BR112016011258B1

BR112016011258B1 - Métodos e composiçôes para o tratamento de depósitos de amiloide

Info

Publication number: BR112016011258B1
Application number: BR112016011258-0A
Authority: BR
Inventors: Beverly L. Davidson; Bradley T. Hyman; Eloise Hudry
Original assignee: The General Hospital Corporation; University Of Iowa Research Foundation
Priority date: 2013-11-20
Filing date: 2014-11-20
Publication date: 2024-03-26

Abstract

MÉTODO PARA A DETERMINAÇÃO DE ABETA EM UM MAMÍFERO ANTES E DEPOIS DO TRATAMENTO DE UM DISTÚRBIO AMILOIDE. A presente descrição fornece métodos para a determinação de A-beta em um mamífero antes e depois do tratamento de um distúrbio amiloide, compreendendo obter uma primeira amostra de sangue do mamífero; administrar ao mamífero um tratamento para um distúrbio amiloide; obter uma segunda amostra de sangue do mamífero; quantificar o nível de A-beta na primeira amostra de sangue e na segunda amostra de sangue; e determinar o nível de A-beta no mamífero antes e depois do tratamento do distúrbio amiloide.

Description

PEDIDO RELACIONADO

[001] Esse pedido reivindica prioridade para o Pedido de Patente Provisório U.S. No. 61/906.811, depositado em 20 de novembro de 2013, cuja totalidade este incorporada aqui por referência.

APOIO DE SUBVENÇÃO FEDERAL

[002] Essa invenção foi feita com apoio governamental sob R00AG33670, NS34568, HD33531, DK54759, 1RC1AG026265-01 e RC1AG036265, concedidos pelo National Institute of Health. O governo tem certos direitos na invenção.

ANTECEDENTES

[003] A transferência com gene é agora amplamente reconhecida como uma ferramenta poderosa para a análise de eventos biológicos e processos de doença em ambos os níveis celular e molecular. Mais recentemente, a aplicação da terapia com gene para o tratamento de doenças humanas, herdadas (por exemplo, deficiência de ADA) ou adquiridas (por exemplo, câncer ou doença infecciosa), tem recebido considerável atenção. Com o advento de técnicas aperfeiçoadas de transferência de gene e a identificação de uma biblioteca ainda em expansão de doenças relacionadas a genes defeituosos, a terapia com gene tem evoluído rapidamente do tratamento teórico para a realidade prática.

[004] Tradicionalmente, a terapia com gene tem sido definida como um procedimento no qual um gene exógeno é introduzido nas células de um paciente a fim de corrigir um erro genético inato. Mais recentemente, a terapia com gene tem sido amplamente definida como a correção de um fenótipo de doença através da introdução de nova informação genética no organismo afetado. Na terapia com gene in vivo, um gene transferido é introduzido nas células do organismo receptor in situ , ou seja, dentro do receptor. A terapia com gene in vivo tem sido examinada em modelos com animais. A possibilidade da transferência direta de gene in situ em órgãos e tecidos tais como músculo, células-tronco hematopoiéticas, a parede arterial, os sistema nervoso e pulmão tem sido relatada. A injeção direta de DNA no músculo esquelético, músculo cardíaco e a injeção de complexos de DNA- lipídeo na vascularização também têm sido relatadas fornecer um nível de expressão detectável dos produtos do gene inserido in vivo.

[005] O tratamento de doenças do sistema nervoso central (SNC), por exemplo, doenças genéticas do cérebro tais como a doença de Alzheimer, permanece um problema intratável. O problema principal cm o tratamento das doenças do cérebro é que as proteínas terapêuticas quando liberadas por via intravenosa não cruzam a abarrei- ra hemato-encefálica ou quando são liberadas diretamente no cérebro, não são amplamente distribuídas. Portanto, as terapias para o tratamento da doença de Alzheimer necessitam ser desenvolvidas.

SUMÁRIO

[006] A presente invenção fornece, em certas modalidades, um método para determinar A-beta em um mamífero antes e depois do tratamento de u distúrbio amiloide, compreendendo: (a) obter uma primeira amostra de sangue do mamífero; (b) administrar ao mamífero um tratamento para um distúrbio amiloide; (c) obter uma segunda amostra de sangue do mamífero; (d) quantificar o nível de A-beta na primeira amostra de sangue e na segunda amostra de sangue; e (e) determinar o nível de A-beta no mamífero antes e depois do tratamento de um distúrbio amiloide.

[007] Em certas modalidades, a presente invenção compreende calcular a proporção do nível de A-beta na primeira amostra com o nível de A-beta na segunda amostra.

[008] Em certas modalidades, a presente invenção compreende comparar o nível de A-beta na primeira amostra com o nível de A-beta na segunda amostra, em que um nível aumentado de A-beta na segunda amostra de sangue quando comparada com a primeira amostra de sangue está associado ou é indicativo de uma diminuição ou redução de placas ou agregados amiloides presentes no cérebro de um mamífero.

[009] Em certas modalidades, a presente invenção compreende ainda comparar o nível de A-beta na primeira amostra com o nível de A-beta na segunda amostra, em que um nível aumentado de A-beta na segunda amostra de sangue quando comparada com a primeira amostra de sangue está associado ou é indicativo de tratamento eficaz do distúrbio amiloide.

[0010] Em certas modalidades, o tratamento compreende administrar ao fluido cérebro-espinhal do mamífero uma partícula de rAAV que compreende uma proteína do capsídeo de AAV e um vetor que compreende um ácido nucleico que codifica uma isoforma protetora da proteína ApoE inseridos entre um par de repetições terminais invertidas (ITRs) de AAV ou adjacentes a uma ou mais ITRs de AAV. Como usada aqui, a expressão "isoforma protetora de ApoE" é usada para distinguir as isoformas de ApoE que diminuem o risco de doença de Alzheimer em pelo menos 5%, tal como 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% ou mais. Em certas modalidades, a partícula rAAV é uma partícula rAAV2 que infecta a célula ependimária de um não roedor em uma taxa de mais do que 20% do que a taxa de infecção de AAV4, tal como em uma taxa de mais do que 50% ou 100%, 1000% ou 2000% do que a taxa de infecção de AAV4.

[0011] Em certas modalidades, o tratamento compreende liberar um ácido nucleico que codifica uma isoforma protetora de ApoE para um mamífero, compreendendo administrar a uma célula ependimária do mamífero uma partícula de rAAV que compreende uma proteína do capsídeo de AAV e um vetor que compreende o ácido nucleico inserido entre um par de repetições terminais invertidas (ITRs) de AAV ou adjacentes a uma ou mais ITRs de AAV e retornando a célula ependi- mária para o mamífero, liberando dessa maneira o ácido nucleico para o mamífero.

[0012] Em certas modalidades, o tratamento compreende liberar um ácido nucleico que codifica uma isoforma protetora de ApoE para uma célula ependimária em um mamífero que compreende administrar ao mamífero uma partícula de rAAV que compreende uma proteína do capsídeo de AAV e um vetor que compreende o ácido nucleico inserido entre um par de repetições terminais invertidas (ITRs) de AAV ou adjacentes a uma ou mais ITRs de AAV, liberando dessa maneira o ácido nucleico para a célula ependimária no mamífero.

[0013] Em certas modalidades, a partícula de rAAV transduz ou transfecta uma célula ependimária no mamífero, em que a célula ependimária transduzida ou transfectada secreta isoformas da proteína ApoE. Em certas modalidades, a partícula de rAAV compreende um capsídeo AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh74 ou Rh10 ou uma variante AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh74 ou Rh10 do capsídeo. Em certas modalidades, a partícula de rAAV compreende uma repetição terminal invertida (ITR) de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh74 ou Rh10 ou uma variante de uma repetição terminal invertida (ITR) AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh74 ou Rh10. Em certas modalidades, a partícula de AAV é uma partícula de rAAV4. Em certas modalidades, a partícula de AAV é uma partícula de rAAV2. Em certas modalidades, o capsídeo de rA- AV2 tem pelo menos 80% de homologia com a proteína do capsídeo VP1, VP2 e/ou VP3 de AAV2. Em certas modalidades, o capsídeo de rAAV2 tem 100% de homologia com VP1, VP2 e/ou VP3 do capsídeo de AAV2.

[0014] Em certas modalidades, o ácido nucleico codifica uma isoforma da proteína ApoE de mamífero. Em certas modalidades, o ácido nucleico codifica uma isoforma da proteína ApoE de humano. Em certas modalidades, a partícula de rAAV compreende uma composição farmacêutica.

[0015] Em certas modalidades, o nível de A-beta na primeira amostra de sangue ou na segunda amostra de sangue é quantificado por um imunoensaio.

[0016] Em certas modalidades, o mamífero é um mamífero não roedor. Em certas modalidades, o mamífero não roedor é um primata, cavalo, ovelha, cabra, porco ou cão. Em certas modalidades, o primata é um ser humano.

[0017] Em certas modalidades, o tratamento compreende um nível aumentado da isoforma protetora da proteína ApoE no cérebro do mamífero. Em certas modalidades, a isoforma protetora de ApoE tem 80% de homologia com ApoE ε2. Em certas modalidades, a isoforma protetora de ApoE tem 100% de homologia com ApoE ε2.

[0018] Em certas modalidades, o distúrbio amiloide compreende a Doença de Alzheimer.

[0019] Em certas modalidades, a amostra de sangue é de sangue total, plasma ou soro.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0020] Figuras 1A-1B. Injeção intraventricular de ApoE de AAV4 leva a expressão estável de huAPOE e uma detecção mantida de proteína huApoE recombinante no cérebro.

[0021] Figura 2. Superexpressão de cada isoforma de ApoE afeta diferencialmente a progressão da amiloidose.

[0022] Figuras 4A-4B. Avaliação post-mortem da carga de amiloi- de confirma os efeitos de ApoE2 e ApoE4 na deposição de amiloide.

[0023] Figura 5A-5D. Cada isoforma de ApoE afeta diferenciada- mente a densidade sináptica em volta dos depósitos amiloides.

[0024] Figura 6A é um alinhamento das proteínas de AAV2 (SEQ ID NO:1) e AAV4 (SEQ ID NO:2) e a Figura 6B é um alinhamento de nucleotídeos de AAV2 (SEQ ID NO:3) e AAV$ (SEQ ID NO:4) baseado na sequência de AAV2 (NC_001401) e AAV4 (NC_001829).

[0025] Figura 7 mostra a atividade elevada de TPP1 em várias regiões do cérebro.

[0026] Figura 8 mostra os resultados do desempenho no labirinto em T de cães de controle e tratados. Os círculos claros são para os cães afetados; quadrados escuros são para cães normais e círculos escuros são para um cão TPP-1 tratado com AAV2-CLN2.

[0027] Figura 9A-9B. Validação da abordagem de transferência do gene APOE pela injeção intraventricular de um sorotipo 4 de AAV. A marcação imuno-histológica de GFP ou ApoE revelou a presença de GFP ou da proteína ApoE humana no epêndima e no plexo coroide. (A) Uso de um ensaio ELISA específico para a espécie para quantificar as concentrações de proteína ApoE humana recombinante dentro de homogenatos cerebrais de camundongos inoculados. (B) Avaliação do percentual de proteína ApoE humana compara com apoE endógena por camundongo. A proporção de ApoE humana e apoE endógena de murino foi calculada para cada animal. Usando o anticorpo 3H1 específico anti-ApoE humana, a presença da proteína re- combinante pode ser detectada em volte de alguns depósitos amiloi- des, onde ela tende a se acumular, dentro do parênquima cortical de camundongos APP/PS1 inoculados. Detecção de ApoE por Western Blot na amostra de ISF de camundongos apoE KO inoculados com um vetor AAV4-APOE4. O anticorpo de cabra anti-apoE altamente sensível (mas não específico para a espécie) da Millipore (AB497) foi usado como anticorpo de detecção. A albumina foi usada como controle. n=4 a 6 animais por grupo. *<0,05.

[0028] Figuras 10A-10D. Os níveis de peptídeos Aβ e a densidade dos depósitos amiloides são modulados pela superexpressão de diferentes alelos de APOE. (A) Análise da densidade de depósitos amiloi- des no córtex (painel esquerdo) e hipocampo (painel direito) de camundongos transgênicos inoculados. Uma tendência similar pode ser observada entre ambas as áreas cerebrais, mas os dados alcançaram significância estatística apenas no córtex. (B) Determinação por ELISA das concentrações de peptídeos Aβ40 e Aβ42 na fração de ácido fórmico (FA). (C) Quantificação por ELISA dos níveis de peptídeos Aβ40 e Aβ42 na fração solúvel em TBS 5 meses depois da injeção intraventricular de cada AAV. (D) Quantificação dos níveis plasmáticos de peptídeos Aβ40, 5 meses depois da injeção intraventricular em camundongos APP/PS1 de vetores AAV-GFP e AAV-APOE2/3/4. n= 4-7 animais por grupo. *p<0,05.

[0029] Figuras 11A-11B. Superexpressão de cada variante de APOE modula diferencialmente a progressão da amiloidose in vivo. Imagens de dois fótons in vivo foram desenvolvidas para a deposição amiloide em camundongos APP/PS1 uma semana (T0), um mês (T1) e dois meses (T2) depois da injeção intracerebroventricular dos vetores AAV-GFP, -APOE2, -3 ou -4. Uma injeção intravenosa de Dextran, Texas red (70.000 Da) foi realizada antes da realização da imagem tal que os mesmos campos da visualização puderam ser acompanhados ao longo do tempo. Dentro de um período de tempo de 2 meses, poucas placas amiloides novas puderam ser detectadas, enquanto que depósitos ocasionais inicialmente visíveis não foram mais detectados depois de um ou dois meses. (A) Avaliação da densidade volumétrica cortical dos depósitos de amiloide depois de um período de tempo de dois meses depois da injeção intraventricular de AAV- GFP, -APOE2, -APOE3 ou APOE4 em camundongos APP/PS1 com 7 meses de idade. Seis dos oito campos visualizados foram fotografados longitudinalmente para cada animal e a densidade das placas foi calculada por volume de córtex e relacionada ao valor inicial para cada animal na linha de base (T0). Uma progressão global de 0,23 da densidade dos depósitos de amiloide foi observada ao longo do tempo (T2/T1, <0,011). Em adição, ApoE2 reduz significativamente a densidade em relação a GFP em 0,66 (se=0,21, p=0,002), em relação a ApoE3 em 0,67 (se=0,17, p<0,0001) e em relação a ApoE4 em 0,74 (se=0,17, p<0,0001). (B) Ajuste da regressão linear da progressão da amiloidose, 2 meses depois da transferência de gene em camundongos APP/PS1 mostra que apenas AAV-APOE4 induz uma inclinação positiva significante durante esse período de tempo. n=4 a 6 animais por grupo. *p<0,05.

[0030] Figura 12. Evolução do tamanho dos depósitos amiloi- des um e dois meses depois da infusão com ApoE2, -3 e -4. Gráficos de dispersão de pontos que representa a proporção de tamanhos de placa entre T1 e T0 mostrou que ApoE4 estava associada com o crescimento aumentado da placa com ambas ApoE2 e ApoE3 depois de um mês. Esse efeito não é sustentado depois de 2 meses. n>50 placas medidas por grupo em 3 a 4 animais. *p<0,05.

[0031] Figuras 13A-13C. As alterações neuropatológicas associadas com os depósitos amiloides são diferencialmente afetadas por cada variante de APOE. Imagens de cortes tomográficos do arranjo imu- no-corados para PSD95 (elemento pós-sináptico) e depósitos amiloi- des em camundongos APP/PS1 dois meses depois da injeção intraventricular de AAV-GFP, -APOE2, -APOE3 e -APOE4 foram prepara- das. Os depósitos amiloides foram marcados usando o anticorpo NAB61 que foi previamente mostrado ser um marcador tóxico preferencialmente para espécies oligoméricas de Aβ. (A) Uma perda significativamente maior do marcador de sinapsina-1 foi observada na vizinhança das placas amiloides quando ambos APOE3 e APOE4 foram expressos comparados com GFP ou APOE2. (B) Um efeito similar foi observado quando os elementos pós-sinápticos foram quantificados, tal que a densidade de PSD95 que circunda os depósitos estava diminuída 2 meses depois de uma injeção intraventricular de AAV4- APOE4. Como um parâmetro adicional da alteração neuropatológica, o número de distrofias neuríticas por placa amiloide foi avaliado no cérebro de camundongos APP/PS1 inoculados, depois da imuno-coloração para ThioS e o marcador axonal SMI312. (C) Uma mudança significativa frente ao número maior de distrofias foi observada quando os camundongos foram infundidos com ApoE4 foi expressa comparada com os grupos com ApoE3 e ApoE2, sugerindo então que ApoE4 pode ter efeitos deletérios além da formação de placas amiloides e pode modular o potencial neurotóxico de agregados amiloides oligoméricos menores. n=4 a 6 animais por grupo. *p<0,05.

[0032] Figura 14. Alterações precoces no conteúdo de espécies de Aβ oligomérico são observadas no ISF depois da injeção intracerebro- ventricular de AAV4-APOE2, -3, -4 em camundongos Tg2576. A quantificação do conteúdo de ISF em oAβ usando o ensaio ELISA 82E1/82E1 mostra que há uma maior concentração de espécie de amiloide β oligomérico depois da injeção de AAV4-APOE4, comparada com AAV4-APOE2 e GFP, enquanto que camundongos inoculados com AAV4-APOE3 atingiram um nível intermediário. n=3 a 6 animais por grupo. *p<0,05.

[0033] Figura 15A-15B. Detecção de mRNA de APOE humana e endógena de murino e da proteína depois da injeção intraventricular de AAV4 em camundongos APP/PS1. (A) Gráficos de caixa que representam as quantidades de proteína apoE endógena de murino nos cérebros de camundongos inoculados. (B) Comparação dos níveis de proteína ApoE 2 e 5 meses depois da injeção intracerebroventricular de AAV4 em camundongos APP/PS1 (as amostras de todos os camundongos inoculados com ApoE foram agrupadas juntas com 2 e 5 meses, sem discriminação da variante de APOE). n=4 a 6 animais por grupo. *<0,05.

[0034] Figura 16A-16C. Efeitos sobre Aβ estão associados com cada isoforma de ApoE depois de uma curta exposição (2 meses). Imagens foram preparadas da deposição de amiloide em camundongos APP/PS1 2 meses depois da injeção. A imuno-coloração usando o anticorpo Bam10 e ThioS foi usada para corar todos os depósitos amiloides ou placas de núcleo denso respectivamente. (A) Análise estereológica da densidade dos depósitos amiloides no córtex revelou que a superexpressão de APOE4 levou a um número aumentado de placas antes de 2 meses depois da injeção, enquanto que nenhuma diferença pode ser observada entre os outros grupos experi-mentais. (B) A proporção entre a coloração com Bam10 e ThioS, por outro lado, permanece inalterada entre todos os diferentes grupos. (C) Determinação das concentrações de peptídeos de Aβ40 (painéis a esquerda) e Aβ42 (painéis a direita) em extratos de ácido fórmico insolúveis depois de uma curta exposição com as diferentes variantes de ApoE. n=3 a 5 animais por grupo. *p<0,05.

[0035] Figuras 17A-17B. Alterações nas espécies solúvel e insolúvel de Aβ detectadas 3 meses depois da injeção em camundongos Tg2576. (A) Quantificação por ELISA do conteúdo de ISF em Aβ40 e Aβ42 (B) mostra que há uma tendência frente a alta concentração de peptídeos de amiloide β solúvel depois da injeção de AAV4- APOE4, comparado com AVV4-APOE2, -APOE3 e GFP. (B) Como previamente observado em camundongos APP/PS1, o efeito mais acentuado foi observado com ApoE4, que induz quantidades significativamente maiores de Aβ42 na fração de ácido fórmico de camundongos Tg2576. n=3 a 5 animais por grupo. *p<0,05.

[0036] Figuras 18A-18B. Transferência de gene de AAV4-APOE pela injeção intracerebroventricular de camundongos APP/PS1. (A) Um ensaio ELISA específico para a espécie foi usado para quantificar as concentrações da proteína APOE humana em homogenatos de cérebro de camundongo depois de 2 e 5 meses. (B) Percentual de APOE humana comparado com Apoe endógena de camundongo depois de 2 ou 5 meses. A proporção entre APOE humana e de murino foi calculada para cada animal.

[0037] Figuras 19A-19D. Peptídeos de Aβ e depósitos de ami- loide são modulados por diferentes alelos de APOE. (A) Análise da densidade dos depósitos amiloides no córtex (painel esquerdo) e hipocampo (painel direito) de camundongos transgênicos APP/PS1 inoculados com AAV4-GFP ou AAV4-APOE2/3/4. (B) Determinação pelo ensaio ELISA das concentrações de Aβ40 e Aβ42 na fração com ácido fórmico (FA) de cérebro de camundongo. (C) Quantificação pelo ensaio ELISA das concentrações de peptídeos de Aβ40 e Aβ42 na fração solúvel de TBS do cérebro de camundongo (A, B, C, D) n= 4 camundongos AAV4-GFP, n= 5 camundongos AAV4-APOE2, n= 6 camun-dongos AAV4-APOE3 e n= 5 camundongos AAV4-APOE4 . *p<0.05.

[0038] Figuras 20A-20B. Variantes de APOE humana modulam diferencialmente a progressão da amiloidose. (A) Avaliação da densidade cortical volumétrica de depósitos de amiloide durante um período de dois meses depois da injeção intraventricular de AAV4- GFP, -APOE2, -APOE3 ou APOE4. Seis a oito campos de visualização foram fotografados longitudinalmente para cada animal. A densidade das placas foi calculada por volume de córtex e foi normalizada para o valor inicial para cada animal na linha de base (T0). (B) Ajuste de regressão linear da progressão da amiloidose durante 2 meses depois da transferência de gene mostra que apenas AAV4-APOE4 induziu uma curva positiva significativa durante esse período de tempo. n= 4 camundongos AAV4-GFP, n= 4 camundongos AAV4-APOE2, n= 6 camundongos AAV4-APOE3 e n= 5 camundongos AAV4-APOE4 . *p<0.05.

[0039] Figura 21. Alteração no tamanho dos depósitos de ami- loide um ou dois meses depois da infusão com APOE2, APOE3 ou APOE4. Gráficos de dispersão de pontos que representam a proporção de tamanhos de placas entre T1 e T0 e (C) entre T2 e T1. n>50 placas medidas por grupo de 3 a 4 animais. *p<0.05.

[0040] Figuras 22A-22C. Alterações neuropatológicas associadas com depósitos de amiloide são diferencialmente afetadas pelas variantes de APOE. (A) Percentual de perda pré-sinaptica (sinapsina I) e (B) pós-sináptica (PSD95) na vizinhança das placas amiloides. (C) Gráfico de barras que representa o número médio de distrofias por surperfície das placas amiloides. n= 4 camundongos AAV4-GFP, n= 4 camundongos AAV4-APOE2, n= 6 camundongos AAV4-APOE3 e n= 5 camundongos AAV4-APOE4 . *p<0.05

[0041] Figura 23. Alterações na espécie de Aβ oligomérica em ISF depois da injeção em camundongos Tg2576. A quantificação do conteúdo no ISF de Aβ oligomérica (o Aβ, como um % de camundongos inoculados com GFP) usando o ensaio ELISA 82E1/82E1 depois da injeção de AAV4-GFP, AAV4-APOE2, AAV4-APOE3 e AAV4- APOE4. n= 3 camundongos AAV4-GFP, n= 3 camundongos AAV4- APOE2, n= 5 camundongos AAV4-APOE3 n= 5 camundongos AAV4- APOE4. *p<0.05.

[0042] Figuras 24A-24D. Detecção de mRNA e proteína APOE humana e endógena de murino depois da injeção intracerebroventricu- lar de AAV4-APOE em camundongos APP/PS1. (A) Análise Western blot de proteínas ApoE recombinante humana e endógena em camundongos inoculados com AAV4-APOE ou AAV4-GFP. (B) Gráficos de caixas que representam as quantidades de proteína apoE endógena de murino nos cérebros de camundongos inoculados. Nenhuma alteração foi detectada 2 ou 5 meses depois da infusão de AAV4-APOE. (C) Gráficos de caixas que representam os níveis de expressão de mRNA de APOE endógeno de murino, normalizados para a quantidade de transcritos de GAPDH. (D) Comparação dos níveis de proteína ApoE 2 e 5 meses depois da injeção intracerebroventricular de AAV4 em camundongos APP/PS1 (amostras de todos os camundongos inoculados com ApoE foram agrupadas com 2 e 5 meses, sem discriminação da variante de APOE). N= 4 a 6 animais por grupo (veja Materiais e Métodos para detalhes). *p<0,05.

[0043] Figuras 25A-25C. Efeitos sobre a patologia de Aβ associada com cada isoforma de ApoE depois de uma curta exposição (2 meses). (A) Análise estereológica da densidade dos depósitos de amiloide no córtex revelou que a superexpressão de APOE4 levou a um número aumentado de placas tão cedo quanto 2 meses depois da injeção, enquanto que nenhuma diferença pode ser observada entre os outros grupos experimentais. (B) A proporção entre a coloração com Bam10 e ThioS, por outro lado, permanece inalterada entre os diferentes grupos. (C) Determinação das concentrações de peptídeos Aβ40 (painéis a esquerda) e Aβ42 (painéis a direita) nos extratos insolúveis de ácido fórmico depois de uma curta exposição com as diferentes variantes de ApoE. n= 4 camundongos AAV4-GFP, n= 4 camundongos AAV4-APOE2, n= 6 camundongos AAV4-APOE3 n= 5 camundongos AAV4-APOE4. *p<0,05

[0044] Figuras 26A-26B. Alterações nas espécies de Aβ solúvel e insolúvel detectadas 3 meses depois da injeção em camun- dongos Tg2576. (A) Quantificação por ELISA do conteúdo de ISF em Aβ40 e Aβ42 mostra que há uma tendência em direção à maior concentração de peptídeos β amiloides depois da injeção de AAV4- APOE4 comparada com AAV4-APOE2, -APOE3 e -GFP. (B) Como previamente observado em camundongos APP/PS1, o efeito mais acentuado foi observado com Apoe4, o que induz quantidades significativamente maiores de Aβ42 na fração de ácido fórmico de camundongos Tg2576. n= 3 camundongos injetados AAV4-GFP, n= 3 camundongos injetados AAV4-APOE2, n= 5 camundongos injetados AAV4-APOE3 n= 5 camundongos injetados AAV4-APOE4. *p<0,05.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0045] Existem várias isoformas diferentes de apolipoproteína E (ApoE) humana, a presença de algumas dessas isoformas no cérebro aumentam o risco de doença de Alzheimer (AD), enquanto que a presença de outras isoformas diminui o risco de AD. A presença da isoforma ApoE ε4 é um fator de risco genético acentuado para AD de início tardio, esporádica. (Casellano et al., Sci Transl Med, 3(89):89ra57 (29 June 2011).). O alelo de ApoE ε4 aumenta acentuadamente o risco de AD e diminui a idade de aparecimento. Por outro lado, a presença do alelo ApoE ε2 parece diminuir o risco de AD. É sugerido que as isoformas humanas de ApoE afetam diferencialmente a depuração ou a síntese de amiloide-β (Aβ) in vivo.

