KR20160079891A - 아밀로이드 침착의 치료를 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

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베벌리 엘. 데이비드슨
브래들리 티. 하이먼
엘로이즈 허드리
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유니버시티 오브 아이오와 리써치 파운데이션
더 제너럴 하스피탈 코포레이션
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Abstract

본 개시내용은 포유동물로부터 제1 혈액 샘플을 얻고; 포유동물에게 아밀로이드 장애에 대한 치료를 투여하고; 포유동물로부터 제2 혈액 샘플을 얻고; 제1 혈액 샘플 중 및 제2 혈액 샘플 중의 A-베타의 수준을 정량화하고; 아밀로이드 장애의 치료 전후의 포유동물 중의 A-베타의 수준을 측정하는 것을 포함하는, 아밀로이드 장애의 치료 전후의 포유동물 중의 A-베타의 측정 방법을 제공한다.
[대표도]
도 1A

Description

아밀로이드 침착의 치료를 위한 방법 및 조성물 {METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATING AMYLOID DEPOSITS}
관련 출원
본 출원은 2013년 11월 20일에 출원된 미국 가 특허 출원 제61/906,811호에 대해 우선권을 주장하며, 그의 전문은 본원에 참고로 포함된다.
연방정부 보조금 지원
본 발명은 국립 보건원에 의해 수여된 R00AG33670, NS34568, HD33531, DK54759, 1RC1AG026265-01 및 RC1AG036265 하의 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에서 특정 권리를 갖는다.
유전자 전달은 현재 세포 및 분자 수준 둘 다에서 생물학적 사건 및 질환 과정의 분석을 위한 강력한 도구로서 폭넓게 인식되어 있다. 보다 최근에, 유전된 (예를 들어, ADA 결핍) 또는 획득된 (예를 들어, 암 또는 감염성 질환) 인간 질환의 치료를 위한 유전자 요법의 적용은 상당한 주목을 받았다. 개선된 유전자 전달 기술의 출현 및 결함성 유전자-관련된 질환의 계속 확장되는 라이브러리의 확인과 함께, 유전자 요법은 치료 이론에서 실제 현실로 빠르게 진화하였다.
전통적으로, 유전자 요법은 선천적 유전적 오류를 수정하기 위해 외인성 유전자를 환자의 세포 내로 도입하는 절차로 정의되었다. 보다 최근에, 유전자 요법은 질환에 걸린 유기체 내로의 새로운 유전 정보의 도입을 통한 질환 표현형의 수정으로 폭넓게 정의되었다. 생체내 유전자 요법에서, 전달되는 유전자는 수용자 유기체의 세포 내로 계내로, 즉 수용자 내에서 도입된다. 생체내 유전자 요법은 동물 모델에서 조사되었다. 기관 및 조직, 예컨대 근육, 조혈 줄기 세포, 동맥 벽, 신경계 및 폐 내로 계내에서의 직접 유전자 전달의 실행가능성이 보고되었다. 골격근, 심장근 내로의 DNA의 직접 주사 및 혈관구조 내로의 DNA-지질 복합체의 주사는 또한 생체내에서 삽입된 유전자 생성물(들)의 검출가능한 발현 수준을 생성하는 것으로 보고되었다.
중추 신경계 (CNS)의 질환, 예를 들어, 뇌의 유전적 질환, 예컨대 알츠하이머병의 치료는 난치성의 문제로 남아 있다. 뇌 질환의 치료와 관련된 주요한 문제는 치료 단백질이 정맥내로 전달될 경우 혈액-뇌 장벽을 건너지 않거나, 뇌에 직접적으로 전달될 경우 폭넓게 분포되지 않는다는 점이다. 따라서, 알츠하이머병의 치료 요법이 개발되어야 할 필요가 있다.
요약
본 발명은 특정 실시양태에서 (a) 포유동물로부터 제1 혈액 샘플을 얻고;
(b) 포유동물에게 아밀로이드 장애에 대한 치료를 투여하고;
(c) 포유동물로부터 제2 혈액 샘플을 얻고;
(d) 제1 혈액 샘플 중 및 제2 혈액 샘플 중의 A-베타의 수준을 정량화하고;
(e) 아밀로이드 장애의 치료 전후의 포유동물 중의 A-베타의 수준을 측정하는 것
을 포함하는, 아밀로이드 장애의 치료 전후의 포유동물 중의 A-베타의 측정 방법을 제공한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 제1 샘플 중의 A-베타의 수준 대 제2 샘플 중의 A-베타의 수준의 비율을 계산하는 것을 더 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 제1 샘플 중의 A-베타의 수준을 제2 샘플 중의 A-베타의 수준과 비교하는 것을 더 포함하며, 여기서 제1 혈액 샘플에 비해 제2 혈액 샘플 중의 A-베타의 증가된 수준은 포유동물의 뇌에 존재하는 아밀로이드 플라크 또는 응집체의 감소 또는 저감과 관련되거나 또는 이를 나타내는 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 제1 샘플 중의 A-베타의 수준을 제2 샘플 중의 A-베타의 수준과 비교하는 것을 더 포함하며, 여기서 제1 혈액 샘플에 비해 제2 혈액 샘플 중의 A-베타의 증가된 수준은 아밀로이드 장애의 유효 치료와 관련되거나 또는 이를 나타내는 것이다.
특정 실시양태에서, 치료는 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 입자, 및 한 쌍의 AAV 역전된 말단 반복부 (ITR) 사이에 삽입되거나 하나 이상의 AAV ITR에 인접한 보호 ApoE 이소형 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 포유동물의 뇌척수액 (CSF)에 투여하는 것을 포함한다. 본원에 사용된 용어 "보호 ApoE 이소형"은 알츠하이머병의 위험을 적어도 5％, 예컨대 10％, 20％, 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 100％ 또는 그 이상 감소시키는 ApoE 이소형을 구별하기 위해 사용된다. 특정 실시양태에서, rAAV 입자는 AAV4의 감염률보다 20％ 초과의 비율로, 예컨대 AAV4의 감염률보다 50％ 또는 100％, 1000％ 또는 2000％ 초과의 비율로 비-설치류 뇌실막 세포(ependymal cell)를 감염시키는 rAAV2 입자이다.
특정 실시양태에서, 치료는 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 입자, 및 한 쌍의 AAV 역전된 말단 반복부 (ITR) 사이에 삽입되거나 하나 이상의 AAV ITR에 인접한 핵산을 포함하는 벡터를 포유동물로부터의 뇌실막 세포에 투여하고, 뇌실막 세포를 포유동물로 복귀시킴으로써, 핵산을 포유동물에 전달하는 것을 포함하는, 보호 ApoE 이소형을 코딩하는 핵산을 포유동물에 전달하는 것을 포함한다.
특정 실시양태에서, 치료는 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 입자, 및 한 쌍의 AAV 역전된 말단 반복부 (ITR) 사이에 삽입되거나 하나 이상의 AAV ITR에 인접한 핵산을 포함하는 벡터를 포유동물에게 투여함으로써, 핵산을 포유동물의 뇌실막 세포에 전달하는 것을 포함하는, 보호 ApoE 이소형을 코딩하는 핵산을 포유동물의 뇌실막 세포에 전달하는 것을 포함한다.
특정 실시양태에서, rAAV 입자는 포유동물의 뇌실막 세포를 형질도입 또는 형질감염시키고, 형질도입된 또는 형질감염된 뇌실막 세포는 ApoE 이소형 단백질을 분비한다. 특정 실시양태에서, rAAV 입자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh74 또는 Rh10 캡시드 또는 변이체 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh74 또는 Rh10 캡시드를 포함한다. 특정 실시양태에서, rAAV 입자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh74 또는 Rh10 역전된 말단 반복부 (ITR) 또는 변이체 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh74 또는 Rh10 역전된 말단 반복부 (ITR)를 포함한다. 특정 실시양태에서, AAV 입자는 rAAV4 입자이다. 특정 실시양태에서, AAV 입자는 rAAV2 입자이다. 특정 실시양태에서, rAAV2 캡시드는 AAV2 캡시드 단백질 VP1, VP2 및/또는 VP3에 대해 적어도 80％ 상동성을 갖는다. 특정 실시양태에서, rAAV2 캡시드는 AAV2 캡시드 VP1, VP2 및/또는 VP3에 대해 100％ 상동성을 갖는다.
특정 실시양태에서, 핵산은 포유동물 ApoE 이소형 단백질을 코딩한다. 특정 실시양태에서, 핵산은 인간 ApoE 이소형 단백질을 코딩한다. 특정 실시양태에서, rAAV 입자는 제약 조성물을 포함한다.
특정 실시양태에서, 제1 혈액 샘플 중 또는 제2 혈액 샘플 중의 A-베타의 수준은 면역검정에 의해 정량화된다.
특정 실시양태에서, 포유동물은 비-설치류 포유동물이다. 특정 실시양태에서, 비-설치류 포유동물은 영장류, 말, 양, 염소, 돼지 또는 개이다. 특정 실시양태에서, 영장류는 인간이다.
특정 실시양태에서, 치료는 포유동물의 뇌 중의 보호 ApoE 이소형 단백질의 증가된 수준을 포함한다. 특정 실시양태에서, 보호 ApoE 이소형은 ApoE ε2에 대해 80％ 상동성을 갖는다. 특정 실시양태에서, 보호 ApoE 이소형은 ApoE ε2에 대해 100％ 상동성을 갖는다.
특정 실시양태에서, 아밀로이드 장애는 알츠하이머병을 포함한다.
특정 실시양태에서, 혈액 샘플은 전혈, 혈장 또는 혈청이다.
도 1A 내지 1B. AAV4-ApoE의 뇌실내 주사는 뇌에서 huAPOE의 안정한 발현 및 재조합 huApoE 단백질의 지속된 검출을 초래한다.
도 2. ApoE의 각각의 이소형의 과발현은 아밀로이드증의 진행에 차등적으로 영향을 준다.
도 3. 아밀로이드 플라크의 크기는 각각의 ApoE 이소형에 따라 다양하다.
도 4A 내지 4B. 아밀로이드 적하량의 사후 평가는 아밀로이드 침착에 대한 ApoE2 및 ApoE4의 효과를 확인시킨다.
도 5A 내지 5D. 각각의 ApoE 이소형은 아밀로이드 침착물 주위의 시냅스 밀도에 차등적으로 영향을 준다.
도 6A는 AAV2 (서열 1) 및 AAV4 (서열 2) 단백질의 정렬이고, 도 6B는 AAV2 (NC_001401) 및 AAV4 (NC_001829)로부터의 서열에 기초한 AAV2 (서열 3) 및 AAV4 (서열 4) 뉴클레오티드의 정렬이다.
도 7은 다양한 뇌 영역에서의 상승된 TPP1 활성을 나타낸다.
도 8은 대조군 및 처리된 개의 T-미로 수행의 결과를 나타낸다. 밝은 원은 질환에 걸린 개에 대한 것이고; 어두운 정사각형은 정상적인 개에 대한 것이고, 어두운 원은 AAV2-CLN2로 처리된 TPP-/- 개에 대한 것이다.
도 9A 내지 9B. 도 9A 내지 9B. AAV 혈청형 4의 뇌실내 주사에 의한 APOE 유전자 전달 접근법의 확인. GFP 또는 ApoE의 면역조직학적 표지화는 뇌실막 중 및 맥락 얼기 중의 GFP 또는 인간 ApoE 단백질의 존재를 밝혔다. (A) 주사된 마우스의 뇌 균질액 내의 재조합 인간 ApoE 단백질의 농도를 정량화하기 위한 종-특이적 ELISA 검정의 사용. (B) 마우스 당 내인성 apoE와 비교한 인간 ApoE 단백질의 퍼센트의 평가. 인간 ApoE 및 뮤린 내인성 apoE의 비율을 각각의 동물에 대해 계산하였다. 특이적 항-인간 ApoE 항체 3H1을 사용하여, 재조합 단백질의 존재를 일부 아밀로이드 침착물 주위에서 검출할 수 있으며, 여기서, 이는 APP/PS1 주사된 마우스의 피질 실질 내에 축적되는 경향이 있다. AAV4-APOE4 벡터로 주사된 apoE KO 마우스의 ISF 샘플 중의 웨스턴 블롯에 의한 ApoE의 검출. 밀리포어 (Millipore)로부터의 고 민감성 (그러나 비-종 특이적) 염소 항-apoE 항체 (AB947)를 검출 항체로서 사용하였다. 알부민을 대조군으로서 사용하였다. n= 군 당 4 내지 6마리 동물. *p<0.05.
도 10A 내지 10D. Aβ 펩티드의 수준 및 아밀로이드 침착물의 밀도는 상이한 APOE 대립유전자의 과발현에 의해 조절된다. (A) 주사된 형질전환 마우스의 피질 (좌측 패널) 및 해마 (우측 패널) 중의 아밀로이드 침착물의 밀도의 분석. 둘 다의 뇌 영역 사이에서 유사한 경향이 관찰될 수 있었지만, 데이터는 단지 피질에서 통계학적 유의성에 도달하였다. (B) 포름산 (FA) 분획 중의 Aβ40 및 Aβ42 펩티드의 농도의 ELISA에 의한 측정. (C) 각각의 AAV의 뇌실내 주사 5개월 후의 TBS 가용성 분획 중의 Aβ40 및 Aβ42 펩티드의 수준의 ELISA에 의한 정량화. (D) AAV-GFP 및 AAV-APOE2/3/4 벡터로의 APP/PS1 마우스의 뇌실내 주사 5개월 후의 Aβ40 펩티드의 혈장 수준의 정량화. n= 군 당 4 내지 7마리 동물. *p<0.05
도 11A 내지 11B. 각각의 APOE 변이체의 과발현은 생체내에서 아밀로이드증 의 진행을 조절한다. AAV-GFP, -APOE2, -3 또는 -4 벡터로의 뇌실내 주사 1주 후 (T0), 1개월 후 (T1) 및 2개월 후 (T2)의 APP/PS1 마우스에서의 아밀로이드 침착의 생체내 2-광자 화상이 현상되었다. 동일한 시야 영역을 시간 경과에 따라 추적할 수 있도록 화상화 전에 덱스트란 (Dextran), 텍사스 레드 (Texas red) (70,000 Da)의 정맥내 주사를 수행하였다. 2개월 기간 내에, 소수의 새로운 아밀로이드 플라크를 검출할 수 있었던 반면, 초기에 볼 수 있는 가끔 나타나는 침착물은 1 또는 2개월 후에 더이상 검출가능하지 않았다. (A) 7월령 APP/PS1 마우스에서의 AAV-GFP, -APOE2, -APOE3 또는 APOE4의 뇌실내 주사 후의 2개월 기간에 걸친 아밀로이드 침착물의 부피 피질 밀도의 평가. 6 내지 8개의 시야 영역을 각각의 동물에 대해 종적으로 화상화하고, 플라크의 밀도를 피질의 부피 당 계산하고, 기준선 (T0)에서 각각의 동물에 대한 초기 값에 대해 보고하였다. 아밀로이드 침착물의 밀도의 0.23의 전체적인 진행이 시간 경과에 따라 관찰되었다 (T2/T1, p<0.011). 또한, 유의하게 ApoE2는 밀도를 GFP에 비교해 0.66 (se=0.21, p=0.002), ApoE3에 비교해 0.67 (se=0.17, p<0.0001), ApoE4에 비교해 0.74 (se=0.17, p<0.0001) 저감시킨다. (B) APP/PS1 마우스에서의 유전자 전달 후 2개월에 걸친 아밀로이드증 진행의 선형 회귀 피트는 단지 AAV-APOE4만이 이 기간 동안 유의한 양의 기울기를 유도함을 나타낸다. n= 군 당 4 내지 6마리 동물. *p<0.05.
도 12. ApoE2 , -3 및 -4로의 주입 1개월 및 2개월(들) 후의 아밀로이드 침착물의 크기의 진화. T1 및 T0 사이의 플라크 크기의 비율을 나타내는 산란 도트 플롯은 ApoE4가 1개월 후 ApoE2 및 ApoE3 둘 다에 비해 증가된 플라크 성장과 관련되었음을 나타내었다. 이 효과는 2개월 후에는 지속되지 않는다. 3 내지 4마리 동물 내의 군 당 측정된 n> 50개 플라크. *p<0.05.
도 13A 내지 13C. 아밀로이드 침착물과 관련된 신경병리학적 변화는 각각의 APOE 변이체에 의해 차등적으로 영향을 받는다. AAV-GFP, -APOE2, -APOE3 및 -APOE4의 뇌실내 주사 2개월 후의 APP/PS1 마우스에서의 PSD95 (시냅스후 요소) 및 아밀로이드 침착물에 대해 면역염색된 어레이 단층촬영 섹션의 화상을 작성하였다. 아밀로이드 침착물을 독성 Aβ 올리고머성 종을 우선적으로 표지하는 것으로 이전에 입증된 항체 NAB61을 사용하여 표지하였다. (A) APOE3 및 APOE4 둘 다가 GFP 또는 APOE2에 비해 발현된 경우, 시냅신-1 마커의 유의하게 보다 높은 소실이 아밀로이드 플라크 부근에서 관찰되었다. (B) 시냅스후 요소를 정량화한 경우 유사한 효과가 관찰되었으며, 침착물 주위의 PSD95의 밀도는 AAV4-APOE4의 뇌실내 주사 2개월 후에 감소되었다. 신경병리학적 변화의 추가의 파라미터로서, 아밀로이드 플라크 당 신경염 이영양증의 수를 ThioS 및 축삭 마커 SMI312에 대해 면역염색한 후 주사된 APP/PS1 마우스의 뇌에서 평가하였다. (C) 마우스에 ApoE4를 주입하고, 발현시킨 경우, ApoE3 및 ApoE2 군에 비해 보다 높은 수의 이영양증을 향한 유의한 이동이 관찰되었으며, 이는 ApoE4가 아밀로이드 플라크 형성을 능가하는 유해한 효과를 가질 수 있으며, 보다 작은 올리고머성 아밀로이드 응집체의 신경독성 잠재성을 조절할 수 있음을 암시한다. n= 군 당 4 내지 6마리 동물. *p<0.05.
도 14. 올리고머성 Aβ 종의 함량의 초기 변화가 Tg2576 마우스에서의 AAV4-APOE2, -3, -4의 뇌실내 주사 후 ISF에서 관찰된다. 82E1/82E1 ELISA 검정을 사용한 oAβ 중의 ISF 함량의 정량화는 AAV4-APOE2 및 -GFP에 비해 AAV4-APOE4의 주사 후 올리고머성 아밀로이드 β 종의 보다 높은 농도가 있는 반면, AAV4-APOE3 주사된 마우스는 중간 수준에 도달하였음을 나타낸다. n= 군 당 3 내지 6마리 동물. *p<0.05.
도 15A 내지 15B. APP /PS1 마우스에서의 AAV4의 뇌실내 주사 후의 인간 및 내인성 뮤린 APOE mRNA 및 단백질의 검출. (A) 주사된 마우스의 뇌 중의 내인성 뮤린 apoE 단백질의 양을 나타내는 박스 블롯 그래프. (B) APP/PS1 마우스에서의 AAV4의 뇌실내 주사 2 및 5개월 후의 ApoE 단백질의 수준의 비교 (모든 ApoE 주사된 마우스로부터의 샘플을 APOE 변이체에 대한 구별 없이 2 및 5개월에 함께 풀링하였음). n= 군 당 4 내지 6마리 동물. *p<0.05.
도 16A 내지 16C. Aβ에 대한 효과는 짧은 (2개월) 노출 후의 각각의 ApoE 이소형과 관련된다. 주사 2개월 후 APP/PS1 마우스에서의 아밀로이드 침착의 화상을 작성하였다. Bam10 항체 및 ThioS를 사용한 면역염색 둘 다를 사용하여 모든 아밀로이드 침착물 또는 밀집-코어 플라크를 각각 염색하였다. (A) 피질 중의 아밀로이드 침착물의 밀도의 입체학적 분석은 APOE4의 과발현이 주사 후 2개월만큼 빨리 증가된 수의 플라크를 초래한 반면, 다른 실험 군 사이에서는 차이를 관찰할 수 없었음을 밝혔다. (B) 한편, Bam10 및 ThioS 염색 사이의 비율은 모든 상이한 군 중에서 변화하지 않고 남아 있다. (C) 상이한 ApoE 변이체로의 짧은 노출 후의 불용성 포름산 추출물 중의 Aβ40 (좌측 패널) 및 Aβ42 (우측 패널) 펩티드의 농도의 측정. n= 군 당 3 내지 5마리 동물. *p<0.05.
도 17A 내지 17B. Tg2576 마우스에서의 주사 3개월 후 검출된 가용성 및 불용성 Aβ 종의 변화. (A) Aβ40 및 Aβ42 (B) 중의 ISF 함량의 ELISA에 의한 정량화는 AAV4-APOE2, -APOE3 및 -GFP에 비해 AAV4-APOE4의 주사 후 가용성 아밀로이드 β 펩티드의 보다 높은 농도를 향한 경향이 있음을 나타낸다. (B) APP/PS1 마우스에서 이전에 관찰된 바와 같이, ApoE4로, Tg2576 마우스의 포름산 분획 중의 Aβ42의 유의하게 보다 높은 양을 유발하는 보다 강한 효과가 관찰되었다. n= 군 당 3 내지 5마리 동물. *p<0.05.
도 18A 내지 18B. APP /PS1 마우스의 뇌실내 주사에 의한 AAV4 - APOE 유전자 전달. (A) 종-특이적 ELISA 검정을 사용하여 2 및 5개월 후의 마우스 뇌 균질액 중의 인간 APOE 단백질의 농도를 정량화하였다. (B) 2 또는 5개월 후의, 내인성 마우스 Apoe에 대한 인간 APOE의 퍼센트. 인간 및 뮤린 APOE 사이의 비율을 각각의 동물에 대해 계산하였다.
도 19A 내지 19D. Aβ 펩티드 및 아밀로이드 침착물은 상이한 APOE 대립유전자에 의해 조절된다. (A) AAV4-GFP 또는 AAV4-APOE2 /3/4로 주사된 APP/PS1 형질전환 마우스의 피질 (좌측 패널) 및 해마 (우측 패널) 중의 아밀로이드 침착물의 밀도의 분석. (B) 마우스 뇌의 포름산 (FA) 분획 중의 Aβ40 및 Aβ42의 농도의 ELISA 검정에 의한 측정. (C) 마우스 뇌의 TBS 가용성 분획 중의 Aβ40 및 Aβ42 펩티드의 농도의 ELISA 검정에 의한 정량화. (A, B, C, D) n= 4 AAV4-GFP, n= 5 AAV4-APOE2, n= 6 AAV4-APOE3, 및 n= 5 AAV4-APOE4 마우스. *p<0.05.
도 20A 내지 20B. 인간 APOE 변이체는 아밀로이드증 진행을 차등적으로 조절한다. (A) AAV4-GFP, -APOE2, -APOE3 또는 APOE4의 뇌실내 주사 후 2개월 기간에 걸친 아밀로이드 침착물의 부피 피질 밀도의 평가. 6 내지 8개의 시야 영역을 각각의 동물에 대해 종적으로 화상화하였다. 플라크의 밀도를 피질의 부피 당 계산하고, 기준선 (T0)에서의 각각의 동물에 대한 초기 값에 대해 정규화하였다. (B) 유전자 전달 후 2개월에 걸친 아밀로이드증 진행의 선형 회귀 피트는 단지 AAV4-APOE4만이 이 기간 동안 유의한 양의 기울기를 유도하였음을 나타낸다. n= 4 AAV4-GFP, n= 4 AAV4-APOE2, n= 6 AAV4-APOE3, 및 n= 5 AAV4-APOE4 마우스. *p<0.05.
도 21. APOE2 , APOE3 또는 APOE4 로의 주입 1 또는 2개월 후의 아밀로이드 침착물의 크기의 변화.
T1 및 T0 사이 및 (C) T2 및 T1 사이의 플라크 크기의 비율을 나타내는 산란 도트 플롯. 3 내지 4마리 동물의 군 당 측정된 n> 50개 플라크. *p<0.05.
도 22A 내지 22C. 아밀로이드 침착물과 관련된 신경병리학적 변화는 APOE 변이체에 의해 차등적으로 영향을 받는다. (A) 아밀로이드 플라크 부근에서의 시냅스전 (시냅신 I) 및 (B) 시냅스후 (PSD95) 소실의 퍼센트. (C) 아밀로이드 플라크의 표면 당 이영양증의 평균 수를 나타내는 막대 그래프. n= 4 AAV4-GFP, n= 4 AAV4-APOE2, n= 6 AAV4-APOE3, 및 n= 5 AAV4-APOE4 마우스. *p<0.05.
도 23. Tg2576 마우스의 주사 후의 ISF 중의 올리고머성 Aβ 종의 변화. AAV4-GFP, AAV4-APOE2, AAV4-APOE3, 및 AAV4-APOE4의 주사 후의 82E1/82E1 ELISA 검정을 사용한 올리고머성 Aβ (oAβ, GFP 주사된 마우스의 ％로서)의 ISF 함량의 정량화. n= 3 AAV4-GFP, n= 3 AAV4-APOE2, n= 5 AAV4-APOE3, 및 n= 5 AAV4-APOE4 마우스. *p<0.05.
도 24A 내지 24D. APP /PS1 마우스에서의 AAV4 - APOE의 뇌실내 주사 후의 인간 및 내인성 뮤린 APOE mRNA 및 단백질의 검출. (A) AAV4-APOE 또는 AAV4-GFP 주사된 마우스에서의 인간 재조합 및 내인성 ApoE 단백질의 웨스턴 블롯 분석. (B) 주사된 마우스의 뇌 중의 내인성 뮤린 apoE 단백질의 양을 나타내는 박스 블롯 그래프. AAV4-APOE의 주입 2 또는 5개월 후 변화가 검출되지 않았다. (C) GAPDH 전사체의 양에 대해 정규화된 내인성 뮤린 APOE mRNA의 발현 수준을 나타내는 박스 블롯 그래프. (D) APP/PS1 마우스에서의 AAV4의 뇌실내 주사 2 및 5개월 후의 ApoE 단백질의 수준의 비교 (모든 ApoE 주사된 마우스로부터의 샘플을 APOE 변이체에 대한 구별 없이 2 및 5개월 후에 함께 풀링하였음). N= 군 당 4 내지 6마리 동물 (상세사항에 대해서는 물질 및 방법 참조). *p<0.05
도 25A 내지 25C. 짧은 노출 (2개월) 후의 각각의 ApoE 이소형과 관련된 A β 병리증상에 대한 효과. (A) 피질 중의 아밀로이드 침착물의 밀도의 입체학적 분석은 APOE4의 과발현이 주사 후 2개월만큼 빨리 증가된 수의 플라크를 초래한 반면, 다른 실험 군 사이에서는 차이를 관찰할 수 없었음을 밝혔다. (B) 한편, Bam10 및 ThioS 염색 사이의 비율은 모든 상이한 군 중에서 변화하지 않고 남아 있다. (C) 상이한 ApoE 변이체로의 짧은 노출 후의 불용성 포름산 추출물 중의 Aβ40 (좌측 패널) 및 Aβ42 (우측 패널) 펩티드의 농도의 측정. n= 4 AAV4-GFP, n= 4 AAV4-APOE2, n= 6 AAV4-APOE3 및 n= 5. AAV4-APOE4 주사된 마우스. *p<0.05
도 26A 내지 26B. Tg2576 마우스에서의 주사 3개월 후에 검출된 가용성 및 불용성 Aβ 종의 변화. (A) Aβ40 및 Aβ42 중의 ISF 함량의 ELISA에 의한 정량화는 AAV4-APOE2, -APOE3 및 -GFP에 비해 AAV4-APOE4의 주사 후 가용성 아밀로이드 β 펩티드의 보다 높은 농도를 향한 경향이 있음을 나타낸다. (B) APP/PS1 마우스에서 이전에 관찰된 바와 같이, ApoE4로, Tg2576 마우스의 포름산 분획 중의 Aβ42의 유의하게 보다 높은 양을 유발하는 보다 강한 효과가 관찰되었다. n= 3 AAV4-GFP, n= 3 AAV4-APOE2, n= 5 AAV4-APOE3 및 n= 5 AAV4-APOE4 주사된 마우스. *p<0.05.
몇몇 상이한 인간 인간 아포리포단백질 E (ApoE) 이소형이 있으며, 뇌에서의 일부의 이들 이소형의 존재는 알츠하이머병 (AD)에 대한 위험을 증가시키는 반면, 다른 이소형의 존재는 AD에 대한 위험을 감소시킨다. ApoE ε4 이소형의 존재는 후기-발병 산발성 AD에 대한 강한 유전적 위험 인자이다 (Casellano et al., Sci Transl Med, 3(89):89ra57 (29 June 2011).) ApoE ε4 대립유전자는 AD 위험을 강하게 증가시키고, 발병 연령을 감소시킨다. 한편, ApoE ε2 대립유전자의 존재는 AD 위험을 감소시키는 것으로 보인다. 이는 인간 ApoE 이소형이 생체내에서 아밀로이드-β (Aβ)의 청소 또는 합성에 차등적으로 영향을 준다는 것을 시사한다.
아데노 관련된 바이러스 (AAV)는 파르보비리다에 과의 작은 비병원성 바이러스이다. AAV는 복제를 위한 헬퍼 바이러스에 대한 그의 의존성에 의해 이 과의 다른 구성원과 구별된다. 헬퍼 바이러스의 부재 하에서, AAV는 염색체 19의 q 아암 내로 좌위 특이적 방식으로 통합될 수 있다. AAV의 대략 5 kb 게놈은 플러스 또는 마이너스 극성의 단일 가닥 DNA의 하나의 절편으로 이루어진다. 게놈의 말단은 헤어핀 구조로 폴딩되고 바이러스 DNA 복제 기점으로서 기능할 수 있는 짧은 역전된 말단 반복부이다. 물리적으로, 파르보바이러스 비리온은 비-외피성이며, 그의 정20면체 캡시드는 직경이 대략 20 nm이다.
지금까지 8개의 혈청학적으로 별개의 AAV가 확인되었으며, 5개는 인간 또는 영장류로부터 단리되었고, AAV 유형 1 내지 5로 지칭된다. 문헌 [Govindasamy et al., "Structurally Mapping the Diverse Phenotype of Adeno-Associated Virus Serotype 4," J. Vir., 80 (23):11556-11570 (2006)]. AAV2의 게놈은 길이가 4680 뉴클레오티드이고, 2개의 오픈 리딩 프레임 (ORF)을 함유한다. 좌측 ORF는 단일-가닥 자손 게놈의 생성 외에도 복제 및 전사의 조절에 관여하는 비-구조적 Rep 단백질, 즉 Rep 40, Rep 52, Rep 68 및 Rep 78을 코딩한다. 또한, Rep 단백질 중 2개는 인간 염색체 19의 q 팔의 영역 내로의 AAV 게놈의 우선적 통합과 관련되었다. Rep68/78은 또한 NTP 결합 활성 뿐만 아니라 DNA 및 RNA 헬리카제 활성을 갖는 것으로 나타났다. Rep 단백질은 핵 편재화 신호 뿐만 아니라 몇몇 잠재적 인산화 부위를 갖는다. 이들 키나제 부위 중 하나의 돌연변이는 복제 활성의 소실을 초래하였다.
게놈의 말단은 바이러스 DNA 복제 기점으로서 기능하는 T-형상 헤어핀 구조 내로 폴딩되는 잠재성을 갖는 짧은 역전된 말단 반복부 (ITR)이다. ITR 영역 내에서, ITR의 기능에 중추적인 2가지 요소, 즉 GAGC 반복 모티프 및 말단 분해 부위 (trs)가 기재되었다. 반복 모티프는 ITR이 선형 또는 헤어핀 형태인 경우 Rep에 결합하는 것으로 나타났다. 이 결합은 부위- 및 가닥-특이적 방식으로 일어나는 trs에서의 절단을 위해 Rep68/78을 위치시키는 기능을 한다. 복제에서의 그의 역할 외에, 이들 2가지 요소는 바이러스 통합에 중추적인 것으로 보인다. 염색체 19 통합 좌위 내에 함유되는 것은 인접한 trs와의 Rep 결합 부위이다. 이들 요소는 기능적이며 좌위 특이적 통합을 위해 필요한 것으로 나타났다.
