다음, 또 다른 24h 동안 100 μM의 CBE로 처리하면서 굶기고(FBS가 없는 고-글루코스 DMEM), 최종적으로 24h 동안 상이한 농도의 PAO로 처리한 SH-SY5Y 세포의 생존력을 나타낸다. 도 9C는 먼저 24h 동안 100 μM의 CBE로 처리한 다음, 또 다른 24h 동안 100 μM의 CBE로 처리하면서 굶기고(FBS가 없는 고-글루코스 DMEM), 최종적으로 24h 동안 상이한 농도의 d5PAO 및 PAO로 처리한 SH-SY5Y 세포의 생존력을 나타낸다(n = 5; 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다; ###p < 0.0001 대 ctrl; **p < 0.001 대 100 μM CBE; ***p < 0.0001 대 100 μM CBE).
도 10은 CBE-유도된 리소좀 및 GlcCer 축적의 억제 및 GlcCer 유출 촉진에 대한 PAO의 효과를 나타낸다. 도 10A는 Lyso-추적자의 면역형광 염색 이미지를 나타내며, 여기서 SH-SY5Y를 30분 동안 리소좀 추적자와 공-배양하고, 이어서 상등액을 제거하고, 상이한 농도의 PAO를 첨가하고, 혼합물을 10분 동안 배양하고, Lyso-추적자를 면역형광 염색에 의해 관찰한다. 도 10B는 각 그룹에서 Lyso-추적자의 형광 강도의 통계 분석을 나타낸다(스케일 바: 50 ㎛; n = 5; 일원 ANOVA; ##p < 0.001 대 ctrl; 및 **p < 0.001, ***p < 0.0001 대 100 μM CBE). 도 10C는 LC/MS 측정값에 따른 각 그룹의 세포 용해물 중의 GlcCer 농도의 통계적 분석을 나타낸다. 도 10D는 LC/MS 측정값에 따른 각 그룹의 세포 배양 배지의 상등액 중의 GlcCer 농도의 통계 분석을 나타낸다.
도 11은 리소좀 축적 감소 촉진에 대한 PI4Ka 녹다운(knockdown)의 효과를 나타낸다. 도 11A는 웨스턴 블롯에 의해 검출된 바와 같은 PI4KⅢα 단백질 수준을 나타내며, 여기서 SH-SY5Y 세포는 48h 동안 상이한 shRNA 간섭 렌티바이러스 벡터(sh-ctrl, sh1-PI4Ka, sh2-PI4Ka 및 sh3-PI4Ka)로 처리된다. 도 11B는 웨스턴 블롯의 통계 분석 결과를 나타낸다. 도 11C는 shRNA 간섭 렌티바이러스 벡터로 처리한 후 Lyso-추적자의 면역형광 염색에 의해 검출된 바와 같은 형광 강도를 나타낸다. 도 11D는 통계 분석을 나타낸다(스케일 바: 50 ㎛; n = 5; 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다; 일원 ANOVA; 및 ***p < 0.0001).
도 12는 pGMLV-SC5RNAi 벡터 지도를 나타낸다.
도 13은 24h 동안 처리된 MRC-5 세포의 명시야 이미지를 나타내며, 여기서 MRC-5 세포를 24h 동안 MEM(무-FBS, 5 ng/㎖ TGF-β1 및 그룹에 따라 상이한 농도의 PAO 또는 d5PAO 함유)에서 배양한다(스케일 바: 50 ㎛).
도 14는 MRC-5 세포 모델에서 α-SMA 및 칼포닌1의 발현에 대한 d5PAO 및 PAO의 억제 효과를 나타낸다. 도 14A는 웨스턴 블롯에 의해 검출된 바와 같은 α-SMA 및 칼포닌1의 발현 수준을 나타낸다. 도 14B는 각 그룹에서 α-SMA의 발현 수준의 통계 분석 결과를 나타낸다. 도 14C는 각 그룹에서 칼포닌1의 발현 수준의 통계 분석 결과를 나타낸다(단백질 신호강도를 Image J 소프트웨어로 분석하였으며, 이때 ctrl의 신호 강도는 1이다; n = 3; 일원 ANOVA, 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다; *p < 0.03, **p < 0.001, ***p < 0.0001 대 5 ng/㎖ TGF-β1; 및 #p < 0.03 대 ctrl).
도 15는 MRC-5 세포 모델에서 α-SMA 및 칼포닌1의 발현에 대한 d5PAO 및 PAO의 억제 효과를 나타낸다. 도 15A는 각 그룹에서 칼포닌1의 면역형광 염색 이미지를 나타낸다(적색: α-SMA, 청색: DAPI(핵), 및 스케일 바: 50 ㎛). 도 15B는 각 그룹에서 칼포닌1의 면역형광 염색 이미지를 나타낸다(적색: 칼포닌1, 청색: DAPI(핵), 및 스케일 바: 50 ㎛). 도 15C 및 15D는 각각 α-SMA 및 칼포닌1의 면역형광 강도의 통계 분석 결과를 나타낸다(이때 ctrl의 평균값은 1이다; n = 5; 일원 ANOVA; 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다; *p < 0.03, **p < 0.001, ***p < 0.0001 대 5 ng/㎖ TGF-β1; 및 ###p < 0.0001 대 ctrl).
도 16은 MSC에서 칼포닌1의 발현에 대한 d5PAO 및 PAO의 조절 효과를 나타낸다. 도 16A는 각 그룹에서 칼포닌1의 면역형광 염색 이미지를 나타낸다(적색: 칼포닌1, 청색: DAPI(세포 핵), 스케일 바: 50 ㎛). 도 16B는 칼포닌1의 면역형광 강도의 통계 분석 결과를 나타낸다(n = 4; 일원 ANOVA; 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다).
도 17은 섬유증 동안 MRC-5 세포에서 COL1의 분비에 대한 d5PAO 및 PAO의 억제 효과를 나타낸다. 도 17A는 ELISA에 의해 검출된 바와 같은 각 그룹의 상등액 중의 COL1 농도를 나타낸다(n = 6, 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다). 도 17B는 각 그룹의 상등액 중의 COL1 농도의 통계 분석을 나타낸다(이때 ctrl의 평균 값은 1이다; 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다; *p < 0.03, **p < 0.001, ***p < 0.0001 대 5 ng/㎖ TGF-β1 및 #p < 0.0001 대 ctrl).
도 18은 PI4KⅢα의 발현 감소에 대한 shRNA 간섭 렌티바이러스 벡터의 영향을 나타내며, 여기서 shRNA 간섭 렌티바이러스 벡터를 MRC-5 세포와 48h 동안 공-배양하고, 단백질을 웨스턴 블롯을 위해 수집한다. 도 18A는 PI4KIIIα 단백질의 검출을 나타낸다. 도 18B는 Image J 소프트웨어의 데이터 분석 결과를 나타낸다(데이터를 sh-ctrl로 1로서 정규화하고 평균 ± SEM으로 표시한다; n = 3; 및 ***p < 0.0001 대 sh-ctrl).
도 19는 TGF-β1로 처리된 MRC-5 세포에서 칼포닌1 및 α-SMA 발현에 대한 PI4Ka 녹다운의 억제 효과를 나타내며, 여기서 MRC-5 세포를 벽에 부착시킨 후, 서열이 다른 렌티바이러스 벡터를 가하고, 혼합물을 24h 동안 배양하고, 24h 동안 그룹에 따라 5 ng/㎖ TGF-β1로 처리하거나 처리하지 않고, 면역형광 염색을 수행한 후 관찰한다. 도 19A는 각 그룹에서 α-SMA의 면역형광 염색 이미지를 나타낸다(적색: α-SMA, 청색: DAPI(핵), 녹색: 녹색 형광 단백질(GFP), 및 스케일 바: 50 ㎛). 도 19B는 각 그룹에서 칼포닌1의 면역형광 염색 이미지를 나타낸다(적색: 칼포닌1, 청색: DAPI(세포 핵), 녹색: 녹색 형광 단백질(GFP), 및 스케일 바: 50 ㎛). α-SMA(도 19C) 및 칼포닌1의 면역형광 강도의 통계 분석 결과를 나타낸다(데이터를 sh-ctrl의 평균값을 1로 하여 정규화하고 평균 ± SEM으로 표시한다; n = 5; *p < 0.03, * **p < 0.0001 대 sh-ctrl+5 ng/㎖ TGF-β1 및 ##p < 0.001, ###p < 0.0001 대 sh-ctrl).
도 20은 BV2 세포 염증 모델에서 IL-6 및 TNF-α의 분비에 대한 d5PAO 및 PAO의 억제 효과를 나타낸다. 도 20A는 ELISA에 의해 검출된 바와 같은 BV2 세포의 상등액 중의 TNF-α 농도를 나타내며, 여기서 TNF-α 함량(pg/㎖)은 표준 곡선에 따라 계산된다. 도 20B는 각 그룹에서 TNF-α의 상대적인 농도 변화를 나타낸다(이때 ctrl의 평균 농도는 1로 한다). 도 20C는 ELISA에 의해 검출된 바와 같은 BV2 세포의 상등액 중의 IL-6 농도를 나타내며, 여기서 IL-6 함량(pg/㎖)은 표준 곡선에 따라 계산된다. 20D는 각 그룹에서 IL-6의 상대적인 농도 변화를 나타낸다(이때 ctrl의 평균 농도를 1로한다; n = 3; 일원 ANOVA; 데이터를 평균 ± SEM으로 표시한다; *p < 0.03, **p < 0.001, ***p < 0.0001 대 1 ㎍/㎖ LPS 및 #p < 0.03, ##p < 0.001 대 ctrl).
도 21은 유방암에 대한 PAO의 억제 효과를 나타낸다.
도 22는 림프종에 대한 PAO의 억제 효과를 나타낸다.
도 23은 흑색종에 대한 d5PAO의 억제 효과를 나타낸다.
도 24는 투여 28일째에 흑색종에 대한 d5PAO의 억제 효과를 나타낸다.
도 25는 마우스의 체중 및 생존율에 대한, 세척을 통한 고용량 PAO 및 d5PAO의 효과의 비교를 나타낸다.
도 26은 유방암 마우스 모델의 체중에 대한 PAO의 효과를 나타낸다.
도 27은 췌장암 모델의 체중에 대한 PAO의 효과를 나타낸다.
도 28은 림프종 동물 모델의 체중에 대한 PAO의 효과를 나타낸다.
도 29는 흑색종이 있는 마우스의 체중에 대한 병용 투여에서 d5PAO의 효과를 나타낸다.
도 30은 HCoV229E(인플루엔자 코로나바이러스)에 대한 PAO 및 d5PAO의 억제 효과를 나타낸다.
도 31은 PAO 및 d5PAO의 항-불안 효과를 나타내며, 여기서 d5PAO는 PAO보다 더 유의한 항-불안 효과를 갖는다.
도 32는 PAO 및 d5PAO의 항-우울 효과를 나타내며, 여기서 d5PAO는 PAO보다 더 유의하고 안정적인 항-우울 효과를 갖는다.
도 33은 U18666A에 의해 유발된 콜레스테롤 축적에 대한 d5PAO 및 PAO의 억제 효과를 나타낸다(스케일 바: 50 ㎛).
도 34는 세포 모델에서 LC3B 및 p62의 발현 촉진에 대한 PAO의 효과 및 PAO의 보호 차단에 대한 Baf-A1의 효과를 나타낸다. 도 34A는 웨스턴 블롯에 의해 검출된 바와 같은 LC3B 및 p62 단백질을 나타낸다. 도 34B 및 34C는 Image J 소프트웨어에 의해 분석된 바와 같은 LC3B 및 p62 단백질의 신호 강도의 통계 분석을 나타낸다. 도 34D는 LC3B 및 p62의 면역형광 염색 이미지를 나타낸다(적색: p62, 녹색: LC3B 및 스케일 바: 50 ㎛). 도 34E는 MTT 및 통계적 분석에 의해 검출된 바와 같은 각 그룹의 세포 생존력을 나타낸다(n = 5; 데이터를 평균 ± SEM으로 표시한다; 일원 ANOVA; ###p < 0.0001 대 ctrl; 및 **p < 0.001 대 100 μM CBE).
도 35는 ALP의 활성화에 대한 PI4Ka 녹다운의 효과를 나타낸다. 도 35A 및 35B는 웨스턴 블롯에 의해 검출된 바와 같은 LC3B 단백질 수준을 나타내며, 여기서 SH-SY5Y 세포를 48h 동안 상이한 shRNA 간섭 렌티바이러스 벡터(sh-ctrl, h1-PI4Ka, sh2-PI4Ka 및 sh3-PI4Ka)로 처리하고, 통계 분석하였다. 도 35C 및 35D는 LC3B 단백질 수준을 나타내며, 여기서 세포를 48h의 공-배양 동안 CBE 처리를 수용하면서 shRNA 간섭 렌티바이러스 벡터에 의해 형질감염시키고, 통계 분석한다(n = 3; 데이터를 평균 ± SEM으로 표시한다; 일원 ANOVA 및 *p < 0.03 대 sh-ctrl).
도 36은 기준선에 대한 아세틸콜린-유도된 향상된 일시정지(Penh) 값의 백분율을 나타낸다.
도 37은 기관지폐포 세척액(BALF) 중의 호산구, 대식세포, 호중구 및 림프구의 총 수를 나타낸다(T.검정; 단측; * < 0.5, ** < 0.1 대 모델 그룹의 총 세포 함량).
도 38은 기관지폐포 세척액(BALF) 중의 호산구, 대식세포, 호중구 및 림프구의 각각의 수를 나타낸다(T.검정; 단측; * < 0.5, ** < 0.1 대 모델 그룹의 BALF).
도 39는 혈장 중 I형 콜라겐 함량을 나타낸다(정상 그룹을 ctrl로 간주한다).
도 40은 폐 섬유증이 있는 마우스(정상 그룹을 ctrl로 간주한다)의 혈장에서 히알루론산의 하향 조절에 대한 PAO 및 dPAO와, 닌테다닙(양성 대조용 약물)과의 효과의 비교를 나타낸다.
이하, 본 발명을 구현예에 따라 첨부된 도면과 함께 상세하게 설명한다. 본 발명의 상기 양태 및 본 발명의 다른 양태는 하기의 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다. 본 발명의 범위는 하기의 구현예에 한정되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "화합물"은 표시된 구조의 모든 입체 이성질체(예를 들어, 거울상 이성질체 및 부분입체 이성질체), 기하 이성질체, 호변 이성질체 및 동위원소를 포함하는 것으로 의도된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 바람직하게는 벤젠 고리 상의 모든 수소 원자가 중수소화 동위원소로 치환된 중수소화 옥소페닐아르신에 관한 것이다.
본원에 기재된 화합물은 비대칭(예를 들어, 하나 이상의 입체중심을 가짐)일 수 있다. 달리 명시되지 않는 한, 거울상 이성질체 및 부분입체 이성질체와 같은 모든 입체 이성질체가 포함되는 것으로 의도된다. 본원에 기재된 화합물은 예를 들어 올레핀 및 탄소-탄소 이중 결합을 포함하는 다양한 기하 이성질체를 가질 수 있으며, 모든 안정한 이성질체가 본원에서 고려되었다. 화합물의 시스- 및 트랜스-기하 이성질체가 본원에 기재되어 있고 이성질체 혼합물 또는 개별 이성질체의 형태로 단리될 수 있다.
본원에 기재된 화합물은 또한 호변 이성질체 형태를 포함한다. 호변 이성질체 형태는 단일 결합이 양성자의 이동과 함께 인접한 이중 결합과 교환하여 생성된다. 호변 이성질체 형태는 동일한 화학식 및 총 전하를 갖는 이성질체 양성자화 상태의 양성자 호변 이성질체를 포함한다. 양성자 호변 이성질체의 예는 케토-에놀, 아미드-이미딘산, 락탐-락팀, 엔아민-이민 및 사이클릭 형태를 포함하며, 여기서 양성자는 헤테로사이클릭 시스템의 2개 이상의 위치를 차지할 수 있다(예를 들어, 1H- 및 3H-이미다졸, 1H-, 2H- 및 4H-1,2,4-트리아졸, 1H- 및 2H-이소인돌, 및 1H- 및 2H-피라졸). 호변 이성질체 형태는 적절한 치환에 의해 평형화되거나 입체적으로 하나의 형태로 고정될 수 있다.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 소분자 화합물은 유기 합성에 의해 수득될 수 있다. 본원에 기재된 화합물은 이의 염, 에스테르, 수화물 또는 용매화물을 포함하여, 임의의 주지된 유기 합성 기법에 의해 제조될 수 있고 다양한 가능한 합성 경로에 따라 합성될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "옥소페닐아르신"(PAO)은 하기의 특정 화학 구조를 갖는 소분자 화합물을 지칭한다:
Figure pct00115
.
세포내 단백질의 미스폴딩과 관련된 질환
본원에서 용어 "세포내 단백질의 미스폴딩과 관련된 질환"은 세포질 내 비정상적으로 폴딩된 단백질의 응집을 특징으로 하는 질환을 의미하며, 또한 단백질 응집(축적) 또는 단백질 미스폴딩 질환으로 진단된다. 또한, "세포내 단백질 미스폴딩과 관련된 질환"이라는 용어는 또한 일부 세포내 봉입체 질환, 예를 들어 단백질 응집 및 봉입체 형성을 갖는 질환을 포함하며, 여기서 이러한 봉입체는 주로 미스폴딩으로 인한 코어 단백질의 응집에 의해 형성되고, 이때 풀린 단백질에 반응하여 다양한 스트레스 단백질의 부착이 수반된다.
세포내 단백질 미스폴딩과 관련된 질환에는 파킨슨병(PD), 루이소체 치매(LBD), 다계통 위축(MSA), 봉입체 근염(IBM), 전두측두엽 치매(FTD), 헌팅턴병(HD), 폴리아민 질환(PolyQ), 근위축성 측삭 경화증(ALS) 및 프리온 질환이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.
리소좀 축적 질환
본원에서 사용되는 용어 "리소좀 축적 질환"은, 비제한적으로 리소좀 내의 불충분한 효소 활성에 의한 리소좀 기능 결핍, 및 활성제 단백질, 수송 단백질 또는 리소좀 단백질에 대한 가공 및 보정 효소의 결여를 포함하여 다양한 이유로 인해 리소좀 중의 일부 내인성 또는 외인성 물질의 측적에 의해 야기되는 질환을 지칭하며, 상기 리소좀 기능 결핍으로 인해 해당 기질이 2차 리소좀에서 소화되지 않고 축적되며, 대사 장애가 발생하여 축적 질환 등으로 이어진다.
리소좀 축적 질환은 스핑고지질 대사 장애, 점액다당류증, 글리코겐 축적 질환, 당단백질 축적 질환, 지질 축적 질환, 번역-후 변형 결핍증, 통합 막 단백질 결핍 장애, 신경지방갈색소증, 또는 리소좀 관련 소기관의 장애를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 그 중, 스핑고지질 대사 장애는 비제한적으로, 파브리병(Fabry disease), 대사장애의 피부병(dermotosis of metabolism disturbance)(파베병(Farbe disease)), I, II 및 III형 고셔병(Gaucher disease) 및 주산기 치명적인 고셔병(perinatal lethal Gaucher disease), I, II 및 III형 GM1 강글리오사이드증(gangliosidosis), GM2 강글리오사이드증(흑내장성 가족성 백치(amaurotic familial idiocy)), GM2 강글리오사이드증, 구형세포 백질장애(globoid cell leukodystrophy)(크라베병(Krabbe disease)), 이색성 백질장애(metachromatic leukodystrophy) 및 A 및 B형 니만-픽병(Niemann-Pick)을 포함하고; 점액다당류증은 비제한적으로, 헐러-샤이 증후군(Hurler-Scheie syndrome) 및 샤이 증후군(ML I), 헌터 증후군(Hunter syndrome)(MPS II), 산필리포 증후군(Sanfilippo syndrome) A(MPS IIIA), 산필리포 증후군 B(MPS IIIB), 산필리포 증후군 C(MPS IIIC), 산필리포 증후군 D(MPS IIID), 편심 골연골이형성 증후군(eccentro-osteochondrodysplasia syndrome)(MPS IVA), 편심 골연골이형성 증후군(MPS IVB), VI형 점액다당류증(마로토-라미 증후군(Maroteaux-lamy syndrome), MPS VI), Sly 질환(MPS VII) 및 MPS IX을 포함하고; 글리코겐 축적 질환은 비제한적으로, 희귀 폼베병(rare Pompe disease)(GSD II)을 포함하고; 당단백질 축적 질환은 비제한적으로, 알파-만노사이드증(alpha-mannosidosis), 베타-만노사이드증(beta-mannosidosis), 푸코사이드증(fucosidosis), 아스파틸글루코사민뇨증(aspartylglucosaminuria), I형 쉰들러병(Schindler disease type I)(유아 신경축삭 이영양증(infantile neuroaxonal dystrophy)), II형 쉰들러병(칸자키병(Kanzaki disease)), III형 쉰들러병(중등도), I형 시알리도증(sialidosis)(체리-붉은 반점-근간대성 경련 증후군(cherry-red spot-myoclonus syndrome), II형 시알리도증(점액다당류증 I) 및 갈락토시알리도증(galactosialidosis)을 포함하고; 지질 축적 질환은 비제한적으로, 산 리파제 결핍, 예를 들어 울만병(Wolman's disease) 및 콜레스테릴 에스테르 축적 질환을 포함하고; 번역-후 변형 결핍은 비제한적으로, 다중 설파타제 결핍(multiple sulfatase deficiency), IIα/β형 점액지질증(mucolipidosis)(I-세포 질환), IIα/β형 점액지질증(슈도-헐러 증후군(pseudo-Hurler syndrome)), 및 IIIγ형 점액지질증(슈도-헐러 증후군 변이형)을 포함하고; 통합 막 단백질 결실 장애는 비제한적으로, 호모시스틴뇨증(homocystinuria), 다농병(Danon disease), 근간대성 경련 신부전 증후군(myoclonus-renal failure syndrome), 시알리도증(예를 들어, ISSD, 살라병(Salla disease) 및 중등도 살라병), C1 및 C2형 니만-픽병 및 IV형 점액지질증을 포함하고; 신경지방갈색소증은 비제한적으로, 1형 지방갈색소증(할티아-산타부리병(Haltia-Santavuori disease) 및 INCL), 2형 신경지방갈색소증(얀스키-빌쇼스키병(Jansky-Bielschowsky disease)), 3형 신경지방갈색소증(바텐-스필마이어-쇼그렌병(Batten-Spielmeyer-Sjogren disease)), 4형 신경지방갈색소증(패리병(Parry disease) 및 A 및 B형 쿠프스병(Kufs disease)), 5형 신경지방갈색소증(유아 말기 핀란드 변종(finnish variant late infantile)), 6형 신경지방갈색소증(레이크-카바나(Lake-Cavanagh) 또는 인도 변종), 7형 신경지방갈색소증(터키 변종), 8형 신경지방갈색소증(북부 간질 및 간질-지적 장애(Northern epilepsy and epilepsy-intellectual disability)), 9형 신경지방갈색소증, 10형 신경지방갈색소증, 11형 신경지방갈색소증, 12형 신경지방갈색소증, 13형 신경지방갈색소증 및 14형 신경지방갈색소증을 포함하고; 리소좀-관련된 소기관 장애는 비제한적으로 1형 헤르만스키-푸드라크 증후군(Hermansky-Pudlak syndrome), 2형 헤르만스키-푸드라크 증후군, 3형 헤르만스키-푸드라크 증후군, 4형 헤르만스키-푸드라크 증후군, 5형 헤르만스키-푸드라크 증후군, 6형 헤르만스키-푸드라크 증후군, 7형 헤르만스키-푸드라크 증후군, 8형 헤르만스키-푸드라크 증후군, 9형 헤르만스키-푸드라크 증후군, 1형 그리셀리 증후군(Griscelli syndrome)(에레할데 증후군(Elejalde syndrome)), 2형 그리셀리 증후군 및 체디악-히가시병(Chediak-Higashi disease)을 포함한다.
약물 투여 및 의학적 용도
본원에 사용된 용어 "약제학적으로 허용되는"은 합리적인 의학적 판단의 범위 내에서 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 또는 기타 문제 또는 합병증 없이 인간 및 동물 조직과 접촉하여 사용하기에 적합하며 합리적인 이익/위험 비율에 상응하는 화합물, 물질, 조성물 및/또는 투여 형태를 지칭한다. 특정 구현예에서, 약제학적으로 허용되는 화합물, 물질, 조성물 및/또는 투여 형태는 규제 당국(예를 들어 미국 식품 의약청, 중국 식품 의약청, 또는 유럽 의약청)에 의해 승인되거나 일반적으로 인정되는 약전(미국 약전, 중국 약전 또는 유럽 약전)에 나열되고 동물(더 구체적으로 인간)에 사용되는 것들이다.