[0046] Vírus adeno-associado (AAD) é um pequeno vírus não patogênico da família parvoviridae. AAV é distinguido de outros membros dessa família pela sua dependência de um vírus auxiliar para a repli- cação. Na ausência de um vírus auxiliar, AAV pode se integrar em um modo específico para o lócus no braço q do cromossomo 19. O geno- ma de AAV de aproximadamente 5 kb consiste em um segmento de DNA de fita simples de polaridade mais ou menos. As extremidades do genoma são repetições terminais invertidas que podem se enovelar em estruturas em grampo e servem como a origem da replicação do DNA viral. Fisicamente, o vírion do parvovírus não é envelopado e seu capsídeo icosaédrico tem aproximadamente 20 nm de diâmetro.

[0047] Até agora oito AAVs sorologicamente diferentes foram identificados e cinco foram isolados de humanos e primatas e são referidos como AAV tipos 1 a 5. Govindasamy et al., "Structurally Mapping the Diverse Phenotype of Adeno-Associated Virus Serotype 4," J. Vir., 80 (23):11556-11570 (2006). O genoma de AAV2 tem 4680 nucleotídeos de extensão e contém duas fases de leitura aberta (ORFs), A ORF esquerda codifica as proteínas Rep não estruturais, Rep 40, Rep 52, Rep 68 e Rep 78, que estão envolvidas na regulação da replicação e na transcrição em adição à produção de genomas da progênie de fita simples. Além disso, duas das proteínas Rep têm sido associadas com a integração preferencial dos genomas de AAV em uma região do braço q do cromossomo 19 humano. Rep68/78 também tem mostrado possuir atividade de ligação a NTP, assim como atividades de helicase de DNA e RNA. As proteínas Rep possuem um sinal de localização nuclear assim como vários sítios de fosforilação e potencial. A mutação de um desses sítios de quinase resultou em perda da atividade de replicação.

[0048] As extremidades do genoma são repetições terminais invertidas (ITR) curtas que possuem o potencial de enovelar em estruturas de grampo em forma de T que servem como a origem da replicação do DNA viral. Dentro da região ITR, dois elementos têm sido descritos que são centrais para a função da ITR, um motivo de repetição GAGC e um sítio de resolução terminal (trs). O motivo de repetição tem mostrado se ligar a Rep quando a ITR está na conformação linear ou em grampo. Essa ligação serve para a posicionar Rep68/78 para a clivagem em trs, o que ocorre de uma maneira específica para o sítio e para a fita. Em adição ao seu papel na replicação, esses dois elementos parecem ser centrais para a integração viral. Contido dentro do cromossomo 19, o lócus de integração é um sítio de ligação a Rep com um trs adjacente. Esses elementos têm sido mostrados serem funcionais e necessários para a integração específica do lócus.

[0049] O vírion de AAV2 é uma partícula não envelopada, iscosa- édrica com aproximadamente 25 nm de diâmetro, consistindo em três proteínas relacionadas referidas como VP1, VP2 e VP3. A ORF direita codifica as proteínas do capsídeo VP1, VP2 e VP3. Essas proteínas são encontradas em uma proporção de 1:1:10, respectivamente e são todas derivadas da ORF do lado direito. As proteínas do capsídeo diferem uma da outra pelo uso de splicing alternativo e um códon de partida incomum. A análise da deleção tem mostrado que a remoção ou alteração de VP1, que é traduzida a partir de uma mensagem alternativamente unida em um rendimento reduzido de partículas de infecção. As mutações dentro da região codificadora de VP3 resultam na falha para produzir qualquer DNA da progênie de fita simples ou partículas infecciosas. Uma partícula de AAV2 é uma partícula viral que compreende uma proteína do capsídeo de AAV2.Um polipeptídeo do capsí- deo de AAV2 pode codificar o polipeptídeo completo de VP1, VP2 e VP3. A partícula pode ser uma partícula que compreende AAV2 e outras proteínas do capsídeo de AAV (isto é, uma proteína quimérica, tal como AAV4 e AAV2). As variações na sequência de aminoácidos da proteína do capsídeo de AAV2 são contempladas aqui, desde que a partícula viral resultante compreenda o capsídeo de AAV2 permaneça antigenicamente ou imunologicamente distinta de AAV4, como pode ser rotineiramente determinado pelos métodos padronizados. Especificamente, por exemplo, ELISA e Western Blots podem ser usados para determinar se uma partícula viral é antigenicamente ou imunologica- mente distinta de AAV4. Além disso, a partícula viral de AAV2 retém preferivelmente o tropismo do tecido distinto de AAV4.

[0050] Uma partícula de AAV2 é uma partícula viral que compreende uma proteína do capsídeo de AAV2. Um polipeptídeo do capsí- deo de AAV2 que codifica o polipeptídeo completo de VP1, VP2 e VP3 pode ter no total pelo menos cerca de 63% de homologia (ou identidade) com o polipeptídeo que tem a sequência de aminoácidos codificada pelos nucleotídeos descritos na SEQ ID NO:1 (proteína do capsí- deo de AAV2). A proteína do capsídeo pode ter cerca de 70% de ho- mologia, cerca de 75% de homologia, 80% de homologia, 85% de ho- mologia, 90% de homologia, 95% de homologia, 98% de homologia, 99% de homologia ou até 100% de homologia com a proteína descrita na SEQ ID NO:1. A proteína do capsídeo pode ter cerca de 70% de identidade, cerca de 75% de identidade, 80% de identidade, 85% de identidade, 90% de identidade, 95% de identidade, 98% de identidade, 99% de identidade ou até 100% de identidade com a proteína descrita na SEQ ID NO:1. A partícula pode ser uma partícula que compreende ambas as proteínas do capsídeo de AAV4 e AAV2, isto é, uma proteína quimérica. Variações na sequência de aminoácidos da proteína do capsídeo de AAV2 são contempladas aqui, desde que a partícula viral resultante que compreende o capsídeo de AAV2 permaneça antigeni- camente ou imunologicamente distinta de AAV4, como pode ser rotineiramente determinado por métodos padronizados. Especificamente, por exemplo, ELISA e Western blots podem ser usados para determinar se uma partícula viral é antigenicamente ou imunologicamente distinta de AAV4. Além disso, a partícula viral de AAV2 preferivelmente retém a distinção do tropismo de AAV4, tal como aquele exemplificado nos exemplos desse, embora uma partícula quimérica de AAV2 que compreende pelo menos uma proteína do revestimento de AAV2 possa ter um tropismo por tecido diferente daquele de uma partícula de AAV2 que consiste apenas nas partículas de revestimento de AAV2.

[0051] Como indicado nas Figuras 6A e 6B, a sequência do cap- sídeo de AAV2 e a sequência do capsídeo de AAV4 são cerca de 60% homólogas. Em certas modalidades, o capsídeo de AAV2 compreende (ou consiste em) uma sequência que é pelo menos cerca de 65% homóloga à sequência de aminoácidos descrita na SEQ ID NO:1.

[0052] Em certas modalidades, a invenção fornece adicionalmente uma partícula de AAV2 contendo, isto é, encapsidando um vetor que compreende um par de repetições terminais invertidas de AAV2. A sequência de nucleotídeos de ITRs de AAV2 é conhecida na técnica. Além disso, a partícula pode ser uma partícula que compreende ambas as proteínas do capsídeo de AAV4 e AAV2, isto é, uma proteína quimérica. Além disso, a partícula pode ser uma partícula que encap- sida um vetor que compreende um par de repetições terminais invertidas de AAV de outros AAVs (por exemplo, AAV1-AAV8). O vetor en- capsidado na partícula compreende adicionalmente um ácido nucleico exógeno inserido entre as repetições terminais invertidas.

[0053] As características a seguir de AAV o tornam um vetor atrativo para a transferência de gene. Vetores de AAV têm sido mostrados integrar estavelmente no genoma celular in vitro; possuem uma ampla faixa de hospedeiros; transduzem ambas as células que se dividem e que não se dividem in vitro e in vivo e mantêm altos níveis de expressão dos genes transduzidos. As partículas virais são termicamente estáveis, resistentes aos solventes, detergentes, alterações de pH, temperatura e podem ser concentrados em gradientes de CsCl. A integração de pró-virus de AAV não está associada com quaisquer efeitos negativos em longo prazo sobre o crescimento ou a diferenciação celular. As ITRs têm mostrado ser apenas elementos em cis necessários para a replicação, envelopamento e integração e podem conter algumas atividades de promotor.

[0054] A presente invenção fornece métodos de administração de partículas de AAV, vetores de AAV recombinantes e vírions de AAV recombinantes. Por exemplo, uma partícula de AAV2 é uma partícula viral que compreende uma proteína do capsídeo de AAV2 ou uma partícula de AAV4 é uma partícula viral que compreende uma proteína do capsídeo de AAV4. Um vetor recombinante de AAV2 é um construto de ácido nucleico que compreende pelo menos um único ácido nuclei- co de AAV2. Um vírion de AAV2 recombinante é uma partícula que contém um vetor de AAV2 recombinante. Para ser considerado dentro da expressão "ITRs de AVV2", a sequência de nucleotídeos deve reter uma ou ambas as características aqui descritas que distinguem a ITR de AVV2 da ITR de AVV4: (1) três (ao invés de quatro como em AVV4) repetições "GAGC" e (2) no sítio de ligação de Rep de ITR de AVV2, o quarto nucleotídeo na primeira das duas repetições "GAGC" é um C ao invés de um T.

[0055] O promotor pode ser qualquer promotor desejado, selecionado pelas considerações conhecidas, tais como o nível de expressão de um ácido nucleico funcionalmente ligado ao promotor e o tipo de célula na qual o vetor vai ser usado. Promotores podem ser promotores exógenos ou endógenos. Promotores podem inclui, por exemplo, promotores fortes conhecidos tais como SV40 ou o promotor induzível de metalotioneína ou um promotor de AAV, tal como um promotor p5 de AAV. Exemplos adicionais de promotores incluem promotores derivados de genes de actina, genes de imunoglobulina, citomegalovírus (CMV), adenovírus, vírus do papiloma bovino, promotores adenovirais, tais como o promotor tardio principal adenoviral, um promotor induzível de choque térmico, vírus sincicial respiratório, vírus do sarcoma de Rous (RSV), etc. Especificamente, o promotor pode ser um promotor p5 de AAV2 ou um promotor p5 de AAV4. Além disso, fragmentos menores do promotor p5 que retenham atividade de promotor podem ser facilmente determinados pelos procedimentos padronizados que incluem, por exemplo, construir uma série de deleções no promotor p5, li- gar a deleção a um gene repórter e determinar se o gene repórter é expresso, isto é, transcrito e/ou traduzido.

[0056] O vetor de AAV pode compreender adicionalmente um ácido nucleico exógeno (heterólogo) funcionalmente ligado ao promotor. Por "ácido nucleico heterólogo" é compreendido que qualquer ácido nucleico heterólogo ou exógeno pode ser inserido no vetor para a transferência para uma célula, tecido ou organismo. Por exemplo, em certas modalidades, o ácido nucleico heterólogo codifica uma isoforma protetora de ApoE. Por "funcionalmente ligado" entende-se que tal promotor pode promover a expressão do ácido nucleico heterólogo, como é conhecido na técnica, tal como a orientação apropriada do promotor em relação ao ácido nucleico heterólogo. Além disso, o ácido nucleico heterólogo preferivelmente tem todas as sequências apropri-adas para a expressão do ácido nucleico como é conhecido na técnica para codificar funcionalmente, isto é, permitir que o ácido nucleico seja expresso. O ácido nucleico pode incluir, por exemplo, sequências de controle da expressão, tais como um intensificador e sítio de processamento da informação necessários, tais como sítios de ligação ao ribossomo, sítios de splice do RNA, sítios de poliadenilação e sequências terminadoras da transcrição. O ácido nucleico pode codificar mais do que um produto de gene, limitado apenas pelo tamanho do ácido nucleico que pode ser empacotado.

[0057] Uma partícula de AAV2 é uma partícula viral que compreende uma proteína do capsídeo de AAV2. Variações na sequência de aminoácidos da proteína do capsídeo de AAV2 são contempladas aqui, desde que a partícula viral resultante que compreende o capsí- deo de AAV2 permaneça antigenicamente ou imunologicamente distinto de AAV4, como pode ser rotineiramente determinado pelos métodos padronizados. Especificamente, por exemplo, ELISA e Western blots podem ser usados para determinar se uma partícula viral é antigeni- camente ou imunologicamente distinta de outros sorotipos de AAV.

[0058] AAV4 é um membro único da família de AAV. Uma discussão sobre AAV4 é fornecida na Patente US No. 6.468.524, que está incorporada aqui por referência. Os dados da hibridização de DNA indicaram um nível similar de homologia para AAV1-4. Entretanto, em contraste com outros AAVs, apenas uma ORF que corresponde as proteínas do capsídeo foi identificada em AAV4 e nenhuma ORF foi detectada para as proteínas Rep. A presente invenção fornece um vetor que compreende o vírus AAV4 assim como partículas virais de AAV4. Embora AAV4 seja similar a AAV2, os dois vírus são encontrados serem fisicamente e geneticamente diferentes. Essas diferenças dotam AAV4 com algumas vantagens únicas que o adequam melhor como um vetor para a terapia de gene. Por exemplo, o genoma de AAV4 do tipo selvagem é maior do que AAV2, o que permite a encap- sidação eficiente de um genoma recombinante maior. Além disso, as partículas de AAV4 de tipo selvagem possuem uma densidade flutuante maior do que as partículas de AAV2 e, portanto, são mais facilmente separadas do vírus auxiliar contaminante e partículas de AAV vazias do que partículas baseadas em AAV2. Adicionalmente, em contraste com AAV1, 2 e 3, AAV4 é capaz de hemaglutinar eritrócitos humanos, de porco da guiné e de carneiros.

[0059] Em certas modalidades, a presente invenção fornece um vetor que compreende o vírus AAV5 ou um vetor que compreende subpartes do vírus, assim como partículas virais de AAV5.Uma discussão sobre AAV5 é fornecida na Patente US No. 6.855.314, que está incorporada aqui por referência. Embora AAV5 seja similar a AAV2, os dois vírus são encontrados serem fisicamente e geneticamente diferentes. Essas diferenças dotam AAV5 com algumas vantagens únicas que o adequam melhor como um vetor para a terapia de gene. Por exemplo, um dos aspectos limitantes do uso de AAV2 como um vetor para a terapia de gene é a produção de uma grande quantidade de vírus. Usando técnicas de produção padronizadas, AAV5 é produzido em um nível 10 a 50 vezes maior comparado com AAV2. Devido ao seu único sítio TRS e s proteínas Rep, AAV5 deve ter também um ló- cus de integração distinto comparado com AAV2.

[0060] Além disso, a proteína do capsídeo de AAV5, surpreendentemente de novo, é distinta da proteína do capsídeo de AAV2 e exibe tropismo tecidual diferente, tronando assim partículas que contêm o capsídeo de AAV5 adequadas para transduzir tipos celulares para os quais AAV2 é inadequado ou menos bem adequado. AAV2 e AAV5 têm mostrado serem sorologicamente distintos e, portanto, em uma aplicação terapia de gene, AAV5 e vetores derivados de AAV5 permitem a transdução de um paciente que já possui anticorpos neutralizan- tes para AAV2 como resultado de defesa imunológica natural ou da exposição prévia a vetores de AAV2. Outra vantagem de AAV5 é que AAV5 não pode ser resgatado por outros sorotipos. Apenas AAV5 pode resgatar o AAV5 integrado no genoma e efetuar a replicação, evitando assim a replicação não intencional de AAV5 causada pelos outros sorotipos de AAV.

[0061] A expressão "polipeptídeo" como usada aqui se refere a um polímero de aminoácidos e inclui proteínas de extensão completa e seus fragmentos. Portanto, "proteína", "polipeptídeo" e "peptídeo" são frequentemente usados alternativamente aqui. As substituições podem ser selecionadas pelos parâmetros conhecidos para serem neutras. Como será apreciado por aqueles versados na técnica, a invenção também inclui aqueles polipeptídeos que possuem variações discretas nas sequências de aminoácidos ou outras propriedades. Tais variações podem surgir naturalmente como variações alélicas (por exemplo, devidas ao polimorfismo genético) ou podem ser produzidas pela intervenção humana (por exemplo, pela mutagênese de sequências de DNA clonadas) tal como mutantes pontuais induzidos, por deleção, inserção e substituição. Alterações menores na sequência de aminoá- cidos são geralmente preferidas, tais como substituições conservativas de aminoácidos, pequenas deleções internas ou inserções e adições ou deleções nas extremidades das moléculas. Essas modificações podem resultar em alterações na sequência de aminoácidos, fornecer mutações silenciosas, modificar um sítio de restrição ou fornecer outras mutações específicas.

[0062] O presente método fornece um método para a liberação de um ácido nucleico em uma célula, compreendendo administrar à célula um vetor que compreende uma partícula de AAV, compreendendo o ácido nucleico inserido entre um par de repetições terminais invertidas (ITR) de AAV ou adjacentes a um ou mais ITRs de AAV, liberando dessa maneira o ácido nucleico para a célula. A administração à célula pode ser obtida por qualquer meio, incluindo simplesmente contatar a partícula, opcionalmente contida em um líquido desejado tal como um meio de cultura do tecido ou uma solução salina tamponada, com as células. A partícula pode ser deixada permanecer em contato com as células por qualquer extensão de tempo desejada e, tipicamente, a partícula é administrada e deixada permanecer indefinidamente. Para tais métodos in vitro, os vírus podem ser administrados à célula pelos métodos de transdução viral padronizada, como conhecido na técnica e como exemplificado aqui. Títulos de vírus para administrar podem variar, dependendo particularmente do tipo celular, mas poderão ser típicos daqueles usados para a transdução de AAV em geral. Adicionalmente, os títulos usados para transduzir as células em particular nos presentes exemplos podem ser utilizados. As células podem incluir quaisquer células desejadas em humanos assim como de outros grandes mamíferos (não roedores), tais como primatas, cavalos, carneiros, cabras, porcos e cães.

[0063] Mais especificamente, a presente invenção fornece um método de liberação de um ácido nucleico para uma célula ependimária, compreendendo administrar à célula ependimária uma partícula de AAV que contém um vetor que compreende o ácido nucleico inserido entre um par de repetições terminais invertidas (ITRs) de AAV ou adjacente a uma ou mais ITRs de AAV, liberando dessa maneira o ácido nucleico para a célula ependimária.

[0064] A presente invenção também inclui um método de liberação de um ácido nucleico para um indivíduo, compreendendo administrar a uma célula do indivíduo uma partícula de AAV que compreende o ácido nucleico inserido entre um par de repetições terminais invertidas (ITRs) de AAV ou adjacente a uma ou mais ITRs de AAV e retornando a célula para o indivíduo, liberando dessa maneira o ácido nucleico para o indivíduo. Em certas modalidades, as ITRs de AAV podem ser ITRs de AAV2. Para tal administração ex vivo, as células são isoladas de um indivíduo por meios padronizados de acordo com o tipo celular e colocadas em um meio de cultura adequado, novamente de acordo com o tipo celular. Partículas virais são então contatadas com as célu-las como descrito acima e o vírus é deixado transfectar as células. As células podem então ser transplantadas de volta para o corpo do indivíduo, novamente por meios padronizados para o tipo de célula e de tecido. Se desejado, antes do transplante, as células podem ser estudadas quanto ao grau de transfecção pelo vírus, por meios de detecção conhecidos e como aqui descritos.

[0065] A presente invenção fornece um método de liberação de um ácido nucleico para uma célula em um indivíduo, compreendendo administrar ao indivíduo uma partícula de AAV que compreende o ácido nucleico inserido entre um par de repetições terminais invertidas (ITRs) de AAV ou adjacente a uma ou mais ITRs de AAV, liberando dessa maneira o ácido nucleico para a célula do indivíduo. A adminis- tração pode ser uma administração ex vivo diretamente a uma célula removida do indivíduo, tal como qualquer uma das células listadas acima, seguida pela recolocação da célula de volta no indivíduo ou a administração pode ser uma administração in vivo em uma célula no indivíduo. Para a administração ex vivo, as células são isoladas do indivíduo por meios padronizados para o tipo de célula e colocadas em meio de cultura, novamente de acordo com o tipo de célula. As partículas virais são então contatadas com as células como descrito acima e o vírus é deixado transfectar as células. As células podem então ser transplantadas de volta para o corpo do indivíduo, novamente por meios padronizados para o tipo de célula e tecido. Se desejado, antes do transplante, as células podem ser estudadas quanto ao grau de trans- fecção pelos vírus, por meios conhecidos e como aqui descritos.

[0066] Também é fornecido um método de liberação de um ácido nucleico em uma célula ependimária em um indivíduo, compreendendo administrar ao indivíduo uma partícula de AAV que compreende o ácido nucleico inserido um par de repetições terminais invertidas (ITRs) de AAV ou adjacentes a uma ou mais ITRs de AAV, liberando dessa maneira o ácido nucleico para a célula ependimária no indivíduo.

[0067] Em certas modalidades, a sequência de aminoácidos que atinge o endotélio vascular cerebral atinge o endotélio vascular cerebral de um indivíduo que tem uma doença, por exemplo, doença de Alzheimer.

[0068] Em certas modalidades, a sequência de aminoácidos que atinge o endotélio vascular cerebral atinge o endotélio vascular cerebral de um indivíduo que não tem a doença de Alzheimer.

[0069] Em certas modalidades, o vetor viral compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica um agente terapêutico. Em certas modalidades, o agente terapêutico é uma isoforma protetora de ApoE.

[0070] Certas modalidades da presente descrição fornecem uma célula que compreende um vetor viral como aqui descrito.

[0071] Em certas modalidades, a célula é uma célula de mamífero de um mamífero não roedor. Em certas modalidades, a célula é uma célula de primata. Em certas modalidades, a célula é uma célula humana. Em certas modalidades, a célula é uma célula não humana. Em certas modalidades, a célula está in vitro. Em certas modalidades, a célula está in vivo. Em certas modalidades, a célula é uma célula ependimária.

[0072] Certas modalidades da presente descrição fornecem um método de tratamento de uma doença em um mamífero, compreendendo administrar um vetor viral ou uma célula como aqui descrito ao mamífero.

[0073] Em certas modalidades, o mamífero é um ser humano.

[0074] Certas modalidades da presente descrição fornecem um método para liberar um agente no sistema nervoso central de um indivíduo, compreendendo administrar ao CSF um vetor viral aqui descrito, tal que as células ependimária transduzidas expressam o agente terapêutico e liberam o agente no sistema nervoso central do indivíduo. Em certas modalidades, o vetor viral transduz células ependimá- rias.

[0075] Certas modalidades da presente descrição fornecem um vetor viral ou célula como aqui descrito para uso em tratamentos médicos.

[0076] Certas modalidades da presente descrição fornecem um vetor viral ou célula como aqui descrito para preparar um medicamento útil para tratar uma doença, por exemplo, doença de Alzheimer em um mamífero.

[0077] O vetor pode compreender adicionalmente uma isoforma protetora da proteína ApoE. Como usada aqui, a expressão "proteína secretada" inclui qualquer proteína secretada, seja naturalmente se- cretada ou modificada para conter uma sequência de sinal tal que ela possa ser secretada.

[0078] O ácido nucleico está "operativamente ligado" quando ele é colocado em um relacionamento funcional com outra sequência de ácido nucleico. Geralmente, "operativamente ligado" significa que as sequências de DNA a serem ligadas são contíguas. Entretanto, inten- sificadores não precisam ser contíguos. A ligação é obtida pela ligação aos sítios de restrição convenientes. Se tais sítios não existem, adaptadores ou ligantes de oligonucleotídeo sintéticos são usados de acordo com a prática convencional. Adicionalmente, múltiplas cópias do ácido nucleico que codificam enzimas podem ser ligadas juntos no vetor de expressão. Tais ácidos nucleicos múltiplos podem ser separados pelos ligantes.

[0079] A presente descrição também fornece uma célula de mamífero que contém um vetor aqui descrito. A célula pode ser de humano e pode ser do cérebro. O tipo da célula pode ser uma célula-tronco ou uma população de célula de células progenitoras.

[0080] A presente descrição fornece um método de tratamento de uma doença tal como uma doença genética ou um câncer em um mamífero pela administração de um polinucleotídeo, polipeptídeo, vetor de expressão ou célula aqui descritos. A doença genética pode ser uma doença neurodegenerativas, tal como a doença de Alzheimer.

[0081] Certos aspectos da descrição se referem a polinucleotídeo, polipeptídeos, vetores e células geneticamente manipuladas (modificadas in vivo) e o uso deles. Em particular, a descrição se refere a um método para a terapia com gene ou proteína que seja capaz de liberar ambos por via sistêmica em uma dose terapeuticamente eficaz do agente terapêutico.

[0082] De acordo com um aspecto, um sistema de expressão celular para a expressão de um agente terapêutico em um mamífero é fornecido. O sistema de expressão (também referido aqui como "célula geneticamente modificada") compreende uma célula e um vetor de expressão para expressar o agente terapêutico. Vetores de expressão incluem, mas não são limitados a vírus, plasmídeos e outros veículos para a liberação de material genético heterólogo para as células. Consequentemente, o termo "vetor de expressão", como usado aqui, se refere a um veículo para liberação de material genético heterólogo em uma célula. Em particular, o vetor de expressão é um vetor adenoviral recombinante, de vírus adeno-associado ou lentivírus ou retrovírus.

[0083] O vetor de expressão inclui adicionalmente um promotor para controlar a transcrição do gene heterólogo. O promotor pode ser um promotor induzível (descrito abaixo). o sistema de expressão é adequado para a administração ao mamífero receptor. O sistema de expressão pode compreender uma pluralidade de células geneticamente modificadas não imortalizadas, cada célula contendo pelo menos um gene recombinante que codifique pelo menos um agente terapêutico.

[0084] O sistema de expressão celular pode ser formado in vivo. De acordo com outro aspecto, é fornecido um método para tratar um mamífero receptor in vivo. O método inclui introduzir um vetor de expressão para expressar um produto de gene heterólogo em uma célula do paciente in situ, tal como através da administração intravenosa. Para formar o sistema de expressão in vivo, um vetor de expressão para expressar o agente terapêutico é introduzido in vivo no mamífero receptor i.v., onde o vetor migra através da vascularização para o cérebro.

[0085] De acordo com outro aspecto, é fornecido um método para tratar um mamífero receptor in vivo. O método inclui introduzir a prote- ína alvo no paciente in vivo.

[0086] O vetor de expressão para expressar o gene heterólogo pode incluir um promotor induzível para controlar a transcrição do produto de gene heterólogo. Consequentemente, a liberação do agente terapêutico in situ é controlada pela exposição da célula in situ às condições que induzem a transcrição do gene heterólogo.

[0087] O mamífero receptor pode ter uma condição que é passível de receber a terapia de substituição de gene. Como usada aqui, "terapia de substituição de gene" se refere à administração ao receptor de um material genético exógeno que codifica um agente terapêutico e a subsequente expressão do material genético administrado in situ. Portanto, a frase "condição passível de terapia de substituição de gene" abrange condições tais como doenças genéticas (isto é, uma condição de doença que não é atribuível a um defeito inato), cânceres e processos profiláticos (isto é, prevenção de uma doença ou de uma condição médica indesejável). Consequentemente, como usada aqui, a expressão "agente terapêutico" se refere a qualquer agente ou material que tenha um efeito benéfico sobre o mamífero receptor. Portanto, "agente terapêutico" abrange ambas as moléculas terapêuticas e profiláticas que possuem componentes de ácido nucleico ou proteína.

