WO2021201116A1 - リソソーム損傷を修復する活性を有する化合物のスクリーニング方法 - Google Patents

リソソーム損傷を修復する活性を有する化合物のスクリーニング方法 Download PDF

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保 吉森
修平 中村
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Definitions

  • the present invention relates to a method for screening a compound having an activity of repairing lysosomal damage targeting the transcription factor EB in cells lacking the ATG protein.
  • Lysosomes are the major intracellular degradative organelles that connect the pathways of endocytosis, phagocytosis, and autophagy. Proper function and integrity of lysosomes are essential for many cellular processes. Numerous intrinsic and extrinsic factors, including oxidative stress, silica or urate crystals, lysosomal tropic drugs, and certain lipids, induce hyperpermeability of the lysosomal membrane and / or lysosomal rupture. Several molecular mechanisms are involved in the repair of damaged lysosomes, thereby contributing to lysosome homeostasis (Non-Patent Document 1).
  • Autophagy is an evolutionarily conserved cytoplasmic degradation system in which a bimembrane structure called autophagosome sequesters cytoplasmic substances and fuses with lysosomes to degrade cargo. Will be done.
  • a special type of autophagy, lysosome has recently been shown to help isolate damaged lysosomes and thereby maintain lysosome homeostasis (Non-Patent Documents 2 and 3).
  • ATG genes mediate the formation and maturation of autophagosomes (Non-Patent Document 4).
  • Autophagy stimulation increases the lipidation of LC3 (ATG8), which depends on ATG genes such as ATG3, ATG5, ATG7, ATG12, ATG16L1, and the lipidized LC3 is localized to the autophagosome membrane (ATG3).
  • ATG genes such as ATG3, ATG5, ATG7, ATG12, ATG16L1, and the lipidized LC3 is localized to the autophagosome membrane (ATG3).
  • Non-Patent Document 5 Autophagy is transcriptionally regulated by several transcription factors, including the transcription factor EB (TFEB), which is a master regulator of autophagy and lysosomal biosynthesis (Non-Patent Documents 6 and 7).
  • TFEB transcription factor EB is known to be activated in response to endolysosomal damage (Non-Patent Documents 8 and 9), but its regulatory mechanism has been largely unknown.
  • the present invention has been made in view of the above-mentioned problems of the prior art, and an object of the present invention is to elucidate the mechanism of activation of TFEB in the process of resorgy and to develop a drug for repairing lysosomal damage based on the mechanism. To do.
  • the present inventors analyzed the mechanism of resorgy related to TFEB, and as a result, the ATG binding system in which TFEB mediates the lipidation of LC3 (ATG8) (ATG3, ATG7, ATG16). It was found that it is activated depending on the function of. This ATG binding system-mediated TFEB activation was independent of the conventionally known TFEB activation by suppressing mTOR. It was also found that lysosomal damage induces the recruitment of LC3 onto lysosomes, and that lipidized LC3 interacts with lysosomal calcium channels TRPML1 and promotes channel volume essential for TFEB activation.
  • the present inventors targeted TFEB in cells lacking the ATG protein. As a result, they have found that it is possible to screen for a drug that repairs lysosomal damage, and have completed the present invention.
  • the present invention provides the following in more detail.
  • a method for screening a compound having an activity of repairing lysosomal damage (A) A step of contacting a test compound with cells lacking at least one ATG protein selected from the group consisting of ATG3, ATG5, ATG7, ATG8, ATG12, ATG16, and homologs thereof. (B) a step of detecting the activation of the transcription factor EB in the cell, and (c) a step of selecting a compound that activates the transcription factor EB. How to include.
  • step (a) The method according to [1], wherein in step (a), the cells are further subjected to a treatment for damaging lysosomes or a treatment for releasing calcium from lysosomes.
  • a method for screening a compound having an activity of repairing lysosomal damage (A) ATG3, ATG5, ATG7, ATG8, ATG12, ATG16, and cells lacking at least one ATG protein selected from the group consisting of homologues thereof and cells lacking the ATG protein. The process of contacting (B) The step of detecting the activation of the transcription factor EB in both cells, and (c) the transcription factor EB is activated in the cells not deficient in the ATG protein, but the transcription factor is activated in the cells deficient in the ATG protein. The process of selecting a compound that does not activate EB, How to include.
  • a method for screening a compound having an activity of repairing lysosomal damage (A) A step of contacting a test compound with a cell lacking ATG8 or its homolog and a cell not lacking ATG8 or its homolog. (B) Step of detecting activation of transcription factor EB in both cells, (C) A step of selecting a compound that activates the transcription factor EB in cells that do not lack the ATG8 or its homolog, but does not activate the transcription factor EB in the cells that lack the ATG8 or its homolog. (D) A step of evaluating whether or not the selected compound promotes the interaction between the lipidized ATG8 or its homologue and TRPML1, and (e) a step of selecting a compound that promotes the interaction. How to include.
  • the active ingredient contains a compound that activates the transcription factor EB in a manner dependent on at least one ATG protein selected from the group consisting of ATG3, ATG5, ATG7, ATG8, ATG12, ATG16, and homologs thereof.
  • a drug to repair lysosomal damage is a compound that activates the transcription factor EB in a manner dependent on at least one ATG protein selected from the group consisting of ATG3, ATG5, ATG7, ATG8, ATG12, ATG16, and homologs thereof.
  • the active ingredient contains a compound that activates the transcription factor EB in a manner dependent on at least one ATG protein selected from the group consisting of ATG3, ATG5, ATG7, ATG8, ATG12, ATG16, and homologs thereof.
  • Drugs for the prevention or treatment of diseases caused by lysosomal damage are included in the group consisting of ATG3, ATG5, ATG7, ATG8, ATG12, ATG16, and homologs thereof.
  • Diseases caused by lithosome damage are selected from the group consisting of crystalline nephropathy, hyperuricemia, type 2 diabetes, arteriosclerosis, siliceous pneumonia, chronic lung disease, neurodegenerative diseases, and infectious diseases. , [6].
  • [8] The agent according to any one of [5] to [7], wherein the ATG protein is ATG8 or a homologue thereof, and the compound promotes the interaction between the lipidated ATG8 or the homologue thereof and TRPML1.
  • the present invention it is possible to screen a compound having an activity of repairing lysosomal damage by targeting TFEB in cells lacking a specific ATG protein. This makes it possible to efficiently develop drugs for the prevention and treatment of diseases caused by lysosomal damage such as crystalline nephropathy.
  • TFEB EGFP (green) strongly localized in WT cells, FIP200-KO cells, and ATG9-KO cells 3 hours after LLOMe treatment (1 hour), ATG7-KO cells and ATG16L1-KO. Damaged by cells.
  • Vi Quantification of nuclear / cytoplasmic TFEB :: EGFP ratio in cells or control cells 3 hours after LROMe treatment.
  • FIG. 2A It is a continuation of FIG. 2A.
  • V A snapshot of Fura-2 calcium imaging. Some WT cells showed a high increase in cytoplasmic calcium (arrow), while ATG7 KO did not show a sharp increase.
  • Vi Ca 2+ levels of individual Fura-2 loaded WT and ATG7-KO HeLa cell cytosol. In total, 104 WT cells and 96 ATG7 KO cells were quantified. The scale bar is 500 ⁇ m (v). It is a figure which shows that the interaction between a lipidized LC3 and a TRPML1 channel is essential for TFEB activation.
  • Quantification of cells containing LC3B spots (viii) and nuclear localization TFEB :: mNeonGreen (ix) in (viii and ix) HA vector, WT TRPML :: HA overexpressing cells, or AXXA TRPML :: HA overexpressing cells. .. * P ⁇ 0.05, ** P ⁇ 0.01, analysis of variance.
  • the scale bar is 50 ⁇ m (vii). It is a figure which shows that lysosomal injury induction TFEB activation alleviates CaOx nephropathy.
  • Kidney sections of WT and proximal tubular epithelial cell (PTEC) -specific Atg5-deficient mice collected 24 hours after oxalate injection (75 mg / kg). Samples were immunostained with TFEB (red) and the marker of the proximal tubule, LRP2 / MEGALIN (green), and counterstained with DAPI (blue).
  • PTEC proximal tubular epithelial cell
  • FIG. 5 shows that transfection of Effectene-coated beads induces TFEB nuclear localization in an ATG-binding system-dependent manner.
  • LC3-II lipidized LC3
  • NT untreated
  • Ii Representative fluorescence images showing LC3 spots in some cell lines. The number of LC3 spots increased after LLOMe treatment in WT cells and autophagy-deficient cells, except for ATG16L1-KO. The scale bar is 50 ⁇ m. It is a continuation of FIG. 9A.
  • IIii Representative immunofluorescent images of the localization of LC3B (green), LAMP1 (magenta), and Gal-3 (cyan) in DMSO or LLOMe treated (1 hour) cells.
  • ML-SA1 increased the number of LC3 spots on lysosomes in WT cells and FIP200 KO cells, but not the number of Gal-3 spots. This suggests that calcium outflow is sufficient to induce the recruitment of LC3 to lysosomes.
  • (Iv) Quantification of LC3B spots in WT cells, FIP200 cells, and ATG7 KO cells treated with DMSO or ML-SA1 (1 hour). The bar represents the mean ⁇ standard error (n 3). * P ⁇ 0.05, analysis of variance.
  • the scale bar is 50 ⁇ m. It is a figure which shows that CaOx crystal causes lysosomal damage of mouse kidney.
  • (I) Representative images of proximal tubular epithelial cells that stably express GFP-galectin-3 under specified conditions (n 3 in each group).
  • Pizzolato-stained kidney sections showing CaOx crystals not only in the lumen but also in tubular epithelial cells (arrows).
  • Kidney sections were immunostained with LAMP1 (v), galectin-3 (vi, red), LAMP1 (vi, green), TFEB (viii) and hematoxylin (v) or DAPI (vi). It was counter-stained with.
  • ⁇ -synuclein monomer was used as a control for ⁇ -synuclein fibers, and WT nematode cells were used as targets for ATG7 KO nematode cells. It is a photograph showing the result of detecting the localization of ⁇ -synuclein in each adult stage of nematodes in the HLH-30 / TFEB mutant (SHU10xtm1978) expressing ⁇ -synuclein. As a control, WT nematode cells (SHU10xc) expressing ⁇ -synuclein were used.
  • the present invention provides a method for screening a compound having an activity of repairing lysosomal damage.
  • the first aspect of the screening method of the present invention is to apply the test compound to cells lacking at least one ATG protein selected from the group consisting of ATG3, ATG5, ATG7, ATG8, ATG12, ATG16, and homologs thereof.
