JP6592435B2 - アミロイド沈着を処置するための方法および組成物 - Google Patents

アミロイド沈着を処置するための方法および組成物 Download PDF

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Description

関連出願
本願は、２０１３年１１月２０日に出願した米国仮特許出願第６１／９０６，８１１号に対する優先権を主張する。この出願の全体は、本明細書中に参考として援用される。
連邦政府の助成金支援
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈにより授与されたＲ００ＡＧ３３６７０、ＮＳ３４５６８、ＨＤ３３５３１、ＤＫ５４７５９、１ＲＣ１ＡＧ０２６２６５−０１およびＲＣ１ＡＧ０３６２６５の下で、政府支援によりなされたものである。政府は、本発明において一定の権利を有する。
背景
遺伝子移入は現在、生物学的事象および疾患過程を細胞レベルおよび分子レベルの両方で分析するための強力なツールとして広く認識されている。ここ最近、遺伝性（例えば、ＡＤＡ欠損症）または後天性（例えば、がんまたは感染症）のいずれかのヒト疾患を処置するための遺伝子療法の適用がかなりの注目を集めている。改善された遺伝子移入技法の出現および増加し続けている遺伝子欠陥に関連する疾患のライブラリーの同定により、遺伝子療法は処置理論から実用的なものへと急速に発展してきた。
伝統的に、遺伝子療法は、先天的な遺伝子エラーを補正するために外因性遺伝子を患者の細胞に導入する手順として定義されている。つい最近、遺伝子療法は、罹患している生物体に新しい遺伝情報を導入することによって疾患表現型を補正するものとして広く定義された。ｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子療法では、移入遺伝子を、レシピエント生物体の細胞にｉｎ ｓｉｔｕで、すなわちレシピエント内に導入する。ｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子療法は動物モデルにおいて調査されている。筋肉、造血幹細胞、動脈壁、神経系、および肺などの臓器および組織へのｉｎ ｓｉｔｕにおける直接遺伝子移入の実施可能性が報告されている。骨格筋、心筋へのＤＮＡの直接注射、および脈管構造へのＤＮＡ−脂質複合体の注射によっても、ｉｎ ｖｉｖｏにおける挿入遺伝子産物（複数可）の検出可能な発現レベルがもたらされることが報告されている。
中枢神経系（ＣＮＳ）の疾患、例えば、アルツハイマー病などの脳の遺伝子疾患の処置は、困難な問題のままである。脳疾患の処置に伴う主な問題は、治療用タンパク質が、静脈内に送達されたときに血液脳関門を横断しない、または、直接脳に送達されたときに広範に分布しないことである。したがって、アルツハイマー病を処置するための療法の開発が必要とされている。
概要
本発明は、特定の実施形態において、アミロイド障害の処置前および処置後の哺乳動物中のＡ−ベータを決定する方法であって、
（ａ）該哺乳動物から第１の血液試料を得るステップと、
（ｂ）該哺乳動物にアミロイド障害に対する処置を施すステップと、
（ｃ）該哺乳動物から第２の血液試料を得るステップと、
（ｄ）該第１の血液試料中および該第２の血液試料中のＡ−ベータのレベルを定量するステップと、
（ｅ）該アミロイド障害の処置前および処置後の該哺乳動物中のＡ−ベータの該レベルを決定するステップと
を含む方法を提供する。
特定の実施形態では、本発明は、前記第１の試料中のＡ−ベータの前記レベルと前記第２の試料中のＡ−ベータの前記レベルの比を算出するステップをさらに含む。
特定の実施形態では、本発明は、前記第１の試料中のＡ−ベータの前記レベルと前記第２の試料中のＡ−ベータの前記レベルを比較するステップをさらに含み、該第２の血液試料中のＡ−ベータのレベルが該第１の血液試料と比較して上昇していることが、前記哺乳動物の脳内に存在するアミロイド斑または凝集体の低下または減少と関連するまたはそれを示す。
特定の実施形態では、本発明は、前記第１の試料中のＡ−ベータの前記レベルと前記第２の試料中のＡ−ベータの前記レベルを比較するステップをさらに含み、該第２の血液試料中のＡ−ベータのレベルが該第１の血液試料と比較して上昇していることが、前記アミロイド障害の有効な処置と関連するまたはそれを示す。
特定の実施形態では、前記処置が、前記哺乳動物の脳脊髄液（ＣＳＦ）に、ＡＡＶカプシドタンパク質と、ＡＡＶ末端逆位配列（ＩＴＲ）の対の間または１つもしくは複数のＡＡＶ ＩＴＲの隣に挿入された保護性ＡｐｏＥアイソフォームタンパク質をコードする核酸を含むベクターとを含むｒＡＡＶ粒子を投与するステップを含む。本明細書で使用される場合、「保護性ＡｐｏＥアイソフォーム」という用語は、アルツハイマー病のリスクを少なくとも５％、例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％またはそれ超低下させるＡｐｏＥアイソフォームを区別するために使用される。ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、非げっ歯類上衣細胞に、ＡＡＶ４の感染速度よりも２０％より大きい速度で、例えば、ＡＡＶ４の感染速度よりも５０％または１００％、１０００％または２０００％より大きい速度で感染するｒＡＡＶ２粒子である。
特定の実施形態では、前記処置が、保護性ＡｐｏＥアイソフォームをコードする核酸を前記哺乳動物に送達するステップであって、該哺乳動物由来の上衣細胞に、ＡＡＶカプシドタンパク質と、ＡＡＶ末端逆位配列（ＩＴＲ）の対の間または１つもしくは複数のＡＡＶ ＩＴＲの隣に挿入された該核酸を含むベクターとを含むｒＡＡＶ粒子を投与することと、該上衣細胞を該哺乳動物に戻し、それにより、該核酸を該哺乳動物に送達することとを含むステップを含む。
特定の実施形態では、前記処置が、保護性ＡｐｏＥアイソフォームをコードする核酸を哺乳動物中の上衣細胞に送達するステップであって、該哺乳動物に、ＡＡＶカプシドタンパク質と、ＡＡＶ末端逆位配列（ＩＴＲ）の対の間または１つもしくは複数のＡＡＶ ＩＴＲの隣に挿入された核酸を含むベクターとを含むｒＡＡＶ粒子を投与し、それにより、該核酸を該哺乳動物中の上衣細胞に送達することを含むステップを含む。
特定の実施形態では、前記ｒＡＡＶ粒子を前記哺乳動物中の上衣細胞に形質導入またはトランスフェクトし、該形質導入またはトランスフェクトされた上衣細胞が前記ＡｐｏＥアイソフォームタンパク質を分泌する。特定の実施形態では、前記ｒＡＡＶ粒子が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ７４もしくはＲｈ１０のカプシド、または変異体ＡＡＶ１、変異体ＡＡＶ２、変異体ＡＡＶ３、変異体ＡＡＶ４、変異体ＡＡＶ５、変異体ＡＡＶ６、変異体ＡＡＶ７、変異体ＡＡＶ８、変異体ＡＡＶ９、変異体ＡＡＶ１０、変異体ＡＡＶ１１、変異体Ｒｈ７４もしくは変異体Ｒｈ１０のカプシドを含む。特定の実施形態では、前記ｒＡＡＶ粒子が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ７４もしくはＲｈ１０の末端逆位配列（ＩＴＲ）または変異体ＡＡＶ１、変異体ＡＡＶ２、変異体ＡＡＶ３、変異体ＡＡＶ４、変異体ＡＡＶ５、変異体ＡＡＶ６、変異体ＡＡＶ７、変異体ＡＡＶ８、変異体ＡＡＶ９、変異体ＡＡＶ１０、変異体ＡＡＶ１１、変異体Ｒｈ７４もしくは変異体Ｒｈ１０の末端逆位配列（ＩＴＲ）を含む。ある特定の実施形態では、ＡＡＶ粒子はｒＡＡＶ４粒子である。ある特定の実施形態では、ＡＡＶ粒子はｒＡＡＶ２粒子である。ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ２カプシドは、ＡＡＶ２カプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３に対して少なくとも８０％の相同性を有する。ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ２カプシドは、ＡＡＶ２カプシドＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３に対して１００％の相同性を有する。
特定の実施形態では、前記核酸が、哺乳動物ＡｐｏＥアイソフォームタンパク質をコードする。特定の実施形態では、前記核酸が、ヒトＡｐｏＥアイソフォームタンパク質をコードする。特定の実施形態では、前記ｒＡＡＶ粒子が、医薬組成物を含む。
特定の実施形態では、前記第１の血液試料中または前記第２の血液試料中のＡ−ベータの前記レベルをイムノアッセイによって定量する。
ある特定の実施形態では、哺乳動物は、非げっ歯類哺乳動物である。ある特定の実施形態では、非げっ歯類哺乳動物は、霊長類、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、またはイヌである。ある特定の実施形態では、霊長類は、ヒトである。
特定の実施形態では、前記処置が、前記哺乳動物の脳内の前記保護性ＡｐｏＥアイソフォームタンパク質のレベルの上昇を含む。ある特定の実施形態では、保護性ＡｐｏＥアイソフォームはＡｐｏＥ ε２に対して８０％の相同性を有する。ある特定の実施形態では、保護性ＡｐｏＥアイソフォームはＡｐｏＥ ε２に対して１００％の相同性を有する。
特定の実施形態では、前記アミロイド障害がアルツハイマー病を含む。
特定の実施形態では、前記血液試料が全血、血漿または血清である。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
アミロイド障害の処置前および処置後の哺乳動物中のＡ−ベータを決定する方法であって、
（ａ）該哺乳動物から第１の血液試料を得るステップと、
（ｂ）該哺乳動物にアミロイド障害に対する処置を施すステップと、
（ｃ）該哺乳動物から第２の血液試料を得るステップと、
（ｄ）該第１の血液試料中および該第２の血液試料中のＡ−ベータのレベルを定量するステップと、
（ｅ）該アミロイド障害の処置前および処置後の該哺乳動物中のＡ−ベータの該レベルを決定するステップと
を含む方法。
（項目２）
前記第１の試料中のＡ−ベータの前記レベルと前記第２の試料中のＡ−ベータの前記レベルの比を算出するステップをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記第１の試料中のＡ−ベータの前記レベルと前記第２の試料中のＡ−ベータの前記レベルを比較するステップをさらに含み、該第２の血液試料中のＡ−ベータのレベルが該第１の血液試料と比較して上昇していることが、前記哺乳動物の脳内に存在するアミロイド斑または凝集体の低下または減少と関連するまたはそれを示す、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記第１の試料中のＡ−ベータの前記レベルと前記第２の試料中のＡ−ベータの前記レベルを比較するステップをさらに含み、該第２の血液試料中のＡ−ベータのレベルが該第１の血液試料と比較して上昇していることが、前記アミロイド障害の有効な処置と関連するまたはそれを示す、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記処置が、前記哺乳動物の脳脊髄液（ＣＳＦ）に、ＡＡＶカプシドタンパク質と、ＡＡＶ末端逆位配列（ＩＴＲ）の対の間または１つもしくは複数のＡＡＶ ＩＴＲの隣に挿入された保護性ＡｐｏＥアイソフォームタンパク質をコードする核酸を含むベクターとを含むｒＡＡＶ粒子を投与するステップを含む、項目１から４までのいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
前記処置が、保護性ＡｐｏＥアイソフォームをコードする核酸を前記哺乳動物に送達するステップであって、該哺乳動物由来の上衣細胞に、ＡＡＶカプシドタンパク質と、ＡＡＶ末端逆位配列（ＩＴＲ）の対の間または１つもしくは複数のＡＡＶ ＩＴＲの隣に挿入された該核酸を含むベクターとを含むｒＡＡＶ粒子を投与することと、該上衣細胞を該哺乳動物に戻し、それにより、該核酸を該哺乳動物に送達することとを含むステップを含む、項目１から４までのいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
前記処置が、保護性ＡｐｏＥアイソフォームをコードする核酸を哺乳動物中の上衣細胞に送達するステップであって、該哺乳動物に、ＡＡＶカプシドタンパク質と、ＡＡＶ末端逆位配列（ＩＴＲ）の対の間または１つもしくは複数のＡＡＶ ＩＴＲの隣に挿入された核酸を含むベクターとを含むｒＡＡＶ粒子を投与し、それにより、該核酸を該哺乳動物中の上衣細胞に送達することを含むステップを含む、項目１から４までのいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
前記ｒＡＡＶ粒子を前記哺乳動物中の上衣細胞に形質導入またはトランスフェクトし、該形質導入またはトランスフェクトされた上衣細胞が前記ＡｐｏＥアイソフォームタンパク質を分泌する、項目５から７までのいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
前記ｒＡＡＶ粒子が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ７４もしくはＲｈ１０のカプシド、または変異体ＡＡＶ１、変異体ＡＡＶ２、変異体ＡＡＶ３、変異体ＡＡＶ４、変異体ＡＡＶ５、変異体ＡＡＶ６、変異体ＡＡＶ７、変異体ＡＡＶ８、変異体ＡＡＶ９、変異体ＡＡＶ１０、変異体ＡＡＶ１１、変異体Ｒｈ７４もしくは変異体Ｒｈ１０のカプシドを含む、項目５から８までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
前記ｒＡＡＶ粒子が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ７４もしくはＲｈ１０の末端逆位配列（ＩＴＲ）または変異体ＡＡＶ１、変異体ＡＡＶ２、変異体ＡＡＶ３、変異体ＡＡＶ４、変異体ＡＡＶ５、変異体ＡＡＶ６、変異体ＡＡＶ７、変異体ＡＡＶ８、変異体ＡＡＶ９、変異体ＡＡＶ１０、変異体ＡＡＶ１１、変異体Ｒｈ７４もしくは変異体Ｒｈ１０の末端逆位配列（ＩＴＲ）を含む、項目５から９までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
前記核酸が、哺乳動物ＡｐｏＥアイソフォームタンパク質をコードする、項目５から１０までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
前記核酸が、ヒトＡｐｏＥアイソフォームタンパク質をコードする、項目５から１０までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
前記ｒＡＡＶ粒子が、医薬組成物を含む、項目５から１２までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
前記第１の血液試料中または前記第２の血液試料中のＡ−ベータの前記レベルをイムノアッセイによって定量する、項目１から１３までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
前記哺乳動物が霊長類である、項目１から１４までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
前記霊長類がヒトである、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記処置が、前記哺乳動物の脳内の前記保護性ＡｐｏＥアイソフォームタンパク質のレベルの上昇を含む、項目５から１６までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１８）
前記保護性ＡｐｏＥアイソフォームがＡｐｏＥ ε２に対して８０％の相同性を有する、項目５から１７までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
前記保護性ＡｐｏＥアイソフォームがＡｐｏＥ ε２に対して１００％の相同性を有する、項目５から１７までのいずれか一項に記載の方法。
（項目２０）
前記アミロイド障害がアルツハイマー病を含む、項目１から１９までのいずれか一項に記載の方法。
（項目２１）
前記血液試料が全血、血漿または血清である、項目１から２０までのいずれか一項に記載の方法。
図１Ａ〜１Ｂ。ＡＡＶ４−ＡｐｏＥの脳室内注射により、脳におけるｈｕＡＰＯＥの安定発現および組換えｈｕＡｐｏＥタンパク質の持続的検出がもたらされる。 ＡｐｏＥの各アイソフォームの過剰発現はアミロイドーシスの進行に示差的に影響を及ぼす。 アミロイド斑のサイズは各ＡｐｏＥアイソフォームに応じて変動する。 図４Ａ〜４Ｂ。アミロイド負荷量（ｌｏａｄ）の死後評価によりＡｐｏＥ２およびＡｐｏＥ４のアミロイド沈着に対する影響が確認される。 図５Ａ〜５Ｄ。各ＡｐｏＥアイソフォームは、アミロイド沈着周囲のシナプス密度に示差的に影響を及ぼす。 図６Ａは、ＡＡＶ２タンパク質（配列番号１）とＡＡＶ４タンパク質（配列番号２）のアラインメントである。 図６Ａは、ＡＡＶ２タンパク質（配列番号１）とＡＡＶ４タンパク質（配列番号２）のアラインメントである。 図６Ａは、ＡＡＶ２タンパク質（配列番号１）とＡＡＶ４タンパク質（配列番号２）のアラインメントである。 図６Ｂは、ＡＡＶ２（ＮＣ＿００１４０１）およびＡＡＶ４（ＮＣ＿００１８２９）からの配列に基づいたＡＡＶ２ヌクレオチド（配列番号３）とＡＡＶ４ヌクレオチド（配列番号４）のアラインメントである。 図６Ｂは、ＡＡＶ２（ＮＣ＿００１４０１）およびＡＡＶ４（ＮＣ＿００１８２９）からの配列に基づいたＡＡＶ２ヌクレオチド（配列番号３）とＡＡＶ４ヌクレオチド（配列番号４）のアラインメントである。 図６Ｂは、ＡＡＶ２（ＮＣ＿００１４０１）およびＡＡＶ４（ＮＣ＿００１８２９）からの配列に基づいたＡＡＶ２ヌクレオチド（配列番号３）とＡＡＶ４ヌクレオチド（配列番号４）のアラインメントである。 図６Ｂは、ＡＡＶ２（ＮＣ＿００１４０１）およびＡＡＶ４（ＮＣ＿００１８２９）からの配列に基づいたＡＡＶ２ヌクレオチド（配列番号３）とＡＡＶ４ヌクレオチド（配列番号４）のアラインメントである。 図６Ｂは、ＡＡＶ２（ＮＣ＿００１４０１）およびＡＡＶ４（ＮＣ＿００１８２９）からの配列に基づいたＡＡＶ２ヌクレオチド（配列番号３）とＡＡＶ４ヌクレオチド（配列番号４）のアラインメントである。 図６Ｂは、ＡＡＶ２（ＮＣ＿００１４０１）およびＡＡＶ４（ＮＣ＿００１８２９）からの配列に基づいたＡＡＶ２ヌクレオチド（配列番号３）とＡＡＶ４ヌクレオチド（配列番号４）のアラインメントである。 図６Ｂは、ＡＡＶ２（ＮＣ＿００１４０１）およびＡＡＶ４（ＮＣ＿００１８２９）からの配列に基づいたＡＡＶ２ヌクレオチド（配列番号３）とＡＡＶ４ヌクレオチド（配列番号４）のアラインメントである。 図７は、種々の脳領域におけるＴＰＰ１活性の上昇を示す。 図８は、対照および処置を受けたイヌのＴ迷路動作の結果を示す。淡い丸は罹患しているイヌについてであり、濃い四角は正常なイヌについてであり、暗い丸はＡＡＶ２−ＣＬＮ２による処置を受けたＴＰＰ−／−イヌについてである。 図９Ａ〜９Ｂ。ＡＡＶ血清型４を脳室内注射することによるＡＰＯＥ遺伝子移入手法の検証。ＧＦＰまたはＡｐｏＥの免疫組織学的標識により、上衣および脈絡叢にＧＦＰまたはヒトＡｐｏＥタンパク質が存在することが明らかになった。（Ａ）注射を受けたマウスの大脳ホモジネート内の組換えヒトＡｐｏＥタンパク質の濃度を定量するための、種特異的ＥＬＩＳＡアッセイの使用。（Ｂ）マウス当たりの、内因性ａｐｏＥと比較したヒトＡｐｏＥタンパク質の百分率の評価。各動物についてヒトＡｐｏＥとマウス内因性ａｐｏＥの比を算出した。特異的な抗ヒトＡｐｏＥ抗体である３Ｈ１を使用して、ＡＰＰ／ＰＳ１の注射を受けたマウスの皮質実質内の、組換えタンパク質が蓄積する傾向があるいくつかのアミロイド沈着周囲に組換えタンパク質の存在を検出することができた。ＡＡＶ４−ＡＰＯＥ４ベクターの注射を受けたａｐｏＥ ＫＯマウスのＩＳＦ試料中のＡｐｏＥのウエスタンブロットによる検出。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅの高感度（しかし非種特異的）ヤギ抗ａｐｏＥ抗体（ＡＢ９４７）を検出抗体として使用した。アルブミンを対照として使用した。群当たりｎ＝４〜６匹の動物。＊ｐ＜０．０５。 図９Ａ〜９Ｂ。ＡＡＶ血清型４を脳室内注射することによるＡＰＯＥ遺伝子移入手法の検証。ＧＦＰまたはＡｐｏＥの免疫組織学的標識により、上衣および脈絡叢にＧＦＰまたはヒトＡｐｏＥタンパク質が存在することが明らかになった。（Ａ）注射を受けたマウスの大脳ホモジネート内の組換えヒトＡｐｏＥタンパク質の濃度を定量するための、種特異的ＥＬＩＳＡアッセイの使用。（Ｂ）マウス当たりの、内因性ａｐｏＥと比較したヒトＡｐｏＥタンパク質の百分率の評価。各動物についてヒトＡｐｏＥとマウス内因性ａｐｏＥの比を算出した。特異的な抗ヒトＡｐｏＥ抗体である３Ｈ１を使用して、ＡＰＰ／ＰＳ１の注射を受けたマウスの皮質実質内の、組換えタンパク質が蓄積する傾向があるいくつかのアミロイド沈着周囲に組換えタンパク質の存在を検出することができた。ＡＡＶ４−ＡＰＯＥ４ベクターの注射を受けたａｐｏＥ ＫＯマウスのＩＳＦ試料中のＡｐｏＥのウエスタンブロットによる検出。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅの高感度（しかし非種特異的）ヤギ抗ａｐｏＥ抗体（ＡＢ９４７）を検出抗体として使用した。アルブミンを対照として使用した。群当たりｎ＝４〜６匹の動物。＊ｐ＜０．０５。 図１０Ａ〜１０Ｄ。Ａβペプチドのレベルおよびアミロイド沈着の密度は、異なるＡＰＯＥ対立遺伝子の過剰発現によって調節される。（Ａ）注射を受けたトランスジェニックマウスの皮質（左側のパネル）および海馬（右側のパネル）におけるアミロイド沈着の密度の分析。両方の大脳領域においても同様の傾向を観察することができたが、皮質のデータのみが統計的有意性に達した。（Ｂ）ギ酸（ＦＡ）画分中のＡβ４０ペプチドおよびＡβ４２ペプチドの濃度のＥＬＩＳＡによる決定。（Ｃ）各ＡＡＶを脳室内注射した５カ月後の、ＴＢＳ可溶性画分中のＡβ４０ペプチドおよびＡβ４２ペプチドのレベルのＥＬＩＳＡによる定量。（Ｄ）ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにＡＡＶ−ＧＦＰベクターおよびＡＡＶ−ＡＰＯＥ２／３／４ベクターを脳室内注射した５カ月後の、Ａβ４０ペプチドの血漿中レベルの定量。群当たりｎ＝４〜７匹の動物。＊ｐ＜０．０５ 図１０Ａ〜１０Ｄ。Ａβペプチドのレベルおよびアミロイド沈着の密度は、異なるＡＰＯＥ対立遺伝子の過剰発現によって調節される。（Ａ）注射を受けたトランスジェニックマウスの皮質（左側のパネル）および海馬（右側のパネル）におけるアミロイド沈着の密度の分析。両方の大脳領域においても同様の傾向を観察することができたが、皮質のデータのみが統計的有意性に達した。（Ｂ）ギ酸（ＦＡ）画分中のＡβ４０ペプチドおよびＡβ４２ペプチドの濃度のＥＬＩＳＡによる決定。（Ｃ）各ＡＡＶを脳室内注射した５カ月後の、ＴＢＳ可溶性画分中のＡβ４０ペプチドおよびＡβ４２ペプチドのレベルのＥＬＩＳＡによる定量。（Ｄ）ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにＡＡＶ−ＧＦＰベクターおよびＡＡＶ−ＡＰＯＥ２／３／４ベクターを脳室内注射した５カ月後の、Ａβ４０ペプチドの血漿中レベルの定量。群当たりｎ＝４〜７匹の動物。＊ｐ＜０．０５ 図１０Ａ〜１０Ｄ。Ａβペプチドのレベルおよびアミロイド沈着の密度は、異なるＡＰＯＥ対立遺伝子の過剰発現によって調節される。（Ａ）注射を受けたトランスジェニックマウスの皮質（左側のパネル）および海馬（右側のパネル）におけるアミロイド沈着の密度の分析。両方の大脳領域においても同様の傾向を観察することができたが、皮質のデータのみが統計的有意性に達した。（Ｂ）ギ酸（ＦＡ）画分中のＡβ４０ペプチドおよびＡβ４２ペプチドの濃度のＥＬＩＳＡによる決定。（Ｃ）各ＡＡＶを脳室内注射した５カ月後の、ＴＢＳ可溶性画分中のＡβ４０ペプチドおよびＡβ４２ペプチドのレベルのＥＬＩＳＡによる定量。（Ｄ）ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにＡＡＶ−ＧＦＰベクターおよびＡＡＶ−ＡＰＯＥ２／３／４ベクターを脳室内注射した５カ月後の、Ａβ４０ペプチドの血漿中レベルの定量。群当たりｎ＝４〜７匹の動物。＊ｐ＜０．０５ 図１０Ａ〜１０Ｄ。Ａβペプチドのレベルおよびアミロイド沈着の密度は、異なるＡＰＯＥ対立遺伝子の過剰発現によって調節される。（Ａ）注射を受けたトランスジェニックマウスの皮質（左側のパネル）および海馬（右側のパネル）におけるアミロイド沈着の密度の分析。両方の大脳領域においても同様の傾向を観察することができたが、皮質のデータのみが統計的有意性に達した。（Ｂ）ギ酸（ＦＡ）画分中のＡβ４０ペプチドおよびＡβ４２ペプチドの濃度のＥＬＩＳＡによる決定。（Ｃ）各ＡＡＶを脳室内注射した５カ月後の、ＴＢＳ可溶性画分中のＡβ４０ペプチドおよびＡβ４２ペプチドのレベルのＥＬＩＳＡによる定量。（Ｄ）ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにＡＡＶ−ＧＦＰベクターおよびＡＡＶ−ＡＰＯＥ２／３／４ベクターを脳室内注射した５カ月後の、Ａβ４０ペプチドの血漿中レベルの定量。群当たりｎ＝４〜７匹の動物。＊ｐ＜０．０５ 図１１Ａ〜１１Ｂ。各ＡＰＯＥ変異体の過剰発現により、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるアミロイドーシスの進行が示差的に調節される。ＡＡＶ−ＧＦＰベクター、ＡＡＶ−ＡＰＯＥ２ベクター、ＡＡＶ−ＡＰＯＥ３ベクターまたはＡＡＶ−ＡＰＯＥ４ベクターを脳室内注射した１週間後（Ｔ０）、１カ月後（Ｔ１）および２カ月後（Ｔ２）のＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおけるアミロイド沈着に関するｉｎ ｖｉｖｏ二光子画像を生じさせた。同じ視野を経時的に追跡できるように、画像化の前にデキストラン、テキサスレッド（７０，０００Ｄａ）の静脈内注射を実施した。２カ月の期間内に、わずかな新しいアミロイド斑を検出することができたが、最初に可視性であった時々の沈着は１カ月後または２カ月後にはもはや検出できなかった。（Ａ）７カ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１マウスにＡＡＶ−ＧＦＰ、ＡＡＶ−ＡＰＯＥ２、ＡＡＶ−ＡＰＯＥ３またはＡＡＶ−ＡＰＯＥ４を脳室内注射した後２カ月の期間にわたる容積測定による皮質のアミロイド沈着の密度の評価。各動物について６〜８視野を縦方向に画像化し、皮質の体積当たりの斑の密度を算出し、各動物についてベースライン（Ｔ０）における最初の値に対して報告した。アミロイド沈着の密度０．２３の全体的な進行が経時的に観察された（Ｔ２／Ｔ１、ｐ＜０．０１１）。さらに、ＡｐｏＥ２により、密度がＧＦＰと比較して０．６６（ｓｅ＝０．２１、ｐ＝０．００２）、ＡｐｏＥ３と比較して０．６７（ｓｅ＝０．１７、ｐ＜０．０００１）およびＡｐｏＥ４と比較して０．７４（ｓｅ＝０．１７、ｐ＜０．０００１）まで有意に減少する。（Ｂ）ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおける遺伝子移入後２カ月にわたるアミロイドーシス進行の線形回帰当てはめにより、ＡＡＶ−ＡＰＯＥ４によってのみ、この期間内に有意な正の傾きが誘導されることが示される。群当たりｎ＝４〜６匹の動物。＊ｐ＜０．０５。 図１１Ａ〜１１Ｂ。各ＡＰＯＥ変異体の過剰発現により、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるアミロイドーシスの進行が示差的に調節される。ＡＡＶ−ＧＦＰベクター、ＡＡＶ−ＡＰＯＥ２ベクター、ＡＡＶ−ＡＰＯＥ３ベクターまたはＡＡＶ−ＡＰＯＥ４ベクターを脳室内注射した１週間後（Ｔ０）、１カ月後（Ｔ１）および２カ月後（Ｔ２）のＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおけるアミロイド沈着に関するｉｎ ｖｉｖｏ二光子画像を生じさせた。同じ視野を経時的に追跡できるように、画像化の前にデキストラン、テキサスレッド（７０，０００Ｄａ）の静脈内注射を実施した。２カ月の期間内に、わずかな新しいアミロイド斑を検出することができたが、最初に可視性であった時々の沈着は１カ月後または２カ月後にはもはや検出できなかった。（Ａ）７カ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１マウスにＡＡＶ−ＧＦＰ、ＡＡＶ−ＡＰＯＥ２、ＡＡＶ−ＡＰＯＥ３またはＡＡＶ−ＡＰＯＥ４を脳室内注射した後２カ月の期間にわたる容積測定による皮質のアミロイド沈着の密度の評価。各動物について６〜８視野を縦方向に画像化し、皮質の体積当たりの斑の密度を算出し、各動物についてベースライン（Ｔ０）における最初の値に対して報告した。アミロイド沈着の密度０．２３の全体的な進行が経時的に観察された（Ｔ２／Ｔ１、ｐ＜０．０１１）。さらに、ＡｐｏＥ２により、密度がＧＦＰと比較して０．６６（ｓｅ＝０．２１、ｐ＝０．００２）、ＡｐｏＥ３と比較して０．６７（ｓｅ＝０．１７、ｐ＜０．０００１）およびＡｐｏＥ４と比較して０．７４（ｓｅ＝０．１７、ｐ＜０．０００１）まで有意に減少する。（Ｂ）ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおける遺伝子移入後２カ月にわたるアミロイドーシス進行の線形回帰当てはめにより、ＡＡＶ−ＡＰＯＥ４によってのみ、この期間内に有意な正の傾きが誘導されることが示される。群当たりｎ＝４〜６匹の動物。＊ｐ＜０．０５。 ＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ３およびＡｐｏＥ４を注入した１カ月後および２カ月後のアミロイド沈着のサイズの進化。Ｔ１とＴ０の間の斑サイズの比を表す散布ドットプロットにより、１カ月後に、ＡｐｏＥ４が、ＡｐｏＥ２およびＡｐｏＥ３のどちらと比較しても斑の成長の増加と関連することが示された。この影響は２カ月後までは持続しなかった。動物３〜４匹の群当たりｎ＞５０の斑が測定された。＊ｐ＜０．０５。 図１３Ａ〜１３Ｃ。アミロイド沈着に関連する神経病理学的変化は、各ＡＰＯＥ変異体による影響を示差的に受ける。ＡＡＶ−ＧＦＰ、ＡＡＶ−ＡＰＯＥ２、ＡＡＶ−ＡＰＯＥ３およびＡＡＶ−ＡＰＯＥ４を脳室内注射した２カ月後のＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいて、ＰＳＤ９５（シナプス後部要素）およびアミロイド沈着について免疫染色したアレイ断層撮影法切片の画像を調製した。アミロイド沈着を、毒性Ａβオリゴマー種を優先的に標識することが以前に示された抗体ＮＡＢ６１を使用して標識した。（Ａ）ＡＰＯＥ３を発現させた場合とＡＰＯＥ４を発現させた場合はどちらも、ＧＦＰまたはＡＰＯＥ２と比較して、アミロイド斑の付近でシナプシン−１マーカーの有意に高い消失（ｌｏｓｓ）が観察された。（Ｂ）シナプス後部要素を定量した場合にも同様の効果が観察され、したがって、沈着周囲のＰＳＤ９５の密度は、ＡＡＶ４−ＡＰＯＥ４を脳室内注射した２カ月後に低下した。神経病理学的変化の追加のパラメータとして、注射を受けたＡＰＰ／ＰＳ１マウスの脳におけるアミロイド斑当たりの神経突起ジストロフィーの数を、ＴｈｉｏＳおよび軸索マーカーＳＭＩ３１２について免疫染色した後に評価した。（Ｃ）マウスにＡｐｏＥ４を注入した場合に、ＡｐｏＥ３およびＡｐｏＥ２群と比較してより多数のジストロフィーへの有意なシフトが観察され、したがって、ＡｐｏＥ４がアミロイド斑形成を超える有害作用を有し得、小さなオリゴマーアミロイド凝集体の神経毒性の潜在性を調節し得ることが示唆される。群当たりｎ＝４〜６匹の動物。＊ｐ＜０．０５。 図１３Ａ〜１３Ｃ。アミロイド沈着に関連する神経病理学的変化は、各ＡＰＯＥ変異体による影響を示差的に受ける。ＡＡＶ−ＧＦＰ、ＡＡＶ−ＡＰＯＥ２、ＡＡＶ−ＡＰＯＥ３およびＡＡＶ−ＡＰＯＥ４を脳室内注射した２カ月後のＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいて、ＰＳＤ９５（シナプス後部要素）およびアミロイド沈着について免疫染色したアレイ断層撮影法切片の画像を調製した。アミロイド沈着を、毒性Ａβオリゴマー種を優先的に標識することが以前に示された抗体ＮＡＢ６１を使用して標識した。（Ａ）ＡＰＯＥ３を発現させた場合とＡＰＯＥ４を発現させた場合はどちらも、ＧＦＰまたはＡＰＯＥ２と比較して、アミロイド斑の付近でシナプシン−１マーカーの有意に高い消失（ｌｏｓｓ）が観察された。（Ｂ）シナプス後部要素を定量した場合にも同様の効果が観察され、したがって、沈着周囲のＰＳＤ９５の密度は、ＡＡＶ４−ＡＰＯＥ４を脳室内注射した２カ月後に低下した。神経病理学的変化の追加のパラメータとして、注射を受けたＡＰＰ／ＰＳ１マウスの脳におけるアミロイド斑当たりの神経突起ジストロフィーの数を、ＴｈｉｏＳおよび軸索マーカーＳＭＩ３１２について免疫染色した後に評価した。（Ｃ）マウスにＡｐｏＥ４を注入した場合に、ＡｐｏＥ３およびＡｐｏＥ２群と比較してより多数のジストロフィーへの有意なシフトが観察され、したがって、ＡｐｏＥ４がアミロイド斑形成を超える有害作用を有し得、小さなオリゴマーアミロイド凝集体の神経毒性の潜在性を調節し得ることが示唆される。群当たりｎ＝４〜６匹の動物。＊ｐ＜０．０５。 図１３Ａ〜１３Ｃ。アミロイド沈着に関連する神経病理学的変化は、各ＡＰＯＥ変異体による影響を示差的に受ける。