[0088] De acordo com uma modalidade, um mamífero receptor tem uma doença genética q o material genético exógeno compreende um gene heterólogo que codifica um agente terapêutico para o tratamento da doença. Em outra modalidade, o mamífero receptor tem uma patologia adquirida e o material genético exógeno compreende um gene heterólogo que codifica um agente terapêutico para tratar a patologia. De acordo com outra modalidade, o paciente tem um câncer e o material genético exógeno compreende um gene heterólogo que codifica um agente terapêutico para tratar a condição.

[0089] Como usada aqui, a expressão "uma isoforma protetora de ApoE" inclui variantes ou fragmentos biologicamente ativos ou inativos desse polipeptídeo. Uma "variante" de um dos polipeptídeos é um po- lipeptídeo que não é completamente idêntico com a proteína nativa. Tal proteína variante pode ser obtida pela alteração da sequência de aminoácidos pela inserção, deleção ou substituição de um ou mais aminoácidos. A sequência de aminoácidos da proteína é modificada, por exemplo, pela substituição para criar um polipeptídeo que possui substancialmente as mesmas qualidades ou qualidades aperfeiçoadas quando comparado com o polipeptídeo nativo. A substituição pode ser uma substituição conservativa. Uma "substituição conservativa" é uma substituição de um aminoácido por outro aminoácido que possui uma cadeia lateral similar. Uma substituição conservativa pode ser uma substituição por um aminoácido que faz a menor alteração possível na carga do aminoácido ou no tamanho da cadeia lateral do aminoácido (alternativamente, no tamanho, carga ou tipo de grupo químico dentro da cadeia lateral) tal que o polipeptídeo global retém sua conformação espacial, mas tem sua atividade biológica alterada. Por exemplo, alterações conservativas comuns podem Asp para Glu, Asn ou Gln; His para Lys, Arg ou Phe; Asn para Gln, Asp ou Glu e Ser para Cys, Thr ou Gly. Alanina é comumente usada para substituir os outros aminoá- cidos. Os 20 aminoácidos essenciais podem ser agrupados como a seguir: alanina, valina, isoleucina, prolina, fenilalanina, triptofano e me- tionina que possuem cadeias laterais não polares; glicina, serina, treo- nina, cistina, tirosina, asparagina e glutamina que possuem cadeias laterais polares não carregadas; aspartato e glutamato que possuem cadeias laterais ácidas; e lisina, arginina e histidina que possuem cadeias laterais básicas.

[0090] As alterações de aminoácidos são obtidas pela alteração dos códons da sequência de ácidos nucleico correspondente. É conhecido que tais polipeptídeos podem ser obtidos com base na substi- tuição de certos aminoácidos por outros aminoácidos na estrutura do polipeptídeo a fim de modificar ou aperfeiçoar a atividade biológica. Por exemplo, através da substituição de aminoácidos alternativos, pequenas alterações conformacionais podem ser conferidas a um poli- peptídeo, o que resulta em atividade aumentada. Alternativamente, as substituições de aminoácidos em certos polipeptídeos podem ser usadas para fornecer resíduos, que podem então ser ligados a outras moléculas para fornecer conjugados de peptídeo-molécula que retêm propriedades suficientes do polipeptídeo de partida para serem úteis para outros propósitos.

[0091] Pode-se usar o índice hidropático dos aminoácidos para conferir a função de interatividade biológica em um polipeptídeo, em que é encontrado que certos aminoácidos podem ser substituídos por outros aminoácidos que possuem índices hidropáticos similares e ainda retêm uma atividade biológica similar. Alternativamente, a substituição de aminoácidos semelhantes pode ser feita com base na hidrofili- cidade, particularmente onde a função biológica desejada no polipeptí- deo a ser gerado é pretendida para uso em modalidades imunológicas. A maior hidrofilicidade média local de uma "proteína", como governada pela hidrofilicidade de seus aminoácidos adjacentes, se correlaciona com sua imunogenicidade. Consequentemente, é observado que tais substituições podem ser feitas com base na hidrofilicidade designada para cada aminoácido.

[0092] Usando o índice de hidrofilicidade ou o índice hidropático, que designam valores para cada aminoácido, é preferido conduzir substituições de aminoácidos onde esses valores são ± 2, com ± 1 sendo particularmente preferido e aqueles com ± 0,5 sendo as substituições mais preferidas.

[0093] A proteína variante tem pelo menos 50%, pelo menos cerca de 80% ou até pelo menos cerca de 90%, mas menos do que 100% de homologia ou identidade de sequência de aminoácidos contíguos com a sequência de aminoácidos de uma proteína nativa correspondente.

[0094] A sequência de aminoácidos do polipeptídeo variante corresponde essencialmente a sequência de aminoácidos do polipeptídeo nativo. Como usada aqui, "corresponde essencialmente a" se refere a uma sequência de polipeptídeo que irá desencadear uma resposta biológica substancialmente igual a resposta gerada pela proteína nativa. Tal resposta pode ser de pelo menos 60% do nível gerado pela proteína nativa e pode ser de pelo menos 80% do nível gerado pela proteína nativa.

[0095] Uma variante pode incluir resíduos de aminoácidos não presentes na proteína nativa correspondente ou deleções em relação à proteína nativa correspondente. Uma variante também pode ser um "fragmento" truncado quando comparado com a proteína nativa correspondente, isto é, apenas uma porção de uma proteína de extensão completa. Variantes de proteína também incluem peptídeos que possuem pelo menos um D-aminoácido.

[0096] A proteína variante pode ser expressa a partir de uma sequência de DNA isolada que codifica a proteína variante. "Recombi- nante" é definido como um peptídeo ou ácido nucleico produzido pelos processos de manipulação genética. Deve ser notado que é bem conhecido na técnica que, devido a redundância do código genético, nu- cleotídeos individuais podem ser prontamente substituídos em um có- don e ainda resultar em uma sequência de aminoácidos idêntica. As expressões "proteína", "peptídeo" e "polipeptídeo" são usadas alternativamente aqui.

[0097] A presente descrição fornece métodos para tratar uma doença em um mamífero pela administração de um vetor de expressão a uma célula ou paciente. Para os métodos de terapia com gene, uma pessoa com conhecimentos comuns na área da biologia molecular e terapia com gene poderá ser capaz de determinar, sem experimentação exaustiva, as dosagens apropriadas e as vias de administração do vetor de expressão usado nos novos métodos da presente descrição.

[0098] De acordo com uma modalidade, as células são transformadas ou geneticamente modificadas de outra maneira in vivo. As células do mamífero receptor são transformadas (isto é, transduzidas ou transfectadas) in vivo com um vetor que contém material genético exógeno para expressar um gene heterólogo (por exemplo, recombi- nante) que codifica um agente terapêutico e o agente terapêutico é liberado in situ.

[0099] Como usado aqui, "material genético exógeno" se refere a um ácido nucleico ou um oligonucleotídeo, natural ou sintético, que não naturalmente encontrado nas células; ou se for encontrado naturalmente nas células, não é transcrito ou expresso em níveis biologicamente significativos pelas células. Portanto, "material genético exógeno" inclui, por exemplo, um ácido nucleico que não ocorre naturalmente que pode ser transcrito em RNA antissenso, assim como um "gene heterólogo" (isto é, um gene que codifica uma proteína que não é expressa ou é expressa em níveis biologicamente insignificantes em uma célula do mesmo tipo que ocorre naturalmente).

[00100] Em certas modalidades, o mamífero receptor tem uma condição que é passível de terapia de substituição de gene. Como usada aqui, "terapia de substituição de gene" se refere à administração ao receptor de material genético exógeno que codifica um agente terapêutico e a subsequente expressão do material genético administrado in situ. Portanto, a frase "condição passível de terapia de substituição de gene" abrange condições tais como doenças genéticas (isto é, uma condição de doença que é atribuível a um ou mais defeitos de gene), patologias adquiridas (isto é, uma condição patológica que não é atribuível a um defeito inato), cânceres e processos profiláticos (isto é, prevenção de uma doença ou de uma condição médica indesejada). Consequentemente, como usada aqui, a expressão "agente terapêutico" se refere a qualquer agente ou material, que tenha um efeito benéfico sobre o mamífero receptor. Portanto, "agente terapêutico" abrange ambas as moléculas terapêuticas e profiláticas que possuem componentes de ácido nucleico (por exemplo, RNA antissenso) e/ou proteínas.

[00101] Alternativamente, a condição passível de terapia de substituição de gene é um processo profilático, isto é, um processo para a prevenção de uma doença ou condição médica indesejada. Portanto, a presente descrição abrange um sistema de expressão celular para liberar um agente terapêutico que tem uma função profilática (isto é, um agente profilático) para um mamífero receptor.

[00102] Em resumo, a expressão "agente terapêutico" inclui, mas não está limitada a agentes associados com as condições listadas acima, assim como seus equivalentes funcionais. Como usada aqui, a expressão "equivalente funcional" se refere a uma molécula (por exemplo, um peptídeo ou proteína) que tem o mesmo ou um efeito benéfico aperfeiçoado sobre o mamífero receptor como o agente terapêutico do qual ele é considerado um equivalente funcional.

[00103] Os agentes terapêuticos acima descritos e as condições passíveis de terapia de substituição de gene são meramente ilustrativos e não são pretendidos limitar o escopo da presente descrição. A seleção de um agente terapêutico adequado para tratar uma condição conhecida é considerada estar dentro do escopo daquele versado na técnica sem experimentação exaustiva.

VETORES DE AAV

[00104] Em uma modalidade, um vetor viral da descrição é um vetor de AAV. Um vetor de "AAV" se refere a um vírus adeno-associado e pode ser usado para se referir ao próprio vírus do tipo selvagem que ocorre naturalmente ou seus derivados. A expressão cobre todos os subtipos, sorotipos e pseudotipos e ambas as formas que ocorrem naturalmente e recombinantes, exceto onde necessário de outra maneira. Como usada aqui, a expressão "sorotipo" se refere a um AAV que é identificado e distinguido de outros AAVs com base na reatividade da proteína do capsídeo com antissoros definidos, por exemplo, há oito sorotipos conhecidos de AAVs de primata, AAV-1 a AAV-8. Por exemplo, o sorotipo AAV2 é usado para se referir a um AAV que contém proteínas do capsídeo codificadas a partir do gene cap de AAV2 e um genoma que contém sequências 5' e 3' ITR do mesmo sorotipo de AAV2. Como usado aqui, por exemplo, rAAV pode ser usado para se referir a um AAV que possui ambas as proteínas do capsídeo e 5'-3' ITRs do mesmo sorotipo ou pode se referir a um AAV que possui proteínas do capsídeo de um sorotipo e 5'-3' ITRs de um sorotipo de AAV diferente, por exemplo, capsídeo do sorotipo 2 de AAV e ITRs do soro- tipo 5 de AAV. Para cada exemplo ilustrado aqui, a descrição do design e da produção do vetor descreve o sorotipo das sequências do capsídeo e de 5'-3' ITR. A abreviação "rAAV" se refere a um vírus adeno-associado recombinante, também referido a um vetor de AAV recombinante (ou ""vetor de rAAV").

[00105] Um "vírus AAV" ou uma "partícula viral de AAV" se refere a uma partícula viral composta de pelo menos uma proteína do capsídeo de AAV (preferivelmente por todas as proteínas do capsídeo de um AAV do tipo selvagem) e um polinucleotídeo encapsidado. Se a partícula compreende um polinucleotídeo heterólogo (isto é, um polinucleo- tídeo diferente de um genoma de AAV do tipo selvagem tal como um transgene a ser liberado para uma célula de mamífero), ela á tipicamente referida como um "rAAV".

[00106] Em uma modalidade, os vetores de expressão de AAV são construídos usando técnicas conhecidas para pelo menos fornecer como componentes operativamente ligados na direção da transcrição, elementos de controle que incluem uma região de iniciação da transcrição, o DNA de interesse e uma região de terminação da transcrição. Os elementos de controle são selecionados para serem funcionais na célula de mamífero. O construto resultante que contém os componentes operativamente ligados é flanqueado (5' e 3') por sequências de ITR de AAV.

[00107] Por "repetições terminais invertidas de vírus adeno- associados" ou "ITRs de AVV", entende-se regiões conhecidas na técnica encontradas em cada extremidade do genoma de AAV que funcionam juntas em cis como origens da replicação do DNA e como sinais de envelopamento para o vírus. ITRs de AAV junto com a região codificadora rep de AAV fornecem a excisão e o resgate eficientes e a integração da sequência de nucleotídeos interposta entre duas ITRs flanqueadoras no genoma de uma célula de mamífero.

[00108] As sequências de nucleotídeos das regiões de ITR de AAV são conhecidas. Como usada aqui, uma "ITR de AAV" não precisa ter a sequência de nucleotídeos do tipo selvagem descrita, mas pode ser alterada, por exemplo, pela inserção, deleção ou substituição de nu- cleotídeos. Adicionalmente, uma ITR de AAV pode ser derivada de qualquer um dos vários sorotipos de AAV, incluindo sem limitação AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV7, etc. Além disso. 5' e 3' ITRs que flanqueiam uma sequência de nucleotídeos selecionada em um vetor de AAV não precisam ser necessariamente idênticas ou derivadas do mesmo sorotipo ou isolado de AAV, desde que elas funcionem como pretendido, isto é, permitam a excisão e o resgate da sequência de interesse do genoma da célula hospedeira ou do vetor e permitam a integração da sequência heteróloga no genoma da célula receptora quando os produtos do gene Rep de AAV estiverem presentes na célula.

[00109] Em uma modalidade, as ITRs de AAV podem ser derivadas de qualquer um dos vários sorotipos de AAV, incluindo sem limitação AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV7, etc. Além disso. 5' e 3' ITRs que flanqueiam uma sequência de nucleotídeos selecionada em um vetor de expressão de AAV não precisam ser necessariamente idênticas ou derivadas do mesmo sorotipo ou isolado de AAV, desde que elas funcionem como pretendido, isto é, permitam a excisão e o resgate da sequência de interesse do genoma da célula hospedeira ou do vetor e permita a integração da molécula de DNA no genoma da célula receptora quando os produtos do gene Rep de AAV estiverem presentes na célula.

[00110] Em uma modalidade, capsídeos de AAV podem ser derivados de AAV2. Moléculas de DNA adequadas para uso nos vetores de AAV terão menos do que cerca de 5 quilobases (kb), menos do que cerca de 4,5 kb, menos do que cerca de 4 kb, menos do que cerca de 3,5 kb, menos do que cerca de 3 kb, menos do que cerca de 2,5 kb de tamanho e são conhecidas na técnica.

[00111] Em uma modalidade, a sequência de nucleotídeos selecionada é operativamente ligada a elementos de controle que direcionam a transcrição e a expressão dessa no indivíduo in vivo. Tais elementos de controle podem compreender sequências de controle normalmente associadas com o gene selecionado. Alternativamente, sequências de controle heterólogas podem ser empregadas. Sequências de controle heterólogas úteis geralmente incluem aquelas derivadas de sequências que codificam genes de mamífero ou virais. Exemplos incluem, mas não são limitados ao promotor precoce de SV40, promotor LTR do vírus do tumor mamário de camundongo, promotor tardio principal de adenovírus (Ad MLP); um promotor do vírus do herpes simplex (HSV), um promotor de citomegalovírus (CMV) tal como a região promotora precoce imediata de CMV (CMVIE), um promotor do vírus do sarcoma de Rous, promotores pol II, promotores pol III, promotores sintéticos, promotores híbridos e semelhantes. Em adição, as sequências derivadas de genes não virais tais como o gene de metalotioneína de murino, também encontrão uso aqui. Tais sequências promotoras são comercialmente disponibilizadas por, por exemplo, Stratagene (San Diego, California).

[00112] Em uma modalidade, ambos promotores heterólogo e outros elementos de controle tais como promotores induzíveis e específicos para o SNC, intensificadores e semelhantes, serão de uso particular. Exemplos de promotores heterólogo incluem o promotor de CMV. Exemplos de promotores específicos para o SNC incluem aqueles isolados dos genes da proteína básica da mielina (MBP), proteína ácida fibrilar da glia (GFAP) e enolase específica para o neurônio (NSE). Exemplos de promotores induzíveis incluem elementos responsivos ao DNA para ecdisona, tetraciclina; hipóxia e aufina.

[00113] Em uma modalidade, o vetor de expressão de AAV que abriga a molécula de DNA de interesse ligada pelas ITRs de AAV, pode ser construído pela inserção direta das sequências selecionadas no genoma de AAV que tem as fases de leitura aberta ("ORFs") principais de AAV excisadas dele. Outras porções do genoma de AAV também podem ser deletadas, desde que uma porção suficiente das ITRs permaneça para permitir as funções de replicação e envelopamento. Tais construtos podem ser designados usando técnicas conhecidas.

[00114] Pag 24 Alternativamente, ITRs de AAV podem ser excisa- das de um genoma viral ou de um vetor de AAV que contenha os mesmos construtos fundidos 5' e 3' de um construto de ácido nucleico selecionado que esteja presente em outro vetor usando técnicas de ligação padronizadas. Por exemplo, as ligações podem ser obtidas em Tris-HCl 20 mM pH 7,5, MgCl2 10 mM, DTT 10 mM, 33 μg/ml de BSA, NaCl 10 mM-50 mM e 40 uM ATP, 0,01-0,02 (Weiss) unidades deT4 DNA ligase a 0°C (para a ligação de "extremidade co esiva") ou 1 mM ATP, 0,3-0,6 (Weiss) unidades de T4 DNA ligase a 14°C (para ligação "blunt end"). As ligações intermoleculares "de extremidade coesiva" são geralmente realizadas em concentrações totais de 30-100 μg/ml de DNA (5 a 100 nM de concentração final total). Vetores de AAV que contém ITRs.

[00115] Adicionalmente, genes quiméricos podem ser produzidos sinteticamente para incluir sequências de ITR de AAV arranjadas em 5' e 3' de uma ou mais sequências de ácido nucleico selecionadas. Có- dons preferidos para expressão da sequência de gene quimérico em células do SNC de mamífero podem ser usados. A sequência quimérica completa é montada a partir de oligonucleotídeo que se superpõem preparados pelos métodos padronizados.

[00116] A fim de produzir vírions de rAAV, um vetor de expressão de AAV é introduzido em uma célula hospedeira adequada usando técnicas conhecidas, tais como a transfecção. Várias técnicas de transfecção são comumente conhecidas. Veja, por exemplo, Sambro- ok et al. (1989) Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York. Métodos de transfecção particularmente adequados incluem a co-precipitação em fosfato de cálcio, micro-injeção direta em células cultivadas, eletroporação, transferência de gene mediada por lipossoma, transdução mediada por lipídeo, e liberação de ácido nucleico usando micro-projéteis de alta velocidade.

[00117] Em uma modalidade, células hospedeiras adequadas para a produção de vírions de rAAV incluem microrganismos, células de levedura, células de inseto e células de mamífero que podem ser ou que forram usadas como receptoras de uma molécula de DNA heteró- logo. A expressão inclui a progênie da célula original que tenho sido transfectadas. Portanto, "célula hospedeira" como usada aqui, se refere geralmente a uma célula que tenha sido transfectadas com uma se- quência de DNA exógeno. As células da linhagem humana estável, 293 (disponibilizadas prontamente através de, por exemplo American Type Culture Collection sob o Número de Acesso ATCC CRL1573) podem ser usadas na prática da presente descrição. Particularmente, a linhagem celular humana 293 é uma linhagem celular de rim embrionário humano que foi transformada com fragmentos de DNA do ade- novírus tipo 5 e expressa os genes E1a e E1b adenovirais. A linhagem celular 293 é facilmente transfectadas e fornece uma plataforma particularmente conveniente na qual são produzidos os vírions de rAAV.

[00118] Por "região codificadora de rep de AAV" entende-se uma região reconhecida na técnica do genoma de AAV que codifica as proteínas de replicação Rep 78, Rep 68, Rep 52 e Rep 40. Esses produtos de expressão de Rep têm mostrado possuir várias funções, incluindo o reconhecimento, ligação e corte da replicação do DNA da origem de AAV, atividade de DNA helicase e modulação da transcrição de promotores AAV (ou outros heterólogo). Os produtos de expressão de Rep são coletivamente requeridos para a replicação do genoma de AAV. Homólogos adequados da região codificadora de rep de AAV incluem o gene rep de herpesvírus 6 humano (HHV-6) que também é conhecido por mediar a replicação do DNA de AAV2.

[00119] Por "região codificadora de cap de AAV" entende-se uma região reconhecida na técnica do genoma de AAV que codifica as proteínas do capsídeo VP1, VP2 e VP3 ou seus homólogos funcionais. Esses produtos de expressão de Cap fornecem as funções de enve- lopamento que são coletivamente necessárias para o envelopamento do genoma viral.

[00120] Em uma modalidade, as funções auxiliares de AAV são introduzidas na célula hospedeira pela transfecção da célula hospedeira com um construto auxiliar de AAV antes ou concomitantemente com a transfecção do vetor de expressão de AAV. Os construtos auxiliares de AAV são então usados para fornecer pelo menos expressão transitória de genes rep e/ou cap de AAV para complementar as funções de AAV ausentes que são necessárias para uma infecção produtiva por AAV. Construtos auxiliares de AAV carecem de ITRs de AAV e não podem nem replicar nem se envelopar. Esses construtos podem estar na forma de um plasmídeo, fago, transposon, cosmídeo, vírus ou ví- rion. Vários construtos auxiliares de AAV têm sido descritos tais como os plasmídeos comumente usados pAAV/Ad e pIM29+45 que codificam ambos produtos de expressão de Rep e Cap. Vários outros vetores têm sido descritos que codificam produtos de expressão de Rep e/ou Cap.

[00121] Métodos de liberação de vetores virais incluem a injeção de AAV no CSF. Geralmente, vírions de rAAV podem ser introduzidos nas células do SNC usando as técnicas de transdução in vitro ou in vivo. Se transduzidas in vitro, a célula receptora desejada será removida do indivíduo, transduzida com os vírions de rAAV e reintroduzidas no indivíduo. Alternativamente, células singeneicas ou xenogenicas podem ser usadas, onde essas células não gerarão uma resposta imune ina- propriada no indivíduo.

[00122] Métodos adequados para liberar e introduzir as células transduzidas em um indivíduo têm sido descritos. Por exemplo, as células podem ser transformadas in vitro pela combinação de vírions de AAV recombinante cm células do SNC, por exemplo, em um meio apropriado e o rastreamento daquelas células que hospedam o DNA de interesse, pode ser feito usando técnicas convencionais tais como Southern blots e/ou PCR ou pelo uso de marcadores selecionáveis. As células transduzidas podem então ser formuladas em composições farmacêuticas, descritas mais completamente abaixo, e as composições introduzidas no indivíduo por várias técnicas, tais como enxerto, injeção intramuscular, intravenosa, subcutânea e intraperitoneal.

[00123] Em uma modalidade, as composições farmacêuticas compreenderão material genético suficiente para produzir uma quantidade terapeuticamente eficaz do ácido nucleico de interesse, isto é, uma quantidade suficiente para reduzir ou melhorar sintomas do estado de doença em questão ou uma quantidade suficiente para conferir o benefício desejado. As composições farmacêuticas também conterão um excipiente farmaceuticamente aceitável. Tais excipientes incluem qualquer agente farmacêutico que não induza ele próprio a produção de anticorpos prejudiciais para o indivíduo que está recebendo a composição e que possam ser administrados sem toxicidade indesejada. Excipientes farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não são limitados a sorbitol, Tween80 e líquidos tais como água, salina, glicerol e etanol. Sais farmaceuticamente aceitáveis podem ser incluídos, por exemplo, sais de ácidos minerais tais como hidrocloreto, hidrobrome- tos, fosfatos, sulfatos e semelhantes; e sai de ácidos orgânicos tais como acetatos, propionatos, malonatos, benzoato e semelhantes. Adicionalmente, substancias auxiliares tais como umectantes ou agentes de emulsificação, substancias para tamponar o pH e semelhantes podem estar presentes em tais veículos. Uma discussão extensa sobre excipientes farmaceuticamente aceitáveis está disponível em Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., N.J. 1991)

[00124] Como está claro para aqueles versados na técnica em vista dos ensinamentos desse pedido, uma quantidade eficaz de um vetor viral que deve ser adicionado pode ser determinada empiricamente. A administração pode ser efetuada em uma dose, continuamente ou intermitentemente durante o curso do tratamento. Métodos para determinar os meios mais eficazes e as dosagens de administração são bem conhecidos daqueles versados na técnica e variarão com o vetor viral, a composição da terapia, as células alvo e o indivíduo a ser tratado. Administrações únicas ou múltiplas podem ser realizadas com o nível de dose e o padrão a serem selecionados pelo médico assistente.

[00125] Deve ficar compreendido que mais do que um transgene pode ser expresso pelo vetor viral liberado. Alternativamente, vetores separados, cada um expressando um ou mais transgenes diferentes, também podem ser liberados para o SNC como aqui descrito. Adicionalmente, também é pretendido que os vetores virais liberados pelos métodos da presente descrição sejam combinados com outras composições e terapias adequadas.

MÉTODOS PARA INTRODUÇÃO DE MATERIAL GENÉTICO NAS CÉLULAS

[00126] O material genético exógeno (por exemplo, um cDNA que codifica uma ou mais proteínas terapêuticas) é introduzido na célula ex vivo ou in vivo pelos métodos de transferência genética, tais como a transfecção e a transdução, para fornecer uma célula geneticamente modificada. Vários vetores de expressão (isto é, veículos para facilitar a liberação de material genético exógeno em uma célula-alvo) são conhecidos por aqueles versados na técnica.

[00127] Como usado aqui, "transfecção de células" se refere a aquisição pela célula de novo material genético pela incorporação do DNA adicionado. Portanto, transfecção se refere à inserção de ácido nucleico em uma célula usando métodos físicos e químicos. Várias técnicas de transfecção são conhecidas daqueles versados na técnica incluindo: co-precipitação de DNA com fosfato de cálcio; DEAE- dextran; eletroporação; transfecção mediada por lipossoma catiônico; e bombardeio de micropartículas facilitado por partículas de tungstê- nio. A co-precipitação de DNA com fosfato de estrôncio é outro método de transfecção possível.

[00128] Em contraste, "transdução de células" se refere ao processo de transferência de ácido nucleico em uma célula usando vírus DNA e RNA. Um vírus RNA (isto é, um retrovírus) para transferir um ácido nucleico em uma célula é referida aqui como um retrovírus quimérico transdutor. O material genético exógeno contido dentro do re- trovírus é incorporado no genoma da célula transduzida. Uma célula que tenha sido transduzida com um vírus DNA quimérico (por exemplo, um adenovírus que carrega um cDNA que codifica um agente terapêutico), não terá o material genético exógeno incorporado em seu genoma, mas será capaz de expressar o material genético exógeno que está retido fora do cromossomo dentro da célula.