  • a method including a step of contacting (step (a)), a step of detecting activation of TFEB in the cell (step (b)), and a step of selecting a compound that activates TFEB (step (c)). Is.
  • a compound having an activity of repairing lysosomal damage independent of a specific ATG protein can be screened. Further, since it was found by the present invention that the activation of TFEB via the ATG binding system and the activation of TFEB by the suppression of mTOR are independent, in this embodiment, the lysosome is lysosome via the suppression of mTOR. Compounds that have the activity of repairing damage can also be screened.
  • "repair of lysosome damage” means that an autophagosome wraps and sequesters a damaged lysosome, and the segregated autophagosome fuses with an undamaged lysosome to form a new lysosome. It means the process of removing damaged lysosomes.
  • test compound used in the present invention is not particularly limited, and a desired compound whose activity for repairing lysosomal damage is to be evaluated can be used.
  • test compound include a gene library and its expression product, a synthetic low molecular weight compound library, a peptide library, a polynucleotide library, and a molecule that suppresses gene function (for example, siRNA, CRISPR-Cas system).
  • libraries include libraries, antibodies, bacterial release substances, cell (microorganisms, plant cells, animal cells) extracts and culture supernatants, purified or partially purified polypeptides, extracts from marine organisms, plants, or animals. However, it is not limited to these.
  • the "cell” to which the test compound is contacted is a eukaryotic cell lacking at least one ATG protein essential for TFEB activation.
  • "ATG protein” originally found in budding yeast, but named ATG (A u t opha g y -related) is assigned, in homologues in other organisms, necessarily, the name “ATG” Not attached. However, as long as it is a homolog that has a similar function in other organisms, it is included in the "ATG protein” in the present invention regardless of its name.
  • mammalian homologues of Saccharomyces cerevisiae ATG8 include LC3 (LC3 A / B / C) and GABARAP (GABARAP, GABARAPL1-3).
  • ATG3, ATG5, ATG7, ATG8, ATG12, and ATG16 are preferable.
  • the typical amino acid sequences of the human-derived ATG3, ATG5, ATG7, LC3A, LC3B, LC3C, GABARAP, GABARAPL1, GABARAPL2, and ATG16L1 amino acid sequences are set to SEQ ID NO: 2, respectively.
  • the base sequences of the DNA encoding the protein are assigned to 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, and 20, respectively, with SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, and 15. , 17, and 19.
  • the "ATG protein" of the present invention may be derived from another organism.
  • Homologs derived from other organisms are, for example, amino acids having 70% or more (for example, 80% or more, 90% or more, 95% or more, 98% or more, 99% or more) homology with the above-mentioned human-derived amino acid sequence.
  • Has a sequence. Sequence homology can be assessed using, for example, Protein-protein BLAST (blastp) (eg, default parameter settings).
  • various eukaryotic cells can be used depending on the purpose, but vertebrate cells are preferable.
  • animals from which cells are derived include mammals, fish, birds, reptiles, and amphibians.
  • Mammals are a concept that includes human and non-human mammals.
  • non-human mammals include rodents such as mice, rats, guinea pigs, hamsters and squirrels, ungulates such as cows, wild boars, pigs, sheep and goats, ungulates such as horses, and rabbits such as rabbits.
  • Meat such as dogs, cats and ferrets, and primates such as monkeys, gorillas and chimpanzees.
  • Animal cells include, for example, cultured animal cells (for example, HeLa cells, mouse fetal fibroblasts), cells constituting organs / tissues extracted from animals, and cells constituting individual animals (for example, near cells). Positional tubule epithelial cells) and the like are included.
  • ATG protein deficiency means that the ATG protein is in a non-functional state in cells.
  • ATG protein deficiency can be performed by a known method such as knockout or suppression of expression of the ATG gene.
  • Knockout cells of the ATG gene can be produced, for example, by introducing a mutation into the gene by a genome editing system (CRISPR-Cas system, TALEN, ZFN, etc.) that targets the ATG gene.
  • a genome editing system CRISPR-Cas system, TALEN, ZFN, etc.
  • the preparation of a conditional knockout animal of the ATG gene can be performed by, for example, the following method.
  • cells having recombinant DNA in their genome are subjected to homologous recombination using a donor vector having DNA in which the ATG gene or a part thereof is sandwiched between recombinant enzyme recognition sequences (for example, loxP sequence). ) Is created.
  • the cells are then generated into individual animals (eg, flox animals) and the resulting animals are mated with animals (eg, Cre animals) into which a recombinant enzyme (eg, Cre) expression cassette has been incorporated.
  • the expressed recombinant enzyme binds to the recognition sequence to cause gene recombination, and the ATG gene is knocked out.
  • an expression-suppressing molecule such as siRNA or ribozyme that targets a transcript of the ATG gene is introduced into the cell, or the expression-suppressing molecule is expressed in the cell. It can be produced by allowing it to be produced.
  • Contact between the test compound and the cell can be performed by adding the test compound to the experimental system containing the cell, but depending on the type of the test compound (for example, in the case of a gene or protein), It may include an operation of introducing the test compound into cells.
  • the test compound When targeting cells constituting an individual animal, the test compound can be brought into contact with the target cells through administration to the animal (oral administration, parenteral administration by injection, etc.).
  • TFEB The screening target "TFEB” in the present invention is a master regulator of autophagy and lysosomal biosynthesis, and is known to be activated in response to endolysosomal damage (Non-Patent Documents 6 and 8, 9).
  • TFEB the typical amino acid sequence of a human-derived TFEB protein is shown in SEQ ID NO: 22, and the base sequence of the DNA encoding the protein is shown in SEQ ID NO: 21. , May be derived from other organisms.
  • Homologs derived from other organisms are, for example, amino acids having 70% or more (for example, 80% or more, 90% or more, 95% or more, 98% or more, 99% or more) homology with the above-mentioned human-derived amino acid sequence.
  • TFEB is dephosphorylated to the active form, translocates into the nucleus and functions as a transcription factor. Therefore, “activation of TFEB” in the present invention detects, for example, nuclear translocation of TFEB, dephosphorylation of TFEB, binding to a gene expression control region by TFEB, expression of a gene induced by TFEB, and the like as indicators. be able to.
  • Nuclear translocation of TFEB is detected when tracking in living cells, for example, by observing the intracellular localization of the fusion protein in cells expressing the fusion protein of the TFEB protein and the reporter protein with a fluorescence microscope. be able to. Reporter proteins used for this purpose include, but are not limited to, for example, green fluorescent protein (GFP), DsRed, mCherry, mOrange, dbana, mStrawbury, mRaspbury, mPlum and the like.
  • GFP green fluorescent protein
  • DsRed red fluorescent protein
  • mCherry mOrange
  • dbana mStrawbury
  • mRaspbury mRaspbury
  • mPlum nuclear translocation of TFEB can also be detected by immune cell staining using an antibody that specifically recognizes TFEB.
  • a labeled antibody that specifically recognizes TFEB when the direct method is adopted, a labeled antibody that specifically recognizes TFEB is used, and when the indirect method is adopted, a labeled molecule (protein A or) that recognizes an antibody that specifically recognizes TFEB is used. Secondary antibody) is used.
  • the label used for this purpose include, but are not limited to, fluorescent dyes such as FITC, Alexa Fluor TM dye, and Cy dye, and fluorescent proteins such as PE and APC.
  • TFEB For dephosphorylation of TFEB, for example, Western blotting using an anti-TFEB antibody is performed, and the molecular weight of the detected TFEB band (for example, downshift of the molecular weight in comparison with non-dephosphorylated TFEB) is used as an index. Can be detected.
  • Western blotting using an antibody that specifically recognizes phosphorylated TFEB is performed, and a decrease in the band of phosphorylated TFEB (for example, a decrease in band compared to non-dephosphorylated TFEB) is used as an index. It can also be detected as.
  • Binding to the gene expression control region by TFEB can be detected using, for example, the reporter activity in a cell into which a vector in which a reporter gene is functionally bound downstream of the expression control region is introduced.
  • “functionally binding” means that the expression control region and the reporter gene are bound so that the expression of the reporter gene is induced by the binding of TFEB to the expression control region. ..
  • a gene expression control region containing a CLEAR (Coordinated Lysosome Expression and Regulation) element to which TFEB binds can be preferably used (Sardiello M et al., Science, 325, 473-477 (2009)). , Settieri C et al., Science.
  • Reporter genes used for this purpose include, for example, chloramphenicol acetyltransferase (CAT) gene, ⁇ -galactosidase (lacZ) gene, ⁇ -galactosidase (lacZ) gene, luciferase gene, ⁇ -glucuronidase (GUS).
  • Examples include, but are not limited to, genes, green fluorescent protein (GFP) genes, and the like.
  • the expression of the reporter gene can be detected by a method known to those skilled in the art, depending on the type of reporter gene used.
  • the reporter gene is a chloramphenicol acetyltransferase (CAT) gene
  • CAT chloramphenicol acetyltransferase
  • lacZ ⁇ -galactosidase
  • the color development of the dye compound due to the catalytic action of the gene expression product is used as an index
  • the chemical luminescence generated by the catalytic action of the gene expression product is used as an index.
  • GFP green fluorescent protein
  • X-Gluc 5-bromo-4-chloro-3-indrill- ⁇ -glucuronide
  • the expression of the reporter gene can be detected using the fluorescence of the GFP protein as an index.
  • the expression of the gene induced by TFEB is detected at the transcription level, for example, by RT-PCR method, Northern blotting method, etc.
  • when it is detected at the translation level for example, Western blotting method, radioimmunoassay method, etc. It can be detected by chemiluminescent immunoassay, chemiluminescent enzyme immunoassay, enzyme immunoassay, or the like.
  • Genes whose expression is induced by TFEB are known (Sardiello M et al., Science, 325, 473-477 (2009), Settieri M. et al., Hum Mol Genet, 20, 3852-66 (2011)).
  • a compound that activates TFEB is selected from the test compounds.
  • the compound thus selected has the activity of repairing lysosomal damage independently of a specific ATG protein (ATG protein deleted in cells).
  • the activation of TFEB by the test compound can be evaluated by comparison with the detection result in the control (when the test compound is not used). In this case, a compound having a higher degree of TFEB activation when the test compound is used as compared with the control is selected.
  • the degree of activation of TFEB can be quantitatively detected, the degree of activation of TFEB when the test compound is used is usually 10% or more, preferably 20% or more, more preferably, as compared with the control. Is 30% or more, more preferably 50% or more (for example, 70% or more, 100% or more, 200% or more, 300% or more, 500% or more).
