JP2023500793A - アルツハイマー病に対する遺伝子治療方法 - Google Patents

Abstract

哺乳動物におけるＡＰＯＥ４の発現に関連する疾患または障害を予防、阻害、または治療するための組成物および方法が提供される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年１０月１６日に出願された米国特許出願第６２／９１５，９８８号の出願日の利益を主張するものであり、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。

背景
アポリポタンパク質Ｅ（ＡＰＯＥ）は、アルツハイマー病（ＡＤ）の最も一般的な遅発型家族性および孤発性形態の病因に密接に関与する重要な中枢神経系（ＣＮＳ）アポリポタンパク質である（Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。一般集団において、主に肝臓および脳において発現される３つのＡＰＯＥアイソフォームをコードする３つの一般的なＡＰＯＥ対立遺伝子（ε４、ε３、およびε２）が存在する。ＡＰＯＥ４キャリアは、ＡＤの発症（ＡＰＯＥ３ホモ接合体と比較して、ヘテロ接合体およびホモ接合体についてそれぞれ３～１５倍）ならびに疾患の発症についてのより早期の発症年齢（各ε４対立遺伝子について約５年）の著しく増加したリスクを有する（Ｃｏｒｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３、Ｆａｒｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９７、Ｌａｍｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，２０１３、Ｓａｕｎｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，１９９３、Ｓｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３）。ＡＤ患者の４５％が少なくとも１つのε４対立遺伝子を保有する（同齢健常対照の１５％のみと比較して）という事実は、ＡＰＯＥ４を、ＡＤの最も一般的な形態である遅発型ＡＤについての断然に最も一般的な遺伝的リスク因子にしている。対照的に、ＡＰＯＥ２は、ＡＤのリスクを約５０％低減させ、発症年齢を著しく遅延させる保護的対立遺伝子である（Ｃｏｒｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９４、Ｆａｒｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９７、Ｓｕｒｉ ｅｔ ａｌ．，２０１３、Ｔａｌｂｏｔ ｅｔ ａｌ．，１９９４、Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。

最も一般的なアイソフォームであるＡＰＯＥ３と、ＡＰＯＥ２およびＡＰＯＥ４との間の主要な生理学的差異は、システイン－アルギニン相互交換である、残基１１２（ＡＰＯＥ４）および１５８（ＡＰＯＥ２）の、２つの位置のうちの１つでのアミノ酸の差異に起因する（Ｈａｔｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，２００６）。これら２つのアミノ酸の差異は、タンパク質構造、およびこれらのＡＰＯＥアイソフォームのリポタンパク質、リポタンパク質受容体への対応する結合親和性、ならびにＡβの凝集、分解、排出、および食作用の調節の差異をもたらす（Ｃａｓｔｅｌｌａｎｏ ｅｔ ａｌ．，２０１１、Ｄｅａｎｅ ｅｔ ａｌ．，２００８、Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０１２、Ｈａｔｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，２００６、Ｈｏｌｔｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１２、Ｍａｎｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，２００４、Ｗａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０００、Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，２０１４、Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，２００９）。

概要
一実施形態では、本開示は、アルツハイマー病に対する遺伝子治療ベクターを提供する。一実施形態では、遺伝子治療ベクターは、ヒトＡＰＯＥ２遺伝子をコードするＡＡＶ発現ベクターと、シスまたはトランスのいずれかで、内因性ＡＰＯＥ４を標的とする人工マイクロＲＮＡと、を含む。このベクターシステムは、遺伝子治療ベクター、例えば、ＡＡＶベクターからの有益なＡＰＯＥ２遺伝子の補充と組み合わせて、有害な内因性ＡＰＯＥ４の発現をサイレンシングする。本明細書に開示されるように、抑制のために内因性ＡＰＯＥ４ ｍＲＮＡを標的とする例示的な人工マイクロＲＮＡ配列が設計された。マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、ＡＰＯＥ２コード配列に対して５’である配列、例えば、ＣＡＧプロモーターイントロンなどのイントロン、またはＡＰＯＥ２コード配列に対して３’である配列、例えば、ヒトＡＰＯＥ２コード配列をコードするベクター導入遺伝子プラスミドのポリＡテールに対して５’である配列中に組み込まれ得る。あるいは、マイクロＲＮＡは、ＡＰＯＥ２発現カセットのポリＡ部位に続くＰｏｌＩＩＩプロモーター、例えば、Ｕ６プロモーターと、ターミネーターとの間に挿入され得る。ベクター由来のヒトＡＰＯＥ２ ＤＮＡ配列は、任意選択で、マイクロＲＮＡによる抑制を減少させるかまたは阻害するためのサイレントヌクレオチド変化を含み、一実施形態では、検出のための、例えば、臨床前検出研究のための、ＨＡタグなどのタグを含み得る。一実施形態では、発現構築物は、ＣＮＳにおける内因性ＡＰＯＥ発現の顕著な部位であるアストロサイトおよびグリア細胞を標的とする血清型（例えば、ＡＡＶ９）のＡＡＶキャプシド中にパッケージングされるが、他のベクター、例えば、他のウイルスベクター、プラスミド、ナノ粒子、またはリポソーム中で提供され得る。

一実施形態では、ＡＰＯＥ２をコードするオープンリーディングフレームおよび３’非翻訳領域を含む核酸配列に機能的に連結された第１のプロモーターを含む遺伝子治療ベクターが提供され、ＡＰＯＥ４ ｍＲＮＡの阻害のための１つ以上のＲＮＡｉ核酸配列を含む単離されたヌクレオチド配列が提供される。一実施形態では、ベクターは、ヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、ヌクレオチド配列は、オープンリーディングフレームに対して５’または３’に挿入されている。一実施形態では、ヌクレオチド配列は、オープンリーディングフレームに対して５’および３’に挿入されている。一実施形態では、ヌクレオチド配列は、異なるベクター上にある。一実施形態では、単離されたヌクレオチド配列は、１つ以上のＲＮＡｉ核酸配列に機能的に連結された第２のプロモーターを含む。一実施形態では、遺伝子治療ベクターは、ウイルスベクターである。一実施形態では、異なるベクターは、ウイルスベクターである。一実施形態では、ウイルスベクターは、ＡＡＶ、アデノウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、またはレトロウイルスベクターである。一実施形態では、ＡＡＶは、ＡＡＶ５、ＡＡＶ９、またはＡＡＶｒｈ１０である。一実施形態では、ＡＰＯＥ４は、ヒトＡＰＯＥ４である。一実施形態では、ＡＰＯＥ２は、ヒトＡＰＯＥ２である。一実施形態では、第１のプロモーターは、ＰｏｌＩプロモーター、例えば、構成的プロモーターまたは調節可能プロモーター、例えば、誘導性プロモーターである。一実施形態では、第２のプロモーターは、ＰｏｌＩＩＩプロモーターである。一実施形態では、単離されたヌクレオチド配列は、２つ以上のＲＮＡｉ核酸配列を含む１つ以上のｍｉＲＮＡのための核酸を含み、例えば、１つ以上のＲＮＡｉ配列は、ｍｉＲＮＡ配列中に包埋されている。一実施形態では、ＲＮＡｉは、複数のｓｉＲＮＡ配列を含むｓｉＲＮＡを含む。一実施形態では、ＲＮＡｉは、約１５～２５ヌクレオチド長のｓｈＲＮＡ配列を含む。一実施形態では、ＡＰＯＥ２のためのオープンリーディングフレームは、配列番号６に対して複数のサイレントヌクレオチド置換を含み、例えば、オープンリーディングフレームは、配列番号７、または配列番号７に対する少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、もしくは９８％の核酸配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、ＡＰＯＥ２をコードするか、あるいはオープンリーディングフレームは、ＡＰＯＥ２をコードし、

に対する少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９８％の核酸配列同一性を有するが、その配列は配列番号７ではない、ヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、ＡＰＯＥ２のオープンリーディングフレームにおける複数のサイレントヌクレオチド置換は、単離されたヌクレオチド配列におけるＲＮＡｉ核酸配列内中にない、すなわち、ヌクレオチド置換を有する配列は、ＲＮＡｉヌクレオチド配列とは異なり、その結果、ヌクレオチド置換を有するｍＲＮＡは、ＲＮＡｉ配列、例えば、単離されたＲＮＡｉまたはベクターから発現されたＲＮＡｉ配列に（例えば、それとの二本鎖のために）結合しない。一実施形態では、ＡＰＯＥ２のためのオープンリーディングフレームにおける少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％のコドンは、サイレントヌクレオチド置換を有する。一実施形態では、ＡＰＯＥ２のためのオープンリーディングフレームにおける少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、または４０％のコドンは、サイレントヌクレオチド置換を、例えば、ＲＮＡｉ配列に対応するＡＰＯＥ２配列の部分において、有する。即ち、ヒトＡＰＯＥ２コード配列におけるサイレントヌクレオチド置換は、内因性ヒトＡＰＯＥ４配列と異なり、かつＡＰＯＥ４ ＲＮＡｉ配列と異なる配列をもたらす。一実施形態では、阻害されるＡＰＯＥ４は、配列番号２２によってコードされたポリペプチドに対する少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより多いアミノ酸配列同一性を有する配列を有する。一実施形態では、ＡＰＯＥ２は、配列番号９によってコードされたポリペプチドに対する少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより多いアミノ酸配列同一性を有する配列を有する。一実施形態では、１つ以上のＲＮＡｉ核酸配列は、配列番号１～４もしくは２０～２２のうちの１つまたはその相補物に対する少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれより多いヌクレオチド配列同一性を有する。一実施形態では、ベクターは、ヒトＡＰＯＥ２をコードするオープンリーディングフレームを含む核酸配列に機能的に連結された第１のＰｏｌＩプロモーターと、ヒトＡＰＯＥ４ ｍＲＮＡの阻害のための１つ以上のＲＮＡｉ核酸配列を有する単離されたヌクレオチド配列と、を有する。一実施形態では、ヌクレオチド配列は、オープンリーディングフレームに対して５’に挿入されている。一実施形態では、ヌクレオチド配列は、オープンリーディングフレームに対して３’に挿入されている。一実施形態では、ヌクレオチド配列は、オープンリーディングフレームに対して５’および３’に挿入されている。一実施形態では、単離されたヌクレオチド配列は、１つ以上のＲＮＡｉ核酸配列に機能的に連結された第２のプロモーターを含む。一実施形態では、ＲＮＡｉ核酸配列は、約１２５～５００、例えば、約１５０～１７５ヌクレオチド長である。一実施形態では、遺伝子治療ベクターは、ｍｉＲＮＡ配列、例えば、ＡＰＯＥ４阻害配列に隣接するｍｉＲＮＡ配列を含み得る、２、３、４、またはそれより多いコピーのＲＮＡｉ核酸配列を有し得る。

一実施形態では、哺乳動物におけるアルツハイマー病を予防、阻害、または治療するための方法であって、哺乳動物に、有効量の、遺伝子治療ベクターを含む組成物を投与することを含む、方法が提供される。一実施形態では、組成物は、遺伝子治療ベクターもしくは異なるベクター、またはその両方を含むナノ粒子を含む。一実施形態では、遺伝子治療ベクターもしくは異なるベクター、またはその両方は、ウイルスベクターを含む。一実施形態では、哺乳動物は、Ｅ２／Ｅ４ヘテロ接合体である。一実施形態では、哺乳動物は、Ｅ４／Ｅ４ホモ接合体である。一実施形態では、組成物は、全身投与される。一実施形態では、組成物は、経口投与される。一実施形態では、組成物は、静脈内投与される。一実施形態では、組成物は、局所投与される。一実施形態では、組成物は、注射される。一実施形態では、組成物は、中枢神経系に投与される。一実施形態では、組成物は、脳に投与される。一実施形態では、組成物は、徐放性組成物である。一実施形態では、哺乳動物は、ヒトである。一実施形態では、ＲＮＡｉ核酸配列は、複数のｍｉＲＮＡ配列を含む。

一実施形態では、哺乳動物におけるＡＰＯＥ４発現に関連する疾患を予防、阻害、または治療するための方法であって、哺乳動物に、有効量の、遺伝子治療ベクターを含む組成物を投与することを含む、方法が提供される。一実施形態では、組成物は、遺伝子治療ベクターもしくは異なるベクター、またはその両方を含むリポソームを含む。一実施形態では、組成物は、遺伝子治療ベクターもしくは異なるベクター、またはその両方を含むナノ粒子を含む。一実施形態では、遺伝子治療ベクターもしくは異なるベクター、またはその両方は、ウイルスベクターを含む。一実施形態では、哺乳動物は、Ｅ２／Ｅ４ヘテロ接合体である。一実施形態では、哺乳動物は、Ｅ４／Ｅ４ホモ接合体である。一実施形態では、組成物は、全身投与される。一実施形態では、組成物は、経口投与される。一実施形態では、組成物は、静脈内投与される。一実施形態では、組成物は、局所投与される。一実施形態では、組成物は、注射される。一実施形態では、組成物は、中枢神経系に投与される。一実施形態では、組成物は、脳に投与される。一実施形態では、組成物は、徐放性組成物である。一実施形態では、哺乳動物は、ヒトである。一実施形態では、ＲＮＡｉ配列は、複数のｍｉＲＮＡ配列を含む。

例示的な標的転写物鋳型からの阻害ＲＮＡの産生（Ｂｏｕｄｒｅａｕ ａｎｄ Ｄａｖｉｄｓｏｎ．２０１２．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ ５０７）。 ｍＲＮＡを阻害するための経路（Ｂｏｒｅｌ ｅｔ ａｌ．，２０１４．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２２：６９２－７０１）。 ｍｉＲＮＡ挿入のための例示的な構築物。 単一ベクターおよび二重ベクター構築物。 ｍｉＲＮＡ配列のための２つの部位を有する単一ベクター構築物。 インビトロでの４つの異なるｓｉＲＮＡによるＡＰＯＥの発現のノックダウン。 ｍｉＲＮＡ発現のための例示的な足場としてのｍｉｒ１５５足場の使用。 マウス実験。