본원에서 "대상"이라는 용어는 인간 및 비-인간 동물을 포함할 수 있다. 비-인간 동물은 포유동물 및 비-포유동물과 같은 모든 척추동물을 포함한다. "대상"은 또한 가축(예를 들어, 소, 돼지, 양, 닭, 토끼 또는 말), 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스), 영장류(예를 들어, 고릴라 또는 원숭이), 또는 가축(예를 들어 개 또는 고양이)일 수 있다. "대상"은 남성 또는 여성 대상일 수 있으며, 또한 연령이 다를 수도 있다. 인간 "대상"은 백인, 아프리카인, 아시아인, 수메르인 또는 기타 인종이거나 다른 인종의 잡종일 수 있다. 인간 "대상"은 노인, 성인, 청소년, 어린이 또는 유아일 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 대상은 인간 또는 비-인간 영장류이다.
본원에 개시된 중수소화 옥소페닐아르신은 주사(예를 들어, 피하 주사, 복강내 주사, 정맥내 주사(정맥내 점적 또는 주입 포함), 근육내 주사 또는 피내 주사) 투여, 또는 비-주사 투여(예를 들어, 경구 투여, 비강 투여, 설하 투여, 직장 투여 또는 국소 투여)와 같은 당업계에 공지된 투여 경로에 의해 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 중수소화 옥소페닐아르신은 경구, 피하, 근육내 또는 정맥내 투여된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 중수소화 옥소페닐아르신은 경구 투여된다.
본원에 사용된 바와 같이, "치료학적 유효량"이란 용어는 대상의 질환 또는 증상을 완화 또는 제거하거나 질환 또는 증상의 발생을 예방적으로 억제하거나 또는 예방할 수 있는 약물의 양을 의미한다. 치료학적 유효량은 대상에서 하나 이상의 질환 또는 증상을 어느 정도 완화시키는 약물의 양; 질환 또는 증상의 원인과 관련된 하나 이상의 생리학적 또는 생화학적 매개변수를 부분적으로 또는 완전히 정상으로 회복시킬 수 있는 약물의 양; 및/또는 질병 또는 증상의 발병 가능성을 감소시킬 수 있는 약물의 양일 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 사용된 용어 "치료학적 유효량"은 대상에서 세포내 단백질 미스폴딩 또는 리소좀 축적 질환과 관련된 질환을 완화 또는 제거할 수 있는 약물의 양을 지칭한다.
본원에 제공된 중수소화 옥소페닐아르신의 치료학적 유효량은 체중, 연령, 병력, 현재 받는 치료, 대상의 건강 상태, 약물-약물 상호작용의 강도, 알레르기, 과민증 및 부작용뿐만 아니라 투여 경로 및 질병 진행 정도과 같은 당업계에 공지된 다양한 인자에 따라 다르다. 당업자(예를 들어, 의사 또는 수의사)는 이러한, 또는 다른 조건 또는 요건에 따라 용량을 줄이거나 늘릴 수 있다.
일부 구현예에서, 치료는 제2 제제를, 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 제2 제제는 세포내 단백질 미스폴딩과 관련된 질환을 치료하기 위한 제제이고, 레보도파 및 릴루졸을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 중수소화 옥소페닐아르신은 제2 제제 이전에, 이후에, 또는 이와 동시에 투여된다.
본원은 또한 유효량의 중수소화 옥소페닐아르신을, 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 세포내 단백질 미스폴딩과 관련된 질환의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.
본원은 또한 유효량의 중수소화 옥소페닐아르신을, 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 리소좀 축적 질환의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.
실시예 1. 화합물의 합성 및 물성
1. d5PAO(5-중수소화 옥소페닐아르신)의 합성 및 물성
1.1 d5PAO의 합성
d5PAO의 합성 경로는 하기와 같다:
Figure pct00116
단계 1: d5-PA의 합성:
Figure pct00117
91.35 ㎖의 수 및 18.27 g의 5-중수소화 아닐린(d5-아닐린)을 3목 플라스크(three-necked flask)에 첨가하고, 교반하고 0-10℃로 냉각시켰다. 37.45 ㎖의 농축된 염산을 적가하였다. 그 후, 아질산나트륨 수용액(수 36.5 ㎖에 용해된 고형 아질산나트륨 13.43 g)을 적가하고, 온도를 5℃ 이하에서 약 2-3h 동안 유지시켜 디아조늄 염의 제조를 완료하였다.
또 다른 용기에 정제수 274 ㎖, 탄산나트륨 69.06 g, 삼산화비소 36.82 g, 및 황산구리 오수화물(CuSO4·5H2O) 2.83 g을 넣고 90℃ 내지 100℃로 가열하고 30분간 항온 교반 하고, 이어서 5℃-15℃로 냉각시킨다. 상기에서 제조한 디아조늄염을 배치(batch)로 천천히 첨가하고, 온도를 15℃ 아래로 조절하였다. 생성된 혼합물을 2-3h 동안 교반한 다음, 자연적으로 실온으로 가열하고, 밤새 교반하고, 여과하였다. 필터 케이크를 물로 헹구었다. 여액을 합하였다. 농축된 염산을 서서히 가하여 시스템의 pH 값을 3.0으로 조절하였고, 소량의 갈색 덩어리가 침전되었다. 흡입 여과를 수행하였다. 여액을 에틸 아세테이트 100 ㎖로 3회 세척하고, 수성상을 감압 하에 50℃-60℃에서 약 170 ㎖로 농축시켰으며, 이때 다량의 백색 고체가 침전되었다. 흡입 여과를 수행하였다. 필터 케이크를 냉수로 헹구고 제습하고, 고체를 50℃의 블라스트 오븐에서 18h 동안 직접 건조시켜 회백색 고체로서 35 g의 d5-PA를 수득하였다(수율: 90.83%, MS ES+(m/z): 208.0 [(M+H)+]).
단계 2: d5-PAO의 합성:
Figure pct00118
3목 플라스크에 정제수 400 ㎖, d5-PA 25 g, 아황산나트륨 75.4 g, 요오드화칼륨 0.32 g, 및 메탄올 125 ㎖를 넣고 30℃ 내지 40℃에서 밤새 교반하였다. 대부분의 원료 물질이 완전히 반응할 때까지 반응을 종료하였다. 생성된 용액의 온도를 30℃ 아래로 조절하고, 농축된 염산을 첨가하여 pH 값을 7.0으로 조절하였다. 혼합물을 에틸 아세테이트로 4회 추출하였다. 이어서, 유기상을 합하고 35℃-45℃에서 농축 건조시켜 20 g의 습한 백색 고체를 수득하였다. 고체를 1h 동안 240 ㎖의 3급-부틸 메틸 에테르로 가열 환류한 다음 냉각시켰다. 흡입 여과를 수행하였다. 필터 케이크를 저온 MTBE로 세척하고 50℃에서 블라스트 오븐에서 밤새 건조시켜 8.7 g의 d5PAO를 백색 고체로서 수득하였다(13C-NMR (δ, DMSO-d6): 149.9, 129.6, 129.4, 128.2, MS ES+(m/z): 173.99 [(M+H)+]).
1.2 d5PAO의 물리화학적 특성
1.2.1 장비
Agilent1260Prime 고성능 액체 크로마토그래프, Mettler Toledo XS105 저울(0.01 mg), KQ5200B 초음파 기기(Kunshan Ultrasonic Instruments Co., Ltd.), BR2000-GM 가변 속도 진동자(VWR International) 및 0.45-㎛ 필터 멤브레인(Shanghai Qingyang Biotechnology Co., Ltd.).
1.2.2 실험 약물
d5PAO(순도: 97.9%), 아세토니트릴(크로마토그래피 순수, Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.), 및 염산 및 DMSO(분석적으로 순수, Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.).
1.2.3 용액 제조
0.1 M 염산 용액 2 ㎖를 취하여 탈이온수로 20 ㎖로 희석하여 0.01 M 염산 용액을 수득하고, 정밀 pH 시험지로 pH를 2로 측정하였다.
0.01 M 염산 용액 2 ㎖를 취하고 탈이온수로 20 ㎖로 희석하여 0.001 M 염산 용액을 수득하였다.
0.001 M 염산 용액 2 ㎖를 취하여 탈이온수로 20 ㎖로 희석하여 0.0001 M 염산 용액을 수득하고, 정밀 pH 시험지를 이용하여 용액의 pH를 4로 측정하였다.
20 ㎖의 탈이온수를 취하고, pH를 6으로 측정하였다.
7.5 ㎎의 d5PAO를 원심분리기 튜브에 넣은 다음 1 ㎖의 DMSO를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 초음파 진동시켜 용해시키고 아세토니트릴/수(1/1) 혼합 액체로 10 ㎖로 희석하여 0.75 ㎎/㎖ d5PAO 저장 용액(stock solution)을 수득하였다. d5PAO 저장 용액을 상이한 d5PAO 작업 용액(0.3 ㎎/㎖, 0.15 ㎎/㎖, 0.075 ㎎/㎖, 0.03 ㎎/㎖ 및 0.015 ㎎/㎖)으로 희석하였다.
1.2.4 크로마토그래피 조건
액체 크로마토그래프: Agilent 1260 Infinity II Prime 초고압 액체 크로마토그래피 시스템.
크로마토그래피 컬럼: ACQUITY UPLC® Peptide C18130Å 2.1 * 100 mm ID, 1.7 ㎛(Waters).
이동상 A: 수(water): 0.01% AA 및 2 mmol/L NH4OAc를 포함하는 ACN(v:v, 95:5) 용액.
이동상 B: 수: 0.01% AA 및 2 mmol/L NH4OAc를 포함하는 ACN(v:v, 5:95) 용액.
용출 구배:
시간(min) 유량(㎖/분) A(%) B(%)
초기 0.400 95 5
2.00 0.400 2 98
3.00 0.400 2 98
3.20 0.400 95 5
4.00 0.400 95 5
컬럼 온도: 40℃
공급 부피: 4 ㎕
검출 파장: 254 ㎚
1.2.5 방법론적 조사
선형 관계의 조사
상이한 d5PAO 용액(0.75 ㎎/㎖, 0.3 ㎎/㎖, 0.15 ㎎/㎖, 0.075 ㎎/㎖, 0.03 ㎎/㎖ 및 0.015 ㎎/㎖)을 취하여 상기 크로마토그래피 조건에 따라 측정하고 크로마토그램을 기록하였다. 샘플 농도에 대한 피크 면적의 선형 회귀를 수행하여 회귀 방정식을 얻었다:
y = 1647.7x + 0.9623, R2 = 0.9999
결과는 d5PAO 샘플 농도가 0.015-0.75 ㎎·㎖-1 범위에 있었고 피크 면적과 양호한 선형 관계를 가지고 있음을 보여주었다.
1.2.6 평형 용해도의 측정
상이한 pH 완충 용액을 3-㎖ 원심분리기 튜브에 피펫팅하였다(각각 2 ㎖). 과량의 d5PAO 분말을 첨가하였다. 용액에 다량의 백색 불용성 침전물이 나타날 때까지, 생성 혼합물을 30분간 초음파 처리하고 항온식 진동자에 넣고 25℃에서 24h 동안 흔든 다음 30분간 더 초음파 처리하고 0.45-㎛ 필터 멤브레인으로 여과하였다. 후속 여액을 피펫팅하고 물로 10배 희석하고 상기 크로마토그래피 조건에 따라 측정하고 크로마토그램을 기록하였다. 상이한 pH 완충액에 대한 d5PAO의 용해도는 각각 5.36 ㎎/㎖, 5.39 ㎎/㎖ 및 5.98 ㎎/㎖로 계산되었다.
d5PAO의 용해도
약물 pH 피크 면적 상응하는 용해도(㎎/㎖)
d5PAO 6 884.20 5.36
d5PAO 4 889.51 5.39
d5PAO 2 986.70 5.98
2. PAO의 합성 및 물성
2.1 PAO의 합성
합성 경로:
Figure pct00119
단계 1:
Figure pct00120
250-㎖ 1목 플라스크(single-necked flask)에 아닐린(10.0 g, 107 mmol, 1.0 eq.) 및 아세톤(20 ㎖)을 넣고 약 -15℃로 냉각시킨 다음(고온은 생성물을 검게 한다) 48% HBF4(30 ㎖, 29.5 g, 161 mmol, 1.5당량)를 천천히 첨가하였다. NaNO2(11.0 g, 161 mmol, 1.5 eq.)를 H2O(20 ㎖)에 용해시키고, 혼합물을 상기 용액에 천천히 적가하였다. 첨가 후, -15℃에서 2h 동안 온도를 유지한 후, 0℃에서 약 1h 동안 반응물을 교반하였다. 고체(백색)를 여과하고 이소프로필 에테르(50 ㎖ × 2)로 세척하였다. 생성물을 진공 하에 30℃에서 건조시키고(중량: 17.5g, 수율: 85%, 분홍색 고체) 다음 단계에서 직접 사용하였다.
단계 2:
Figure pct00121
Na2CO3(21.2 g, 200.6 mmol, 3.85 eq.), As2O3(11.3 g, 57.3 mmol, 1.1 eq.), CuSO4-5H2O(800 ㎎, 3.13 mol, 0.06 eq.) 및 H2O(60 ㎖)를 250-㎖ 플라스크에 첨가하였다. 대부분의 고체가 용해될 수 있도록 현탁액을 약 20분 동안 약 90℃로 가열하였다. 용액을 약 0-15℃로 냉각시켰다. 아조벤젠 플루오로보레이트(10.0 g, 52.1 mmol, 1.0 eq.) 및 H2O(60 ㎖)의 현탁액을 배치로 천천히 첨가하고, 소량의 아세톤을 첨가하여 거품 응집을 감소시켰다. 첨가 후, 혼합물을 실온에서 약 12h 동안 교반하고, 규조암으로 여과하고, H2O(20 ㎖ × 3)로 세척하였으며, 여기서 여액이 너무 진하면 여과 전에 탈색을 위해 활성탄을 첨가할 수 있다. 여액에 농축된 염산(12 N, 40 ㎖)을 첨가하여 중화하고, 반응액을 추가로 산성으로 조절하였다. 여액을 약 50 ㎖로 농축시켰다. 고체를 여과하고 냉수로 1회 세척하였다. 여액을 농축시켜 고체를 생성하였다. 고체를 여과하고 냉수로 1회 세척하였다. 모든 고체를 합하고 건조시켰다(백색 고체, 중량: 8.6 g, 수율: 82%, MS ES+(m/z): 202.9 [(M+H)+]).
단계 3:
Figure pct00122
SO2를 포화될 때까지 페닐아르센산(8.0 g, 40 mmol, 1.0 당량), 메탄올(40 ㎖), 농축된 염산(15 ㎖) 및 KI(촉매량, 50 ㎎)의 혼합물에 통과시키고 생성된 혼합물을 실온에서 2h 동안 교반하였다. 용액이 투명해질 때까지 NaOH 용액(2N)을 혼합물에 첨가하였다. 그 다음, 중화를 위해 농축된 염산을 첨가하였다. 백색 고체가 침전되었으며, 이를 여과하고, 수/에탄올(1/5)로 재결정화하고 건조시켰다(중량: 4.0 g, 수율: 60%, 백색 분말 고체, 1H NMR (δ, CDCl3): 7.41-7.62 (m, 3H), 7.75-7.78 (m, 2H). MS ES+ (m/z): 168.8 [(M+H)+]).
2.2 PAO의 물리화학적 성질
PAO의 분자식은 C6H5AsO이고 분자량은 168.03이다.
2.2.1 장비
Agilent1260Prime 고성능 액체 크로마토그래프, Mettler Toledo XS105 저울(0.01 ㎎), KQ5200B 초음파 기기(Kunshan Ultrasonic Instruments Co., Ltd.), BR2000-GM 가변 속도 진동자(VWR International) 및 0.45-㎛ 필터 멤브레인(Shanghai Qingyang Biotechnology Co., Ltd.).
2.2.2 실험 약물
PAO(순도: 98%), 아세토니트릴(크로마토그래피 순수, Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.), 및 염산 및 DMSO(분석적으로 순수, Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.).
2.2.3 용액 제조
0.1 M 염산 용액 2 ㎖를 취하여 탈이온수로 20 ㎖로 희석하여 0.01 M 염산 용액을 수득하고, 정밀 pH 시험지로 pH를 2로 측정하였다.
0.01 M 염산 용액 2 ㎖를 취하고 탈이온수로 20 ㎖로 희석하여 0.001 M 염산 용액을 수득하였다.
0.001 M 염산 용액 2 ㎖를 취하여 탈이온수로 20 ㎖로 희석하여 0.0001 M 염산 용액을 수득하고, 정밀 pH 시험지를 이용하여 용액의 pH를 4로 측정하였다.
20 ㎖의 탈이온수를 취하고, pH를 6으로 측정하였다.
7.5 ㎎의 PAO를 원심분리기 튜브에 넣은 다음 1 ㎖의 DMSO를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 초음파 진동시켜 용해시키고 아세토니트릴/수(1/1) 혼합 액체로 10 ㎖로 희석하여 0.75 ㎎/㎖ PAO 저장 용액을 수득하였다. PAO 저장 용액을 상이한 PAO 작업 용액(0.3 ㎎/㎖, 0.15 ㎎/㎖, 0.075 ㎎/㎖, 0.03 ㎎/㎖ 및 0.015 ㎎/㎖)으로 희석하였다.
2.2.4 크로마토그래피 조건
액체 크로마토그래프: Agilent 1260 Infinity II Prime 초고압 액체 크로마토그래피 시스템.
크로마토그래피 컬럼: ACQUITY UPLC® Peptide C18130Å 2.1 * 100 mm ID, 1.7 ㎛(Waters).
이동상 A: 수: 0.01% AA 및 2 mmol/L NH4OAc를 포함하는 ACN(v:v, 95:5) 용액.
이동상 B: 수: 0.01% AA 및 2 mmol/L NH4OAc를 포함하는 ACN(v:v, 5:95) 용액.
용출 구배:
시간(min) 유량(㎖/분) A(%) B(%)
초기 0.400 95 5
2.00 0.400 2 98
3.00 0.400 2 98
3.20 0.400 95 5
4.00 0.400 95 5
컬럼 온도: 40℃
공급 부피: 4 ㎕
검출 파장: 254 ㎚
2.2.5 방법론적 조사
선형 관계의 조사
상이한 PAO 용액(0.75 ㎎/㎖, 0.3 ㎎/㎖, 0.15 ㎎/㎖, 0.075 ㎎/㎖, 0.03 ㎎/㎖ 및 0.015 ㎎/㎖)을 취하여 상기 크로마토그래피 조건에 따라 측정하고 크로마토그램을 기록하였다. 샘플 농도에 대한 피크 면적의 선형 회귀를 수행하여 회귀 방정식을 얻었다:
y = 1834.8x - 4.2355 R2 = 1
결과는 PAO 샘플 농도가 0.015-0.75 ㎎·㎖-1 범위에 있었고 피크 면적과 양호한 선형 관계를 가지고 있음을 보여주었다.
2.2.6 평형 용해도의 측정
상이한 pH 완충 용액을 3-㎖ 원심분리기 튜브에 피펫팅하였다(각각 2 ㎖). 과량의 PAO 분말을 첨가하였다. 용액에 다량의 백색 불용성 침전물이 나타날 때까지, 생성 혼합물을 30분간 초음파 처리하고 항온식 진동자에 넣고 25℃에서 24h 동안 흔든 다음 30분간 더 초음파 처리하고 0.45-㎛ 필터 멤브레인으로 여과하였다. 후속 여액을 피펫팅하고 물로 10배 희석하고 상기 크로마토그래피 조건에 따라 측정하고 크로마토그램을 기록하였다. 상이한 pH 완충액에 대한 PAO의 용해도는 각각 1.15 ㎎/㎖, 3.38 ㎎/㎖ 및 4.52 ㎎/㎖로 계산되었다.
PAO의 용해도
약물 pH 피크 면적 상응하는 용해도(㎎/㎖)
PAO 6 207.25 1.15
PAO 4 616.40 3.38
PAO 2 824.35 4.52
3. 중수소화 화합물 d1PAO, d2PAO 및 d3PAO의 합성 및 물리화학적 특성
3.1 d1PAO의 제조
Figure pct00123
질소하에서 파라브로모아닐린(3.44 g)을 중수소메탄올(5 ㎖)에 용해시키고, 반응 혼합물을 30분간 환류시키고, 3회 회전-건조시키고, 이어서 사용을 위해 제습하였다. 중수소화 메탄올(10 ㎖)에 금속성 나트륨 3 g을 배치로 첨가하고, 반응이 완료된 후 중수(30 ㎖)를 천천히 첨가하여 중수 중 산화중수소화 나트륨의 10% 용액을 수득하였다. 질소하에, 단계 1의 생성물을 중수소화 메탄올(5 ㎖)에 용해시켰다. 아연 분말(6.5 g) 및 상기 제조된 중수 중 산화중수소화 나트륨의 10% 용액을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 3h 동안 가열 환류시키고, TLC에 의해 검출된 바와 같이 파라브로모아닐린이 소실된 후 실온으로 냉각시키고, 에테르로 추출하고, 저온에서 회전 건조시켜 생성물, p-중수소화 아닐린을 수득하였다.
Figure pct00124
자기 교반 막대가 있는 둥근 바닥 플라스크에, 이전 단계에서 얻은 p-중수소화 아닐린(0.94 g) 및 수(5 ㎖)를 첨가하고 0-5℃로 냉각시켰다. 이 온도에서 37% 염산 수용액(2 ㎖)을 천천히 가하고 혼합물을 수 5㎖로 희석하였다. 생성된 용액을 교반하고 추가로 30분 동안 반응시켰다. 이어서, 반응액에 NaNO2 수용액(724.5 ㎎, 10.5 mmol, H2O 3 ㎖)을 0-5℃에서 30-40분 이내에 천천히 첨가하여 갈색을 띤 노란색 용액을 수득하였다. 갈색을 띤 노란색 용액을 교반하고 저온에서 추가로 2h 동안 반응시켰다. Na2CO3(4.0 g, 38.0 mmol, 3.8 eq.), As2O3(1.0 g, 5.0 mmol, 0.5 eq.), CuSO4·5H2O(150 ㎎, 0.6 mmol, 0.06 eq.) 및 H2O(13 ㎖)를 또 다른 둥근 바닥 반응 플라스크에 적가하였다. 혼합물을 95℃에서 45분 동안 반응시켜 녹색 용액을 수득하였다. 녹색 용액을 0-5℃로 냉각시켰다. 단계 1에서 제조된 아조 하이드로클로라이드를 단계 2의 반응액에 천천히 적가하고, 반응 시스템의 온도를 5℃ 아래로 조절하였다. 적가 도중 기포가 발생하면 소량의 아세톤을 첨가하여 기포를 제거하였다. 기포가 사라지면 적가를 계속하였다. 1h 이내에 적가를 완료한 후, 자연스럽게 온도를 상승시켰다. 생성된 생성물을 밤새 교반하고 규조암으로 여과하고 필터 케이크를 빙수(2 ㎖ × 2)로 헹구었다. 수성상을 50℃에서 감압 하에 10 ㎖로 농축시켰다. 빙수욕에서 4 ㎖의 6 N HCl을 적가하여 pH를 7-8로 조절하였으며, 소량의 황갈색 고체가 나타났다. 흡입 여과 후, 고체를 빙수 2 ㎖로 세척 후 버렸다. 여액에 6 N HCl 2.5 ㎖를 적가하여 pH를 2-3으로 조절하였으며, 기포가 많이 나타났다. 여액을 감압하에 농축시켰다. 시스템에 다량의 고체가 나타나면 온도를 낮추고 흡입 여과하고, 이어서 고체를 수집하였다. 생성된 여액에 6 N HCl을 첨가하여 pH를 1로 조절한 후 회전 증발시켰다. 시스템에 다량의 고체가 나타나면 온도를 낮추고 흡입 여과를 수행하였다. 모액(mother liquor)을 2회 세척하고, 고체를 수집하였다. 순수한 고체 p-중수소화 페닐아르손산 900 ㎎을 수득하였다(수율: 44%, 1H NMR (δ, DMSO-d6): 7.60 (d, 2H), 7.53 (d, 2H)).