  • the cells lacking the ATG protein are further treated to damage the lysosome or release calcium from the lysosome. ..
  • the lysosome in addition to the compound selected in the first aspect, is independent of the particular ATG protein, but dependent on lysosomal damage or calcium release from the lysosome. Compounds that have the activity of repairing damage can also be identified.
  • Examples of the "treatment that damages lysosomes” for cells include contact of a drug that damages lysosomes with cells.
  • Examples of the drug include, but are not limited to, L-leucyl-L-leucine methyl ester (LLOME) and glycyl-L-phenylalanine 2-naphthylamide (GPN).
  • examples of the "treatment for releasing calcium from lysosomes” for cells include contact of a drug that induces the release of calcium from lysosomes with cells.
  • Examples of the drug include, but are not limited to, agonists of TRPML1 which is a calcium channel of lysosomes (for example, ML-SA1).
  • the above treatment and contact of the test compound with the cells may be performed first or simultaneously.
  • Contact between a cell and a drug that damages the lysosome or induces the release of calcium from the lysosome can be performed, for example, by a drug in a solution containing the cell.
  • the drug can be brought into contact with the target cells through administration to the animal (oral administration, parenteral administration by injection, etc.).
  • a third aspect of the screening method of the present invention comprises cells lacking at least one ATG protein selected from the group consisting of ATG3, ATG5, ATG7, ATG8, ATG12, ATG16, and homologs thereof for the test compound.
  • This method includes a step (step (c)) of selecting a compound that activates TFEB but does not activate TFEB in cells lacking the ATG protein.
  • the third aspect differs from the first and second aspects in that the compound obtained by screening has an activity of repairing lysosomal damage in a specific ATG protein-dependent manner.
  • One preferred example of the third aspect is the step of contacting the test compound with cells lacking ATG8 or its homologue and cells lacking ATG8 or its homologue (step (a)), transcription in both cells.
  • step (b) the transcription factor EB is activated in the cells not deficient in the ATG8 or its homologue, but the transcription factor EB is activated in the cells lacking the ATG8 or its homologue.
  • step (c) a step of selecting a compound that does not activate
  • step (d) a step of evaluating whether or not the selected compound promotes the interaction between the lipidated ATG8 or its homologue and TRPML1 (step (d)).
  • step (e) A method comprising the step of selecting a compound that promotes the interaction.
  • a compound that promotes the interaction between lipidated ATG8 or its homologue and TRPML1 in the process of repairing lysosomal damage, a compound that promotes the interaction between lipidated ATG8 or its homologue and TRPML1 can be screened.
  • the interaction between lipidized ATG8 or its homologue and TRPML1 can be detected, for example, by co-immunoprecipitation or proximity ligation assay (PLA: Ploximity Ligation Assay). Whether or not the test compound promotes the interaction can be evaluated by comparison with the detection result in the control (when the test compound is not added).
  • test compound "ATG protein”, “cell lacking ATG protein”, “contact between test compound and cell”, and “detection of TFEB activation”
  • test compound "ATG protein”, “cell lacking ATG protein”, “contact between test compound and cell”, and “detection of TFEB activation”
  • candidates for a drug for repairing lysosomal damage and a drug for preventing or treating a disease caused by lysosomal damage can be identified.
  • the compounds identified include compounds that activate TFEB independently of the ATG protein and compounds that activate TFEB dependent on the ATG protein.
  • Lysosome damage includes, for example, calcium oxalate crystals, uric acid crystals, cholesterol crystals, crystals such as crystalline silica, aggregates such as pancreatic islet amyloid polypeptide (IAPP), ⁇ -sinucrane, tau, bacterial toxins, lysosome-directing agents, etc.
  • the method for screening a compound having an activity of repairing lysosomal damage of the present invention is effective as a method for screening a compound for preventing or treating a disease caused by these lysosomal damage.
  • the compound identified by the screening of the present invention can be made into a pharmaceutical product by mixing it with a pharmacologically acceptable carrier and formulating it by a known pharmaceutical method.
  • Pharmaceutically acceptable carriers include, for example, sterile water, saline, vegetable oils, solvents, bases, emulsifiers, suspensions, surfactants, stabilizers, flavoring agents, fragrances, excipients, vehicles. , Preservatives, binders, diluents, isotonic agents, soothing agents, bulking agents, disintegrants, buffers, coating agents, lubricants, colorants, sweeteners, thickeners, flavoring agents, dissolving Auxiliary agents or other additives and the like can be mentioned, but are not limited thereto.
  • Antibodies and Reagents for Cell Culture were used: anti-Galtecin3 (Santa Cruz Biotechnology), anti-LAMP1 (Santa Cruz Biotechnology), anti-TF. rabbit, Cell Signaling Technology), anti-phospho S6K (rabbit, Cell Signaling Technology), anti-S6K (rabbit, Cell Signaling Technology), anti-phospho GSK ⁇ (Cell Signaling Technology), anti-GSK ⁇ (Cell Signaling Technology), anti -PPP3CB (OriGene), antibody-p62 (rabbit, MBL), anti-HA (mouse, BioLegend), antibody-FLAG (mouse, Sigma).
  • LLOME Leu-Leu methyl ester hydrobromide
  • 3xFLAG tagged humans LC3A, LC3B, LC3G120A, LC3C, GABARAP, GABARAPL1, GABARAPL2 were subcloned into pcDNA3.1.
  • an In-Fusion reaction (Takara Bio Inc.) was carried out.
  • gRNA sequence ATG2A, 5'-TGCCGAGACATCCACCTGGAA-3' / SEQ ID NO: 25 ATG2B, 5'-CACTATGCCTTGCCGTTT-3' / SEQ ID NO: 26 ATG3,5'-ACAACCATAATCGTGGAGTC-3' / SEQ ID NO: 27 ATG7,5'-GAAATAATATGGCGGCAGCTACG-3'/ SEQ ID NO: 28 ATG9,5'-GTGTTGGTGCACGTCGCCGAG-3' / SEQ ID NO: 29 ATG13,5'-GTCCCTTCTTGCTATAACTA-3' / SEQ ID NO: 30 ATG14,5'-ACATAGGCACTTTCTAGGC-3' / SEQ ID NO: 31 ATG16L1,5'-GCCGCCGCTGACTTCCCCCGC-3' / SEQ ID NO: 32 FIP200,5'-CAAGATTGCTATTCAAC-3'/ SEQ ID NO: 33 STX17,5'-ATAG
  • siRNA knockdown For TFEB knockdown, ON-TARGETplus Human TFEB (7942) siRNA (Dharmacon) was used. PPP3CB siRNA and ATG16L1 were purchased from Sigma. SiRNA (final concentration 20 nM) was transfected into HeLa cells with Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) and the expression level was evaluated by Western blotting 48 hours later.
  • TFEB nuclear localization For evaluation of TFEB nuclear localization, cells were treated with 1 mM LLOMe for 1 hour and rinsed with DMEM. Samples were inspected 3 hours after washing. EBSS starvation was performed for 4 hours. The CellProfiler was used to quantify the nuclear to cytoplasmic ratio TFEB :: EGFP or TFEB :: mNeonGreen. The number of LC3 spots and the co-localization rate between Lamp1 and LC3B were analyzed using Fiji.
  • Biochemical measurement Plasma creatinine and BUN were measured using the CRE-EN Kainos test (Kainos Co., Ltd., Japan) and BUN-Test-Wako (Wako, Japan).
  • RNA extraction and qRT-PCR Total RNA was extracted using Trizol (Invitrogen). CDNA was generated using the PrimeScript RT Reagent Kit (Takara Bio Inc.). qRT-PCR was performed on the ABI 7900HT RT-PCR system (Applied Biosystems) using Power SYBR Green (Applied Biosystems). GAPDH was used as an internal control.
  • the primer sequences are as follows: Kim1-F, 5'-tbagctcgggaatgcaca-3'/ SEQ ID NO: 35 Kim1-R, 5'-tggttgtgtctccgtgt-3'/ SEQ ID NO: 36 Ngal-F, 5'-ctacaacccagttcccatgg-3'/ SEQ ID NO: 37 Ngal-R, 5'-acactccacccactcat-3'/ SEQ ID NO: 38 Gapdh-F, 5'-aactttggcattgtgggaagg-3'/ SEQ ID NO: 39 Gapdh-R, 5'-acacattgggggggaaca-3'/ SEQ ID NO: 40.
  • Antibodies and reagents for nematode cell culture experiments In this experiment, anti-Gal-3 (rat, 1/1000; Santa Cruz Biotechnology, sc-23938) was used. As a secondary antibody for immunofluorescence, goat antibody-rat Alexa Fluor 568/647 pre-absorbed (1/1,000; Abcam, ab150167) was used. Cells were treated with 10 ⁇ g / ml ⁇ -synuclein ATTO fibers or monomers for 8 hours.
  • plasmid construction and transformation of nematodes A plasmid containing EGFP-tagged human TFEB (plasmid number 38119) was obtained from Addgene.
  • the pMRX-IRES-puro vector was donated by Professor Shoji Yamaoka (Tokyo Medical and Dental University, Tokyo, Japan).
  • Complementary DNA corresponding to mNeonGreen-tagged TFEB was subcloned into the pMRX-IRES-puro vector to generate recombinant retroviruses.
  • Recombinant retroviruses were prepared as previously reported to generate stable cell lines.
  • a translational fusion construct of SNCA :: EGFP or SNCA :: RFP
  • the 1-kb exogenous promoter and coding sequence of SNCA were cloned into a pEXP-aex vector or pEXP-ACC vector.
  • the vector contains a tag of EGFP or RFP and is expressed in a nerve-specific manner.
  • SHU10 nakEx5 [SNCA-RFP :: unc-54, Lin44 :: GFP]
  • pEXP-aex-SNCA-RFP was microinjected with the co-injection marker Lin44 :: GFP.
  • m1978 hlh-30 variant
  • SHU10xtm1978 For use in microscopic experiments, m1978 (hlh-30 variant) was obtained from CGC and the strain was crossed with a transformant (SHU10xtm1978).
  • C. elegans growth conditions C. elegans was cultured with Escherichia coli strain OP50 on a nematode growth medium at 20 ° C. by a standard method.
  • Galectin-3 (Gal-3) is a ⁇ -galactose-binding lectin and is a marker for damaged endosomes and lysosomes. The sugar chains in the lumen become accessible to the cytosol galectin-3, which then forms spots (I. Paz et al., Cell Microbiol 12, 530-544 (2010)).