詳細な説明
定義
「ベクター」は、ポリヌクレオチドを含むか、またはそれと会合し、インビトロまたはインビボのいずれかで、ポリヌクレオチドの細胞への送達を媒介するために使用され得る巨大分子または巨大分子の会合を指す。例示的なベクターとしては、例えば、プラスミド、ウイルスベクター、リポソーム、および他の遺伝子送達ビヒクルが挙げられる。時には「標的ポリヌクレオチド」または「導入遺伝子」と称される、送達されるポリヌクレオチドは、遺伝子治療における目的のコード配列（治療目的のタンパク質をコードする遺伝子など）、ワクチン開発における目的のコード配列（哺乳動物における免疫応答の誘発に好適なタンパク質、ポリペプチド、もしくはペプチドを発現するポリヌクレオチドなど）、および／または選択可能もしくは検出可能なマーカーを含み得る。

本明細書で使用される「形質導入」、「トランスフェクション」、「形質転換」、または「形質導入する」は、細胞におけるポリヌクレオチド、例えば、導入遺伝子の発現をもたらす宿主細胞中への外因性ポリヌクレオチドの導入のためのプロセスを指す用語であり、外因性ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための組換えウイルスの使用を含む。細胞におけるポリヌクレオチドの形質導入、トランスフェクション、または形質転換は、例えば、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、およびウェスタンブロットによるタンパク質発現（定常状態レベルを含む）、ハイブリダイゼーションアッセイ、例えば、ノーザンブロット、サザンブロット、およびゲルシフト移動度アッセイによるＤＮＡおよびＲＮＡの測定を含むが、これらに限定されない、当該技術分野で周知の方法によって決定され得る。外因性ポリヌクレオチドの導入のために使用される方法には、ウイルス感染またはトランスフェクション、リポフェクション、形質転換、およびエレクトロポレーションなどの周知の技術、ならびに他の非ウイルス遺伝子送達技術が含まれる。導入されたポリヌクレオチドは、宿主細胞において安定にまたは一過性に維持され得る。

「遺伝子送達」は、遺伝子移入のための細胞中への外因性ポリヌクレオチドの導入を指し、標的指向、結合、取り込み、輸送、局在化、レプリコン組み込み、および発現を包含し得る。

「遺伝子移入」は、標的指向、結合、取り込み、輸送、局在化、およびレプリコン組み込みを包含し得るが、その後の遺伝子の発現とは異なるかまたはそれを意味しない、外因性ポリヌクレオチドの細胞中への導入を指す。

「遺伝子発現」または「発現」は、遺伝子の転写、翻訳、および翻訳後修飾のプロセスを指す。

「感染性」ウイルスまたはウイルス粒子は、それに対してウイルス種が栄養性である細胞中に、それが送達することができるポリヌクレオチド構成要素を含むものである。この用語は、必ずしもウイルスの任意の複製能力を意味しない。

「ポリヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、またはそのアナログを含む、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドは、メチル化またはキャッピングされたヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログなどの修飾ヌクレオチドを含み得、非ヌクレオチド構成要素によって中断され得る。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーの組み立ての前または後に付与され得る。本明細書で使用されるポリヌクレオチドという用語は、二本鎖および一本鎖分子を互換的に指す。別段の指定または要求がない限り、ポリヌクレオチドである本明細書に記載される任意の実施形態は、二本鎖形態、および二本鎖形態を作り上げることが知られているかまたは予想される２つの相補的な一本鎖形態の各々の両方を包含する。

「単離された」ポリヌクレオチド、例えば、プラスミド、ウイルス、ポリペプチド、または他の物質は、物質または類似の物質が、天然に存在するか、または最初にそこから調製される所にそれもまた存在し得る他の構成要素の少なくともいくらかを欠いている物質の調製物を指す。したがって、例えば、単離された物質は、精製技術を使用して、供給源混合物からそれを濃縮することによって調製され得る。単離された核酸、ペプチドまたはポリペプチドは、それが天然に見出される形態または状況とは異なる形態または状況で存在する。例えば、所与のＤＮＡ配列（例えば、遺伝子）は、隣接する遺伝子に近接して宿主細胞染色体上に見出され、ＲＮＡ配列、例えば、特定のタンパク質をコードする特定のｍＲＮＡ配列は、多数のタンパク質をコードする多数の他のｍＲＮＡとの混合物として細胞において見出される。単離された核酸分子は、一本鎖または二本鎖の形態で存在し得る。単離された核酸分子がタンパク質を発現させるために利用される場合、分子は、最低でもセンス鎖またはコード鎖を含有する（すなわち、分子は、一本鎖であり得る）が、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含有し得る（すなわち、分子は、二本鎖であり得る）。濃縮は、溶液の体積当たりの重量などの絶対的な基準で測定され得るか、または供給源混合物中に存在する第２の潜在的妨害物質との関連で測定され得る。本発明の実施形態の漸増的濃縮が想定される。したがって、例えば、２倍の濃縮、１０倍の濃縮、１００倍の濃縮、または１０００倍の濃縮。

「転写調節配列」は、それが機能的に連結している遺伝子またはコード配列の転写を制御するゲノム領域を指す。本発明における使用の転写調節配列は、一般に、少なくとも１つの転写プロモーターを含み、１つ以上の転写のエンハンサーおよび／またはターミネーターもまた含み得る。

「機能的に連結された」は、そのように記載された構成要素が、それらが協調的に機能することを可能にする関係にある、２つ以上の構成要素の配置を指す。例示として、転写調節配列またはプロモーターは、ＴＲＳまたはプロモーターが、コード配列の転写を促進する場合、コード配列に機能的に連結されている。機能的に連結されたＴＲＳは、一般に、コード配列とシスで連結されるが、必ずしもそれに直接的に隣接しない。

「異種」は、それが比較される実体とは遺伝子型が異なる実体に由来することを意味する。例えば、遺伝子工学技術によって異なる細胞型中に導入されたポリヌクレオチドは、異種ポリヌクレオチドである（そして、発現される場合、異種ポリペプチドをコードし得る）。同様に、そのネイティブなコード配列から取り出され、異なるコード配列に機能的に連結されたプロモーターなどの転写調節エレメントは、異種転写調節エレメントである。

「ターミネーター」は、リードスルー転写を減少または防止する傾向があるポリヌクレオチド配列を指す（すなわち、ターミネーターの一方の側を起源とする転写が、ターミネーターの他方の側まで継続することを減少または防止する）。転写が中断される程度は、典型的には、塩基配列および／またはターミネーター配列の長さに応ずる。特に、多数の分子生物学的システムにおいて周知であるように、一般に「転写終結配列」と称される特定のＤＮＡ配列は、ＲＮＡポリメラーゼによるリードスルー転写を、おそらくＲＮＡポリメラーゼ分子を停止させること、および／または転写されているＤＮＡから離脱させることによって、中断する傾向がある特定の配列である。そのような配列特異的ターミネーターの典型的な例としては、ポリアデニル化（「ポリＡ」）配列、例えば、ＳＶ４０ポリＡが挙げられる。そのような配列特異的ターミネーターに加えて、またはその代わりに、プロモーターとコード領域との間の比較的長いＤＮＡ配列の挿入もまた、一般に、介在配列の長さに比例して、コード領域の転写を中断する傾向がある。この効果は、おそらく、転写されているＤＮＡからＲＮＡポリメラーゼ分子が離脱するようになるいくらかの傾向が常に存在し、コード領域に到達する前に横切られる配列の長さを増加させることが、一般に、コード領域の転写が完了する前、またはことによると開始される前にさえ離脱が生じる可能性を増加させることから生じる。したがって、ターミネーターは、一方向のみから（「一方向」ターミネーター）または両方向から（「二方向」ターミネーター）の転写を防止し得、配列特異的終結配列もしくは配列非特異的ターミネーター、またはその両方で構成され得る。様々なそのようなターミネーター配列が当該技術分野で既知であり、本発明の文脈内でのそのような配列の例示的な使用が以下に提供される。

「宿主細胞」、「細胞株」、「細胞培養物」、「パッケージング細胞株」、および他のそのような用語は、本発明において、例えば、組換えウイルスまたは組換え融合ポリペプチドを産生するために有用な、ヒト細胞を含む哺乳動物細胞などの高等真核細胞を示す。これらの細胞は、形質導入された元の細胞の子孫を含む。単一細胞の子孫は、必ずしも元の親細胞と完全に同一ではない（形態またはゲノム補完が）場合があることが理解される。

ポリヌクレオチドに適用される「組換え」は、ポリヌクレオチドが、クローニング、制限、および／またはライゲーションステップ、ならびに天然に見出されるポリヌクレオチドとは異なる構築物をもたらす他の手順の種々の組み合わせの産物であることを意味する。組換えウイルスは、組換えポリヌクレオチドを含むウイルス粒子である。この用語は、元のポリヌクレオチド構築物の複製物、および元のウイルス構築物の子孫をそれぞれ含む。

「制御エレメント」または「制御配列」は、ポリヌクレオチドの複製、重複、転写、スプライシング、翻訳、または分解を含む、ポリヌクレオチドの機能調節に寄与する分子の相互作用に関与するヌクレオチド配列である。調節は、プロセスの頻度、速度、または特異性に影響を与え得、本来、増強的または阻害的であり得る。当該技術分野で既知の制御エレメントには、例えば、プロモーターおよびエンハンサーなどの転写調節配列が含まれる。プロモーターは、特定の条件下でＲＮＡポリメラーゼに結合し、通常はプロモーターの下流（３’方向）に位置するコード領域の転写を開始することができるＤＮＡ領域である。プロモーターには、ＡＡＶプロモーター、例えば、Ｐ５、Ｐ１９、Ｐ４０、およびＡＡＶ ＩＴＲプロモーター、ならびに異種プロモーターが含まれる。

「発現ベクター」は、目的の遺伝子産物をコードする領域を含むベクターであり、意図された標的細胞における遺伝子産物の発現をもたらすために使用される。発現ベクターはまた、標的におけるタンパク質の発現を促進するようにコード領域に機能的に連結された制御エレメントを含む。制御エレメントと、発現のためにそれが機能的に連結された１つまたは複数の遺伝子との組み合わせは、時には「発現カセット」と称され、その多数が、当該技術分野で既知であり、利用可能であるか、または当該技術分野で利用可能である構成要素から容易に構築され得る。

「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すために本明細書で互換的に使用される。この用語はまた、修飾された（例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、アセチル化、ホスホニル化、脂質付加、または標識構成要素とのコンジュゲーション）アミノ酸ポリマーを包含する。

「外因性」という用語は、細胞または生物におけるタンパク質、遺伝子、核酸、またはポリヌクレオチドに関連して使用される場合、人工的なまたは天然の手段によって細胞または生物中に導入されたタンパク質、遺伝子、核酸、またはポリヌクレオチドを指す。外因性核酸は、異なる生物もしくは細胞からのものであり得、または生物もしくは細胞内で天然に存在する核酸の１つ以上の追加のコピーであり得る。非限定的な例として、外因性核酸は、天然細胞のものとは異なる染色体位置にあるか、またはそうでなければ、天然に見出されるものとは異なる核酸配列によって隣接されている（例えば、１つの遺伝子からのプロモーターを、異なる遺伝子からの遺伝子産物のオープンリーディングフレームに連結する発現カセット）。

「形質転換された」または「トランスジェニック」は、少なくとも１つの組換えＤＮＡ配列の存在によって変化または増強させられた任意の宿主細胞または細胞株を含むように本明細書で使用される。本発明の宿主細胞は、典型的には、単離された直鎖ＤＮＡ配列としての、プラスミド発現ベクター中のＤＮＡ配列を用いるトランスフェクション、または組換えウイルスベクターでの感染によって産生される。

「配列相同性」という用語は、２つの核酸配列の間の塩基マッチの割合、または２つのアミノ酸配列の間のアミノ酸マッチの割合を意味する。配列相同性がパーセンテージとして表される場合（例えば、５０％）、パーセンテージは、何らかの他の配列と比較される、選択された配列の長さにわたるマッチの割合を示す。ギャップ（２つの配列のいずれかにおける）はマッチングを最大化するために許容され、１５塩基以下のギャップ長が通常使用される（６塩基以下、例えば、２塩基以下）。オリゴヌクレオチドをプローブまたは治療として使用する場合、標的核酸とオリゴヌクレオチド配列との間の配列相同性は、一般に、２０個の可能なオリゴヌクレオチド塩基対マッチのうち１７個以上の標的塩基対マッチ（８５％）、１０個の可能な塩基対マッチのうち９個以上のマッチ（９０％）、または２０個の可能な塩基対マッチのうち１９個以上のマッチ（９５％）である。

２つのアミノ酸配列は、それらの配列の間に部分的なまたは完全な同一性が存在する場合、相同である。例えば、８５％の相同性は、２つの配列が最大のマッチングのために整列させられたときに、アミノ酸の８５％が同一であることを意味する。ギャップ（マッチングされる２つの配列のいずれかにおける）は、マッチングの最大化において許容される（５以下または２以下のギャップ長）。あるいは、２つのタンパク質配列（または少なくとも３０アミノ酸長のそれらに由来するポリペプチド配列）は、変異データマトリックスおよび６以上のギャップペナルティでプログラムＡＬＩＧＮを使用して５超（標準偏差単位）のアラインメントスコアを有する場合、この用語が本明細書で使用されるように相同である。２つの配列またはその部分は、それらのアミノ酸が、ＡＬＩＧＮプログラムを使用して最適に整列させられたときに５０％以上同一である場合、より相同である。

「対応する」という用語は、ポリヌクレオチド配列が参照ポリヌクレオチド配列の全部または一部に構造的に関連すること、またはポリペプチド配列が参照ポリペプチド配列の全部または一部に構造的に関連することを意味するために本明細書で使用され、例えば、それらは少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上、例えば、９９％または１００％の配列同一性を有する。これと対比して、「相補的」という用語は、相補配列が参照ポリヌクレオチド配列の全部または一部に相同であることを意味するために本明細書で使用される。例示のために、ヌクレオチド配列「ＴＡＴＡＣ」は、参照配列「ＴＡＴＡＣ」に対応し、参照配列「ＧＴＡＴＡ」に相補的である。