ＡＡＶ−ＧＦＰ、ＡＡＶ−ＡＰＯＥ２、ＡＡＶ−ＡＰＯＥ３およびＡＡＶ−ＡＰＯＥ４を脳室内注射した２カ月後のＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいて、ＰＳＤ９５（シナプス後部要素）およびアミロイド沈着について免疫染色したアレイ断層撮影法切片の画像を調製した。アミロイド沈着を、毒性Ａβオリゴマー種を優先的に標識することが以前に示された抗体ＮＡＢ６１を使用して標識した。（Ａ）ＡＰＯＥ３を発現させた場合とＡＰＯＥ４を発現させた場合はどちらも、ＧＦＰまたはＡＰＯＥ２と比較して、アミロイド斑の付近でシナプシン−１マーカーの有意に高い消失（ｌｏｓｓ）が観察された。（Ｂ）シナプス後部要素を定量した場合にも同様の効果が観察され、したがって、沈着周囲のＰＳＤ９５の密度は、ＡＡＶ４−ＡＰＯＥ４を脳室内注射した２カ月後に低下した。神経病理学的変化の追加のパラメータとして、注射を受けたＡＰＰ／ＰＳ１マウスの脳におけるアミロイド斑当たりの神経突起ジストロフィーの数を、ＴｈｉｏＳおよび軸索マーカーＳＭＩ３１２について免疫染色した後に評価した。（Ｃ）マウスにＡｐｏＥ４を注入した場合に、ＡｐｏＥ３およびＡｐｏＥ２群と比較してより多数のジストロフィーへの有意なシフトが観察され、したがって、ＡｐｏＥ４がアミロイド斑形成を超える有害作用を有し得、小さなオリゴマーアミロイド凝集体の神経毒性の潜在性を調節し得ることが示唆される。群当たりｎ＝４〜６匹の動物。＊ｐ＜０．０５。 Ｔｇ２５７６マウスにおいて、ＡＡＶ４−ＡＰＯＥ２、ＡＡＶ４−ＡＰＯＥ３、ＡＡＶ４−ＡＰＯＥ４を脳室内注射した後のＩＳＦ中のオリゴマーＡβ種の含有量の初期変化が観察される。８２Ｅ１／８２Ｅ１ ＥＬＩＳＡアッセイを使用したＩＳＦのｏＡβ含有量（the ISF content in oAβ）の定量により、ＡＡＶ４−ＡＰＯＥ４の注射後には、ＡＡＶ４−ＡＰＯＥ２およびＡＡＶ４−ＧＦＰと比較してオリゴマーアミロイドβ種の濃度が高く、ＡＡＶ４−ＡＰＯＥ３の注射を受けたマウスでは中間のレベルに達することが示される。群当たりｎ＝３〜６匹の動物。＊ｐ＜０．０５。 図１５Ａ〜１５Ｂ。ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおける、ＡＡＶ４を脳室内注射した後のヒトＡＰＯＥ ｍＲＮＡおよびタンパク質ならびに内因性マウスＡＰＯＥ ｍＲＮＡおよびタンパク質の検出。（Ａ）注射を受けたマウスの脳内の内因性マウスａｐｏＥタンパク質の量を表すボックスブロットグラフ。（Ｂ）ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおける、ＡＡＶ４を脳室内注射した２カ月後と５カ月後のＡｐｏＥタンパク質のレベルの比較（ＡｐｏＥの注射を受けた全マウス由来の試料を２カ月および５カ月の時点で、ＡＰＯＥ変異体を識別せずに、まとめてプールした）。群当たりｎ＝４〜６匹の動物。＊ｐ＜０．０５。 図１５Ａ〜１５Ｂ。ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおける、ＡＡＶ４を脳室内注射した後のヒトＡＰＯＥ ｍＲＮＡおよびタンパク質ならびに内因性マウスＡＰＯＥ ｍＲＮＡおよびタンパク質の検出。（Ａ）注射を受けたマウスの脳内の内因性マウスａｐｏＥタンパク質の量を表すボックスブロットグラフ。（Ｂ）ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおける、ＡＡＶ４を脳室内注射した２カ月後と５カ月後のＡｐｏＥタンパク質のレベルの比較（ＡｐｏＥの注射を受けた全マウス由来の試料を２カ月および５カ月の時点で、ＡＰＯＥ変異体を識別せずに、まとめてプールした）。群当たりｎ＝４〜６匹の動物。＊ｐ＜０．０５。 図１６Ａ〜１６Ｃ。短期間（２カ月）曝露後のＡβに対する影響は、各ＡｐｏＥアイソフォームと関連する。注射の２カ月後のＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおけるアミロイド沈着の画像を調製した。それぞれ全てのアミロイド沈着または有芯斑（dense-core plaque）を染色するために、Ｂａｍ１０抗体を使用した免疫染色とＴｈｉｏＳを使用した免疫染色の両方を使用した。（Ａ）皮質におけるアミロイド沈着の密度の立体解析により、早ければ注射の２カ月後に、ＡＰＯＥ４の過剰発現により斑の数の増加がもたらされることが明らかになったが、他の実験群の間では差異は観察できなかった。（Ｂ）他方では、Ｂａｍ１０染色とＴｈｉｏＳ染色の比は、異なる群の全ての間で変化しないままである。（Ｃ）異なるＡｐｏＥ変異体に短期間曝露した後の不溶性ギ酸抽出物中のＡβ４０ペプチド（左側のパネル）およびＡβ４２ペプチド（右側のパネル）の濃度の決定。群当たりｎ＝３〜５匹の動物。＊ｐ＜０．０５。 図１６Ａ〜１６Ｃ。短期間（２カ月）曝露後のＡβに対する影響は、各ＡｐｏＥアイソフォームと関連する。注射の２カ月後のＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおけるアミロイド沈着の画像を調製した。それぞれ全てのアミロイド沈着または有芯斑（dense-core plaque）を染色するために、Ｂａｍ１０抗体を使用した免疫染色とＴｈｉｏＳを使用した免疫染色の両方を使用した。（Ａ）皮質におけるアミロイド沈着の密度の立体解析により、早ければ注射の２カ月後に、ＡＰＯＥ４の過剰発現により斑の数の増加がもたらされることが明らかになったが、他の実験群の間では差異は観察できなかった。（Ｂ）他方では、Ｂａｍ１０染色とＴｈｉｏＳ染色の比は、異なる群の全ての間で変化しないままである。（Ｃ）異なるＡｐｏＥ変異体に短期間曝露した後の不溶性ギ酸抽出物中のＡβ４０ペプチド（左側のパネル）およびＡβ４２ペプチド（右側のパネル）の濃度の決定。群当たりｎ＝３〜５匹の動物。＊ｐ＜０．０５。 図１６Ａ〜１６Ｃ。短期間（２カ月）曝露後のＡβに対する影響は、各ＡｐｏＥアイソフォームと関連する。注射の２カ月後のＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおけるアミロイド沈着の画像を調製した。それぞれ全てのアミロイド沈着または有芯斑（dense-core plaque）を染色するために、Ｂａｍ１０抗体を使用した免疫染色とＴｈｉｏＳを使用した免疫染色の両方を使用した。（Ａ）皮質におけるアミロイド沈着の密度の立体解析により、早ければ注射の２カ月後に、ＡＰＯＥ４の過剰発現により斑の数の増加がもたらされることが明らかになったが、他の実験群の間では差異は観察できなかった。（Ｂ）他方では、Ｂａｍ１０染色とＴｈｉｏＳ染色の比は、異なる群の全ての間で変化しないままである。（Ｃ）異なるＡｐｏＥ変異体に短期間曝露した後の不溶性ギ酸抽出物中のＡβ４０ペプチド（左側のパネル）およびＡβ４２ペプチド（右側のパネル）の濃度の決定。群当たりｎ＝３〜５匹の動物。＊ｐ＜０．０５。 図１７Ａ〜１７Ｂ。Ｔｇ２５７６マウスにおいて注射の３カ月後に検出された可溶性および不溶性Ａβ種の変化。（Ａ）ＩＳＦのＡβ４０含有量およびＡβ４２含有量（the ISF content in Aβ40 and Aβ42）（Ｂ）のＥＬＩＳＡによる定量により、ＡＡＶ４−ＡＰＯＥ４の注射後には、ＡＡＶ４−ＡＰＯＥ２、ＡＡＶ４−ＡＰＯＥ３およびＡＡＶ４−ＧＦＰと比較して可溶性アミロイドβペプチドの濃度が高くなる傾向があることが示される。（Ｂ）ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいて予め観察された通り、ＡｐｏＥ４を用いるとより強力な影響が観察され、Ｔｇ２５７６マウスのギ酸画分中のＡβ４２の量が有意に多くなる。群当たりｎ＝３〜５匹の動物。＊ｐ＜０．０５。 図１７Ａ〜１７Ｂ。Ｔｇ２５７６マウスにおいて注射の３カ月後に検出された可溶性および不溶性Ａβ種の変化。（Ａ）ＩＳＦのＡβ４０含有量およびＡβ４２含有量（the ISF content in Aβ40 and Aβ42）（Ｂ）のＥＬＩＳＡによる定量により、ＡＡＶ４−ＡＰＯＥ４の注射後には、ＡＡＶ４−ＡＰＯＥ２、ＡＡＶ４−ＡＰＯＥ３およびＡＡＶ４−ＧＦＰと比較して可溶性アミロイドβペプチドの濃度が高くなる傾向があることが示される。（Ｂ）ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいて予め観察された通り、ＡｐｏＥ４を用いるとより強力な影響が観察され、Ｔｇ２５７６マウスのギ酸画分中のＡβ４２の量が有意に多くなる。群当たりｎ＝３〜５匹の動物。＊ｐ＜０．０５。 図１８Ａ〜１８Ｂ。ＡＰＰ／ＰＳ１マウスの脳室内注射によるＡＡＶ４−ＡＰＯＥ遺伝子移入。（Ａ）種特異的ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、２カ月後および５カ月後のマウス脳ホモジネート中のヒトＡＰＯＥタンパク質の濃度を定量した。（Ｂ）２カ月後または５カ月後の、内因性マウスＡｐｏｅと比較したヒトＡＰＯＥの百分率。各動物についてヒトＡＰＯＥとマウスＡＰＯＥの比を算出した。 図１８Ａ〜１８Ｂ。ＡＰＰ／ＰＳ１マウスの脳室内注射によるＡＡＶ４−ＡＰＯＥ遺伝子移入。（Ａ）種特異的ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、２カ月後および５カ月後のマウス脳ホモジネート中のヒトＡＰＯＥタンパク質の濃度を定量した。（Ｂ）２カ月後または５カ月後の、内因性マウスＡｐｏｅと比較したヒトＡＰＯＥの百分率。各動物についてヒトＡＰＯＥとマウスＡＰＯＥの比を算出した。 図１９Ａ〜１９Ｄ。Ａβペプチドおよびアミロイド沈着が、異なるＡＰＯＥ対立遺伝子によって調節される。（Ａ）ＡＡＶ４−ＧＦＰまたはＡＡＶ４−ＡＰＯＥ２／３／４の注射を受けたＡＰＰ／ＰＳ１トランスジェニックマウスの皮質（左側のパネル）および海馬（右側のパネル）におけるアミロイド沈着の密度の分析。（Ｂ）マウス脳のギ酸（ＦＡ）画分中のＡβ４０およびＡβ４２の濃度のＥＬＩＳＡアッセイによる決定。（Ｃ）マウス脳のＴＢＳ可溶性画分中のＡβ４０ペプチドおよびＡβ４２ペプチドの濃度のＥＬＩＳＡアッセイによる定量。（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）ｎ＝４匹のＡＡＶ４−ＧＦＰマウス、ｎ＝５匹のＡＡＶ４−ＡＰＯＥ２マウス、ｎ＝６匹のＡＡＶ４−ＡＰＯＥ３マウス、およびｎ＝５匹のＡＡＶ４−ＡＰＯＥ４マウス。＊ｐ＜０．０５。 図１９Ａ〜１９Ｄ。Ａβペプチドおよびアミロイド沈着が、異なるＡＰＯＥ対立遺伝子によって調節される。（Ａ）ＡＡＶ４−ＧＦＰまたはＡＡＶ４−ＡＰＯＥ２／３／４の注射を受けたＡＰＰ／ＰＳ１トランスジェニックマウスの皮質（左側のパネル）および海馬（右側のパネル）におけるアミロイド沈着の密度の分析。（Ｂ）マウス脳のギ酸（ＦＡ）画分中のＡβ４０およびＡβ４２の濃度のＥＬＩＳＡアッセイによる決定。（Ｃ）マウス脳のＴＢＳ可溶性画分中のＡβ４０ペプチドおよびＡβ４２ペプチドの濃度のＥＬＩＳＡアッセイによる定量。（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）ｎ＝４匹のＡＡＶ４−ＧＦＰマウス、ｎ＝５匹のＡＡＶ４−ＡＰＯＥ２マウス、ｎ＝６匹のＡＡＶ４−ＡＰＯＥ３マウス、およびｎ＝５匹のＡＡＶ４−ＡＰＯＥ４マウス。＊ｐ＜０．０５。 図１９Ａ〜１９Ｄ。Ａβペプチドおよびアミロイド沈着が、異なるＡＰＯＥ対立遺伝子によって調節される。（Ａ）ＡＡＶ４−ＧＦＰまたはＡＡＶ４−ＡＰＯＥ２／３／４の注射を受けたＡＰＰ／ＰＳ１トランスジェニックマウスの皮質（左側のパネル）および海馬（右側のパネル）におけるアミロイド沈着の密度の分析。（Ｂ）マウス脳のギ酸（ＦＡ）画分中のＡβ４０およびＡβ４２の濃度のＥＬＩＳＡアッセイによる決定。（Ｃ）マウス脳のＴＢＳ可溶性画分中のＡβ４０ペプチドおよびＡβ４２ペプチドの濃度のＥＬＩＳＡアッセイによる定量。（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）ｎ＝４匹のＡＡＶ４−ＧＦＰマウス、ｎ＝５匹のＡＡＶ４−ＡＰＯＥ２マウス、ｎ＝６匹のＡＡＶ４−ＡＰＯＥ３マウス、およびｎ＝５匹のＡＡＶ４−ＡＰＯＥ４マウス。＊ｐ＜０．０５。 図１９Ａ〜１９Ｄ。Ａβペプチドおよびアミロイド沈着が、異なるＡＰＯＥ対立遺伝子によって調節される。（Ａ）ＡＡＶ４−ＧＦＰまたはＡＡＶ４−ＡＰＯＥ２／３／４の注射を受けたＡＰＰ／ＰＳ１トランスジェニックマウスの皮質（左側のパネル）および海馬（右側のパネル）におけるアミロイド沈着の密度の分析。（Ｂ）マウス脳のギ酸（ＦＡ）画分中のＡβ４０およびＡβ４２の濃度のＥＬＩＳＡアッセイによる決定。（Ｃ）マウス脳のＴＢＳ可溶性画分中のＡβ４０ペプチドおよびＡβ４２ペプチドの濃度のＥＬＩＳＡアッセイによる定量。（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）ｎ＝４匹のＡＡＶ４−ＧＦＰマウス、ｎ＝５匹のＡＡＶ４−ＡＰＯＥ２マウス、ｎ＝６匹のＡＡＶ４−ＡＰＯＥ３マウス、およびｎ＝５匹のＡＡＶ４−ＡＰＯＥ４マウス。＊ｐ＜０．０５。 図２０Ａ〜２０Ｂ。ヒトＡＰＯＥ変異体により、アミロイドーシス進行が示差的に調節される。（Ａ）ＡＡＶ４−ＧＦＰ、ＡＡＶ４−ＡＰＯＥ２、ＡＡＶ４−ＡＰＯＥ３またはＡＡＶ４−ＡＰＯＥ４を脳室内注射した後２カ月の期間にわたる容積測定による皮質のアミロイド沈着の密度の評価。各動物について６〜８視野を縦方向に画像化した。皮質の体積当たりの斑の密度を算出し、ベースライン（Ｔ０）における各動物の最初の値に対して正規化した。（Ｂ）遺伝子移入後２カ月にわたるアミロイドーシス進行の線形回帰当てはめにより、ＡＡＶ４−ＡＰＯＥ４によってのみ、この期間内に有意な正の傾きが誘導されることが示される。ｎ＝４匹のＡＡＶ４−ＧＦＰマウス、ｎ＝４匹のＡＡＶ４−ＡＰＯＥ２マウス、ｎ＝６匹のＡＡＶ４−ＡＰＯＥ３マウス、およびｎ＝５匹のＡＡＶ４−ＡＰＯＥ４マウス。＊ｐ＜０．０５。 図２０Ａ〜２０Ｂ。ヒトＡＰＯＥ変異体により、アミロイドーシス進行が示差的に調節される。（Ａ）ＡＡＶ４−ＧＦＰ、ＡＡＶ４−ＡＰＯＥ２、ＡＡＶ４−ＡＰＯＥ３またはＡＡＶ４−ＡＰＯＥ４を脳室内注射した後２カ月の期間にわたる容積測定による皮質のアミロイド沈着の密度の評価。各動物について６〜８視野を縦方向に画像化した。皮質の体積当たりの斑の密度を算出し、ベースライン（Ｔ０）における各動物の最初の値に対して正規化した。（Ｂ）遺伝子移入後２カ月にわたるアミロイドーシス進行の線形回帰当てはめにより、ＡＡＶ４−ＡＰＯＥ４によってのみ、この期間内に有意な正の傾きが誘導されることが示される。ｎ＝４匹のＡＡＶ４−ＧＦＰマウス、ｎ＝４匹のＡＡＶ４−ＡＰＯＥ２マウス、ｎ＝６匹のＡＡＶ４−ＡＰＯＥ３マウス、およびｎ＝５匹のＡＡＶ４−ＡＰＯＥ４マウス。＊ｐ＜０．０５。 ＡＰＯＥ２、ＡＰＯＥ３またはＡＰＯＥ４を注入した１カ月後または２カ月後のアミロイド沈着のサイズの変化。Ｔ１とＴ０の間および（Ｃ）Ｔ２とＴ１の間の斑サイズの比を表す散布ドットプロット。動物３〜４匹の群当たりｎ＞５０の斑が測定された。＊ｐ＜０．０５。 図２２Ａ〜２２Ｃ。アミロイド沈着に関連する神経病理学的変化は、ＡＰＯＥ変異体の影響を示差的に受ける。アミロイド斑の付近の、（Ａ）シナプス前部（シナプシンＩ）の減少の百分率および（Ｂ）シナプス後部（ＰＳＤ９５）の消失の百分率。（Ｃ）アミロイド斑の表面当たりのジストロフィーの平均数を表す棒グラフ。ｎ＝４匹のＡＡＶ４−ＧＦＰマウス、ｎ＝４匹のＡＡＶ４−ＡＰＯＥ２マウス、ｎ＝６匹のＡＡＶ４−ＡＰＯＥ３マウス、およびｎ＝５匹のＡＡＶ４−ＡＰＯＥ４マウス。＊ｐ＜０．０５。 図２２Ａ〜２２Ｃ。アミロイド沈着に関連する神経病理学的変化は、ＡＰＯＥ変異体の影響を示差的に受ける。アミロイド斑の付近の、（Ａ）シナプス前部（シナプシンＩ）の減少の百分率および（Ｂ）シナプス後部（ＰＳＤ９５）の消失の百分率。（Ｃ）アミロイド斑の表面当たりのジストロフィーの平均数を表す棒グラフ。ｎ＝４匹のＡＡＶ４−ＧＦＰマウス、ｎ＝４匹のＡＡＶ４−ＡＰＯＥ２マウス、ｎ＝６匹のＡＡＶ４−ＡＰＯＥ３マウス、およびｎ＝５匹のＡＡＶ４−ＡＰＯＥ４マウス。＊ｐ＜０．０５。 図２２Ａ〜２２Ｃ。アミロイド沈着に関連する神経病理学的変化は、ＡＰＯＥ変異体の影響を示差的に受ける。アミロイド斑の付近の、（Ａ）シナプス前部（シナプシンＩ）の減少の百分率および（Ｂ）シナプス後部（ＰＳＤ９５）の消失の百分率。（Ｃ）アミロイド斑の表面当たりのジストロフィーの平均数を表す棒グラフ。ｎ＝４匹のＡＡＶ４−ＧＦＰマウス、ｎ＝４匹のＡＡＶ４−ＡＰＯＥ２マウス、ｎ＝６匹のＡＡＶ４−ＡＰＯＥ３マウス、およびｎ＝５匹のＡＡＶ４−ＡＰＯＥ４マウス。＊ｐ＜０．０５。 Ｔｇ２５７６マウスへの注射後のＩＳＦ中のオリゴマーＡβ種の変化。ＡＡＶ４−ＧＦＰ、ＡＡＶ４−ＡＰＯＥ２、ＡＡＶ４−ＡＰＯＥ３、およびＡＡＶ４−ＡＰＯＥ４を注射した後の、８２Ｅ１／８２Ｅ１ ＥＬＩＳＡアッセイを使用したＩＳＦのオリゴマーＡβの含有量の定量（ｏＡβ、ＧＦＰの注射を受けたマウスに対する％として）。ｎ＝３匹のＡＡＶ４−ＧＦＰマウス、ｎ＝３匹のＡＡＶ４−ＡＰＯＥ２マウス、ｎ＝５匹のＡＡＶ４−ＡＰＯＥ３マウス、およびｎ＝５匹のＡＡＶ４−ＡＰＯＥ４マウス。＊ｐ＜０．０５。 図２４Ａ〜２４Ｄ。ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおける、ＡＡＶ４−ＡＰＯＥを脳室内注射した後の、ヒトＡＰＯＥ ｍＲＮＡおよびタンパク質ならびに内因性マウスＡＰＯＥ ｍＲＮＡおよびタンパク質の検出。（Ａ）ＡＡＶ４−ＡＰＯＥまたはＡＡＶ４−ＧＦＰの注射を受けたマウスにおける、ヒト組換えＡｐｏＥタンパク質および内因性ＡｐｏＥタンパク質のウエスタンブロット分析。（Ｂ）注射を受けたマウスの脳内の内因性マウスａｐｏＥタンパク質の量を表すボックスブロットグラフ。ＡＡＶ４−ＡＰＯＥを注入した２カ月後または５カ月後に変化は検出されなかった。（Ｃ）ＧＡＰＤＨ転写物の量に対して正規化した内因性マウスＡＰＯＥ ｍＲＮＡの発現レベルを表すボックスブロットグラフ。（Ｄ）ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおける、ＡＡＶ４を脳室内注射した２カ月後と５カ月後のＡｐｏＥタンパク質のレベルの比較（ＡｐｏＥの注射を受けた全マウス由来の試料を２カ月および５カ月の時点で、ＡＰＯＥ変異体を識別せずに、まとめてプールした）。群当たりＮ＝４〜６匹の動物（詳細については材料および方法を参照されたい）。＊ｐ＜０．０５。 図２５Ａ〜２５Ｃ。短期間の曝露（２カ月）後の、各ＡｐｏＥアイソフォームに関連するＡβ病理に対する影響。（Ａ）皮質におけるアミロイド沈着の密度の立体解析により、早ければ注射の２カ月後に、ＡＰＯＥ４の過剰発現により斑の数の増加がもたらされることが明らかになったが、他の実験群の間では差異は観察できなかった。（Ｂ）他方では、Ｂａｍ１０染色とＴｈｉｏＳ染色の比は、異なる群の全ての間で変化しないままである。（Ｃ）異なるＡｐｏＥ変異体に短期間曝露した後の不溶性ギ酸抽出物中のＡβ４０ペプチド（左側のパネル）およびＡβ４２ペプチド（右側のパネル）の濃度の決定。ｎ＝４匹の、ＡＡＶ４−ＧＦＰの注射を受けたマウス、ｎ＝４匹の、ＡＡＶ４−ＡＰＯＥ２の注射を受けたマウス、ｎ＝６匹の、ＡＡＶ４−ＡＰＯＥ３の注射を受けたマウス、およびｎ＝５匹の、ＡＡＶ４−ＡＰＯＥ４の注射を受けたマウス。＊ｐ＜０．０５ 図２５Ａ〜２５Ｃ。短期間の曝露（２カ月）後の、各ＡｐｏＥアイソフォームに関連するＡβ病理に対する影響。（Ａ）皮質におけるアミロイド沈着の密度の立体解析により、早ければ注射の２カ月後に、ＡＰＯＥ４の過剰発現により斑の数の増加がもたらされることが明らかになったが、他の実験群の間では差異は観察できなかった。（Ｂ）他方では、Ｂａｍ１０染色とＴｈｉｏＳ染色の比は、異なる群の全ての間で変化しないままである。（Ｃ）異なるＡｐｏＥ変異体に短期間曝露した後の不溶性ギ酸抽出物中のＡβ４０ペプチド（左側のパネル）およびＡβ４２ペプチド（右側のパネル）の濃度の決定。ｎ＝４匹の、ＡＡＶ４−ＧＦＰの注射を受けたマウス、ｎ＝４匹の、ＡＡＶ４−ＡＰＯＥ２の注射を受けたマウス、ｎ＝６匹の、ＡＡＶ４−ＡＰＯＥ３の注射を受けたマウス、およびｎ＝５匹の、ＡＡＶ４−ＡＰＯＥ４の注射を受けたマウス。＊ｐ＜０．０５ 図２５Ａ〜２５Ｃ。短期間の曝露（２カ月）後の、各ＡｐｏＥアイソフォームに関連するＡβ病理に対する影響。（Ａ）皮質におけるアミロイド沈着の密度の立体解析により、早ければ注射の２カ月後に、ＡＰＯＥ４の過剰発現により斑の数の増加がもたらされることが明らかになったが、他の実験群の間では差異は観察できなかった。（Ｂ）他方では、Ｂａｍ１０染色とＴｈｉｏＳ染色の比は、異なる群の全ての間で変化しないままである。（Ｃ）異なるＡｐｏＥ変異体に短期間曝露した後の不溶性ギ酸抽出物中のＡβ４０ペプチド（左側のパネル）およびＡβ４２ペプチド（右側のパネル）の濃度の決定。ｎ＝４匹の、ＡＡＶ４−ＧＦＰの注射を受けたマウス、ｎ＝４匹の、ＡＡＶ４−ＡＰＯＥ２の注射を受けたマウス、ｎ＝６匹の、ＡＡＶ４−ＡＰＯＥ３の注射を受けたマウス、およびｎ＝５匹の、ＡＡＶ４−ＡＰＯＥ４の注射を受けたマウス。＊ｐ＜０．０５ 図２６Ａ〜２６Ｂ。Ｔｇ２５７６マウスにおいて、注射の３カ月後に検出された可溶性および不溶性Ａβ種の変化。（Ａ）ＩＳＦのＡβ４０およびＡβ４２含有量（the ISF content in Aβ40 and Aβ42）のＥＬＩＳＡによる定量により、ＡＡＶ４−ＡＰＯＥ４の注射後に、ＡＡＶ４−ＡＰＯＥ２、ＡＡＶ４−ＡＰＯＥ３およびＡＡＶ４−ＧＦＰと比較して可溶性アミロイドβペプチドの濃度が高くなる傾向があることが示される。（Ｂ）ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいて予め観察された通り、ＡｐｏＥ４を用いるとより強力な影響が観察され、Ｔｇ２５７６マウスのギ酸画分中のＡβ４２の量が有意に多くなる。ｎ＝３匹の、ＡＡＶ４−ＧＦＰの注射を受けたマウス、ｎ＝３匹の、ＡＡＶ４−ＡＰＯＥ２の注射を受けたマウス、ｎ＝５匹の、ＡＡＶ４−ＡＰＯＥ３の注射を受けたマウス、およびｎ＝５匹の、ＡＡＶ４−ＡＰＯＥ４の注射を受けたマウス。＊ｐ＜０．０５。
詳細な説明
いくつかの異なるヒトアポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）アイソフォームが存在し、これらのアイソフォームの一部が脳内に存在するとアルツハイマー病（ＡＤ）のリスクが上昇し、一方で、他のアイソフォームが存在するとＡＤのリスクが低下する。ＡｐｏＥ ε４アイソフォームの存在は、遅発性散発性ＡＤの強力な遺伝的リスク因子である。（Casellanoら、Sci Transl Med、３巻（８９号）：８９ｒａ５７頁（２０１１年６月２９日））。ＡｐｏＥ ε４対立遺伝子によりＡＤリスクが強力に上昇し、発症年齢が低下する。他方では、ＡｐｏＥ ε２対立遺伝子の存在により、ＡＤリスクが低下するようである。ヒトＡｐｏＥアイソフォームは、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるアミロイド−β（Ａβ）のクリアランスまたは合成に示差的に影響を及ぼすことが示唆される。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ科の小さな非病原性ウイルスである。ＡＡＶは、複製に関してヘルパーウイルスに依存することにより、この科の他のメンバーとは性質を異にしている。ヘルパーウイルスの不在下では、ＡＡＶは、遺伝子座に特異的な様式で第１９染色体のｑアームに組み込まれ得る。およそ５ｋｂのＡＡＶのゲノムは、正極性または負極性の一本鎖ＤＮＡの１つのセグメントからなる。ゲノムの末端は、ヘアピン構造に折り畳まれ得る短い末端逆位配列（inverted terminal repeat）であり、ウイルスＤＮＡ複製開始点として機能する。物理的には、パルボウイルスビリオンはエンベロープを有さず、その正二十面体（icosohedral）のカプシドは直径およそ２０ｎｍである。
これまで、血清学的に区別されるＡＡＶが８種同定されており、５種はヒトまたは霊長類から単離されたものであり、ＡＡＶ１型〜ＡＡＶ５型と称される。Govindasamyら、「Structurally Mapping the Diverse Phenotype of Adeno-Associated Virus Serotype 4」、J. Vir.、８０巻（２３号）：１１５５６〜１１５７０頁（２００６年）。ＡＡＶ２のゲノムは、４６８０ヌクレオチドの長さであり、２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有する。左側のＯＲＦは、一本鎖の後代ゲノムの産生に加えて複製および転写の調節に関与する非構造Ｒｅｐタンパク質であるＲｅｐ４０、Ｒｅｐ５２、Ｒｅｐ６８およびＲｅｐ７８をコードする。さらに、Ｒｅｐタンパク質のうちの２種は、ヒト第１９染色体のｑアームの領域へのＡＡＶゲノムの優先的な組み込みに関連している。Ｒｅｐ６８／７８は、ＮＴＰ結合活性ならびにＤＮＡおよびＲＮＡヘリカーゼ活性を有することも示されている。Ｒｅｐタンパク質は、核局在化シグナルならびにいくつかの潜在的なリン酸化部位を有する。これらのキナーゼ部位のうちの１つの変異により、複製活性が失われる。
ゲノムの末端は、ウイルスＤＮＡ複製開始点としての機能を果たす、Ｔ字形ヘアピン構造に折り畳まれる潜在性を有する短い末端逆位配列（ＩＴＲ）である。ＩＴＲ領域内に関しては、ＩＴＲの機能の中核をなす２つのエレメント、ＧＡＧＣ反復モチーフおよび末端分解能部位（ｔｒｓ）が記載されている。反復モチーフはＩＴＲが直鎖状またはヘアピンコンフォメーションのどちらかにある場合にＲｅｐと結合することが示されている。この結合は、部位特異的かつ鎖特異的な様式で起こるｔｒｓにおける切断のためにＲｅｐ６８／７８を位置付けるのに役立つ。これらの２つのエレメントは、複製におけるそれらの役割に加えて、ウイルス組み込みの中核をなすようである。第１９染色体組み込み遺伝子座内にはＲｅｐ結合部位がｔｒｓに隣接して含有される。これらのエレメントは、機能性であり、遺伝子座に特異的な組み込みに必要であることが示されている。
ＡＡＶ２ビリオンは、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３と称される３種の関連するタンパク質からなる、エンベロープを有さない、直径およそ２５ｎｍの正二十面体の粒子である。右側のＯＲＦは、カプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３をコードする。これらのタンパク質はそれぞれ１：１：１０の比で見いだされ、全て右側のＯＲＦに由来する。カプシドタンパク質は、オルタナティブスプライシングおよび普通でない開始コドンを使用することにより、互いとは異なる。欠失分析から、選択的にスプライシングされたメッセージから翻訳されるＶＰ１の除去または変更により感染性粒子の収量が減少することが示された。ＶＰ３コード領域内の変異により、いかなる一本鎖の後代ＤＮＡまたは感染性粒子の産生もできなくなる。ＡＡＶ２粒子はＡＡＶ２カプシドタンパク質を含むウイルス粒子である。ＡＡＶ２カプシドポリペプチドは、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３ポリペプチドの全体をコードし得る。粒子は、ＡＡＶ２および他のＡＡＶカプシドタンパク質を含む粒子（すなわち、ＡＡＶ４およびＡＡＶ２などのキメラタンパク質）であってよい。本明細書では、結果得られるＡＡＶ２カプシドを含むウイルス粒子が、標準の方法によって常套的に決定することができる通り、抗原としてまたは免疫学的にＡＡＶ４とは性質が異なったままである限りは、ＡＡＶ２カプシドタンパク質のアミノ酸配列のバリエーションが意図されている。詳細には、例えば、ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロットを使用して、ウイルス粒子が抗原としてまたは免疫学的にＡＡＶ４と性質を異にするかどうかを決定することができる。さらに、ＡＡＶ２ウイルス粒子は、ＡＡＶ４とは別個の組織トロピズムを保持することが好ましい。
ＡＡＶ２粒子は、ＡＡＶ２カプシドタンパク質を含むウイルス粒子である。ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３ポリペプチドの全体をコードするＡＡＶ２カプシドポリペプチドは、全体的に、配列番号１に記載されているヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＡＡＶ２カプシドタンパク質）に対して少なくとも約６３％の相同性（または同一性）を有するものであってよい。カプシドタンパク質は、配列番号１に記載されているタンパク質に対して約７０％の相同性、約７５％の相同性、８０％の相同性、８５％の相同性、９０％の相同性、９５％の相同性、９８％の相同性、９９％の相同性、または、さらには１００％の相同性を有するものであってよい。カプシドタンパク質は、配列番号１に記載されているタンパク質に対して約７０％の同一性、約７５％の同一性、８０％の同一性、８５％の同一性、９０％の同一性、９５％の同一性、９８％の同一性、９９％の同一性、または、さらには１００％の同一性を有するものであってよい。粒子は、ＡＡＶ４カプシドタンパク質とＡＡＶ２カプシドタンパク質を両方含む粒子、すなわち、キメラタンパク質であってよい。本明細書では、結果得られるＡＡＶ２カプシドを含むウイルス粒子が、標準の方法によって常套的に決定することができる通り、抗原としてまたは免疫学的にＡＡＶ４とは性質が異なったままである限りは、ＡＡＶ２カプシドタンパク質のアミノ酸配列のバリエーションが意図されている。詳細には、例えば、ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロットを使用して、ウイルス粒子が抗原としてまたは免疫学的にＡＡＶ４と性質を異にするかどうかを決定することができる。さらに、ＡＡＶ２ウイルス粒子は、本明細書の実施例において例示されているものなどの、ＡＡＶ４とは別個の組織トロピズムを保持することが好ましいが、少なくとも１つのＡＡＶ２コートタンパク質を含むＡＡＶ２キメラ粒子は、ＡＡＶ２コートタンパク質のみからなるＡＡＶ２粒子のものとは異なる組織トロピズムを有してよい。
図６Ａおよび６Ｂに示されている通り、ＡＡＶ２カプシド配列とＡＡＶ４カプシド配列は約６０％相同である。ある特定の実施形態では、ＡＡＶ２カプシドは、配列番号１に記載されているアミノ酸配列と少なくとも６５％相同である配列を含む（またはそれからなる）。
ある特定の実施形態では、本発明は、ＡＡＶ２末端逆位配列の対を含むベクターを含有する、すなわち、カプシド内に包含する（encapsidating）ＡＡＶ２粒子をさらに提供する。ＡＡＶ２ ＩＴＲのヌクレオチド配列は当技術分野で公知である。さらに、粒子は、ＡＡＶ４カプシドタンパク質とＡＡＶ２カプシドタンパク質を両方含む粒子、すなわち、キメラタンパク質であってよい。さらに、粒子は、他のＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ１〜ＡＡＶ８）由来のＡＡＶ末端逆位配列の対を含むベクターをカプシド内に包含する粒子であってよい。粒子においてカプシド内に包含されるベクターは、末端逆位配列の間に挿入された外因性核酸をさらに含んでよい。
ＡＡＶは、以下の特徴により、遺伝子移入に関して魅力的なベクターになっている。ＡＡＶベクターは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて細胞のゲノムに安定に組み込まれること、広宿主域を有すること、分裂細胞と非分裂細胞のどちらもｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおいて形質導入し、形質導入された遺伝子の高レベルの発現を維持することが示されている。ウイルス粒子は、熱安定性であり、溶媒、界面活性剤、ｐＨの変化、温度に対して抵抗性であり、また、ＣｓＣｌ勾配で濃縮することができる。ＡＡＶプロウイルスの組み込みには、細胞の成長または分化に対する長期にわたる負の影響はいかなるものも付随しない。ＩＴＲは、複製、パッケージングおよび組み込みのために必要な唯一のシスエレメントであることが示されており、いくつかのプロモーター活性を有し得る。
本発明は、ＡＡＶ粒子、組換えＡＡＶベクター、および組換えＡＡＶビリオンを投与する方法を提供する。例えば、ＡＡＶ２粒子はＡＡＶ２カプシドタンパク質を含むウイルス粒子である、または、ＡＡＶ４粒子は、ＡＡＶ４カプシドタンパク質を含むウイルス粒子である。組換えＡＡＶ２ベクターは、ＡＡＶ２に独特の核酸を少なくとも１つ含む核酸構築物である。組換えＡＡＶ２ビリオンは、組換えＡＡＶ２ベクターを含有する粒子である。用語「ＡＡＶ２ ＩＴＲ」の範囲内に入るとみなされるためには、ヌクレオチド配列は、本明細書に記載されている、ＡＡＶ２ ＩＴＲとＡＡＶ４ ＩＴＲとを区別する特徴の一方または両方を保持しなければならない：（１）３つ（ＡＡＶ４の場合のように４つではなく）の「ＧＡＧＣ」反復および（２）ＡＡＶ２ ＩＴＲ Ｒｅｐ結合部位において、最初の２つの「ＧＡＧＣ」反復の第４のヌクレオチドがＴではなくＣである。
プロモーターは、プロモーターに機能的に連結した核酸の発現レベルおよびベクターを使用する細胞型などの、公知の考察によって選択された任意の所望のプロモーターであってよい。プロモーターは、外因性プロモーターであっても内因性プロモーターであってもよい。プロモーターとしては、例えば、ＳＶ４０もしくは誘導性メタロチオネインプロモーターなどの公知の強力なプロモーター、またはＡＡＶ ｐ５プロモーターなどのＡＡＶプロモーターを挙げることができる。プロモーターのさらなる例としては、アクチン遺伝子、免疫グロブリン遺伝子、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、アデノウイルス主要後期プロモーターなどのアデノウイルスプロモーター、誘導性熱ショックプロモーター、呼吸器合胞体ウイルス、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）などに由来するプロモーターが挙げられる。詳細には、プロモーターは、ＡＡＶ２ ｐ５プロモーターまたはＡＡＶ４ ｐ５プロモーターであってよい。さらに、プロモーター活性を保持するｐ５プロモーターの小さな断片を、例えば、ｐ５プロモーターにおいて一連の欠失を構築し、欠失をレポーター遺伝子に連結し、レポーター遺伝子が発現するかどうか、すなわち、転写および／または翻訳されるかどうかを決定することを含めた標準の手順によって容易に決定することができる。