AAV2 비리온은 VP1, VP2 및 VP3으로 지칭되는 3개의 관련된 단백질로 이루어진 직경이 대략 25 nm인 비-외피성 정20면체 입자이다. 우측 ORF는 캡시드 단백질 VP1, VP2 및 VP3을 코딩한다. 이들 단백질은 각각 1:1:10의 비율로 발견되며, 모두 우측-손 ORF로부터 유래된다. 캡시드 단백질은 선택적 스플라이싱 및 독특한 시작 코돈의 사용에 의해 서로 상이하다. 결실 분석은 선택적으로 스플라이싱된 메시지로부터 번역된 VP1의 제거 또는 변경이 감염 입자의 감소된 수율을 초래함을 나타내었다. VP3 코딩 영역 내의 돌연변이는 임의의 단일-가닥 자손 DNA 또는 감염성 입자를 생성하는 것의 실패를 초래한다. AAV2 입자는 AAV2 캡시드 단백질을 포함하는 바이러스 입자이다. AAV2 캡시드 폴리펩티드는 전체 VP1, VP2 및 VP3 폴리펩티드를 코딩할 수 있다. 입자는 AAV2 및 다른 AAV 캡시드 단백질 (즉, 키메라 단백질, 예컨대 AAV4 및 AAV2)을 포함하는 입자일 수 있다. AAV2 캡시드 단백질의 아미노산 서열의 변이는, AAV2 캡시드를 포함하는 생성된 바이러스 입자가 표준 방법에 의해 통상적으로 측정될 수 있는 바와 같이, AAV4와 항원적으로 또는 면역학적으로 별개로 남아 있는 한, 본원에서 고려된다. 구체적으로, 예를 들어, ELISA 및 웨스턴 블롯을 사용하여 바이러스 입자가 AAV4와 항원적으로 또는 면역학적으로 별개인지 여부를 측정할 수 있다. 또한, AAV2 바이러스 입자는 바람직하게는 AAV4와 별개인 조직 굴성을 보유한다.
AAV2 입자는 AAV2 캡시드 단백질을 포함하는 바이러스 입자이다. 전체 VP1, VP2 및 VP3 폴리펩티드를 코딩하는 AAV2 캡시드 폴리펩티드는 서열 1 (AAV2 캡시드 단백질)에 나타낸 뉴클레오티드에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 대해 전체적으로 적어도 약 63％ 상동성 (또는 동일성)을 가질 수 있다. 캡시드 단백질은 서열 1에 나타낸 단백질에 대해 약 70％ 상동성, 약 75％ 상동성, 80％ 상동성, 85％ 상동성, 90％ 상동성, 95％ 상동성, 98％ 상동성, 99％ 상동성, 또는 심지어 100％ 상동성을 가질 수 있다. 캡시드 단백질은 서열 1에 나타낸 단백질에 대해 약 70％ 동일성, 약 75％ 동일성, 80％ 동일성, 85％ 동일성, 90％ 동일성, 95％ 동일성, 98％ 동일성, 99％ 동일성, 또는 심지어 100％ 동일성을 가질 수 있다. 입자는 AAV4 및 AAV2 캡시드 단백질 둘 다, 즉 키메라 단백질을 포함하는 입자일 수 있다. AAV2 캡시드 단백질의 아미노산 서열의 변이는, AAV2 캡시드를 포함하는 생성된 바이러스 입자가 표준 방법에 의해 통상적으로 측정될 수 있는 바와 같이, AAV4와 항원적으로 또는 면역학적으로 별개로 남아 있는 한, 본원에서 고려된다. 구체적으로, 예를 들어, ELISA 및 웨스턴 블롯을 사용하여 바이러스 입자가 AAV4와 항원적으로 또는 면역학적으로 별개인지 여부를 측정할 수 있다. 또한, AAV2 바이러스 입자는 바람직하게는 AAV4와 별개인 조직 굴성, 예컨대 본원의 실시예에 예시된 것을 보유하지만, 적어도 하나의 AAV2 피막 단백질을 포함하는 AAV2 키메라 입자는 AAV2 피막 단백질로만 이루어진 AAV2 입자와는 상이한 조직 굴성을 가질 수 있다.
도 6A 및 6B에 지시된 바와 같이, AAV2 캡시드 서열 및 AAV4 캡시드 서열은 약 60％ 상동성이다. 특정 실시양태에서, AAV2 캡시드는 서열 1에 나타낸 아미노산 서열에 대해 적어도 65％ 상동성인 서열을 포함한다 (또는 이로 이루어진다).
특정 실시양태에서, 본 발명은 한 쌍의 AAV2 역전된 말단 반복부를 포함하는 벡터를 함유하는, 즉 캡시드화하는 AAV2 입자를 더 제공한다. AAV2 ITR의 뉴클레오티드 서열은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 또한, 입자는 AAV4 및 AAV2 캡시드 단백질 둘 다, 즉, 키메라 단백질을 포함하는 입자일 수 있다. 더욱이, 입자는 다른 AAV (예를 들어, AAV1 내지 AAV8)로부터 한 쌍의 AAV 역전된 말단 반복부를 포함하는 벡터를 캡시드화하는 입자일 수 있다. 입자에 캡시드화된 벡터는 역전된 말단 반복부 사이에 삽입된 외인성 핵산을 더 포함할 수 있다.
AAV의 하기 특징은 이를 유전자 전달을 위한 매력적인 벡터로 만들었다. AAV 벡터는 시험관내에서 세포 게놈 내로 안정하게 통합되고; 넓은 숙주 범위를 갖고; 시험관내 및 생체내에서 분할 및 비분할 세포 둘 다를 형질도입하고, 형질도입된 유전자의 높은 수준의 발현을 유지하는 것으로 나타났다. 바이러스 입자는 열 안정성이고, 용매, 세정제에 내성이고, pH, 온도에서 변화하며, CsCl 구배에 대해 농축될 수 있다. AAV 프로바이러스의 통합은 세포 성장 또는 분화에 대한 임의의 장기 부정적 효과와 관련되지 않는다. ITR은 복제, 패키징 및 통합에 요구되는 단지 시스 요소인 것으로 나타났으며, 일부 프로모터 활성을 함유할 수 있다.
본 발명은 AAV 입자, 재조합 AAV 벡터, 및 재조합 AAV 비리온의 투여 방법을 제공한다. 예를 들어, AAV2 입자는 AAV2 캡시드 단백질을 포함하는 바이러스 입자이거나, AAV4 입자는 AAV4 캡시드 단백질을 포함하는 바이러스 입자이다. 재조합 AAV2 벡터는 AAV2의 적어도 하나의 고유한 핵산을 포함하는 핵산 구축물이다. 재조합 AAV2 비리온은 재조합 AAV2 벡터를 함유하는 입자이다. 용어 "AAV2 ITR" 내로 간주되기 위해, 뉴클레오티드 서열은 AAV2 ITR을 AAV4 ITR과 구별하는 본원에 기재된 하나 또는 둘 다의 특징을 보유해야 한다: (1) 3개의 (AAV4에서와 같은 4개라기 보다는) "GAGC" 반복부 및 (2) AAV2 ITR Rep 결합 부위에서, 첫번째 2개의 "GAGC" 반복부 중의 네번째 뉴클레오티드는 T라기 보다는 C이다.
프로모터는 공지된 고려사항, 예컨대 프로모터에 기능적으로 연결된 핵산의 발현의 수준, 및 벡터가 사용되는 세포 유형에 의해 선택된 임의의 바람직한 프로모터일 수 있다. 프로모터는 외인성 또는 내인성 프로모터일 수 있다. 프로모터로는 예를 들어, 공지된 강한 프로모터, 예컨대 SV40 또는 유도성 메탈로티오네인 프로모터, 또는 AAV 프로모터, 예컨대 AAV p5 프로모터를 들 수 있다. 프로모터의 추가의 예로는 액틴 유전자, 이뮤노글로불린 유전자, 시토메갈로바이러스 (CMV), 아데노바이러스, 소 유두종 바이러스로부터 유래된 프로모터, 아데노바이러스 프로모터, 예컨대 아데노바이러스 주요 후기 프로모터, 유도성 열 쇼크 프로모터, 호흡기 융합 바이러스, 라우스 육종 바이러스 (RSV) 등을 들 수 있다. 구체적으로, 프로모터는 AAV2 p5 프로모터 또는 AAV4 p5 프로모터일 수 있다. 또한, 프로모터 활성을 보유하는 p5 프로모터의 보다 작은 단편은 예를 들어, p5 프로모터 중의 일련의 결실을 구축하고, 리포터 유전자에 결실을 연결하고, 리포터 유전자가 발현되는지, 즉, 전사되고/거나 번역되는지 여부를 측정하는 것을 포함하는 표준 절차에 의해 용이하게 측정될 수 있다.
AAV 벡터는 프로모터에 기능적으로 연결된 외인성 (이종성) 핵산을 더 포함할 수 있다. "이종성 핵산"은 임의의 이종성 또는 외인성 핵산이 세포, 조직 또는 유기체 내로의 전달을 위한 벡터 내로 삽입될 수 있음을 의미한다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 이종성 핵산은 보호 ApoE 이소형을 코딩한다. "기능적으로 연결된"은 프로모터가 관련 기술분야에 공지된 바와 같은 이종성 핵산의 발현, 예컨대 이종성 핵산에 대한 프로모터의 적절한 배향을 촉진시킬 수 있음을 의미한다. 또한, 이종성 핵산은 바람직하게는 관련 기술분야에 공지된 바와 같이 기능적으로 코딩하는, 즉 핵산이 발현되는 것을 허용하는 핵산의 발현을 위한 모든 적절한 서열을 갖는다. 핵산은 예를 들어, 발현 제어 서열, 예컨대 인핸서, 및 필요한 정보 가공 부위, 예컨대 리보솜 결합 부위, RNA 스플라이스 부위, 폴리아데닐화 부위, 및 전사 종결자 서열을 포함할 수 있다. 핵산은 패키징될 수 있는 핵산의 크기에 의해서만 제한되는 하나 초과의 유전자 생성물을 코딩할 수 있다.
AAV2 입자는 AAV2 캡시드 단백질을 포함하는 바이러스 입자이다. AAV2 캡시드 단백질의 아미노산 서열의 변이는, AAV2 캡시드를 포함하는 생성된 바이러스 입자가 표준 방법에 의해 통상적으로 측정될 수 있는 바와 같이, AAV4와 항원적으로 또는 면역학적으로 별개로 남아 있는 한, 본원에서 고려된다. 구체적으로, 예를 들어, ELISA 및 웨스턴 블롯을 사용하여 바이러스 입자가 다른 AAV 혈청형과 항원적으로 또는 면역학적으로 별개인지 여부를 측정할 수 있다.
AAV4는 AAV 과의 고유한 구성원이다. AAV4의 논의는 미국 특허 제6,468,524호에 제공되며, 이는 본원에 참고로 포함된다. DNA 혼성화 데이터는 AAV1 내지 4에 대한 유사한 수준의 상동성을 지시하였다. 하지만, 다른 AAV와는 대조적으로, 캡시드 단백질에 상응하는 단지 하나의 ORF만이 AAV4에서 확인되었으며, Rep 단백질에 대해서는 ORF가 검출되지 않았다. 본 발명은 AAV4 바이러스 뿐만 아니라 AAV4 바이러스 입자를 포함하는 벡터를 제공한다. AAV4는 AAV2와 유사하지만, 2가지 바이러스는 본원에서 물리적으로 및 유전적으로 별개인 것으로 밝혀진다. 이러한 차이는 AAV4에게 유전자 요법을 위한 벡터로서 이를 보다 적합하게 하는 일부 고유한 이점을 부여한다. 예를 들어, 야생형 AAV4 게놈은 AAV2보다 크며, 이는 보다 큰 재조합 게놈의 유효한 캡시드화를 허용한다. 또한, 야생형 AAV4 입자는 AAV2 입자보다 큰 부력 밀도를 가지며, 따라서 AAV2-계 입자보다 오염 헬퍼 바이러스 및 빈 AAV 입자로부터 보다 용이하게 분리된다. 추가적으로, AAV1, 2 및 3과 대조적으로, AAV4는 인간, 기니아 피크, 및 양 적혈구를 응집시킬 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 AAV5 바이러스를 포함하는 벡터 또는 바이러스의 하위부분을 포함하는 벡터, 뿐만 아니라 AAV5 바이러스 입자를 제공한다. AAV5의 논의는 미국 특허 제6,855,314호에 제공되며, 이는 본원에 참고로 포함된다. AAV5는 AAV2와 유사하지만, 2가지 바이러스는 본원에서 물리적으로 및 유전적으로 별개인 것으로 밝혀진다. 이러한 차이는 AAV5에게 유전자 요법을 위한 벡터로서 이를 보다 적합하게 하는 일부 고유한 특성 및 이점을 부여한다. 예를 들어, 유전자 요법을 위한 벡터로서 AAV2의 사용의 제한적 특징 중 하나는 많은 양의 바이러스의 생성이다. 표준 생성 기술을 사용하여, AAV5는 AAV2에 비해 10 내지 50배 더 높은 수준으로 생성된다. 그의 고유한 TRS 부위 및 rep 단백질 때문에, AAV5는 또한 AAV2에 비해 별개의 통합 좌위를 가져야 한다.
또한, AAV5 캡시드 단백질은 다시 놀랍게도 AAV2 캡시드 단백질와 별개이며, 상이한 조직 굴성을 나타내고, 따라서 AAV5 캡시드-함유 입자를 AAV2가 비적합하거나 덜 적합한 세포 유형을 형질도입하는 데 적합하게 한다. AAV2 및 AAV5는 혈청학적으로 별개이며, 따라서, 유전자 요법 적용에서, AAV5, 및 AAV5-유래된 벡터는 자연적 면역학적 방어의 결과로서 또는 AAV2 벡터에의 이전의 노출로부터 AAV2에 대한 중화 항체를 이미 갖는 환자의 형질도입을 허용할 것이다. AAV5의 또다른 이점은 AAV5가 다른 혈청형에 의해 구조될 수 없다는 점이다. 단지 AAV5만이 통합된 AAV5 게놈을 구조하고, 복제를 실행할 수 있으며, 따라서 다른 AAV 혈청형에 의해 유발되는 AAV5의 의도하지 않은 복제를 회피한다.
본원에 사용된 용어 "폴리펩티드"는 아미노산의 중합체를 지칭하며, 전장 단백질 및 그의 단편을 포함한다. 따라서, "단백질", 폴리펩티드" 및 "펩티드"는 종종 본원에서 호환적으로 사용된다. 치환은 공지된 파라미터에 의해 중성으로 선택될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해될 것인 바와 같이, 본 발명은 또한 아미노산 서열의 약간의 변이 또는 다른 특성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 이러한 변이는 대립유전자 변이로서 (예를 들어, 유전적 다형성으로 인해) 자연적으로 발생할 수 있거나, 인간 개입에 의해 (예를 들어, 클로닝된 DNA 서열의 돌연변이유발에 의해) 생성될 수 있고, 예컨대 유도점, 결실, 삽입 및 치환 돌연변이체일 수 있다. 아미노산 서열의 사소한 변화, 예컨대 보존적 아미노산 대체, 작은 내부 결실 또는 삽입, 및 분자의 말단에서의 첨가 또는 결실은 일반적으로 바람직하다. 이들 개질은 아미노산 서열의 변화를 초래하거나, 침묵 돌연변이를 제공하거나, 제한 부위를 개질하거나, 다른 특이적 돌연변이를 제공할 수 있다.
본 발명은 한 쌍의 AAV 역전된 말단 반복부 (ITR) 사이에 삽입되거나 하나 이상의 AAV ITR에 인접한 핵산을 포함하는 벡터를 함유하는 AAV 입자를 세포에 투여함으로써, 핵산을 세포에 전달하는 것을 포함하는, 핵산을 세포에 전달하는 방법을 제공한다. 세포에의 투여는 임의로 바람직한 액체, 예컨대 조직 배양 배지, 또는 완충 염수 용액에 함유된 입자를 세포와 간단히 접촉시키는 것을 비롯한 임의의 수단에 의해 달성될 수 있다. 입자는 임의의 바람직한 길이의 시간 동안 세포와 접촉한 채 잔류할 수 있으며, 전형적으로 입자는 무기한으로 투여되고 잔류할 수 있다. 이러한 시험관내 방법을 위해, 바이러스는 관련 기술분야에 공지된 바와 같은 및 본원에 예시된 바와 같은 표준 바이러스 형질도입 방법에 의해 세포에 투여될 수 있다. 투여하는 바이러스의 역가는 특히 세포 유형에 따라 다양할 수 있지만, 일반적으로 AAV 형질도입에 사용되는 것이 전형적일 것이다. 추가적으로, 본 실시예에서 특정 세포를 형질도입하는 데 사용된 역가가 이용될 수 있다. 세포는 인간 뿐만 아니라 다른 대형 (비-설치류) 포유동물, 예컨대 영장류, 말, 양, 염소, 돼지 및 개에서의 임의의 바람직한 세포를 포함할 수 있다.
보다 구체적으로, 본 발명은 한 쌍의 AAV 역전된 말단 반복부 (ITR) 사이에 삽입되거나 하나 이상의 AAV ITR에 인접한 핵산을 포함하는 벡터를 함유하는 AAV 입자를 뇌실막 세포에 투여함으로써, 핵산을 뇌실막 세포에 전달하는 것을 포함하는, 핵산을 뇌실막 세포에 전달하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 한 쌍의 AAV 역전된 말단 반복부 (ITR) 사이에 삽입되거나 하나 이상의 AAV ITR에 인접한 핵산을 포함하는 AAV 입자를 대상체로부터의 세포에 투여하고, 세포를 대상체로 복귀시킴으로써 핵산을 대상체에 전달하는 것을 포함하는, 핵산을 대상체에 전달하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, AAV ITR은 AAV2 ITR일 수 있다. 이러한 생체외 투여를 위해, 세포를 세포 유형에 따라 표준 수단에 의해 대상체로부터 단리하고, 다시 세포 유형에 따라 적절한 배양 배지에 정치시킨다. 그 후, 바이러스 입자를 상기 기재된 바와 같이 세포와 접촉시키고, 바이러스가 세포를 형질감염시키도록 한다. 그 후, 세포를 다시 세포 유형 및 조직에 대한 표준 수단에 의해 대상체의 신체 내로 다시 이식할 수 있다. 바람직할 경우, 이식 전에, 세포를 공지된 검출 수단에 의해 및 본원에 기재된 바와 같이 바이러스에 의한 형질감염의 정도에 대해 연구할 수 있다.
본 발명은 한 쌍의 AAV 역전된 말단 반복부 (ITR) 사이에 삽입되거나 하나 이상의 AAV ITR에 인접한 핵산을 포함하는 AAV 입자를 대상체에게 투여함으로써, 핵산을 대상체 내의 세포에 전달하는 것을 포함하는, 핵산을 대상체 내의 세포에 전달하는 방법을 더 제공한다. 투여는 대상체로부터 제거된 세포, 예컨대 상기 열거된 임의의 세포에 직접적으로 생체외 투여한 후, 대상체 내로 세포를 다시 대체하는 것일 수 있거나, 투여는 대상체 내의 세포에의 생체내 투여일 수 있다. 생체외 투여를 위해, 세포를 세포 유형에 따라 표준 수단에 의해 대상체로부터 단리하고, 다시 세포 유형에 따라 적절한 배양 배지에 정치시킨다. 그 후, 바이러스 입자를 상기 기재된 바와 같이 세포와 접촉시키고, 바이러스가 세포를 형질감염시키도록 한다. 그 후, 세포를 다시 세포 유형 및 조직에 대한 표준 수단에 의해 대상체의 신체 내로 다시 이식할 수 있다. 바람직할 경우, 이식 전에, 세포를 공지된 검출 수단에 의해 및 본원에 기재된 바와 같이 바이러스에 의한 형질감염의 정도에 대해 연구할 수 있다.
또한, 한 쌍의 AAV 역전된 말단 반복부 (ITR) 사이에 삽입되거나 하나 이상의 AAV ITR에 인접한 핵산을 포함하는 AAV 입자를 대상체에게 투여함으로써, 핵산을 대상체 내의 뇌실막 세포에 전달하는 것을 포함하는, 핵산을 대상체 내의 뇌실막 세포에 전달하는 방법이 제공된다.
특정 실시양태에서, 뇌 혈관 내피를 표적화하는 아미노산 서열은 질환, 예를 들어, 알츠하이머병을 갖는 대상체에서 뇌 혈관 내피를 표적화한다.
특정 실시양태에서, 뇌 혈관 내피를 표적화하는 아미노산 서열은 알츠하이머병을 갖지 않는 대상체에서 뇌 혈관 내피를 표적화한다.
특정 실시양태에서, 바이러스 벡터는 치료제를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 치료제는 보호 ApoE 이소형이다.
본 개시내용의 특정 실시양태는 본원에 기재된 바와 같은 바이러스 벡터를 포함하는 세포를 제공한다.
특정 실시양태에서, 세포는 비-설치류 포유동물의 포유동물 세포이다. 특정 실시양태에서, 세포는 영장류 세포이다. 특정 실시양태에서, 세포는 인간 세포이다. 특정 실시양태에서, 세포는 비-인간 세포이다. 특정 실시양태에서, 세포는 시험관내의 것이다. 특정 실시양태에서, 세포는 생체내의 것이다. 특정 실시양태에서, 세포는 뇌실막 세포이다.
본 개시내용의 특정 실시양태는 본원에 기재된 바와 같은 바이러스 벡터 또는 세포를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서의 질환의 치료 방법을 제공한다.
특정 실시양태에서, 포유동물은 인간이다.
본 개시내용의 특정 실시양태는 형질도입된 뇌실막 세포가 치료제를 발현하고, 이 제제를 대상체의 중추 신경계에 전달하도록 본원에 기재된 바이러스 벡터로 CSF에 투여하는 것을 포함하는, 제제를 대상체의 중추 신경계에 전달하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 바이러스 벡터는 뇌실막 세포를 형질도입한다.
본 개시내용의 특정 실시양태는 의학적 치료에 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 바이러스 벡터 또는 세포를 제공한다.
본 개시내용의 특정 실시양태는 질환, 예를 들어, 포유동물에서의 알츠하이머병의 치료에 유용한 의약을 제조하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 바이러스 벡터 또는 세포의 용도를 제공한다.
벡터는 보호 ApoE 이소형 단백질을 더 포함할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "분비된 단백질"은 자연적으로 분비되거나, 이것이 분비될 수 있도록 신호 서열을 함유하도록 개질된 임의의 분비된 단백질을 포함한다.
핵산은 이것이 또다른 핵산 서열과의 기능적 관계에 놓여질 경우 "작동적으로 연결"된다. 일반적으로, "작동적으로 연결된"은 연결되는 DNA 서열이 인접한 것을 의미한다. 하지만, 인핸서는 인접할 필요는 없다. 연결은 편리한 제한 부위에서 라이게이션에 의해 달성된다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커가 통상적인 관행에 따라 사용된다. 추가적으로, 효소를 코딩하는 핵산의 다중 카피는 발현 벡터에서 함께 연결될 수 있다. 이러한 다중 핵산은 링커에 의해 분리될 수 있다.
본 개시내용은 또한 본원에 기재된 벡터를 함유하는 포유동물 세포를 제공한다. 세포는 인간일 수 있으며, 뇌로부터의 것일 수 있다. 세포 유형은 줄기 또는 조상 세포 집단일 수 있다.
본 개시내용은 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 발현 벡터 또는 세포를 투여함으로써 포유동물에서 질환, 예컨대 유전적 질환 또는 암을 치료하는 방법을 제공한다. 유전적 질환은 신경퇴행성 질환, 예컨대 알츠하이머병일 수 있다.
본 개시내용의 특정 측면은 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 벡터, 및 유전적으로 조작된 세포 (생체내에서 개질됨), 및 이들의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 개시내용은 둘 다 치료 유효량의 치료제의 전신 전달이 가능한 유전자 또는 단백질 요법을 위한 방법에 관한 것이다.
한 측면에 따라, 포유동물 수용자에서 치료제의 발현을 위한 세포 발현 시스템이 제공된다. 발현 시스템 (또한 본원에서 "유전적으로 개질된 세포"로도 지칭됨)은 치료제를 발현하기 위한 세포 및 발현 벡터를 포함한다. 발현 벡터로는 바이러스, 플라스미드, 및 이종성 유전 물질을 세포에 전달하기 위한 다른 비히클을 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 따라서, 본원에 사용된 용어 "발현 벡터"는 이종성 유전 물질을 세포에 전달하기 위한 비히클을 지칭한다. 특히, 발현 벡터는 재조합 아데노바이러스, 아데노-관련된 바이러스, 또는 렌티바이러스 또는 레트로바이러스 벡터이다.
발현 벡터는 이종성 유전자의 전사를 제어하기 위한 프로모터를 더 포함한다. 프로모터는 유도성 프로모터 (하기 기재됨)일 수 있다. 발현 시스템은 포유동물 수용자에게 투여하기에 적합하다. 발현 시스템은 복수의 비-불멸화된 유전적으로 개질된 세포를 포함할 수 있으며, 각각의 세포는 적어도 1종의 치료제를 코딩하는 적어도 하나의 재조합 유전자를 함유한다.
세포 발현 시스템은 생체내에서 형성될 수 있다. 또다른 측면에 따르면, 생체내에서의 포유동물 수용자의 치료 방법이 제공된다. 방법은 이종성 유전자 생성물을 계내에서, 예컨대 정맥내 투여를 통해 환자의 세포 내로 발현시키기 위한 발현 벡터를 도입하는 것을 포함한다. 생체내에서 발현 시스템을 형성하기 위해, 치료제를 발현시키기 위한 발현 벡터를 생체내에서 포유동물 수용자 내로 정맥내로 도입하며, 여기서, 벡터는 혈관구조를 통해 뇌로 이동한다.
또다른 측면에 따르면, 생체내에서의 포유동물 수용자의 치료 방법이 제공된다. 방법은 표적 단백질을 생체내에서 환자 내로 도입하는 것을 포함한다.
이종성 유전자를 발현시키기 위한 발현 벡터는 이종성 유전자 생성물의 전사를 제어하기 위한 유도성 프로모터를 포함할 수 있다. 따라서, 계내에서의 치료제의 전달은 세포를 계내에서 이종성 유전자의 전사를 유도하는 조건에 노출시킴으로써 제어된다.
포유동물 수용자는 유전자 대체 요법에 순응하는 상태를 가질 수 있다. 본원에 사용된 "유전자 대체 요법"은 치료제를 코딩하는 외인성 유전 물질의 수용자에의 투여 및 계내에서의 투여된 유전 물질의 후속 발현을 지칭한다. 따라서, 어구 "유전자 대체 요법에 순응하는 상태"는 유전적 질환 (즉, 하나 이상의 유전자 결함에 기인하는 질환 상태), 후천적 병리증상 (즉, 선천적 결합에 기인하지 않는 병리학적 상태), 암 및 예방적 과정 (즉, 질환의 또는 바람직하지 않은 의학적 상태의 예방)과 같은 상태를 포함한다. 따라서, 본원에 사용된 용어 "치료제"는 포유동물 수용자에 대해 유익한 효과를 갖는 임의의 제제 또는 물질을 지칭한다. 따라서, "치료제"는 핵산 또는 단백질 성분을 갖는 치료적 및 예방적 분자 둘 다를 포함한다.
한 실시양태에 따르면, 포유동물 수용자는 유전적 질환을 가지며, 외인성 유전 물질은 질환을 치료하기 위한 치료제를 코딩하는 이종성 유전자를 포함한다. 또다른 실시양태에서, 포유동물 수용자는 후천적 병리증상을 가지며, 외인성 유전 물질은 병리증상을 치료하기 위한 치료제를 코딩하는 이종성 유전자를 포함한다. 또다른 실시양태에 따르면, 환자는 암을 가지며, 외인성 유전 물질은 항-신생물제를 코딩하는 이종성 유전자를 포함한다. 또다른 실시양태에서, 환자는 바람직하지 않은 의학적 상태를 가지며, 외인성 유전 물질은 상태를 치료하기 위한 치료제를 코딩하는 이종성 유전자를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "보호 ApoE 이소형"은 이 폴리펩티드의 변이체 또는 생물학적 활성 또는 불활성 단편을 포함한다. 하나의 폴리펩티드의 "변이체"는 천연 단백질과 완전히 동일하지 않은 폴리펩티드이다. 이러한 변이체 단백질은 하나 이상의 아미노산의 삽입, 결실 또는 치환에 의해 아미노산 서열을 변경함으로써 얻어질 수 있다. 단백질의 아미노산 서열은 예를 들어 치환에 의해 개질되어 천연 폴리펩티드에 비해 실질적으로 동일하거나 개선된 품질을 갖는 폴리펩티드를 생성한다. 치환은 보존적 치환일 수 있다. "보존적 치환"은 유사한 측쇄를 갖는 또다른 아미노산으로의 아미노산의 치환이다. 보존적 치환은 전체 펩티드가 그의 공간 형태를 보유하지만 변경된 생물학적 활성을 갖도록, 아미노산의 전하 또는 아미노산의 측쇄의 크기에서 (대안적으로, 측쇄 내의 화학적 기의 크기, 전하 또는 종류에서) 가능한 최소의 변화를 생성하는 아미노산으로의 치환일 것이다. 예를 들어, 통상적인 보존적 변화는 Asp가 Glu, Asn 또는 Gln으로; His가 Lys, Arg 또는 Phe로; Asn이 Gln, Asp 또는 Glu로, 및 Ser이 Cys, Thr 또는 Gly로일 수 있다. 알라닌은 다른 아미노산을 치환하는 데 통상적으로 사용된다. 20개의 필수 아미노산은 하기와 같이 그룹화될 수 있다: 비극성 측쇄를 갖는 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌; 비하전된 극성 측쇄를 갖는 글리신, 세린, 트레오닌, 시스틴, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민; 산성 측쇄를 갖는 아스파르테이트 및 글루타메이트; 및 염기성 측쇄를 갖는 리신, 아르기닌 및 히스티딘.
아미노산 변화는 상응하는 핵산 서열의 코돈을 변화시킴으로써 달성된다. 이러한 폴리펩티드는 생물학적 활성을 개질하거나 개선시키기 위해 폴리펩티드 구조에서 특정 아미노산을 다른 아미노산으로 치환하는 것에 기초하여 얻어질 수 있다. 예를 들어, 대안적인 아미노산의 치환을 통해, 작은 형태적 변화는 증가된 활성을 초래하는 폴리펩티드에 대해 부여될 수 있다. 대안적으로, 특정 폴리펩티드에서의 아미노산 치환은 잔기를 제공하는 데 사용될 수 있으며, 이는 그 후 다른 분자에 연결되어 다른 목적에 유용한 출발 폴리펩티드의 충분한 특성을 보유하는 펩티드-분자 컨쥬게이트를 제공할 수 있다.
폴리펩티드에 대한 상호작용 생물학적 기능을 부여하는 데 있어서 아미노산의 수치 지수를 사용할 수 있으며, 여기서, 특정 아미노산은 유사한 수치 지수를 갖는 다른 아미노산으로 치환될 수 있고, 여전히 유사한 생물학적 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 대안적으로, 특히 생성되는 폴리펩티드에 바람직한 생물학적 기능이 면역학적 실시양태에 사용하기 위해 의도되는 경우, 유사 아미노산의 치환은 친수성에 기초하여 이루어질 수 있다. 그의 인접한 아미노산의 친수성에 의해 지배되는 바와 같이, "단백질"의 최대 국소 평균 친수성은 그의 면역원성과 상관된다. 따라서, 치환은 각각의 아미노산에 할당된 친수성에 기초하여 이루어질 수 있는 것으로 언급된다.
각각의 아미노산에 대한 값을 할당하는 친수성 지수 또는 수치 지수를 사용하는 데 있어서, 이들 값이 ±2이고, ±1이 특히 바람직하고, ±0.5가 가장 바람직한 치환인 아미노산의 치환을 수행하는 것이 바람직하다.
변이체 단백질은 상응하는 천연 단백질의 아미노산 서열에 대해 적어도 50％, 적어도 약 80％, 또는 심지어 적어도 약 90％, 그러나 100％ 미만의 인접한 아미노산 서열 상동성 또는 동일성을 갖는다.
변이체 폴리펩티드의 아미노산 서열은 본질적으로 천연 폴리펩티드의 아미노산 서열에 상응한다. 본원에 사용된 "본질적으로 상응한다"는 천연 단백질에 의해 생성되는 반응과 실질적으로 동일한 생물학적 반응을 유발할 것인 폴리펩티드 서열을 지칭한다. 이러한 반응은 천연 단백질에 의해 생성되는 수준의 적어도 60％일 수 있으며, 심지어 천연 단백질에 의해 생성되는 수준의 적어도 80％일 수 있다.
변이체는 상응하는 천연 단백질에 존재하지 않는 아미노산 잔기 또는 상응하는 천연 단백질에 비해 결실을 포함할 수 있다. 변이체는 또한 상응하는 천연 단백질에 비해 말단절단된 "단편", 즉 단지 전장 단백질의 일부일 수 있다. 단백질 변이체는 또한 적어도 하나의 D-아미노산을 갖는 펩티드를 포함한다.