「配列同一性」という用語は、２つのポリヌクレオチド配列が、比較のウィンドウにわたって（すなわち、ヌクレオチドごとに）同一であることを意味する。「配列同一性のパーセンテージ」という用語は、２つのポリヌクレオチド配列が、比較のウィンドウにわたって（すなわち、ヌクレオチドごとに）同一であることを意味する。「配列同一性のパーセンテージ」という用語は、２つの最適に整列させられた配列を比較のウィンドウにわたって比較し、同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ）が両方の配列において生じる位置の数を決定して、マッチした位置の数を得、マッチした位置の数を比較のウィンドウにおける位置の総数（すなわち、ウィンドウサイズ）で割り、結果に１００を掛けて、配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算される。本明細書で使用される「実質的な同一性」という用語は、ポリヌクレオチド配列の特徴を示し、ここで、ポリヌクレオチドは、少なくとも２０個のヌクレオチド位置の比較ウィンドウにわたって、頻繁には、少なくとも２０～５０個のヌクレオチドのウィンドウにわたって、参照配列と比較して少なくとも８５パーセントの配列同一性、例えば、少なくとも９０～９５パーセントの配列同一性、または少なくとも９９パーセントの配列同一性を有する配列を含み、ここで、配列同一性のパーセンテージは、参照配列を、比較のウィンドウにわたって、参照配列の合計２０パーセント以下になる欠失または付加を含み得るポリヌクレオチド配列と比較することによって計算される。

「保存的」アミノ酸置換は、例えば、極性酸性アミノ酸としてのアスパラギン酸－グルタミン酸、極性塩基性アミノ酸としてのリジン／アルギニン／ヒスチジン、非極性または疎水性アミノ酸としてのロイシン／イソロイシン／メチオニン／バリン／アラニン／グリシン／プロリン、極性または非荷電親水性アミノ酸としてのセリン／スレオニンである。保存的アミノ酸置換はまた、側鎖に基づく群化を含む。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンであり、脂肪族－ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群は、セリンおよびスレオニンであり、アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群は、アスパラギンおよびグルタミンであり、芳香族側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンであり、塩基性側鎖を有するアミノ酸の群は、リジン、アルギニン、およびヒスチジンであり、含硫側鎖を有するアミノ酸の群は、システインおよびメチオニンである。例えば、ロイシンのイソロイシンまたはバリンでの、アスパラギン酸のグルタミン酸での、スレオニンのセリンでの置換、またはアミノ酸の構造的に関連するアミノ酸での同様な置換が、得られるポリペプチドの特性に対する大きな効果を有しないと予想することは合理的である。アミノ酸変化が機能性ポリペプチドをもたらすかどうかは、ポリペプチドの比活性をアッセイすることによって容易に決定され得る。天然に存在する残基は、一般的な側鎖特性に基づいて群に分けられる。（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ、（２）中性親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ、（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ、（４）塩基性：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ、（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ、および（６）芳香族；ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。

本開示はまた、非保存的置換を有するポリペプチドを想定する。非保存的置換は、上記のクラスのうちの１つのメンバーを別のものと交換することを必然的に伴う。

例示的なヒトＡＰＯＥ配列には、以下：

（シグナルペプチドを含む、上記で斜字体で示す）（配列番号８）、ならびにそれに対する少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上、例えば９９％または１００％の配列同一性を有する配列（配列番号９に対応する残基１１２でのＣｙｓ（成熟ポリペプチド番号付け、上記で太字で示すｃ）、および残基１５８でのＣｙｓ（上記で太字で示すｒ）を有するもの（ＡＰＯＥ２）、または配列番号１０に対応する残基１１２でのＡｒｇ（成熟ポリペプチド番号付け）、および残基１５８でのＡｒｇを有するもの（ＡＰＯＥ４）を含む）が含まれるが、これらに限定されず、ここで、一実施形態では、ＡＰＯＥ４は、３１Ｋ、４６Ｐ、７９Ｔ、１３０Ｒ、１６３Ｃ、２９２Ｈ、および／または３１４Ｒを有し得、ＡＰＯＥ２は、４３Ｃ、１５２Ｑ、１５４Ｃ／Ｓ、１６３Ｃ／Ｐ、１６４Ｑ、１７２Ａ、１７６Ｃ、２４２Ｑ、２４６Ｃ、２５４Ｅを有し得る。

配列番号９は、以下を含む。

配列番号１０は、以下を含む。

例示的なヒトＡＰＯＥ核酸配列、例えば、それがＡＰＯＥ２をコードする場合のサイレントヌクレオチド置換配列のためのものには、以下：

または

ならびに、ＡＰＯＥをコードする、それに対する少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上、例えば９９％または１００％の配列同一性を有する配列が含まれるが、これらに限定されない。

組成物および方法
アルツハイマー病（ＡＤ）は、５００万人のアメリカ人を直接的に冒しており、有病率および経済的影響を急速に増加させている。既存の薬物は、基礎疾患プロセスに対してほとんど影響を有さず、現在利用可能な予防療法はない。バリアントＡＰＯＥ４遺伝子の遺伝は、ＡＤの発症の高いリスクを伝え、一方、ＡＰＯＥ２遺伝子の遺伝は、保護的であり、ＡＤを発症するリスクを約５０％低減し、発症年齢を遅延させる。ＡＰＯＥ４は、ＡＤにおける脳アミロイド負荷の増加およびより大きな記憶障害に関連している。逆に、ＡＰＯＥ２は、これらの効果を減弱させる。ヒトにおいて、Ｅ４／Ｅ４ホモ接合型遺伝子型についてのＡＤを発症するオッズ比は１４．９であり、Ｅ２／Ｅ４ヘテロ接合体においては２．６に低減される。ＡＰＯＥ４は、アミロイド産生を促進するその役割のほかに、異常な脳機能と関連し得る。

本開示は、ＡＰＯＥ２の発現のための遺伝子治療ベクター、ＡＰＯＥ４発現を阻害するための配列、ならびにＡＰＯＥ２およびＡＰＯＥ４阻害配列を使用する方法を提供する。

例示的な遺伝子治療ベクター
本開示は、ＡＰＯＥ２をコードし、内因性ＡＰＯＥ４発現の阻害配列を含み得る、または一実施形態では、阻害配列の発現のための別のベクターもしくは阻害ＲＮＡ配列を有する組成物を含み得る核酸配列を含む遺伝子治療ベクターを提供する。遺伝子治療ベクターおよび方法の種々の態様を以下で考察する。各パラメータは別々に考察されるが、遺伝子治療ベクターおよび方法は、例えば、ＡＰＯＥ４関連病理に対する保護を誘起するために、以下に記述されるパラメータの組み合わせを含む。したがって、遺伝子治療ベクターおよび方法に従ってパラメータの任意の組み合わせが使用され得る。

したがって、「遺伝子治療ベクター」は、異種核酸配列を、コードされたタンパク質の合成がそこで生じる好適な宿主細胞中に運ぶ能力を有する任意の分子または組成物である。典型的には、遺伝子治療ベクターは、異種核酸配列（例えば、プロモーターなどの他のベクター配列、またはウイルス配列などのベクター骨格配列に関して異種）を組み込むように、当該技術分野で既知である組換えＤＮＡ技術を使用して操作された核酸分子である。望ましくは、遺伝子治療ベクターは、ＤＮＡで構成されている。好適なＤＮＡベースの遺伝子治療ベクターの例としては、プラスミドおよびウイルスベクターが挙げられる。しかしながら、リポソームまたはナノ粒子などの核酸のみに基づかない遺伝子治療ベクターもまた用いられ得る。遺伝子治療ベクターは、単一の型の核酸（例えば、プラスミド）に基づき得るか、または非核酸分子（例えば、脂質もしくはポリマー）を含み得る。遺伝子治療ベクターは、宿主細胞ゲノム中に組み込まれ得るか、またはエピソームの形態で宿主細胞中に存在し得る。

本開示の範囲内の遺伝子またはｓｉＲＮＡ送達ベクターには、単離された核酸、例えば、染色体外で維持され得るプラスミドベースのベクター、およびウイルスベクター、例えば、組換えアデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、パピローマウイルス、またはアデノ随伴ウイルスが含まれるが、これらに限定されず、リポソーム、例えば、ＤＯＳＰＡ／ＤＯＰＥ、ＤＯＧＳ／ＤＯＰＥ、またはＤＭＲＩＥ／ＤＯＰＥリポソームなどの中性またはカチオン性リポソーム中に存在する、および／あるいはＤＮＡ－抗ＤＮＡ抗体－カチオン性脂質（ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ）複合体または天然もしくは合成ポリマーなどの他の分子と会合したウイルスおよび非ウイルスベクターが含まれる。例示的なウイルス遺伝子送達ベクターを以下に記載する。遺伝子送達ベクターは、頭蓋内、髄腔内、筋肉内、頬側、直腸、静脈内、または冠状動脈内投与を含むが、これらに限定されない、任意の経路を介して投与され得、細胞への移入は、エレクトロポレーションおよび／またはイオントフォレシス、および／または細胞外マトリックスもしくはヒドロゲル、例えば、ヒドロゲルパッチなどの足場を使用して増強され得る。

一実施形態では、遺伝子治療ベクターまたは他のベクターは、ウイルスベクターである。好適なウイルスベクターには、例えば、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベースのベクター、パルボウイルスベースのベクター、例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベースのベクター、ＡＡＶ－アデノウイルスキメラベクター、およびアデノウイルスベースのベクターが含まれる。これらのウイルスベクターは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２００１）、およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９４）に記載される標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して調製され得る。

レトロウイルスベクター
レトロウイルスベクターは、宿主ゲノム中に安定かつ正確に組み込んで、長期導入遺伝子発現を提供するその能力を含むいくつかの特有の特徴を示す。これらのベクターは、全身感染および患者間伝播のリスクを最小化するために、感染性遺伝子粒子を除去するようにエクスビボで操作され得る。シュードタイプ化レトロウイルスベクターは、宿主細胞の向性を変化させ得る。

レンチウイルス
レンチウイルスは、ヒト免疫不全ウイルスおよびネコ免疫不全ウイルスを含むレトロウイルス科に由来する。しかしながら、分裂細胞のみに感染するレトロウイルスとは異なり、レンチウイルスは、分裂細胞および非分裂細胞の両方に感染し得る。レンチウイルスは特異的な向性を有するが、水泡性口内炎ウイルスでのウイルスエンベロープのシュードタイプ化は、より広域のウイルスをもたらす（Ｓｃｈｎｅｐｐ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，６９：４２７（２００２））。

アデノウイルスベクター
アデノウイルスベクターは、ゲノムからのウイルス遺伝子発現を担う初期（Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ）遺伝子を欠失させることによって複製不全にされ得、染色体外形態で宿主細胞中に安定に維持される。これらのベクターは、複製細胞および非複製細胞の両方にトランスフェクトする能力を有する。アデノウイルスベクターは、インビボで治療遺伝子の一過性発現をもたらすことが示されており、７日でピークに達し、約４週間持続する。加えて、アデノウイルスベクターは、非常に高い力価で産生され得、少量のウイルスを用いた効率的な遺伝子治療を可能にする。

アデノ随伴ウイルスベクター
組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）は、非病原性パルボウイルスに由来し、細胞免疫応答を本質的に誘起せず、大部分のシステムにおいて数ヶ月持続する導入遺伝子発現をもたらす。さらに、アデノウイルスと同様に、アデノ随伴ウイルスベクターもまた、複製細胞および非複製細胞に感染する能力を有する。

ＡＡＶベクターには、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、またはＡＡＶｒｈ１０（ＡＡＶゲノムが、キャプシドとは異なる供給源からのものであるキメラウイルスを含む）が含まれるが、これらに限定されない。

プラスミドＤＮＡベクター
プラスミドＤＮＡは、より入念なパッケージングシステムが存在しないために、しばしば「裸のＤＮＡ」と称される。インビボでの心筋細胞へのプラスミドＤＮＡの直接注射が達成されている。プラスミドベースのベクターは、相対的に非免疫原性であり、非病原性であり、細胞ゲノム中に安定的に組み込まれる潜在力を有し、インビボでの有糸分裂後細胞における長期遺伝子発現をもたらす。さらに、プラスミドＤＮＡは、血流中で迅速に分解され、したがって、遠位の器官系における導入遺伝子発現の見込みは無視できる。プラスミドＤＮＡは、巨大分子複合体、例えば、リポソームまたはＤＮＡ－タンパク質複合体の一部として細胞に送達され得、送達は、エレクトロポレーションを含む技術を使用して増強され得る。

例示的なＡＡＶベクター
一実施形態では、本開示は、ＡＰＯＥ２をコードする核酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを提供する。ＡＡＶベクターが、ＡＰＯＥ２をコードする核酸配列から本質的になる場合、ＡＡＶベクターに実質的に影響を与えない追加の構成要素（例えば、ポリ（Ａ）配列、またはインビトロでのベクターの操作を容易にする制限酵素部位などの遺伝子エレメント）が含まれ得る。ＡＡＶベクターが、ＡＰＯＥ２をコードする核酸配列からなる場合、ＡＡＶベクターは、いかなる追加の構成要素（すなわち、ＡＡＶに対して内因性ではなく、核酸配列の発現をもたらすために必要とされない構成要素）も含まない。

アデノ随伴ウイルスは、パルボウイルス科のメンバーであり、約５，０００ヌクレオチド未満の直鎖一本鎖ＤＮＡゲノムを含む。ＡＡＶは、効率的な複製のために、ヘルパーウイルス（すなわち、アデノウイルスまたはヘルペスウイルス）との共感染、またはヘルパー遺伝子の発現を必要とする。治療核酸の投与のために使用されるＡＡＶベクターは、典型的には、ＤＮＡ複製およびパッケージングのための認識シグナルを含有する末端反復（ＩＴＲ）のみが残るように、親ゲノムの約９６％が欠失している。これは、ウイルス遺伝子の発現に起因する免疫学的なまたは毒性の副作用を排除する。さらに、特定のＡＡＶタンパク質を産生細胞に送達することは、所望であれば、ＡＡＶ ＩＴＲを含むＡＡＶベクターの、細胞ゲノムの特定の領域中への組み込みを可能にする（例えば、米国特許第６，３４２，３９０号および第６，８２１，５１１号を参照されたい）。組み込まれたＡＡＶゲノムを含む宿主細胞は、細胞増殖または形態の変化を示さない（例えば、米国特許第４，７９７，３６８号を参照されたい）。