ＡＡＶベクターは、プロモーターに機能的に連結した外因性（異種性）核酸をさらに含んでよい。「異種核酸」とは、任意の異種性または外因性核酸を細胞、組織または生物体への移入のためにベクターに挿入することができることを意味する。例えば、ある特定の実施形態では、異種核酸は、保護性ＡｐｏＥアイソフォームをコードする。「機能的に連結した」とは、当技術分野で公知の通り、プロモーターにより異種核酸の発現が促進され得るような、例えば、異種核酸に対するプロモーターの適切な配向などを意味する。さらに、異種核酸は、機能的にコードするため、すなわち、核酸の発現を可能にするために、当技術分野で公知の核酸を発現させるための適切な配列を全て有することが好ましい。核酸は、例えば、エンハンサーなどの発現制御配列、ならびに、リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写ターミネーター配列などの必要な情報処理部位を含んでよい。核酸は、２つ以上の遺伝子産物をコードしてよく、パッケージング可能な核酸のサイズによってのみ限定される。
ＡＡＶ２粒子は、ＡＡＶ２カプシドタンパク質を含むウイルス粒子である。本明細書では、結果得られるＡＡＶ２カプシドを含むウイルス粒子が、標準の方法によって常套的に決定することができる通り、抗原としてまたは免疫学的にＡＡＶ４とは性質が異なったままである限りは、ＡＡＶ２カプシドタンパク質のアミノ酸配列のバリエーションが意図されている。詳細には、例えば、ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロットを使用して、ウイルス粒子が抗原としてまたは免疫学的に他のＡＡＶ血清型と性質を異にするかどうかを決定することができる。
ＡＡＶ４は、ＡＡＶファミリーの独特のメンバーである。ＡＡＶ４に関する考察は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，４６８，５２４号において提供される。ＤＮＡのハイブリダイゼーションデータにより、ＡＡＶ１〜４に関して同様のレベルの相同性が示された。しかし、他のＡＡＶとは対照的に、ＡＡＶ４ではカプシドタンパク質に対応するただ１つのＯＲＦが同定され、Ｒｅｐタンパク質に対するＯＲＦは検出されなかった。本発明は、ＡＡＶ４ウイルスを含むベクターならびにＡＡＶ４ウイルス粒子を提供する。ＡＡＶ４はＡＡＶ２と類似しているが、この２つのウイルスは、本明細書では、物理的かつ遺伝的に別のものであることが見いだされる。これらの差は、ＡＡＶ４に、遺伝子療法用のベクターとしてより適したものになるいくつかの独特の利点を付与するものである。例えば、野生型ＡＡＶ４ゲノムはＡＡＶ２よりも大きく、より大きな組換えゲノムを効率的にカプシド内に包含することが可能になる。さらに、野生型ＡＡＶ４粒子は、ＡＡＶ２粒子よりも浮遊密度が大きく、したがって、ＡＡＶ２に基づく粒子よりも容易に、混入したヘルパーウイルスおよび空のＡＡＶ粒子から分離される。さらに、ＡＡＶ１、２、および３とは対照的に、ＡＡＶ４は、ヒト、モルモット、およびヒツジの赤血球を凝集させることが可能である。
ある特定の実施形態では、本発明は、ＡＡＶ５ウイルスを含むベクターまたは該ウイルスのサブパートを含むベクター、ならびにＡＡＶ５ウイルス粒子を提供する。ＡＡＶ５に関する考察は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，８５５，３１４号において提供される。ＡＡＶ５はＡＡＶ２と類似しているが、この２つのウイルスは、本明細書では物理的かつ遺伝的に別のものであることが見いだされる。これらの差は、ＡＡＶ５に、遺伝子療法用のベクターとしてより適したものになるいくつかの独特の特性および利点を付与するものである。例えば、ＡＡＶ２の遺伝子療法用のベクターとしての使用を限定する特徴の１つは、大量のウイルスの産生である。標準の産生技法を使用すると、ＡＡＶ５はＡＡＶ２と比較して１０〜５０倍高いレベルで産生される。その独特のＴＲＳ部位およびｒｅｐタンパク質に起因して、ＡＡＶ５はＡＡＶ２と比較して別個の組み込み遺伝子座も有するはずである。
さらに、ＡＡＶ５カプシドタンパク質は、重ねて驚いたことに、ＡＡＶ２カプシドタンパク質と性質を異にし、異なる組織トロピズムを示し、したがって、ＡＡＶ５カプシドを含有する粒子が、ＡＡＶ２が適さないまたはあまり適さない細胞型を形質導入するのに適したものになる。ＡＡＶ２とＡＡＶ５は血清学的に別のものであることが示されており、したがって、遺伝子療法への適用では、ＡＡＶ５およびＡＡＶ５由来のベクターにより、自然免疫防御の結果としてか、またはＡＡＶ２ベクターへの以前の曝露によってＡＡＶ２に対する中和抗体をすでに有する患者への形質導入が可能になる。ＡＡＶ５の別の利点は、ＡＡＶ５が他の血清型によって救済され得ないことである。ＡＡＶ５のみが組み込まれたＡＡＶ５ゲノムを救済し、複製をもたらすことができ、したがって、他のＡＡＶ血清型によって引き起こされる、意図されたものではないＡＡＶ５の複製が回避される。
「ポリペプチド」という用語は、本明細書で使用される場合、アミノ酸のポリマーを指し、全長タンパク質およびその断片を包含する。したがって、「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」は、本明細書では互換的に使用されることが多い。置換は、中性になるように公知のパラメータによって選択することができる。当業者には理解されるように、本発明は、アミノ酸配列または他の特性にわずかなバリエーションを有するポリペプチドも包含する。そのようなバリエーションは、対立遺伝子バリエーションとして（例えば遺伝的多型に起因する）天然に生じたものであってもよく、人為的な介入（例えば、クローニングしたＤＮＡ配列の変異誘発）によって生じさせたもの、例えば、誘導された点変異体、欠失変異体、挿入変異体および置換変異体などであってもよい。アミノ酸配列の軽微な変化、例えば、保存的アミノ酸の置き換え、小さな内部の欠失または挿入、および分子の末端における付加または欠失などが一般に好ましい。これらの修飾により、アミノ酸配列の変化がもたらされるか、サイレント変異がもたらされるか、制限部位が修飾されるか、または他の特定の変異がもたらされ得る。
本方法は、核酸を細胞に送達する方法であって、細胞に、ＡＡＶ末端逆位配列（ＩＴＲ）の対の間または１つもしくは複数のＡＡＶ ＩＴＲの隣に挿入された核酸を含むベクターを含有するＡＡＶ粒子を投与し、それにより、核酸を細胞に送達するステップを含む方法を提供する。細胞への投与は、任意選択で組織培養培地または緩衝食塩溶液などの所望の液体に含有された粒子を細胞と単に接触させることを含めた、任意の手段によって実現することができる。粒子を任意の所望の長さの時間にわたって細胞と接触させたままにすることができ、また、一般には、粒子を投与し、無期限にそのままにすることができる。そのようなｉｎ ｖｉｔｒｏにおける方法に関して、ウイルスは、当技術分野で公知のおよび本明細書において例示されている標準のウイルス形質導入方法によって細胞に投与することができる。投与されるウイルスの力価は、特に細胞型に応じて変動し得るが、一般にＡＡＶ形質導入のために使用される力価が典型的である。さらに、本実施例において特定の細胞を形質導入するために使用される力価を利用することができる。細胞は、ヒトならびに霊長類、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、およびイヌなどの他の大きな（非げっ歯類）哺乳動物の任意の所望の細胞を含んでよい。
より詳細には、本発明は、核酸を上衣細胞に送達する方法であって、上衣細胞に、ＡＡＶ末端逆位配列（ＩＴＲ）の対の間または１つもしくは複数のＡＡＶ ＩＴＲの隣に挿入された核酸を含むベクターを含有するＡＡＶ粒子を投与し、それにより、核酸を上衣細胞に送達するステップを含む方法を提供する。
本発明は、核酸を被験体に送達する方法であって、被験体由来の細胞に、ＡＡＶ末端逆位配列（ＩＴＲ）の対の間または１つもしくは複数のＡＡＶ ＩＴＲの隣に挿入された核酸を含むＡＡＶ粒子を投与するステップと、細胞を被験体に戻し、それにより、核酸を被験体に送達するステップとを含む方法も包含する。ある特定の実施形態では、ＡＡＶ ＩＴＲはＡＡＶ２ ＩＴＲであってよい。そのようなｅｘ ｖｉｖｏにおける投与に関しては、細胞を、被験体から細胞型に応じた標準の手段によって単離し、また再度細胞型に応じた適切な培養培地に入れる。次いで、ウイルス粒子を上記の通り細胞と接触させ、ウイルスを細胞にトランスフェクトさせる。次いで、細胞を、再度、細胞型および組織についての標準の手段によって被験体の体内に移植し戻すことができる。所望であれば、移植前に、細胞を、ウイルスによるトランスフェクションの程度について、公知の検出手段によって、本明細書に記載の通りに研究することができる。
本発明は、核酸を被験体内の細胞に送達する方法であって、被験体に、ＡＡＶ末端逆位配列（ＩＴＲ）の対の間または１つもしくは複数のＡＡＶ ＩＴＲの隣に挿入された核酸を含むＡＡＶ粒子を投与し、それにより、核酸を被験体内の細胞に送達するステップを含む方法をさらに提供する。投与は、上に列挙されている細胞のいずれかなどの被験体から取り出された細胞に直接ｅｘ ｖｉｖｏで投与し、その後、細胞を被験体に戻して置き換えることであってもよく、投与は被験体内の細胞へのｉｎ ｖｉｖｏ投与であってもよい。ｅｘ ｖｉｖｏにおける投与に関しては、細胞を、被験体から細胞型に応じた標準の手段によって単離し、また再度細胞型に応じた適切な培養培地に入れる。次いで、ウイルス粒子を上記の通り細胞と接触させ、ウイルスを細胞にトランスフェクトさせる。次いで、細胞を、再度、細胞型および組織についての標準の手段によって被験体の体内に移植し戻すことができる。所望であれば、移植前に、細胞を、ウイルスによるトランスフェクションの程度について、公知の検出手段によって、本明細書に記載の通りに研究することができる。
核酸を被験体内の上衣細胞に送達する方法であって、被験体に、ＡＡＶ末端逆位配列（ＩＴＲ）の対の間または１つもしくは複数のＡＡＶ ＩＴＲの隣に挿入された核酸を含むＡＡＶ粒子を投与し、それにより、核酸を被験体内の上衣細胞に送達するステップを含む方法も提供される。
ある特定の実施形態では、脳血管内皮を標的とするアミノ酸配列は、疾患、例えば、アルツハイマー病を有する被験体における脳血管内皮を標的とする。
ある特定の実施形態では、脳血管内皮を標的とするアミノ酸配列は、アルツハイマー病を有さない被験体における脳血管内皮を標的とする。
ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、治療用作用物質（therapeutic agent）をコードする核酸配列を含む。ある特定の実施形態では、治療用作用物質は、保護性ＡｐｏＥアイソフォームである。
本開示のある特定の実施形態は、本明細書に記載のウイルスベクターを含む細胞を提供する。
ある特定の実施形態では、細胞は、非げっ歯類哺乳動物の哺乳動物細胞である。ある特定の実施形態では、細胞は、霊長類細胞である。ある特定の実施形態では、細胞はヒト細胞である。ある特定の実施形態では、細胞は非ヒト細胞である。ある特定の実施形態では、細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏのものである。ある特定の実施形態では、細胞はｉｎ ｖｉｖｏのものである。ある特定の実施形態では、細胞は上衣細胞である。
本開示のある特定の実施形態は、哺乳動物における疾患を処置する方法であって、本明細書に記載のウイルスベクターまたは細胞を哺乳動物に投与するステップを含む方法を提供する。
ある特定の実施形態では、哺乳動物はヒトである。
本開示のある特定の実施形態は、作用物質を被験体の中枢神経系に送達する方法であって、ＣＳＦに本明細書に記載のウイルスベクターを投与し、それにより、形質導入された上衣細胞が治療用作用物質を発現し、当該作用物質を被験体の中枢神経系に送達するステップを含む方法を提供する。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターで上衣細胞に形質導入する。
本開示のある特定の実施形態は、医学的処置において使用するための、本明細書に記載のウイルスベクターまたは細胞を提供する。
本開示のある特定の実施形態は、哺乳動物における疾患、例えば、アルツハイマー病を処置するのに有用な医薬を調製するための、本明細書に記載のウイルスベクターまたは細胞の使用を提供する。
ベクターは、保護性ＡｐｏＥアイソフォームタンパク質をさらに含んでよい。本明細書で使用される場合、「分泌タンパク質」という用語は、天然に分泌されるものであるか、分泌可能になるようにシグナル配列を含有するよう改変されたのであるかにかかわらず任意の分泌タンパク質を包含する。
核酸は、別の核酸配列と機能性関係に配置されている場合、「作動可能に連結」している。一般に、「作動可能に連結」とは、連結するＤＮＡ配列が近接していることを意味する。しかし、エンハンサーは近接している必要はない。連結は、都合のよい制限部位におけるライゲーションによって実現される。そのような部位が存在しない場合には、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを従来の実施に従って使用する。さらに、酵素をコードする核酸の複数のコピーを発現ベクター内に合わせて連結することができる。そのような複数の核酸は、リンカーによって分離されていてもよい。
本開示は、本明細書に記載のベクターを含有する哺乳動物細胞も提供する。細胞は、ヒト細胞であってよく、また、脳に由来するものであってよい。細胞型は、幹細胞集団または前駆細胞集団であってよい。
本開示は、哺乳動物における遺伝子疾患またはがんなどの疾患を、本明細書に記載のポリヌクレオチド、ポリペプチド、発現ベクター、または細胞を投与することによって処置する方法を提供する。遺伝子疾患は、アルツハイマー病などの神経変性疾患であってよい。
本開示のある特定の態様は、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ベクター、および遺伝子操作された細胞（ｉｎ ｖｉｖｏにおいて改変されたもの）、ならびにそれらの使用に関する。具体的には、本開示は、治療有効用量の治療用作用物質を全身送達することが可能な遺伝子療法またはタンパク質療法のための方法に関する。
一態様によると、哺乳動物レシピエントにおいて治療用作用物質を発現させるための細胞発現系が提供される。発現系（本明細書では「遺伝子改変細胞」とも称される）は、細胞と、治療用作用物質を発現させるための発現ベクターとを含む。発現ベクターとしては、これらに限定されないが、異種遺伝物質を細胞に送達するためのウイルス、プラスミド、および他のビヒクルが挙げられる。したがって、「発現ベクター」という用語は、本明細書で使用される場合、異種遺伝物質を細胞に送達するためのビヒクルを指す。具体的には、発現ベクターは、組換えアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターである。
発現ベクターは、異種遺伝子の転写を制御するためのプロモーターをさらに含む。プロモーターは、誘導性プロモーター（下記）であってよい。発現系は、哺乳動物レシピエントへの投与に適するものである。発現系は、複数の非不死化遺伝子改変細胞を含んでよく、各細胞が少なくとも１つの治療用作用物質をコードする少なくとも１つの組換え遺伝子を含有する。
細胞発現系は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて形成することができる。さらに別の態様によると、哺乳動物レシピエントをｉｎ ｖｉｖｏにおいて処置するための方法が提供される。当該方法は、異種遺伝子産物を発現させるための発現ベクターを患者の細胞にｉｎ ｓｉｔｕで、静脈内投与によってなどで導入するステップを含む。発現系をｉｎ ｖｉｖｏで形成するために、治療用作用物質を発現させるための発現ベクターをｉｎ ｖｉｖｏで哺乳動物レシピエントに静脈内導入し、ベクターが脈管構造を介して脳に移動する。
さらに別の態様によると、哺乳動物レシピエントをｉｎ ｖｉｖｏにおいて処置するための方法が提供される。当該方法は、標的タンパク質を患者にｉｎ ｖｉｖｏで導入するステップを含む。
異種遺伝子を発現させるための発現ベクターは、異種遺伝子産物の転写を制御するための誘導性プロモーターを含んでよい。したがって、ｉｎ ｓｉｔｕにおける治療用作用物質の送達は、細胞をｉｎ ｓｉｔｕにおいて、異種遺伝子の転写が誘導される条件に曝露することによって制御される。
哺乳動物レシピエントは、遺伝子置換療法を受けることができる状態を有してよい。本明細書で使用される場合、「遺伝子置換療法」とは、レシピエントに治療用作用物質をコードする外因性遺伝物質を投与し、その後、投与した遺伝物質をｉｎ ｓｉｔｕで発現させることを指す。したがって、「遺伝子置換療法を受けることができる状態」という句は、遺伝子疾患（すなわち、１つまたは複数の遺伝子欠損に起因する疾患状態）、後天性の病態（すなわち、先天的な欠損に起因しない病的状態）、がん、および予防プロセス（すなわち、疾患の予防または望ましくない医学的状態の予防）を包含する。したがって、本明細書で使用される場合、「治療用作用物質」という用語は、哺乳動物レシピエントに対して有益な効果を有する任意の作用物質または物質を指す。したがって、「治療用作用物質」は、核酸成分またはタンパク質成分を有する、治療用分子と予防用分子の両方を包含する。
一実施形態によると、哺乳動物レシピエントは遺伝子疾患を有し、外因性遺伝物質は当該疾患を処置するための治療用作用物質をコードする異種遺伝子を含む。さらに別の実施形態では、哺乳動物レシピエントは後天性の病態を有し、外因性遺伝物質は当該病態を処置するための治療用作用物質をコードする異種遺伝子を含む。別の実施形態によると、患者はがんを有し、外因性遺伝物質は抗新生物剤をコードする異種遺伝子を含む。さらに別の実施形態では、患者は望ましくない医学的状態を有し、外因性遺伝物質は当該状態を処置するための治療用作用物質をコードする異種遺伝子を含む。
本明細書で使用される場合、「保護性ＡｐｏＥアイソフォーム」という用語は、このポリペプチドの変異体または生物学的活性もしくは不活性断片を包含する。ポリペプチドの１つの「変異体」は、ネイティブなタンパク質と完全には同一でないポリペプチドである。そのような変異体タンパク質は、１つまたは複数のアミノ酸の挿入、欠失または置換によりアミノ酸配列を変更することによって得ることができる。タンパク質のアミノ酸配列を、例えば置換によって改変して、ネイティブなポリペプチドと比較して実質的に同じまたは改善された品質を有するポリペプチドを作製する。置換は、保存された置換であってよい。「保存された置換」とは、アミノ酸の、同様の側鎖を有する別のアミノ酸での置換である。保存された置換は、アミノ酸の電荷またはアミノ酸の側鎖のサイズ（あるいは、側鎖内の化学基のサイズ、電荷または種類）の可能性のある最小の変化をもたらすアミノ酸での置換であり、それにより、ペプチド全体は、その空間的コンフォメーションを保持するが、生物学的活性は変更されている。例えば、共通の保存された変化は、ＡｓｐからＧｌｕ、ＡｓｎまたはＧｌｎ；ＨｉｓからＬｙｓ、ＡｒｇまたはＰｈｅ；ＡｓｎからＧｌｎ、ＡｓｐまたはＧｌｕ、およびＳｅｒからＣｙｓ、ＴｈｒまたはＧｌｙであり得る。アラニンは他のアミノ酸を置換するために一般に使用される。２０種の必須アミノ酸は、以下の通り群分けすることができる：非極性側鎖を有するアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニン；無電荷極性側鎖を有するグリシン、セリン、トレオニン、シスチン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミン；酸性側鎖を有するアスパラギン酸およびグルタミン酸；ならびに塩基性側鎖を有するリシン、アルギニン、およびヒスチジン。
アミノ酸の変化は、対応する核酸配列のコドンを変化させることによって実現される。そのようなポリペプチドは、生物学的活性を改変または改善するために、ある特定のアミノ酸でポリペプチド構造内の他のアミノ酸を置換することに基づいて得ることができることが公知である。例えば、代替アミノ酸の置換を通じて小さなコンフォメーションの変化をポリペプチドに付与することができ、その結果、活性の増加がもたらされる。あるいは、ある特定のポリペプチドにおいてアミノ酸置換を使用して残基をもたらすことができ、次いでそれを他の分子と連結して、他の目的ために有用である出発ポリペプチドの十分な特性を保持する、ペプチド−分子コンジュゲートをもたらすことができる。
ポリペプチドへの相互作用的な生物学的機能の付与においてアミノ酸の疎水性親水性指標を使用することができ、ここで、ある特定のアミノ酸は同様の疎水性親水性指標を有する他のアミノ酸を置換することができ、それでも同様の生物学的活性を保持できることがわかる。あるいは、似ているアミノ酸の置換は、特にポリペプチドに生じさせることが所望される生物学的機能が免疫学的実施形態における使用について意図される場合に、親水性に基づいて行うことができる。「タンパク質」の最大局所平均親水性は、その隣接アミノ酸の親水性によって支配されるので、その免疫原性と相関する。したがって、置換は、各アミノ酸に割り当てられた親水性に基づいて行うことができることに留意する。
各アミノ酸に値を割り当てる親水性指標または疎水性親水性指標のいずれかの使用では、これらの値が±２になるアミノ酸の置換を行うことが好ましく、±１になることが特に好ましく、±０．５になることが最も好ましい置換である。
変異体タンパク質は、対応するネイティブなタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも５０％、少なくとも約８０％、または、さらには少なくとも約９０％であるが１００％未満の、連続したアミノ酸配列の相同性または同一性を有する。
変異体ポリペプチドのアミノ酸配列は、ネイティブなポリペプチドのアミノ酸配列に基本的に対応する。本明細書で使用される場合、「に基本的に対応する」とは、ネイティブなタンパク質によって生じる応答と実質的に同じ生物学的応答を引き出すポリペプチド配列を指す。そのような応答はネイティブなタンパク質によって生じるレベルの少なくとも６０％であり得、さらにはネイティブなタンパク質によって生じるレベルの少なくとも８０％であり得る。
変異体は、対応するネイティブなタンパク質には存在しないアミノ酸残基または対応するネイティブなタンパク質に対する欠失を含んでよい。変異体は、対応するネイティブなタンパク質と比較して先端が切断された「断片」、すなわち、全長タンパク質のほんの一部であってもよい。タンパク質変異体は、少なくとも１つのＤ−アミノ酸を有するペプチドも包含する。
変異体タンパク質は、変異体タンパク質をコードする単離されたＤＮＡ配列から発現させることができる。「組換え体」とは、遺伝子工学のプロセスによって作製されるペプチドまたは核酸と定義される。遺伝暗号における重複性に起因して、コドン内の個々のヌクレオチドは容易に交換され得、それでも同一のアミノ酸配列をもたらすことができることは当技術分野で周知であることに留意するべきである。「タンパク質」、「ペプチド」および「ポリペプチド」という用語は、本明細書では互換的に使用される。
本開示は、発現ベクターを細胞または患者に投与することによって哺乳動物における疾患を処置する方法を提供する。遺伝子療法の方法に関して、分子生物学および遺伝子療法の当業者は、過度な実験を伴わずに、本開示の新規方法において使用する発現ベクターの適切な投与量および投与経路を決定することができる。
一実施形態によると、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて細胞を形質転換するまたは他のやり方で遺伝子改変する。哺乳動物レシピエント由来の細胞を、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、治療用作用物質をコードする異種（例えば、組換え）遺伝子を発現させるための外因性遺伝物質を含有するベクターを用いて形質転換（すなわち、形質導入またはトランスフェクト）し、治療用作用物質をｉｎ ｓｉｔｕにおいて送達する。
本明細書で使用される場合、「外因性遺伝物質」とは、細胞内に天然には見いだされない、または細胞内に天然に見いだされる場合には細胞により生物学的に有意なレベルで転写も発現もされない、天然または合成の核酸またはオリゴヌクレオチドを指す。したがって、「外因性遺伝物質」は、例えば、アンチセンスＲＮＡに転写され得る天然に存在しない核酸、ならびに「異種遺伝子」（すなわち、天然に存在する同じ型の細胞において発現しないまたは生物学的に有意でないレベルで発現するタンパク質をコードする遺伝子）を含む。
ある特定の実施形態では、哺乳動物レシピエントは、遺伝子置換療法を受けることができる状態を有する。本明細書で使用される場合、「遺伝子置換療法」とは、レシピエントに治療用作用物質をコードする外因性遺伝物質を投与し、その後、投与した遺伝物質をｉｎ ｓｉｔｕで発現させることを指す。したがって、「遺伝子置換療法を受けることができる状態」という句は、遺伝子疾患（すなわち、１つまたは複数の遺伝子欠損に起因する疾患状態）、後天性病態（すなわち、先天的な欠損に起因しない病的状態）、がん、および予防プロセス（すなわち、疾患の予防または望ましくない医学的状態の予防）などの状態を包含する。したがって、本明細書で使用される場合、「治療用作用物質」という用語は、哺乳動物レシピエントに対する有益な効果を有する任意の作用物質または材料を指す。したがって、「治療用作用物質」は、核酸成分（例えば、アンチセンスＲＮＡ）および／またはタンパク質成分を有する、治療用分子と予防用分子の両方を包含する。
あるいは、遺伝子置換療法を受けることができる状態は、予防プロセス、すなわち、疾患または望ましくない医学的状態を予防するためのプロセスである。したがって、本開示は、予防機能を有する治療用作用物質（すなわち、予防剤）を哺乳動物レシピエントに送達するための細胞発現系を包含する。
要約すると、「治療用作用物質」という用語は、これらに限定されないが、上に列挙されている状態に関連する作用物質ならびにそれらの機能的等価物を含む。本明細書で使用される場合、「機能的等価物」という用語は、哺乳動物レシピエントに対して、機能的等価物とみなされる治療用作用物質と同じまたは改善された有益な効果を有する分子（例えば、ペプチドまたはタンパク質）を指す。
上で開示されている、治療用作用物質および遺伝子置換療法を受けることができる状態は、ただ単に例示的なものであり、本開示の範囲を限定するものではない。公知の状態を処置するための適切な治療用作用物質の選択は、過度な実験を伴わずに、当業者の範囲内であるとみなされる。
ＡＡＶベクター
一実施形態では、本開示のウイルスベクターはＡＡＶベクターである。「ＡＡＶ」ベクターとは、アデノ随伴ウイルスを指し、天然に存在する野生型ウイルス自体またはその誘導体を指すために使用することができる。この用語は、別の必要がある場合を除き、亜型、血清型およびシュードタイプの全てを包含し、天然に存在するものと組換え型のものをどちらも包含する。本明細書で使用される場合、「血清型」という用語は、定義済みの抗血清とのカプシドタンパク質の反応性に基づいて同定され、他のＡＡＶと区別されるＡＡＶを指し、例えば、霊長類ＡＡＶの血清型は、ＡＡＶ−１〜ＡＡＶ−８の８種が公知である。例えば、血清型ＡＡＶ２は、ＡＡＶ２のｃａｐ遺伝子によりコードされるカプシドタンパク質と、同じＡＡＶ２血清型に由来する５’および３’ＩＴＲ配列を含有するゲノムとを含有するＡＡＶを指すために使用される。本明細書で使用される場合、例えば、ｒＡＡＶは、同じ血清型に由来するカプシドタンパク質と５’−３’ＩＴＲとの両方を有するＡＡＶを指すために使用することができ、１つの血清型に由来するカプシドタンパク質と、異なるＡＡＶ血清型に由来する５’−３’ＩＴＲとを有する、例えば、ＡＡＶ血清型２に由来するカプシドとＡＡＶ血清型５に由来するＩＴＲとを有するＡＡＶを指す場合もある。本明細書において例示されている各例に関して、ベクターの設計および作製についての記載では、カプシドの血清型および５’−３’ＩＴＲ配列について記載されている。「ｒＡＡＶ」という略語は、組換えＡＡＶベクター（または「ｒＡＡＶベクター」）とも称される、組換えアデノ随伴ウイルスを指す。
「ＡＡＶウイルス」または「ＡＡＶウイルス粒子」とは、少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質（好ましくは野生型ＡＡＶのカプシドタンパク質の全て）と、カプシド内に包含されるポリヌクレオチドとで構成されるウイルス粒子を指す。粒子が異種ポリヌクレオチド（すなわち、哺乳動物細胞に送達される導入遺伝子などの、野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド）を含む場合、それは一般的には「ｒＡＡＶ」と称される。
一実施形態では、ＡＡＶ発現ベクターを、公知の技法を使用して、少なくとも、転写開始領域、目的のＤＮＡおよび転写終結領域を含む制御エレメントを転写の方向に作動可能に連結した成分としてもたすように構築する。制御エレメントは、哺乳動物の細胞において機能性になるように選択される。結果得られた、作動可能に連結した成分を含有する構築物は、機能性ＡＡＶ ＩＴＲ配列で挟まれている（５’および３’）。
「アデノ随伴ウイルス末端逆位配列」または「ＡＡＶ ＩＴＲ」は、ウイルスに対してＤＮＡ複製開始点としておよびパッケージングシグナルとしてシスで共に機能する、ＡＡＶゲノムの各末端に見いだされる当技術分野で認識されている領域を意味する。ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ ｒｅｐコード領域と共に、２つのフランキングＩＴＲの間に挟まれたヌクレオチド配列の哺乳動物細胞ゲノムからの効率的な切除および救済、ならびに哺乳動物細胞ゲノムへの組み込みをもたらす。
ＡＡＶ ＩＴＲ領域のヌクレオチド配列は公知である。本明細書で使用される場合、「ＡＡＶ ＩＴＲ」は、示されている野生型ヌクレオチド配列を有する必要はないが、例えば、ヌクレオチドの挿入、欠失または置換によって変更され得る。さらに、ＡＡＶ ＩＴＲは、限定することなく、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７などを含めた、いくつかのＡＡＶ血清型のうちのいずれかに由来するものであってよい。さらに、ＡＡＶベクター内の選択されたヌクレオチド配列を挟む５’および３’ＩＴＲは、意図された通りに、すなわち、宿主細胞のゲノムまたはベクターからの目的の配列の切除および救済を可能にするように、ならびにＡＡＶ Ｒｅｐ遺伝子産物が細胞内に存在する場合にレシピエント細胞ゲノムへの異種配列の組み込みを可能にするように機能する限りは、必ずしも同一であるまたは同じＡＡＶ血清型もしくは分離株に由来するものでなくてよい。
一実施形態では、ＡＡＶ ＩＴＲは、限定することなく、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７などを含めたいくつかのＡＡＶ血清型のうちのいずれかに由来するものであってよい。さらに、ＡＡＶ発現ベクター内の選択されたヌクレオチド配列を挟む５’および３’ＩＴＲは、意図された通りに、すなわち、宿主細胞のゲノムまたはベクターからの目的の配列の切除および救済を可能にするように、ならびにＡＡＶ Ｒｅｐ遺伝子産物が細胞内に存在する場合にレシピエント細胞ゲノムへのＤＮＡ分子の組み込みを可能にするように機能する限りは、必ずしも同一であるまたは同じＡＡＶ血清型もしくは分離株に由来するものでなくてよい。
一実施形態では、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ２に由来するものであってよい。ＡＡＶベクターに使用するために適したＤＮＡ分子は、約５キロベース（ｋｂ）未満、約４．５ｋｂ未満、約４ｋｂ未満、約３．５ｋｂ未満、約３ｋｂ未満、約２．５ｋｂ未満のサイズであり、また、これらは当技術分野で公知である。
一実施形態では、選択されたヌクレオチド配列は、被験体におけるその転写または発現をｉｎ ｖｉｖｏで導く制御エレメントに作動可能に連結している。そのような制御エレメントは、通常、選択された遺伝子に付随する制御配列を含んでよい。あるいは、異種制御配列を使用することができる。有用な異種制御配列は、一般に、哺乳動物遺伝子またはウイルス遺伝子をコードする配列に由来する配列を含む。例としては、これらに限定されないが、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルスＬＴＲプロモーター；アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ ＭＬＰ）；単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）プロモーター、ＣＭＶ最初期プロモーター領域（ＣＭＶＩＥ）などのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ｐｏｌ ＩＩプロモーター、ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター、合成プロモーター、ハイブリッドプロモーターなどが挙げられる。さらに、マウスメタロチオネイン遺伝子などの非ウイルス遺伝子に由来する配列も本発明において用途が見出される。そのようなプロモーター配列は、例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）から市販されている。
