CN104540952A

CN104540952A - 用于治疗淀粉状蛋白沉积的方法和组合物

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Publication number: CN104540952A
Application number: CN201380038140.1A
Authority: CN
Inventors: B.L.戴维森; B.T.海曼
Original assignee: University of Iowa Research Foundation UIRF; General Hospital Corp
Current assignee: University of Iowa Research Foundation UIRF; General Hospital Corp
Priority date: 2012-05-18
Filing date: 2013-03-14
Publication date: 2015-04-22
Also published as: CN112574964A; IN2014KN02672A; EP2850195A4; CA2873890C; RU2014151218A; EP2850195A1; AU2013263346A1; EP2850195B1; HK1207109A1; BR112014028666B1; AU2013263346B2; JP2019031564A; BR112014028666A2; US20150183850A1; JP6469000B2; RU2673484C2; ES2786078T3; WO2013172964A1; JP2015520161A; CA2873890A1

Abstract

本公开内容提供将保护性ApoE同种型递送到哺乳动物的中枢神经系统中的方法，所述方法包括以有效感染非啮齿类哺乳动物的室管膜细胞的方式，将包含AAV衣壳蛋白和含编码保护性ApoE同种型的核酸的载体的rAAV颗粒给予哺乳动物的脑脊液(CSF)，使得室管膜细胞分泌ApoE进入哺乳动物的CSF中，所述核酸插入一对AAV反向末端重复之间。

Description

用于治疗淀粉状蛋白沉积的方法和组合物

相关申请

本专利申请要求2012年5月18日提交的美国申请顺序号61/648,801的优先权的权益，所述申请通过引用结合到本文中。

联邦资助支持

本发明在美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的资助号RC1AG036265的政府支持下完成。政府在本发明中享有一定权利。

序列表

本申请含以ASCII格式通过EFS-Web提交的序列表，并通过引用以其整体结合到本文中。2013年3月12日创建的所述ASCII副本被命名为17023.122WO1.txt，大小为20,234字节。

发明背景

基因转移目前被广泛公认为用于在细胞和分子水平两者上分析生物学事件和疾病过程的强大工具。最近，用于遗传性(例如ADA缺乏症)或获得性(例如癌症或感染性疾病)人类疾病治疗的基因疗法的应用，已受到相当多的关注。随着改进的基因转移技术的出现和缺陷性基因相关疾病不断扩大的文库的鉴定，基因疗法已从治疗理论快速发展成实用的事实。

传统上，基因疗法被定义为这样一种方法，其中将外源基因导入患者的细胞中以纠正先天遗传错误。最近，基因疗法在广义上被定义为通过将新的遗传信息导入受影响的生物体中来纠正疾病表型。在体内基因疗法中，转移的基因被原位导入接受生物体的细胞中，即在接受者内。已在动物模型中检验了体内基因疗法。已报道了原位直接基因转移到器官和组织(例如肌肉、造血干细胞、动脉壁、神经系统和肺)的可行性。还报告了DNA直接注射入骨骼肌、心肌和DNA-脂质复合物注射入血管系统以产生体内可检测表达水平的插入的基因产物。

中枢神经系统(CNS)疾病(例如脑部遗传疾病例如阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease))的治疗，仍然是难解决的问题。治疗脑部疾病的一个主要问题是治疗性蛋白质在静脉内递送时，无法跨越血脑屏障，或当直接递送到脑时，不会广泛分布。因此，需要开发用于治疗阿尔茨海默病的疗法。

发明概述

在某些实施方案中，本发明提供治疗哺乳动物的阿尔茨海默病的方法，所述方法包括以有效感染非啮齿类哺乳动物的室管膜细胞的方式，将包含AAV衣壳蛋白和含编码保护性ApoE同种型蛋白的核酸的载体的rAAV颗粒给予哺乳动物的脑脊液(CSF)，所述核酸插入一对AAV反向末端重复之间，其中室管膜细胞分泌ApoE以治疗所述疾病。本文所用术语“保护性ApoE同种型”用来区分降低阿尔茨海默病的风险达至少5%，例如10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%或更高的ApoE同种型。

在某些实施方案中，本发明提供将保护性ApoE同种型递送至非啮齿类哺乳动物的中枢神经系统的方法，所述方法包括以有效感染非啮齿类哺乳动物的室管膜细胞的方式，将包含AAV衣壳蛋白和包含编码保护性ApoE同种型的核酸的载体的rAAV颗粒给予非啮齿类哺乳动物的脑脊液(CSF)，使得室管膜细胞分泌ApoE进入哺乳动物CSF，所述核酸插入一对AAV反向末端重复之间。在某些实施方案中，rAAV颗粒是以超过AAV4的感染率20%的感染率，例如以超过AAV4的感染率的50%或100%、1000%或2000%的感染率，感染非啮齿类动物室管膜细胞的rAAV2颗粒。

在某些实施方案中，本发明提供治疗非啮齿类哺乳动物的疾病的方法，所述方法将包含AAV衣壳蛋白和含编码保护性ApoE同种型蛋白的插入一对AAV反向末端重复之间的核酸的载体的rAAV颗粒给予哺乳动物的室管膜细胞，从而将核酸递送至室管膜细胞中，其中室管膜细胞分泌ApoE蛋白以治疗所述疾病。本发明提供将核酸递送至哺乳动物的室管膜细胞中的方法，所述方法包括将包含插入一对AAV反向末端重复之间的核酸的AAV颗粒给予哺乳动物，从而将核酸递送至哺乳动物的室管膜细胞中。

在某些实施方案中，本发明提供将编码保护性ApoE同种型的核酸递送至哺乳动物的室管膜细胞中的方法，所述方法包括将包含AAV衣壳蛋白和含插入一对AAV反向末端重复之间的核酸的载体的rAAV颗粒给予室管膜细胞，从而将核酸递送至室管膜细胞中。

在某些实施方案中，本发明提供将编码保护性ApoE同种型的核酸递送至哺乳动物的方法，所述方法包括将包含AAV衣壳蛋白和含插入一对AAV反向末端重复之间的核酸的载体的rAAV颗粒给予哺乳动物的室管膜细胞，并将室管膜细胞输回给哺乳动物，从而将所述核酸递送给哺乳动物。

在某些实施方案中，本发明提供将编码保护性ApoE同种型的核酸递送到哺乳动物的室管膜细胞中的方法，所述方法包括将包含AAV衣壳蛋白和含插入一对AAV反向末端重复之间的核酸的载体的rAAV颗粒给予哺乳动物，从而将核酸递送至哺乳动物的室管膜细胞中。

在某些实施方案中，本发明提供转染哺乳动物脑的室管膜细胞的方法，所述方法包括以有效感染哺乳动物的室管膜细胞的方式，将包含AAV衣壳蛋白和含编码保护性ApoE同种型的核酸的载体的rAAV颗粒给予哺乳动物的脑脊液(CSF)，使得室管膜细胞分泌作用剂进入哺乳动物的CSF中，所述核酸插入一对AAV反向末端重复之间。

在某些实施方案中，哺乳动物是非啮齿类哺乳动物。在某些实施方案中，非啮齿类哺乳动物是灵长类动物、马、绵羊、山羊、猪或狗。在某些实施方案中，灵长类动物是人。

在某些实施方案中，保护性ApoE同种型与ApoE ε2具有至少约80%同源性。在某些实施方案中，保护性ApoE同种型与ApoE ε2具有100%同源性。

在某些实施方案中，AAV颗粒是rAAV4颗粒。在某些实施方案中，AAV颗粒是rAAV2颗粒。在某些实施方案中，rAAV2衣壳与AAV2衣壳蛋白VP1、VP2和/或VP3具有至少80%同源性。在某些实施方案中，rAAV2衣壳与AAV2衣壳VP1、VP2和/或VP3具有100%同源性。

在某些实施方案中，本发明提供用于转染哺乳动物的室管膜细胞以产生治疗结果的含有编码保护性ApoE同种型的插入一对AAV反向末端重复之间的核酸的载体的rAAV颗粒。

在某些实施方案中，本发明提供含有包含编码保护性ApoE同种型的插入一对AAV反向末端重复之间的核酸的载体的rAAV颗粒在制备用于治疗或预防动物(例如人)的阿尔茨海默病的药物中的用途。

本发明提供上述用于医学治疗或诊断的细胞。

本发明提供上述细胞在制备用于治疗哺乳动物的阿尔茨海默病的药物中的用途。

在某些实施方案中，本发明提供药盒，所述药盒包含含有具有编码保护性ApoE同种型的插入一对AAV反向末端重复之间的核酸的载体的rAAV颗粒的化合物、容器和说明将AAV颗粒给予CSF以治疗动物的阿尔茨海默病的包装说明书或标签。

附图简述

图 1A-1B. 脑室内注射AAV4-ApoE导致huAPOE的稳定表达和脑中重组huApoE蛋白的持续检测。

图 2. ApoE各同种型的过量表达差异性地影响淀粉样变的进程。

图 3. 淀粉状蛋白斑的大小随各ApoE同种型而变化。

图 4A-4B. 淀粉状蛋白负荷的死后评价证实ApoE2和ApoE4对淀粉状蛋白沉积的作用。

图 5A-5D. 各ApoE同种型差异性地影响淀粉状蛋白沉积周围的突触密度。

图 6A是AAV2 (SEQ ID NO:1)和AAV4 (SEQ ID NO:2)蛋白质的比对，图 6B是根据得自AAV2 (NC_001401)和AAV4 (NC_001829)的序列的AAV2 (SEQ ID NO:3)和AAV4 (SEQ ID NO:4)核苷酸的比对。

图 7显示不同脑区TPP1活性升高。

图 8显示对照和经治疗的狗的T型迷津行为的结果。浅色圆圈为受感染的狗；深色正方形为正常的狗，深色圆圈为用AAV2-CLN2治疗的TPP-/-狗。

图 9A-9B. 脑室内注射 AAV 血清型 4 的 APOE 基因转移法的验证。GFP或ApoE的免疫组织学标记显示GFP或人ApoE蛋白在室管膜中和脉络丛中的存在情况。(A)定量测定经过注射的小鼠的脑匀浆物内重组人ApoE蛋白的浓度的物种特异性ELISA测定法的应用。(B)每只小鼠的人ApoE蛋白与内源性apoE相比的百分比的评价。计算每只动物的人ApoE和鼠内源性apoE的比率。使用特异性抗人ApoE抗体3H1，可在APP/PS1注射小鼠的皮层实质内的某些淀粉状蛋白沉积周围检出重组蛋白的存在，重组蛋白趋于在淀粉状蛋白沉积周围蓄积。通过蛋白质印迹在注射AAV4-APOE4载体的apoE KO小鼠的ISF样品中检出ApoE。来自Millipore的高灵敏度(但非物种特异性)山羊抗apoE抗体(AB947)用作检测抗体。白蛋白用作对照。n= 4-6只动物/组。*p<0.05。

图 10A-10D. 不同 APOE 等位基因的过量表达调节 Aβ 肽的水平和淀粉状蛋白沉积的密度。(A)经注射的转基因小鼠的皮质(左图)和海马(右图)中淀粉状蛋白沉积的密度的分析。在两个脑区可观察到类似趋势，但仅皮质中的数据达到统计显著性。(B)通过ELISA测定甲酸(FA)级分中Aβ₄₀和Aβ₄₂肽的浓度。(C)脑室内注射各种AAV后5个月通过ELISA定量测定TBS可溶性级分中Aβ₄₀和Aβ₄₂肽的水平。(D) APP/PS1小鼠脑室内注射AAV-GFP和AAV-APOE2/3/4载体后5个月定量测定Aβ₄₀肽的血浆水平。n= 4-7只动物/组。*p<0.05。

图 11A-11B. 各 APOE 变体的过量表达体内差异性地调节淀粉样变的进展。脑室内注射AAV-GFP、-APOE2、-3或-4载体后一周(T0)、一月(T1)和两月(T2)，显现APP/PS1小鼠中淀粉状蛋白沉积的体内双光子图像。在成像前进行葡聚糖(Dextran)、德克萨斯红(70,000 Da)的静脉内注射，使得可随时间推移跟踪同一视场。在2个月的时间内，可检出少量新的淀粉状蛋白斑，而在1或2个月后不再可检出最初可见的临时沉积。(A)在7月龄APP/PS1小鼠中，在脑室内注射AAV-GFP、-APOE2、-APOE3或APOE4后的2个月时间内对淀粉状蛋白沉积的体积皮质密度的评价。对每只动物的6-8个视场进行纵向成像，计算每体积皮质的斑块密度，相对于基线每只动物的最初值(T0)予以报告。随时间观察到0.23的淀粉状蛋白沉积密度的总体进展(T2/T1，p<0.011)。另外，相对于GFP，ApoE2显著降低密度达0.66 (se=0.21，p=0.002)，相对于ApoE3达0.67 (se=0.17，p<0.0001)，相对于ApoE4达0.74 (se=0.17，p<0.0001)。(B) APP/PS1小鼠中基因转移后2个月内淀粉样变进展的线性回归拟合显示，在这个时期仅AAV-APOE4导致显著的正斜率。n= 4-6只动物/组。*p<0.05。

图 12. 在输注 ApoE2 、 -3 和 -4 后 1 和 2 个月淀粉状蛋白沉积大小的演变。表示T1和T0间的斑块大小比率的散点图显示，一个月后，与ApoE2和ApoE3两者相比，ApoE4与斑块生长加快相关。2个月后，这种作用不会持续。3-4只动物内每组测量n> 50个斑块。*p<0.05。

图 13A-13C. 与淀粉状蛋白沉积相关的神经病理学改变受各 APOE 变体的差异性影响。APP/PS1小鼠中，脑室内注射AAV-GFP、-APOE2、-APOE3和-APOE4后2个月制备针对PSD95 (突触后成分)和淀粉状蛋白沉积免疫染色的阵列断层扫描术(array tomography)切片的图像。淀粉状蛋白沉积使用抗体NAB61标记，所述抗体NAB61之前显示优先标记毒性Aβ寡聚体类。(A) 与GFP或APOE2相比，当APOE3和APOE4两者表达时，在淀粉状蛋白斑附近观察到突触蛋白-1标志物显著较高的丢失。(B)当定量测定突触后成分时，观察到类似作用，使得在脑室内注射AAV4-APOE4后2个月，沉积周围的PSD95的密度降低。作为神经病理学改变的其它参数，在针对ThioS和轴突标志物SMI312免疫染色后，在注射APP/PS1小鼠的脑中，评价每淀粉状蛋白斑的神经突营养不良(neuritic dystrophy)的数目。(C)与ApoE3和ApoE2组相比，当输注ApoE4的小鼠表达时，观察到朝着较高数目的营养不良的显著改变，因此表明ApoE4可能具有淀粉状蛋白斑形成以外的有害作用，并可调节较小的寡聚淀粉状蛋白聚集体的神经毒性潜力。n= 4-6只动物/组。*p<0.05。

图 14. Tg2576 小鼠中在脑室内注射 AAV4-APOE2 、 -3 、 -4 后在 ISF 中观察到寡聚 Aβ 物类含量的早期改变。采用82E1/82E1 ELISA测定法的oAβ中ISF含量的定量测定表明，与AAV4-APOE2和-GFP相比，在注射AAV4-APOE4后存在较高浓度的寡聚淀粉状蛋白β类，而AAV4-APOE3注射小鼠达到中间水平。n= 3-6只动物/组。*p<0.05。