변이체 단백질은 변이체 단백질을 코딩하는 단리된 DNA 서열로부터 발현될 수 있다. "재조합"은 유전적 조작의 과정에 의해 생성되는 펩티드 또는 핵산으로 정의된다. 유전 암호의 중복성으로 인해, 개별 뉴클레오티드는 코돈에서 용이하게 교환되고, 여전히 동일한 아미노산 서열을 초래할 수 있음이 관련 기술분야에 널리 공지되어 있음을 유념해야 한다. 용어 "단백질", "펩티드" 및 "폴리펩티드"는 본원에서 호환적으로 사용된다.
본 개시내용은 발현 벡터를 세포 또는 환자에게 투여함으로써 포유동물에서의 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 유전자 요법 방법을 위해, 분자 생물학 및 유전자 요법의 관련 기술분야의 통상의 기술자는 과도한 실험 없이 본 개시내용의 신규한 방법에 사용되는 발현 벡터의 적절한 투여량 및 투여 경로를 결정할 수 있을 것이다.
한 실시양태에 따르면, 세포는 새험관내에서 형질전환되거나 다르게는 유전적으로 개질된다. 포유동물 수용자로부터의 세포는 치료제를 코딩하는 이종성 (예를 들어, 재조합) 유전자를 발현시키기 위한 외인성 유전 물질을 함유하는 벡터로 생체내에서 형질전환 (즉, 형질도입 또는 형질감염)되며, 치료제는 계내에서 전달된다.
본원에 사용된 "외인성 유전 물질"은 세포에서 천연적으로 발견되지 않거나; 세포에서 천연적으로 발견되는 경우, 세포에 의해 생물학적으로 유의한 수준으로 전사되거나 발현되지 않는 천연 또는 합성의 핵산 또는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 따라서, "외인성 유전 물질"로는 예를 들어, 안티-센스 RNA로 전사될 수 있는 비-천연 발생 핵산, 뿐만 아니라 "이종성 유전자" (즉, 동일한 유형의 천연-발생 세포에서 별현되지 않거나 생물학적으로 비유의한 수준으로 발현되는 단백질을 코딩하는 유전자)를 들 수 있다.
특정 실시양태에서, 포유동물 수용자는 유전자 대체 요법에 순응하는 상태를 갖는다. 본원에 사용된 "유전자 대체 요법"은 치료제를 코딩하는 외인성 유전 물질의 수용자에의 투여 및 계내에서의 투여된 유전 물질의 후속 발현을 지칭한다. 따라서, 어구 "유전자 대체 요법에 순응하는 상태"는 유전적 질환 (즉, 하나 이상의 유전자 결함에 기인하는 질환 상태), 후천적 병리증상 (즉, 선천적 결합에 기인하지 않는 병리학적 상태), 암 및 예방적 과정 (즉, 질환의 또는 바람직하지 않은 의학적 상태의 예방)과 같은 상태를 포함한다. 따라서, 본원에 사용된 용어 "치료제"는 포유동물 수용자에 대해 유익한 효과를 갖는 임의의 제제 또는 물질을 지칭한다. 따라서, "치료제"는 핵산 (예를 들어, 안티센스 RNA) 또는 단백질 성분을 갖는 치료적 및 예방적 분자 둘 다를 포함한다.
대안적으로, 유전자 대체 요법에 순응하는 상태는 예방적 과정, 즉, 질환 또는 바람직하지 않은 의학적 상태를 예방하는 과정이다. 따라서, 본 개시내용은 예방적 기능을 갖는 치료제 (즉, 예방제)를 포유동물 수용자에게 전달하기 위한 세포 발현 시스템을 포함한다.
요약하면, 용어 "치료제"는 상기 열거된 상태와 관련된 제제, 뿐만 아니라 그의 기능적 등가물을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 본원에 사용된 용어 "기능적 등가물"은 기능적 등가물로 간주되는 치료제와 동일하거나 개선된 포유동물 수용자에 대한 유익한 효과를 갖는 분자 (예를 들어, 펩티드 또는 단백질)를 지칭한다.
상기 개시된 치료제 및 유전자 대체 요법에 순응하는 상태는 단지 예시적이며, 본 개시내용의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 공지된 상태를 치료하기 위한 적합한 치료제의 선택은 과도한 실험 없이 관련 기술분야의 통상의 기술자의 범위 내에 있는 것으로 간주된다.
AAV 벡터
한 실시양태에서, 본 개시내용의 바이러스 벡터는 AAV 벡터이다. "AAV" 벡터는 아데노-관련된 바이러스를 지칭하며, 천연 발생 야생형 바이러스 자체 또는 그의 유도체를 지칭하는 데 사용될 수 있다. 이 용어는 달리 요구되는 경우를 제외하고 모든 아형, 혈청형 및 의사형, 및 천연 발생 및 재조합 형태 둘 다를 커버한다. 본원에 사용된 용어 "혈청형"은 정의된 항혈청과의 캡시드 단백질 반응성에 기초하여 다른 AAV에 의해 확인되고, 이로부터 구별되며, 예를 들어, 영장류 AAV의 8가지 공지된 혈청형, 즉 AAV-1 내지 AAV-8이 있다. 예를 들어, 혈청형 AAV2는 AAV2의 cap 유전자로부터 코딩되는 캡시드 단백질 및 동일한 AAV2 혈청형으로부터의5' 및 3' ITR 서열을 함유하는 게놈을 함유하는 AAV를 지칭한다. 예를 들어, 본원에 사용된 rAAV는 동일한 혈청형으로부터의 캡시드 단백질 및 5'-3' ITR 둘 다를 갖는 AAV를 지칭하는 데 사용될 수 있거나, 이는 하나의 혈청형으로부터의 캡시드 단백질 및 상이한 AAV 혈청형으로부터의 5'-3' ITR, 예를 들어, AAV 혈청형 2로부터의 캡시드 및 AAV 혈청형 5로부터의 ITR을 갖는 AAV를 지칭할 수 있다. 본원에 예시된 각각의 예에 대해, 벡터 설계 및 생성의 기재는 캡시드 및 5'-3' ITR 서열의 혈청형을 기재한다. 약어 "rAAV"는 또한 재조합 AAV 벡터 (또는 "rAAV 벡터")로도 지칭되는 재조합 아데노-관련된 바이러스를 지칭한다.
"AAV 바이러스" 또는 "AAV 바이러스 입자"는 적어도 하나의 AAV 캡시드 단백질 (바람직하게는, 야생형 AAV의 모든 캡시드 단백질에 의해) 및 캡시드화된 폴리뉴클레오티드로 이루어진 바이러스 입자를 지칭한다. 입자가 이종성 폴리뉴클레오티드 (즉, 야생형 AAV 게놈 이외의 폴리뉴클레오티드, 예컨대 포유동물 세포에 전달되는 트랜스진)를 포함하는 경우, 이는 전형적으로 "rAAV"로 지칭된다.
한 실시양태에서, AAV 발현 벡터는 전사의 방향으로 작동적으로 연결된 성분으로서, 전사 개시 영역을 포함하는 제어 요소, 관심의 DNA 및 전사 종결 영역을 적어도 제공하는 공지된 기술을 사용하여 구축된다. 제어 요소는 포유동물 세포에서 기능적인 것으로 선택된다. 작동적으로 연결된 성분을 함유하는 생성된 구축물은 기능적 AAV ITR 서열과 플랭킹된다 (5' 및 3').
"아데노-관련된 바이러스 역전된 말단 반복부" 또는 "AAV ITR"은 DNA 복제 기점으로서 및 바이러스에 대한 패키징 신호로서 시스로 함께 기능하는 AAV 게놈의 각각의 말단에서 발견되는 관련 기술분야에서 인식된 영역을 의미한다. AAV ITR은 AAV rep 코딩 영역과 함께 포유동물 세포 게놈 내로의 2개의 플랭킹 ITR 사이에 개재된 뉴클레오티드 서열로부터의 유효한 제거 및 구조, 및 그의 통합을 제공한다.
AAV ITR 영역의 뉴클레오티드 서열은 공지되어 있다. 본원에 사용된 "AAV ITR"은 나타내어진 야생형 뉴클레오티드 서열을 가질 필요는 없지만, 예를 들어, 뉴클레오티드의 삽입, 결실 또는 치환에 의해 변경될 수 있다. 추가적으로, AAV ITR은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV7 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 몇몇 AAV 혈청형으로부터 유래될 수 있다. 또한, AAV 벡터에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 플랭킹하는 5' 및 3' ITR은, 이들이 의도되는 바와 같이, 즉, 숙주 세포 게놈 또는 벡터로부터 관심의 서열의 삭제 및 구조를 허용하고, AAV Rep 유전자 생성물이 세포에 존재하는 경우 수용자 세포 게놈 내로의 이종성 서열의 통합을 허용하도록 기능하는 한, 반드시 동일하거나 동일한 AAV 혈청형 또는 단리체로부터 유래될 필요는 없다.
한 실시양태에서, AAV ITR은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV7 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 몇몇 AAV 혈청형으로부터 유래될 수 있다. 또한, AAV 발현 벡터에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 플랭킹하는 5' 및 3' ITR은, 이들이 의도되는 바와 같이, 즉, 숙주 세포 게놈 또는 벡터로부터 관심의 서열의 삭제 및 구조를 허용하고, AAV Rep 유전자 생성물이 세포에 존재하는 경우 수용자 세포 게놈 내로의 DNA 분자의 통합을 허용하도록 기능하는 한, 반드시 동일하거나 동일한 AAV 혈청형 또는 단리체로부터 유래될 필요는 없다.
한 실시양태에서, AAV 캡시드는 AAV2로부터 유래될 수 있다. AAV 벡터에 사용하기에 적합한 DNA 분자는 크기가 약 5 킬로베이스 (kb) 미만, 약 4.5 kb 미만, 약 4 kb 미만, 약 3.5 kb 미만, 약 3 kb 미만, 약 2.5 kb 미만일 것이며, 관련 기술분야에 공지되어 있다.
한 실시양태에서, 선택된 뉴클레오티드 서열은 생체내에서 대상체에서의 그의 전사 또는 발현을 지정하는 제어 요소에 작동적으로 연결된다. 이러한 제어 요소는 선택된 유전자와 정상적으로 관련되는 제어 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로, 이종성 제어 서열이 채용될 수 있다. 유용한 이종성 제어 서열로는 일반적으로 포유동물 또는 바이러스 유전자를 코딩하는 서열로부터 유래된 것들을 들 수 있다. 그 예로는 SV40 초기 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스 LTR 프로모터; 아데노바이러스 주요 후기 프로모터 (Ad MLP); 단순 헤르페스 바이러스 (HSV) 프로모터, 시토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터, 예컨대 CMV 급초기 프로모터 영역 (CMVIE), 라우스 육종 바이러스 (RSV) 프로모터, pol II 프로모터, pol III 프로모터, 합성 프로모터, 하이브리드 프로모터 등을 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 비바이러스 유전자, 예컨대 뮤린 메탈로티오네인 유전자로부터 유래된 서열은 또한 본원에서 용도가 발견될 것이다. 이러한 프로모터 서열은 예를 들어, 스트라타진 (Stratagene) (미국 캘리포니아주 산 디에고)로부터 시판된다.
한 실시양태에서, 이종성 프로모터 및 다른 제어 요소, 예컨대 CNS-특이적 및 유도성 프로모터, 인핸서 등의 둘 다는 특히 유용할 것이다. 이종성 프로모터의 예로는 CMV 프로모터를 들 수 있다. CNS-특이적 프로모터의 예로는 미엘린 염기성 단백질 (MBP), 아교세포 섬유 산성 단백질 (GFAP), 및 뉴런 특이적 에놀라제 (NSE)로부터의 유전자로부터 단리된 것들을 들 수 있다. 유도성 프로모터의 예로는 엑디손, 테트라시클린, 저산소증 및 아우핀에 대한 DNA 반응성 요소를 들 수 있다.
한 실시양태에서, AAV ITR에 의해 경계화된 관심의 DNA 분자를 갖는 AAV 발현 벡터는 선택된 서열(들)을 그로부터 삭제되는 주요 AAV 오픈 리딩 프레임 ("ORF")을 가진 AAV 게놈 내로 직접적으로 삽입함으로써 구축될 수 있다. AAV 게놈의 다른 부분은 또한 ITR의 충분한 부분이 복제 및 패키징 기능을 허용하도록 남아 있는 한 결실될 수 있다. 이러한 구축물은 관련 기술분야에 널리 공지된 기술을 사용하여 설계될 수 있다.
대안적으로, AAV ITR은 표준 라이게이션 기술을 사용하여 또다른 벡터에 존재하는 선택된 핵산 구축물의 동일하고 융합된 5' 및 3'를 함유하는 바이러스 게놈으로부터 또는 AAV 벡터로부터 삭제될 수 있다. 예를 들어, 라이게이션은 20 mM 트리스 (Tris)-Cl pH 7.5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 33 μg/ml BSA, 10 mM 내지 50 mM NaCl, 및 40 uM ATP, 0.01 내지 0.02 (바이스 (Weiss)) 유닛 T4 DNA 리가제 (0℃) ("점착성 말단" 라이게이션용) 또는 1 mM ATP, 0.3 내지 0.6 (Weiss) 유닛 T4 DNA 리가제 (14℃) ("블런트 말단" 라이게이션용)에서 달성될 수 있다. 분자간 "점착성 말단" 라이게이션은 통상적으로 30 내지 100 μg/ml 총 DNA 농도 (5 내지 100 nM 총 말단 농도)에서 수행된다. AAV 벡터는 ITR을 함유한다.
추가적으로, 키메라 유전자는 하나 이상의 선택된 핵산 서열의 5' 및 3' 배열된 AAV ITR 서열을 포함하도록 합성적으로 생성될 수 있다. 포유동물 CNS 세포에서의 키메라 유전자 서열의 발현을 위한 바람직한 코돈이 사용될 수 있다. 완전한 키메라 서열은 표준 방법에 의해 제조된 중복하는 올리고뉴클레오티드로부터 집합된다.
rAAV 비리온을 생성하기 위해, AAV 발현 벡터를 공지된 기술을 사용하여, 예컨대 형질감염에 의해 적합한 숙주 세포 내로 도입한다. 다수의 형질감염 기술은 관련 기술분야에 일반적으로 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al . (1989) Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York]을 참조한다. 특히 적합한 형질감염 방법으로는 인산칼슘 공-침전, 배양된 세포 내로의 직접 미세-주사, 전기천공, 리포좀 매개된 유전자 전달, 지질-매개된 형질도입, 및 고속 미세투사를 사용한 핵산 전달을 들 수 있다.
한 실시양태에서, rAAV 비리온을 생성하기 위한 적합한 숙주 세포로는 이종성 DNA 분자의 수용자일 수 있거나 이로서 사용되었던 미생물, 효모 세포, 곤충 세포 및 포유동물 세포를 들 수 있다. 이 용어는 형질감염된 기원 세포의 자손을 포함한다. 따라서, 본원에 사용된 "숙주 세포"는 일반적으로 외인성 DNA 서열로 형질감염된 세포를 지칭한다. 적합한 인간 세포주인 293 (예를 들어, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collection)을 통해 수탁 번호 ATCC CRL1573 하에 용이하게 이용가능함)으로부터의 세포는 본 개시내용의 실시에 사용될 수 있다. 특히, 인간 세포주 293은 아데노바이러스 유형-5 DNA 단편으로 형질전환된 인간 배아 신장 세포주이며, 아데노바이러스 E1a 및 E1b 유전자를 발현한다. 293 세포주는 용이하게 형질감염되며, rAAV 비리온을 생성하기 위한 특히 편리한 플랫폼을 제공한다.
"AAV rep 코딩 영역"은 복제 단백질 Rep 78, Rep 68, Rep 52 및 Rep 40을 코딩하는 AAV 게놈의 관련 기술분야에 인식된 영역을 의미한다. 이들 Rep 발현 생성물은 DNA 복제의 AAV 기점의 인식, 결합 및 니킹, DNA 헬리카제 활성 및 AAV (또는 다른 이종성) 프로모터로부터의 전사의 조절을 비롯한 많은 기능을 갖는 것으로 나타났다. Rep 발현 생성물은 AAV 게놈을 복제하기 위해 집합적으로 요구된다. AAV rep 코딩 영역의 적합한 상동체는 또한 AAV2 DNA 복제를 매개하는 것으로 공지된 인간 헤르페스바이러스 6 (HHV-6) rep 유전자를 포함한다.
"AAV cap 코딩 영역"은 캡시드 단백질 VP1, VP2 및 VP3, 또는 그의 기능적 상동체를 코딩하는 AAV 게놈의 관련 기술분야에 인식된 영역을 의미한다. 이들 Cap 발현 생성물은 바이러스 게놈을 패키징하기 위해 집합적으로 요구되는 패키징 기능을 공급한다.
한 실시양태에서, AAV 헬퍼 기능은 AAV 발현 벡터의 형질감염 전에 또는 그와 공동으로 AAV 헬퍼 구축물을 갖는 숙주 세포를 형질감염시킴으로써 숙주 세포 내로 도입된다. 따라서, AAV 헬퍼 구축물은 생산적 AAV 감염에 필요한 미싱 AAV 기능을 보완하기 위해 AAV rep 및/또는 cap 유전자의 적어도 일시적 발현을 제공하는 데 사용된다. AAV 헬퍼 구축물은 AAV ITR이 결여되며, 그 자신을 복제하거나 패키징할 수 없다. 이들 구축물은 플라스미드, 파지, 트랜스포존, 코스미드, 바이러스 또는 비리온의 형태일 수 있다. 다수의 AAV 헬퍼 구축물, 예컨대 Rep 및 Cap 발현 생성물 둘 다를 코딩하는 통상적으로 사용되는 플라스미드 pAAV/Ad 및 pIM29+45가 기재되었다. Rep 및/또는 Cap 발현 생성물을 코딩하는 다수의 다른 벡터가 기재되었다.
바이러스 벡터의 전달 방법은 AAV를 CSF 내로 주사하는 것을 포함한다. 일반적으로, rAAV 비리온은 생체내 또는 시험관내 형질도입 기술을 사용하여 CNS의 세포 내로 도입될 수 있다. 시험관내에서 형질도입되는 경우, 바람직한 수용자 세포를 대상체로부터 제거하고, rAAV 비리온으로 형질도입하고, 대상체 내로 재도입할 것이다. 대안적으로, 공통발생성 또는 이종발생성 세포를 사용할 수 있으며, 여기서, 이들 세포는 대상체에서 부적절한 면역 반응을 생성하지 않을 것이다.
대상체 내로의 형질도입된 세포의 전달 및 도입을 위한 적합한 방법이 기재되었다. 예를 들어, 세포는 재조합 AAV 비리온을 예를 들어 적절한 배지에서 CNS 세포와 배합함으로써 시험관내에서 형질도입될 수 있으며, 관심의 DNA를 갖는 세포에 대한 스크리닝은 통상적인 기술, 예컨대 서던 블롯 및/또는 PCR을 사용하여, 또는 선택적 마커를 사용함으로써 스크리닝될 수 있다. 그 후, 형질도입된 세포를 하기에 보다 충분히 기재되는 제약 조성물, 및 다양한 기술에 의해, 예컨대 이식, 근육내, 정맥내, 피하 및 복강내 주사에 의해 대상체 내로 도입되는 조성물로 제제화할 수 있다.
한 실시양태에서, 제약 조성물은 관심의 핵산의 치료 유효량, 즉, 당해 질환 상태의 증상을 감소시키거나 개선시키는 데 충분한 양 또는 바람직한 이익을 제공하는 데 충분한 양을 생성하는 데 충분한 유전 물질을 포함할 것이다. 제약 조성물은 또한 제약학적으로 허용되는 부형제를 함유할 것이다. 이러한 부형제는 그 자체가 조성물을 받는 개체에게 해로운 항체의 생성을 유도하지 않고, 과도한 독성 없이 투여될 수 있는 임의의 제약 제제를 포함한다. 제약학적으로 허용되는 부형제로는 소르비톨, 트윈 (Tween)80, 및 물, 염수, 글리세롤 및 에탄올과 같은 액체를 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 제약학적으로 허용되는 염은 그 안에 예를 들어, 광물 산 염, 예컨대 염산염, 브롬화수소산염, 포스페이트, 술페이트 등; 및 유기 산의 염, 예컨대 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트, 벤조에이트 등을 포함될 수 있다. 추가적으로, 보조 물질, 예컨대 습윤화제 또는 유화제, pH 완충 물질 등이 이러한 비히클에 존재할 수 있다. 제약학적으로 허용되는 부형제의 완전한 논의는 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., N.J. 1991)]에서 이용가능하다.
관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백한 바와 같이, 본 명세서의 교시의 관점에서, 첨가되어야 하는 바이러스 벡터의 유효량은 실험적으로 결정될 수 있다. 투여는 하나의 용량으로, 치료의 과정 전반에 걸쳐 연속적으로 또는 간헐적으로 실행될 수 있다. 투여의 가장 유효한 수단 및 투여량을 결정하는 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있으며, 바이러스 벡터, 요법의 조성물, 표적 세포, 및 치료되는 대상체에 따라 다양할 것이다. 단일 및 다중 투여는 용량 수준으로 수행될 수 있으며, 패턴은 치료하는 의사에 의해 선택된다.
하나 초과의 트랜스진이 전달되는 바이러스 벡터에 의해 발현될 수 있음이 이해되어야 한다. 대안적으로, 각각 하나 이상의 상이한 트랜스진을 발현하는 별개의 벡터는 또한 본원에 기재된 바와 같이 CNS에 전달될 수 있다. 또한, 본 개시내용의 방법에 의해 전달되는 바이러스 벡터는 다른 적합한 조성물 및 요법과 조합되는 것으로 또한 의도된다.
세포 내로의 유전 물질의 도입 방법
외인성 유전 물질 (예를 들어, 1종 이상의 치료 단백질을 코딩하는 cDNA)을 유전자 전달 방법, 예컨대 형질감염 또는 형질도입에 의해 생체외 또는 생체내에서 세포 내로 도입하여 유전적으로 개질된 세포를 제공한다. 다양한 발현 벡터 (즉, 표적 세포 내로의 외인성 유전 물질의 전달을 용이하게 하기 위한 비히클)는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다.
본원에 사용된 "세포의 형질감염"은 첨가되는 DNA의 혼입에 의한 세포에 의한 새로운 유전 물질의 획득을 지칭한다. 따라서, 형질감염은 물리적 또는 화학적 방법을 사용한 세포 내로의 핵산의 삽입을 지칭한다. 인산칼슘 DNA 공-침전; DEAE-덱스트란; 전기천공; 양이온성 리포좀-매개된 형질감염; 및 텅스텐 입자-용이화된 미세입자 포격을 비롯한 몇몇 형질감염 기술이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 인산스트론튬 DNA 공-침전은 또다른 가능한 형질감염 방법이다.
대조적으로, "세포의 형질도입"은 DNA 또는 RNA 바이러스를 사용하여 세포 내로 핵산을 전달하는 과정을 지칭한다. 세포 내로 핵산을 전달하기 위한 RNA 바이러스 (즉, 레트로바이러스)는 본원에서 형질도입 키메라 레트로바이러스로 지칭된다. 레트로바이러스 내에 함유된 외인성 유전 물질은 형질도입된 세포의 게놈 내로 혼입된다. 키메라 DNA 바이러스 (예를 들어, 치료제를 코딩하는 cDNA를 운반하는 아데노바이러스)로 형질도입된 세포는 그의 게놈 내로 혼입된 외인성 유전 물질을 갖지 않을 것이지만, 세포 내에 염색체외적으로 보유된 외인성 유전 물질을 발현할 수 있을 것이다.
전형적으로, 외인성 유전 물질은 새로운 유전자의 전사를 제어하는 프로모터와 함께 이종성 유전자 (통상적으로 치료제 단백질을 코딩하는 엑손을 포함하는 cDNA의 형태)를 포함한다. 프로모터는 특징적으로 전사를 개시하는 데 필요한 특이적 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 임의로, 외인성 유전 물질은 바람직한 유전자 전사 활성을 얻는 데 요구되는 추가의 서열 (즉, 인핸서)을 더 포함한다. 본 논의의 목적상, "인핸서"는 간단히 프로모터에 의해 지시되는 기저 전사 수준을 변화시키는 코딩 서열 (시스)과 인접하여 작동하는 임의의 비-번역되는 DNA 서열이다. 외인성 유전 물질은 프로모터 및 코딩 서열이 코딩 서열의 전사를 허용하도록 작동적으로 연결되도록 프로모터로부터 바로 하류에서 세포 게놈 내로 도입될 수 있다. 레트로바이러스 발현 벡터는 삽입된 외인성 유전자의 전사를 제어하는 외인성 프로모터 요소를 포함할 수 있다. 이러한 외인성 프로모터는 구조적 및 유도성 프로모터 둘 다를 포함한다.
천연-발생 구조적 프로모터는 필수적인 세포 기능의 발현을 제어한다. 그 결과, 구조적 프로모터의 제어 하의 유전자는 세포 성장의 모든 조건 하에서 발현된다. 예시적인 구조적 프로모터로는 특정 구조적 또는 "하우스키핑" 기능을 코딩하는 하기 유전자에 대한 프로모터를 들 수 있다: 히포크산틴 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HPRT), 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR), 아데노신 데아미나제, 포스포글리세롤 키나제 (PGK), 피루베이트 키나제, 포스포글리세폴 뮤타제, 액틴 프로모터, 및 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다른 구조적 프로모터. 또한, 많은 바이러스 프로모터는 진핵 세포에서 구조적으로 기능한다. 이들로는 많은 다른 것들 중에서 SV40의 초기 및 후기 프로모터; 원숭이 백혈병 바이러스 및 다른 레트로바이러스의 긴 말단 반복부 (LTR); 및 단순 헤르페스 바이러스의 티미딘 키나제 프로모터를 들 수 있다. 따라서, 임의의 상기 언급된 구조적 프로모터는 이종성 유전자 삽입물의 전사를 제어하는 데 사용될 수 있다.
유도성 프로모터의 제어 하에 있는 유전자는 단지 또는 보다 큰 정도로 유도제의 존재 하에서 발현된다 (예를 들어, 메탈로티오네인 프로모터의 제어 하의 전사는 특정 금속 이온의 존재 하에서 크게 증가됨). 유도성 프로모터는 그의 유도성 인자가 결합될 경우 전사를 자극하는 반응성 요소 (RE)를 포함한다. 예를 들어, 혈청 인자, 스테로이드 호르몬, 레티노산 및 시클릭 AMP에 대한 RE가 있다. 유도성 반응을 얻기 위해 특정 RE를 함유하는 프로모터가 선택될 수 있으며, 일부의 경우, RE 자체가 상이한 프로모터에 부착됨으로써 재조합 유전자에 유도성을 부여할 수 있다. 따라서, 적절한 프로모터 (구조적 대 유도성: 강한 대 약한)를 선택함으로써, 유전적으로 개질된 세포에서의 치료제의 존재 및 발현의 수준 둘 다를 제어할 수 있다. 치료제를 코딩하는 유전자가 유도성 프로모터의 제어 하에 있는 경우, 계내에서의 치료제의 전달은 계내에서 유전적으로 개질된 세포를 치료제의 전사를 허용하는 조건에 노출시킴으로써, 예를 들어, 제제의 전사를 제어하는 유도성 프로모터의 특이적 유도제의 복강내 주사에 의해 촉발된다. 예를 들어, 메탈로티오네인 프로모터의 제어 하에 유전자에 의해 코딩되는 치료제의 유전적으로 개질된 세포에 의한 계내 발현은 유전적으로 개질된 세포를 계내에서 적절한 (즉, 유도성) 금속 이온을 함유하는 용액과 접촉시킴으로써 향상된다.
따라서, 계내에서 전달되는 치료제의 양은 하기 인자를 제어함으로써 조절된다: (1) 삽입된 유전자의 전사를 지정하는 데 사용되는 프로모터의 성질 (즉, 프로모터가 구조적인지 유도성인지, 강한지 약한지); (2) 세포 내로 삽입되는 외인성 유전자의 카피의 수; (3) 환자에게 투여되는 (예를 들어, 이식되는) 형질도입된/형질감염된 세포의 수; (4) 이식물 (예를 들어, 이식편 또는 캡슐화된 발현 시스템)의 크기; (5) 이식물의 수; (6) 형질도입된/형질감염된 세포 또는 이식물이 장소에 정치되는 시간의 길이; 및 (7) 유전적으로 개질된 세포에 의한 치료제의 생성 속도. 특정 치료제의 치료 유효 용량의 전달을 위한 이들 인자의 선택 및 최적화는 상기 개시된 인자 및 환자의 임상적 프로파일을 고려하여 과도한 실험 없이 관련 기술분야의 통상의 기술자의 범위 내에 있는 것으로 간주된다.
적어도 하나의 프로모터 및 치료제를 코딩하는 적어도 하나의 이종성 핵산 외에, 발현 벡터는 발현 벡터로 형질감염되거나 형질도입된 세포의 선택을 용이하게 하기 위한 선택 유전자, 예를 들어, 네오마이신 저항성 유전자를 포함할 수 있다. 대안적으로, 세포는 2개 이상의 발현 벡터로 형질감염되며, 적어도 하나의 벡터는 치료제(들)를 코딩하는 유전자(들)를 함유하고, 다른 벡터는 선택 유전자를 함유한다. 적합한 프로모터, 인핸서, 선택 유전자 및/또는 신호 서열 (하기에 기재됨)의 선택은 과도한 실험 없이 관련 기술분야의 통상의 기술자의 범위 내에 있는 것으로 간주된다.
치료제는 세포외, 세포내 또는 막 위치에 전달하기 위해 표적화될 수 있다. 유전자 생성물이 세포로부터 분비되는 것이 바람직할 경우, 발현 벡터는 세포로부터 세포외 환경으로 치료 유전 생성물을 분비하기 위한 적절한 분비 "신호" 서열을 포함하도록 설계된다. 유전자 생성물이 세포 내에 보유되는 것이 바람직할 경우, 이 분비 신호 서열은 생략된다. 유사한 방식으로, 발현 벡터는 세포 원형질 막 내에 치료제를 부착하기 위한 "체류" 신호 서열을 포함하도록 구축될 수 있다. 예를 들어, 모든 막 단백질은 막 중의 단백질의 전위를 중지시키고, 단백질이 분비되는 것을 허용하지 않는 소수성 막관통 영역을 갖는다. 유전자 생성물을 특정 위치에 표적화하기 위한 신호 서열을 포함하는 발현 벡터의 구축은 과도한 실험에 대한 필요 없이 관련 기술분야의 통상의 기술자의 범위 내인 것으로 간주된다.
검출 검정
다양한 면역검출 방법이 본 실시양태에 대해 고려된다. 이러한 면역검출 방법으로는 효소 연관 면역흡착 검정 (ELISA), 방사성면역검정 (RIA), 면역방사계수 검정, 형광면역검정, 화학발광 검정, 생물발광 검정 및 웨스턴 블롯을 들 수 있지만, 몇몇 다른 것들은 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 다양한 유용한 면역검출 방법의 단계는 과학 문헌에 기재되었다.
일반적으로, 면역결합 방법은 Aβ 단백질을 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 얻고, 샘플을 경우에 따라 면역복합체의 형성을 허용하는 데 유효한 조건 하에서, 본 발명에 따른 Aβ에 특이적인 모노클로날 또는 폴리클로날인 제1 항체와 접촉시키는 것을 포함한다.
면역결합 방법은 샘플 중의 Aβ 단백질의 양을 검출 및 정량화하는 방법, 및 결합 과정 동안 형성된 임의의 면역 복합체의 검출 및 정량화를 포함한다. 여기서, Aβ 단백질을 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 얻고, 샘플을 본 발명의 항체 단편과 접촉시킨 후, 특정 조건 하에서 형성된 면역 복합체의 양을 검출 및 정량화할 것이다.
선택된 생물학적 샘플을 면역 복합체 (1차 면역 복합체)의 형성을 허용하는 유효한 조건 하에서 및 그에 충분한 기간 동안 항체와 접촉시키는 것은 일반적으로 간단히 항체 조성물을 샘플에 첨가하고, 혼합물을 항체가 존재하는 임의의 항원과 면역 복합체를 형성하는, 즉, 이에 결합하는 데 충분히 긴 기간 동안 인큐베이션하는 문제이다. 이 시간 후, 샘플-항체 조성물, 예컨대 조직 섹션, ELISA 플레이트, 도트 블롯 또는 웨스턴 블롯을 일반적으로 세척하여 임의의 비-특이적으로 결합된 항체 종을 제거하여, 단지 1차 면역 복합체 내에서 특이적으로 결합된 scFv 분자만이 검출되는 것을 허용할 것이다.