[00129] Tipicamente, o material genético exógeno inclui o gene he- terólogo (geralmente na forma de um cDNA que compreende os éxons codificadores para a proteína terapêutica) junto com um promotor para controlar a transcrição do novo gene. O promotor caracteristicamente tem uma sequência de nucleotídeos específica, necessária para iniciar a transcrição. Opcionalmente, o material genético exógeno inclui ainda sequências adicionais (isto é, intensificadoras) necessárias para obter a atividade de transcrição do gene desejado. Para o propósito dessa discussão, uma "intensificadora" é simplesmente qualquer sequência de DNA não traduzida que funciona contígua com a sequência codificadora (em cis) para alterar o nível de transcrição basal ditado pelo promotor. O material genético exógeno pode ser introduzido no geno- ma da célula imediatamente a jusante do promotor tal que o promotor e a sequência codificadora são operativamente ligados de modo a permitir a transcrição da sequência codificadora. Um vetor de expressão retroviral pode incluir um elemento promotor exógeno para controlar a transcrição do gene exógeno inserido. Tais promotores exógenos incluem promotores constitutivos e induzíveis.

[00130] Promotores constitutivos que ocorrem naturalmente controlam a expressão das funções essenciais da célula. Como resultado, um gene sob o controle de um promotor constitutivo é expresso sob todas as condições de crescimento celular. Promotores constitutivos exemplificadores incluem os promotores para os seguintes genes que codificam certas funções constitutivas ou "de manutenção": hipoxanti- na fosforibosil transferase (HPRT), di-hidrofolato redutase (DHFR), adenosina deaminase, fosfoglicerol quinase (PGK), piruvato quinase, fosfoglicerol mutase, o promotor de actina e outros promotores constitutivos conhecidos por aqueles versados na técnica. Adicionalmente, vários promotores virais funcionam constitutivamente em células euca- rióticas. Esses incluem: os promotores precoce e tardio de SV40; as repetições terminais longas (LTRs) do Vírus da leucemia de Moloney e outros retrovirus; e o promotor de timidina quinase do Vírus do Herpes Simplex, entre vários outros. Consequentemente, qualquer um dos promotores constitutivos acima referidos pode ser usado para controlar a transcrição do inserto de gene heterólogo.

[00131] Genes que estão sob o controle de promotores induzíveis são expressos apenas ou em um grau menor, na presença de um agente de indução (por exemplo, transcrição sob o controle do promotor de metalotioneína é grandemente aumentada na presença de certos íons de metal). Promotores induzíveis incluem elementos responsi- vos (Res) que estimulam a transcrição quando seus fatores de indução estão ligados. Por exemplo, existem Res para fatores séricos, hormônios esteroides, ácido retinoico e AMP cíclico. Promotores que contêm um RE particular podem ser escolhidos a fim de obter uma resposta induzível e em alguns casos, o próprio RE pode ser acoplado a um promotor diferente, conferindo capacidade de indução ao gene recom- binante. Pela seleção do promotor apropriado (constitutivo versus in- duzível; forte versus fraco), é possível controlar ambos a existência e o nível de expressão de um agente terapêutico na célula geneticamente modificada. Se o gene que codifica o agente terapêutico está sob o controle de um promotor induzível, a liberação do agente terapêutico in situ é desencadeada pela exposição da célula geneticamente modificada in situ a condições que permitem a transcrição do agente terapêutico, por exemplo pela injeção intraperitoneal de indutores específicos dos promotores induzíveis que controlam a transcrição do agente. Por exemplo, a expressão in situ pelas células geneticamente modificadas de um agente terapêutico codificado por um gene sob o controle do promotor de metalotioneina, é intensificada pelo contato das células geneticamente modificadas com uma solução que contém os íons de metal apropriados (isto é, indutores) in situ.

[00132] Consequentemente, a quantidade de agente terapêutico que é liberada in situ é regulada pelo controle de fatores tais como: (1) a natureza do promotor usado para direcionar a transcrição do gene inserido (isto é, se o promotor é constitutivo ou induzível, forte ou fraco); (2) o número de cópias do gene exógeno que é inserido na célula; (3) o número de células transduzidas/transfectadas que são administradas (por exemplo, implantadas) para o paciente; (4) o tamanho do implante (por exemplo, enxerto ou sistema de expressão encapsulado); (5) o número de implantes; (6) a duração do tempo em que as células transduzidas/transfectadas ou implantes são deixados no local; e (7) a taxa de produção do agente terapêutico pela célula geneticamente modificada . A seleção e a otimização desses fatores para a liberação de uma dose terapeuticamente eficaz de um agente terapêutico em particular são consideradas estar dentro do escopo daquele versado na técnica sem experimentação exaustiva, levando em consideração os fatores acima descritos e o perfil clínico do paciente.

[00133] Em adição a pelo menos um promotor e pelo menos um ácido nucleico heterólogo que codifica o agente terapêutico, o vetor de expressão pode incluir um gene de seleção, por exemplo, um gene de resistência a neomicina, para facilitar a seleção das células que tenham sido transfectadas ou transduzidas com o vetor de expressão. Alternativamente, as células são transfectadas com dois ou mais vetores de expressão, pelo menos um vetor que contém o(s) gene(s) que codifica/codificam agentes terapêuticos, o outro vetor contém o gene de seleção. A seleção de um promotor adequado, intensificador, gene de seleção e/ou sequência de sinal (descrita abaixo) é considerada dentro do escopo daquele versado na técnica sem experimentação exaustiva.

[00134] O agente terapêutico pode ser direcionado para liberação para uma localização extracelular, intracelular ou na membrana. Se for desejável que o produto de gene seja secretado a partir das células, o vetor de expressão é designado para incluir uma sequência de "sinal" de secreção apropriada para secretar o produto de gene terapêutico da célula para o meio extracelular. Se for desejável que o produto de gene seja retido dentro da célula, essa sequência de sinal de secreção é omitida. De uma maneira similar, o vetor de expressão pode ser construído para incluir sequências de sinal de "retenção" para ancorar o agente terapêutico dentro da membrana plasmática da célula. Por exemplo, toas as proteínas de membrana possuem regiões trans- membrana hidrofóbicas, que param a translocação da proteína na membrana e não permitem que a proteína seja secretada. A construção de um vetor de expressão que inclua as sequências de sinal para direcionar um produto de gene para uma localização particular é considerada estar dentro do escopo daquele versado na técnica sem a necessidade de experimentação exaustiva.

ENSAIOS DE DETECÇÃO

[00135] Uma variedade de métodos de imuno-detecção é contemplada nessa modalidade. Tais métodos de imuno-detecção incluem um ensaio imunosorvente ligado à enzima (ELISA), radioimunoensaio (RIA), ensaio imunoradiométrico, fluorimunoensaio, ensaio quimiolu- minescente, ensaio bioluminescente e Western blot, embora vários outros sejam bem conhecidos por aqueles versados na técnica. As etapas de vários métodos de imunodetecção úteis tem sido descritas na literatura científica.

[00136] Em geral, os métodos de imuno-ligação incluem a obtenção de uma amostra suspeita de conter a proteína Aβ e contatar a mostra com um primeiro anticorpo, monoclonal ou policlonal específico para Aβ, de acordo com a presente invenção, conforme o caso, sob condições eficazes para permitir a formação de complexos imunes.

[00137] Os métodos de ligação imune incluem métodos para detectar e quantificar a quantidade da proteína Aβ em uma amostra e a detecção e quantificação de quaisquer complexos imunes formados durante o processo de ligação. Aqui, pode ser obtida uma amostra suspeita de conter a proteína Aβ e contatar a amostra com um fragmento de anticorpo da invenção e depois detectar e quantificar a quantidade de complexos imunes formados sob as condições específicas.

[00138] Contatar a amostra biológica escolhida com o anticorpo sob condições eficazes e por um período de tempo suficiente para permitir a formação de complexos imunes (complexos imunes primários) é geralmente uma questão de simplesmente adicionar a composição de anticorpo à amostra e incubar a mistura por um período de tempo longo o suficiente para que os anticorpos formem complexos imunes com, isto é, se liguem com quaisquer antígenos presentes. Depois desse tempo, a composição de amostra-anticorpo tal como uma seção de tecido, placa de ELISA, dot blot ou western blot, será lavada para remover qualquer espécie de anticorpo não especificamente ligado, permitindo apenas que aquelas moléculas de scFv especificamente ligadas dentro dos complexos imunes primários sejam detectadas.

[00139] Em geral, a detecção da formação de complexos imunes é bem conhecida na técnica e pode ser obtida através da aplicação de numerosas abordagens. Esses métodos são geralmente baseados na detecção de um rótulo ou marcador, tal como qualquer um daqueles marcadores radioativos, fluorescentes, biológicos e enzimáticos. As patentes U.S. que dizem respeito ao uso de tais marcadores incluem as Pat. U.S. Nos 3.817.837; 3.850.752; 3.939.350; 3.996.345; 4.277.437; 4.275.149 e 4.366.241, cada uma incorporada por referência. É claro que podem ser encontradas vantagens adicionais através do uso de um ligante de ligação secundário tal como um anticorpo secundário e/ou um arranjo de ligação ao ligante de biotina/avidina, como é conhecido na técnica.

[00140] Como notado acima, uma molécula de detecção de proteína (isto é, ligante de ligação, tal como um anticorpo ou fragmento de anticorpo) pode ele própria estar ligada a um marcador detectável, em que se pode então simplesmente detectar esse marcador, permitindo dessa maneira que a quantidade dos complexos imunes primários na composição seja determinada. Alternativamente, o primeiro anticorpo que se torna ligado dentro do complexo imune primário pode ser detectado por meio de um segundo ligante de ligação que tem uma afinidade de ligação pelo anticorpo. Nesses casos, o segundo ligante de ligação pode estar ligado a um marcador detectável. O segundo ligan- te de ligação é ele próprio um anticorpo, que pode então ser denominado um anticorpo "secundário". Os complexos imunes primários são contatados com o ligante de ligação secundário marcado ou anticorpo, sob condições eficazes e por um período de tempo suficiente para permitir a formação de complexos imunes secundários. Os complexos imunes secundários são então lavados para remover quaisquer anticorpos secundários ou ligantes marcados não especificamente ligados e o marcador remanescente nos complexos imunes secundários é então detectado.

[00141] Métodos adicionais incluem a detecção de complexos imunes primários por uma abordagem em duas etapas. Um segundo li- gante de ligação, tal como um anticorpo, que tem afinidade de ligação pelo primeiro ligante de ligação é usado para formar complexos imunes secundários, como descrito acima. Depois de lavar, complexos imunes secundários são contatados com um terceiro ligante de ligação ou anticorpo que tem afinidade de ligação pelo anticorpo secundário, de novo sob condições eficazes e por um período de tempo suficiente para permitir a formação de complexos imunes (complexos imunes terciários). O terceiro ligante ou anticorpo é ligado a um marcador de- tectável, possibilitando a detecção dos complexos imunes terciários assim formados. Esse sistema pode fornecer à amplificação de sinal se isso é desejado.

[00142] Como detalhado acima, imunoensaios, em seu sentido mais simples e/ou direto, são ensaios de ligação. Certos imunoensaios preferidos são os vários tipos de ensaios imunosorbentes ligados a enzima (ELISAs) e/ou radioimunoensaios (RIA) conhecidos na técnica. A detecção imuno-histoquímica usando cortes de tecido também é particularmente útil. Entretanto, será apreciado que a detecção não está limitada a tais técnicas e/ou western blotting, dot blotting, análise FACS e/ou semelhantes também podem ser usados.

[00143] Em um ELISA exemplificador, os anticorpos são imobilizados sobre uma superfície selecionada que exibe afinidade pela proteína, tal como um poço em uma placa de microtitulação de poliestireno. Depois, uma composição de teste suspeita de conter a proteína Aβ, tal como uma amostra clínica (por exemplo, uma amostra biológica obtida de um indivíduo) é adicionada aos poços. Depois da ligação e/ou lavagem para remover complexos imunes não especificamente ligados, o antígeno ligado pode ser detectado. A detecção é geralmente obtida pela adição de outro anticorpo que está ligado a um marcador detectá- vel. Esse tipo de ELISA é um simples "ELISA sanduíche". A detecção também pode ser obtida pela adição de um anticorpo secundário, se- guido pela adição de um terceiro anticorpo que tem afinidade de ligação pelo segundo anticorpo, com o terceiro anticorpo sendo ligado a um marcador detectável. Em outro ELISA exemplificador, as amostras suspeitas de conter o antígeno são imobilizadas sobre a superfície do poço e/ou então contatadas com agentes de ligação. Depois da ligação e/ou lavagem para remover complexos imunes não especificamente ligados, os agentes anti-ligação ligados são detectados. Onde os agentes de ligação iniciais estão ligados a um marcador detectável, os complexos imunes podem ser detectados diretamente. Novamente, os complexos imunes podem ser detectados usando um anticorpo secundário que tem afinidade de ligação pelos primeiros agentes de ligação, com o segundo anticorpo estando ligado a um marcador detectá- vel.

[00144] Outro ELISA no qual os antígenos são imobilizados, envolve o uso de competição de anticorpo na detecção. Nesse ELISA, anticorpos marcados contra um antígeno são adicionados aos poços, deixados se ligar e/ou detectados por meio de seus marcadores. A quantidade de um antígeno em uma amostra desconhecida é então determinada pela mistura da amostra com os anticorpos marcados contra o antígeno durante a incubação com poços revestidos. A presença de um antígeno na amostra atua para reduzir a quantidade de anticorpo contra o antígeno disponível para a ligação ao poço e assim reduzir o sinal final. Isso também é apropriado para detectar os anticorpos contra um antígeno em uma amostra desconhecida, onde os anticorpos não marcados se ligam aos poços revestidos com antígeno e também reduz a quantidade de antígeno disponível para a ligação dos anticor-pos marcados.

[00145] Independente do formato empregado, ELISAs possuem certos aspectos em comum, tais como revestimento, incubação e ligação, lavagem para remover espécies não especificamente ligadas e detecção de complexos imunes ligados.

[00146] Nos ELISAs, é provavelmente mais habitual usar um meio de detecção secundário ou terciário mais do que um procedimento direto. Portanto, depois da ligação de uma proteína ou anticorpo ao poço, revestimento com um material não reativo para reduzir o fundo e lavagem para remover o material não ligado, a superfície de imobilização é contatada com uma amostra biológica a ser testada sob as condições eficazes para permitir a formação do complexo imune (antíge- no/anticorpo). A detecção do complexo imune requer então um ligante ou anticorpo de ligação secundário e um ligante ou anticorpo de ligação secundário em conjunto com um anticorpo terciário marcado ou um terceiro ligante de ligação.

[00147] "Sob condições eficazes para possibilitar a formação de um complexo imune (antígeno/anticorpo)" significa que as condições incluem preferivelmente a diluição de uma composição de oligômeros tau e/ou scFv com soluções tais como BSA, gamaglobulina bovina (BGG) ou salina tamponada com fosfato (PBS)/Tween. Esses agentes adicionados tendem a auxiliar na redução de um fundo não específico.

[00148] As condições "adequadas" também significam que a incubação é em uma temperatura ou por um período de tempo suficiente para permitir a ligação efetiva. As etapas de incubação são tipicamente entre cerca de 1 a 2 ou 4 horas ou mais, em temperatura preferivelmente na ordem de 25°C a 27°C ou podem ser durante uma noite em cerca de 4°C ou mais.

[00149] Depois de todas as etapas de incubação em um ELISA, a superfície contatada é lavada de modo a remover todo material não complexado. Um exemplo de um procedimento de lavagem inclui a lavagem como uma solução de PBS/Tween ou tampão borato. Depois da formação de complexos imunes específicos entre a amostra de teste e o material originalmente ligado e a lavagem subsequente, a ocor rência de quantidades até diminutas de complexos imunes pode ser determinada.

[00150] Para fornecer um meio de detecção, o segundo ou terceiro anticorpo terão um marcador associado para permitir a detecção. Esse pode ser uma enzima que gerará o desenvolvimento de cor depois da incubação com um substrato cromogênico apropriado. Portanto, por exemplo, será desejável contatar ou incubar o primeiro ou segundo complexo imune com uréase, glicose oxidase, fosfatase alcalina ou anticorpo conjugado com peroxidase de hidrogênio por um período de tempo e sob condições que favorecem o desenvolvimento da formação de complexo imune adicional (por exemplo, incubação por 2 horas em temperatura ambiente em uma solução que contém PBS tal como PBS-Tween).

[00151] Depois da incubação com um anticorpo marcado e subsequente lavagem para remover o material não ligado, a quantidade de marcador é quantificada, por exemplo, pela incubação com um substrato cromogênico tal como ureia ou bromocresol roxo ou ácido 2,21- azino-di-(3-etil-benzotiazolino-6-)sulfônico (ABTS) ou H2O2 no caso de peroxidase como o marcador enzimático. A quantificação é então obtida pela medida do grau de cor gerada, por exemplo, usando um es- pectrofotômetro de espectro visível.

EXEMPLO 1 Alterações na Progressão da Deposição Amiloide

[00152] Esse Exemplo estudou as alterações na progressão da deposição amiloide e camundongos app/ps depois da superexpressão de diferentes isoformas de ApoE através da injeção intraventricular de um vírus adeno-associado sorotipo 4 (AAV4).

[00153] O alelo épsilon 4 de ApoE (ApoE ε4) é o primeiro fator de risco genético para a doença de Alzheimer (AD), enquanto que a herança do alelo raro épsilon 2 de ApoE (ApoE ε2) reduz esse risco em cerca de metade. Entretanto, apesar da descoberta dessas fortes indicações genéticas há quase 17 anos, os mecanismos através dos quais ApoE confere o risco permanecem incertos.

[00154] A fim de decifrar como as diferentes isoformas de ApoE (ApoE ε2, ε3 e ε4) impactam a formação e a estabilidade das placas amiloides fibrilares, vetores de AAV4 que codificam cada isoforma de ApoE foram injetados no ventrículo de camundongos APP/OS com 7 meses de idade. Usando a imagem de múltiplos fótons, populações de depósitos amiloides foram rastreadas na linha de base e depois da exposição à ApoE durante um intervalo de dois meses, permitindo assim uma visão dinâmica da progressão da amiloidose em um animal vivo.

[00155] A cinética da deposição da placa amiloide foi observada ser variável de acordo com cada isoforma, tal que camundongos injetados com ApoE ε4 tiveram um aumento de 38% nas placas senis, enquanto que os camundongos tratados com ApoE ε2 apresentaram uma diminuição do número de depósitos de amiloide comparada com ApoE ε3 depois de 2 meses. A análise post-mortem confirmou esses resultados e revelou a presença de proteínas ApoE humanas decorando placas no córtex, refletindo uma grande difusão da proteína através do parên- quima e seu acúmulo focal onde os peptídeos Aβ são depositados. É importante notar que esse conteúdo aumentado da proteína ApoE ε4 também estava associado com uma perda de sinapse mais severa em volta dos depósitos de amiloide.

[00156] Globalmente, os presentes dados demonstraram que a superprodução de diferentes isoformas de ApoE foi capaz de influenciar a progressão da doença e pode modular a extensão da perda de si- napse, um dos parâmetros que se correlaciona melhor com o dano cognitivo em pacientes com AD.

[00157] 1. A injeção intraventricular de ApoE de AAV4 levou a uma expressão estável de huApoE e uma detecção sustentada da proteína ApoE recombinante humana (huApoE) no cérebro.

[00158] Resumidamente, GFP e huApoE foram imunodectados em camundongos APP/OS inoculados com vetores de AAV4. O sinal de GFP pode ser observado na totalidade da área ventricular (painel superior) e nas células que pavimentam o ventrículo, assim como APOE humana.

[00159] A fim de avaliar a presente abordagem, AAV4-Venus (controle), -ApoE2, -ApoE3 e ApoE4 foram injetadas no ventrículo de camundongos do tipo selvagem. Dois meses depois da injeção, as proteínas ApoE humanas puderam ser detectadas no parênquima cortical em volta de depósitos de amiloide (observe o anticorpo 3H1; penas um fundo não especifico foi observado em camundongos injetados com AAV4-GFP). Portanto, o nível significativo de ApoE humana foi detectado por ELISA no cérebro e as colorações imuno-histológicas para Venus e ApoE confirmaram a expressão dos diferentes transgenes pelas células que pavimentam o ventrículo.

[00160] Experimentos de qRT-PCR foram realizados a fim de avaliar os níveis de mRNA do transgene. Uma curva padronizada nos levou a determinar as concentrações de mRNA de huApoE de acordo com o nível de GAPDH endógeno. As amostras dos camundongos que foram expostos por 2 ou 5 meses foram incluídas. Um ensaio ELISA designado para detectar, especificamente, APOE humana foi realizado em homogenatos de cérebro (Fig. 1A). Baixos níveis de proteínas recom- binantes puderam ser detectados em camundongos injetados com APOE de AAV4 comparados com animais trados com AAV4-GFP, como quantificado pelo ELISA específico para APOE humana (Fig. 1B) e confirmado por Western blot.

[00161] 2. A superexpressão de cada isoforma de APOE afeta dife rencialmente a progressão da amiloidose.

[00162] A imagem de dois fótons in vivo foi usada para acompanhar a deposição de amiloide ao longo do tempo em um animal vivo. Resumidamente, camundongos APP/OS (7 meses de idade) foram injetados estereotaxicamente com vetores de AAV4 que codificam ApoE2, Apoe3, ApoE4 e Venus. Depois de 1 semana, uma janela craniana foi implantada e os depósitos de amiloide foram fotografados ao longo do tempo depois da craniotomia. Depois de 2 meses, os animais foram sacrificados e as análises post-mortem foram realizadas.

[00163] Imagens com 2 fótons de camundongos APP/OS injetados com AAV4-ApoE2, AAV4-ApoE3 ou AAV4-ApoE4 foram preparadas. As placas de amiloide puderam ser detectadas depois da injeção intraperitoneal de Methoxy-XO4 (5 mg/kg) e Texas Red dextran (peso molecular de 70.000 Da; 12,5 mg/ml em PBS estéril) foi injetado na veia lateral da cauda para fornecer um angiograma fluorescente. As imagens foram realizadas com 1 semana (=T0), um mês e dois meses depois da injeção. Os mesmos campos foram capturados ao longo do tempo para acompanhar a progressão das lesões. Alguns depósitos de amiloide novos apareceram, enquanto que alguns deles não puderam ser detectados mais durante um período de tempo de dois meses.

[00164] A análise completa das imagens in vivo mostra que o número de depósitos de amiloide aumente significativamente amis rápido em camundongos APP/OS injetados com AAV4-ApoE4, comparados com ambos os animais tratados com AAV4-APOE3 e AAV4-Venus. Em contraste, uma diminuição pequena, mas significativa das placas é medida quando AAV4-ApoE2 foi usada (Fig. 2). Uma tendência na direção de placas maiores é observada em camundongos APP/OS injetados com AAV4-ApoE4 (p<0,06), mas no geral, o tamanho das placas permaneceu constante. Os dados resumidos da imagem in vivo mos-tram que a superexpressão de cada APOE afeta diferencialmente a progressão da deposição de amiloide in vivo. A injeção de AAV4- ApoE2 leva a uma diminuição discreta da densidade do amiloide ao longo do tempo, enquanto que a injeção de AAv4-ApoE4 agrava a amiloidose.

[00165] 3. O tamanho das placas de amiloide pode variar de acordo com cada isoforma de ApoE.

[00166] A imagem de dois fótons in vivo permitiu o acompanhamento das alterações do tamanho de cada depósito de amiloide durante um período de 2 meses. O tamanho das placas permaneceu estável, aumentou ou diminuiu ao longo do tempo. As distribuições das proporções de tamanho entre T1/T0 e T2/T1, mostram que há uma mudança em direção a placas de amiloide maiores em camundongos injetados com AAV4-ApoE4 comparados com outros grupos (Fig. 3).

[00167] 4. Avaliação post-mortem da carga de amiloide confirma os efeitos de ApoE2 e ApoE4 sobre a deposição de amiloide.

[00168] Dois meses depois da injeção de AAV4, a avaliação este- reológica post-mortem revelou que animais injetados com AAV4- ApoE4 possuem uma densidade maior de placas de amiloide no córtex, enquanto que nenhuma diferença pode ser detectada entre os outros grupos (Fig. 4A). Esse número aumentado de depósitos de ami- loide é observado quando as placas foram marcadas com ThioS ou Bam10. Entretanto, nenhuma alteração na proporção entre Bam10 e ThioS foi detectada. Cinco meses depois da injeção, os efeitos de cada isoforma de ApoE são mais pronunciados comparados com dois meses (Fig. 4B). Uma densidade significativamente aumentada dos depósitos foi observada quando os camundongos eram injetados com AAV4-ApoE4, enquanto que um efeito inverso foi detectado com ApoE2. Novamente, nenhuma alteração na proporção entre Bam10 e ThioS foi detectada.

[00169] 5. Cada isoforma de ApoE afeta diferencialmente a densi dade sináptica em volta dos depósitos de amiloide.

[00170] A tomografia de matriz foi usada para determinar precisa- mente a densidade dos elementos pré e pós-sinápticos em volta dos depósitos de amiloide. Esse novo método de imagem oferece capacidades de imagem com alta resolução da arquitetura molecular do tecido. A tomografia de matriz é baseada no corte ultrafino do espécime (70 nm), imunocoloração e reconstrução em 3D. Imagens representativas de amostras de tomografia de matriz coradas para placa amiloide e o marcador pós-sináptico PSD95. As imagens da tomografia de matriz mostram que um número diminuído do marcador pós-sináptico PSD95 é observado em volta dos depósitos de amiloide, mas esse efeito está abolido longe das placas. A quantificação de marcadores pré- (sinapsina-1) e pós-sinápticos na vizinhança ou longe das placas foi determinada em cada grupo de camundongos injetados com AAV4 (Fig. 5A-D). A quantificação extensa de elementos pré- e pós- sinápticos confirmou que uma densidade diminuída de sinapsina-1 e PSD95 estava associada com as placas de amiloide, esse efeito sendo dramaticamente amplificada quando ApoE4 foi superexpressa no cérebro de camundongos APP/PS1 (Fig. 5C, Fig. 5D). A superexpres- são de ApoE4 está associada com uma perda aumentada de sinapse comparada com outros grupos na vizinhança de depósitos de amiloide. Ao contrário, a densidade de pontos de sinapsina é maior em animais tratados com ApoE2 em volta das placas.

CONCLUSÃO

[00171] As injeções intraventriculares de vírus AAV sorotipo 4 levou a uma superprodução mantida e crônica de proteínas solúveis recom- binantes através do parênquima cerebral. A superexpressão de ApoE2, ApoE3 e ApoE4 afetou diferencialmente o curso da patologia em camundongos APP/OS, tal que a progressão da carga de amiloide estava significativamente aumentada quando ApoE4 é injetada comparada com ApoE3. Inversamente, ApoE2 estava associada com os efeitos protetores e alguns depósitos de amiloide não foram mais detecta- dos dois meses depois da injeção. A análise imuno-histológica postmortem confirmou o efeito adverso de ApoE4. A superprodução sustentada de ApoE4 exacerbou a perda de sinapse em volta dos depósitos de amiloide comparada com ApoE3, enquanto que ApoE2 teve um efeito moderado. O presente estudo demonstrou uma conexão direta entre as isoformas de ApoE, a progressão da amiloidose e a perda de sinapse in vivo.