图 15A-15B. APP/PS1 小鼠中在脑室内注射 AAV4 后人和内源性鼠 APOE mRNA 和蛋白质的检测。(A)箱形图表示经注射的小鼠的脑中内源性鼠ApoE蛋白的量。(B) APP/PS1小鼠中在脑室内注射AAV4后2和5个月ApoE蛋白水平的比较(在2和5个月时将来自所有ApoE注射小鼠的样品合并在一起，不区分APOE变体)。n= 4-6只动物/组。*p<0.05。

图 16A-16B. 在短期 (2 个月 ) 暴露后对 Aβ 的作用与各 ApoE 同种型相关。在注射后2个月在APP/PS1小鼠中制作淀粉状蛋白沉积的图像。使用Bam10抗体和ThioS的两种免疫染色用来分别使所有淀粉状蛋白沉积或致密中心斑染色。(A)皮质中淀粉状蛋白沉积的密度的体视学分析显示APOE4的过量表达早在注射后2个月便引起斑块数增加，而在其它实验组间未观察到差异。(B)另一方面，Bam10和ThioS染色间的比率，在所有不同组中保持不变。(C)在用不同ApoE变体的短期暴露后不溶性甲酸提取物中Aβ₄₀ (左图)和Aβ₄₂(右图)肽浓度的测定。n= 3-5只动物/组。*p<0.05。

图 17A-17B. Tg2576 小鼠中注射后 3 个月检测到的可溶性和不溶性 Aβ 类的变化。(A) Aβ₄₀和Aβ₄₂ (B)中ISF含量的ELISA定量测定显示，与AAV4-APOE2、-APOE3和-GFP相比，注射AAV4-APOE4后存在朝向较高浓度的可溶性淀粉状蛋白β肽的趋势。(B)如之前在APP/PS1小鼠中观察的，用ApoE4观察到较强作用，ApoE4引起Tg2576小鼠的甲酸级分中显著较高量的Aβ₄₂。n= 3-5只动物/组。*p<0.05。

发明详述

有几种不同的人载脂蛋白E (ApoE)同种型，这些同种型有一些在脑中的存在增加阿尔茨海默病(AD)的风险，而其它同种型的存在降低AD的风险。ApoE ε4同种型的存在是迟发性偶发性AD的强遗传风险因子。(Casellano等，Sci Transl Med，3(89):89ra57 (2011年6月29日))。ApoE ε4等位基因极强地增加AD风险并减低发病年龄。另一方面，ApoE ε2等位基因的存在似乎降低AD风险。人ApoE同种型被认为在体内差异性地影响淀粉状蛋白-β (Aβ)的清除或合成。

腺伴随病毒(AAV)是细小病毒科的小的不致病病毒。AAV因其复制依赖于辅助病毒而不同于该科的其它成员。在辅助病毒不存在时，AAV可以基因座特异性方式整合至染色体19的q臂上。AAV的大约5 kb基因组由一段正或负极性的单链DNA组成。基因组的末端是短的反向末端重复，其可折叠成发夹结构，并用作病毒DNA复制的起点。实体上，细小病毒病毒粒子是无包膜的，且其二十面体衣壳的直径约为20 nm。

迄今已鉴定出8种血清学上不同的AAV，已从人或灵长类动物中分离出5种，称为AAV 1-5型。Govindasamy等，“Structurally Mapping the Diverse Phenotype of Adeno-Associated Virus Serotype 4 (对腺伴随病毒血清型4的各种表型在结构上作图),” J. Vir., 80 (23):11556-11570 (2006)。AAV2基因组的长度为4680个核苷酸，含有2个可读框(ORF)。左ORF编码非结构的Rep蛋白，Rep 40、Rep 52、Rep 68和Rep 78，除产生单链子代基因组以外，Rep蛋白还参与复制和转录的调节。此外，Rep蛋白中的两种与AAV基因组优先整合入人染色体19的q臂区有关。Rep68/78还显示具有NTP结合活性以及DNA和RNA解旋酶活性。Rep蛋白具有核定位信号以及几个潜在的磷酸化位点。这些激酶位点之一的突变导致复制活性的丧失。

该基因组的末端是短的反向末端重复(ITR)，其具有折叠成用作病毒DNA复制起点的T形发夹结构的潜力。描述了ITR区内对ITR的功能是关键的2个元件，GAGC重复基序和末端解离位点(trs)。当ITR呈线性或发夹构象时，该重复基序显示结合Rep。这种结合提供Rep68/78位用于在trs上切割，这以位点特异性和链特异性方式发生。除了其在复制中的作用以外，这2个元件似乎对病毒整合是关键的。包含在染色体19整合基因座内的是具有邻接trs的Rep结合部位。这些元件显示对于基因座特异性整合是功能性的和必须的。

AAV2病毒粒子是无包膜的，二十面体颗粒的直径约25 nm，由称为VP1、VP2和VP3的3个相关蛋白质组成。右ORF编码衣壳蛋白VP1、VP2和VP3。这些蛋白质分别以1:1:10的比率存在，全部来源于右手ORF。衣壳蛋白因使用可变剪切和非常见起始密码子而彼此不同。缺失分析表明，VP1 (自选择性剪接的信使RNA翻译)的剔除或改变导致感染颗粒产量降低。VP3编码区内的突变导致任何单链子代DNA或感染性颗粒的产生失败。AAV2颗粒是包含AAV2衣壳蛋白的病毒颗粒。AAV2衣壳多肽可编码完整VP1、VP2和VP3多肽。颗粒可以是包含AAV2和其它AAV衣壳蛋白(即嵌合蛋白，例如AAV4和AAV2)的颗粒。本文考虑AAV2衣壳蛋白的氨基酸序列的变异，只要包含AAV2衣壳的所得病毒颗粒保持在抗原上或在免疫上不同于AAV4，如可通过标准方法常规测定的。具体地说，例如，ELISA和蛋白质印迹可用来测定病毒颗粒是否在抗原上或免疫上不同于AAV4。此外，AAV2病毒颗粒优选保持不同于AAV4的组织嗜性。

AAV2颗粒是包含AAV2衣壳蛋白的病毒颗粒。编码完整VP1、VP2和VP3多肽的AAV2衣壳多肽可与具有SEQ ID NO:1所示的由核苷酸编码的氨基酸序列的多肽(AAV2衣壳蛋白)总体上有至少约63%同源性(或同一性)。衣壳蛋白可与SEQ ID NO:1所示蛋白质具有约70%同源性、约75%同源性、80%同源性、85%同源性、90%同源性、95%同源性、98%同源性、99%同源性或甚至100%同源性。衣壳蛋白可与SEQ ID NO:1所示蛋白质具有约70%同一性、约75%同一性、80%同一性、85%同一性、90%同一性、95%同一性、98%同一性、99%同一性或甚至100%同一性。颗粒可以是包含AAV4和AAV2衣壳蛋白两者(即嵌合蛋白)的颗粒。本文考虑AAV2衣壳蛋白的氨基酸序列的变异，只要所得的包含AAV2衣壳的病毒颗粒保持在抗原上或在免疫上不同于AAV4，如可通过标准方法常规测定的。具体地说，例如，ELISA和蛋白质印迹可用来测定病毒颗粒是否在抗原上或免疫上不同于AAV4。此外，AAV2病毒颗粒优选保持例如本文实例例示的不同于AAV4的组织嗜性，尽管包含至少一种AAV2外被蛋白的AAV2嵌合颗粒可具有不同于仅由AAV2外被蛋白组成的AAV2颗粒的组织嗜性。

如图 6A和6B所示，AAV2衣壳序列和AAV4衣壳序列约为60%同源的。在某些实施方案中，AAV2衣壳包含与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列有至少65%同源性的序列(或由与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列有至少65%同源性的序列组成)。

在某些实施方案中，本发明还提供含有(即用衣壳包裹)包含一对AAV2反向末端重复的载体的AAV2颗粒。AAV2 ITR的核苷酸序列是本领域已知的。此外，颗粒可以是包含AAV4和AAV2衣壳蛋白两者(即嵌合蛋白)的颗粒。此外，颗粒可以是用衣壳包裹包含来自其它AAV (例如AAV1-AAV8)的一对AAV反向末端重复的载体的颗粒。在颗粒中被衣壳包裹的载体还可包含插入反向末端重复之间的外源核酸。

AAV的下列特征使之成为基因转移的有吸引力的载体。已表明AAV载体在体外稳定整合至细胞基因组中；具有宽泛的宿主范围；体外和体内转导分裂和不分裂的细胞两者并保持高水平的转导基因表达。病毒颗粒是热稳定的，抵抗溶剂、去污剂、pH变化、温度变化的，可在CsCl梯度上浓缩。AAV原病毒的整合与对细胞生长或分化的任何长期负面作用无关。已表明ITR是复制、包装和整合所必需的唯一顺式元件，并且可含有一些启动子活性。

本发明提供给予AAV颗粒、重组AAV载体和重组AAV病毒粒子的方法。例如，AAV2颗粒是包含AAV2衣壳蛋白的病毒颗粒，或AAV4颗粒是包含AAV4衣壳蛋白的病毒颗粒。重组AAV2载体是包含至少一种独特的AAV2核酸的核酸构建体。重组AAV2病毒粒子是含有重组AAV2载体的颗粒。在术语“AAV2 ITR”内要考虑的是，核苷酸序列必须保持将AAV2 ITR与AAV4 ITR区分开来的本文所述的一个或两个特征：(1)三个(而非AAV4中的四个) “GAGC”重复序列，和(2)在AAV2 ITR Rep结合部位中，前2个“GAGC”重复序列的第4个核苷酸是C而非T。

启动子可以是任何所需的启动子，根据已知的考虑事项选择，例如与启动子功能性连接的核酸的表达水平和将在其中使用载体的细胞类型。启动子可以是外源或内源启动子。启动子可包括例如已知的强启动子例如SV40或诱导型金属硫蛋白启动子或AAV启动子，例如AAV p5启动子。启动子的其它实例包括来源于以下的启动子：肌动蛋白基因、免疫球蛋白基因、巨细胞病毒(CMV)、腺病毒、牛乳头瘤病毒、腺病毒启动子例如腺病毒主要晚期启动子、诱导型热激启动子、呼吸道合胞体病毒、劳斯肉瘤病毒(RSV)等。具体地说，启动子可以是AAV2 p5启动子或AAV4 p5启动子。此外，保持启动子活性的p5启动子的较小片段可容易地通过标准方法测定，包括例如在p5启动子中构建一系列的缺失，使该缺失与报道基因连接，并测定报道基因是否表达，即转录和/或翻译。

AAV载体还可包含与启动子功能性连接的外源(异源)核酸。所谓“异源核酸”意指可插入载体中的任何异源或外源核酸，所述载体用于转移到细胞、组织或生物体中。例如，在某些实施方案中，异源核酸编码保护性ApoE同种型。所谓“功能性连接”意指如本领域已知，使得启动子可促进异源核酸的表达，例如启动子相对于异源核酸的适当取向。此外，如本领域已知，异源核酸优选具有用于核酸表达的所有适当序列，以功能性编码待表达的核酸(即允许核酸表达)。核酸可包括例如表达调控序列，例如增强子和必要的信息处理位点，例如核糖体结合部位、RNA剪接位点、聚腺苷酸化位点和转录终止子序列。核酸可编码多于一种的基因产物，仅受可被包装的核酸的大小限制。

AAV2颗粒是包含AAV2衣壳蛋白的病毒颗粒。本文考虑AAV2衣壳蛋白的氨基酸序列的变异，只要所得的包含AAV2衣壳的病毒颗粒保持在抗原上或在免疫上不同于AAV4，如可通过标准方法常规测定的。具体地说，例如，ELISA和蛋白质印迹可用来测定病毒颗粒是否在抗原上或免疫上不同于其它AAV血清型。

AAV4是AAV家族的独特成员。美国专利号6,468,524中提供了AAV4的论述，所述专利通过引用结合到本文中。DNA杂交数据表明AAV1-4同源性的相似水平。然而，与其它AAV形成对比，在AAV4中鉴定出对应于衣壳蛋白的唯一一个ORF，且针对Rep蛋白未检出ORF。本发明提供包含AAV4病毒的载体以及AAV4病毒颗粒。虽然AAV4与AAV2相似，但本文发现两个病毒在物理上和遗传上不同。这些差异赋予AAV4一些独特的优势，使之更好地适于用于基因疗法的载体。例如，野生型AAV4基因组比AAV2大，允许较大重组基因组有效衣壳化。此外，野生型AAV4颗粒具有比AAV2颗粒大的浮力密度，因此比基于AAV2的颗粒更容易从污染性辅助病毒和空的AAV颗粒中分离。另外，与AAV1、2和3形成对比，AAV4能够使人、豚鼠和绵羊红细胞凝聚。

在某些实施方案中，本发明提供包含AAV5病毒的载体或包含该病毒的子部件的载体以及AAV5病毒颗粒。美国专利号6,855,314中提供了AAV5的论述，所述专利通过引用结合到本文中。虽然AAV5与AAV2相似，但是发现两种病毒在物理上和遗传上不同。这些差异赋予AAV5某些独特的性质和优势，使之更好地适于用于基因疗法的载体。例如，使用AAV2作为基因疗法的载体的一个限制性特征是产生大量的病毒。采用标准生产技术，AAV5以是AAV2的10-50倍高的水平产生。因为其独特的TRS位点和Rep蛋白，AAV5应还具有较之于AAV2不同的整合基因座。

此外，再次出乎意料的是，AAV5衣壳蛋白不同于AAV2衣壳蛋白，并显示不同组织嗜性，因此使得含AAV5衣壳的颗粒适于转导AAV2不适于或不太适于的细胞类型。已表明AAV2和AAV5在血清学上是不同的，因此，在基因疗法应用中，AAV5和AAV5来源的载体可允许转导由于天然免疫防疫或因之前暴露于AAV2载体的结果所致已具有AAV2中和抗体的患者。AAV5的另一个优势是AAV5不能被其它血清型拯救。仅AAV5可拯救整合的AAV5基因组，并引起复制，因此避免由其它AAV血清型引起的非有意的AAV5复制。

本文所用术语“多肽”是指氨基酸的聚合物，包括全长蛋白质及其片段。因此，“蛋白质”、“多肽”和“肽”在本文常常互换使用。可通过已知参数选择中性取代。如本领域技术人员所理解的，本发明还包括在氨基酸序列或其它性质中具有细微变化的那些多肽。这些变化可作为等位基因变化(例如由于遗传多态性所致)天然产生或可通过人为干预(例如通过克隆的DNA序列的诱变)产生，例如诱导的点、缺失、插入和取代突变体。一般优选氨基酸序列的少量变化，例如保守氨基酸置换、小的内部缺失或插入和在分子末端的添加或缺失。这些修饰可导致氨基酸序列的改变、提供沉默突变、更改限制位点或提供其它特定突变。

本发明的方法提供将核酸递送至细胞的方法，所述方法包括给予细胞含有包含插入一对AAV反向末端重复之间的核酸的载体的AAV颗粒，从而将核酸递送至细胞。给予细胞可通过任何方法实现，包括使任选包含在所需液体(例如组织培养基或缓冲盐水溶液)中的颗粒与细胞简单接触。可使颗粒保持与细胞接触任何所需的时长，通常给予颗粒并允许无限期地保留。对于这种体外方法，可通过本领域已知的和本文所例示的标准病毒转导方法将病毒给予细胞。待给予的病毒的滴度尤其可根据细胞类型而变化，但总的来说用于AAV转导的应是典型的。另外可以使用本发明实施例中用于转导特定细胞的滴度。细胞可包括人以及其它大型(非啮齿类)哺乳动物(例如灵长类动物、马、绵羊、山羊、猪和狗)中的任何所需细胞。