ＡＡＶ ＩＴＲは、非構造複製（Ｒｅｐ）タンパク質および構造キャプシド（Ｃａｐ）タンパク質（ビリオンタンパク質（ＶＰ）としても知られる）のための特有のコードヌクレオチド配列に隣接する。末端の１４５ヌクレオチドは、自己相補的であり、Ｔ字形のヘアピンを形成するエネルギー的に安定な分子内二本鎖が形成され得るように編成されている。これらのヘアピン構造は、細胞ＤＮＡポリメラーゼ複合体のためのプライマーとして作用することによって、ウイルスＤＮＡ複製のための起点として機能する。Ｒｅｐ遺伝子は、Ｒｅｐタンパク質であるＲｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、およびＲｅｐ４０をコードする。Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ６８は、ｐ５プロモーターから転写され、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０は、ｐ１９プロモーターから転写される。Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ６８タンパク質は、増殖性複製の間にヘリカーゼおよびニッカーゼ機能を行って、ＡＡＶ末端の分解を可能にする多機能性ＤＮＡ結合タンパク質である（例えば、Ｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，６１：４４７（１９９０）を参照されたい）。これらのタンパク質はまた、内因性ＡＡＶプロモーター、およびヘルパーウイルス内のプロモーターからの転写を調節する（例えば、Ｐｅｒｅｉｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７１：１０７９（１９９７）を参照されたい）。他のＲｅｐタンパク質は、Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ６８の機能を改変する。ｃａｐ遺伝子は、キャプシドタンパク質であるＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３をコードする。ｃａｐ遺伝子は、ｐ４０プロモーターから転写される。

ＡＡＶベクターは、当該技術分野で既知の任意のＡＡＶ血清型を使用して生成され得る。いくつかのＡＡＶ血清型および１００を超えるＡＡＶバリアントが、アデノウイルスストックから、またはヒトもしくは非ヒト霊長類組織から単離されている（例えば、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，１４（３）：３１６（２００６）において概説されている）。一般に、ＡＡＶ血清型は、核酸配列およびアミノ酸配列のレベルで有意な相同性のゲノム配列を有しており、それによって、異なる血清型は、遺伝子機能の同一のセットを有し、本質的に物理的および機能的に同等であるビリオンを産生し、実質的に同一の機構によって複製し、組み立てられる。ＡＡＶ血清型１～５および７～９は、それらが、全ての他の既存の特徴付けられた血清型に特異的な中和血清と効率的に交差反応しないという点で、「真の」血清型として定義されている。対照的に、ＡＡＶ血清型６、１０（Ｒｈ１０とも称される）、および１１は、「真の」血清型の定義を遵守しないことから、「バリアント」血清型と考えられている。ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）は、その病原性の欠如、広範囲の感染性、および長期導入遺伝子発現を確立する能力に起因して、遺伝子治療適用のために広く使用されている（例えば、Ｃａｒｔｅｒ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１６：５４１（２００５）、およびＷｕ ｅｔ ａｌ．，上記を参照されたい）。種々のＡＡＶ血清型のゲノム配列およびそれらの比較は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ８９７９０、Ｊ０１９０１、ＡＦ０４３３０３、およびＡＦ０８５７１６、Ｃｈｉｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７１：６８２３（１９９７）、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，４５：５５５（１９８３）、Ｃｈｉｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７３：１３０９（１９９９）、Ｒｕｔｌｅｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７２：３０９（１９９８）、およびＷｕ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７４：８６３５（２０００））に開示されている。

ＡＡＶのｒｅｐおよびＩＴＲ配列は、大部分のＡＡＶ血清型にわたって特に保存されている。例えば、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、およびＡＡＶ６のＲｅｐ７８タンパク質は、報告によれば、約８９～９３％同一である（Ｂａｎｔｅｌ－Ｓｃｈａａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７３（２）：９３９（１９９９）を参照されたい）。ＡＡＶ血清型２、３Ａ、３Ｂ、および６は、ゲノムレベルで約８２％の全ヌクレオチド配列同一性を共有することが報告されている（Ｂａｎｔｅｌ－Ｓｃｈａａｌ ｅｔ ａｌ．，上記）。さらに、多くのＡＡＶ血清型のｒｅｐ配列およびＩＴＲは、哺乳動物細胞におけるＡＡＶ粒子の産生の間に、他の血清型からの対応する配列を効率的に交差補完する（例えば、機能的に代わりをする）ことが知られている。

一般に、ＡＡＶ粒子の細胞向性を決定するｃａｐタンパク質、および関連するｃａｐタンパク質コード配列は、異なるＡＡＶ血清型にわたってＲｅｐ遺伝子よりも有意に低く保存されている。他の血清型の対応する配列を交差補完するＲｅｐおよびＩＴＲ配列の能力を考慮すると、ＡＡＶベクターは、血清型の混合物を含み得、それにより「キメラ」または「シュードタイプ化」ＡＡＶベクターであり得る。キメラＡＡＶベクターは、典型的には、２つ以上（例えば、２つ、３つ、４つなど）の異なるＡＡＶ血清型に由来するＡＡＶキャプシドタンパク質を含む。対照的に、シュードタイプ化ＡＡＶベクターは、別のＡＡＶ血清型のキャプシド中にパッケージングされた１つのＡＡＶ血清型の１つ以上のＩＴＲを含む。キメラおよびシュードタイプ化ＡＡＶベクターは、例えば、米国特許第６，７２３，５５１号、Ｆｌｏｔｔｅ，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１３（１）：１（２００６）、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：６３８１（２００４）、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９：１１８５４（２００２）、Ｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１３：６７（２００６）、およびＧａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１３：７７（２００６）にさらに記載されている。

一実施形態では、ＡＡＶベクターは、ヒトに感染するＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ２）を使用して生成される。あるいは、ＡＡＶベクターは、例えば、大型類人猿（例えば、チンパンジー）、旧世界サル（例えば、マカク）、および新世界サル（例えば、マーモセット）などの非ヒト霊長類に感染するＡＡＶを使用して生成される。一実施形態では、ＡＡＶベクターは、ヒトに感染するＡＡＶでシュードタイプ化された非ヒト霊長類に感染するＡＡＶを使用して生成される。そのようなシュードタイプ化ＡＡＶベクターの例は、例えば、Ｃｅａｒｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，１３：５２８（２００６）に開示されている。一実施形態では、ＡＡＶ２逆位末端反復（ＩＴＲ）でシュードタイプ化されたアカゲザルに感染するＡＡＶからのキャプシドタンパク質を含むＡＡＶベクターが生成され得る。特定の実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２ ＩＴＲでシュードタイプ化されたアカゲザルに感染するＡＡＶ１０（「ＡＡＶｒｈ．１０」とも称される）からのキャプシドタンパク質を含む（例えば、Ｗａｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１７（８）：１０４２（２０１０）、およびＭａｏ ｅｔ ａｌ，．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，２２：１５２５（２０１１）を参照されたい）。

ＡＰＯＥ２をコードする核酸配列に加えて、ＡＡＶベクターは、宿主細胞における核酸配列の発現を提供する、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、転写ターミネーター、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）などのような発現制御配列、ならびに一実施形態では、ＡＰＯＥ４ ＲＮＡｉの配列を含み得る。例示的な発現制御配列は、当該技術分野で既知であり、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ．（１９９０）に記載されている。

様々な異なる供給源からの、構成的、誘導性、および抑制可能プロモーターを含む多数のプロモーターが、当該技術分野で周知である。プロモーターの代表的な供給源には、例えば、ウイルス、哺乳動物、昆虫、植物、酵母、および細菌が含まれ、これらの供給源からの好適なプロモーターは、容易に入手可能であるか、または例えば、ＡＴＣＣなどの保管所、ならびに他の商業的または個々の供給源から公的に入手可能な配列に基づいて合成的に作製され得る。プロモーターは、一方向性（すなわち、一方向に転写を開始する）または二方向性（すなわち、３’または５’のいずれかの方向に転写を開始する）であり得る。プロモーターの非限定的な例としては、例えば、Ｔ７細菌発現システム、ｐＢＡＤ（ａｒａＡ）細菌発現システム、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、およびＲＳＶプロモーターが挙げられる。誘導性プロモーターには、例えば、Ｔｅｔシステム（米国特許第５，４６４，７５８号および第５，８１４，６１８号）、エクジソン誘導性システム（Ｎｏ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９３：３３４６（１９９６））、Ｔ－ＲＥＸＴＭシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＬＡＣＳＷＩＴＣＨ（商標）システム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、およびＣｒｅ－ＥＲＴタモキシフェン誘導性リコンビナーゼシステム（Ｉｎｄｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，２７：４３２４（１９９９）、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，２８：ｅ９９（２０００）、米国特許第７，１１２，７１５号、およびＫｒａｍｅｒ ＆ Ｆｕｓｓｅｎｅｇｇｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３０８：１２３（２００５））が含まれる。

本明細書で使用される「エンハンサー」という用語は、例えば、それが機能的に連結している核酸配列の、転写を増加させるＤＮＡ配列を指す。エンハンサーは、核酸配列のコード領域から何キロベースも離れて位置し得、調節因子の結合、ＤＮＡメチル化のパターン、またはＤＮＡ構造の変化を媒介し得る。様々な異なる供給源からの多数のエンハンサーが、当該技術分野で周知であり、クローン化されたポリヌクレオチドとして、またはクローン化されたポリヌクレオチド内で（例えば、ＡＴＣＣなどの保管所、ならびに他の商業的または個々の供給源から）入手可能である。プロモーター（一般的に使用されるＣＭＶプロモーターなど）を含むいくつかのポリヌクレオチドは、エンハンサー配列もまた含む。エンハンサーは、コード配列の上流、コード配列内、またはコード配列の下流に位置し得る。一実施形態では、ＡＰＯＥ２をコードする核酸配列は、ＣＭＶエンハンサー／ニワトリベータアクチンプロモーター（「ＣＡＧプロモーター」とも称される）に機能的に連結される（例えば、Ｎｉｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１０８：１９３（１９９１）、Ｄａｌｙ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９６：２２９６（１９９９）、およびＳｏｎｄｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１５：４８１（２００７）を参照されたい）。

典型的には、ＡＡＶベクターは、十分に特徴付けられたプラスミドを使用して産生される。例えば、ヒト胎児腎臓２９３Ｔ細胞を、導入遺伝子特異的プラスミドのうちの１つと、アデノウイルスヘルパーならびにＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子（必要に応じてＡＡＶｒｈ．１０、８、または９に特異的）を含有する別のプラスミドとを用いてトランスフェクトする。７２時間後、細胞を回収し、ベクターを５回の凍結／解凍サイクルによって細胞から遊離させる。その後の遠心分離およびベンゾナーゼ処理は、細胞デブリおよびキャプシド形成されていないＤＮＡを除去する。各ＡＡＶベクターをさらに精製するために、ヨウジキサノール勾配およびイオン交換カラムを使用し得る。次に、精製されたベクターを、サイズ排除遠心スピンカラムによって必要とされる濃度まで濃縮する。最後に、緩衝液を交換して、１×リン酸緩衝食塩水中に（例えば）製剤化された最終ベクター産物を作製する。ウイルス力価を、ＴａｑＭａｎ（登録商標）リアルタイムＰＣＲによって測定し得、ウイルス純度を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって評価し得る。

医薬組成物およびベクターの送達
本開示は、上記の遺伝子治療ベクターと、薬学的に許容される（例えば、生理学的に許容される）担体と、またはＲＮＡｉの発現のためのベクターを含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる組成物を提供する。組成物が、遺伝子治療ベクターと、薬学的に許容される担体と、から本質的になる場合、組成物に実質的に影響を与えない追加の構成要素（例えば、アジュバント、緩衝剤、安定化剤、抗炎症剤、可溶化剤、保存剤など）が含まれ得る。組成物が、遺伝子治療ベクターと、薬学的に許容される担体と、からなる場合、組成物は、いかなる追加の構成要素も含まない。任意の好適な担体が、本開示の文脈内で使用され得、そのような担体は、当該技術分野で周知である。担体の選択は、部分的に、組成物が投与され得る特定の部位、および組成物を投与するために使用される特定の方法によって決定される。組成物は、任意選択で、本明細書に記載される遺伝子治療ベクターを例外として、無菌であり得る。組成物は、貯蔵のために凍結または凍結乾燥され、使用前に好適な無菌担体中で再構成され得る。組成物は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ（２００１）に記載される従来の技術に従って生成され得る。

組成物に好適な製剤には、水性および非水性溶液、等張無菌溶液（これは、抗酸化剤、緩衝剤、および静菌剤を含有し得る）、ならびに懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、および保存剤を含み得る水性および非水性無菌懸濁液が含まれる。製剤は、単位用量または複数回用量の密封容器、例えば、アンプルおよびバイアル中で提示され得、使用直前に無菌液体担体、例えば、水の添加のみを必要とする、フリーズドライ（凍結乾燥）状態で貯蔵され得る。即時性溶液および懸濁液は、以前に記載された種類の無菌粉末、顆粒、および錠剤から調製され得る。一実施形態では、担体は、緩衝食塩水溶液である。一実施形態では、遺伝子治療ベクターは、投与前に遺伝子治療ベクターを損傷から保護するように製剤化された組成物中で投与される。例えば、組成物は、ガラス器具、シリンジ、または針などの遺伝子治療ベクターを調製、貯蔵、または投与するために使用されるデバイス上での遺伝子治療ベクターの損失を低減するように製剤化され得る。組成物は、遺伝子治療ベクターの光感受性および／または温度感受性を低下させるように製剤化され得る。この目的のために、組成物は、例えば、上記のものなどの薬学的に許容される液体担体、およびポリソルベート８０、Ｌ－アルギニン、ポリビニルピロリドン、トレハロース、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される安定化剤を含み得る。そのような組成物の使用は、遺伝子治療ベクターの有効期間を延長し、投与を容易にし、方法の効率を増加させる。遺伝子治療ベクター含有組成物のための製剤は、例えば、Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｄｅｖｅｌ．，６（２）：１７４－１７８（２００３）およびＷｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，１２：１７１－１７８（２００５））にさらに記載されている