EXEMPLO 2 Tratamento de Distúrbios do Sistema Nervoso Central através do Fluido Cérebro-espinhal (CSF) em Grandes Mamíferos

[00172] A fim de obter a terapia de gene para distúrbios cerebrais, tais como a doença de Alzheimer, foi necessário ser determinado se os níveis do estado estacionário, em longo prazo das enzimas terapêuticas poderia ser obtido em um mamífero. Foi descoberto que as células ependimária (células que pavimentam os ventrículos no cérebro) podem ser transduzidas e secretam uma enzima-alvo no fluido cérebro-espinhal (CSF). Foi determinado que o vírus adeno-associado (AAV4) pode transduzir o epêndima em um modelo de camundongo com alta eficiência. (Davidson et al, PNAS, 28:3428-3432, 2000.). Nos camundongos houve uma normalização dos níveis de substrato arma-zenado na doença cerebral depois do tratamento com AAV4.

[00173] Foi investigado se a liberação global de um vetor poderia ser efetivamente realizada a fim de atingir os níveis do estado estacionário da enzima no CSF. Primeiro, é necessário encontrar um vetor que possa transduzir as células ependimária (células que pavimentam os ventrículos) no cérebro de mamíferos superiores. Os estudos foram realizados em um modelo de cão de LINCL e um modelo de primata não humano de LINCL. Os cães LINCL são normais no nascimento, mas desenvolvem sinais neurológicos em torno dos 7 meses, déficits cognitivos que podem ser testados com ~ 5 a 6 meses, convulsões com 10 a 11 meses e perda visual progressiva.

[00174] Um vírus adeno-associado (AAV) foi selecionado como o vetor, devido ao seu pequeno tamanho (20 nm), a maioria de seu material genético pode ser removido ("eviscerado") tal que nenhum gene viral esteja presente e tal que ele tenha replicação incompetente, Foi previamente testado se os vetores de vírus adeno-associado tipo 4 (AAV4) poderiam mediar os aperfeiçoamentos globais funcionais e patológicos em um modelo de murino de mucopolissacaridose tipo VII (MPS VII) causada pela deficiência de beta-glicuronidase (Liu et al., J. Neuroscience, 25(41):9321-9327, 2005). Vetores de AAV4 recombi- nantes que codificam a beta-glicuronidase foram injetados unilateralmente nos ventrículo lateral de camundongos com MPS VII com a do-ença estabelecida. O epêndima transduzido expressou altos níveis de enzima recombinante, com a enzima secretada penetrando nas estruturas cerebrais e cerebelares, assim como no tronco cerebral. Estudos imuno-histoquímicos revelaram uma intima associação da enzima re- combinante e a microvascularização cerebral, indicando que a beta- glicuronidase atingiu o parênquima cerebral através dos espaços peri- vasculares que permeiam os vasos sanguíneos. O aprendizado aver- sivo associativo foi testado pelo contexto de condicionamento pelo medo. Comparados como os controles heterozigotos com a mesma idade, os camundongos afetados mostraram resposta ao medo condicionado e discriminação do contexto prejudicados. Esse déficit com- portamental foi revertido 6 semanas depois da transferência de gene em camundongos MPS VII tratados com beta-glicuronidase AAV4. Os dados mostram que as células ependimária podem servir como uma fonte de secreção de enzima no parênquima cerebral circundante e CSF.

[00175] Surpreendentemente, entretanto, quando esses estudos foram estendidos para grandes mamífero (isto é, cães e primatas não humanos), os vetores de AAV4 não foram eficazes no direcionamento para o epêndima nesses animais. Ao contrário, um vetor de AAV2 precisou ser usado. Resumidamente, rAAV2 foi gerado codificando TPP1 (AAV2-CLN2) e injetado por via intraventricular para transduzir o epêndima (Liu et al., J. Neuroscience, 25(41):9321-9327, 2005). TPP1 é a enzima deficiente em LINCL. Os dados indicaram que a transdu- ção do epêndima no cérebro NPH resultou em um aumento significativo da enzima no CSF. Os resultados indicaram níveis elevados de atividade de TPP1 em várias regiões do cérebro, onde o eixo vertical mostra o controle da atividade (Figura 7).

[00176] No primeiro cão que foi tratado, a liberação do vetor foi subótima, mas ainda exibiu atividade de CLN2 no cérebro. Os cães subsequentes foram submetidos à liberação ICV com estereotaxia. Foi descoberto que as habilidades cognitivas dos cães tratados foram significativamente melhoradas em comparação ao cão não tratado, como medido pelo desempenho do labirinto em T (Figura 8). Além disso, os efeitos da liberação ICV de AAV2-CLN2 no modelo de cão de LINCL foram muito pronunciados. No animal (-/-) não tratado, grandes ventrículos estavam presentes, enquanto que os cérebros do controle não tratado e dos animais tratados não exibiam ventrículos. Depois da liberação de AAV.TPP1 para os ventrículos de cães com LINCL, a atividade detectável da enzima foi notada em várias regiões do cérebro, incluindo o cerebelo e a medula espinhal superior. Em dois cães vivos afetados adicionais, a atrofia cerebral foi significativamente atenuada, a longevidade foi aumentada e a função cognitiva foi melhorada. Finalmente, em NHP, mostrou-se que esse método pode obter níveis de atividade de TPP1 2 a 5 vezes acima do tipo selvagem.

[00177] Vários vetores de AAV foram gerados e testados para determinar a combinação ótima de ITR e capsídeo. Cindo combinações diferentes foram produzidas, uma vez que foi determinado que AVV2 ITR era a mais eficaz: AAV2/1 (isto é, ITR de AAV2 e capsídeo de AAV1), AAV2/2, AAV2/4, AAV2/5 e AAV2/8. Foi descoberto que AAV2/2 funcionava muito melhor em grandes mamíferos (cães e NHP), seguido por AAV2/8, AAV2/5, AAV2/1 e AAV2/4. Isso foi bastante surpreendente por que a ordem de eficácia dos vetores virais é oposta dessa observada nos camundongos.

[00178] Portanto, o presente trabalho mostrou que as células de pavimentação ventricular podem ser uma fonte de enzima recombinan- te no CSF para distribuição através do cérebro e que AAV2/2 é um veículo eficaz para a administração de agentes terapêuticos, tais como o gene que codifica CNL2 (TPP1) em cães e primatas não humanos.

EXEMPLO 3 Isoformas de APOE Humana Liberadas através de Transferência de Gene Modula Diferencialmente a Doença de Alzheimer por Afetar a Deposição, Depuração e Neurotoxicidade do Amiloide.

[00179] A doença de Alzheimer (AD) é o distúrbio neurodegenerati- vo relacionado a idade mais frequente e tem se tornado um grande problema de saúde pública. Entre os genes de suscetibilidade associados com a forma de aparecimento tardio esporádico de AD, o alelo da apolipoproteína E ε4 (APOE - gene; ApoE - proteína) é de longe o fator de risco genético mais significativo. A presença de uma cópia de APOE ε4 aumenta substancialmente o risco de desenvolver a doença por um fator de 3, comparado com o alelo mais comum, APOE ε3, enquanto que duas cópias levam a um aumento de 12 vezes. Intrigantemente, APOE ε2 tem um impacto oposto e é um fator de proteção, tal que a herança desse alelo específico diminui o risco ajustado para a idade de AD em cerca da metade comparado com APOE3/3. A idade média para o aparecimento de demência também corresponde a esses perfis de risco, com portadores de APOE4/4 tendo um início em meados dos 60 anos e veiculadores de APOE2/3 no início dos 90 anos, uma mudança de quase 3 décadas, enquanto que indivíduos com APOE3/3 possuem uma idade de início no intervalo - em meados de 1970.

[00180] O mecanismo através do qual ApoE impacta a AD é controverso. O acúmulo de placas senis contendo Aβ no hipocampo e córtex de pacientes é considerado desempenhar um papel central na AD, por que todos os genes conhecidos responsáveis pelas formas autossômi- cas dominantes raras da doença participam na produção de peptídeos de Aβ. Interessantemente, o genótipo de APOE foi mostrado afetar acentuadamente a extensão da deposição de amiloide em pacientes com AD assim como a quantidade de Aβ oligomérico solúvel neurotó- xico detectada em amostras de autópsia. Isoformas de ApoE têm sido sugeridas influenciar diferencialmente a integridade cerebrovascular e afetar o efluxo de peptídeos de Aβ através da barreira hemato- encefálica, modulando assim a construção de agregados de amiloide em volta de vasos sanguíneos (angiopatia amiloide cerebral ou CAA). Adicionalmente, ApoE também tem sido implicada diretamente na neu- rodegeneração e na plasticidade neuronal. Os efeitos de ApoE2 têm sido relativamente pouco estudados nesses contextos.

[00181] Animais geneticamente manipulados que expressam APOE2, -E3 e -E4 humanas possuem uma ordem de classificação de carga amiloide como os humanos, consistente com a hipótese de que as diferentes isoformas de ApoE impactam a iniciação e/ou o crescimento da placa. Entretanto, estudos adicionais são necessários para dissecar os mecanismos dos efeitos mediados por ApoE sobre os depósitos amiloides existentes e sobre a neurodegeneração existente. Para superar essa lacuna no conhecimento, foi usada uma abordagem de transferência de gene, na qual vetores de vírus adeno-associados que expressam vários alelos de APOE (ou GFP de controle) são injetados no ventrículo lateral para transduzir primariamente o epêndima, que depois atua como uma fábrica biológica para liberar ApoE dentro dos fluidos cérebro-espinhal e intersticial. Então foi usada a microsco- pia de múltiplos fótons intravital para rastrear os efeitos de várias isoformas de ApoE sobre a formação, crescimento e no caso de ApoE2, dissolução da placa assim como abordagens de microdiálise in vivo para monitorar as variáveis bioquímicas de ApoE e Aβ no ISF e a to- mografia de matriz para avaliar as alterações na neurotoxicidade associada a Aβ. Descobriu-se que as isoformas de ApoE impactam os níveis de Aβ oligomérica solúvel no ISF, o ritmo da fibrilização e deposição de Aβ, a estabilidade dos depósitos de amiloide uma vez formados, sua depuração e a extensão dos efeitos neurotóxicos peri-placa. De fato, camundongos com AD tratados com ApoE4 mostraram uma quantidade aumentada de Aβ solúvel, uma maior densidade de placas fibrilares, uma exacerbação da perda do elemento sináptico e um número aumentado de distrofias neuríticas em volta de cada depósito, enquanto um efeito protetor relativo foi observado com ApoE2. Esses dados apoiam a hipótese de que alelos de APOE mediam seu efeito sobre AD primariamente através de Aβ e colocam em evidencia ApoE como alvo terapêutico.

RESULTADOS Injeção intraventricular de AAV4-APOE leva a expressão estável de APOE e a produção mantida de ApoE humana no cérebro

[00182] A Apolipoproteína E é uma proteína naturalmente secreta- da, produzida principalmente pelos astrócitos e células da micróglia e podem se difundir através do parênquima cerebral. Tirou-se vantagem dessa propriedade pela injeção de um sorotipo 4 de AVV que codifica GFP (controle) ou cada alelo de APOE nos ventrículos cerebrais laterais de camundongos APP/PS1 com 7 meses de idade. Considerando as grandes áreas cerebrais afetadas pelas lesões características de AD, essa estratégia ofereceu uma grande vantagem comparada com as injeções intra-parenquimatosas múltiplas.

[00183] Dois meses depois da injeção, as células transduzidas foram detectadas no plexo coroide e no epêndima que pavimenta o ventrículo, confirmando assim a funcionalidade dos vetores de AAV4. Usando anticorpos específicos para cada espécie, ambas as proteínas ApoE de humano e murino também foram detectadas por ELISA (Fig. 9A, 9B e 15A) e Western blot. Observou-se que a concentração de apolipoproteína E humana atingiu 20 μg/mg de proteína total em média (Fig. 9A), representando cerca de 10% da ApoE endógena de murino (Fig. 9B). A presença dessa quantidade adicional modesta de ApoE humana não altera detectavelmente os níveis de proteína apoE endógena de murino (Fig. 15A). Uma diminuição pequena, mas estatisti-camente significativa foi observada entre 2 e 5 meses depois da injeção de AAV4 (Fig. 15B). Não obstante, os níveis de proteína humana permaneceram detectáveis comparados com o grupo de controle, sugerindo que a transdução mediada por AAV4 forneceu uma plataforma para a produção sustentada da proteína recombinante secretada através do parênquima. De fato, as proteínas ApoE humanas podem ser detectadas em volta de depósitos de amiloide de camundongos APP/PS1 através do manto cortical, onde a proteína apoE é conhecida se acumular.

[00184] Depois, avaliou-se a presença de ApoE humana no fluido intersticial (ISF), um compartimento celular que também contém espécies altamente solúveis de Aβ biologicamente ativas. Devido a quantidade relativamente pequena de ApoE detectada no lisado completo de cérebro, foram injetados em vários camundongos apoE KO com cada um dos vetores de AAV4-APOE e rastreada a presença da proteína humana usando anticorpos altamente sensíveis, mas não específicos para a espécie. Usando uma técnica de microdiálise, foi confirmada a presença de ApoE no ISF de animais apoE KO injetados.

[00185] No geral, esses dados confirmam que uma única injeção intracerebroventricular de AAV4 foi suficiente para levar a produção sustentada de uma proteína de interesse através de todo o parênqui- ma cerebral e dentro do ISF e que o epêndima/plexo coroide podem ser usados como uma "bomba biológica" para liberar proteínas potencialmente terapêuticas para o cérebro.

Infusão das isoformas de ApoE afetam diferencialmente os peptí- deos amiloides e a deposição da placa

[00186] Camundongos APP/PS1 foram transduzidos com vetores que expressam GFP ou as várias isoformas de ApoE por 5 meses antes da eutanásia. Uma análise da carga de placa amiloide revelou que, depois de 5 meses, um aumento significativo na densidade dos depósitos de amiloide foi observado no córtex de animais injetados com AVV4-APOE4 comparados com aqueles que expressam APOE2. A densidade da placa em camundongos tratados com AAV4-GFP e AAV4-APOE3 não foi diferente de um para o outro em um nível intermediário (Fig. 16A).

[00187] As concentrações de peptídeos Aβ40 e Aβ42 medidas a partir de extratos de ácido fórmico mimetizaram as alterações observadas no conteúdo das placas amiloides, tal que uma concentração aumentada de peptídeos amiloides foi encontrada em camundongos que expressam o alelo de APOE4 (Fig. 16B) e um efeito oposto foi detectado com APOE2 depois de 5 meses. O conteúdo de peptídeos Aβ40 e Aβ42 na fração solúvel com TBS foi similarmente afetado pela injeção de cada APOE de AAV (Fig. 16C). Em adição, a proporção entre peptí- deos de Aβ agregados e solúveis permaneceu inalterada pela exposição a ApoE, sugerindo então que a superexpressão de cada isoforma distinta de ApoE humana modula concomitantemente ambas as espécies de amiloide fibrilar e solúvel.

[00188] A superexpressão de cada isoforma de ApoE por apenas 2 meses leva a efeitos menores do que observados no estudo de 5 meses. Não obstante, um aumento significativo na densidade da placa amiloide dentro da área cortical de camundongos injetados com AAV4- APOE4 foi observado, comparado com outros grupos experimentais (Fig. 16A). Isso foi acompanhado pela quantidade de Aβ contida na fração de ácido fórmico (Fig. 16C), demonstrando o efeito predominante dessa variante específica. Espécies de Aβ40/42 solúveis em TBS mostraram apenas uma tendência para diminuir ou aumentar quando AAV4-APOE2 ou AAV4-APOE4, respectivamente, eram expressos por 2 meses (dados não mostrados).

[00189] Para determinar se a presença de isoformas de ApoE humana poderiam refletir uma alteração precoce no grau de fibrilização de Aβ, mediu-se também a proporção entre a imuno-coloração robusta para Aβ usando Bam10 (que marca todos os depósitos de amiloide) e Thio-S (que marca apenas o núcleo denso) 2 meses depois da injeção. Nenhuma alteração foi detectada entre as 3 isoformas, sugerindo que não houve efeito diferencial na distribuição das populações de depósitos de amiloide densos e difusos através dos grupos experimentais nesse período de tempo (Fig. 16B). Esses dados indicam que uma exposição mais prolongada às variantes de ApoE tem efeitos mais acentuados sobre a deposição de amiloide do que a exposição mais curta.

[00190] Foi sugerido que ApoE desempenha um papel no transporte de Aβ através da barreira hemato-encefálica. Para testar se a exposição às isoformas de ApoE poderiam modular o efluxo de peptídeos de Aβ através da barreira hemato-encefálica, a concentração de Aβ40 foi medida no plasma de cada animal injetado. Observou-se que o conteúdo no plasma de Aβ humana em camundongos injetados com AAV4-APOE3 e AAV4-APOE4 por via intracerebroventricular era menor comparado com AAV4-APOE2 e AAV4-GFP (Fig. 10D). Isso suge- re que ambas as variantes E3 e E4 auxiliam a reter Aβ no compartimento do sistema nervoso central, consistente com as concentrações relativas aumentadas de Aβ no parênquima cerebral observadas e com os dados prévios sugerindo meia-vida intensificada de Aβ devido a ApoE.

[00191] Portadores de APOE4 são mais suscetíveis à disfunção neurovascular e o rompimento da barreira hemato-encefálica foi mostrado recentemente ser favorecido em camundongos transgênicos APOE4, mesmo na ausência de deposição amiloide. A fim de avaliar se uma injeção intraventricular de um AAV4-APOE4 em camundongos APP/PS poderia comprometer a integridade da BBB, a coloração postmortem com azul da Prússia foi realizada. Apesar da presença de algumas áreas focais positivas para hemosiderina esparsamente espalhadas através do cérebro em todos os grupos, nenhuma diferença óbvia foi observada entre qualquer um dos grupos de animais experimentais.

Expressão de isoformas de ApoE modula a cinética da progressão da amiloidose

[00192] ApoE4 foi associada com uma densidade aumentada de depósitos de amiloide, enquanto que o efeito oposto foi observado com ApoE2 depois de 5 meses. Isso pode refletir as alterações nas taxas de deposição, remoção de amiloide β ou ambas. Para avaliar como as variantes de ApoE afetam a dinâmica da progressão da ami- loidose, foi usada a imagem com dois fótons in vivo e acompanhada a cinética da formação e a remoção da placa amiloide. Os camundongos receberam uma injeção intraventricular com vetores de AAV4 com 7 meses de idade e uma janela craniana foi implantada uma semana depois da injeção a fim de realizar a primeira sessão de imagem (T0). Depois de 1 mês (T1) e 2 (T2) meses, os depósitos amiloides foram fotografados nos mesmos campos de visão. Os camundongos foram sacrificados para a análise post-mortem depois da segunda sessão de imagens.

[00193] A grande maioria dos depósitos amiloides permaneceu estável, embora novas placas ocasionais pudessem ser detectadas no pequeno volume de visualização depois do período de dois meses. Além disso, em raras ocasiões, uma placa Methoxi-positiva que tinha sido fotografada no início do experimento não foi mais detectada depois de um ou dois meses, sugerindo que algumas placas puderam ser removidas. Ao longo do tempo, foi observado um aumento global na densidade volumétrica dos depósitos de amiloide, com a densidade em T2 em média 23% maior do que a T1. A taxa de progressão de amiloide foi mais rápida em camundongos APP/PS1 tratados com ApoE4, enquanto que os animais expostos a ApoE2 tiveram uma densidade de depósito de amiloide significativamente reduzida em relação à GFP (0,66), ApoE3 (0,67) e ApoE4 (0,74) depois de 2 meses (Figs. 11A, 11B). Importantemente, as alterações de ApoE2 refletem uma diminuição a partir da linha de base mostrando diretamente e pela primeira vez, uma remoção mediada ativa não imune das placas. Em contraste com os dados obtidos de animais transgênicos APOE, esses resultados demonstram que a indução de um aumento modesto da quantidade de ApoE pode afetar o amiloidogênico em andamento mesmo depois que a deposição amiloide já tenha começado.

[00194] Foi avaliado, em seguida, o crescimento de uma única placa amiloide pela medida da proporção da área transversal de depósitos individuais entre T1/T0 e T2/T1. As diferenças foram detectadas entre grupos em T1 (proporção T1/T0), mas não em T2 (proporção T2/T1), Fig. 12), sugerindo que a presença de variantes de ApoE humana afeta principalmente o crescimento da placa durante o primeiro mês depois da exposição, mas esse parâmetro não difere mais tarde. Em particular, o tamanho dos depósitos de amiloide cresceu mais sig- nificativamente em camundongos tratados com ApoE4 comparados com ambos ApoE2 e ApoE3, sugerindo que não apenas o número de placas assim como seu tamanho foram exacerbados por esse alelo. Portanto, ApoE4 afeta a semeadura de peptídeos de Aβ assim como o tamanho de placas pré-existentes.

A densidade sináptica em volta dos depósitos de amiloide é piorada pelas isoformas ApoE3 e ApoE4 comparadas com ApoE2.

[00195] A perda da sinapse é um parâmetro que se correlaciona melhor com a deficiência cognitiva. Foi mostrado recentemente que a presença de ApoE4 está associada com níveis elevados de Aβ oligo- mérica sináptica nos cérebros de pacientes humanos com AD e leva s uma densidade de sinapse significativamente diminuída em volta das placas de amiloide comparada com ApoE3 (R. M. Koffie et al., Apolipoprotein E4 effects in Alzheimer's disease are mediated by synaptotoxic oligomeric amyloid-beta. Brain 135, 2155 (Jul, 2012); T. Hashimoto et al., Apolipoprotein E, Especially Apolipoprotein E4, Increases the Oligomerization of Amyloid beta Peptide. J Neurosci 32, 15181 (Oct 24, 2012)). Em adição, recentes evidencias in vitro demonstraram que ApoE4 falhou em proteger contra a perda de sinapse induzida por Aβ (M. Buttini et al., Modulation of Alzheimer-like synaptic and cholinergic deficits in transgenic mice by human apolipoprotein E depends on isoform, aging, and overexpression of amyloid beta peptides but not on plaque formation. J Neurosci 22, 10539 (Dec 15, 2002); A. Sen, D. L. Alkon, T. J. Nelson, Apolipoprotein E3 (ApoE3) but not ApoE4 protects against synaptic loss through increased expression of protein kinase C epsilon. J Biol Chem 287, 15947 (May 4, 2012)). Portanto, postula-se que uma distribuição contínua e difusa de cada isoforma de ApoE pode não apenas afetar diferencialmente a cinética da deposição e da remoção de Aβ no cérebro de camundongos APP/PS, mas também a integridade das sinapses que circundam os depósitos de amiloide.

[00196] As densidades dos elementos pré e pós-sinápticos (respectivamente sinapsina-1 e PSD95) foram determinadas usando a tomo- grafia de matriz, uma técnica de alta resolução baseada na coloração imunofluorescente de seções de tecido ultra-finas (K. D. Micheva, S. J. Smith, Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron 55, 25 (Jul 5, 2007); R. M. Koffie et al., Oligomeric amyloid beta associates with postsynaptic densities and correlates with excitatory synapse loss near senile plaques. Proc Natl Acad Sci U S A 106, 4012 (Mar 10, 2009)). Conforme as espécies oligoméricas eram mostradas estarem altamente concentradas em íntima proximidade dos depósitos amiloides, pon-tos de sinapsina-1 e PSD95 foram quantificados longe (>50 μm) ou perto (< 50 μm) das placas usando protocolos previamente estabelecidos (R. M. Koffie et al., Oligomeric amyloid beta associates with postsynaptic densities and correlates with excitatory synapse loss near senile plaques. Proc Natl Acad Sci U S A 106, 4012 (Mar 10, 2009)). Observou-se que a perda dos elementos pré-sinápticos proximo das placas foi exacerbada quando APOE3 ou APOE4 foram expressos, o que não foi o caso depois da injeção de AAV4-APOE2 ou AAV4-GFP (Fig. 13A). Em contraste, a densidade dos pontos pós-sinápticos permaneceu inalterada entre os camundongos injetados com GFP, ApoE2 e ApoE3, enquanto que os animais tratados com ApoE4 mostraram uma perda significativa de PSD95 em volta dos depósitos de amiloide, reforçando assim o efeito deletério de ApoE4 sobre os efeitos neurotóxicos de Aβ (Fig. 13C). Quando a densidade dos elementos sinápticos foi avaliada em áreas localizadas longe dos depósitis de amiloide (> 50 μm), nenhuma diferença pode ser detectada entre os grupos, sugerindo que não há efeito das variantes de ApoE humanas per se sobre o densidade sináptica, mas um efeito importante das isoformas de ApoE sobre a neurotoxicidade induzida por Aβ. A perda sináptica relativa observada com ApoE3 e ApoE4 está, portanto, diretamente relacionada com a presença de peptídeos de Aβ que circundam cada placa (em uma distancia < 50 μm a partir de sua borda).

[00197] Como um parâmetro neuropatológico adicional, ovaliou-se também o número de distrofias neuríticas associadas com os depósitos de amiloide em camundongos APP/PS1 injetados com AAV4. Em adição a uma densidade diminuída da coluna em volta delas, as placas senis também causam uma alteração mais geral do neuropilo com um aumento da curvatura neurítica e o aparecimento de distrofias intumescidas. Essas alterações patológicas são provavelmente atribuíveis a espécies de Aβ oligomérica solúvel que são enriquecidas em uma região a 50 μm da superfície da placa. Observou-se que a superexpressão de ApoE4 exacerba a formação de distrofias neuríticas positivas para SMI312 associadas com depósitos de amiloide comparada com GFP, ApoE2 e ApoE3 (Fig. 13C). Esse resultado confirma a observação de que a isoforma de ApoE4 tem o efeito mais forte e não apenas modula a formação da placa, mas também afeta a neurotoxicidade associada com o amiloide.

Proteinas ApoE humanas modificam a quantidade de Aβ oligomérica contida no fluido intersticial em outro modelo de camundongo com AD

[00198] Foi abordada, agora, a questão de se presença de diferentes isoformas de ApoE dentro do ISF pode alterar a quantidade da espécie de amiloide solúvel naquele compartimento extracelular. Escolheu-se injetar outro modelo de AD, os camundongos Tg2576, a fim de validar nossos achados prévios em uma linhagem de camundongo transgênico diferente. Os camundongos Tg2576 superexpressam a forma mutada de APP que contém a mutação Swedish e apresenta um fenótipo muito mais brando do que os camundongos APP/PS1 em uma dada idade. Foram injetados coortes de animais com 16 a 18 meses de idade, tal que os depósitos de amiloide já estavam presentes no momento da transdução de APOE4 de AVV4. Três meses depois da transferência de gene, uma sonda de microdiálise foi inserida no hipocampo e amostras foram coletadas para caracterziar alterações precoces associadas com cada variante de APOE dentro do ISF.

[00199] Observou-se que a concentração da espécie oligomérica de Aβ medida usando o ensaio 82E1/82E1 ELISA específico era significativamente maior (42±7%) depois da injeção de AAV4-APOE4 comparada com AAV4-APOE2 (Fig. 14), sugerindo que a presença de ApoE pode modular a natureza de agregados amiloides nesse compartimento extracelular. Além disso, quando Aβ40 e Aβ42 foram avaliadas no ISF, a mesma tendência foi observada, mas não atingiu significância (Fig. 17A), sugerindo que a presença de diferentes isoformas de ApoE no ISF influencia o estado de agregação dos peptídeos amiloides talvez mais do que a quantidade total.