일반적으로, 면역복합체 형성의 검출은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있으며, 수많은 접근법의 적용을 통해 달성될 수 있다. 이들 방법은 일반적으로 표지 또는 마커, 예컨대 임의의 방사성, 형광, 생물학적 및 효소적 태그의 검출에 기초한다. 이러한 표지의 사용에 관한 미국 특허로는 미국 특허 제3,817,837호; 제3,850,752호; 제3,939,350호; 제3,996,345호; 제4,277,437호; 제4,275,149호 및 제4,366,241호를 들 수 있으며, 이들 각각은 본원에 참고로 포함된다. 물론, 관련 기술분야에 공지된 바와 같이 2차 결합 리간드, 예컨대 제2 항체 및/또는 비오틴/아비딘 리간드 결합 배열의 사용을 통해 추가의 이점을 발견할 수 있다.
상기 언급된 바와 같이, 단백질 검출 분자 (즉, 결합 리간드, 예컨대 항체 또는 항체 단편)는 그 자체로 검출가능한 표지에 연결될 수 있으며, 그 후 이 표지를 간단히 검출함으로써 조성물 중의 1차 면역 복합체의 양을 측정할 것이다. 대안적으로, 1차 면역 복합체 내에서 결합하게 되는 제1 항체를 항체에 대한 결합 친화성을 갖는 제2 결합 리간드에 의해 검출할 수 있다. 이 경우, 제2 결합 리간드는 검출가능한 표지에 연결될 수 있다. 제2 결합 리간드 그 자체는 종종 항체이며, 따라서 "2차 항체"로 지칭될 수 있다. 1차 면역 복합체를 2차 면역 복합체의 형성을 허용하는 데 유효한 조건 하에서 및 그에 충분한 기간 동안 표지된 2차 결합 리간드, 또는 항체와 접촉시킨다. 그 후, 2차 면역 복합체를 일반적으로 세척하여 임의의 비-특이적으로 결합된 표지된 2차 항체 또는 리간드를 제거한 후, 2차 면역 복합체 중의 잔류하는 표지를 검출한다.
추가의 방법은 2-단계 접근법에 의한 1차 면역 복합체의 검출을 포함한다. 제1 결합 리간드에 대한 결합 친화성을 갖는 제2 결합 리간드, 예컨대 항체를 사용하여 상기 기재된 바와 같이 2차 면역 복합체를 형성한다. 세척 후, 2차 면역 복합체를 다시 면역 복합체 (3차 면역 복합체)의 형성을 허용하는 데 유효한 조건 하에서 및 그에 충분한 기간 동안 제2 항체에 대한 결합 친화성을 갖는 제3 결합 리간드 또는 항체와 접촉시킨다. 제3 리간드 또는 항체는 검출가능한 표지에 연결되며, 이는 이렇게 형성된 3차 면역 복합체의 검출을 허용한다. 이 시스템은 이것이 바람직할 경우 신호 증폭을 제공할 수 있다.
상기 상세화된 바와 같이, 면역검정은 그의 가장 단순한 및/또는 직접적인 의미에서 결합 검정이다. 특정 바람직한 면역검정은 관련 기술분야에 공지된 다양한 유형의 효소 연관 면역흡착 검정 (ELISA) 및/또는 방사성면역검정 (RIA)이다. 조직 섹션을 사용한 면역조직화학적 검출은 또한 특히 유용하다. 하지만, 검출은 이러한 기술에 제한되지 않음이 용이하게 이해될 것이며, 웨스턴 블롯팅, 도트 블롯팅, FACS 분석 등이 또한 사용될 수 있다.
하나의 예시적인 ELISA에서, 항체를 단백질 친화성을 나타내는 선택된 표면, 예컨대 폴리스티렌 미세역가판 중의 웰 상으로 고정한다. 그 후, Aβ 단백질을 함유하는 것으로 의심되는 시험 조성물, 예컨대 임상적 샘플 (예를 들어, 대상체로부터 얻어진 생물학적 샘플)을 웰에 첨가한다. 결합시키고, 세척하여 비-특이적으로 결합된 면역 복합체를 제거한 후, 결합된 항원을 검출할 수 있다. 검출은 일반적으로 검출가능한 표지에 연결된 또다른 항체의 첨가에 의해 달성된다. 이 유형의 ELISA는 간단한 "샌드위치 ELISA"이다. 검출은 또한 제2 항체를 첨가한 후, 제2 항체에 대한 결합 친화성을 갖는 검출가능한 표지에 연결된 제3 항체를 첨가함으로써 달성될 수 있다.
또다른 예시적인 ELISA에서, 항원을 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 웰 표면 상에 고정하고/거나, 그 후 결합제와 접촉시킨다. 결합시키고/거나, 세척하여 비-특이적으로 결합된 면역 복합체를 제거한 후, 결합된 항-결합제를 검출한다. 초기 결합제가 검출가능한 표지에 연결되는 경우, 면역 복합체는 직접적으로 검출될 수 있다. 다시, 면역 복합체는 제1 결합제에 대한 결합 친화성을 갖는 검출가능한 표지에 연결된 제2 항체를 사용하여 검출될 수 있다.
항원이 고정되는 또다른 ELISA는 검출에서 항체 경쟁의 사용을 포함한다. 이 ELISA에서, 항원에 대한 표지된 항체를 웰에 첨가하여 결합하게 하고/거나 그의 표지에 의해 검출한다. 그 후, 샘플을 코팅된 웰로의 인큐베이션 동안 항원에 대한 표지된 항체와 혼합함으로써, 미지의 샘플 중의 항원의 양을 측정한다. 샘플 중의 항원의 존재는 웰에 결합하는 데 이용가능한 항원에 대한 항체의 양을 감소시키고, 따라서 궁극적인 신호를 감소시키는 작용을 한다. 이는 또한 비표지된 항체가 항원-코팅된 웰에 결합하고, 또한 표지된 항체를 결합시키는 데 이용가능한 하원의 양을 감소시키는 경우, 미지의 샘플 중의 항원에 대한 항체를 검출하는 데 적절하다.
채용되는 형식에 관계없이, ELISA는 공통적인 특정 특징, 예컨대 코팅, 인큐베이션 및 결합, 비-특이적으로 결합된 종을 제거하기 위한 세척, 및 결합된 면역 복합체의 검출을 갖는다.
ELISA에서, 아마도 직접적 절차보다는 2차 또는 3차 검출 수단을 사용하는 것이 보다 통상적이다. 따라서, 단백질 또는 항체를 웰에 결합시키고, 배경을 저감시키는 비-반응성 물질로 코팅하고, 세척하여 비결합된 물질을 제거한 후, 고정화 표면을 면역 복합체 (항원/항체) 형성을 허용하는 데 유효한 조건 하에서 시험되는 생물학적 샘플과 접촉시킨다. 그 후, 면역 복합체의 검출은 표지된 2차 결합 리간드 또는 항체, 및 표지된 3차 항체 또는 제3 결합 리간드와 함께 2차 결합 리간드 또는 항체를 요구한다.
면역 복합체 (항원/항체) 형성을 허용하는 데 유효한 조건 하에서"는 조건이 바람직하게는 tau 올리고머 및/또는 scFv 조성물을 BSA, 소 감마 글로불린 (BGG) 또는 인산염 완충 염수 (PBS)/트윈과 같은 용액으로 희석하는 것을 포함함을 의미한다. 이들 첨가되는 제제는 또한 비특이적 배경의 저감을 돕는 경향이 있다.
"적합한" 조건은 또한 인큐베이션이 유효한 결합을 허용하는 데 충분한 온도에서 또는 기간 동안임을 의미한다. 인큐베이션 단계는 전형적으로 바람직하게는 25℃ 내지 27℃ 정도의 온도에서 약 1 내지 2 내지 4시간 정도이거나, 약 4℃ 정도에서 밤새일 수 있다.
ELISA에서 모든 인큐베이션 단계 후, 접촉된 표면을 세척하여 비-복합체화된 물질을 제거한다. 세척 절차의 예로는 PBS/트윈과 같은 용액, 또는 보레이트 완충액으로의 세척을 들 수 있다. 시험 샘플 및 원래 결합된 물질 사이의 특이적 면역 복합체의 형성 및 후속 세척 후, 심지어 미량의 면역 복합체의 발생을 측정할 수 있다.
검출 수단을 제공하기 위해, 제2 또는 제3 항체는 검출을 허용하는 관련된 표지를 가질 것이다. 이는 적절한 발색성 기질로의 인큐베이션 시 색 발달을 생성하는 효소일 수 있다. 따라서, 예를 들어, 제1 및 제2 면역 복합체를 추가의 면역 복합체 형성의 발달을 선호하는 기간 동안 및 조건 하에서 우레아제, 글루코스 옥시다제, 알칼리성 포스파타제 또는 히드로겐 퍼옥시다제-컨쥬게이션된 항체와 접촉시키거나 인큐베이션한다 (예를 들어, PBS-함유 용액, 예컨대 PBS-트윈 중에서 실온에서 2시간 동안 인큐베이션).
표지된 항체로 인큐베이션하고, 이어서 세척하여 비결합된 물질을 제거한 후, 표지의 양을 예를 들어, 발색성 기질, 예컨대 우레아, 또는 브로모크레솔 퍼플, 또는 2,2'-아지노-디-(3-에틸-벤즈티아졸린-6-술폰산 (ABTS), 또는 효소 표지로서 퍼옥시다제의 경우 H2O2로의 인큐베이션에 의해 정량화한다. 그 후, 정량화는 예를 들어, 가시 스펙트럼 분광광도계를 사용하여 생성된 색의 정도를 측정함으로써 달성된다.
실시예 1
아밀로이드 침착의 진행의 변화
본 실시예는 아데노-관련된 바이러스 혈청형 4 (AAV4)의 뇌실내 주사를 통한 상이한 ApoE 이소형의 과발현 후의 app/ps 마우스에서의 아밀로이드 침착의 진행의 변화를 연구하였다.
ApoE의 엡실론 4 대립유전자 (ApoE ε4)는 알츠하이머병 (AD)에 대한 첫번째 유전적 위험 인자인 반면, 드문 ApoE의 엡실론 2 대립유전자 (ApoE ε2)의 유전은 이 위험을 약 반으로 저감시킨다. 하지만, 거의 17년 전의 이들 강한 유전적 단서의 발견에도 불구하고, ApoE가 위험을 제공하는 메커니즘은 불확실하게 남아 있다.
상이한 ApoE 이소형 (ApoE ε2, ε3 및 ε4)이 섬유성 아밀로이드 플라크의 형성 및 안정성에 어떻게 영향을 주는지 해석하기 위해, 각각의 ApoE 이소형을 코딩하는 AAV4 벡터를 7월령 APP/PS 마우스의 뇌실 내로 주사하였다. 생체내 다중광자 화상화를 사용하여, 아밀로이드 침착물의 집단을 기준선에서 및 ApoE에의 노출 후 2개월 간격에 걸쳐 추적하여, 살아있는 동물에서의 아밀로이드증 진행을 동적 조망하였다.
아밀로이드 플라크 침착의 동역학은 각각의 이소형에 따라 다양한 것으로 관찰되었으며, ApoE ε4 주사된 마우스는 노년 플라크의 38％ 증가를 가진 반면, ApoE ε2로 처리된 마우스는 2개월 후 ApoE ε3에 비해 아밀로이드 침착물의 수의 15％ 감소를 나타내었다. 사후 분석은 이들 결과를 확인시켰으며, 피질 중의 플라크를 장식하는 인간 ApoE 단백질의 존재를 밝혔고, 이는 실질 전반에 걸쳐 단백질의 넓은 확산 및 Aβ 펩티드가 침착되는 그의 초점 축적을 반영한다. ApoE ε4 단백질의 이 증가된 함량은 또한 아밀로이드 침착물 주위의 보다 심각한 시냅스 소실과 관련되었음을 주목하는 것이 중요하다.
전체적으로, 본 데이터는 상이한 ApoE 이소형의 과-생성이 질환의 진행에 영향을 줄 수 있었으며, AD 환자에서의 인지 손상과 가장 상관되는 파라미터 중 하나인 시냅스 소실의 정도를 조절할 수 있었음을 입증하였다.
1. AAV4 - ApoE의 뇌실내 주사는 뇌에서의 huApoE의 안정한 발현 및 재조합 인간 ApoE (huApoE) 단백질의 지속된 검출을 초래한다.
간략하게, GFP 및 huApoE를 AAV4 벡터로 주사된 APP/PS 마우스에서 면역검출하였다. GFP 신호는 전체 뇌실 영역 (상부 패널) 내로 및 뇌실을 따라 늘어선 세포, 뿐만 아니라 인간 APOE에서 관찰될 수 있었다.
본 접근법을 평가하기 위해, AAV4-비너스 (Venus) (대조군), -ApoE2, -ApoE3 및 -ApoE4를 야생형 마우스의 뇌실에 주사하였다. 주사 2개월 후, 인간 ApoE 단백질을 아밀로이드 침착물 주위의 피질 실질에서 검출할 수 있었다 (3H1 항체를 주목한다; 단지 비특이적 배경만이 AAV4-GFP 주사된 마우스에서 관찰되었음). 따라서, 유의한 수준의 인간 ApoE가 뇌에서 ELISA에 의해 검출되었으며, 비너스 및 ApoE에 대한 면역조직학적 염색은 뇌실을 따라 늘어선 세포에 의한 상이한 트랜스진의 발현을 확인시켰다.
트랜스진의 mRNA 수준을 평가하기 위해 qRT-PCR 실험을 수행하였다. 표준 곡선은 본 발명자들이 내인성 GAPDH의 수준에 따른 huApoE mRNA의 농도를 측정하는 것을 허용하였다. 2 또는 5개월 동안 노출된 마우스로부터의 샘플이 포함되었다. 인간 APOE를 특이적으로 검출하도록 설계된 ELISA 검정을 뇌 균질액에 대해 수행하였다 (도 1A). 인간 APOE에 대해 특이적인 ELISA (도 1B)에 의해 정량화되고, 웨스턴 블롯에 의해 확인된 바와 같이, AAV4-GFP 처리된 동물에 비해 AAV4-APOE 주사된 마우스에서 낮은 수준의 재조합 단백질을 검출할 수 있었다.
2. APOE의 각각의 이소형의 과발현은 아밀로이드증의 진행에 차등적으로 영향을 준다.
생체내 2-광자 화상화를 사용하여 살아있는 동물에서 시간 경과에 따라 아밀로이드 침착을 추적하였다. 간략하게, APP/PS 마우스 (7월령)를 ApoE2, ApoE3, ApoE4 및 비너스를 코딩하는 AAV4 벡터로 정위적으로 주사하였다. 1주 후, 두개골 창을 이식하고, 아밀로이드 침착물을 개두 후에 시간 경과에 따라 화상화하였다. 2개월 후, 동물을 희생시키고, 사후 분석을 수행하였다.
AAV4-ApoE2, AAV4-ApoE3 또는 AAV4-ApoE4로 주사된 APP/PS 마우스의 2-광자 화상을 작성하였다. 아밀로이드 플라크를 메톡시 (Methoxy)-XO4 (5mg/kg)의 복강내 주사 후에 검출할 수 있었으며, 텍사스 레드 덱스트란 (70,000 Da 분자량; 멸균 PBS 중 12.5 mg/ml)을 측면 꼬리 정맥 내로 주사하여 형광 혈관촬영도를 제공하였다. 화상을 주사 후 1주 (=T0), 1개월 및 2개월에 취하였다. 동일한 장을 시간 경과에 따라 캡처하여 병변의 진행을 추적하였다. 소수의 새로운 아밀로이드 침착물이 나타난 반면, 이들 중 소수는 2개월 기간에 걸쳐 더이상 검출할 수 없었다.
생체내 화상의 완전한 분석은 아밀로이드 침착물의 수가 AAV4-ApoE3 및 AAV4-비너스 처리된 동물 둘 다에 비해 AAV4-ApoE4 주사된 APP/PS 마우스에서 유의하게 보다 급속하게 증가함을 나타낸다. 대조적으로, 작지만 유의한 플라크의 밀도의 감소가 AAV4-ApoE2를 사용한 경우 측정되었다 (도 2). 보다 큰 플라크를 향한 경향이 AAV4-ApoE4로 주사된 APP/PS 마우스에서 관찰되었지만 (p<0.06), 플라크의 전체적인 크기는 일정하게 남아 있었다. 생체내 화상화의 요약된 데이터는 각각의 APOE 이소형의 과발현이 생체내에서 아밀로이드 침착의 진행에 차등적으로 영향을 줌을 나타낸다. AAV4-ApoE2의 주사는 시간 경과에 따라 아밀로이드 밀도의 약간의 감소를 초래하는 반면, AAV4-ApoE4의 주사는 아밀로이드증을 악화시킨다.
3. 아밀로이드 플라크의 크기는 각각의 ApoE 이소형에 따라 다양하다.
생체내 2-광자 화상화는 2개월의 기간에 걸친 각각의 아밀로이드 침착물의 크기의 변화의 추적을 허용하였다. 플라크의 크기는 시간 경과에 따라 안정하게 남아 있거나, 증가하거나, 감소한다. T1/T0 및 T2/T1 사이의 크기 비율의 분포는 다른 군에 비해 AAV4-ApoE4로 주사된 마우스에서 보다 큰 아밀로이드 플라크를 향한 이동이 있음을 나타낸다 (도 3).
4. 아밀로이드 적하량의 사후 평가는 아밀로이드 침착에 대한 ApoE2 및 ApoE4의 효과를 확인시킨다.
AAV4 주사 2개월 후, 사후 입체학적 평가는 AAV4-ApoE4 주사된 동물이 피질에서 아밀로이드 플라크의 보다 높은 밀도를 갖는 반면, 다른 군 사이에서는 차이를 검출할 수 없었음을 밝혔다 (도 4A). 아밀로이드 침착물의 이 증가된 수는 플라크를 ThioS 또는 Bam10으로 표지한 경우 관찰된다. 하지만, Bam10 및 ThioS 사이의 비율의 변화는 검출되지 않았다. 주사 5개월 후, 각각의 ApoE 이소형의 효과는 2개월에 비해 보다 현저하다 (도 4B). 마우스를 AAV4-ApoE4로 주사한 경우 침착물의 유의한 증가된 밀도가 관찰된 반면, ApoE2로는 반대 효과가 검출되었다. 다시, Bam10 및 ThioS 사이의 비율의 변화는 검출되지 않았다.
5. 각각의 ApoE 이소형은 아밀로이드 침착물 주위의 시냅스 밀도에 차등적으로 영향을 준다.
어레이 단층촬영을 사용하여 아밀로이드 침착물 주위의 시냅스전 및 시냅스후 요소의 밀도를 정확하게 측정하였다. 이 새로운 화상화 방법은 조직 분자 구조의 고-해상도 화상화를 위한 능력을 부여한다. 어레이 단층촬영은 시편 (70 nm)의 극박 절편화, 면역염색 및 3D 재구성에 기초한다. 어레이 단층촬영 샘플의 대표적인 화상은 아밀로이드 플라크 및 시냅스후 마커 PSD95에 대해 염색하였다. 어레이 단층촬영 화상은 감소된 수의 시냅스후 마커 PSD95가 아밀로이드 침착물 주위에서 관찰되지만, 이 효과는 플라크로부터 멀어지면 없어짐을 나타낸다. 플라크 부근의 또는 멀리의 시냅스전 (시냅신-1) 및 시냅스후 마커의 정량화를 AAV4로 주사된 마우스의 각각의 군에서 측정하였다 (도 5A 내지 D). 시냅스전 및 시냅스후 요소의 광범위한 정량화는 시냅신 1 및 PSD95의 감소된 밀도가 아밀로이드 플라크와 관련되었으며, 이 효과는 ApoE4가 APP/PS1 마우스의 뇌에서 과발현된 경우 극적으로 증폭됨을 확인시켰다 (도 5C, 도 5D). ApoE4의 과발현은 아밀로이드 침착물 부근의 다른 군에 비해 증가된 척주 소실과 관련된다. 반대로, 시냅신 반점의 밀도는 플라크 주위의 ApoE2 처리된 동물에서 보다 높다.
결론
AAV 바이러스 혈청형 4의 뇌실내 주사는 뇌 실질 전반에 걸쳐 가용성 재조합 단백질의 지속된 만성 과-생성을 초래하였다. ApoE2, ApoE3 및 ApoE4의 과발현은 APP/PS 마우스에서 병리증상의 과정에 차등적으로 영향을 주며, 아밀로이드 적하의 진행은 ApoE3에 비해 ApoE4가 주사된 경우 유의하게 증가되었다. 반대로, ApoE2는 보호 효과와 관련되었으며, 아밀로이드 침착물은 주사 2개월 후 거의 더이상 검출가능하지 않았다. 사후 면역조직학적 분석은 ApoE4의 반대 효과를 확인시켰다. ApoE4의 지속된 과-생성은 ApoE3에 비해 아밀로이드 침착물 주위에서 관찰된 시냅스 소실을 악화시킨 반면, ApoE2는 온건한 효과를 가졌다. 본 연구는 생체내에서 ApoE 이소형, 아밀로이드증 진행 및 시냅스 소실 사이의 직접적 관련성을 입증하였다.
실시예 2
대형 포유동물에서의 뇌 척수액 ( CSF )을 통한 중추 신경계 장애의 치료
뇌 장애, 예컨대 알츠하이머병에 대한 유전자 요법을 달성하기 위해, 치료 효소의 장기 지속-상태 수준이 포유동물에서 달성될 수 있는지 여부를 측정할 필요가 있었다. 뇌실막 세포 (뇌의 뇌실에 있는 세포)는 형질도입되고, 표적화된 효소를 뇌 척수액 (CSF) 내로 분비할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 아데노-관련된 바이러스 (AAV4)는 마우스 모델에서 뇌실막을 고 효율로 형질도입할 수 있는 것으로 측정되었다 (Davidson et al, PNAS, 28:3428-3432, 2000.). 마우스에서, AAV4 처리 후 질환 뇌에서 저장된 기질 수준의 정규화가 있었다.
CSF에서 효소의 지속-상태 수준을 달성하기 위해 벡터의 전반적 전달이 효과적으로 수행될 수 있는지 여부를 조사하였다. 먼저, 보다 대형 포유동물의 뇌에서 뇌실막 세포 (뇌실에 있는 세포)를 형질도입할 수 있는 벡터를 발견할 필요가 있었다. 연구를 LINCL의 개 모델 및 LINCL의 비-인간 영장류 모델에서 수행하였다. LINCL 개는 출생시 정상이지만, 7개월 경에 신경학적 징후를, 약 5 내지 6개월에 시험가능한 인지 결함을, 10 내지 11개월에 발작을, 그리고 진행성 시각 소실을 발달시킨다.
아데노-관련된 바이러스 (AAV)는 그의 작은 크기 (20 nm) 때문에 벡터로서 선택되었으며, 그의 유전 물질의 대부분은 바이러스 유전자가 존재하지 않도록, 및 그것이 복제 무능하도록 제거될 ("꺼내질") 수 있다. 아데노-관련된 바이러스 유형 4 (AAV4) 벡터가 베타-글루쿠로니다제 결함에 의해 유발된 점액다당류증 유형 VII (MPS VII)의 뮤린 모델에서 전반적 기능적 및 병리학적 개선을 매개할 수 있는지 여부는 이전에 시험되었다 (Liu et al., J. Neuroscience, 25(41):9321-9327, 2005). 베타-글루쿠로니다제를 코딩하는 재조합 AAV4 벡터를 확립된 질환을 갖는 MPS VII 마우스의 측면 뇌실 내로 단독으로 주사하였다. 형질도입된 뇌실막은 높은 수준의 재조합 효소를 발현하였으며, 분비된 효소는 뇌 및 소뇌 구조 뿐만 아니라 뇌간을 관통한다. 면역조직화학적 연구는 재조합 효소 및 뇌 미세혈관구조의 밀접한 관련을 밝혔으며, 이는 베타-글루쿠로니다제가 혈관을 따라 늘어선 혈관주위 공간을 통해 뇌 실질에 도달할 수 있음을 지시한다. 혐오 연상 학습을 맥락 공포 조건화에 의해 시험하였다. 동일 연령 이형 대조군에 비해, 질환에 걸린 마우스는 손상된 조건화된 공포 반응 및 맥락 구별을 나타내었다. 이 행동 결함은 AAV4 베타-글루쿠로니다제-처리된 MPS VII 마우스에서 유전자 전달 6주 후에 반전되었다. 데이터는 뇌실막 세포가 주위의 뇌 실질 및 CSF 내로 효소 분비의 공급원으로서 기능할 수 있음을 나타낸다.
하지만, 놀랍게도, 이들 연구가 대형 포유동물 (즉, 개 및 비-인간 영장류)로 확장된 경우, AAV4 벡터는 이들 동물에서 뇌실막을 표적화하는 데 효과적이지 않았다. 대신, AAV2 벡터가 사용될 필요가 있었다. 간략하게, TPP1를 코딩하는 rAAV2를 생성하고 (AAV2-CLN2), 뇌실내로 주사하여 뇌실막을 형질도입하였다 (Liu et al., J. Neuroscience, 25(41):9321-9327, 2005). TPP1은 LINCL에서 결함성인 효소이다. 데이터는 NHP 뇌에서의 뇌실막 형질도입이 CSF에서 효소의 유의한 증가를 초래하였음을 지시하였다. 결과는 다양한 뇌 영역에서 상승된 수준의 TPP1 활성을 지시하였으며, 여기서, 수직 축은 활성의 ％ 제어를 나타낸다 (도 7).
치료된 첫번째 개에서, 벡터의 전달은 차선이었지만, 여전히 뇌에서 CLN2 활성을 나타내었다. 후속의 개는 정위를 갖는 ICV 전달을 받았다. 치료된 개의 인지 능력은 T-미로 수행에 의해 측정된 바로 비-치료된 개에 비해 유의하게 개선되었음이 밝혀졌다 (도 8). 또한, LINCL의 개 모델에서 AAV2-CLN2의 ICV 전달의 효과는 매우 현저하였다. 비치료된 (-/-) 동물에서, 큰 뇌실이 존재하는 반면, 비치료된 대조군 및 치료된 동물의 뇌는 뇌실을 나타내지 않았다. LINCL 개의 뇌실로의 AAV.TPP1의 전달 후, 검출가능한 효소 활성이 소뇌 및 상부 척수를 비롯한 다양한 뇌 영역에서 주목되었다. 2개의 살아있는 추가의 질환에 걸린 개에서, 뇌 위축증은 유의하게 약화되었으며, 수명은 증가되고, 인지 기능은 개선되었다. 마지막으로, NHP에서, 본 발명자들은 이 방법이 야생형보다 2 내지 5배의 TPP1 활성 수준을 달성할 수 있음을 보인다.
몇몇 AAV 벡터를 생성하고, ITR 및 캡시드의 최적 조합을 측정하기 위해 시험하였다. 5개의 상이한 조합을 생성하였으며, AAV2 ITR이 가장 효과적이라고 측정되었다: AAV2/1 (즉, AAV2 ITR 및 AAV1 캡시드), AAV2/2, AAV2/4, AAV2/5, 및 AAV2/8. AAV2/2는 대형 포유동물 (개 및 NHP)에서 보다 양호하게 작동하였으며, AAV2/8, AAV2/5, AAV2/1 및 AAV2/4가 뒤를 잇는 것으로 밝혀졌다. 이는 바이러스 벡터의 유효성의 순서가 마우스에서 관찰된 것과 반대되기 때문에 매우 놀라웠다.
따라서, 본 연구는 뇌실을 따라 늘어선 세포가 뇌 전반에 걸친 분포를 위한 CSF에서의 재조합 효소의 공급원일 수 있으며, AAV2/2가 치료제, 예컨대 개 및 비인간 영장류에서 CLN2를 코딩하는 유전자 (TPP1)를 투여하기 위한 효과적인 비히클임을 나타내었다.
실시예 3
유전자 전달을 통해 전달된 인간 APOE 이소형은 아밀로이드 침착, 청소 및 신경독성에 영향을 줌으로써 알츠하이머병을 조절한다
알츠하이머병 (AD)은 가장 빈번한 연령-관련된 신경퇴행성 장애이며, 주요한 공중 보건 관심사가 되었다. AD의 후기 발병 산발성 형태와 관련된 감수성 유전자 중에서, 아포리포단백질 E ε4 (APOE - 유전자; ApoE - 단백질) 대립유전자는 지금까지 가장 중요한 유전적 위험 인자이다. 하나의 APOE ε4 카피의 존재는 가장 흔한 APOE ε3 대립유전자에 비해 3배수만큼 질환 발병 위험을 유의하게 증가시키는 반면, 2개의 카피는 12배 증가를 초래한다. 흥미롭게도, APOE ε2는 반대 영향을 갖고, 보호 인자이며, 따라서 이 특이적 대립유전자의 유전은 APOE3 /3에 비해 AD의 연령-보정 위험을 대략 절반 감소시킨다. 치매의 발병의 평균 연령은 또한 이들 위험 프로파일에 상응하는데, APOE4 /4 보유자는 그의 60대 중반에 발병하고, APOE2/3 보유자는 거의 30년을 이동한 그의 90대 초반에 발병하는 반면, APOE3 / 3 개체는 70대 사이 내지 중반에 발병의 연령을 갖는다.
ApoE가 AD에 영향을 주는 메커니즘은 논란의 여지가 있다. 질환의 드문 상염색체 우세 형태를 담당하는 모든 공지된 유전자가 Aβ 펩티드의 생성에 참여하기 때문에, 환자의 해마 및 피질 중의 Aβ 함유 노인성 플라크의 축적은 AD에서 중추적인 역할을 하는 것으로 믿어진다. 흥미롭게도, APOE 유전자형은 AD를 갖는 환자에서 아밀로이드 침착의 정도 뿐만 아니라 부검 샘플에서 검출된 신경독성 가용성 올리고머성 Aβ의 양에 강하게 영향을 주는 것으로 나타났다. ApoE 이소형은 뇌혈관 온전성에 차등적으로 영향을 주고, 혈액 뇌 장벽을 통한 Aβ 펩티드의 유출에 영향을 주며, 따라서 혈관 주위의 아밀로이드 응집체의 축적 (뇌 아밀로이드 혈관병증 또는 CAA)을 조절하는 것으로 제안되었다. 또한, ApoE는 또한 신경퇴행 및 뉴런 가소성에 직접적으로 연관되었다. ApoE2의 효과는 이들 내용에 관련하여 상대적으로 연구가 부족하다.
인간 APOE2, -E3 및 -E4를 발현하는 유전적으로 조작된 동물은 인간과 유사한 아밀로이드 적재량의 순위를 가지며, 이는 상이한 ApoE 이소형이 플라크 개시 및/또는 성장에 영향을 준다는 가설과 일치한다. 하지만, 기존의 아밀로이드 침착에 대한 및 잔존하는 신경퇴행에 대한 ApoE 매개된 효과의 메커니즘을 분석하기 위한 추가의 연구가 필요하다. 지식에서의 이러한 간극을 극복하기 위해, 본 발명자들은 다양한 APOE 대립유전자 (또는 GFP 대조군)를 발현하는 아데노-관련된 바이러스 벡터를 측면 뇌실 내로 주사하여 일차적으로 뇌실막을 형질도입한 후, 뇌척수액 및 간질액 내의 ApoE를 전달하는 생물학적 공장으로서 작용하는 유전자 전달 접근법을 사용하였다. 그 후, 본 발명자들은 생체내 다중광자 현미경검사를 사용하여 플라크 형성, 성장, 및 ApoE2의 경우 용해에 대한 다양한 ApoE 이소형의 효과를 추적하였을 뿐만 아니라, 생체내 미세투석 접근법을 사용하여 ISF에서의 ApoE 및 Aβ 생화학적 변수를 모니터링하고, 어레이 단층촬영을 사용하여 Aβ-관련된 신경독성의 변화를 평가하였다. 본 발명자들은 ApoE 이소형이 ISF 중의 가용성 올리고머성 Aβ의 수준, Aβ 섬유화 및 침착의 속도, 일단 형성된 아밀로이드 침착물의 안정성, 그의 청소, 및 플라크-주위 신경독성 효과의 정도에 영향을 줌을 밝혀내었다. 사실, ApoE4로 처리된 AD 마우스는 가용성 Aβ의 향상된 양, 섬유성 플라크의 보다 높은 밀도, 시냅스 요소 소실의 악화 및 각각의 침착물 주위의 신경염 이영양증의 증가된 수를 나타내는 반면, ApoE2로는 상대적 보호 효과가 관찰되었다. 이들 데이터는 APOE 대립유전자가 일차적으로 Aβ를 통해 AD에 대한 그의 효과를 매개하며, 치료 표적으로서 ApoE를 강조한다는 가설을 지지한다.