Figure pct00125
P-중수소화 페닐아르손산(880 ㎎, 4.3 mmol, 1.0 eq.), KI(16.6 ㎎, 0.1 mmol, 0.023 eq.), 37% HCl(1.7 ㎖, 20.0 mmol, 4.6 eq.) 및 메탄올(5.8 ㎖)을 25-㎖ 3목 플라스크에 순차적으로 첨가하고 실온에서 5-10분 동안 교반하였다. SO2를 계속 통과시키고 3h 동안 반응시켰다. TLC는 반응이 완료되었음을 보였다. 반응액을 흡입 여과하고, 메탄올(1.5 ㎖×2)로 세척하였다. 빙수욕에서 생성된 액체에 15% NaOH 용액을 적가하여 pH를 14로 조절하였으며, 시스템은 오렌지색의 탁한 액체로 보였다. 혼합물을 에틸 아세테이트(50 ㎖ × 2)로 추출하였다. 유기상을 합하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고 저온(20℃-28℃)에서 회전 건조시켜 조 생성물을 수득하였다. 조 생성물에 약 4 ㎖의 디에틸 에테르를 첨가하고, 혼합물을 약 30분 동안 펄프화하고, 여과하고, 제습하여 회백색 고체로서 약 430 ㎎의 d1PAO를 수득하였다(1H NMR (δ, DMSO-d6): 7.70 (d, 2H), 7.46 (d, 2H), MS ES+ (m/z): 169.9 [(M+H)+], 수율: 약 59%).
3.2 d2PAO의 제조
Figure pct00126
농축된 염산(5 ㎖)을 디에틸 에테르 중 o-브로모아닐린(3.44 g)의 용액에 적가하여 고체를 수득하였다. 샌드코어 깔때기로 흡입여과하고 디에틸에테르로 세척하고 제습하여 아닐린 하이드로클로라이드를 수득하였다. 질소하에서 고체를 밀봉된 튜브 중의 중수(7 ㎖)에 용해시키고 120℃로 가열하고 24h 동안 반응시켰다. 중수를 회전-건조시키고 질소를 교체하였다. 다시 중수(7 ㎖)를 넣고 48h 동안 반응시켰다. 반응물을 실온으로 냉각시키고, 30% 수산화나트륨을 사용하여 pH를 7로 조절하였다. 혼합물을 디에틸 에테르로 추출하고, 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 회전 건조시켜 2-브로모-4,6-이중수소-아닐린을 수득하였다. 질소 하에, 메탄올 22 ㎖를 2-브로모-4,6-이중수소-아닐린 및 10% Pd/C(300 ㎎)의 혼합물에 첨가하였다. 질소를 수소로 교체하고 3h 동안 반응시켰다. TLC에서 2-브로모-4,6-이중수소-아닐린이 소실된 것으로 나타났을 때, 생성된 반응액을 규조암으로 여과하고, 소량의 메탄올로 세척하고 직접 회전 건조시켜 2,4-이중수소-아닐린 하이드로브로마이드를 수득하였다.
Figure pct00127
이전 단계에서 얻은 2,4-이중수소-아닐린 하이드로브로마이드 및 수(5 ㎖)를 자기 교반 막대가 있는 25 ㎖ 둥근 바닥 플라스크에 첨가하고 0-5℃로 냉각시켰다. 이 온도에서 37% 염산 수용액(1.1 ㎖)을 천천히 가하고 혼합물을 수 5㎖로 희석하였다. 생성된 용액을 교반하고 추가로 30분 동안 반응시켰다. 이어서, 반응액에 NaNO2 수용액(724.5 ㎎, 10.5 mmol, 3 ㎖ H2O)을 0-5℃에서 30-40분 이내에 천천히 첨가하여 갈색을 띤 노란색 용액을 수득하였다. 갈색을 띤 노란색 용액을 교반하고 저온에서 추가로 2h 동안 반응시켰다. Na2CO3(4.0 g, 38.0 mmol, 3.8 eq.), As2O3(1.0 g, 5.0 mmol, 0.5 eq.), CuSO4·5H2O(150 ㎎, 0.6 mmol, 0.06 eq.) 및 H2O(13 ㎖)를 50-㎖ 둥근 바닥 반응 플라스크에 적가하였다. 혼합물을 95℃에서 45분 동안 반응시켜 녹색 용액을 수득하였다. 녹색 용액을 0-5℃로 냉각시켰다. 단계 1에서 제조된 아조 하이드로클로라이드를 단계 2의 반응액에 천천히 적가하고, 반응 시스템의 온도를 5℃ 아래로 조절하였다. 적가하는 동안 기포가 발생하면 소량의 아세톤을 첨가하여 기포를 제거하였다. 기포가 사라지면 적가를 계속하였다. 1h 이내에 적가를 완료한 후, 자연스럽게 온도를 상승시켰다. 생성된 생성물을 밤새 교반하고 규조암으로 여과하고 필터 케이크를 빙수(2 ㎖ × 2)로 세정하였다. 수성상을 50℃에서 감압 하에 10 ㎖로 농축시켰다. 빙수욕에서 4 ㎖의 6 N HCl을 적가하여 pH를 7-8로 조절하였으며, 소량의 황갈색 고체가 나타났다. 흡입 여과 후, 고체를 빙수 2 ㎖로 세척하고 버렸다. 2 ㎖의 6 N HCl을 여액에 적가하여 pH를 3-4로 조절하였으며, 점성 고체가 나타났다. 흡입 여과를 수행하고, 고체(NMR은 이 고체가 생성물을 함유하지 않음을 나타내었다)를 버렸다. 생성된 여액을 8 ㎖로 농축시키고, 6 N HCl(0.5 ㎖)을 첨가하여 pH를 2-3으로 조절하였으며, 다량의 고체가 나타났다. 흡입 여과하여 2,4-이중수소-페닐아르손산 1.15 g을 고체로서 수득하였다(수율: 56.4%, 1H NMR (δ, DMSO-d6): 7.72 (d, 1H), 7.56-7.59 (m, 2H)).
Figure pct00128
2,4-이중수소-페닐아르손산(1.1 g, 5.4 mmol, 1.0 당량), KI(20.6 ㎎, 0.124 mmol, 0.023 당량), 37% HCl(2.1 ㎖, 25.0 mmol, 4.6당량) 및 MeOH(7.3 ㎖)를 25 ㎖ 3목 플라스크에 순차적으로 첨가하고 실온에서 5-10분 동안 교반하였다. SO2를 계속 통과시키고 3h 동안 반응시켰다. TLC는 반응이 완료되었음을 보였다. 빙수욕에 15% NaOH 용액을 적가하여 pH를 7로 조절하였으며, 시스템에 다량의 불용성 물질이 나타났다. 혼합물을 에틸 아세테이트(50 ㎖ × 2)로 추출하였다. 유기상을 합하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고 저온(20℃-28℃)에서 회전 건조시켜 조 생성물을 수득하였다. 조 생성물에 약 3 ㎖의 에틸 아세테이트를 첨가하고, 혼합물을 약 30분 동안 펄프화하고, 여과하고, 제습하여 회백색 고체로서 약 400 ㎎의 d2PAO를 수득하였다(1H NMR (δ, DMSO-d6): 7.58 (d, 1H), 7.36-7.39 (m, 2H). MS ES+ (m/z): 170.7 [(M+H)+], 수율: 약 48%).
3.3 d3PAO의 제조
Figure pct00129
아닐린 용액(아닐린 2.65 g, 중수 7 ㎖)에 농축된 염산(5 ㎖)을 적가하여 고체를 수득하였다. 샌드코어 깔때기를 이용하여 흡입 여과하고, 혼합물을 디에틸에테르로 세척하고 제습하여 아닐린 하이드로클로라이드를 수득하고, 이를 다음 단계에서 바로 사용하였다. 질소하에서 고체를 밀봉된 튜브 중의 중수(7 ㎖)에 용해시키고 120℃로 가열하고 24h 동안 반응시켰다. 중수를 회전-건조시키고, 질소를 교체하였다. 다시 중수(7 ㎖)를 넣고 48h 동안 반응시켜 중수 중의 2,4,6-삼중수소-아닐린 용액을 수득하였으며, 이를 바로 다음 단계에 사용하였다.
Figure pct00130
중수 및 수(2.5 ㎖) 중 2,4,6-삼중수소-아닐린의 용액(4.33 ㎖)을 자기 교반 막대가 있는 25 ㎖ 둥근 바닥 플라스크에 첨가하고 0-5℃로 냉각시켰다. 이 온도에서 37% 염산 수용액(1.1 ㎖)을 천천히 가하고 혼합물을 수 5㎖로 희석하였다. 생성된 용액을 교반하고 추가로 30분 동안 반응시켰다. 이어서, 반응액에 NaNO2 수용액(724.5 ㎎, 10.5 mmol, H2O 3 ㎖)을 0-5℃에서 30-40분 이내에 천천히 첨가하여 보라색에서 노란색으로 변한 용액을 수득하였다. 이어서, 황색 용액을 교반하고 저온에서 추가로 2h 동안 반응시켰다. Na2CO3(4.0 g, 38.0 mmol, 3.8 eq.), As2O3(1.0 g, 5.0 mmol, 0.5 eq.), CuSO4·5H2O(150 ㎎, 0.6 mmol, 0.06 eq.) 및 H2O(13 ㎖)를 50-㎖ 둥근 바닥 반응 플라스크에 적가하였다. 혼합물을 95℃에서 45분 동안 반응시켜 녹색 용액을 수득하였다. 녹색 용액을 0-5℃로 냉각시켰다. 단계 1에서 제조된 아조 하이드로클로라이드를 단계 2의 반응액에 천천히 적가하고, 반응 시스템의 온도를 5℃ 아래로 조절하였다. 적가하는 동안 기포가 발생하면 소량의 아세톤을 첨가하여 기포를 제거하였다. 기포가 사라지면 적가를 계속하였다. 1h 이내에 적가를 완료한 후, 자연스럽게 온도를 상승시켰다. 생성된 생성물을 밤새 교반하고 규조암으로 여과하고 필터 케이크를 빙수(2 ㎖ × 2)로 세정하였다. 수성상을 50℃에서 감압 하에 10㎖로 농축시켰다. 빙수욕에서 6 N HCl 1.8 ㎖를 적가하여 pH를 7-8로 조절하였고, 소량의 황갈색 고체가 나타났다. 흡입 여과 후, 고체를 빙수 2 ㎖로 세척하고 버렸다. 1.8 ㎖의 6 N HCl을 여액에 적가하여 pH를 3으로 조절하였으며, 희미한 황색 고체가 나타났다. 흡입 여과 후, 고체를 빙수 2 ㎖로 세척하여 수집하였다. 생성된 여액을 8 ㎖로 농축시키고, 0.8 ㎖의 6 N HCl을 첨가하여 pH를 1로 조절하였으며, 다량의 고체가 나타났다. 흡입 여과를 수행하고, 고체를 수집하여 고체로서 총 860 ㎎의 2,4,6-삼중수소-페닐아르손산을 수득하였다(수율: 39%, 1H NMR(δ, DMSO-d6): 7.56(s,2H)).
Figure pct00131
2,4,6-삼중수소-페닐아르손산(3.9 mmol, 1.0 당량), KI(15 ㎎, 0.09 mmol, 0.023 당량), 37% HCl(1.3 ㎖, 18.0 mmol, 4.6 당량) 및 메탄올(5.3 ㎖)을 25 ㎖ 3목 플라스크에 순차적으로 첨가하고 실온에서 5-10분 동안 교반하였다. SO2를 계속 통과시키고 3h 동안 반응시켰다. TLC는 반응이 완료되었음을 보였다. 반응액을 흡입 여과하고, 메탄올(1.5 ㎖×2)로 세척하였다. 빙수욕에 17% NaOH 용액 4.3 ㎖를 적가하여 pH를 7로 조절하였으며, 이때 플라스크 벽에 노란색 유성 물질이 나타났다. 혼합물을 에틸 아세테이트(25 ㎖ × 2)로 추출하였다. 유기상을 합하고, 무수 NaSO4로 건조시키고, 여과하고, 저온(20℃-28℃)에서 회전 건조시켰다. 수득된 고체에 에틸 아세테이트 약 3 ㎖를 가하고 혼합물을 약 30분간 펄프화하고, 여과 및 제습하여 회백색 고체로서 d3PAO 약 200 ㎎을 수득하였다. 이전 단계에서 수득된 모액을 회전-건조시키고, 수득된 고체에 Et2O 약 1.5㎖를 첨가하고 혼합물을 약 30분간 펄프화하고, 여과 및 제습하여 약 170 ㎎의 d3PAO를 회백색 고체로서 수득하였다. d3PAO를 합하였다(수율: 약 55%, 1H NMR (δ, DMSO-d6): 7.46 (s, 2H). MS ES+ (m/z): 171.9 [(M+H)+]).
실시예 2. d5PAO 및 PAO의 약동학 연구
d5PAO(d5-PAO)를 실시예 1에 기재된 방법으로 제조하였으며, PAO는 자사에서 제조하였다. 성체 수컷 래트 대상체에게 PAO 및 d5PAO의 단일 용량 정맥 주사(용량은 0.1 ㎎/㎏이고 화합물은 0.1% DMSO에 용해됨) 또는 단일 용량 경구 위관영양(용량은 0.2 ㎎/㎏이다)을 제공한 후, 약동학 시험을 위해 투여 후 0, 0.083, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 24, 32 및 48h째에 정맥혈을 채취하였다. 시험 샘플 중의 PAO 및 d5PAO를 단백질 침전에 의해 추출하였다. 처리된 샘플을 액체 크로마토그래피-질량 분석기/질량 분석기(LC-MS/MS)에 로딩하고 액상 분리 후 ESI 음이온 모드에서 검출하였다.
샘플 처리(혈액 샘플):
1) 40 ㎕의 미지 샘플, 보정 표준, 품질 관리 샘플, 단일 블랭크 샘플 및 이중 블랭크 샘플을 96-웰 플레이트에 첨가하였다;
2) 수 중의 0.1 ㎎/㎖ 나트륨 디머캅토설포네이트 120 ㎕를 각 샘플에 첨가하였다;
3) 수 중의 0.2% 포름산 40 ㎕를 각 샘플에 첨가하고; 생성된 혼합물을 균일하게 혼합한 다음, 45℃에서 15분 동안 진탕하면서 배양하고 4℃에서 5분 동안 원심분리시켰다(x3220 g);
4) 각 샘플(이중 블랭크 샘플 제외)을 200 ㎕의 IS1으로 급냉시키고(이중 블랭크 샘플은 240 ㎕의 MeOH로 급냉되었다), 15분 동안 진탕 및 혼합한 다음 4℃에서 15분 동안 원심분리시켰다(×3220 g);
5) 50 ㎕의 상등액을 96웰 플레이트로 옮기고 4℃에서 5분 동안 원심분리(x3220 g)시킨 다음 3중 Quad6500 + LC-MS/MS(SCIEX) 시스템을 통해 LC-MS/MS로 분석하였다.
실험 결과:
단일 용량 정맥 주사(0.1 ㎎/㎏) 또는 단일 용량 경구 위관영양(0.2 ㎎/㎏)을 통해 수컷 SD 래트(n = 3)에 투여된 동일한 용량에서의 PAO 및 d5PAO의 약동학 지수에서 유의한 차이가 관찰되지 않았다(표 3, 표 4 및 도 1 및 2 참조). 0.1 ㎎/㎏ 위관영양 그룹의 생체이용률은 15.7%였다.
단일 용량 정맥 주사(0.1 ㎎/㎏)를 통해 수컷 SD 래트에게 투여된 동일한 용량에서의 PAO 및 d5PAO의 약동학 지수
PAO (IV, 0.1 ㎎/㎏) d5PAO (IV, 0.1 ㎎/㎏)
PK 매개변수 평균 ± SD 평균 ± SD
T1/2에 사용된 포인트 No. 3.00 3.00
C0 (ng/㎖) 1344.67 ± 210.97 1487.67 ± 141.76
T1/2 (h) 11.4 ± 0.03 12.43 ± 0.65
Vdss (L/㎏) 0.16 ± 0.02 0.155 ± 0.02
Cl (㎖/min/㎏) 0.41 ± 0.03 0.38 ± 0.02
Tlast (h) 48.0 48.000
AUC0-last (ng.h/㎖) 4010 ± 252.82 4337 ± 280.63
AUC0-inf (ng.h/㎖) 4061.67 ± 258.10 4404.33 ± 275.54
MRT0-last (h) 5.84 ± 0.44 5.87 ± 0.049
MRT0-inf(h) 6.58 ± 0.45 6.79 ± 0.65
AUCExtra(%) 1.267 ± 0.05 1.54 ± 0.27
AUMCExtra(%) 12.47 ± 0.67 14.87 ± 1.46
단일 용량 경구 위관영양(0.2 ㎎/㎏)을 통해 수컷 SD 래트에게 투여된 PAO 및 d5PAO의 약동학 지수
PAO (PO, 0.2 ㎎/㎏) d5PAO (PO, 0.2 ㎎/㎏)
PK 매개변수 평균 ± SD 평균 ± SD
T1/2에 사용된 포인트 No. 3.00 3.00
Cmax (ng/㎖) 156 ± 12.53 161 ± 12.5
Tmax (h) 8.00 ± 0.00 7.33 ± 1.15
T1/2 (h) 6.87 ± 0.94 7.19 ± 0.78
Tlast (h) 48.00 48.00
AUC0-last (ng.h/㎖) 2313.67 ± 419.51 244.5.00 ± 474.53
AUC0-inf (ng.h/㎖) 2341 ± 425.87 2478.67 ± 483.09
MRT0-last (h) 12.53 ± 0.61 12.63 ± 0.78
MRT0-inf(h) 13.03 ± 0.75 13.27 ± 0.9
AUCExtra(%) 1.16 ± 0.47 1.35 ± 0.44
AUMCExtra(%) 5.09 ± 1.99 5.92 ± 1.8
생체이용률 (%)a 28.82 28.14
실시예 3. d5PAO 및 PAO의 세포 생존력 및 약력학에 대한 효과의 비교
세포 배양 및 약물 투여: SH-SY5Y의 완전한 배양 시스템은 15% FBS(Gibco)가 보충된 고-글루코스 DMEM(Gibco)이었다. 플라스미드를 Fugene HD 형질감염 시약(Promega, Beijing Biotech Co., Ltd. Catalog No. E2311)으로 형질감염시켰다. 플라스미드를 Obio Technology(Shanghai Corp., Ltd.)에서 구입하였으며, 벡터 지도를 도 3에 나타내었다. α-시누클레인 과발현 플라스미드는 하기의 서열을 갖는다:
Figure pct00132
안정하게-형질전환된 APP(SW) HEK293 세포주는 스웨덴 이중 돌연변이 APP695 cDNA로 형질감염된 인간 배아 신장 세포주였다. 세포를 시딩하기 전에, 플레이트를 24h 동안 20 ㎍/㎖ 폴리-D-리신(PDL)으로 처리하였다. 배양액은 10% FBS가 첨가된 고-글루코스 DMEM이었으며, 선별을 위해 200 ㎍/㎖ G418을 첨가하였다. 세포를 플레이트에 48h 동안 시딩한 후 기아(starvation)를 수행하였다, 즉 혈청을 제거하고 고-글루코스 DMEM 배지만을 사용하였다. 배양 24h 후 완전한 배양 시스템을 사용하여 대체하고 약물을 투여하였다.
세포 생존력을 티아졸릴 블루(MTT) 분석에 의해 검출하였다.
투여 12h 후에, 최종 농도가 0.5 ㎎/㎖인 MTT를 첨가하고, 혼합물을 4h 동안 배양한 후, 배양 용액을 피펫팅하였다. DMSO 100 ㎕를 첨가하여 흡착된 MTT를 용해시키고, 잔류물을 15분 동안 진탕시키고, 이어서 흡광도 값을 판독하였다.
ELISA
a) α-시누클레인 ELISA용 α-시누클레인 단클론 항체(마우스 단클론)를 Sigma-Aldrich(Shanghai, Catalog No. S5566)에서 구입하고; α-시누클레인 ELISA 키트를 Thermo Fisher Scientific(카탈로그 번호 KHB0061)에서 구입하였다. 50 ㎕의 Huα-시누클레인 검출 항체 용액을 각 웰(비어 있는 발색체 블랭크, 즉 발색체 블랭크 웰 제외)에 첨가하고, 50 ㎕의 샘플 및 표준 곡선 샘플(표준 곡선 샘플의 제조에 대해 도 4 참조)을 각 웰(비어 있는 발색체 블랭크 제외)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 부드럽게 흔들어 균일하게 혼합하였다. 플레이트를 필름으로 덮고 4℃에서 밤새 배양하였다. 웰을 100 ㎕의 1X 세척 완충액으로 4회 충분히 세척하고, 100 ㎕의 항-토끼 IgG HRP를, 발색체 블랭크 웰을 제외하고, 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 필름으로 덮고 실온에서 30분 동안 배양하고, 이어서 1X 세척 완충액으로 4회 충분히 세척하였다. 100 ㎕의 안정화된 발색체를 각 웰에 첨가하였다. 용액이 청색으로 변하였으며 이어서 이를 암실에서 실온에서 30분 동안 배양하였다. 100 ㎕의 정지액 각 웰에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 부드럽게 흔들어 균일하게 혼합하였다. 용액이 황색으로 변하였으며, NovoStar 마이크로플레이트 판독기(BMG company, Germany)를 사용하여 450 ㎚의 흡수 파장에서 판독하였다.
b) Aβ ELISA
아밀로이드 베타42휴먼 ELISA 키트를 Thermo Fisher Scientific(카탈로그 번호 KHB3544)에서 구입하였다. 100 ㎕의 희석된 표준 곡선 샘플, 100 ㎕의 블랭크 대조군 및 100 ㎕의 샘플을 분석 플레이트의 해당 웰에 첨가하였다. 플레이트를 필름으로 덮고 37℃에서 2h 동안 배양하였다. 각 웰의 액체를 버리고, 이어서 100 ㎕의 검출 시약 A 작업 용액을 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 필름으로 덮고 37℃에서 1h 동안 배양하였다. 상등액을 버렸다. 그런 다음, 각 웰을 1x 세척 완충액으로 3회, 매회 2분 세척하여 액체 잔류물을 가능한 한 적게 유지하였다. 100 ㎕의 검출 시약 B 작업 용액을 각 웰에 첨가하고 플레이트를 필름으로 덮고 37℃에서 1h 동안 배양하였다. 세척을 5회 반복하였다. 각 웰에 기질 용액 90 ㎕를 첨가하고 플레이트를 필름으로 덮고 암실에서 37℃에서 20분 동안 배양하였다. 용액이 청색으로 변하였다. 50 ㎕의 정지액을 각 웰에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 부드럽게 흔들고 균일하게 혼합하였다. 용액이 황색으로 변하였으며 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 450 ㎚의 흡수 파장에서 가능한 빨리 판독하였다.
프로피듐 요오다이드(PI) 염색
면역형광 염색 15분 전에 PI(Cell Signaling Technology, 카탈로그 번호 4087)를 첨가하였다. 혼합물을 세포 배양기에서 15분 동안 공-배양한 후 면역형광 염색하였다. PI/RNase 염색 용액의 가장 긴 여기 및 방출 파장은 각각 535 ㎚ 및 617 ㎚였다.
면역형광 염색
약물 등으로 처리한 세포로부터 상등액을 흡출하였다. 다음으로, 잔류물을 미리 냉각된 PBS로 3회 세척하고, 4% PFA로 처리하고, 실온에서 30분 동안 방치한 후, PB-S로 3회(매회 10분) 세척하였다. 트리톤-X를 PBS에 용해시켜 0.1% 트리톤-X 용액을 제조하고 15분간 처리하였다. 용액을 1h 동안 10% 당나귀 혈청으로 차단하였다. 1차 항체: 마우스 항-Ki67(Cell Signaling Technology, 카탈로그 번호 9129); 2차 항체: 항-마우스 Alex488.
통계 분석
데이터를 GraphPad Prism5 소프트웨어로 처리 및 분석하였다. 일원 ANOVA 및 평균 ± SEM이 수반되었으며, p < 0.03은 통계적 차이를 가리켰다.
