KR20230020945A - 세포내 단백질 미스폴딩-관련 질환 및 리소좀 축적 질환에서 pi4k 억제제의 적용 - Google Patents

세포내 단백질 미스폴딩-관련 질환 및 리소좀 축적 질환에서 pi4k 억제제의 적용 Download PDF

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웨난 왕
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Abstract

세포내 단백질 미스폴딩-관련 질환의 예방 또는 치료에서 PI4KIIIα 특이적 억제제의 용도를 제공하며, 리소좀 축적 질환의 예방 또는 치료에서 PI4KIIIα 특이적 억제제의 용도를 또한 제공한다.

Description

세포내 단백질 미스폴딩-관련 질환 및 리소좀 축적 질환에서 PI4K 억제제의 적용
본 발명은 세포내 단백질 미스폴딩(misfolding)-관련 질환의 예방 또는 치료에서 PI4KIIIα 특이적 억제제의 용도에 관한 것이며, 한편으로 본 발명은 리소좀 축적 질환(lysosomal storage disease)의 예방 또는 치료에서 PI4KIIIα 특이적 억제제의 용도에 관한 것이다.
리소좀은 단백질, 탄수화물, 지질 등을 분해할 수 있는 가수분해효소를 포함하여, 다양한 외부 및 내인성 거대분자를 분해할 수 있는 다수의 가수분해효소를 함유하는, 소포 구조의 단층막으로 둘러싸인 세포내 기관이며, 따라서 리소좀은 단백질, 핵산 및 다당류와 같은 생물학적 거대분자를 분해할 수 있으며 또한 세포 자체의 국소 세포질 또는 세포소기관을 소화할 수 있다. 리소좀은 1차 리소좀과 2차 리소좀으로 분류된다.
1차 리소좀은 직경이 약 0.2 내지 0.5 um이고 막 두께가 7.5 ㎚이며 내용물이 균일하고 뚜렷한 입자가 없으며 골지체에서 분비되어 형성된다. 1차 리소좀은 하기의 과정에 의해 트랜스 골지체상에서 출아(budding) 형태로 형성된다: 소포체상의 리보솜이 리소좀 단백질을 합성하고, 리소좀 단백질은 N-연결된 글리코실화 변형을 위해 소포체 공동에 들어가며, 먼저 상기 리소좀 효소 단백질에 3개의 글루코스, 9개의 만노스 및 2개의 N-아세틸글루코스아민이 제공되고, 이어서 3분자의 글루코스 및 1 분자의 만노스가 제거되며, 생성되는 리소좀 효소 단백질은 시스 골치체에 들어가고; N-아세틸글루코스아민 포스포트랜스퍼라제는 리소좀 가수분해효소의 신호 플라크를 인식하며; N-아세틸글루코스아민 포스페이트를 1 내지 2개의 만노스 잔기로 전달하고; N-아세틸글루코스아민은 내측 골지체에서 N-아세틸글루코스아미니다제에 의해 절단되어 M6P 리간드를 형성하고; M6P 리간드는 시스 골지체상의 수용체에 결합하고; 선택적인 패키징에 의해 1차 리소좀이 형성된다. 1차 리소좀에는 활성이 없는 가수분해효소가 많이 포함되어 있으며 상기 가수분해효소는 리소좀이 파열되거나 다른 물질이 들어갈 때만 활성을 갖는다. 1차 리소좀의 가수분해효소는 프로테아제, 뉴클레아제, 리파제, 포스파타제, 설파타제 및 포스파티다제를 포함하며, 60개가 넘는 가수분해효소가 공지되어 있고, 가수분해효소는 모두 산 가수분해효소에 속하며, 반응을 위한 최적 pH 값은 약 5이고, 리소좀 막의 두께는 세포질 막의 두께와 유사하지만, 상기 리소좀 막의 성분은 세포질 막의 성분과 상이하며, 주요 차이는 하기와 같다: (1) 리소좀 막에는 양성자 펌프가 있고 H+가 리소좀내로 펌핑되어 상기 리소좀의 pH 값을 감소시키며; (2) 막 단백질은 고도로 글리코실화되어 상기 막 단백질 자체의 분해를 방지하는 데 이로울 수 있다.
2차 리소좀은 모두 소화를 진행 중이거나 완료 중인 식포로, 가수분해효소와 해당 기질을 포함하고 있으며, 소화시키고자 하는 물질이 외부 출처로부터 유래하는 포식리소좀과, 소화시키고자 하는 물질이 세포 자체의 다양한 성분들로부터 유래하는 자가포식 리소좀으로 분류될 수 있다.
2차 리소좀은 리소좀 기질의 출처에 따라 하기와 같이 분류된다:
(1) 세포질 막에 불투과성인 거대분자 용액 또는 바이러스, 세균 등을 지칭하고, 음세포작용(pinocytosis)(수용체-매개된 내포작용 포함)을 통해 전자에 의해 형성된 음작용 소포(또는 엔도솜) 및 식세포작용(phagocytosis)을 통해 후자에 의해 형성된 포식 액포가 각각 1차 리소좀(또는 엔도리소좀)과 융합하여 2차 리소좀(또는 리소좀)을 형성하는 헤테로리소좀(heterolysosome);
(2) 부분적으로 손상되거나 노화된 세포소기관(미토콘드리아, 소포체 단편 등)을 둘러싸고 있는 자가포식소체(autophagosome)와 1차 리소좀(또는 엔도리소좀)이 융합하여 형성된 2차 리소좀을 지칭하는, 자가리소좀 또는 자가포식 리소좀. 자가리소좀 또는 자가포식 리소좀에서 소화된 물질은 내인성이다. 소화될 수 없는 잔류 물질을 포함하는 2차 리소좀을 잔류 소체라고 한다. 일부 잔류 물질은 배출될 수 있지만, 일부 잔류 물질은 장기간 세포에 저장되어 배출되지 않는다.
포스트-리소좀(post-lysosome)이라고도 하는 잔류소체(residual body)는 효소 활성을 상실하고 단지 소화되지 않은 잔류물만을 갖는다. 잔류소체는 유출에 의해 세포에서 배출될 수 있으며, 또한 간세포의 리포푸신과 같이 세포 내부에 남아 해마다 증가할 수 있다.
따라서 리소좀은 자가포식, 내포작용 및 ER-골지체 경로와 같은 다중 세포 대사 경로의 공통 접합 하류이다. 자가포식 또는 자가포식 리소좀 매개 신호전달 경로는 세포내 단백질 항상성을 유지하기 위한 주요 조절 시스템 중 하나로 간주된다(Manecka et al ., 2017). 자가포식-리소좀 신호 전달 경로는 거대자가포식과 샤페론 매개 자가포식(CMA)의 두 가지 모드에 의해 실현된다. 거대자가포식은 주로, 리소좀과 융합하여 리소좀에 단백질을 도입시켜 분해하는 자가포식소체의 형성으로 시작한다(Bento et al ., 2016). CMA는 샤페론(예를 들어, Hsc70)이 표적 단백질에 결합하고 리소좀 수용체 LAMP2A를 통해 상기 단백질을 리소좀으로 수송하여 분해시키는 것이다(Cuervo and Wong, 2014).
가수분해효소의 부재로 인한 리소좀 기능 결함, 가수분해효소의 불충분한 활성, 유전적 변이 및 기타 인자로 인한 활성제 단백질, 수송체 단백질 또는 리소좀 단백질 가공 및 리소좀 보정을 위한 효소의 결핍은 2차 리소좀에서 상응하는 기질의 절단 실패, 기질의 축적 및 대사 장애를 일으키며, 따라서 이는 리소좀 축적 장애(LSD)의 형성으로 이어진다. LSD는 고셔병(Gaucher's disease), 폼페병(Pompe disease) 및 C형 니만-픽병(Niemann-Pick Type C disease)(NPC)을 포함하여 60가지가 넘는 질환을 포함한다. 지금까지, 이와 같은 질환의 치료를 위한 주요 전략은 리소좀 효소 기질의 합성을 차단하거나 리소좀 효소를 교체하는 것이었으나, 대부분의 치료는 제한된 효능을 갖는다(Platt et al., 2018). 따라서, 자가포식 및 리소좀 분비를 촉진함으로써 리소좀 중에 축적된 물질을 세포 밖으로 제거하는 것은 LSD에 대한 새로운 치료 방향이다(Samie and Xu, 2014).
더욱 또한, 다양한 단백질 봉입체 응집 질환(미스폴딩으로 인한 봉입체 중의 세포내 단백질 응집으로 인한 질환)에서, mTOR(Kahan, 2011, Decreassac et al., 2013, Magahaes et al., 2016, Tian et al., 2016), 베클린(Beclin)-1 (Spencer et al., 2009), 스페르미딘(Spermidin)[14](Buttner et al., 2014), PLK2 (Mbefo et al., 2010) 및 LAMP2(Xilouri et al., 2013)와 같은 다양한 자가포식-리소좀 조절인자의 발현 및 활성은 다양한 정도로 변한다. 이들 봉입체 내에서 응집되는 단백질, 예를 들어 파킨슨병(Parkinson's disease)(PD) 및 루이소체 치매(Lewy body dementia)(LBD)와 연관된 α-시누클레인은 자가포식-리소좀 경로에 존재하거나 이에 의해 분해된다(Dehay et al., 2010. J. Neurosci, 30:12535-12544). 따라서 자가포식 및 리소좀 분비를 촉진하면 세포가 이러한 단백질의 제거를 촉진하여 봉입체 응집을 감소시킬 수 있다.
리소좀 내용물에는 다수의 중요한 효소와, 세포 밖으로 배출시킬 필요가 있는 세포 폐기물이 함유되어 있다. 미세아교 리소좀은 리소좀 외포작용(exocytosis)에 의해 이의 내용물을 세포로부터 방출시키고, 리소좀의 분비 기능의 일부는 리소좀 외포작용에 의해 달성되며, 상기 외포작용은 소포가 세포질 막과 융합한 다음 이의 내용물을 세포외 공간으로 방출시키는 에너지-의존적인 활동이다. 리소좀은 세포질 막과의 완전한 융합을 통해 내용물을 방출하거나, 또는 "키스 앤드 런(kiss-and-run)"에 의해 외포작용을 겪을 수 있다. "키스-앤드-런" 외포작용의 경우, 리소좀 소포와 세포질 막과의 융합은 일시적이며, 상기 소포의 내용물을 방출되게 하는 융합 기공의 신속한 개방과 폐쇄를 수반한다.
리소좀 분비(외포작용)의 조절은 파킨슨병 및 루이소체 치매를 포함한 리소좀 축적 질환 및 세포 봉입체 응집 질환의 치료에 유효한 치료학적 접근법을 제공할 것으로 예상된다.
세포 봉입체 질환 다계통 위축증(MSA) 환자의 뇌 조직에서 자가포식소체 형성 관련 유전자 GABARAPs/GATE-16의 수준이 유의하게 감소되며, 이는 자가포식소체 단백질 수준이 MSA 환자에서 억제되고 따라서 자가포식 시스템의 성숙화 과정이 중단됨을 가리킨다(Tanji et al ., 2013). 또 다른 연구[22](Miki et al ., 2016)는 MSA에서 α-시누클레인 결합 단백질의 분해가 상기 단백질에 결합된 자가포식/베클린1 조절인자 1(AMBRA1) 단백질에 의해 조절되고, MSA 뉴런 중 AMBRA1 과인산화 수준이 현저하게 증가됨을 나타내었다. 마우스 피질 세포에 대한 시험관내 실험은 자가포식 억제제가 AMBRA1의 활성을 침묵시켜, α-시누클레인의 응집을 초래할 수 있음을 보여주었다.
봉입체 근염(inclusion body myositis)(IBM)에서 15-18 ㎚의 튜불린과 같은 세포 내 단백질의 폴딩 및 침착은 매우 흔하다.
일부 가족성 전두측두엽 변성은 프로그래뉼린(PGRN) 유전자의 돌연변이와 관련될 수 있다. 프로그래뉼린은 성장인자이며, 유전자 돌연변이는 성장인자의 감소를 유발하여 신경의 성장과 복구를 방해할 수 있다. TAR-DNA 결합 단백질 43(TDP-43, 전사 조절 핵 단백질)의 비정상적인 인산화가 운동 뉴런 질환을 동반한 전두측두엽 변성과 밀접하게 관련되어 있다는 것이 최근에 밝혀졌다.
폴리글루타민병(Polyglutamine disease)(PolyQ 질환)은 9개 질환(헌팅턴병(HD); X-연관 구척수성 근위축증(spinal bulbar muscular atrophy)(SBMA), 치상핵적핵-담창구시상하부위축증(dentatorubralpalludoluysian atrophy)(DRPLA) 및 6개의 척수 소뇌 위축증(spinal cerebellar atrophy)(SCA 1, 2, 3, 6, 7 & 17))으로 이루어진다. 각 질환과 연관된 단백질은 상이하지만, 이들은 자가포식의 유동성의 불활성화와 연관되며[26](Cortes et al ., 2015), 자가포식소체 마커 단백질 P62는 SBMA 마우스 모델에서 신체의 행동 및 운동 기능의 결함을 완화할 수 있다[27](Doi et al ., 2013). DRPLA 드로소필라 모델은 응집체에 리포푸신 및 P62가 있는, 리소좀 축적 질환과 유사한 표현형을 나타내며, 이는 자가포식 장애로 인한 리소좀 소화 기능의 불활성화를 가리킨다[28](Settembre et al., 2008).
헌팅턴병(Huntington disease)에서, Htt 유전자의 돌연변이는 비정상적인(CAG-암호화된) 길이의 폴리글루타민의 번역 및 축적을 초래한다.
근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis)(ALS) 환자의 95%의 운동 뉴런은 주로 TDP-43 단백질로 구성된 봉입체를 함유한다. FUS 및 SOD1과 같은 다른 단백질도 또한 ALS 환자에서 빈번히 함께 응집된다.
프리온병(Prion disease)은 미스폴딩된 프리온 단백질(PrP)에 의해 발생하는 질환이다(Cai et al., 2016). 정상적인 PrP(PrPC)는 세포막에 존재하며 감염 형태(PrPSc)로 전환될 수도 있다.
포스파티딜이노시톨(PI)과 이의 대사 효소는 리소좀 형성과 수송에 중요한 역할을 한다. PI4KIIIβ가 리소좀의 방출과 리소좀 물질의 분류를 조절할 수 있는 것으로 밝혀졌다[38, 39](Sridhar S, Patel B, Aphkhazava D, et al. The lipid kinase PI4KIIIβ preserves lysosomal identity[J]. The EMBO Journal, 2012, 32(3):324-339; De Barry J, Janoshazi, Dupont J L, et al. Functional Implication of Neuronal Calcium Sensor-1 and Phosphoinositol 4-Kinase-beta Interaction in Regulated Exocytosis of PC12 Cells [J]. Journal of Biological Chemistry, 2006, 281(26):18098-18111). 골지체의 PI4KIIIβ와 PI4KIIα는 모두 리소좀으로의 리소좀 효소 및 단백질의 전달을 조절하거나 촉진하는 데 관여한다. 조직학적으로 PI4KIIα 유전자-결실된 마우스는 리포푸신 침착물을 보이며, 이는 PI4KIIα의 하향 조절이 엔도리소좀 수송을 억제하여, 척수에서 푸르키네 세포 감소 및 축삭 결함을 유발함을 가리킨다. PI4KIIIβ 및 PI4KIIα의 억제는 리소좀 단백질의 축적과 고셔병(리소좀 축적 장애)을 초래한다(Jovic M, Kean M J, Szentpetery Z, et al. Two phosphatidylinositol 4-kinases control lysosomal delivery of the Gaucher disease enzyme-glucocerebrosidase[J]. Molecular Biology of the Cell, 2012, 23(8):1533-1545). 그러나, 리소좀 수송에서 PI4KIIIα의 역할은 보고되지 않았다.
PI4KIIIα는, 세포막 상에 위치한 스캐폴드 단백질 TTC7A 또는 TTC7B 및 Efr3a 또는 Efr3b뿐만 아니라 세포질 단백질 FAM126A 또는 FAM126B 또는 이들의 상동성 단백질(homologous protein)과 함께 세포막 상에 단백질 복합체를 형성하고, 세포막 상의 포스파티딜이노시톨-4 포스페이트(PI4P)의 수준을 직접 조절하며; PI4KIIIα의 발현 또는 세포막 상의 위치는 Efr3a/Efr3b, TTC7A/TTC7B 및 FAM126A/FAM126B에 의존한다(Baird D, Stefan C, et al., J Cell Biol, 2008, 183: 1061-1074; Nakatsu F, Baskin JM, et al., J Cell Biol, 2012, 199: 1003-1016; Baskin JM, Wu X et al., Nat Cell Biol, 2016, 18: 132-138; Zhang X, Jiang LX, et al., J Neurosci, 2017, 37(16): 4928-4941; Lees JA, Zhang Y, et al., PNAS, 2017, 114: 13720-13725).
하나의 양태에서, 본 발명은 세포내 단백질 미스폴딩-관련 질환을 예방 또는 치료하기 위한 약물의 제조(preparation)에서 PI4KIIIα 특이적 억제제의 용도를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 리소좀 축적 질환을 예방 또는 치료하기 위한 약물의 제조에서 PI4KIIIα 특이적 억제제의 용도를 제공한다.
일부 구현예에서, PI4KIIIα 특이적 억제제는 항체, 소분자(small molecule) 화합물, RNAi 분자 또는 안티센스(antisense) 핵산이다.
일부 구현예에서, 항체는 단클론 항체(monoclonal antibody) 또는 다클론 항체이다.
일부 구현예에서, 항체는 키메라 항체(chimeric antibody), 인간화된 항체 또는 완전한 인간 항체이다.
일부 구현예에서, RNAi 분자는 작은 간섭 RNA(siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA) 또는 마이크로RNA(miRNA)이다.
일부 구현예에서, RNAi 분자는 길이가 18-100개 염기이다.
일부 구현예에서, RNAi 분자는 이의 안정성을 향상시키기 위해 변형된다.
일부 구현예에서, PI4KIIIα 특이적 억제제는 소분자 화합물이다.
일부 구현예에서, 소분자 화합물은 페닐아르신 옥사이드 또는 이의 유도체, G1 및 이의 유사체, A1 및 이의 유사체이다.