결과
AAV4 - APOE의 뇌실내 주사는 뇌에서 안정한 APOE 발현 및 인간 ApoE의 지속된 생성을 초래한다
아포리포단백질 E는 자연적으로 분비되는 단백질이고, 주로 성상세포 및 미세아교세포에 의해 생성되며, 뇌 실질 전반에 걸쳐 확산될 수 있다. 본 발명자들은 GFP (대조군) 또는 각각의 APOE 대립유전자를 코딩하는 AAV 혈청형 4를 7월령 APP/PS1 마우스의 측면 뇌 뇌실 내로 주사함으로써 이 특성을 이용하였다. AD의 특징적인 병변에 의해 영향을 받은 대뇌 영역을 고려하여, 이 전략은 다중 실질내 주사에 비해 큰 이점을 제공하였다.
주사 2개월 후, 형질도입된 세포를 맥락 얼기 및 뇌실을 따라 늘어선 뇌실막에서 검출하였으며, 따라서 AAV4 벡터의 기능성을 확인하였다. 각각의 종에 대해 특이적인 항체를 사용하여, 인간 및 뮤린 ApoE 단백질 둘 다를 또한 ELISA (도 9A, 9B 및 15A) 및 웨스턴 블롯에 의해 검출하였다. 본 발명자들은 인간 아포리포단백질 E의 농도가 평균적으로 총 단백질의 20 μg/mg에 도달하였음을 관찰하였으며 (도 9A), 이는 내인성 뮤린 apoE의 약 10％를 나타낸다 (도 9B). 인간 ApoE의 이 크지 않은 추가의 양의 존재는 내인성 뮤린 apoE 단백질의 수준을 검출가능하게 변경하지 않았다 (도 15A). 작지만 통계학적으로 유의한 감소가 AAV4 주사 2 내지 5개월 후에 관찰되었다 (도 15B). 그럼에도 불구하고, 인간 단백질의 수준은 대조군에 비해 검출가능하게 남아 있었으며, 이는 AAV4-매개된 형질도입이 실질 전반에 걸쳐 분비된 재조합 단백질의 지속된 생성을 위한 플랫폼을 제공하였음을 암시한다. 사실, 인간 ApoE 단백질을 내인성 뮤린 apoE 단백질이 축적되는 것으로 공지된 피질 막 전반에 걸쳐 APP/PS1 마우스의 아밀로이드 침착물 주위에서 검출할 수 있었다.
다음으로, 본 발명자들은 간질액 (ISF), 즉 또한 매우 생물학적 활성 Aβ 가용성 종을 함유하는 세포외 구획 중의 인간 ApoE의 존재를 평가하였다. 전체 뇌 용해물에서 검출된 상대적으로 소량의 ApoE 때문에, 본 발명자들은 몇몇 apoE KO 마우스를 각각의 AAV4-APOE 벡터로 주사하고, 매우 민감성이지만 비-종 특이적 항체를 사용하여 인간 단백질의 존재를 추적하였다. 미세투석 기술을 사용하여, 본 발명자들은 apoE KO 주사된 동물의 ISF 중의 ApoE의 존재를 확인하였다.
전체적으로, 이들 데이터는 AAV4의 단일 뇌실내 주사가 전체 뇌 실질 전반에 걸쳐 및 ISF 내에서 관심의 단백질의 지속된 생성을 초래하는 데 충분하였으며, 뇌실막/맥락 얼기가 잠재적으로 치료 단백질을 뇌로 전달하는 "생물학적 펌프"로서 사용될 수 있음을 확인시킨다.
ApoE 이소형의 주입은 아밀로이드 펩티드 및 플라크 침착에 차등적으로 영향을 준다
APP/PS1 마우스를 GFP 또는 다양한 ApoE 이소형을 발현하는 벡터로 안락사 전 5개월 동안 형질도입하였다. 아밀로이드 플라크 적하량의 분석은 5개월 후 APOE2를 발현하는 것에 비해 AAV4-APOE4로 주사된 동물의 피질에서 아밀로이드 침착물의 밀도의 유의한 증가가 관찰되었음을 밝혔다. AAV4-GFP 및 AAV4-APOE3 처리된 마우스에서의 플라크 밀도는 중간 수준으로 서로 상이하지 않았다 (도 16A).
포름산 추출물로부터 측정된 Aβ40 및 Aβ42 펩티드의 농도는 아밀로이드 플라크 함량에서 관찰된 변화를 모방하였으며, 5개월 후 아밀로이드 펩티드의 증가된 농도가 APOE4 대립유전자를 발현하는 마우스에서 발견되었고 (도 16B), APOE2로는 반대 효과가 검출되었다. TBS-가용성 분획 중의 Aβ40 및 Aβ42 펩티드의 함량은 각각의 AAV-APOE의 주사에 의해 유사하게 영향을 받았다 (도 16C). 또한, 응집된 및 가용성 Aβ 펩티드 사이의 비율은 ApoE 노출에 의해 변화되지 않고 남아 있으며, 이는 각각의 별개의 인간 ApoE 이소형이 섬유성 및 가용성 아밀로이드 종 둘 다를 공동으로 조절함을 암시한다.
단지 2개월 동안의 각각의 ApoE 이소형의 과발현은 5개월 연구에서 관찰된 것보다 작은 효과를 초래한다. 그럼에도 불구하고, 다른 실험 군에 비해 AAV4-APOE4 주사된 마우스의 피질 영역 내의 아밀로이드 플라크 밀도의 유의한 증가가 관찰되었다 (도 16A). 이는 포름산 분획에 함유된 Aβ의 양에 의해 평형화되었으며 (도 16C), 이는 이 특이적 변이체의 현저한 효과를 입증한다. TBS-가용성 Aβ40/42 종은 각각 AAV4-APOE2 또는 AAV4-APOE4를 2개월 동안 발현시켰을 경우 단지 보다 낮거나 보다 높은 경향을 나타내었다 (데이터는 도시하지 않음).
인간 ApoE 이소형의 존재가 Aβ의 섬유화의 정도의 초기 변화를 반영할 수 있는지를 측정하기 위해, 본 발명자들은 또한 주사 2개월 후 Bam10 (모든 아밀로이드 침착물을 표지화함) 및 Thio-S (단지 밀집 코어만을 염색함)를 사용하여 Aβ에 대한 양호한 면역염색 사이의 비율을 측정하였다. 3개의 이소형 중에서 변화가 검출되지 않았으며, 이는 이 기간에서 실험 군에 걸쳐 밀집 및 확산 아밀로이드 침착물 집단의 분포에 대한 차등적 효과가 없었음을 암시한다 (도 16B). 이들 데이터는 ApoE 변이체에의 보다 긴 노출이 보다 짧은 노출보다 아밀로이드 침착에 대해 보다 강한 효과를 가짐을 지시한다.
ApoE는 혈액-뇌 장벽을 통한 Aβ 수송에 역할을 하는 것으로 제안되었다. ApoE 이소형에의 노출이 혈액 뇌 장벽을 통해 Aβ 펩티드의 유출을 조절하는지를 시험하기 위해, Aβ40의 농도를 각각의 주사된 동물의 혈장에서 측정하였다. 본 발명자들은 뇌실내로 주사된 AAV4-APOE3 및 AAV4-APOE4 마우스 둘 다에서 인간 Aβ의 혈장 함량이 AAV4-APOE2 및 AAV4-GFP에 비해 낮았음을 관찰하였다 (도 10D). 이는 E3 및 E4 변이체 둘 다가 중추 신경계 구획에서 Aβ를 보유하는 것을 도움을 암시하며, 이는 관찰된 뇌 실질에서의 Aβ의 상대적으로 증가된 농도 및 ApoE로 인한 Aβ의 향상된 반감기를 암시하는 이전의 데이터와 일치한다.
APOE4 보유자는 신경혈관 기능이상에 보다 감수성이며, 혈액 뇌 장벽 고장은 최근 심지어 아밀로이드 침착의 부재 하에서 APOE4 형질전환 마우스에서 선호되는 것으로 나타났다. APP/PS에서의 AAV4-APOE의 뇌실내 주사가 BBB의 온전성을 절충할 수 있는지를 평가하기 위해, 프러시안 블루 (Prussian blue)로의 사후 염색을 수행하였다. 모든 군에서 뇌를 통해 드문드문 퍼진 소수의 헤모시데린 양성 초점 영역의 존재에도 불구하고, 동물의 임의의 실험 군 사이에 명백한 차이가 관찰되지 않았다.
ApoE 이소형의 발현은 아밀로이드증의 진행의 동역학을 조절한다
ApoE4는 아밀로이드 침착물의 증가된 밀도와 관련되는 반면, 5개월 후 ApoE2로는 반대 효과가 관찰되었다. 이는 아밀로이드 β 침착, 청소, 또는 둘 다의 속도의 변화를 반영할 수 있다. ApoE 변이체가 아밀로이드증의 동적 진행에 어떻게 영향을 주는지 평가하기 위해, 본 발명자들은 생체내 2-광자 화상화를 사용하고, 아밀로이드 플라크 형성 및 청소의 동역학을 추적하였다. 마우스는 7월령에서 AAV4 벡터로 뇌실내 주사를 받았으며, 제1 화상화 시즌 (T0)을 수행하기 위해 두개골 창을 주사 1주 후에 이식하였다. 1개월 (T1) 및 2개월(들) (T2) 후, 아밀로이드 침착물을 동일한 시야 영역에서 화상화하였다. 마우스를 제2 화상화 시즌 후 사후 분석을 위해 안락사시켰다.
대다수의 아밀로이드 침착물은 안정하게 남아 있었지만, 가끔씩 새로운 플라크를 2개월 기간에 걸쳐 작은 조망 부피에서 검출할 수 있었다. 더욱이, 드물게, 실험의 시작에 화상화된 메톡시-양성 플라크는 1 또는 2개월(들) 후에 검출할 수 없었으며, 이는 일부 플라크가 청소될 수 있었음을 암시한다. 시간 경과에 따라, 본 발명자들은 아밀로이드 침착물의 부피 밀도의 전체적인 증가를 관찰하였으며, T2에서의 밀도는 T1보다 평균적으로 23％ 크다. 아밀로이드 진행의 속도는 ApoE4 처리된 APP/PS1 마우스에서 보다 빠른 반면, ApoE2 노출된 동물은 2개월 후 GFP (0.66), ApoE3 (0.67) 및 ApoE4 (0.74)에 비해 유의하게 저감된 아밀로이드 침착물 밀도를 가졌다 (도 11A, 11B). 중요하게, ApoE2 변화는 직접적으로 및 처음으로 플라크의 비-면역 매개된 활성 청소를 나타내는 기준선으로부터의 감소를 반영한다. APOE 형질전환 동물로부터 얻어진 데이터와 대조적으로, 이들 결과는 ApoE의 양의 크지 않은 증가의 유도가 심지어 아밀로이드 침착이 이미 시작된 후에도 진행중인 아밀로이드형성 과정에 영향을 줄 수 있음을 입증한다.
본 발명자들은 다음으로 T1/T0 및 T2/T1 사이의 개별 침착물의 단면적의 비율을 측정함으로써 단일 아밀로이드 플라크 성장을 평가하였다. T1 (비율 T1/T0)에서 군 중에서 차이가 검출되었지만, T2 (비율 T2/T1, 도 12)에서는 그렇지 않았으며, 이는 인간 ApoE 변이체의 존재가 주로 노출 후 제1 개월 동안 플라크 성장에 영향을 주지만, 이 파라미터는 그 후에는 상이하지 않음을 암시한다. 특히, 아밀로이드 침착물의 크기는 ApoE2 및 ApoE3 둘 다에 비해 ApoE4 처리된 마우스에서 유의하게 크게 성장하였으며, 이는 플라크의 수 뿐만 아니라 그의 크기도 이 대립유전자에 의해 악화되었음을 암시한다. 따라서, ApoE4는 Aβ 펩티드의 시딩 뿐만 아니라 기존의 플라크의 크기 둘 다에 영향을 준다.
아밀로이드 침착물 주위의 시냅스 밀도는 ApoE2에 비해 ApoE3 및 ApoE4 이소 형에 의해 악화된다
시냅스 소실은 인지 손상과 가장 상관되는 파라미터이다. 본 발명자들은 최근 ApoE4의 존재가 인간 AD 환자의 뇌에서 시냅스 올리고머성 Aβ의 보다 높은 수준과 관련되며, ApoE3에 비해 아밀로이드 플라크 주위의 유의하게 감소된 시냅스 밀도를 초래함을 보였다 (R. M. Koffie et al ., Apolipoprotein E4 effects in Alzheimer's disease are mediated by synaptotoxic oligomeric amyloid-beta. Brain 135, 2155 (Jul, 2012); T. Hashimoto et al ., Apolipoprotein E, Especially Apolipoprotein E4, Increases the Oligomerization of Amyloid beta Peptide. J Neurosci 32, 15181 (Oct 24, 2012)). 또한, 최근의 시험관내 증거는 ApoE4가 Aβ 유도된 시냅스 소실에 대해 보호하는 데 실패하였음을 입증하였다 (M. Buttini et al., Modulation of Alzheimer-like synaptic and cholinergic deficits in transgenic mice by human apolipoprotein E depends on isoform, aging, and overexpression of amyloid beta peptides but not on plaque formation. J Neurosci 22, 10539 (Dec 15, 2002); A. Sen, D. L. Alkon, T. J. Nelson, Apolipoprotein E3 (ApoE3) but not ApoE4 protects against synaptic loss through increased expression of protein kinase C epsilon. J Biol Chem 287, 15947 (May 4, 2012)). 따라서, 본 발명자들은 각각의 ApoE 이소형의 연속적 및 확산 분포가 APP/PS 마우스의 뇌에서 Aβ 침착 및 청소의 동역학 뿐만 아니라 아밀로이드 침착물 주위의 시냅스의 온전성에도 차등적으로 영향을 줄 수 있음을 가설화하였다.
시냅스전 및 시냅스후 요소 (각각 시냅신-1 및 PSD95)의 밀도를 극박 조직 섹션의 면역형광 염색에 기초한 고-해상도 기술인 어레이 단층촬영을 사용하여 측정하였다 (K. D. Micheva, S. J. Smith, Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron 55, 25 (Jul 5, 2007); R. M. Koffie et al ., Oligomeric amyloid beta associates with postsynaptic densities and correlates with excitatory synapse loss near senile plaques. Proc Natl Acad Sci U S A 106, 4012 (Mar 10, 2009)). 아밀로이드 올리고머성 종은 아밀로이드 침착물의 가까운 부근에서 매우 농축되는 것으로 나타났기 때문에, 시냅신-1 및 PSD95 반점을 이전에 확립된 프로토콜 (R. M. Koffie et al ., Oligomeric amyloid beta associates with postsynaptic densities and correlates with excitatory synapse loss near senile plaques. Proc Natl Acad Sci U S A 106, 4012 (Mar 10, 2009))을 사용하여 플라크로부터 멀리 (> 50 μm) 또는 가까이 (< 50 μm) 정량화하였다. 본 발명자들은 플라크 근처의 시냅스전 요소의 소실이, AAV4-APOE2 또는 AAV4-GFP의 주사 후의 경우가 아닌 APOE3 또는 APOE4가 발현된 경우 악화되었음을 관찰하였다 (도 13A). 대조적으로, 시냅스후 반점의 밀도는 GFP, ApoE2 및 ApoE3 주사된 마우스 사이에서 변화하지 않고 남아 있었던 반면, ApoE4 처리된 동물은 아밀로이드 침착물 주위의 PSD95의 유의한 소실을 나타내었으며, 따라서 이는 Aβ의 신경독성 효과에 대한 ApoE4의 유해한 효과를 강화한다 (도 13C). 시냅스 요소의 밀도를 아밀로이드 침착물로부터 멀리 위치한 영역 (> 50 μm)에서 평가한 경우, 군 사이에서 차이를 검출할 수 없었으며, 이는 시냅스 밀도에 대한 인간 ApoE 변이체 자체의 효과는 없지만, Aβ에 대한 ApoE 이소형의 중요한 효과는 신경독성을 유도하였음을 암시한다. 따라서, ApoE3 및 ApoE4로 관찰된 상대적 시냅스 소실은 각각의 플라크 주위의 (그의 모서리로부터 50 μm 미만의 거리의) Aβ 펩티드의 존재와 직접적으로 관련된다.
추가의 신경병리학적 파라미터로서, 본 발명자들은 또한 AAV4 주사된 APP/PS1 마우스에서 아밀로이드 침착물과 관련된 신경염 이영양증의 수를 평가하였다. 그들 주위의 감소된 척주 밀도 외에, 노년 플라크는 또한 신경돌기 만곡의 증가 및 팽창된 이영양증의 출현과 함께 신경망의 보다 일반적인 변경을 유발한다. 이들 병리학적 변화는 아마도 플라크 표면의 50 μm 내의 영역에 풍부한 가용성 올리고머성 Aβ 종에 기인한다. 본 발명자들은 ApoE4의 과발현이 GFP, ApoE2 및 ApoE3에 비해 아밀로이드 침착물과 관련된 SMI312-양성 신경염 이영양증의 형성을 악화시킴을 관찰하였다 (도 13C). 이 결과는 ApoE4 이소형이 가장 강한 효과를 갖고, 플라크 형성을 조절할 뿐만 아니라 아밀로이드 관련된 신경독성에 영향을 준다는 관찰을 확인시킨다.
인간 ApoE 단백질은 AD의 또다른 마우스 모델에서 간질액에 함유된 올리고머 성 Aβ 종의 양을 개질한다
본 발명자들은 다음으로 ISF 내의 상이한 ApoE 이소형의 존재가 동일한 세포외 구획 중의 가용성 아밀로이드 종의 양을 변경시킬 수 있는지 여부의 질문을 다루었다. 본 발명자들은 상이한 형질전환 마우스 주에서의 본 발명자들의 이전의 발견을 확인하기 위해 AD의 또다른 마우스 모델인 Tg2576 마우스를 주사하는 것을 선택하였다. Tg2576 마우스는 스웨덴 돌연변이를 함유하는 APP의 돌연변이된 형태를 과발현하며, 주어진 연령에서 APP/PS1 마우스보다 훨씬 온건한 표현형을 나타낸다. 본 발명자들은 아밀로이드 침착물이 AAV4-APOE 형질도입의 때에 이미 존재하도록 16 내지 18월령 동물의 코호트를 주사하였다. 유전자 전달 3개월 후, 미세투석 프로브를 해마 내로 삽입하고, 샘플을 수집하여 ISF 내의 각각의 APOE 변이체와 관련된 초기 변화를 특성화하였다.
본 발명자들은 특이적 82E1/82E1 ELISA 검정을 사용하여 측정된 Aβ 올리고머성 종의 농도가 AAV4-APOE2에 비해 AAV4-APOE4의 주사 후에 유의하게 보다 높았음 (42±7％까지)을 관찰하였으며 (도 14), 이는 ApoE의 존재가 이 세포외 구획에서 아밀로이드 응집체의 성질을 조절할 수 있음을 암시한다. 더욱이, 총 Aβ40 및 Aβ42를 ISF에서 평가한 경우, 동일한 경향이 관찰되었지만, 유의성에 도달하지는 않았으며 (도 17A), 이는 ISF 중의 상이한 ApoE 이소형의 존재가 다소 총량 초과로 아밀로이드 펩티드의 응집 상태에 영향을 줌을 암시한다.
예상된 바와 같이, 다양한 ApoE 이소형에 노출된 Tg2576 마우스로부터의 뇌의 사후 생화학적 분석은 포름산 분획 중의 Aβ42의 농도가 ApoE4 처리된 동물에서 유의하게 증가하였음을 나타내었으며 (도 17B), 이는 제2 형질전환 모델에서 APP/PS1 마우스에서의 본 발명자들의 관찰을 확인시킨다.
함께 취하여, 이들 생화학적 측정치는 Tg2576 마우스에서의 ApoE 발현이 APP/PS1 마우스에서 관찰된 바와 유사한 아밀로이드 생물학의 변화를 유도함을 암시한다. 중요하게, 초기 변화는 ISF 내의 oAβ의 함량에서 관찰되며, 여기서, 이들 신경독성 종은 시냅스 말단과 직접적으로 상호작용할 수 있다.
논의
APOE4 대립유전자 증가 위험의 유전 및 AD의 발달에 대한 극적인 반대 효과를 갖는 APOE2 대립유전자 사이의 현저한 관련성은 이 위험이 어떻게 매개되는지에 대한 여러가지 제안을 초래하였다. ApoE는 Aβ 청소에 관여하는 Aβ 결합 단백질로서 연관되었다. 하지만, apoE 넉아웃 마우스에서의 연구는 놀랍게도 Aβ 침착물이 apoE의 부재 하에서 실질적으로 보다 낮았음을 보고하였다. 인간 APOE2, APOE3 또는 APOE4로의 대체는 AD 환자에서와 동일한 정도로 증가하는 아밀로이드 침착물을 초래하였으며, 이는 플라크 개시 또는 섬유 형성에 대한 효과를 통해 일어나는 것으로 상정되었다. 대안적인 가설은 신경염 돌출에 대한 차등적 효과에 초점을 맞추거나, 심지어 알츠하이머병 표현형에 대한 APOE 유전자형의 효과가 염색체 19 상의 APOE와의 유전적 불평형에 있는 또다른 유전자의 결과임을 제안한다.
리소좀 저장 질환 및 헌팅톤병의 설정에서 이전에 시험된 접근법을 사용한 2개의 상이한 마우스 모델의 연구로부터 유도된 본 발명자들의 데이터는 생체내 다중광자 화상화, 표준 정량적 면역조직병리학, 시냅스 구조의 어레이 단층촬영 연구, 및 올리고머성 Aβ의 검사를 허용하는 신규한 고분자량 미세투석 접근법의 조합을 사용함으로써 이들 쟁점을 직접적으로 다루었다. 본 발명자들은 확립된 질환을 갖는 동물에서 ISF ApoE 미세환경을 변화시키는 것이 Aβ 경제성에 대한 현저하며 급속한 대립유전자 특이적 효과를 가짐을 보였다. 본 발명자들의 연구는 ISF에 전달된 ApoE4 수준의 심지어 크지 않은 (약 10％) 증가가 증가된 가용성 Aβ 뿐만 아니라 섬유성 및 포름산 추출가능한 형태의 ApoE4 관련된 체류와 함께 Aβ 표현형 및 청소 동역학에 현저하게 영향을 주며, 시냅스 소실 및 증가된 신경염 이영양증에 의해 뚜렷한 플라크 주위의 신경독성을 증가시킴을 입증하였다. 반대로, apoE2는 Aβ를 감소시키며, 뚜렷한 신경보호 효과를 갖는다.
ISF ApoE의 수준의 크지 않은 변화가 이러한 극적인 결과를 갖기 때문에, 이들 결과는 APOE 발현에 영향을 줌으로써 AD에 대한 위험 또는 AD의 진행을 변경할 수 있는 폭넓게 다양한 환경적 및 유전적 인자의 효과로의 통찰을 초래할 수 있다. 실질적으로 본 발명자들이 입증한 규모 초과의 ApoE의 증가는 외상, 간질, 허혈 및 고 콜레스테롤 식이 후에 일어날 수 있으며, 이들 모두는 상승된 뇌 Aβ와 관련되었다. 더욱이, APOE4 대립유전자와 유전적 불평형에 있는 것으로 이전에 밝혀진 프로모터 다형성은 APOE 발현에 영향을 준다.
CNS에서 ApoE 또는 ApoE-리포단백질 항상성에 영향을 주는 다른 조작은 명백하게 Aβ 침착을 변화시킨다. 예를 들어, APOE 렌티바이러스로의 초점 유전자 전달을 갖는 실험에서 (주로 해마 뉴런에서), APOE4 과발현은 APOE3에 비해 아밀로이드에 대한 보다 강한 효과를 발휘한다. 이전의 연구는 또한 내인성 apoE 합성을 향상시키는 것을 비롯한 여러가지 효과를 갖는 RXR 효능제가 아마도 혈액 뇌 장벽을 통한 청소에 대한 효과에 의해 뇌로부터의 Aβ의 청소를 초래함을 나타내었다. 또한, CNS에서 콜레스테롤을 대사하며 그의 수준을 저하시키는 CYP46A의 뇌 형질도입은 apoE 수준을 감소시키는 것으로 공지된 뇌 중의 LDL-R의 용량 증가에 따라 Aβ 침착을 저감시킨다. 마지막으로, 유전적 조작은 apoE 발현을 반으로 변화시키는 것이 Aβ 표현형에 영향을 줄 수 있음을 암시한다. 본 발명자들의 결과는 흥미롭게도 보다 크지 않은 변화가 또한 극적인 효과를 가질 수 있음을 암시한다.
본 발명자들의 데이터는 APOE-알츠하이머 문헌에서의 논란의 4가지 다른 중요한 영역을 직접적으로 다룬다. 1) 본 발명자들은 둘 다 아마도 뉴런계 기능의 손상과 관련되는 시냅스 소실 및 신경염 이영양증에 의해 평가된 신경독성에 대한 ApoE 이소형의 명백한 효과를 입증한다. 이들 효과는 플라크 바로 부근에서 명백하지만, 플라크로부터 먼 영역에서는 그렇지 않기 때문에, ApoE4에 비해 ApoE2의 시냅스 보호 성질은 아마도 시냅스 안정성에 대한 ApoE의 직접적 효과로 인한 것이라기 보다는 플라크-주위 Aβ에 대한 효과에 의해 매개된다. 2) 종적 다중광자 생체내 화상화를 사용한 플라크 침착 및 성장의 동역학의 직접적 관찰은 ApoE4가 플라크 침착 및 성장을 향상시키는 반면, ApoE2는 사실상 플라크의 분해와 관련됨을 나타내며 - 이는 ApoE 이소형이 섬유성 플라크 형성에 대한 초기 효과를 넘어 질환의 속도 및 진행에 강력한 영향을 가짐을 논증한다. 결과는 ApoE4가 아밀로이드 침착 및 신경독성 둘 다의 관점에서 질환 과정을 가속화할 수 있는 (따라서, 발병의 보다 빠른 연령을 초래함) 반면, ApoE2는 반대로 작용한다는 생각을 강화시키며, 이는 CNS 내로의 ApoE2 (또는 ApoE2 모방체)의 도입이 심지어 질환이 잘 확립된 후에도 치료적 가치를 가질 수 있다는 가능성을 제기한다. 3) ApoE는 뇌로부터 Aβ를 청소하는 메커니즘으로서 또는 청소 반감기를 증가시키는 체류 분자로서 다양하게 제안되었다; 본 발명자들의 현재 결과는 ISF 내로의 ApoE의 크지 않은 양의 도입이 이것이 ApoE2가 아니라면 CNS에서의 Aβ의 체류를 향상시키는 데 충분함을 나타낸다. 4) AD에서의 APOE2의 현저한 보호 작용의 메커니즘은 오래도록 불명확하였으며, 이는 부분적으로 ApoE2가 ApoE 수용체와 상대적으로 빈약하게 결합하기 때문이다. 본 발명자들의 현재 데이터는 ApoE2가 혈장 내로의 Aβ 청소에 대한 아마도 중성 또는 널 (null) 효과 외에 유익한 기능 - 확립된 Aβ 침착물을 사실상 반전시킬 수 있을 뿐만 아니라, 시냅스 및 신경염 가소성을 지지할 수 있음 - 을 가짐을 암시한다. 이는 APOE4 및 APOE2 대립유전자가 유전된 환자 사이에서 발병의 연령의 수십 년 차이가 Aβ 침착 및 청소의 동역학의 상이한 개시점 및 연속적 차이 둘 다 뿐만 아니라 침착물과 관련된 신경독성의 정도의 대립유전자 특이적 차이를 반영할 수 있음을 암시한다. ApoE2의 이 이중 기능은 그의 플라크 청소 및 시냅스 복원 능력을 모방하는 것을 목표로 하는 치료적 접근법을 초래할 수 있다.
이들 결과는 apoE가 Aβ 올리고머화에 대한 스캐폴드로서 작용하는 모델, 올리고머성 Aβ의 형성 및 안정화의 효능 ApoE4>ApoE3>ApoE2, 및 올리고머성 Aβ가 AD를 갖는 ApoE4 >ApoE3 인간 환자의 CNS에서 상승된다 (심지어 플라크 적재량이 경우를 통해 정상화된 경우에도)는 본 발명자들의 최근의 관찰과 일치한다. ApoE, 특히 ApoE4가 신경독성 올리고머성 Aβ의 형성을 매개하는 경우, 본 발명자들은 현재 데이터에서의 경우인 것으로 보이는 바와 같이, 향상된 ApoE4가 증가된 시냅스 및 신경염 변경을 초래할 것이라고 예측하였다. 이들 결과에 기초하여, APOE4 대립유전자가 유전된 AD를 갖는 환자에서 뇌 중의 ApoE 수준을 증가시키는 제제에 대해 주의가 기울여져야 한다.
마지막으로, 본 발명자들의 데이터는 분비된 단백질을 뇌에, 및 여기서 전체 피질 막에 전달하는 뇌실막의 AAV 매개된 형질도입의 능력을 확인시킨다. apoE4를 감소시키거나 apoE2를 증가시키는 유전자 전달 또는 다른 접근법은 AD 질환 진행에 영향을 주는 강력한 수단이다.
물질 및 방법
동물 . APPswe/PS1dE9 (APP/PS1) 이중 형질전환 마우스 (D. R. Borchelt et al., Accelerated amyloid deposition in the brains of transgenic mice coexpressing mutant presenilin 1 and amyloid precursor proteins. Neuron 19, 939 (Oct, 1997)) (미국 메인주 바 하버에 소재하는 잭슨 래버러토리 (Jackson laboratory)로부터 얻음) 및 Tg2576 마우스 (K. Hsiao et al ., Correlative memory deficits, Abeta elevation, and amyloid plaques in transgenic mice. Science 274, 99 (Oct 4, 1996)) 둘 다를 사용하여 실험을 수행하였다. 스웨덴 이중 돌연변이 K594N/M595L을 함유하는 인간 돌연변이체 아밀로이드 전구체 단백질 유전자를 프리온 단백질 프로모터의 제어 하에서 이들 2개의 마우스 주의 게놈에 삽입하였다. 또한, APP/PS1 마우스 모델은 엑손 9에 대해 결실된 프레세닐린 (Presenilin) 1 유전자의 변이체 (동일한 프로모터에 의해 유도됨)를 과발현한다. APP/PS1 마우스에서의 APPswe 및 PSEN1의 공동 과발현은 보다 심각한 표현형을 초래하며, 실질적인 아밀로이드 침착은 6월령만큼 빨리 볼 수 있다. 한편, Tg2576 마우스 주는 단지 1연령 경에 아밀로이드 플라크를 발달시키는 훨씬 온건한 모델이다. 상이한 ApoE 이소형의 도입이 질환의 진행에 영향을 주는지를 측정하기 위해, 본 발명자들은 7월령 및 16월령 APP/PS1 (상태 당 4 내지 7 동물) 및 Tg2576 (상태 당 3 내지 5 동물) 마우스를 각각 주사하였다. APOE-결함성 마우스 (ApoE-KO, 잭슨 래버러토리, 미국 메인주 바 하버)를 또한 사용하였다. 실험은 NIH 및 기관의 지침에 따라 수행하였다.
바이러스 벡터 구축 및 생성
APOE -2, -3 및 -4 cDNA는 유니버시티 오브 일리노이 (University of Illinois) (미국 시카고)의 라두 (LaDu) 박사에 의해 관대하게 제공되었다. PCR에 의한 증폭 후, 이들 각각을 BamHI에 의해 소화시키고, AAV2-pCMV-hrGFP 골격 내로 삽입하였다. 고 역가의 AAV 혈청형 4 벡터 (AAV4-APOE2, AAV4-APOE3, AAV4-APOE4 및 AAV4-GFP)를 미국 아이오와 시티에 소재하는 유니버시티 오브 아이오와 (University of Iowa)의 유전자 전달 벡터 코어 (Gene Transfer Vector Core)에 의한 바쿨로바이러스 시스템을 사용하여 생성하였다. 바이러스를 정량적 PCR을 사용하여 역가측정하였다.