[00200] Como esperado, a análise bioquímica post-mortem de cérebros de camundongos Tg2576 expostos às várias isoformas de ApoE mostrou que a concentração de Aβ42 na fração de ácido fórmico estava significativamente aumentada em animais tratados com ApoE4 (Fig, 17B), confirmando em um segundo modelo transgênico nossas observações em camundongos APP/PS1.

[00201] Juntas, essas medidas bioquímicas sugerem que a expressão de ApoE em camundongos Tg2576 induz alterações similares na biologia do amiloide como observado em camundongos APP/PS1. Importantemente, uma alteração precoce é observada no conteúdo de oAβ dentro do ISF, onde essas espécies neurotóxicas podem interagir diretamente com os terminais sinápticos.

DISCUSSÃO

[00202] A conexão surpreendente entre a herança do risco crescente com alelos de APOE4 e alelos de APOE2 que possuem um efeito oposto dramático para o desenvolvimento de AD, tem levado a múltiplas sugestões de como esse risco é mediado. ApoE tem sido implicada como uma proteína de ligação a Aβ envolvida na remoção de Aβ. Entretanto, estudos em camundongos knockout para apoE relataram surpreendentemente que os depósitos de Aβ eram substancialmente menores na ausência de apoE. A substituição com APOE2 humana, APOE3 ou APOE4 leva ao aumento dos depósitos de amiloide na mesma ordem como em pacientes com AD, o que foi postulado ocorrer através de um efeito sobre a iniciação da placa ou a formação de fibrila. Uma hipótese alternativa focaliza em efeitos diferenciais sobre desenvolvimento neurítico ou até propõe que o efeito do genótipo de APOE no fenótipo da doença de Alzheimer é uma consequência de outro gene no desequilíbrio genético com APOE no cromossomo 19.

[00203] Os dados, derivados do estudo de 2 modelos de camundongo diferentes usando uma abordagem previamente testada na configuração da doença do armazenamento lisossomal e doença de Huntington, se dirigiram diretamente para essas questões pelo uso de uma combinação de imagem com múltiplos fótons in vivo, imuno- histopatologia quantitativa padronizada, estudos de tomografia de matriz de estrutura sináptica e novas abordagens de microdiálise de alto peso molecular que permitem o exame de Aβ oligomérica. Mostrou-se que a alteração do microambiente de ApoE no ISF em animais com a doença estabelecida tem efeitos específicos para o alelo surpreendentes e rápidos sobre a economia de Aβ. Nosso estudo demonstrou que mesmo um aumento modesto (~10%) nos níveis de ApoE4, liberada para o ISF, impacta acentuadamente o fenótipo de Aβ e a cinética da remoção, com a retenção associada de ApoE4 de Aβ solúvel aumen- tada assim como as formas fibrilar e extraível com ácido fórmico e aumenta a neurotoxicidade em volta das placas, marcada pela perda si- náptica e distrofias neuríticas aumentadas. Inversamente, apoE2 diminui Aβ e tem um acentuado efeito neuroprotetor.

[00204] Como alterações modestas nos níveis de ApoE no ISF possuem tais consequências dramáticas, esses resultados podem levar à percepção dos efeitos de uma grande variedade de fatores ambientais e genéticos que poderão alterar o risco de AD ou da progressão de AD pela influência sobre a expressão de APOE. Aumentos em ApoE de substancialmente mais do que uma magnitude, foram demonstrados que podem ocorrer depois de um trauma, epilepsia, isquemia e dietas com muito colesterol, todos os quais têm sido associados com Aβ cerebral elevada. Além disso, polimorfismos do promotor que têm sido previamente encontrados estar em desequilíbrio genético com o alelo de APOE4 impactam a expressão de APOE.

[00205] Outras manipulações que impactam a homeostase de ApoE ou de ApoE-lipoproteínas no SNC alteram claramente a deposição de Aβ. Por exemplo, em experimentos com a transferência focal de gene com APOE de lentivírus (primariamente nos neurônios do hipocampo), a superexpressão de APOE4 exerce um efeito acentuado sobre o ami- loide em relação à APOE3. Estudos prévios também mostraram que agonistas de RXR, que possuem múltiplos efeitos incluindo a intensificação da síntese de apoE endógena, levam à remoção de Aβ do cérebro, talvez por um efeito sobre a remoção através da barreira hemato- encefálica. Em adição, a transdução no cérebro de CYP46A, que me- taboliza o colesterol no SNC e diminui seus níveis, reduz a deposição de Aβ assim como o aumento de LDL-R no cérebro, que é conhecido por diminuir os níveis de apoE. Finalmente, as manipulações genéticas sugerem que a alteração na expressão de apoE pela metade, pode impactar o fenótipo de Aβ. Nossos resultados sugerem de modo inte- ressante que alterações mais modestas também podem ter efeitos dramáticos.

[00206] Os dados abordam outras quatro áreas importantes de controvérsia na literatura sobre APOE-Alzheimer. 1) Demonstrou-se um claro efeito da isoforma de ApoE sobre a neurotoxicidade avaliada pela perda da sinapse e distrofias neuríticas, ambas provavelmente relacionadas ao déficit da função neuronal. Como esses efeitos foram evidentes na vizinhança imediata das placas, mas não nas áreas distantes das placas, a natureza protetora da sinapse de ApoE2 comparada com ApoE4 é provavelmente mediada pelos efeitos sobre Aβ peri- placa ao invés de devido a um efeito direto de ApoE sobre a estabilidade sináptica. 2) A observação direta da cinética da deposição e crescimento da placa usando a imagem de múltiplos fótons longitudinais in vivo mostra que ApoE4 intensifica a deposição e o crescimento da placa, enquanto que ApoE2 está associada de fato com a resolução das placas - arguindo que as isoformas de ApoE possuem um impacto poderoso sobre o ritmo e a progressão da doença além de um efeito inicial sobre a formação da placa fibrilar. Os resultados reforçam a ideia de que ApoE4 pode acelerar o processo da doença em termos de deposição de amiloide e neurotoxicidade (e levando, portanto, a uma idade precoce de início), enquanto que ApoE2 faz o oposto, o que aumenta a possibilidade de que a introdução de ApoE2 (ou de um mi- mético de ApoE2) no SNC pode ter um valor terapêutico mesmo depois que a doença está bem estabelecida. 3) ApoE tem sido sugerida como um mecanismo para remover Aβ do cérebro ou como uma molécula de retenção que aumenta a meia-vida da remoção; nossos resultados atuais mostram que a introdução de quantidades modestas de ApoE no ISF é suficiente para intensificar a retenção de Aβ no SNC, a menos que seja ApoE2. 4) Os mecanismos da ação protetora acentuada de APOE2 na AD ainda não está claro, em parte por que ApoE2 se liga aos receptores de ApoE de modo relativamente pobre. Nossos dados atuais sugerem que ApoE2 tem um ganho de função - capaz de reverter de fato os depósitos de Aβ estabelecidos, assim como o suporte sináptico e a plasticidade neurítica - em adição ao provável efeito neutro ou nulo sobre a remoção de Aβ no plasma. Isso sugere que as décadas de diferença na idade de início entre pacientes que herdam os alelos de APOE4 e APOE2 podem refletir um ponto de início diferente e diferenças continuas na cinética da deposição e remoção de Aβ assim como as diferenças especificas do alelo na extensão da neurotoxicidade associada com os depósitos. Essa função dupla de ApoE2 pode levar a abordagens terapêuticas objetivadas para mimeti- zar sua capacidade de remoção de placa e restauração sináptica.

[00207] Esses resultados são consistentes com um modelo no qual apoE atua como um arcabouço para a oligomerização de Aβ, com eficiência da formação e estabilização de ApoE4>ApoE3>ApoE2 de Aβ oligomérica e com nossa recente observação de que Aβ oligomérica está elevada no SNC de pacientes humanos com AD com ApoE4>ApoE3 (mesmo quando a carga da placa está normalizada em todos dos casos). Se ApoE, especialmente ApoE4, medeia a formação de Aβ oligomérica neurotóxica, foi predito que ApoE4 intensificada poderá levar a alterações sinápticas e neuríticas aumentadas, como parece ser o caso nos dados atuais. Com base nesses resultados, deve ser exercida cautela com relação aos agentes que podem aumentar os níveis de ApoE no cérebro de pacientes com AD que têm o alelo de APOE4 herdado.

[00208] Finalmente, os dados confirmam o poder da transdução mediada por AAV do epêndima para liberar as proteínas secretadas para o cérebro e daí para todo o manto cortical. A transferência de gene ou outras abordagens que diminuem apoE4 ou aumentam apoE2 são meios poderosos de impactar a progressão da doença de AD.

MATERIAIS E MÉTODOS

[00209] Animais. Os experimentos foram realizados usando ambos os camundongos APPswe/PS1dE9 (APP/PS1) duplamente transgêni- cos (D. R. Borchelt et al., Accelerated amyloid deposition in the brains of transgenic mice coexpressing mutant presenilin 1 and amyloid precursor proteins. Neuron 19, 939 (Oct, 1997)) (obtidos do Jackson laboratory, Bar Harbor, Maine) e camundongos Tg2576 (K. Hsiao et al., Correlative memory deficits, Abeta elevation, and amyloid plaques in transgenic mice. Science 274, 99 (Oct 4, 1996)). Um gene da proteína mutante precursora do amiloide humano contendo a mutação dupla Swedish K594N/M595L foi inserido no genoma dessas duas linhagens de camundongo, sob o controle do promotor de proteína príon. Em adição, o modelo de camundongo APP/PS1 superexpressa uma variante do gene de Presenilina 1 deletado para o éxon 9 (direcionado pelo mesmo promotor). A superexpressão concomitante de APPswe e PSEN1 em camundongos APP/PS1, leva a um fenótipo mais severo, com deposição amiloide substancial visível antes dos 6 meses de idade. Por outro lado, a linhagem de camundongo Tg2576 é um modelo muito mais moderado que apenas desenvolve as placas amiloides em volta de um ano de idade. Para determinar se a introdução de diferentes isoformas de ApoE poderia afetar a progressão da doença, foram injetados, respectivamente, camundongos APP/PS1 (entre 4 e 7 animais por condição) e Tg2576 (entre 3 a 5 animais por condição) com 7 meses e 16 meses. Camundongos deficientes em APOE (ApoE-KO, Jackson Laboratory, Bas Harbor, Maine) também foram usados. Os experimentos foram realizados de acordo com as normas da NIH e institucionais.

CONSTRUÇÃO E PRODUÇÃO DE VETORES VIRAIS

[00210] cDNA de APOE-2, -3 e -4 foi generosamente fornecido pelo Dr. LaDu da University of Illinois (Chicago). Depois da amplificação por PCR, cada um deles foi digerido por BamHI e inserido no arcabouço de AAV2-pCMV-hrGFP. Altos títulos de vetores do sorotipo 4 de AAV (AAV4-APOE2, AAV4-APOE3, AAV4-APOE4 e AAV4-GFP) foram produzidos usados o sistema de baculovirus pelo Gene Transfer Vector Core at the University of Iowa, Iowa City. Os vírus foram titulados usando PCR quantitativa.

[00211] Injeções Intraventriculares Estereotáxicas. As injeções intraventriculares estereotáxicas de vetores do sorotipo 4 de AAV foram realizadas como previamente descrito (T. L. Spires et al., Dendritic spine abnormalities in amyloid precursor protein transgenic mice demonstrated by gene transfer and intravital multiphoton microscopy. J Neurosci 25, 7278 (Aug 3, 2005); G. Liu, I. H. Martins, J. A. Chiorini, B. L. Davidson, Adeno-associated virus type 4 (AAV4) targets ependyma and astrocytes in the subventricular zone and RMS. Gene Ther 12, 1503 (Oct, 2005)). Os animais foram anestesiados pela injeção intraperitoneal de quetamina/xilazina (100 mg/kg e 50 mg/kg de peso corporal, respectivamente) e posicionados em uma tela estereotáxica (David Kopf Instruments, Tujunga, CA). As injeções de vetores foram realizadas em cada ventrículo lateral com 5 μl de preparação viral (título de 2x1012 vg/ml) usando uma micropipeta penetrante de calibre 33 acoplada a uma seringa de 10 μl Hamilton (Hamilton Medical, Reno, NV) em uma taxa de 0,25 μl/minuto. As coordenadas estereotáxicas dos locais de injeção foram calculadas a partir do bregma (anteroposterior +0,3 mm, médio-lateral ± 1 mm e dorsoventral -2mm).

[00212] Implantação da Janela Craniana e Imagem com Múltiplos Fótons. Uma semana depois ad injeção intraventricular, os camundongos foram anestesiados com isofluorano (1,5%) e uma janela craniana foi implantada pela remoção de um pedaço de crânio e substituindo-o por uma lamínula de vidro de 8 mm de diâmetro (como descrito previamente, T. L. Spires et al., Dendritic spine abnormalities in amyloid precursor protein transgenic mice demonstrated by gene transfer and intravital multiphoton microscopy. J Neurosci 25, 7278 (Aug 3, 2005)). Para a imagem, um anel de cera foi construído ao longo da borda da janela para criar um poço de água para a objetiva (objetiva de 20x, abertura numérica de 0,95, Olympus). A fim de visualizar os depósitos amiloides, animais transgênicos receberam uma injeção intraperitoneal de metoxi-XO4 (5 mg/kg) 24 h antes da cirurgia, um composto fluorescente que cruza a barreira hemato-encefálica e se liga aos depósitos de amiloide (B. J. Bacskai, W. E. Klunk, C. A. Mathis, B. T. Hyman, Imaging amyloid-beta deposits in vivo. J Cereb Blood Flow Metab 22, 1035 (Sep, 2002)). Antes da imagem, Texas Red dextran (peso molecular de 70.000 Da; 1,25 mg/ml em PBS estéril; Molecular Probes, Eugene, OR) foi injetado em uma veia lateral da cauda para fornecer um angiograma fluorescente tal que a forma da vascularização pudesse ser usada como um ponto de referência para acompanhar exatamente os mesmos campos de visualização ao longo do tempo. Os camundongos foram fotografados uma semana depois da injeção de AAV a fim de avaliar a linha de base dos depósitos de amiloide, depois de um e dois meses depois da injeção.

[00213] Um laser mode-locked Ti:Sapphire (MaiTai, Spectra- Physics, Mountain View, CA) montado em um sistema de imagem de múltiplos fótons (Bio-Rad 1024ES, Bio-Rad, Hercules, CA) gerou uma luz fluorescente da excitação de dois fótons a 860 nm. A luz emitida foi coletada através de um detetor externo feito por encomenda contendo três tubos foto-multiplicadores (Hammamatsu Photonics, Bridgewater, NJ) na faixa de 380-480, 500-540 e 560-650 nm. Imagens em duas cores foram adquiridas para as placas e angiografia simultaneamente. Imagens in vivo com baixa magnificação (615 x 615 μm; etapa z, 2 μm, profundidade ~ 200 μm) foram adquiridas e 6 a 8 campos de visualização foram fotografados para cobrir uma grande área cortical.

[00214] Processamento e Análise da Imagem. A densidade da placa em cada campo de visualização foi quantificada usando Image J relatando o número total de depósitos e amiloide por volume de córtex fotografado. Foi considerado o volume cortical começando pelo primeiro corte da pilha z na superfície até o último corte onde um depósito de amiloide podia ser detectado. O tamanho dos depósitos de amiloide foi avaliado ao longo do tempo pela medida de sua área transversal a partir da intensidade máxima depois da projeção bidimensional. Para cada placa, a proporção da área da área entre o ponto de tempo inicial e o primeiro mês (T1/T0) ou entre o segundo e o primeiro mês (T2/T1) foi calculado.

[00215] Os ajustes do microscópio de múltiplos fótons (potência do laser e PMTs) foram mantidos inalterados ao longo das diferentes sessões de imagem durante o tempo total do experimento.

[00216] Amostragem para microdiálise in vivo. A amostragem para a microdiálise in vivo de Aβ e ApoE intersticial cerebral foi realizada em camundongos Tg2576, 3 meses depois da injeção intracére- broventricular de cada AAV4 (S. Takeda et al., Novel microdialysis method to assess neuropeptides and large molecules in free-moving mouse. Neuroscience 186, 110 (Jul 14, 2011)). A sonda de microdiáli- se tinha um eixo de 4 mm com uma membrana de polietileno (PE) com ponto de corte de peso molecular de 1000 kDa) de 3,0 mm (PEP-4-03, Eicom, Kyoto, Japão). Antes do uso, a sonda foi condicionada pela rápida imersão em etanol e depois lavada com tampão de perfusão de fluido cérebro-espinhal artificial (aCSF) (em mM: NaCl 122, CaCl2 1,3, MgCl2 1,2, KH2PO4 3,0, Na2HCO3 25,0) que foi filtrado através de uma membrana com tamanho de poro de 0,2 μm. A saída e a entrada da sonda pré-condicionada foram conectadas a uma bomba peristálti- ca (ERP-10, Eicom, Kyoto, Japão) e uma bomba de microseringa (ESP-32, Eicom, Kyoto, Japão), respectivamente, usando um tubo (Φ 250 μm i.d.) de etileno propileno fuoretado (FEP).

[00217] O implante da sonda foi realizado como previamente descrito (S. Takeda et al., Novel microdialysis method to assess neuropeptides and large molecules in free-moving mouse. Neuroscience 186, 110 (Jul 14, 2011; J. R. Cirrito et al., In vivo assessment of brain interstitial fluid with microdialysis reveals plaque-associated changes in amyloid-beta metabolism and half-life. J Neurosci 23, 8844 (Oct 1, 2003)), com discretas modificações. Resumidamente, os animais anestesiados (isofluorano 1,5%) foram estereotaxicamente implantados com uma cânula guia (PEG-4, Eicom, Kyoto, Japão) no hipocampo (bregma -3,1 mm, lateral até a linha média -2,5 mm, ventral até a dura -1,2 mm). A guia foi então fixada ao crânio usando cimento dental binário.

[00218] Quatro dias depois do implante da cânula guia, os camundongos foram colocados em uma gaiola de microdiálise padronizada e uma sonda foi inserida através da guia. Depois da inserção da sonda a fim de obter os registros, a sonda e os tubos de conexão foram perfundido coa CSF por 240 min em uma taxa de 10 μl/min antes da coleta da amostra. As amostras foram coletadas em uma taxa de fluxo de 0,25 (para a quantificação de Aβ) e 0,1 μl/min (para a detecção de ApoE). As amostras foram armazenadas a 4°C em tubos de polipropi- leno. Durante a coleta de amostra para microdiálise, os camundongos foram despertados e se movimentaram livremente na gaiola de micro- diálise designada para permitir a movimentação sem restrições dos animais sem aplicação de pressão sobre a montagem da sonda (sistema de microdiálise AtmosLM, Eicom, Kyoto, Japão).

[00219] Análise imuno-histológica. Camundongos APP/PS1 foram sacrificados pela inalação de CO2 2 ou 5 meses depois da injeção intraventricular (exposição de curto e longo prazo), enquanto que os animais Tg2576 foram sacrificados depois de 3 meses. Um hemisfério cerebral inteiro foi fixado em paraformaldeído 4% em salina tampona- da com fosfato para a análise imuno-histológica e embebido em cera de parafina. Uma seção coronal de 1 mm através do córtex frontal foi processada para o ensaio de tomografia de matriz, enquanto que o resto do hemisfério cerebral foi congelado instantaneamente para realizar as análises bioquímicas e biomoleculares.

[00220] Para detectar os depósitos de amiloide, ApoE e GFP, os cortes embebidos em parafina (10 μm) foram sequencialmente despa- rafinizados em xileno, reidratados em etanol, tratados em tampão citrato (Citrato de sódio 10 mM, Tween 0,05%, pH 6,0), permeabilizados em PBS com Triton 0,5% e bloqueados em PBS com BSA 3% por 2 horas em temperatura ambiente. A Incubação com anticorpos primários foi feita por uma noite a 4°C: Bam10 (Sigma 1:1000) e R1282 (1:500, fornecido pelo Dr. Dennis Selkoe) para placas de amiloide, anticorpo monoclonal de camundongo 3H1 (Ottawa Heart Institute) para ApoE humana, anti-GFP de Galinha (1:500, Aves) e SMI-312 (Covance) para as distrofias neuríticas. A incubação com o anticorpo secundário foi feita por 2 h em temperatura ambiente no dia seguinte. O núcleo denso de amiloide das placas foi marcado pela incubação dos cortes por 8 minutos em uma solução de Thio-S (Sigma, St. Louis, MO) 0,05% em etanol 50% antes da montagem. Preparação da Amostra, Imuno-Coloração e Análise da Imagem para a Tomografia de Matriz.

[00221] As análises da tomografia de matriz para os elementos pré e pós-sinápticos foram realizadas como previamente descrito (R. M. Koffie et al., Oligomeric amyloid beta associates with postsynaptic densities and correlates with excitatory synapse loss near senile plaques. Proc Natl Acad Sci U S A 106, 4012 (Mar 10, 2009)). Resumidamente, um pedaço de tecido cortical (1 mm3) adjacente à região ventricular foi dissecado e fixado por 3 h em paraformaldeído 4%, su- crose 2,5% em PBS 001 M. Depois da desidratação em etanol, as amostras foram incubadas em resina LR White (Electron Microscopy Sciences) por uma noite a 4°C antes da polimerização a 53°C. Tiras das seções (70 nm) foram então cortadas em um micrótomo de ultra- corte (Leica) usando uma Jumbo Histo Diamond Knife (Diatome).

[00222] Depois da reidratação em glicina 50 mM em TBS por 5 minutos, as seções foram bloqueadas em Tween 0,05% e BSA 0,1% por 5 minutos e os anticorpo primários aplicados em 1:50 em tampão de bloqueio por 2 horas (PSD95 Abcam Ab12093, sinapsina I Millipore AB1543 e NAB61 de Dra Virginia Lee, que cora preferencialmente espécies oligoméricas de Aβ, E. B. Lee et al., Targeting amyloid-beta peptide (Abeta) oligomers by passive immunization with a conformation-selective monoclonal antibody improves learning and memory in Abeta precursor protein (APP) transgenic mice. J Biol Chem 281, 4292 (Feb 17, 2006)). As lâminas foram lavadas com TBS e os anticorpos secundários aplicados (Alexa Fluor 488 anti-cabra, Cy3 anti- camundongo ou Alexa Fluor 488 anti-camundongo Invitrogen). As imagens foram obtidas em seções seriadas de 7-30 através do córtex frontal e foram adquiridas usando um microscópio confocal/múltiplos fótons Zeiss Axioplan LSM510 (objetiva de imersão em óleo 63x de abertura numérica Plan Apochromatic).

[00223] As imagens foram analisadas como descrito previamente usando Image J (National Institutes of Health open software) e MATLAB (Mathworks) (R. M. Koffie et al., Oligomeric amyloid beta associates with postsynaptic densities and correlates with excitatory synapse loss near senile plaques. Proc Natl Acad Sci U S A 106, 4012 (Mar 10, 2009)). Cada conjunto de imagens foi convertido em pilhas e alinhados pelo uso de plug-ins de Image J MultiStackReg e StackReg (cortesia de Brad Busse e P. Thevenaz, Stanford University). Volumes conhecidos foram selecionados e um programa de detecção automatizado e baseado no limiar foi usado para contar pontos de PSD95 e de sinap- sina que apareceram em mais do que uma seção consecutiva (programa WaterShed fornecido por Brad Busse, Stephen Smith e Kristina Micheva, Stanford University). Watershed exportou uma pilha de imagens limiarizadas (separadas por cada canal) mostrando pontos que estavam presentes em mais do que um corte do arranjo. Vários sítios no córtex foram amostrados por camundongo e sua distância da borda da placa foi medida.

Quantificação de Aβ

[00224] As concentrações de Aβ40 e Aβ42 na fração solúvel em TBS, fração solúvel em ácido fórmico assim como no microdialisado foram determinadas pelo ELISA sanduíche (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japão) BNT-77/BA-27 (para Aβ40) e BNT-77/BC-05 (para Aβ42) e acordo com as instruções do fabricante. A quantidade de oligômero de Aβ na amostra foi determinada pelo ELISA sanduíche 82E1/82E1 (Immuno-Biological Laboratories, Inc., Hamburgo, Alemanha), no qual os mesmos anticorpos N-terminais (resíduos 1-16) foram usados para ambas, captura e detecção (W. Xia et al., A specific enzyme-linked immunosorbent assay for measuring beta-amyloid protein oligomers in human plasma and brain tissue of patients with Alzheimer disease. Arch Neurol 66, 190 (Feb, 2009)).

Análise de imunoblot

[00225] Frações de cérebro e microdialisados solúveis em TBS (20 μg de proteína) foram submetidos a eletroforese em géis Novex BisTris 4-12% (Invitrogen) em tampão de corrida MOPS para SDS-PAGE (Invitrogen). Os géis foram transferidos para uma membrana de PVDF e bloqueados por 60 min em RT em Leite 5%/TBS-T. As membranas foram sondadas com anticorpo de cabra anti-ApoE (1:1000, Millipore AB947) para detectar pequenas quantidades de APOE no ISF de animais APOE null, enquanto que a albumina foi detectada como um con- trole. Blots para ApoE humana e de camundongo foram sondados, respectivamente, com o anticorpo EP1373Y (1:1000, Novus Biologi- cals, NB110-55467) e com anticorpo policlonal de coelho para apoE (1:1000, Abcam, ab20874). A incubação com anticorpos IgG de cabra conjugados com HRP (Vetor) foi feita por 2 horas. As proteínas imu- norreativas foram desenvolvidas usando o kit ECL (Western Lightning, PerkinElmer) e detectadas em Hyperfilm ECL (GE Healthcare).

qRT-PCR

[00226] RNA total das amostras de cérebro foi extraído usando TRIzol® Reagent (Life technologies; 15596-026) e cDNA foi então sintetizado de acordo com a tecnologia SuperScript® III One-Step RT- PCR System (Life technologies; 12574-018) de acordo com as instruções do fabricante. Iniciadores de PCR foram designados para amplificar o mRNA de APOE humana recombinante e os mRNAs de ApoE e Gapdh endógenos (Apoe à frente: 5’-AGCTCCCAAGTCACACAAGA ; Apoe Reverso : 5’- GTTGCGTAGATCCTCCATGT ; APOE à frente: 5’- CCAGCGACAATCACTGAAC ; APOE Reverso : 5’- GCGCGTAATA- CGACTCACTA; Gapdh à frente: 5’- ATGACATCAAGAAGGTGGTG e Gapdh Reverso: 5’- CATACCAGGAAATGAGCTTG).

ELISA DE APOE

[00227] Ensaios ELISA específicos foram usados para detectar ambas proteínas APOE humana e de murino endógena. Resumidamente, placas de ELISA foram revestidas por uma noite com 1,5 ug/ml de anticorpo anti-APOE de cabra (para detectar APOE de Murino) ou 1,5 ug/ml de anticorpo WUE4 (para detectar APOE Humana) e bloqueadas com leite desnatado 1% diluído em PBS por 1,5 h a 37°C. Proteínas apoE recombinantes humanas foram usadas como padrões (para o ensaio específico para humano, Biovision) ou padrões internos para camundongo a partir de extrato de cérebro (para o ensaio específico para murino) e as amostras foram diluídas em tampão de ELISA (BSA 0,5% e Tween-20 0,025% em PBS) e incubadas por uma noite. Depois da lavagem, anticorpos de detecção específicos para humano (apoe de cabra Millipore; 1:10.000) ou camundongo (Abcam ab 20874; 1:2000) foram usados, respectivamente, seguidos pela incubação por 1,5 h com um anticorpo secundário conjugado com HRP apropriado. A revelação do sinal foi feita usando o substrato TMB antes de paralisar a solução usando H3PO4. Os resultados colorimétricos foram medidos a 450 nm.