실험 결과:
SH-sy5y 세포의 생존력에 대한 d5PAO 및 PAO의 효과
SH-sy5y 세포주의 완전한 배양 시스템은 15% FBS가 보충된 고-글루코스 DMEM이다. 세포독성 실험에서, SH-sy5y 세포를 48h 동안 배양하고 상이한 농도의 d5PAO와 PAO를 24h 동안 처리하였다. 최종 농도가 0.5 ㎎/㎖인 티아졸릴 블루(MTT)를 첨가하고 혼합물을 4h 동안 배양한 후 배양 용액을 피펫팅하였다. DMSO 100 ㎕를 첨가하여 흡착된 MTT를 용해시키고, 잔류물을 15분 동안 흔들고, 이어서 흡광도 값을 판독하였다. 결과는 6.25 nM, 25 nM, 50 nM, 100 nM 및 200 nM의 d5PAO가 SH-sy5y 세포의 증식을 유의하게 촉진한 반면, 200 nM의 PAO는 처리 24h 후에 독성을 나타내고 세포사를 야기함을 보여주었다. SH-sy5y 세포에 대한 상이한 농도의 d5PAO 및 PAO의 독성 효과를 추가로 검출하기 위해, SH-sy5y 세포의 아팝토시스/세포사 및 증식에 대한 d5PAO 및 PAO의 효과를 Ki67의 PI 염색 및 면역형광 염색에 의해 조사하였다. PI(프로피디움 요오다이드)는 DNA와 RNA 염기 및 염료 사이에 삽입될 수 있는 형광 염료로서, 살아있는 세포막을 통과할 수 없지만 손상된 세포막을 통과하여 세포자멸/죽은 세포의 핵을 염색할 수 있다. 그러나 Ki67은 세포 증식에 없어서는 안될 단백질이며 그 기능은 유사 분열과 밀접한 관련이 있다. 따라서 Ki67은 증식 주기에서 세포를 표시하는 데 종종 사용되며, 임상 적용에서는, 일반적으로 Ki67 양성률이 높은 세포 종양이 더 빨리 성장하는 것으로 간주된다. PI 염색 및 Ki67 염색을 상이한 농도의 d5PAO 및 PAO 처리 24h 후에 수행하였다. 결과는 50 nM 및 100 nM의 PAO 및 50 nM 및 100 nM의 d5PAO 모두 Ki67 양성비를 유의하게 증가시키지 않았으며, 대조군(ctrl)과 비교하여 PI 양성 세포가 감소하였고, 이는 d5PAO 및 PAO가 아팝토시스 또는 세포사를 감소시켰지만 세포 증식을 유의하게 촉진하지는 않았음을 가리킨다(도 5).
실시예 4. 안정하게-형질전환된 APP(SW) HEK293 세포의 생존력 및 Aβ 방출에 대한 d5PAO 및 PAO의 효과
안정하게-형질전환된 APP(SW) HEK293 세포주는, 스웨덴 이중 돌연변이 아밀로이드 전구체 단백질(APP) 695 cDNA로 형질감염되고 G418 선택 마커(marker)를 지닌 인간 배아 신장 세포주였다. 세포를 시딩하기 전에 플레이트를 24h 동안 20 ㎍/㎖ 폴리-D-리신(PDL)으로 처리하였다. 배양액은 10% FBS가 첨가된 고-글루코스 DMEM이었고, 선별을 위해 200 ㎍/㎖ G418을 첨가하였다. 48h 배양 후 상이한 농도의 d5PAO와 PAO를 첨가하고 24h 동안 처리하였다. 최종 농도가 0.5 ㎎/㎖인 티아졸릴 블루(MTT)를 첨가하고 혼합물을 4h 동안 배양한 후 배양 용액을 피펫팅하였다. DMSO 100 ㎕를 첨가하여 흡착된 MTT를 용해시키고 잔류물을 15분 동안 흔든 후 흡광도 값을 판독하였다.
APP(SW)HEK293 세포의 Aβ 방출에 대한 d5PAO 및 PAO의 효과를 검출하는 실험에서, 48h 배양 후에 24h 동안 기아시키고, 이어서 완전한 배양 시스템을 사용하여 교체하였다. 세포를 화합물 d5PAO 및 PAO로 4h 동안 처리하고, 세포 배양 용액의 상등액 중의 Aβ 수준을 ELISA로 검출하였다.
실험 결과:
안정하게-형질전환된 APP(SW) HEK293 세포를 25 nM, 50 nM, 100 nM 및 200 nM에서 d5PAO로 24h 동안 처리하였으며, 이는 대조군과 비교하여 세포 생존력의 유의한 증가로 이어졌다. 이전 연구에서는 PAO가 아밀로이드 β-단백질(Aβ) 및 기타 단백질의 방출을 촉진할 수 있음을 보여주었다. 안정하게-형질전환된 APP(SW) HEK293 세포의 상등액 중의 Aβ를 ELISA 키트로 검출한 결과, 25nM, 50nM 및 100nM에서 d5PAO 및 25nM, 50nM 및 100nM에서 PAO가 세포외 Aβ 함량을 유의하게 증가시키는 것으로 나타났다(도 6).
실시예 5. 안정하게-형질전환된 APP(SW) HEK293 세포의 Aβ 방출에 대한 다른 중수소화 화합물의 효과 비교
PAO의 3가지 중수소화 화합물인 d1PAO, d2PAO 및 d3PAO를 선택하였다. APP(SW) HEK293 세포의 배양 방법 및 투여 방법은 실시예 4와 동일하다. 참여 그룹: 대조군(ctrl), d5PAO50nM 처리 그룹, d5PAO100nM 처리 그룹, PAO50 nM 처리 그룹, PAO75nM 처리 그룹, d1PAO25nM 처리 그룹, d1PAO50 nM 처리 그룹, d1PAO75nM 처리 그룹, d2PAO25nM 처리 그룹, d2PAO50 nM 처리 그룹, d2PAO75nM 처리 그룹, d3PAO25nM 처리 그룹, d3PI0350 nM 처리 그룹 및 d3PAO75nM 처리 그룹. 결과는 대조군과 비교하여, 50 nM 및 75 nM d5PAO 처리 그룹, 50 nM 및 75 nM PAO 처리 그룹, 25 nM, 50 nM 및 75 nM d1PAO 처리 그룹, 25 nM, 50 nM 및 75 nM d2PAO 처리 그룹, 및 25 nM, 50 nM 및 75 nM d3PAO 처리 그룹 모두에서 세포외 Aβ 함량이 유의하게 증가함을 보였다. d5PAO50 nM 처리 그룹을 다른 그룹(대조군 제외)과 비교함으로써, 50 nM 및 75 nM PAO 처리 그룹, 25 nM, 50 nM 및 75 nM d1PAO 처리 그룹, 25 nM 및 75 nM d2PAO 처리 그룹 및 25 nM 및 75 nM d3PAO 처리 그룹은 세포 배양 상등액에서 Aβ 함량 측면에서 유의한 차이를 가졌다(도 7A 및 7B).
실시예 6. α-시누클레인 분비에 대한 d5PAO 및 PAO의 효과
SH-SY5Y 세포주를 Fugene HD 형질감염 시약을 사용하여 α-시누클레인 과발현(α-syn OE) 플라스미드로 형질감염시켰다. 기아 상태를 24h 동안 수행한 후 완전한 배양 시스템을 사용하여 교체하였다. 세포를 24h 동안 화합물 d5PAO 및 PAO로 처리하고, α-시누클레인 플라스미드로 형질감염된 SH-sy5y 세포의 생존력에 대한 d5PAO 및 PAO의 효과를 MTT에 의해 검출하였다. 결과는 α-시누클레인 과발현이 SH-sy5y 세포의 생존력을 유의하게 감소시켰고, 25 nM, 50 nM, 75 nM, 100 nM 및 200 nM에서 d5PAO 및 50 nM, 75 nM 및 100 nM에서 PAO가 α-시누클레인 과발현 그룹과 비교하여 α-시누클레인을 과발현하는 SH-sy5y 세포의 생존력을 유의하게 증가시켰음을 보여주었다. 세포 상등액 중의 α-시누클레인을 ELISA 키트로 검출하였다. 결과는 하기를 보여주었다: 50 nM d5PAO는 상등액에서 α-시누클레인 함량을 유의하게 증가시켰고, PAO 및 d5PAO는 α-시누클레인을 증가시키는 유사한 경향을 나타내었다(도 8).
실시예 7. 고셔병에 대한 d5PAO 및 PAO의 치료 효과
1. SH-SY5Y 세포의 CBE-유도 아팝토시스 또는 세포사에 대한 d5PAO 및 PAO의 억제 효과
콘듀리톨 베폭사이드(Conduritol Bepoxide)(CBE)는 리소좀 글루코세레브로시다제 GBA 유전자에 의해 암호화된(encoded) GBA1 효소의 억제제이며 통상적으로 고셔병(GD)의 세포 및 동물 모델을 구성하는 데 사용된다. SH-SY5Y 세포를 48h 동안 CBE로 처리하여 SH-SY5Y 세포의 세포 생존력을 농도 의존적으로 감소시켰다(도 9A). 후속 실험을 위해 100 μM의 CBE를 선택하였다. SH-SY5Y 세포를 24h 동안 100 μM의 CBE로 처리하고 24h 동안 상이한 그룹에 따라 특정 농도의 d5PAO 또는 PAO와 공-배양하였다. 세포 생존력을 MTT에 의해 검출하였다. 실험 결과에 따르면 100 μM CBE 처리 그룹과 비교하여, 100 μM CBE+25nM, 50nM 및 100nM d5PAO 공-처리 그룹과 100 μM CBE+25nM, 50nM 및 100 nM PAO 공-처리 그룹에서 세포 생존력이 유의하게 증가하였으며(도 9B 및 9C), 이는 d5PAO 또는 PAO가 SH-SY5Y 세포의 CBE-유도된 아팝토시스 또는 세포사에 대한 보호 효과가 있음을 가리킨다.
2. 리소좀 축적 감소 및 글루코실세라마이드(GlcCer) 유출 촉진에 대한 PAO의 효과
GD는 통상적인 유형의 리소좀 축적 질환이다. d5PAO와 PAO가 CBE-유도된 리소좀 축적을 완화시키는지의 여부를 리소좀 마커인 Lyso-추적자 red DND99에 의해 조사하였다. 실험 결과는 대조군(ctrl)과 비교하여 100 μM CBE 처리 그룹과 100 μM CBE Lyso-추적자에서 형광 강도가 증가함을 보여주었으며(도 10A 및 10B), 이는 CBE 처리가 SH-SY5Y 세포에서 리소좀 축적을 유도함을 나타낸다. 100 μM CBE 처리 그룹과 비교하여, 100 μM CBE+50nM 및 100 nM PAO 공-처리 그룹에서 Lyso-추적자의 형광 강도가 유의하게 감소하였다(도 10A 및 10B). GD의 근본적인 결함은 글루코세레브로시다제의 활성 결여에 있다. 그러나 이 효소는 주로 글루코세레브로사이드를 글루코스와 GlcCer로 분해하는 과정을 매개한다. 따라서 GlcCer와 같은 기질의 축적은 GD 환자 또는 CBE 처리된 세포에서 발생한다. PAO가 SH-SY5Y 세포 모델에서 GlcCer 축적에 영향을 미치는지 여부를 추가로 조사하기 위해, LC-MS로 세포 및 세포 배양 배지의 상등액에서 다양한 측쇄의 GlcCer 함량을 검출하였다. 검출 결과, 100 μM CBE 처리 그룹에서 세포 내 다양한 측쇄의 GlcCer 농도가 대조군(ctrl)보다 훨씬 높았고, 100 μM CBE+50nM PAO 공-처리 그룹에서 GlcCer 농도는 100 μM CBE 처리 그룹보다 낮았다(도 10C). 100 μM CBE 단독 처리는 세포 배양 배지의 상등액에서 GlcCer를 감소시킨 반면, 100 μM CBE + 50 nM PAO 공-처리 그룹은 GlcCer 농도를 증가시켰다(도 10D).
3. 리소좀 축적 감소 촉진에 대한 PI4Ka 녹다운의 효과
이전 연구에 따르면 낮은 농도(<5 μM)의 PAO는 주로 포스파티딜이노시톨 4 키나제(PI4KIIIα)에 작용하는 것으로 나타났다. 섬유증 동안 표적 스폿 PI4KIIIα에 대한 PAO의 효과를 추가로 조사하기 위해서, shRNA 간섭 렌티바이러스 벡터(녹색 형광 단백질 GFP 발현 서열 포함)를, PI4KIIIα 단백질을 암호화하는 유전자 서열 PI4Ka에 대해 설계하였다. 웨스턴 블롯 결과는 SH-SY5Y 세포를 48h 동안 PI4Ka를 표적화하는 3개의 shRNA 간섭 렌티바이러스 벡터로 형질감염시킨 후, 간섭 서열 sh1, sh2 및 sh3이 모두 처리 그룹에서 PI4KⅢα의 발현 수준을 유의하게 감소시켰다는 것을 보여주었다(도 11A 및 11B). 세포를 48h 동안 shRNA 간섭 렌티바이러스 벡터로 처리한 후, 면역형광 염색에 의해 Lyso-추적자의 형광 강도를 관찰하였다. sh-ctrl 그룹과 비교하여, sh-ctrl+100 μM CBE 공-처리 그룹에서 Lyso-추적자의 면역형광 강도가 유의하게 증가하였다. sh-ctrl+100 μM CBE 공-처리 그룹과 비교하여, sh1-PI4Ka+100 μM CBE 공-처리 그룹에서 Lyso-추적자의 면역형광 강도가 유의하게 감소하였다(도 11C). 상기 결과는 PI4Ka 녹다운이 리소좀 축적 감소를 촉진하였음을 가리켰다.
실시예 8. 폐 섬유증에 대한 d5PAO 및 PAO의 억제 효과
폐 섬유증(PF)은 다양한 인자에 의해 유발될 수 있는 만성 섬유성 폐 질환으로서, 주로 마른 기침과 진행성 호흡곤란으로 나타난다. 예후가 좋지 않고 여전히 치료가 어렵다. PF의 주요 병리학적 특징은 정상적인 폐 조직 구조가 파괴된 후 과도하게 흉터가 복구되고, 결국 호흡 부전으로 이어진다. 폐 섬유증의 병태생리학적 기전에 대한 연구는 큰 진전을 이루었지만 그 병인은 아직 완전히 밝혀지지 않았고 효과적인 치료제도 임상적으로 부족한 실정이다.
인간 태아 폐 섬유아세포, 즉 MRC-5 세포는 PF 및 약물 개발의 병리학적 변화를 연구하기 위한 중요한 세포 도구이다. PF가 발달하는 동안, 형질전환 성장 인자-1(TGF-β1)과 같은 관련 전사 인자가 섬유아세포의 비정상적인 활성화, 증식 및 이동을 조절하여 세포외 기질(ECM)의 비정상적인 침착 및 폐포 구조의 파괴를 초래할 수 있고, 결국 PF의 형성으로 이어진다. PF 유도의 핵심 인자 중 하나인 TGF-β1은 해당 수용체에 결합하여 섬유아세포가 근섬유아세포로 형질전환되는 것을 조절할 수 있다. 따라서, MRC-5 세포를 대개는 섬유증의 발달을 촉진하기 위한 실험 과정에서 일정 농도의 TGF-β1으로 처리한다. d5PAO 및 PAO는 각각 옥소페닐아르신 및 이의 변이체이다. 예비 연구는 PAO가 PF를 억제할 가능성이 있음을 보여주었다.
실험 방법:
MRC-5 세포의 배양 및 처리
MRC-5 세포를 중국 과학 아카데미의 분자 세포 과학 우수 센터에서 구입하였다. 세포 배양 지침에 따라 세포를 10% 소 태아 혈청(FBS)을 포함하는 MEM(Gibco)에서 포화된 습도의 37℃, 5% CO2 항온 배양기에서 24h 동안 배양하여 벽에 부착시켰다. 다음날, 5 ng/㎖ TGF-β1(Proteintech Group, HZ-1011)을 첨가하고, 그룹에 따라 상이한 농도의 PAO 또는 d5PAO를 함유하는 MEM(Gibco)을 첨가하였다. 실험적 필요에 따라 세포를 추가로 24h 동안 배양하였다. 그룹은 하기와 같다: 대조군(ctrl), 5 ng/㎖ TGF-β1 그룹, 5 ng/㎖ TGF-β1+50nM d5PAO 공-처리 그룹(5 ng/㎖ TGF-β1+50nM d5PAO 그룹), 5 ng/㎖ TGF-β1+25nM d5PAO 공-처리 그룹(5 ng/㎖ TGF-β1+25nM d5PAO 그룹), 5 ng/㎖ TGF-β1+50nM PAO 공-처리 그룹(5 ng/㎖ TGF-β1+50nM PAO 그룹) 및 5 ng/㎖ TGF-β1+25nM PAO 공-처리 그룹(5 ng/㎖ TGF-β1+25nM PAO 그룹).
래트 중간엽 줄기세포의 1차 배양 및 처리
6주령의 스프래그-다우리(SD) 래트(Shanghai Slack Experimental Animal Co., Ltd.)를 클로랄 하이드레이트로 마취시키고, 75% 에탄올로 멸균하고, 슈퍼 클린 벤치에서 해부하여 경골과 대퇴골을 적출하였다. 경골과 대퇴골의 두 끝을 멸균 가위로 제거하여 골수강을 노출시켰다. 골수강을 10% FBS를 함유하는 5 ㎖의 MEM으로 플러싱(flushing)하였다. 골수를 포함하는 플러싱액을 배양 접시에 첨가하고, 70-㎛ 세포 여과기를 통해 여과하고, 2000 rpm에서 3분 동안 원심분리하였다. 상등액을 제거하고, 세포를 10% FBS를 함유하는 MEM에 재현탁시켰다. 세포를 플레이트에 시딩한 후, 플레이트를 6h 동안 포화된 습도의 37℃, 5% CO2 항온 배양기에서 배양하였다. 그 다음, 배지 교환을 통해 부착되지 않은 세포를 제거하였다. 80% 밀도로 성장했을 때, 세포를 2.5% 트립신으로 1분간 절단하고, 1:2의 비로 계대배양하였다. 면역형광 실험을 위한 중간엽 줄기세포를 24-웰 플레이트의 커버슬립상에서, 3000-5000 세포/웰로 시딩한다. 관찰한 바와 같이 세포 밀도가 70%에 도달하면, 상이한 농도의 PAO 또는 d5PAO를 함유하는 MEM(FBS 없음)을 그룹별로 첨가하였다. 다음으로, 플레이트를 24h 동안 포화된 습도의 37℃, 5% CO2 항온 배양기에서 배양하였다. 그룹은 다음과 같다: 대조군(ctrl), 50 nM d5PAO 처리 그룹, 25 nM d5PAO 처리 그룹, 50 nM PAO 처리 그룹 및 25 nM PAO 처리 그룹.
면역형광 염색
MRC-5 세포를 24h 동안 처리한 후, 상등액을 흡출하였다. 3회 세척을 위해 포스페이트 완충 염수(PBS)를 첨가하고, 4% 파라포름알데히드(PFA)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 30분 동안 방치하였다. 4% PFA를 버렸다. 그런 다음 PBS를 첨가하여 매회 10분씩 3회 세척하고 0.3% 비이온성 세제 트리톤-X(PBS 중의)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 30분 동안 방치하였다. 0.3% 트리톤-X를 흡출하였다. 10% 염소 혈청(GS)을 함유하는 PBS 차단 완충액을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 1h 동안 방치하였다. 1차 항체를 4℃에서 밤새 배양하였다(1차 항체를 1:200으로 10% GS 차단 완충액으로 희석하였으며, α-평활근 액틴(토끼 항-α-평활근 액틴, Cell Signaling Technology #19245), 및 칼포닌1 희석비는 1:100이었다).
다음날, PBS를 첨가하여 매회 10분씩 3회 세척하였다. 2차 항체 알렉사 플루오르555 염소-항-토끼 IgG(Molecular Probes)를 배양하고, 차단 완충액으로 1:500으로 희석하고, 1 ㎍/㎖ 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)을 첨가하였다). 생성된 혼합물을 실온에서 2h 동안 방치하였다. PBS를 첨가하여 매회 10분씩 3회 세척하였다. 봉입제를 사용하여 커버슬립을 슬라이드에 부착시킨 다음, 현미경으로 관찰하였다. 골수 중간엽 줄기세포(bone marrow mesenchymal stem cell)의 면역형광 염색 과정은 상기와 동일하였다.
웨스턴 블롯 실험:
1) 세포 배양 접시를 얼음 위에 놓고, 상등액을 흡출하고, 세포를 미리 냉각된 PBS로 3회 세척하였다;
2) 세포 용해물을 120 ㎕/웰로 첨가하고, 세포 배양 접시를 얼음 위에 30분 동안 수평으로 놓았다;
3) 세포 스크레이퍼를 사용하여 용해물을 긁어내고 1.5 ㎖ EP 튜브에 수집하였다;
4) 15000 g에서 15분간 원심분리하고, 상등액을 새로운 EP 튜브에 수집하고, 단백질 함량 검출(BCA 방법)을 위해 5 ㎕의 샘플을 취하고, 1/4(부피)의 로딩 완충액을 나머지 용해물에 첨가하였다;
5) 생성된 혼합물을 수 중에서 5분 동안 비등시켰다;
6) 10% SDS 분리 겔을 제조하고, 적층 겔을 제조하였다;
7) 분자량이 상이한 단백질을 SDS-PAGE 겔 전기영동으로 분리하였다;
8) 습윤 이동 완충액을 제조하고, 0.45-㎛ PVDF 멤브레인을 멤브레인 이동 실험에 사용하였다;
9) 1h 동안 실온에서 차단을 위해 5% 탈지유를 첨가하였다;
10) 세척 후, 1차 항체를 4℃에서 밤새 배양하였다;
11) 다음날, TBST 용액을 첨가하여 3회 세척하고, 2차 항체를 배양한 후 2h 동안 실온에 두었다;
12) 발색을 위해 ECL 현상액을 첨가하고, GE를 첨가하였다.
효소 결합 면역흡수 분석: 인간 콜라겐 유형 IELISA 키트
총 8개의 샘플은 하기를 포함한다: 대조군(ctrl), 5 ng/㎖ TGF-β1 그룹, 5 ng/㎖ TGF-β1+50nM d5PAO 공-처리 그룹(5 ng/㎖ TGF-β1+50 nM d5PAO 그룹), 5 ng/㎖ TGF-β1+25nM d5PAO 공-처리 그룹(5 ng/㎖ TGF-β1+25nM d5PAO 그룹), 5 ng/㎖ TGF-β1+50nM PAO 공-처리 그룹(5 ng/㎖ TGF-β1+50nM PAO 그룹) 및 5 ng/㎖ TGF-β1+25nM PAO 공-처리 그룹(5 ng/㎖ TGF-β1+25nM PAO 그룹).
인간 콜라겐 유형 IELISA 키트를 Novus Biologicals(Catalog No. NBP2-30102)에서 구입하였으며, 하기의 실험 단계를 지침에 따라 수행하였다:
1) 표준 곡선 샘플(4000 pg/㎖, 2000 pg/㎖, 1000 pg/㎖, 500 pg/㎖, 250 pg/㎖, 125 pg/㎖, 62.5 pg/㎖ 및 0 pg/㎖)을, 표준 희석제를 사용하여 제조하였다;
2) 100 ㎕의 시험하고자 하는 샘플(3개의 복제 웰) 또는 표준 곡선 샘플을 각 웰에 첨가하고 플레이트를 밀봉 필름으로 밀봉하고 37℃에서 2h 동안 배양하였다;
3) 상등액을 흡출하였으며, 세척이 필요하지 않았다;
4) 100 ㎕의 검출 시약 A 용액을 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 밀봉 필름으로 밀봉하고 37℃에서 1h 동안 배양하였다;
5) 상등액을 버리고, 진동자에서 2분간 세척을 위해 1×세척액 350 ㎕를 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 먼지가 없는 종이 위에 거꾸로 놓고 상등액을 두드려 제거하고, 이어서 연속적으로 3회 세척하였다;
6) 100 ㎕의 검출 시약 B 용액을 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 밀봉 필름으로 밀봉하고 37℃에서 30분 동안 배양하였다;
7) 상등액을 버리고, 진동자에서 2분간 세척을 위해 1×세척액 350 ㎕를 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 먼지가 없는 종이 위에 거꾸로 놓고 상등액을 두드려 제거하고, 이어서 연속적으로 5회 세척하였다;
8) 그 후, 각 웰에 90 ㎕의 TMB 기질을 첨가하고, 플레이트 내의 액체가 점차 청색으로 변하고, 플레이트를 밀봉 필름으로 밀봉하고 실온에서 10분 동안 방치하였다;
9) 각 웰에 50 ㎕의 정지액을 첨가하고, 플레이트의 액체가 황색으로 변하였다;
10) 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 450 nM의 흡수파장에서 판독하여 데이터를 분석하였다.
shRNA 렌티바이러스 벡터의 구성 및 처리
PI4Ka 간섭용 shRNA 렌티바이러스 벡터는 Genomeditech(Shanghai) Co., Ltd.에서 설계 및 제작되었다. 벡터 정보: pGMLV-SC5 RNAi 벡터(도 12).
하기의 표적 스폿을 설계하였다:
Figure pct00133
MRC-5 세포를 포화된 습도의 37℃, 5% CO2 항온 배양기에서 10% 소 태아 혈청(FBS)를 함유하는 MEM에서 24h 동안 배양하여 벽에 부착시켰다. 다음날 렌티바이러스 벡터를 그룹별로 1 ㎕/웰씩 첨가하였다. 24h 후, 그룹별로 5 ng/㎖ TGF-β1을 첨가하고, 혼합물을 24h 동안 공-배양하였다. 웨스턴 블롯 실험 또는 면역형광 염색을 위해 단백질을 수집하였다.