一実施形態では、異種プロモーターおよび他の制御エレメントの両方、例えば、ＣＮＳ特異的プロモーターおよび誘導性プロモーター、ＣＮＳ特異的エンハンサーおよび誘導性エンハンサーなどが特に使用される。異種プロモーターの例としては、ＣＭＶプロモーターが挙げられる。ＣＮＳ特異的プロモーターの例としては、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、および神経特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）に由来する遺伝子から単離されたプロモーターが挙げられる。誘導性プロモーターの例としては、エクジソン、テトラサイクリン、低酸素およびアウフィン（ａｕｆｉｎ）に対するＤＮＡ応答性エレメントが挙げられる。
一実施形態では、ＡＡＶ ＩＴＲが結合した目的のＤＮＡ分子を有するＡＡＶ発現ベクターを、主要ＡＡＶオープンリーディングフレーム（「ＯＲＦ」）を切除したＡＡＶゲノムへと選択配列（複数可）を直接挿入することによって構築することができる。複製およびパッケージング機能を可能にするために十分なＩＴＲの部分が残っている限りは、ＡＡＶゲノムの他の部分も欠失させることができる。そのような構築物は、当技術分野で周知の技法を使用して設計することができる。
あるいは、ＡＡＶ ＩＴＲをウイルスゲノムからまたはそれを含有するＡＡＶベクターから切り取り、標準のライゲーション技法を使用して別のベクター内に存在する選択された核酸構築物の５’および３’と融合することができる。例えば、ライゲーションは、２０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＤＴＴ、３３μｇ／ｍｌのＢＳＡ、１０ｍＭ〜５０ｍＭのＮａＣｌ、および、４０μＭのＡＴＰ、０．０１〜０．０２（Ｗｅｉｓｓ）単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼ、０℃（「粘着末端」ライゲーションのために）または１ｍＭのＡＴＰ、０．３〜０．６（Ｗｅｉｓｓ）単位Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、１４℃（「平滑末端」ライゲーションのために）で実現することができる。分子間「粘着末端」ライゲーションは、通常、３０〜１００μｇ／ｍｌの総ＤＮＡ濃度（５〜１００ｎＭの総最終濃度）で実施される。ＩＴＲを含有するＡＡＶベクター。
さらに、キメラ遺伝子は、１つまたは複数の選択された核酸配列の５’および３’にＡＡＶ ＩＴＲ配列が配置されるように、合成により作製することができる。哺乳動物ＣＮＳ細胞においてキメラ遺伝子配列を発現させるための好ましいコドンを使用することができる。完全なキメラ配列は標準の方法によって調製された、重複したオリゴヌクレオチドから組み立てられる。
ｒＡＡＶビリオンを産生させるために、ＡＡＶ発現ベクターを、トランスフェクションによるなど、公知の技法を使用して適切な宿主細胞に導入する。いくつかのトランスフェクション技法は、一般に、当技術分野で公知である。例えば、Sambrookら、（１９８９年）Molecular Cloning、a laboratory manual、Cold Spring Harbor Laboratories、New Yorkを参照されたい。特に適切なトランスフェクション方法としては、リン酸カルシウム共沈澱、培養細胞への直接微量注入、電気穿孔、リポソーム媒介性遺伝子移入、脂質媒介性形質導入、および高速微粒子銃を使用した核酸送達が挙げられる。
一実施形態では、ｒＡＡＶビリオンを産生させるための適切な宿主細胞としては、異種ＤＮＡ分子のレシピエントとして使用することができるまたは使用されている微生物、酵母細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞が挙げられる。この用語は、トランスフェクトされた元の細胞の後代を包含する。したがって、「宿主細胞」とは、本明細書で使用される場合、一般に、外因性ＤＮＡ配列をトランスフェクトされた細胞を指す。安定なヒト細胞株２９３由来の細胞（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎを通じて、受託番号ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５７３の下で容易に入手可能）を本開示の実施において使用することができる。特に、ヒト細胞株２９３は、アデノウイルス５型ＤＮＡ断片で形質転換されており、アデノウイルスＥ１ａ遺伝子およびＥ１ｂ遺伝子を発現するヒト胎児由来腎臓細胞株である。２９３細胞株は容易にトランスフェクトされ、ｒＡＡＶビリオンを産生させるために特に都合のよいプラットフォームをもたらす。
「ＡＡＶ ｒｅｐコード領域」とは、複製タンパク質Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０をコードする、当技術分野で認識されているＡＡＶゲノムの領域を意味する。これらのＲｅｐ発現産物は、ＡＡＶのＤＮＡ複製開始点の認識、結合およびニッキング、ＤＮＡヘリカーゼ活性ならびにＡＡＶ（または他の異種）プロモーターからの転写の調節を含めた多くの機能を有することが示されている。Ｒｅｐ発現産物は、集合的に、ＡＡＶゲノムの複製のために必要である。ＡＡＶ ｒｅｐコード領域の適切な相同体は、ＡＡＶ２ ＤＮＡ複製を媒介することも公知であるヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ−６）ｒｅｐ遺伝子を含む。
「ＡＡＶ ｃａｐコード領域」は、カプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３、またはその機能性相同体をコードする、当技術分野で認識されているＡＡＶゲノムの領域を意味する。これらのＣａｐ発現産物は、集合的にウイルスゲノムのパッケージングのために必要であるパッケージング機能をもたらす。
一実施形態では、宿主細胞を、ＡＡＶ発現ベクターをトランスフェクトする前かまたはそれと同時にＡＡＶヘルパー構築物を用いてトランスフェクトすることによってＡＡＶヘルパー機能を宿主細胞に導入する。したがって、ＡＡＶヘルパー構築物は、増殖性ＡＡＶ感染に必要なＡＡＶ機能の欠如を補完するためにＡＡＶ ｒｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝子の少なくとも一過性の発現をもたらすために使用される。ＡＡＶヘルパー構築物はＡＡＶ ＩＴＲを欠き、それ自体では複製もパッケージングもできない。これらの構築物は、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、ウイルス、またはビリオンの形態であってよい。ＲｅｐおよびＣａｐ発現産物の両方をコードする、一般に使用されるプラスミドｐＡＡＶ／ＡｄおよびｐＩＭ２９＋４５などの、いくつかのＡＡＶヘルパー構築物が記載されている。Ｒｅｐおよび／またはＣａｐ発現産物をコードするいくつかの他のベクターが記載されている。
ウイルスベクターを送達する方法は、ＡＡＶをＣＳＦに注射するステップを含む。一般に、ｒＡＡＶビリオンは、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏにおける形質導入技法のいずれかを使用してＣＮＳの細胞に導入することができる。ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて形質導入する場合、所望のレシピエント細胞を被験体から取り出し、ｒＡＡＶビリオンを用いて形質導入し、被験体に再度導入する。あるいは、被験体において不適切な免疫応答を生じさせない、同系または異種細胞を使用することができる。
形質導入された細胞を被験体に送達および導入するために適した方法が記載されている。例えば、組換えＡＡＶビリオンとＣＮＳ細胞を、例えば適切な培地中で組み合わせることによって、細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて形質導入することができ、目的のＤＮＡを有する細胞についてのスクリーニングを、サザンブロットおよび／またはＰＣＲなどの従来の技法を使用して、または選択マーカーを使用することによってスクリーニングすることができる。次いで、形質導入された細胞を、下でより詳細に記載されている医薬組成物に製剤化し、当該組成物を移植、筋肉内注射、静脈内注射、皮下注射および腹腔内注射によってなどの種々の技法によって被験体に導入することができる。
一実施形態では、医薬組成物は、目的の核酸の治療有効量、すなわち、問題の疾患状態の症状を軽減するもしくは好転させるのに十分な量、または、所望の利益を付与するのに十分な量をもたらすのに十分な遺伝物質を含む。医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤も含有する。そのような賦形剤は、それ自体は、組成物を受ける個体に有害な抗体の産生を誘導せず、また、過度の毒性を伴わずに投与することができる任意の医薬品を含む。薬学的に許容される賦形剤としては、これらに限定されないが、ソルビトール、Ｔｗｅｅｎ８０、ならびに水、食塩水、グリセロールおよびエタノールなどの液体が挙げられる。薬学的に許容される塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などのような鉱酸塩；および酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などのような有機酸の塩を含めることができる。さらに、例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質などの補助物質がそのようなビヒクル中に存在してよい。薬学的に許容される賦形剤の詳細な考察は、Remington's Pharmaceutical Sciences（Mack Pub. Co.、N.J. １９９１年）において入手可能である。
当業者には明らかである通り、本明細書の教示を考慮して、添加しなければならない有効量のウイルスベクターを経験的に決定することができる。投与は、処置の過程全体にわたって１回用量で、継続的に、または断続的に行うことができる。最も有効な投与の手段および投与量を決定する方法は当業者には周知であり、ウイルスベクター、療法の組み立て、標的細胞、および処置される被験体で変動する。治療担当医師によって選択された用量レベルおよびパターンを用いて単回および複数回投与を行うことができる。
送達されるウイルスベクターによって２つ以上の導入遺伝子を発現させることができることが理解されるべきである。あるいは、それぞれが１つまたは複数の異なる導入遺伝子を発現する別々のベクターを本明細書に記載の通りＣＮＳに送達することもできる。さらに、本開示の方法によって送達されるウイルスベクターを他の適切な組成物および療法と組み合わせることも意図されている。
遺伝物質を細胞に導入するための方法
外因性遺伝物質（例えば、１つまたは複数の治療用タンパク質をコードするｃＤＮＡ）を、細胞に、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにおいて、トランスフェクションまたは形質導入などの遺伝子移入方法によって導入して、遺伝子改変細胞をもたらす。種々の発現ベクター（すなわち、標的細胞への外因性遺伝物質の送達を容易にするためのビヒクル）は当業者には公知である。
本明細書で使用される場合、「細胞のトランスフェクション」とは、細胞が、添加されたＤＮＡを組み入れることによって新しい遺伝物質を取得することを指す。したがって、トランスフェクションとは、物理的または化学的方法を使用して細胞に核酸を挿入することを指す。リン酸カルシウムＤＮＡ共沈澱；ＤＥＡＥ−デキストラン；電気穿孔；カチオン性リポソーム媒介性トランスフェクション；およびタングステン粒子促進性微小粒子衝撃を含めたいくつかのトランスフェクション技法が当業者に公知である。リン酸ストロンチウムＤＮＡ共沈澱は、別の可能性のあるトランスフェクション方法である。
対照的に、「細胞の形質導入」とは、ＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスを使用して細胞に核酸を移入するプロセスを指す。細胞に核酸を移入するためのＲＮＡウイルス（すなわち、レトロウイルス）は、本明細書では、形質導入キメラレトロウイルスと称される。レトロウイルスに含有される外因性遺伝物質は、形質導入された細胞のゲノムに組み入れられる。キメラＤＮＡウイルス（例えば、治療用作用物質をコードするｃＤＮＡを担持するアデノウイルス）を用いて形質導入した細胞では、外因性遺伝物質はそのゲノム内には組み入れられないが、染色体外に保持された外因性遺伝物質を細胞内で発現させることが可能である。
一般には、外因性遺伝物質は、異種遺伝子（通常、治療用タンパク質をコードするエクソンを含むｃＤＮＡの形態で）を、新しい遺伝子の転写を制御するためのプロモーターと一緒に含む。プロモーターは、特徴的に、転写を開始するために必要な特定のヌクレオチド配列を有する。任意選択で、外因性遺伝物質は、所望の遺伝子の転写活性を得るために必要な追加の配列（すなわち、エンハンサー）をさらに含む。この考察の目的で、「エンハンサー」とは、単に、コード配列と連続して働いて（シスで）プロモーターによって規定される基底の転写レベルを変化させる任意の非翻訳ＤＮＡ配列である。外因性遺伝物質を細胞ゲノムに、プロモーターのすぐ下流に導入することができ、それにより、プロモーターとコード配列が、コード配列の転写が可能になるように作動可能に連結する。レトロウイルス発現ベクターは、挿入された外因性遺伝子の転写を制御するための外因性プロモーターエレメントを含んでよい。そのような外因性プロモーターは、構成的プロモーターと誘導性プロモーターのどちらも含む。
天然に存在する構成的プロモーターは、必須の細胞機能の発現を制御する。結果として、構成的プロモーターの制御下にある遺伝子は、細胞の成長の全ての条件の下で発現する。例示的な構成的プロモーターとしては、ある特定の構成的なまたは「ハウスキーピング」機能をコードする以下の遺伝子のためのプロモーター：ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、アデノシンデアミナーゼ、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）、ピルビン酸キナーゼ、ホスホグリセロールムターゼ、アクチンプロモーター、および当業者に公知の他の構成的プロモーターが挙げられる。さらに、多くのウイルスプロモーターは真核細胞において構成的に機能する。これらとしては、とりわけ、ＳＶ４０の初期および後期プロモーター；モロニー白血病ウイルスおよび他のレトロウイルスの長い末端反復（ＬＴＲ）；ならびに単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーターが挙げられる。したがって、上で参照されている構成的プロモーターのいずれかを使用して異種遺伝子挿入物の転写を制御することができる。
誘導性プロモーターの制御下にある遺伝子は、誘導作用物質（inducing agent）の存在下でのみ発現する、または、誘導作用物質の存在下ではより大きな程度で発現する（例えば、メタロチオネインプロモーターの制御下での転写は、ある特定の金属イオンの存在下で著しく増加する）。誘導性プロモーターは、それらの誘導因子（inducing factor）が結合すると転写を刺激する応答性エレメント（ＲＥ）を含む。例えば、血清因子、ステロイドホルモン、レチノイン酸およびサイクリックＡＭＰに対するＲＥが存在する。誘導性応答を得るために、特定のＲＥを含有するプロモーターを選択することができ、また、いくつかの場合には、ＲＥ自体を異なるプロモーターに結合させ、それにより、組換え遺伝子に誘導能を付与することができる。したがって、適切なプロモーターを選択すること（構成的であるか誘導性であるか；強いか弱いか）により、遺伝子改変細胞における治療用作用物質の発現の存在およびレベルの両方を制御することが可能である。治療用作用物質をコードする遺伝子が誘導性プロモーターの制御下にある場合、ｉｎ ｓｉｔｕにおける治療用作用物質の送達は、遺伝子改変細胞を、ｉｎ ｓｉｔｕにおいて、治療用作用物質の転写が可能になる条件に曝露することによって、例えば、当該作用物質の転写を制御する誘導性プロモーターの特定の誘発因子（inducer）を腹腔内注射することによって誘発する。例えば、ｉｎ ｓｉｔｕにおける、メタロチオネインプロモーターの制御下にある遺伝子によりコードされる治療用作用物質の遺伝子改変細胞による発現は、遺伝子改変細胞を、適切な（すなわち、誘導性）金属イオンを含有する溶液とｉｎ ｓｉｔｕにおいて接触させることによって増強される。
したがって、ｉｎ ｓｉｔｕにおいて送達される治療用作用物質の量は、（１）挿入された遺伝子の転写を導くために使用するプロモーターの性質（すなわち、プロモーターが構成的であるか誘導性であるか、強いか弱いか）；（２）細胞に挿入する外因性遺伝子のコピーの数；（３）患者に投与する（例えば、埋め込む）、形質導入／トランスフェクトされた細胞の数；（４）埋め込み物（例えば、移植片または封入発現系）のサイズ；（５）埋め込み物の数；（６）形質導入／トランスフェクトされた細胞または埋め込み物が定位置に放置される時間の長さ；および（７）遺伝子改変細胞による治療用作用物質の産生速度などの因子を制御することによって調節される。治療有効用量の特定の治療用作用物質を送達するための、これらの因子の選択および最適化は、上で開示されている因子および患者の臨床プロファイルを考慮に入れて、過度な実験を伴わずに、当業者の範囲内であるとみなされる。
発現ベクターは、少なくとも１つのプロモーターおよび治療用作用物質をコードする少なくとも１つの異種核酸に加えて、発現ベクターでトランスフェクトまたは形質導入された細胞の選択を容易にするための選択遺伝子、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子を含んでよい。あるいは、細胞に、少なくとも１つのベクターが治療用作用物質（複数可）をコードする遺伝子（複数可）を含有し、他のベクターが選択遺伝子を含有する２つまたはそれ超の発現ベクターをトランスフェクトする。適切なプロモーター、エンハンサー、選択遺伝子および／またはシグナル配列（下記）の選択は、過度な実験を伴わずに、当業者の範囲内であるとみなされる。
治療用作用物質は、細胞外、細胞内または膜の場所への送達のために標的化することができる。遺伝子産物が細胞から分泌されることが望ましい場合には、発現ベクターを、治療用遺伝子産物を細胞から細胞外環境に分泌させるための適切な分泌「シグナル」配列を含むように設計する。遺伝子産物が細胞内に保持されることが望ましい場合には、この分泌シグナル配列を省く。同様に、発現ベクターを、治療用作用物質を細胞原形質膜内に係留するための「保持」シグナル配列を含むように構築することができる。例えば、膜タンパク質は全て疎水性膜貫通領域を有し、これにより膜内のタンパク質の移動が止まり、タンパク質を分泌させない。遺伝子産物を特定の場所に標的化するためのシグナル配列を含めた発現ベクターの構築は、過度な実験を必要とせずに、当業者の範囲内であるとみなされる。
検出アッセイ
この実施形態について種々の免疫検出方法が意図されている。そのような免疫検出方法としては、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫放射定量測定法、蛍光免疫測定法、化学発光アッセイ、生物発光アッセイ、およびウエスタンブロットが挙げられるが、いくつかの他の方法が当業者には周知である。種々の有用な免疫検出方法のステップは科学文献に記載されている。
一般に、免疫結合（ｉｍｍｕｎｏｂｉｎｄｉｎｇ）方法は、Ａβタンパク質を含有する疑いがある試料を得るステップと、試料を、第１の抗体である、本発明によるＡβに特異的なモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体と、場合によって、免疫複合体（ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐｌｅｘ）の形成を可能にするのに有効な条件下で接触させるステップとを含む。
免疫結合方法は、試料中のＡβタンパク質の量を検出および定量するための方法ならびに結合プロセスの間に形成されるあらゆる免疫複合体（ｉｍｍｕｎｅ ｃｏｍｐｌｅｘ）の検出および定量を含む。ここで、Ａβタンパク質を含有する疑いがある試料を得、試料を本発明の抗体断片と接触させ、次いで、特定の条件下で形成された免疫複合体の量を検出および定量する。
選択された生体試料と抗体を、免疫複合体（一次免疫複合体）の形成を可能にするのに有効な条件下、十分な期間にわたって接触させることは、一般に、単に抗体組成物を試料に添加し、混合物を、抗体が存在する任意の抗原と免疫複合体を形成する、すなわち、それと結合するのに十分に長い期間にわたってインキュベートすることである。この期間後、組織切片、ＥＬＩＳＡプレート、ドットブロットまたはウエスタンブロットなどの試料−抗体組成物を、一般に、洗浄してあらゆる非特異的に結合した抗体種を除去し、それにより、一次免疫複合体内の特異的に結合したｓｃＦｖ分子のみを検出することを可能にする。
一般に、免疫複合体（ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐｌｅｘ）形成の検出は、当技術分野で周知であり、多数の手法を適用することによって実現することができる。これらの方法は、一般に、放射性タグ、蛍光タグ、生物学的タグおよび酵素的タグのいずれかなどの標識またはマーカーの検出に基づく。そのような標識の使用に関する米国特許としては、米国特許第３，８１７，８３７号；同第３，８５０，７５２号；同第３，９３９，３５０号；同第３，９９６，３４５号；同第４，２７７，４３７号；同第４，２７５，１４９号および同第４，３６６，２４１号が挙げられ、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる。当然、当技術分野で公知の通り、第２の抗体および／またはビオチン／アビジンリガンド結合性配置などの二次結合性リガンドを使用することによって追加の利点を見いだすことができる。
上記の通り、タンパク質検出分子（すなわち、抗体または抗体断片などの結合性リガンド）はそれ自体を検出可能な標識と連結することができ、その場合、次いで、この標識を単に検出し、それにより、組成物中の一次免疫複合体の量を決定することが可能になる。あるいは、一次免疫複合体内に結合した状態になる第１の抗体は、抗体に対する結合親和性を有する第２の結合性リガンドによって検出することができる。これらの場合には、第２の結合性リガンドは、検出可能な標識と連結することができる。第２の結合性リガンドは、多くの場合、それ自体が抗体であり、したがって、「二次」抗体と称することができる。一次免疫複合体を、標識した二次結合性リガンド、または抗体と、二次免疫複合体の形成を可能にするのに有効な条件下、十分な期間にわたって接触させる。次いで、二次免疫複合体を、一般に、洗浄してあらゆる非特異的に結合した標識二次抗体またはリガンドを除去し、次いで、二次免疫複合体内の残りの標識を検出する。
別の方法は、二段階手法によって一次免疫複合体を検出することを含む。第１の結合性リガンドに対する結合親和性を有する、抗体などの第２の結合性リガンドを使用して、上記の通り二次免疫複合体を形成させる。洗浄後、二次免疫複合体を、第２の抗体に対する結合親和性を有する第３の結合性リガンドまたは抗体と、再度、免疫複合体（三次免疫複合体）の形成を可能にするのに有効な条件下、十分な期間にわたって接触させる。第３のリガンドまたは抗体を検出可能な標識と連結し、それにより、このように形成された三次免疫複合体の検出を可能にする。この系は、望ましい場合にはシグナル増幅をもたらすことができる。
上記の通り、イムノアッセイは、それらの最も単純かつ／または直接的な意味では、結合アッセイである。ある特定の好ましいイムノアッセイは、当技術分野で公知の種々の型の酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）および／またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）である。組織切片を使用した免疫組織化学的検出も特に有用である。しかし、検出はそのような技法に限定されず、かつ／またはウエスタンブロッティング、ドットブロッティング、ＦＡＣＳ分析、および／もしくは同様のものも使用できることが容易に理解されよう。
１つの例示的なＥＬＩＳＡでは、ポリスチレンマイクロタイタープレートのウェルなどの、タンパク質親和性を示す選択された表面上に抗体を固定化する。次いで、臨床試料（例えば、被験体から得た生体試料）などの、Ａβタンパク質を含有する疑いがある試験組成物をウェルに添加する。結合させ、かつ／または洗浄して非特異的に結合した免疫複合体を除去した後、結合した抗原を検出することができる。検出は、一般に、検出可能な標識と連結した別の抗体を添加することによって実現される。この型のＥＬＩＳＡは、単純な「サンドイッチＥＬＩＳＡ」である。検出は、第２の抗体を添加し、その後、第２の抗体に対する結合親和性を有する、検出可能な標識と連結した第３の抗体を添加することによっても実現することができる。
別の例示的なＥＬＩＳＡでは、抗原を含有する疑いがある試料をウェルの表面に固定化し、かつ／または、次いで結合性作用物質（binding agent）と接触させる。結合させ、かつ／または洗浄して非特異的に結合した免疫複合体を除去した後、結合した抗結合性作用物質を検出する。最初の結合性作用物質が検出可能な標識と連結している場合、免疫複合体を直接検出することができる。重ねて、免疫複合体は、第１の結合性作用物質に対する結合親和性を有する、検出可能な標識と連結した第２の抗体を使用して検出することができる。
抗原を固定化する別のＥＬＩＳＡは、検出に抗体競合の使用を伴う。このＥＬＩＳＡでは、抗原に対する標識した抗体をウェルに添加し、結合させ、かつ／またはそれらの標識によって検出する。次いで、未知の試料中の抗原の量を、試料と、抗原に対する標識した抗体とを、コーティングしたウェルを用いてインキュベートしている間に混合することによって決定する。試料中に抗原が存在することは、ウェルとの結合に利用可能な抗原に対する抗体の量が減少するように、したがって、最終的なシグナルが減少するように作用する。これは、標識されていない抗体が抗原でコーティングしたウェルと結合し、標識した抗体との結合に利用可能な抗原の量も減少させる場合の、未知の試料中の抗原に対する抗体を検出することにも適する。
使用されるフォーマットに関係なく、ＥＬＩＳＡには、コーティングすること、インキュベートすること、および結合させ、洗浄して非特異的に結合した種を除去すること、および結合した免疫複合体を検出することなどの、ある特定の共通した特徴がある。
ＥＬＩＳＡでは、直接的な手順よりも二次または三次検出手段を使用することの方がおそらくより習慣的である。したがって、タンパク質または抗体をウェルに結合させ、バックグラウンドを減少させるために非反応性材料でコーティングし、洗浄して結合していない材料を除去した後、固定化表面と試験される生体試料を、免疫複合体（抗原／抗体）形成を可能にするのに有効な条件下で接触させる。次いで、免疫複合体の検出には、標識した二次結合性リガンドまたは抗体、および二次結合性リガンドまたは抗体と併せて標識した三次抗体または第３の結合性リガンドが必要である。
「免疫複合体（抗原／抗体）形成を可能にするのに有効な条件下で」とは、条件が、好ましくは、ｔａｕオリゴマーおよび／またはｓｃＦｖ組成物をＢＳＡ、ウシガンマグロブリン（ＢＧＧ）またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）／Ｔｗｅｅｎなどの溶液で希釈することを含むことを意味する。これらの添加作用物質は、非特異的なバックグラウンドの減少にも役立つ傾向がある。
「適切な」条件とは、インキュベーションが、有効な結合を可能にするのに十分な温度であるまたは十分な期間にわたることも意味する。インキュベーションステップは、一般には、好ましくはおよそ２５℃〜２７℃の温度で、約１〜２〜４時間ほどである、または約４℃ほどで一晩であり得る。
ＥＬＩＳＡでの全てのインキュベーションステップの後、接触させた表面を洗浄して、複合体を形成していない材料を除去する。洗浄手順の例は、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ、またはホウ酸緩衝液などの溶液で洗浄することを含む。試験試料と最初に結合した材料との間で特異的な免疫複合体が形成され、その後洗浄した後、微量の免疫複合体の出現さえも決定することができる。
検出手段をもたらすために、第２または第３の抗体は、検出を可能にするための会合した標識を有する。これは、適切な発色基質と一緒にインキュベートすると発色を生じる酵素であってよい。したがって、例えば、第１および第２の免疫複合体をウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ、アルカリホスファターゼまたは水素ペルオキシダーゼ（hydrogen peroxidase）とコンジュゲートした抗体と一緒に、さらなる免疫複合体形成が生じるのに有利な期間および条件下で接触またはインキュベートすること（例えば、ＰＢＳ−ＴｗｅｅｎなどのＰＢＳを含有する溶液中、室温で２時間のインキュベーション）が望まれる。
標識した抗体と一緒にインキュベートし、その後洗浄して結合していない材料を除去した後に、標識の量を、例えば、発色基質、例えば、尿素、もしくはブロモクレゾールパープル、またはペルオキシダーゼの場合では酵素標識として、２，２’−アジノ−ジ−（３−エチル−ベンゾチアゾリン−６−スルホン酸（ＡＢＴＳ）、もしくはＨ２Ｏ２などと一緒にインキュベートすることによって定量する。次いで、生じた色の程度を、例えば、可視スペクトル分光光度計を使用して測定することによって定量を実現する。
（実施例１）
アミロイド沈着の進行の変化
この実施例では、ａｐｐ／ｐｓマウスにおいて、アデノ随伴ウイルス血清型４（ＡＡＶ４）の脳室内注射による異なるＡｐｏＥアイソフォームの過剰発現後のアミロイド沈着の進行の変化を研究した。
ＡｐｏＥのイプシロン４対立遺伝子（ＡｐｏＥ ε４）はアルツハイマー病（ＡＤ）についての第１の遺伝的リスク因子であるが、一方、ＡｐｏＥの稀なイプシロン２対立遺伝子（ＡｐｏＥ ε２）の遺伝により、このリスクは約半分まで低下する。しかし、ほぼ１７年前にこれらの強力な遺伝学的な手がかりが発見されたにもかかわらず、ＡｐｏＥによりリスクが付与される機構は不確かなままである。
異なるＡｐｏＥアイソフォーム（ＡｐｏＥ ε２、ε３およびε４）が線維状アミロイド斑の形成および安定性にどのように影響するかを解読するために、各ＡｐｏＥアイソフォームをコードするＡＡＶ４ベクターを７カ月齢のＡＰＰ／ＰＳマウスの脳室内に注射した。ｉｎ ｖｉｖｏ多光子イメージングを使用して、ベースラインのときおよびＡｐｏＥに曝露した後、２カ月の間隔にわたってアミロイド沈着の集団を追跡し、このように、生きている動物におけるアミロイドーシス進行の動的観察を可能にした。
アミロイド斑沈着の動態は各アイソフォームに応じて変動することが観察され、したがって、２カ月後に、ＡｐｏＥ ε３と比較して、ＡｐｏＥ ε４の注射を受けたマウスでは老人斑が３８％増加したが、ＡｐｏＥ ε２による処置を受けたマウスではアミロイド沈着の数の１５％の低下が示された。死後分析により、これらの結果が確認され、また、皮質内の斑を修飾するヒトＡｐｏＥタンパク質が存在することが明らかになり、これは、タンパク質が実質全体にわたって大きく拡散していること、およびＡβペプチドが沈着するところに限局的に蓄積していることを反映する。このＡｐｏＥ ε４タンパク質の含有量の増加が、アミロイド沈着の周囲のシナプス消失がより重度であることにも関連していたことに留意することが重要である。
全体として、本データから、異なるＡｐｏＥアイソフォームの過剰産生によって疾患の進行に影響を及ぼすことができ、ＡＤ患者における認知障害と最もよく相関するパラメータの１つであるシナプス消失の程度を調節することができることが実証された。
１．ＡＡＶ４−ＡｐｏＥの脳室内注射により、脳におけるｈｕＡｐｏＥの安定発現および組換えヒトＡｐｏＥ（ｈｕＡｐｏＥ）タンパク質の持続的検出が導かれた。
簡単に述べると、ＡＡＶ４ベクターの注射を受けたＡＰＰ／ＰＳマウスにおいてＧＦＰおよびｈｕＡｐｏＥを免疫検出した。ＧＦＰシグナルは脳室領域全体（上のパネル）および脳室内側を覆う細胞において観察することができ、ヒトＡＰＯＥも同様であった。
本手法を評価するために、ＡＡＶ４−Ｖｅｎｕｓ（対照）、ＡＡＶ４−ＡｐｏＥ２、ＡＡＶ４−ＡｐｏＥ３およびＡＡＶ４−ＡｐｏＥ４を野生型マウスの脳室に注射した。注射の２カ月後、アミロイド沈着の周囲の皮質実質においてヒトＡｐｏＥタンパク質を検出することができた（３Ｈ１抗体；ＡＡＶ４−ＧＦＰの注射を受けたマウスでは非特異的なバックグラウンドのみが観察されたことに留意されたい）。したがって、脳におけるＥＬＩＳＡによって有意なレベルのヒトＡｐｏＥが検出され、ＶｅｎｕｓおよびＡｐｏＥについての免疫組織学的染色により、異なる導入遺伝子が脳室内側を覆う細胞により発現されることが確認された。