更具体地说，本发明提供将核酸递送至室管膜细胞的方法，所述方法包括给予室管膜细胞含有包含插入一对AAV反向末端重复之间的核酸的载体的AAV颗粒，从而将核酸递送至室管膜细胞中。

本发明还包括将核酸递送给受试者的方法，所述方法包括给予受试者的细胞包含插入一对AAV反向末端重复之间的核酸的AAV颗粒，并将细胞再输回给受试者，从而将核酸递送给受试者。在某些实施方案中，AAV ITR可以是AAV2 ITR。对于这种离体给予，根据细胞类型通过标准方法，从受试者中分离细胞，再次根据细胞类型，将细胞置于合适的培养基中。然后如上所述，使病毒颗粒与细胞接触，使病毒转染细胞。然后可再次通过针对细胞类型和组织的标准方法，使细胞回植入受试者的机体。如有需要，在移植前，可通过已知的检测方法和如本文所述，针对病毒的转染度对细胞进行研究。

本发明还提供将核酸递送至受试者的细胞的方法，所述方法包括给予受试者包含插入一对AAV反向末端重复之间的核酸的AAV颗粒，从而将核酸递送至受试者的细胞。给予可以是对取自受试者的细胞(例如上文列举的细胞的任一种)的离体直接给予，接着通过将细胞置换返回受试者，或给予可以是对受试者的细胞的体内给予。对于离体给予，可根据细胞类型通过标准方法，从受试者中分离细胞，再次根据细胞类型，将细胞置于合适的培养基中。然后如上所述，使病毒颗粒与细胞接触，使病毒转染细胞。然后可再次通过针对细胞类型和组织的标准方法，将细胞回植入受试者的机体。如有需要，在移植前，可通过已知的检测方法和如本文所述，针对病毒的转染度对细胞进行研究。

还提供将核酸递送至受试者的室管膜细胞的方法，所述方法包括给予受试者包含插入一对AAV反向末端重复之间的核酸的AAV颗粒，从而将核酸递送至受试者的室管膜细胞。

在某些实施方案中，靶向脑血管内皮的氨基酸序列靶向患有疾病(例如阿尔茨海默病)的受试者的脑血管内皮。

在某些实施方案中，靶向脑血管内皮的氨基酸序列靶向未患阿尔茨海默病的受试者的脑血管内皮。

在某些实施方案中，病毒载体包含编码治疗剂的核酸序列。在某些实施方案中，治疗剂是保护性ApoE同种型。

本公开内容的某些实施方案提供包含本文所述的病毒载体的细胞。

在某些实施方案中，细胞是非啮齿类哺乳动物的哺乳动物细胞。在某些实施方案中，细胞是灵长类动物细胞。在某些实施方案中，细胞是人细胞。在某些实施方案中，细胞是非人类细胞。在某些实施方案中，细胞是体外的。在某些实施方案中，细胞是体内的。在某些实施方案中，细胞是室管膜细胞。

本公开内容的某些实施方案提供治疗哺乳动物的疾病的方法，所述方法包括将本文所述病毒载体或细胞给予哺乳动物。

在某些实施方案中，哺乳动物是人。

本公开内容的某些实施方案提供将作用剂递送给受试者的中枢神经系统的方法，所述方法包括将本文所述病毒载体给予CSF，使得转导的室管膜细胞表达治疗剂并将作用剂递送至受试者的中枢神经系统。在某些实施方案中，病毒载体转导室管膜细胞。

本公开内容的某些实施方案提供本文所述的病毒载体或细胞用于医学治疗。

本公开内容的某些实施方案提供本文所述的病毒载体或细胞制备用于治疗哺乳动物的疾病(例如阿尔茨海默病)的药物的用途。

载体还可包含保护性ApoE同种型蛋白。本文所用术语“分泌的蛋白质”包括任何分泌的蛋白质，不论是天然分泌的，还是经修饰以含有信号序列使得它能够分泌。

核酸当放置成与另一个核酸序列有功能关系时是“有效连接”的。一般而言，“有效连接”意指连接的DNA序列是邻接的。然而，增强子不必是邻接的。连接通过在适宜的限制位点上的连接来实现。如果所述位点不存在，则按常规做法使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。另外，编码酶的核酸的多个拷贝可在表达载体中连接在一起。这类的多个核酸可被接头分隔。

本公开内容还提供含有本文所述载体的哺乳动物细胞。细胞可以是人的，并可来自脑。细胞类型可以是干细胞群或祖细胞群。

本公开内容提供通过给予本文所述的多核苷酸、多肽、表达载体或细胞来治疗哺乳动物的疾病(例如遗传疾病或癌症)的方法。遗传疾病可以是神经变性疾病，例如阿尔茨海默病。

本公开内容的某些方面涉及多核苷酸、多肽、载体和遗传工程细胞(体内修饰的细胞)及其用途。具体地讲，本公开内容涉及能够全身递送治疗有效剂量的治疗剂的基因或蛋白质疗法的方法。

一方面，提供用于在哺乳动物接受者中表达治疗剂的细胞表达系统。该表达系统(本文亦称为“遗传修饰细胞”)包含细胞和用于表达治疗剂的表达载体。表达载体包括但不限于用于将异源遗传物质递送至细胞的病毒、质粒和其它载体。因此，本文所用术语“表达载体”是指用于将异源遗传物质递送至细胞的载体。具体地讲，表达载体为重组腺病毒、腺伴随病毒或慢病毒或反转录病毒载体。

表达载体还包括用于调控异源基因转录的启动子。启动子可以是诱导型启动子(下文描述)。表达系统适于给予哺乳动物接受者。表达系统可包含大量非永生化的遗传修饰细胞，每个细胞含有编码至少一种治疗剂的至少一个重组基因。

细胞表达系统可在体内形成。又一方面，提供用于体内治疗哺乳动物接受者的方法。该方法包括例如通过静脉内给予，将表达异源基因产物的表达载体原位导入患者的细胞中。为了体内形成表达系统，将用于表达治疗剂的表达载体体内i.v.导入哺乳动物接受者中，其中载体通过血管系统迁移至脑。

又一方面，提供用于体内治疗哺乳动物接受者的方法。该方法包括将目标蛋白质体内导入患者中。

用于表达异源基因的表达载体可包括用于调控异源基因产物转录的诱导型启动子。因此，通过将细胞原位暴露于诱导异源基因转录的条件下，来控制原位治疗剂的递送。

哺乳动物接受者可患有适于基因置换疗法的病况。如本文所用，“基因置换疗法”是指给予接受者编码治疗剂的外源遗传物质，随后原位表达所给予的遗传物质。因此，短语“适于基因置换疗法的病况”包括例如遗传疾病(即可归因于一个或多个基因缺陷的疾病病况)、获得性病理(即不归因于先天缺陷的病理病况)、癌症等病况和预防方法(即疾病或非期望的医学病况的预防)。因此，本文所用术语“治疗剂”是指对哺乳动物接受者具有有益作用的任何作用剂或物质。因此，“治疗剂”包括具有核酸或蛋白质组分的治疗性和预防性分子两种。

按照一个实施方案，哺乳动物接受者患有遗传疾病，且外源遗传物质包含编码用于治疗该疾病的治疗剂的异源基因。在又一个实施方案中，哺乳动物接受者患有获得性病理，且外源遗传物质包含编码用于治疗该病理的治疗剂的异源基因。按照另一个实施方案，患者患有癌症，且外源遗传物质包含编码抗肿瘤剂的异源基因。在又一个实施方案中，患者患有非期望的医学病况，且外源遗传物质包含编码用于治疗该病况的治疗剂的异源基因。

本文所用术语“保护性ApoE同种型”包括该多肽的变体或有生物活性或无生物活性的片段。该多肽之一的“变体”是与天然蛋白质不完全相同的多肽。可通过经由一个或多个氨基酸的插入、缺失或取代改变氨基酸序列来获得这类变体蛋白质。蛋白质的氨基酸序列例如通过取代而被修饰，产生与天然多肽相比，具有基本相同的性质或性质得到改进的多肽。取代可以是保守取代。“保守取代”是氨基酸被具有相似侧链的另一个氨基酸取代。保守取代可以是被在氨基酸的电荷或氨基酸侧链的大小(或者侧链内的化学基团的大小、电荷或种类)方面的变化尽可能小的氨基酸的取代，使得总体上肽保持其空间构象但生物活性被改变。例如，常见的保守变化可为Asp至Glu、Asn或Gln；His至Lys、Arg或Phe；Asn至Gln、Asp或Glu和Ser至Cys、Thr或Gly。丙氨酸常用来取代其它氨基酸。20种必需氨基酸可如下分组：具有非极性侧链的丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；具有不带电荷的极性侧链的甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；具有酸性侧链的天冬氨酸和谷氨酸；和具有碱性侧链的赖氨酸、精氨酸和组氨酸。

通过改变相应的核酸序列的密码子来实现氨基酸改变。已知可根据用某些氨基酸取代多肽结构的其它氨基酸，来获得这类多肽，以改变或改进生物活性。例如，通过备选氨基酸的取代，可赋予多肽导致活性提高的小的构象改变。或者，某些多肽中的氨基酸取代可用来提供残基，所述残基然后可与其它分子连接以提供肽-分子缀合物，所述缀合物保持充分的起始多肽的性质以用于其它目的。

在赋予多肽相互作用性生物功能时，可使用氨基酸的亲水指数(hydropathic index)，其中发现，可用某些氨基酸取代具有类似亲水指数的其它氨基酸，并仍保持类似的生物活性。或者，可根据亲水性进行相似氨基酸的取代，特别是当待产生的多肽中所需的生物功能欲用于免疫实施方案时。受其邻近氨基酸的亲水性支配的“蛋白质”的最大局部平均亲水性，与其免疫原性关联。因此，注意到，可根据各个氨基酸所分配的亲水性进行取代。

在使用亲水性指数或亲水指数(其将值分配给各个氨基酸)时，优选进行其中这些值为±2的氨基酸的取代，其中±1是特别优选的，为±0.5的那些是最优选的取代。

变体蛋白质与相应的天然蛋白质的氨基酸序列具有至少50%、至少约80%或甚至至少约90%但小于100%的邻接氨基酸序列同源性或同一性。

变体多肽的氨基酸序列基本上相当于天然多肽的氨基酸序列。本文所用的“基本上相当于”是指可诱导与由天然蛋白质所产生的反应基本上相同的生物反应的多肽序列。所述反应可以是由天然蛋白质所产生的水平的至少60%，甚至可以是由天然蛋白质所产生的水平的至少80%。

变体可包括不存在于相应天然蛋白质中的氨基酸残基或相对于相应天然蛋白质的缺失。与相应的天然蛋白质相比，变体还可以是截短“片段”即仅是全长蛋白质的一部分。蛋白质变体还包括具有至少一个D-氨基酸的肽。

变体蛋白质可由编码变体蛋白质的分离的DNA序列表达。“重组体”定义为通过遗传工程方法产生的肽或核酸。应注意，本领域众所周知的是，由于遗传密码的丰余性所致，各个核苷酸可在密码子中容易地交换，并仍导致相同的氨基酸序列。术语“蛋白质”、“肽”和“多肽”在本文可互换使用。

本公开内容提供通过将表达载体给予细胞或患者治疗哺乳动物的疾病的方法。对于基因治疗方法，具有分子生物学和基因疗法领域普通技术的人员无需过多实验，便能够测定给予用于本公开内容的新的方法的表达载体的合适剂量和途径。

按照一个实施方案，细胞是在体内转化的或以别的方式遗传修饰的。哺乳动物接受者的细胞用含有用于表达编码治疗剂的异源(例如重组)基因的外源遗传物质的载体体内转化(即转导或转染)，并且治疗剂原位递送。

如本文所用，“外源遗传物质”是指天然或合成(即不是天然存在于细胞中)的核酸或寡核苷酸；或如果其天然存在于细胞中，则不被细胞以生物学上显著的水平转录或表达。因此，“外源遗传物质”包括例如可转录成反义RNA的非天然存在的核酸以及“异源基因” (即编码在天然存在的相同类型的细胞中不表达或以生物学上不显著的水平表达的蛋白质的基因)。

在某些实施方案中，哺乳动物接受者患有适于基因置换疗法的病况。如本文所用，“基因置换疗法”是指给予接受者编码治疗剂的外源遗传物质，随后原位表达所给予的遗传物质。因此，短语“适于基因置换疗法的病况”包括例如遗传疾病(即可归因于一个或多个基因缺陷的疾病病况)、获得性病理(即不归因于先天缺陷的病理病况)、癌症等病况和预防方法(即疾病或非期望的医学病况的预防)。因此，本文所用术语“治疗剂”是指对哺乳动物接受者具有有益作用的任何作用剂或物质。因此，“治疗剂”包括具有核酸(例如反义RNA)和/或蛋白质组分的治疗性和预防性分子两者。

或者，适于基因置换疗法的病况是预防方法，即用于预防疾病或非期望的医学病况的方法。因此，本公开内容包括用于将具有预防功能(即预防药)的治疗剂递送给哺乳动物接受者的细胞表达系统。

总的来说，术语“治疗剂”包括但不限于与上文所列病况有关的作用剂，及其功能等同物。本文所用术语“功能等同物”是指对哺乳动物接受者具有与籍之视为功能等同物的治疗剂相同或改进的有益作用的分子(例如肽或蛋白质)。

上文公开的治疗剂和适于基因置换疗法的病况只是说明性的，并无意限制本公开内容的范围。用于治疗已知病况的合适治疗剂的选择被认为在本领域普通技术人员的的无需过多实验的范围内。

AAV 载体

在一个实施方案中，本公开内容的病毒载体是AAV载体。“AAV”载体是指腺伴随病毒，并可用来指天然存在的野生型病毒本身或其衍生物。该术语涵盖所有的亚型、血清型和假型及天然存在的和重组形式两者，除另有要求外。本文所用术语“血清型”是指根据与规定抗血清的衣壳蛋白反应性鉴定以及与其它AAV区别开来的AAV，例如，有8种已知的灵长类动物AAV血清型，AAV-1至AAV-8。例如，血清型AAV2用来指含有由AAV2的cap基因编码的衣壳蛋白和含有来自相同AAV2血清型的5'和3' ITR序列的基因组的AAV。如本文所用，例如，rAAV可用来指具有来自相同血清型的衣壳蛋白和5'-3' ITR两者的AAV，或它可指具有来自一种血清型的衣壳蛋白和来自不同AAV血清型的5'-3' ITR的AAV (例如来自AAV血清型2的衣壳和AAV血清型5的ITR)。对于本文列举的各个实例，载体设计和生产的描述叙述了衣壳和5'-3' ITR序列的血清型。缩略语“rAAV”是指重组腺伴随病毒，亦称为重组AAV载体(或“rAAV载体”)。