통계
형광 강도 처리를, Image J 소프트웨어를 사용하여 수행하고, 데이터 처리 및 통계를 GraphPad prism 5 소프트웨어를 사용하여 수행하였으며, 데이터를 평균 ± 평균의 표준오차(평균 ± SEM)로서 표현하였다. 그룹 간의 차이를 일원 ANOVA로 비교 분석하였으며, p < 0.03은 통계적 차이를 나타내었다.
실험 결과:
MRC-5 세포를 5 ng/㎖ TGF-β1을 함유하는 MEM(FBS 없음)으로 24h 동안 처리하고, 그룹별로 상이한 농도의 d5PAO 또는 PAO로 처리하였다. 대조군과 비교하여, TGF-β1을 단독으로 사용하거나 또는 일정한 농도의 d5PAO 또는 PAO와 함께 사용하면 유의한 세포사나 아팝토시스를 일으키지 않았다(도 13). α-평활근 액틴(α-SMA) 및 액틴 결합 단백질(칼포닌1)은 근섬유아세포의 마커이다. d5PAO 및 PAO가 폐 섬유증에 대한 조절 효과가 있는지의 여부를 조사하기 위해서, α-SMA 및 칼포닌1을 별도로 검출하였다. 웨스턴 블롯 실험 결과는 하기를 나타내었다: 대조군(ctrl)과 비교하여, 5 ng/㎖ TGF-β1 처리 그룹에서 α-SMA의 발현 수준이 유의하게 증가하였으며, 이는 5 ng/㎖ TGF-β1로 처리된 MRC-5 세포가 24h 동안 세포 섬유증을 유발하는 반면, 25nM, 50nM 및 100nM의 d5PAO 및 50nM 및 100nM의 PAO는 5 ng/㎖ TGF-β1에 의해 유도된 α-SMA 과발현을 용량-의존적인 관계로 유의하게 억제하였다(도 14A 및 14B). 칼포닌1의 웨스턴 블롯 실험 결과는 상기 α-SMA의 결과와 유사하였다. ctrl군과 비교하여, 5 ng/㎖ TGF-β1 처리 그룹에서 칼포닌1의 발현 수준은 유의하게 증가하였고, 일정 농도의 d5PAO 또는 PAO+5 ng/㎖ TGF-β1 공-처리 그룹에서 칼포닌 1의 발현 수준은 5 ng/㎖ TGF-β1 처리 그룹에서보다 유의하게 더 높았다(도 14A 및 14C). 또한, 면역형광 분석 결과도 웨스턴 블롯 결과와 일치하였으며, 5 ng/㎖ TGF-β1 처리 그룹에서 α-SMA의 발현 수준은 대조군에서보다 유의하게 더 높았다(도 15A 및 15C). 5 ng/㎖ TGF-β1+25 nM d5PAO, 5 ng/㎖ TGF-β1+50 nM d5PAO, 5 ng/㎖ TGF-β1+25 nM PAO 및 5 ng/㎖ TGF-β1+50 nM PAO 공-처리 그룹에서 α-SMA의 발현 수준은 대조군에서와 유의한 차이가 없었다. 그러나, 5 ng/㎖ TGF-β1+25 nM d5PAO, 5 ng/㎖ TGF-β1+50 nM d5PAO, 5 ng/㎖ TGF-β1+25 nM PAO 및 5 ng/㎖ TGF-β1 + 50 nM PAO 공-처리 그룹에서 α-SMA의 발현 수준은 5 ng/㎖ TGF-β1 처리 그룹과 비교하여 유의하게 감소하였다(도 15A 및 15C). 액틴 결합 단백질(칼포닌1)의 면역형광 분석 결과는 상기 α-SMA의 결과와 일치하였다(도 15B 및 15D). 이러한 결과는 d5PAO 및 PAO가 TGF-β1에 의해 유도되는 MRC-5 세포의 섬유증 과정을 유의하게 억제할 수 있음을 가리켰다.
골 중간엽 줄기 세포(bMSC)에서 칼포닌1의 발현에 대한 d5PAO 및 PAO의 억제 효과
폐 섬유증은 유효한 치료 약물 및 방법이 부족하고, 줄기 세포는 독특한 생물학적 특성과 잠재적인 생물 의학 응용 가치로 인해 최근 몇 년 동안 폐 섬유증 치료에서 뜨거운 연구 분야가 되었다. 중간엽 줄기세포(MSC)는 낮은 면역원성, 다양한 분화 가능성, 면역 조절, 소염 능력, 다양한 공급원, 단리된 방식의 배양 용이성 및 덜 윤리적인 분쟁 등의 장점으로 인해 상처 조직 복구, 장기 기능 재건 및 세포 요법에 이상적인 공학 세포가 되었다. 따라서 래트의 뼈에서 유래한 MSC를 단리된 방식으로 배양하여, d5PAO와 PAO가 MSC에서 칼포닌1의 발현을 조절하는지 여부를 검출하였다. 단리된 MSC를 10% FBS를 포함하는 MEM에서 배양한 다음 면역형광 실험에서 24웰 플레이트의 커버슬립에 웰당 3000-5000 세포로 시딩하였다. 관찰된 바와 같이 세포 밀도가 70%에 도달하면, 상이한 농도의 PAO 또는 d5PAO를 함유하는 MEM(FBS 없음)을 그룹별로 첨가하였다. 다음으로, 플레이트를 24h 동안 포화된 습도의 37℃, 5% CO2 항온 배양기에서 배양하였다. 면역형광 분석 결과 24h 동안 25 nM 및 50 nM의 d5PAO 및 25 nM 및 50 nM의 PAO에 의한 MSC 처리는 상기 MSC에서의 칼포닌 1의 발현을 억제하는 경향이 있는 것으로 나타났다(도 16).
TGF-β1로 처리된 MRC-5 세포에서 I형 콜라겐(COL1)의 분비에 대한 d5PAO 및 PAO의 억제 효과
COL1은 세포외 기질의 중요한 구성요소 중 하나이다. 연구에 따르면 TGF-β1은 MRC-5 세포의 섬유증 과정에서 COL1의 분비를 유의하게 증가시키는 것으로 나타났다. 폐 섬유증 억제 과정에서 d5PAO 및 PAO가 COL1의 분비를 조절할 수 있는지 여부를 더 알아보기 위해 세포 상등액의 COL1 수준을 ELISA로 검출하였다. MRC-5 세포를 5 ng/㎖ TGF-β1을 함유하는 MEM(FBS 없음)으로 24h 동안 처리하고, 상이한 농도의 d5PAO 또는 PAO로 24h 동안 그룹별로 처리하였다. ELISA를 위해 상등액을 수집하였다. 실험 결과는 하기를 나타내었다: ctrl 그룹과 비교하여, 5 ng/㎖ TGF-β1 처리 그룹에서 세포 상등액의 COL1 농도가 유의하게 증가하였고, 5 ng/㎖ TGF-β1+25 nM d5PAO, 5 ng/㎖ TGF-β1+50 nM d5PAO, 5 ng/㎖ TGF-β1+100 nM d5PAO, 5 ng/㎖ TGF-β1+25 nM PAO, 5 ng/㎖ TGF-β1+50 nM PAO 및 5 ng/㎖ TGF-β1 + 100 nM PAO 공-처리 그룹에서 세포 상등액의 COL1 수준은 5 ng/㎖ TGF-β1 처리 그룹과 비교하여 유의하게 감소되었으며(도 17A 및 17B), 이는 d5PAO 및 PAO가 MRC-5 세포 모델에서 COL1의 분비를 억제할 수 있음을 가리킨다.
MRC-5 세포의 섬유화에 대한 PI4Kα 녹다운의 억제 효과
이전 연구에 따르면 낮은 농도(< 5 μM)의 PAO는 주로 포스파티딜이노시톨 4 키나제(PI4KIIIα)에 작용하는 것으로 나타났다. 섬유증 동안 표적 스폿 PI4KIIIα에 대한 PAO의 영향을 추가로 조사하기 위해서, shRNA 간섭 렌티바이러스 벡터(녹색 형광 단백질 GFP 발현 서열 포함)를 PI4KIIIα 단백질을 암호화하는 유전자 서열 PI4Ka에 대해 설계하였다. 웨스턴 블롯 결과는 MRC-5 세포를 48h 동안 PI4Ka를 표적화하는 3개의 shRNA 간섭 렌티바이러스 벡터로 형질감염시킨 후, 간섭 서열 sh1, sh2 및 sh3이 모두 처리 그룹에서 PI4KⅢα의 발현 수준을 유의하게 감소시켰음을 보여주었다(도 18A 및 18B). shRNA 간섭 렌티바이러스 벡터를 48h 동안 처리한 후, 면역형광염색을 통해 칼포닌1과 α-SMA의 발현을 관찰하였다. 벡터 대조군(sh-ctrl)과 비교하여, sh-ctrl+5 ng/㎖ TGF-β1 공-처리 그룹에서 α-SMA의 발현 수준이 유의하게 증가하였다. sh-ctrl+5 ng/㎖ TGF-β1 공-처리 그룹과 비교하여, sh1+5 ng/㎖ TGF-β1 공-처리 그룹 및 sh3+5 ng/㎖ TGF-β1 공-처리 그룹에서 α-SMA의 발현 수준은 유의하게 감소하였고, sh2+5 ng/㎖ TGF-β1 공-처리 그룹에서 α-SMA의 발현 수준도 또한 감소하는 경향을 보였다(도 19A 및 19C). 칼포닌1의 관찰 결과는 α-SMA의 관찰 결과와 일치하며(도 19B 및 19D), 이는 PI4Kα 녹다운이 MRC-5 세포의 섬유화를 억제함을 가리킨다.
실시예 9. d5PAO 및 PAO의 소염 효과의 비교
쥐 미세아교 세포 BV2에서 염증 인자의 방출에 대한 d5PAO 및 PAO의 억제 효과
BV2 세포는, v-raf/v-myc에 의한 쥐 미세아교 세포의 레트로바이러스 매개 형질감염에 의해 불멸화되며, 미세아교 세포의 많은 형태학적, 대표적 및 기능적 특징을 유지한다. 신경계 염증과 관련된 실험에서 지질다당류(LPS)는 통상적으로 실험을 위한 염증 세포 모델을 얻기 위해 BV2 세포를 자극하는 데 사용된다. 이 실험에서 LPS는 염증 세포 모델을 얻기 위해 BV2 세포를 자극하는 데 사용되었다. d5PAO 및 PAO가 종양 괴사 인자 α(TNF-α), 인터류킨-6(IL-6)과 같은 염증 인자의 분비에 미치는 영향을 관찰하였으며, 소염제로 흔히 사용되는 인도메타신을 실험에서 양성 대조군으로서 사용하였다.
세포 배양 및 처리
BV2 세포를 48h 동안 37℃, 5% CO2 세포 배양기에서 10% FBS가 보충된 고-글루코스 DMEM에서 배양하였다. 배양 배지를 제거하고 1 ㎍/㎖ LPS(지질다당류, Sigma에서 구입, 카탈로그 번호 L2880)를 함유하는 고-글루코스 DMEM(FBS 없음)으로 교체하였다. 상이한 농도의 d5PAO 또는 PAO를 그룹별로 세포와 함께 24h 동안 배양하였다. 상등액을 수집하고 후속 실험에 사용하기 위해 원심분리시켰다. 그룹은 하기와 같다: 대조군(ctrl), 1 ㎍/㎖ LPS 그룹, 1 ㎍/㎖ LPS+50 nM d5PAO 공-처리 그룹(1 ㎍/㎖ LPS+50 nM d5PAO 그룹), 1 ㎍/㎖ LPS+25 nM d5PAO 공-처리 그룹(1 ㎍/㎖ LPS+25 nM d5PAO 그룹), 1 ㎍/㎖ LPS+12.5 nM d5PAO 공-처리 그룹(1 ㎍/㎖ LPS+12.5 nM d5PAO), 1 ㎍/㎖ LPS+50 nM PAO 공-처리 그룹(1 ㎍/㎖ LPS+50 nM PAO 그룹), 1 ㎍/㎖ LPS+25 nM PAO 공-처리 그룹(1 ㎍/㎖ LPS+25 nM PAO 그룹), 1 ㎍/㎖ LPS+12.5 nM PAO 공-처리 그룹(1 ㎍/㎖ LPS+12.5 nM PAO 그룹) 및 1 ㎍/㎖ LPS+100 μM 인도메타신 공-처리 그룹.
마우스 종양 괴사 인자 알파(TNF-α) ELISA
마우스 종양 괴사 인자 알파(TNF-α) ELISA 키트를 Signalway Antibody LLC(카탈로그 번호 EK16997)에서 구입하였다. 제품 지침에 따라 하기 실험을 수행하였다.
1) 희석 완충액을 사용하여 10 ng/㎖, 5 ng/㎖, 2.5 ng/㎖, 1.25 ng/㎖, 0.625 ng/㎖, 0.312 ng/㎖, 0.156 ng/㎖ 및 0에서 표준을 제조하였다.
2) 검출 시약 A 및 검출 시약 B를 부드럽게 진동시키고, 희석 완충액을 사용하여 시약 A 및 시약 B를 모액의 1/100로 희석하여 작업 용액 농도에 도달하도록 하였다.
3) 세척액을 모액의 1/30이 되도록 탈이온수로 희석하여 작업 용액을 형성시켰다.
4) 100 ㎕의 시험하고자 하는 샘플 또는 표준을 각 웰에 첨가하고 플레이트를 밀봉 필름으로 밀봉하고 37℃에서 2h 동안 배양하였다;
5) 상등액을 제거하였으며, 세척이 필요하지 않았다;
6) 100 ㎕의 검출 시약 A 작업 용액을 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 밀봉 필름으로 밀봉하고 37℃에서 1h 동안 배양하였다;
7) 상등액을 버리고, 3회 세척을 위해 300 ㎕의 세척액 작업 용액을 첨가하고, 매번 2분간 정치시키고, 이어서 플레이트를 먼지가 없는 흡착지 위에 거꾸로 놓아 세척액을 가능한 한 많이 제거하였다;
8) 100 ㎕의 검출 시약 B 작업 용액을 각 웰에 첨가하고 플레이트를 밀봉 필름으로 밀봉하고 37℃에서 1h 동안 배양하였다;
9) 플레이트를 단계 7)의 방법에 따라 5회 세척하고;
10) 90 ㎕의 기질 용액을 각 웰에 첨가하고, 플레이트에서 관찰된 바와 같이 액체가 청색으로 변하였으며, 플레이트를 밀봉 필름으로 밀봉하고 20분 동안 암실에서 37℃에서 배양하였다;
11) 각 웰에 정지액 50㎕를 첨가하고, 플레이트에서 관찰되는 바와 같이 청색 액체가 황색으로 변하였으며, 플레이트를 밀봉 필름으로 밀봉하고, 생성된 혼합물을 진탕기를 사용하여 회전 및 진탕시키고 10분 동안 균일하게 혼합하였다;
12) 마이크로플레이트 판독기(NOVOstar 액체 이동형 마이크로플레이트 판독기)를 사용하여 450 nM의 파장에서 샘플의 흡광도 값을 판독하였다.
마우스 IL-6 ELISA 실험
마우스 IL-6 ELISA 키트를 Proteintech 그룹에서 구입하였다(카탈로그 번호 KE10007). 제품 지침에 따라 하기의 실험을 수행하였다:
100 ㎕의 표준 곡선 샘플 또는 각 농도의 시험 샘플을 분석 플레이트의 해당 웰에 첨가하고 발색체 블랭크 웰을 남겨두었으며; 커버 필름을 가습 상자에 넣고 플레이트를 37℃에서 2h 동안 배양하였다. 350 ㎕의 세척액을 각 웰에 첨가하여 매번 1-2분씩 4회 세척하여 액체 잔류물을 가능한 한 적게 유지시켰다. 100 ㎕의 희석 항체 용액(검출 항체 용액)을 각 웰에 첨가하고; 커버 필름을 가습 상자에 넣고 플레이트를 37℃에서 1h 동안 배양하였다. 액체 잔류물을 가능한 한 적게 유지하면서 세척을 매번 1-2분씩 4회 반복하였다. 100 ㎕의 HRP-접합체 항체를 각 웰에 첨가하고; 커버 필름을 가습 상자에 넣고 플레이트를 37℃에서 40분 동안 배양하였다. 액체 잔류물을 가능한 한 적게 유지하면서 세척을 4회 반복하였다. 각 웰에 TMB 기질 용액 100 ㎕를 첨가하고 플레이트를 필름으로 덮고 37℃ 암실에서 15분 동안 배양하였다. 용액이 청색으로 변하였다. 각 웰에 정지액 100 ㎕를 첨가하고 혼합물을 부드럽게 흔들어 균일하게 혼합하였다. 용액이 황색으로 변하였으며 NOVOstar(액체 이동형) 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 450 ㎚의 흡수 파장에서 가능한 빨리 판독하였다.
통계
데이터 처리 및 통계를 GraphPad prism 5 소프트웨어를 사용하여 수행하였으며, 데이터를 평균 ± 평균의 표준오차(평균 ± SEM)로 표현하였다. 그룹 간의 차이를 일원 ANOVA로 비교 분석하였으며, p < 0.03은 통계적 차이를 나타냈다.
실험 결과
BV2 세포를 37℃ 5% CO2 세포 배양기에서 48h 동안 10% FBS가 첨가된 고-글루코스 DMEM에서 배양한 후, 배양 배지를 제거하고 1 ㎍/㎖ LPS를 함유하는 고-글루코스 DMEM(FBS가 없음)으로 교체하였다. 세포를 24h 동안 상이한 농도의 d5PAO 또는 PAO와 함께 배양하고, 상등액을 수집하고, 배양 배지 중의 IL-6 및 TNF-α의 농도를 ELISA(효소 결합 면역흡수 분석)를 통해 검출하였다. 실험 결과, 대조군(ctrl)과 비교하여 1 ㎍/㎖ LPS 처리 그룹에서 BV2 세포의 상등액 중의 IL-6 및 TNF-α의 농도가 유의하게 증가하였으며, 이는 1 ㎍/㎖ LPS에 의한 BV2 세포의 처리가 염증 인자의 방출을 촉진시킴을 가리킨다(도 20A 내지 20D). 1 ㎍/㎖ LPS 처리 그룹과 비교하여, 100 μM 양성 약물(인도메타신)은 TNF-α의 분비를 유의하게 억제하였다(도 20A 내지 20B). 양성 약물의 결과와 유사하게, 1 ㎍/㎖ LPS+12.5 nM, 25 nM 및 50 nM d5PAO 공-처리 그룹, 및 1 ㎍/㎖ LPS+12.5 nM, 25 nM 및 50 nM PAO 공-처리 그룹에서 상등액 중의 TNF-α 농도는 1 ㎍/㎖ LPS 처리 그룹과 비교하여 유의하게 감소되었으며, 이는 d5PAO 및 PAO가 LPS 유도 TNF-α 방출을 억제할 수 있음을 가리킨다. IL-6의 ELISA 결과는 특정 농도의 d5PAO 및 PAO 처리가 BV2 세포로부터의 LPS-유도된 IL-6 분비를 억제하는 경향이 있음을 보여주었다(도 20C 내지 20D). 상기 실험은 특정 농도의 d5PAO 및 PAO가 BV2 세포로부터 염증 인자의 LPS-유도된 방출을 억제할 수 있음을 보여주었다.
실시예 10. d5PAO 및 PAO의 항종양 효과의 비교
1. 종양 세포 모델에 대한 PAO 및 d5PAO의 약력학적 실험
실험 방법
세포 도말:
완전 배지를 제조하고 균일하게 혼합하였다. 해동된 원발 종양 세포(Shanghai ChemPartner)를 약 2세대 동안 계대배양하여 양호한 생육 조건을 갖는 세포주를 선택하였다. 세포 부착: 배양 배지를 흡출하고, 세척을 위해 트립신을 첨가하고, 폐액을 버리고, 소화(digestion)를 위해 3 ㎖의 신선한 트립신을 배양 플라스크에 첨가하였다. 세포가 플라스크 벽에서 탈착되려고 할 때, 8 ㎖의 완전 배지를 첨가하여 트립신에 의한 소화를 중지시킨 후 부드럽게 혼합하였다. 세포 현탁액을 피펫으로 원심분리기 튜브에 피펫팅하고 1000 rpm에서 4분 동안 원심분리하였다. 세포 현탁: 세포 현탁액을 원심분리기 튜브에 피펫팅하고 1000 rpm에서 4분 동안 원심분리시켰다. 상등액을 버렸다. 원심분리기 튜브에 적절한 부피의 배양 배지를 첨가하고, 부드럽게 불어서 세포를 균일하게 재현탁시켰다. Vi-Cell XR 세포 계수기를 사용하여 세포를 카운트하였다. 세포 현탁액을 적절한 농도로 조절하였다.
화합물 플레이트의 준비 및 첨가
시험하고자 하는 화합물: DMSO 중의 화합물 10 mM 용액을 제조하고, 화합물 PAO 및 d5PAO를 DMSO 중의 0.5 mM 용액으로 희석하였다. 화합물을 HPD300 장비를 사용하여 상응하는 세포 웰에 첨가하고 CO2 배양기에서 72h 동안 배양하였다.
시약 제조 및 시험
CellTiter-Glo 완충액을 실온에서 용융시켰다. 동결건조된 CellTiter Glo 기질을 실온으로 평형화시켰다. CellTiter-Glo 완충액을 CellTiter Glo 기질에 첨가하고 완전히 균일하게 혼합하였다. 세포 플레이트를 꺼내 실온으로 평형화시켰다. 균일하게 혼합된 CellTiter Glo 시약 100 마이크로리터를 각 웰에 첨가하고 혼합물을 암실에서 10분 동안 흔든 후 10분 동안 배양하였다. Envision 판독 플레이트에 배양 플레이트를 놓고 발광 판독 결과를 기록하였다. 억제율을 하기 식에 따라 계산하였다: 억제율(%) = (1-(RLU 화합물-RLU 블랭크)/(RLU DMSO-RLU 블랭크)) × 100%. XLFit을 이용하여 약력학적 억제율 곡선을 플롯팅하고 IC50 값을 계산하였다. 4-모수 모델 [fit = (a+((BA)/(1+((C/x) ^ D)))]을 사용하였다.
실험 결과:
하기 표 5에 나타낸 바와 같이, d5PAO 및 PAO 모두 시험된 종양 세포에 대해 억제 효과를 가졌고, 이들의 억제 효과(IC50)는 유사하였다. d5PAO의 IC50은 약간 낮았다. 이들은 50 nM 미만의 IC50으로 U2-OS 및 A-375 세포에 대해 가장 강력한 억제 효과를 보였고, HeLa, SK-HEP-1, Daudi, EL4, HL-60, Jurkat, E6-1 및 NAMALWA 세포에 대해 50-100 nM의 IC50으로 비교적 강한 억제를 가졌다. A-431 세포에 대한 억제 효과는 약 300 nM의 IC50으로 가장 약하였다. 그러나 IC50은 다른 세포의 경우 100-200 nM이었다. PAO(원래 화합물) 및 d5PAO(오중수소화 화합물)와 비교하여, 대부분의 종양 세포에 대한 단일중수소화 화합물 d1PAO의 효과적인 억제 농도는 200nM를 초과하였으며, 이는 종양 세포에 대한 단일중수소화 화합물의 억제 효과가 PAO 및 d5PAO만큼 양호하지는 않았음을 가리킨다.