일부 구현예에서, 페닐아르신 옥사이드 및 이의 유도체는 하기 화학식 I로 나타내는 바와 같은 구조 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 갖는다:
[화학식 I]
Figure pct00001
상기식에서,
각각의 R1은 (a) H, 할로겐, 니트로, 시아노, 하이드록실, 아미노, 카바모일, C1-6 알킬설푸릴, C1-6 알킬, C1-6 사이클로알킬, C2-6 알키닐, C2-6 알케닐, C1-6 알콕시, C1-6 할로알킬, C1-6 알킬렌-NH2, C1-6 알킬렌-NH-C(O)H, -As(O), -N=NH, N-(C1-6 알킬)아미노, N,N-(C1-6 알킬)2 아미노, -NH-C(O)H, -NH-S(O)2H, -C(O)OH, -OC(O)H, -SH, -S(O)2H, -S(O)2-NH2 또는 헤테로사이클릴 중에서 독립적으로 선택되고, R2 또는 R3으로 임의로 치환되며, 여기서 R2 및 R3은 각각 독립적으로 아미노, C1-6 알킬, C1-6 알콕시, C1-6 할로알킬, N-(C1-6 알킬) 아미노, N-(6-12원 아릴)아미노, N,N-(C1-6 알킬)2 아미노, C3-6 사이클로알킬, 6-12원 아릴 또는 3-12원 헤테로사이클릴 중에서 선택되고, 하나 이상의 할로겐, 니트로, 시아노, 하이드록실, 아미노, 카바모일, -NH-C(O)-R5, -C(O)OR4, 6-12원 아릴, C1-6 알킬, C2-6 알키닐, C2-6 알케닐, C1-6 알콕시, C1-6 할로알킬, 3-6원 헤테로사이클릴, C3-6 사이클로알킬 또는 Bn-O-로 임의로 치환되고, R4는 C1-6 알킬이고, 하나 이상의 할로겐, 니트로, 시아노, 하이드록실, 아미노, 카바모일, 6-12원 아릴, C1-6 알킬, C2-6 알키닐, C2-6 알케닐, C1-6 알콕시, C1-6 할로알킬, 3-6원 헤테로사이클릴, C3-6 사이클로알킬 또는 Bn-O-로 임의로 치환되고, R5는 H, C1-6 알킬, C2-6 알키닐, C2-6 알케닐, C1-6 알콕시 또는 C1-6 할로알킬 중에서 선택되고, 및/또는
(b) 2개의 인접한 탄소 원자상의 R1은 5-12원 사이클로알킬, 아릴 또는 헤테로사이클릴을 형성하고, 하나 이상의 할로겐, 니트로, 시아노, 하이드록실, 아미노, 카바모일, 6-12원 아릴, C1-6 알킬, C2-6 알키닐, C2-6 알케닐, C1-6 알콕시, C1-6 할로알킬, 3-6원 헤테로사이클릴, C3-6 사이클로알킬 또는 Bn-O-로 임의로 치환되고,
여기서 n은 0 내지 5의 정수이다.
일부 구현예에서, n은 0 내지 2의 정수이고, 각각의 R1은 H, 할로겐, 니트로, 시아노, 하이드록실, 아미노, 카바모일, C1-6 알킬설푸릴, C1-6 알킬, C1-6 사이클로알킬, C1-6 알콕시, C1-6 할로알킬, -As(O), N-(C1-6 알킬)아미노, N,N-(C1-6 알킬)2 아미노, -NH-C(O)H 또는 -NH-S(O)2H 중에서 독립적으로 선택되고, R2 또는 R3으로 임의로 치환된다.
일부 구현예에서, n은 0 내지 2의 정수이고, 각각의 R1은 H, 할로겐, 니트로, 시아노, 하이드록실, 아미노, C1-6 알킬설푸릴, C1-6 알킬, C1-6 사이클로알킬, C1-6 알콕시, C1-6 할로알킬, -As(O), -NH-C(O)H 또는 -NH-S(O)2H 중에서 독립적으로 선택되고, R2 또는 R3으로 임의로 치환된다.
일부 구현예에서, n은 1 또는 2이고, 각각의 R1은 H, 할로겐, 아미노, C1-6 알킬설푸릴, C1-6 사이클로알킬, C1-6 알콕시, C1-6 할로알킬, -NH-C(O)R2 또는 -NH-S(O)2R3 중에서 독립적으로 선택되고, 여기서 R2는 C1-6 알킬이고 하나의 6-12원 아릴로 임의로 치환되고, R3은 6-12원 아릴이고 하나의 할로겐, C1-6 알콕시 또는 C1-6 할로알킬로 임의로 치환된다.
일부 구현예에서, R1은 -As(O)의 오르토- 및/또는 파라-위치에 위치한다.
일부 구현예에서, n은 0이다.
일부 구현예에서, 소분자 화합물은 하기의 화합물로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다:
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일부 구현예에서, 대상체(subject)는 인간 또는 포유동물이다.
일부 구현예에서, 세포내 단백질 미스폴딩-관련 질환은 파킨슨병(Parkinson's disease), 루이소체 치매(Lewy body dementia), 다계통 위축(multiple system atrophy), 봉입체 근염(inclusion body myositis), 전두측두엽 치매(frontotemporal dementia), 헌팅톤병(Hungtington disease), 폴리글루타민병(polyglutamine disease), 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis), 또는 프리온병(Prion disease)이다.
일부 구현예에서, 리소좀 축적 질환은 스핑고지질 대사 장애(sphingolipid metabolism disorder), 점액다당류증(mucopolysaccharidosis), 글리코겐 축적 질환(glycogen storage disease), 당단백질 축적 질환(glycoprotein storage disease), 지질 축적 질환(lipid storage disease), 번역-후 변형 결핍증(post-translational modification deficiency), 통합 막 단백질 결핍 장애(integral membrane protein deficiency disorder), 신경지방갈색소증(neuronal ceroid lipofuscinosis) 또는 리소좀-관련 세포소기관 장애이다.
일부 구현예에서, 스핑고지질 대사 장애는 고셔병이다.
일부 구현예에서, 제2 제제(second agent)를, 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 제2 제제는 세포내 단백질 미스폴딩-관련 질환 치료제 또는 리소좀 축적 질환 치료제이다.
일부 구현예에서, PI4KIIIα 특이적 억제제는 제2 제제 이전에, 이후에 또는 이와 동시에 투여된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 약물 후보물(drug candidate)을 PI4KIIIα 단백질 또는 핵산 또는 PI4KIIIα와 접촉시키는 단계, 및 상기 약물 후보물이 PI4KIIIα의 형성 또는 활성을 억제할 수 있는지 여부를 검출하는 단계를 포함하는, 세포내 단백질 미스폴딩-관련 질환을 예방 또는 치료하기 위한 약물을 스크리닝(screening)하기 위한 방법을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 약물 후보물을 PI4KIIIα 단백질 또는 핵산 또는 PI4KIIIα와 접촉시키는 단계, 및 상기 약물 후보물이 PI4KIIIα의 형성 또는 활성을 억제할 수 있는지 여부를 검출하는 단계를 포함하는, 리소좀 축적 질환을 예방 또는 치료하기 위한 약물을 스크리닝하기 위한 방법을 제공한다.
본 발명은 PI4KIIα 또는 PI4KIIIβ 유전자의 결실에 의해 생성된 결과와 반대로, PI4KIIIα의 억제가 리소좀 분비를 촉진하여 세포 및 리소좀에서 다양한 분자의 축적 또는 저장을 감소시킨다는 것을 발견하였다. 소분자 화합물 PAO와 같은 PI4KIIIα 억제제는 PI4KIIIα 활성을 억제함으로써 혈액뇌장벽을 통과하고, 리소좀 분비를 촉진하며, 세포 및 리소좀 중의 다양한 분자의 축적 또는 저장을 감소시켜, 기존 치료법의 결함을 보완할 수 있다.
도 1은 PI4KIIIα의 억제가 미세아교세포 리소좀 외포작용을 유도함을 나타낸다. (A) 로딩액에서 배양되고 27개의 스폿이 무작위로 선택된 대조군, 도 1(A)에서 스케일 바는 22 ㎛이다; (B) 21개의 스폿이 무작위로 채택된 100 nM PAO 처리 그룹, 도 1(B)의 스케일 바는 22 ㎛이다; (C) 22개의 형광 스폿이 무작위로 채택된 PI4KIIIα 이형접합 녹아웃 그룹, 도 1(C)의 스케일 바는 16 ㎛이다.
도 2는 브로모페놀 블루(BPB)가 "키스-앤드-런" 외포작용으로 인해 미세아교세포의 리소좀에 진입하여 리소좀 형광성을 감소시킴을 나타낸다. 사진은 각각 0초 및 500초 동안의 형광 그래프이고, 선 그래프는 리소좀 형광 강도의 변화에 대한 그래프이다. (A) WT 세포가 0초째에 BPB 용액에서 배양되고 20개 스폿이 무작위로 선택된 대조군, 도 2(A)의 스케일 바는 16 ㎛이다; (B) WT 세포가 0초째에 BPB 및 PAO 용액에서 배양되고 22개의 스폿이 무작위로 채택된 PAO 처리 그룹, 도 2(B)의 스케일 바는 22 ㎛이다; (C) 0초째에 BPB 용액에서 배양되고 22개의 스폿이 무작위로 채택된 PI4KIIIα 이형접합 녹아웃 세포 그룹, 도 2(C)의 스케일 바는 22 ㎛이다.
도 3은 BPB가 리소좀으로부터 빠져나간 후의 미세아교세포 리소좀 형광성의 회복/증가를 나타낸다. 사진은 각각 0초, 200초 및 500초 동안의 형광 그래프이고, 선 그래프는 약물 투여 60분 전에 BPB 용액을 첨가했을 때의 리소좀 형광 강도 변화 그래프이다. (A) WT 세포가 0초째에 로딩 용액에서 배양되고 22개의 스폿이 무작위로 선택된 대조군; (B) WT 세포가 0초째에 PAO 용액에서 배양되고 28개의 스폿이 무작위로 선택된 PAO 처리 그룹; (C) 0초째에 BPB 용액에서 배양이 수행되고 26개의 스폿이 무작위로 채택된 PI4KIIIα 이형접합 녹아웃 세포 그룹. 도 3의 스케일 바는 22 ㎛이다.
도 4는 PI4KIIIα 효소 활성의 억제가 미세아교세포 리소좀에 의한 ATP의 세포외 분비를 촉진함을 나타낸다. (A) 리소좀과 ATP의 공동-국소화(localization). 좌측 그래프: 1 μM 퀴나크린(Quinacrine)-표지된 WT 미세아교세포내 ATP 분자, 중간 그래프: Lyso 추적자-표지된 리소좀, 우측 그래프: 채널 병합 후 공동-국소화된 형광 그래프. 도 4의 스케일 바는 16 ㎛이다. (B) 100 nM PAO 처리된 WT 세포 그룹 및 PI4K+/- 세포 그룹의 세포외 ATP 농도.
도 5는 뉴런 세포의 PI4KIIIα-유도된 리소좀 외포작용의 억제를 나타낸다. 해마 뉴런에 있는 리소좀의 형광 사진을 0초 및 500초에서 촬영한다. (A) 대조군; (B) 100 nM PAO 처리 그룹. 도 5의 스케일 바는 16 ㎛이다.
도 6은 PAO가 α-시누클레인의 과발현으로 인한 세포사 또는 세포자멸사를 억제함을 나타낸다. PAO 처리를 12시간 동안 수행하고 MTT를 첨가하고 세포를 4시간 동안 배양하고 흡광도 값을 측정한다. (A) 사진은 세포 생존을 나타낸다; (B) 세포 생존율.
도 7은 PAO 및 PI-07이 α-시누클레인 분비를 촉진함을 나타낸다.
도 8은 PAO가 세포내 α-시누클레인 단백질 수준을 하향 조절함을 나타낸다. (A) ELISA는 세포내 α-시누클레인 단백질 수준을 검출한다. n = 6, 일원 ANOVA, **p <0.001 대 α-syn-OE. (B) 웨스턴 블롯은 세포내 α-시누클레인 단백질 수준을 검출한다.
도 9는 PAO가 HTT 단백질 및 SOD1 단백질의 분비를 촉진함을 나타낸다. (A) ELISA는 HTT 단백질 분비를 검출하고; (B) ELISA는 SOD1 단백질을 검출한다.
도 10은 CBE-유도된 SH-SY5Y 세포 손상을 감소시키는 PAO의 효과를 나타낸다. MTT 분석은 세포 생존율을 검출한다. (A) 상이한 농도의 CBE에 의한 SH-SY5Y 세포 처리; (B) 100 μM CBE로 처리한 후 상이한 농도의 PAO로 24시간 동안 처리. n = 5, 일원 ANOVA, **p <0.001, ***p <0.0001, 대 α-syn-OE.
도 11은 PAO가 CBE-유도된 리소좀 응집 및 세포 내 글루코실세라마이드(GlcCer) 축적을 완화시킴을 나타낸다. (A) SH-SY5Y 세포와 리소좀 추적자를 30분 동안 배양한 다음 상등액을 버리고 상이한 농도의 PAO로 교체하고 10분 동안 배양하고 Lyso-추적자를 면역형광에 의해 관찰하고; (B) 각 그룹의 Lyso-추적자 형광 강도를 통계 분석한다. 스케일 바: 50 ㎛; n = 5; 일원 ANOVA 분석, 대조군과 비교하여 ##p <0.001, 100 μM CBE 처리 그룹과 비교하여 **p <0.001 및 ***p <0.0001; (C) 세포 용해물의 각 그룹에서 GlcCer 농도를 LC/MS 분석에 의해 통계 분석한다.
도 12는 PI4KIIIa 억제제 A1 및 G1이 CBE-유도된 리소좀 응집을 완화시킴을 나타낸다. SH-SY5Y를 100 μM CBE로 72시간 동안 처리한 다음, 리소좀 추적자(Lyso-추적자)를 첨가하여 리소좀을 표지하고; 30분 후, 50 nM 또는 75 nM A1 또는 G1을 제공하여 5분 및 10분간 처리하고, 4% 파라포름알데히드(PFA) 고정 후 관찰하였다. 스케일 바: 50 ㎛.
도 13은 PI4Ka의 녹다운이 리소좀 외포작용을 촉진하거나 리소좀 축적을 감소시킴을 나타낸다. 도 13A는 녹다운 웨스턴 블롯 분석이 48시간 동안 상이한 shRNA 렌티바이러스 벡터(sh-ctrl, sh1-PI4Ka, sh2-PI4Ka, sh3-PI4Ka)로 처리 된 SH-SY5Y 세포에서 PI4KⅢα 단백질 수준을 검출함을 나타내고; 도 13B는 웨스턴 블롯 분석 결과의 통계 분석이고; 도 13C는 면역형광 및 통계 분석에 의한 shRNA 간섭 렌티바이러스 벡터 처리 후의 Lyso-추적자 형광 강도의 검출을 나타낸다(도 13D). 스케일 바: 50 ㎛; n = 5; 데이터를 평균 ± SEM으로 표시한다, 일원 ANOVA 분석, ***p <0.0001.
도 14는 PAO가 LC3B 및 p62의 발현을 촉진하고, Baf-A1이 세포 모델에서 PAO 보호를 차단함을 나타내며, 여기서 도 34A는 웨스턴 블롯 분석에 의한 LC3B 및 p62 단백질의 검출을 나타내고; 도 34B 및 34C는 Image J 소프트웨어에 의한 LC3B 및 p62 단백질 신호 강도의 통계 분석을 나타내며; 도 34D는 면역형광에 의한 LC3B 및 p62의 검출을 나타내고, 적색: p62, 녹색: LC3B, 스케일 바: 50 ㎛; 도 34E는 MTT가 각 그룹에 대한 세포 생존력(viability)을 측정함을 나타내고, 통계 분석을 나타낸다. n = 5, 데이터를 평균 ± SEM으로 표시한다, 일원 ANOVA 분석, 대조군과 비교하여 ###p <0.0001, 100 μM CBE 처리그룹과 비교하여 **p <0.001.
도 15는 PI4Ka의 녹다운이 CBE-처리 및 CBE-비함유 처리된 세포에서 자가포식 경로를 활성화함을 나타낸다. PAO는 LC3B 및 p62의 발현을 촉진하고 Baf-A1은 세포 모델에서 PAO 보호를 차단한다. (A) 웨스턴 블롯 분석은 LC3B 및 p62 단백질을 검출한다; (B, C) Image J 소프트웨어에 의한 LC3B 및 p62 단백질 신호 강도의 통계 분석; (D) 면역형광에 의한 LC3B 및 p62 검출, 적색: p62, 녹색: LC3B, 스케일 바: 50 ㎛; (E) MTT 및 통계 분석에 의한 각 그룹에 대한 세포 생존력의 측정. n = 5, 데이터를 평균 ± SEM으로 표현한다, 일원 ANOVA 분석, 대조군과 비교하여 ###p <0.0001, 100 μM CBE 처리 그룹과 비교하여 **p <0.001.
도 16은 U18666A에 의해 유발된 콜레스테롤 축적의 PAO에 의한 억제를 나타낸다. 스케일 바: 50 ㎛.
본원에서 이후에, 본 발명을 구현예에 따라서 및 첨부 도면과 함께 상세히 기재할 것이다. 본 발명의 상기 양태 및 본 발명의 다른 양태는 하기의 상세한 설명으로부터 명백할 것이다. 본 발명의 범위는 하기의 구현예로 제한되지 않는다.
PI4KIIIα 특이적 억제제
본원에 사용되는 바와 같은 "PI4KIIIα 특이적 억제제"란 용어는 PI4KIIIα 유전자의 전사 또는 번역, 및/또는 PI4KIIIα 단백질의 활성을 특이적으로 줄이거나, 감소시키거나 또는 제거할 수 있는 다양한 물질을 지칭한다. 일부 구현예에서, 상기 PI4KIIIα 특이적 억제제는 PI4KIIIα의 활성을 적어도 5%, 10%, 20%, 40%, 50%, 80%, 90%, 95% 이상까지 감소시킬 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같이, "활성"은 증가 또는 감소와 함께 사용될 때, 가변량으로 또는 불변량으로 존재하지만 다양한 기능 활성으로 존재할 수 있는 검출된 기능 활성을 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같이, PI4KIIIα의 활성은 특정 위치에서 포스파티딜이노시톨(PI)을 인산화하는(예를 들어 포스파티딜이노시톨 4-포스페이트(PI4P)로 전환시킬 수 있는) PI4KIIIα 단백질의 활성을 지칭한다. PI4KIIIα 단백질에 대한 PI4KIIIα 특이적 억제제의 결합 상수는 PI4KIIIα 특이적 억제제의, 다른 비-특이적 결합 단백질에의 결합 상수의 적어도 2배이다. 일부 구현예에서, PI4KIIIα 특이적 억제제는 다른 PI4K 하위유형 단백질과의 혼합물을 포함하여, 바람직하게는 복합 혼합물 중의 PI4KIIIα 단백질을 인식할 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 PI4KIIIα 특이적 억제제는 PI4KIII을 PI4K 단백질(예를 들어 PI4KIIα 또는 PI4KIIβ를 포함한, PI4K 단백질)의 다른 하위유형보다 적어도 1배, 2배, 4배, 5배, 10배, 20배, 30배, 50배, 100배, 200배, 500배, 또는 10,000배 더 억제한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 상기 PI4KIIIα 특이적 억제제는 PI4KII(예를 들어 PI4KIIα 또는 PI4KIIβ)를 실질적으로 억제하지 않는다, 예를 들어 상기 PI4KIIIα 특이적 억제제의 IC50은 10 μM, 20 μM, 30 μM, 40 μM, 50 μM, 60 μM, 80 μM, 100 μM, 150 μM, 200 μM 또는 500 μM 이상이다.