“AAV病毒”或“AAV病毒颗粒”是指由至少一种AAV衣壳蛋白(优选野生型AAV的所有衣壳蛋白)和衣壳化多核苷酸组成的病毒颗粒。如果所述颗粒包含异源多核苷酸(即野生型AAV基因组以外的多核苷酸，例如待递送至哺乳动物细胞中的转基因)，则通常称为“rAAV”。

在一个实施方案中，AAV表达载体采用已知技术构建，以至少提供作为以转录方向有效连接的组分的调控元件(包括转录起始区)、目标DNA和转录终止区。选择在哺乳动物细胞中有功能的调控元件。含有有效连接的组分的所得构建体被功能性AAV ITR序列侧接(5'和3')。

所谓“腺伴随病毒反向末端重复”或“AAV ITR”意指存在于AAV基因组各端的公认区域，其作为DNA复制的起点并作为病毒的包装信号以顺式一起起作用。AAV ITR，连同AAV rep编码区，提供自插在2个侧接ITR之间的核苷酸序列自哺乳动物细胞基因组的有效切割和拯救以及整合到哺乳动物细胞基因组。

AAV ITR区的核苷酸序列是已知的。如本文所用，“AAV ITR”不需要具有所述的野生型核苷酸序列，但可通过例如核苷酸的插入、缺失或取代来改变。另外，AAV ITR可来源于几种AAV血清型的任一种，包括而不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV7等。此外，在AAV载体中侧接所选定的核苷酸序列的5'和3' ITR不必是相同的或源于相同的AAV血清型或分离株，只要它们按预定起作用，即允许目标序列自宿主细胞基因组或载体上切割和拯救以及当AAV Rep基因产物存在于细胞中时允许异源序列整合于接受细胞基因组中。

在一个实施方案中，AAV ITR可来源于数种AAV血清型的任一种，包括而不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV7等。此外，AAV表达载体中侧接所选定的核苷酸序列的5'和3' ITR不必是相同的或源于相同的AAV血清型或分离株，只要它们按预定起作用，即允许目标序列自宿主细胞基因组或载体切割和拯救，以及当AAV Rep基因产物存在于细胞中时允许DNA分子整合至接受细胞基因组中。

在一个实施方案中，AAV衣壳可来源于AAV2。用于AAV载体的合适DNA分子可在大小上小于约5千碱基(kb)、小于约4.5 kb、小于约4kb、小于约3.5 kb、小于约3 kb、小于约2.5 kb，并且是本领域已知的。

在一个实施方案中，所选的核苷酸序列与体内指导其在受试者中转录或表达的调控元件有效连接。所述调控元件可包含通常与所选的基因关联的调控序列。或者，可使用异源调控序列。有用的异源调控序列一般包括来源于编码哺乳动物或病毒基因的序列的那些。实例包括但不限于SV40早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒LTR启动子、腺病毒主要晚期启动子(Ad MLP)、单纯疱疹病毒(HSV)启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子例如CMV立即早期启动子区(CMVIE)、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子、pol II启动子、pol III启动子、合成启动子、杂合启动子等。另外，源于非病毒基因(例如鼠金属硫蛋白基因)的序列也可应用于本文。这类启动子序列可市售获自例如Stratagene (San Diego，Calif.)。

在一个实施方案中，异源启动子和其它调控元件两者，例如CNS特异性和诱导型启动子、增强子等，可具有特殊用途。异源启动子的实例包括CMV启动子。CNS-特异性启动子的实例包括自来自髓鞘碱性蛋白(MBP)、胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)和神经元特异性烯醇化酶(NSE)的基因分离的启动子。诱导型启动子的实例包括脱皮素、四环素、缺氧和aufin的DNA反应性元件。

在一个实施方案中，带有被AAV ITR结合的目标DNA分子的AAV表达载体，可通过将所选择的序列直接插入具有从中切离的主要AAV可读框(“ORF”)的AAV基因组来构建。AAV基因组的其它部分也可缺失，只要保持ITR的足够部分以允许复制和包装功能。这类构建体可采用本领域众所周知的技术设计。

或者，可采用标准连接技术，自病毒基因组或自含有所述病毒基因组的AAV载体切离AAV ITR，并将其融合在存在于另一载体中的选定核酸构建体的5'和3'。例如，可在20 mM Tris-Cl pH 7.5、10 mM MgCl₂、10 mM DTT、33 µg/ml BSA、10 mM-50 mM NaCl和40 uM ATP、0.01-0.02 (Weiss)单位T4 DNA连接酶中在0℃下(用于“黏性末端”连接)或在1 mM ATP、0.3-0.6 (Weiss)单位T4 DNA连接酶在14℃下(用于“平端”连接)，完成连接。分子间“黏性末端”连接通常在30-100 µg/ml总DNA浓度(5-100 nM总最终浓度)下进行。AAV载体含有ITR。

另外，嵌合基因可合成产生以包括安排在一个或多个选定核酸序列的5'和3'的AAV ITR序列。可使用针对在哺乳动物CNS细胞中表达嵌合基因序列的优选密码子。完全嵌合序列由通过标准方法制备的重叠寡核苷酸装配。

为了产生rAAV病毒粒子，采用已知技术，例如通过转染，将AAV表达载体导入合适的宿主细胞中。多种转染技术一般是本领域已知的。参见例如Sambrook等(1989) Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York。特别合适的转染方法包括磷酸钙共沉淀、直接显微注射入培养的细胞中、电穿孔、脂质体介导的基因转移、脂质介导的转导和使用高速度微弹的核酸递送。

在一个实施方案中，用于产生rAAV病毒粒子的合适的宿主细胞包括可用作或已用作异源DNA分子接受者的微生物、酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。该术语包括已被转染的原始细胞的子代。因此，本文所用的“宿主细胞”一般是指已用外源DNA序列转染的细胞。来自稳定的人细胞系293的细胞(可容易地获自例如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)，使用登记号ATCC CRL1573)可用于实施本公开内容。特别地，人细胞系293是已用腺病毒5型DNA片段转化的人胚肾细胞系，并表达腺病毒E1a和E1b基因。293细胞系容易转染，并提供产生rAAV病毒粒子的特别适宜的平台。

所谓“AAV rep编码区”意指本领域公认的编码复制蛋白Rep 78、Rep 68、Rep 52和Rep 40的AAV基因组的区域。已表明这些Rep表达产物具有许多功能，包括AAV DNA复制起点的识别、结合和切割；DNA解旋酶活性和自AAV (或其它异源)启动子转录的调节。Rep表达产物总体上是复制AAV基因组所必需的。AAV rep编码区的合适同源物包括人疱疹病毒6 (HHV-6) rep基因，也已知其介导AAV2 DNA复制。

所谓“AAV cap编码区”意指本领域公认的编码衣壳蛋白VP1、VP2和VP3或其功能性同源物的AAV基因组的区域。这些Cap表达产物提供总体上是病毒基因组包装所必需的包装功能。

在一个实施方案中，通过在AAV表达载体转染之前或与之同时用AAV辅助构建体转染宿主细胞，将AAV辅助功能导入宿主细胞中。AAV辅助构建体因此用来提供至少瞬时表达的AAV rep和/或cap基因以补充失去的产生性AAV感染所必需的AAV功能。AAV辅助构建体缺乏AAV ITR，其本身既不能复制，也不能包装。这些构建体可呈质粒、噬菌体、转座子、黏粒、病毒或病毒粒子的形式。已描述了多个AAV辅助构建体，例如编码Rep和Cap表达产物两者的常用质粒pAAV/Ad和pIM29+45。已描述了编码Rep和/或Cap表达产物的多个其它载体。

递送病毒载体的方法包括将AAV注射到CSF中。一般可采用体内或体外转导技术，将rAAV病毒粒子导入CNS的细胞中。如果体外转导，则所需的接受细胞可从受试者中取出，用rAAV病毒粒子转导，并再导入受试者中。或者，可使用同基因或异基因的细胞，其中这些细胞在受试者中不会产生不当的免疫应答。

已描述了用于递送和导入转导的细胞至受试者中的合适方法。例如，可通过使重组AAV病毒粒子与CNS细胞在例如合适的培养基中混合，体外来转导细胞，并且可采用常规技术例如DNA印迹法和/或PCR，或者通过使用选择标记，筛选出携带目标DNA的那些细胞。然后可将转导细胞配制成下文更全面描述的药物组合物，并通过各种技术，例如移植、肌内、静脉内、皮下和腹膜内注射，将组合物引入受试者中。

在一个实施方案中，药物组合物可包含足够的遗传物质以产生治疗有效量的目标核酸，即量足以减轻或改善所述疾病状态的症状或量足以提供所需益处。药物组合物还可含有药学上可接受的赋形剂。所述赋形剂包括本身不会引起产生对接受组合物的个体有害的抗体，并且可被给予而无过度毒性的任何药用物质。药学上可接受的赋形剂包括但不限于山梨糖醇、Tween80和例如水、盐水、甘油和乙醇等液体。其中可包括药学上可接受的盐，例如无机酸盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等；和有机酸的盐，例如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等。另外，辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等可存在于所述溶媒中。药学上可接受的赋形剂的全面论述可获自Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., N.J. 1991))。

鉴于本说明书的教导对本领域技术人员显而易见的是，可凭经验确定必须添加的病毒载体的有效量。在整个疗程中可以一剂连续或间歇地实现给药。测定最有效的给药的方式和剂量的方法是本领域技术人员熟知的，并随病毒载体、治疗组合物、靶细胞和正被治疗的受试者而改变。可根据治疗医生选择的剂量水平和方式进行单次和多次给药。

应了解，通过递送的病毒载体可表达多于一种的转基因。或者，还可如本文所述，将各自表达一种或多种不同转基因的各个载体递送至CNS中。此外，还预期通过本公开内容的方法递送的病毒载体可与其它合适的组合物和疗法组合。

将遗传物质导入细胞中的方法

通过遗传转移方法(例如转染或转导)，离体或体内将外源遗传物质(例如编码一种或多种治疗性蛋白质的cDNA)导入细胞中以提供遗传修饰的细胞。各种表达载体(即促进外源遗传物质递送至靶细胞中的载体)是本领域普通技术人员已知的。

如本文所用，“细胞的转染”是指通过掺入添加的DNA由细胞获取新的遗传物质。因此，转染是指采用物理或化学方法将核酸插入细胞中。几种转染技术是本领域普通技术人员已知的，包括磷酸钙DNA共沉淀、DEAE-葡聚糖、电穿孔、阳离子脂质体介导的转染和钨颗粒促进的微粒轰击。磷酸锶DNA共沉淀是另一种可行的转染方法。

相比之下，“细胞的转导”是指使用DNA或RNA病毒将核酸转移到细胞中的方法。用于将核酸转移到细胞中的RNA病毒(即反转录病毒)在本文称为转导嵌合反转录病毒。将反转录病毒中所包含的外源遗传物质掺入转导细胞的基因组。已用嵌合DNA病毒(例如携带编码治疗剂的cDNA的腺病毒)转导的细胞不具有掺入其基因组中的外源遗传物质，但能够表达在细胞内染色体外保留的外源遗传物质。

通常，外源遗传物质包括异源基因(通常呈包含编码治疗性蛋白质的外显子的cDNA的形式)连同控制新基因转录的启动子。启动子特征性地具有启动转录所必需的特殊核苷酸序列。任选外源遗传物质还包括获得所需基因转录活性所必需的其它序列(即增强子)。出于该论述的目的，“增强子”仅仅是任何非翻译的DNA序列，其与编码序列(按顺式)邻接用于改变由启动子支配的基础转录水平。可将外源遗传物质在启动子的直接下游导入细胞基因组中，使得启动子和编码序列有效连接，以允许编码序列的转录。反转录病毒表达载体可包括控制插入外源基因的转录的外源启动子元件。所述外源启动子包括组成型和诱导型启动子两种。

天然存在的组成型启动子控制必需细胞功能的表达。因此，在组成型启动子控制下的基因在所有细胞生长的条件下表达。示例性的组成型启动子包括编码某些组成型或“持家”功能的下列基因的启动子：次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、腺苷脱氨酶、磷酸甘油激酶(PGK)、丙酮酸激酶、磷酸甘油变位酶、肌动蛋白启动子和本领域技术人员已知的其它组成型启动子。另外，许多病毒启动子在真核细胞中组成型地起作用。这些包括SV40的早期和晚期启动子、莫洛尼白血病毒和其它反转录病毒的长末端重复序列(LTR)及单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子等。因此，上述组成型启动子的任一种可用来控制异源基因插入物的转录。

在诱导型启动子控制下的基因仅在诱导剂存在下表达或在诱导剂存在下较大程度地表达(例如在金属硫蛋白启动子控制下的转录在某些金属离子存在下大大增加)。诱导型启动子包括当结合其诱导因子时刺激转录的应答元件(RE)。例如，存在血清因子、类固醇激素、视黄酸和环状AMP的RE。可选择含有特定RE的启动子，以获得诱导型反应，且在某些情况下，RE本身可与不同的启动子连接，从而赋予重组基因可诱导性。因此，通过选择合适的启动子(组成型与诱导型；强与弱)，可控制遗传修饰的细胞中治疗剂表达的存在和水平两者。如果编码基因治疗剂的基因在诱导型启动子的控制下，则通过将遗传修饰的细胞原位暴露于允许治疗剂转录的条件下，例如通过腹膜内注射控制所述治疗剂转录的诱导型启动子的特定诱导剂，引发治疗剂的原位递送。例如，使遗传修饰的细胞与含有合适的(即诱导性)金属离子的溶液原位接触，提高由在金属硫蛋白启动子控制下的基因编码的治疗剂的遗传修饰细胞的原位表达。

因此，通过调控诸如以下因素调节原位递送的治疗剂的量：(1)用于直接转录插入基因的启动子的性质(即启动子是组成型还是诱导型，是强还是弱)；(2)插入细胞的外源基因的拷贝数；(3)给予(例如植入)患者的转导/转染细胞的数目；(4)植入物(例如移植物或包封的表达系统)的大小；(5)植入物的数目；(6)转导/转染细胞或植入物留在适当位置的持续时间；和(7)遗传修饰细胞对治疗剂的生产速率。考虑上文公开的因素和患者的临床概况，用于递送治疗有效剂量的特定治疗剂的这些因素的选择和优化被视为在本领域普通技术人员的范围内而无需过多实验。

除了至少一个启动子和编码治疗剂的至少一个异源核酸以外，表达载体可包括选择基因(例如新霉素抗性基因)以利于已用表达载体转染或转导的细胞的选择。或者，细胞用两个或更多个表达载体转染，至少一个载体含有编码治疗剂的基因，其它载体含有选择基因。合适的启动子、增强子、选择基因和/或信号序列(下文描述)的选择被视为在本领域普通技术人员的范围内而无需过多实验。

治疗剂可被靶向用于递送至胞外、胞内或膜位置。如果需要基因产物从细胞中分泌，则设计表达载体以包括合适的分泌“信号”序列用于将治疗性基因产物从细胞中分泌到胞外环境中。如果需要基因产物保留在细胞内，则省略该分泌信号序列。以相似方式，可构建表达载体以包括“保留”信号序列用于将治疗剂锚定在细胞质膜内。例如，所有膜蛋白具有疏水跨膜区，它终止膜中的蛋白质移位，并且不允许蛋白质分泌。包括信号序列用于将基因产物靶向特定位置的表达载体的构建被视为在本领域普通技术人员的范围内而不需要过度实验。