導入遺伝子のｍＲＮＡレベルを評価するために、ｑＲＴ−ＰＣＲ実験を実施した。標準曲線により、ｈｕＡｐｏＥ ｍＲＮＡの濃度を内因性ＧＡＰＤＨのレベルに応じて決定することが可能になった。２カ月または５カ月にわたって曝露したマウス由来の試料を含めた。ヒトＡＰＯＥを特異的に検出するために設計したＥＬＩＳＡアッセイを脳ホモジネートに対して実施した（図１Ａ）。ヒトＡＰＯＥに特異的なＥＬＩＳＡによって定量し（図１Ｂ）、ウエスタンブロットによって確認した通り、ＡＡＶ４−ＡＰＯＥの注射を受けたマウスでは、ＡＡＶ４−ＧＦＰによる処置を受けた動物と比較して、低レベルの組換えタンパク質を検出することができた。
２．ＡＰＯＥの各アイソフォームの過剰発現はアミロイドーシスの進行に示差的に影響を及ぼす。
ｉｎ ｖｉｖｏ二光子イメージングを使用して、生きている動物におけるアミロイド沈着を経時的に追跡した。簡単に述べると、ＡＰＰ／ＰＳマウス（７カ月齢）に、ＡｐｏＥ２をコードするＡＡＶ４ベクター、ＡｐｏＥ３をコードするＡＡＶ４ベクター、ＡｐｏＥ４をコードするＡＡＶ４ベクターおよびＶｅｎｕｓをコードするＡＡＶ４ベクターを定位で注射した。１週間後、頭蓋窓（ｃｒａｎｉａｌ ｗｉｎｄｏｗ）を埋め込み、開頭術後、経時的にアミロイド沈着を画像化した。２カ月後、動物を屠殺し、死後分析を実施した。
ＡＡＶ４−ＡｐｏＥ２、ＡＡＶ４−ＡｐｏＥ３またはＡＡＶ４−ＡｐｏＥ４の注射を受けたＡＰＰ／ＰＳマウスの二光子画像を調製した。メトキシ−ＸＯ４（５ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射後にアミロイド斑を検出することができ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄデキストラン（分子量７０，０００Ｄａ；滅菌ＰＢＳ中１２．５ｍｇ／ｍｌ）を外側尾静脈内に注射して、蛍光血管造影図をもたらした。画像を注射の１週間後（＝Ｔ０）、１カ月後および２カ月後に取得した。同じ視野を経時的に捕捉して病変の進行を追跡した。わずかな新しいアミロイド沈着が出現したが、そのうちの少数は２カ月の期間にわたって、もはや検出することができなかった。
ｉｎ ｖｉｖｏ画像の完全な分析により、ＡＡＶ４−ＡｐｏＥ４の注射を受けたＡＰＰ／ＰＳマウスにおいて、ＡＡＶ４−ＡｐｏＥ３による処置を受けた動物とＡＡＶ４−Ｖｅｎｕｓによる処置を受けた動物のどちらと比較してもアミロイド沈着の数が有意により急速に増加することが示される。対照的に、ＡＡＶ４−ＡｐｏＥ２を使用した場合、斑の密度の小さいが有意な低下が測定される（図２）。ＡＡＶ４−ＡｐｏＥ４の注射を受けたＡＰＰ／ＰＳマウスでは、斑が大きくなる傾向が観察されるが（ｐ＜０．０６）、全体的に斑のサイズは一定のままである。ｉｎ ｖｉｖｏイメージングの要約データから、各ＡＰＯＥアイソフォームの過剰発現が、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるアミロイド沈着の進行に示差的に影響を及ぼすことが示される。ＡＡＶ４−ＡｐｏＥ２を注射するとアミロイド密度のわずかな低下が経時的にもたらされるが、ＡＡＶ４−ＡｐｏＥ４を注射するとアミロイドーシスが悪化する。
３．アミロイド斑のサイズは各ＡｐｏＥアイソフォームに応じて変動する。
ｉｎ ｖｉｖｏ二光子イメージングにより、２カ月にわたって各アミロイド沈着のサイズの変化を追跡することが可能であった。斑のサイズは、経時的に安定なままであるか、増加するかまたは低下したままであり得る。Ｔ１／Ｔ０とＴ２／Ｔ１のサイズ比の分布により、ＡＡＶ４−ＡｐｏＥ４の注射を受けたマウスでは他の群と比較してアミロイド斑が大きい方にシフトすることが示される（図３）。
４．アミロイド負荷量（ｌｏａｄ）の死後評価により、ＡｐｏＥ２およびＡｐｏＥ４のアミロイド沈着に対する影響が確認される。
ＡＡＶ４注射の２カ月後、死後立体解析評価により、ＡＡＶ４−ＡｐｏＥ４の注射を受けた動物では皮質におけるアミロイド斑の密度が高いことが明らかになったが、他の群の間では差異を検出することはできなかった（図４Ａ）。このアミロイド沈着の数の増加は、斑をＴｈｉｏＳまたはＢａｍ１０で標識すると観察される。しかし、Ｂａｍ１０とＴｈｉｏＳの比の変化は検出されなかった。注射の５カ月後の各ＡｐｏＥアイソフォームの影響は２カ月後と比較してより著しいものである（図４Ｂ）。マウスがＡＡＶ４−ＡｐｏＥ４の注射を受けた場合には沈着の密度の有意な増加が観察されたが、ＡｐｏＥ２を用いると逆の効果が検出された。重ねて、Ｂａｍ１０とＴｈｉｏＳの比の変化は検出されなかった。
５．各ＡｐｏＥアイソフォームはアミロイド沈着周囲のシナプス密度に示差的に影響を及ぼす。
アレイ断層撮影法を使用して、アミロイド沈着の周囲のシナプス前部要素およびシナプス後部要素の密度を正確に決定した。この新しい画像化方法により、組織分子アーキテクチャの高分解能イメージングの能力がもたらされる。アレイ断層撮影法は、検体の超薄切片作製（７０ｎｍ）、免疫染色および３Ｄ再構成に基づく。アレイ断層撮影法試料の代表的な画像はアミロイド斑およびシナプス後部マーカーＰＳＤ９５について染色したものあった。アレイ断層撮影法画像により、アミロイド沈着の周囲のシナプス後部マーカーＰＳＤ９５の数の低下が観察されるが、この影響は斑から離れると消失することが示される。ＡＡＶ４の注射を受けたマウスの各群において、斑の近くまたは遠くにおけるシナプス前部マーカー（シナプシン−１）およびシナプス後部マーカーの定量を決定した（図５Ａ〜Ｄ）。シナプス前部要素およびシナプス後部要素の広範囲にわたる定量により、シナプシン１およびＰＳＤ９５の密度の低下がアミロイド斑に関連し、この影響は、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスの脳においてＡｐｏＥ４が過剰発現すると劇的に増幅されることが確認された（図５Ｃ、図５Ｄ）。ＡｐｏＥ４の過剰発現は、他の群と比較してアミロイド沈着の付近におけるスパインの消失が増加することと関連する。逆に、ＡｐｏＥ２による処置を受けた動物では斑の周囲のシナプシン斑点（synapsin punctum）の密度が高い。
結論
ＡＡＶウイルス血清型４の脳室内注射により、大脳実質全体にわたって、可溶性組換えタンパク質の持続的な長期にわたる過剰産生が導かれた。ＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ３およびＡｐｏＥ４の過剰発現は、ＡＰＰ／ＰＳマウスにおける病理の過程に示差的に影響を及ぼし、したがって、ＡｐｏＥ４の注射を受けた場合、ＡｐｏＥ３と比較してアミロイド負荷の進行が有意に増大した。逆に、ＡｐｏＥ２は保護性の効果と関連し、注射の２カ月後には少数のアミロイド沈着はもはや検出可能ではない。死後免疫組織学的分析により、ＡｐｏＥ４の有害作用が確認された。ＡｐｏＥ４の持続的な過剰産生により、アミロイド沈着の周囲で観察されるシナプス消失がＡｐｏＥ３と比較して悪化するが、ＡｐｏＥ２では軽度の影響が見られた。本研究により、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＡｐｏＥアイソフォーム、アミロイドーシス進行およびシナプス消失の直接の関係が実証された。
（実施例２）
大きな哺乳動物における、脳脊髄液（ＣＳＦ）を介した中枢神経系障害の処置
アルツハイマー病などの脳障害に対する遺伝子療法を実現するためには、哺乳動物において、長期間にわたって治療用酵素の定常状態のレベルを実現することができるかどうかを決定することが必要である。上衣細胞（脳の脳室に位置する細胞）を形質導入し、標的化した酵素を脳脊髄液（ＣＳＦ）中に分泌させることができることが発見された。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ４）により、マウスモデルにおける上衣を高い効率で形質導入することができることが決定された。（Davidsonら、PNAS、２８巻：３４２８〜３４３２頁、２０００年）。マウスでは、ＡＡＶ４処置後に疾患脳内の貯蔵基質レベルが正常化した。
ＣＳＦ中の酵素の定常状態のレベルを実現するためにベクターの全体的な送達が有効に実施できたかどうかを調査した。まず、ベクターにより大きな哺乳動物の脳内の上衣細胞（脳室の内側を覆う細胞）に形質導入できたことが見いだされる必要があった。ＬＩＮＣＬのイヌモデルおよびＬＩＮＣＬの非ヒト霊長類モデルにおいて研究を実施した。ＬＩＮＣＬイヌは出生時には正常であるが、約７カ月の時点で神経性の徴候が発生し、約５〜６カ月の時点で試験可能な失認が発生し、１０〜１１カ月の時点で発作および進行性失明が発生する。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、サイズが小さく（２０ｎｍ）、その遺伝物質の大部分を除去する（「完全に破壊する」）ことができ、したがってウイルス遺伝子が存在せず、したがって複製インコンピテントであるので、これをベクターとして選択した。アデノ随伴ウイルス４型（ＡＡＶ４）ベクターは、ベータグルクロニダーゼ欠損によって引き起こされるＶＩＩ型ムコ多糖症（ＭＰＳ ＶＩＩ）のマウスモデルにおける全体的な機能性および病理学的改善を媒介することができるかどうかは以前に試験されている（Liuら、J. Neuroscience、２５巻（４１号）：９３２１〜９３２７頁、２００５年）。ベータグルクロニダーゼをコードする組換えＡＡＶ４ベクターを、確立した疾患を有するＭＰＳ ＶＩＩマウスの側脳室（ｌａｔｅｒａｌ ｖｅｎｔｒｉｃｌｅ）に片側性に注射した。形質導入された上衣は高レベルの組換え酵素を発現し、分泌された酵素が大脳および小脳の構造、ならびに脳幹に浸透した。免疫組織化学的研究により、組換え酵素と脳微小血管系の密接な関連性が明らかになり、これにより、ベータグルクロニダーゼが血管の内側を覆う血管周囲空間を介して脳実質に到達したことが示された。嫌悪連合学習を恐怖条件付けの状況で試験した。年齢を釣り合わせたヘテロ接合性対照と比較して、罹患しているマウスでは、条件恐怖反応および文脈識別が損なわれた。この行動欠陥は、ＡＡＶ４ベータグルクロニダーゼによる処置を受けたＭＰＳ ＶＩＩマウスでは遺伝子移入の６週間後に逆転した。データから、上衣細胞が、周囲の脳実質およびＣＳＦ中に分泌される酵素の供給源としての機能を果たし得ることが示される。
しかし、驚いたことに、これらの研究を大きな哺乳動物（すなわち、イヌおよび非ヒト霊長類）に拡張すると、ＡＡＶ４ベクターは、これらの動物における上衣の標的化において有効ではなかった。その代わりに、ＡＡＶ２ベクターを使用する必要があった。簡単に述べると、ＴＰＰ１（ＡＡＶ２−ＣＬＮ２）をコードするｒＡＡＶ２を生成し、上衣に形質導入するために脳室内に注射した（Liuら、J. Neuroscience、２５巻（４１号）：９３２１〜９３２７頁、２００５年）。ＴＰＰ１は、ＬＩＮＣＬが欠損した酵素である。データから、ＮＨＰ脳における上衣への形質導入により、ＣＳＦ中の酵素の有意な増加がもたらされることが示された。結果から、種々の脳領域におけるＴＰＰ１活性のレベルの上昇が示された。ここで、垂直方向の軸は活性の対照に対する％を示す（図７）。
処置した最初のイヌでは、ベクターの送達は最適以下であったが、それでも脳においてＣＬＮ２活性が示された。その後のイヌには定位脳手術を用いてＩＣＶ送達を行った。Ｔ迷路動作によって測定して、処置したイヌの認知能力が無処置のイヌを凌駕して有意に改善されたことが見いだされた（図８）。さらに、ＬＩＮＣＬのイヌモデルにおけるＡＡＶ２−ＣＬＮ２のＩＣＶ送達の影響は非常に著しいものであった。無処置の（−／−）動物では、大きな脳室が存在するが、無処置の対照および処置した動物の脳では脳室は示されなかった。ＡＡＶ．ＴＰＰ１をＬＩＮＣＬイヌの脳室に送達した後、小脳および上部脊髄を含めた種々の脳領域において検出可能な酵素活性が認められた。生きている追加の罹患しているイヌ２匹では、脳萎縮は有意に減弱し、寿命が延び、認知機能が改善された。最後に、本発明者らは、ＮＨＰでは、この方法により、野生型を２〜５倍上回るＴＰＰ１活性レベルを実現できることを示す。
いくつかのＡＡＶベクターを生成し、ＩＴＲとカプシドの最適な組合せを決定するために試験した。ＡＡＶ２ ＩＴＲが最も有効であることが決定されたら、５つの異なる組合せを作製した：ＡＡＶ２／１（すなわち、ＡＡＶ２ ＩＴＲおよびＡＡＶ１カプシド）、ＡＡＶ２／２、ＡＡＶ２／４、ＡＡＶ２／５、およびＡＡＶ２／８。大きな哺乳動物（イヌおよびＮＨＰ）では、ＡＡＶ２／２がはるかに良好に機能し、その後にＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／１およびＡＡＶ２／４が続くことが発見された。これは、ウイルスベクターの効果の順位がマウスで観察されたものと逆であったので、かなり驚くべきことであった。
したがって、本研究により、脳室内側を覆う細胞が、脳全体にわたって分布させるためのＣＳＦ中の組換え酵素の供給源になり得ること、およびＡＡＶ２／２が、イヌおよび非ヒト霊長類においてＣＬＮ２（ＴＰＰ１）をコードする遺伝子などの治療用作用物質を投与するための有効なビヒクルであることが示された。
（実施例３）
遺伝子移入によって送達されたヒトＡＰＯＥアイソフォームは、アミロイド沈着、クリアランス、および神経毒性に影響を及ぼすことによってアルツハイマー病を示差的に調節する
アルツハイマー病（ＡＤ）は、最も頻度の高い加齢性の神経変性障害であり、主要な公衆衛生の懸念になっている。遅発性散発性型のＡＤに関連する易罹患性遺伝子の中でも、アポリポタンパク質Ｅ ε４（ＡＰＯＥ−遺伝子；ＡｐｏＥ−タンパク質）対立遺伝子は、最も有意な遺伝的リスク因子である。ＡＰＯＥ ε４が１コピー存在することにより、疾患が発生するリスクが最も一般的なＡＰＯＥ ε３対立遺伝子と比較して３倍に実質的に上昇し、２コピーでは１２倍の上昇がもたらされる。興味深いことに、ＡＰＯＥ ε２は逆の影響を有し、保護性因子であり、したがって、この特定の対立遺伝子の遺伝により、年齢を調整したＡＤのリスクがＡＰＯＥ３／３と比較して約半分に低下する。認知症の平均発症年齢もこれらのリスクプロファイルに対応し、ＡＰＯＥ４／４保有者は６０代半ばで発症し、ＡＰＯＥ２／３保有者は、ほぼ３０年シフトして９０代前半で発症し、ＡＰＯＥ３／３個体の発症年齢はそれらの中間の１９７０年代半ばである。
ＡｐｏＥがＡＤに影響を及ぼす機構は議論の的になっている。患者の海馬および皮質におけるＡβを含有する老人斑の蓄積は、稀な常染色体優性型の疾患に関与する公知の遺伝子が全てＡβペプチドの産生に関与するので、ＡＤにおいて中心的な役割を果たすと考えられる。興味深いことに、ＡＰＯＥ遺伝子型は、ＡＤの患者におけるアミロイド沈着の程度ならびに剖検試料において検出される神経毒性可溶性オリゴマーＡβの量に強力に影響を及ぼすことが示された。ＡｐｏＥアイソフォームは、脳血管の完全性に示差的に影響を及ぼし、また、血液脳関門を通じたＡβペプチドの流出に影響を及ぼし、したがって、血管周囲へのアミロイド凝集体の集積（脳アミロイド血管症またはＣＡＡ）を調節することが示唆されている。さらに、ＡｐｏＥは、神経変性およびニューロン可塑性とも直接関連付けられている。ＡｐｏＥ２の影響は、これらの状況で相対的に研究中である。
ヒトＡＰＯＥ２、ヒトＡＰＯＥ３およびヒトＡＰＯＥ４を発現する遺伝子操作された動物は、ヒトと同様のアミロイド負荷量（ｂｕｒｄｅｎ）の順位を有し、これは、異なるＡｐｏＥアイソフォームが斑の開始および／または成長に影響を及ぼすという仮説と一致する。しかし、現存するアミロイド沈着に対する、および現存する神経変性に対する、ＡｐｏＥに媒介される影響の機構を詳細に分析するためにはさらなる研究が必要である。知見のこのギャップを克服するために、本発明者らは、種々のＡＰＯＥ対立遺伝子（またはＧＦＰ対照）を発現するアデノ随伴ウイルスベクターを側脳室内に注射して、第一に上衣を形質導入し、その後、それがＡｐｏＥを脳脊髄液および間質液内に送達するための生物学的工場としての機能を果たす、遺伝子移入手法を使用した。次いで、本発明者らは、斑の形成、成長、およびＡｐｏＥ２の場合では溶解に対する種々のＡｐｏＥアイソフォームの影響を追跡するために生体内多光子顕微鏡法を使用し、ＩＳＦ中のＡｐｏＥおよびＡβ生化学的変数をモニターするためにｉｎ ｖｉｖｏ微量透析手法を使用し、Ａβ関連神経毒性の変化を評価するためにアレイ断層撮影法を使用した。本発明者らは、ＡｐｏＥアイソフォームがＩＳＦ中の可溶性オリゴマーＡβのレベル、Ａβの線維化および沈着のペース、一度形成されたアミロイド沈着の安定性、それらのクリアランス、ならびに斑周囲の神経毒性作用の程度に影響を及ぼすことを見いだした。実際に、ＡｐｏＥ４による処置を受けたＡＤマウスでは、可溶性Ａβの量の増強、より高密度の線維状斑、シナプス要素消失の増悪および各沈着の周囲の神経突起ジストロフィーの数の増加が示されるが、ＡｐｏＥ２を用いると相対的に保護性の効果が観察された。これらのデータから、ＡＰＯＥ対立遺伝子が、ＡＤに対するそれらの影響を主にＡβを通じて媒介するという仮説が支持され、ＡｐｏＥが治療上の標的として強調される。
結果
ＡＡＶ４−ＡＰＯＥの脳室内注射により、脳における安定なＡＰＯＥ発現およびヒトＡｐｏＥの持続的産生がもたらされる
アポリポタンパク質Ｅは、主にアストロサイトおよび小膠細胞によって産生され、大脳実質全体にわたって拡散し得る天然に分泌されるタンパク質である。本発明者らは、ＧＦＰ（対照）または各ＡＰＯＥ対立遺伝子をコードするＡＡＶ血清型４を７カ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１マウスの側脳室（ｌａｔｅｒａｌ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｖｅｎｔｒｉｃｌｅ）に注射することにより、この特性を利用した。大脳領域がＡＤの独特の病変の影響を受けることを考慮すると、この戦略は、複数の実質内注射と比較して大きな利点をもたらすものであった。
注射の２カ月後、形質導入された細胞が脈絡叢および脳室の内側を覆う上衣において検出され、したがって、ＡＡＶ４ベクターの機能性が確認された。各種に特異的な抗体を使用して、ヒトＡｐｏＥタンパク質とマウスＡｐｏＥタンパク質もＥＬＩＳＡ（図９Ａ、９Ｂおよび１５Ａ）およびウエスタンブロットによって検出された。本発明者らにより、ヒトアポリポタンパク質Ｅの濃度が平均で総タンパク質量１ｍｇ当たり２０μｇに達したことが観察され（図９Ａ）、これは、内因性マウスａｐｏＥの約１０％を表す（図９Ｂ）。このそれほど大きくない追加量のヒトＡｐｏＥの存在により、内因性マウスａｐｏＥタンパク質のレベルは検出可能には変更されなかった（図１５Ａ）。ＡＡＶ４注射の２カ月後から５カ月後の間に、小さいが統計的に有意な低下が観察された（図１５Ｂ）。それにもかかわらず、ヒトタンパク質のレベルは、対照群と比較して、検出可能なままであり、これにより、ＡＡＶ４媒介性形質導入によって実質全体にわたる分泌型組換えタンパク質の持続的産生のプラットフォームがもたらされたことが示唆された。実際に、内因性マウスａｐｏＥタンパク質が蓄積することが公知である皮質外套全体にわたってＡＰＰ／ＰＳ１マウスのアミロイド沈着の周囲にヒトＡｐｏＥタンパク質を検出することができた。
次に、本発明者らは、高度に生物学的活性のあるＡβ可溶性種も含有する細胞外区画である間質液（ＩＳＦ）中のヒトＡｐｏＥの存在を評価した。脳全体の溶解物中に比較的少量のＡｐｏＥが検出されたので、本発明者らは、いくつかのａｐｏＥ ＫＯマウスに各ＡＡＶ４−ＡＰＯＥベクターを注射し、高感度であるが非種特異的な抗体を使用してヒトタンパク質の存在を追跡した。微量透析技法を使用して、本発明者らは、注射を受けたａｐｏＥ ＫＯ動物のＩＳＦ中のＡｐｏＥの存在を確認した。
全体として、これらのデータから、脳実質全体にわたる、およびＩＳＦ中での目的のタンパク質の持続的産生を導くにはＡＡＶ４の単回の脳室内注射が十分であること、ならびに、上衣／脈絡叢を、潜在的な治療用タンパク質を脳に送達するための「生物学的ポンプ」として使用することができることが確認される。
ＡｐｏＥアイソフォームの注入は、アミロイドペプチドおよび斑の沈着に示差的に影響を及ぼす
安楽死の前５カ月間、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスに、ＧＦＰまたは種々のＡｐｏＥアイソフォームを発現するベクターを用いて形質導入した。アミロイド斑負荷量（ｌｏａｄ）の分析により、５カ月後に、ＡＡＶ４−ＡＰＯＥ４の注射を受けた動物の皮質において、ＡＰＯＥ２を発現する動物と比較して、アミロイド沈着の密度の有意な上昇が観察されたことが明らかになった。ＡＡＶ４−ＧＦＰによる処置を受けたマウスおよびＡＡＶ４−ＡＰＯＥ３による処置を受けたマウスにおける斑の密度は、中間のレベルであり、互いと異ならなかった（図１６Ａ）。
ギ酸抽出物から測定したＡβ４０ペプチドおよびＡβ４２ペプチドの濃度はアミロイド斑含有量について観察された変化を模倣し、したがって、５カ月後に、ＡＰＯＥ４対立遺伝子を発現するマウスではアミロイドペプチドの濃度の上昇が見いだされ（図１６Ｂ）、ＡＰＯＥ２を用いた場合には逆の効果が検出された。ＴＢＳ可溶性画分中のＡβ４０ペプチドおよびＡβ４２ペプチドの含有量は、各ＡＡＶ−ＡＰＯＥの注射の影響を同様に受けた（図１６Ｃ）。さらに、凝集Ａβペプチドと可溶性Ａβペプチドの比は、ＡｐｏＥ曝露によって変化しないままであり、したがって、別個のヒトＡｐｏＥアイソフォームのそれぞれの過剰発現により、線維状アミロイド種および可溶性アミロイド種の両方が同時に調節されることが示唆された。
２カ月のみにわたる各ＡｐｏＥアイソフォームの過剰発現により、５カ月の研究において観察されたものよりも小さな影響がもたらされる。それにもかかわらず、他の実験群と比較して、ＡＡＶ４−ＡＰＯＥ４の注射を受けたマウスの皮質領域内のアミロイド斑の密度の有意な上昇が観察された（図１６Ａ）。これは、ギ酸画分中に含有されるＡβの量と類似し（図１６Ｃ）、これにより、この特定の変異体の優勢な影響が実証された。ＴＢＳ可溶性Ａβ４０／４２種は、それぞれＡＡＶ４−ＡＰＯＥ２またはＡＡＶ４−ＡＰＯＥ４を２カ月にわたって発現させると、少なくなるまたは多くなる傾向のみを示した（データは示していない）。
ヒトＡｐｏＥアイソフォームの存在がＡβの線維化の程度の初期変化を反映し得るかどうかを決定するために、本発明者らは、注射の２カ月後の、Ｂａｍ１０を使用したＡβについてのロバストな免疫染色（全てのアミロイド沈着を標識する）とＴｈｉｏ−Ｓを使用したＡβについてのロバストな免疫染色（密集したコアのみを染色する）の比も測定した。３種のアイソフォームの中で変化は検出されず、これにより、この時間枠内で、密集したアミロイド沈着集団および拡散したアミロイド沈着集団の分布に対して実験群の間で示差的な影響はなかったことが示唆された（図１６Ｂ）。これらのデータから、ＡｐｏＥ変異体への曝露が長い方が、短い曝露よりもアミロイド沈着に対する影響が強力であることが示される。
ＡｐｏＥは、血液脳関門を横切るＡβ輸送において役割を果たすことが示唆されている。ＡｐｏＥアイソフォームへの曝露により血液脳関門を通るＡβペプチドの流出を調節することができるかどうかを試験するために、注射を受けた各動物の血漿中のＡβ４０の濃度を測定した。本発明者らにより、ＡＡＶ４−ＡＰＯＥ３を脳室内注射したマウスおよびＡＡＶ４−ＡＰＯＥ４を脳室内注射したマウスのヒトＡβの血漿中含有量はどちらも、ＡＡＶ４−ＡＰＯＥ２およびＡＡＶ４−ＧＦＰと比較して少ないことが観察された（図１０Ｄ）。これにより、Ｅ３変異体とＥ４変異体はどちらも、Ａβを中枢神経系区画内に保持する助けとなることが示唆され、これは、観察した大脳実質におけるＡβの相対的な濃度の上昇、およびＡｐｏＥに起因したＡβの半減期の増強が示唆される以前のデータと一致する。
ＡＰＯＥ４保有者は、神経血管の機能障害にかかりやすく、ＡＰＯＥ４トランスジェニックマウスでは、アミロイド沈着の不在下でさえ血液脳関門の崩壊が好都合であることが最近示された。ＡＰＰ／ＰＳにおけるＡＡＶ４−ＡＰＯＥの脳室内注射によりＢＢＢの完全性が損なわれ得るかどうかを評価するために、プルシアンブルーを用いた死後染色を実施した。全群において脳にわたって低密度に拡散したヘモジデリン陽性病巣領域がわずかに存在するにもかかわらず、動物の実験群のいずれの間でも明白な差異は観察されなかった。
ＡｐｏＥアイソフォームの発現によりアミロイドーシスの進行の動態が調節される
ＡｐｏＥ４はアミロイド沈着の密度の上昇に関連したが、ＡｐｏＥ２を用いると５カ月後に逆の効果が観察された。これは、アミロイドβの沈着、クリアランス、またはその両方の速度の変化を反映する可能性がある。ＡｐｏＥ変異体が動的なアミロイドーシスの進行にどのように影響を及ぼすかを評価するために、本発明者らは、ｉｎ ｖｉｖｏ二光子イメージングを使用し、アミロイド斑の形成およびクリアランスの動態を追跡した。７カ月齢のマウスにＡＡＶ４ベクターを脳室内注射し、第１のイメージングセッション（Ｔ０）を実施するために、注射の１週間後に頭蓋窓を埋め込んだ。１カ月後（Ｔ１）および２カ月後（Ｔ２）に、同じ視野のアミロイド沈着を画像化した。第２のイメージングセッション後、マウスを死後分析のために安楽死させた。
２カ月の期間にわたって小さな視野体積においてアミロイド沈着の大部分は安定なままであったが、時々新しい斑を検出することができた。さらに、稀な場合、実験の開始のときに画像化されたメトキシ陽性斑は、１カ月後または２カ月後には検出することができず、これにより、いくつかの斑が除去され得たことが示唆される。経時的に、本発明者らは、容積測定によるアミロイド沈着の密度の全体的な上昇を観察し、Ｔ２における密度は平均でＴ１よりも２３％大きかった。アミロイド進行の速度は、ＡｐｏＥ４による処置を受けたＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいてより速かったが、ＡｐｏＥ２に曝露した動物では、２カ月後に、ＧＦＰ（０．６６）、ＡｐｏＥ３（０．６７）およびＡｐｏＥ４（０．７４）と比較してアミロイド沈着の密度が有意に低下した（図１１Ａ、１１Ｂ）。重要なことに、ＡｐｏＥ２による変化は、ベースラインからの低下を反映し、これにより、直接、および初めて、斑の非免疫媒介性活性クリアランスが示される。ＡＰＯＥトランスジェニック動物から得られたデータとは対照的に、これらの結果から、アミロイド沈着がすでに開始した後でも、ＡｐｏＥの量のそれほど大きくない増加を誘導することにより、進行中のアミロイド形成プロセスに影響を及ぼすことができることが実証される。
本発明者らは、次に、単一のアミロイド斑の成長を、Ｔ１／Ｔ０とＴ２／Ｔ１の間の個々の沈着の断面積の比を測定することによって評価した。Ｔ１（Ｔ１／Ｔ０比）では群間で差異が検出されたが、Ｔ２（Ｔ２／Ｔ１比、図１２）では差異は検出されず、これにより、ヒトＡｐｏＥ変異体の存在は、曝露後１カ月の間の斑の成長に主に影響を及ぼすが、このパラメータは、その後は異ならないことが示唆される。具体的には、アミロイド沈着のサイズは、ＡｐｏＥ４による処置を受けたマウスにおいて、ＡｐｏＥ２およびＡｐｏＥ３のどちらと比較しても有意に成長が大きく、これにより、この対立遺伝子によって斑の数だけでなくそれらのサイズも悪化したことが示唆される。したがって、ＡｐｏＥ４は、Ａβペプチドの播種ならびに既存の斑のサイズの両方に影響を及ぼす。
アミロイド沈着周囲のシナプス密度は、ＡｐｏＥ３およびＡｐｏＥ４アイソフォームにより、ＡｐｏＥ２と比較して悪化する
シナプス消失は、認知障害と最もよく相関するパラメータである。本発明者らは最近、ＡｐｏＥ４の存在が、ヒトＡＤ患者の脳における高レベルのシナプスオリゴマーＡβと関連し、ＡｐｏＥ３と比較してアミロイド斑周囲のシナプス密度を有意に低下させることを示した（R. M. Koffieら、Apolipoprotein E4 effects in Alzheimer's disease are mediated by synaptotoxic oligomeric amyloid-beta. Brain １３５巻、２１５５頁（２０１２年７月）；T. Hashimotoら、Apolipoprotein E, Especially Apolipoprotein E4, Increases the Oligomerization of Amyloid beta Peptide. J Neurosci ３２巻、１５１８１頁（２０１２年１０月２４日））。さらに、最近のｉｎ ｖｉｔｒｏにおける証拠により、ＡｐｏＥ４はＡβに誘導されるシナプス消失からの保護ができないことが実証された（M. Buttiniら、Modulation of Alzheimer-like synaptic and cholinergic deficits in transgenic mice by human apolipoprotein E depends on isoform, aging, and overexpression of amyloid beta peptides but not on plaque formation. J Neurosci ２２巻、１０５３９頁（２００２年１２月１５日）；A. Sen、D. L. Alkon、T. J. Nelson、Apolipoprotein E3 (ApoE3) but not ApoE4 protects against synaptic loss through increased expression of protein kinase C epsilon. J Biol Chem ２８７巻、１５９４７頁（２０１２年５月４日））。したがって、本発明者らは、各ＡｐｏＥアイソフォームの継続的かつ拡散性の分布は、ＡＰＰ／ＰＳマウスの脳におけるＡβの沈着およびクリアランスの動態だけでなく、アミロイド沈着周囲のシナプスの完全性にも示差的に影響を及ぼす可能性があるという仮説を立てた。
シナプス前部要素およびシナプス後部要素の密度（それぞれシナプシン−１およびＰＳＤ９５）を、超薄組織切片の免疫蛍光染色に基づく高分解能技法であるアレイ断層撮影法を使用して決定した（K. D. Micheva、S. J. Smith、Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron ５５巻、２５頁（２００７年７月５日）；R. M. Koffieら、Oligomeric amyloid beta associates with postsynaptic densities and correlates with excitatory synapse loss near senile plaques. Proc Natl Acad Sci U S A １０６巻、４０１２頁（２００９年３月１０日））。アミロイドオリゴマー種は、アミロイド沈着のすぐ付近に高度に濃縮されることが示されたので、シナプシン−１およびＰＳＤ９５の斑点を、以前に確立されたプロトコール（R. M. Koffieら、Oligomeric amyloid beta associates with postsynaptic densities and correlates with excitatory synapse loss near senile plaques. Proc Natl Acad Sci U S A １０６巻、４０１２頁（２００９年３月１０日））を使用して、斑から遠く（＞５０μｍ）または近く（＜５０μｍ）のいずれかで定量した。本発明者らは、ＡＰＯＥ３またはＡＰＯＥ４のいずれかが発現した場合には斑の近くのシナプス前部要素の消失が悪化し、ＡＡＶ４−ＡＰＯＥ２またはＡＡＶ４−ＧＦＰの注射後にはそうではなかったことを観察した（図１３Ａ）。対照的に、シナプス後部斑点の密度は、ＧＦＰの注射を受けたマウス、ＡｐｏＥ２の注射を受けたマウスおよびＡｐｏＥ３の注射を受けたマウスの間で変化しないままであったが、ＡｐｏＥ４による処置を受けた動物では、アミロイド沈着の周囲のＰＳＤ９５の有意な消失、したがって、Ａβの神経毒性作用に対するＡｐｏＥ４の有害作用の強化が示された（図１３Ｃ）。アミロイド沈着から遠く（＞５０μｍ）に位置する領域内のシナプス要素の密度を評価した場合、群間で差異を検出することはできず、これにより、ヒトＡｐｏＥ変異体それ自体によるシナプス密度への影響はないが、Ａβに誘導される神経毒性に対するＡｐｏＥアイソフォームの重要な影響があることが示唆される。したがって、ＡｐｏＥ３およびＡｐｏＥ４を用いて観察される相対的なシナプスの消失は、各斑の周囲のＡβペプチドの存在（その端部から＜５０μｍの距離）に直接関連する。
追加の神経病理学的パラメータとして、本発明者らは、ＡＡＶ４の注射を受けたＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいて、アミロイド沈着に関連する神経突起ジストロフィーの数も評価した。老人斑は、アミロイド沈着の周囲のスパイン密度を低下させることに加えて、神経突起の屈曲の増加および膨張したジストロフィーの出現を伴うより一般的なニューロピルの変更も引き起こす。これらの病理学的変化は、斑表面の５０μｍ以内の領域に富化される可溶性オリゴマーＡβ種に起因する可能性がある。本発明者らは、ＡｐｏＥ４の過剰発現により、ＧＦＰ、ＡｐｏＥ２およびＡｐｏＥ３と比較して、アミロイド沈着に関連するＳＭＩ３１２陽性神経突起ジストロフィーの形成が増悪することを観察した（図１３Ｃ）。この結果から、ＡｐｏＥ４アイソフォームが最も強力に影響を及ぼし、斑形成を調節するだけでなく、アミロイドに関連する神経毒性にも影響を及ぼすという知見が確認される。
ＡＤの別のマウスモデルにおいて、ヒトＡｐｏＥタンパク質により間質液に含有されるオリゴマーＡβ種の量が改変される