일부 구현예에서, 상기 PI4KIIIα 특이적 억제제는 PI4KIIIα를 PI4KII의 다른 하위유형(예를 들어 PI4KIIIβ)보다 적어도 1배, 2배, 4배, 5배, 10배, 20배, 30배, 50배, 100배, 200배, 500배, 또는 10,000배 더 강하게 억제한다.
일부 구현예에서, PI4KIIIα에 대한 PI4KIIIα 특이적 억제제의 IC50은 100 μM, 80 μM, 50 μM, 30 μM, 20 μM, 10 μM, 5 μM, 3 μM, 2 μM, 1 μM, 0.5 μM, 0.2 μM, 0.1 μM, 0.05 μM, 0.02 μM, 0.01 μM, 0.005 μM, 0.002 μM 또는 0.001 μM 이하이다. 일부 구현예에서, 상기 PI4KIIIα 특이적 억제제는 항체, 소분자 화합물, RNAi 분자 또는 안티센스 핵산이다.
일부 구현예에서, PI4KIIIα 특이적 억제제는 항체이다.
본원에 사용되는 바와 같은 "항체"란 용어는 임의의 면역글로불린, 단클론 항체, 다클론 항체, 다가 항체, 2가 항체, 1가 항체, 또는 특정 항원에 결합하는 항체를 포함한다. 본원에서 "항체"란 용어는 통상적인 4-쇄 항체뿐만 아니라 4개의 쇄가 없는 덜 통상적인 항체(예를 들어 자연적으로 경쇄가 없는 항체)를 포함하고자 한다.
하나의 통상적인 온전한 항체는 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)를 포함하는 이종사량체이다. 포유동물의 중쇄는 α쇄, δ쇄, ε쇄, γ쇄 및 μ쇄로 분류될 수 있으며, 각각의 중쇄는 가변 영역(VH)과, 제1 불변 영역, 제2 불변 영역 및 제3 불변 영역(각각 CH1, CH2 및 CH3)으로 이루어지고; 포유동물의 경쇄는 λ쇄 또는 κ쇄로 분류될 수 있으며, 각 경쇄는 가변 영역(VL) 및 불변 영역으로 이루어진다. 통상적인 항체는 "Y"-형상이며, 이때 상기 "Y"-형상 구조의 목은 다이설파이드 결합에 의해 결합된 2개 중쇄의 제2 불변 영역과 제3 불변 영역으로 이루어진다. 상기 "Y"-형상 구조의 각 가지는 하나의 경쇄의 가변 영역 및 불변 영역에 결합하는 하나의 중쇄의 가변 영역 및 제1 불변 영역을 포함한다. 경쇄 및 중쇄의 가변 영역은 항원 결합을 결정한다. 각 쇄의 가변 영역은 3개의 고가변(hypervariable) 영역, 즉 상보성 결정 영역(CDR)(경쇄에 대한 CDR은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고, 중쇄에 대한 CDR은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함한다)을 함유한다. 3개의 CDR은 프레임워크 영역(FR)으로서 공지된 측면 인접 부분 사이에 삽입되며, 상기 FR은 CDR보다 더 고도로 보존되고 고가변 루프를 지지하는 스캐폴드를 형성한다. 상기 중쇄 및 경쇄의 불변 영역은 항원 결합과 연관되지 않지만 다중 효과기 기능을 갖는다.
본 발명의 일부 구현예에서, 항체는 완전길이 항체 또는 항원-결합 단편이다.
본원에 사용되는 바와 같은 "항원-결합 단편"이란 용어는 하나 이상의 CDR을 갖는 항체 부분을 함유하지만 온전한 항체 구조를 갖지 않는 항체 단편으로부터 형성된 항체 단편을 지칭한다. 항원-결합 단편의 예로는 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편, 단쇄 항체 분자(scFv), scFv 이량체, 카멜화된 단일 도메인 항체 및 나노바디를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 상기 항원-결합 단편은 모 항체와 동일한 항원에 결합할 수 있다.
항체의 "Fab" 단편은 하나의 경쇄(가변 영역 및 불변 영역 포함), 및 다이설파이드 결합에 의해 결합된 하나의 중쇄의 가변 영역 및 제1 불변 영역을 함유하는 항체 부분을 지칭한다.
"Fab'" 단편은 힌지 영역의 일부를 함유하는 Fab 단편을 지칭한다.
"F(ab')2" 단편은 Fab'의 이량체를 지칭한다.
항체의 "Fv" 단편은 하나의 경쇄의 가변 영역 및 하나의 중쇄의 가변 영역으로 이루어진다.
"단쇄 항체 분자" 또는 "scFv"는 직접 연결되거나 또는 펩티드 쇄에 의해 연결된 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역으로 구성된 조작된 항체를 지칭한다. 상세한 설명에 대해서, 예를 들어, 문헌[Huston JS et al., Proc Natl Acad Sci USA, 85:5879 (1988)]을 참조하시오.
"scFv 이량체"는 2개의 scFv로부터 형성된 중합체를 지칭한다.
"카멜화된 단일 도메인 항체"("중쇄 항체" 또는 "중쇄-만의 항체(HCAb)"로도 또한 지칭됨)는 2개의 중쇄 가변 영역을 함유하지만 경쇄는 함유하지 않는 항체를 지칭한다. 중쇄 항체는 원래 낙타과(낙타, 단봉 낙타 및 라마)로부터 유래한다. 카멜화된 항체는 경쇄의 결실에도 불구하고 항원 결합에 대한 모든 기능을 갖는다.
"나노바디"는 하나의 중쇄 가변 영역, 및 중쇄 항체로부터의 2개의 불변 영역 CH2 및 CH3으로 이루어진다.
일부 구현예에서, 항체는 단클론 항체 또는 다클론 항체이다.
일부 구현예에서, 항체는 쥐 항체, 토끼 항체, 키메라 항체, 인간화된 항체 또는 완전한 인간 항체이다.
본원에 사용되는 바와 같은 "완전한 인간"이란 용어는 항체 또는 항원 결합 단편에 적용될 때, 상기 항체 또는 항원-결합 단편의 아미노산 서열이 인간 또는 인간 면역 세포에 의해 생성되거나 또는 비-인간 공급원, 예를 들어 인간 항체 라이브러리를 사용하는 트랜스제닉 비-인간 동물, 또는 인간 항체를 암호화하는 다른 서열로부터 유래된 항체의 아미노산 서열에 상응함을 의미한다.
본원에 사용되는 바와 같은 "인간화된"이란 용어는 항체 또는 항원-결합 단편에 적용될 때, 비-인간 동물로부터 유래된 CDR, 인간으로부터 유래된 FR 영역, 및 인간으로부터 유래된 불변 영역(적용가능한 경우)을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편을 지칭한다. 인간화된 항체 또는 항원-결합 단편은 면역원성이 낮기 때문에, 특정 구현예에서 인간에 대한 치료제로서 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 비-인간 동물은 포유동물(예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 염소, 양, 기니피그 또는 햄스터)이다. 특정 구현예에서, 인간화된 항체 또는 항원-결합 단편은 비-인간 CDR 서열을 제외하고, 본질적으로는 전적으로 인간 서열로 이루어진다.
본원에 사용되는 바와 같은 "키메라"라는 용어는 항체 또는 항원-결합 단편에 적용될 때, 하나의 종에서 유래된 중쇄 및/또는 경쇄의 일부를 갖고 상기 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지는 상이한 종으로부터의 항체 또는 항원-결합 단편으로부터 유래됨을 지칭한다. 일부 구현예에서, 키메라 항체는 인간으로부터 유래된 불변 영역 및 비-인간 동물(예를 들어, 마우스 또는 토끼)로부터 유래된 가변 영역을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 항체는 단일특이성 항체, 이중특이성 항체 또는 다중특이성 항체이다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 항체는 추가로 표지될 수 있다.
일부 구현예에서, PI4KIIIα 특이적 억제제는 RNAi 분자이다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "RNAi 분자"란 용어는 RNA 또는 이의 유사체를 지칭하며 이는 표적 RNA와의 충분한 서열 상보성을 가져 RNA 간섭을 유도한다. 일부 구현예에서, RNA를 생성시키는 데 사용될 수 있는 DNA가 또한 포함된다. RNA 간섭(RNAi)은 표적 분자(예를 들어, 표적 유전자, 단백질 또는 RNA)를 하향 조절하는 서열 특이적 또는 선택적 과정을 지칭한다.
일부 구현예에서, 상기 RNAi 분자는 PI4KIIIα의 발현을 감소시킬 수 있다, 예를 들어 PI4KA 유전자를 녹다운시킬 수 있다.
일부 구현예에서, RNAi 분자는 [5'-GCTGATCTCTACTACACTTCC-3'](서열번호 1)을 갖는다.
일부 구현예에서, RNAi 분자는 [5'-GGTTATCACCGGAAATCAATA-3'](서열번호 2)을 갖는다.
일부 구현예에서, RNAi 분자는 [5'-GCAACATTATGCTGGACAAGA-3'](서열번호 3)을 갖는다.
일부 구현예에서, 상기 RNAi 분자는 길이가 18-100개 염기이다.
일부 구현예에서, 상기 RNAi 분자는 이의 안정성을 향상시키기 위해 변형된다.
일부 구현예에서, 상기 RNAi 분자는 작은 간섭 RNA(siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA) 또는 마이크로RNA(miRNA)이다.
본원에 사용되는 바와 같은 "작은 간섭 RNA(siRNA)"란 용어는 약 10 내지 50개 뉴클레오티드의 길이, 바람직하게는 약 15 내지 25개 뉴클레오티드의 길이, 보다 바람직하게는 약 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개 뉴클레오티드의 길이를 갖는 RNA 분자, 바람직하게는 이중-가닥 분자를 지칭하며, 상기 가닥은 임의로, 예를 들어 1, 2 또는 3개의 돌출 뉴클레오티드(또는 뉴클레오티드 유사체)를 포함하는 돌출 말단을 갖는다. siRNA는 RNA의 분해를 유도하거나 매개할 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같은 "짧은 헤어핀 RNA(shRNA)"라는 용어는 상보성 서열의 제1 영역 및 제2 영역을 포함하는 스템-루프 구조를 갖는 RNA 분자를 지칭하며, 상보성 정도 및 영역 방향은 상기 영역 사이에서 염기 짝짓기가 발생하기에 충분하고, 상기 제1 및 제2 영역은 루프 영역에 의해 연결되며, 상기 루프는 상기 루프 영역 중의 뉴클레오티드(또는 뉴클레오티드 유사체)간의 염기 짝짓기의 결여로부터 생성된다.
본원에 사용되는 바와 같은 "마이크로RNA 또는 miRNA"는 길이가 약 16-26 뉴클레오티드(nt)(예를 들어, 약 16-29 nt, 19-22 nt, 20-25 nt 또는 21-23 nt)인 짧은, 천연의 비-코딩 및 단일-가닥 RNA 분자이며, 이는 전형적으로 생체내 유전자 발현 조절에 관여한다. 진핵생물 세포에서, 상기 miRNA 유전자는 DNA 전사효소 II에 의해 "1차 miRNA"(pri-miRNA)로 전사되고, 이는 리보뉴클레아제 III(Drosha)에 의해 "전구체" miRNA(pre-miRNA)로 빠르게 가공되며, 상기 pre-miRNA는 세포 핵에서 세포질로 수송된 다음 또 다른 리보뉴클레아제 III(Dicer)에 의해 인식되고 성숙한 miRNA로 절단된다. 성숙한 miRNA 분자는 하나 이상의 mRNA에 부분적으로 상보적이며 단백질의 발현을 조절한다. 공지된 miRNA의 서열은 miRNA 서열 정보, 기능적 주석, 예측된 유전자 표적 등을 포함하는 정보가 제공되는 miRBase 데이터베이스(www.mirbase.org)와 같은 공개된 데이터베이스로부터 획득될 수 있다. 본 발명에서, miRNA는, 천연 miRNA와 유사한 구조 및 기능을 갖고, 천연 miRNA와 같이 상응하는 mRNA를 표적화하고 이의 단백질로의 번역을 방지할 수 있는 합성 플라스미드에 의해 세포에서 발현되는 RNA 분자를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 PI4KIIIα 특이적 억제제는 안티센스 핵산이다.
본원에 사용되는 바와 같은 "안티센스 핵산"이란 용어는, 상기 안티센스 핵산이 표적 서열에 특이적으로 하이브리드화할 수 있는 한, 표적 서열에 완전히 상보적인 뉴클레오티드뿐만 아니라 하나 이상의 뉴클레오티드 미스매치를 갖는 뉴클레오티드를 포함한다. 예를 들어, 본원의 안티센스 핵산은 적어도 15개의 연속 뉴클레오티드의 길이에 걸쳐 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 및 훨씬 더 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 하이브리드의 형성으로 인해, 표적 유전자의 전사 및/또는 표적 mRNA의 번역이 감소되거나 차단된다.
일부 구현예에서, 상기 PI4KIIIα 억제제는 소분자 화합물이다.
본원에 사용되는 바와 같은 "소분자 화합물"이란 용어는 천연이거나 화학적으로 합성될 수 있는, 3000, 2500, 2000, 1500, 1000 또는 500 달톤 미만의 분자량을 갖는 유기 화합물을 지칭한다.
상기 소분자 화합물은 하기 화학식 I로 표시되는 구조 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 갖는다,
화학식 I
Figure pct00094
상기식에서,
각각의 R1은 (a) H, 할로겐, 니트로, 시아노, 하이드록실, 아미노, 카바모일, C1-6 알킬설푸릴, C1-6 알킬, C1-6 사이클로알킬, C2-6 알키닐, C2-6 알케닐, C1-6 알콕시, C1-6 할로알킬, C1-6 알킬렌-NH2, C1-6 알킬렌-NH-C(O)H, -As(O), -N=NH, N-(C1-6 알킬)아미노, N,N-(C1-6 알킬)2 아미노, -NH-C(O)H, -NH-S(O)2H, -C(O)OH, -OC(O)H, -SH, -S(O)2H, -S(O)2-NH2 또는 헤테로사이클릴 중에서 독립적으로 선택되고, R2 또는 R3으로 임의로 치환되며, 여기서 R2 및 R3은 각각 독립적으로 아미노, C1-6 알킬, C1-6 알콕시, C1-6 할로알킬, N-(C1-6 알킬) 아미노, N-(6-12원 아릴)아미노, N,N-(C1-6 알킬)2 아미노, C3-6 사이클로알킬, 6-12원 아릴 또는 3-12원 헤테로사이클릴 중에서 선택되고, 하나 이상의 할로겐, 니트로, 시아노, 하이드록실, 아미노, 카바모일, -NH-C(O)-R5, -C(O)OR4, 6-12원 아릴, C1-6 알킬, C2-6 알키닐, C2-6 알케닐, C1-6 알콕시, C1-6 할로알킬, 3-6원 헤테로사이클릴, C3-6 사이클로알킬 또는 Bn-O-로 임의로 치환되고, R4는 C1-6 알킬이고, 하나 이상의 할로겐, 니트로, 시아노, 하이드록실, 아미노, 카바모일, 6-12원 아릴, C1-6 알킬, C2-6 알키닐, C2-6 알케닐, C1-6 알콕시, C1-6 할로알킬, 3-6원 헤테로사이클릴, C3-6 사이클로알킬 또는 Bn-O-로 임의로 치환되고, R5는 H, C1-6 알킬, C2-6 알키닐, C2-6 알케닐, C1-6 알콕시 또는 C1-6 할로알킬 중에서 선택되고, 및/또는
(b) 2개의 인접한 탄소 원자상의 R1은 5-12원 사이클로알킬, 아릴 또는 헤테로사이클릴을 형성하고, 하나 이상의 할로겐, 니트로, 시아노, 하이드록실, 아미노, 카바모일, 6-12원 아릴, C1-6 알킬, C2-6 알키닐, C2-6 알케닐, C1-6 알콕시, C1-6 할로알킬, 3-6원 헤테로사이클릴, C3-6 사이클로알킬 또는 Bn-O-로 임의로 치환되고,
여기서 n은 0 내지 5의 정수이다.
일부 구현예에서, n은 0 내지 2의 정수이고, 각각의 R1은 H, 할로겐, 니트로, 시아노, 하이드록실, 아미노, 카바모일, C1-6 알킬설푸릴, C1-6 알킬, C1-6 사이클로알킬, C1-6 알콕시, C1-6 할로알킬, -As(O), N-(C1-6 알킬)아미노, N,N-(C1-6 알킬)2 아미노, -NH-C(O)H 또는 -NH-S(O)2H 중에서 독립적으로 선택되고, R2 또는 R3으로 임의로 치환된다.
일부 구현예에서, n은 0 내지 2의 정수이고, 각각의 R1은 H, 할로겐, 니트로, 시아노, 하이드록실, 아미노, C1-6 알킬설푸릴, C1-6 알킬, C1-6 사이클로알킬, C1-6 알콕시, C1-6 할로알킬, -As(O), -NH-C(O)H 또는 -NH-S(O)2H 중에서 독립적으로 선택되고, R2 또는 R3으로 임의로 치환된다.
일부 구현예에서, n은 1 또는 2이고, 각각의 R1은 H, 할로겐, 아미노, C1-6 알킬설푸릴, C1-6 사이클로알킬, C1-6 알콕시, C1-6 할로알킬, -NH-C(O)R2 또는 -NH-S(O)2R3 중에서 독립적으로 선택되고, 여기서 R2는 C1-6 알킬이고 하나의 6-12원 아릴로 임의로 치환되고, R3은 6-12원 아릴이고 하나의 할로겐, C1-6 알콕시 또는 C1-6 할로알킬로 임의로 치환된다.
일부 구현예에서, R1은 -As(O)의 오르토- 및/또는 파라-위치에 위치한다.
일부 구현예에서, n은 0이다.
본원에 사용되는 바와 같은 "치환된"이란 용어는 화학기를 지칭할 때, 상기 화학기의 하나 이상의 수소 원자가 제거되어 치환체로 치환되는 것을 의미한다.
본원에 사용되는 바와 같은 "치환체"란 용어는 당업계에 공지된 일반적인 의미를 가지며, 적합한 경우 모 기(parent group)에 공유 부착되거나 또는 축합된 화학적 모이어티를 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같은 "Cn-Cm"이란 용어는 탄소 원자 수의 범위를 나타내며, 여기서 n 및 m은 정수이고 상기 탄소 원자 수의 범위는 종점(즉, n 및 m) 및 그 사이의 각 정수 점을 포함한다. 예를 들어, C1-C6은 1개의 탄소 원자, 2개의 탄소 원자, 3개의 탄소 원자, 4개의 탄소 원자, 5개의 탄소 원자 및 6개의 탄소 원자를 포함하는, 1 내지 6개의 탄소 원자 범위를 나타낸다.