정위적 뇌실내 주사 . AAV 혈청형 4 벡터의 정위적 뇌실내 주사를 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다 (T. L. Spires et al ., Dendritic spine abnormalities in amyloid precursor protein transgenic mice demonstrated by gene transfer and intravital multiphoton microscopy. J Neurosci 25, 7278 (Aug 3, 2005); G. Liu, I. H. Martins, J. A. Chiorini, B. L. Davidson, Adeno-associated virus type 4 (AAV4) targets ependyma and astrocytes in the subventricular zone and RMS. Gene Ther 12, 1503 (Oct, 2005)). 동물을 케마틴/크실라진 (각각 100 mg/kg 및 50 mg/kg 체중)의 복강내 주사에 의해 마취시키고, 정위적 프레임 (데이빗 코프 인스트루먼츠 (David Kopf Instruments), 미국 캘리포니아주 터헝가) 상에 위치시켰다. 벡터의 주사를 10-μl 해밀톤 (Hamilton) 주사기 (해밀톤 메디컬 (Hamilton Medical), 미국 네바다주 레노)에 부착된 33-게이지 샤프 마이크로피펫을 사용하여 0.25　μl/분의 속도로 바이러스 제제 5 μl (역가 2×1012 vg/ml)로 각각의 측면 뇌실에서 수행하였다. 주사 부위의 정위적 좌표를 정수리점으로부터 계산하였다 (전후 +0.3 mm, 내외측 ±1 mm 및 등배 -2 mm).
두개골 창 이식 및 다중광자 화상화. 뇌실내 주사 1주 후, 마우스를 이소플루란 (1.5％)으로 마취시키고, 한 조각의 두개골을 제거하고, 이를 8 mm 직경의 유리 커버슬립으로 대체함으로써 두개골 창을 이식하였다 (이전에 기재된 바와 같음, T. L. Spires et al ., Dendritic spine abnormalities in amyloid precursor protein transgenic mice demonstrated by gene transfer and intravital multiphoton microscopy. J Neurosci 25, 7278 (Aug 3, 2005)). 화상화를 위해, 왁스 링을 창의 경계를 따라 설치하여 대물렌즈 (20× 대물렌즈, 0.95의 수치 구경, 올림푸스 (Olympus))에 대한 물의 웰을 생성하였다. 아밀로이드 침착물을 가시화하기 위해, 형질전환 동물은 수술 24시간 전 메톡시-XO4 (5 mg/kg), 즉 혈액-뇌 장벽을 횡단하고 아밀로이드 침착물에 결합하는 형광 화합물을 복강내 주사 받았다 (B. J. Bacskai, W. E. Klunk, C. A. Mathis, B. T. Hyman, Imaging amyloid-beta deposits in vivo. J Cereb Blood Flow Metab 22, 1035 (Sep, 2002)). 화상화 전, 텍사스 레드 덱스트란 (70,000 Da 분자량; 멸균 PBS 중 12.5 mg/ml; 몰리큘라 프로브스 (Molecular Probes), 미국 오레곤주 유진)을 측면 꼬리 정맥 내로 주사하여, 혈관구조의 형상은 시간 경과에 따라 정확한 동일한 시야 영역을 추적하는 표식으로서 사용되도록 형광 혈관촬영도를 제공하였다. 아밀로이드 침착물의 기준선 수준을 평가하기 위해 마우스를 AAV 주사 1주 후에 화상화하고, 그 후 주사 1개월 및 2개월(들) 후에 화상화하였다.
다중광자 화상화 시스템 (바이오-래드 (Bio-Rad) 1024ES, 바이오-래드, 미국 캘리포니아주 허큘레스) 상에 실장된 모드-잠금된 Ti:사파이어 레이저 (마이타이 (MaiTai), 스펙트라-피직스 (Spectra-Physics), 미국 캘리포니아주 마운틴 뷰)는 860 nm 2-광자 형광 여기 광을 생성하였다. 방출된 광을 3개의 광전자증배관 (하마마츠 포토닉스 (Hamamatsu Photonics), 미국 뉴저지주 브리지워터)을 함유하는 주문-제작 외부 검출기를 통해 380 내지 480, 500 내지 540 및 560 내지 650 nm의 범위로 수집하였다. 2-색상 화상을 플라크 및 혈관촬영에 대해 동시에 획득하였다. 저 배율 생체내 화상 (615 × 615 μm; z-단계, 2 μm, 깊이, 약 200 μm)을 획득하고, 큰 피질 영역을 커버하도록 6 내지 8개의 시야 영역을 화상화하였다.
화상 가공 및 분석. 각각의 시야 영역에서의 플라크의 밀도를 화상화된 피질의 부피 당 아밀로이드 침착물의 총 수를 보고함으로써 이미지 제이 (Image J)를 사용하여 정량화하였다. 본 발명자들은 피질 부피가 표면의 z-스택의 첫번째 슬라이스에서 시작하여 아밀로이드 침착물이 검출될 수 있는 마지막 슬라이스까지인 것으로 간주하였다. 아밀로이드 침착물의 크기를 2-차원 투사 후의 최대 강도로부터 그의 단면적을 측정함으로써 시간 경과에 따라 평가하였다. 각각의 플라크에 대해, 초기 시점 및 제1 개월 사이 (T1/T0), 또는 제2 및 제1 개월 사이 (T2/T1)의 면적의 비율을 계산하였다.
다중광자 현미경의 설정 (레이저 파워 및 PMT)을 실험의 전체 시간 동안 상이한 화상 시즌 전반에 걸쳐 변화하지 않게 유지하였다.
생체내 미세투석 샘플링. 뇌 간질 Aβ 및 ApoE의 생체내 미세투석 샘플링을 각각의 AAV4의 뇌실내 주사 3개월 후 Tg2576 마우스에 대해 수행하였다 (S. Takeda et al ., Novel microdialysis method to assess neuropeptides and large molecules in free-moving mouse. Neuroscience 186, 110 (Jul 14, 2011)). 미세투석 프로브는 3.0 mm, 1000 kDa 분자량 컷오프 (MWCO) 폴리에틸렌 (PE) 막 (PEP-4-03, 에이콤 (Eicom), 일본 교토)을 갖는 4 mm 샤프트를 가졌다. 사용 전에, 프로브를 이를 에탄올에 침지시킨 후, 0.2-μm 공극 크기 막을 통해 여과된 인공 뇌척수액 (aCSF) 관류 완충액 (mM로: 122 NaCl, 1.3 CaCl2, 1.2 MgCl2, 3.0 KH2PO4, 25.0 NaHCO3)으로 세척함으로써 컨디셔닝하였다. 예비컨디셔닝된 프로브의 출구 및 입구를 플루오르화 에틸렌 프로필렌 (FEP) 튜브 (Φ 250 μm 내경)를 사용하여 각각 연동 펌프 (ERP-10, 에이콤, 일본 교토) 및 미세주사기 펌프 (ESP-32, 에이콤, 일본 교토)에 연결하였다.
프로브 이식을 약간의 변형으로 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다 (S. Takeda et al ., Novel microdialysis method to assess neuropeptides and large molecules in free-moving mouse. Neuroscience 186, 110 (Jul 14, 2011; J. R. Cirrito et al ., In vivo assessment of brain interstitial fluid with microdialysis reveals plaque-associated changes in amyloid-beta metabolism and half-life. J Neurosci 23, 8844 (Oct 1, 2003)). 간략하게, 마취된 동물 (1.5％ 이소플루란)을 가이드 카눌라 (PEG-4, 에이콤, 일본 교토)로 해마 (정수리점 -3.1 mm, -2.5 mm 측면에서 중간선, -1.2 mm 복부에서 경막)에서 정위적으로 이식하였다. 그 후, 가이드를 2성분 치과용 시멘트를 사용하여 두개골에 고정하였다.
가이드 카눌라 이식 4일 후, 마우스를 표준 미세투석 케이지에 정치시키고, 프로브를 가이드를 통해 삽입하였다. 프로브의 삽입 후, 안정한 기록을 얻기 위해, 샘플 수집 전 프로브 및 연결 튜브를 aCSF로 240분 동안 10 μl/분의 유속으로 관류하였다. 샘플을 0.25 (Aβ 정량화를 위해) 및 0.1 μl/분 (ApoE 검출을 위해)의 유속으로 수집하였다. 샘플을 4℃에서 폴리프로필렌 튜브에 저장하였다. 미세투석 샘플 수집 동안, 마우스를 깨우고, 프로브 어셈블리 (아트모스 (Atmos)LM 미세투석 시스템, 에이콤, 일본 교토) 상에 압력을 가하지 않고 동물의 비제한된 운동을 허용하도록 설계된 미세투석 케이지에서 자유-운동하게 하였다.
면역조직학적 분석. APP/PS1 마우스를 뇌실내 주사 2 또는 5개월 후 (단기 및 장기 노출) CO2 흡입에 의해 안락사시킨 반면, Tg2576 동물은 3개월 후에 희생시켰다. 하나의 전체 뇌 반구를 면역조직학적 분석을 위해 인산염 완충 염수 중 4％ 파라포름알데히드 중에서 고정하고, 파라핀 왁스에 끼웠다. 정면 피질을 통한 1 mm 관상 섹션을 어레이 단층촬영 검정을 위해 가공한 반면, 뇌반구의 나머지는 생화학적 및 생체분자 분석을 수행하기 위해 스냅 동결하였다.
아밀로이드 침착물을 검출하기 위해, ApoE 및 GFP, 파라핀-끼워진 섹션 (10 μm)을 순차적으로 크실렌 중에서 탈파라핀화하고, 에탄올 중에서 재수화시키고, 시트레이트 완충액 (10 mM 시트르산나트륨, 0.05％ 트윈 20, pH 6.0) 중에서 처리하고, 0.5％ 트리톤 (Triton)을 갖는 PBS 중에서 투과시키고, 3％ BSA를 갖는 PBS 중에서 실온에서 2시간 동안 블로킹하였다. 1차 항체로 인큐베이션을 4℃에서 밤새 수행하였다: 아밀로이드 플라크에 대해 Bam10 (시그마 (SIGMA) 1:1000) 및 R1282 (1:500, 데니스 셀코에 (Dennis Selkoe) 박사에 의해 제공됨), 인간 ApoE에 대해 마우스 모노클로날 항체 3H1 (오타와 하트 인스티튜트 (Ottawa Heart Institute)), 신경염 이영양증에 대해 닭 항-GFP (1:500, 아베스 (Aves)) 및 SMI-312 (코반스 (Covance)). 2차 항체로의 인큐베이션을 다음날 실온에서 2시간 동안 수행하였다. 아밀로이드 밀집 코어 플라크를 마운팅 전 슬라이스를 50％ 에탄올 중 Thio-S (시그마, 미국 미주리주 세인트 루이스) 0.05％의 용액 중에서 8분 동안 인큐베이션함으로써 표지하였다.
어레이 단층촬영을 위한 샘플 제조, 면역염색 및 화상 분석
시냅스전 및 시냅스후 요소에 대한 어레이 단층촬영 분석을 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다 (R. M. Koffie et al ., Oligomeric amyloid beta associates with postsynaptic densities and correlates with excitatory synapse loss near senile plaques. Proc Natl Acad Sci U S A 106, 4012 (Mar 10, 2009)). 간략하게, 뇌실 영역에 인접한 한 조각의 피질 조직 (1 mm3)을 절개하고, 0.01M PBS 중 4％ 파라포름알데히드, 2.5％ 수크로스 중에서 3시간 동안 고정하였다. 에탄올 중에서의 탈수 후, 샘플을 4℃에서 밤새 LR 화이트 (White) 수지 (일렉트론 마이크로스코피 사이언시즈 (Electron Microscopy Sciences)) 중에서 인큐베이션한 후, 53℃에서 중합하였다. 그 후, 섹션의 리본 (70 nm)을 점보 히스토 다이아몬드 나이프 (Jumbo Histo Diamond Knife) (다이아톰 (Diatome))를 사용함으로써 울트라컷 마이크로톰 (레이카 (Leica)) 상에서 절단하였다.
TBS 중 50 mM 글리신 중에서 5분 동안 재수화 후, 섹션을 트리스 중 0.05％ 트윈 및 0.1％ BSA 중에서 5분 동안 블로킹하고, 1차 항체를 블로킹 완충액 중에서 2시간 동안 1:50으로 적용하였다 (올리고머성 Aβ 항체를 우선적으로 염색하는 PSD95 앱캠 (Abcam) Ab12093, 시냅신 I 밀리포어 (Millipore) AB1543 및 버지니아 리 (Virginia Lee) 박사로부터의 NAB61, E. B. Lee et al., Targeting amyloid-beta peptide (Abeta) oligomers by passive immunization with a conformation-selective monoclonal antibody improves learning and memory in Abeta precursor protein (APP) transgenic mice. J Biol Chem 281, 4292 (Feb 17, 2006)). 슬라이드를 TBS로 세척하고, 2차 항체를 적용하였다 (항 염소- 알렉사 플루오르 (Alexa Fluor) 488, 항-마우스 Cy3, 또는 항 마우스 알렉사 플루오르 488 인비트로젠 (Invitrogen)). 화상을 정면 피질을 통해 7 내지 30개의 일련의 섹션 상에서 얻고, 차이스 액시오플랜 (Zeiss Axioplan) LSM510 공초점/다중광자 현미경 (63x 수치 구경 플랜 아포크로마틱 (Plan Apochromatic) 오일 대물렌즈)을 사용함으로써 획득하였다.
화상을 이미지 제이 (국립 보건원 개방 소프트웨어) 및 MATLAB (매쓰웍스 (Mathworks))를 사용하여 이전에 기재된 바와 같이 분석하였다 (R. M. Koffie et al ., Oligomeric amyloid beta associates with postsynaptic densities and correlates with excitatory synapse loss near senile plaques. Proc Natl Acad Sci U S A 106, 4012 (Mar 10, 2009)). 화상의 각각의 세트를 스택으로 전환시키고, 이미지 제이 멀티스택레그 (MultiStackReg) 및 스택레그 (StackReg) 플러그-인 (브래드 부스 (Brad Busse) 및 피. 테베나즈 (P. Thevenaz)의 기증, 스탠포드 유니버시티 (Stanford University))을 사용함으로써 정렬하였다. 기지의 부피를 선택하고, 자동화 역치-기재 검출 프로그램을 사용하여 하나 초과의 연속적 섹션에서 나타난 PSD95 및 시냅신 반점 둘 다를 카운트하였다 (워터쉐드 (WaterShed) 프로그램, 브래드 부스, 스티븐 스미쓰 (Stephen Smith), 및 크리스티나 미쉐바 (Kristina Micheva)에 의해 제공됨, 스탠포드 유니버시티). 워터쉐드는 어레이의 하나 초과의 슬라이스에 존재한 반점을 나타내는 (각각의 채널로부터 별개의) 역치 화상 스택을 내보내었다. 피질 중의 몇몇 부위를 마우스 당 샘플링하고, 플라크의 모서리로부터의 그의 거리를 측정하였다.
Aβ 정량화
TBS 가용성 분획, 포름산 분획 뿐만 아니라 미세투석물 중의 Aβ40 및 Aβ42의 농도를 BNT-77/BA-27 (Aβ40에 대해) 및 BNT-77/BC-05 (Aβ42에 대해) 샌드위치 ELISA (와코 퓨어 케미컬 인더스트리즈 (Wako Pure Chemical Industries), 일본 오사카)에 의해 제조자의 지시서에 따라 측정하였다. 샘플 중의 올리고머 Aβ의 양을 동일한 N-말단 (잔기 1 내지 16) 항체를 캡처 및 검출 둘 다에 사용한 82E1/82E1 샌드위치 ELISA (이뮤노-바이올로지컬 래버러토리즈, 인코포레이티드 (Immuno-Biological Laboratories, Inc), 독일 함부르크)에 의해 측정하였다 (W. Xia et al ., A specific enzyme-linked immunosorbent assay for measuring beta-amyloid protein oligomers in human plasma and brain tissue of patients with Alzheimer disease. Arch Neurol 66, 190 (Feb, 2009)).
이뮤노블롯 분석
뇌 TBS-가용성 분획 및 미세투석물 (20 μg 단백질)을 SDS-PAGE용 MOPS 구동 완충액 (인비트로젠) 중 4 내지 12％ 노벡스 비스-트리스 (Novex Bis-Tris) 겔 (인비트로젠) 상에서 전기영동시켰다. 겔을 PVDF 막으로 옮기고, 5％ 밀크 (Milk) / TBS-T 중에서 실온에서 60분 동안 블로킹하였다. 막을 염소 항-ApoE 항체 (1:1000, 밀리포어, AB947)로 탐침화하여 APOE 널 동물의 ISF 중의 소량의 APOE를 검출한 반면, 알부민을 대조군으로서 검출하였다. 인간 및 마우스 ApoE에 대한 블롯을 각각 EP1373Y 항체 (1:1000, 노부스 바이올로지컬즈 (Novus Biologicals), NB110-55467) 및 토끼 폴리클로날 apoE 항체 (1:1000, 앱캠, ab20874)로 탐침화하였다. HRP-컨쥬게이션된 염소 IgG 항체 (Vector (벡터))로 인큐베이션을 2시간 동안 수행하였다. 면역반응성 단백질을 ECL 키트 (웨스턴 라이트닝 (Western Lightning), 퍼킨엘머 (PerkinElmer))를 사용하여 전개하고, 하이퍼필름 (Hyperfilm) ECL (지이 헬스케어 (GE healthcare)) 상에서 검출하였다.
qRT - PCR
뇌 샘플로부터의 총 RNA를 트리졸 (TRIzol)® 시약 (라이프 테크놀로지즈 (Life technologies); 15596-026)을 사용하여 추출한 후, cDNA를 수퍼스크립트 (SuperScript)® III 원-스텝 RT-PCR 시스템 (One-Step RT-PCR System) (라이프 테크놀로지즈; 12574-018) 제조자 지시서에 따라 합성하였다. PCR 프라이머를 특이적으로 설계하여 재조합 인간 APOE mRNA 및 내인성 Apoe 및 Gapdh mRNA를 증폭시켰다 (Apoe 전방향: 5'-AGCTCCCAAGTCACACAAGA　; Apoe 역방향: 5'- GTTGCGTAGATCCTCCATGT　; APOE 전방향: 5'- CCAGCGACAATCACTGAAC　; APOE 역방향: 5'- GCGCGTAATACGACTCACTA; Gapdh 전방향: 5'- ATGACATCAAGAAGGTGGTG 및 Gapdh 역방향: 5'- CATACCAGGAAATGAGCTTG).
APOE ELISA
특이적 ELISA 검정을 사용하여 인간 및 내인성 뮤린 APOE 단백질 둘 다를 검출하였다. 간략하게, ELISA 플레이트를 염소 항-APOE 항체 (뮤린 APOE를 검출하기 위해) 1.5 ug/ml 또는 WUE4 항체 (인간 APOE를 검출하기 위해) 1.5 ug/ml로 밤새 코팅하고, 37℃에서 1.5시간 동안 PBS에 희석된 1％ 비-지방 밀크로 블로킹하였다. 인간 재조합 apoE 단백질을 표준물로서 (인간-특이적 검정을 위해, 바이오비젼 (Biovision)) 또는 뇌 추출물로부터의 인-하우스 마우스 표준물로서 (뮤린 특이적 검정을 위해) 사용하고, 샘플을 ELISA 완충액 (PBS 중 0.5％ BSA 및 0.025％ 트윈-20)에 희석하고, 밤새 인큐베이션하였다. 세척 후, 인간 (염소-apoe 밀리포어; 1:10,000) 또는 마우스 (앱캠 ab20874; 1:2,000)에 대해 특이적인 검출 항체를 각각 사용한 후, 적절한 HRP-컨쥬게이션된 2차로 1.5시간 인큐베이션하였다. 신호의 시현을 TMB 기질을 사용하여 수행한 후, 용액을 H3PO4를 사용하여 중지시켰다. 비색 결과를 450 nm에서 측정하였다.
통계학적 분석
통계학적 분석을 프리즘 (Prism) 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. 샘플의 작은 크기 때문에, 정상화는 대부분의 분석에 대해 가정될 수 없었다. 모든 사후 분석을 위해, 비모수 크루스칼-월리스 (Kruskal-Wallis) 시험, 그 후 던 다중 비교 시험 (Dunn's Multiple Comparison Test)을 수행하여 주사된 각각의 벡터의 효과를 평가하였다. 아밀로이드 진행의 생체내 화상화 데이터를 마우스에 대해 랜덤 효과, 및 벡터에 대해 고정 효과를 갖는 혼합 효과 모델, 시간 및 기준선 부피 밀도를 사용하여 분석하였다. 시간 및 벡터 사이의 상호작용은 이 분석에서 고려되었지만, 유의하지는 않았다. 시간 경과에 따른 플라크 크기의 분석을 위해, 2가지 혼합 효과 모델을 마우스에 대해 랜덤 효과 및 로그 기준선 크기 (제1 분석에서 t0, 제2 분석에서 t1)에 대해 고정 효과를 갖는, 2개의 연속적 시점의 비율의 로그에 대해 피팅하였다.
실시예 4
인간 ApoE 이소형의 유전자 전달은 마우스에서 아밀로이드 침착 및 신경독성을 차등적으로 조절한다
아포리포단백질 E (APOE)의 ε4 대립유전자의 유전은 알츠하이머병 (AD)의 산발성 형태와 관련된 가장 강한 유전적 위험 인자인 반면, 드문 APOE ε2 대립유전자는 반대 효과를 갖는다. 하지만, APOE가 위험 및 보호를 제공하는 메커니즘은 불명확하게 남아 있다. 여기서, 본 발명자들은 아밀로이드 플라크-함유 형질전환 마우스의 피질을 바이러스적으로-발현된 인간 APOE로 담그는 유전자 전달 접근법을 사용하였다. 본 발명자들은 아밀로이드-β (Aβ)를 다중광자 화상화, 생체내 미세투석, 및 사후 어레이 단층촬영으로 모니터링하여 형질전환 마우스에서의 Aβ-관련된 신경독성의 인간 APOE-매개된 변화의 동역학을 연구하였다. 본 발명자들은 인간 APOE4가 간질액 (ISF) 내의 올리고머성 Aβ의 농도를 증가시키고, 플라크 침착을 악화시켰음을 관찰하였다; 인간 APOE2에의 노출 후에는 반대가 일어났다. 플라크-주위 시냅스 소실 및 신경염 이영양증은 또한 APOE4에 의해 악화되거나 APOE2에 의해 약화되었다. Aβ의 중추신경계 (CNS)로부터의 혈장 내로의 출리는 CNS 중의 Aβ의 이소형-특이적 체류에 따라 APOE2에 비해 APOE3 및 APOE4에 의해 줄어들었다. 전체적으로, 본 발명자들의 데이터는 형질전환 마우스에서 아밀로이드 침착 및 청소에 대한, 및 보다 중요하게는 Aβ-매개된 시냅스독성에 대한 인간 APOE 이소형의 차등적 효과를 나타낸다. 이들 결과는 APOE 유전적 위험이 Aβ에 의해 매개되며, APOE4를 감소시키거나 APOE2를 증가시키는 것을 목표로 하는 치료적 접근법은 AD에 유익할 수 있음을 암시한다.
알츠하이머병 (AD)은 가장 빈번한 연령-관련된 신경퇴행성 장애이며, 주요한 공중 보건 관심사이다. AD의 후기 발병 산발성 형태와 관련된 감수성 유전자 중에서, 아포리포단백질 E ε4 (APOE ε4) 대립유전자는 지금까지 가장 중요한 유전적 위험 인자이다. 하나의 APOE ε4 카피의 존재는 가장 흔한 APOE ε3 대립유전자에 비해 3배수만큼 질환 발병 위험을 실질적으로 증가시키는 반면, 2개의 카피는 12-배 증가를 초래한다. 흥미롭게도, APOE ε2는 반대 영향을 가지며, AD의 연령-보정 위험을 약 절반 감소시킨다. 치매의 발병의 평균 연령은 이들 위험 프로파일에 상응하며, APOE4 /4 보유자는 그의 60대 중반에 발병하고, APOE2 /3 보유자는 거의 30년을 이동한 그의 90대 초반에 발병하는 반면, APOE3 / 3 개체는 70대 사이 내지 중반에 발병의 연령을 갖는다.
질환의 드문 상염색체 우세 형태를 담당하는 모든 공지된 유전자가 Aβ 펩티드의 생성에 참여하기 때문에, 환자의 해마 및 피질 중의 Aβ를 함유하는 노인성 플라크의 축적은, AD에서 중추적인 역할을 하는 것으로 믿어진다. APOE가 Aβ에 대한 효과를 통해 AD에 영향을 주는지 여부는 논란의 소지가 있다. APOE 유전자형은 환자에서 아밀로이드 침착의 정도에 강하게 영향을 주며, 인간 APOE2, -E3 및 -E4를 발현하는 유전적으로 조작된 동물은 인간과 유사한 아밀로이드 적재량의 순위를 갖고, 이는 상이한 APOE 이소형이 플라크 개시 및/또는 성장에 영향을 준다는 가설과 일치한다. APOE 변이체는 또한 신경독성 가용성 올리고머성 Aβ의 양을 개질하며, 뇌혈관 온전성 및 혈액 뇌 장벽을 통한 Aβ 유출에 차등적으로 영향을 주는 것으로 제안되었다. 마지막으로, APOE는 신경퇴행 및 시냅스 온전성에 직접적으로 연관되었다. AD에 대해 보호성인 APOE2가 어떻게 이들 과정에 영향을 주는지는 알려져 있지 않다.
APOE 효과의 이전의 연구 대부분은 Apoe의 유전적 제거 또는 형질전환 마우스에서의 APOE의 평생 발현을 사용하였기 때문에, 플라크 침착이 이미 시작된 후 APOE를 도입하는 것의 영향은 현재 알려져 있지 않다. 하지만, APOE 발현을 상승시키는 것을 목표로 하는 새로운 치료적 시도가 현재 평가되며, 아밀로이드 침착은 인지 결함의 수십 년 전 관찰될 수 있음을 고려하여 이 쟁점을 다루는 것은 중요하다. 이 지식 간극을 극복하기 위해, 본 발명자들은 다양한 인간 APOE 대립유전자 (또는 대조군으로서 녹색 형광성 단백질, GFP)를 발현하는 아데노-관련된 바이러스 벡터 (AAV)를 AD의 형질전환 마우스 모델의 측면 뇌실 내로 주사하여 뇌실막 층을 형질도입한 후, 뇌척수액 (CSF) 및 간질액 (ISF) 내에서 인간 APOE 단백질을 전달하는 유전자 전달 접근법을 사용하였다. 생존중 다중광자 현미경검사, 생체내 미세투석 뿐만 아니라 어레이 단층촬영을 사용하여, 본 발명자들은 인간 APOE 이소형이 ISF에서 가용성 올리고머성 Aβ의 수준, Aβ 섬유화 및 침착의 속도 및 플라크-주위 신경독성 효과의 정도에 영향을 주었음을 밝혀내었다. 사실, 인간 APOE4에 노출된 AD 마우스는 가용성 Aβ의 향상된 양, 섬유성 플라크의 보다 높은 밀도, 시냅스 소실의 악화 및 각각의 침착물 주위의 신경염 이영양증의 증가된 수를 나타낸 반면, APOE2로는 상대적 보호 효과가 관찰되었다.
결과
AAV4 - APOE의 뇌실내 주사는 뇌에서 인간 APOE의 지속된 생성을 초래한다
APOE는 뇌 실질을 통해 확산될 수 있는 주로 성상세포 및 미세아교세포에 의해 생성되는 자연적으로 분비되는 단백질이다. 본 발명자들은 GFP 또는 각각의 인간 APOE 대립유전자를 코딩하는 유전자를 운반하는 AAV 혈청형 4 벡터를 7월령 APP/PS1 형질전환 마우스의 측면 뇌 뇌실 내로 주사함으로써 이 특성을 이용하였다. AD의 특징적인 병변에 의해 영향을 받은 대뇌 영역을 고려하여, 이 전략은 다중 실질내 주사에 비해 이점을 제공할 수 있다.
주사 2개월 후, 형질도입된 세포를 맥락 얼기 및 뇌실을 따라 늘어선 뇌실막에서 검출하였다. 종-특이적 항체를 사용하여, 인간 및 뮤린 APOE 단백질 둘 다를 또한 ELISA 검정 (도 18A 내지 18B 및 도 24B) 및 웨스턴 블롯 (도 24A)에 의해 검출하였다. 인간 아포리포단백질 E의 농도는 평균적으로 총 단백질의 20 μg/mg에 도달하였으며 (도 18A), 이는 내인성 뮤린 Apoe의 약 10％를 나타낸다 (도 18BC). 인간 APOE의 이 크지 않은 추가의 양은 내인성 뮤린 mRNA 또는 단백질의 수준을 유의하게 변경하지 않았다 (도 24A 내지 24C). 인간 APOE 수준의 작지만 통계학적으로 유의한 감소가 AAV4 주사 2 내지 5개월 후에 관찰되었다 (도 24D). 그럼에도 불구하고, 인간 단백질의 양은 용이하게 검출가능하게 남아 있으며, 이는 AAV4-매개된 형질도입이 실질 전반에 걸쳐 분비된 단백질의 지속된 생성을 위한 플랫폼을 제공하였음을 암시한다. 사실, 인간 APOE 단백질은 APOE 단백질이 축적되는 것으로 공지된 피질 막 전반에 걸쳐 아밀로이드 침착물 주위에 존재하였다.
다음으로, 본 발명자들은 ISF, 즉 매우 생물학적 활성 가용성 Aβ를 함유하는 세포외 구획 중의 인간 APOE의 존재를 평가하였다. 전체 뇌 용해물에서 검출된 상대적으로 소량의 APOE 때문에, 본 발명자들은 Apoe 넉아웃 마우스를 AAV4-APOE 벡터로 주사하고, 매우 민감성이지만 비-종 특이적 항체를 사용하여 인간 APOE 단백질의 존재를 추적하였다. 미세투석은 주사된 Apoe 넉아웃 동물의 ISF 중의 APOE의 존재를 확인시켰다.
전체적으로, 이들 데이터는 AAV4-APOE2 /3/4의 단일 뇌실내 주사가 전체 뇌 실질 및 ISF 전반에 걸쳐 관심의 단백질의 지속된 생성을 초래하였으며, 뇌실막/맥락 얼기가 단백질을 뇌에 전달하는 데 사용될 수 있음을 확인시킨다.
각각의 APOE 이소형의 주입은 아밀로이드 펩티드 및 플라크 침착에 차등적으로 영향을 준다
실질적인 아밀로이드 침착을 갖는 7월령 APP/PS1 마우스를 안락사 전 5개월 동안 GFP 또는 각각의 인간 APOE 이소형을 발현하는 벡터로 주사하였다. 아밀로이드 플라크 적하량의 분석은 APOE2를 발현하는 것들에 비해 AAV4-APOE4로 주사된 동물의 피질에서 아밀로이드 침착물의 밀도의 유의한 증가를 밝혔다 (AAV4-APOE2: 31±4 및 AAV4-APOE4: 77±5 플라크/피질의 mm2. p<0.01). GFP 및 APOE3 노출된 마우스에서의 플라크 밀도는 APOE4 및 APOE2 사이의 중간 수준에 도달하였으며 (AAV4-GFP: 54±15; AAV4-APOE3: 47±3 플라크/피질의 mm2. 도 19A), 또한 비주사된 동물의 것과 동등하였다.
마우스 뇌의 포름산 추출물로부터 측정된 Aβ40 및 Aβ42 펩티드의 농도는 조직학적으로 관찰된 변화를 모방하였으며, 아밀로이드 펩티드의 증가는 APOE4를 발현하는 마우스에서 발견되었고 (Aβ40: 1733±338 pMol/단백질의 mg 및 Aβ42: 8720±1155 pMol/단백질의 mg), APOE2로는 반대 효과가 검출되었다 (Aβ40: 468±105 pMol/단백질의 mg 및 Aβ42: 5156±1318 pMol/단백질의 mg, p<0.05. 도 19B). 트리스 완충 염수 (Tris Buffer Saline) (TBS)-가용성 분획 중의 Aβ 펩티드의 함량은 유사하게 영향을 받았으며, 가용성 Aβ40 및 Aβ42 둘 다의 보다 높은 농도가 APOE2에 비해 (Aβ40: 20±8 pMol/단백질의 mg 및 Aβ42: 2.3±0.8 pMol/단백질의 mg, p<0.05. 도 19C) APOE4 노출 후에 측정되었다 (Aβ40: 94±18 pMol/단백질의 mg 및 Aβ42: 12.9±1.5 pMol/단백질의 mg).