  • Non-Patent Document 2 galectin-3 positive injury 12 hours after LLOMe treatment by knockdown of ATG16L1, which is essential for autophagy. Removal of lysosomes was impaired (FIGS. 1A (iii) and (iv), and FIG. 5A (i)).
  • knockdown of TFEB also resulted in a significant increase in the number of Gal-3 positive spots compared to controls, which is also essential for the removal of lysosomes with impaired TFEB function. It shows that there are (FIGS. 1A (iii) and (iv), and FIG. 5A (i)).
  • TFEB :: EGFP was strongly nuclear localized by LLOMe in wild-type (WT) and ATG9 and FIP200 knockout cells, but nuclear localization was significantly impaired in ATG7 knockout cells and ATG16 knockout cells (FIG. 1B). (V) and (vi)).
  • ATG7 knockout cells and ATG16 knockout cells lack components of the ATG binding system that are essential for the lipidation of the autophagosome markers LC3 / ATG8.
  • Activated calcineurin dephosphorylates TFEB during starvation and promotes its activation (D. L. Medina et al., Nature Cell Biology 17, 288-299 (2015)). Knockdown of PPP3CB, one of the subunits of calcineurin, did not significantly ineffective LLOMe-induced TFEB activation (FIGS. 8 (ii) and (iii)). This suggests that although it cannot be ruled out that some subunits of calcineurin may mediate this process, additional mechanisms may be involved in this pathway. ..
  • LLOMe treatment rapidly increased the lipidation of LC3, the number of LC3 spots, and the amount of Lamp1-positive lysosomes co-localized with LC3 (FIGS. 3A (i)-(iii) and 9A (i)).
  • LC3 to Lamp1-positive spots was also observed in FIP200-KO cells, ATG13-KO cells, ATG14-KO cells, ATG9-KO cells, and Rubicon-KO cells, but also in ATG7-KO cells and It was not observed in ATG16L1-KO cells.
  • lipidized LC3 is essential for TRPML1 volume and TFEB activation.
  • Co-immunoprecipitation analysis revealed that all ATG8 homologs interact with TRPML1 (FIG. 3A (iv)).
  • lipidized LC3 not lipid-deficient LC3 (G120A mutant), co-immunoprecipitated with TRPML1 (FIG. 3B (v)).
  • the TRPML1 channel functions as a homotetramer (Q. Chen et al., Nature 550, 415-418 (2017), P. Schmiege et al., Nature 550, 366-370 (2017)) and has several LIR motifs. Includes.
  • CN Crystalline nephropathy
  • Oxalic acid nephropathy is a typical type of CN caused by calcium oxalate (CaOx) crystals, and develops this condition when mice are exposed to oxalic acid (S.R.Mulay et al., J Clin). Invest 123, 236-246 (2013), F.
  • Oxalic nephropathy has recently been attracting attention because it is closely related to the progression of chronic kidney disease, but it was previously regarded as a relatively rare disorder (S.S.Waikar et al., JAMA Intern). Med 179, 542-551 (2019)). Therefore, a oxalate nephropathy model was used to investigate the relationship between the ATG binding system, TFEB activation, and lysosomal injury repair.
  • Proximal tubular epithelial cells of all patients with crystalline nephropathy contained Gal-3 positive spots co-localized with LAMP-1-positive lysosomes, but no such spots were found in control samples.
  • Fig. 4B (ix) Nuclear TFEB staining was lower in proximal tubular epithelial cells in patients with crystalline nephropathy than in control proximal tubular epithelial cells (FIG. 4B (x)), which is TFEB expression and human crystalline kidney. It shows a clear correlation with the progression of the disease.
  • the nematode (SHU10xtm1978), which is an HLH-30 / TFEB mutant expressing ⁇ -synuclein, was compared with the SHU10 WT background, especially on the 3rd day (AD3) and 4th day (AD4) of the adults.
  • Very bright alf-syn :: RFP was shown (FIG. 13). This suggests that HLH-30 / TFEB is essential to prevent the development of alfa-sin :: RFP aggregation.
  • the present invention it is possible to efficiently identify a compound having an activity of repairing lysosomal damage. Since lysosomal damage is involved in various diseases such as crystalline nephropathy, the present invention can mainly contribute to pharmaceutical development.

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Abstract

特定のＡＴＧタンパク質に依存したＴＦＥＢの活性化がリソソーム損傷の修復に寄与しているという知見に基づき、当該ＡＴＧタンパク質を欠損した細胞におけるＴＦＥＢを標的として、リソソーム損傷を修復する活性を有する化合物をスクリーニングする方法を見出した。

Description

リソソーム損傷を修復する活性を有する化合物のスクリーニング方法
　本発明は、ＡＴＧタンパク質が欠損した細胞における転写因子ＥＢを標的とした、リソソーム損傷を修復する活性を有する化合物をスクリーニングする方法に関する。
　リソソームは、細胞内の主要な分解性オルガネラであり、エンドサイトーシス、貪食、およびオートファジーの経路間を接続する。リソソームの適切な機能と完全性は、多くの細胞プロセスにとって不可欠である。酸化ストレス、シリカまたは尿酸塩の結晶、リソソーム指向性薬物、および特定の脂質を含む多数の内因性因子および外因性因子は、リソソーム膜の透過性亢進および／またはリソソームの破裂を誘導する。幾つかの分子メカニズムが損傷したリソソームの修復に関与し、そうすることでリソソームの恒常性に寄与する（非特許文献１）。