본원에 사용되는 바와 같은 "알킬"이란 용어는 또 다른 용어의 일부로 사용되든 단독으로 사용되든, 선형이거나 또는 분지될 수 있는 포화된 탄화수소 기를 지칭한다. "Cn-Cm 알킬"이란 용어는 n 내지 m개의 탄소 원자를 갖는 알킬을 지칭한다. 특정 구현예에서, 알킬기는 1 내지 12, 1 내지 8, 1 내지 6, 1 내지 4, 1 내지 3, 또는 1 내지 2개의 탄소 원자를 함유한다. 알킬기의 예는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 3급-부틸, 이소부틸, 2급-부틸, 2-메틸-1-부틸, n-펜틸, 3-펜틸, n-헥실, 1,2,2-트리메틸프로필과 같은 화학기를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용되는 바와 같은 "알케닐"이란 용어는 또 다른 용어의 일부로 사용되든 단독으로 사용되든, 불포화된 하이드로카빌 기를 지칭하며, 이는 하나 이상의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 선형이거나 또는 분지된 기일 수 있다. 특정 구현예에서, 알케닐기는 또한 2 내지 12, 2 내지 10, 2 내지 8, 2 내지 6, 2 내지 5, 2 내지 4, 또는 2 내지 3개의 탄소 원자를 함유한다. 특정 구현예에서, 알케닐기는 또한 1 내지 6, 1 내지 5, 1 내지 4, 1 내지 3, 1 내지 2, 또는 1개의 탄소-탄소 이중 결합을 가질 수 있다. 알케닐기의 예는 에테닐, n-프로페닐, 이소프로페닐, n-부테닐, 2급-부테닐과 같은 화학기를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용되는 바와 같은 "알키닐"이란 용어는 또 다른 용어의 일부로 사용되든 단독으로 사용되든, 적어도 하나의 탄소-탄소 삼중 결합을 갖는, 선형 또는 분지된 불포화 알키닐기를 지칭한다. 특정 구현예에서, 알키닐기는 2 내지 12, 2 내지 10, 2 내지 8, 2 내지 6, 2 내지 5, 2 내지 4, 또는 2 내지 3개의 탄소 원자를 함유한다. 특정 구현예에서, 알키닐기는 또한 1 내지 6, 1 내지 5, 1 내지 4, 1 내지 3, 1 내지 2, 또는 1개의 탄소-탄소 삼중 결합을 가질 수 있다. 알키닐기의 예로는 에티닐, 프로피닐 및 부티닐과 같은 화학기가 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용되는 바와 같은 "사이클로알킬"이란 용어는 적어도 3개의 원자로 이루어지는 사이클릭 알킬을 지칭한다. "n-m원 사이클로알킬"이란 용어는 고리를 형성하는 n 내지 m개의 구성원을 갖는 사이클로알킬을 지칭한다. 더욱이, 상기 고리는 또한 하나 이상의 이중 결합을 가질 수 있지만 완전히 공액된 시스템을 갖지는 않는다. 특정 구현예에서, 사이클로알킬은 고리를 형성하는 3 내지 8, 3 내지 6, 또는 4 내지 6개의 탄소 원자를 갖는다. 상기 사이클로알킬의 예는 사이클로프로판, 사이클로부탄, 사이클로펜틸 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용되는 바와 같은 "헤테로사이클릴"은 고리 시스템 중의 적어도 하나의 원자가 헤테로원자이고 나머지 고리 원자가 탄소 원자인 사이클릭 기를 지칭한다. "n-m원 헤테로사이클릴"이란 용어는 고리를 형성하는 n 내지 m개의 구성원을 갖는 헤테로사이클릴을 지칭한다. 본원에 사용되는 바와 같은 "헤테로사이클릴"이란 용어는 헤테로아릴 및 헤테로사이클로알킬을 포함한다. 또한, 상기 고리는 하나 이상의 이중 결합을 가질 수도 있다. 특정 구현예에서, 헤테로사이클릴은 포화된 헤테로사이클로알킬이다. 헤테로원자의 예는 산소, 황, 질소, 인 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용되는 바와 같은 "헤테로사이클로알킬"이란 용어는 고리 시스템 중의 적어도 하나의 원자가 헤테로원자이고 나머지 고리 원자가 탄소 원자인 사이클로알킬을 지칭한다. "n-m원 헤테로사이클로알킬"이란 용어는 고리를 형성하는 n 내지 m개의 구성원을 갖는 헤테로사이클로알킬을 지칭한다. 더욱이, 상기 고리는 또한 하나 이상의 이중 결합을 가질 수 있지만 완전히 공액된 시스템을 갖지는 않는다. 특정 구현예에서, 상기 헤테로사이클로알킬은 포화된 헤테로사이클로알킬이다. 헤테로원자의 예는 산소, 황, 질소, 인 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, 상기 헤테로사이클로알킬은 고리를 형성하는 3 내지 8, 3 내지 6, 또는 4 내지 6개의 탄소 원자를 갖는다. 상기 헤테로사이클로알킬의 예는 아제티딘, 아지리딘, 피롤리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, 모르폴리닐, 티오모르폴린, 호모피페라진 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용되는 바와 같은 "아릴"이란 용어는 또 다른 용어의 일부로 사용되든 단독으로 사용되든, 고리를 형성하는 탄소 원자 사이에 교번하는 이중 및 단일 결합을 갖는 모노- 또는 폴리-카보사이클릭 고리 시스템 기를 지칭한다. "Cn-Cm 아릴"이란 용어는 고리를 형성하는 n 내지 m개의 탄소 원자를 갖는 아릴을 지칭한다. 특정 구현예에서, 상기 아릴 고리 시스템은 하나 이상의 고리에 6 내지 12, 6 내지 10, 또는 6 내지 8개의 탄소 원자를 갖는다. 특정 구현예에서, 상기 아릴 고리 시스템은 함께 축합된 2개 이상의 고리를 갖는다. 아릴기의 예는 페닐, 나프틸, 테트라하이드로나프틸, 인다닐, 인데닐 등과 같은 화학기를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용되는 바와 같은 "헤테로아릴"이란 용어는 방향족 고리 중의 적어도 하나의 고리 원자가 헤테로원자이고 나머지 고리 원자가 탄소 원자인 아릴기를 지칭한다. "n-m원 헤테로아릴"이란 용어는 고리를 형성하는 n 내지 m개의 구성원을 갖는 헤테로아릴을 지칭한다. 헤테로원자의 예는 산소, 황, 질소, 인 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, 상기 헤테로아릴은 고리를 형성하는 5 내지 10, 5 내지 8, 또는 5 내지 6개의 구성원을 가질 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 헤테로아릴은 5- 또는 6-원 헤테로아릴이다. 상기 헤테로아릴의 예는 푸릴, 티에닐, 피리딜, 퀴놀릴, 피롤릴, N-저급 알킬피롤릴, 피리딜-N-옥사이드, 피리미디닐, 피라지닐, 이미다졸릴, 인돌릴 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용되는 바와 같은 "알콕시"란 용어는 또 다른 용어의 일부로 사용되든 단독으로 사용되든, 화학식 "-O-알킬"로 표시되는 기를 지칭한다. "Cn-Cm 알콕시"라는 용어는 상기 알콕시의 알킬 부분이 n 내지 m개의 탄소 원자를 갖는 것을 의미한다. 특정 구현예에서, 알킬 모이어티는 1 내지 6, 1 내지 4, 또는 1 내지 3개의 탄소 원자를 갖는다. 상기 알콕시기의 예는 메톡시, 에톡시, 프로폭시(예를 들어, n-프로폭시 및 이소프로폭시), t-부톡시 등과 같은 화학기를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용되는 바와 같은 "할로알킬"이란 용어는 또 다른 용어의 일부로 사용되든 단독으로 사용되든, 화학식 "-알킬-X"로 표시되는 기를 나타내며, 여기서 X는 할로겐, 즉 불소, 염소, 브롬 및 요오드 중에서 선택된 원자이다. "Cn-Cm 할로알킬"이란 용어는 할로알킬의 알킬 모이어티가 n 내지 m개의 탄소 원자를 갖는 것을 의미한다. 특정 구현예에서, 상기 알킬 모이어티는 1 내지 6, 1 내지 4, 또는 1 내지 3개의 탄소 원자를 갖는다. 상기 할로알킬 기의 예는 할로메틸, 할로에틸, 할로프로필(예를 들어, n-할로프로필 및 이소-할로프로필), t-할로부틸 등과 같은 화학기를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용되는 바와 같은 "n-원"(여기서 n은 정수이다)이란 용어는 통상적으로 고리 시스템에서 고리를 형성하는 원자의 수를 기재하기 위해 고리 시스템과 함께 사용된다. 예를 들어, 피페리디닐은 6원 헤테로사이클로알킬 고리의 한 예이고, 피라졸릴은 5원 헤테로아릴 고리의 한 예이며, 피리디닐은 6원 헤테로아릴 고리의 한 예이고, 1,2,3,4-테트라히드로-나프탈렌은 10원 아릴의 한 예이다. 본원에 사용되는 바와 같은 "n- 내지 m-원"이란 용어는 일반적으로 고리 시스템에서 고리를 형성하는 구성원의 수를 기재하기 위해 고리 시스템과 함께 사용되며, 여기서 n 및 m은 정수이고 고리를 형성하는 구성원의 범위는 종점(즉, n 및 m) 및 그 사이의 각 정수 점을 포함한다. 예를 들어, 3- 내지 8-원은 3개의 구성원, 4개의 구성원, 5개의 구성원, 6개의 구성원, 7개의 구성원, 및 8개의 구성원을 포함하는, 고리를 형성하는 3 내지 8개 구성원의 범위를 의미한다.
본원에 사용되는 바와 같은 "할로겐"이란 용어는 불소, 염소, 브롬 및 요오드 중에서 선택된 원자를 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같은 "시아노"란 용어는 화학식 "-CN"으로 표시되는 기를 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같은 "하이드록실"이라는 용어는 화학식 "-OH"로 표시되는 기를 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같은 "니트로"란 용어는 화학식 "-NO2"로 표시되는 기를 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같은 "아미노"란 용어는 화학식 "-NH2"로 표시되는 기를 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같은 "카바모일"이란 용어는 화학식 "-HNCONH2"로 표시되는 기를 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같은 "화합물"이란 용어는 도시된 구조의 모든 입체 이성질체(예를 들어, 거울상 이성질체 및 부분입체 이성질체), 기하 이성질체, 및 호변 이성질체를 포함하는 것으로 의도된다.
본원에 기재된 화합물은 비대칭일 수 있다(예를 들어, 하나 이상의 입체중심을 가질 수 있다). 달리 명시되지 않는 한, 거울상 이성질체 및 부분입체 이성질체와 같은 모든 입체 이성질체가 포함되는 것으로 의도된다. 올레핀, 탄소-탄소 이중 결합 등을 포함하는 다양한 기하 이성질체가 또한 본원에 기재된 화합물 중에 존재할 수 있고, 이러한 모든 안정한 이성질체가 본원에서 고려되었다. 화합물의 시스- 및 트랜스-기하 이성질체가 본원에 기재되어 있고 이성질체의 혼합물로서 또는 개별 이성질체로서 단리될 수 있다.
본원의 화합물은 또한 화합물의 호변 이성질체 형태를 포함한다. 호변 이성질체 형태는 단일 결합이 양성자의 이동에 의해 동반되는 인접한 이중 결합과 교환되어 생성된다. 호변 이성질체 형태는 동일한 화학식과 총 전하를 갖는 이성질체성 양성자화된 상태의 양성자의 호변 이성질체를 포함한다. 상기 양성자 호변 이성질체의 예는 케토-에놀 쌍, 아미드-이미드산 쌍, 락탐-락팀 쌍, 엔아민-이민 쌍 및 사이클릭 형태를 포함하며, 여기서 양성자는 1H- 및 3H-이미다졸, 1H- , 2H- 및 4H-1,2,4-트리아졸, 1H- 및 2H-이소인돌 및 1H- 및 2H-피라졸과 같은 헤테로사이클릭 시스템 중 2개 이상의 위치를 차지할 수 있다. 호변 이성질체 형태는 평형 상태로 있거나 적절한 치환에 의해 하나의 형태로 입체적으로 고정될 수 있다.
특정 구현예에서, 본원의 소분자 화합물은 유기 합성에 의해 수득될 수 있다. 본원의 화합물은 이의 염, 에스테르, 수화물 또는 용매화물을 포함하여, 주지된 유기 합성 기법 중 임의의 것을 사용하여 제조될 수 있고 다양한 가능한 합성 경로에 따라 합성될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 소분자 화합물은 하기 중 하나 이상을 포함하는, 하기 구조식을 갖는 화합물이다:
Figure pct00095
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,
Figure pct00185
, 및
Figure pct00186
.
본원에 사용되는 바와 같은 "페닐아르신 옥사이드"(PAO)라는 용어는 하기에 나타낸 바와 같은 특정한 화학 구조를 갖는 소분자 화합물을 지칭한다:
Figure pct00187
본원에 사용되는 바와 같은 "A1" 및 "G1"이란 용어는 둘 다 PI4KIIIα 단백질의 소분자 화합물 억제제이며, 비교적 유사한 구조를 갖는다. A1의 화학 구조식은 하기와 같다:
[화학식 A1]
Figure pct00188
5-(2-아미노-1-(4-(4-모르폴리닐)페닐)-1H-벤즈이미다졸-6-일)-N-(2-플루오로페닐)-2-메톡시-3-피리딘설폰아미드
G1의 화학 구조식은 하기와 같다:
[화학식 G1]
Figure pct00189
(aS)-5-(2-아미노-4-옥소-3-(2-(트리플루오로메틸)페닐)-3,4-디하이드로퀴나졸린-6-일)-N-(2,4-디플루오로페닐)-2-메톡시피리딘-3-설폰아미드.
본 발명은 또한 페닐아르신 옥사이드의 유도체 및 A1 또는 G1의 유사체에 관한 것으로, 상기 유도체 및 유사체는 또한 상기 유도체 및 유사체가 PI4KIIIα 단백질의 포스포키나제 활성을 억제하는 기능을 갖는 한, 세포내 단백질 미스폴딩-관련 질환 및 리소좀 축적 질환의 치료에 사용될 수 있으며, 이와 같은 구조 유사체의 제조 방법이 또한 개시되었다. 일부 구현예에서, 페닐아르신 옥사이드, A1 또는 G1의 유도체는 페닐아르신 옥사이드, A1 또는 G1과 유사한 구조를 갖는 유사체이다.
세포내 단백질 미스폴딩-관련 질환
본원에 사용된 바와 같은 "세포내 단백질 미스폴딩-관련 질환"이란 용어는 세포질 내 비정상적으로 폴딩된 단백질의 응집을 특징으로 하는 질환을 의미하며, 또한 단백질 응집/축적 또는 단백질 미스폴딩 질환으로 진단된다. 또한, "세포내 단백질 미스폴딩-관련 질환"이라는 용어에는, 봉입체가 폴딩 오류로 인해 응집된 코어 단백질, 및 풀린 단백질에 반응하여 수반되고 외부적으로 부착되는 다양한 스트레스 단백질로 주로 구성되는 단백질 봉입체 축적 질환과 같은 일부 세포내 봉입체 질환이 또한 포함된다.
세포내 단백질 미스폴딩-관련 질환에는 비제한적으로, 파킨슨병(PD), 루이소체 치매(LBD), 다계통 위축(MSA), 봉입체 근염(IBM), 전두측두엽 치매(FTD), 헌팅톤병(HD), 폴리글루타민병(PolyQ), 근위축성 측삭 경화증(ALS) 및 프리온병이 포함된다.
리소좀 축적 질환
본원에 사용된 바와 같은 "리소좀 축적 질환"이란 용어는 비제한적으로, 리소좀에서의 불충분한 효소 활성으로 인한 리소좀 기능 결함, 활성제 단백질, 수송체 단백질 또는 리소좀 단백질 가공 및 보정을 위한 효소의 결핍(이는 2차 리소좀에서 해당 기질의 절단 실패, 기질의 축적 및 대사 장애를 일으키고, 따라서 이는 축적 질환 등으로 이어진다)을 포함한, 다양한 원인에 기인한 리소좀 중의 일부 내인성 또는 외인성 물질의 축적으로 인한 질환을 지칭한다.
리소좀 축적 질환은 스핑고지질 대사 장애, 점액다당류증, 글리코겐 축적 질환, 당단백질 축적 질환, 지질 축적 질환, 번역-후 변형 결핍증, 통합 막 단백질 결핍 장애, 신경지방갈색소증, 또는 리소좀 관련 세포소기관 장애를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 스핑고지질 대사 장애는 비제한적으로, 파브리병(Fabry disease), 대사장애 피부병(파베병(Farbe disease)), I, II, III형 및 주산기 치명적인 고셔병(Gaucher disease), I, II 및 III형 GM1 강글리오사이드증(gangliosidosis), GM2 강글리오사이드증(흑내장성 가족성 백치(familial amaurotic idiocy)), GM2 강글리오사이드증, 구형세포 백질장애(spheroid leukodystrophy)(크라베병(Krabbe disease)), 이색성 백질장애(metachromatic leukodystrophy) 및 A 및 B형 니만-픽병(Niemann-Pick)을 포함하고; 점액다당류증은 비제한적으로, 헐러-샤이 증후군(Hurler-Scheie syndrome) 및 샤이 증후군(ML I), 헌터 증후군(Hunter syndrome)(MPS II), 산필리포 증후군(Sanfilippo syndrome) A(MPS IIIA), 산필리포 증후군 B(MPS IIIB), 산필리포 증후군 C(MPS IIIC), 산필리포 증후군 D(MPS IIID), 편심 골연골이형성 증후군(eccentro-osteochondrodysplasia syndrome)(MPS IVA), 편심 골연골이형성 증후군(MPS IVB), 마로토-라미 증후군(Maroteaux-lamy syndrome)(라미 증후군, MPS VI), Sly 질환(MPS VII) 및 MPS IX을 포함하고; 글리코겐 축적 질환은 비제한적으로 폼페병(Pompe disease)(GSD II)을 포함하고; 당단백질 축적 질환은 비제한적으로, α-만노사이드 축적 질환(α-mannoside storage disease), β-만노사이드 축적 질환, 푸코사이드증(fucosidosis), 아스파틸글루코사민뇨증(aspartylglucosaminuria), I형 쉰들병(Schindle disease type I)(유아 발병 신경축삭 이영양증(infantile onset neuroaxonal dystrophy)), II형 쉰들병(칸자키병(Kanzaki disease)), III형 쉰들러병(중등도), I형 시알산 축적병(체리-붉은 반점-근간대성 경련 증후군(cherry-red spot-myoclonus syndrome), II형 시알산 축적병(점액다당류증 I) 및 갈락토시알리도증(galactosialidosis)을 포함하고; 지질 축적 질환은 비제한적으로, 산 리파제 결핍, 예를 들어 울프만병(Wolfman disease) 및 콜레스테릴 에스테르 축적 질환을 포함하고; 번역-후 변형 결핍증은 비제한적으로, 다중 설파타제 결핍(multiple sulfatase deficiency), IIα/β형 점액지질증(mucolipidosis)(I-세포 질환), IIα/β형 점액지질증(슈도-헐러 증후군(pseudo-Hurler syndrome)), 및 IIIγ형 점액지질증(슈도-헐러 증후군 변형)을 포함하고; 통합 막 단백질 결핍 장애는 비제한적으로, 시스틴증(Cystinosis), 다농병(Danon disease), 근간대성 경련 신부전 증후군(myoclonus renal failure syndrome), 시알산 축적 장애, 예를 들어 ISSD, 살라병(Salla disease) 및 중등도 살라병, C1 및 C2형 니만-픽병 및 IV형 점액지질증을 포함하고; 신경지방갈색소증은 비제한적으로, 1형 지방갈색소증(할티아-산타부리병(Haltia-Santavuori disease) 및 INCL), 2형 신경지방갈색소증(얀스키-빌쇼스키병(Jansky-Bielschowsky disease)), 3형 신경지방갈색소증(바텐-스필마이어-쇼그렌병(Batten-Spielmeyer-Sjogren disease)), 4형 신경지방갈색소증(패리병(Parry disease) 및 A 및 B형 쿠프스병(Kufs disease)), 5형 신경지방갈색소증(유아 말기 핀란드 변종(finnish variant late infantile)), 6형 신경지방갈색소증(레이크-카바나(Lake-Cavanagh) 또는 인도 변종), 7형 신경지방갈색소증(터키 변종), 8형 신경지방갈색소증(북부 간질, 간질 지적 장애(Northern epilepsy, epilepsy intellectual deterioration)), 9형 신경지방갈색소증, 10형 신경지방갈색소증, 11형 신경지방갈색소증, 12형 신경지방갈색소증, 13형 신경지방갈색소증, 14형 신경지방갈색소증을 포함하고; 리소좀-관련된 세포소기관 장애는 비제한적으로 1형 헤르만스키-푸드라크병(Hermansky-Pudlak disease), 2형 헤르만스키-푸드라크병, 3형 헤르만스키-푸드라크병, 4형 헤르만스키-푸드라크병, 5형 헤르만스키-푸드라크병, 6형 헤르만스키-푸드라크병, 7형 헤르만스키-푸드라크병, 8형 헤르만스키-푸드라크병, 9형 헤르만스키-푸드라크병, 1형 그리셀리 증후군(Griscelli syndrome)(에레할데 증후군(Elejalde syndrome)), 2형 그리셀리 증후군 및 체디악-히가시병(Chediak-Higashi disease)을 포함한다.