实施例 1

淀粉状蛋白沉积进展中的变化

该实施例研究了通过脑室内注射腺伴随病毒血清型4 (AAV4)，在不同ApoE同种型过量表达后，app/ps小鼠中淀粉状蛋白沉积进展中的变化。

ApoE的ε4等位基因(ApoE ε4)是阿尔茨海默病(AD)的首要遗传风险因子，而ApoE的稀有ε2等位基因(ApoE ε2)的遗传降低这种风险达大约一半。然而，尽管将近17年前这些强的遗传线索的发现，但ApoE籍此赋予风险的机制仍不确定。

为了解释不同ApoE同种型(ApoE ε2、ε3和ε4)如何影响原纤维状淀粉状蛋白斑的形成和稳定性，将编码各ApoE同种型的AAV4载体注入7月龄APP/PS小鼠的脑室。采用体内多光子成像，在基线和在暴露于ApoE后在两个月间隔内跟踪淀粉状蛋白沉积群，因此使得在活的动物中动态观察淀粉样变进展。

观察到淀粉状蛋白斑沉积的动力学据各个同种型是可变的，使得2个月后，与ApoE ε3相比，ApoE ε4注射小鼠的老年斑增加38%，而用ApoE ε2处理的小鼠淀粉状蛋白沉积的数目呈现15%降低。死后分析证实了这些结果，并显示装饰皮质中的斑块的人ApoE蛋白的存在，反映了蛋白质在整个实质中大量扩散及其局灶性蓄积在Aβ肽所沉积的地方。重要的是注意，ApoE ε4蛋白的含量增加还与淀粉状蛋白沉积周围更严重的突触丢失有关。

总的来说，本发明的数据表明，不同ApoE同种型的过量生产能够影响疾病的进展，并可调节突触丢失的程度，是与AD患者的认知缺损最大程度关联的参数之一

1. 脑室内注射 AAV4-ApoE 导致在脑中 huApoE 的稳定表达和重组人 ApoE (huApoE) 蛋白的持续检测。

简单地说，在注射AAV4载体的APP/PS小鼠中免疫检测出GFP和huApoE。在完整脑室区(上图)和在内衬脑室的细胞中可观察到GFP信号，以及人APOE。

为了评价本发明的方法，将AAV4-Venus (对照)、-ApoE2、-ApoE3和-ApoE4注入野生型小鼠的脑室。在注射后2个月，在淀粉状蛋白沉积周围的皮层实质中可检测到人ApoE蛋白(注意3H1抗体；在AAV4-GFP注射小鼠中只观察到非特异性背景)。因此，通过ELISA，在脑中检测到人ApoE的显著水平，并且Venus和ApoE的免疫组织学染色证实内衬脑室的细胞的不同转基因的表达。

进行了qRT-PCR实验，以评价转基因的mRNA水平。标准曲线允许我们根据内源性GAPDH的水平测定huApoE mRNA的浓度。包括了来自暴露持续2或5个月的小鼠的样品。对脑匀浆物进行了经设计以特异性检测人APOE的ELISA测定法(图 1A)。如通过对人APOE有特异性的ELISA所定量测定(图 1B)且通过蛋白质印迹所证实的，与AAV4-GFP处理的动物相比，在AAV4-APOE注射小鼠中可检测到低水平的重组蛋白。

2. ApoE 各同种型的过量表达差异性地影响淀粉样变的进程。

使用体内双光子成像在活的动物中跟踪随时间推移的淀粉状蛋白沉积。简单地说，给APP/PS小鼠(7月龄)立体定位地注射编码ApoE2、ApoE3、ApoE4和Venus的AAV4载体。1周后，植入颅窗，对开颅术后随时间推移的淀粉状蛋白沉积成像。2个月后，处死动物，进行死后分析。

制备了注射AAV4-ApoE2、AAV4-ApoE3或AAV4-ApoE4的APP/PS小鼠的双光子图像。在腹膜内注射Methoxy-XO4 (5mg/kg)后可检测到淀粉状蛋白斑，将德克萨斯红葡聚糖(70,000 Da分子量；12.5 mg/ml，在无菌PBS中)注射入外侧尾静脉以提供荧光血管造影片。在注射后1周(=T0)、1个月和2个月拍摄图像。随时间拍摄相同视野以跟踪病变的进展。出现少量新的淀粉状蛋白沉积，而其少数几个在2个月时间内不能再检测到。

体内图像的全面分析显示，与AAV4-ApoE3和AAV4-Venus处理的动物两者相比，在AAV4-ApoE4注射的APP/PS小鼠中淀粉状蛋白沉积的数目显著更快地增加。相比之下，当使用AAV4-ApoE2时，测量到斑块密度小但显著的降低(图 2)。在注射AAV4-ApoE4的APP/PS小鼠中，观察到趋于较大斑块的趋势(p<0.06)，但总体上斑块的大小保持不变。体内成像的汇总数据显示，各APOE同种型的过量表达体内差异性地影响淀粉状蛋白沉积的进展。注射AAV4-ApoE2导致淀粉状蛋白密度随时间轻微降低，而注射AAV4-ApoE4使淀粉样变加剧。

3. 淀粉状蛋白斑的大小根据各 ApoE 同种型而改变。

体内双光子成像允许跟踪在2个月时间内各淀粉状蛋白沉积大小的变化。斑块的大小可随时间保持稳定、增大或减小。介于T1/T0和T2/T1之间的大小比率的分布显示与其它组相比，在注射AAV4-ApoE4的小鼠中有趋于较大淀粉状蛋白斑的变化(图 3)。

4. 淀粉状蛋白负荷的死后评价证实 ApoE2和ApoE4 对淀粉状蛋白沉积的作用。

在AAV4注射后2个月，死后体视学评价显示，AAV4-ApoE4注射动物在皮质中具有较高密度的淀粉状蛋白斑，而在其它组间未能检出差异(图 4A)。当斑块用ThioS或Bam10标记时，观察到这种淀粉状蛋白沉积数目的增加。然而，未检出Bam10和ThioS之间比率的变化。与2个月的相比，在注射后5个月，各ApoE同种型的作用更明显(图 4B)。当给小鼠注射AAV4-ApoE4时，观察到沉积密度显著增加，而用ApoE2检测到相反的作用。再次，未检出Bam10和ThioS间比率的变化。

5. 各 ApoE 同种型差异性地影响淀粉状蛋白沉积周围的突触密度。

采用阵列断层扫描术来精确地测定淀粉状蛋白沉积周围突触前和突触后成分的密度。这种新的成像方法提供组织分子构造的高分辨率成像的能力。阵列断层扫描术基于样本的超薄切片(70nm)、免疫染色和3D重建。针对淀粉状蛋白斑和突触后标志物PSD95染色阵列断层扫描术样品的代表性图像。阵列断层扫描术图像显示，在淀粉状蛋白沉积周围观察到突触后标志物PSD95的数目减少，但远离斑块处这种作用消失。在注射AAV4的小鼠的各组中定量测定在斑块附近或远离斑块的突触前(突触蛋白-1)和突触后标志物(图 5A-D)。突触前和突触后成分的广泛量化证实，突触蛋白1和PSD95密度的增加与淀粉状蛋白斑有关，当ApoE4在APP/PS1小鼠脑中过量表达时，这种作用被急剧放大(图 5C，图 5D)。与其它组相比，在淀粉状蛋白沉积附近，ApoE4的过量表达与脊丢失(spine loss)增加有关。与此相反，突触蛋白点(synapsin puncta)的密度在ApoE2处理的动物中在斑块周围较高。

结论

脑室内注射AAV病毒血清型4导致整个脑实质可溶性重组蛋白持续和长期的过量生产。ApoE2、ApoE3和ApoE4的过量表达差异性地影响APP/PS小鼠中病理的进程，使得与ApoE3相比，当注射ApoE4时淀粉状蛋白负荷的进展显著加快。相反地，ApoE2与保护作用有关，少量的淀粉状蛋白沉积在注射后2个月再无法检测出。死后免疫组织学分析证实ApoE4的不良作用。与ApoE3相比，ApoE4的持续过量生产加剧淀粉状蛋白沉积周围所观察到的突触丢失，而ApoE2具有轻微作用。本研究表明体内ApoE同种型、淀粉样变进展和突触丢失之间的直接联系。

实施例 2

大型哺乳动物中通过脑脊液 (CSF) 治疗中枢神经系统病症

为了实现针对脑病症(例如阿尔茨海默病)的基因疗法，需要测定是否可在哺乳动物中达到治疗性酶的长期稳态水平。发现室管膜细胞(位于脑室的细胞)可被转导，并分泌所靶向的酶进入脑脊液(CSF)中。测定了在小鼠模型中，腺伴随病毒(AAV4)可以高效率转导室管膜。(Davidson等，PNAS，28:3428-3432，2000)。在小鼠中，在AAV4治疗后，疾病脑中存在归一化的贮存的底物水平。

研究了载体的全面递送是否可有效地进行，以实现酶在CSF中的稳态水平。首先，需要发现可转导较大哺乳动物脑中的室管膜细胞(内衬脑室的细胞)的载体。在LINCL的狗模型和LINCL的非人灵长类动物模型中进行了研究。LINCL狗出生时正常，但在7个月左右出现神经病学征兆，在5-6个月左右出现可测试的认知缺陷，在10-11个月出现癫痫发作和进行性视力丧失。

腺伴随病毒(AAV)由于其小的尺寸(20 nm)被选为载体，可去除(“挖去”)其遗传物质的大部分，使得不存在病毒基因，并使之无能力复制。之前测试过腺伴随病毒4型(AAV4)载体是否可在由β-葡糖醛酸糖苷酶缺乏症引起的黏多糖贮积症VII型(MPS VII)鼠模型中介导全面的功能和病理改进(Liu等，J. Neuroscience, 25(41):9321-9327, 2005)。将编码β-葡糖醛酸糖苷酶的重组AAV4载体单侧注射进患有已证实疾病的MPS VII小鼠的侧脑室。转导的室管膜表达高水平的重组酶，其分泌的酶穿透大脑和小脑结构以及脑干。免疫组织化学研究显示重组酶和脑微脉管系统的密切关系，表明β-葡糖醛酸糖苷酶通过内衬血管的血管周围间隙达到脑实质。通过场景恐惧条件反射(context fear conditioning)测试了厌恶性联想学习。与年龄相配的杂合对照相比，受累小鼠显示条件性恐惧反应和场景辨别受损。这种行为缺陷在AAV4 β-葡糖醛酸糖苷酶治疗MPS VII小鼠中在基因转移后6周逆转。数据表明室管膜细胞可用作酶分泌进入周围脑实质和CSF的来源。

然而，出人意料的是，当这些研究延伸到大型哺乳动物(即狗和非人灵长类动物)时，AAV4载体在这些动物中在靶向室管膜时是无效的。取而代之的是，需要使用AAV2载体。简单地说，产生编码TPP1的rAAV2 (AAV2-CLN2)，脑室内注射以转导室管膜(Liu等, J. Neuroscience, 25(41):9321-9327, 2005)。TPP1是LINCL中的酶缺陷型。数据表明，NHP脑中的室管膜转导引起CSF中酶的显著增加。结果表明不同脑区中TPP1活性的水平升高，其中垂直轴表示活性的%对照(图 7)。

在治疗的第一只狗中，载体的递送是亚最佳的，但在脑中仍显示CLN2活性。随后，用立体定位手术对狗进行了ICV递送。发现相对于未治疗的狗，经治疗的狗的认知能力显著改善，如通过T型迷津行为测量的(图 8)。此外，在LINCL狗模型中AAV2-CLN2的ICV递送的作用非常明显。在未治疗的(-/-)动物中，存在大的脑室，而未治疗对照和受治疗动物的脑中不显示脑室。在将AAV.TPP1递送至LINCL狗的脑室后，在不同脑区(包括小脑和上段脊髓)注意到可检测的酶活性。在两只其它活的受累狗中，脑萎缩显著减轻，寿命延长，认知功能改善。最后，在NHP中，我们表明该方法可实现野生型的2-5倍高的TPP1活性水平。

产生了几种AAV载体，并测试以确定ITR和衣壳的最佳组合。产生了5种不同组合，经测定，AAV2 ITR是最有效的：AAV2/1 (即AAV2 ITR和AAV1衣壳)、AAV2/2、AAV2/4、AAV2/5和AAV2/8。发现AAV2/2 在大型哺乳动物(狗和NHP)中运行好得多，接着是AAV2/8、AAV2/5、AAV2/1和AAV2/4。这是相当出乎意料的，因为病毒载体功效的顺序与在小鼠中观察的相反。

因此，本研究显示，脑室内衬细胞可能是用于分布在整个脑中的CSF中的重组酶的来源，且AAV2/2是在狗和非人灵长类动物给予治疗剂(例如编码CLN2 (TPP1)的基因)的有效载体。

实施例 3

通过基因转移递送的人 APOE 同种型通过影响淀粉状蛋白沉积、清除和神经毒性差异性地调节阿尔茨海默病

阿尔茨海默病(AD)是最常见的年龄相关性神经变性病症，已成为主要的公共健康顾虑。在与AD的晚期发作性偶发性形式有关的易感性基因中，载脂蛋白E ε4 (APOE – 基因；ApoE - 蛋白质)等位基因迄今是最重要的遗传风险因子。与最普通的APOE ε3等位基因相比，1个APOE ε4拷贝的存在相当大地增加发生疾病的风险达3倍，而2拷贝导致12倍增加。令人感兴趣的是，APOE ε2具有相反的影响，并且是保护因子，使得这种特定等位基因的遗传降低AD的年龄调节的风险为与APOE3/3相比的大约一半。痴呆的平均发病年龄还与这些风险概况一致，其中APOE4/4携带者在其六十来岁中期发作，APOE2/3携带者在其九十来岁早期发作，变化几乎三十年，而APOE3/3个体的发病年龄介于期间，在七十来岁中期。

ApoE影响AD的机制是有争议的。含Aβ的老年斑在患者的海马和皮质中的蓄积被认为在AD中起重要作用，因为负责该病的稀有常染色体显性形式的所有已知基因都参与Aβ肽的产生。引人关注的是，显示了APOE基因型极强地影响AD患者中淀粉状蛋白沉积的程度以及尸检样品中检检到的神经毒性可溶性寡聚Aβ的量。已表明ApoE同种型差异性地影响脑血管的完整性，并影响Aβ肽通过血脑屏障的流出，因此调节血管周围淀粉状蛋白聚集体的集结(脑淀粉状蛋白血管病或CAA)。另外，ApoE还直接涉及神经变性和神经元可塑性。在这些情况中ApoE2的作用的研究不足。

表达人APOE2、-E3和-E4的基因工程改造的动物具有与人类似的淀粉状蛋白负荷的等级顺序，与不同ApoE同种型影响斑块启动和/或生长的假设一致。然而，需要其它研究以仔细分析ApoE介导的对已有淀粉状蛋白沉积和对现存神经变性的作用的机制。为了克服这种在知识上的缺口，我们采用了基因转移方法，其中将表达各种APOE等位基因(或GFP对照)的腺伴随病毒载体注射到侧脑室中以主要转导室管膜，其然后作为生物工厂起作用，以在脑脊液和间质液内递送ApoE。我们然后采用活体内多光子显微术追踪不同的ApoE同种型对斑块形成、生长和在ApoE2的情况下对溶解的作用，以及采用体内微透析方法监测ISF中的ApoE和Aβ生化变量，并采用阵列断层扫描术评价Aβ相关神经毒性的变化。我们发现，ApoE同种型影响ISF中可溶性寡聚Aβ的水平、Aβ原纤化和沉积的步伐、曾经形成的淀粉状蛋白沉积的稳定性、其清除和斑块周围神经毒性作用的程度。实际上，用ApoE4治疗的AD小鼠显示可溶性Aβ的量提高、原纤维状斑块的密度较高、突触成分丢失加剧和各个沉积周围神经突营养不良的数目增加，而用ApoE2观察到相对的保护作用。这些数据支持这样的假设，即APOE等位基因主要通过Aβ介导其对AD的作用，并强调ApoE为治疗靶。