　マクロオートファジー（以下、「オートファジー」と称する）は、進化的に保存された細胞質分解システムであり、オートファゴソームと呼ばれる二重膜構造が細胞質物質を隔離してリソソームと融合し、カーゴが分解される。特別なタイプのオートファジーであるリソファジーは、損傷したリソソームを隔離し、それによってリソソームの恒常性を維持するのに役立つことが最近示された（非特許文献２、３）。オートファジーの際に、幾つかのオートファジー関連遺伝子（いわゆるＡＴＧ遺伝子）が、オートファゴソームの形成と成熟を媒介する（非特許文献４）。飢餓やリソソーム損傷を含むオートファジー刺激は、ＡＴＧ３、ＡＴＧ５、ＡＴＧ７、ＡＴＧ１２、ＡＴＧ１６Ｌ１等のＡＴＧ遺伝子に依存するＬＣ３（ＡＴＧ８）の脂質化を増加させ、脂質化ＬＣ３はオートファゴソーム膜に局在する（非特許文献５）。オートファジーは、オートファジーとリソソーム生合成のマスターレギュレーターである転写因子ＥＢ（ＴＦＥＢ）を含む幾つかの転写因子によって転写的に調節される（非特許文献６、７）。ＴＦＥＢは、エンドリソソーム損傷に応答して活性化されることが知られているが（非特許文献８、９）、その制御機構については、ほとんど解明されていない。
C.　Papadopoulos　et　al.,　J　Mol　Biol,　432,　231-239　(2019) I.　Maejima　et　al.,　EMBO　J　32,　2336-2347　(2013) Y.　H.　Hung　et　al.,　Nat　Commun　4,　2111　(2013) N.　Mizushima　et　al.,　Annu　Rev　Cell　Dev　Biol　27,　107-132　(2011) Y.　Kabeya　et　al.,　Embo　Journal　19,　5720-5728　(2000) C.　Settembre　et　al.,　Science　332,　1429-1433　(2011) M.　Sardiello　et　al.,　Science　325,　473-477　(2009) J.　Jia　et　al.,　Mol　Cell　70,　120-135　e128　(2018) S.　Chauhan　et　al.,　Dev　Cell　39,　13-27　(2016)
　本発明は、上記従来技術の課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、リソファジー過程においてＴＦＥＢが活性化する機序を解明し、当該機序を基礎としてリソソーム損傷を修復する薬剤を開発することにある。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく、ＴＦＥＢが関係するリソファジーの機序の解析を行った結果、ＴＦＥＢがＬＣ３（ＡＴＧ８）の脂質化を媒介するＡＴＧ結合系（ＡＴＧ３、ＡＴＧ７、ＡＴＧ１６）の機能に依存して活性化されることを見出した。このＡＴＧ結合系を介したＴＦＥＢ活性化は、従来から知られているｍＴＯＲの抑制によるＴＦＥＢ活性化に非依存的であった。また、リソソーム損傷によりリソソーム上へのＬＣ３の動員が誘導され、脂質化ＬＣ３がリソソームのカルシウムチャネルＴＲＰＭＬ１と相互作用し、ＴＦＥＢの活性化に不可欠なチャネル容量を助長することも判明した。さらに、リソソーム損傷を伴うシュウ酸腎症のマウスモデルを利用して、ｉｎ　ｖｉｖｏにおけるＴＦＥＢ活性化の機序の検証を行ったところ、シュウ酸腎症におけるリソソーム損傷の修復過程において、ＡＴＧ５がＴＦＥＢの活性化を媒介していることが判明した。また、特定のＡＴＧによるＴＦＥＢの活性化が、パーキンソン病の原因となるα－シヌクレインの細胞への取り込みの際にも生じ、線虫のモデルでＴＦＥＢを欠損させると、このα－シヌクレイン凝集が増加することを見出した。
　このように、リソソーム損傷の修復において、ＴＦＥＢが、ＡＴＧタンパク質に依存して活性化しているとの知見が得られたことから、本発明者らは、当該ＡＴＧタンパク質を欠損した細胞におけるＴＦＥＢを標的として、リソソーム損傷を修復する薬剤をスクリーニングすることが可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
　本発明は、より詳しくは、以下を提供するものである。
　［１］リソソーム損傷を修復する活性を有する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）被検化合物を、ＡＴＧ３、ＡＴＧ５、ＡＴＧ７、ＡＴＧ８、ＡＴＧ１２、ＡＴＧ１６、およびそれらのホモログからなる群より選択される少なくとも１つのＡＴＧタンパク質を欠損した細胞に接触させる工程、
（ｂ）当該細胞における転写因子ＥＢの活性化を検出する工程、および
（ｃ）転写因子ＥＢを活性化する化合物を選択する工程、
を含む方法。
　［２］工程（ａ）において、上記細胞に対して、さらに、リソソームを損傷させる処理またはリソソームからカルシウムを放出させる処理を行う、［１］に記載の方法。
　［３］リソソーム損傷を修復する活性を有する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）被検化合物を、ＡＴＧ３、ＡＴＧ５、ＡＴＧ７、ＡＴＧ８、ＡＴＧ１２、ＡＴＧ１６、およびそれらのホモログからなる群より選択される少なくとも１つのＡＴＧタンパク質を欠損した細胞および当該ＡＴＧタンパク質を欠損していない細胞に接触させる工程、
（ｂ）両細胞における転写因子ＥＢの活性化を検出する工程、および
（ｃ）当該ＡＴＧタンパク質を欠損していない細胞では転写因子ＥＢを活性化するが、当該ＡＴＧタンパク質を欠損した細胞では転写因子ＥＢを活性化しない化合物を選択する工程、
を含む方法。
　［４］リソソーム損傷を修復する活性を有する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）被検化合物をＡＴＧ８またはそのホモログを欠損した細胞および当該ＡＴＧ８またはそのホモログを欠損していない細胞に接触させる工程、
（ｂ）両細胞における転写因子ＥＢの活性化を検出する工程、
（ｃ）当該ＡＴＧ８またはそのホモログを欠損していない細胞では転写因子ＥＢを活性化するが、当該ＡＴＧ８またはそのホモログを欠損した細胞では転写因子ＥＢを活性化しない化合物を選択する工程、
（ｄ）選択した化合物が脂質化したＡＴＧ８またはそのホモログとＴＲＰＭＬ１との相互作用を促進するか否かを評価する工程、および
（ｅ）当該相互作用を促進する化合物を選択する工程、
を含む方法。
　［５］ＡＴＧ３、ＡＴＧ５、ＡＴＧ７、ＡＴＧ８、ＡＴＧ１２、ＡＴＧ１６、およびそれらのホモログからなる群より選択される少なくとも１つのＡＴＧタンパク質に依存的に転写因子ＥＢを活性化する化合物を有効成分として含有する、リソソーム損傷を修復するための薬剤。
　［６］ＡＴＧ３、ＡＴＧ５、ＡＴＧ７、ＡＴＧ８、ＡＴＧ１２、ＡＴＧ１６、およびそれらのホモログからなる群より選択される少なくとも１つのＡＴＧタンパク質に依存的に転写因子ＥＢを活性化する化合物を有効成分として含有する、リソソーム損傷に起因する疾患の予防または治療のための薬剤。
　［７］リソソーム損傷に起因する疾患が、結晶性腎症、高尿酸血症、２型糖尿病、動脈硬化症、珪肺症、慢性肺疾患、神経変性疾患、および感染症からなる群より選択される、［６］に記載の薬剤。
　［８］ＡＴＧタンパク質がＡＴＧ８またはそのホモログであり、かつ、化合物が脂質化したＡＴＧ８またはそのホモログとＴＲＰＭＬ１との相互作用を促進する、［５］～［７］のいずれかに記載の薬剤。
　本発明によれば、特定のＡＴＧタンパク質が欠損した細胞におけるＴＦＥＢを標的として、リソソーム損傷を修復する活性を有する化合物をスクリーニングすることが可能となる。これにより、結晶性腎症などのリソソーム損傷に起因する疾患の予防や治療のための薬剤を効率的に開発することが可能となる。
リソソーム損傷がＡＴＧ結合系依存的にＴＦＥＢの核移行を誘導したことを示す図である。（ｉ）ＤＡＰＩ（青）で対比染色されたＨｅＬａ細胞の内因性ＴＦＥＢ（緑）の代表的な免疫蛍光画像。未処理の対照サンプルおよび１ｍＭのＬＬＯＭｅ処理（１時間）の３時間後のサンプルを示している。（ｉｉ）ＬＬＯＭｅ処理後のＴＦＥＢ核局在細胞の割合。バーは平均値±標準誤差を表している（ｎ＝３）。（ｉｉｉ）ＤＡＰＩ（青）で対比染色されたＧａｌ－３（緑）の代表的な免疫蛍光画像。ＴＦＥＢノックダウンは、ＬＬＯＭｅ処理（１ｍＭ，１時間）の１２時間後のＧａｌ－３斑点の除去が損なわれた。（ｉｖ）指定条件下での各ノックダウン細胞のＧａｌ－３ド斑点数（ＮＴ，非処理；ＬＬＯＭｅ０時間、１時間のＬＬＯＭｅ処理の直後；ＬＬＯＭｅ１２時間、１時間のＬＬＯＭｅ処理の１２時間後）。スケールバーは５０μｍ（ｉおよびｉｉｉ）。 図１Ａの続きの図である。（ｖ）ＴＦＥＢ：：ＥＧＦＰ（緑）は、ＬＬＯＭｅ処理（１時間）の３時間後のＷＴ細胞、ＦＩＰ２００－ＫＯ細胞、およびＡＴＧ９－ＫＯ細胞に強く局在し、ＡＴＧ７－ＫＯ細胞およびＡＴＧ１６Ｌ１－ＫＯ細胞で損なわれた。（ｖｉ）ＬＬＯＭｅ処理の３時間後の細胞または対照細胞における核／細胞質ＴＦＥＢ：：ＥＧＦＰ比の定量。（ｖｉｉ）指定条件下でのＷＴ細胞またはＡＴＧ８ｓ－ＫＯ細胞におけるＴＦＥＢの代表的なイムノブロット（ＥＢＳＳ，４時間の飢餓；ＬＬＯＭｅ，１時間のＬＬＯＭｅ処理の３時間後）。スケールバーは５０μｍ（ｖ）。 リソソームからのカルシウム流出がＡＴＧ結合系依存的にＴＦＥＢの核移行を引き起こすことを示す図である。（ｉ）１時間のＤＭＳＯ（対照）またはＭＬ－ＳＡ１処理後のＷＴ細胞およびＡＴＧ７　ＫＯ細胞のＴＦＥＢ：：ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ画像。（ｉｉ）核対細胞質のＴＦＥＢ：：ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ比の定量。バーは平均値±標準誤差を表している（ｎ＝３）。＊Ｐ＜０．０５，分散分析。（ｉｉｉ）指定条件下（ＤＭＳＯまたはＭＬ－ＳＡ１で１時間処理）のＷＴ細胞またはＡＴＧ８ｓ－ＫＯ細胞におけるＴＦＥＢ発現およびポンソーＳ染色膜（Ｐｏ－Ｓ）を示す代表的なＷＢ画像。ＴＦＥＢ活性化（バンドのダウンシフト）は、ＭＬ－ＳＡ１処理後のＡＴＧ８ｓ　ＫＯで損なわれた。（ｉｖ）ＤＭＳＯ、ＭＬ－ＳＡ１、またはＴｏｒｉｎ１で処理したＷＴ細胞およびＡＴＧ７　ＫＯ細胞におけるＴＦＥＢ、ｐＳ６Ｋ、Ｓ６Ｋ、およびアクチンを示す代表的なＷＢ画像。ＭＬ－ＳＡ１とＴｏｒｉｎ１処理により、ＡＴＧ７－ＫＯ細胞のＴＦＥＢ活性化の欠陥が救済された。スケールバーは５０μｍ（ｉ）。 図２Ａの続きの図である。（ｖ）Ｆｕｒａ－２カルシウムイメージングのスナップショット。幾つかのＷＴ細胞は高い細胞質カルシウムの増加を示した（矢印）一方、ＡＴＧ７　ＫＯは急激な増加を示さなかった。（ｖｉ）個々のＦｕｒａ－２負荷ＷＴおよびＡＴＧ７－ＫＯ　ＨｅＬａ細胞の細胞質基質のＣａ２＋レベル。