本発明者らは、次に、ＩＳＦ中の異なるＡｐｏＥアイソフォームの存在により、それと同じ細胞外区画内の可溶性アミロイド種の量が変更され得るかどうかという質問に対処した。本発明者らは、異なるトランスジェニックマウス系統における本発明者らの以前の所見を検証するために、ＡＤの別のモデル、Ｔｇ２５７６マウスを注射のために選択した。Ｔｇ２５７６マウスは、スウェーデン変異を含有するＡＰＰの変異型を過剰発現し、所与の年齢のＡＰＰ／ＰＳ１マウスよりもはるかに穏やかな表現型を示す。本発明者らは、１６〜１８カ月齢の動物のコホートに注射し、したがって、アミロイド沈着はＡＡＶ４−ＡＰＯＥによる形質導入のときにはすでに存在していた。遺伝子移入の３カ月後、微量透析プローブを海馬に挿入し、試料を収集してＩＳＦ中の各ＡＰＯＥ変異体に関連する初期変化を特徴付けた。
本発明者らは、特異的な８２Ｅ１／８２Ｅ１ ＥＬＩＳＡアッセイを使用して測定されたＡβオリゴマー種の濃度は、ＡＡＶ４−ＡＰＯＥ４の注射後に、ＡＡＶ４−ＡＰＯＥ２と比較して有意に高いことを観察し（４２±７％）（図１４）、これにより、ＡｐｏＥの存在により、この細胞外区画内のアミロイド凝集体の性質が調節され得ることを示唆した。さらに、総Ａβ４０およびＡβ４２をＩＳＦにおいて評価したところ、同じ傾向が観察されたが、有意には達せず（図１７Ａ）、これにより、ＩＳＦ中の異なるＡｐｏＥアイソフォームの存在がアミロイドペプチドの凝集状態に総量よりもいくらか多く影響を及ぼすことが示唆される。
予測通り、種々のＡｐｏＥアイソフォームに曝露したＴｇ２５７６マウス由来の脳の死後生化学的分析により、ＡｐｏＥ４による処置を受けた動物ではギ酸画分中のＡβ４２の濃度が有意に上昇することが示され（図１７Ｂ）、これにより、第２のトランスジェニックモデルにおいて、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおける本発明者らの知見が確認される。
総合すると、これらの生化学的尺度から、Ｔｇ２５７６マウスにおけるＡｐｏＥ発現により、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいて観察されたのと同様のアミロイドの生物学的性質の変化が誘導されることが示唆される。重要なことに、初期変化は、ＩＳＦ中のｏＡβの含有量について観察され、ここで、これらの神経毒性種は、シナプス末端と直接相互作用し得る。
考察
リスクを上昇させるＡＰＯＥ４対立遺伝子の遺伝と、ＡＤの発生に関して劇的な逆の効果を有するＡＰＯＥ２対立遺伝子との間の著しい関係により、このリスクがどのように媒介されるかに関する複数の示唆がもたらされている。ＡｐｏＥは、Ａβクリアランスに関与するＡβ結合性タンパク質として関連付けられている。しかし、ａｐｏＥノックアウトマウスにおける研究では、驚いたことに、Ａβの沈着がａｐｏＥの不在下では実質的に少ないことが報告された。ヒトＡＰＯＥ２、ＡＰＯＥ３、またはＡＰＯＥ４で置き換えることにより、ＡＤ患者におけるものと同じ順位でアミロイド沈着が増加し、これは、斑の開始または原線維形成に対する影響によって起こると仮定された。代替の仮説は、神経突起伸長に対する示差的な影響に焦点を当てたものである、または、さらにはアルツハイマー病表現型に対するＡＰＯＥ遺伝子型の影響は、第１９染色体上のＡＰＯＥと遺伝子不均衡にある別の遺伝子の結果であることを提唱するものである。
リソソーム蓄積症およびハンチントン病の状況で以前に試験した手法を使用した２つの異なるマウスモデルの研究に由来する本発明者らのデータは、オリゴマーＡβの検査を可能にする、ｉｎ ｖｉｖｏ多光子イメージング、標準の定量的免疫組織病理検査、シナプスの構造に関するアレイ断層撮影法による研究、および新規の高分子量微量透析手法の組合せを使用することによってこれらの問題に直接対処した。本発明者らは、確立した疾患を有する動物におけるＩＳＦ ＡｐｏＥ微小環境を変化させることには、Ａβの効率的使用に対する著しく急速な対立遺伝子特異的影響があることを示した。本発明者らの研究により、ＩＳＦに送達されるＡｐｏＥ４レベルのそれほど大きくない（約１０％）上昇でさえ、可溶性Ａβならびに線維状およびギ酸により抽出可能な形態の上昇のＡｐｏＥ４に関連する保持を伴ってＡβの表現型およびクリアランス動態に著しく影響を及ぼし、また、シナプスの消失および神経突起ジストロフィーの増加によって特徴付けられる斑の周囲の神経毒性が増加することが実証された。逆に、ａｐｏＥ２はＡβを低下させ、顕著な神経保護性の効果を有する。
ＩＳＦ ＡｐｏＥのレベルのより穏やかな変化がそのような劇的な結果を有するので、これらの結果から、ＡＰＯＥ発現に影響を及ぼすことによってＡＤのリスクまたはＡＤの進行を変更させる可能性がある多種多様な環境および遺伝因子の影響に関する洞察がもたらされ得る。本発明者らが実証した規模よりも実質的に大きなＡｐｏＥの増加が外傷、てんかん、虚血および高コレステロール食事の後に起こる可能性があり、これらは全て、大脳Ａβの上昇と関連している。さらに、ＡＰＯＥ４対立遺伝子と遺伝子不均衡にあることが以前に見いだされているプロモーター多型がＡＰＯＥ発現に影響を及ぼす。
ＣＮＳにおけるＡｐｏＥまたはＡｐｏＥ−リポタンパク質の恒常性に影響を及ぼす他の操作により、Ａβの沈着が明白に変化する。例えば、ＡＰＯＥレンチウイルスを用いた限局的な遺伝子移入（主に海馬のニューロンへのもの）を用いた実験では、ＡＰＯＥ４過剰発現は、ＡＰＯＥ３と比較してより強力な影響をアミロイドに対して発揮する。以前の研究により、内因性ａｐｏＥ合成の増強を含めた複数の作用を有するＲＸＲアゴニストにより、おそらく、血液脳関門を渡るクリアランスに影響を及ぼすことによって、Ａβの脳からのクリアランスがもたらされることも示された。さらに、ＣＮＳにおいてコレステロールを代謝し、そのレベルを低下させるＣＹＰ４６Ａの脳への形質導入により、脳内の、ａｐｏＥレベルを低下させることが公知であるＬＤＬ−Ｒが増加するにつれ、Ａβの沈着が減少する。最後に、遺伝子操作により、ａｐｏＥ発現が半分変化することによりＡβ表現型が影響を受け得ることが示唆される。興味深いことに、本発明者らの結果から、より穏やかな変化でも、劇的な効果を有し得ることが示唆される。
本発明者らのデータは、ＡＰＯＥ−アルツハイマー文献における４つの他の重要な議論の領域に直接対処するものである。１）本発明者らは、どちらも神経細胞系の機能の機能障害に関連する可能性があるシナプス消失および神経突起ジストロフィーによって評価される、ＡｐｏＥアイソフォームの神経毒性に対する明白な効果を実証する。これらの効果は斑のすぐ近くにおいて明らかであったが、斑から遠い領域では明らかでなかったので、ＡｐｏＥ４と比較してＡｐｏＥ２のシナプス保護性は、シナプス安定性に対するＡｐｏＥの直接の効果に起因するのではなく、斑のＡβの周囲に対する効果によって媒介される可能性がある。２）縦方向の多光子ｉｎ ｖｉｖｏイメージングを使用した斑の沈着および成長の動態の直接観察により、ＡｐｏＥ４は斑の沈着および成長を増強するが、ＡｐｏＥ２は、斑の消散に実際に関連することが示され、これにより、ＡｐｏＥアイソフォームが、線維状斑形成に対する最初の影響を超えて疾患のペースおよび進行に対する強力な影響を有することが示される。この結果から、ＡｐｏＥ４は、アミロイド沈着と神経毒性の両方に関して疾患過程を加速し得る（したがって、発症年齢の低下をもたらす）が、ＡｐｏＥ２は逆であるという見解が補強され、これにより、疾患が十分に確立された後でさえ、ＡｐｏＥ２（またはＡｐｏＥ２模倣物）をＣＮＳに導入することには治療的価値があり得るという可能性が生じる。３）ＡｐｏＥは、Ａβを脳から除去する機構として、またはクリアランス半減期を増加させる保持分子として多様に提案されている；本発明者らの現在の結果では、ＡｐｏＥ２を除き、それほど多くない量のＡｐｏＥをＩＳＦに導入することが、ＣＮＳ内のＡβの保持を増強するのに十分であることが示される。４）ＡＤにおけるＡＰＯＥ２の注目すべき保護性作用の機構は、一部において、ＡｐｏＥ２のＡｐｏＥ受容体への結合が比較的乏しいことが理由で、長く不明のままである。本発明者らの現在のデータから、ＡｐｏＥ２が、可能性のある血漿中へのＡβクリアランスに対する中立的またはヌルの効果に加えて、機能獲得を有する−確立したＡβの沈着を実際に逆転させること、ならびにシナプスおよび神経突起の可塑性を支持することが可能である−ことが示唆される。これにより、ＡＰＯＥ４対立遺伝子が遺伝している患者とＡＰＯＥ２対立遺伝子が遺伝している患者の間の発症年齢の数十年の違いが、Ａβの沈着およびクリアランスの動態における異なる開始点および継続的な差異と、沈着に関連する神経毒性の程度の対立遺伝子に特異的な差異との両方を反映し得ることが示唆される。ＡｐｏＥ２のこの二重の機能により、その斑の除去およびシナプス回復能力を模倣することを目的とした治療的手法がもたらされ得る。
これらの結果は、ａｐｏＥがＡβオリゴマー形成の足場として作用するモデルと、オリゴマーＡβの形成および安定化の効率がＡｐｏＥ４＞ＡｐｏＥ３＞ＡｐｏＥ２であることと、オリゴマーＡβがＡｐｏＥ４＞ＡｐｏＥ３ヒトＡＤの患者のＣＮＳにおいて上昇する（斑負荷量（ｂｕｒｄｅｎ）を症例にわたって正規化した場合でさえも）という本発明者らの最近の知見と一致する。本発明者らは、ＡｐｏＥ、特にＡｐｏＥ４により神経毒性オリゴマーＡβの形成が媒介される場合、現在のデータにおいてそうであるようにみえるのと同様に、ＡｐｏＥ４の増強によりシナプスおよび神経突起の変更の増加がもたらされると予測した。これらの結果に基づいて、ＡＰＯＥ４対立遺伝子が遺伝しているＡＤ患者の脳内のＡｐｏＥレベルを上昇させる作用物質に関して注意が払われるべきである。
最後に、本発明者らのデータから、分泌タンパク質を脳およびここでは皮質外套全体に送達するための上衣へのＡＡＶ媒介性形質導入の能力が確認される。ａｐｏＥ４を低下させるもしくはａｐｏＥ２を増加させる遺伝子移入または他の手法は、ＡＤ疾患の進行に影響を及ぼす強力な手段である。
材料および方法
動物。ＡＰＰｓｗｅ／ＰＳ１ｄＥ９（ＡＰＰ／ＰＳ１）二重トランスジェニックマウス（D. R. Borcheltら、Accelerated amyloid deposition in the brains of transgenic mice coexpressing mutant presenilin 1 and amyloid precursor proteins. Neuron １９巻、９３９頁（１９９７年１０月））（Jackson laboratory、Bar Harbor、Maineから入手）およびＴｇ２５７６マウス（K. Hsiaoら、Correlative memory deficits, Abeta elevation, and amyloid plaques in transgenic mice. Science ２７４巻、９９頁（１９９６年１０月４日））の両方を使用して実験を実施した。スウェーデン二重変異Ｋ５９４Ｎ／Ｍ５９５Ｌを含有するヒト変異体アミロイド前駆体タンパク質遺伝子を、これらの２種のマウス系統のゲノムに、プリオンタンパク質プロモーターの制御下で挿入した。さらに、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスモデルは、エクソン９が欠失したプレセニリン１遺伝子の変異体を過剰発現する（同じプロモーターによって駆動される）。ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおけるＡＰＰｓｗｅおよびＰＳＥＮ１の同時過剰発現により、より重症の表現型がもたらされ、実質的なアミロイド沈着が６カ月齢の早さで現れる。他方では、Ｔｇ２５７６マウス系統は、はるかに軽症のモデルであり、約１年齢でアミロイド斑が発生するだけである。異なるＡｐｏＥアイソフォームの導入が疾患の進行に影響を及ぼすかどうかを決定するために、本発明者らは、７カ月齢および１６カ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１マウス（条件当たり動物４匹から７匹の間）ならびにＴｇ２５７６マウス（条件当たり動物３匹から５匹の間）にそれぞれ注射を行った。ＡＰＯＥ欠損マウス（ＡｐｏＥ−ＫＯ、ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、Ｍａｉｎｅ）も使用した。ＮＩＨおよび施設のガイドラインに従って実験を実施した。
ウイルスベクターの構築および作製
ＡＰＯＥ−２ ｃＤＮＡ、ＡＰＯＥ−３ ｃＤＮＡおよびＡＰＯＥ−４ ｃＤＮＡは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｉｌｌｉｎｏｉｓ（Ｃｈｉｃａｇｏ）のＤｒ．ＬａＤｕから惜しみなく提供された。ＰＣＲによって増幅した後、そのそれぞれをＢａｍＨＩによって消化し、ＡＡＶ２−ｐＣＭＶ−ｈｒＧＦＰ骨格に挿入した。高力価のＡＡＶ血清型４ベクター（ＡＡＶ４−ＡＰＯＥ２、ＡＡＶ４−ＡＰＯＥ３、ＡＡＶ４−ＡＰＯＥ４およびＡＡＶ４−ＧＦＰ）は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｉｏｗａ、Ｉｏｗａ ＣｉｔｙのＧｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｒｅにより、バキュロウイルス系を使用して作製された。定量的ＰＣＲを使用してウイルスの力価測定を行った。
定位脳室内注射。ＡＡＶ血清型４ベクターの定位脳室内注射を以前に記載されている通り実施した（T. L. Spiresら、Dendritic spine abnormalities in amyloid precursor protein transgenic mice demonstrated by gene transfer and intravital multiphoton microscopy. J Neurosci ２５巻、７２７８頁（２００５年８月３日）；G. Liu、I. H. Martins、J. A. Chiorini、B. L. Davidson、Adeno-associated virus type 4 (AAV4) targets ependyma and astrocytes in the subventricular zone and RMS. Gene Ther １２巻、１５０３頁（２００５年１０月））。ケタミン／キシラジン（それぞれ体重１ｋｇ当たり１００ｍｇおよび体重１ｋｇ当たり５０ｍｇ）を腹腔内注射することによって動物を麻酔し、定位枠に置いた（Ｄａｖｉｄ Ｋｏｐｆ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｔｕｊｕｎｇａ、ＣＡ）。ウイルス調製物（力価２×１０１２ｖｇ／ｍｌ）５μｌを用いた各側脳室へのベクターの注射を、１０μｌのＨａｍｉｌｔｏｎシリンジ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｍｅｄｉｃａｌ、Ｒｅｎｏ、ＮＶ）に取り付けた３３ゲージの鋭いマイクロピペットを使用し、毎分０．２５μｌの速度で実施した。注射部位の定位座標はブレグマから算出した（前後＋０．３ｍｍ、中外側±１ｍｍおよび背腹側−２ｍｍ）。
頭蓋窓の埋め込みおよび多光子イメージング。脳室内注射の１週間後、マウスをイソフルラン（１．５％）で麻酔し、頭蓋の小片を取り出し、直径８ｍｍのカバーガラスで置き換えることによって頭蓋窓を埋め込んだ（以前に記載されている通り、T. L. Spiresら、Dendritic spine abnormalities in amyloid precursor protein transgenic mice demonstrated by gene transfer and intravital multiphoton microscopy. J Neurosci ２５巻、７２７８頁（２００５年８月３日））。画像化のために、窓の縁に沿ってワックスリング（ｗａｘ ｒｉｎｇ）を構築して対物レンズ（２０×対物レンズ、開口数０．９５、Ｏｌｙｍｐｕｓ）用の水のウェルを作製した。アミロイド沈着を可視化するために、トランスジェニック動物に、血液脳関門を横断し、アミロイド沈着に結合する蛍光化合物であるメトキシ−ＸＯ４（５ｍｇ／ｋｇ）を外科手術の２４時間前に腹腔内注射した（B. J. Bacskai、W. E. Klunk、C. A. Mathis、B. T. Hyman、Imaging amyloid-beta deposits in vivo. J Cereb Blood Flow Metab ２２巻、１０３５頁（２００２年９月））。画像化の前に、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄデキストラン（分子量７０，０００Ｄａ；滅菌ＰＢＳ中１２．５ｍｇ／ｍｌ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）を外側尾静脈内に注射して、蛍光血管造影図をもたらし、したがって、脈管構造の形状を正確な同じ視野を経時的に追跡するためのランドマークとして使用することとした。ＡＡＶ注射の１週間後に、アミロイド沈着のベースラインレベルを評価するためにマウスを画像化し、次いで、注射の１カ月後および２カ月後に画像化した。
多光子イメージングシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ １０２４ＥＳ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）に搭載したモードロックＴｉ：Ｓａｐｐｈｉｒｅ ｌａｓｅｒ（ＭａｉＴａｉ、Ｓｐｅｃｔｒａ−Ｐｈｙｓｉｃｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）により８６０ｎｍの二光子蛍光励起光を生成した。放出された光を、３８０〜４８０、５００〜５４０および５６０〜６５０ｎｍの範囲の３つの光電子増倍管（Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ、Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ、ＮＪ）を含有する特注外付け検出器によって収集した。斑および血管造影についての二色画像を同時に取得した。低拡大率のｉｎ ｖｉｖｏ画像（６１５×６１５μｍ；ｚ−ステップ、２μｍ、深さ、約２００μｍ）を取得し、大皮質領域を網羅するように６〜８視野を画像化した。
画像処理および解析。各視野内の斑の密度を、Ｉｍａｇｅ Ｊを使用して、画像化した皮質の体積当たりのアミロイド沈着の総数を報告することによって定量した。本発明者らは、表面におけるｚスタックの最初のスライスから始まってアミロイド沈着を検出することができた最後のスライスまでを皮質の体積とみなした。アミロイド沈着のサイズを、２次元投影後の最大強度からそれらの断面積を測定することによって経時的に評価した。各斑について、最初の時点と１カ月目の間の面積の比（Ｔ１／Ｔ０）、または２カ月目と１カ月目の間の面積の比（Ｔ２／Ｔ１）を算出した。
多光子顕微鏡の設定（レーザーパワーおよびＰＭＴ）は、実験の全時間中、異なるイメージングセッション全体にわたって変化させずに維持した。
ｉｎ ｖｉｖｏにおける微量透析試料採取。Ｔｇ２５７６マウスに対して、各ＡＡＶ４を脳室内注射した３カ月後に、脳間質ＡβおよびＡｐｏＥのｉｎ ｖｉｖｏにおける微量透析試料採取を実施した（S. Takedaら、Novel microdialysis method to assess neuropeptides and large molecules in free-moving mouse. Neuroscience １８６巻、１１０頁（２０１１年７月１４日））。微量透析プローブは、４ｍｍのシャフトを有し、３．０ｍｍ、１０００ｋＤａ分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）ポリエチレン（ＰＥ）膜（ＰＥＰ−４−０３、株式会社エイコム、日本、京都）を伴った。使用する前に、プローブを、エタノール中に短時間液浸し、次いで、孔径０．２μｍ膜を通して濾過した人工脳脊髄液（ａＣＳＦ）灌流緩衝液（１２２ｍＭのＮａＣｌ、１．３ｍＭのＣａＣｌ２、１．２ｍＭのＭｇＣｌ２、３．０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、２５．０ｍＭのＮａＨＣＯ３）を用いて洗浄することによって条件付けた。予め条件付けたプローブの出口および入口を、フッ素化エチレンプロピレン（ＦＥＰ）管材料（φ２５０μｍ ｉ．ｄ．）を使用して、それぞれ蠕動ポンプ（ＥＲＰ−１０、株式会社エイコム、日本、京都）およびマイクロシリンジポンプ（ＥＳＰ−３２、株式会社エイコム、日本、京都）に接続した。
プローブの埋め込みを、わずかな改変を伴って以前に記載されている通り実施した（S. Takedaら、Novel microdialysis method to assess neuropeptides and large molecules in free-moving mouse. Neuroscience １８６巻、１１０頁（２０１１年７月１４日；J. R. Cirritoら、In vivo assessment of brain interstitial fluid with microdialysis reveals plaque-associated changes in amyloid-beta metabolism and half-life. J Neurosci ２３巻、８８４４頁（２００３年１０月１日））。簡単に述べると、麻酔した動物（１．５％イソフルラン）に、ガイドカニューレ（ＰＥＧ−４、株式会社エイコム、日本、京都）を海馬（ブレグマ−３．１ｍｍ、正中線に対して−２．５ｍｍ外側、硬膜に対して−１．２ｍｍ腹側）に定位に埋め込んだ。次いで、二成分歯科用セメント（binary dental cement）を使用してガイドを頭蓋に固定した。
ガイドカニューレ埋め込みの４日後、マウスを標準の微量透析ケージに入れ、ガイドを通じてプローブを挿入した。プローブを挿入した後、安定した記録を得るために、試料収集の前に、プローブおよび接続管を、ａＣＳＦを用いて毎分１０μｌの流速で２４０分にわたって灌流した。試料を毎分０．２５μｌ（Ａβ定量のため）および毎分０．１μｌ（ＡｐｏＥ検出のため）の流速で収集した。試料をポリプロピレンチューブ中に入れ４℃で保管した。微量透析試料収集の間、マウスは覚醒しており、プローブ集合に圧力を適用せずに動物の制限されない動作が可能になるように設計された微量透析ケージ内を自由に動ける状態であった（ＡｔｍｏｓＬＭ ｍｉｃｒｏｄｉａｌｙｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ、株式会社エイコム、日本、京都）。
免疫組織学的分析。ＡＰＰ／ＰＳ１マウスは、脳室内注射の２カ月後または５カ月後（短期および長期曝露）にＣＯ２吸入によって安楽死させ、Ｔｇ２５７６動物は３カ月後に屠殺した。大脳半球全体の一方を免疫組織学的分析のためにリン酸緩衝食塩水中４％パラホルムアルデヒド中に固定し、パラフィンワックスに包埋した。前頭皮質を通る１ｍｍの冠状切片をアレイ断層撮影アッセイのために処理し、残りの半脳は生化学的および生体分子分析を実施するためにスナップ凍結した。
アミロイド沈着、ＡｐｏＥおよびＧＦＰを検出するために、パラフィン包埋した切片（１０μｍ）を逐次的にキシレン中で脱パラフィンし、エタノール中で再水和し、クエン酸緩衝液（１０ｍＭのクエン酸ナトリウム、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０、ｐＨ６．０）中で処理し、０．５％トリトンを伴うＰＢＳ中で透過処理し、３％ＢＳＡを伴うＰＢＳ中、室温で２時間ブロッキングした。一次抗体と一緒に４℃で一晩インキュベートした：アミロイド斑についてはＢａｍ１０（ＳＩＧＭＡ １：１０００）およびＲ１２８２（１：５００、Ｄｒ Ｄｅｎｎｉｓ Ｓｅｌｋｏｅから提供された）、ヒトＡｐｏＥについてはマウスモノクローナル抗体３Ｈ１（Ｏｔｔａｗａ Ｈｅａｒｔ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、神経突起ジストロフィーについてはニワトリ抗ＧＦＰ（１：５００、Ａｖｅｓ）およびＳＭＩ−３１２（Ｃｏｖａｎｃｅ）。翌日、二次抗体と一緒に室温で２時間インキュベートした。封入前にスライスを５０％エタノール中Ｔｈｉｏ−Ｓ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）０．０５％の溶液中で８分インキュベートすることによってアミロイド密集コア斑（amyloid dense core plaque）を標識した。
アレイ断層撮影法のための試料の調製、免疫染色および画像解析
シナプス前部要素およびシナプス後部要素についてのアレイ断層撮影分析を以前に記載されている通り実施した（R. M. Koffieら、Oligomeric amyloid beta associates with postsynaptic densities and correlates with excitatory synapse loss near senile plaques. Proc Natl Acad Sci U S A １０６巻、４０１２頁（２００９年３月１０日））。簡単に述べると、脳室領域に隣接する皮質組織の小片（１ｍｍ３）を切り取り、０．０１ＭのＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒド、２．５％スクロース中に３時間にわたって固定した。エタノール中で脱水した後、試料をＬＲ Ｗｈｉｔｅ ｒｅｓｉｎ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）中、４℃で一晩インキュベートし、その後、５３℃で重合させた。次いで、切片のリボン（７０ｎｍ）をｕｌｔｒａｃｕｔ ｍｉｃｒｏｔｏｍｅ（Ｌｅｉｃａ）上でＪｕｍｂｏ Ｈｉｓｔｏ Ｄｉａｍｏｎｄ Ｋｎｉｆｅ（Ｄｉａｔｏｍｅ）を使用することによって切断した。
ＴＢＳ中５０ｍＭのグリシンで５分再水和した後、切片をＴｒｉｓ中０．０５％Ｔｗｅｅｎおよび０．１％ＢＳＡで５分にわたってブロッキングし、ブロッキング緩衝液中１：５０の一次抗体を２時間にわたって適用した（Ｄｒ Ｖｉｒｇｉｎｉａ Ｌｅｅからの、オリゴマーＡβ種を優先的に染色する、ＰＳＤ９５ Ａｂｃａｍ Ａｂ１２０９３、ｓｙｎａｐｓｉｎ Ｉ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＡＢ１５４３およびＮＡＢ６１、E. B. Leeら、Targeting amyloid-beta peptide (Abeta) oligomers by passive immunization with a conformation-selective monoclonal antibody improves learning and memory in Abeta precursor protein (APP) transgenic mice. J Biol Chem ２８１巻、４２９２頁（２００６年２月１７日））。スライドをＴＢＳで洗浄し、二次抗体を適用した（抗ヤギＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、抗マウスＣｙ３、または抗マウスＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。前頭皮質を通した７〜３０の連続切片に関して画像を得、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｐｌａｎ ＬＳＭ５１０共焦点／多光子顕微鏡（６３×開口数、Ｐｌａｎ Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔｉｃ油浸対物レンズ）を使用することによって取得した。
画像を、Ｉｍａｇｅ Ｊ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ｏｐｅｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ）およびＭＡＴＬＡＢ（Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ）を使用して以前に記載されている通り解析した（R. M. Koffieら、Oligomeric amyloid beta associates with postsynaptic densities and correlates with excitatory synapse loss near senile plaques. Proc Natl Acad Sci U S A １０６巻、４０１２頁（２００９年３月１０日））。各画像セットをスタックに変換し、Ｉｍａｇｅ Ｊ ＭｕｌｔｉＳｔａｃｋＲｅｇおよびＳｔａｃｋＲｅｇ ｐｌｕｇ−ｉｎｓ（Ｂｒａｄ ＢｕｓｓｅおよびＰ．Ｔｈｅｖｅｎａｚ、Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの好意による）を使用することによってアラインメントした。既知体積を選択し、自動化された閾値に基づく検出プログラムを使用して、２つ以上の連続した切片に出現したＰＳＤ９５斑点とシナプシン斑点の両方を計数した（ＷａｔｅｒＳｈｅｄ ｐｒｏｇｒａｍ、Ｂｒａｄ Ｂｕｓｓｅ、Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｓｍｉｔｈ、およびＫｒｉｓｔｉｎａ Ｍｉｃｈｅｖａ、Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙにより提供された）。Ｗａｔｅｒｓｈｅｄにより、２つ以上のアレイのスライスに存在した斑点を示す閾値画像スタック（各チャネルについて別々）がエクスポートされた。マウスごとに皮質内のいくつかの部位を試料採取し、斑の端部からのそれらの距離を測定した。
Ａβ定量
ＴＢＳ可溶性画分、ギ酸画分ならびに微量透析液中のＡβ４０およびＡβ４２の濃度を、ＢＮＴ−７７／ＢＡ−２７（Ａβ４０について）およびＢＮＴ−７７／ＢＣ−０５（Ａβ４２について）サンドイッチＥＬＩＳＡ（和光純薬工業株式会社、日本、大阪）により、製造業者の指示に従って決定した。試料中のオリゴマーＡβの量を、同じＮ末端（残基１〜１６）抗体を捕捉と検出のどちらにも使用した８２Ｅ１／８２Ｅ１サンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｉｍｍｕｎｏ−Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって決定した（W. Xiaら、A specific enzyme-linked immunosorbent assay for measuring beta-amyloid protein oligomers in human plasma and brain tissue of patients with Alzheimer disease. Arch Neurol ６６巻、１９０頁（２００９年２月））。
免疫ブロット分析
脳ＴＢＳ可溶性画分および微量透析液（タンパク質２０μｇ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）用のＭＯＰＳランニング緩衝液中４〜１２％Ｎｏｖｅｘ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で電気泳動した。ゲルをＰＶＤＦ膜に転写し、５％Ｍｉｌｋ／ＴＢＳ−Ｔ中、室温で６０分にわたってブロッキングした。膜をヤギ抗ＡｐｏＥ抗体（１：１０００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＡＢ９４７）でプローブしてＡＰＯＥヌル動物のＩＳＦ中の少量のＡＰＯＥを検出し、対照としてアルブミンを検出した。ヒトおよびマウスのＡｐｏＥについてのブロットを、ＥＰ１３７３Ｙ抗体（１：１０００、Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、ＮＢ１１０−５５４６７）を用いて、およびウサギポリクローナルａｐｏＥ抗体（１：１０００、Ａｂｃａｍ、ａｂ２０８７４）を用いてそれぞれプローブした。ＨＲＰとコンジュゲートしたヤギＩｇＧ抗体（Ｖｅｃｔｏｒ）と一緒に２時間インキュベートした。ＥＣＬ ｋｉｔ（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して免疫反応性タンパク質を生じさせ（developed）、Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ ＥＣＬ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で検出した。
ｑＲＴ−ＰＣＲ
ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；１５５９６−０２６）を使用して脳試料由来の全ＲＮＡを抽出し、次いで、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩ Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；１２５７４−０１８）の製造業者の指示に従ってｃＤＮＡを合成した。組換えヒトＡＰＯＥ ｍＲＮＡならびに内因性Ａｐｏｅ ｍＲＮＡおよびＧａｐｄｈ ｍＲＮＡを増幅するために、ＰＣＲプライマーを特別に設計した（Ａｐｏｅフォワード：５’−ＡＧＣＴＣＣＣＡＡＧＴＣＡＣＡＣＡＡＧＡ；Ａｐｏｅリバース：５’−ＧＴＴＧＣＧＴＡＧＡＴＣＣＴＣＣＡＴＧＴ；APOEフォワード:5’- CCAGCGACAATCACTGAAC;APOEリバース:5’- GCGCGTAATACGACTCACTA;Gapdhフォワード:5’- ATGACATCAAGAAGGTGGTGおよびGapdhリバース:5’- CATACCAGGAAATGAGCTTG）。
ＡＰＯＥ ＥＬＩＳＡ