结果

脑室内注射 AAV4-APOE 引起脑中稳定的 APOE 表达和人 ApoE 的持续产生

载脂蛋白E是一种天然分泌的蛋白质，主要通过星形细胞和小神经胶质细胞产生，可在整个脑实质中扩散。我们利用这种性质将编码GFP (对照)或各个APOE等位基因的AAV血清型4注射入7月龄APP/PS1小鼠的侧脑室。考虑到受AD的特征性病变影响的大的脑区，与多次实质内注射相比，该策略提供大的优势。

在注射后2个月，在内衬脑室的脉络丛和室管膜中检出转导细胞，因此证实了AAV4载体的功能性。使用对各物种有特异性的抗体，通过ELISA (图 9A 、 9B和15A)和蛋白质印迹还检出人和鼠ApoE蛋白两者。我们发现，人载脂蛋白E的浓度达到平均20 μg/mg总蛋白质(图 9A)，代表了约10%的内源性鼠apoE (图 9B)。这种适中的额外量的人ApoE的存在不会可检出地改变内源性鼠ApoE蛋白的水平(图 15A)。在AAV4注射后2和5个月之间观察到小但统计学上显著的降低(图 15B)。虽然如此，与对照组相比，人蛋白质的水平保持可检出，表明了AAV4介导的转导提供在整个实质中持续产生分泌的重组蛋白的平台。实际上，在整个皮质中在APP/PS1小鼠的淀粉状蛋白沉积周围可检出人ApoE蛋白，已知内源性鼠ApoE蛋白在皮质中蓄积。

接下来，我们评价了间质液(ISF) (一种还含有高生物活性的Aβ可溶性物类的胞外区室)中人ApoE的存在情况。因为在整个脑裂解物中检出相对少量的ApoE，我们给几种apoE KO小鼠注射各AAV4-APOE载体，并使用高灵敏度但非物种特异性抗体追踪人蛋白质的存在。采用微透析技术，我们证实了apoE KO注射动物的ISF中ApoE的存在。

总的来说，这些数据证实，单次AAV4脑室内注射足以导致目标蛋白质在整个脑实质中和在ISF内的持续产生，且室管膜/脉络丛可用作“生物泵”以将潜在治疗性的蛋白质递送到脑中。

ApoE 同种型的输注差异性地影响淀粉状蛋白肽 和 斑块沉积

在安乐死前，APP/PS1小鼠用表达GFP或各种ApoE同种型的载体转导5个月。淀粉状蛋白斑负荷的分析显示，5个月后，与表达APOE2的相比，在注射AAV4-APOE4的动物的皮质中观察到淀粉状蛋白沉积的密度显著增加。AAV4-GFP和AAV4-APOE3治疗小鼠中的斑块密度在中间水平上彼此无不同(图 16A)。

从甲酸提取物测量的Aβ₄₀和Aβ₄₂肽的浓度酷似淀粉状蛋白斑含量中观察到的变化，使得5个月后表达APOE4等位基因的小鼠中发现淀粉状蛋白肽的浓度提高(图 16B)，用APOE2检出相反的作用。TBS-可溶性级分中Aβ₄₀和Aβ₄₂肽的含量类似地受注射各种AAV-APOE影响(图 16C)。另外，聚集的Aβ肽和可溶性Aβ肽间的比率在ApoE暴露时保持不变，因此表明各种不同的人ApoE同种型的过量表达同时调节原纤维状淀粉状蛋白和可溶性淀粉状蛋白物类两者。

持续仅2个月的各个ApoE同种型过量表达，导致比5个月研究中观察到的小的作用。然而，观察到与其它实验组相比，AAV4-APOE4注射小鼠皮质区内淀粉状蛋白斑密度的显著增加(图 16A)。这与甲酸级分所含Aβ的量是相似的(图 16C)，证实了该特定变体的支配作用。TBS-可溶性Aβ_40/42物类仅显示当AAV4-APOE2或AAV4-APOE4分别表达2个月时趋于较低或较高的趋势(数据未显示)。

为了测定人ApoE同种型的存在是否可反映Aβ原纤化程度的早期变化，在注射后2个月，我们还测量了使用Bam10 (标记所有淀粉状蛋白沉积)和Thio-S (只染色致密中心)针对Aβ的稳固免疫染色之间的比率。在3个同种型中未检出变化，这就表明在这个时限内在实验组间，对致密和弥散性淀粉状蛋白沉积群的分布没有差异性作用(图 16B)。这些数据表明，较长暴露于ApoE变体比较短暴露对淀粉状蛋白沉积具有较强的作用。

已表明，ApoE在Aβ跨越血脑屏障的转运中起作用。为了测试暴露于ApoE同种型是否可调节Aβ肽通过血脑屏障的流出，测量了每只经注射的动物血浆中Aβ₄₀的浓度。我们观察到与AAV4-APOE2和AAV4-GFP相比，脑室内注射AAV4-APOE3和AAV4-APOE4小鼠两者中人Aβ的血浆含量较低(图 10D)。这表明了E3和E4变体两者有助于保留Aβ在中枢神经系统区室中，与所观察到的脑实质中Aβ的浓度相对增加和表明因ApoE所致Aβ的半寿期延长的之前数据一致。

APOE4携带者更易感神经血管功能障碍，且最近表明血脑屏障损坏甚至在淀粉状蛋白沉积不存在时都偏好于APOE4转基因小鼠。为了评价APP/PS中脑室内注射的AAV4-APOE是否会损害BBB的完整性，进行了用普鲁士蓝进行的死后染色。尽管在所有组中存在稀疏分布在脑中的少量含铁血黄素阳性局灶区，但在任何的动物实验组间未观察到明显差异。

ApoE 同种型的表达调节淀粉样变进展的动力学

ApoE4与淀粉状蛋白沉积密度增加有关，而在5个月后用ApoE2观察到相反的作用。这可能反映出淀粉状蛋白β沉积、清除的速率或两者的变化。为了评价ApoE变体如何影响淀粉样变的动态进展，我们采用体内双光子成像，并跟踪淀粉状蛋白斑形成和清除的动力学。小鼠在7月龄时接受AAV4载体的脑室内注射，注射后一周植入颅窗以进行第一成像时段(T0)。在1 (T1)和2个月(T2)后，在相同视场中使淀粉状蛋白沉积成像。对小鼠处予安乐死，用于第二成像时段后的死后分析。

绝大部分的淀粉状蛋白沉积保持稳定，尽管在2个月时间内在小的观察体积内可检测到偶尔的新斑块。此外，在极少情况下，在1或2个月后，可能无法检出在实验开始时成像的甲氧基阳性斑块，表明了一些斑块可能被清除。随着时间推移，我们观察到淀粉状蛋白沉积的体积密度总体增加，在T2时的密度平均起来大于T1的密度23%。淀粉状蛋白进展的速率在ApoE4治疗的APP/PS1小鼠中较快，而2个月后，相对于GFP (0.66)、ApoE3 (0.67)和ApoE4 (0.74)，ApoE2暴露的动物的淀粉状蛋白沉积密度显著降低(图 11A,11B)。重要的是，ApoE2变化反映了自基线降低，首次直接表明斑块的非免疫介导的活性清除。与获自APOE转基因动物的数据形成对比，这些结果证实，甚至在已开始淀粉状蛋白沉积后，ApoE的量的适度增加的诱导可影响进行中的促淀粉状蛋白生成过程。

我们接下来通过测量T1/T0和T2/T1间各个沉积的横截面积的比率，评价了单个淀粉状蛋白斑生长。在T1 (比率T1/T0)时，但未在T2 (比率T2/T1，图 12)时在组间检出差异，表明了人ApoE变体的存在主要影响在暴露后头个月期间的斑块生长，但是该参数之后没有不同。具体地讲，与ApoE2和ApoE3两者相比，在ApoE4治疗小鼠中淀粉状蛋白沉积的大小长得显著更大，表明了不仅斑块的数目还有其大小都被该等位基因加剧。因此ApoE4影响Aβ肽的孕育以及预存斑块的大小。

与 ApoE2 相比， ApoE3 和 ApoE4 同种型使淀粉状蛋白沉积周围的突触密度变差

突触丢失是与认知缺损最佳相关的参数。我们最近表明，ApoE4的存在与人AD患者脑中较高水平的突触寡聚Aβ有关，并且与ApoE3相比，导致淀粉状蛋白斑周围的突触密度显著降低(R. M. Koffie等, Apolipoprotein E4 effects in Alzheimer's disease are mediated by synaptotoxic oligomeric amyloid-beta (突触毒性寡聚淀粉状蛋白-β介导阿尔茨海默病中的载脂蛋白E4作用). Brain 135, 2155 (Jul, 2012)；T. Hashimoto等, Apolipoprotein E, Especially Apolipoprotein E4, Increases the Oligomerization of Amyloid beta Peptide (载脂蛋白E，尤其载脂蛋白E4增加淀粉状蛋白β肽的寡聚化). J Neurosci 32, 15181 (2012年10月24日))。另外，最近体外证据证实，ApoE4不能防止Aβ诱导的突触丢失(M. Buttini等, Modulation of Alzheimer-like synaptic and cholinergic deficits in transgenic mice by human apolipoprotein E depends on isoform, aging, and overexpression of amyloid beta peptides but not on plaque formation (转基因小鼠中通过人载脂蛋白E调节阿尔茨海默病样突触和胆碱能缺陷取决于同种型、老化和淀粉状蛋白β肽的过量表达但不取决于斑块形成). J Neurosci 22, 10539 (2002年12月15日)；A. Sen, D. L. Alkon, T. J. Nelson, Apolipoprotein E3 (ApoE3) but not ApoE4 protects against synaptic loss through increased expression of protein kinase C epsilon (载脂蛋白E3 (ApoE3)但非ApoE4通过蛋白质激酶Cε表达增加防止突触丢失). J Biol Chem 287, 15947 (2012年5月4日))。我们因此假设各个ApoE同种型的连续和弥散性分布不仅可差异性地影响Aβ沉积的动力学和APP/PS小鼠脑中的清除，而且还可影响淀粉状蛋白沉积周围突触的完整性。

采用阵列断层扫描术，一种基于超薄组织切片的免疫荧光染色的高分辨率技术，测定了突触前和突触后成分(分别为突触蛋白-1和PSD95)的密度(K. D. Micheva, S. J. Smith, Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits (阵列断层扫描术：一种用于神经回路的分子构造和超微结构成像的新的工具). Neuron 55, 25 (2007年7月5日)；R. M. Koffie等, Oligomeric amyloid beta associates with postsynaptic densities and correlates with excitatory synapse loss near senile plaques (寡聚淀粉状蛋白β与突触后密度相关并与老年斑附近的兴奋性突触丢失关联). Proc Natl Acad Sci U S A 106, 4012 ( 2009年3月10日))。因为淀粉状蛋白寡聚体类显示高度集中于紧接淀粉状蛋白沉积的附近，所以采用之前确立的方案，量化距离斑块远(> 50μm)或近(< 50μm)的突触蛋白-1和PSD95点(R. M. Koffie等, Oligomeric amyloid beta associates with postsynaptic densities and correlates with excitatory synapse loss near senile plaques (寡聚淀粉状蛋白β与突触后密度相关并与老年斑附近的兴奋性突触丢失关联). Proc Natl Acad Sci U S A 106, 4012 (2009年5月10日))。我们观察到，当APOE3或APOE4表达时，斑块附近突触前成分的丢失加剧，在注射AAV4-APOE2或AAV4-GFP后不是这种情况(图 13A)。相比之下，突触后点的密度在GFP、ApoE2和ApoE3注射小鼠之间保持不变，而ApoE4治疗的动物显示淀粉状蛋白沉积周围PSD95的显著丢失，因此加强ApoE4对Aβ的神经毒性作用的有害作用(图 13C)。当评价位于远离(> 50μm)淀粉状蛋白沉积的区域的突触成分的密度时，组间未能检出差异，表明了人ApoE变体本身对突触密度没有作用，而是表明ApoE同种型对Aβ诱导的神经毒性的重要作用。因此用ApoE3和ApoE4观察到的相对突触丢失与每个斑块周围(在距其边缘<50 μm的距离处)存在的Aβ肽正相关。

作为额外的神经病理学参数，我们还评价了AAV4注射APP/PS1小鼠中与淀粉状蛋白沉积有关的神经突营养不良的数目。除了老年斑周围的脊密度降低以外，老年斑还引起神经毡更普遍的改变，其神经突弯曲增加，并出现浮肿性营养不良。这些病变有可能归因于在斑块表面50µm内的区域内富集的可溶性寡聚Aβ类。我们观察到与GFP、ApoE2和ApoE3相比，ApoE4的过量表达加剧与淀粉状蛋白沉积有关的SMI312阳性神经突营养不良的形成(图13C)。该结果证实了以下观察结果：ApoE4同种型具有最强的作用，并且不仅仅调节斑块形成而且还影响淀粉状蛋白相关的神经毒性。

人 ApoE 蛋白更改另一种 AD 小鼠模型中间质液所含的寡聚 Aβ 类的量

我们接下来解决了ISF内不同ApoE同种型的存在是否可改变在该同一胞外区室中可溶性淀粉状蛋白物类的量的问题。我们选择了给另一种AD模型Tg2576小鼠注射，以证实我们之前在不同转基因小鼠品系中的研究结果。Tg2576小鼠过量表达含有Swedish突变的APP的突变形式并在指定年龄呈现比APP/PS1小鼠轻得多的表型。我们给16-18月龄动物组群注射，使得淀粉状蛋白沉积在AAV4-APOE转导时已存在。基因转移后3个月，将微透析探头插入海马中，收集样品以表征与ISF内各个APOE变体有关的早期变化。

我们观察到与AAV4-APOE2相比，在注射AAV4-APOE4后，使用特异性82E1/82E1 ELISA测定法测量的Aβ寡聚体类的浓度显著较高(达42±7%) (图 14)，这就表明了ApoE的存在可调节该胞外区室的淀粉状蛋白聚集体的性质。此外，当评价ISF中的总的Aβ₄₀和Aβ₄₂时，观察到相同的趋势，但未达到显著(图 17A)，这就表明了ISF中不同ApoE同种型的存在影响淀粉状蛋白肽的聚集状态，某程度上超过对总量的影响。

如所预期的，暴露于不同ApoE同种型的Tg2576小鼠脑的死后生化分析显示，甲酸级分中Aβ₄₂的浓度在ApoE4治疗的动物中显著增加(图 17B)，在第二种转基因模型中证实了我们在APP/PS1小鼠中的观察。

总之，这些生化测量表明，Tg2576小鼠中的ApoE表达诱导与APP/PS1小鼠中观察到的类似的淀粉状蛋白生物学方面的变化。重要的是，观察到ISF内oAβ的含量的早期变化，在ISF中这些神经毒性物类可与突触末端直接相互作用。