2개월 동안의 각각의 APOE 이소형의 발현은 5개월 후에 관찰된 것보다 작은 효과를 초래하였으며, 이는 아밀로이드 형성 또는 청소에 대한 APOE 영향이 사후 평가되는 경우 명백하게 되는 데 수 개월이 걸렸음을 암시한다. 그럼에도 불구하고, 다른 군에 비해 AAV4-APOE4 주사된 마우스의 피질 내의 아밀로이드 플라크 밀도의 유의한 증가가 관찰되었으며 (AAV4-GFP: 25±4; AAV4-APOE2: 22±6; AAV4-APOE3: 26±5 및 AAV4-APOE4: 56±4 플라크/피질의 mm2, p<0.05. 도 25A), 이는 포름산 분획에 함유된 Aβ40의 양에 의해 평형화되었다 (AAV4-GFP: 725±92; AAV4-APOE2: 492±62; AAV4-APOE3: 681±140 및 AAV4-APOE4: 1108±238 pMol/단백질의 mg, p<0.05. 도 25C). TBS-가용성 Aβ40 / 42 종의 농도는 변화하지 않았으며, 밀집 코어 플라크 대 총 Aβ-면역반응성의 비율의 변화는 검출되지 않았다 (도 25B). 추가의 대조 실험은 아밀로이드 전구체 단백질 (APP) 대사, 아교세포 활성화, 또는 인슐린 분해 효소의 양에 대한 AAV4-APOE 주사의 임의의 영향을 밝히지 않았다. 전체적으로, 2개월 및 5개월 노출에서의 데이터의 비교는 APOE 이소형의 변경이 급성으로 작용한다기 보다는 수개월에 걸쳐 Aβ 가용성 및 섬유성 침착물을 이동시킴을 암시한다.
APOE는 혈액 뇌 장벽 (BBB)에 영향을 주며, Aβ 펩티드의 유출을 변경시킨다. APOE 노출이 어떻게 BBB를 통한 Aβ 펩티드의 평형을 조절하는지를 조사하기 위해, Aβ40의 혈장 농도를 5개월 후에 측정하였다. AAV4-APOE3 또는 AAV4-APOE4로 주사된 마우스 중의 Aβ의 혈장 함량은 AAV4-APOE2 및 AAV4-GFP에 비해 낮았으며 (AAV4-GFP: 1167±213; AAV4-APOE2: 1247±160; AAV4-APOE3: 736±78 및 AAV4-APOE4: 799±67 pMol/혈장의 ml; p<0.05. 도 19D), 이는 APOE3 및 APOE4가 CNS에서 Aβ의 체류를 도왔다는 것을 암시하고, 이는 상대적으로 증가된 Aβ 뇌 농도 및 APOE로 인한 Aβ의 보다 긴 CNS 반감기를 보고하는 이전의 데이터와 일치한다.
APOE4 보유자는 신경혈관 기능이상에 보다 감수성이며, BBB 고장은 심지어 아밀로이드 침착의 부재 하에서 APOE4 형질전환 마우스에서 선호되는 것으로 나타났다. AAV4-APOE 주사가 BBB의 온전성을 절충하는지를 평가하기 위해, 프러시안 블루로의 사후 염색을 수행하였다. 소수의 헤모시데린 양성 초점 영역의 존재에도 불구하고, 임의의 실험 군 중에서 효과가 관찰되지 않았다.
APOE 이소형의 발현은 아밀로이드증의 동역학을 조절한다
APOE 변이체가 아밀로이드증의 동적 진행에 어떻게 영향을 주는지를 평가하기 위해, 본 발명자들은 생체내 2-광자 화상화를 사용하였으며, 아밀로이드 플라크 형성 및 청소의 동역학을 추적하였다. 마우스는 GFP 또는 각각의 APOE 변이체를 운반하는 AAV4의 뇌실내 주사를 7월령에 받았으며, 두개골 창을 그 후 1주 (T0)에 이식하였다. 1개월 (T1) 또는 2개월 (T2) 후, 아밀로이드 침착물을 화상화하여 시간 경과에 따라 뇌 중의 정확한 동일한 피질 영역을 추적하였다.
대다수의 아밀로이드 침착물은 안정하게 남아 있었지만, 가끔씩 새로운 플라크를 작은 조망 부피에서 검출할 수 있었다. 하지만, 드물게, 실험의 시작에 화상화된 메톡시-양성 플라크는 1 또는 2개월 후에 검출할 수 없었으며, 이는 일부 플라크가 청소될 수 있었음을 암시한다. 아밀로이드 진행의 속도는 APOE4에 노출된 APP/PS1 마우스에서 보다 빠르지만 감소하였으며, 심지어 APOE2에 노출된 동물에서는 반대였다. 2개월 후, APOE2는 GFP에 비해 0.66으로 (p=0.002), APOE3에 비해 0.67로 (p<0.0001), 및 APOE4에 비해 0.74로 (p<0.0001) 아밀로이드 침착물의 밀도를 유의하게 저감시켰다 (도 20A, B).
본 발명자들은 다음으로 T1/T0 및 T2/T1 사이의 개별 침착물의 단면적의 비율을 측정함으로써 단일 아밀로이드 플라크 성장을 평가하였다. T1에서 군 중에서 차이가 검출되지 않았으며 (비율 T1/T0, 도 21), APOE4 노출된 아밀로이드 침착물은 GFP, APOE2 및 APOE3 노출된 동물에 비해 유의하게 크게 성장하였다 (T1/T0 비율: AAV4-GFP에 대해 1.175±0.048; AAV4-APOE2에 대해 0.97±0.043; AAV4-APOE3에 대해 1.063±0.041 및 AAV4-APOE4에 대해 1.29±0.065; p<0.05). 하지만, 이 효과는 제2 개월 후에는 관찰되지 않았다 (비율 T1/T2).
APOE 노출 후의 아밀로이드 침착물 주위의 시냅스 소실 및 신경염 이영양증.
시냅스 소실은 인지 손상과 상관되는 것으로 공지되어 있다. 본 발명자들은 최근 APOE4의 존재가 시냅스 올리고머성 Aβ의 보다 높은 농도 및 APOE3에 비해 인간 AD 환자의 뇌 중의 아밀로이드 플라크 주위의 감소된 시냅스 밀도와 관련됨을 보였다. 또한, 최근의 시험관내 증거는 APOE4가 Aβ-유도된 시냅스 소실에 대해 보호하는 데 실패하였음을 입증하였다. 따라서, 본 발명자들은 APOE가 Aβ 침착 및 청소의 동역학 뿐만 아니라, 아밀로이드 침착물 주위의 시냅스의 온전성에도 차등적으로 영향을 줄 수 있음을 가설화하였다.
시냅스전 및 시냅스후 요소 (시냅신-1 및 PSD95)의 밀도를 극박 조직 섹션의 면역형광 염색에 기초한 고-해상도 기술인 어레이 단층촬영을 사용하여 측정하였다 (K. D. Micheva, S. J. Smith, Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron 55, 25 (Jul 5, 2007); R. M. Koffie et al ., Oligomeric amyloid beta associates with postsynaptic densities and correlates with excitatory synapse loss near senile plaques. Proc Natl Acad Sci U S A 106, 4012 (Mar 10, 2009)). 아밀로이드 올리고머성 종은 아밀로이드 침착물 부근에서 매우 농축되는 것으로 나타났기 때문에, 시냅신-1 및 PSD95 반점을 플라크에 대해 멀리 (> 50 μm) 또는 가까이 (< 50 μm) 정량화하였다. 플라크 근처의 시냅스전 요소의 소실은 AAV4-APOE2 또는 AAV4-GFP의 주사 후의 경우가 아닌 APOE3 또는 APOE4가 발현된 경우 악화되었다 (도 22A). 시냅스후 반점의 밀도는 AAV4-GFP, AAV4-APOE2 및 AAV4-APOE3으로 주사된 마우스 중에서 변화되지 않고 남아 있었던 반면, AAV4-APOE4 처리된 동물은 아밀로이드 침착물 주위의 PSD95의 보다 큰 소실을 나타내었으며, 이는 Aβ 신경독성에 대한 APOE4의 유해한 효과를 강화한다 (도 22B). 시냅스 요소의 밀도를 아밀로이드 침착물로부터 멀리 위치한 영역 (> 50 μm)에서 평가한 경우, 군 중에서 차이를 검출할 수 없었으며, 이는 APOE3 및 APOE4로 관찰된 상대적 시냅스 소실이 각각의 플라크 주위의 Aβ 펩티드의 존재에 직접적으로 관련되었음을 암시한다.
본 발명자들은 또한 신경염 플라크가 증가된 신경돌기 만곡을 갖는 신경막의 보다 일반적인 변경 및 팽창된 이영양증의 출현을 반영하기 때문에, 아밀로이드 침착물과 관련된 이영양성 신경돌기의 수를 평가하였다. 이들 병리학적 변화는 아마도 플라크 표면의 50 μm 내의 영역에 풍부한 가용성 올리고머성 Aβ 종에 기인한다. APOE4의 발현은 GFP, APOE2 및 APOE3에 비해 아밀로이드 침착물과 관련된 SMI312-양성 이영양성 신경돌기의 형성을 악화시킨다 (도 22C). 이 결과는 APOE4 이소형이 아밀로이드 신경독성에 영향을 준다는 관찰을 확인시킨다.
인간 APOE 단백질은 Tg2576 마우스에서 간질액 중의 올리고머성 Aβ 종의 양을 개질한다
본 발명자들은 다음으로 ISF 내의 상이한 인간 APOE 이소형의 존재가 그 동일한 세포외 구획 중의 가용성 아밀로이드 종의 양을 변경시킬 수 있는지 여부의 질문을 다루었다. 본 발명자들은 상이한 AD 마우스 모델에서의 본 발명자들의 이전의 발견을 확인하기 위해 Tg2576 마우스를 주사하였다. Tg2576 마우스는 동일한 연령의 APP/PS1 마우스보다 훨씬 온건한 표현형을 나타낸다. 본 발명자들은 아밀로이드 침착이 이미 시작된 16 내지 18월령 동물의 코호트를 처리하였다. 유전자 전달 3개월 후, 미세투석 프로브를 해마 내로 삽입하고, 샘플을 수집하여 각각의 인간 APOE 변이체와 관련된 초기 변화를 특성화하였다.
본 발명자들은 특이적 82E1/82E1 ELISA 검정을 사용하여 측정된 Aβ 올리고머의 농도가 AAV4-APOE2에 비해 AAV4-APOE4의 주사 후 유의하게 보다 높았음 (42±7％까지; p<0.05)을 관찰하였으며 (도 23), 이는 APOE의 존재가 세포외 구획에서 아밀로이드 응집체의 성질을 조절할 수 있음을 입증한다. 총 Aβ40 및 Aβ42를 ISF에서 평가한 경우, 동일한 경향이 관찰되었지만, 유의성에 도달하지는 않았다 (도 26).
예상된 바와 같이, Tg2576 마우스로부터의 뇌의 사후 생화학적 분석은 포름산 분획 중의 Aβ42의 농도가 APOE4 노출된 동물에서 증가하였음을 나타내었으며 (도 26B), 이는 제2 형질전환 모델에서 APP/PS1 마우스에서의 본 발명자들의 이전의 관찰을 확인시킨다.
논의
APOE 대립유전자의 유전 및 AD 사이의 현저한 유전적 관련성은 이 위험이 어떻게 매개되는지에 대한 여러가지 제안을 초래하였다. APOE는 Aβ에 결합하며, Aβ 청소에 연관되었지만, Apoe 넉아웃 마우스에서의 연구는 놀랍게도 Aβ 침착물이 Apoe의 부재 하에서 유의하게 보다 낮음을 나타낸다. 내인성 뮤린 Apoe의 인간 APOE2, APOE3 또는 APOE4로의 대체는 아마도 플라크 개시 또는 섬유 형성에 대한 효과를 통해 AD 환자에서와 동일한 정도로 아밀로이드 침착물을 개질한다. 대안적인 가설은 신경염 돌출에 대한 차등적 효과, 또는 AD 표현형에 대한 APOE 유전자형의 효과가 염색체 19 상의 APOE와의 유전적 불평형에 있는 또다른 유전자의 결과라는 제안에 초점을 맞춘다.
최근에 개발된 유전자 전달 기술 (G. Liu, I. Martins, J. A. Wemmie, J. A. Chiorini, B. L. Davidson, Functional correction of CNS phenotypes in a lysosomal storage disease model using adeno-associated virus type 4 vectors. J Neurosci 25, 9321 (Oct 12, 2005)) 및 AD의 2가지 마우스 모델을 사용하여, 본 발명자들의 데이터는 생체내 다중광자 화상화, 표준 정량적 면역조직병리학, 어레이 단층촬영, 및 ISF 내의 올리고머성 Aβ의 검사를 허용하는 고분자량 미세투석 접근법의 조합을 사용함으로써 이들 쟁점을 다루었다. 본 발명자들의 연구는 APOE4 수준의 크지 않은 (약 10％) 증가가 Aβ 응집 및 청소 동역학을 변경시켰으며, 이는 Aβ의 증가된 체류 및 플라크 주위의 시냅스 소실 및 신경염 이영양증의 악화를 초래함을 입증하였다. 반대로, APOE2는 Aβ 침착을 감소시키며, 현저한 신경보호 영향을 갖는다. 관찰된 효과는 APP 단백질분해 생성물의 함량의 변화와 상관되지 않았으며, 이는 Aβ 생성 그 자체는 영향을 받지 않았음을 암시한다. 따라서, 이들 결과는 ISF 중의 APOE4 및 APOE2의 크지 않은 양은 아밀로이드 청소, 침착 및 신경독성에 반대 방향으로 영향을 줌을 논증한다. 보다 낮은 양의 Aβ가 단지 CNS에서 APOE3 또는 APOE4에 노출된 마우스의 혈장에서 측정되었기 때문에, 본 발명자들은 본 발명자들의 결과가 뇌 내의 차등적 Aβ 청소로 인한 것일 수 있음을 가설화하였다. 이 효과는 잠재적으로 AAV-형질도입된 뇌실막 세포에 의해 생성된 각각의 APOE 변이체의 지질화 상태와 관련될 수 있다. 사실, 이전의 연구는 APOE4는 APOE2 및 APOE3에 비해 덜 리포단백질-관련되며, 탈지질화된 대 지질화된 리포단백질의 수준을 증가시키는 것은 뇌에서의 Aβ 축적 및 체류에 대한 APOE 이소형의 차등적 효과에 대한 하나의 메커니즘일 수 있음을 나타내었다. 대안적으로, 본 발명자들의 연구의 하나의 한계는 인간 APOE2의 발현이 중요한 구획에서 뮤린 Apoe를 저하시키거나 대체함으로써, Aβ가 덜 축적되는 Apoe 널 동물에서 보이는 것과 유사한 효과를 생성할 가능성이다. 그럼에도 불구하고, 본 발명자들의 뮤린 Apoe 단백질 및 mRNA의 직접적 측정은 내인성 단백질에 대한 인간 APOE 발현의 전반적인 효과를 나타내지 않으며, APOE2 및 APOE4가 아밀로이드 침착에 대해 반대 영향을 갖기 때문에, 본 발명자들은 아밀로이드 침착에 대한 인간 APOE 이소형의 직접적 효과를 선호한다.
ISF APOE의 수준의 크지 않은 변화가 이러한 극적인 결과를 갖기 때문에, 이들 결과는 또한 APOE 발현에 영향을 줌으로써 AD의 위험 또는 진행을 변경시킬 수 있는 폭넓게 다양한 환경적 및 유전적 인자의 효과로의 통찰을 초래할 수 있다. 여기서 본 발명자들이 입증하는 규모보다 큰 APOE의 증가는 외상성 뇌 손상, 간질, 허혈 및 고 콜레스테롤 식이 후에 일어날 수 있으며, 이들 모두는 상승된 뇌 Aβ와 관련되었다. 더욱이, APOE4 대립유전자와 유전적 불평형에 있는 것으로 밝혀진 프로모터 다형성은 APOE 발현에 영향을 준다.
CNS에서 APOE-리포단백질 항상성에 영향을 주는 다른 조작은 명백하게 Aβ 침착을 변화시킨다. 예를 들어, APOE 렌티바이러스 (주로 해마 뉴런에서 발현됨)로 초점 유전자 전달을 갖는 실험에서, APOE4 과발현은 APOE3에 비해 아밀로이드에 대한 보다 강한 효과를 발휘한다. 이전의 연구는 또한 내인성 APOE 합성을 향상시키는 레티노이드 X 수용체 효능제가 뇌로부터의 Aβ의 청소를 초래하였음을 나타내었다 (P. E. Cramer et al ., ApoE-directed therapeutics rapidly clear beta-amyloid and reverse deficits in AD mouse models. Science 335, 1503 (Mar 23, 2012); C. Bachmeier, D. Beaulieu-Abdelahad, F. Crawford, M. Mullan, D. Paris, Stimulation of the retinoid x receptor facilitates Beta-amyloid clearance across the blood-brain barrier. J Mol Neurosci 49, 270 (Feb, 2012)). 또한, CNS에서 콜레스테롤을 대사하며 그의 수준을 저하시키는 CYP46A1로의 뇌 형질도입은 APOE 수준을 감소시키는 것으로 공지된 뇌 중의 LDL-R의 용량 증가에 따라 Aβ 침착을 감소시킨다. 대안적으로, APOE3/4 및 Aβ 사이의 상호작용을 차단하거나 APOE4의 구조를 APOE2 또는 APOE3-유사 형태로 전환시키는 Aβ 모방 펩티드는 또한 아밀로이드의 축적에 대한 효과를 나타내었다. 마지막으로, 유전적 조작은 내인성 Apoe 발현을 50％까지 감소시키는 것은 동물의 일생에 걸쳐 Aβ 표현형에 강하게 영향을 줌을 암시한다. 인간 APOE가 뮤린 Apoe의 배경 상에 발현된 본 발명자들의 현재 결과는 부분적으로 Aβ 상호작용에 대한 인간 APOE 및 뮤린 Apoe 사이의 경쟁으로부터 초래될 수 있다. 무관하게, 이들 데이터는 인간 이소형-의존성 변화가 심지어 병리학적 변화가 잘 확립된 후에도 극적인 효과를 가질 수 있음을 암시한다.
본 발명자들의 데이터는 APOE AD 문헌에서의 논란의 4가지 중요한 영역을 직접적으로 다룬다. 본 발명자들은 둘 다 아마도 뉴런계 기능의 손상과 관련되는 시냅스 소실 및 신경염 이영양증에 의해 평가된 신경독성에 대한 APOE 이소형의 명백한 효과를 입증한다. 이들 효과는 플라크 바로 부근에서 명백하였지만, 플라크로부터 먼 영역에서는 그렇지 않기 때문에, APOE2에 의한 시냅스 보호는 아마도 시냅스 안정성에 대한 APOE의 직접적 영향으로 인한 것이라기 보다는 플라크-주위 Aβ에 대한 효과에 의해 매개된다. 아밀로이드증의 종적 다중광자 생체내 화상화는 APOE4가 플라크 침착 및 성장을 향상시키는 반면, APOE2는 플라크의 분해와 관련됨을 나타내며, 이는 APOE 이소형이 섬유성 플라크 형성에 대한 초기 효과를 넘어 질환의 속도 및 진행에 강력한 영향을 가짐을 논증한다. 이들 결과는 APOE4가 아밀로이드 침착 및 신경독성 둘 다의 관점에서 질환 과정을 가속화할 수 있는 (따라서, 발병의 보다 빠른 연령을 초래함) 반면, APOE2는 반대로 작용한다는 생각을 강화시키며, 이는 CNS 내로의 APOE2 (또는 APOE2 모방체)의 도입이 치료적 가치를 가질 수 있다는 가능성을 제기한다. APOE는 뇌로부터 Aβ를 청소하는 메커니즘으로서 또는 청소 반감기를 감소시키는 체류 분자로서 다양하게 제안되었다; 본 발명자들의 현재 결과는 ISF 내로의 APOE3/4의 크지 않은 양의 도입이 CNS에서의 Aβ의 체류를 향상시키는 데 충분함을 나타낸다. AD에서의 APOE2의 현저한 보호 작용의 메커니즘은 오래도록 불명확하였으며, 이는 부분적으로 APOE2가 APOE 수용체와 상대적으로 빈약하게 결합하기 때문이다. 본 발명자들의 현재 데이터는 APOE2가 기능을 가지며 Aβ의 CNS 체류에 대한 아마도 중성 또는 유익한 효과 (다른 대립유전자에 비해) 외에 확립된 Aβ 침착물을 반전시킬 수 있을 뿐만 아니라, 시냅스 및 신경염 가소성을 지지할 수 있음을 암시한다. 이는 APOE4 대 APOE2 대립유전자가 유전된 환자 사이에서 발병의 연령의 수십 년 차이가 Aβ 침착 및 청소의 동역학의 상이한 개시점 및 연속적 차이 둘 다 뿐만 아니라 침착물과 관련된 신경독성의 정도의 대립유전자 특이적 차이를 반영할 수 있음을 암시한다. APOE2의 이 이중 기능은 그의 플라크 청소 및 시냅스 복원 능력을 모방하는 것을 목표로 하는 치료적 접근법을 초래할 수 있다.
이들 결과는 APOE가 Aβ 올리고머화에 대한 스캐폴드로서 작용하는 모델과 일치한다. 이들 결과는 또한 올리고머성 Aβ가 AD를 갖는 인간 환자의 CNS에서 APOE4 >APOE3으로 상승된다 (심지어 플라크 적재량이 경우를 통해 정규화된 경우에도)는 본 발명자들의 최근의 관찰과 일치한다. APOE, 특히 APOE4가 신경독성 올리고머성 Aβ의 형성을 매개하는 경우, 본 발명자들의 현재 데이터로부의 경우인 것으로 보이는 바와 같이, 예측은 향상된 APOE4 발현이 증가된 시냅스 및 신경염 변경을 초래할 것이라는 것이다. 이들 결과에 기초하여, APOE4 보유자의 뇌 중의 APOE 농도를 증가시키는 제제에 대해 주의가 기울여져야 한다.
마지막으로, 본 발명자들의 데이터는 그 후 전체 피질 막을 통해 확산되는 분비된 단백질을 코딩하는 유전자의 전달을 위한 뇌의 뇌실막 층의 AAV-매개된 형질도입의 이용을 강조한다. 본 발명자들은 APOE4를 감소시키거나 APOE2를 증가시키는 유전자 전달 또는 다른 접근법은 AD 질환 진행에 영향을 주는 데 유용할 수 있음을 제안한다.
물질 및 방법
연구 설계
본 연구는 각각의 인간 APOE 이소형의 도입이 플라크 침착이 시작된 후 아밀로이드 진행 및 Aβ-관련된 신경독성에 어떻게 영향을 주는지를 조사하는 것을 목표료 하였다. 이 질문을 다루기 위해, 각각의 APOE 변이체를 코딩하는 AAV 벡터로의 단일 주입을 2가지 상이한 AD 형질전환 마우스 모델의 뇌실내 공간 내에서 수행하였다. 마우스를 짧은 (2 내지 3개월) 또는 긴 (5개월) 기간 동안 노출시켰다. 생체내 화상화, 생체내 미세투석 및 어레이 단층촬영을 사용하여, 인간 ApoE 이소형의 영향을 ISF 내의 아밀로이드 침착 및 올리고머화 뿐만 아니라 Aβ-관련된 신경독성 (척주 소실 및 이영양증)에 대해 평가하였다. 마우스를 처리 군으로 랜덤하게 할당하였다. 주사된 벡터의 성질을 통계학적 분석까지 맹검으로 유지하였다. 수술 절차로부터 성공적으로 회복된 모든 동물을 사후 분석에 포함시켰다. 샘플 크기를 이전의 실험에 기초하여 예비-측정하였다. 제2 형질전환 주로의 복제를 수행하여 가설을 추가로 시험하였다.
동물
APPswe/PS1dE9 (APP/PS1) (D. R. Borchelt et al ., Accelerated amyloid deposition in the brains of transgenic mice coexpressing mutant presenilin 1 and amyloid precursor proteins. Neuron 19, 939 (Oct, 1997)) (잭슨 래버러토리) 및 Tg2576 (K. Hsiao et al ., Correlative memory deficits, Abeta elevation, and amyloid plaques in transgenic mice. Science 274, 99 (Oct 4, 1996)) 마우스는 스웨덴 돌연변이 K594N/M595L을 함유하는 인간 돌연변이체 아밀로이드 전구체 단백질 유전자를 프리온 프로모터의 제어 하에 발현한다. APP/PS1 마우스 모델은 또한 엑손 9에 대해 결실된 프레세닐린 1 유전자를 과발현하며, 이는 6월령에서 아밀로이드 침착을 갖는 심각한 표현형을 초래한다. Tg2576 주는 1연령 경에 아밀로이드 플라크를 발달시키는 보다 온건한 모델이다. 본 발명자들은 7월령 APPPS1을 2개월 (n=4 AAV4-GFP, n=4 AAV4-APOE2, n=6 AAV4-APOE3 및 n=5 AAV4-APOE4 동물) 또는 5개월 (n=4 AAV4-GFP, n=5 AAV4-APOE2, n=6 AAV4-APOE3 및 n=5 AAV4-APOE4 동물) 동안 각각의 AAV 벡터로 노출시켰다. 또한, 16월령 Tg2576 마우스의 코호트 (n=3 AAV4-GFP, n=3 AAV4-APOE2, n=5 AAV4-APOE3 및 n=5 AAV4-APOE4 동물)를 ISF 내의 Aβ의 수준을 측정하기 위해 포함시켰다. APOE-결함성 마우스 (잭슨 래버러토리)를 또한 사용하였다. 실험은 NIH 및 기관의 지침에 따라 수행하였다.
바이러스 벡터 구축 및 생성
유니버시티 오브 일리노이 (미국 시카고)의 라두 박사에 의해 관대하게 제공된 APOE -2, -3 및 -4 cDNA를 PCR에 의해 증폭하고, BamHI에 의해 소화시키고, AAV2-pCMV-hrGFP 골격 내로 삽입하였다. AAV 혈청형 4 벡터를 미국 아이오와 시티에 소재하는 유니버시티 오브 아이오와의 유전자 전달 벡터 코어에 의해 생성하였다. AAV 바이러스 역가를 정량적 PCR에 의해 측정하였다.
정위적 뇌실내 주사
AAV 뇌실내 주사를 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다 (G. Liu, I. H. Martins, J. A. Chiorini, B. L. Davidson, Adeno-associated virus type 4 (AAV4) targets ependyma and astrocytes in the subventricular zone and RMS. Gene Ther 12, 1503 (Oct, 2005); T. L. Spires et al ., Dendritic spine abnormalities in amyloid precursor protein transgenic mice demonstrated by gene transfer and intravital multiphoton microscopy. J Neurosci 25, 7278 (Aug 3, 2005)). 동물을 마취시키고 (케마틴/크실라진: 각각 100 mg/kg 및 50 mg/kg 체중), 정위적 프레임 (데이빗 코프 인스트루먼츠) 상에 위치시켰다. 주사를 10-μl 해밀톤 주사기 (해밀톤 메디컬)에 부착된 33-게이지 바늘을 사용하여 0.25　μl/분의 속도로 바이러스 제제 5 μl (역가 2×1012 vg/ml)로 각각의 측면 뇌실에서 수행하였다. 정위적 좌표를 정수리점으로부터 계산하였다 (전후 +0.3 mm, 내외측 ±1 mm 및 등배 -2 mm).
두개골 창 이식 및 다중광자 화상화
마우스를 이소플루란 (1.5％)으로 마취시키고, 한 조각의 두개골을 5 mm 유리 커버슬립으로 대체함으로써 두개골 창을 이식하였다 (T. L. Spires et al ., Dendritic spine abnormalities in amyloid precursor protein transgenic mice demonstrated by gene transfer and intravital multiphoton microscopy. J Neurosci 25, 7278 (Aug 3, 2005)). 화상화를 위해, 왁스 링을 설치하여 대물렌즈 (20×, 0.95의 수치 구경, 올림푸스)에 대한 물의 웰을 생성하였다. 아밀로이드 침착물을 수술 24시간 전 메톡시-XO4 (5 mg/kg), 즉 BBB를 횡단하고 플라크에 결합하는 형광 화합물의 복강내 주사 후 가시화하였다 (B. J. Bacskai, W. E. Klunk, C. A. Mathis, B. T. Hyman, Imaging amyloid-beta deposits in vivo. J Cereb Blood Flow Metab 22, 1035 (Sep, 2002)). 텍사스 레드 덱스트란 (70,000 Da; PBS 중 12.5 mg/ml; 몰리큘라 프로브스)을 측면 꼬리 정맥 내로 주사하여 형광 혈관촬영도를 제공하고, 시간 경과에 따라 정확한 동일한 시야 영역을 추적하였다. 마우스를 AAV 주사 1주 후에 화상화하고, 그 후 주사 1개월 및 2개월(들) 후에 화상화하였다.
다중광자 화상화 시스템 (바이오-래드 1024ES, 바이오-래드) 상에 실장된 모드-잠금된 Ti:사파이어 레이저 (마이타이, 스펙트라-피직스)는 860 nm 2-광자 형광 여기 광을 생성하였다. 방출된 광을 3개의 광전자증배관 (하마마츠 포토닉스)을 함유하는 외부 검출기를 통해 380 내지 480, 500 내지 540 및 560 내지 650 nm의 범위로 수집하였다. 2-색상 화상을 플라크 및 혈관촬영에 대해 동시에 획득하였다. 저 배율 생체내 화상 (615 × 615 μm; z-단계, 2 μm, 깊이, 약 200 μm)을 취하고, 6 내지 8개의 시야 영역을 화상화하였다.
화상 가공 및 분석
플라크 밀도를 화상화된 피질의 부피 당 아밀로이드 침착물의 수를 보고함으로써 이미지 제이를 사용하여 정량화하였다. 본 발명자들은 피질 부피가 표면의 z-스택의 첫번째 슬라이스에서 시작하여 아밀로이드 침착물이 검출될 수 있는 마지막 슬라이스까지인 것으로 간주하였다. 아밀로이드 침착물의 크기를 2-차원 투사 후의 최대 강도로부터 그의 단면적을 측정함으로써 시간 경과에 따라 평가하였다. 각각의 플라크에 대해, 초기 시점 및 제1 개월 사이 (T1/T0), 또는 제2 및 제1 개월 사이 (T2/T1)의 면적의 비율을 계산하였다. 다중광자 현미경의 설정 (레이저 파워 및 PMT)을 화상화 시즌 전반에 걸쳐 유지하였다.
생체내 미세투석 샘플링
ISF의 생체내 미세투석 샘플링을 AAV 주사 3개월 후 Tg2576 마우스에 대해 수행하였다 (S. Takeda et al ., Novel microdialysis method to assess neuropeptides and large molecules in free-moving mouse. Neuroscience 186, 110 (Jul 14, 2011)). 미세투석 프로브는 3.0 mm, 1000 kDa 분자량 컷오프 (MWCO) 폴리에틸렌 (PE) 막 (PEP-4-03, 에이콤)을 갖는 4 mm 샤프트를 가졌다. 사용 전에, 프로브를 인공 뇌척수액 (aCSF: mM로: 122 NaCl, 1.3 CaCl2, 1.2 MgCl2, 3.0 KH2PO4, 25.0 NaHCO3)으로 세척하였다. 예비컨디셔닝된 프로브의 출구 및 입구를 플루오르화 에틸렌 프로필렌 (FEP) 튜브 (Φ 250 μm 내경)를 사용하여 각각 연동 펌프 (ERP-10, 에이콤) 및 미세주사기 펌프 (ESP-32, 에이콤, 일본 교토)에 연결하였다.
프로브 이식을 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다 (S. Takeda et al ., Novel microdialysis method to assess neuropeptides and large molecules in free-moving mouse. Neuroscience 186, 110 (Jul 14, 2011); J. R. Cirrito et al., In vivo assessment of brain interstitial fluid with microdialysis reveals plaque-associated changes in amyloid-beta metabolism and half-life. J Neurosci 23, 8844 (Oct 1, 2003)). 마취된 동물 (1.5％ 이소플루란)을 가이드 카눌라 (PEG-4, 에이콤)로 해마 (정수리점 -3.1 mm, -2.5 mm 측면에서 중간선, -1.2 mm 복부에서 경막)에서 정위적으로 이식하였다. 그 후, 가이드를 치과용 시멘트를 사용하여 두개골에 고정하였다. 수술 4일 후, 마우스를 미세투석 케이지에 정치시키고, 프로브를 가이드를 통해 삽입하였다. 샘플 수집 전 프로브를 aCSF로 240분 동안 10 μl/분의 유속으로 관류하였다. 샘플을 0.25 (Aβ에 대해) 및 0.1 μl/분 (ApoE에 대해)의 유속으로 수집하였다. 마우스를 깨우고, 미세투석 케이지 (어트모스LM (AtmosLM) 미세투석 시스템, 에이콤)에서 자유-운동하게 하였다.