合計で、１０４個のＷＴ細胞と９６個のＡＴＧ７　ＫＯ細胞が定量化された。スケールバーは５００μｍ（ｖ）。 脂質化ＬＣ３とＴＲＰＭＬ１チャネルとの間の相互作用が、ＴＦＥＢ活性化に不可欠であることを示す図である。（ｉ）対照またはＬＬＯＭｅ処理（１時間）した細胞におけるＬＣ３Ｂ（緑）、ＬＡＭＰ１（マゼンタ）、およびＧａｌ－３（シアン）の局在化の免疫蛍光画像。（ｉｉ）対照またはＬＬＯＭｅ処理（１時間）したＷＴ細胞、ＦＩＰ２００細胞、およびＡＴＧ７－ＫＯ細胞におけるＬＣ３Ｂ斑点の定量。バー：平均値±標準誤差（ｎ＝３）。（ｉｉｉ）ＬＡＭＰ１とＬＣ３との間の共局在率。ＬＣ３を含むＬＡＭＰ１斑点の割合を示している。バー：平均値±標準誤差（ｎ＝３）。＊＊Ｐ＜０．０１，分散分析。（ｉｖ）共免疫沈降により、すべての３ｘＦＬＡＧ：：ＡＴＧ８パラログがＴＲＰＭＬ１：：ＨＡと相互作用することが明らかになった。ＨｅＬａ細胞にＴＲＰＭＬ１：：ＨＡおよび３ｘＦＬＡＧベクターまたは３ｘＦＬＡＧタグ付きＡＴＧ８パラログをトランスフェクトし、ＦＬＡＧ抗体で免疫沈降させた。スケールバーは５０μｍ（ｉ）。 図３Ａの続きの図である。（ｖ）共免疫沈降により、ＷＴ　ＬＣ３ＢはＴＲＰＭＬ１：：ＨＡと相互作用し、脂質化欠損ＬＣ３Ｂ　Ｇ１２０Ａは相互作用せずＬＣ３－ＩＩのみがＴＲＰＭＬ１：：ＨＡと相互作用し、ｐ６２はＬＣ３－ＩとＬＣ３－ＩＩの両方と相互作用することが明らかになった。（ｖｉ）免疫共沈降により、ＴＲＰＭＬ１のＬＩＲモチーフ（ＡＸＸＡ）のアラニン置換が、３ｘＦＬＡＧ：：ＬＣ３ＢとＴＲＰＭＬ１：：ＨＡとの間の相互作用を部分的に破壊したことが明らかになった。（ｖｉｉ）ＷＴ　ＴＲＰＭＬ１過剰発現はＬＣ３斑点およびＴＦＥＢ核局在化を誘導したが、ＬＩＲモチーフ（ＡＸＸＡ）に置換を含むＴＲＰＭＬ１による程度は、それよりも低かった。（ｖｉｉｉおよびｉｘ）ＨＡベクター、ＷＴ　ＴＲＰＭＬ１：：ＨＡ過剰発現細胞、またはＡＸＸＡ　ＴＲＰＭＬ１：：ＨＡ過剰発現細胞におけるＬＣ３Ｂ斑点（ｖｉｉｉ）および核局在化ＴＦＥＢ：：ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ（ｉｘ）を含む細胞の定量化。＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１，分散分析。スケールバーは５０μｍ（ｖｉｉ）。 リソソーム損傷誘導ＴＦＥＢ活性化がＣａＯｘ腎症を緩和することを示す図である。（ｉ）シュウ酸塩注射（７５ｍｇ／ｋｇ）を行い、２４時間後に収集したＷＴおよび近位尿細管上皮細胞（ＰＴＥＣ）特異的Ａｔｇ５欠損マウスの腎臓切片。サンプルは、ＴＦＥＢ（赤）および近位尿細管のマーカーであるＬＲＰ２／ＭＥＧＡＬＩＮ（緑）で免疫染色され、ＤＡＰＩ（青）で対比染色した。（ｉｉ）対照および近位尿細管上皮細胞特異的Ａｔｇ５欠損マウスにおけるＴＦＥＢ核局在化の定量化（各グループでｎ＝４～５）。（ｉｉｉ～ｖｉ）シュウ酸塩注射（７５ｍｇ／ｋｇ）を行った対照および近位尿細管上皮細胞特異的Ｔｆｅｂ欠損マウスを、４８時間後に検証した［対照群ではｎ＝５～６；シュウ酸塩注射群ではｎ＝１５～２１（ｉｉｉ～ｖ）；各群ではｎ＝５～６（ｖｉ）］。過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）染色（ｉｉｉ）、ＰＡＳ損傷スコア（ｉｖ）、血中尿素窒素（ＢＵＮ）および血漿クレアチニンのレベル（ｖ）、腎臓損傷マーカー遺伝子のｍＲＮＡ発現レベル（ｖｉ）を示している。スケールバー：２０μｍ（ｉ）、５０μｍ（ｉｉｉ）。バー：平均値±標準誤差。＊，Ｐ＜０．０５。 図４Ａの続きの図である。（ｖｉｉ～ｖｉｉｉ）ＤＡＰＩによりガレクチン－３およびＬＲＰ２／ＭＥＧＡＬＩＮについて免疫染色された腎臓切片（ｖｉｉ）、および対照と近位尿細管上皮細胞特異的Ｔｆｅｂ欠損マウスにおけるガレクチン－３陽性斑点の定量化（グループあたりｎ＝６）。（ｉｘおよびｘ）対照および結晶性腎症患者から得られた腎臓標本の代表的な画像（それぞれｎ＝３）。腎臓切片は、ガレクチン－３（ｉｘ，赤）、ＬＡＭＰ１（ｉｘ，緑）、ＴＦＥＢ（ｘ，茶）で免疫染色され、ＤＡＰＩ（ｉｘ）またはヘマトキシリン（ｘ）で対比染色された。矢印は、ＬＡＭＰ－１陽性リソソームと共局在するガレクチン－３陽性斑点を示している（ｉｘ）。スケールバー：２０μｍ（ｖｉｉおよびｉｘ）、５０μｍ（ｘ）。バー：平均値±標準誤差。＊，Ｐ＜０．０５。 飢餓ではなく、リソソーム損傷が、ＡＴＧ結合系依存的にＴＦＥＢの核移行を誘導することを示す図である。（ｉ）ＡＴＧ１６Ｌ１およびＴＦＥＢ　ｓｉＲＮＡの効率的なノックダウンを確認する代表的なイムノブロット。アクチンは、ローディングコントロールとして使用した。（ｉｉ）ＷＴ細胞および幾つかのＫＯ　ＨｅＬａ細胞におけるＴＦＥＢ、リン酸化Ｓ６Ｋ、総Ｓ６Ｋ、リン酸化ＧＳＫαβ、総ＧＳＫβおよびアクチンを示す代表的なイムノブロット。ＴＦＥＢ活性化は、ＬＬＯＭｅ処理下のＡＴＧ７－ＫＯ細胞およびＡＴＧ１６Ｌ１－ＫＯ細胞で部分的に損なわれた。 図５Ａの続きの図である。（ｉｉｉ）ＷＴ細胞および幾つかのＫＯ　ＨｅＬａ細胞におけるＴＦＥＢ、リン酸化Ｓ６Ｋ、総Ｓ６Ｋ、リン酸化ＧＳＫαβ、総ＧＳＫβおよびアクチンを示す代表的なイムノブロット。ＴＦＥＢ活性化（ダウンシフト）がＥＢＳＳ飢餓下のすべてのＫＯ細胞で観察された。（ｉｖ）対照条件下、ＥＢＳＳ飢餓（４時間）下、またはＬＬＯＭｅ処理（１時間のＬＬＯＭｅ処理の３時間後）下でのＷＴ細胞およびＡＴＧ３－ＫＯ　ＨｅＬａ細胞におけるＴＦＥＢ発現を示す代表的なイムノブロット。 リソソーム損傷時のＴＦＥＢ核局在化のためのＡｔｇ８パラログの要求性を示す図である。（ｉ）ＴＦＥＢ：：ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ（緑）を安定して発現するＭＥＦ細胞株をＬＬＯＭｅ有りで、または無しで処理した（１時間のＬＬＯＭｅ処理の３時間後）。（ｉｉ）各条件下でのＴＦＥＢ：：ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎの核／細胞質の比率の定量化。バーは平均値±標準誤差を表している。（ｎ＝３）＊Ｐ＜０．０５，分散分析。スケールバーは５０μｍ。 Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ被覆ビーズのトランスフェクションが、ＡＴＧ結合系依存的にＴＦＥＢ核局在化を誘導することを示す図である。（ｉ）ＴＦＥＢ：：ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎおよびＤＡＰＩで対比染色されたＧａｌ－３を示す代表的な免疫蛍光画像。Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ被覆ビーズのトランスフェクションはエンドソームまたはリソソームを損傷したが、ＰＥＩ被覆ビーズでのトランスフェクションはエンドソームまたはリソソームを損傷しなかった。Ｇａｌ－３によって視覚化された損傷を有する細胞は、ＴＦＥＢの核移行を示したことに注意されたい（白抜き矢印）。（ｉｉ）Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ被覆ビーズまたはＰＥＩ被覆ビーズでトランスフェクトしたＷＴ細胞およびＡＴＧ７－ＫＯ細胞における核ＴＦＥＢ：：ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎの比率。＊＊Ｐ＜０．０１，分散分析。スケールバーは５０μｍ。 リソソームからのカルシウム流出が、ＡＴＧ結合系依存的にＴＦＥＢの核移行を引き起こすことを示す図である。（ｉ）ＤＭＳＯ（対照）またはＭＬ－ＳＡ１で処理したＷＴ細胞およびＡＴＧ３－ＫＯ　ＨｅＬａ細胞でのＴＦＥＢ発現を示す代表的なイムノブロット。ＡＴＧ３－ＫＯ細胞では、ＭＬ－ＳＡ１処理後にＴＦＥＢの活性化（ダウンシフト）に欠陥があった。（ｉｉ）ＰＰＰ３ＣＢのノックダウンがＬＬＯＭｅ処理後（１時間のＬＬＯＭｅ処理の３時間後）、ＴＦＥＢ：：ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎの核移行を消失させなかったことを示す代表的な画像。（ｉｉｉ）ＴＦＥＢおよびＰＰＰ３ＣＢの代表的なブロット。ＰＰＰ３ＣＢのノックダウンをしても、ＴＦＥＢの活性化に干渉しなかった。 ＬＣ３が、リソソーム損傷および／またはリソソームからのカルシウム流出によってリソソームに動員されることを示す図である。（ｉ）１時間のＬＬＯＭｅ処理後のＬＣ３脂質化を示す代表的なブロット。脂質化ＬＣ３（ＬＣ３－ＩＩ）のレベルは、非処理（ＮＴ）対照と比較して、ＬＬＯＭｅ処理の直後に上昇した。この効果は、最後の２４時間持続した。（ｉｉ）幾つかの細胞株におけるＬＣ３斑点を示す代表的な蛍光画像。ＬＣ３斑点の数は、ＷＴ細胞およびオートファジー欠損細胞でのＬＬＯＭｅ処理後、ＡＴＧ１６Ｌ１－ＫＯを除いて上昇した。スケールバーは５０μｍ。 図９Ａの続きの図である。（ｉｉｉ）ＤＭＳＯまたはＬＬＯＭｅ処理（１時間）細胞におけるＬＣ３Ｂ（緑）、ＬＡＭＰ１（マゼンタ）、およびＧａｌ－３（シアン）の局在化の代表的な免疫蛍光画像。ＭＬ－ＳＡ１は、ＷＴ細胞およびＦＩＰ２００　ＫＯ細胞において、リソソーム上のＬＣ３斑点の数を増加させたが、Ｇａｌ－３斑点の数は増加させなかった。このことは、カルシウム流出がＬＣ３のリソソームへの動員を誘導するのに十分であることを示唆している。（ｉｖ）ＤＭＳＯまたはＭＬ－ＳＡ１処理（１時間）した、ＷＴ細胞、ＦＩＰ２００細胞、およびＡＴＧ７　ＫＯ細胞におけるＬＣ３Ｂ斑点の定量。バーは平均値±標準誤差を表している（ｎ＝３）。＊Ｐ＜０．０５，分散分析。（ｖ）ＬＡＭＰ１とＬＣ３との間の共局在率。ＬＣ３を伴う全ＬＡＭＰ１斑点の割合を示している。バー：平均±標準誤差（ｎ＝３）＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１，分散分析。スケールバーは５０μｍ。 ＣａＯｘ結晶がマウス腎臓のリソソーム損傷を引き起こすことを示す図である。（ｉ）指定条件下でＧＦＰ－ガレクチン３を安定して発現する近位尿細管上皮細胞の代表的な画像（各グループでｎ＝３）。（ｉｉ）シュウ酸塩投与後のＢＵＮおよび血漿クレアチニンのレベル（各グループでｎ＝３～４）。（ｉｉｉ～ｉｖ）シュウ酸塩注射（７５ｍｇ／ｋｇ）を行ったＷＴマウスを、２４時間後に検証した（各グループでｎ＝３～４）。（ｉｉｉ）管腔内だけでなく、尿細管上皮細胞（矢印）内にＣａＯｘ結晶を示すＰｉｚｚｏｌａｔｏ染色した腎臓切片。（ｉｖ）ＣａＯｘ腎症において、液胞形成並びに近位尿細管上皮細胞における刷子縁の損失および尿細管腔内の顆粒円柱を示すＰＡＳ染色。