약물 투여 및 의학적 용도
본원에 사용된 용어 "약제학적으로 허용되는"은 합리적인 의학적 판단의 범위 내에서 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 또는 기타 문제 또는 합병증 없이 인간 및 동물 조직과 접촉하여 사용하기에 적합하며 합리적인 이익/위험 비율에 상응하는 화합물, 물질, 조성물 및/또는 투여 형태를 지칭한다. 특정 구현예에서, 약제학적으로 허용되는 화합물, 물질, 조성물 및/또는 투여 형태는 규제 당국(예를 들어 미국 식품 의약청, 중국 식품 의약청, 또는 유럽 의약청)에 의해 승인되거나 일반적으로 인정되는 약전(미국 약전, 중국 약전 또는 유럽 약전)에 나열되고 동물(더 구체적으로 인간)에 사용되는 것들이다.
본원에서 "대상체"라는 용어는 인간 및 비-인간 동물을 포함할 수 있다. 비-인간 동물은 포유동물 및 비-포유동물과 같은 모든 척추동물을 포함한다. "대상체"는 또한 가축(예를 들어, 소, 돼지, 양, 닭, 토끼 또는 말), 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스), 영장류(예를 들어, 고릴라 또는 원숭이), 또는 가축(예를 들어 개 또는 고양이)일 수 있다. "대상체"는 남성 또는 여성일 수 있으며, 또한 연령이 다를 수도 있다. 인간 "대상체"는 백인, 아프리카인, 아시아인, 수메르인 또는 기타 인종이거나 다른 인종의 잡종일 수 있다. 인간 "대상체"는 노인, 성인, 청소년, 어린이 또는 유아일 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 대상체는 인간 또는 비-인간 영장류이다.
본원에 개시된 PI4KIIIα 특이적 억제제는 주사(예를 들어, 피하 주사, 복강내 주사, 정맥내 주사(정맥내 점적 또는 정맥내 주입 포함), 근육내 주사 또는 피내 주사) 또는 비-주사(예를 들어, 경구, 비강, 설하, 직장 또는 국소 투여)에 의해서와 같이, 당업계에 주지된 투여 경로에 의해 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 PI4KIIIα 특이적 억제제는 경구, 피하, 근육내 또는 정맥내 투여된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 PI4KIIIα 특이적 억제제는 경구 투여된다.
본원에 사용되는 바와 같은 "치료 유효량"은 대상체의 질병 또는 증상을 완화 또는 제거하거나, 또는 질병 또는 증상의 발병을 예방적으로 억제 또는 예방하는 약물의 양을 지칭한다. 치료 유효량은 대상체의 하나 이상의 질병 또는 증상을 어느 정도 완화시키는 약물의 양; 질병 또는 증상의 원인과 관련된 하나 이상의 생리학적 또는 생화학적 매개변수를 부분적으로 또는 완전히 정상으로 회복시킬 수 있는 약물의 양; 및/또는 질병 또는 증상의 발병 가능성을 감소시킬 수 있는 약물의 양일 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 사용되는 바와 같은 "치료 유효량"이란 용어는 대상체의 세포내 단백질 미스폴딩-관련 질환 또는 리소좀 축적 질환을 완화하거나 제거할 수 있는 약물의 양을 지칭한다.
본원에서 제공되는 PI4KIIIα 특이적 억제제의 치료 유효 용량은 체중, 연령, 과거 병력, 현재 진행 중인 치료, 대상의 건강 상태 및 약물 상호작용의 강도, 알레르기, 과민증 및 부작용뿐만 아니라 투여 경로 및 질병 진행 정도와 같은 당업계에 주지된 다양한 요인에 따라 다르다. 당업자(예를 들어, 의사 또는 수의사)는 이들 또는 다른 조건 또는 요건에 따라 용량을 낮추거나 높일 수 있다.
일부 구현예에서, 치료는 제2 제제를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 제2 제제는 레보도파 및 릴루졸을 포함하나 이에 제한되지 않는, 세포내 단백질 미스폴딩-관련 질환의 치료제이다.
일부 구현예에서, PI4KIIIα 특이적 억제제를 상기 제2 제제 이전에, 이후에 또는 이와 동시에 투여한다.
본원은 또한 유효량의 PI4KIIIα 특이적 억제제를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 세포내 단백질 미스폴딩-관련 질환의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.
본원은 또한 유효량의 PI4KIIIα 특이적 억제제를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 리소좀 축적 질환의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.
약물 스크리닝
본 발명은 약물 후보물을 PI4KIIIα 단백질 또는 핵산 또는 PI4KIIIα와 접촉시키는 단계, 및 상기 약물 후보물이 PI4KIIIα의 형성 또는 활성을 억제할 수 있는지 여부를 검출하는 단계를 포함하는, 세포내 단백질 미스폴딩-관련 질환을 예방 또는 치료하기 위한 약물을 스크리닝하기 위한 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 약물 후보물을 PI4KIIIα 단백질 또는 핵산 또는 PI4KIIIα와 접촉시키는 단계, 및 상기 약물 후보물이 PI4KIIIα의 형성 또는 활성을 억제할 수 있는지 여부를 검출하는 단계를 포함하는, 리소좀 축적 질환을 예방 또는 치료하기 위한 약물을 스크리닝하기 위한 방법을 제공한다.
실시예 1. PI4KIIIα 억제제에 의한 미세아교세포 리소좀의 외포작용 촉진
1.1 실험 동물
사용된 마우스는 야생형(WT) C57BL/6J 마우스, 및 PI4KA의 이형접합 녹아웃(KO)을 갖는 C57BL/6J 마우스였다. 수컷 PI4KA -/+ 돌연변이 마우스[Pi4kaGt(RRO073) Byg/+, MMRRC, Cat. #016351, UC Davis Mouse Resource Center (USA)] 및 야생형 C57BL/6 마우스를 5세대 이상 역교배시켰다. 이어서 생성된 Pi4kaGt(RRO073) Byg/+ 마우스를 이 연구에 사용하였다. WT 마우스를 GemPharmatech Co., Ltd.에서 구입하였으며 모든 마우스를 Fudan 대학 약학 연구소의 동물 연구 센터(Shanghai, China)에서 사육하였다. 모든 마우스를 12시간의 명암 주기 동안 음식과 물 섭취의 제한 없이 케이지당 5마리 이하로 표준 케이지에 보관하였다. 번식을 필요로 하는 마우스의 경우, 케이지당 한 마리 이하의 수컷과 두 마리의 암컷만을 사육하였다.
1.2 1차 미세아교세포의 단리 및 배양(완전 배지: MEM + 10% FBS)
a. 혼합된 미세아교세포의 단리 및 배양
18-20일 동안 임신한 마우스를 마취제(복강에 1.2% 아바멕틴 0.3 ㎖/10 g 주사)로 마취하고, 배아를 수집하여 멸균된 비이커에 넣고, 비이커의 입구를 박막 장갑으로 밀봉하고, 세포실로 옮겼다. 머리를 자르고, 뇌를 떼어내었으며, 이전 단계는 1차 뉴런 세포를 채취하는 것과 일치하였다. 채취한 뇌조직을 행크스 균형염 용액이 담긴 세포 배양 접시에 놓은 후, 해부현미경 하에서 대뇌피질을 분리하여 HBSS에 넣고, 대뇌피질에 부착된 수막과 혈관을 박리하고, 핀셋으로 찢어 올리고, 15 ㎖ EP 튜브내로 흡입하였다. HBSS 세척 후, HBSS를 버리고, 트립신을 첨가하고(트립신 부피는 세포 양에 따라 다르며, 일반적으로 10x 트립신 비는 1:10이었다), 혼합물을 CO2 배양기에서 37℃에서 10분 동안 절단시키고, 이어서 트립신을 버리고 FBS(총 부피의 약 20%)를 첨가하여 1.5 내지 2분 동안 절단 반응을 종결시켰다. FBS를 일회용 피펫을 사용하여 조심스럽게 피펫팅하고, MEM 배양 용액을 첨가하고, 혼합물을 배양 용액이 세포를 함유하는 현탁액이 될 때까지 반복적으로 피펫팅하였으며; 이때 세포는 명백한 덩어리 및 조직 단편 없이 MEM 배양 용액에 균일하게 분산되었고, 70 마이크론 세포 체를 사용하여 체질하고; 완전 배양 배지를 첨가하고, 세포를 균일하게 피펫팅한 후 카운팅하고; 10% FBS를 포함하는 MEM 완전 배양 배지를 T25 세포 배양 플라스크에 첨가하고, 한 마리의 태아 마우스의 뇌로부터 분리된 미세아교세포를 각각 1개의 배양 플라스크에서 배양하였다. 배양 플라스크를 CO2가 있는 배양기에서 배양하고, 밤새 기존 배양 배지를 버리고 신선한 배양 배지로 교체하고; 그 후, 배지를 48시간마다 교체하고, 약 10일 후에 세포의 층상 성장이 관찰되었으며, 여기서 굴절률이 더 양호한 상층이 미세아교세포이고, 성장을 지지하는 하층은 성상세포였다.
b. 순한 트립신 절단 방법에 의한 미세아교세포의 분리 및 정제
기존 배양 배지를 버리고 PBS로 3회 세척하고 저농도 0.125% 트립신 5 ㎖를 첨가하여 절단시키고, 배양 플라스크를 도립현미경 하에서 진탕시키면서 관찰하고; 미세아교세포가 포함된 현탁액을 15 ㎖ 원심분리기 튜브에 옮겼으며; 상층 세포의 대부분을 탈착시키고 1000 g의 회전속도로 4℃의 저온에서 5분간 원심분리시킨 후에, 상등액을 피펫팅하여 제거하고, 이어서 2 ㎖의 완전 배양 배지를 첨가하여 세포 침전물을 재현탁시키고, 세포 현탁액을 0.4% 트리판 블루 용액과 9:1의 비로 잘 혼합한 다음, 혼합물을 혈구 계수용 챔버에 적가하였다. 카운팅 후, 폴리리신-코팅된 35 ㎜ 유리-바닥 배양 접시에 1×106의 세포수로 세포를 접종하고 30분 후에, 기존 배지를 신선한 완전 배지로 교체하고, 완전히-부착되지 않은 잡다한 세포를 제거하고, 나머지 세포를 CO2가 있는 배양기에서 배양하였다. 배지를 정제 24시간 후에 신선한 완전 배양 용액으로 교체하고, 이어서 2일마다 배양 용액의 전체 또는 절반을 교체하였다. 1차 미세아교세포를 적어도 4시간 동안 배양한 후에, 배지를 무혈청 배양 배지로 교체하고, 이어서 후속 실험을 수행하였다.
1.3 미세아교세포 Iba1 항체의 면역염색
Iba1(이온화된 칼슘-결합 어댑터 분자 1) 항체는 미세아교세포와 대식세포의 특이적 항체로, 미세아교세포에 의해 특이적으로 발현되는 칼슘 결합 단백질에 특이적으로 결합할 수 있으며, 중추신경계 중의 미세아교세포의 마커이다.
4%(w/v)의 PFA의 제형: 먼저, 물 700 ㎖를 자기력 하에서 교반하여 온도 상승을 가속화하고, 온도 상승 후 용해를 돕기 위해 1 M 수산화나트륨 용액 몇 방울을 첨가한 다음, 40 g 파라포름알데히드(PFA)를 첨가하고 교반하여 완전히 용해시킨 다음, 가열된 10×PBS 100 ㎖를 용액에 넣고, 물로 부피를 1 L로 만들고 pH 값을 8.0으로 조절한 후 혼합 용액을 여과하여 50 ㎖ 원심분리기 튜브에 분액하고, 원심분리기 튜브를 4℃의 냉장고에 넣어 냉각시킨 후 보관하였다.
분리되고 정제된 미세아교세포를, PDL로 코팅된 커버 글라스가 깔린 12-웰 플레이트에 시딩하고, 세포 융합이 약 70%에 도달하면 배양 배지를 버리고 PBS로 3회(매회 5분) 세척하고, PBS를 버리고, 4%(w/v)의 PFA를 사용하여 4℃에서 20분 동안 고정시키고 PBS를 사용하여 3회(매회 5분) 세척한 다음, 0.2%(w/v)의 트리톤 X-100-PBS를 실온에서 5분 동안 사용하여 투과화시키고, PBS를 사용하여 3회(매회 5분) 세척하였다. 고정된 세포를 실온에서 1시간 동안 10% BSA(PBS)와 함께 배양하여 차단시키고 PBS로 2회 세척하였다. 세포 슬라이드를 어두운 상자에 넣고 항-Iba1 항체와 함께 4℃에서 밤새 배양하고, PBS로 3회 세척하였다(매회 5분). 형광-표지된 2차 항체를 첨가하고 실온의 암실에서 1시간 동안 배양하고, PBS를 사용하여 4회(매회 5분) 세척하였다. DAPI 염료가 함유된 항-형광 소광 봉입제를 첨가하고 슬라이드 글라스에 커버 글라스를 역으로 버클 고정시키고, 세포 슬라이드를 투명한 매니큐어로 밀봉하고 분석을 위해 어두운 상자에 넣었다. 1차 항체를 1:500으로 희석하고, 2차 항체는 1:1000으로 희석하였다.
3개의 형광 사진을 무작위로 선택하고 전체 사진을 Image-pro-plus 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 적색 스폿은 양성 세포의 수이고, 청색 스폿은 전체 핵 수이며, 양성 세포율을 계산하였다. 계산식: 양성 세포율(%) = 양성 염색 세포 수/전체 핵 수 × 100%. 실험에서 정제된 미세아교세포의 순도는 양성 세포율을 계산한 후 >95%였으며, 정제된 미세아교세포를 후속 실험에 사용할 수 있다.
1.4 형광 염색 및 살아있는 세포 영상화
생세포 영상화를 필요로 하는 1차 미세아교세포를 유리 바닥 배양 접시에 접종하고, 실험 전에 기존 배양 배지를 무혈청 배양 배지로 교체하여 밤새 배양하였다. 1 mM Lyso추적자 Red DND-99를 10% FBS를 함유하는 MEM 완전 배지에서 50 nM으로 희석하고; 기존 배양 용액을 형광 탐침이 포함된 로딩 용액으로 교체한 후 배양 접시를 CO2 배양기에 넣어 30분간 배양하여 살아있는 세포의 리소좀을 염색하고 세포내 ATP를 완전 배지에서 100 nM으로 희석된 퀴나크린으로 염색하였다. 형광 사진은 Plan Apo 60 × 1.40-배 오일 렌즈를 대물렌즈로 사용하여 Nikon 도립현미경(Nikon Eclipse Ti-E, Japan)으로 촬영하였으며, 실시간 생세포 영상화를 연속 레이저 스캐닝으로 수행하였고, 여기서 Lyso추적자의 방출은 561 ㎚이고 퀴나크린의 방출은 488 ㎚였다. 세포 배양 배지에 고농도 PAO 모액을 스폿팅 방식으로 첨가하여 배양 배지 내 PAO 모액의 최종 농도가 100 nM이 되도록 하였으며, 스폿팅에서 PAO 첨가 0초부터 타이밍을 수행하였고, 타임랩스 촬영에 의해 10초마다 형광 이미지를 수집하였으며, 여기서 총 촬영 시간은 500초였고, Volocity 소프트웨어(PerkinElmer)를 사용하여 형광 이미지 분석을 수행하였다. 타임랩스 촬영에 사용된 레이저 출력은 형광 표백 가능성을 피하기 위해 가능한 한 많이 줄였다(<1%).
1.5 PI4KIIIα 억제제에 의한 세포 처리
1차 미세아교세포를 저 농도에서 PI4KIIIα의 특정 억제제인 페닐아르신 옥사이드(PAO)로 처리하였다. 1차 미세아교세포 배양물을 각각 1시간 동안 완전 배지로 희석된 0, 25 또는 100 nM 농도의 PAO와 함께 배양한 다음, 리소좀 외포작용 영상화를 위해 세포 샘플을 수집하거나 세포외액 중의 ATP 농도를 측정하기 위해 배양 용액을 수집하였다. 미세아교세포를 대조용 실험으로서 PAO가 없는 10% FBS를 함유하는 MEM 배양 용액으로 처리하였다.