ヒトＡＰＯＥタンパク質と内因性マウスＡＰＯＥタンパク質の両方を検出するために特異的なＥＬＩＳＡアッセイを使用した。簡単に述べると、ＥＬＩＳＡプレートを、１．５μｇ／ｍｌのヤギ抗ＡＰＯＥ抗体（マウスＡＰＯＥを検出するために）または１．５μｇ／ｍｌのＷＵＥ４抗体（ヒトＡＰＯＥを検出するために）を用いて一晩コーティングし、ＰＢＳ中に希釈した１％脱脂乳を用いて３７℃で１．５時間ブロッキングした。ヒト組換えａｐｏＥタンパク質を標準物質として使用した（ヒト特異的アッセイについて、Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ）、または脳抽出物由来の、組織内の（in-house）マウス標準物質（マウス特異的アッセイについて）および試料をＥＬＩＳＡ緩衝液（ＰＢＳ中０．５％ＢＳＡおよび０．０２５％Ｔｗｅｅｎ−２０）中に希釈し、一晩インキュベートした。洗浄後、ヒトに特異的な検出抗体（ヤギ−ａｐｏｅ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；１：１０，０００）またはマウスに特異的な検出抗体（Ａｂｃａｍ ａｂ２０８７４；１：２，０００）をそれぞれ使用し、その後、適切なＨＲＰとコンジュゲートした二次抗体と一緒に１．５時間インキュベートした。Ｈ３ＰＯ４を使用して溶液を停止する前にＴＭＢ基質を使用してシグナルを明らかにした。比色定量の結果を４５０ｎｍにおいて測定した。
統計解析
Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して統計解析を実施した。試料のサイズが小さいので、本解析の大部分について、正規性を仮定することはできなかった。全ての死後分析について、ノンパラメトリックなクラスカル・ワリス検定、続いてダンの多重比較検定を実施して、注射した各ベクターの影響を評価した。アミロイド進行のｉｎ ｖｉｖｏイメージングデータを、マウスを変量効果として、およびベクターを固定効果として、時間およびベースライン容積測定密度を用いた混合効果モデルを使用して解析した。時間とベクターとの間の相互作用をこの解析で考察したが、有意ではなかった。斑サイズを経時的に分析するために、マウスを変量効果としておよび対数ベースラインサイズ（第１の分析におけるｔ０、第２の分析におけるｔ１）を固定効果として用いて、２つの混合効果モデルを２つの連続した時点の比の対数について当てはめた。
（実施例４）
マウスにおいて、ヒトＡｐｏＥアイソフォームの遺伝子移入によりアミロイド沈着および神経毒性が示差的に調節される
アポリポタンパク質Ｅ（ＡＰＯＥ）のε４対立遺伝子の遺伝は、散発型のアルツハイマー病（ＡＤ）に関連する最も強力な遺伝的リスク因子であるが、稀なＡＰＯＥ ε２対立遺伝子は、逆の効果を有する。しかし、ＡＰＯＥによりリスクおよび保護が付与される機構は不確かなままである。本発明者らは、アミロイド斑を有するトランスジェニックマウスの皮質を、ウイルスにより発現させたヒトＡＰＯＥに浸す（bathe）遺伝子移入手法を使用した。本発明者らは、アミロイド−β（Ａβ）を、トランスジェニックマウスにおけるＡβ関連神経毒性におけるヒトＡＰＯＥ媒介性変化の動態を研究するために、多光子イメージング、ｉｎ ｖｉｖｏ微量透析、および死後アレイ断層撮影法を用いてモニターした。本発明者らは、ヒトＡＰＯＥ４により、間質液（ＩＳＦ）中のオリゴマーＡβの濃度が上昇し、斑の沈着が悪化することを観察し、ヒトＡＰＯＥ２に曝露すると逆のことが起こった。斑周囲のシナプス消失および神経突起ジストロフィーも、ＡＰＯＥ４により悪化した、またはＡＰＯＥ２により減弱した。中枢神経系（ＣＮＳ）から血漿中へのＡβの放出は、ＣＮＳにおけるＡβのアイソフォーム特異的保持に従って、ＡＰＯＥ２と比較して、ＡＰＯＥ３およびＡＰＯＥ４によって少なくなった。全体として、本発明者らのデータから、トランスジェニックマウスにおけるアミロイド沈着およびクリアランスに対する、ならびに、より重要なことに、Ａβ媒介性シナプス毒性に対するヒトＡＰＯＥアイソフォームの示差的な影響が示される。これらの結果から、ＡＰＯＥ遺伝的リスクがＡβによって媒介されること、およびＡＰＯＥ４を低下させること、またはＡＰＯＥ２を増加させることを目的とする治療的手法がＡＤに関して有益であり得ることが示唆される。
アルツハイマー病（ＡＤ）は、最も頻度の高い加齢性神経変性障害であり、主要な公衆衛生の懸念である。遅発性散発性型のＡＤに関連する易罹患性遺伝子の中で、アポリポタンパク質Ｅ ε４（ＡＰＯＥ ε４）対立遺伝子が断然最も有意な遺伝的リスク因子である。ＡＰＯＥ ε４が１コピー存在することにより、疾患が発生するリスクが最も一般的なＡＰＯＥ ε３対立遺伝子と比較して３倍に実質的に上昇し、２コピーでは１２倍の上昇がもたらされる。興味深いことに、ＡＰＯＥ ε２は逆の影響を有し、年齢を調整したＡＤのリスクが約半分低下する。認知症の平均発症年齢はこれらのリスクプロファイルに対応し、ＡＰＯＥ４／４保有者は６０代半ばで発症し、ＡＰＯＥ２／３保有者は、ほぼ３０年シフトして９０代前半で発症し、ＡＰＯＥ３／３個体の発症年齢はそれらの中間の７０代半ばである。
患者の海馬および皮質におけるＡβを含有する老人斑の蓄積は、稀な常染色体優性型の疾患に関与する公知の遺伝子が全てＡβペプチドの産生に関与するので、ＡＤにおいて中心的な役割を果たすと考えられる。ＡＰＯＥがＡβに対する影響を介してＡＤに影響を及ぼすかどうかは議論の的になっている。ＡＰＯＥ遺伝子型は、患者におけるアミロイド沈着の程度に強力に影響を及ぼし、ヒトＡＰＯＥ２、ヒトＡＰＯＥ３およびヒトＡＰＯＥ４を発現する遺伝子操作された動物は、ヒトと同様のアミロイド負荷量（ｂｕｒｄｅｎ）の順位を有し、これは、異なるＡＰＯＥアイソフォームが斑の開始および／または成長に影響を及ぼすという仮説と一致する。ＡＰＯＥ変異体は、神経毒性可溶性オリゴマーＡβの量を改変すること、ならびに脳血管の完全性および血液脳関門を通じたＡβの流出に示差的に影響を及ぼすことも提唱されている。最後に、ＡＰＯＥは、神経変性およびシナプス完全性と直接関連付けられている。ＡＤに対して保護性であるＡＰＯＥ２がこれらのプロセスにどのように影響を及ぼすかは分かっていない。
ＡＰＯＥの影響に関する以前の研究の大部分は、トランスジェニックマウスにおけるＡｐｏｅの遺伝子切除またはＡＰＯＥの生涯発現を使用しているので、斑の沈着がすでに開始した後にＡＰＯＥを導入することの影響は現在のところ分かっていない。しかし、ＡＰＯＥ発現を上昇させることを目的とする新しい治療試験が現在評価されていること、およびアミロイド沈着が失認の数十年前に観察され得ることを考えると、この問題に対処することは重要である。この知見のギャップを克服するために、本発明者らは、種々のヒトＡＰＯＥ対立遺伝子（または対照として緑色蛍光タンパク質、ＧＦＰ）を発現するアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）をＡＤのトランスジェニックマウスモデルの側脳室に注射して上衣層に形質導入し、次いで、それによりヒトＡＰＯＥタンパク質が脳脊髄液（ＣＳＦ）および間質液（ＩＳＦ）中に送達される遺伝子移入手法を使用した。生体内多光子顕微鏡法、ｉｎ ｖｉｖｏ微量透析ならびにアレイ断層撮影法を使用して、本発明者らは、ヒトＡＰＯＥアイソフォームは、ＩＳＦ中の可溶性オリゴマーＡβのレベル、Ａβの線維化および沈着のペースならびに斑周囲の神経毒性作用の程度に影響を及ぼすことを見いだした。実際に、ヒトＡＰＯＥ４に曝露したＡＤマウスでは、可溶性Ａβの量の増強、より高密度の線維状斑、シナプスの消失の増悪、および各沈着の周囲の神経突起ジストロフィーの数の増加が示されたが、ＡＰＯＥ２を用いた場合には相対的に保護性の効果が観察された。
結果
ＡＡＶ４−ＡＰＯＥの脳室内注射により、脳におけるヒトＡＰＯＥの持続的産生がもたらされる
ＡＰＯＥは、主にアストロサイトおよび小膠細胞によって産生され、大脳実質全体にわたって拡散し得る天然に分泌されるタンパク質である。本発明者らは、ＧＦＰをコードする遺伝子または各ヒトＡＰＯＥ対立遺伝子を有するＡＡＶ血清型４ベクターを７カ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１トランスジェニックマウスの側脳室（ｌａｔｅｒａｌ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｖｅｎｔｒｉｃｌｅ）に注射することにより、この特性を利用した。大脳領域がＡＤの独特の病変の影響を受けることを考慮すると、この戦略により、複数回の実質内注射と比較して利点がもたらされ得る。
注射の２カ月後、形質導入された細胞が脈絡叢および脳室の内側を覆う上衣において検出された。種特異的抗体を使用して、ヒトＡＰＯＥタンパク質およびマウスＡＰＯＥタンパク質も両方ともＥＬＩＳＡアッセイ（図１８Ａ〜１８Ｂおよび図２４Ｂ）およびウエスタンブロット（図２４Ａ）によって検出された。ヒトアポリポタンパク質Ｅの濃度が平均で総タンパク質１ｍｇ当たり２０μｇに達し（図１８Ａ）、これは、内因性マウスＡｐｏｅの約１０％を表わしていた（図１８ＢＣ）。このそれほど多くない追加量のヒトＡＰＯＥにより、内因性マウスｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルは有意には変更されなかった（図２４Ａ〜２４Ｃ）。ＡＡＶ４注射の２カ月後から５カ月後の間に、ヒトＡＰＯＥレベルの小さいが統計的に有意な低下が観察された（図２４Ｄ）。それにもかかわらず、ヒトタンパク質の量は容易に検出可能なままであり、これにより、ＡＡＶ４媒介性形質導入により、実質全体にわたる分泌タンパク質の持続的産生のプラットフォームがもたらされたことが示唆された。実際に、ＡＰＯＥタンパク質が蓄積することが公知である皮質外套全体にわたってアミロイド沈着の周囲にヒトＡＰＯＥタンパク質が存在した。
次に、本発明者らは、高度に生物学的活性のある可溶性Ａβを含有する細胞外区画であるＩＳＦ中のヒトＡＰＯＥの存在を評価した。脳全体の溶解物中に比較的少量のＡＰＯＥを検出したので、本発明者らは、ＡｐｏｅノックアウトマウスにＡＡＶ４−ＡＰＯＥベクターを注射し、高感度であるが非種特異的な抗体を使用してヒトＡＰＯＥタンパク質の存在を追跡した。微量透析により、注射を受けたＡｐｏｅノックアウト動物のＩＳＦ中のＡＰＯＥの存在を確認した。
全体として、これらのデータから、ＡＡＶ４−ＡＰＯＥ２／３／４の単回の脳室内注射により、脳実質全体およびＩＳＦにわたり目的のタンパク質の持続的産生がもたらされること、ならびに上衣／脈絡叢を、タンパク質を脳に送達するために使用することができることが確認される。
各ＡＰＯＥアイソフォームの注入は、アミロイドペプチドおよび斑の沈着に示差的に影響を及ぼす
安楽死の前５カ月間、実質的なアミロイド沈着を有する７カ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１マウスに、ＧＦＰまたは各ヒトＡＰＯＥアイソフォームを発現するベクターを注射した。アミロイド斑負荷量（ｌｏａｄ）の分析により、ＡＡＶ４−ＡＰＯＥ４の注射を受けた動物の皮質において、ＡＰＯＥ２を発現する動物と比較して、アミロイド沈着の密度の有意な上昇が明らかになった（皮質１ｍｍ２当たりの斑の数、ＡＡＶ４−ＡＰＯＥ２：３１±４およびＡＡＶ４−ＡＰＯＥ４：７７±５。ｐ＜０．０１）。ＧＦＰに曝露したマウスおよびＡＰＯＥ３に曝露したマウスにおける斑の密度は、ＡＰＯＥ４とＡＰＯＥ２の中間のレベルに達し（皮質１ｍｍ２当たりの斑の数、ＡＡＶ４−ＧＦＰ：５４±１５；ＡＡＶ４−ＡＰＯＥ３：４７±３、図１９Ａ）、さらに、注射を受けていない動物の斑の密度と同等であった。
マウス脳のギ酸抽出物から測定したＡβ４０ペプチドおよびＡβ４２ペプチドの濃度は組織学的に観察された変化を模倣し、したがって、ＡＰＯＥ４を発現するマウスではアミロイドペプチドの増加が見いだされ（Ａβ４０：タンパク質１ｍｇ当たり１７３３±３３８ｐＭｏｌおよびＡβ４２：タンパク質１ｍｇ当たり８７２０±１１５５ｐＭｏｌ）、ＡＰＯＥ２を用いると逆の効果が検出された（Ａβ４０：タンパク質１ｍｇ当たり４６８±１０５ｐＭｏｌおよびＡβ４２：タンパク質１ｍｇ当たり５１５６±１３１８ｐＭｏｌ、ｐ＜０．０５、図１９Ｂ）。トリス緩衝食塩水（ＴＢＳ）可溶性画分中のＡβペプチドの含有量も同様に影響を受け、ＡＰＯＥ４曝露後に測定された可溶性Ａβ４０およびＡβ４２はどちらも、ＡＰＯＥ２（Ａβ４０：タンパク質１ｍｇ当たり２０±８ｐＭｏｌおよびＡβ４２：タンパク質１ｍｇ当たり２．３±０．８ｐＭｏｌ、ｐ＜０．０５。図１９Ｃ）と比較して高濃度であった（Ａβ４０：タンパク質１ｍｇ当たり９４±１８ｐＭｏｌおよびＡβ４２：タンパク質１ｍｇ当たり１２．９±１．５ｐＭｏｌ）。
２カ月にわたる各ＡＰＯＥアイソフォームの発現により、５カ月後に観察されたものよりも小さな影響がもたらされ、これは、アミロイドの形成またはクリアランスに対するＡＰＯＥの影響が、死後に評価した場合、明らかになるまでに数カ月かかったことを意味していた。それにもかかわらず、他の群と比較して、ＡＡＶ４−ＡＰＯＥ４の注射を受けたマウスの皮質内のアミロイド斑の密度の有意な上昇が観察され（皮質１ｍｍ２当たりの斑の数、ＡＡＶ４−ＧＦＰ：２５±４；ＡＡＶ４−ＡＰＯＥ２：２２±６；ＡＡＶ４−ＡＰＯＥ３：２６±５およびＡＡＶ４−ＡＰＯＥ４：５６±４、ｐ＜０．０５。図２５Ａ）、これは、ギ酸画分中に含有されるＡβ４０の量と類似した（ＡＡＶ４−ＧＦＰ：タンパク質１ｍｇ当たり７２５±９２ｐＭｏｌ；ＡＡＶ４−ＡＰＯＥ２：タンパク質１ｍｇ当たり４９２±６２ｐＭｏｌ；ＡＡＶ４−ＡＰＯＥ３：タンパク質１ｍｇ当たり６８１±１４０ｐＭｏｌおよびＡＡＶ４−ＡＰＯＥ４：タンパク質１ｍｇ当たり１１０８±２３８ｐＭｏｌ、ｐ＜０．０５。図２５Ｃ）。ＴＢＳ可溶性Ａβ４０／４２種の濃度は変化せず、また、総Ａβ免疫反応性に対する密集したコア斑の比に変化は検出されなかった（図２５Ｂ）。別の対照実験では、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）代謝、グリアの活性化、またはインスリン分解酵素の量に対してＡＡＶ４−ＡＰＯＥ注射のいかなる影響も示されなかった。全体として、２カ月曝露のデータと５カ月曝露のデータの比較により、ＡＰＯＥアイソフォームの変更は、急性に作用するのではなく、Ａβ可溶性および線維状沈着を数カ月かけてシフトさせることが示唆される。
ＡＰＯＥは、血液脳関門（ＢＢＢ）に影響を及ぼし、Ａβペプチドの流出を変更する。ＡＰＯＥへの曝露により、ＢＢＢ全体に渡るＡβペプチドの平衡がどのように調節されるかを調査するために、５カ月後にＡβ４０の血漿中濃度を測定した。ＡＡＶ４−ＡＰＯＥ３またはＡＡＶ４−ＡＰＯＥ４の注射を受けたマウスにおけるＡβの血漿中含有量は、ＡＡＶ４−ＡＰＯＥ２およびＡＡＶ４−ＧＦＰと比較して低く（ＡＡＶ４−ＧＦＰ：血漿１ｍｌ当たり１１６７±２１３ｐＭｏｌ；ＡＡＶ４−ＡＰＯＥ２：血漿１ｍｌ当たり１２４７±１６０ｐＭｏｌ；ＡＡＶ４−ＡＰＯＥ３：血漿１ｍｌ当たり７３６±７８ｐＭｏｌおよびＡＡＶ４−ＡＰＯＥ４：血漿１ｍｌ当たり７９９±６７ｐＭｏｌ；ｐ＜０．０５。図１９Ｄ）、これにより、ＡＰＯＥ３およびＡＰＯＥ４がＡβをＣＮＳ内に保持する助けとなったことが示唆され、これは、Ａβの脳内濃度の相対的な上昇、およびＡＰＯＥに起因したＡβのより長いＣＮＳ半減期が報告された以前のデータと一致した。
ＡＰＯＥ４保有者は、神経血管の機能障害にかかりやすく、ＡＰＯＥ４トランスジェニックマウスでは、アミロイド沈着の不在下でさえＢＢＢ崩壊が好都合であることが示された。ＡＡＶ４−ＡＰＯＥ注射によりＢＢＢの完全性が損なわれるかどうかを評価するために、プルシアンブルーを用いた死後染色を実施した。ヘモジデリン陽性病巣領域がわずかに存在するにもかかわらず、実験群のいずれの間でも影響は観察されなかった。
ＡＰＯＥアイソフォームの発現により、アミロイドーシスの動態が調節される
ＡＰＯＥ変異体がアミロイドーシスの動的な進行にどのように影響を及ぼすかを評価するために、本発明者らは、ｉｎ ｖｉｖｏ二光子イメージングを使用し、アミロイド斑の形成およびクリアランスの動態を追跡した。７カ月齢のマウスに、ＧＦＰまたは各ＡＰＯＥ変異体を有するＡＡＶ４を脳室内注射し、その１週間後に頭蓋窓を埋め込んだ（Ｔ０）。１カ月後（Ｔ１）または２カ月後（Ｔ２）に、アミロイド沈着を画像化し、脳内の正確な同じ皮質領域を経時的に追跡した。
小さな視野体積において、大多数のアミロイド沈着は安定なままであったが、時々新しい斑を検出することができた。しかし、稀な場合、最初に画像化されたメトキシ陽性斑は、１カ月後または２カ月後には検出することができず、これにより、いくつかの斑が除去された可能性があることが示唆された。アミロイド進行の速度は、ＡＰＯＥ４に曝露したＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいてより速かったが、ＡＰＯＥ２に曝露した動物では、低下し、さらには逆転した。２カ月後、ＡＰＯＥ２ではアミロイド沈着の密度がＧＦＰと比較して０．６６（ｐ＝０．００２）、ＡＰＯＥ３と比較して０．６７（ｐ＜０．０００１）およびＡＰＯＥ４と比較して０．７４（ｐ＜０．０００１）、有意に低下した（図２０Ａ、Ｂ）。
次に、本発明者らは、単一のアミロイド斑の成長を、Ｔ１／Ｔ０とＴ２／Ｔ１との間の個々の沈着の断面積の比を測定することによって評価した。Ｔ１（Ｔ１／Ｔ０比、図２１）では群間で差異が検出され、したがって、ＡＰＯＥ４への曝露では、ＧＦＰ、ＡＰＯＥ２およびＡＰＯＥ３に曝露した動物と比較して、アミロイド沈着の成長が有意に大きかった（Ｔ１／Ｔ０比：ＡＡＶ４−ＧＦＰについて１．１７５±０．０４８；ＡＡＶ４−ＡＰＯＥ２について０．９７±０．０４３；ＡＡＶ４−ＡＰＯＥ３について１．０６３±０．０４１およびＡＡＶ４−ＡＰＯＥ４について１．２９±０．０６５；ｐ＜０．０５）。しかし、この影響は２カ月後には観察されなかった（Ｔ１／Ｔ２比）。
ＡＰＯＥへの曝露後のアミロイド沈着の周囲のシナプスの消失および神経突起ジストロフィー
シナプス消失は、認知障害と相関することが公知である。本発明者らは最近、ＡＰＯＥ４の存在が、ＡＰＯＥ３と比較して、ヒトＡＤ患者の脳における高濃度のシナプスオリゴマーＡβおよびアミロイド斑周囲のシナプス密度の低下と関連することを示した。さらに、最近のｉｎ ｖｉｔｒｏにおける証拠により、ＡＰＯＥ４はＡβに誘導されるシナプス消失からの保護ができないことが実証された。したがって、本発明者らは、ＡＰＯＥが、Ａβの沈着およびクリアランスの動態だけでなく、アミロイド沈着周囲のシナプスの完全性にも示差的に影響を及ぼし得るという仮説を立てた。
シナプス前部要素およびシナプス後部要素の密度（シナプシン−１およびＰＳＤ９５）を、超薄組織切片の免疫蛍光染色に基づく高分解能技法であるアレイ断層撮影法を使用して決定した（K. D. Micheva、S. J. Smith、Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron ５５巻、２５頁（２００７年７月５日）；R. M. Koffieら、Oligomeric amyloid beta associates with postsynaptic densities and correlates with excitatory synapse loss near senile plaques. Proc Natl Acad Sci U S A １０６巻、４０１２頁（２００９年３月１０日））。アミロイドオリゴマー種は、アミロイド沈着の付近に高度に濃縮されることが示されたので、シナプシン−１およびＰＳＤ９５の斑点を、斑から遠く（＞５０μｍ）または近く（＜５０μｍ）のいずれかで定量した。ＡＰＯＥ３またはＡＰＯＥ４のいずれかが発現した場合には斑の近くのシナプス前部要素の消失が悪化し、ＡＡＶ４−ＡＰＯＥ２またはＡＡＶ４−ＧＦＰの注射後にはそうではなかった（図２２Ａ）。シナプス後部斑点の密度は、ＡＡＶ４−ＧＦＰの注射を受けたマウス、ＡＡＶ４−ＡＰＯＥ２の注射を受けたマウスおよびＡＡＶ４−ＡＰＯＥ３の注射を受けたマウスの間で変化しないままであったが、ＡＡＶ４−ＡＰＯＥ４による処置を受けた動物では、アミロイド沈着の周囲のＰＳＤ９５の大きな消失、したがって、Ａβ神経毒性に対するＡＰＯＥ４の有害作用の強化が示された（図２２Ｂ）。アミロイド沈着から遠く（＞５０μｍ）に位置する領域内のシナプス要素の密度を評価した場合、群間で差異を検出することはできず、これにより、ＡＰＯＥ３およびＡＰＯＥ４を用いて観察された相対的なシナプスの消失が各斑の周囲のＡβペプチドの存在に直接関連するものであったことが示唆される。
老人斑が、神経突起の屈曲の増加および膨張したジストロフィーの出現を伴うより一般的なニューロピルの変更を反映するので、本発明者らは、アミロイド沈着に関連するジストロフィー性神経突起の数も評価した。これらの病理学的変化は、斑表面の５０μｍ以内の領域に富化される可溶性オリゴマーＡβ種に起因する可能性がある。ＡＰＯＥ４の発現により、ＧＦＰ、ＡＰＯＥ２およびＡＰＯＥ３と比較して、アミロイド沈着に関連するＳＭＩ３１２陽性ジストロフィー性神経突起の形成が増悪する（Ｂ２２Ｃ）。この結果から、ＡＰＯＥ４アイソフォームがアミロイド神経毒性に影響を及ぼすという知見が確認される。
Ｔｇ２５７６マウスにおいて、ヒトＡＰＯＥタンパク質により間質液中のオリゴマーＡβ種の量が改変される
次に、本発明者らは、ＩＳＦ中の異なるヒトＡＰＯＥアイソフォームの存在により、それと同じ細胞外区画内の可溶性アミロイド種の量が変更され得るかどうかという質問に対処した。異なるＡＤマウスモデルにおける本発明者らの以前の所見を検証するために、本発明者らは、Ｔｇ２５７６マウスに注射を行った。Ｔｇ２５７６マウスは、同じ年齢のＡＰＰ／ＰＳ１マウスよりもはるかに穏やかな表現型を示す。本発明者らは、アミロイド沈着がすでに始まっている１６〜１８カ月齢の動物のコホートを処置した。遺伝子移入の３カ月後、微量透析プローブを海馬に挿入し、試料を収集して各ヒトＡＰＯＥ変異体に関連する初期変化を特徴付けた。
本発明者らは、特異的な８２Ｅ１／８２Ｅ１ ＥＬＩＳＡアッセイを使用して測定されたＡβオリゴマーの濃度が、ＡＡＶ４−ＡＰＯＥ４の注射後に、ＡＡＶ４−ＡＰＯＥ２と比較して有意に高いことを観察し（４２±７％；ｐ＜０．０５）（図２３）、これにより、ＡＰＯＥの存在により、細胞外区画内のアミロイド凝集体の性質が調節され得ることを実証した。総Ａβ４０およびＡβ４２をＩＳＦにおいて評価したところ、同じ傾向が観察されたが、有意には達しなかった（図２６）。
予測通り、Ｔｇ２５７６マウス由来の脳の死後生化学的分析により、ＡＰＯＥ４に曝露した動物ではギ酸画分中のＡβ４２の濃度が上昇することが示され（図２６Ｂ）、これにより、第２のトランスジェニックモデルにおいて、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおける本発明者らの以前の知見が確認された。
考察
ＡＰＯＥ対立遺伝子の遺伝とＡＤとの間の著しい遺伝的関連により、このリスクがどのように媒介されるかに関する多数の示唆がもたらされている。ＡＰＯＥは、Ａβに結合し、Ａβクリアランスに関連付けられているが、Ａｐｏｅノックアウトマウスにおける研究では、驚いたことに、Ａβの沈着がＡｐｏｅの不在下では実質的に少ないことが示されている。内因性マウスＡｐｏｅをヒトＡＰＯＥ２、ＡＰＯＥ３、またはＡＰＯＥ４で置き換えることにより、おそらく斑の開始または原線維形成に対する影響を通じて、ＡＤ患者におけるものと同じ順位でアミロイド沈着が改変される。代替の仮説は、神経突起伸長に対する示差的な影響に焦点を当てたものである、またはＡＤ表現型に対するＡＰＯＥ遺伝子型の影響は、第１９染色体上のＡＰＯＥと遺伝子不均衡にある別の遺伝子の結果であることを提唱するものである。
最近開発された遺伝子移入技術（G. Liu、I. Martins、J. A. Wemmie、J. A. Chiorini、B. L. Davidson、Functional correction of CNS phenotypes in a lysosomal storage disease model using adeno-associated virus type 4 vectors. J Neurosci ２５巻、９３２１頁（２００５年１０月１２日））および２種のＡＤのマウスモデルを使用して、本発明者らのデータは、ＩＳＦ中のオリゴマーＡβの検査を可能にする、ｉｎ ｖｉｖｏ多光子イメージング、標準の定量的免疫組織病理検査、アレイ断層撮影法、および高分子量微量透析手法の組合せを使用することによってこれらの問題に対処するものであった。本発明者らの研究により、ＡＰＯＥ４レベルのそれほど大きくない（約１０％）上昇により、Ａβの凝集およびクリアランスの動態が変更され、それによりＡβの保持の増加がもたらされ、斑の周囲のシナプスの消失および神経突起ジストロフィーが増悪することが実証された。逆に、ＡＰＯＥ２は、Ａβの沈着を低下させ、顕著な神経保護性の効果を有する。観察された効果は、ＡＰＰタンパク質分解産物の含有量の変化と相関せず、これにより、Ａβ産生自体は影響を受けなかったことが示唆された。したがって、これらの結果から、ＩＳＦ中のそれほど多くない量のＡＰＯＥ４およびＡＰＯＥ２がアミロイドクリアランス、沈着、および神経毒性に逆方向に影響を及ぼすことが示される。ＣＮＳにおいてＡＰＯＥ３またはＡＰＯＥ４単独に曝露したマウスの血漿中で測定されたＡβの量が少ないので、本発明者らは、本発明者らの結果が、脳内の示差的なＡβクリアランスに起因し得るという仮説を立てる。この影響は、ＡＡＶにより形質導入された上衣細胞によって産生される各ＡＰＯＥ変異体の脂質付加の状態と潜在的に関連する可能性がある。実際に、以前の研究により、ＡＰＯＥ４はＡＰＯＥ２およびＡＰＯＥ３と比較してリポタンパク質との関連性が低く、したがって、脂質付加されたリポタンパク質に対する脱脂されたリポタンパク質のレベルの上昇が、脳におけるＡβの蓄積および保持に対するＡＰＯＥアイソフォームの示差的な影響の１つの機構であり得ることが示されている。あるいは、本発明者らの研究の１つの限定は、ヒトＡＰＯＥ２の発現により、重要な区画内のマウスＡｐｏｅが低下するまたは置き換えられ、それにより、Ａβの蓄積が少ないＡｐｏｅヌル動物において見られるものと類似した影響が生じる可能性である。それにもかかわらず、マウスＡｐｏｅタンパク質およびｍＲＮＡの本発明者らの直接の測定値では、内因性タンパク質に対するヒトＡＰＯＥ発現の全体的な影響は示されないので、また、ＡＰＯＥ２とＡＰＯＥ４はアミロイド沈着に対して対立する効果を有するので、本発明者らは、アミロイド沈着に対するヒトＡＰＯＥアイソフォームの直接の効果を支持する。
ＩＳＦ ＡＰＯＥのレベルのより穏やかな変化がそのような劇的な結果を有するので、これらの結果から、ＡＰＯＥ発現に影響を及ぼすことによってＡＤのリスクまたは進行を変更させ得る多種多様な環境因子および遺伝因子の影響に関する洞察ももたらされ得る。ここで本発明者らが実証する規模よりも大きなＡＰＯＥの増加が外傷性脳損傷、てんかん、虚血および高コレステロール食事の後に起こり得、これらは全て、大脳Ａβの上昇に関連している。さらに、ＡＰＯＥ４対立遺伝子と遺伝子不均衡であることが見いだされているプロモーター多型がＡＰＯＥ発現に影響を及ぼす。
ＣＮＳにおけるＡＰＯＥ−リポタンパク質の恒常性に影響を及ぼす他の操作により、Ａβの沈着が明白に変化する。例えば、ＡＰＯＥレンチウイルスを用いた限局的な遺伝子移入（海馬のニューロンにおいて主に発現する）を用いた実験では、ＡＰＯＥ４過剰発現は、ＡＰＯＥ３と比較してより強力な影響をアミロイドに対して発揮する。以前の研究により、内因性ＡＰＯＥ合成を増強するレチノイドＸ受容体アゴニストが、脳からのＡβのクリアランスをもたらすことも示された（P. E. Cramerら、ApoE-directed therapeutics rapidly clear beta-amyloid and reverse deficits in AD mouse models. Science ３３５巻、１５０３頁（２０１２年３月２３日）；C. Bachmeier、D. Beaulieu-Abdelahad、F. Crawford、M. Mullan、D. Paris、Stimulation of the retinoid x receptor facilitates Beta-amyloid clearance across the blood-brain barrier. J Mol Neurosci ４９巻、２７０頁（２０１２年２月））。さらに、ＣＮＳにおいてコレステロールを代謝し、そのレベルを低下させるＣＹＰ４６Ａ１の脳への形質導入により、脳内の、ＡＰＯＥレベルを低下させることが公知であるＬＤＬ−Ｒが増加するにつれ、Ａβの沈着が減少する。あるいは、ＡＰＯＥ３／４とＡβとの間の相互作用を遮断するまたはＡＰＯＥ４の構造をＡＰＯＥ２またはＡＰＯＥ３様コンフォメーションに変換するＡβ模倣ペプチドもアミロイドの蓄積に影響を及ぼすことが示された。最後に、遺伝子操作により、内因性Ａｐｏｅの発現が５０％低下することが動物の寿命にわたってＡβの表現型に強力に影響を及ぼすことが示唆される。マウスＡｐｏｅのバックグラウンドで発現させたヒトＡＰＯＥについての本発明者らの現在の結果は、一部において、Ａβ相互作用についてのヒトＡＰＯＥとマウスＡｐｏｅとの間の競合に起因し得る。それにもかかわらず、これらのデータから、ヒトアイソフォーム依存性変化は、病理学的変化が十分に確立された後でさえも劇的な影響を有し得ることが示唆される。
本発明者らのデータは、ＡＰＯＥ ＡＤ文献における４つの重要な議論の領域に直接対処するものである。本発明者らは、どちらも神経細胞系の機能の機能障害に関連する可能性があるシナプス消失および神経突起ジストロフィーによって評価される、神経毒性に対するＡＰＯＥアイソフォームの明白な効果を実証する。これらの効果は斑のすぐ近くにおいて明らかであったが、斑から遠い領域では明らかでなかったので、ＡＰＯＥ２によるシナプス保護は、シナプス安定性に対するＡＰＯＥの直接の効果に起因するのではなく、斑のＡβの周囲に対する効果によって媒介される可能性がある。アミロイドーシスの縦方向の多光子ｉｎ ｖｉｖｏイメージングにより、ＡＰＯＥ４は斑の沈着および成長を増強するが、ＡＰＯＥ２は斑の消散に関連することが示され、これにより、ＡＰＯＥアイソフォームが、線維状斑形成に対する最初の影響を超えて疾患のペースおよび進行に対する強力な影響を有することが示される。これらの結果から、ＡＰＯＥ４は、アミロイド沈着と神経毒性の両方に関して疾患過程を加速し得る（したがって、発症年齢の低下をもたらす）が、ＡＰＯＥ２は逆であるという見解が補強され、これにより、ＣＮＳへのＡＰＯＥ２（またはＡＰＯＥ２模倣物）の導入には治療的価値があり得るという可能性が生じる。ＡＰＯＥは、Ａβを脳から除去する機構として、またはクリアランス半減期を低下させる保持分子として多様に提案されている；本発明者らの現在の結果から、それほど多くない量のＡＰＯＥ３／４をＩＳＦに導入することが、ＣＮＳにおけるＡβの保持を増強するのに十分であることが示される。ＡＤにおけるＡＰＯＥ２の注目すべき保護性作用の機構は、一部において、ＡＰＯＥ２のＡＰＯＥ受容体への結合が比較的乏しいことが理由で長く不明のままである。本発明者らの現在のデータから、ＡＰＯＥ２が、ＡβのＣＮＳ保持に対する可能性のある中立的または有益な効果（他の対立遺伝子と比較して）に加えて、機能獲得を有し、確立したＡβの沈着を逆転させること、ならびにシナプスおよび神経突起の可塑性を支持することが可能であることが示唆される。これにより、ＡＰＯＥ４対立遺伝子が遺伝している患者とＡＰＯＥ２対立遺伝子が遺伝している患者との間の発症年齢の数十年の違いが、Ａβの沈着およびクリアランスの動態における異なる開始点および継続的な差異と、沈着に関連する神経毒性の程度の対立遺伝子に特異的な差異との両方を反映し得ることが示唆される。このＡＰＯＥ２の二重の機能により、その斑の除去およびシナプス回復能力を模倣することを目的とした治療的手法がもたらされ得る。
これらの結果は、ＡＰＯＥがＡβオリゴマー形成の足場として作用するモデルと一致する。これらの結果はまた、オリゴマーＡβがＡＰＯＥ４＞ＡＰＯＥ３（斑負荷量（ｂｕｒｄｅｎ）を症例にわたって正規化した場合でさえも）を有するＡＤのヒト患者のＣＮＳにおいて上昇するという本発明者らの最近の知見とも一致する。ＡＰＯＥ、特にＡＰＯＥ４により神経毒性オリゴマーＡβの形成が媒介される場合、本発明者らの現在のデータからそうであるとみなされるのと同様に、ＡＰＯＥ４の発現の増強によりシナプスおよび神経突起の変更の増加がもたらされると予測した。これらの結果に基づいて、ＡＰＯＥ４保有者の脳内のＡＰＯＥ濃度を上昇させる作用物質に関して注意が払われるべきである。
最後に、本発明者らのデータから、分泌タンパク質をコードする遺伝子を送達し、次いで皮質外套全体に拡散させるための、脳の上衣層へのＡＡＶ媒介性形質導入の有用性が強調される。本発明者らは、ＡＰＯＥ４を低下させる、またはＡＰＯＥ２を増加させる遺伝子移入または他の手法がＡＤ疾患の進行に影響を及ぼすのに有用であり得ることを示唆する。
材料および方法
研究デザイン
本研究は、斑の沈着が開始された後に、各ヒトＡＰＯＥアイソフォームの導入がアミロイドの進行およびＡβ関連神経毒性にどのように影響を及ぼすかを調査することを目的とした。この問題に取り組むために、２つの異なるＡＤトランスジェニックマウスモデルの脳室空間内に、各ＡＰＯＥ変異体をコードするＡＡＶベクターの単回注入を行った。マウスを短期間（２〜３カ月）または長期間（５カ月）曝露した。ｉｎ ｖｉｖｏイメージング、ｉｎ ｖｉｖｏ微量透析およびアレイ断層撮影法を使用して、ＩＳＦにおけるアミロイド沈着およびオリゴマー形成に対するだけでなく、Ａβ関連神経毒性（スパイン消失およびジストロフィー）に対する、ヒトＡｐｏＥアイソフォームの影響を評価した。マウスを処置群にランダムに割り当てた。注射するベクターの性質は統計解析まで盲検化したままにした。外科手技から首尾よく回復した全ての動物を死後分析に含めた。サンプルサイズは以前の経験に基づいて予め決定した。第２のトランスジェニック系統を用いた反復を行って仮説をさらに試験した。