讨论

对于AD的发生，增加风险的APOE4等位基因的遗传与具有引人注目的相反作用的APOE2等位基因的遗传之间引人注目的关系引起了关于该风险是如何介导的多种提议。ApoE被指作为参与Aβ清除的Aβ结合蛋白。然而，apoE敲除小鼠中的研究出人意料地报告了Aβ沉积在apoE不存在时显著较低。用人APOE2、APOE3或APOE4置换导致与在AD患者中相同的顺序递增的淀粉状蛋白沉积，这被假设为通过对斑块启动或原纤维形成的作用而发生。替代假设集中在对神经突生长的差异性作用，或甚至提出APOE基因型对阿尔茨海默病表型的作用是与染色体19上的APOE遗传失衡的另一个基因的结果。

我们的数据，来源于采用之前在溶酶体贮积症和亨廷顿舞蹈病的背景下测试的方法对2种不同的小鼠模型的研究，通过采用体内多光子成像、标准定量免疫组织病理学、突触结构的阵列断层扫描术研究和允许检查寡聚Aβ的新的高分子量微透析方法的组合，直接克服了这些问题。我们表明，改变患有已确立的疾病的动物中的ISF ApoE微环境对Aβ体系(Aβ economy)具有引人注目的快速等位基因特异性作用。我们的研究证实了甚至递送至ISF的ApoE4水平的适度(约10%)提高，都显著影响Aβ表型和清除动力学以及增加的可溶性Aβ以及原纤维状形式和甲酸可提取形式的ApoE4相关保留，增加以突触丢失和加重的神经突营养不良为标志的斑块周围的神经毒性。相反地，apoE2降低Aβ，具有显著的神经保护作用。

因为ISF ApoE水平的适度变化具有如此显著的后果，所以这些结果可引起对可通过影响APOE表达改变AD的风险或AD的进展的各种环境和遗传因素的作用的深入了解。大大超过我们所证实的量值的ApoE的增加可发生在创伤、癫痫、缺血和高胆固醇饮食后，所有这些与脑Aβ升高有关。此外，之前发现的与APOE4等位基因遗传失衡的启动子多态性影响APOE表达。

CNS中影响ApoE或ApoE-脂蛋白稳态的其它操作明显改变Aβ沉积。例如，在用APOE慢病毒的病灶基因转移(主要在海马神经元中)的实验中，相对于APOE3，APOE4过量表达对淀粉状蛋白发挥较强的作用。之前的研究还显示，具有多种作用(包括提高内源性apoE合成)的RXR激动剂，或许通过对跨越血脑屏障的清除的作用，导致Aβ从脑中清除。另外，CYP46A (其在CNS中代谢胆固醇并降低其水平)的脑转导，如增加脑中的LDL-R水平那样降低Aβ沉积，已知增加脑中的LDL-R水平降低apoE水平。最后，遗传操作表明，改变apoE表达达一半可影响Aβ表型。我们的结果引人关注地表明较适度的变化也可具有巨大作用。

我们的数据直接解决了APOE-阿尔茨海默病文献中4个其它重要的争议方面。1)我们证实了ApoE同种型对通过突触丢失和神经突营养不良(两者都可能与神经元系统功能受损有关)评价的神经毒性的明确作用。因为这些作用在紧接斑块的附近明显，但在远离斑块的区域不明显，因此与ApoE4相比，ApoE2的突触保护性质可能通过对斑块周围Aβ的作用而不是因ApoE对突触稳定性的直接作用而介导。2)采用纵向多光子体内成像对斑块沉积和生长的动力学的直接观察结果显示，ApoE4提高斑块沉积和生长，而ApoE2实际上与斑块溶解有关——这就表明了ApoE同种型除对原纤维状斑块形成的初期作用以外，还对疾病的步伐和进展具有强大的作用。该结果强化了这样的构想，即就淀粉状蛋白沉积和神经毒性两者而言，ApoE4可加快疾病过程(因此导致较早的发病年龄)，而ApoE2反其道而行之，这就产生了这样的可能性，即将ApoE2 (或ApoE2模拟物)导入CNS中可能甚至在疾病已充分确立之后还具有治疗价值。3)之前已表明ApoE作为Aβ从脑清除的机制或作为延长清除半寿期的保留分子；我们的现有结果表明，除ApoE2之外，将适量的ApoE导入ISF中足以提高Aβ在CNS中的保留。4)长期以来不清楚AD中APOE2显著保护作用的机制，部分是因为ApoE2相对差地结合ApoE受体。我们现有的数据表明，除了对Aβ清除至血浆的中性作用或无作用以外，ApoE2具有功能获益 – 实际上能够逆转已建立的Aβ沉积，以及支持突触和神经突的可塑性。这表明了遗传APOE4和APOE2等位基因的患者间发病年龄几十年长的差异可反映在Aβ沉积和清除动力学中的不同引发点和持续差异两者以及在与沉积相关的神经毒性的程度方面的等位基因特异性差异。ApoE2的这种双重功能可导致旨在模拟其斑块清除和突触恢复能力的治疗方法。

这些结果与以下方面一致：其中apoE起Aβ寡聚化的支架作用的模型、寡聚Aβ的形成和稳定的效率为ApoE4>ApoE3>ApoE2和我们的最新观察结果，即在患有AD的ApoE4 >ApoE3人患者的CNS中寡聚Aβ升高(甚至当斑块负荷在这些情况中归一化时)。如果ApoE，尤其是ApoE4，介导神经毒性寡聚Aβ的形成，我们预测升高的ApoE4可导致突触和神经突改变增加，现行数据似乎正是如此。根据这些结果，就在遗传了APOE4等位基因的AD患者脑中可提高ApoE水平的作用剂而言，应谨慎行事。

最后，我们的数据证实AAV介导的室管膜转导将分泌的蛋白质递送至脑中及在此递送至整个皮质中的能力。降低apoE4或增加apoE2的基因转移或其它方法是影响AD疾病进展的有力手段。

材料与方法

动物。使用以下两种小鼠进行了实验：APPswe/PS1dE9 (APP/PS1)双重转基因小鼠(D. R. Borchelt等, Accelerated amyloid deposition in the brains of transgenic mice coexpressing mutant presenilin 1 and amyloid precursor proteins (在共表达突变型早老蛋白1和淀粉状蛋白前体蛋白的转基因小鼠脑中淀粉状蛋白沉积加快. Neuron 19, 939 (1997年10月)) (获自Jackson laboratory，Bar Harbor，Maine)和Tg2576小鼠(K. Hsiao等, Correlative memory deficits, Abeta elevation, and amyloid plaques in transgenic mice (转基因小鼠中相关性记忆缺陷、Aβ升高和淀粉状蛋白斑). Science 274, 99 (1996年10月4日))。将含有Swedish双重突变K594N/M595L的人突变型淀粉状蛋白前体蛋白基因在朊病毒蛋白质启动子控制下插入这两个小鼠品系的基因组中。另外，APP/PS1小鼠模型过量表达外显子9缺失的早老蛋白1基因的变体 (由同一启动子驱动)。APP/PS1小鼠中APPswe和PSEN1的同时过量表达导致更严重的表型，其大量淀粉状蛋白沉积在早至6月龄时便可见。另一方面，Tg2576小鼠品系是轻微得多的模型，只在1岁左右形成淀粉状蛋白斑。为了测定不同ApoE同种型的导入是否会影响疾病的进展，我们分别给7月龄和16月龄APP/PS1 (每种情况4和7只动物)和Tg2576 (每种情况3-5只动物)小鼠注射。还使用了APOE缺陷型小鼠(ApoE-KO，Jackson Laboratory，Bar Harbor，Maine)。按照NIH和协会准则进行实验。

病毒载体构建和产生

APOE-2、-3和-4 cDNA由University of Illinois (Chicago)的LaDu博士惠赠。在通过PCR扩增后，其每种用BamHI消化，并插入AAV2-pCMV-hrGFP骨架中。由University of Iowa，Iowa City的基因转移载体中心(Gene Transfer Vector Core)使用杆状病毒系统生产高滴度的AAV血清型4载体(AAV4-APOE2、AAV4-APOE3、AAV4-APOE4和AAV4-GFP)。采用定量PCR对病毒进行滴定。

立体定位脑室内注射 。如前所述进行AAV血清型4载体的立体定位脑室内注射(T. L. Spires等, Dendritic spine abnormalities in amyloid precursor protein transgenic mice demonstrated by gene transfer and intravital multiphoton microscopy(通过基因转移和活体内多光子显微术证实淀粉状蛋白前体蛋白转基因小鼠中的树突棘异常). J Neurosci 25, 7278 (2005年8月3日)；G. Liu, I. H. Martins, J. A. Chiorini, B. L. Davidson, Adeno-associated virus type 4 (AAV4) targets ependyma and astrocytes in the subventricular zone and RMS (腺伴随病毒4型(AAV4)靶向脑室下区和RMS中的室管膜和星形细胞). Gene Ther 12, 1503 (2005年10月))。通过腹膜内注射氯胺酮/赛拉嗪(分别为100mg/kg和50mg/kg体重)使动物麻醉，并定位于立体定位支架(David Kopf Instruments，Tujunga，CA)上。使用连接至10-µl Hamilton注射器(Hamilton Medical，Reno，NV)的33规尖头微量移液管，以0.25 µl/分钟的速率，在各侧脑室中，用5μl的病毒制备物(滴度2×10¹² vg/ml)进行载体注射。计算注射部位距前囟的立体定位坐标(前后位+0.3 mm，中侧± 1mm和背腹侧-2mm)。

颅窗植入和多光子成像 。脑室内注射后一周，小鼠用异氟烷(1.5%)麻醉，通过取出一片颅骨并用8mm直径的玻璃盖玻片替换颅骨植入颅窗(如以前所述，T. L. Spires等, Dendritic spine abnormalities in amyloid precursor protein transgenic mice demonstrated by gene transfer and intravital multiphoton microscopy (通过基因转移和活体内多光子显微术证实淀粉状蛋白前体蛋白转基因小鼠中的树突棘异常). J Neurosci 25, 7278 (2005年8月3日))。对于成像，沿窗的边界制作蜡环以产生用于物镜的一汪水(20×物镜，数值孔径为0.95，Olympus)。为了观测淀粉状蛋白沉积，在手术前24小时，转基因动物接受腹膜内注射methoxy-XO₄ (5mg/kg)，一种跨越血脑屏障并与淀粉状蛋白沉积结合的荧光化合物(B. J. Bacskai, W. E. Klunk, C. A. Mathis, B. T. Hyman, Imaging amyloid-beta deposits in vivo (体内使淀粉状蛋白-β沉积成像). J Cereb Blood Flow Metab 22, 1035 (2002年9月))。在成像前，将德克萨斯红葡聚糖(70,000 Da分子量；12.5 mg/ml，在无菌PBS中；Molecular Probes, Eugene, OR)注射至外侧尾静脉以提供荧光血管造影片，使得血管系统的形状可用作跟踪随着时间推移确切相同的视场的界标。AAV注射后一周给小鼠成像以评价淀粉状蛋白沉积的基线水平，然后在注射后1和2个月成像。

装在多光子成像系统(Bio-Rad 1024ES，Bio-Rad，Hercules，CA)中的模式锁定的Ti:蓝宝石激光器(MaiTai，Spectra-Physics，Mountain View，CA)产生860 nm双光子荧光激发光。通过装有3个范围为380–480、500–540和560–650 nm的光电倍增管(Hamamatsu Photonics, Bridgewater, NJ)的定制外部检测器收集发射光。同时获得斑块和血管造影术的两色图像。获得低放大倍数体内图像(615 × 615 μm；z-步长，2 μm，深，~200 μm)，对6-8个视场拍摄以覆盖大的皮质区。

图像处理和分析 。应用Image J，通过报告每体积所成像的皮质的淀粉状蛋白沉积的总数，定量测定每个视场中斑块的密度。我们考虑了自表面上z-堆栈的第一个切片开始到其中可检测淀粉状蛋白沉积的最后一个切片的皮质体积。通过测量二维投影后其来自最大强度的横截面积，来评价随着时间推移的淀粉状蛋白沉积的大小。对于每个斑块，计算初始时间点和第1个月(T1/T0)之间或第2个月和第1个月(T2/T1)之间的面积的比率。

多光子显微镜的设置(激光功率和PMT)在整个实验期间在不同成像时段全都保持不变。

体内微透析采样 。在脑室内注射各AAV4后3个月，对Tg2576小鼠进行了脑间质Aβ和ApoE的体内微透析采样(S. Takeda等, Novel microdialysis method to assess neuropeptides and large molecules in free-moving mouse (评价自由运动的小鼠中的神经肽和大分子的新的微透析方法. Neuroscience 186, 110 (2011年7月14日))。微透析探头具有4 mm柄，该柄具有3.0 mm，1000 kDa分子量截止值(MWCO)聚乙烯(PE)膜(PEP-4-03，Eicom，Kyoto，Japan)。在使用前，通过将探头短暂地浸入乙醇中，然后用通过0.2-μm孔径膜过滤的人工脑脊液(aCSF)灌注缓冲液(单位mM：122 NaCl、1.3 CaCl2、1.2 MgCl2、3.0 KH2PO4、25.0 NaHCO3)洗涤，来对其进行调适。使用氟化乙丙烯(FEP)管(φ 250 μm内径)，分别将预调适的探头出口和进口与蠕动泵(ERP-10，Eicom，Kyoto，Japan)和微量注射泵(ESP-32，Eicom，Kyoto，Japan)连接。

按以前所述(S. Takeda等, Novel microdialysis method to assess neuropeptides and large molecules in free-moving mouse (评价自由运动的小鼠中的神经肽和大分子的新的微透析方法). Neuroscience 186, 110 (2011年7月14日)；J. R. Cirrito等, In vivo assessment of brain interstitial fluid with microdialysis reveals plaque-associated changes in amyloid-beta metabolism and half-life (用微透析对脑间质液的体内评价显示淀粉状蛋白-β代谢和半寿期中斑块相关的变化). J Neurosci 23, 8844 (2003年10月1日))，作略微改变的情况下进行探头植入。简单地说，在经麻醉的动物(1.5%异氟烷)的海马(前囟-3.1 mm，外侧至中线-2.5 mm，腹侧至硬膜-1.2 mm)中立体定位地植入导管(PEG-4，Eicom，Kyoto，Japan)。然后使用二元牙科粘固粉(binary dental cement)将导管固定在颅骨上。

导管植入后4天，将小鼠置于标准微透析笼中，将探头通过导管插入。在插入探头后，为了获得稳定的记录，在样品收集前，将探头和连接管用aCSF以10 μl/分钟的流速灌注240分钟。以0.25 (对于Aβ定量测定)和0.1 μl/分钟(对于ApoE检测)的流速，收集样品。将样品在聚丙烯管中保存在4℃下。在微透析样品收集期间，小鼠苏醒并在微透析笼中自由运动，微透析笼被设计成允许动物不受限制地运动而不给探头组件(AtmosLM微透析系统，Eicom，Kyoto，Japan)施加压力。