Análise Estatística

[00228] A análise estatística foi feita usando o programa Prism. Devido ao pequeno tamanho das amostras, a normalidade não pode ser presumida para a maioria das análises. Para todas as análises postmortem, um teste de Kruskal-Wallis não paramétrico seguido pelo Teste da Comparação Múltipla de Dunn foram realizados para avaliar o efeito de cada vetor injetado. Os dados da imagem in vivo da progressão do amiloide foram analisados usando um modelo de efeitos mistos, com um efeito aleatório para camundongo e efeitos fixos para o vetor, tempo e densidade volumétrica da linha de base. Uma interação entre o tempo e o vetor foi considerada nessa análise, mas não foi significativa. Para a análise do tamanho da placa ao longo do tempo, dois modelos de efeitos mistos foram configurados para o log da proporção de dois pontos de tempo consecutivos, com efeitos aleatórios para camundongo e efeitos fixos para o log do tamanho da linha de base (t0 na primeira análise, t1 na segunda análise).

EXEMPLO 4 Transferência de Gene de Isoformas de ApoE Humana Modulam Diferencialmente a Deposição de Amiloide e Neurotoxicidade em Camundongos

[00229] A herança do alelo ε4 da apolipoproteína E (APOE) é o fator de risco genético mais forte associado com a forma esporádica da doença de Alzheimer (AD), enquanto que o alelo ε2 raro de APOE tem o efeito oposto. Entretanto, os mecanismos através dos quais APOE confere risco e proteção permanecem incertos. Aqui, foi usada uma abordagem de transferência de gene para banhar o córtex de camundongos transgênicos que carregam placas de amiloide com APOE humana expressa viralmente. Monitorou-se o β- amiloide (Aβ) com imagens de múltiplos fótons, microdiálise in vivo e tomografia de matriz post-mortem para estudar a cinética das alterações mediadas por APOE humana na neurotoxicidade relacionada a Aβ em camundongos transgênicos. Observou-se que APOE4 humana aumentou as concentrações de Aβ oligomérico dentro do fluido intersticial (ISF) e exacerbou a deposição da placa; o inverso ocorreu depois da exposição a APOE2 humana. A perda de sinapse peri-placa e as distrofias neuríti- cas também foram pioradas por APOE4 e atenuadas por APOE2. A saída de Aβ do sistema nervoso central (SNC) para o plasma foi diminuída por APOE3 e APOE4 comparadas com APOE2, de acordo com a retenção específica para a isoforma de Aβ no SNC. Globalmente. Nossos dados mostram um efeito diferencial de isoformas de APOE humana sobre a deposição e remoção de amiloide em camundongos transgênicos e, mais importante, sobre a sinaptoxicidade mediada por Aβ. Esses resultados sugerem que o risco genético de APOE é mediado por Aβ e que as abordagens terapêuticas que têm por objetivo diminuir APOE4 ou aumentar APOE2 podem ser benéficas na AD.

[00230] A doença de Alzheimer (AD) é o distúrbio neurodegenerati- vo relacionado à idade mais frequente e um problema maior de saúde pública. Entre os genes de suscetibilidade associados com a forma esporádica de início tardio de AD, a apolipoproteína E do alelo ε4 (APOE ε4 é de longe o fator de risco genético mais significativo. A presença de um\ cópia de APOE ε4 aumenta substancialmente o risco do desenvolvimento da doença por um fator de 3 comparado com o alelo APOE ε3 mais comum, onde duas cópias levam a um aumento de 12 vezes. Intrigantemente, APOE ε2 tem um impacto oposto e diminui o risco ajustado para a idade de AD em cerca de metade. A idade média do início da demência corresponde a esses perfis de risco, com os portadores de APOE4/4 tendo um início em meados dos 60 anos e os portadores de APOE2/3 no início dos 90 anos, uma mudança de quase 3 décadas, enquanto que os indivíduos com APOE3/3 têm uma idade de início nos meados dos 70 anos.

[00231] O acúmulo de placas senis contendo Aβ no hipocampo e no córtex de pacientes, é considerado desempenhar um papel central na AD, por que todos os genes conhecidos responsáveis pelas formas autossômicas dominantes raras da doença participam na produção de peptídeos de Aβ. Se APOE impacta AD através de um efeito sobre Aβ é controverso. O genótipo de APOE afeta acentuadamente a extensão da deposição de amiloide em pacientes e animais geneticamente manipulados que expressam APOE2, -E3 e E4 possuem uma ordem de classificação similar de carga de amiloide como os humanos, consistente com a hipótese que diferentes isoformas de APOE impactam a iniciação e/ou o crescimento da placa. As variantes de APOE também têm sido sugeridas modificar a quantidade de Aβ oligomérica solúvel neurotóxica e influenciar diferencialmente a integridade cerebrovascular e o efluxo de Aβ através da barreira hemato-encefálica. Finalmente, APOE tem sido implicada diretamente na neurodegeneração e na integridade sináptica. Como APOE2, que é protetora contra AD, influencia esses processos é desconhecido.

[00232] Como a maioria dos estudos anteriores dos efeitos de APOE usou a ablação genética de Apoe ou a expressão de longa duração de APOE em camundongos transgênicos, o impacto da introdução de APOE depois que a deposição da placa já tenha começado é atualmente desconhecido. No entanto, é fundamental para resolver esse problema considerar que novos testes clínicos que têm por objetivo elevar a expressão de APOE estão sendo atualmente avaliados e que a deposição de amiloide pode ser observada décadas antes dos déficits cognitivos. Para superar essa lacuna do conhecimento, foi usada uma abordagem de transferência de gene na qual os vetores adeno-associados virais (AAV) que expressam os vários alelos de APOE humana (ou a proteína verde fluorescente, GFP, como controle) foram injetados nos ventrículos laterais de um modelo de camundongo transgênico de AD para transduzir a camada ependimária, que então libera as proteínas APOE humanas dentro do fluido cérebro-espinhal (CSF) e fluido intersticial (ISF). Usando a microscopia de múltiplos fó- tons intravital, microdiálise in vivo assim como a tomografia de matriz, descobriu-se que as isoformas de APOE humana impactaram os níveis de Aβ oligomérico solúvel no ISF, o ritmo da fibrilização e da deposição de Aβ e a extensão dos efeitos neurotóxicos peri-placas. De fato, camundongos AD expostos a APOE4 humana mostraram uma quantidade aumentada de Aβ solúvel, uma maior densidade de placas fibrilares, uma exacerbação da perda sináptica e um número aumentado de distrofias neuríticas em volta de cada depósito, enquanto que um efeito protetor relativo foi observado com APOE2.

RESULTADOS Injeção intraventricular de AAV4-APOE leva a produção sustentada de APOE humana no cérebro

[00233] APOE é uma proteína naturalmente secretada, produzida principalmente pelos astrócitos e células da micróglia, que pode se difundir através do parênquima cerebral. Tirou-se vantagem dessa propriedade pela injeção de um vetor com o sorotipo 4 de AVV que carrega um gene que codifica GFP ou cada alelo de APOE humana nos ventrículos cerebrais laterais de camundongos transgênicos APP/PS1 com 7 meses de idade. Considerando as grandes áreas cerebrais afe- tadas pelas lesões características de AD, essa estratégia pode oferecer uma vantagem comparada com as múltiplas injeções intraparen- quimatosas.

[00234] Dois meses depois da injeção, as células transduzidas foram detectadas no plexo coroide e no epêndima que reveste o ventrículo. Usando anticorpos específicos para a espécie, ambas proteínas APOE humana e de murino também foram detectadas pelo ensaio ELISA (Fig. 18A-18B e Fig. 24B) e Western blot (Fig. 24A). A concentração de apolipoproteína E humana atingiu 20 μg/mg de proteína total em média (Fig. 18A), representando cerca de 10% da Apoe endógena de murino (Fig. 18BC). Essa modesta quantidade adicional de APOE humana mão alterou significativamente os níveis de mRNA ou proteína endógena de murino (Fig. 24A-24C). Uma pequena, mas estatisticamente significativa, diminuição nos níveis de APOE humana foi observada entre 2 e 5 meses depois da injeção de AAV4 (Fig. 24D). Não obstante, as quantidades de proteína humana permaneceram prontamente detectáveis, sugerindo que a transdução mediada por AVV4 forneceu uma plataforma para a produção sustentada da proteína se- cretada através do parênquima. De fato, a proteína APOE humana estava presente em volta dos depósitos amiloides ao longo do manto cortical, onde a proteína APOE é conhecida por se acumular.

[00235] Depois, foi avaliada a presença de APOE humana no ISF, um compartimento extracelular que contém Aβ solúvel altamente biologicamente ativa. Devido a quantidade relativamente pequena de APOE detectada no lisado de cérebro total, foram inoculados camundongos knockout para Apoe com vetores AAV4-APOE e rastreada a presença da proteína APOE humana usando anticorpos altamente sensíveis, mas não específicos para a espécie. A microdiálise confirmou a presença de APOE no ISF de animais knockout para Apoe injetados.

[00236] Globalmente, esses dados confirmam que uma única injeção intracerebroventricular de AAV4-APOE2/3/4 leva a uma produção sustentada de uma proteína de interesse ao longo de todo o parên- quima cerebral e ISF e que o epêndima/plexo coroide podem ser usados para liberar as proteínas para o cérebro.

Infusão de cada isoforma de APOE afeta diferencialmente os pep- tídeos amiloides e a deposição da placa

[00237] Camundongos APP/PS1 com sete meses de idade com deposição de amiloide substancial foram injetados com vetores que expressam GFP ou cada isoforma de APOE humana por 5 meses antes da eutanásia. Uma análise da carga da placa amiloide revelou um aumento significativo na densidade dos depósitos amiloides no córtex de amimais injetados com AAV4-APOE4 comparados com aqueles que expressam APOE2 (AAV4-APOE2: 31±4 e AAV4-APOE4: 77±5 placas/mm2 de córtex. p<0,01). A densidade da placa em camundongos expostos a GFP e APOE3 atingiu um nível intermediário entre APOE4 e APOE2 (AAV4-GFP: 54±15; AAV4-APOE3: 47±3 pla- cas/mm2 de córtex. Fig. 19A) e também foi equivalente aquela de animais não injetados.

[00238] As concentrações de peptídeos de Aβ40 e Aβ42 medidas a partir de extratos de ácido fórmico de cérebro de camundongo mimeti- zaram as alterações observadas histologicamente, tal que um aumento nos peptídeos de amiloide foi descoberto em camundongos que expressam APOE4 (Aβ40 :1733±338 pMol/mg de proteína e Aβ42:8720±1155 pMol/mg de proteína), e um efeito oposto foi detectado com APOE2 (Aβ40 : 468±105 pMol/mg de proteína Aβ42: 5156±1318 pMol/mg de proteína, p<0.05. Fig. 19B). O conteúdo de peptídeos de Aβ na fração solúvel em Tris Tampão Salina (TBS) foi similarmente afetado e altas concentrações de ambos Aβ40 e Aβ42 foram medidas depois da exposição a APOE4 (Aβ40 :94±18 pMol/mg de proteína e Aβ42:12,9±1,5 pMol/mg de proteína) compared with APOE2 (Aβ40 :20±8 pMol/mg de proteína e Aβ42:2,3±0,8 pMol/mg de proteína, p<0,05. Fig. 19C).

[00239] A expressão de cada isoforma de APOE por 2 meses levou a efeitos menores do que aqueles observados depois de 5 meses, implicando que o impacto de APOE na formação ou remoção de amiloide leva vários meses para se tornar óbvia quando avaliada pós-mortem. Não obstante, um aumento significativo na densidade da placa de ami- loide dentro do córtx de camundongos injetados com AAV4-APOE4 foi observado comparado com os outros grupos (AAV4-GFP: 25±4; AAV4- APOE2: 22±6; AAV4-APOE3: 26±5 e AAV4-APOE4: 56±4 placas/mm2 de córtex, p<0,05. Fig. 25A), em paralelo com o aumento de Aβ40 contido na fração de ácido fórmico (AAV4-GFP: 725±92; AAV4-APOE2: 492±62; AAV4-APOE3: 681±140 e AAV4-APOE4: 1108±238 pMol/mg de proteína, p<0,05. Fig. 25C). As concentrações de Aβ40/42 solúveis em TBS não se alteram e nenhuma alteração na proporção de placas com núcleo denso para a imunoreatividade total de Aβ foi detectada (Fig. 25B). Experimentos de controle adicionais não revelam qualquer impacto da injeção de AAV4-APOE sobre o metabolismo da Proteína Precursora de Amiloide (APP), ativação da glia ou quantidade de enzima que degrada a insulina. Globalmente, a comparação dos dados com 2 e 5 meses de exposição sugere que as alterações na isoforma de APOE mudam o Aβ solúvel e os depósitos fibrilares ao longo dos meses, mais do que atuando agudamente.

[00240] APOE afeta a barreira hemato-encefálica (BBB) e altera o efluxo de peptídeos de Aβ. Para examinar como a exposição de APOE modula o equilíbrio de peptídeos de Aβ através da BBB, as concentrações plasmáticas de Aβ40 foram medidas depois de 5 meses. O conteúdo plasmático de Aβ em camundongos injetados com AAV4-APOE3 ou AAV4-APOE4 era menor comparado com AAV4-APOE2 e AAV4- GFP (AAV4-GFP:1167±213; AAV4-APOE2:1247±160; AAV4- APOE3:736±78 e AAV4-APOE4:799±67 pMol/ml de plasma; p<0.05. Fig. 19D), sugerindo que APOE3 e APOE4 auxiliaram na retenção de Aβ no SNC, consistente com as concentrações relativas aumentadas de Aβ no cérebro com os dados prévios que relatam uma meia-vida mais longa de Aβ no SNC devido a APOE.

[00241] Portadores de APOE4 são mais suscetíveis à disfunção neurovascular e o rompimento da BBB foi mostrada ser favorecida em camundongos transgênicos para APOE4, mesmo na ausência de deposição de amiloide. Para avaliar se as injeções de AAV4-APOE comprometeram a integridade da BBB, a coloração post-mortem com azul da Prússia foi realizada, Apesar da presença de algumas áreas focais positivas para hemosiderina, nenhum efeito foi observado entre qualquer um dos grupos experimentais.

Expressão de isoformas de APOE modula a cinética da amiloido- se

[00242] Para avaliar como as variantes de APOE afetam a dinâmica da progressão da amiloidose, foi usada a imagem com dois fótons in vivo e acompanhada a cinética da formação e da remoção da placa amiloide. Os camundongos receberam uma injeção intraventricular de AAV4 que carrega GFP ou cada variante de APOE com 7 meses de idade e uma janela craniana foi implantada uma semana depois disso (T0). Depois de 1 mês (T1) ou de 2 meses (T2), os depósitos de ami- loide foram fotografados, seguindo exatamente as mesmas áreas cor- ticais no cérebro ao longo do tempo.

[00243] A maioria dos depósitos de amiloide permaneceram estáveis, embora novas placas pudessem ser detectadas ocasionalmente no mesmo volume visualizado. Entretanto, em raras ocasiões, uma placa positiva para metoxi que foi fotografada no início não foi mais detectada depois de um ou dois meses, sugerindo que algumas placas puderam ser removidas. A taxa de progressão do amiloide foi mais rápida em camundongos APP/PS1 expostos a APOE4, mas diminuiu e foi até revertida em animais expostos a APOE2. Depois de 2 meses, APOE2 reduziu significativamente a densidade dos depósitos de ami- loide em relação a GFP em 0,66 (p=0,002), em relação à APOE3 em 0,67 (p<0,0001) e em relação a APOE4 em 0,74 (p<0,0001) (Fig. 20A, B).

[00244] Em seguida, foi avaliado o crescimento de uma única placa de amiloide pela medida da proporção da área da seção transversal de depósitos individuais entre T1/T0 e T2/T1. As diferenças foram detectadas entre os grupos em T1 (proporção de T1/T0, Fig. 21), tal que depósitos de amiloide expostos a APOE4 cresceram significativamente mais, comparados com animais expostos a GFP, APOE2 e APOE3 (proporções de T1/T0: 1,175±0,048 para AAV4-GFP; 0,97±0,043 para AAV4-APOE2; 1,063±0,041 para AAV4-APOE3 e 1,29±0,065 para AAV4-APOE4; p<0,05). Esse efeito, entretanto, não foi observado depois do segundo mês (proporção T1/T2).

Perda Sináptica e Distrofias Neuríticas em Volta de Depósitos de Amiloide Depois da Exposição a APOE.

[00245] A perda sináptica é conhecida se correlacionar com o dano cognitivo. foi mostrado recentemente que a presença de APOE4 está associada com altas concentrações de Aβ oligomérico e uma densidade diminuída de sinapse em volta das placas de amiloide nos cérebros de pacientes humanos com AD comparado com APOE3. Em adição, evidencias recentes in vitro demonstraram que APOE4 falhou em proteger contra a perda de sinapse induzida por Aβ. Portanto, postulou-se que APOE não apenas afetou diferencialmente a cinética e a remoção da deposição de Aβ, mas também a integridade das sinapses que circundam os depósitos de amiloide.

[00246] As densidades dos elementos pré e pós-sinápticos (sinap- sina-1 e PSD95) foram determinadas usando a tomografia de matriz, uma técnica de alta resolução baseada na coloração imunofluorescen- te de seções de tecido ultra-finas (K. D. Micheva, S. J. Smith, Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron 55, 25 (Jul 5, 2007); R. M. Koffie et al., Oligomeric amyloid beta associates with postsynaptic densities and correlates with excitatory synapse loss near senile plaques. Proc Natl Acad Sci U S A 106, 4012 (Mar 10, 2009)). Conforme as espécies oligoméricas eram mostradas estarem altamente con-centradas em íntima proximidade dos depósitos amiloides, pontos de sinapsina-1 e PSD95 foram quantificados longe (>50 μm) ou perto (< 50 μm) das placas. A perda dos elementos pré-sinápticos proximo das placas foi exacerbada quando APOE3 ou APOE4 foram expressos, o que não foi o caso depois da injeção de AAV4-APOE2 ou AAV4-GFP (Fig. 22A). Em contraste, a densidade dos pontos pós-sinápticos permaneceu inalterada entre os camundongos injetados com GFP, ApoE2 e ApoE3, enquanto que os animais tratados com ApoE4 mostraram uma perda maior de PSD95 em volta dos depósitos de amiloide, reforçando assim o efeito deletério de ApoE4 sobre os efeitos neurotóxicos de Aβ (Fig. 22B). Quando a densidade dos elementos sinápticos foi avaliada em áreas localizadas longe dos depósitis de amiloide (> 50 μm), nenhuma diferença pode ser detectada entre os grupos, sugerindo que a perda sináptica relativa observada com APOE3 e APOE4 estava diretamente relacionada com a presença de peptídeos de Aβ que circundam cada placa.

[00247] avaliou-se também que o número de distrofias neuríticas associadas com os depósitos de amiloide como placas neuríticas refletem. uma alteração mais geral do neuropilo com um aumento da curvatura neurítica e o aparecimento de distrofias intumescidas. Essas alterações patológicas são provavelmente atribuíveis a espécies de Aβ oligomérica solúvel que são enriquecidas em uma região a 50 μm da superfície da placa. A expressão de APOE4 exacerba a formação de distrofias neuríticas positivas para SMI312 associadas com depósitos de amiloide comparada com GFP, APOE2 e APOE3 (Fig. 22C). Esse resultado confirma a observação de que a isoforma de APOE4 afeta a neurotoxicidade do amiloide.

Proteína APOE humanas modificam a quantidade de espécies de Aβ oligomérico no fluido intersticial de camundongos Tg2756

[00248] Foi abordada, depois, a questão de se presença de diferentes isoformas de APOE humana dentro do ISF pode alterar a quantidade da espécie de amiloide solúvel naquele compartimento extracelular. Foram inoculados camundongos Tg2576, a fim de validar nossos achados prévios em um modelo diferente de AD de camundongo. Os camundongos Tg2576 apresentam um fenótipo muito mais brando do que os camundongos APP/PS1 da mesma idade. São tratados, coortes de animais com 16 a 18 meses de idade, nos quais os depósitos de amiloide já tinham começado. Três meses depois da transferência de gene, uma sonda de microdiálise foi inserida no hipocampo e amostras foram coletadas para caracterziar alterações precoces associadas com cada variante de APOE humana.

[00249] Observou-se que a concentração de oligômeros de Aβ medida usando o ensaio 82E1/82E1 ELISA específico era significativa-mente maior (42±7%; p<0,05) depois da injeção de AAV4-APOE4 comparada com AAV4-APOE2 (Fig. 23), demonstrando que a presença de APOE pode modular a natureza de agregados amiloides no compartimento extracelular. Quando Aβ40 e Aβ42 total avaliados no ISF, a mesma tendência foi observada, mas não atingiu significância (Fig. 26).

[00250] Como esperado, a análise bioquímica post-mortem de cérebros de camundongos Tg2576 mostrou que a concentração de Aβ42 na fração de ácido fórmico estava aumentada em animais expostos a APOE4 (Fig. 26B), confirmando em um segundo modelo transgênico nossas observações prévias em camundongos APP/PS1.

DISCUSSÃO

[00251] Uma associação genética surpreendente entre a herança de alelos de APOE e AD, tem levado a múltiplas sugestões de como esse risco é mediado. APOE se liga à Aβ e tem sido implicada na remoção de Aβ, mas estudos em camundongos knockout para ApoE relataram surpreendentemente que os depósitos de Aβ eram substancialmente menores na ausência de ApoE. A substituição de ApoE endógena de murino com com APOE2, APOE3 ou APOE4 humanas modifica os depósitos de amiloide na mesma ordem como em pacientes com AD, presumivelmente através de um efeito sobre a iniciação da placa ou a formação de fibrila. Uma hipótese alternativa focaliza em efeitos diferenciais sobre desenvolvimento neurítico ou até propõe que o efeito do genótipo de APOE no fenótipo de AD é uma consequência de outro gene em desequilíbrio genético com APOE no cromossomo 19.

[00252] Usando uma tecnologia recentemente desenvolvida de transferência de gene (G. Liu, I. Martins, J. A. Wemmie, J. A. Chiorini, B. L. Davidson, Functional correction of CNS phenotypes in a lysosomal storage disease model using adeno-associated virus type 4 vectors. J Neurosci 25, 9321 (Oct 12, 2005)) e dois modelos de camundongo de AD, nossos dados se dirigiram diretamente para essas questões pelo uso de uma combinação de imagem com múltiplos fó- tons in vivo, imuno-histopatologia quantitativa padronizada, estudos de tomografia de matriz e abordagens de microdiálise de alto peso molecular que permitem o exame de Aβ oligomérico dentro do ISF. Nosso estudo demonstrou que mesmo um aumento modesto (~10%) nos níveis de APOE4 alterou a agregação de Aβ e a cinética da remoção, levando a retenção de Aβ e exacerbando a perda sináptica e distrofias neuríticas em volta das placas. Inversamente, APOE2 diminui a deposição de Aβ e tem um acentuado efeito neuroprotetor. Os efeitos observados não se correlacionam com as alterações no conteúdo de produtos proteolíticos de APP, sugerindo que a produção de Aβ per se não foi afetada. Portanto, esses resultados demonstram que quantidades modestas de APOE4 e APOE2 no ISF impactam a remoção de amiloide, deposição e a neurotoxicidade em direções opostas. Como quantidades menores de Aβ foram medidas no plasma de camundongos expostos a APOE3 ou APOE4 unicamente no SNC, postulou-se que os resultados podem ser devidos a depuração diferencial de Aβ dentro do cérebro. Esse efeito pode estar potencialmente relacionado com o estado da lipidação de cada variante de APOE produzida pelas células ependimárias transduzidas com AAV. De fato, estudos prévios mostraram que menos APOE4 está associada com lipoproteína comparada com APOE2 e APOE3, tal que o aumento dos níveis de lipo- proteínas delipidadas versus lipidadas pode ser um mecanismo para os efeitos diferenciais das isoformas de APOE sobre o acúmulo de Aβ e retenção no cérebro. Alternativamente, uma limitação de nosso estudo é a possibilidade de que a expressão de APOE2 humana diminui ou desloca Apoe de murino em um compartimento crítico, produzindo dessa maneira um efeito análogo aquele visto em animais Apoe null nos quais menos Aβ se acumula. Não obstante, como nossas medidas diretas da proteína e do mRNA de Apoe de murino não mostram um efeito global da expressão de APOE humana sobre a proteína endógena e como APOE2 e APOE4 possuem impactos opostos sobre a deposição de amiloide, foi favorecido um efeito direto de isoformas de APOE humana sobre a deposição de amiloide.

[00253] Como alterações modestas nos níveis de APOE no ISF possuem tais consequências dramáticas, esses resultados podem le- var à percepção dos efeitos de uma grande variedade de fatores ambientais e genéticos que poderão alterar o risco de AD ou da progressão de AD pela influência sobre a expressão de APOE. Aumentos em APOE de substancialmente mais do que uma magnitude, foram demonstrados que podem ocorrer depois de uma lesão cerebral traumática, epilepsia, isquemia e dietas com muito colesterol, todos os quais têm sido associados com Aβ cerebral elevada. Além disso, polimorfismos do promotor que têm sido previamente encontrados estar em desequilíbrio genético com o alelo de APOE4 afetam a expressão de APOE.

[00254] Outras manipulações que impactam a homeostase de lipo- proteínas APOE no SNC alteram claramente a deposição de Aβ. Por exemplo, em experimentos com a transferência focal de gene com APOE de lentivírus (primariamente expressos nos neurônios do hipocampo), a superexpressão de APOE4 exerce um efeito acentuado sobre o amiloide em relação à APOE3. Estudos prévios também mostraram que agonistas do Receptor X de Retinoide, que intensificam a síntese de APOE endógena, levam à remoção de Aβ do cérebro (P. E. Cramer et al., ApoE-directed therapeutics rapidly clear beta-amyloid and reverse deficits in AD mouse models. Science 335, 1503 (Mar 23, 2012); C. Bachmeier, D. Beaulieu-Abdelahad, F. Crawford, M. Mullan, D. Paris, Stimulation of the retinoid x receptor facilitates Beta-amyloid clearance across the blood-brain barrier. J Mol Neurosci 49, 270 (Feb, 2012)). Em adição, a transdução no cérebro de CYP46A1, que meta- boliza o colesterol no SNC e diminui seus níveis, reduz a deposição de Aβ assim como o aumento de LDL-R no cérebro, que é conhecido por diminuir os níveis de APOE. Alternativamente, peptídeos que mimeti- zam Aβ que bloqueiam a interação entre APOE3/4 e Aβ ou que convertem a estrutura de APOE4 em uma conformação semelhante de APOE2 ou APOE3 também mostraram efeitos sobre o acúmulo de amiloide. Finalmente, manipulações genéticas sugerem que a diminuição da expressão de Apoe endógena em 50%, impactam acentuada- mente o fenótipo de Aβ durante toda a vida do animal. Nossos estudos atuais, com APOE humana expressa sobre o background de Apoe de murino, pode resultar em parte da competição entre APOE humana e Apoe de murino pelas interações com Aβ. Não obstante, esses dados sugerem que alterações dependentes da isoforma humana podem ter efeitos dramáticos mesmo depois que as alterações patológicas estão bem estabelecidas.