組成物はまた、形質導入効率を高めるように製剤化され得る。加えて、当業者は、遺伝子治療ベクターが、他の治療剤または生物活性剤と共に組成物中に存在し得ることを理解するであろう。例えば、イブプロフェンまたはステロイドなどの炎症を制御する因子は、遺伝子治療ベクターのインビボ投与に関連する腫脹および炎症を低減するために組成物の一部となり得る。免疫系刺激剤またはアジュバント、例えば、インターロイキン、リポ多糖、および二本鎖ＲＮＡは、免疫応答を増強または修飾するために投与され得る。抗生物質、すなわち、殺菌剤および殺真菌剤は、既存の感染症を治療するため、および／または遺伝子治療手順に関連する感染症などの将来の感染症のリスクを低減するために存在し得る。

注射用デポー形態は、ポリラクチド－ポリグリコリドなどの生分解性ポリマー中で、対象化合物のマイクロカプセルマトリックスを形成することによって作製される。ポリマーに対する薬物の比率、および用いられる特定のポリマーの性質に応じて、薬物放出の速度は制御され得る。他の生分解性ポリマーの例としては、ポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物）が挙げられる。デポー注射用製剤はまた、体組織と適合性であるリポソームまたはマイクロエマルジョン中に薬物を封入することによって調製される。

特定の実施形態では、製剤は、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリアルキレン、アクリル酸エステルおよびメタクリル酸エステルのポリマー、ポリビニルポリマー、ポリグリコリド、ポリシロキサン、ポリウレタンおよびそのコポリマー、セルロース、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスチレン、乳酸およびグリコール酸のポリマー、ポリ無水物、ポリ（オルト）エステル、ポリ（酪酸）、ポリ（吉草酸）、ポリ（ラクチド－コ－カプロラクトン）、多糖、タンパク質、ポリヒアルロン酸、ポリシアノアクリレート、およびそれらのブレンド、混合物、またはコポリマーからなる群から選択される生体適合性ポリマーを含む。

組成物は、スポンジ、生体適合性メッシュワーク、機械的リザーバー、または機械的インプラントなどの、制御放出または徐放を可能にするデバイスの中または上で投与され得る。インプラント（例えば、米国特許第５，４４３，５０５号を参照されたい）、デバイス（例えば、米国特許第４，８６３，４５７号を参照されたい）、例えば、植え込み型デバイス、例えば、機械的リザーバー、またはポリマー組成で構成されたインプラントもしくはデバイスは、遺伝子治療ベクターの投与に特に有用である。組成物はまた、例えば、ゲルフォーム、ヒアルロン酸、ゼラチン、コンドロイチン硫酸、ポリホスホエステル、例えば、ビス－２－ヒドロキシエチル－テレフタレート（ＢＨＥＴ）、および／またはポリ乳酸－グリコール酸を含む徐放性製剤（例えば、米国特許第５，３７８，４７５号を参照されたい）の形態で投与され得る。

遺伝子治療ベクターを含む組成物の送達は、当該技術分野で既知のデバイスを使用して、脳内（実質内、脳室内、もしくは大槽内を含むが、これらに限定されない）、髄腔内（腰部もしくは大槽を含むが、これらに限定されない）、または全身（静脈内を含むが、これに限定されない）、あるいはそれらの任意の組み合わせであり得る。送達はまた、植え込まれるデバイスの外科的移植を介したものであり得る。

哺乳動物に投与される組成物中の遺伝子治療ベクターの用量は、哺乳動物のサイズ（質量）、任意の副作用の程度、特定の投与経路などを含むいくつかの要因に依存する。一実施形態では、方法は、「治療有効量」の、本明細書に記載される遺伝子治療ベクターを含む組成物を投与することを含む。「治療有効量」は、所望される治療結果を達成するために、必要な期間および投薬量で、有効な量を指す。治療有効量は、病態の程度、個体の年齢、性別、および体重、ならびに個体において所望される応答を誘発する遺伝子治療ベクターの能力などの要因に応じて変動し得る。特定の治療効果を達成するために必要とされる組成物中の遺伝子治療ベクターの用量は、典型的には、細胞当たりのベクターゲノムコピー（ｇｃ／細胞）またはキログラム体重当たりのベクターゲノムコピー（ｇｃ／ｋｇ）の単位で投与される。当業者は、これらおよび当該技術分野で周知である他の要因に基づいて、特定の疾患または障害を有する患者を治療するための適切な遺伝子治療ベクター用量範囲を容易に決定し得る。治療有効量は、１×１０^１０ゲノムコピー～１×１０^１３ゲノムコピーであり得る。治療有効量は、１×１０^１１ゲノムコピー～１×１０^１４ゲノムコピーであり得る。治療有効量は、１×１０^１２ゲノムコピー～１×１０^１５ゲノムコピーであり得る。治療有効量は、１ｘ１０^１３ゲノムコピー（ｇｃ）～１ｘ１０^１６ｇｃ、例えば、１ｘ１０^１３ｇｃ～１ｘ１０^１４ｇｃ、１ｘ１０^１４ｇｃ～１ｘ１０^１５ｇｃ、または１ｘ１０^１５ｇｃ～１ｘ１０^１４ｇｃであり得る。７０ｋｇのヒトを想定すると、用量範囲は、１．４×１０^８ｇｃ／ｋｇ～１．４×１０^１１ｇｃ／ｋｇ、１．４×１０^９ｇｃ／ｋｇ～１．４×１０^１２ｇｃ／ｋｇ、１．４×１０^１０ｇｃ／ｋｇ～１．４×１０^１３ｇｃ／ｋｇ、または１．４×１０^１１ｇｃ／ｋｇ～１．４×１０^１４ｇｃ／ｋｇであり得る。

一実施形態では、組成物は、哺乳動物に１回投与される。組成物の単回投与は、最小の副作用で哺乳動物においてＡＰＯＥ２の発現、およびＡＰＯＥ４発現の抑制、をもたらすと考えられる。しかしながら、特定の場合では、組成物への細胞の十分な曝露を確実にするために、治療期間の間に組成物を複数回投与することが適切であり得る。例えば、組成物は、治療期間の間に、哺乳動物に２回以上（例えば、２、３、４、５、６、６、８、９、または１０回、またはそれ以上）投与され得る。

したがって、本開示は、治療有効量の、ＡＰＯＥ２をコードする核酸配列とＡＰＯＥ４発現を阻害する配列とを含む遺伝子治療ベクターを含む、薬学的に許容される組成物を提供する。

対象
対象は、ヒトおよび非ヒト動物を含む任意の動物であり得る。非ヒト動物には、全ての脊椎動物、例えば、哺乳動物および非哺乳動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ニワトリ、両生類、および爬虫類が含まれるが、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ、およびウマなどの哺乳動物が対象として想定される。対象はまた、家畜、例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、家禽、およびウマ、またはペット、例えば、イヌおよびネコであり得る。

一実施形態では、対象には、本明細書に記載される医学的疾患および障害に罹患しているか、またはそのリスクがあるヒト対象が含まれる。対象は、一般に、当業者、例えば、医師によってその状態と診断される。

本明細書に記載される方法は、任意の種、性別、年齢、民族集団、または遺伝子型の対象のため用いられ得る。したがって、対象という用語は、男性および女性を含み、高齢者、高齢者～成人の移行年齢にある対象成人、成人～前成人の移行年齢にある対象、ならびに思春期、小児、および乳幼児を含む前成人を含む。

ヒト民族集団の例としては、コーカサス人、アジア人、ヒスパニック、アフリカ人、アフリカ系アメリカ人、ネイティブアメリカン、セム人、およびパシフィックアイランダーズが挙げられる。方法は、コーカサス人、特に北欧人集団、ならびにアジア人集団などのいくつかの民族集団により適切であり得る。

対象という用語はまた、上記のように、それらが治療を必要とする限り、任意の遺伝子型または表現型の対象を含む。加えて、対象は、任意の毛髪の色、眼の色、皮膚の色、またはそれらの任意の組み合わせのための遺伝子型または表現型を有し得る。対象という用語は、任意の身長、体重、または任意の器官もしくは身体部分のサイズもしくは形状の対象を含む。

例示的なナノ粒子製剤
生分解性ナノ粒子（例えば、遺伝子治療ベクターまたは単離された核酸またはＲＮＡｉ発現のためのベクターを含む）は、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ＰＬＡおよびＰＧＡのコポリマー（すなわち、ポリ乳酸－コ－グリコール酸（ＰＬＧＡ））、ポリ－ε－カプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（３－ヒドロキシブチレート）、ポリ（ｐ－ジオキサノン）、ポリプロピレンフマレート、ポリ（オルトエステル）、ポリオール／ジケテンアセタール付加ポリマー、ポリ－アルキル－シアノ－アクリレート（ＰＡＣ）、ポリ（セバシン酸無水物）（ＰＳＡ）、ポリ（カルボキシビスカルボキシフェノキシフェノキシヘキソン）（ＰＣＰＰ）ポリ［ビス（ｐ－カルボキシフェノキシ）メタン］（ＰＣＰＭ）、ＰＳＡ、ＰＣＰＰ、およびＰＣＰＭのコポリマー、ポリ（アミノ酸）、ポリ（シュードアミノ酸）、ポリホスファゼン、ポリ［（ジクロロ）ホスファゼン］およびポリ［（オルガノ）ホスファゼン］の誘導体、ポリヒドロキシ酪酸、またはＳ－カプロン酸、エラスチン、またはゼラチンを含み得るが、これらに限定されない生分解性ポリマー分子を含み得るかまたはそれから形成され得る。（例えば、Ｋｕｍａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｌｏｉｄｓ ａｎｄ Ｓｕｒｆａｃｅｓ Ｂ：Ｂｉｏｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ ７５（２０１０）１－１８、ならびに米国特許第６，９１３，７６７号、第６，８８４，４３５号、第６，５６５，７７７号、第６，５３４，０９２号、第６，５２８，０８７号、第６，３７９，７０４号、第６，３０９，５６９号、第６，２６４，９８７号、第６，２１０，７０７号、第６，０９０，９２５号、第６，０２２，５６４号、第５，９８１，７１９号、第５，８７１，７４７号、第５，７２３，２６９号、第５，６０３，９６０号、および第５，５７８，７０９号、ならびに米国出願公開第２００７／００８１９７２号、ならびに国際出願公開第ＷＯ２０１２／１１５８０６号および第ＷＯ２０１２／０５４４２５号（その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。

生分解性ナノ粒子は、当該技術分野で既知の方法によって調製され得る。（例えば、Ｎａｇａｖａｒｍａ ｅｔ ａｌ．Ａｓｉａｎ Ｊ．ｏｆ Ｐｈａｒｍａ．Ａｎｄ Ｃｌｉｎ．Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ ５，Ｓｕｐｐｌ ３，２０１２，ｐａｇｅｓ １６－２３、Ｃｉｓｍａｒｕ ｅｔ ａｌ．Ｒｅｖ．，Ｒｏｕｍ．Ｃｈｉｍ．，２０１０，５５（８），４３３－４４２、ならびに国際出願公開第ＷＯ２０１２／１１５８０６号、および第ＷＯ２０１２／０５４４２５号（その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。ナノ粒子を調製するための好適な方法には、溶媒蒸発、ナノ沈殿、乳化／溶媒拡散、塩析、透析、および超臨界流体技術を含み得るが、これらに限定されない、予め形成されたポリマーの分散液を利用する方法が含まれ得る。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、ダブルエマルジョン（例えば、水中油中水）を形成し、その後溶媒蒸発を行うことによって調製され得る。開示される方法によって得られたナノ粒子は、所望により、洗浄および凍結乾燥などのさらなる処理ステップに供され得る。任意選択で、ナノ粒子は、保存剤（例えば、トレハロース）と合わされ得る。

典型的には、ナノ粒子は、１ミクロン未満の平均有効径を有し、例えば、ナノ粒子は、約２５ｎｍ～約５００ｎｍ、例えば、約５０ｎｍ～約２５０ｎｍ、約１００ｎｍ～約１５０ｎｍ、または約４５０ｎｍ～６５０ｎｍの平均有効径を有する。粒子のサイズ（例えば、平均有効径）は、透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）、走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）、原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）、光子相関分光法（ＰＣＳ）、ナノ粒子表面積モニター（ＮＳＡＭ）、凝縮式粒子計数器（ＣＰＣ）、微分型電気移動度分析器（ＤＭＡ）、走査型電気移動度粒径測定器（ＳＭＰＳ）、ナノ粒子トラッキング分析（ＮＴＡ）、Ｘ線回折（ＸＲＤ）、エアロゾル飛行時間型質量分析法（ＡＴＦＭＳ）、およびエアロゾル粒子質量分析器（ＡＰＭ）を含み得るが、これらに限定されない当該技術分野で既知の方法によって評価され得る。

生分解性ナノ粒子は、標的細胞による取り込みを容易にするゼータ電位を有し得る。典型的には、ナノ粒子は、０を超えるゼータ電位を有する。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、約５ｍＶ～約４５ｍＶ、約１５ｍＶ～約３５ｍＶ、または約２０ｍＶ～約４０ｍＶのゼータ電位を有する。ゼータ電位は、電気泳動移動度または動的電気泳動移動度を含む特徴によって決定され得る。電気運動現象および電気音響現象を利用して、ゼータ電位を計算し得る。

一実施形態では、非ウイルス送達ビヒクルは、ポリ（乳酸－コ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、異なる分子量（例えば、２、２２、および２５ｋＤａ）を有する直鎖および／もしくは分岐ＰＥＩ、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）およびポリメトアクリレートなどのデンドリマー、カチオン性リポソーム、カチオン性エマルション、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＴＭＡ、ＤＭＲＩＥ、ＤＯＳＰＡ、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ＤＯＰＥ、もしくはＤＣコレステロールを含むが、これらに限定されない脂質、ポリ－Ｌ－リジンもしくはプロタミンを含むが、これらに限定されないペプチドベースのベクター、またはポリ（β－アミノエステル）、キトサン、ＰＥＩ－ポリエチレングリコール、ＰＥＩ－マンノース－デキストロース、ＤＯＴＡＰ－コレステロール、もしくはＲＮＡｉＭＡＸを含むが、これらに限定されないポリマーを含む。