1.6 세포 배양 용액 중의 ATP 농도 측정
세포외액 중의 ATP 함량을 루시페라제 리포터 실험을 이용한 생물발광 방법에 의해 측정하였다. 미세아교세포를 밤새 무혈청 MEM 배지에서 굶겼다. ATP 가수분해를 방지하기 위해, ATP 가수분해효소 억제제 디피리다몰(10 μM)을 실험 내내 배지에 첨가하였다. 배지에 각각 0, 25, 100 nM의 PI4KIIIα 억제제 PAO를 첨가하고, 각각 0, 4, 6, 8, 15, 30 및 60분 동안 배양한 후 배지를 수집하였다. 불투명한 백색 96-웰 플레이트에 루시페라제-루시페린 완충액을 함유하는 ATP 분석 혼합물 50 ㎕를 첨가하고, 플레이트를 2분간 방치하여 웰 중의 ATP가 소모되도록 하고, 이어서 샘플 50 ㎕를 웰에 첨가하였다. 용액의 발광값을 Varioskan Flash(Thermo Fisher Scientific) 다기능 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 측정하였다. 표준 ATP 샘플의 발광값으로부터 표준 곡선을 구하고, 표준 방정식을 참조하여 샘플 중의 ATP 함량을 구하였다. 데이터를 그룹당 적어도 3회 실험의 평균 ± SEM으로 표시하였다. 통계 데이터 분석은 일원 ANOVA 분석을 사용하여 수행하였다.
1.7 세포의 총 단백질 함량 측정
기존의 세포 배양 배지를 흡출하고 PBS 완충액을 첨가하여 3회 세척하고 PBS를 버리고 1% 프로테아제 억제제를 함유하는 RIPA 용해물(12-웰 플레이트에서 100 ㎕/웰)을 첨가하고, 플레이트를 30분 동안 빙상에 두어 용해시키고, 이어서 웰 바닥의 세포를 세포 스크래퍼로 긁어내고 1.5 ㎖ 원심분리기 튜브에 넣은 후 4℃에서 15000 rpm으로 30분간 원심분리시켜 상등액을 수집하고 그 중의 총 단백질 함량을 측정하였다. 작업 용액 및 표준 용액을 명세서의 요건에 따라 제형화하고, 샘플 및 작업 용액을 96-웰 플레이트에 1:8의 비로 첨가하였다, 즉 25 ㎕의 샘플, BSA 표준 용액 및 200 ㎕의 작업 용액을 각 웰에 첨가하고, 혼합물을 편평 플레이트 진동자상에서 30초 동안 균일하게 혼합하고, 이어서 웰 플레이트를 알루미늄 호일로 덮고 37℃에서 30분 동안 배양하고, 웰 플레이트를 실온으로 냉각 시킨 후에 상기 웰 플레이트의 562 ㎚에서의 흡광도를 측정하였다. 전체 세포내 단백질 농도를 표준 곡선으로부터 계산할 수 있다.
1.8 통계 분석
데이터 처리를 GraphPad Prism 5 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 치료를 위해 일원 ANOVA 분석을 사용하였으며, 평균 ± SEM, p <0.03은 통계적 차이가 있음을 가리킨다.
1.9 PI4KIIIα 억제에 의한 미세아교세포 리소좀 형광 강도 감소의 촉진
실험에서 정제된 미세아교세포의 순도는 양성 세포율을 계산한 후 >95%였으며, 정제된 미세아교세포를 후속 실험에 사용할 수 있다.
배양된 미세아교세포(각각 C57B6 또는 PI4KA-/+ 돌연변이 마우스)의 경우, 1 mM Lyso추적자 Red DND-99를 50 nM으로 희석하고 기존 배양 배지를 형광 탐침이 포함된 로딩 용액으로 교체한 후, 배양 접시를 살아있는 세포의 리소좀을 염색하기 위해 30분 동안 배양하였다. 1차 미세아교세포 배양 용액을 100 nM 농도의 PAO 또는 배양 배지와 함께 1시간 동안 배양한 후, 형광 영상화를 수행하였다(도 1).
도 1은 형광 강도가 시간에 따라(0초에서 500초) 감소함을 보여주며, 이는 리소좀 막과 세포질 막의 융합이 리소좀 내 형광 염료의 해리를 유발함을 가리킨다. 도 1(A)의 대조군(PAO가 없는 야생형 WT 마우스 세포)에서, 각 형광 스폿의 형광강도는 500초 이내에 큰 변화가 없었으며, 상기 형광강도는 0초째의 형광강도와 비교하여, 250초에서 13.5%(p <0.001)까지 감소하였고, 통상적인 500초 리소좀 외포작용 후에는 단지 15.1%(p <0.001)까지 감소하였다. 도 1(B)의 PAO(100 nM) 그룹에서, 100초에서 5.2% 변색(p <0.001)을 나타내었고, 200초에서 47.4% 변색(p <0.001), 400초에서 68.5%(p <0.001), 및 500초에서 70.1%(p <0.001) 변색이 달성되었다. 도 1(C)의 PI4K+/- 그룹에서, 일부 스폿의 경우 형광강도 감소가 미미하였으며, 평균 형광강도 감소는 45.1%(p <0.001)였고, 200초 후에 형광강도 변화의 크기가 감소하였다.
1.10 BPB에 의한 미세아교세포의 리소좀 형광 감소
상기 "키스-앤드-런" 융합 포맷을 추가로 검증하기 위해서, 막-불투과성 형광 소광제인 브로모페놀 블루(BPB)를 1 mM의 작업 농도로 도입하였다. BPB는 "키스-앤드-런" 과정에서 형성된 융합 기공을 통해 빠르게 확산되어 리소좀 막 내부의 리플릿상의 잔류 형광을 소멸시킬 수 있다. 아무런 처리도 하지 않은 1차 미세아교세포는 통상적인 외포작용을 거쳐 소량의 BPB가 세포로 유입되게 하는 반면, PI4KIIIα 효소 활성이 억제되면, "키스-앤드-런" 과정에서 생성된 융합 기공을 통해 많은 양의 BPB가 리소좀의 내엽으로 진입하여, 세포내 리소좀 형광의 짧은 소광을 유발한다(도 2).
도 2(A)는 대조군에서 0초째의 형광 강도와 비교하여 250초에서 17.7%(p <0.001), 및 500초에서 20.2%(p <0.001)의 변색을 나타낸다. 도 2(B)는 PAO 처리 후 0초째의 형광 강도와 비교하여, 10초에서 22.3%(p <0.001), 50초에서 55.1%(p <0.001), 100초에서 62.8%(p <0.001), 200초에서 69.1%(p <0.001), 400초에서 75.5%(p <0.001) 및 500초에서 78%(p <0.001)의 변색을 나타낸다. 도 2(C)에서, 22개의 형광 스폿의 평균 형광 강도는 0초째의 평균 형광 강도에 비해, 500초에서 62.5%까지 감소하였다.
1.11 리소좀으로부터 BPB의 분산으로 인해 야기된 미세아교세포 리소좀 형광의 회복/증가
또한, BPB 용액에서 1시간 동안 배양을 수행하였을 때, BPB는 통상적인 외포작용을 통해 세포에 진입하여 제한된 농도에 도달하고, 따라서 리소좀 형광이 소멸되며; 이때, PI4KIIIα의 하향 조절은 리소좀과 세포질 막의 "키스-앤드-런" 융합을 가능하게 하였으며, 리소좀 염료가 해리되기 전에 BPB가 리소좀 밖으로 확산되었고; 이때 일시적으로 소멸되었던 리소좀 형광이 다시 방출되었다(도 3).
도 3(A)는 500초에서 리소좀 형광 강도가 거의 변하지 않았지만 0초째의 형광 강도와 비교하여 1.4%까지 약간 증가한 대조용 실험이다. 도 3(B)에서, 처음 200초 동안 융합 기공의 존재로 인해 세포외 BPB가 WT 세포에 진입하여 리소좀 형광을 일시적으로 소멸시켰으며, 이때 형광 강도는 0초에 비해 평균 41.8% 감소하였다. 다음 300초 동안, 융합 기공의 존재로 인해, 염료가 리소좀으로부터 해리되기 전에 세포 내 BPB가 융합 기공을 통해 상기 세포로부터 다시 배출되었으며, 이는 잠시 소광된 형광성의 회복을 허용하며, 이때 0초에 비해 26.4% 증가하였다. 도 3(C)에서, 1시간 동안 BPB 배양 후 PI4K-/+ 이형접합 녹아웃 세포의 세포내 및 세포외 BPB 농도는 평형에 도달했는데, 이는 리소좀이 이 과정 동안 항상 "키스-앤드-런" 상태에 있었기 때문이며, 결국 0초에 비해 500초에서 평균 11.7%의 형광 강도가 증가하였다.
1.12 PI4KIIIα 억제제에 의한 미세아교세포 리소좀의 세포외 ATP 분비의 촉진
세포외 ATP가 세포질 막과 리소좀의 융합을 촉진하는 데 중요한 역할을 한다는 것이 문헌에 보고되었으며, 미세아교세포에 다량의 ATP가 축적됨이 확인되었다(Dou Y, Wu H J, Li H Q, et al. Microglial migration mediated by ATP-induced ATP release from lysosomes [J]. Cell Research, 2012, 22(6):1022-1033; Imura Y, Moriza WA Y, Komatus R, et al. Microglia release ATP by exocytosis [J]. Glia, 2013, 61(8):1320-1330; Zhang Z, Chen G, Zhou W, et al. Regulated ATP release from astrocytes through lysosome exocytosis [J]. Nature Cell Biology, 2007, 9(8):945-953). PI4KIIIα의 억제는 미세아교세포 리소좀과 세포막과의 "키스-앤드-런" 융합을 촉진하여 리소좀에서 ATP를 방출시킨다. ATP는 세포외로 방출되어 리소좀과 세포막과의 융합을 더욱 촉진하여, 리소좀 중에 β 아밀로이드와 같은 세포 분해 산물 및 세포 독성 물질을 방출시킨다. 리소좀에서 ATP의 축적과 방출을 확인하기 위해 본 발명은 100 nM의 퀴나크린을 사용하여 세포내 ATP를 표지하였다(도 4).
도 4에서, 병합된 그래프로부터, 세포내 ATP가 리소좀과 함께 국소화되어 있음을 확인할 수 있으며, 이는 미세아교세포 리소좀에 다량의 ATP가 축적되어 있음을 입증하였다. 이때, PAO를 배양하였으며, ATP가 세포외로 방출되고, 세포내 ATP가 감소되었다. 도 4(B)의 데이터 분석에서 알 수 있는 바와 같이, PAO-처리된 WT 세포와 PI4K+/- 세포에서 8, 15, 30, 및 60분에 측정된 세포외 ATP 농도는 대조군에 비해 유의하게 증가하였다(p<0.05).
실시예 2. PI4KIIIα 억제제에 의한 뉴런 리소좀의 외포작용 촉진
2.1 1차 해마 뉴런 세포의 단리 및 배양
18-20일 동안 임신한 마우스를 마취제(복강에 1.2% 아바멕틴 0.3 ㎖/10 g 주사)로 마취하고, 배아를 수집하여 멸균된 비이커에 넣고, 비이커의 입구를 박막 장갑으로 밀봉하고, 세포실로 옮겼다. 머리를 자르고, 뇌를 떼어내었으며, 채취한 뇌조직을 DMEM 고-글루코스 배양 배지를 함유하는 세포 배양 접시에 놓은 후, 해부현미경 하에서 해마를 분리하고 DMEM 고-글루코스 배양 배지에 넣고, 해마에 부착된 수막과 혈관을 박리하고, 핀셋으로 찢어 올리고, 12-웰 플레이트내로 흡입하였다. DMEM 고-글루코스 배지를 철저한 세정을 위해 첨가하고, 상기 DMEM 고-글루코스 배지를 마이크로피펫으로 조심스럽게 흡출하고, 이어서 상기 플레이트에 1 ㎖의 0.125% 트립신을 첨가하고, 8분간 부드러운 절단을 위해 37℃에서 이산화 탄소와 함께 배양기에 넣었으며; 상기 플레이트를 4분마다 꺼내어 진탕시켜 균일한 절단을 보장하였으며, 트립신을 조심스럽게 흡출하여 버리고, 소 태아 혈청(FBS)(총 부피의 약 20%)을 첨가하여 1.5 내지 2분 동안 절단 반응을 종결시켰다. FBS를 조심스럽게 흡출하고 접종물(DMEM-HG)을 첨가하고 10회 피펫팅한 다음 2분 동안 정치하고; 상등액에 유리된 단세포가 있었으며, 바닥에 덩어리가 침착되었고, 상등액을 빙욕 배양접시로 옮기고, 상기 조작을 3회 반복한 후에 침전된 덩어리를 버렸다. 세포를 균일하게 피펫팅한 후 세포를 카운트하였으며, 혈구 계수판의 각 웰을 카운팅할 필요가 있었고, 세포가 균일하게 분포되지 않은 경우, 세포를 다시 카운팅할 필요가 있었다. 카운팅이 끝난 후, 접종물을 첨가하여 세포를 균일하게 피펫팅하고, 세포를 세포 배양 플레이트에 시딩하였다(전형적으로 6-웰 플레이트에 1 x 105 세포/웰 등, 형질감염이 필요한 경우 세포의 수를 적합하게 증가시켰다). 플레이트를 CO2가 있는 배양기에 넣어 4시간 동안 배양하고, 이어서 기존의 배지를 신경세포배양용 배지로 교체하고, 플레이트 중의 액체를 배지 교체 중에 가볍게 진탕하고, 플레이트를 37℃에서 접종물로 세척하여 느슨하게 부착된 혈관 세포를 탈착시켰다. 그 후에, 배지의 절반을 2일마다 교환하고, 후속 실험을 위해 배양을 10일 동안 시험관내에서 수행하였다(DIV10).
2.2 PI4KIIIα 억제에 의한 뉴런 세포의 리소좀 형광 강도 감소의 촉진
WT 배아 마우스의 해마로부터 1차 해마 뉴런을 단리하고, 1차 뉴런 세포에 PI4KIIIα 약물 억제를 수행하고, 약물 처리된 야생형 뉴런 세포 및 약물 처리되지 않은 야생형 뉴런 세포의 리소좀 변화를 각각 비교하였다(도 5).
도 5(A)는 리소좀 형광 스폿의 수가, PAO에 의한 PI4KIIIα 활성의 억제 없이 WT 1차 뉴런 세포에서 거의 변하지 않는다는 것을 나타낸다. 도 5(B)는 야생형 1차 뉴런 세포에서 PAO 용액과 함께 배양한 후 리소좀 형광 강도가 대조군에 비해 유의하게 감소되었음을 나타낸다.
실시예 3. PI4KIIIα 억제제에 의한 세포내 α-시누클레인 단백질 수준의 감소 억제
3.1 PC12, SH-SY5Y 세포주의 배양
PC12 완전 배양 시스템을, 10% HS 및 5% FBS를 고-글루코스 DMEM에 첨가하여 제조하였고; SH-SY5Y 완전 배양 시스템을, 고-글루코스 DMEM에 15% FBS를 첨가하여 제조하였다.
3.2 PC12 및 SH-SY5Y 세포의 면역형광 염색
세포 배양 시스템을 약물로 처리한 후, 하기의 작업을 수행하였다, 고정: 4% PFA로 30분간 처리; 투과화: 15분 동안 0.1% 트리톤-X로 처리; 및 차단: 1시간 동안 10% 당나귀 혈청으로 차단; 1차 항체: 마우스 항-α-시누클레인; 2차 항체: 항-마우스 Alex 555.
3.3 α-시누클레인 ELISA 분석
Hu α-시누클레인 검출 항체 용액 50 ul를 각 웰에 첨가하고(빈 발색체 블랭크, 즉 비색성 블랭크 웰 제외), 50 ul의 샘플 및 표준 곡선 시약(하기 도면에서 제조된다)을 각 웰에 첨가하고(빈 발색체 블랭크 제외), 균일한 혼합을 위해 부드러운 진탕을 수행하고, 웰을 덮기 위해 필름을 사용하고 4℃에서 밤새 배양을 수행하고; 웰을 100 ul의 1X 세척 완충액으로 4회 충분히 세척한 후, 각 웰에, 빈 발색체 블랭크를 제외하고 100 ul의 항-토끼 IgG HRP를 첨가하고, 필름을 사용하여 웰을 덮고 실온에서 30분 동안 배양을 수행하고, 웰을 다시 1X 세척 완충액으로 4회 충분히 세척하고; 각 웰에 100 ㎕의 안정화된 발색체를 첨가하고, 용액이 청색으로 변하였으며, 웰을 실온의 암실에서 30분 동안 배양하고; 각 웰에 100 ㎕의 정지액을 첨가하였다. 혼합물을 부드럽게 진탕시킴으로써 균일하게 혼합하고, 용액이 황색으로 변하였으며, 미세플레이트 판독기로 판독하였다(파장: 450 ㎚).
3.4 PI4KIIIα 억제제에 의한 세포의 처리
PC12 또는 SY 세포 배양 시스템: 10% HS + 5% FBS + 고-글루코스 DMEM, 40-60% 배양 접시로 배양, 및 Fugene HD 형질감염 시약을 사용하여 α-시누클레인 과발현 플라스미드를 형질감염시켰다. 24시간 배양 후에 24시간 동안 기아 배양을 수행하고(혈청 제거), 배양 시스템을 정상 배양 시스템으로 바꾸고, Lyso-추적자를 첨가하여 30분간 처리한 다음, 신선한 배양 배지 교체 및 PAO 처리를 수행하였다. PAO 처리 그룹: 25 nM, 50 nM, 100 nM에서 10분간 처리 후 면역세포화학적 염색을 수행하였다.
3.5 티아졸릴 블루(MTT) 분석에 의한 세포 생존력의 측정
약물을 12시간 동안 투여하여 처리하고, 최종 농도가 05. ㎎/㎖인 MTT를 첨가하고, 배양 4시간 후 배양 용액을 흡출하고, 흡착된 MTT를 용해시키기 위해 DMSO 100 ㎕를 첨가하고, 15분 동안 진탕시킨 후 흡광도 값을 판독하였다.
3.6 플라스미드 형질감염
α-시누클레인 과발현 플라스미드의 정보는 하기와 같았다:
ATGGATGTATTCATGAAAGGACTTTCAAAGGCCAAGGAGGGAGTTGTGGCTGCTGCTGAGAAAACCAAACAGGGTGTGGCAGAAGCAGCAGGAAAGACAAAAGAGGGTGTTCTCTATGTAGGCTCCAAAACCAAGGAGGGAGTGGTGCATGGTGTGGCAACAGTGGCTGAGAAGACCAAAGAGCAAGTGACAAATGTTGGAGGAGCAGTGGTGACGGGTGTGACAGCAGTAGCCCAGAAGACAGTGGAGGGAGCAGGGAGCATTGCAGCAGCCACTGGCTTTGTCAAAAAGGACCAGTTGGGCAAGAATGAAGAAGGAGCCCCACAGGAAGGAATTCTGGAAGATATGCCTGTGGATCCTGACAATGAGGCTTATGAAATGCCTTCTGAGGAAGGGTATCAAGACTACGAACCTGAAGCCTAA(서열번호 4)
α-시누클레인 ELISA 키트를 Thermo Fisher Scientific(카탈로그 번호 KHB0061)에서 구입하였다. Fugene HD 형질감염 시약을 Promega(Beijing) Biotech Co., Ltd.(카탈로그 번호 E2311)에서 구입하였고; α-시누클레인 단클론 항체(마우스 단클론)를 Sigma-Aldrich(Shanghai, Cataltlog No. S5566)에서 구입하였다.