免疫组织学分析 。在脑室内注射后2或5个月(短期和长期暴露)，APP/PS1小鼠通过吸入CO₂被处于安乐死，而Tg2576动物在3个月后处死。将一个完整的脑半球在含4%低聚甲醛的磷酸缓冲盐水中固定用于免疫组织学分析并包埋在石蜡中。对遍及额皮质的1mm冠状切片进行处理用于阵列断层扫描术测定，而将半脑的其余部分速冻以进行生物化学和生物分子分析。

为了检测淀粉状蛋白沉积、ApoE和GFP，将石蜡包埋的切片(10µm)依次在二甲苯中脱石蜡，在乙醇中再水化，在柠檬酸盐缓冲液(10mM柠檬酸钠，0.05% Tween 20，pH 6.0)中处理，在含0.5% Triton的PBS中透化，并在含3% BSA的PBS中在室温下封闭2小时。与以下第一抗体的温育在4℃下过夜进行：Bam10 (SIGMA 1:1000)和R1282 (1:500，由Dennis Selkoe博士提供)用于淀粉状蛋白斑；小鼠单克隆抗体3H1 (Ottawa Heart Institute)用于人ApoE；鸡抗GFP (1:500，Aves)和SMI-312 (Covance)用于神经突营养不良。与第二抗体的温育次日在室温下进行2小时。在封片前，通过将切片在含Thio-S (Sigma，St Louis，MO) 0.05%的50%乙醇溶液中温育8分钟，对淀粉状蛋白致密中心斑块进行标记。

用于阵列断层扫描术的样品制备 、免疫染色和图像分析

按以前所述，进行了用于突触前和突触后成分的阵列断层扫描术分析(R. M. Koffie等, Oligomeric amyloid beta associates with postsynaptic densities and correlates with excitatory synapse loss near senile plaques (寡聚淀粉状蛋白β与突触后密度相关并与老年斑附近的兴奋性突触丢失关联). Proc Natl Acad Sci U S A 106, 4012 (2009年3月10日))。简单地说，切下邻近脑室区的一块皮质组织(1 mm³)，并在含4%低聚甲醛、2.5%蔗糖的0.01M PBS中固定3小时。在乙醇中脱水后，在53℃下聚合前，将样品在LR White树脂(Electron Microscopy Sciences)中在4℃下温育过夜。然后使用Jumbo Histo Diamond Knife (Diatome)，在超薄切片机(Leica)切下切片带(70nm)。

在含50 mM甘氨酸的TBS中再水化5分钟后，将切片在含0.05% Tween和0.1% BSA的Tris中封闭5分钟，将第一抗体1:50加入封闭缓冲液中2小时(来自Virginia Lee博士的优先染色寡聚Aβ类的PSD95 Abcam Ab12093、突触蛋白I Millipore AB1543和NAB61，E. B. Lee等, Targeting amyloid-beta peptide (Abeta) oligomers by passive immunization with a conformation-selective monoclonal antibody improves learning and memory in Abeta precursor protein (APP) transgenic mice (通过用构象选择性单克隆抗体被动免疫靶向淀粉状蛋白-β肽(Aβ)寡聚体改善Aβ前体蛋白(APP)转基因小鼠的学习和记忆). J Biol Chem 281, 4292 (2006年2月17日))。载玻片用TBS洗涤，加入第二抗体(抗山羊-Alexa Fluor 488、抗小鼠Cy3或抗小鼠Alexa Fluor 488 Invitrogen)。获得遍及额皮质的7-30个连续切片的图像，并使用Zeiss Axioplan LSM510共焦/多光子显微镜(63x数值孔径Plan Apochromatic油物镜)获取。

按以前所述应用Image J (美国国立卫生研究院开放软件)和MATLAB (Mathworks)分析图像(R. M. Koffie等, Oligomeric amyloid beta associates with postsynaptic densities and correlates with excitatory synapse loss near senile plaques (寡聚淀粉状蛋白β与突触后密度相关并与老年斑附近的兴奋性突触丢失关联). Proc Natl Acad Sci U S A 106, 4012 (2009年3月10日))。将每套图像转化成堆栈，应用Image J MultiStackReg和StackReg plug-ins (承Brad Busse和P. Thevenaz, Stanford University赠送)比对。选择已知体积并使用自动化的基于阈值的检测程序对多于一个连续切片上出现的PSD95和突触蛋白点进行计数(WaterShed程序，由Brad Busse，Stephen Smith和Kristina Micheva，Stanford University提供)。分水岭(watershed)输出了阈值化图像栈(对于各通道是单独的)，图像栈显示了存在于阵列中的多于一个切片上的点。对每只小鼠皮质中的几个部位进行采样，并测量了它们距斑块边缘的距离。

Aβ 定量测定

按照生产商说明书，通过BNT-77/BA-27 (对于Aβ₄₀)和BNT-77/BC-05 (对于Aβ₄₂)夹心ELISA (Wako Pure Chemical Industries，Osaka，Japan)，测定了TBS可溶性级分、甲酸级分以及微量透析液中Aβ₄₀和Aβ₄₂的浓度。样品中寡聚体Aβ的量通过82E1/82E1夹心ELISA (Immuno-Biological Laboratories，Inc，Hamburg，Germany)测定，其中相同N端(残基1–16)抗体用来俘获和检测两者(W. Xia等, A specific enzyme-linked immunosorbent assay for measuring beta-amyloid protein oligomers in human plasma and brain tissue of patients with Alzheimer disease (用于测量阿尔茨海默病患者的人血浆和脑组织中的β-淀粉状蛋白蛋白质寡聚体的特异性酶联免疫吸收测定法). Arch Neurol 66, 190 ( 2009年2月))。

免疫印迹分析

使脑TBS可溶性级分和微量透析液(20 μg蛋白质)在4-12% Novex Bis-Tris凝胶(Invitrogen)上在用于SDS-PAGE的MOPS运行缓冲液 (Invitrogen)中进行电泳。将凝胶转移至PVDF膜上，在5%牛奶/TBS-T中在室温下封闭60分钟。将膜用山羊抗ApoE抗体(1:1000，Millipore，AB947)探测以检测无APOE动物的ISF中少量的APOE，而白蛋白作为对照检测。人和小鼠ApoE的印迹分别用EP1373Y抗体(1:1000，Novus Biologicals，NB110-55467)和兔多克隆apoE抗体(1:1000，Abcam，ab20874)探测。与HRP缀合的山羊IgG抗体(载体)的温育进行2小时。免疫反应性蛋白质使用ECL试剂盒(Western Lightning，PerkinElmer)显影，并在Hyperfilm ECL (GE healthcare)上检测。

qRT-PCR

使用TRIzol®试剂(Life technologies；15596-026)从脑样品中提取总的RNA，然后按照SuperScript® III One-Step RT-PCR System (Life technologies；12574-018)生产商说明书，合成cDNA。特别设计PCR引物以扩增重组人APOE mRNA和内源性Apoe和Gapdh mRNA (Apoe正向：5’-AGCTCCCAAGTCACACAAGA ；Apoe 反向：5’- GTTGCGTAGATCCTCCATGT ；APOE正向：5’- CCAGCGACAATCACTGAAC ；APOE 反向：5’- GCGCGTAATACGACTCACTA；Gapdh正向：5’- ATGACATCAAGAAGGTGGTG和Gapdh反向：5’- CATACCAGGAAATGAGCTTG)。

APOE ELISA

特异性ELISA测定法用来检测人和内源性鼠APOE蛋白两者。简单地说，ELISA板用1.5ug/ml山羊抗APOE抗体(检测鼠APOE)或1.5ug/ml WUE4抗体(检测人APOE)包被过夜，在PBS中稀释的1%脱脂奶中在37℃下封闭1.5小时。人重组ApoE蛋白用作标准物(对于人-特异性测定，Biovision)或使用来自脑提取物的内部小鼠标准物(对于鼠特异性测定)，将样品稀释于ELISA缓冲液(含0.5% BSA和0.025% Tween-20的PBS)中，并温育过夜。在洗涤后，分别使用对人(山羊-apoe Millipore；1:10,000)或小鼠(Abcam ab20874 ；1 :2,000)有特异性的检测抗体，接着与合适的HRP缀合的第二抗体温育1.5小时。在使用H₃PO₄停止溶液前，使用TMB底物进行信号显示。在450nm处测量比色结果。

统计分析

应用Prism软件进行了统计分析。由于样品的量小，对于大多数分析不能采用当量浓度。对于所有的死后分析，进行了非参数性Kruskal-Wallis检验，接着Dunn多重比较检验，以评价所注射的各载体的作用。使用混合效应模型(其对于小鼠具有随机效应，对于载体、时间和基线体积密度具有固定效应)，分析了淀粉状蛋白进展的体内成像数据。在该分析中考虑了时间和载体间的相互作用，但是该相互作用不显著。对于斑块大小随时间的分析，将两种混合效应模型对两个连续时间点的比率的对数进行拟合，对于小鼠为随机效应，对于log基线大小(在第一项分析为t0，在第二项分析中为t1)为固定效应。

所有出版物、专利和专利申请均通过引用结合到本文中。虽然在前述说明书中，就其某些优选的实施方案描述了本发明，并提供了许多细节用于说明目的，但对本领域技术人员显而易见的是，本发明能容许其它实施方案，且在不偏离本发明基本原理的情况下，可大大地改变本文描述的某些细节。

在描述本发明的情况下，术语“一个”和“一种”和“所述”和类似指示物的使用应解释为涵盖单数和复数，除非本文另有说明或上下文中明确冲突。术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应解释为开放式术语(即意指“包括但不限于”)，除非另有说明。除非本文另有说明，否则本文数值范围的引述仅仅旨在用作分别提及落入该范围的各个单独的值的简写方法，并且每个单独的值结合到本说明书中，就像在本文个别引述一样。本文描述的所有方法可以任何合适的顺序进行，除非本文另有说明或以其它方式在上下文中明确冲突。本文提供的任何和全部实例或示例性用语(例如“例如”)的使用，仅仅旨在更好地说明本发明，并不对本发明的范围提出限制，除非另作声明。本说明书中任何用语都不应解释为表明任何未要求保护的要素为实施本发明所必需的。

本文描述了本发明的实施方案，包括实施本发明的本发明人已知的最佳方式。当阅读上面的描述时，这些实施方案的变化对于本领域普通技术人员而言可变得显而易见。本发明人预期技术人员在适当时应用这些变化，并且本发明人预期按本文明确描述以外的方法实施本发明。因此，本发明包括适用法律所允许的随附权利要求书中引述的主题的所有修改和等同内容。此外，本发明包括呈其所有可能变化的上述要素的任何组合，除非本文另有说明或以其它方式在上下文中明确冲突。

Claims

1. 一种治疗哺乳动物的阿尔茨海默病的方法，所述方法包括以有效感染哺乳动物的室管膜细胞的方式，将包含AAV衣壳蛋白和含编码保护性ApoE同种型蛋白的核酸的载体的rAAV颗粒给予哺乳动物的脑脊液(CSF)，所述核酸插入一对AAV反向末端重复之间，其中所述室管膜细胞分泌ApoE以治疗所述疾病。

2. 一种将保护性ApoE同种型递送至哺乳动物的中枢神经系统的方法，所述方法包括以有效感染哺乳动物的室管膜细胞方式，将包含AAV衣壳蛋白和含编码保护性ApoE同种型的核酸的载体的rAAV颗粒给予哺乳动物的脑脊液(CSF)，使得室管膜细胞分泌ApoE进入哺乳动物的CSF中，所述核酸插入一对AAV反向末端重复之间。

3. 一种治疗哺乳动物的疾病的方法，所述方法包括将包含AAV衣壳蛋白和含编码保护性ApoE同种型蛋白的插入一对AAV反向末端重复之间的核酸的载体的rAAV颗粒给予哺乳动物的室管膜细胞，从而将核酸递送至室管膜细胞中，其中所述室管膜细胞分泌ApoE蛋白以治疗所述疾病。

4. 一种将编码保护性ApoE同种型的核酸递送至哺乳动物的室管膜细胞中的方法，所述方法包括将包含AAV衣壳蛋白和含插入一对AAV反向末端重复之间的所述核酸的载体的rAAV颗粒给予室管膜细胞，从而将所述核酸递送至室管膜细胞中。

5. 一种将编码保护性ApoE同种型的核酸递送到哺乳动物的方法，所述方法包括将包含AAV衣壳蛋白和含插入一对AAV反向末端重复之间的所述核酸的载体的rAAV颗粒给予哺乳动物的室管膜细胞，并将室管膜细胞输回给哺乳动物，从而将所述核酸递送给哺乳动物。

6. 一种将编码保护性ApoE同种型的核酸递送到哺乳动物的室管膜细胞中的方法，所述方法包括将包含AAV衣壳蛋白和含插入一对AAV反向末端重复之间的所述核酸的载体的rAAV颗粒给予哺乳动物，从而将所述核酸递送至哺乳动物的室管膜细胞中。

7. 一种转染哺乳动物脑的室管膜细胞的方法，所述方法包括以有效感染哺乳动物的室管膜细胞的方式，将包含AAV衣壳蛋白和含编码保护性ApoE同种型的核酸的载体的rAAV颗粒给予哺乳动物的脑脊液(CSF)，使得室管膜细胞分泌作用剂进入哺乳动物的CSF中，所述核酸插入一对AAV反向末端重复之间。

8. 权利要求1-7中任一项的方法，其中所述哺乳动物是非啮齿类哺乳动物。

9. 权利要求8的方法，其中所述非啮齿类哺乳动物是灵长类动物、马、绵羊、山羊、猪或狗。

10. 权利要求9的方法，其中所述非啮齿类哺乳动物是狗。

11. 权利要求9的方法，其中所述非啮齿类哺乳动物是灵长类动物。

12. 权利要求11的方法，其中所述灵长类动物是人。

13. 权利要求1-12中任一项的方法，其中所述保护性ApoE同种型与ApoE ε2具有80%同源性。

14. 权利要求1-12中任一项的方法，其中所述保护性ApoE同种型与ApoE ε2具有100%同源性。

15. 一种用于转染哺乳动物的室管膜细胞以产生治疗结果的含有载体的rAAV颗粒，所述rAAV颗粒包含编码保护性ApoE同种型的插入一对AAV反向末端重复之间的核酸。

16. 权利要求15的rAAV颗粒，其中所述哺乳动物是非啮齿类哺乳动物。

17. 权利要求16的rAAV颗粒，其中所述非啮齿类哺乳动物是灵长类动物、马、绵羊、山羊、猪或狗。

18. 权利要求17的rAAV颗粒，其中所述非啮齿类哺乳动物是狗。

19. 权利要求17的rAAV颗粒，其中所述非啮齿类哺乳动物是灵长类动物。

20. 权利要求19的rAAV颗粒，其中所述灵长类动物是人。

21. 权利要求15-20中任一项的rAAV颗粒，其中所述保护性ApoE同种型与ApoE ε2具有80%同源性。

22. 权利要求15-20的rAAV颗粒，其中所述蛋白质与ApoE ε2具有100%同源性。

23. 含有包含编码保护性ApoE同种型的插入一对AAV反向末端重复之间的核酸的载体的rAAV颗粒在制备用于治疗或预防动物例如人的阿尔茨海默病的药物中的用途。

24. 一种药盒，所述药盒包含rAAV颗粒的化合物、容器和说明将AAV颗粒给予CSF以治疗动物的阿尔茨海默病的包装说明书或标签，所述rAAV颗粒包含含有编码保护性ApoE同种型的插入一对AAV反向末端重复之间的核酸的载体。