종양 세포에 대한 d5PAO 및 PAO의 억제 효과 목록(72h 동안 배양됨)
세포주 PAO d5PAO d1PAO 파클리탁셀
IC50 (nM) IC50 (nM) AbsIC50 (nM) IC50 (nM)
HeLa 자궁경부암 87.01 87.78 > 200 10.66
SK-HEP-1 간암 85.73 83.09 4.69
MCF7 유방암 137.09 151.95 > 200 23.36
MDA-MB-231 유방암 105.55 106.42 > 200 > 10000
A549 폐암 216.39 225.21 > 200 3.95
NCI-H1299 폐암 116.97 120.85 > 200 17.69
HT-29 결장암 175.72 168.06 > 200 4.19
A-431 피부암 344.36 312.71 > 200 3.08
NCIN87[N87] 위암 161.28 153.93 > 200 7.76
HCC827 폐암 180.53 179.63 > 200 5.88
EL4 T-세포 림프종 60.22 52.68 55.00
Daudi 백혈병 63.42 59.30 97.66 4.71
U-2OS 골육종 49.51 48.49 71.17 16.77
Jurkat, 클론 E6-1 백혈병 93.01 91.06 175.35 3.83
K-562 골수종 51.92 52.10 6.53
HL-60 백혈병 49.94 51.14 > 200 2.82
SK-OV-3 난소암 207.68 199.59 > 200 9.90
U-937 림프종 85.09 85.79 149.63 3.97
NAMALWA 백혈병 61.09 60.73 68.66 3.66
KG-1 골수종 151.10 151.32 176.84 76.80
A-375 흑색종 33.23 34.96 50.76 3.98
BxPC-3 췌장암 > 200 > 200 - -
ZR-75-1 유방관암종 28.54 50-100
4T1 유방암 47.54 50-100
B6F10 흑색종 20.88 < 50
A20 B 세포 림프종 64.42 < 50
Raji-Luc 림프모구 110 > 100
SU-DHL-1 림프절 대세포 림프종 100-200 100-200
LOVO 결장암 > 200 100-200
HepG2 간암 105 100-200
NCI-H358 비-소세포 폐암 75.4 ~100
OVCAR-3 난소암 50-100
SNU-5 위암 100-200
LLC1 폐암 162.3
2. 마우스 종양 모델에 대한 PAO 및 d5PAO의 약력학적 실험
실험 동물을 Beijing Biocytogen Co., Ltd 동물센터의 SPF 차단 시설에서 사육하였다. 차단 시스템의 온도를 20℃-26℃, 습도는 40%-70%로 조절하였다. 명암 주기를 12h마다 변경하였다. SPF 등급의 성장 및 번식 사료를 Beijing Keao Xieli Feed Co., Ltd.에서 구입하였다. 음용수는 고압멸균에 의해 멸균된 산성수(pH 2.5-3.0)였다. 동물은 살균된 음식과 물을 마음껏 이용할 수 있다.
2.1 유방암에 대한 PAO의 억제 효과
실험 방법:
PDX 모델의 접종 및 분류
접종을 위한 PDX 종양을 약 800-1000 ㎣로 성장시킨 후에, 종양을 무균 조건에서 꺼내어 RPMI1640 배양 배지에 넣고, 석회화, 분비물 등의 비-종양 조직을 제거한 후 종양을 균일한 크기(3 × 3 × 3 ㎜)의 작은 조각으로 절단하고 유방암 PDX 모델(BP1395)의 피하 접종에 사용하였다. 마우스 오른쪽 옆가슴의 피부를 아이오도포르로 소독하고 가위로 절단하여 약 3-5 ㎜ 정도 절개하고, 접종바늘을 이용하여 마우스 오른쪽 옆가슴에 종양 조각을 피하 접종하였다. 평균 종양 부피가 약 100 ㎣에 도달했을 때, 중간 종양 부피를 갖는 마우스를 선택하고 종양 부피에 따라, 그룹당 8마리씩 무작위로 4개의 실험 그룹으로 분류하였다. 투여를 분류 당일에 시작하였다. 모든 그룹에게 분류 당일 시험 제품 PAO를 1일 1회 총 20회 용량으로 경구(P.O.) 투여하였다. 파클리탁셀은 총 4회 용량으로 주 1회 정맥내(i.v.) 투여하였다. 동물을 실험 종료 시 또는 인도적 종말점에서 과량의 CO2로 안락사시켰다.
종양 부피: 분류 후, 주 2회 버니어 캘리퍼스를 사용하여 종양 부피를 측정하였다. 안락사 전에 종양의 부피를 측정하고 종양의 긴 직경과 짧은 직경을 측정하였다. 부피 계산식은 하기와 같다: 종양 부피 = 0.5 × 긴 직경 × 짧은 직경2.
체중 측정: 동물을 접종하고, 분류하고(즉, 첫 번째 투여 전), 투여 동안 주 2회 체중을 칭량하고, 안락사 전에 체중을 칭량하였다.
약물 평가 지수:
종양 부피 억제율(TGITV)
TGI(%) = [1-(Ti-T0)/(Vi-V0)] × 100%
(Ti: 투여 후 i일째 처리 그룹의 평균 종양 부피, T0: 투여 0일째 처리 그룹의 평균 종양 부피, Vi: 투여 후 i일째 용매 대조군의 평균 종양 부피, 및 V0: 투여 0일째 용매 대조군의 평균 종양 부피)
종양 중량 억제율(TGITW):
실험이 끝나면, 살아있는 동물을 안락사시킨 후 종양 조직을 절제하였다. 종양 중량을 칭량하고, 각 그룹의 종양 중량 차이를 계산하여 종양 중량 억제율(TGITW)을 추가로 계산하였다. 계산식은 하기와 같다:
종양 중량 억제율 TGITW% = (W용매 대조군 - W처리 그룹)/W용매 대조군 × 100%, 여기서 W는 종양 중량을 지칭한다.
데이터 수집 및 통계 분석:
원본 데이터를 기준으로 분석을 수행하였으며, 그 결과를 평균 ± 평균의 표준오차(평균 ± SEM)로 표시하였다. 동시에, 종양 부피를 통계적으로 분석하였고, P < 0.05는 통계적 차이를 가리켰다. 결과를 분석할 때 통계적 및 생물학적 유의수준을 모두 고려하였다.
실험 결과:
실험에서 모든 동물은 투여 동안 양호한 활동과 섭식 상황을 가졌다. 비-종양-함유 마우스의 체중은 어느 정도 증가하였고, 종양-함유 마우스의 체중은 약간 감소하였으며, 이는 동물이 시험 제품에 대해 양호한 내성을 가졌음을 가리킨다. 분류 및 투여 후 21일 째에, 용매 대조군 G1의 평균 종양 부피는 436 ± 40 ㎣이었다. 처리 그룹 G2(PAO, 2 ㎎/㎏), G3(파클리탁셀, 7 ㎎/㎏) 및 G4(파클리탁셀, 7 ㎎/㎏+PAO, 2 ㎎/㎏)의 평균 종양 부피는 각각 519 ± 96 ㎣, 290 ± 63 ㎣ 및 162 ± 26 ㎣이었고, 종양 부피 억제율(TGITV)은 각각 -25.7%, 44.8% 및 84.1%(P = 0.01)였다. 결과는 PAO와 파클리탁셀의 병용이 종양 성장을 효과적으로 억제할 수 있음을 보여주었다(도 21).
2.2 림프종에 대한 PAO의 억제 효과
실험 방법:
ATCC에서 구입한 마우스 림프종 SU-DHL-1 세포를 37℃, 5% CO2 배양기에서 10% 불활성화된 소 태아 혈청을 함유하는 둘베코의 변형된 이글 배양 배지에서 배양하였다.
종양 세포의 접종 및 분류:
PBS에 재현탁된 SU-DHL-1 림프종 세포를 B-NDG 인간화된 마우스의 오른쪽에 1 x 107 세포/0.1 ㎖ 및 0.1 ㎖/마우스로 피하 접종하였다. 평균 종양 부피가 약 100 ㎣에 도달했을 때, 보통의 종양 부피를 갖는 36마리의 마우스를 선택하고 종양 부피에 따라 그룹당 6마리씩, 6개의 실험 그룹으로 무작위로 분류하였다. 투여를 분류 당일에 시작하였다. 시험 제품 PAO를 1일 1회 총 17회 투여하였다. 사이클로포스파미드는 총 4회 용량으로 일주일에 1회 피하(iv) 주사하였다. 동물을 실험 종료 시 또는 인도적 종말점에서 과량의 CO2로 안락사시켰다.
실험 결과:
실험에서, 모든 동물은 투여 동안 양호한 활동과 섭식 상황을 가졌다. 비-종양-함유 마우스의 체중은 어느 정도 증가하였고, 종양-함유 마우스의 체중은 약간 감소하였으며, 이는 동물이 시험 제품에 대해 양호한 내성을 가졌음을 가리킨다. 분류 및 투여 후 17일 째에, 용매 대조군 G1의 평균 종양 부피는 3899 ± 272 ㎣였다. 처리 그룹 G2(사이클로포스파미드, 50 ㎎/㎏), G3(PAO, 0.3 ㎎/㎏), G4(PAO, 0.6 ㎎/㎏), G5(PAO, 1.2 ㎎/㎏) 및 G6(사이클로포스파미드, 50 ㎎/㎏+PAO 0.6, ㎎/㎏)의 평균 종양 부피는 각각 367 ± 79 ㎣ , 3427 ± 128 ㎣ , 3784 ± 114 ㎣ , 3735 ± 205 ㎣ 및 497 ± 106 ㎣이었다. 종양 부피 억제율 TGITV는 각각 -93%(**P < 0.001), 17.2%, 3%, 4.3% 및 89.9%(P < 0.001**)였다. 종양 중량의 실험 결과를 또한 확인하였다. 사이클로포스파미드는 림프종의 성장을 효과적으로 억제할 수 있으며 PAO와 사이클로포스파미드의 병용은 억제 효과를 추가로 향상시킬 수 없다(도 22).
2.3 흑색종에 대한 d5PAO의 억제 효과
실험 방법:
A2058 세포를 B-NDG 마우스의 오른쪽에 1 x 107 세포/0.1 ㎖ 및 0.1 ㎖/마우스로 피하 접종하였다. 평균 종양 부피가 약 100 ㎣에 도달했을 때, 보통의 종양 부피를 갖는 48마리의 마우스를 선택하고 이들을 종양 부피에 따라 그룹당 8마리씩 6개의 실험 그룹으로 무작위로 분류하였다. 그룹에는 G3(생리식염수/비히클), G4(d5PAO, 0.5 ㎎/㎏), G5(d5PAO, 1.5 ㎎/㎏), G6(테모졸로미드, 30 ㎎/㎏+d5PAO, 0.5 ㎎/㎏), G7(테모졸로미드, 30 ㎎/㎏+d5PAO, 1.5 ㎎/㎏) 및 G8(테모졸로미드, 30 ㎎/㎏)이 포함되었다. 한편, 16마리의 비-종양-보유 마우스를 체중에 따라 선택하고 2개의 실험 그룹(그룹당 8마리 마우스), 즉 G1(생리식염수/비히클) 및 G2(d5PAO, 1.5 ㎎/㎏)로 동등하게 분류하였다. 시험 제품 d5PAO를 1일 1회 총 23회 용량으로 분류 당일 모든 그룹에게 위내 투여하였다. 시험 제품 테모졸로미드를 주 4회 총 12회 용량으로 투여하였다. 마우스의 체중 및 종양 부피를 투여 및 관찰 동안 주 2회 측정하였고, 측정치를 기록하였다(도 23). 실험이 끝나면 동물을 안락사시키고 종양을 절제하고, 칭량하고, 사진을 찍고 종양 성장 억제율(TGI%)을 계산하였다.
실험 결과:
실험에서, 모든 동물은 투여 동안 양호한 활동과 섭식 상황을 가졌다. 비-종양-함유 마우스의 체중은 어느 정도 증가하였고, 종양-함유 마우스의 체중은 약간 감소하였으며, 이는 동물이 시험 제품에 대해 양호한 내성을 가졌음을 가리킨다. 분류 및 투여 후 25일 째에, 용매 대조군 G3의 평균 종양 부피는 2806 ± 240 ㎣이었다. 치료 그룹 G4(d5PAO 0.5 ㎎/㎏), G5(d5PAO 1.5 ㎎/㎏), G6(테모졸로미드, 30 ㎎/㎏+d5PAO, 0.5 ㎎/㎏), G7(테모졸로미드, 30 ㎎/kg+d5PAO, 1.5 ㎎/㎏) 및 G8(테모졸로미드, 30 ㎎/㎏)의 평균 종양 부피는 각각 2907 ± 295 ㎣, 2180 ± 312 ㎣, 1064 ± 164 ㎣, 1213 ± 155 ㎣ 및 1480 ± 136 ㎣이었다. 종양 부피 억제율 TGITV는 각각 -3.7%, 23.2%, 64.5%, 58.9% 및 49.1%였다. 종양 중량의 실험 결과를 또한 확인하였다. 실험의 끝에서, 마우스의 종양 조직 중량은 하기와 같았다: 그룹 G3의 경우 3.413 ± 0.253 g(비히클/생리식염수); 그룹 G4의 경우 3.557 ± 0.379 g(d5PAO 0.5 ㎎/㎏); 그룹 G5의 경우 2.744 ± 0.459 g(d5PAO 1.5 ㎎/㎏); 그룹 G6의 경우 1.413 ± 0.233 g(테모졸로미드, 30 ㎎/㎏+d5PAO, 0.5 ㎎/㎏); 그룹 G7의 경우 1.442 ± 0.251 g(테모졸로미드, 30 ㎎/㎏+d5PAO, 1.5 ㎎/㎏); 및 그룹 G8(테모졸로미드, 30 ㎎/㎏)의 경우 1.884 ± 0.217 g(도 24).
대조군 G3와 비교하여, 테모졸로미드 30 ㎎/㎏ 단독 사용, 및 0.5 ㎎/㎏ 및 1.5 ㎎/㎏ 테모졸로미드를 d5PAO와 함께 사용하는 경우 모두, A2058의 피하 이식 종양의 성장에 매우 유의한 억제 효과가 있었다(P < 0.001). 테모졸로미드 단독 사용에 비해, 테모졸로미드를 병용하면 억제 효과를 더욱 높일 수 있다.
실시예 11. d5PAO 및 PAO의 항종양-악액질 효과의 비교
암은 인간 사망의 두 번째 주요 원인이며, 전 세계 사망의 거의 6분의 1이 암으로 인해 발생한다. 암은 주로 화학 요법, 방사선 요법, 수술, 면역 요법, 유전자 요법, 호르몬 요법 등으로 치료한다. 현재 화학 요법은 가장 효과적인 수단 중 하나이다. 그러나 화학 요법의 주요 문제는 부작용이다. 화학 요법 약물은 암세포를 죽일 때 혈액, 입, 소화계 및 모낭의 세포를 포함하여 체내에서 빠르게 성장하는 세포도 죽이며, 이는 소화 반응, 탈모, 골수 억제 및 다른 시스템의 기능 저하을 일으킬 수 있다.
혈액이상(dyscrasia)이라고도 알려진 악액질은 극도의 쇠약, 체중 감소, 지방 손실 및 골격근과 심장 근육의 용해 감소로 나타나며, 이는 점진적인 기능 장애와 결국 전신 부전 및 기타 증후군으로 이어진다. 악액질은 주로 종양, AIDS, 중증 외상, 수술 후, 흡수 장애, 중증 패혈증 등을 비롯한 중증 만성 소모성 질환에 의해 유발된다. 그 중 종양을 동반하는 악액질이 가장 흔한 상황이며 종양 악액질이라고도 한다. 악성종양 환자의 31 내지 87%가 악액질을 동반하며, 종양환자의 약 20%가 사망의 직접적인 원인은 질병 자체라기보다는 악액질에 의한 영양실조이다. 악액질은 췌장암, 위암, 폐암 및 간암과 높은 상관관계가 있다. 악액질은 암 치료 효과에 직접적인 영향을 미치고, 합병증의 발생률을 증가시키며, 삶의 질을 저하시키고, 생존 기간을 단축시키고, 치료 시간을 연장시키고, 의료 비용을 증가시킨다.
악액질의 원인은 아직 완전히 밝혀지지 않았으나, 최근 연구를 통해 종양 세포나 종양 세포 주변 환경의 세포에서 분비되는 다양한 병원성 인자가 점차 밝혀지고 있다. 종양 악액질의 발병을 늦추거나 예방하는 것은 환자의 삶의 질을 향상시키고 생존 기간을 연장시킬 수 있으며, 항암 치료 계획의 주요 부분이다. 동물 실험 모델에 대한 연구는, 종양 발달 중 체중 감소 예방으로 생존율이 연장될 수 있음을 입증하였다. 종양 환자의 악액질을 치료하는 주요 접근법은 약물에 의한 체중 감소 및 근육 감소를 억제하는 것이다. 지금까지 제1선의 항-악액질 약물의 대부분은 종양 악액질의 예방 및 치료에 미치는 효과가 매우 제한적이었다.
1. 건강한 마우스의 체중에 대한 PAO 및 d5PAO의 효과
22(2개월령) 및 20(6개월령) 마리의 수컷 C57B/6 마우스를 마우스 사육 케이지로 데려갔다. 각 케이지에는 5-6마리의 마우스가 있었다. 그 중 12(2개월령) 및 10(6개월령) 마리의 마우스는 매일 2.1 ㎎/㎏의 MCT 중의 d5PAO를 받았고 나머지 10(2개월령) 및 10(6개월령) 마리의 마우스는 매일 2.0 ㎎/㎏의 MCT 중의 PAO를 받았다. 투여 첫날부터 4일마다 모든 마우스의 체중을 투여 전에 측정하고 체중을 기록하였다. 다음 4일 동안, 체중을 기준으로 해당 용량의 PAO 또는 d5PAO를 위내 투여하였다. 살아있는 마우스의 수를 4일마다 기록하였다.
그 결과를 도 25에 나타낸다. d5PAO(2M-d5PAO) 및 PAO(2M-PAO) 처리 그룹의 2개월된 마우스의 경우, 마우스의 평균 체중이 위내 투여의 처음 24일 동안 정확히 동일하고 점진적으로 증가하였다. 24일 후, 두 그룹의 마우스는 모두 체중이 감소하였으며, 여기서 2M-PAO 그룹의 체중 감소는 2M-d5PAO 그룹보다 훨씬 더 빨랐다. 투여 44-48일째에, 상기 그룹에서 한 마리의 마우스가 사망한 반면, 2M-d5PAO 그룹에서는 사망이 발생하지 않았다. d5PAO(6M-d5PAO) 및 PAO(6M-PAO) 처리 그룹의 6개월된 마우스의 경우, 위내 투여 48일째에, 두 그룹의 마우스의 평균 체중이 전체적으로 변동하는 방식으로 서서히 감소하였다. 그러나 투여 32일째부터 6M-PAO 그룹이 6M-d5PAO 그룹보다 체중 감소가 훨씬 빨랐고 두 그룹 모두에서, 6M-PAO 그룹에서 5마리(50%) 및 6M-d5PAO 그룹에서 2마리(20%)의 마우스가 죽었다. 따라서, d5PAO의 위내 투여로 인한 독성은 6M-PAO의 독성보다 유의하게 낮았다.
2. 종양 동물 모델의 체중에 대한 PAO의 효과
2.1 유방암 마우스 모델의 체중에 대한 PAO의 영향
파클리탁셀의 주사는 동물의 체중 감소를 야기할 수 있다. 투여 21일째에, 동물 체중은 101.4% ± 1.6%(비히클 그룹, 0일째의 평균 체중 대비)에서 94.3% ± 2.6%(7 ㎎/㎏ 파클리탁셀 그룹, 0일째의 평균 체중 대비, P = 0.036*)로 감소하였다. PAO의 첨가는 파클리탁셀에 의한 체중 감소를 방지하였다(105.3% ± 2.4%, P = 0.187). PAO 자체가 종양 보유 동물의 체중도 증가시킬 수 있다는 점은 주목할 만하다(106.1% ± 2.5%, P = 0.128)(도 26).
2.2 췌장암 모델의 체중에 대한 PAO의 영향
췌장암 모델의 확립은 상기와 동일하였다. 투여 28일째 젬시타빈(1.5 ㎎/㎏)+파클리탁셀(7 ㎎/㎏) 그룹의 평균 체중(104.3% ± 4.0%, 0일차 평균 체중 대비)은 비히클 그룹(99.0% ± 2.2%, 0일째의 평균 체중 대비)의 체중과 유의한 차이가 없었다. 그러나, PAO의 첨가는 체중을 116.7% ± 3.9%로 증가시킬 수 있다(P = 0.002 대 비히클 그룹 및 젬시타빈+파클리탁셀 그룹, 도 27).
2.3 림프종 동물 모델의 체중에 대한 PAO의 효과
림프종 모델의 확립은 상기와 동일하였다. PAO의 추가는 종양 성장을 더 이상 억제하는 데 실패했지만 사이클로포스파미드 주사로 인한 체중 감소를 완화시킬 수 있다. 투여 17일째에, 동물 체중은 117.4% ± 1.4%(비히클 그룹 G1, 0일째의 평균 체중 대비)에서 104.7% ± 1.6%(50 ㎎/㎏ 사이클로포스파미드 그룹 G2, 0일째의 평균 체중 대비, P < 0.01*)로 감소하였다. 사이클로포스파미드와 함께 사용된 PAO(0.6-0.9 ㎎/㎏)는 사이클로포스파미드로 인한 체중 감소를 완화시켰다(G6, 111.1% ± 1.9%, P = 0.032 대 비히클 그룹, P = 0.05 대 사이클로포스파미드 그룹)(도 28).
2.4 흑색종 동물 모델의 체중에 대한 d5PAO의 효과
건강한 쥐와 비교했을 때, 종양이 있는 쥐의 체중은 모두 감소하였다. 비히클 그룹의 종양-보유 마우스와 비교하여, 단독으로 사용된 30 ㎎/㎏의 테모졸로미드는 마우스 체중을 감소시켰고(0일에 비해 88% ± 1.5%), 고용량 d5PAO와 함께 사용된 테모졸로미드(1.5 ㎎/㎏)는 체중 감소를 완화시켰다(95% ± 2%, P = 0.01 대 테모졸로미드 그룹, P = 0.038 대 비히클 그룹). 단독으로 사용된 d5PAO는 종양-보유 동물의 체중에 유의한 영향을 미치지 않았다(도 29).
실시예 12. HCoV229E(인플루엔자 코로나바이러스)에 대한 PAO 및 d5PAO의 억제 효과
시험 화합물 및 대조 화합물
대조용 화합물인 렘데시비르는 WuXi AppTec에서 제공하였다. 화합물을 DMSO 용액을 사용하여 20 mM 저장 용액으로 제조하였다. 시험 샘플 및 대조용 화합물을 8개 농도에서 시험하고 복제 웰을 사용하여 2배 또는 3배 구배로 희석하였다.
세포주, 바이러스 균주 및 시약
MRC5 세포 및 HCoV229E 균주를 ATCC에서 구입하였다. 세포를 10% 소 태아 혈청(Hyclone), 1% 이중항체(Hyclone), 1% L-글루타민(Gibco) 및 1% 불필수 아미노산(Gibco)이 보충된 EMEM(Sigma) 배양액에서 배양하였다. 실험 배양액으로서 5% 소 태아 혈청(Hyclone), 1% 이중항체(Hyclone), 1% L-글루타민(Gibco) 및 1% 불필수아미노산(Gibco)이 보충된 EMEM(Sigma) 배양액을 사용하였다. 이번 프로젝트에 사용된 주요 시약은 세포 생존력 검출 키트 CellTiter-Glo(Promega)이다.
시험 방법
MRC5 세포를 96-웰 분석 플레이트에 웰당 20000개 세포로 시딩하고 37℃, 5% CO2 배양기에서 밤새 배양하였다. 다음 날, 배수-희석된 화합물(8개의 농도점, 2배 또는 3배 구배로 희석됨, 복제 웰)을 첨가한 다음, 바이러스를 웰당 200TCID50으로 세포에 첨가하였다. 세포 대조군(화합물 처리 또는 바이러스 감염이 없는 세포), 바이러스 대조군(바이러스에 감염된 세포, 화합물 처리 없음) 및 배양액 대조군(배양액만)을 설정하였다. 배양액 중 DMSO의 최종 농도는 0.5%였다. 세포를 배양기에서 3일 동안 배양하였다. 세포독성 실험 및 항바이러스 실험을 바이러스 감염이 없는 것을 제외하고는 동일한 실험 조건에서 동시에 수행하였다. 세포 생존력을 세포 생존력 분석 키트 CellTiter Glo(Promega)를 사용하여 검출하였다. 화합물의 항바이러스 활성 및 세포독성을 각각, 상이한 농도에서 바이러스에 의한 세포변성 효과에 대한 화합물의 억제율(%) 및 MRC5 세포의 생존력(%)으로서 표현하였다. 계산식은 하기와 같다:
억제율(%) = (시험 웰 판독값 - 바이러스 대조군 평균값)/(세포 대조군 평균값 - 바이러스 대조군 평균값) × 100
세포 생존력(%) = (시험 웰 판독값 - 배양액 대조군 평균값)/(세포 대조군 평균값 - 배양액 대조군 평균값) × 100
GraphPad Prism(버전 5)을 사용하여 화합물의 억제율 및 세포 생존력에 대한 비선형 피팅 분석을 수행하고, 화합물의 절반 유효 농도(EC50) 및 절반 세포독성 농도(CC50)를 계산하였다. 피팅 식은 하기와 같다: log(억제제) 대 반응--가변 기울기.
결과
도 30에 도시된 PAO 및 d5PAO 약물의 용량-반응 피팅 곡선. 대조용 화합물인 렘데시비르는 예상되는 항바이러스 활성과 세포독성을 보였다.