一実施形態では、送達ビヒクルは、種々のポリヌクレオチド型と複合体形成し、ナノ粒子を形成する能力を有する、グリコポリマーベースの送達ビヒクルであるポリ（グリコアミドアミン）（ＰＧＡＡ）である。これらの材料は、種々の炭水化物（Ｄ－グルカレート（Ｄ）、メソ－ガラクタレート（Ｇ）、Ｄ－マンナレート（Ｍ）、およびＬ－タータレート（Ｔ））のメチルエステルまたはラクトン誘導体を、一連のオリゴエチレンアミンモノマー（１～４個のエチレンアミンを含有する）と重合することによって作製される（Ｌｉｕ ａｎｄ Ｒｅｉｎｅｋｅ，２００６）。ポリマー反復単位中のこれらの炭水化物および４つのエチレンアミンから構成されるサブセットは、卓越した送達効率をもたらした。

一実施形態では、送達ビヒクルは、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）、ＰＥＩ－ＰＥＧ、ＰＥＩ－ＰＥＧ－マンノース、デキストラン－ＰＥＩ、ＯＶＡ抱合体、ＰＬＧＡ微粒子、もしくはＰＡＭＡＭでコーティングされたＰＬＧＡ微粒子、またはそれらの任意の組み合わせを含む。開示されるカチオン性ポリマーには、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマーが含まれ得るが、これに限定されない。本開示のナノ粒子を調製するために好適なポリアミドアミンデンドリマーには、第３、第４、第５、または少なくとも第６世代のデンドリマーが含まれ得る。

一実施形態では、送達ビヒクルは、脂質、例えば、Ｎ－［１－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロペル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）、２，３－ジオレイルオキシ－Ｎ－［２－スペルミンカルボキサミド］エチル－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－プロパンアンモニウムトリフルオルアセテート（ＤＯＳＰＡ，Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ－［１－（２，３－ジミリストルオキシ）プロピル］、Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）アンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、３－β－［Ｎ－（Ｎ，Ｎ’－ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）、ジオクタデシルアミドグリセリルスペルミン（ＤＯＧＳ，Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ）、またはイメチルジオクタデクリアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）を含む。カチオン性脂質の正に荷電した親水性頭部基は、通常、第三級および第四級アミン、ポリアミン、アミジニウム、またはグアニジニウム基などのモノアミンからなる。一連のピリジニウム脂質が開発されている（Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．，２００８、ｖａｎ ｄｅｒ Ｗｏｕｄｅ ｅｔ ａｌ．，１９９７、Ｉｌｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００４）。ピリジニウムカチオン性脂質に加えて、他の型の複素環式頭部基には、イミダゾール、ピペリジン、およびアミノ酸が含まれる。カチオン性頭部基の主な機能は、負に荷電した核酸を、わずかに正に荷電したナノ粒子に静電相互作用によって縮合し、細胞取り込みおよびエンドソーム脱出の増強をもたらすことである。

ＤＯＴＭＡ、ＤＯＴＡＰ、およびＳＡＩＮＴ－２、またはＤＯＤＡＣなどの２つの直鎖脂肪酸鎖を有する脂質は、テトラアルキル脂質鎖界面活性剤であるＮ，Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）の二量体と同様に、送達ビヒクルとして用いられ得る。その疎水性鎖長にかかわらず（Ｃ_１６：１、Ｃ_１８：１、およびＣ_２０：１）、全てのトランス配向脂質は、それらのシス配向対応物と比較してトランスフェクション効率を増強させるようである。

送達ビヒクルとして有用なカチオン性ポリマーの構造には、キトサンおよび直鎖ポリ（エチレンイミン）などの直鎖ポリマー、分岐ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）などの分岐ポリマー、シクロデキストリンなどの環様ポリマー、架橋ポリ（アミノ酸）（ＰＡＡ）などのネットワーク（架橋）型ポリマー、ならびにデンドリマーが含まれるが、これらに限定されない。デンドリマーは、そこからいくつかの高度に分岐したアームが「成長」して、対称または非対称の様式で樹様構造を形成する、中心コア分子からなる。デンドリマーの例としては、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）およびポリプロピレンイミン（ＰＰＩ）デンドリマーが挙げられる。

ＤＯＰＥおよびコレステロールは、カチオン性リポソームを調製するために一般的に使用される中性共脂質である。分岐ＰＥＩ－コレステロール水溶性リポポリマー抱合体は、カチオン性ミセルに自己組織化する。非イオン性ポリマーであるＰｌｕｒｏｎｉｃ（ポロキサマー）、ならびにＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｌ６１およびＦ１２７の組み合わせであるＳＰ１０１７もまた使用され得る。

一実施形態では、ＰＬＧＡ粒子は、カプセル化頻度を増加させるために用いられるが、ＰＬＬとの複合体形成もまた、カプセル化効率を増加させ得る。他のカチオン性材料、例えば、ＰＥＩ、ＤＯＴＭＡ、ＤＣ－Ｃｈｏｌ、またはＣＴＡＢは、ナノスフェアを作製するために使用され得る。

一実施形態では、複合体は、ポロキサマー、ポリアクリルアミド、ポリ（２－ヒドロキシエチルメタクリレート）、カルボキシビニルポリマー（例えば、Ｃａｒｂｏｐｏｌ ９３４、Ｇｏｏｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）、セルロース誘導体、例えば、メチルセルロース、酢酸セルロース、およびヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドンもしくはポリビニルアルコール、またはそれらの組み合わせのヒドロゲルを含むが、これらに限定されない材料中に包埋されるか、またはそれにアプライされる。

いくつかの実施形態では、生体適合性ポリマー材料は、コラーゲン、例えば、ヒドロキシル化コラーゲン、フィブリン、ポリ乳酸－ポリグリコール酸、またはポリ無水物などの生分解性ポリマーに由来する。他の例には、任意の生体適合性ポリマー（親水性、疎水性、または両親媒性のいずれでも）、例えば、エチレン酢酸ビニルコポリマー（ＥＶＡ）、ポリメチルメタクリレート、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリテトラフルオロエチレン、Ｎ－イソプロピルアクリルアミドコポリマー、ポリ（エチレンオキシド）／ポリ（プロピレンオキシド）ブロックコポリマー、ポリ（エチレングリコール）／ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド－コ－グリコリド）ブロックコポリマー、ポリグリコリド、ポリラクチド（ＰＬＬＡまたはＰＤＬＡ）、ポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ）、またはポリ（ジオキサノン）（ＰＰＳ）が含まれるが、これらに限定されない。

別の実施形態では、生体適合性材料には、ポリエチレンテレフアレート、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエチレンオキシドおよびポリプロピレンオキシドのコポリマー、ポリグリコール酸およびポリヒドロキシアルカノエートの組み合わせ、ゼラチン、アルギネート、ポリ－３－ヒドロキシブチレート、ポリ－４－ヒドロキシブチレート、ならびにポリヒドロキシオクタノエート、ならびにポリアクリロニトリルポリビニルクロリドが含まれる。

一実施形態では、以下のポリマー、例えば、デンプン、キチン、グリコサミノグリカン、例えば、ヒアルロン酸、デルマタン硫酸、およびクロンドロチン硫酸などの天然ポリマー、ならびに微生物ポリエステル、例えば、ヒドロキシバレレートおよびヒドロキシブチレートコポリマーなどのヒドロキシアルカノエート、ならびに合成ポリマー、例えば、ポリ（オルトエステル）およびポリ無水物、ならびにグリコリドおよびラクチドのホモおよびコポリマーを含む（例えば、ポリ（Ｌ－ラクチド、ポリ（Ｌ－ラクチド－コ－Ｄ，Ｌ－ラクチド）、ポリ（Ｌ－ラクチド－コ－グリコリド、ポリグリコリドおよびポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド）、ポル（Ｄ，Ｌ－ラクチド－コグリコリド）、ポリ（乳酸コリジン）、およびポリカプロラクトンが用いられ得る）。

一実施形態では、生体適合性材料は、単離された細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に由来する。ＥＣＭは、種々の細胞集団、組織、および／または器官の内皮層、例えば、温血脊椎動物の皮膚、肝臓、消化管、気道、腸管、尿路、または生殖器の真皮を含む任意の器官または組織供給源から単離され得る。本発明において用いられるＥＣＭは、供給源の組み合わせからものであり得る。単離されたＥＣＭは、シートとして、粒子形態、ゲル形態などで調製され得る。

生体適合性足場ポリマーは、シルク、エラスチン、キチン、キトサン、ポリ（ｄ－ヒドロキシ酸）、ポリ（無水物）、またはポリ（オルトエステル）を含み得る。より具体的には、生体適合性ポリマーは、ポリエチレングリコール、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、乳酸およびグリコール酸のコポリマー、乳酸およびグリコール酸のポリエチレングリコールとのコポリマー、ポリ（Ｅ－カプロラクトン）、ポリ（３－ヒドロキシブチレート）、ポリ（ｐ－ジオキサノン）、ポリプロピレンフマレート、ポリ（オルトエステル）、ポリオール／ジケテンアセタール付加ポリマー、ポリ（セバシン酸無水物）（ＰＳＡ）、ポリ（カルボキシビスカルボキシフェノキシフェノキシヘキソン（ＰＣＰＰ）ポリ［ビス（ｐ－カルボキシフェノキシ）メタン］（ＰＣＰＭ）、ＳＡ、ＣＰＰ、およびＣＰＭのコポリマー、ポリ（アミノ酸）、ポリ（シュードアミノ酸）、ポリホスファゼン、ポリ[（ジクロロ）ホスファゼン]またはポリ[（オルガノ）ホスファゼン］の誘導体、ポリ－ヒドロキシ酪酸、またはＳ－カプロン酸、ポリラクチド－コ－グリコリド、ポリ乳酸、ポリエチレングリコール、セルロース、酸化セルロース、アルギネート、ゼラチン、またはそれらの誘導体で形成され得る。

したがって、ポリマーは、天然に存在するポリマー、合成ポリマー、またはそれらの組み合わせを含むポリマーを含む広範囲の材料のいずれかで形成され得る。一実施形態では、足場は、生分解性ポリマーを含む。一実施形態では、天然に存在する生分解性ポリマーは、天然に存在するポリマーに由来する合成生分解性ポリマーを提供するために修飾され得る。一実施形態では、ポリマーは、ポリ（乳酸）（「ＰＬＡ」）またはポリ（乳酸－コ－グリコール酸）（「ＰＬＧＡ」）である。一実施形態では、足場ポリマーには、アルギネート、キトサン、ポリ（２－ヒドロキシエチルメタクリレート）、キシログルカン、２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンのコポリマー、ポリ（ビニルアルコール）、シリコーン、疎水性ポリエステルおよび親水性ポリエステル、ポリ（ラクチド－コ－グリコリド）、Ｎ－イソプロイルアクリルアミドコポリマー、ポリ（エチレンオキシド）／ポリ（プロピレンオキシド）、ポリ乳酸、ポリ（オルトエステル）、ポリ無水物、ポリウレタン、２－ヒドロキシエチルメタクリレートおよびメタクリル酸ナトリウムのコポリマー、ホスホリルコリン、シクロデキストリン、ポリスルホンおよびポリビニルピロリジン、デンプン、ポリ－Ｄ，Ｌ－乳酸－パラ－ジオキサノン－ポリエチレングリコールブロックコポリマー、ポリプロピレン、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリ（テトラフルオロエチレン）、ポリ－イプシロン－カプロラクトン、または架橋キトサンヒドロゲルが含まれるが、これらに限定されない。

あるいは、核酸またはベクターは、少なくとも約０．０００１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約０．５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約０．２５ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約０．２５ｍｇ／ｋｇ体重の投薬量で投与され得るが、他の投薬量は有益な結果を与え得る。

あるいは、核酸またはベクターは、少なくとも約０．０００１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約０．５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約０．２５ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約０．２５ｍｇ／ｋｇ体重の投薬量で投与され得るが、他の投薬量は有益な結果を与え得る。

例示的な実施形態
一実施形態では、ＡＰＯＥ２をコードするオープンリーディングフレームおよび３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）を含む核酸配列に機能的に連結されたプロモーターと、ＡＰＯＥ４ ｍＲＮＡの阻害のためのＡＰＯＥ４に対応するＲＮＡｉ配列を有するヌクレオチド配列と、を含む遺伝子治療ベクター、が提供される。一実施形態では、ベクターは、ヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、ヌクレオチド配列は、オープンリーディングフレームに対して５’または３’である。一実施形態では、ヌクレオチド配列は、オープンリーディングフレームに対して５’および３’である。一実施形態では、ヌクレオチド配列は、異なるベクター上にある。一実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。一実施形態では、ウイルスベクターは、ＡＡＶ、アデノウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、またはレトロウイルスベクターである。一実施形態では、ＡＡＶは、ＡＡＶ５、ＡＡＶ９、またはＡＡＶｒｈ１０である。一実施形態では、ＡＰＯＥ４は、ヒトＡＰＯＥ４である。一実施形態では、ＡＰＯＥ２は、ヒトＡＰＯＥ２である。一実施形態では、ヌクレオチド配列は、第２のプロモーターに連結されている。一実施形態では、第２のプロモーターは、ＰｏｌＩＩＩプロモーターである。一実施形態では、ＲＮＡｉは、複数のｍｉＲＮＡ配列を含むｍｉＲＮＡを含む。一実施形態では、ＲＮＡｉは、複数のｓｉＲＮＡ配列を含むｓｉＲＮＡを含む。一実施形態では、オープンリーディングフレームは、複数のサイレントヌクレオチド置換を含む。一実施形態では、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％のコドンは、サイレントヌクレオチド置換を有する。一実施形態では、オープンリーディングフレームは、ペプチドタグをさらに含む。一実施形態では、タグは、ＨＡ、ヒスチジンタグ、ＡｖｉＴａｇ、マルトース結合タグ、Ｓｔｒｅｐ－タグ、ＦＬＡＧ－タグ、Ｖ５－タグ、Ｍｙｃ－タグ、Ｓｐｏｔ－タグ、Ｔ７タグ、またはＮＥ－タグを含む。