スケールバーは２０μｍ（ｉ）、５０μｍ（ｉｉｉおよびｉｖ）。バー：平均値±標準誤差。統計的に有意な差（＊Ｐ＜０．０５）を示している。 図１０Ａの続きの図である。（ｖ～ｖｉｉｉ）シュウ酸塩注射（７５ｍｇ／ｋｇ）を行ったＷＴマウスを、２４時間後に検証した（各グループでｎ＝３～４）。（ｖ，ｖｉ，およびｖｉｉｉ）腎臓切片をＬＡＭＰ１（ｖ）、ガレクチン－３（ｖｉ，赤）、ＬＡＭＰ１（ｖｉ，緑）、ＴＦＥＢ（ｖｉｉｉ）で免疫染色し、ヘマトキシリン（ｖ）またはＤＡＰＩ（ｖｉ）で対比染色した。（ｖｉｉ）近位尿細管上皮細胞の電子顕微鏡写真。矢印は、リソソームの表面に沿って伸びている隔離膜を示している（ｎ＝３）。Ｍｔ、ミトコンドリア、アスタリスク：リソソーム。スケールバーは２０μｍ（ｖｉ）、５０μｍ（ｖおよびｖｉｉｉ）、５００ｎｍ（ｖｉｉ）。 ＴＦＥＢ　ＫＯマウスにおけるアポトーシスの増加を示す図である。（ｉ）ＷＴマウスおよび近位尿細管上皮細胞特異的Ｔｆｅｂ欠損マウスにおけるＴＵＮＥＬ染色を示す代表的な画像。サンプルにシュウ酸塩注射（７５ｍｇ／ｋｇ）を行い、４８時間後に検証した（各グループでｎ＝９～１５）。（ｉｉ）指定の遺伝子型の腎臓切片におけるＴＵＮＥＬ陽性細胞の数。スケールバーは５０μｍ。バー：平均値±標準誤差。統計的に有意な差（＊Ｐ＜０．０５）を示している。 α－シヌクレイン線維によってリソソーム損傷を誘導したＡＴＧ７　ＫＯ線虫細胞におけるＴＦＥＢおよびガレクチン３の局在を検出した結果を示す写真である。α－シヌクレイン線維に対する対照としてα-シヌクレインモノマーを、ＡＴＧ７　ＫＯ線虫細胞に対する対象としてＷＴ線虫細胞をそれぞれ用いた。 α－シヌクレインを発現するＨＬＨ－３０／ＴＦＥＢ変異体（ＳＨＵ１０ｘｔｍ１９７８）におけるα－シヌクレインの局在を線虫の各成虫段階で検出した結果を示す写真である。対照として、α－シヌクレインを発現するＷＴ線虫細胞（ＳＨＵ１０ｘｃ）を用いた。
　本発明は、リソソーム損傷を修復する活性を有する化合物をスクリーニングする方法を提供する。
　本発明のスクリーニング方法の第一の態様は、被検化合物を、ＡＴＧ３、ＡＴＧ５、ＡＴＧ７、ＡＴＧ８、ＡＴＧ１２、ＡＴＧ１６、およびそれらのホモログからなる群より選択される少なくとも１つのＡＴＧタンパク質を欠損した細胞に接触させる工程（工程（ａ））、当該細胞におけるＴＦＥＢの活性化を検出する工程（工程（ｂ））、および、ＴＦＥＢを活性化する化合物を選択する工程（工程（ｃ））、を含む方法である。
　第一の態様においては、特定のＡＴＧタンパク質に非依存的にリソソーム損傷を修復する活性を有する化合物をスクリーニングすることができる。また、ＡＴＧ結合系を介したＴＦＥＢの活性化とｍＴＯＲの抑制によるＴＦＥＢの活性化が独立していることが本発明により見出されたことから、この態様においては、ｍＴＯＲの抑制を介してリソソーム損傷を修復する活性を有する化合物をもスクリーニングすることができる。
　本発明において「リソソーム損傷の修復」とは、オートファゴソームが損傷したリソソームを包みこんで隔離し、この隔離されたオートファゴソームが、損傷を受けていないリソソームと融合して新たなリソソームを形成することで、損傷したリソソームを除去する過程を意味する。
　本発明に用いる「被検化合物」としては特に制限はなく、リソソーム損傷を修復する活性を評価したい所望の化合物を用いることができる。被検化合物としては、例えば、遺伝子ライブラリーやその発現産物、合成低分子化合物ライブラリー、ペプチドライブラリー、ポリヌクレオチドライブラリー、遺伝子の機能を抑制する分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系）のライブラリー、抗体、細菌放出物質、細胞（微生物、植物細胞、動物細胞）の抽出液および培養上清、精製または部分精製ポリペプチド、海洋生物、植物、または動物から採取した抽出物などが挙げられるが、これらに制限されない。
　被検化合物を接触させる「細胞」は、ＴＦＥＢの活性化に必須な少なくとも一つのＡＴＧタンパク質を欠損している真核細胞である。「ＡＴＧタンパク質」は、当初、出芽酵母において見出され、ＡＴＧ（Ａｕｔｏｐｈａｇｙ－ｒｅｌａｔｅｄ）という名称が付与されたが、他の生物におけるホモログにおいては、必ずしも、「ＡＴＧ」という名称が付されていない。しかしながら、他の生物において同様の機能を有するホモログである限り、その名称の如何を問わず、本発明における「ＡＴＧタンパク質」に含まれる。例えば、出芽酵母のＡＴＧ８の哺乳動物ホモログには、ＬＣ３（ＬＣ３　Ａ／Ｂ／Ｃ）およびＧＡＢＡＲＡＰ（ＧＡＢＡＲＡＰ、ＧＡＢＡＲＡＰＬ１～３）が含まれる。本発明において、細胞において欠損させる「ＡＴＧタンパク質」としては、ＡＴＧ３、ＡＴＧ５、ＡＴＧ７、ＡＴＧ８、ＡＴＧ１２、およびＡＴＧ１６（それらのホモログを含む）が好ましい。本発明における「ＡＴＧタンパク質」の例として、ヒト由来のＡＴＧ３、ＡＴＧ５、ＡＴＧ７、ＬＣ３Ａ、ＬＣ３Ｂ、ＬＣ３Ｃ、ＧＡＢＡＲＡＰ、ＧＡＢＡＲＡＰＬ１、ＧＡＢＡＲＡＰＬ２、ＡＴＧ１６Ｌ１の各アミノ酸配列の典型的なアミノ酸配列を、それぞれ配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０に、当該タンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列を、それぞれ配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９に示す。本発明の「ＡＴＧタンパク質」は、他の生物に由来するものであってもよい。他の生物に由来するホモログは、例えば、上記ヒト由来のアミノ酸配列と７０％以上（例えば、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上）の相同性を有するアミノ酸配列を有する。配列の相同性は、例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ　ＢＬＡＳＴ（ｂｌａｓｔｐ）を利用して評価することができる（例えば、デフォルトのパラメーター設定）。
　ＡＴＧタンパク質を欠損させる細胞としては、目的に応じて種々の真核細胞を用いることができるが、好ましくは脊椎動物細胞である。細胞の由来する動物としては、例えば、哺乳動物、魚類、鳥類、爬虫類、両生類が挙げられる。哺乳動物は、ヒトおよび非ヒト哺乳動物を包含する概念である。非ヒト哺乳動物の例としては、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、リスなどの齧歯類、ウシ、イノシシ、ブタ、ヒツジ、ヤギなどの偶蹄類、ウマなどの奇蹄類、ウサギなどのウサギ目、イヌ、ネコ、フェレットなどの食肉類、サル、ゴリラ、チンパンジーなどの霊長類などが挙げられる。動物細胞には、例えば、動物の培養細胞（例えば、ＨｅＬａ細胞、マウス胎児線維芽細胞）、動物から摘出された器官・組織を構成する細胞、動物の個体を構成している細胞（例えば、近位尿細管上皮細胞）などが含まれる。
　本発明において「ＡＴＧタンパク質の欠損」とは、細胞においてＡＴＧタンパク質が機能しない状態となっていることを意味する。「ＡＴＧタンパク質の欠損」は、例えば、ＡＴＧ遺伝子のノックアウトや発現抑制などの公知の方法により行うことができる。
　ＡＴＧ遺伝子のノックアウト細胞は、例えば、ＡＴＧ遺伝子を標的化するゲノム編集系（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮなど）による当該遺伝子への変異の導入により作製することができる。ノックアウト用ＤＮＡの両端にホモロジーアームを有するドナーＤＮＡをゲノム編集系と組み合わせて利用すれば、効率的に目的の遺伝子がノックアウトされた細胞を得ることができる。
　また、ＡＴＧ遺伝子のコンディショナルノックアウト動物の作製は、例えば、以下の方法で行うことができる。まず、ＡＴＧ遺伝子またはその一部を組換え酵素認識配列（例えば、ｌｏｘＰ配列）で挟んだＤＮＡを有するドナーベクターを利用した相同組換えにより、ゲノムに組換えＤＮＡを持つ細胞（ＥＳ細胞や受精卵）を作成する。次いで、それら細胞を動物個体（例えば、ｆｌｏｘ動物）へと発生させ、得られた動物を、組換え酵素（例えば、Ｃｒｅ）の発現カセットが組み込まれた動物（例えば、Ｃｒｅ動物）と交配する。交配された動物においては、発現した組換え酵素がその認識配列に結合して遺伝子組換えが生じ、ＡＴＧ遺伝子がノックアウトされる。
　また、ＡＴＧ遺伝子が発現抑制された細胞は、例えば、ＡＴＧ遺伝子の転写産物を標的化するｓｉＲＮＡやリボザイムなどの発現抑制分子を細胞内に導入すること、または、当該発現抑制分子を細胞内で発現させることにより、作製することができる。
　被検化合物と細胞との「接触」は、当該細胞を含む実験系への被検化合物の添加などにより行うことができるが、被検化合物の種類によっては（例えば、遺伝子やタンパク質の場合）、被検化合物の細胞内への導入操作を含みうる。動物の個体を構成している細胞を標的とする場合には、当該動物への投与（経口投与、注射などによる非経口投与）を通じて、被検化合物を標的となる細胞に接触させることができる。
　本発明におけるスクリーニングの標的である「ＴＦＥＢ」は、オートファジーとリソソーム生合成のマスターレギュレーターであり、エンドリソソーム損傷に応答して活性化されることが知られている（非特許文献６、８、９）。「ＴＦＥＢ」の例として、ヒト由来のＴＦＥＢタンパク質の典型的なアミノ酸配列を配列番号：２２に、当該タンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号：２１に示すが、本発明における「ＴＦＥＢ」は、他の生物に由来するものであってもよい。他の生物に由来するホモログは、例えば、上記ヒト由来のアミノ酸配列と７０％以上（例えば、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上）の相同性を有するアミノ酸配列を有する。配列の相同性は、例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ　ＢＬＡＳＴ（ｂｌａｓｔｐ）を利用して評価することができる（例えば、デフォルトのパラメーター設定）。
　「ＴＦＥＢ」は、脱リン酸化して活性型となり、核内へ移行して転写因子として機能する。従って、本発明における「ＴＦＥＢの活性化」は、例えば、ＴＦＥＢの核移行、ＴＦＥＢの脱リン酸化、ＴＦＥＢによる遺伝子発現制御領域への結合、ＴＦＥＢにより誘導される遺伝子の発現などを指標として検出することができる。