시험 결과, 시험 화합물 PAO와 P100은 HCoV229E에 대한 항바이러스 활성을 나타내었으며 이때 EC50 값은 각각 55.35 nM 및 47.21 nM이었다. 시험 화합물 PAO 및 P100은 각각 256.8 nM 및 317.5 nM의 CC50 값으로 MRC5 세포에 명백한 독성을 보였다.
실시예 13. 저용량 d5PAO 및 PAO의 항불안 및 항우울 효과의 비교
시험 동물
30마리의 수컷 ICR 마우스(2개월령)를 정상적인 일주기 리듬 및 기타 조건의 청정 등급 방에서 8주 동안 사육한 후 무작위로 3개의 그룹으로 분류하였다. 담체, PAO 및 d5PAO 그룹에게는 그룹당 2개의 케이지, 케이지당 5마리씩, 만성적인 예측 불가능한 다중 자극(CUMS)을 제공하였다.
CUMS 우울증 모델링
CUMS 우울증 모델링: 마우스에게 매주 매일 교대로 다양한 자극을 주어 마우스에 제공되는 각 자극의 지속 시간과 다음 자극의 패턴 및 지속 시간을 예측할 수 없도록 하였다. 첫 주의 자극과 일정을 표 6에 나타내었다. 표의 자극 패턴과 시간은 총 7개의 모듈을 형성한다. 두 번째 주부터, 월요일에 자극을 위해 7개 모듈을 무작위로 선택하고 화요일에 나머지 6개 모듈을 자극하도록 무작위로 선택하고 수요일에 나머지 5개 모듈을 무작위로 자극하는 식으로 계속하였다. 특정 날짜에 시험 시도가 예정되어 있는 경우, 이전 2일 및 시험 당일에 대한 자극을 적절하게 조정하였다.
CUMS 자극 일정
시간 자극 일정
월요일 9: 00 꼬리를 클립으로 고정시킨다
12: 00 꼬리 클립 고정을 멈추고, 녹나무 블록을 놓고, 마우스 케이지를 기울인다
화요일 10: 00 녹나무 블록을 제거하고 이물질(유리 또는 플라스틱 컵)을 놓는다
16: 00 음식물 및 이물질을 제거하고, 조명을 유지시킨다(스위치 켜기)
수요일 9: 00 3h 동안 백색 소음
12: 00 얼음 펠릿(200 ㎖)/케이지
목요일 9: 00 케이지를 교체하고, 약 7h 동안 백색소음을 낸다
16: 00 음식을 공급하고, 마우스 케이지를 기울이고, 플래시를 켠다
금요일 9: 00 플래시를 끄고 3h 동안 꼬리를 클립으로 고정시킨다
12: 00 음식을 공급하고, 6h 동안 백색 소음을 낸다
16: 00 백식 소음을 중지하고 야간 조명을 유지한다(스위치 켜기)
토요일 10: 00 마우스 케이지를 기울인다
16: 00 물을 제거하고, 마우스 케이지 기울기를 멈추고, 플래시를 켠다
일요일 9: 00 45℃-50℃ 온수 공급(150 ㎖/케이지)
투여 방법
CUMS 자극의 첫 주를 완료한 후, PAO 및 d5PAO 그룹의 마우스에게 각각 0.05 ㎎/㎏/일의 화합물 PAO 및 d5PAO 용액을 위내 투여하였다. 담체 그룹의 마우스에게는 매일 마우스 체중에 상응하는 부피로 MCT(MIGLYOL812N, IOI Oleo GmbH에서 공급)를 위내 투여하였으며, 여기서 MCT는 화합물 PAO 및 d5PAO의 용액을 제조하는 데 사용된 담체였다. MCT 중의 PAO 및 d5PAO 용액의 농도는 0.005 ㎎/㎖이었다.
참신 억제 섭식(NSF) 검사
참신 억제 섭식(novelty suppressed feeding)(NSF) 검사에서, 불투명한 플렉시 유리로 만들어진 25 ㎝ x 25 ㎝ x 25 ㎝(길이 × 너비 × 높이) 상자가 있었다. 상자는 상단이 열려 있고 중앙에 작은 플랫폼만 있고 플랫폼에 마우스 먹이 조각이 놓였다. 검사에서, 마우스를 이의 머리가 상자의 모서리를 향하도록 상자의 임의의 모서리에서 상자에 넣고 간섭 없이 5분 동안 자유롭게 움직이게 하였으며, 5분 이내의 첫 번째 식사의 대기 시간을 기록하였다. 마우스가 5분 이내에 식사를 하지 않으면 마우스를 꺼내고, 마우스의 첫 번째 식사의 대기 시간을 300s로 기록하였다. 첫 번째 식사의 대기 시간 길이(초)가 마우스의 불안 지수이다.
우울행동지수 : 설탕물 선호도 검사
설탕물 선호도 검사에서, 앞서 칭량한 동일한 두 개의 병을 깨끗한 마우스 케이지의 급수 장소에 놓았으며, 한 병에는 물이 들어 있었고 다른 한 병에는 1% 슈크로스 수용액이 들어 있었다. 검사에서, 마우스를 이의 머리가 병의 반대 방향을 향하도록 하여 병에서 떨어진 깨끗한 케이지의 끝에 놓았다. 마우스는 간섭 없이 1h 이내에 설탕물 또는 물에 자유롭게 접근할 수 있었다. 1h 후 마우스를 꺼내어 두 개의 병을 조심스럽게 꺼내 무게를 달아 마우스가 마신 설탕물과 물의 중량을 계산하여 각각 W물 및 W설탕물로서 카운트하였다. 마우스의 설탕물 선호도 = W설탕물/(W물 및 W설탕물) × 100%.
통계적 방법
통계 분석을 SPSS 소프트웨어를 사용하여 수행하였으며, 데이터를 평균 ± 평균의 표준오차(
Figure pct00134
±s.e.m)로서 표현하였다. PAO는 항우울 효과가 있는 것으로 알려져 있으므로, PAO 및 d5PAO 그룹과 담체 그룹 간의 투여 후 설탕물 선호도의 차이를 단측 독립표본 t 검정에 의해 유의수준에 대해 시험하였고, P < 0.05는 *로 표시하고, P < 0.01은 **로 표시하였다.
결과
3개의 마우스 그룹에게 3주간의 CUMS를 실시하고 담체(MCT), PAO 및 d5PAO 제제를 각각 15일 동안 위내 투여한 다음 참신 억제 섭식 검사(NSF)를 수행하였다. 그 결과 벡터 그룹에서 10마리 중 2마리만이 음식을 먹은 반면, 나머지 8마리는 제한된 5분 이내에 음식을 먹지 않았으며, 대기 시간은 300s로서 기록되었고, 이 그룹의 평균 불안 지수는 282 ± 12(초)였다. PAO 및 d5PAO 그룹의 평균 불안 지수는 각각 227 ± 29(초) 및 181 ± 36(초)으로, 이는 담체 그룹의 경우보다 유의하게 더 낮았다. 이는 저용량(0.05 ㎎/㎏/일) PAO 및 d5PAO도 명백한 항불안 효과를 가지며, d5PAO가 d5PAO보다 더 유의한 항불안 효과를 가짐을 가리켰다(도 31).
세 그룹의 마우스가 NSF 검사를 완료한 지 48h 후에, 상기 세 그룹의 마우스의 우울증 정도를 탐지하기 위해 설탕물 선호도 검사를 수행하였다. 도 27에 도시된 바와 같이, 담체, PAO 및 d5PAO 그룹의 마우스의 설탕물 선호도는 각각 66% ± 3.8%, 75% ± 4.3% 및 78% ± 2.4%였다. PAO 및 d5PAO 그룹의 설탕물 선호도는 담체 그룹의 경우보다 유의하게 더 높았으며, 이는 저용량(0.05 ㎎/㎏/일) PAO 및 d5PAO도 또한 유의한 항우울 효과를 가졌고 d5PAO가 PAO보다 더 유의한 항우울 효과가 있음을 가리킨다(도 32). 1차 설탕물 선호도 검사가 완료된 후, 세 그룹의 마우스에게 총 38일 동안 CUMS를 추가로 제공한 후 설탕물 선호도 검사를 수행하였다. 결과는 담체, PAO 및 d5PAO 그룹에서 마우스의 설탕물 선호도가 각각 71% ± 3.5%, 77% ± 2.0% 및 82% ± 2.9%임을 보여주었고; PAO 및 d5PAO 그룹의 설탕물 선호도는 담체 그룹에서보다 높았지만, PAO 그룹과 담체 그룹 간의 차이는 유의하지 않았으며, 이는 저용량(0.05 ㎎/㎏/일) PAO 및 d5PAO가 여전히 항우울 효과가 있고, d5PAO가 d5PAO보다 더 현저하고 안정적인 항우울 효과를 가졌음을 가리킨다(도 32).
실시예 14. NPC에 대한 d5PAO 및 PAO의 치료 효과 연구
세포내 콜레스테롤 수송 억제제인 U18666A는 C형 니만-픽병(NPC)의 세포 모델을 구성하는 데 종종 사용된다.
1. 세포 배양 및 화합물 처리
SH-SY5Y 세포를 37℃, 5% CO 배양기에서 고-글루코스 DMEM 및 15% FBS를 함유하는 완전 배지에서 배양하였다. 세포 융합이 70%에 도달하면, 10 μM U18666A(Absin(Shanghai) Biotechnology Co., Ltd.에서 구입, 카탈로그 번호 abs819512)를 첨가하고, 그룹별로 상이한 농도의 d5PAO 및 PAO를 첨가하여 24h 동안 배양하였다.
2. 필리핀(Filipin) 염색
1) 24웰 플레이트 중의 배양 배지를 버리고, PBS 완충액 1 ㎖를 첨가하여 1분간 정치시키고, 24웰 플레이트 중의 액체를 버리고, 이러한 단계를 2회 반복하였다;
2) 각 웰에 4% 파라포름알데히드 1 ㎖를 첨가하고, 실온에서 30분간 고정시켰다;
3) 24-웰 플레이트 중의 4% 파라포름알데히드를 버리고 PBS 완충제 1 ㎖를 첨가하고, 24-웰 플레이트를 1분간 부드럽게 흔들고, 24-웰 플레이트 중의 액체를 버리고, 이러한 단계를 2회 반복하였다;
4) 1.5 ㎎/㎖ 글리신 용액 1 ㎖를 각 웰에 첨가한 다음, 실온에서 10분 동안 배양하였다;
5) 24-웰 플레이트 중의 액체를 버리고, 최종 농도 50 ㎍/㎖의 필리핀 염색 용액 1 ㎖(sigma Aldrich에서 구입, 카탈로그 번호 SAE0087)를 첨가한 다음, 1h 동안 실온의 암실에서 배양하였다;
6) 24웰 플레이트 중의 액체를 버리고, PBS 완충액 1 ㎖를 첨가하고 24웰 플레이트를 1분 동안 부드럽게 흔들고, 24웰 플레이트 중의 액체를 버리고, 이러한 단계를 2회 반복하였다;
7) 슬라이드 글라스를 취하고, 슬라이드 글라스 중앙에 5 ㎕의 봉입제(DAPI 함유)를 적가하고, 세포 슬라이드를 꺼내 건조시키고, 세포가 자라는 면을 아래로 향하게 하여 슬라이드 글라스를 덮은 다음(이는 세포를 봉입제와 완전히 접촉시킨다), 실온의 암실에서 30분 동안 배양하였다.
8) 레이저 공초점 현미경을 사용하여 관찰을 수행하였다.
실험 결과
SH-SY5Y 세포를 10 μM U18666A로 처리하고, 그룹별로 상이한 농도의 d5PAO 및 PAO와 24h 동안 공-배양하고, 필리핀 염색 후에 관찰을 수행하였다. 면역형광 염색 결과 10 μM U18666A 처리 그룹에서 필리핀의 형광 강도가 대조군(ctrl)에서보다 더 강하였으며, 이는 10 μM U18666A 처리가 필리핀에 결합하는 콜레스테롤 량의 증가로 이어졌음, 즉 콜레스테롤 축적이 발생했음을 가리킨다. 10 μM U18666A 처리 그룹과 비교하여, 10 μM U18666A+35 nM d5PAO 공-처리 그룹, 10 μM U18666A+70 nM d5PAO 공-처리 그룹, 10 μM U18666A+35 nM PAO 공-처리 그룹 및 10 μM U18666A + 70 nM PAO 공-처리 그룹에서 필리핀의 형광 강도가 감소하였다(도 33). 상기 결과는 특정 농도의 d5PAO 및 PAO가 U18666A로 인한 콜레스테롤 축적을 억제할 수 있음을 나타낸다.
실시예 15. 자가포식-리소좀 경로(ALP) 활성화에 대한 PAO 및 PI4Ka 녹다운의 효과
이전 연구에 따르면 GD 및 기타 리소좀 축적 질환이 발생하는 동안 ALP가 차단되었다. SH-SY5Y 세포를 48h 동안 CBE로 처리하고, 24h 동안 그룹별로 양성 대조군으로서 첨가된 상이한 농도의 PAO 또는 mTOR 억제제 라파마이신(RAPA)과 공-배양하였다. 웨스턴 블롯 또는 면역형광 분석을 수행하였다. 자가포식-리소좀 경로에 대한 PAO 및 기타 화합물의 영향을, ALP의 공통 마커를 관찰하여 연구하였다. ALP의 공통 마커인 LC3B와 p62가 검출되었으며, 웨스턴 블롯은, CBE에 의해 구성된 SH-SY5Y 세포 모델에서 PAO가 용량 의존적으로 LC3B 단백질의 발현을 촉진하고 p62 단백질의 수준을 억제함을 보였으며, 이는 PAO가 ALP 경로를 활성화하고 자가포식 유출을 활성화시킴을 가리킨다(도 34A 내지 34C). 결과는 양성 대조군 500 nM RAPA와 유사하였다(도 34A 내지 34C). 면역형광 분석 결과는 웨스턴 블롯 결과와 일치하였다(도 34D). 또한, H+-ATPase 억제제 바필로마이신 A1(Baf-A1)은 통상적으로 사용되는 ALP 억제제이다. Baf-A1으로 ALP 신호를 차단함으로써, CBE에 의해 구성된 SH-SY5Y 세포에 대한 PAO와 같은 화합물의 보호 효과가 ALP와 연관되는지 여부를 추가로 확인할 수 있다. SH-SY5Y 세포를 48h 동안 CBE로 처리하고 24h 동안 그룹별로 상이한 농도의 PAO 또는 50 nM Baf-A1과 함께 배양하였다. 세포 생존력을 MTT에 의해 검출하였다. 실험 결과는 대조군(ctrl)과 비교하여 100 μM CBE가 SH-SY5Y 세포의 생존력을 유의하게 억제함을 보여주었다. 100 μM CBE 처리 그룹과 비교하여, 100 μM CBE+25 nM, 50 nM 및 75 nM PAO 공-처리 그룹은 세포 생존력을 유의하게 증가시켰다. 50 nM Baf-A1 처리는 해당 그룹에서 PAO의 보호 효과를 감소시켰고, 그 결과 50 nM Baf-A1 및 100 μM CBE+25 nM, 50 nM 및 75 nM 1PAO 공-처리 그룹의 세포 생존력이 100 μM CBE 처리 그룹의 경우와 크게 다르지 않았으며(도 34E), 이는 Baf-A1이 ALP 신호전달을 억제함으로써 CBE 처리된 SH-SY5Y 세포에 대한 PAO의 보호 효과를 차단함을 가리킨다. 상기 결과는 PAO가 ALP를 활성화하여 자가포식 유출을 활성화하고 ALP를 통해 GD 세포 모델에 보호 효과를 발휘함을 입증하였다. shRNA 간섭 렌티바이러스 벡터로 처리된 SH-SY5Y 세포를 ALP 경로 마커 LC3B에 대해 검출하였다. 결과는 하기를 나타내었다: sh-ctrl 그룹과 비교하여, LC3B 단백질의 수준은 PI4Ka 녹다운 후 유의하게 증가되었고(도 35), CBE-처리된 SH-SY5Y 세포에서 PI4Ka 녹다운은 또한 LC3B 단백질의 발현을 촉진시켰으며, 이는 PI4Ka 억제제 PAO의 결과와 유사하게 PI4Ka 녹다운이 ALP 경로도 또한 활성화시켰음을 가리킨다.
실시예 16. 화학-인자 유발된 폐렴 및 폐 섬유증에 대한 PAO 및 d5PAO의 내성
폐와 상기도는 병원체, 화학적 인자(약물 포함), 이물질, 물리적 손상, 알레르기 반응, 자가면역 이상 등 다양한 병인에 의해 염증 반응을 가장 빈번하게 일으키는 조직 및 기관이다. 유발되는 염증 반응은 국소 조직 또는 전신 혈액 중의 백혈구(호중구, 대식세포, 림프구 등)의 증가 및 다양한 염증 인자 또는 사이토카인의 증가로 나타난다. 병원체에는 미생물과 기생충이 포함된다. 미생물은 세균, 바이러스, 클라미디아, 마이코플라스마, 스피로헤타, 진균 등을 포함한다. 폐 염증은 때때로 폐 조직의 섬유증을 유발할 수 있으며, 이는 폐 구조와 기능을 손상시키고 특히 산소의 환기 및 확산을 손상시킨다.
블레오마이신은 명확히 폐렴과 폐 섬유증을 유발할 수 있는 약물 또는 화학 물질이다. 동물의 폐에서 블레오마이신에 의해 유발되는 간질성 폐렴 및 폐 섬유증은 특발성 폐 섬유증(IPF)의 일반적인 모델이다. IPF는 진행성 및 비가역성 폐 섬유증을 특징으로 하는 치명적인 질환으로서, 현재로서는 특별한 치료법이 없다. 기존 치료 방법의 치료 효과는 크지 않다. 대부분의 환자는 증상이 시작된 후 3-8년 이내에 진행성 호흡부전으로 사망하였다. 우리는 IPF 병인의 근원적인 기전에 대해 거의 알지 못하지만, 상징적인 병리학적 특징에는 염증 반응, 섬유아세포의 과증식 및 세포외 기질의 비정상적인 침착이 포함된다.
마우스에서 블레오마이신 유발 폐렴 및 폐 섬유증에 대한 PAO 및 d5PAO의 효능은 염증 반응 및 조직 섬유증에 대한 PAO 및 d5PAO의 약학 적용의 일례이다.
실험 방법:
블레오마이신 유도
1. 블레오마이신의 준비
블레오마이신을 생리식염수에 용해시키고 최종 농도를 용량에 따라 조절하였다.
2. 유도 방식
1일째에, 동물을 2-5% 이소플루란을 흡입하여 마취시켰다. 체중을 기준으로 동물에게 블레오마이신을 기관내 투여하였다(2 ㎎/㎏, 투여된 특정 부피를 동물의 체중을 기준으로 계산하고 기록하였다).
3. 투여
블레오마이신 유도를 받은 날을 시험 1일로 간주하였다. 3일째에, 동물을 스크리닝하고 분류하였다. 시험 8일째에, 시험이 끝날 때까지 모든 동물에게 1일 1회 투여하였다. 특정 투여 요법에 대해서 표 7을 참조하십시오.
분류 및 투여 섭생
그룹 시험 대상 동물 투여 경로 농도
㎎/㎖ 		투여 농도 투여 섭생
㎎/㎏ ㎖/㎏
1 정상 그룹a 6 경구 복용 / - 10 D8-D21, q.d
2 모델 그룹a 10 경구 복용 / - 10 D8-D21, q.d
3 닌테다닙 10 경구 복용 5 50 10 D8-D21, q.d
4 PAO 10 경구 복용 0.03 0.3 10 D8-D21, q.d
5 d5PAO 10 경구 복용 0.03 0.3 10 D8-D21, q.d
a: MCT
4. 샘플 수집 및 분석
21일째에, 투여 후 기관지 반응성을 시험한 후, 모든 동물을 2-5% 이소플루란을 흡입하여 마취시키고, 안와에서 최소 0.5 ㎖의 전혈을 수집하였다. 혈액을 EDTA-2K로 항응고시키고, 혈장을 4℃에서 10000 rpm으로 원심분리하여 -80℃에서 보관하였다. 동물로부터 혈액 샘플을 채취한 후, 졸레틸(Zoletil)(복강 내 주사, 25-50 ㎎/㎏, 1 ㎎/㎖ 자일라진 함유)로 동물을 마취시키고, 기관 캐뉼라를 삽입하고, PBS(1% FBS 함유) 0.5 ㎖을 폐의 첫 번째 세척에 사용하였다. 또 다른 0.5 ㎖의 PBS(1% FBS 함유)를 폐의 두 번째 세척을 위해 취하였다. 100 ㎕의 현탁액을 취하여 BALF의 총 세포 수를 카운트하였다. BALF를 4℃에서 5분 동안 300 g에서 원심분리하고, 세포 덩어리가 없는 기관지폐포 세척액(BALF) 상등액을 수집하였다. 마우스의 BALF에서 염증 인자(예를 들어, TNF-α, IL-1β, IL-6 및 IFN-γ) 및 사이토카인의 농도를 전기화학발광 면역분석(Merck MSD로부터의 마우스 인자 X 검출 키트, V-PLEX 염증전 패널1마우스 키트, 카탈로그 번호 15048D-X)에 의해 검출하였다. 원심분리 후 수득된 세포 덩어리를 도말 준비를 위해 재현탁하고 라이트-김사(Wright-Giemsa) 염색 용액으로 염색하여 호산구, 호중구, 대식세포 및 림프구를 구별하였다. 광학 현미경 하에서 세포를 카운트하였다.
세척 후, 동물을 경추 탈구를 통해 안락사시켰다. 폐 조직을 채취하고 오른쪽 폐를 냉동 보관하고 균질화 후 전체 단백질을 추출하였다. I형 콜라겐, 히알루론산 및 α-SMA의 함량을 상업적인 ELISA 키트로 검출하였고, 모든 샘플을 복제 웰에 로딩하였다.
왼쪽 폐를 수집하고 중성 포름알데히드에 고정시켰다. 각 동물의 왼쪽 폐를 3등분하여 파라핀 블록에 포매하여 파라핀 포매 블록과 두께 5마이크론의 초박 절편을 제조하였다. 마쏜(Masson) 염색 후, 조직병리학적 평가를 수행하였다.
혈장 중의 히알루론산 및 콜라겐 수준의 검출을 위한 ELISA
각 그룹 마우스의 혈장 중 히알루론산 및 I형 콜라겐을 히알루론산 ELISA 키트(마우스 Quantikine ELISA 키트, Biotechne, 카탈로그 번호 DHYAL0) 및 I형 콜라겐 ELISA 키트(마우스 I형 콜라겐 검출 ELISA 키트, Chondrex, 카탈로그 번호 6012)의 제품 설명서에 따라 검출하였다.
시험 지수
1. 체중
전체 실험 기간 동안 동물을, 모델링 당일 1회, 분류 당일 1회, 분류 후 주 3회 체중을 측정하여 동물의 체중을 기록하였다.
2. 폐기능 검사
기관지 과민성 분석을, 폐 기능을 측정하기 위해 제한되지 않은 전신 혈량계(WBP) 시스템을 사용하여 시험 마우스에서 수행하였다. 먼저, 마우스에게 에어로졸 흡입을 통해 PBS 용액을 제공한 다음 연속 에어로졸 흡입을 통해 1.5625, 3.125, 6.25, 12.5, 25 및 50 ㎎/㎖의 메타콜린(Mch)을 제공하고 해당 농도에서 향상된 일시정지(Penh)를 측정하고, 각 농도에서 90s 동안 자극을 수행하였다. 기준선-Mch 농도에 대한 Penh의 변화율 곡선을 플롯팅하고 곡선 아래 면적을 계산하였다.
3. 병리학적 평가
각 동물의 왼쪽 폐를 3등분하여 파라핀 블록에 포매하여 파라핀 포매 블록과 두께 5마이크론의 초박 절편을 준비하였다. 각 파라핀 블록에서 하나의 섹션을 준비하고 섬유증 평가를 위해 마쏭 염색을 수행하였다. 채점 기준은 표 8을 참조하시오.
섬유증 채점 기준
점수 기준
1 정상
3 최소 섬유증성 비후
5 중등도 섬유증성 비후
7 폐 조직 손상이 있는 섬유증(두꺼운 다발)
8 큰 섬유 영역, "벌집 모양"을 보인다
I형 콜라겐, 히알루론산, α-SMA 및 10가지 인자(TNF-α, IL-1β, IL-6 등)의 함량 검출
수집된 오른쪽 폐 조직을 상업적인 검출 키트의 설명에 따라 균질화 처리하여 I형 콜라겐, 히알루론산 및 α-SMA 함량을 검출하였다. BALF에서 사이토카인의 발현을 MSD에 의해 측정하였다.