ベクターを含む宿主細胞または哺乳動物もまた提供される。一実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞である。一実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。一実施形態では、哺乳動物は、非ヒト霊長類である。一実施形態では、哺乳動物は、ヒトである。

哺乳動物におけるアルツハイマー病を予防、阻害、または治療するための方法であって、哺乳動物に、有効量の、遺伝子治療ベクターを含む組成物を投与することを含む、方法がさらに提供される。

哺乳動物におけるＡＰＯＥ４発現に関連する疾患を予防、阻害、または治療するための方法であって、哺乳動物に、有効量の、遺伝子治療ベクターを含む組成物を投与することを含む、方法が提供される。

一実施形態では、組成物は、ベクターを含むリポソームを含む。一実施形態では、組成物は、核酸を含むナノ粒子を含む。一実施形態では、遺伝子治療ベクターは、ウイルスベクターを含む。一実施形態では、哺乳動物は、Ｅ２／Ｅ４ヘテロ接合体である。一実施形態では、哺乳動物は、Ｅ４／Ｅ４ホモ接合体である。一実施形態では、組成物は、全身投与される。一実施形態では、組成物は、経口投与される。一実施形態では、組成物は、静脈内投与される。一実施形態では、組成物は、局所投与される。一実施形態では、組成物は、注射される。一実施形態では、組成物は、中枢神経系に投与される。一実施形態では、組成物は、脳に投与される。一実施形態では、組成物は、徐放性組成物である。一実施形態では、哺乳動物は、ヒトである。一実施形態では、ＲＮＡｉ配列は、複数のｍｉＲＮＡ配列、例えば、同一のｍｉＲＮＡ配列を含む。

本発明を、以下の非限定的な実施例によって説明する。

実施例１
アルツハイマー病（ＡＤ）は、５００万人のアメリカ人を冒しており、有病率を急速に増加させている。既存の薬物は、基礎疾患プロセスに対してほとんど影響を有さず、現在利用可能な予防療法はない。ＡＰＯＥ４対立遺伝子の遺伝は、疾患の発症の高いリスクを表し、一方、ＡＰＯＥ２対立遺伝子の遺伝は、保護的であり、ＡＤを発症するリスクを≧５０％低減し、発症年齢を遅延させる。ヒトＡＰＯＥ４を発現するＡＤのマウスモデル（ホモ接合型発現）へのヒトＡＰＯＥ２遺伝子のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）送達は、アミロイドβペプチドおよびアミロイド負荷の低減を示した。ＡＤを発症するオッズ比は、Ｅ４／Ｅ４ホモ接合体と比較して、Ｅ２／Ｅ４ヘテロ接合体において低減される（２．６対１４．９）。ヒトＡＰＯＥ２を同時に発現しながらの、ＡＰＯＥ４の抑制（例えば、ＡＡＶベクターの送達を介した）は、ＡＤに対するリスクをなおもさらに低減し得る。一実施形態では、ＡＡＶ療法などの遺伝子治療を、ヒトＡＰＯＥ２遺伝子コード配列および人工ＲＮＡ、例えば、内因性ＡＰＯＥ４を標的とするマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の両方を送達するように設計する。有害な内因性ＡＰＯＥ４発現のノックダウンの、有益なＡＰＯＥ２対立遺伝子の発現との組み合わせは、ＡＰＯＥ４対立遺伝子についてホモ接合型である個体にＡＤ発症からの保護の増強を提供し得る。

一実施形態では、ｓｉＲＮＡは、ｍＲＮＡと相互作用して、翻訳をサイレンシングする。遺伝子治療発現ベクターなどのＤＮＡ配列からｓｉＲＮＡを発現させるために、標的指向配列を、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）またはｍｉＲＮＡ足場中に包埋しなければならない。ベクター発現された人工ｍｉＲＮＡは、内因性ＲＮＡｉに類似しており、２つのプロセシングステップを経る。ｍｉＲＮＡはより低いレベルで発現されることから、それは、遺伝子治療ベクターによる送達に際して肝臓およびＣＮＳの毒性を誘導する可能性がより低い。

一実施形態では、内因性ＡＰＯＥの全てのアイソフォームに対するｍｉＲＮＡを用いたノックダウンを、ＡＰＯＥ ｍＲＮＡの異なるセクションを標的とする複数のｍｉＲＮＡを使用して達成し得、それによりサイレンシングを増強する。一実施形態では、ベクター由来のヒトＡＰＯＥ２は、サイレンシングを防止するために、コード配列中にサイレント変異を含有し得る。

図３に示すように、ＡＰＯＥ４発現を阻害するためのＲＮＡｉ配列を有するｍｉＲＮＡを、５’非コード配列、例えば、イントロン、および／または３’非コード配列中に挿入し得る。例えば、ＡＰＯＥ４のサイレンシングの増強のために、複数のｍｉＲＮＡをタンデムに配置し得る。ｈＡＰＯＥ２－ＨＡおよびｍｉＲＮＡの発現のレベルが類似することが見出された。より低いレベルのｍｉＲＮＡ発現（Ｕ６プロモーターと比較して）が存在し、これは次に、より少ないオフターゲット効果、およびより低い毒性の可能性をもたらす。

一実施形態では（図４を参照されたい）、ＣＡＧなどの構成的プロモーターは、ｈＡＰＯＥ２－ＨＡを駆動し、Ｕ６プロモーター（例示的なＰｏｌＩＩＩプロモーター）プロモーターは、ｍｉＲＮＡを駆動する。一実施形態では、複数のｍｉＲＮＡをタンデムに配置して、ＡＰＯＥ４のサイレンシングを増強する（例えば、２つ、３つ ４つ、またはそれより多いｍｉＲＮＡ）。一実施形態では、ＰｏｌＩＩＩプロモーターを、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、および／またはｍｉＲＮＡの転写のために使用する。一実施形態では、ベクターは、規定されたターミネーターを有し得、例えば、ｐｏｌｙＡは必要でない。なぜなら、ＰｏｌＩＩＩ転写は、非鋳型鎖におけるオリゴ（ｄＴ）ストレッチ（鋳型鎖におけるｄＡ）によって終結されるからである。一実施形態では、２ベクターシステムを用い得、ここで、第２のベクターは、長さを維持し、発現を追跡するために、スタッファー配列（例えば、レポーター遺伝子のための）を含む。

したがって、本開示は、ヒトＡＰＯＥ２遺伝子、およびヒトＡＰＯＥ４を標的とする人工ｍｉＲＮＡの両方を送達するベクター、例えば、ＡＡＶベクターなどのウイルスベクターを提供する。これらの遺伝子治療ベクターを、有益なＡＰＯＥ２対立遺伝子の発現に向けてバランスを傾けることによって、ＡＰＯＥ４ホモ接合型個体（ならびにＥ２／Ｅ４ヘテロ接合体）におけるＡＤ発症のリスクを軽減するために使用し得る。

一実施形態では、ベクターは、ＡＰＯＥ２の増加および／またはＡＰＯＥ４の減少から恩恵を被り得る障害または疾患において有用である。一実施形態では、ベクターを、ＡＤのリスクがあるヒトなどの哺乳動物に送達する。ＡＤは現在、米国において５００万人を冒しており、世界的有病率は、２０３０年までに６５００万人に上昇すると予想されている。ＡＰＯＥ４対立遺伝子の全体的有病率は１５％であり、ＡＤ患者の約５０％が、少なくとも１つのＡＰＯＥ４対立遺伝子を保有している。有害なＡＰＯＥ４遺伝子を、発現の低下のために標的とし、一方、保護的なＡＰＯＥ２の発現を提供し、ＡＰＯＥ２を送達するのみの遺伝子治療と比較して、ＡＰＯＥ４に関連するリスクをさらに低減する。

実施例２
図５は、ｍｉＲＮＡが全てのＡＰＯＥアイソフォーム発現をノックダウンし、ベクター由来のＡＰＯＥ２がｍｉＲＮＡに対して耐性であるシステムを示す。例えば、ＣＡＧプロモーターを使用することによって、ｈＡｐｏＥ２－ＨＡおよびｍｉＲＮＡの発現のレベルは類似しており、より低いレベルのｍｉＲＮＡ発現（Ｕ６プロモーターと比較して）は、サイレンシングはより低いが、しかしながら、より少ないオフターゲットおよび毒性がまた存在することを意味し得る。一実施形態では、ｍｉＲＮＡを、ＣＡＧイントロンまたは３’非翻訳領域中に挿入し得る。

図６は、Ｕ８７細胞におけるｓｉＲＮＡによるＡＰＯＥノックダウン効率の試験を示す。複数のｓｉＲＮＡ設計アルゴリズムの比較に基づいて、ＡＰＯＥのコード配列を標的とする４つの異なるｓｉＲＮＡを生成した。ｓｉＲＮＡを、Ｕ８７細胞（アストログリオーマ細胞株）中にトランスフェクトし、ＡＰＯＥ ｍＲＮＡコピーをＲＴ－ｑＰＣＲによって定量化した。同定された配列は、以下の通りであった。

非標的指向ｓｉＲＮＡは、

である。
ｓｉＲＮＡのための他の配列は、以下を含む。

１つのｓｉＲＮＡ（上記の＃２）からの配列を、ｍｉＲＮＡに変換した。ｍｉｒ１５５の改変バージョンに基づく足場（Ｆｏｗｌｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１５ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，４４：ｅ４８（その開示は参照により本明細書に組み込まれる））を用いた。しかしながら、任意のｍｉＲＮＡ骨格を用い得る（例えば、ｍｉｒ２１、ｍｉｒ３０、またはｍｉｒ３３）。

例えば、ｓｉＲＮＡ＃２からのｍｉＲのために、以下を用い得る。

一実施形態では、ｍｉＲＮＡは、５’マイクロプロセッサ切断部位に対するガイド位置１でのＵまたはＡ、位置２～７、１０～１４、および１７でのＵまたはＡ、ならびに位置１９～２１でのＧまたはＣ、ならびに／あるいは３６．４％～４５．５％のＧ／Ｃ含量、ならびに／あるいはパッセンジャー鎖より２ヌクレオチド長いガイド鎖、ならびに／あるいは（１）ガイド鎖の３～５個の隣接ヌクレオチドが標的鎖と塩基対合しないループ、（２）２個の単一ガイド鎖ヌクレオチドミスマッチが３個のガイド／パッセンジャー塩基対によって隔てられている３ｂｐ間隔のミスマッチ、および／または（３）２個の単一ガイド鎖ヌクレオチドミスマッチが４個のガイド／パッセンジャー塩基対によって隔てられている４ｂｐ間隔のミスマッチ、といったミスマッチのうちの１つ以上を有する。最適なＧＣ含量および位置のために、パッセンジャー鎖におけるミスマッチを選択した。Ｍｆｏｌｄを使用して、ｍｉＲＮＡヘアピン二次構造を予測した。ｍｉＲＮＡの２つのタンデムコピーを、ｐＡＡＶ発現カセットのＣＡＧイントロンまたは３’非翻訳領域のいずれかの中にクローン化した。最大４コピーのｍｉＲＮＡ（その長さの）を、ＡＡＶサイズ限度内で挿入し得る。

ベクター由来のＡＰＯＥ２を、上記の標的指向ｍｉＲＮＡによるサイレンシングに対して耐性となるように改変した（以下の下線を付した配列を参照されたい）。サイレント変化を、ｍｉＲＮＡ標的指向領域のヌクレオチド配列において作製した（赤／太字）。

ベクターからのＡＰＯＥ２：

改変ＡＰＯＥ２：

上記の配列は、ｓｉＲＮＡ＃２に由来する３つのｍｉＲＮＡのための複合認識部位内でのコドン使用を考慮しながら、全ての可能なヌクレオチドをサイレントに変化させる。しかしながら、他の例を以下に示す。
改変ＡＰＯＥ：

改変ＡＰＯＥ：

改変ＡＰＯＥ：

改変ＡＰＯＥ：

改変ＡＰＯＥ：

改変ＡＰＯＥ：

または、
改変ＡＰＯＥ：

ベクターを、マウスなどの非ヒト動物において試験し得る。一実施形態では、ベクターは、ニワトリβアクチンプロモーターの後ろでＡＰＯＥ２を発現するアデノ随伴ウイルスベクター血清型９であるＡＡＶ９－ＣＡＧ－ＡＰＯＥ２ベクター（ＡＡＶ９－ＡＰＯＥ２）からの、またはニワトリβアクチンプロモーターの後ろでＡＰＯＥ２導入遺伝子を発現するアカゲザルアデノ随伴ウイルスベクター血清型１０であるＡＡＶｒｈ．１０－ＣＡＧ－ＡＰＯＥ２ベクター（ＡＡＶｒｈ．１０－ＡＰＯＥ２）からの配列を含む。