動物
ＡＰＰｓｗｅ／ＰＳ１ｄＥ９（ＡＰＰ／ＰＳ１）マウス（D. R. Borcheltら、Accelerated amyloid deposition in the brains of transgenic mice coexpressing mutant presenilin 1 and amyloid precursor proteins. Neuron １９巻、９３９頁（１９９７年１０月））（Jackson laboratory）およびＴｇ２５７６マウス（K. Hsiaoら、Correlative memory deficits, Abeta elevation, and amyloid plaques in transgenic mice. Science ２７４巻、９９頁（１９９６年１０月４日））は、プリオンプロモーターの制御下で、スウェーデン変異Ｋ５９４Ｎ／Ｍ５９５Ｌを含有するヒト変異体アミロイド前駆体タンパク質遺伝子を発現する。ＡＰＰ／ＰＳ１モデルは、６カ月齢でアミロイド沈着を有する重症の表現型がもたらされる、エクソン９が欠失したプレセニリン１遺伝子も過剰発現する。Ｔｇ２５７６系統は、約１年齢でアミロイド斑が発生する穏やかなモデルである。本発明者らは、７カ月齢のＡＰＰＰＳ１を２カ月（ｎ＝４匹のＡＡＶ４−ＧＦＰ動物、ｎ＝４匹のＡＡＶ４−ＡＰＯＥ２動物、ｎ＝６匹のＡＡＶ４−ＡＰＯＥ３動物およびｎ＝５匹のＡＡＶ４−ＡＰＯＥ４動物）または５カ月（ｎ＝４匹のＡＡＶ４−ＧＦＰ動物、ｎ＝５匹のＡＡＶ４−ＡＰＯＥ２動物、ｎ＝６匹のＡＡＶ４−ＡＰＯＥ３動物およびｎ＝５匹のＡＡＶ４−ＡＰＯＥ４動物）のいずれかにわたって各ＡＡＶベクターに曝露した。さらに、ＩＳＦ中のＡβのレベルを測定するために、１６カ月齢のＴｇ２５７６マウスのコホート（ｎ＝３匹のＡＡＶ４−ＧＦＰ動物、ｎ＝３匹のＡＡＶ４−ＡＰＯＥ２動物、ｎ＝５匹のＡＡＶ４−ＡＰＯＥ３動物およびｎ＝５匹のＡＡＶ４−ＡＰＯＥ４動物）を含めた。ＡＰＯＥ欠損マウス（ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）も使用した。ＮＩＨおよび施設のガイドラインに従って実験を実施した。
ウイルスベクターの構築および作製
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｉｌｌｉｎｏｉｓ（Ｃｈｉｃａｇｏ）のＤｒ．ＬａＤｕから惜しみなく提供されたＡＰＯＥ−２ ｃＤＮＡ、ＡＰＯＥ−３ ｃＤＮＡおよびＡＰＯＥ−４ ｃＤＮＡをＰＣＲによって増幅し、ＢａｍＨＩによって消化し、ＡＡＶ２−ｐＣＭＶ−ｈｒＧＦＰ骨格に挿入した。ＡＡＶ血清型４ベクターは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｉｏｗａ、Ｉｏｗａ ＣｉｔｙのＧｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｒｅにより作製された。ＡＡＶウイルス力価を定量的ＰＣＲによって決定した。
定位脳室内注射
ＡＡＶ脳室内注射を以前に記載されている通り実施した（G. Liu、I. H. Martins、J. A. Chiorini、B. L. Davidson、Adeno-associated virus type 4 (AAV4) targets ependyma and astrocytes in the subventricular zone and RMS. Gene Ther １２巻、１５０３頁（２００５年１０月）；T. L. Spiresら、Dendritic spine abnormalities in amyloid precursor protein transgenic mice demonstrated by gene transfer and intravital multiphoton microscopy. J Neurosci ２５巻、７２７８頁（２００５年８月３日））。動物を麻酔し（ケタミン／キシラジン：それぞれ体重１ｋｇ当たり１００ｍｇおよび体重１ｋｇ当たり５０ｍｇ）、定位枠に置いた（Ｄａｖｉｄ Ｋｏｐｆ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）。ウイルス調製物（力価２×１０１２ｖｇ／ｍｌ）５μｌを用いた各側脳室への注射を、１０μｌのＨａｍｉｌｔｏｎシリンジ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｍｅｄｉｃａｌ）に取り付けた３３ゲージの針を使用し、０．２５μｌ／分で実施した。定位座標はブレグマから算出した（前後＋０．３ｍｍ、中外側±１ｍｍおよび背腹側−２ｍｍ）。
頭蓋窓の埋め込みおよび多光子イメージング
マウスをイソフルラン（１．５％）で麻酔し、頭蓋の小片を５ｍｍのカバーガラスで置き換えることによって頭蓋窓を埋め込んだ（T. L. Spiresら、Dendritic spine abnormalities in amyloid precursor protein transgenic mice demonstrated by gene transfer and intravital multiphoton microscopy. J Neurosci ２５巻、７２７８頁（２００５年８月３日））。画像化のために、ワックスリングを構築して対物レンズ（２０×、開口数０．９５、Ｏｌｙｍｐｕｓ）用の水のウェルを作製した。ＢＢＢを横断し、斑に結合する蛍光化合物であるメトキシ−ＸＯ４（５ｍｇ／ｋｇ）を外科手術の２４時間前に腹腔内注射した後にアミロイド沈着を可視化した（B. J. Bacskai、W. E. Klunk、C. A. Mathis、B. T. Hyman、Imaging amyloid-beta deposits in vivo. J Cereb Blood Flow Metab ２２巻、１０３５頁（２００２年９月））。Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄデキストラン（７０，０００Ｄａ；ＰＢＳ中１２．５ｍｇ／ｍｌ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を外側尾静脈内に注射して、蛍光血管造影図をもたらし、正確な同じ視野を経時的に追跡した（follow）。ＡＡＶ注射の１週間後、次いで、１カ月後および２カ月後にマウスを画像化した。
多光子イメージングシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ １０２４ＥＳ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に搭載したモードロックＴｉ：Ｓａｐｐｈｉｒｅ ｌａｓｅｒ（ＭａｉＴａｉ、Ｓｐｅｃｔｒａ−Ｐｈｙｓｉｃｓ）により８６０ｎｍの二光子蛍光励起光を生成した。放出された光を、３８０〜４８０、５００〜５４０および５６０〜６５０ｎｍの範囲の３つの光電子増倍管（Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ）を含有する外付け検出器によって収集した。斑および血管造影についての二色画像を同時に取得した。低拡大率のｉｎ ｖｉｖｏ画像（６１５×６１５μｍ；ｚ−ステップ、２μｍ、深さ、約２００μｍ）を取得し、６〜８視野を画像化した。
画像処理および解析
斑の密度を、Ｉｍａｇｅ Ｊを使用して、画像化した皮質の体積当たりのアミロイド沈着の数を報告することによって定量した。本発明者らは、表面におけるｚスタックの最初のスライスから始まってアミロイド沈着を検出することができた最後のスライスまでを皮質の体積とみなした。アミロイド沈着のサイズを、２次元投影後の最大強度からそれらの断面積を測定することによって経時的に評価した。各斑について、最初の時点と１カ月目の間の面積の比（Ｔ１／Ｔ０）、または２カ月目と１カ月目の間の面積の比（Ｔ２／Ｔ１）を算出した。多光子顕微鏡の設定（レーザーパワーおよびＰＭＴ）はイメージングセッション全体にわたって維持した。
ｉｎ ｖｉｖｏにおける微量透析試料採取
Ｔｇ２５７６マウスに対して、ＡＡＶ注射の３カ月後に、ＩＳＦのｉｎ ｖｉｖｏにおける微量透析試料採取を実施した（S. Takedaら、Novel microdialysis method to assess neuropeptides and large molecules in free-moving mouse. Neuroscience １８６巻、１１０頁（２０１１年７月１４日））。微量透析プローブは４ｍｍのシャフトを有し、３．０ｍｍ、１０００ｋＤａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）ポリエチレン（ＰＥ）膜（ＰＥＰ−４−０３、株式会社エイコム）を伴った。使用する前に、プローブを人工脳脊髄液（ａＣＳＦ：１２２ｍＭのＮａＣｌ、１．３ｍＭのＣａＣｌ２、１．２ｍＭのＭｇＣｌ２、３．０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、２５．０ｍＭのＮａＨＣＯ３）で洗浄した。予め条件付けたプローブの出口および入口を、フッ素化エチレンプロピレン（ＦＥＰ）管材料（φ２５０μｍ ｉ．ｄ．）を使用して、それぞれ蠕動ポンプ（ＥＲＰ−１０、株式会社エイコム）およびマイクロシリンジポンプ（ＥＳＰ−３２、株式会社エイコム、日本、京都）に接続した。
プローブの埋め込みを、以前に記載されている通り実施した（S. Takedaら、Novel microdialysis method to assess neuropeptides and large molecules in free-moving mouse. Neuroscience １８６巻、１１０頁（２０１１年７月１４日）；J. R. Cirritoら、In vivo assessment of brain interstitial fluid with microdialysis reveals plaque-associated changes in amyloid-beta metabolism and half-life. J Neurosci ２３巻、８８４４頁（２００３年１０月１日））。麻酔した動物（１．５％イソフルラン）に、ガイドカニューレ（ＰＥＧ−４、株式会社エイコム）を海馬（ブレグマ−３．１ｍｍ、正中線に対して−２．５ｍｍ外側、硬膜に対して−１．２ｍｍ腹側）に定位に埋め込んだ。次いで、歯科用セメントを使用してガイドを頭蓋に固定した。外科手術の４日後、マウスを微量透析ケージに入れ、ガイドを通じてプローブを挿入した。試料収集の前に、プローブを、ａＣＳＦを用いて毎分１０μｌの流速で２４０分にわたって灌流した。試料を毎分０．２５μｌ（Ａβについて）および毎分０．１μｌ（ＡｐｏＥについて）の流速で収集した。マウスは覚醒しており、微量透析ケージ内を自由に動ける状態であった（ＡｔｍｏｓＬＭ ｍｉｃｒｏｄｉａｌｙｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ、株式会社エイコム）。
免疫組織学的分析
マウスをＣＯ２吸入によって安楽死させた。一方の大脳半球をＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒド中に固定し、パラフィンワックスに包埋した。皮質の１ｍｍ３の小片をアレイ断層撮影法のために処理し、残りはスナップ凍結した。パラフィン包埋した切片（１０μｍ）をキシレン中で脱パラフィンし、エタノール中で再水和し、クエン酸緩衝液（１０ｍＭのクエン酸ナトリウム、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０、ｐＨ６．０）中で処理し、０．５％トリトンを伴うＰＢＳ中で透過処理し、３％ＢＳＡを伴うＰＢＳ中で２時間にわたってブロッキングした。一次抗体と一緒に４℃で一晩インキュベートした：アミロイド斑についてはＢａｍ１０（１：１０００、ＳＩＧＭＡ）およびＲ１２８２（１：５００、Ｄｒ Ｄｅｎｎｉｓ Ｓｅｌｋｏｅから提供された）、ヒトＡＰＯＥについてはマウスモノクローナル抗体３Ｈ１（１：２５０、Ｏｔｔａｗａ Ｈｅａｒｔ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、神経突起ジストロフィーについてはニワトリ抗ＧＦＰ（１：５００、Ａｖｅｓ）、ＳＭＩ−３１２（１：５００、Ｃｏｖａｎｃｅ）、小膠細胞およびアストロサイトについてはそれぞれＩＢＡ１（１：５００、和光純薬工業株式会社）およびＧＦＡＰ（１：１０００、ＳＩＧＭＡ）。二次抗体と一緒に２時間インキュベートした。封入前に５０％エタノール中Ｔｈｉｏ−Ｓ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）０．０５％によってアミロイド密集コア斑を標識した。
アレイ断層撮影法のための試料の調製、免疫染色およびイメージング
アレイ断層撮影分析を以前に記載されている通り実施した（R. M. Koffieら、Oligomeric amyloid beta associates with postsynaptic densities and correlates with excitatory synapse loss near senile plaques. Proc Natl Acad Sci U S A １０６巻、４０１２頁（２００９年３月１０日））。脳室領域に隣接する皮質組織の小片（１ｍｍ３）を切り取り、０．０１ＭのＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒド、２．５％スクロース中に３時間にわたって固定した。エタノール中で脱水した後、試料をＬＲ Ｗｈｉｔｅ ｒｅｓｉｎ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で４℃で一晩インキュベートし、その後、５３℃で重合させた。次いで、切片のリボン（７０ｎｍ）をｕｌｔｒａｃｕｔ ｍｉｃｒｏｔｏｍｅ（Ｌｅｉｃａ）上でＪｕｍｂｏ Ｈｉｓｔｏ Ｄｉａｍｏｎｄ Ｋｎｉｆｅ（Ｄｉａｔｏｍｅ）を使用することによって切断した。
ＴＢＳ中５０ｍＭのグリシンで５分再水和した後、切片をＴｒｉｓ中０．０５％Ｔｗｅｅｎおよび０．１％ＢＳＡで５分にわたってブロッキングし、ブロッキング緩衝液中１：５０の一次抗体を２時間にわたって適用し（Ｄｒ Ｖｉｒｇｉｎｉａ Ｌｅｅからの、オリゴマーＡβ種を優先的に染色するＰＳＤ９５ Ａｂｃａｍ Ａｂ１２０９３、シナプシンＩ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＡＢ１５４３およびＮＡＢ６１（E. B. Leeら、Targeting amyloid-beta peptide (Abeta) oligomers by passive immunization with a conformation-selective monoclonal antibody improves learning and memory in Abeta precursor protein (APP) transgenic mice. J Biol Chem ２８１巻、４２９２頁（２００６年２月１７日））、その後、二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を適用した。７〜３０の連続切片に関して画像を得、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｐｌａｎ ＬＳＭ５１０共焦点／多光子顕微鏡（６３×開口数 Ｐｌａｎ Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔｉｃ油浸対物レンズ）を使用することによって取得した。
画像を、ＩｍａｇｅＪ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）およびＭＡＴＬＡＢ（Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ）を使用して以前に記載されている通り解析した（R. M. Koffieら、Oligomeric amyloid beta associates with postsynaptic densities and correlates with excitatory synapse loss near senile plaques. Proc Natl Acad Sci U S A １０６巻、４０１２頁（２００９年３月１０日））。各画像セットをスタックに変換し、Ｉｍａｇｅ Ｊ ＭｕｌｔｉＳｔａｃｋＲｅｇおよびＳｔａｃｋＲｅｇ ｐｌｕｇ−ｉｎｓ（Ｂｒａｄ ＢｕｓｓｅおよびＰ．Ｔｈｅｖｅｎａｚ、Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの好意による）を使用することによってアラインメントした。既知体積を選択し、自動化された閾値に基づく検出プログラムを使用して、２つ以上の連続した切片に出現したＰＳＤ９５斑点とシナプシン斑点の両方を計数した（ＷａｔｅｒＳｈｅｄ ｐｒｏｇｒａｍ、Ｂｒａｄ Ｂｕｓｓｅ、Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｓｍｉｔｈ、およびＫｒｉｓｔｉｎａ Ｍｉｃｈｅｖａ、Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙにより提供された）。Ｗａｔｅｒｓｈｅｄにより、２つ以上のアレイのスライスに存在した斑点を示す閾値画像スタック（各チャネルについて別々）がエクスポートされた。マウスごとに皮質内のいくつかの部位を試料採取し、斑の端部からのそれらの距離を測定した。
Ａβ定量
Ａβ４０およびＡβ４２の濃度を、ＢＮＴ−７７／ＢＡ−２７（Ａβ４０について）およびＢＮＴ−７７／ＢＣ−０５（Ａβ４２について）サンドイッチＥＬＩＳＡ（和光純薬工業株式会社）により、製造業者の指示に従って決定した。同じＮ末端（残基１〜１６）抗体を捕捉と検出のどちらにも使用した８２Ｅ１／８２Ｅ１サンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｉｍｍｕｎｏ−Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用してＡβオリゴマーを定量した（W. Xiaら、A specific enzyme-linked immunosorbent assay for measuring beta-amyloid protein oligomers in human plasma and brain tissue of patients with Alzheimer disease. Arch Neurol ６６巻、１９０頁（２００９年２月））。
免疫ブロット分析
脳溶解物および微量透析液（タンパク質２０μｇ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）用のＭＯＰＳランニング緩衝液中４〜１２％Ｎｏｖｅｘ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で電気泳動した。ゲルをＰＶＤＦ膜に転写し、５％Ｍｉｌｋ／ＴＢＳ−Ｔ中で６０分にわたってブロッキングした。膜をヤギ抗ＡＰＯＥ抗体（１：１０００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）でプローブしてＡｐｏｅヌル動物のＩＳＦ中のＡＰＯＥを検出し、対照としてアルブミンを使用した。ヒトおよびマウスのＡＰＯＥについてのブロットを、ＥＰ１３７３Ｙ抗体（１：１０００、Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）を用いて、およびウサギポリクローナルＡＰＯＥ抗体（１：１０００、Ａｂｃａｍ）を用いてそれぞれプローブした。ＡＰＰタンパク質分解産物（ｓＡＰＰ：２２Ｃ１１、１：４０００、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅおよびＣ８３／Ｃ９９：ＡＰＰ Ｃｔｅｒ、１：４０００、Ｓｉｇｍａ）およびインスリン分解酵素（ＩＤＥ、１：１０００、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）も分析した。ＨＲＰとコンジュゲートしたヤギＩｇＧ抗体（Ｖｅｃｔｏｒ）と一緒に２時間インキュベートした。ＥＣＬ ｋｉｔ（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して免疫反応性タンパク質を生じさせ、Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ ＥＣＬ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で検出した。
ｑＲＴ−ＰＣＲ
ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；１５５９６−０２６）を使用して脳由来の全ＲＮＡを抽出し、次いで、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩ Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；１２５７４−０１８）を使用してｃＤＮＡを合成した。ヒトＡＰＯＥ ｍＲＮＡ、内因性ａｐｏＥ ｍＲＮＡおよびＧａｐｄｈ ｍＲＮＡを増幅するために、ＰＣＲプライマーを設計した(Apoeフォワード:5’-AGCTCCCAAGTCACACAAGA;Apoeリバース:5’-GTTGCGTAGATCCTCCATGT;APOEフォワード:5’-CCAGCGACAATCACTGAAC;APOEリバース:5’-GCGCGTAATACGACTCACTA;Gapdhフォワード:5’-ATGACATCAAGAAGGTGGTGおよびGapdhリバース:5’-CATACCAGGAAATGAGCTTG)
ＡＰＯＥ ＥＬＩＳＡ
試料をＴＢＳ中２％トリトンで抽出し、それにより、膜に結合したＡｐｏＥの動員（mobilization）および定量を可能にした。ＥＬＩＳＡプレートを、１．５μｇ／ｍｌのヤギ抗ＡＰＯＥ抗体（マウスＡＰＯＥ）または１．５μｇ／ｍｌのＷＵＥ４抗体（ヒトＡＰＯＥ）を用いて一晩コーティングし、ＰＢＳ中１％乳を用いて１．５時間にわたってブロッキングした。ヒト組換えＡｐｏＥを標準物質として使用した（ヒトアッセイ、Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ）または脳抽出物由来の、組織内のマウス標準物質（マウスアッセイ）および試料をＥＬＩＳＡ緩衝液（ＰＢＳ中０．５％ＢＳＡおよび０．０２５％Ｔｗｅｅｎ−２０）中で一晩インキュベートした。ヒトに特異的な検出抗体（ヤギ−ａｐｏｅ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；１：１０，０００）またはマウスに特異的な検出抗体（Ａｂｃａｍ；１：２，０００）をそれぞれ使用し、その後、ＨＲＰとコンジュゲートした二次抗体を使用した。Ｈ３ＰＯ４を使用して溶液を停止する前にＴＭＢ基質を使用してシグナルを明らかにし、それを４５０ｎｍにおいて測定した。
統計解析
Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して統計解析を実施した。試料のサイズが小さいので、本解析の大部分について、正規性を仮定することはできなかった。全ての死後分析について、ノンパラメトリックなクラスカル・ワリス検定、続いてダンの多重比較検定を実施した。アミロイド進行のｉｎ ｖｉｖｏイメージングデータを、マウスを変量効果として、およびベクターを固定効果として、時間およびベースライン容積測定密度を用いた混合効果モデルを使用して解析した。時間とベクターとの間の相互作用をこの解析で考察したが、有意ではなかった。斑サイズを経時的に分析するために、マウスを変量効果としておよび対数ベースラインサイズ（第１の分析におけるｔ０、第２の分析におけるｔ１）を固定効果として用いて、２つの混合効果モデルを２つの連続した時点の比の対数について当てはめた。試料は各分析について盲検化した。
刊行物、特許および特許出願は全て、参照により本明細書に組み込まれる。上記明細書では本発明をそのある特定の好ましい実施形態に関連して記載し、また、例示目的で多くの詳細を記載しているが、当業者には、本発明にはさらなる実施形態が可能であること、および本明細書に記載の詳細のいくつかは、本発明の基本的な原理から逸脱することなく相当に変動し得ることが明らかである。
「ａ（１つの）」および「ａｎ（１つの）」および「ｔｈｅ（その）」という用語ならびに同様の指示対象の使用は、本発明の記載に関しては、本明細書において特に指定がある場合を除き、または文脈から明らかに矛盾する場合を除き、単数と複数の両方を包含すると解釈されるべきである。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」という用語は、特に断りのない限り、制限のない用語（すなわち、「〜に限定されないが、〜を含めた」という意味である）と解釈されるべきである。本明細書では、値の範囲の列挙は、本明細書では別段の指定のない限り、ただ単にその範囲内に入る別々の値のそれぞれについて個々に参照する簡潔な方法として機能するものとし、別々の値のそれぞれが、本明細書において個々に列挙されたのと同じく本明細書に組み込まれる。本明細書に記載の方法は全て、本明細書において別段の指定がある場合を除き、または文脈から明らかに矛盾する場合を除き、任意の適切な順番で実施することができる。本明細書において提供されるありとあらゆる例、または例示的な言葉（例えば、「などの（ｓｕｃｈ ａｓ）」）の使用は、ただ単に本発明をよりよく明らかにするためのものであり、別段特許請求されていない限り、本発明の範囲に対する限定を課すものではない。本明細書中のどの言葉も、任意の特許請求されていない要素が本発明の実施に必須であることを示すと解釈されるべきではない。
本発明の実施形態は、本発明を実行するため、本発明者らが知っている最良の様式を含めて、本明細書に記載されている。それらの実施形態の変形は、前述の記載を読めば当業者には明らかになり得る。本発明者らは、当業者がそのような変形を必要に応じて使用することを予想し、また、本発明者らは、本発明が本明細書で具体的に記載されているものとは別のやり方で実施されることを意図している。したがって、本発明は、適用法によって認められる添付の特許請求の範囲において列挙されている主題の改変および等価物の全てを包含する。さらに、本明細書において別段の指定がある場合を除き、または文脈から明らかに矛盾する場合を除き、その可能性のある変形全てにおける上記の要素の任意の組合せが本発明に包含される。

Claims (18)

  1. アミロイド障害の処置前および処置後の哺乳動物中のＡ−ベータを検出する方法であって、該方法は、
    アミロイド障害に対する処置の前に該哺乳動物から得られた第１の血液試料中のＡ−ベータのレベルおよびアミロイド障害に対する処置の後に該哺乳動物から得られた第２の血液試料中のＡ−ベータのレベルを定量するステップと、
    該アミロイド障害の処置前および処置後の該哺乳動物中のＡ−ベータの該レベルを決定するステップと
    を含み、
    該方法が、該第１の血液試料中のＡ−ベータのレベルと該第２の血液試料中のＡ−ベータのレベルを比較するステップをさらに含み、該第２の血液試料中のＡ−ベータのレベルが該第１の血液試料と比較して上昇していることが、該哺乳動物の脳内に存在するアミロイド斑または凝集体の低下または減少と関連するまたはそれを示す、ならびに／あるいは該アミロイド障害の有効な処置と関連するまたはそれを示し、
    該処置が、該哺乳動物の脳内の保護性ＡｐｏＥアイソフォームタンパク質のレベルの上昇を含み、
    該保護性ＡｐｏＥアイソフォームがＡｐｏＥ ε２に対して８０％の相同性を有する、方法。
  2. 前記第１の血液試料中のＡ−ベータの前記レベルと前記第２の血液試料中のＡ−ベータの前記レベルの比を算出するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記処置が、前記哺乳動物の脳脊髄液（ＣＳＦ）に、ＡＡＶカプシドタンパク質と、ＡＡＶ末端逆位配列（ＩＴＲ）の対の間または１つもしくは複数のＡＡＶ ＩＴＲの隣に挿入された前記保護性ＡｐｏＥアイソフォームタンパク質をコードする核酸を含むベクターとを含むｒＡＡＶ粒子を投与するステップを含む、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記処置が、前記保護性ＡｐｏＥアイソフォームをコードする核酸を前記哺乳動物に送達するステップであって、該哺乳動物由来の上衣細胞に、ＡＡＶカプシドタンパク質と、ＡＡＶ末端逆位配列（ＩＴＲ）の対の間または１つもしくは複数のＡＡＶ ＩＴＲの隣に挿入された該核酸を含むベクターとを含むｒＡＡＶ粒子を投与することと、該上衣細胞を該哺乳動物に戻し、それにより、該核酸を該哺乳動物に送達することとを含むステップを含む、請求項１または２に記載の方法。
  5. 前記処置が、前記保護性ＡｐｏＥアイソフォームをコードする核酸を哺乳動物中の上衣細胞に送達するステップであって、該哺乳動物に、ＡＡＶカプシドタンパク質と、ＡＡＶ末端逆位配列（ＩＴＲ）の対の間または１つもしくは複数のＡＡＶ ＩＴＲの隣に挿入された核酸を含むベクターとを含むｒＡＡＶ粒子を投与し、それにより、該核酸を該哺乳動物中の上衣細胞に送達することを含むステップを含む、請求項１または２に記載の方法。
  6. 前記ｒＡＡＶ粒子を前記哺乳動物中の上衣細胞に形質導入またはトランスフェクトし、該形質導入またはトランスフェクトされた上衣細胞が前記ＡｐｏＥアイソフォームタンパク質を分泌する、請求項３から５までのいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記ｒＡＡＶ粒子が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ７４もしくはＲｈ１０のカプシド、または変異体ＡＡＶ１、変異体ＡＡＶ２、変異体ＡＡＶ３、変異体ＡＡＶ４、変異体ＡＡＶ５、変異体ＡＡＶ６、変異体ＡＡＶ７、変異体ＡＡＶ８、変異体ＡＡＶ９、変異体ＡＡＶ１０、変異体ＡＡＶ１１、変異体Ｒｈ７４もしくは変異体Ｒｈ１０のカプシドを含む、請求項３から６までのいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記ｒＡＡＶ粒子が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ７４もしくはＲｈ１０の末端逆位配列（ＩＴＲ）または変異体ＡＡＶ１、変異体ＡＡＶ２、変異体ＡＡＶ３、変異体ＡＡＶ４、変異体ＡＡＶ５、変異体ＡＡＶ６、変異体ＡＡＶ７、変異体ＡＡＶ８、変異体ＡＡＶ９、変異体ＡＡＶ１０、変異体ＡＡＶ１１、変異体Ｒｈ７４もしくは変異体Ｒｈ１０の末端逆位配列（ＩＴＲ）を含む、請求項３から７までのいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記核酸が、哺乳動物ＡｐｏＥアイソフォームタンパク質をコードする、請求項３から８までのいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記核酸が、ヒトＡｐｏＥアイソフォームタンパク質をコードする、請求項３から８までのいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記ｒＡＡＶ粒子が、医薬組成物を含む、請求項３から１０までのいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記第１の血液試料中または前記第２の血液試料中のＡ−ベータの前記レベルをイムノアッセイによって定量する、請求項１から１１までのいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記哺乳動物が霊長類である、請求項１から１２までのいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記霊長類がヒトである、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記保護性ＡｐｏＥアイソフォームがＡｐｏＥ ε２に対して１００％の相同性を有する、請求項３から１４までのいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記アミロイド障害がアルツハイマー病を含む、請求項１から１５までのいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記第１および第２の血液試料が全血、血漿または血清である、請求項１から１６までのいずれか一項に記載の方法。
  18. 哺乳動物中のアミロイド障害を処置するための組成物であって、該組成物は、ＡＡＶカプシドタンパク質と、ＡＡＶ末端逆位配列（ＩＴＲ）の対の間または１つもしくは複数のＡＡＶ ＩＴＲの隣に挿入された保護性ＡｐｏＥアイソフォームタンパク質をコードする核酸を含むベクターとを含むｒＡＡＶ粒子を含み、
    該組成物は、該哺乳動物の脳脊髄液（ＣＳＦ）に投与されることを特徴とし、
    ここで、該組成物は、該組成物での該アミロイド障害の処置の後に該哺乳動物から得られた第２の血液試料中のＡ−ベータのレベルが該組成物での該アミロイド障害の処置の前に該哺乳動物から得られた第１の血液試料と比較して上昇していることに基づいて該アミロイド障害を処置するために有効であると決定されており、
    該保護性ＡｐｏＥアイソフォームがＡｐｏＥ ε２に対して８０％の相同性を有する、組成物。
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