3.7 SH-SY5Y 세포에서 α-시누클레인의 과발현으로 인한 세포사 또는 세포자멸사의 PAO 억제
파킨슨병 환자의 특징적인 세포병리학적 특징은 미스폴딩된 α-시누클레인 단백질에 의해 좌우되는 단백질 응집의 발생이다. 이러한 응집된 단백질은 제때 제거될 수 없기 때문에 세포독성을 유발하는 것으로 생각된다. 본 발명은 SH-SY5Y 세포주를 α-시누클레인 과발현(α-syn-OE) 플라스미드로 형질감염시키고, 24시간 후에 PAO 처리를 12시간 동안 제공하였다. 이어서 MTT 분석에 의해 각 그룹에 대한 세포 생존율을 측정하고 α-syn-OE 그룹과 비교하였다(도 6).
일원 ANOVA 분석 후 결과는 하기와 같다: 도 6(A)는 α-syn-OE 그룹의 세포 생존율이 대조용(비히클) 그룹의 세포 생존율보다 유의하게 낮음을 나타내고; 도 6(B)는 α-syn-OE + PAO 처리 그룹(각각 6.25, 12.5, 25, 50, 75, 100 nM 농도의 PAO)의 세포 생존율이 α-syn-OE 그룹의 세포 생존율보다 유의하게 높음을 나타낸다(n = 5, 평균 ± SEM, 일원 ANOVA, **p <0.01, ***p <0.0001 대 α-syn-OE). 이 실험은 PAO가 α-시누클레인의 과발현으로 인한 세포독성을 완화시키는 작용을 할 수 있음을 입증한다.
3.8 PAO 시리즈 화합물에 의한 α-시누클레인 분비의 촉진
본 발명은 또한 α-시누클레인의 분비 또는 배출을 촉진하는 PAO의 특성을 분석하였다. 배양된 PC12 및 SH-SY5Y 세포주를 각각 Fugene HD 형질감염 시약을 사용하여 α-시누클레인 과발현 플라스미드로 형질감염시켰으며, 24시간 동안 기아 처리를 수행한 후 기존 배양 시스템을 완전 배양 시스템으로 교체하였고, 한편으로 화합물 PAO 또는 PAO 유도체 p-메틸 페닐 아르신 옥사이드를 4시간 동안 처리에 사용하였으며, 세포 배양 용액의 상등액 중의 α-시누클레인 수준을 ELISA에 의해 측정하였다.
PAO 유도체 p-메틸 페닐 아르신 옥사이드는 하기 화학식을 갖는다:
Figure pct00190
도 7(A)는 50 nM, 75 nM 및 100 nM PAO-처리 그룹의 세포외 α-시누클레인 단백질 수준이 P12 세포주에서 PAO가 없는 대조용 α-synOE 그룹에 비해 유의하게 증가되었음을 나타내며, 이는 PAO가 세포내 α-시누클레인 단백질의 유출을 촉진할 수 있음을 암시한다. 도 7(B)는 PAO가 SH-SY5Y 세포주에서 세포외 α-시누클레인 단백질 수준을 촉진하는 동일한 능력을 가졌음을 나타낸다. 도 7(C)는 50 nM, 75 nM PI-70 처리가 또한 P12 세포주에서 세포내 α-시누클레인 단백질의 유출도 촉진하였음을 나타낸다.
3.9 PAO에 의한 세포내 α-시누클레인 단백질 수준 감소의 촉진
본 발명은 먼저 세포에 PAO 처리를 수행한 후, ELISA 방법과 웨스턴 블롯에 의해 세포내 α-시누클레인 단백질 수준을 측정하였다. 세포 배양 및 약물 처리 방식은 상기와 동일하였다. 도 8에서, ELISA 분석 결과는 75 nM 및 100 nM PAO-처리 그룹에서 α-시누클레인 단백질 수준이 α-syn OE 그룹에 비해 유의하게 감소하였음을 나타내었으며, 이는 PAO가 세포내 α-시누클레인 단백질 수준을 감소시킬 수 있음을 암시한다. 도 8(B)에서, 웨스턴 블롯 분석 결과는 75 nM 및 100 nM PAO-처리된 그룹에서 α-시누클레인이 대조군에서보다 더 낮음을 나타내었다.
실시예 4. PI4KIIIα 억제제에 의한 HTT 및 SOD1 단백질의 분비 촉진
4.1 SOD1 ELISA 분석
100 ul의 희석된 표준 곡선 시약, 블랭크 대조군 및 샘플을 분석 웰 플레이트의 해당 웰에 첨가하였다. 플레이트를 필름으로 덮고 37℃에서 2시간 동안 배양하고; 각 웰의 액체를 버리고, 각 웰에 100 ul 검출 시약 A 작업 용액을 첨가하고 플레이트를 필름으로 덮고 37℃에서 1시간 동안 배양하고; 상등액을 버리고 각 웰을 가능한 한 액체 잔류물 없이 매회 2분 동안 1X 세척 완충액으로 3회 세척하고; 각 웰에 100 ul 검출 시약 B 작업 용액을 첨가하고 플레이트를 필름으로 덮고 37℃에서 1시간 동안 배양하고; 세척 작업을 5회 반복하고; 각 웰에 90 ㎕의 기질 용액을 첨가하고 플레이트를 필름으로 덮고 암실에서 37℃에서 20분 동안 배양하였다. 용액이 파란색으로 변하였으며; 각 웰에 정지액 50 ㎕를 넣고, 혼합물을 가볍게 진탕시켜 균일하게 혼합하였으며, 용액이 황색으로 변하였고, 가능한 한 빨리 마이크로플레이트 판독기로 판독을 수행하였다(흡수 파장: 450 ㎚).
4.2 인간 헌팅틴 ELISA 분석
50 ul의 희석된 표준 곡선 시약, 블랭크 대조군 및 샘플을 분석 웰 플레이트의 해당 웰에 첨가하고; 50 ul의 검출 A 작업 용액을 각 웰에 즉시 첨가하였다. 균일하게 혼합하기 위해 부드럽게 진탕시킨 후, 플레이트를 필름으로 덮고 37℃에서 1시간 동안 배양하고; 각 웰의 액체를 제거하고, 상등액을 버리고, 각 웰을 가능한 한 액체 잔류물 없이 매회 2분 동안 1X 세척 완충액으로 3회 세척하고; 100 ul의 검출 시약 B 작업 용액을 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 필름으로 덮고 37℃에서 45분 동안 배양하고, 세척 작업을 5회 반복하고; 각 웰에 90 ㎕의 기질 용액을 첨가하였다. 플레이트를 새로운 필름으로 덮고 37℃의 암실에서 10-20분 동안 배양하고; 각 웰에 정지액 50 ㎕를 첨가하고, 혼합물을 가볍게 진탕시켜 균일하게 혼합하였으며, 용액이 황색으로 변하였고, 즉시 마이크로플레이트 판독기로 판독을 수행하였다(흡수 파장: 450 ㎚).
4.3 형질전환 시약
형질감염 PC12 세포주를 HTT(1-586aa)(HTT(1-586aa) 과발현 플라스미드는 HTT 단백질 이동에 중요한 부분인 HTT 단백질의 N-말단을 발현할 수 있다) 또는 SOD1 과발현 플라스미드로 Fugene HD 형질감염 시약을 사용하여 형질감염시켰다.
4.4 플라스미드 형질감염
하기의 플라스미드를 Obio Technology (Shanghai) Corp., Ltd.에서 구입하였다:
1) 유전자 명칭: HTT(1-586aa); GenBank ID:NM_002111;
2) 유전자 명칭: SOD1, gen ID: 6647.
인간 초산화물 디스뮤타제 1, 용해성 (SOD1) ELISA 키트를 Signalway Antibody LLC에서 구입하고(SAB, 카탈로그 번호 EK16688); 인간 헌팅틴(HTT) ELISA 키트를 Signalway Antibody LLC에서 구입하였다(SAB, 카탈로그 번호 EK2869).
4.5 PI4KIIIα 억제제에 의한 HTT 및 SOD1 단백질 분비 촉진
신경학적 질환에서, HTT 및 SOD1 단백질은 또한 다양한 신경계 질환의 발생과 밀접한 관련이 있으며, 이때 헌팅톤 질환은 HTT 단백질과 관련되고 근위축성 측삭 경화증은 SOD1 단백질과 관련이 있다. PC12 세포주를 HTT(1-586aa)(HTT(1-586aa) 과발현 플라스미드는 HTT 단백질 이동에 중요한 부분인 HTT 단백질의 N-말단을 발현할 수 있음) 또는 SOD1 과발현 플라스미드로 Fugene HD 형질감염 시약을 사용하여 형질감염시키고; 24시간 배양 후에 24시간 동안 기아 처리를 수행하였으며, 이어서 시스템을 통상적인 배양 시스템으로 교체하고, 화합물 PAO를 사용하여 4시간 동안 처리하고, 세포 배양 유체의 상등액 중의 HTT 단백질 및 SOD1 단백질의 수준을 ELISA를 통해 측정하였다. 결과는 25 nM, 50 nM, 75 nM 및 100 nM PAO 처리 그룹이 HTT OE 그룹과 비교하여 PC12 세포주에서 HTT 단백질 분비를 유의하게 촉진함을 나타내었다(도 9A). 한편, SOD1 과발현 실험에서, 75 nM 및 100 nM PAO 처리 그룹의 SOD1 분비는 HTT OE 그룹에 비해 현저한 유의수준을 가졌다(도 9B).
실시예 5. PI4KIIIα 억제에 의한 CBE-유도된 리소좀 응집의 완화
5.1 PAO 촉진 리소좀에 의한 CBE-유도된 세포독성의 완화
고셔병은 통상적인 유형의 리소좀 축적 질환(LSD)이다. 구체적으로, 글루코세레브로시다제의 유전자 돌연변이에 의해 야기된 체내 산 β-글루코시다제 또는 글루코세레브로시다제(GCase)의 활성 결핍으로 인해, 글루코세레브로시다제의 기질 글루코세레브로시드는 간, 비장, 뼈, 폐 및 심지어 뇌를 포함한 다양한 기관의 대식세포 리소좀에 저장되고, 따라서 영향을 받은 조직 및 기관은 병리학적 변화를 일으키며, 여러 기관이 영향을 받아 임상적으로 점진적으로 악화된다. 콘듀리톨(Conduritol) B 에폭사이드(CBE)는 β-글루코시다제의 통상적으로 사용되는 억제제이며, 본원에서 CBE는 PAO에 의한 고셔병의 조절을 조사하기 위해 사용된다.
하기 농도의 CBE를 배양된 SH-SY5Y 세포주에 각각 첨가하고: 1.5 μM, 3 μM, 6.25 μM, 12.5 μM, 25 μM, 50 μM 및 100 μM, 처리 72시간 후 세포 생존력을 측정하였다. 그 결과, 72시간 동안 50 μM 및 100 μM의 CBE 처리에 의해 유발된 세포사 또는 세포자멸사가 대조군(ctrl)과 비교하여 유의하게 상이함을 나타내었다(도 10A). 후속 실험을 위해 SH-SY5Y 세포를 처리하기 위해 100 μM CBE를 선택하였다. 100 μM CBE 처리 24시간 후, 기아 처리를 수행하고, 24시간 동안 기아 처리 후에, 100 μM CBE를 재-배양에 사용하였고 상이한 농도의 PAO를 24시간 동안 처리를 위해 제공하였으며, MTT 분석을 수행하여 세포 생존율을 측정하였다. n = 5, 일원 ANOVA, **p <0.001, ***p <0.0001, 대 α-syn-OE. 100 μM CBE 처리로 인한 세포사 또는 세포자멸사에 대한 PAO의 효과를 MTT에 의해 분석하였다. 실험 결과, 6.25 nM, 12.5 nM, 25 nM, 50 nM, 75 nM 및 100 nM PAO 처리 그룹의 세포 생존율이 100 μM CBE 처리 그룹보다 유의하게 높은 것으로 나타났다(도 10B).
5.2 PAO에 의한 리소좀 방출 촉진 및 다중 GlcCer의 세포내 축적 감소
PAO가 리소좀 방출을 유도할 수 있기 때문에, 본 발명은 PAO와 CBE를 조합하여 PAO가 리소좀 방출에 영향을 미칠 수 있는지 여부를 시험하였다. SH-SY5Y 세포를 72시간 동안 100 μM CBE로 처리한 후 리소좀 추적자(Lyso추적자)를 첨가하여 리소좀을 표지하였다. 결과는 100 μM CBE 처리 그룹에서 Lyso추적자-표지된 양성 세포의 수가 음성 대조군에 비해 유의하게 증가함을 나타내었으며(도 11), 이는 CBE가 리소좀에서 응집을 유도하고 이를 고셔병의 시뮬레이션에 사용할 수 있음을 가리킨다. SH-SY5Y를 100 μM CBE로 72시간 처리한 후 Lyso추적자를 첨가하고 30분 후에 50 nM 또는 75 nM PAO를 5분(A) 또는 10분(B) 동안 처리하고, 4% 파라포름알데히드(PFA) 고정 후에 관찰을 수행하였다. 스케일 바 = 100 ㎛. 5분(도 11A) 또는 10분(도 11B) 후, Lyso-추적자 표지된 양성 세포는 대조군에 비해 감소되었으며, 이는 PAO가 리소좀에서 CBE-유도된 응집을 완화할 수 있음을 가리킨다.
PAO는 CBE-처리된 세포에서 글루코실세라마이드(GlcCer)의 축적을 감소시켰다. GD의 근본적인 결함은 글루코세레브로시드의 글루코스 및 GlcCer로의 분해를 주로 매개하는 글루코세레브로시다제 활성의 결여이며, 따라서 GlcCer과 같은 기질의 저장이 GD 환자 또는 CBE 처리된 세포의 세포에서 발생한다. PAO가 SH-SY5Y 세포 모델에서 GlcCer 축적에 영향을 미치는지 여부를 추가로 조사하기 위해 우리는 LC-MS 분석에 의해 세포 내 다양한 측쇄의 GlcCer 함량을 측정하였다. 그 결과 100 μM CBE로 처리된 세포에서 다양한 측쇄의 GlcCer 농도가 대조군(ctrl)에서보다 훨씬 높았고, 100 μM CBE와 50 nM PAO를 함께 처리한 그룹에서 GlcCer의 농도가, 100 μM CBE로 처리된 그룹과 비교하여 감소한 것으로 나타났다(도 11C).
화합물 A1 및 G1은 또한 PI4KIIIα의 특이적 억제제이다. SH-SY5Y를 100 μM CBE로 72시간 동안 처리한 다음, 리소좀을 표지하기 위해 리소좀 추적자(Lyso-추적자)를 첨가하였고; 30분 후, 50 nM 또는 75 nM A1 또는 G1을 제공하여 10분 동안 처리하였다. 결과는 100μM CBE-처리 그룹에서 Lyso-추적자 표지된 양성 세포의 수가 음성 대조군에 비해 유의하게 증가하였으며, 50 nM 및 75 nM A1 또는 G1을 10분 동안 처리한 결과 Lyso-추적자 표지된 양성 세포가 100μM CBE 처리와 비교하여 더 적음을 나타내었다(도 12A, B). 따라서 A1과 G1은 모두 리소좀 효소의 외포작용을 촉진하여 CBE 처리로 인한 리소좀 축적을 감소시킬 수 있었다.
5.3 PI4Kα의 녹다운에 의한 리소좀 외포작용 촉진 또는 리소좀 축적의 감소
이전 연구에서는 PAO가 낮은 농도(<5 μM)에서 주로 포스파티딜이노시톨 4-키나제 PI4KⅢα에 작용하는 것으로 나타났으며, 리소좀 축적 질환 및 단백질 미스폴딩-관련 질환에서 PAO 표적 PI4KⅢα의 역할을 추가로 조사하기 위해, 우리는 shRNA 간섭 렌티바이러스 벡터(녹색 형광 단백질 GFP 발현 서열을 갖는다)를, PI4KⅢα 단백질을 암호화하는 유전자 서열 PI4Kα에 대해 설계하였다. 웨스턴 블롯 분석에 대한 결과는 SH-SY5Y 세포를 PI4Kα에 대한 3개의 shRNA 간섭 렌티바이러스 벡터로 형질감염시킨 지 48시간 후에, 간섭 서열 sh1, sh2 및 sh3이 처리 그룹에서 PI4KⅢα의 발현 수준을 유의하게 감소시켰음을 나타내었다(도 13A 및 도 13B). Lyso-추적자의 형광 강도를 shRNA 간섭 렌티바이러스 벡터를 처리한 지 48시간 후에 면역형광에 의해 관찰하였다. sh-ctrl과 비교하여, sh-ctrl 및 100 μM CBE 공-처리 그룹의 Lyso-추적자의 면역형광 강도가 유의하게 증가하였다. sh-ctrl 및 100 μM CBE 공-처리 그룹과 비교하여, sh1-PI4Kα 및 100 μM CBE 공-처리 그룹에서 Lyso-추적자의 면역형광 강도가 유의하게 감소하였다. 상기 결과는 PI4Kα의 녹다운이 리소좀 축적을 감소시키거나 리소좀 외포작용을 촉진할 수 있음을 가리킨다.