ＡＡＶｒｈ．１０およびＡＡＶ９ベクターを、以前に記載されたように産生および精製し得る（Ｓｏｎｄｈｉ ｅｔ ａｌ．，２００７，２０１２；Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００２）。簡潔に述べると、ベクターを、発現カセットプラスミドおよびアデノウイルスヘルパープラスミドを用いたＨＥＫ２９３Ｔ細胞のコトランスフェクションによって産生する。パッケージング細胞株であるＨＥＫ２９３Ｔを、５％ウシ胎仔血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００ｍｇ／ｍＬストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地中で維持し、３７℃、５％ＣＯ_２で維持する。細胞を、ＣｅｌｌＳＴＡＣＫＳ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｔｅｗｋｓｂｕｒｙ，ＭＡ）中にプレーティングして３０％～４０％のコンフルエンスで２４時間置き（または７０％～８０％のコンフルエンスのとき）、続いてＰＥＩｐｒｏ手順を使用してプラスミドを用いたトランスフェクションを行う。細胞を、３７℃で３日間インキュベートした後、回収し、５回の凍結／解凍サイクルによって溶解する。得られた細胞溶解物を、３７℃で３０分間、５０Ｕ／ｍＬのベンゾナーゼで処理する。ＡＡＶｒｈ．１０ベクターについては、細胞溶解物を、ヨウジキサノール密度勾配、それに続くＱ－ＨＰイオン交換クロマトグラフィーによって精製する。ＡＡＶ９ベクターについては、細胞溶解物を、ＰＥＧ中で（ＰＥＧの最終濃度：８％）一晩沈殿させる。遠心分離後、上清を廃棄し、ペレットを１５ｍＬの溶解緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．５）中に再懸濁する。試料を、２４，０００ｒｐｍ（１８２，０００ｇ）、２０℃で２４時間の、ＳＷ２８ローターを使用する３８．５ｍＬポリアロマーチューブ中の１．３７ｇ／ｍＬのＣｓＣｌを通した遠心分離によって精製する。２１ゲージ針（Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｒｅｎｏ，ＮＶ）を遠心チューブの底側を通して挿入し、１ｍＬの画分を収集する。ベクター含有画分を、ベクター構築物の配列を含有する^３２Ｐ標識プローブを用いたドットブロットによって決定する。その後、陽性画分をプールし、１．３７ｇ／ｍＬのＣｓＣｌで希釈し、試料を１３．５ｍＬ Ｑｕｉｃｋ－Ｓｅａｌチューブ中にロードし、超遠心分離器（Ｂｅｃｋｍａｎ ＬＥ－８０Ｋ；Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）９０Ｔｉローター中、６７，０００ｒｐｍ（３８４，０００ｇ）、２０℃で１６～２０時間遠心分離する。画分（０．５ｍＬ）を収集し、陽性画分をプールした。精製したＡＡＶｒｈ．１０またはＡＡＶ９ベクターを、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で濃縮する。ベクターゲノム力価を、Ｔａｑ－Ｍａｎ定量的ポリメラーゼ連鎖反応によって決定する。精製したベクターを無菌濾過し、好気性細菌、嫌気性細菌、または真菌の増殖を支持する培地上での増殖について１４日間試験し、エンドトキシンについて試験し、マイコプラズマ不含であることを実証する。

ＡＡＶ調製物（２ｍＬ、１．０×１０^１０ｖｇまたは別の用量）を、例えば、３３ゲージ針（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）およびシリンジポンプ（ＫＤ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ）を使用して、０．２ｍＬ／分の速度で注射し得る。

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Ｈｕｄｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．，５：２１２ｒａ１６１ （２０１３）．
Ｊｏｈｎｓｏｎ－Ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９４：１５５０ｅ１５５５ （１９９７）．
Ｋｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１０６：２４０７ｅ２４１１ （２００９）．
Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ，６３：２８７ｅ３０３ （２００９）．
Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，３１：１８００７ｅ１８０１２ （２０１１）．
Ｌａｍｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，４５：１４５２ｅ１４５８ （２０１３）．
Ｌｅｍｅｒｅ ａｎｄ Ｍａｓｌｉａｈ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｌ．，６：１０８ｅ１１９ （２０１０）．
Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８７：４４５９３ｅ４４６０１ （２０１２）．
Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｌ．，９：１０６ｅ１１８ （２０１３）．
Ｍａｎｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２３：２３５ｅ２４６ （２００４）．
Ｍｏｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．，６７：１２２ｅ１３１ （２０１０）．
Ｒａｍａｎａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，１９：３５１ｅ３５７ （２０１３）．
Ｒｅｂｅｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ，１１：５７５ｅ５８０ （１９９３）．
Ｒｅｉｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１０６：６８２０ｅ６８２５ （２００９）．
Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖ．，２９：２４ （２０１８）．
Ｓａｆｉｅｈ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１７：６４ （２０１９）．
Ｓａｕｎｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，４３：１４６７ｅ１４７２ （１９９３）．
Ｓｃｈｍｅｃｈｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９０：９６４９ｅ９６５３ （１９９３）．
Ｓｃｈｍｕｅｄ ａｎｄ Ｈｏｐｋｉｎｓ，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．，８７４：１２３ （２０００）．
Ｓｏｎｄｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１５：４８１ｅ４９１ （２００７）．
Ｓｏｎｄｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄ，２３：３２４ｅ３３５ （２０１２）．
Ｓｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９０：１９７７ｅ１９８１ （１９９３）．
Ｓｕｌｌｉｖａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ａｇｉｎｇ，３２：７９１ｅ８０１ （２０１１）．
Ｓｕｌｌｉｖａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２：１７９７２ｅ１７９８０ （１９９７）．
Ｓｕｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｂｉｏｂｅｈａｖ．Ｒｅｖ．，３７：２８７８ｅ２８８６ （２０１３）．
Ｔａｌｂｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ，３４３：１４３２ｅ１４３３ （１９９４）．
Ｔｓｉｒｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９４：９７７９ （１９９７）．
Ｗａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．，１００：３６ｅ４２ （２０００）．
Ｙｏｕｍａｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８７：４１７７４ｅ４１７８６ （２０１２）．
Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，３７：７９ｅ１００ （２０１４）．
Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２９：３６０３ｅ３６１２ （２００９）．
Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ａｇｉｎｇ，４４：１５９ （２０１６）．
Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ，２８：１５８ｅ１６７ （２００２）．

全ての刊行物、特許、および特許出願は、参照により本明細書に組み込まれる。先の明細書において、本発明を、その特定の実施形態との関連で説明し、例示の目的で多くの詳細を記述しているが、本発明には追加の実施形態を受け入れる余地があること、および本明細書に記載される詳細のいくらかは、本発明の基本原理から逸脱することなく相当に変動され得ることは当業者には明白であろう。

Claims (52)

1. ＡＰＯＥ２をコードするオープンリーディングフレームおよび３’非翻訳領域を含む核酸配列に機能的に連結された第１のプロモーターと、
   ＡＰＯＥ４ ｍＲＮＡの阻害のための１つ以上のＲＮＡｉ核酸配列を含む単離されたヌクレオチド配列と
   を含む、遺伝子治療ベクター。
2. 前記ヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のベクター。
3. 前記ヌクレオチド配列が、前記オープンリーディングフレームに対して５’または３’に挿入されている、請求項２に記載のベクター。
4. 前記ヌクレオチド配列が、前記オープンリーディングフレームに対して５’および３’に挿入されている、請求項２に記載のベクター。
5. 前記ヌクレオチド配列が、異なるベクター上にある、請求項１に記載のベクター。
6. 前記単離されたヌクレオチド配列が、前記１つ以上のＲＮＡｉ核酸配列に機能的に連結された第２のプロモーターを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のベクター。
7. 前記遺伝子治療ベクターが、ウイルスベクターである、請求項１～６のいずれか一項に記載のベクター。
8. 前記異なるベクターが、ウイルスベクターである、請求項５に記載のベクター。
9. 前記ウイルスベクターが、ＡＡＶ、アデノウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、またはレトロウイルスベクターである、請求項７または８に記載のベクター。
10. 前記ＡＡＶが、ＡＡＶ５、ＡＡＶ９、またはＡＡＶｒｈ１０である、請求項９に記載のベクター。
11. 前記ＡＰＯＥ４が、ヒトＡＰＯＥ４である、請求項１～１０のいずれか一項に記載のベクター。
12. 前記ＡＰＯＥ２が、ヒトＡＰＯＥ２である、請求項１～１０のいずれか一項に記載のベクター。
13. 前記第１のプロモーターが、ＰｏｌＩプロモーターである、請求項１～１３のいずれか一項に記載のベクター。
14. 前記第２のプロモーターが、ＰｏｌＩＩＩプロモーターである、請求項６に記載のベクター。
15. 前記単離されたヌクレオチド配列が、前記ＲＮＡｉ核酸配列のうちの２つ以上を含む１つ以上のｍｉＲＮＡのための核酸を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載のベクター。
16. 前記ＲＮＡｉが、複数のｓｉＲＮＡ配列を含むｓｉＲＮＡを含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載のベクター。
17. ＡＰＯＥ２のための前記オープンリーディングフレームが、配列番号６に対して複数のサイレントヌクレオチド置換を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載のベクター。
18. 前記ＡＰＯＥ２のオープンリーディングフレームにおける前記複数のサイレントヌクレオチド置換が、前記単離されたヌクレオチド配列における前記ＲＮＡｉ核酸配列中にない、請求項１７に記載のベクター。
19. 前記オープンリーディングフレームにおける少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％のコドンが、サイレントヌクレオチド置換を有する、請求項１６、１７、または１８に記載のベクター。
20. 前記オープンリーディングフレームにおける少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、または４０％のコドンが、サイレントヌクレオチド置換を有する、請求項１６、１７、または１８に記載のベクター。
21. 阻害される前記ＡＰＯＥ４が、配列番号１０を含むポリペプチドに対する少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより多いアミノ酸配列同一性を有する配列を有する、請求項１～２０のいずれか一項に記載のベクター。
22. 前記ＡＰＯＥ２が、配列番号１１によってコードされたポリペプチドに対する少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより多いアミノ酸配列同一性を有する配列を有する、請求項１～２１のいずれか一項に記載のベクター。
23. 前記１つ以上のＲＮＡｉ核酸配列が、配列番号１～４のうちの１つまたはその相補物に対する少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれより多いヌクレオチド配列同一性を有する、請求項１～２２のいずれか一項に記載のベクター。
24. ヒトＡＰＯＥ２をコードするオープンリーディングフレームを含む核酸配列に機能的に連結された第１のプロモーターと、
    ヒトＡＰＯＥ４ ｍＲＮＡの阻害のための１つ以上のＲＮＡｉ核酸配列を有する単離されたヌクレオチド配列と
    を含む、請求項１に記載のベクター。
25. 前記ヌクレオチド配列が、前記オープンリーディングフレームに対して５’に挿入されている、請求項２４に記載のベクター。
26. 前記ヌクレオチド配列が、前記オープンリーディングフレームに対して３’に挿入されている、請求項２４に記載のベクター。
27. 前記ヌクレオチド配列が、前記オープンリーディングフレームに対して５’および３’に挿入されている、請求項２４に記載のベクター。
28. 前記単離されたヌクレオチド配列が、前記１つ以上のＲＮＡｉ核酸配列に機能的に連結された第２のプロモーターを含む、請求項２４～２７のいずれか一項に記載のベクター。
29. 請求項１～２８のいずれか一項に記載の遺伝子治療ベクターと、
    任意選択で、薬学的に許容される担体と
    を含む、組成物。
30. 哺乳動物におけるアルツハイマー病を予防、阻害、または治療するための方法であって、
    前記哺乳動物に、有効量の、請求項１～２８のいずれか一項に記載の遺伝子治療ベクターを含む組成物または請求項２９に記載の組成物を投与すること
    を含む、方法。
31. 哺乳動物におけるＡＰＯＥ４発現に関連する疾患を予防、阻害、または治療するための方法であって、
    前記哺乳動物に、有効量の、請求項１～２８のいずれか一項に記載の遺伝子治療ベクターを含む組成物または請求項２９に記載の組成物を投与すること
    を含む、方法。
32. 前記組成物が、前記遺伝子治療ベクターもしくは前記異なるベクター、またはその両方を含むリポソームを含む、請求項３０または３１に記載の方法。
33. 前記組成物が、前記遺伝子治療ベクターもしくは前記異なるベクター、またはその両方を含むナノ粒子を含む、請求項３０または３１に記載の方法。
34. 前記遺伝子治療ベクターもしくは前記異なるベクター、またはその両方が、ウイルスベクターを含む、請求項３０または３１に記載の方法。
35. 前記哺乳動物が、Ｅ２／Ｅ４ヘテロ接合体である、請求項３０～３４のいずれか一項に記載の方法。
36. 前記哺乳動物が、Ｅ４／Ｅ４ホモ接合体である、請求項３０～３４のいずれか一項に記載の方法。
37. 前記組成物が、全身投与される、請求項３０～３６のいずれか一項に記載の方法。
38. 前記組成物が、経口投与される、請求項３０～３７のいずれか一項に記載の方法。
39. 前記組成物が、静脈内投与される、請求項３０～３７のいずれか一項に記載の方法。
40. 前記組成物が、局所投与される、請求項３０～３７のいずれか一項に記載の方法。
41. 前記組成物が、注射される、請求項３０～３７のいずれか一項に記載の方法。
42. 前記組成物が、中枢神経系に投与される、請求項３０～３７のいずれか一項に記載の方法。
43. 前記組成物が、脳に投与される、請求項３０～３７のいずれか一項に記載の方法。
44. 前記組成物が、徐放性組成物である、請求項３０～４３のいずれか一項に記載の方法。
45. 前記哺乳動物が、ヒトである、請求項３０～４４のいずれか一項に記載の方法。
46. 前記ＲＮＡｉ配列が、ＡＰＯＥ４ ｍＲＮＡの阻害のための前記１つ以上のＲＮＡｉ核酸配列を各々が含む複数のｍｉＲＮＡ配列を含む、請求項３０～４５のいずれか一項に記載の方法。
47. 前記ベクターにおける前記ｍｉＲＮＡ配列のうちの１つが、前記オープンリーディングフレームに対して５’に挿入されており、別のｍｉＲＮＡ配列が、前記オープンリーディングフレームに対して３’に挿入されている、請求項４６に記載の方法。
48. 前記ＲＮＡｉ配列が、ＡＰＯＥ４ ｍＲＮＡの阻害のための前記１つ以上のＲＮＡｉ核酸配列を含むｍｉＲＮＡ配列を含む、請求項３０～４５のいずれか一項に記載の方法。
49. 前記ベクターにおける前記ｍｉＲＮＡ配列が、前記オープンリーディングフレームに対して５’に挿入されている、請求項４８に記載の方法。
50. 前記ベクターにおける前記ｍｉＲＮＡ配列が、前記オープンリーディングフレームに対して３’に挿入されている、請求項４８に記載の方法。
51. 前記ベクターが、前記ＲＮＡｉ配列に機能的に連結されたＰｏｌＩＩＩプロモーターを含む、請求項３０～４５のいずれか一項に記載の方法。
52. 第２のベクターが、前記ＲＮＡｉ配列に機能的に連結されたＰｏｌＩＩＩプロモーターを含む、請求項３０～４５のいずれか一項に記載の方法。

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