[00255] Esses dados abordam outras quatro áreas importantes de controvérsia na literatura sobre APOE-AD. Foi demonstrado um claro efeito das isoformas de APOE sobre a neurotoxicidade avaliada pela perda da sinapse e distrofias neuríticas, ambas provavelmente relacionadas ao comprometimento do sistema da função neuronal. Como esses efeitos foram evidentes na vizinhança imediata das placas, mas não nas áreas distantes das placas, a proteção da sinapse por APOE2 é provavelmente mediada pelos efeitos sobre Aβ peri-placa ao invés de devidos a um efeito direto de APOE sobre a estabilidade sináptica. A imagem de múltiplos fótons longitudinais in vivo mostra que APOE4 intensifica a deposição e o crescimento da placa, enquanto que APOE2 está associada com a resolução das placas, arguindo que as isoformas de APOE possuem um impacto poderoso sobre o ritmo e a progressão da doença além de um efeito inicial sobre a formação da placa fibrilar. Os resultados reforçam a ideia de que ApoE4 pode acelerar o processo da doença em termos de deposição de amiloide e neurotoxicidade (e levando, portanto, a uma idade precoce de início), enquanto que APOE2 faz o oposto, o que aumenta a possibilidade de que a introdução de APOE2 (ou de um mimético de APOE2) no SNC pode ter um valor terapêutico. APOE tem sido sugerida como um mecanismo para remover Aβ do cérebro ou como uma molécula de reten- ção que diminui a meia-vida da remoção; os resultados atuais mostram que a introdução de quantidades modestas de APOE3/4 no ISF é suficiente para intensificar a retenção de Aβ no SNC. Os mecanismos da ação protetora acentuada de APOE2 na AD ainda não estão claros, em parte por que APOE2 se liga aos receptores de APOE de modo relativamente pobre. Os dados atuais sugerem que APOE2 tem um ganho de função e é capaz de reverter de fato os depósitos de Aβ estabelecidos, assim como o suporte sináptico e a plasticidade neurítica em adição ao provável efeito neutro ou nulo (comparado com outros alelos) sobre a remoção de Aβ no SNC. Isso sugere que as décadas de diferença na idade de início entre pacientes que herdam os alelos de APOE4 versus APOE2 podem refletir um ponto de início diferente e diferenças continuas na cinética da deposição e remoção de Aβ assim como as diferenças especificas do alelo na extensão da neurotoxicida- de associada com os depósitos. Essa função dupla de APOE2 pode levar a abordagens terapêuticas objetivadas para mimetizar sua capacidade de remoção de placa e restauração sináptica.

[00256] Esses resultados são consistentes com um modelo no qual APOE atua como um arcabouço para a oligomerização de Aβ. Esses resultados também são consistentes com a recente observação de que Aβ oligomérico está elevado no SNC de pacientes humanos com AD com APOE4 > APOE3 (mesmo quando a carga da placa está normalizada através dos casos). Se APOE, especialmente APOE4, medeia a formação de Aβ oligomérico neurotóxico, a predição pode ser que a expressão intensificada de APOE4 poderá levar a alterações sinápticas e neuríticas aumentadas, como parece ser o caso de nossos dados atuais. Com base nesses resultados, deve ser exercida cautela com relação aos agentes que podem aumentar as concentra-ções de APOE nos cérebros de portadores de APOE4.

[00257] Finalmente, os dados ressaltam a utilidade da transdução mediada por AAV da camada ependimária do cérebro para a liberação de genes que codificam proteínas secretadas que então se difundem através de todo o manto cortical. Foi sugerido que a transferência de gene ou outras abordagens que diminuem APOE4 ou aumentam APOE2, podem ser úteis para impactar a progressão da doença de AD.

MATERIAIS E MÉTODOS PROJETO DO ESTUDO

[00258] O presente estudo teve como objetivo investigar como a introdução de cada isoforma de APOE humana pode influenciar a progressão de amiloide e da neurotoxicidade associada a Aβ, depois que a deposição da placa já começou. Para abordar essa questão, uma única infusão com vetores de AAV que codificam cada variante de APOE foi feita dentro do espaço intracerebroventricular de dois diferentes modelos de camundongo transgênico com AD. Camundongos foram expostos por um curto período de tempo (2 -3 meses) ou longo período de tempo (5 meses). Usando a imagem in vivo, microdiálise in vivo e tomografia de matriz, o impacto das isoformas humanas de ApoE foi avaliado não apenas na deposição de amiloide e na oligome- rização dentro do ISF, mas também sobre a neurotoxicidade relacionada a Aβ (perda de sinapse e distrofias). Os camundongos foram designados aleatoriamente para os grupos de tratamento. A natureza do vetor injetado foi mantida oculta até a análise estatística. Todos os animais forma recuperados com sucesso dos procedimentos cirúrgicos foram incluídos nas análises post-mortem. O tamanho das amostras foi predeterminado com base na experiência prévia. A replicação com uma segunda linhagem transgênica foi realizada para testar adicionalmente a hipótese.

Animais

[00259] Camundongos APPswe/PS1dE9 (APP/PS1) (D. R. Borchelt et al., Accelerated amyloid deposition in the brains of transgenic mice coexpressing mutant presenilin 1 and amyloid precursor proteins. Neuron 19, 939 (Oct, 1997)) (Jackson Laboratory) e Tg2576 (K. Hsiao et al., Correlative memory deficits, Abeta elevation, and amyloid plaques in transgenic mice. Science 274, 99 (Oct 4, 1996)) expressam um gene da proteína mutante precursora do amiloide contendo a mutação Swedish K594N/M595L, sob o controle do promotor do príon. O modelo APP/PS1 também superexpressa o gene de Presenilina dele- tado para o éxon 9, o que leva a um fenótipo severo com deposição de amiloide aos 6 meses de idade. A linhagem Tg2576 é um modelo mais brando que desenvolve placas de amiloide em torno de 1 ano de idade. Foram expostos APP/PS1 com 7 meses de idade a cada vetor de AAV por 2 meses (n=4 AAV4-GFP, n=4 AAV4-APOE2, n=6 AAV4- APOE3 e n=5 AAV4-APOE4 animais) ou 5 meses (n=4 AAV4-GFP, n=5 AAV4-APOE2, n=6 AAV4-APOE3 w n=5 AAV4-APOE4 animais). Em adição, uma coorte de camundongos Tg2576 com 16 meses de idade (n=3 AAV4-GFP, n=3 AAV4-APOE2, n=5 AAV4-APOE3 e n=5 AAV4-APOE4 animais) foi incluída para medir os níveis de Aβ dentro do ISF. Camundongos deficientes em APOE (Jackson Laboratory) também foram usados. Os experimentos foram realizados de acordo com as normas da NIH e institucionais.

Construção e produção de vetores virais

[00260] cDNA de APOE-2, -3 e -4, generosamente fornecido pelo Dr. LaDu da University of Illinois (Chicago) foi amplificado por PCR, digerido por BamHI e inserido no arcabouço de AAV2-pCMV-hrGFP. Vetores do sorotipo 4 de AAV foram produzidos pelo Gene Transfer Vector Core na University of Iowa, Iowa City. Os títulos virais foram determinados por PCR quantitativa.

Injeções estereotáxicas intracerebroventriculares

[00261] As injeções intraventriculares de AAV foram realizadas co mo previamente descrito (G. Liu, I. H. Martins, J. A. Chiorini, B. L. Davidson, Adeno-associated virus type 4 (AAV4) targets ependyma and astrocytes in the subventricular zone and RMS. Gene Ther 12, 1503 (Oct, 2005); T. L. Spires et al., Dendritic spine abnormalities in amyloid precursor protein transgenic mice demonstrated by gene transfer and intravital multiphoton microscopy. J Neurosci 25, 7278 (Aug 3, 2005)). Os animais foram anestesiados (quetamina/xilazina: 100 mg/kg e 50 mg/kg de peso corporal, respectivamente) e posicionados em uma tela estereotáxica (David Kopf Instruments, Tujunga, CA). As injeções foram realizadas em cada ventrículo lateral com 5 μl de preparação viral (título de 2x1012 vg/ml) usando uma micropipeta penetrante de calibre 33 acoplada a uma seringa de 10 μl Hamilton (Hamilton Medical) 0,25 μl/minuto. As coordenadas estereotáxicas foram calculadas a partir do bregma (antero-posterior +0,3 mm, médio- lateral ± 1 mm e dorsoventral -2mm).

Implantação da Janela Craniana e Imagem de Múltiplos Fótons

[00262] Os camundongos foram anestesiados com isofluorano (1,5%) e uma janela craniana foi implantada pela substituição de um pedaço de crânio por uma lamínula de vidro de 5 mm (T. L. Spires et al., Dendritic spine abnormalities in amyloid precursor protein transgenic mice demonstrated by gene transfer and intravital multiphoton microscopy. J Neurosci 25, 7278 (Aug 3, 2005)). Para a imagem, um anel de cera foi construído para criar um poço de água para a objetiva (objetiva de 20x, abertura numérica de 0,95, Olympus). Os depósitos de amiloide foram visualizados depois de uma injeção intraperitoneal de metoxi-XO4 (5 mg/kg) 24 h antes da cirurgia, um composto fluorescente que cruza a barreira hemato-encefálica e se liga as placas (B. J. Bacskai, W. E. Klunk, C. A. Mathis, B. T. Hyman, Imaging amyloid-beta deposits in vivo. J Cereb Blood Flow Metab 22, 1035 (Sep, 2002)). Texas Red dextran (70.000 Da; 1,25 mg/ml em PBS; Molecular Probes) foi injetado em uma veia lateral da cauda para fornecer um angiogra- ma fluorescente para acompanhar exatamente os mesmos campos de visualização ao longo do tempo. Os camundongos foram fotografados uma semana depois da injeção de AAV, depois um e dois meses.

[00263] Um laser mode-locked Ti:Sapphire (MaiTai, Spectra- Physics, Mountain View, CA) montado em um sistema de imagem de múltiplos fótons (Bio-Rad 1024ES, Bio-Rad) gerou uma luz fluorescente da excitação de dois fótons a 860 nm. A luz emitida foi coletada através de um detector externo contendo três tubos foto- multiplicadores (Hammamatsu Photonics) na faixa de 380-480, 500540 e 560-650 nm. Imagens em duas cores foram adquiridas para as placas e angiografia simultaneamente. Imagens in vivo com baixa magnificação (615 x 615 μm; etapa z, 2 μm, profundidade ~ 200 μm) foram adquiridas e 6 a 8 campos de visualização foram fotografados.

Processamento e análise da imagem

[00264] A densidade da placa foi quantificada usando Image J relatando o número total de depósitos de amiloide por volume de córtex fotografado. Foi considerado o volume cortical começando pelo primeiro corte da pilha z na superfície até o último corte onde um depósito de amiloide podia ser detectado. O tamanho dos depósitos de amiloide foi avaliado ao longo do tempo pela medida de sua área transversal a partir da intensidade máxima depois da projeção bidimensional. Para cada placa, a proporção da área da área entre o ponto de tempo inicial e o primeiro mês (T1/T0) ou entre o segundo e o primeiro mês (T2/T1) foi calculado. Os ajustes do microscópio de múltiplos fótons (potência do laser e PMTs) foram mantidos inalterados ao longo das diferentes sessões de imagem.

Amostragem para microdiálise in vivo

[00265] A amostragem para a microdiálise in vivo de ISF foi realizada em camundongos Tg2576, 3 meses depois da injeção de AAV (S. Takeda et al., Novel microdialysis method to assess neuropeptides and large molecules in free-moving mouse. Neuroscience 186, 110 (Jul 14, 2011)). A sonda de microdiálise tinha um eixo de 4 mm com uma membrana de polietileno (PE) com ponto de corte de peso molecular de 1000 kDa (MWCO) de 3,0 mm (PEP-4-03, Eicom). Antes do uso, a sonda foi lavada com fluido cérebro-espinhal artificial (aCSF) (em mM: NaCl 122, CaCl2 1,3, MgCl2 1,2, KH2PO4 3,0, Na2HCO3 25,0). A saída e a entrada da sonda pré-condicionada foram conectadas a uma bomba peristáltica (ERP-10, Eicom, Kyoto, Japão) e uma bomba de microseringa (ESP-32, Eicom, Kyoto, Japão), respectivamente, usando um tubo (Φ 250 μm i.d.) de etileno propileno fuoretado (FEP).

[00266] O implante da sonda foi realizado como previamente descrito (S. Takeda et al., Novel microdialysis method to assess neuropeptides and large molecules in free-moving mouse. Neuroscience 186, 110 (Jul 14, 2011; J. R. Cirrito et al., In vivo assessment of brain interstitial fluid with microdialysis reveals plaque-associated changes in amyloid-beta metabolism and half-life. J Neurosci 23, 8844 (Oct 1, 2003)). Resumidamente, os animais anestesiados (isofluorano 1,5%) foram estereotaxicamente implantados com uma cânula guia (PEG-4, Eicom) no hipocampo (bregma -3,1 mm, lateral até a linha média -2,5 mm, ventral até a dura -1,2 mm). A guia foi então fixada ao crânio usando cimento dental binário. Quatro dias depois da cirurgia, os camundongos foram colocados em uma gaiola de microdiálise padronizada e uma sonda foi inserida através da guia. A sonda foi perfundida com aCSF por 240 min em uma taxa de 10 μl/min antes da coleta da amostra. As amostras foram coletadas em uma taxa de fluxo de 0,25 (para Aβ) e 0,1 μl/min (para ApoE). As amostras foram armazenadas a 4°C em tubos de polipropileno. Os camundongos foram despertados e se movimentaram livremente na gaiola de microdiálise (sistema de mi- crodiálise AtmosLM, Eicom, Kyoto, Japão).

Análise imuno-histológica

[00267] Camundongos foram sacrificados pela inalação de CO2. Um hemisfério cerebral foi fixado em paraformaldeído 4% em PBS e embebido em cera de parafina. Uma de 1 mm através do córtex foi processada para o ensaio de tomografia de matriz, enquanto que o resto do hemisfério cerebral foi congelado instantaneamente. Os cortes embebidos em parafina (10 μm) foram sequencialmente desparafinizados em xileno, reidratados em etanol, tratados em tampão citrato (Citrato de sódio 10 mM, Tween 0,05%, pH 6,0), permeabilizados em PBS com Triton 0,5% e bloqueados em PBS com BSA 3% por 2 horas. A Incubação com anticorpos primários foi feita por uma noite a 4°C: Bam10 (Sigma 1:1000) e R1282 (1:500, fornecido pelo Dr. Dennis Selkoe) para placas de amiloide, anticorpo monoclonal de camundongo 3H1 (Ottawa Heart Institute) para ApoE humana, anti-GFP de Galinha (1:500, Aves), SMI-312 (Covance) para as distrofias neuríticas IBA1 (1:500, Wako) e GFAP (1:1000, SIGMA), respectivamente para células da mi- cróglia e astrócitos. A incubação com o anticorpo secundário foi feita por 2 h. O núcleo denso das placas de amiloide foi marcado com Thio- S (Sigma-Aldrich) 0,05% em etanol 50% antes da montagem.

Preparação da amostra, imuno-coloração e imagem para a tomo- grafia de matriz.

[00268] As análises da tomografia de matriz foram realizadas como previamente descrito (R. M. Koffie et al., Oligomeric amyloid beta associates with postsynaptic densities and correlates with excitatory synapse loss near senile plaques. Proc Natl Acad Sci U S A 106, 4012 (Mar 10, 2009)). Um pedaço de tecido cortical (1 mm3) adjacente à região ventricular foi dissecado e fixado por 3 h em paraformaldeído 4%, sucrose 2,5% em PBS 0,01 M. Depois da desidratação em etanol, as amostras foram incubadas em resina LR White (Electron Microscopy Sciences) por uma noite a 4°C antes da polimerização a 53°C. Tiras das seções (70 nm) foram então cortadas em um micrótomo de ultra- corte (Leica) usando uma Jumbo Histo Diamond Knife (Diatome).

[00269] Depois da reidratação em glicina 50 mM em TBS por 5 minutos, as seções foram bloqueadas em Tween 0,05% e BSA 0,1% por 5 minutos e os anticorpo primários aplicados em 1:50 em tampão de bloqueio por 2 horas (PSD95 Abcam Ab12093, sinapsina I Millipore AB1543 e NAB61 de Dra Virginia Lee, que cora preferencialmente espécies oligoméricas de Aβ ( E. B. Lee et al., Targeting amyloid-beta peptide (Abeta) oligomers by passive immunization with a conformation-selective monoclonal antibody improves learning and memory in Abeta precursor protein (APP) transgenic mice. J Biol Chem 281, 4292 (Feb 17, 2006)), seguidos pelos anticorpos secundários (Invitrogen). As imagens foram obtidas em seções seriadas de 7-30 e foram adquiridas usando um microscópio confocal/múltiplos fótons Zeiss Axioplan LSM510 (objetiva de imersão em óleo 63x de abertura numérica Plan Apochromatic).

[00270] As imagens foram analisadas como descrito previamente usando Image J (National Institutes of Health)) e MATLAB (Mathworks) (R. M. Koffie et al., Oligomeric amyloid beta associates with postsynap- tic densities and correlates with excitatory synapse loss near senile plaques. Proc Natl Acad Sci U S A 106, 4012 (Mar 10, 2009)). Cada conjunto de imagens foi convertido em pilhas e alinhado pelo uso de plug-ins de Image J MultiStackReg e StackReg (cortesia de Brad Busse e P. Thevenaz, Stanford University). Volumes conhecidos foram selecionados e um programa de detecção automatizado e baseado no limiar foi usado para contar pontos de PSD95 e de sinapsina que apareceram em mais do que uma seção consecutiva (programa WaterShed fornecido por Brad Busse, Stephen Smith e Kristina Micheva, Stanford University). Watershed exportou uma pilha de imagens limia- rizadas (separadas por cada canal) mostrando pontos que estavam presentes em mais do que um corte do arranjo. Vários sítios no córtex foram amostrados por camundongo e sua distância da borda da placa foi medida.

Quantificação de Aβ

[00271] As concentrações de Aβ40 e Aβ42 foram determinadas pelo ELISA sanduíche (Wako) BNT-77/BA-27 (para Aβ40) e BNT-77/BC-05 (para Aβ42) de acordo com as instruções do fabricante. A quantidade de oligômero de Aβ foi quantificada pelo ELISA sanduíche 82E1/82E1 (Immuno-Biological Laboratories), no qual os mesmos resíduos N- terminais (resíduos 1-16) foram usados para ambas, captura e detecção (W. Xia et al., A specific enzyme-linked immunosorbent assay for measuring beta-amyloid protein oligomers in human plasma and brain tissue of patients with Alzheimer disease. Arch Neurol 66, 190 (Feb, 2009)).

Análise de imunoblot

[00272] Lisados e microdialisados de cérebro foram submetidos a eletroforese em géis Novex Bis-Tris 4-12% (Invitrogen) em tampão de corrida MOPS para SDS-PAGE (Invitrogen). Os géis foram transferidos para uma membrana de PVDF e bloqueados por 60 min em RT em Leite 5%/TBS-T. As membranas foram sondadas com anticorpo de cabra anti-ApoE (1:1000, Millipore) para detectar pequenas quantidades de APOE no ISF de animais APOE null, enquanto que a albumina foi usada como um controle. Blots para ApoE humana e de camundongo foram sondados, respectivamente, com o anticorpo EP1373Y (1:1000, Novus Biologicals, NB110-55467) e com anticorpo policlonal de coelho para APOE (1:1000, Abcam). Produtos proteolíticos de APP (sAPP: 22C11, 1:4000, Millipore e C83/C99: APP Cter, 1:4000, Sigma) e a enzima que degrada a insulina (IDE, 1:1000, Santa Cruz) também foram analisados. A incubação com anticorpos IgG de cabra conjugados com HRP (Vetor) foi feita por 2 horas. As proteínas imunorreativas foram desenvolvidas usando o kit ECL (Western Lightning, PerkinEl- mer) e detectadas em Hyperfilm ECL (GE Healthcare).

qRT-PCR

[00273] RNA total das amostras de cérebro foi extraído usando TRIzol® Reagent (Life technologies; 15596-026) e cDNA foi então sintetizado de acordo com a tecnologia SuperScript® III One-Step RT- PCR System (Life technologies; 12574-018). Iniciadores de PCR foram designados para amplificar o mRNA de APOE humana e os mRNAs de apoE endógena e Gapdh (Apoe à frente: 5’- AGCTCCCAAGTCACACAAGA ; Apoe Reverso : 5’- GTTGCGTAGA- TCCTCCATGT ; APOE à frente: 5’- CCAGCGACAATCACTGAAC ; APOE Reverso : 5’- GCGCGTAATACGACTCACTA; Gapdh à frente: 5’- ATGACATCAAGAAGGTGGTG e Gapdh Reverso: 5’- CATACCA- GGAAATGAGCTTG).

ELISA DE APOE

[00274] Amostras foram extraídas em Triton 2% em TBS, permitindo a mobilização e a quantificação de ApoE ligada a membrana. As placas de ELISA foram revestidas por uma noite com 1,5 ug/ml de anticorpo anti-APOE de cabra (APOE de Murino) ou 1,5 ug/ml de anticorpo WUE4 (APOE Humana) e bloqueadas com leite desnatado 1% diluído em PBS por 1,5 h. Proteínas apoE recombinantes humanas foram usadas como padrões (ensaio humano, Biovision) ou padrões internos para camundongo a partir de extrato de cérebro (ensaio para murino) e as amostras foram incubadas por uma noite em tampão de ELISA (BSA 0,5% e Tween-20 0,025% em PBS). Anticorpos de detecção específicos para humano (apoe de cabra Millipore; 1:10.000) ou camundongo (Abcam ab 20874; 1:2000) foram usados, respectivamente, seguidos por anticorpos secundários conjugados com HRP. A revelação do sinal foi feita usando o substrato TMB antes de paralisar a solução usando H3PO4, que foi medido a 450 nm.

ANÁLISE ESTATÍSTICA

[00275] A análise estatística foi feita usando o programa Prism. Devido ao pequeno tamanho das amostras, a normalidade não pode ser presumida para a maioria das análises. Para todas as análises postmortem, um teste de Kruskal-Wallis não paramétrico seguido pelo Teste da Comparação Múltipla de Dunn foram realizados. Os dados da imagem in vivo da progressão do amiloide foram analisados usando um modelo de efeitos mistos, com um efeito aleatório para camundongo e efeitos fixos para o vetor, tempo e densidade volumétrica da linha de base. Uma interação entre o tempo e o vetor foi considerada nessa análise, mas não foi significativa. Para a análise do tamanho da placa ao longo do tempo, dois modelos de efeitos mistos foram configurados para o log da proporção de dois pontos de tempo consecutivos, com efeitos aleatórios para camundongo e efeitos fixos para o log do tamanho da linha de base (t0 na primeira análise, t1 na segunda análise). As amostras não foram identificadas para cada análise.

[00276] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente estão incorporadas aqui por referência. Embora no pedido precedente essa invenção tenha sido descrita em relação a certas modalidades preferidas e vários detalhes tenham sido descritos com propósitos de ilustração, ficará claro para aqueles versados na técnica que a invenção é suscetível à modalidades adicionais e que certos detalhes aqui descritos podem ser variados consideravelmente sem se afastar dos princípios básicos da invenção.

[00277] O uso das expressões "o/a" e "um/uma" e referências similares no contexto da descrição da invenção deve ser considerado como abrangendo o singular e o plural, a menos que indicado de outra maneira ou claramente contradito pelo contexto. As expressões "compreendendo", "tendo", "incluindo" e "contendo" devem ser consideradas como expressões de sentido aberto (isto é, significando "incluindo, mas não limitado a") a menos que notado de outra maneira. A citação de faixas de valores é meramente pretendida servir como um método de abreviação para se referir individualmente a cada valor separado que está dentro da faixa, a menos que indicado aqui de outra maneira e cada valor separado está incorporado no pedido como se fosse individualmente aqui citado.

[00278] Todos os métodos aqui descritos podem ser realizados em qualquer ordem adequada a menos que indicado de outra maneira ou claramente contradito pelo contexto. O uso de qualquer um e de todos os exemplos ou linguagem exemplificadora (por exemplo, "tal como") fornecidos aqui, é pretendido meramente ilustrar melhor a invenção e não impor uma limitação ao escopo da invenção a menos que reivindicado de outra maneira. Nenhuma linguagem no pedido pode ser considerada como indicando qualquer elemento não reivindicado como essencial para a prática da invenção.

[00279] Modalidades dessa invenção estão aqui descritas, incluindo o melhor modo conhecido pelos inventores para realizar a invenção. Variações dessas modalidades podem se tornar claras para aqueles versados na técnica depois da leitura da descrição precedente. Os inventores esperam que profissionais experientes empreguem tais variações como apropriadas e os inventores pretendem que a invenção seja praticada de outra maneira do que aquela especificamente aqui descrita. Consequentemente, essa invenção inclui todas as modificações e equivalentes do assunto em questão citadas nas reivindicações em anexo como permitidas pela lei aplicável. Além disso, qualquer combinação dos elementos acima descritos em todas as suas possí-veis variações é abrangida pela invenção a menos que indicado aqui ou claramente contradito pelo contexto.

Claims

1. Método in vitro para a determinação de A-beta 40 em um mamífero antes e depois do tratamento de um distúrbio amiloide, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) quantificar o nível de A-beta 40 em uma primeira amostra de sangue do mamífero antes de o referido mamífero receber um tratamento para um distúrbio amiloide; (b) quantificar o nível de A-beta 40 em uma segunda amostra de sangue do mamífero após receber um tratamento para um distúrbio amiloide; e (c) determinar o nível de A-beta 40 no mamífero antes e depois do tratamento de um distúrbio amiloide, em que o método in vitro compreende ainda comparar o nível de A-beta 40 na primeira amostra com o nível de A-beta 40 na segunda amostra, em que um nível aumentado de A-beta 40 na segunda amostra de sangue quando comparado com a primeira amostra de sangue está associado com ou é indicativo de uma diminuição ou uma redução das placas ou agregados amiloides presentes no cérebro do mamífero, e/ou está está associado com ou é indicativo de tratamento eficaz do distúrbio amiloide, e em que o tratamento compreende um nível elevado de isoforma de ApoE protetora no cérebro do mamífero, em que a isoforma de ApoE protetora é ApoE ApoE ε2, e em que o distúrbio amiloide é doença de Alzheimer.

2. Método in vitro de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender ainda calcular a proporção do nível de A-beta 40 na primeira amostra para o nível de A-beta 40 na segunda amostra.

3. Método in vitro de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o nível de A-beta 40 na primeira amos- tra de sangue ou na segunda amostra de sangue é quantificada por um imunoensaio.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a amostra de sangue é de sangue total, plasma ou soro.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o mamífero é um primata, preferencialmente um humano.