실시예 6. PI4KIIIα 억제에 의한 자가포식의 촉진 또는 활성화 및 자가포식 플럭스의 활성화
이전 연구에서는 GD와 같은 리소좀 축적 질환이 발병하는 동안 ALP가 차단되는 것으로 나타났다. SH-SY5Y 세포를 48시간 동안 CBE로 처리한 후, 상이한 농도의 PAO 또는 mTOR 억제제 라파마이신(RAPA)(양성 대조군)을 각각 첨가하고 24시간 동안 배양하고 웨스턴 블롯 분석 또는 면역형광 분석을 실시하고, 자가포식-리포좀 경로에 대한 PAO와 같은 화합물의 효과를, ALP에 대한 공통 마커를 관찰하여 연구하였다. ALP에 공통적인 마커 LC3B 및 p62가 검출되었고 웨스턴 블롯 분석은 하기를 나타내었다: CBE에 의해 구성된 SH-SY5Y 세포 모델에서, PAO가 용량 의존적으로 LC3B 단백질 발현을 촉진하고 p62 단백질 수준을 억제하였으며, 이는 PAO가 ALP 경로를 활성화하고 자가포식 플럭스를 활성화하였으며(도 14A-C), 이는 양성 대조군 500nM RAPA의 결과와 유사하였음을 가리킨다(도 14A-C). 면역형광 결과는 웨스턴 블롯 분석 결과와 일치하였다(도 14D). 또한, H+-ATPase 억제제 바필로마이신 A1(Baf-A1)은 통상적으로 사용되는 ALP 억제제이며, Baf-A1에 의한 ALP 신호전달의 차단을, CBE에 의해 구성된 SH-SY5Y 세포에 대한 PAO와 같은 화합물의 보호 효과가 ALP와 관련있는 지의 여부를 추가로 검증할 수 있다. SH-SY5Y 세포에 48시간 동안 CBE를 처리한 후, 그룹에 따라 각각 상이한 농도의 PAO 또는 50 nM Baf-A1을 첨가하고 24시간 동안 배양하고, 세포 생존력을 MTT 분석에 의해 측정하였다. 실험 결과는 100 μM CBE가 대조군(ctrl)에 비해 SH-SY5Y 세포 생존력을 유의하게 억제함을 보여주었다. 100 μM CBE 처리 그룹과 비교하여, 100 μM CBE 및 25 nM, 50 nM 및 75 nM PAO 공-처리 그룹에서 세포 생존력이 유의하게 증가하였으며, 50 nM Baf-A1 처리는 해당 그룹에서 PAO의 보호 효과를 감소시켰고, 각각 25 nM, 50 nM 및 75 nM PAO와 조합된 50 nM Baf-A1 및 100 μM CBE로 처리된 그룹의 세포 생존력은 100 μM CBE로 처리된 그룹과 크게 다르지 않았으며(도 14E), 이는 Baf-A1이 ALP 신호 전달을 억제함으로써 CBE-처리된 SH-SY5Y 세포에 대한 PAO의 보호 효과를 차단하였음을 가리킨다. 상기 결과는 PAO가 ALP를 활성화하여 자가포식 플럭스를 활성화하고 ALP를 통해 GD 세포 모델에 보호 효과를 발휘함을 입증하였다.
ALP 경로 마커 LC3B는 shRNA 간섭 렌티바이러스 벡터로 처리된 SH-SY5Y 세포에서 검출되었으며, 그 결과는 하기를 나타내었다: sh-ctrl 그룹과 비교하여, LC3B 단백질 수준이 PI4Kα의 녹다운 후에 유의하게 증가하였으며(도 15), CBE-처리된 SH-SY5Y 세포의 PI4Kα의 녹다운은 LC3B 단백질 발현을 유사하게 촉진하였고, 이는 PI4Kα 억제제 PAO와 동일한 결과를 가리키며, PI4Kα의 녹다운은 또한 ALP 경로를 활성화시켰다.
실시예 7. PI4KIIIα 억제에 의한 C형 니만-픽병(NPC)의 세포내 콜레스테롤 축적의 감소(도 16)
세포내 콜레스테롤 수송 억제제인 U18666A는 C형 니만-픽병(NPC)의 세포 모델을 구성하는 데 종종 사용된다.
1. 세포 배양 및 화합물 처리
SH-SY5Y 세포를 37℃, 5% CO 배양기에서 고-글루코스 DMEM 및 15% FBS를 함유하는 완전 배지에서 배양하였다. 세포 융합이 70%에 도달하면, 10 μM U18666A(Absin(Shanghai) Biotechnology Co., Ltd.에서 구입, 카탈로그 번호 abs819512)를 첨가하고, 그룹별로 상이한 농도의 d5PAO 및 PAO를 첨가하여 24h 동안 배양하였다.
2. 필리핀(Filipin) 염색
1) 24웰 플레이트 중의 배양 배지를 버리고, PBS 완충액 1 ㎖를 첨가하여 1분간 정치시키고, 24웰 플레이트 중의 액체를 버리고, 이러한 단계를 2회 반복하였다;
2) 각 웰에 4% 파라포름알데히드 1 ㎖를 첨가하고, 실온에서 30분간 고정시켰다;
3) 24-웰 플레이트 중의 4% 파라포름알데히드를 버리고 PBS 완충제 1 ㎖를 첨가하고, 24-웰 플레이트를 1분간 부드럽게 진탕시키고, 24-웰 플레이트 중의 액체를 버리고, 상기 단계를 2회 반복하였다;
4) 1.5 ㎎/㎖ 글리신 용액 1 ㎖를 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 실온에서 10분 동안 배양하였다;
5) 24-웰 플레이트 중의 액체를 버리고, 50 ㎍/㎖의 필리핀 염색 용액 1 ㎖(Sigma Aldrich에서 구입, 카탈로그 번호 SAE0087)를 첨가하고, 1h 동안 실온의 암실에서 배양하였다;
6) 24웰 플레이트 중의 액체를 버리고, PBS 완충액 1 ㎖를 첨가하고 24웰 플레이트를 1분 동안 부드럽게 진탕시키고, 24웰 플레이트 중의 액체를 버리고, 상기 단계를 2회 반복하였다;
7) 슬라이드 글라스를 취하고, 슬라이드 글라스 중앙에 5 ㎕의 봉입제(DAPI 함유)를 적가하고, 세포 슬라이드를 꺼내 건조시키고, 세포가 자라는 면을 아래로 향하게 하여 슬라이드 글라스를 덮은 다음(이는 세포를 봉입제와 완전히 접촉시킨다), 세포를 실온의 암실에서 30분 동안 배양하였다.
8) 레이저 공초점 현미경을 사용하여 관찰을 수행하였다.
실험 결과
SH-SY5Y 세포를 10 μM U18666A로 처리하고, 그룹별로 상이한 농도의 PAO와 24h 동안 배양하고, 필리핀 염색 후에 관찰을 수행하였다. 면역형광 염색 결과 10 μM U18666A-단독 처리 그룹에서 필리핀 염색 형광 강도가 대조군(ctrl)에 비해 향상되었으며, 이는 10 μM U18666A 처리가 필리핀에 결합된 콜레스테롤 량의 증가로 이어졌음, 즉 콜레스테롤 축적이 발생했음을 암시한다. 10 μM U18666A-단독 처리 그룹과 비교하여, 10 μM U18666A 및 35 nM, 70 nM PAO 공-처리 그룹에서 필리핀 염색 형광 강도가 감소하였다(도 16). 상기 결과는 특정 농도의 PAO가 U18666A로 인한 콜레스테롤 축적을 억제할 수 있음을 나타낸다.
본 발명의 특정 실시예가 예시를 목적으로 여기에 설명되었지만, 본 발명의 진의 및 범위를 벗어나지 않고 다양한 변형이 이루어질 수 있음은 당업자에게 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 구현예 및 실시예에 대한 상세한 설명이 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명은 첨부된 청구범위에 의한 경우를 제외하고는 제한되지 않는다. 본원에 인용된 모든 문서는 그 전체가 참고로 포함된다.

Claims (27)

  1. 세포내 단백질 미스폴딩(misfolding)-관련 질환을 예방 또는 치료하는 제조(preparation)에서의, PI4KIIIα 특이적 억제제의 용도.
  2. 리소좀 축적 질환(lysosomal storage disease)을 예방 또는 치료하는 제조에서의, PI4KIIIα 특이적 억제제의 용도.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    PI4KIIIα 특이적 억제제가 항체, 소분자(small molecule) 화합물, RNAi 분자 또는 안티센스(antisense) 핵산인, 용도.
  4. 제3항에 있어서,
    항체가 단클론 항체(monoclonal antibody) 또는 다클론 항체인, 용도.
  5. 제3항에 있어서,
    항체가 키메라 항체(chimeric antibody), 인간화된 항체 또는 완전한 인간 항체인, 용도.
  6. 제3항에 있어서,
    RNAi 분자가 작은 간섭 RNA(siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA) 또는 마이크로RNA(miRNA)인, 용도.
  7. 제3항에 있어서,
    RNAi 분자는 길이가 18-100개 염기인, 용도.
  8. 제3항, 제6항 및 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    RNAi 분자가 이의 안정성을 향상시키기 위해 변형되는, 용도.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    PI4KIIIα 특이적 억제제가 소분자 화합물인, 용도.
  10. 제9항에 있어서,
    소분자 화합물이 페닐아르신 옥사이드 또는 이의 유도체, G1 및 이의 유사체, 및 A1 및 이의 유사체인, 용도.
  11. 제10항에 있어서,
    페닐아르신 옥사이드 및 이의 유도체가 하기 화학식 I로 표시되는 구조 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 갖는, 용도:
    화학식 I
    Figure pct00191

    상기식에서,
    각각의 R1은 (a) H, 할로겐, 니트로, 시아노, 하이드록실, 아미노, 카바모일, C1-6 알킬설푸릴, C1-6 알킬, C1-6 사이클로알킬, C2-6 알키닐, C2-6 알케닐, C1-6 알콕시, C1-6 할로알킬, C1-6 알킬렌-NH2, C1-6 알킬렌-NH-C(O)H, -As(O), -N=NH, N-(C1-6 알킬)아미노, N,N-(C1-6 알킬)2 아미노, -NH-C(O)H, -NH-S(O)2H, -C(O)OH, -OC(O)H, -SH, -S(O)2H, -S(O)2-NH2 또는 헤테로사이클릴 중에서 독립적으로 선택되고 R2 또는 R3으로 임의로 치환되며, 여기서 R2 및 R3은 각각 독립적으로 아미노, C1-6 알킬, C1-6 알콕시, C1-6 할로알킬, N-(C1-6 알킬) 아미노, N-(6-12원 아릴)아미노, N,N-(C1-6 알킬)2 아미노, C3-6 사이클로알킬, 6-12원 아릴 또는 3-12원 헤테로사이클릴 중에서 선택되고 하나 이상의 할로겐, 니트로, 시아노, 하이드록실, 아미노, 카바모일, -NH-C(O)-R5, -C(O)OR4, 6-12원 아릴, C1-6 알킬, C2-6 알키닐, C2-6 알케닐, C1-6 알콕시, C1-6 할로알킬, 3-6원 헤테로사이클릴, C3-6 사이클로알킬 또는 Bn-O-로 임의로 치환되고, R4는 C1-6 알킬이고 하나 이상의 할로겐, 니트로, 시아노, 하이드록실, 아미노, 카바모일, 6-12원 아릴, C1-6 알킬, C2-6 알키닐, C2-6 알케닐, C1-6 알콕시, C1-6 할로알킬, 3-6원 헤테로사이클릴, C3-6 사이클로알킬 또는 Bn-O-로 임의로 치환되고, R5는 H, C1-6 알킬, C2-6 알키닐, C2-6 알케닐, C1-6 알콕시 또는 C1-6 할로알킬 중에서 선택되고/되거나
    (b) 2개의 인접한 탄소 원자상의 R1은 5-12원 사이클로알킬, 아릴 또는 헤테로사이클릴을 형성하고 하나 이상의 할로겐, 니트로, 시아노, 하이드록실, 아미노, 카바모일, 6-12원 아릴, C1-6 알킬, C2-6 알키닐, C2-6 알케닐, C1-6 알콕시, C1-6 할로알킬, 3-6원 헤테로사이클릴, C3-6 사이클로알킬 또는 Bn-O-로 임의로 치환되고,
    여기서 n은 0 내지 5의 정수이다.
  12. 제11항에 있어서,
    n이 0 내지 2의 정수이고, 각각의 R1이 H, 할로겐, 니트로, 시아노, 하이드록실, 아미노, 카바모일, C1-6 알킬설푸릴, C1-6 알킬, C1-6 사이클로알킬, C1-6 알콕시, C1-6 할로알킬, -As(O), N-(C1-6 알킬)아미노, N,N-(C1-6 알킬)2 아미노, -NH-C(O)H 또는 -NH-S(O)2H 중에서 독립적으로 선택되고 R2 또는 R3으로 임의로 치환되는, 용도.
  13. 제11항에 있어서,
    n이 0 내지 2의 정수이고, 각각의 R1이 H, 할로겐, 니트로, 시아노, 하이드록실, 아미노, C1-6 알킬설푸릴, C1-6 알킬, C1-6 사이클로알킬, C1-6 알콕시, C1-6 할로알킬, -As(O), -NH-C(O)H 또는 -NH-S(O)2H 중에서 독립적으로 선택되고 R2 또는 R3으로 임의로 치환되는, 용도.
  14. 제11항에 있어서,
    n이 1 또는 2이고, 각각의 R1이 H, 할로겐, 아미노, C1-6 알킬설푸릴, C1-6 사이클로알킬, C1-6 알콕시, C1-6 할로알킬, -NH-C(O)R2 또는 -NH-S(O)2R3 중에서 독립적으로 선택되고, 여기서 R2가 C1-6 알킬이고 하나의 6-12원 아릴로 임의로 치환되고, R3이 6-12원 아릴이고 하나의 할로겐, C1-6 알콕시 또는 C1-6 할로알킬로 임의로 치환되는, 용도.
  15. 제14항에 있어서,
    R1이 -As(O)의 오르토- 및/또는 파라-위치에 위치하는, 용도.
  16. 제11항에 있어서,
    n이 0인, 용도.
  17. 제10항에 있어서,
    소분자 화합물이 하기의 화합물로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는, 용도:
    Figure pct00192
    ,
    Figure pct00193
    ,
    Figure pct00194
    ,
    Figure pct00195
    ,
    Figure pct00196
    ,
    Figure pct00197
    ,
    Figure pct00198
    ,
    Figure pct00199
    ,
    Figure pct00200
    ,
    Figure pct00201
    ,
    Figure pct00202
    ,
    Figure pct00203
    ,
    Figure pct00204
    ,
    Figure pct00205
    ,
    Figure pct00206
    ,
    Figure pct00207
    ,
    Figure pct00208
    ,
    Figure pct00209
    ,
    Figure pct00210
    ,
    Figure pct00211
    ,
    Figure pct00212
    ,
    Figure pct00213
    ,
    Figure pct00214
    ,
    Figure pct00215
    ,
    Figure pct00216
    ,
    Figure pct00217
    ,
    Figure pct00218
    ,
    Figure pct00219
    ,
    Figure pct00220
    ,
    Figure pct00221
    ,
    Figure pct00222
    ,
    Figure pct00223
    ,
    Figure pct00224
    ,
    Figure pct00225
    ,
    Figure pct00226
    ,
    Figure pct00227
    ,
    Figure pct00228
    ,
    Figure pct00229
    ,
    Figure pct00230
    ,
    Figure pct00231
    ,
    Figure pct00232
    ,
    Figure pct00233
    ,
    Figure pct00234
    ,
    Figure pct00235
    ,
    Figure pct00236
    ,
    Figure pct00237
    ,
    Figure pct00238
    ,
    Figure pct00239
    ,
    Figure pct00240
    ,
    Figure pct00241
    ,
    Figure pct00242
    ,
    Figure pct00243
    ,
    Figure pct00244
    ,
    Figure pct00245
    ,
    Figure pct00246
    ,
    Figure pct00247
    ,
    Figure pct00248
    ,
    Figure pct00249
    ,
    Figure pct00250
    ,
    Figure pct00251
    ,
    Figure pct00252
    ,
    Figure pct00253
    ,
    Figure pct00254
    ,
    Figure pct00255
    ,
    Figure pct00256
    ,
    Figure pct00257
    ,
    Figure pct00258
    ,
    Figure pct00259
    ,
    Figure pct00260
    ,
    Figure pct00261
    ,
    Figure pct00262
    ,
    Figure pct00263
    ,
    Figure pct00264
    ,
    Figure pct00265
    ,
    Figure pct00266
    ,
    Figure pct00267
    ,
    Figure pct00268
    ,
    Figure pct00269
    ,
    Figure pct00270
    ,
    Figure pct00271
    ,
    Figure pct00272
    ,
    Figure pct00273
    ,
    Figure pct00274
    ,
    Figure pct00275
    ,
    Figure pct00276
    ,
    Figure pct00277
    ,
    Figure pct00278
    ,
    Figure pct00279
    ,
    Figure pct00280
    ,
    Figure pct00281
    ,
    Figure pct00282
    ,
    Figure pct00283
    .
  18. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    대상체(subject)가 인간 또는 포유동물인, 용도.
  19. 제1항에 있어서,
    세포내 단백질 미스폴딩-관련 질환이 파킨슨병(Parkinson's disease), 루이소체 치매(Lewy body dementia), 다계통 위축(multiple system atrophy), 봉입체 근염(inclusion body myositis), 전두측두엽 치매(frontotemporal dementia), 헌팅톤병(Hungtington disease), 폴리글루타민병(polyglutamine disease), 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis), 또는 프리온병(Prion disease)인, 용도.
  20. 제2항에 있어서,
    리소좀 축적 질환이 스핑고지질 대사 장애(sphingolipid metabolism disorder), C형 니만-픽병(Niemann-Pick disease type C), 점액다당류증(mucopolysaccharidosis), 글리코겐 축적 질환(glycogen storage disease), 당단백질 축적 질환(glycoprotein storage disease), 지질 축적 질환(lipid storage disease), 번역-후 변형 결핍증(post-translational modification deficiency), 통합 막 단백질 결핍 장애(integral membrane protein deficiency disorder), 신경지방갈색소증(neuronal ceroid lipofuscinosis) 또는 리소좀-관련 세포소기관 장애인, 용도.
  21. 제20항에 있어서,
    스핑고지질 대사 장애가 고셔병(Gaucher disease)인, 용도.
  22. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    제2 제제(second agent)를, 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함을 추가로 포함하는, 용도.
  23. 제22항에 있어서,
    제2 제제가 세포내 단백질 미스폴딩-관련 질환 치료제 또는 리소좀 축적 질환 치료제인, 용도.
  24. 제23항에 있어서,
    PI4KIIIα 특이적 억제제가 제2 제제 이전에, 이후에 또는 이와 동시에 투여되는, 용도.
  25. 약물 후보물(drug candidate)을 PI4KIIIα 단백질 또는 핵산 또는 PI4KIIIα 또는 PI4KIIIα 단백질 복합체와 접촉시키는 단계, 및 상기 약물 후보물이 PI4KIIIα의 형성 또는 활성, 또는 PI4KIIIα 단백질 복합체의 형성, 안정성, 활성 또는 이의 세포막 상의 국소화(localization)를 억제할 수 있는지 여부를 검출하는 단계를 포함하는, 세포내 단백질 미스폴딩-관련 질환을 예방 또는 치료하기 위한 약물을 스크리닝(screening)하기 위한 방법.
  26. 약물 후보물을 PI4KIIIα 단백질 또는 핵산 또는 PI4KIIIα 또는 PI4KIIIα 단백질 복합체와 접촉시키는 단계, 및 상기 약물 후보물이 PI4KIIIα의 형성 또는 활성, 또는 PI4KIIIα 단백질 복합체의 형성, 안정성, 활성 또는 이의 세포막 상의 국소화를 억제할 수 있는지 여부를 검출하는 단계를 포함하는, 리소좀 축적 질환을 예방 또는 치료하기 위한 약물을 스크리닝하기 위한 방법.
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서,
    PI4KIIIα 단백질 복합체가 PI4KIIIα 및 Efr3a/Efr3b, TTC7A/TTC7B, FAM126A/FAM126B 또는 이의 상동성 단백질(homologous protein)로 이루어지는 단백질 복합체인, 방법.
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