면역조직학적 분석
마우스를 CO2 흡입에 의해 안락사시켰다. 하나의 뇌 반구를 PBS 중 4％ 파라포름알데히드 중에서 고정하고, 파라핀 왁스에 끼웠다. 피질 1 mm3 조각을 어레이 단층촬영을 위해 가공한 반면, 나머지는 스냅 동결하였다. 파라핀-끼워진 섹션 (10 μm)을 크실렌 중에서 탈파라핀화하고, 에탄올 중에서 재수화시키고, 시트레이트 완충액 (10 mM 시트르산나트륨, 0.05％ 트윈 20, pH 6.0) 중에서 처리하고, 0.5％ 트리톤을 갖는 PBS 중에서 투과시키고, 3％ BSA를 갖는 PBS 중에서 2시간 동안 블로킹하였다. 1차 항체로 인큐베이션을 4℃에서 밤새 수행하였다: 아밀로이드 플라크에 대해 Bam10 (1:1000, 시그마) 및 R1282 (1:500, 데니스 셀코에 박사에 의해 제공됨), 인간 APOE에 대해 마우스 모노클로날 항체 3H1 (1:250, 오타와 하트 인스티튜트), 신경염 이영양증에 대해 닭 항-GFP (1:500, 아베스) 및 SMI-312 (1:500, 코반스), 미세아교세포 및 성상세포에 대해 각각 IBA1 (1:500, 와코) 및 GFAP (1:1000, 시그마). 2차 항체로의 인큐베이션을 2시간 동안 수행하였다. 아밀로이드 밀집 코어 플라크를 마운팅 전 50％ 에탄올 중 Thio-S (시그마-알드리치) 0.05％에 의해 표지하였다.
어레이 단층촬영을 위한 샘플 제조, 면역염색 및 화상화
어레이 단층촬영 분석을 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다 (R. M. Koffie et al ., Oligomeric amyloid beta associates with postsynaptic densities and correlates with excitatory synapse loss near senile plaques. Proc Natl Acad Sci U S A 106, 4012 (Mar 10, 2009)). 뇌실 영역에 인접한 한 조각의 피질 조직 (1 mm3)을 절개하고, 0.01M PBS 중 4％ 파라포름알데히드, 2.5％ 수크로스 중에서 3시간 동안 고정하였다. 에탄올 중에서의 탈수 후, 샘플을 LR 화이트 수지 (일렉트론 마이크로스코피 사이언시즈) 중에서 4℃에서 밤새 인큐베이션한 후, 53℃에서 중합하였다. 그 후, 섹션의 리본 (70 nm)을 점보 히스토 다이아몬드 나이프 (다이아톰)를 사용함으로써 울트라컷 마이크로톰 (레이카) 상에서 절단하였다.
TBS 중 50 mM 글리신 중에서 5분 동안 재수화 후, 섹션을 트리스 중 0.05％ 트윈 및 0.1％ BSA 중에서 5분 동안 블로킹하고, 1차 항체를 블로킹 완충액 중에서 2시간 동안 1:50으로 적용한 후 (올리고머성 Aβ 종을 우선적으로 염색하는 PSD95 앱캠 Ab12093, 시냅신 I 밀리포어 AB1543 및 버지니아 리 박사로부터의 NAB61 (E. B. Lee et al., Targeting amyloid-beta peptide (Abeta) oligomers by passive immunization with a conformation-selective monoclonal antibody improves learning and memory in Abeta precursor protein (APP) transgenic mice. J Biol Chem 281, 4292 (Feb 17, 2006)), 2차 항체 (인비트로젠)를 적용하였다. 화상을 7 내지 30개의 일련의 섹션 상에서 얻고, 차이스 액시오플랜 LSM510 공초점/다중광자 현미경 (63x 수치 구경 플랜 아포크로마틱 오일 대물렌즈)을 사용함으로써 획득하였다.
화상을 이미지 제이 (국립 보건원) 및 MATLAB (매쓰웍스)를 사용하여 이전에 기재된 바와 같이 분석하였다 (R. M. Koffie et al ., Oligomeric amyloid beta associates with postsynaptic densities and correlates with excitatory synapse loss near senile plaques. Proc Natl Acad Sci U S A 106, 4012 (Mar 10, 2009)). 화상의 각각의 세트를 스택으로 전환시키고, 이미지 제이 멀티스택레그 및 스택레그 플러그-인 (브래드 부스 및 피. 테베나즈의 기증, 스탠포드 유니버시티)을 사용함으로써 정렬하였다. 기지의 부피를 선택하고, 자동화 역치-기재 검출 프로그램을 사용하여 하나 초과의 연속적 섹션에서 나타난 PSD95 및 시냅신 반점 둘 다를 카운트하였다 (워터쉐드 프로그램, 브래드 부스, 스티븐 스미쓰, 및 크리스티나 미쉐바에 의해 제공됨, 스탠포드 유니버시티). 워터쉐드는 어레이의 하나 초과의 슬라이스에 존재한 반점을 나타내는 (각각의 채널로부터 별개의) 역치 화상 스택을 내보내었다. 피질 중의 몇몇 부위를 마우스 당 샘플링하고, 플라크의 모서리로부터의 그의 거리를 측정하였다.
Aβ 정량화
Aβ40 및 Aβ42의 농도를 BNT-77/BA-27 (Aβ40에 대해) 및 BNT-77/BC-05 (Aβ42에 대해) 샌드위치 ELISA (와코)에 의해 제조자의 지시서에 따라 측정하였다. Aβ 올리고머를 동일한 N-말단 (잔기 1 내지 16) 항체를 캡처 및 검출 둘 다에 사용한 82E1/82E1 샌드위치 ELISA (이뮤노-바이올로지컬 래버러토리즈)를 사용하여 정량화하였다 (W. Xia et al ., A specific enzyme-linked immunosorbent assay for measuring beta-amyloid protein oligomers in human plasma and brain tissue of patients with Alzheimer disease. Arch Neurol 66, 190 (Feb, 2009)).
이뮤노블롯 분석
뇌 용해물 및 미세투석물 (20 μg 단백질)을 SDS-PAGE용 MOPS 구동 완충액 (인비트로젠) 중 4 내지 12％ 노벡스 비스-트리스 겔 (인비트로젠) 상에서 전기영동시켰다. 겔을 PVDF 막으로 옮기고, 5％ 밀크 / TBS-T 중에서 60분 동안 블로킹하였다. 막을 염소 항-APOE 항체 (1:1000, 밀리포어)로 탐침화하여 Apoe 널 동물의 ISF 중의 APOE를 검출한 반면, 알부민을 대조군으로서 사용하였다. 인간 및 마우스 APOE에 대한 블롯을 각각 EP1373Y 항체 (1:1000, 노부스 바이올로지컬즈) 및 토끼 폴리클로날 APOE 항체 (1:1000, 앱캠)로 탐침화하였다. APP 단백질분해 생성물 (sAPP: 22C11, 1:4000, 밀리포어 및 C83/C99: APP Cter, 1:4000, 시그마) 및 인슐린 분해 효소 (IDE, 1:1000, 산타 크루즈 (Santa Cruz))를 또한 분석하였다. HRP-컨쥬게이션된 염소 IgG 항체 (벡터)로 인큐베이션을 2시간 동안 수행하였다. 면역반응성 단백질을 ECL 키트 (웨스턴 라이트닝, 퍼킨엘머)를 사용하여 전개하고, 하이퍼필름 ECL (지이 헬스케어) 상에서 검출하였다.
qRT - PCR
뇌로부터의 총 RNA를 트리졸® 시약 (라이프 테크놀로지즈; 15596-026)을 사용하여 추출한 후, cDNA를 수퍼스크립트® III 원-스텝 RT-PCR 시스템 (라이프 테크놀로지즈; 12574-018)을 사용하여 합성하였다. PCR 프라이머를 설계하여 인간 APOE mRNA 및 내인성 apoE 및 Gapdh mRNA를 증폭시켰다 (Apoe 전방향: 5'-AGCTCCCAAGTCACACAAGA　; Apoe 역방향: 5'- GTTGCGTAGATCCTCCATGT　; APOE 전방향: 5'- CCAGCGACAATCACTGAAC　; APOE 역방향: 5'- GCGCGTAATACGACTCACTA; Gapdh 전방향: 5'- ATGACATCAAGAAGGTGGTG 및 Gapdh 역방향: 5'- CATACCAGGAAATGAGCTTG).
APOE ELISA
샘플을 막-결합된 ApoE의 이동 및 정량화를 허용하는 TBS 중 2％ 트리톤에서 추출하였다. ELISA 플레이트를 염소 항-APOE 항체 (뮤린 APOE) 1.5 ug/ml 또는 WUE4 항체 (인간 APOE) 1.5 ug/ml로 밤새 코팅하고, 1.5시간 동안 PBS 중 1％ 밀크로 블로킹하였다. 인간 재조합 ApoE를 표준물로서 (인간 검정, 바이오비젼) 또는 뇌 추출물로부터의 인-하우스 마우스 표준물로서 (뮤린 검정) 사용하고, 샘플을 ELISA 완충액 (PBS 중 0.5％ BSA 및 0.025％ 트윈-20) 중에서 밤새 인큐베이션하였다. 인간 (염소-apoe 밀리포어; 1:10,000) 또는 마우스 (앱캠; 1:2,000)에 대해 특이적인 검출 항체를 각각 사용한 후, HRP-컨쥬게이션된 2차 항체를 사용하였다. 신호의 시현을 TMB 기질을 사용하여 수행한 후, 용액을 H3PO4를 사용하여 중지시키고, 450 nm에서 측정하였다.
통계학적 분석
통계학적 분석을 프리즘 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. 샘플의 작은 크기 때문에, 정상화는 대부분의 분석에 대해 가정될 수 없었다. 모든 사후 분석을 위해, 비모수 크루스칼-월리스 시험, 그 후 던 다중 비교 시험을 수행하였다. 아밀로이드 진행의 생체내 화상화 데이터를 마우스에 대해 랜덤 효과, 및 벡터에 대해 고정 효과를 갖는 혼합 효과 모델, 시간 및 기준선 부피 밀도를 사용하여 분석하였다. 시간 및 벡터 사이의 상호작용은 이 분석에서 고려되었지만, 유의하지는 않았다. 시간 경과에 따른 플라크 크기의 분석을 위해, 2가지 혼합 효과 모델을 마우스에 대해 랜덤 효과 및 로그 기준선 크기 (제1 분석에서 t0, 제2 분석에서 t1)에 대해 고정 효과를 갖는, 2개의 연속적 시점의 비율의 로그에 대해 피팅하였다. 샘플을 각각의 분석을 위해 맹검화하였다.
모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 본원에 참고로 포함된다. 상기 명세서에서 본 발명을 그의 특정 바람직한 실시양태와 관련하여 기재하였으며, 많은 상세사항은 예시의 목적으로 설명되었지만, 본 발명은 추가의 실시양태가 가능하며 본원에 기재된 특정 상세사항은 본 발명의 기본적인 원리로부터 벗어나지 않고 상당히 다양화될 수 있음은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다.
본 발명을 기재하는 내용에서 용어 관사 ("a" 및 "an" 및 "the") 및 유사한 언급대상의 사용은 본원에서 달리 지시되거나 내용에 의해 명백하게 모순되지 않는다면 단수 및 복수 둘 다를 커버하는 것으로 간주되어야 한다. 용어 "포함하는 (comprising)", "갖는", "포함하는 (including)" 및 "함유하는"은 달리 언급되지 않는다면 개방-말단 용어 (즉, "포함하나 이에 제한되지 않는"을 의미함)로서 간주되어야 한다. 본원에서 값의 범위의 인용은 본원에서 달리 지시되지 않는다면 단지 개별적으로 범위 내에 해당하는 각각의 별개의 값을 언급하는 약칭 방법으로서 기능하는 것으로 의도되며, 각각의 별개의 값은 그것이 개별적으로 본원에 인용되는 것처럼 명세서에 포함된다. 본원에 기재된 모든 방법은 본원에서 달리 지시되거나 달리 내용에 의해 명백하게 모순되지 않는다면 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본원에 제공된 임의의 및 모든 예, 또는 예시적인 언어 (예를 들어, "예컨대")의 사용은 단지 본 발명을 보다 잘 예시하기 위한 것으로 의도되며, 달리 청구되지 않는다면 본 발명의 범위를 제한하지 않는다. 명세서 중의 어떤 언어도 임의의 비-청구된 요소를 본 발명의 실시에 필수적인 것으로서 지시하는 것으로 간주되지 않아야 한다.
본 발명을 실시하기 위해 본 발명자들에게 공지된 가장 양호한 방식을 포함하는 본 발명의 실시양태가 본원에 기재된다. 이들 실시양태의 변동은 상기 설명을 읽을 때 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백하게 될 수 있다. 본 발명자들은 통상의 기술자가 이러한 변동을 적절하게 채용할 것을 기대하며, 본 발명자들은 본 발명이 본원에 구체적으로 기재된 것과 다르게 실시되는 것을 의도한다. 따라서, 본 발명은 적용가능한 법칙에 의해 허용되는 바와 같은 본원에 첨부된 청구범위에 인용된 요지의 모든 변형 및 등가물을 포함한다. 더욱이, 그의 모든 가능한 변동으로 상기 기재된 요소의 임의의 조합은 본원에서 달리 지시되거나 달리 내용에 의해 명백하게 모순되지 않는다면 본 발명에 의해 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> UNIVERSITY OF IOWA RESEARCH FOUNDATION THE GENERAL HOSPITAL CORPORATION <120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATING AMYLOID DEPOSITS <130> 17023.140WO1 <140> PCT/US2014/066658 <141> 2014-11-20 <150> 61/906,811 <151> 2013-11-20 <160> 10 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 735 <212> PRT <213> Adeno-associated virus - 2 <400> 1 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro 20 25 30 Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60 Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80 Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala 85 90 95 Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110 Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro 115 120 125 Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140 Pro Val Glu His Ser Pro Val Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Thr Gly 145 150 155 160 Lys Ala Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr 165 170 175 Gly Asp Ala Asp Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Gln Pro Pro 180 185 190 Ala Ala Pro Ser Gly Leu Gly Thr Asn Thr Met Ala Thr Gly Ser Gly 195 200 205 Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser 210 215 220 Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Met Gly Asp Arg Val Ile 225 230 235 240 Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu 245 250 255 Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr 260 265 270 Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His 275 280 285 Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp 290 295 300 Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val 305 310 315 320 Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu 325 330 335 Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr 340 345 350 Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp 355 360 365 Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser 370 375 380 Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser 385 390 395 400 Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr Phe Glu 405 410 415 Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg 420 425 430 Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Arg Thr 435 440 445 Asn Thr Pro Ser Gly Thr Thr Thr Gln Ser Arg Leu Gln Phe Ser Gln 450 455 460 Ala Gly Ala Ser Asp Ile Arg Asp Gln Ser Arg Asn Trp Leu Pro Gly 465 470 475 480 Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Ser Ala Asp Asn Asn 485 490 495 Asn Ser Glu Tyr Ser Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His Leu Asn Gly 500 505 510 Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys Asp 515 520 525 Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Gln Ser Gly Val Leu Ile Phe Gly Lys 530 535 540 Gln Gly Ser Glu Lys Thr Asn Val Asp Ile Glu Lys Val Met Ile Thr 545 550 555 560 Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln Tyr 565 570 575 Gly Ser Val Ser Thr Asn Leu Gln Arg Gly Asn Arg Gln Ala Ala Thr 580 585 590 Ala Asp Val Asn Thr Gln Gly Val Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asp 595 600 605 Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr 610 615 620 Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys 625 630 635 640 His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asn 645 650 655 Pro Ser Thr Thr Phe Ser Ala Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr Gln 660 665 670 Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys 675 680 685 Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr 690 695 700 Asn Lys Ser Val Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val Tyr 705 710 715 720 Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu 725 730 735 <210> 2 <211> 734 <212> PRT <213> Adeno-associated virus - 4 <400> 2 Met Thr Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser Glu 1 5 10 15 Gly Val Arg Glu Trp Trp Ala Leu Gln Pro Gly Ala Pro Lys Pro Lys 20 25 30 Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro Gly 35 40 45 Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro Val 50 55 60 Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp Gln 65 70 75 80 Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala Asp 85 90 95 Ala Glu Phe Gln Gln Arg Leu Gln Gly Asp Thr Ser Phe Gly Gly Asn 100 105 110 Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro Leu 115 120 125 Gly Leu Val Glu Gln Ala Gly Glu Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg Pro 130 135 140 Leu Ile Glu Ser Pro Gln Gln Pro Asp Ser Ser Thr Gly Ile Gly Lys 145 150 155 160 Lys Gly Lys Gln Pro Ala Lys Lys Lys Leu Val Phe Glu Asp Glu Thr 165 170 175 Gly Ala Gly Asp Gly Pro Pro Glu Gly Ser Thr Ser Gly Ala Met Ser 180 185 190 Asp Asp Ser Glu Met Arg Ala Ala Ala Gly Gly Ala Ala Val Glu Gly 195 200 205 Gly Gln Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ala Ser Gly Asp Trp His Cys 210 215 220 Asp Ser Thr Trp Ser Glu Gly His Val Thr Thr Thr Ser Thr Arg Thr 225 230 235 240 Trp Val Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu Tyr Lys Arg Leu Gly Glu 245 250 255 Ser Leu Gln Ser Asn Thr Tyr Asn Gly Phe Ser Thr Pro Trp Gly Tyr 260 265 270 Phe Asp Phe Asn Arg Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln 275 280 285 Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp Gly Met Arg Pro Lys Ala Met Arg Val 290 295 300 Lys Ile Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Thr Ser Asn Gly Glu 305 310 315 320 Thr Thr Val Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Ile Phe Ala Asp 325 330 335 Ser Ser Tyr Glu Leu Pro Tyr Val Met Asp Ala Gly Gln Glu Gly Ser 340 345 350 Leu Pro Pro Phe Pro Asn Asp Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr 355 360 365 Cys Gly Leu Val Thr Gly Asn Thr Ser Gln Gln Gln Thr Asp Arg Asn 370 375 380 Ala Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly 385 390 395 400 Asn Asn Phe Glu Ile Thr Tyr Ser Phe Glu Lys Val Pro Phe His Ser 405 410 415 Met Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile 420 425 430 Asp Gln Tyr Leu Trp Gly Leu Gln Ser Thr Thr Thr Gly Thr Thr Leu 435 440 445 Asn Ala Gly Thr Ala Thr Thr Asn Phe Thr Lys Leu Arg Pro Thr Asn 450 455 460 Phe Ser Asn Phe Lys Lys Asn Trp Leu Pro Gly Pro Ser Ile Lys Gln 465 470 475 480 Gln Gly Phe Ser Lys Thr Ala Asn Gln Asn Tyr Lys Ile Pro Ala Thr 485 490 495 Gly Ser Asp Ser Leu Ile Lys Tyr Glu Thr His Ser Thr Leu Asp Gly 500 505 510 Arg Trp Ser Ala Leu Thr Pro Gly Pro Pro Met Ala Thr Ala Gly Pro 515 520 525 Ala Asp Ser Lys Phe Ser Asn Ser Gln Leu Ile Phe Ala Gly Pro Lys 530 535 540 Gln Asn Gly Asn Thr Ala Thr Val Pro Gly Thr Leu Ile Phe Thr Ser 545 550 555 560 Glu Glu Glu Leu Ala Ala Thr Asn Ala Thr Asp Thr Asp Met Trp Gly 565 570 575 Asn Leu Pro Gly Gly Asp Gln Ser Asn Ser Asn Leu Pro Thr Val Asp 580 585 590 Arg Leu Thr Ala Leu Gly Ala Val Pro Gly Met Val Trp Gln Asn Arg 595 600 605 Asp Ile Tyr Tyr Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr Asp 610 615 620 Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Ile Gly Gly Phe Gly Leu Lys His 625 630 635 640 Pro Pro Pro Gln Ile Phe Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asn Pro 645 650 655 Ala Thr Thr Phe Ser Ser Thr Pro Val Asn Ser Phe Ile Thr Gln Tyr 660 665 670 Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Gln Ile Asp Trp Glu Ile Gln Lys Glu 675 680 685 Arg Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Val Gln Phe Thr Ser Asn Tyr Gly 690 695 700 Gln Gln Asn Ser Leu Leu Trp Ala Pro Asp Ala Ala Gly Lys Tyr Thr 705 710 715 720 Glu Pro Arg Ala Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr His His Leu 725 730 <210> 3 <211> 2208 <212> DNA <213> Adeno-associated virus - 2 <400> 3 atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca ctctctctga aggaataaga 60 cagtggtgga agctcaaacc tggcccacca ccaccaaagc ccgcagagcg gcataaggac 120 gacagcaggg gtcttgtgct tcctgggtac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180 aagggagagc cggtcaacga ggcagacgcc gcggccctcg agcacgacaa agcctacgac 240 cggcagctcg acagcggaga caacccgtac ctcaagtaca accacgccga cgcggagttt 300 caggagcgcc ttaaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcggacgagc agtcttccag 360 gcgaaaaaga gggttcttga acctctgggc ctggttgagg aacctgttaa gacggctccg 420 ggaaaaaaga ggccggtaga gcactctcct gtggagccag actcctcctc gggaaccgga 480 aaggcgggcc agcagcctgc aagaaaaaga ttgaattttg gtcagactgg agacgcagac 540 tcagtacctg acccccagcc tctcggacag ccaccagcag ccccctctgg tctgggaact 600 aatacgatgg ctacaggcag tggcgcacca atggcagaca ataacgaggg cgccgacgga 660 gtgggtaatt cctcgggaaa ttggcattgc gattccacat ggatgggcga cagagtcatc 720 accaccagca cccgaacctg ggccctgccc acctacaaca accacctcta caaacaaatt 780 tccagccaat caggagcctc gaacgacaat cactactttg gctacagcac cccttggggg 840 tattttgact tcaacagatt ccactgccac ttttcaccac gtgactggca aagactcatc 900 aacaacaact ggggattccg acccaagaga ctcaacttca agctctttaa cattcaagtc 960 aaagaggtca cgcagaatga cggtacgacg acgattgcca ataaccttac cagcacggtt 1020 caggtgttta ctgactcgga gtaccagctc ccgtacgtcc tcggctcggc gcatcaagga 1080 tgcctcccgc cgttcccagc agacgtcttc atggtgccac agtatggata cctcaccctg 1140 aacaacggga gtcaggcagt aggacgctct tcattttact gcctggagta ctttccttct 1200 cagatgctgc gtaccggaaa caactttacc ttcagctaca cttttgagga cgttcctttc 1260 cacagcagct acgctcacag ccagagtctg gaccgtctca tgaatcctct catcgaccag 1320 tacctgtatt acttgagcag aacaaacact ccaagtggaa ccaccacgca gtcaaggctt 1380 cagttttctc aggccggagc gagtgacatt cgggaccagt ctaggaactg gcttcctgga 1440 ccctgttacc gccagcagcg agtatcaaag acatctgcgg ataacaacaa cagtgaatac 1500 tcgtggactg gagctaccaa gtaccacctc aatggcagag actctctggt gaatccgggc 1560 ccggccatgg caagccacaa ggacgatgaa gaaaagtttt ttcctcagag cggggttctc 1620 atctttggga agcaaggctc agagaaaaca aatgtggaca ttgaaaaggt catgattaca 1680 gacgaagagg aaatcaggac aaccaatccc gtggctacgg agcagtatgg ttctgtatct 1740 accaacctcc agagaggcaa cagacaagca gctaccgcag atgtcaacac acaaggcgtt 1800 cttccaggca tggtctggca ggacagagat gtgtaccttc aggggcccat ctgggcaaag 1860 attccacaca cggacggaca ttttcacccc tctcccctca tgggtggatt cggacttaaa 1920 caccctcctc cacagattct catcaagaac accccggtac ctgcgaatcc ttcgaccacc 1980 ttcagtgcgg caaagtttgc ttccttcatc acacagtact ccacgggaca ggtcagcgtg 2040 gagatcgagt gggagctgca gaaggaaaac agcaaacgct ggaatcccga aattcagtac 2100 acttccaact acaacaagtc tgttaatgtg gactttactg tggacactaa tggcgtgtat 2160 tcagagcctc gccccattgg caccagatac ctgactcgta atctgtaa 2208 <210> 4 <211> 2205 <212> DNA <213> Adeno-associated virus - 4 <400> 4 atgactgacg gttaccttcc agattggcta gaggacaacc tctctgaagg cgttcgagag 60 tggtgggcgc tgcaacctgg agcccctaaa cccaaggcaa atcaacaaca tcaggacaac 120 gctcggggtc ttgtgcttcc gggttacaaa tacctcggac ccggcaacgg actcgacaag 180 ggggaacccg tcaacgcagc ggacgcggca gccctcgagc acgacaaggc ctacgaccag 240 cagctcaagg ccggtgacaa cccctacctc aagtacaacc acgccgacgc ggagttccag 300 cagcggcttc agggcgacac atcgtttggg ggcaacctcg gcagagcagt cttccaggcc 360 aaaaagaggg ttcttgaacc tcttggtctg gttgagcaag cgggtgagac ggctcctgga 420 aagaagagac cgttgattga atccccccag cagcccgact cctccacggg tatcggcaaa 480 aaaggcaagc agccggctaa aaagaagctc gttttcgaag acgaaactgg agcaggcgac 540 ggaccccctg agggatcaac ttccggagcc atgtctgatg acagtgagat gcgtgcagca 600 gctggcggag ctgcagtcga gggcggacaa ggtgccgatg gagtgggtaa tgcctcgggt 660 gattggcatt gcgattccac ctggtctgag ggccacgtca cgaccaccag caccagaacc 720 tgggtcttgc ccacctacaa caaccacctc tacaagcgac tcggagagag cctgcagtcc 780 aacacctaca acggattctc caccccctgg ggatactttg acttcaaccg cttccactgc 840 cacttctcac cacgtgactg gcagcgactc atcaacaaca actggggcat gcgacccaaa 900 gccatgcggg tcaaaatctt caacatccag gtcaaggagg tcacgacgtc gaacggcgag 960 acaacggtgg ctaataacct taccagcacg gttcagatct ttgcggactc gtcgtacgaa 1020 ctgccgtacg tgatggatgc gggtcaagag ggcagcctgc ctccttttcc caacgacgtc 1080 tttatggtgc cccagtacgg ctactgtgga ctggtgaccg gcaacacttc gcagcaacag 1140 actgacagaa atgccttcta ctgcctggag tactttcctt cgcagatgct gcggactggc 1200 aacaactttg aaattacgta cagttttgag aaggtgcctt tccactcgat gtacgcgcac 1260 agccagagcc tggaccggct gatgaaccct ctcatcgacc agtacctgtg gggactgcaa 1320 tcgaccacca ccggaaccac cctgaatgcc gggactgcca ccaccaactt taccaagctg 1380 cggcctacca acttttccaa ctttaaaaag aactggctgc ccgggccttc aatcaagcag 1440 cagggcttct caaagactgc caatcaaaac tacaagatcc ctgccaccgg gtcagacagt 1500 ctcatcaaat acgagacgca cagcactctg gacggaagat ggagtgccct gacccccgga 1560 cctccaatgg ccacggctgg acctgcggac agcaagttca gcaacagcca gctcatcttt 1620 gcggggccta aacagaacgg caacacggcc accgtacccg ggactctgat cttcacctct 1680 gaggaggagc tggcagccac caacgccacc gatacggaca tgtggggcaa cctacctggc 1740 ggtgaccaga gcaacagcaa cctgccgacc gtggacagac tgacagcctt gggagccgtg 1800 cctggaatgg tctggcaaaa cagagacatt tactaccagg gtcccatttg ggccaagatt 1860 cctcataccg atggacactt tcacccctca ccgctgattg gtgggtttgg gctgaaacac 1920 ccgcctcctc aaatttttat caagaacacc ccggtacctg cgaatcctgc aacgaccttc 1980 agctctactc cggtaaactc cttcattact cagtacagca ctggccaggt gtcggtgcag 2040 attgactggg agatccagaa ggagcggtcc aaacgctgga accccgaggt ccagtttacc 2100 tccaactacg gacagcaaaa ctctctgttg tgggctcccg atgcggctgg gaaatacact 2160 gagcctaggg ctatcggtac ccgctacctc acccaccacc tgtaa 2205 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 5 agctcccaag tcacacaaga 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 6 gttgcgtaga tcctccatgt 20 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 7 ccagcgacaa tcactgaac 19 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 8 gcgcgtaata cgactcacta 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 9 atgacatcaa gaaggtggtg 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 10 cataccagga aatgagcttg 20

Claims (21)

  1. (a) 포유동물로부터 제1 혈액 샘플을 얻고;
    (b) 포유동물에게 아밀로이드 장애에 대한 치료를 투여하고;
    (c) 포유동물로부터 제2 혈액 샘플을 얻고;
    (d) 제1 혈액 샘플 중 및 제2 혈액 샘플 중의 A-베타의 수준을 정량화하고;
    (e) 아밀로이드 장애의 치료 전후의 포유동물 중의 A-베타의 수준을 측정하는 것
    을 포함하는, 아밀로이드 장애의 치료 전후의 포유동물 중의 A-베타의 측정 방법.
  2. 제1항에 있어서, 제1 샘플 중의 A-베타의 수준 대 제2 샘플 중의 A-베타의 수준의 비율을 계산하는 것을 더 포함하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 제1 샘플 중의 A-베타의 수준을 제2 샘플 중의 A-베타의 수준과 비교하는 것을 더 포함하며, 여기서 제1 혈액 샘플에 비해 제2 혈액 샘플 중의 A-베타의 증가된 수준은 포유동물의 뇌에 존재하는 아밀로이드 플라크 또는 응집체의 감소 또는 저감과 관련되거나 또는 이를 나타내는 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 제1 샘플 중의 A-베타의 수준을 제2 샘플 중의 A-베타의 수준과 비교하는 것을 더 포함하며, 여기서 제1 혈액 샘플에 비해 제2 혈액 샘플 중의 A-베타의 증가된 수준은 아밀로이드 장애의 유효 치료와 관련되거나 또는 이를 나타내는 것인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 치료가 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 입자, 및 한 쌍의 AAV 역전된 말단 반복부 (ITR) 사이에 삽입되거나 하나 이상의 AAV ITR에 인접한 보호 ApoE 이소형 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 포유동물의 뇌척수액 (CSF)에 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 치료가 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 입자, 및 한 쌍의 AAV 역전된 말단 반복부 (ITR) 사이에 삽입되거나 하나 이상의 AAV ITR에 인접한 보호 ApoE 이소형을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 포유동물로부터의 뇌실막 세포에 투여하고, 뇌실막 세포를 포유동물로 복귀시킴으로써, 핵산을 포유동물에 전달하는 것을 포함하는, 보호 ApoE 이소형을 코딩하는 핵산을 포유동물에 전달하는 것을 포함하는 것인 방법.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 치료가 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 입자, 및 한 쌍의 AAV 역전된 말단 반복부 (ITR) 사이에 삽입되거나 하나 이상의 AAV ITR에 인접한 보호 ApoE 이소형을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 포유동물에게 투여함으로써, 핵산을 포유동물의 뇌실막 세포에 전달하는 것을 포함하는, 보호 ApoE 이소형을 코딩하는 핵산을 포유동물의 뇌실막 세포에 전달하는 것을 포함하는 것인 방법.
  8. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 입자가 포유동물의 뇌실막 세포를 형질도입 또는 형질감염시키고, 여기서 형질도입된 또는 형질감염된 뇌실막 세포는 ApoE 이소형 단백질을 분비하는 것인 방법.
  9. 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 입자가 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh74 또는 Rh10 캡시드 또는 변이체 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh74 또는 Rh10 캡시드를 포함하는 것인 방법.
  10. 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 입자가 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh74 또는 Rh10 역전된 말단 반복부 (ITR) 또는 변이체 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh74 또는 Rh10 역전된 말단 반복부 (ITR)를 포함하는 것인 방법.
  11. 제5항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산이 포유동물 ApoE 이소형 단백질을 코딩하는 것인 방법.
  12. 제5항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산이 인간 ApoE 이소형 단백질을 코딩하는 것인 방법.
  13. 제5항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 입자가 제약 조성물을 포함하는 것인 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 혈액 샘플 중 또는 제2 혈액 샘플 중의 A-베타의 수준이 면역검정에 의해 정량화되는 것인 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물이 영장류인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 영장류가 인간인 방법.
  17. 제5항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 치료가 포유동물의 뇌 중의 보호 ApoE 이소형 단백질의 증가된 수준을 포함하는 것인 방법.
  18. 제5항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 보호 ApoE 이소형이 ApoE ε2에 대해 80％ 상동성을 갖는 것인 방법.
  19. 제5항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 보호 ApoE 이소형이 ApoE ε2에 대해 100％ 상동성을 갖는 것인 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 아밀로이드 장애가 알츠하이머병을 포함하는 것인 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 혈액 샘플이 전혈, 혈장 또는 혈청인 방법.
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