세포 덩어리가 없는 BALF 상등액을 수집하고, BALF 내 사이토카인의 발현(TNF-α, IL-1β 및 IL-6과 같은 10가지 인자의 함량)을 MSD로 측정하고, 샘플을 복제 웰에 로딩하였다.
시험 관찰
동물의 건강 상태를 하루에 두 번 케이지 근처에서 관찰하였으며, 동물실에 관한 일지에 기록하였다.
칭량과 동시에, 프로젝트 팀원들이 동물의 상태를 관찰하였다. 비정상적인 모습이나 행동은 PharmaLegacy 생물학적 시험 관찰표에 자세히 기록해야 한다. 예를 들어, 투여 후 동물의 체중이 현저히 감소(15% 이상)하거나 기타 부작용(혼수, 부동, 정신적 권태감 등)이 발생한 경우, 그러한 사건을 즉시 의뢰인에게 보고하고 용량이나 투여 섭생의 변경 여부를 의뢰인과 논의해야 한다.
통계 분석:
시험 데이터를 평균 ± 평균의 표준 오차(평균 ± S.E.M)로 표현하였다. 데이터를 SPSS 또는 Graphpad Prism을 사용하여 분석하였다. 사용된 특정 분석 방법은 도면 범례와 하기 표의 참고 사항에 설명되어 있다. P < 0.05는 통계적 차이를 나타낸다.
실험 결과:
기관지 과민성 분석을 WBP 시스템을 사용하여 시험 마우스에 대해 수행하였다. 먼저, 마우스에게 에어로졸 흡입을 통해 PBS 용액을 제공한 다음 연속 에어로졸 흡입을 통해 1.5625, 3.125, 6.25, 12.5, 25 및 50 ㎎/㎖의 메타콜린(Mch)을 제공하고 해당 농도에서 향상된 일시정지(Penh)를 측정하고, 각 농도에서 90s 동안 자극을 수행하였다. PBS에서 각 마우스의 Penh 백분율 및 기준선에 대한 상이한 농도의 Mch를 계산하였다. 결과를 표 9에 나타내었다. 기준선-Mch 농도에 대한 Penh의 변화율 곡선을 플롯팅하고(도 36), 곡선 아래 면적을 계산하였다(표 10). 이러한 결과는 PAO 및 d5PAO가 폐 섬유증으로 인한 폐 기능 손상을 잘 개선시킬 수 있음을 가리키며, 여기서 d5PAO의 효과는 PAO의 효과보다 강하다.
각 그룹의 동물의 BALF에서 10개의 염증인자(TNF-α, IL-1β, IL-6 등) 및 사이토카인을 전기화학발광 면역분석으로 검출하였다. 표 11에 나타낸 바와 같이, PAO와 d5PAO는 모두 IFN-γ, IL-1β, IL-2, IL-5, IL-6 및 TNF-α의 상향조절에 대한 억제 효과가 있었으며, 특히 IL-6의 상향 조절에 대해 강한 억제효과를 보였다.
각 그룹의 마우스의 BALF 세포를, 슬라이드를 도말하는 데 사용하고, 라이트-김사 염색 용액으로 염색하여 호산구, 호중구, 대식세포 및 림프구를 구별하고 광학 현미경 하에서 카운트하였다. 각 그룹의 4가지 유형의 세포에 대한 총 카운트 결과를 표 9에 나타내며, 각 그룹의 4가지 유형의 세포에 대한 각 카운트 결과를 도 38에 나타낸다. PAO 및 d5PAO는 폐 섬유증에 의해 야기된 총 염증 세포수, 및 4가지 유형의 염증세포의 증가에 대한 억제 효과가 상이하며, 특히 호중구 증가에 대해 유의한 억제 효과를 갖는 것으로 나타났다.
폐 섬유증은 종종 혈 중 히알루론산과 콜라겐 수치의 상승을 동반한다. 따라서, 혈장 내 히알루론산 및 콜라겐의 수준을 ELISA로 시험하였다. 일부 결과를 도 39 및 도 40에 나타내었으며, 이는 PAO 및 d5PAO가 폐 섬유증에 의한 혈장 히알루론산 및 콜라겐 증가에 대해 억제 효과가 있음을 가리키고, 여기서 히알루론산 증가 억제 효과는 양성 대조용 약물(닌테다닙)과 비교하여 현저히 높다.
[표 9]
기준선에 대한 메타콜린에 의해 유도된 향상된 일시정지(Penh)의 백분율
Figure pct00135
양방향 ANOVA, ### < 0.001 대 정상 그룹; ** < 0.01 및 *** < 0.001 대 모델 그룹.
기준선-Mch 농도에 대한 Penh의 변화율의 곡선 아래 면적(AUC)
그룹 penh 값의 AUC 억제율
정상 그룹(6) 13166 --
모델 그룹(10) 18522 --
닌테다닙(10) 16732 9.67%
PAO 그룹(10) 14921 19.45%
d5PAO(10) 14549 21.45%
각 그룹에서 동물의 기관지폐포 세척액(BALF) 내 염증인자 및 사이토카인의 함량(pg/㎖)
인자 정상 그룹(6) 모델 그룹(10) 양성 약물 그룹(10) PAO(10) d5PAO(9)
IFN-γ 0.07 ± 0.01 0.08 ± 0.00 0.13 ± 0.05 0.07 ± 0.00 0.07 ± 0.01
IL-10 1.87 ± 0.09 2.4 ± 0.23 2.17 ± 0.16 2.19 ± 0.16 2.37 ± 0.24
IL-12p70 31.39 ± 2.27 23.31 ± 1.03 25.09 ± 1.12 23.30 ± 2.52 24.32 ± 2.41
IL-1β 0.36 ± 0.02 0.77 ± 0.14 1.24 ± 0.34 0.71 ± 0.12 0.73 ± 0.15
IL-2 0.30 ± 0.02 0.31 ± 0.02 0.31 ± 0.04 0.30 ± 0.02 0.29 ± 0.04
IL-4 0.28 ± 0.02 0.22 ± 0.01 0.24 ± 0.01 0.23 ± 0.02 0.23 ± 0.02
IL-5 0.52 ± 0.07 1.64 ± 0.61 5.67 ± 3.38 1.57 ± 0.27 1.20 ± 0.27
IL-6 9.69 ± 0.81 290.24 ± 251.49 371.98 ± 216.68 34.59 ± 6.64 82.83 ± 49.05
KC/GRO 3.13 ± 0.62 7.97 ± 0.99 9.01 ± 1.89 7.15 ± 1.00 11.45 ± 3.41
TNF-α 0.61 ± 0.06 5.51 ± 0.81 3.83 ± 0.61 5.16 ± 0.79 4.82 ± 0.92
본 발명의 특정 구현예가 예시의 목적으로 여기에 설명되었지만, 본 발명의 진의 및 범위로부터 이탈되지 않고 다양한 변형이 이루어질 수 있음은 당업자에게 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 특정 구현예 및 실시예가 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명은 첨부된 청구범위에 의해서만 제한된다. 여기에 인용된 모든 문서는 그 전체가 참고로 포함된다.

Claims (38)

  1. 하기 화학식 I의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염:
    화학식 I
    Figure pct00136

    여기서 R1, R2, R3, R4 및 R5는 수소, 중수소, 할로겐, 메틸, 일-중수소화 메틸(mono-deuterated methyl), 이-중수소화 메틸 또는 삼-중수소화 메틸 중에서 독립적으로 선택되고, R1, R2, R3, R4 및 R5 중 적어도 하나는 중수소 또는 중수소화 메틸이다.
  2. 제1항에 있어서,
    R1, R2, R3, R4 및 R5가 수소 또는 중수소 중에서 독립적으로 선택되고, R1, R2, R3, R4 및 R5 중 적어도 하나, 적어도 2개, 및 바람직하게는 적어도 3개, 4개 또는 5개가 중수소인, 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  3. 제2항에 있어서,
    하기로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는, 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염:
    Figure pct00137
    ,
    Figure pct00138
    ,
    Figure pct00139
    ,
    Figure pct00140
    ,
    Figure pct00141
    ,
    Figure pct00142
    ,
    Figure pct00143
    ,
    Figure pct00144
    ,
    Figure pct00145
    ,
    Figure pct00146
    ,
    Figure pct00147
    ,
    Figure pct00148
    ,
    Figure pct00149
    ,
    Figure pct00150
    ,
    Figure pct00151
    ,
    Figure pct00152
    ,
    Figure pct00153
    ,
    Figure pct00154
    및
    Figure pct00155
    .
  4. 대상체(subject)에서 질환 또는 병리학적 반응(pathological reaction)을 예방 또는 치료하기 위한 약물(drug)의 제조에서의, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염의 용도.
  5. 제4항에 있어서,
    질환이 종양(tumor), 악액질(cachexia), 예를 들어 종양의 치료를 위한 화학요법 약물(chemotherapeutic drug)에 의해 야기된 암(malignancy) 또는 악액질, 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 세포내 단백질 미스폴딩(misfolding)과 관련된 질환, 리소좀 축적 질환(lysosomal storage disease), 염증 반응, 조직 및 기관 섬유증(tissue and organ fibrosis), 바이러스에 의해 야기된 감염성 질환 및 신경증(neurosis) 중에서 선택되는, 용도.
  6. 제4항에 있어서,
    대상체가 인간 또는 비-인간 포유동물인, 용도.
  7. 제5항에 있어서,
    종양이 림프종(lymphoma), 자궁경부암(cervical cancer), 간암(liver cancer), 삼중 음성 유방암(triple negative breast cancer)과 같은 유방암, 비-소세포 폐암(non-small cell lung cancer) 또는 소세포 폐암(small cell lung cancer)과 같은 폐암, 결장직장암(colorectal cancer), 위암(gastric cancer), 흑색종(melanoma)과 같은 피부암(skin cancer), 골암종(osteocarcinoma), 골육종(osteosarcoma), 골수종(myeloma), 백혈병(leukemia) 또는 난소암(ovarian cancer) 중에서 선택되는, 용도.
  8. 제5항에 있어서,
    세포내 단백질 미스폴딩과 관련된 질환이 파킨슨병(Parkinson's disease), 루이소체 치매(Lewy body dementia), 다계통 위축(multiple system atrophy), 봉입체 근육염(inclusion body myositis), 전두측두엽 치매(frontotemporal dementia), 헌팅톤병(Huntington's disease), 폴리글루타민병(polyglutamine disease), 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis) 또는 프리온병(prion disease)인, 용도.
  9. 제5항에 있어서,
    리소좀 축적 질환이 스핑고지질 대사 장애, 예를 들어 고셔병(Gaucher disease), C형 니만-픽병(Niemann-Pick disease), 점액다당류증(mucopolysaccharidosis), 글리코겐 축적 질환(glycogen storage disease), 당단백질 축적 질환(glycoprotein storage disease), 지질 축적 질환(lipid storage disease), 번역-후 변형 결핍증(post-translational modification deficiency), 통합 막 단백질 결핍 장애(integral membrane protein deficiency disorder), 신경지방갈색소증(neuronal ceroid lipofuscinosis) 또는 리소좀-관련 소기관 장애(disorder of lysosome-related organelle)인, 용도.
  10. 제5항에 있어서,
    염증 반응이 국소 조직 또는 전신 혈액 중의 TNF-α 또는 IL-6과 같은 염증 인자의 증가에 의해 나타나는, 용도.
  11. 제5항에 있어서,
    조직 및 기관 섬유증이 폐 섬유증(pulmonary fibrosis) 또는 간 섬유증(hepatic fibrosis) 중에서 선택되는, 용도.
  12. 제5항에 있어서,
    바이러스가 코로나바이러스 및 비-코로나바이러스를 포함하고, 바람직하게 상기 코로나바이러스가 조류 감염성 기관지염 바이러스, 돼지 유행성 설사 바이러스, 돼지 전염성 위장염 바이러스, 돼지 혈구응집성 뇌척수염 바이러스, 돼지 델타 코로나바이러스, 개 호흡기 코로나바이러스, 마우스 간염 바이러스, 고양이 코로나바이러스, 인간 코로나바이러스, 중증 급성 호흡기 증후군 바이러스, 중동 호흡기 증후군 바이러스 또는 신종 코로나바이러스 중에서 선택되며, 상기 비-코로나바이러스가 C형 간염 바이러스 또는 HIV 중에서 선택되는, 용도.
  13. 제5항에 있어서,
    신경증이 신경쇠약(neurasthenia), 불안증(anxiety), 우울증(depression) 또는 조증(mania) 중에서 선택되는, 용도.
  14. 제5항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    제2 제제(second agent)를, 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함을 추가로 포함하는, 용도.
  15. 제14항에 있어서,
    질환이 종양 중에서 선택되고, 제2 제제가 종양 치료제이며, 질환이 폐 섬유증 중에서 선택되고, 제2 제제가 폐 섬유증 치료제, 예를 들어 혈관 내피 성장 인자 수용체 티로신 키나제 억제제, 바람직하게는 닌테다닙인, 용도.
  16. 제15항에 있어서,
    제2 제제가 종양 치료제이고, 상기 종양 치료제가 파클리탁셀, 젬시타빈, 사이클로포스파미드 및 테모졸로미드 중 적어도 하나로부터 선택되는, 용도.
  17. 제14항에 있어서,
    제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이 제2 제제의 투여 전에, 투여 후에 또는 투여와 동시에 투여되는, 용도.
  18. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 약제학적으로 허용되는 염 및 약제학적으로 허용되는 담체(carrier)를 포함하는 약제학적 조성물.
  19. 제18항에 있어서,
    종양 치료용 약물을 추가로 포함하는 약제학적 조성물.
  20. 제19항에 있어서,
    종양 치료용 약물이 파클리탁셀, 젬시타빈, 사이클로포스파미드 및 테모졸로미드 중 적어도 하나로부터 선택되는, 약제학적 조성물.
  21. 하기 단계를 포함하는, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염의 제조 방법:
    Figure pct00156

    1) 0 내지 10℃에서 화학식 I에 상응하는 구조를 갖는 아닐린 또는 이의 염의 수용액에 농축된 염산 및 아질산나트륨의 수용액을 순차적으로 첨가하고, 5℃ 미만의 온도를 유지시키는 단계;
    2) 탄산나트륨, 삼산화비소 및 황산구리 수용액을 90℃-100℃로 가열하고, 이어서 상기 수용액을 냉각시키고, 상기 냉각된 수용액에 단계 1)에서 제조된 용액을 첨가하고, 생성 혼합물을 교반 및 여과하고, 산을 첨가하여 여액의 pH 값을 조절하고, 침전된 고체를 분리시키는 단계; 및
    3) 상기 침전된 고체, 요오드화칼륨, 아황산수소나트륨 또는 염산 및 이산화황을 메탄올 중에서 반응이 완료될 때까지 교반하고, 이어서 후-처리를 수행하여 화합물을 수득하는 단계.
  22. 폐 섬유증 또는 간 섬유증과 같은 조직 및 기관 섬유증을 예방 또는 치료하기 위한 약물의 제조에 있어서의, 옥소페닐아르신 및 이의 유도체의 용도.
  23. 염증 반응을 예방 또는 치료하기 위한 약물의 제조에 있어서의, 옥소페닐아르신 및 이의 유도체의 용도로서, 여기서 상기 염증 반응이 국소 조직 또는 전신 혈액 중의 TNF-α 또는 IL-6과 같은 염증 인자의 증가에 의해 나타나는, 용도.
  24. 종양을 치료하기 위한 화학요법 약물에 의해 야기된 암 또는 악액질과 같은 악액질을 예방 또는 치료하기 위한 위한 약물의 제조에 있어서의, 옥소페닐아르신 및 이의 유도체의 용도.
  25. 종양을 예방 또는 치료하기 위한 위한 약물의 제조에 있어서의, 옥소페닐아르신 및 이의 유도체의 용도.
  26. 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    옥소페닐아르신 및 이의 유도체가 하기 화학식 II의 구조 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 갖는, 용도:
    화학식 II
    Figure pct00157

    상기식에서,
    (a) R6은 각각 독립적으로 H, 할로겐, 니트로, 시아노, 하이드록실, 아미노, 카바모일, C1-6 알킬설푸릴, C1-6 알킬, C1-6 사이클로알킬, C2-6 알키닐, C2-6 알케닐, C1-6 알콕시, C1-6 할로알킬, C1-6 알킬렌-NH2, C1-6 알킬렌-NH-C(O)H, -As(O), -N=NH, N-(C1-6 알킬)아미노, N,N-(C1-6 알킬)2아미노, -NH-C(O)H, -NH-S(O)2H, -C(O)OH, -OC(O)H, -SH, -S(O)2H, -S(O)2-NH2 또는 헤테로사이클릴 중에서 선택되고 R7 또는 R8로 임의로 치환되고, 여기서 R7 및 R8은 각각 독립적으로 아미노, C1-6 알킬, C1-6 알콕시, C1-6 할로알킬, N-(C1-6 알킬)아미노, N-(6 내지 12-원 아릴)아미노, N,N-(C1-6 알킬)2아미노, C3-6 사이클로알킬, 6-12원 아릴 또는 3-12원 헤테로사이클릴 중에서 선택되고 할로겐, 니트로, 시아노, 하이드록실, 아미노, 카바모일, -NH-C(O)-R10, -C(O)OR9, 6-12원 아릴, C1-6 알킬, C2-6 알키닐, C2-6 알케닐, C1-6 알콕시, C1-6 할로알킬, 3-6원 헤테로사이클릴, C3-6 사이클로알킬 또는 Bn-O- 중 하나 이상으로 임의로 치환되고, 여기서 R9는 C1-6 알킬이고 할로겐, 니트로, 시아노, 하이드록실, 아미노, 카바모일, 6-12원 아릴, C1-6 알킬, C2-6 알키닐, C2-6 알케닐, C1-6 알콕시, C1-6 할로알킬, 3-6원 헤테로사이클릴, C3-6 사이클로알킬 또는 Bn-O- 중 하나 이상으로 임의로 치환되고, 여기서 R10은 H, C1-6 알킬, C2-6 알키닐, C2-6 알케닐, C1-6 알콕시 또는 C1-6 할로알킬 중에서 선택되고; 및/또는
    (b) 2개의 인접한 탄소 원자상의 R6은 5-12원 사이클로알킬, 아릴 또는 헤테로사이클릴을 형성하고, 이는 할로겐, 니트로, 시아노, 하이드록실, 아미노, 카바모일, 6-12원 아릴, C1-6 알킬, C2-6 알키닐, C2-6 알케닐, C1-6 알콕시, C1-6 할로알킬, 3-6원 헤테로사이클릴, C3-6 사이클로알킬 또는 Bn-O- 중 하나 이상으로 임의로 치환되고,
    여기서 n은 0 내지 5의 정수이다.
  27. 제26항에 있어서,
    n이 0 내지 2의 정수이고, R6이 각각 독립적으로 H, 할로겐, 니트로, 시아노, 하이드록실, 아미노, 카바모일, C1-6 알킬설푸릴, C1-6 알킬, C1-6 사이클로알킬, C1-6 알콕시, C1-6 할로알킬, -As(O), N-(C1-6 알킬)아미노, N,N-(C1-6 알킬)2아미노, -NH-C(O)H 또는 -NH-S(O)2H 중에서 선택되고, R7 또는 R8로 임의로 치환되는, 용도.
  28. 제26항에 있어서,
    n이 0 내지 2의 정수이고, R1이 각각 독립적으로 H, 할로겐, 니트로, 시아노, 하이드록실, 아미노, C1-6 알킬설푸릴, C1-6 알킬, C1-6 사이클로알킬, C1-6 알콕시, C1-6 할로알킬, -As(O), -NH-C(O)H 또는 -NH-S(O)2H 중에서 선택되고, R7 또는 R8로 임의로 치환되는, 용도.
  29. 제26항에 있어서,
    n이 1 또는 2이고, R6이 각각 독립적으로 H, 할로겐, 아미노, C1-6 알킬설푸릴, C1-6 사이클로알킬, C1-6 알콕시, C1-6 할로알킬, -NH-C(O)R7 또는 -NH-S(O)2R8 중에서 선택되고, 여기서 R7이 C1-6 알킬이고, 이는 6-12원 아릴로 임의로 치환되고, R8이 6-12원 아릴이고, 이는 할로겐, C1-6 알콕시 또는 C1-6 할로알킬 중 하나로 임의로 치환되는, 용도.
  30. 제29항에 있어서,
    R6이 -As(O) 기에 대해 오르토 위치 및/또는 파라 위치에 위치하는, 용도.
  31. 제26항에 있어서,
    n이 0인, 용도.
  32. 제26항에 있어서,
    화합물이 하기로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는, 용도:
    Figure pct00158
    ,
    Figure pct00159
    ,
    Figure pct00160
    ,
    Figure pct00161
    ,
    Figure pct00162
    ,
    Figure pct00163
    ,
    Figure pct00164
    ,
    Figure pct00165
    ,
    Figure pct00166
    ,
    Figure pct00167
    ,
    Figure pct00168
    ,
    Figure pct00169
    ,
    Figure pct00170
    ,
    Figure pct00171
    ,
    Figure pct00172
    ,
    Figure pct00173
    ,
    Figure pct00174
    ,
    Figure pct00175
    ,
    Figure pct00176
    ,
    Figure pct00177
    ,
    Figure pct00178
    ,
    Figure pct00179
    ,
    Figure pct00180
    ,
    Figure pct00181
    ,
    Figure pct00182
    ,
    Figure pct00183
    ,
    Figure pct00184
    ,
    Figure pct00185
    ,
    Figure pct00186
    ,
    Figure pct00187
    ,
    Figure pct00188
    ,
    Figure pct00189
    ,
    Figure pct00190
    ,
    Figure pct00191
    ,
    Figure pct00192
    ,
    Figure pct00193
    ,
    Figure pct00194
    ,
    Figure pct00195
    ,
    Figure pct00196
    ,
    Figure pct00197
    ,
    Figure pct00198
    ,
    Figure pct00199
    ,
    Figure pct00200
    ,
    Figure pct00201
    ,
    Figure pct00202
    ,
    Figure pct00203
    ,
    Figure pct00204
    ,
    Figure pct00205
    ,
    Figure pct00206
    ,
    Figure pct00207
    ,
    Figure pct00208
    ,
    Figure pct00209
    ,
    Figure pct00210
    ,
    Figure pct00211
    ,
    Figure pct00212
    ,
    Figure pct00213
    ,
    Figure pct00214
    ,
    Figure pct00215
    ,
    Figure pct00216
    ,
    Figure pct00217
    ,
    Figure pct00218
    ,
    Figure pct00219
    ,
    Figure pct00220
    ,
    Figure pct00221
    ,
    Figure pct00222
    ,
    Figure pct00223
    ,
    Figure pct00224
    ,
    Figure pct00225
    ,
    Figure pct00226
    ,
    Figure pct00227
    ,
    Figure pct00228
    ,
    Figure pct00229
    ,
    Figure pct00230
    ,
    Figure pct00231
    ,
    Figure pct00232
    ,
    Figure pct00233
    ,
    Figure pct00234
    ,
    Figure pct00235
    ,
    Figure pct00236
    ,
    Figure pct00237
    ,
    Figure pct00238
    ,
    Figure pct00239
    ,
    Figure pct00240
    ,
    Figure pct00241
    ,
    Figure pct00242
    ,
    Figure pct00243
    ,
    Figure pct00244
    ,
    Figure pct00245
    ,
    Figure pct00246
    ,
    Figure pct00247
    ,
    Figure pct00248
    및
    Figure pct00249
    .
  33. 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    대상이 인간 또는 포유동물인, 용도.
  34. 제25항에 있어서,
    종양이 림프종, 자궁경부암, 간암, 삼중 음성 유방암과 같은 유방암, 비-소세포 폐암 또는 소세포 폐암과 같은 폐암, 결장직장암, 위암, 흑색종과 같은 피부암, 골암종, 골육종, 골수종, 백혈병 또는 난소암 중에서 선택되는, 용도.
  35. 제25항에 있어서,
    제2 제제를, 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함을 추가로 포함하며, 여기서 제2 제제가 바람직하게는 종양을 치료하기 위한 제제인, 용도.
  36. 제35항에 있어서,
    제2 제제가 종양을 치료하기 위한 제제인, 용도.
  37. 제35항에 있어서,
    화합물이 제2 제제의 투여 전에, 투여 후에 또는 투여와 동시에 투여되는, 용도.
  38. 제37항에 있어서,
    종양 치료제가 파클리탁셀, 젬시타빈, 사이클로포스파미드 및 테모졸로미드 중 적어도 하나로부터 선택되는, 약제학적 조성물.

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