　ＴＦＥＢの核移行は、生細胞で追跡を行う場合、例えば、ＴＦＥＢタンパク質とレポータータンパク質との融合タンパク質を発現させた細胞における当該融合タンパク質の細胞内の局在を蛍光顕微鏡により観察することによって検出することができる。この目的に使用されるレポータータンパク質としては、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＤｓＲｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＢａｎａｎａ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＰｌｕｍなどが挙げられるが、これらに制限されない。また、ＴＦＥＢの核移行は、ＴＦＥＢを特異的に認識する抗体を利用した免疫細胞染色によって検出することもできる。免疫細胞染色においては、直接法を採用する場合、ＴＦＥＢを特異的に認識する標識抗体が用いられ、間接法を採用する場合、ＴＦＥＢを特異的に認識する抗体を認識する標識分子（プロテインＡや二次抗体）が用いられる。この目的に使用される標識としては、例えば、ＦＩＴＣ、Ａｌｅｘａ　ＦｌｏｕｒＴＭ色素、Ｃｙ色素などの蛍光色素や、ＰＥ、ＡＰＣなどの蛍光タンパク質が挙げられるが、これらに制限されない。
　ＴＦＥＢの脱リン酸化は、例えば、抗ＴＦＥＢ抗体を利用したウェスタンブロッティングを行い、検出されたＴＦＥＢのバンドの分子量（例えば、脱リン酸化されていないＴＦＥＢとの比較における分子量のダウンシフト）を指標として検出することができる。また、リン酸化されたＴＦＥＢを特異的に認識する抗体を利用したウェスタンブロッティングを行い、リン酸化されたＴＦＥＢのバンドの減少（例えば、脱リン酸化されていないＴＦＥＢと比較したバンドの減少）を指標として検出することもできる。
　ＴＦＥＢによる遺伝子発現制御領域への結合は、例えば、当該発現制御領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したベクターを導入した細胞におけるレポーター活性を指標として検出することができる。ここで「機能的に結合」とは、当該発現制御領域にＴＦＥＢが結合することにより、レポーター遺伝子の発現が誘導されるように、当該発現制御領域とレポーター遺伝子とが結合していることをいう。遺伝子発現制御領域としては、ＴＦＥＢが結合するＣＬＥＡＲ（Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ　Ｌｙｓｏｓｏｍａｌ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）エレメントを含む遺伝子発現制御領域を好適に用いることができる（Sardiello　M　et　al.,　Science,　325,　473-477　(2009)、Settembre　C　et　al.,　Science.　332,　1429-1433　(2011)、Palmieri　M　et　al.,　Hum　Mol　Genet,　20,　3852-66　(2011)）。この目的に使用されるレポーター遺伝子としては、例えば、クロラムフェニコールアセチル転移酵素（ＣＡＴ）遺伝子、β－ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子、β－ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、β－グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子などが挙げられるが、これらに制限されない。
　レポーター遺伝子の発現は、使用するレポーター遺伝子の種類に応じて、当業者に公知の方法により検出することができる。例えば、レポーター遺伝子が、クロラムフェニコールアセチル転移酵素（ＣＡＴ）遺伝子である場合には、該遺伝子産物によるクロラムフェニコールのアセチル化を指標に、β－ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による色素化合物の発色を指標に、ルシフェラーゼ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による化学発光を指標に、β－グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用によるグルクロンの発光や５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリル－β－グルクロニド（Ｘ－Ｇｌｕｃ）の発色を指標に、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子である場合には、とＧＦＰタンパク質の蛍光を指標に、それぞれレポーター遺伝子の発現を検出することができる。
　また、ＴＦＥＢにより誘導される遺伝子の発現は、転写レベルで検出する場合、例えば、ＲＴ－ＰＣＲ法、ノーザンブロッティング法などにより、翻訳レベルで検出する場合、例えば、ウェスタンブロッティング法、放射免疫測定法、化学発光免疫測定法、化学発光酵素免疫測定法、酵素免疫測定法などにより、検出することができる。ＴＦＥＢにより発現が誘導される遺伝子は、公知である（Sardiello　M　et　al.,　Science,　325,　473-477　(2009)、Settembre　C　et　al.,　Science.　332,　1429-1433　(2011)、Palmieri　M　et　al.,　Hum　Mol　Genet,　20,　3852-66　(2011)）。
　以上の検出の結果、被検化合物の中から、ＴＦＥＢを活性化させる化合物を選択する。これにより選択された化合物は、特定のＡＴＧタンパク質（細胞において欠損させたＡＴＧタンパク質）に非依存的にリソソーム損傷を修復する活性を有する。
　被検化合物によるＴＦＥＢの活性化は、対照（被検化合物を用いない場合）における検出結果との比較において評価することができる。この場合、対照と比較して、被検化合物を用いた場合においてＴＦＥＢの活性化の程度が高い化合物を選択する。ＴＦＥＢの活性化の程度を定量的に検出できる場合、被検化合物を用いた場合のＴＦＥＢの活性化の程度は、対照と比較して、通常、１０％以上、好ましくは２０％以上、より好ましくは３０％以上、さらに好ましくは５０％以上（例えば、７０％以上、１００％以上、２００％以上、３００％以上、５００％以上）高い。
　本発明のスクリーニング方法の第二の態様は、第一の態様の工程（ａ）において、ＡＴＧタンパク質を欠損した細胞に対して、さらに、リソソームを損傷させる処理またはリソソームからカルシウムを放出させる処理を行う。
　第二の態様においては、第一の態様で選択される化合物に加えて、特定のＡＴＧタンパク質には非依存的であるが、リソソームの損傷またはリソソームからのカルシウムの放出には依存的に、リソソーム損傷を修復する活性を有する化合物をも同定することができる。
　細胞に対する「リソソームを損傷させる処理」としては、例えば、リソソームを損傷させる薬剤の細胞への接触が挙げられる。当該薬剤としては、例えば、Ｌ－ロイシル－Ｌ－ロイシンメチルエステル（ＬＬＯＭｅ）、グリシル－Ｌ－フェニルアラニン２－ナフチルアミド（ＧＰＮ）が挙げられるが、これらに制限されない。また、細胞に対する「リソソームからカルシウムを放出させる処理」としては、例えば、リソソームからカルシウムの放出を誘導する薬剤の細胞への接触が挙げられる。当該薬剤としては、例えば、リソソームのカルシウムチャネルであるＴＲＰＭＬ１のアゴニスト（例えば、ＭＬ－ＳＡ１）が挙げられるが、これらに制限されない。
　細胞への上記処理および被検化合物の接触は、いずれか一方が先であっても、同時であってもよい。リソソームを損傷させる薬剤またはリソソームからカルシウムの放出を誘導する薬剤と細胞との「接触」は、例えば、当該細胞を含む溶液への薬剤により行うことができる。動物の個体を構成している細胞を標的とする場合には、当該動物への投与（経口投与、注射などによる非経口投与）を通じて、当該薬剤を標的となる細胞に接触させることができる。
　本発明のスクリーニング方法の第三の態様は、被検化合物を、ＡＴＧ３、ＡＴＧ５、ＡＴＧ７、ＡＴＧ８、ＡＴＧ１２、ＡＴＧ１６、およびそれらのホモログからなる群より選択される少なくとも１つのＡＴＧタンパク質を欠損した細胞および当該ＡＴＧタンパク質を欠損していない細胞に接触させる工程（工程（ａ））、両細胞におけるＴＦＥＢの活性化を検出する工程（工程（ｂ））、および、当該ＡＴＧタンパク質を欠損していない細胞ではＴＦＥＢを活性化するが、当該ＡＴＧタンパク質を欠損した細胞ではＴＦＥＢを活性化しない化合物を選択する工程（工程（ｃ））、を含む方法である。
　第三の態様は、スクリーニングにより得られる化合物が特定のＡＴＧタンパク質に依存的にリソソーム損傷を修復する活性を有する点で、第一および第二の態様と異なる。
　第三の態様の一つの好ましい例は、被検化合物をＡＴＧ８またはそのホモログを欠損した細胞および当該ＡＴＧ８またはそのホモログを欠損していない細胞に接触させる工程（工程（ａ））、両細胞における転写因子ＥＢの活性化を検出する工程（工程（ｂ））、当該ＡＴＧ８またはそのホモログを欠損していない細胞では転写因子ＥＢを活性化するが、当該ＡＴＧ８またはそのホモログを欠損した細胞では転写因子ＥＢを活性化しない化合物を選択する工程（工程（ｃ））、選択した化合物が脂質化したＡＴＧ８またはそのホモログとＴＲＰＭＬ１との相互作用を促進するか否かを評価する工程（工程（ｄ））、および当該相互作用を促進する化合物を選択する工程（工程（ｅ））、を含む方法である。
　この態様においては、リソソーム損傷の修復過程において、脂質化したＡＴＧ８またはそのホモログとＴＲＰＭＬ１との相互作用を促進する化合物をスクリーニングすることができる。脂質化したＡＴＧ８またはそのホモログとＴＲＰＭＬ１との相互作用は、例えば、共免疫沈降や近接ライゲーションアッセイ（PLA：Ploximity　Ligation　Assay)により検出することができる。被検化合物が当該相互作用を促進するか否かは、対照（被検化合物を添加しない場合）における検出結果との比較において評価することができる。
　なお、「被検化合物」、「ＡＴＧタンパク質」、「ＡＴＧタンパク質を欠損した細胞」、「被検化合物と細胞との接触」、「ＴＦＥＢの活性化の検出」については、第一および第二の態様と同様である。
　本発明のスクリーニング方法によれば、リソソーム損傷を修復するための薬剤やリソソーム損傷に起因する疾患の予防または治療のための薬剤の候補を同定することができる。同定される化合物には、ＡＴＧタンパク質に非依存的にＴＦＥＢを活性化する化合物およびＡＴＧタンパク質に依存的にＴＦＥＢを活性化する化合物が含まれる。リソソームの損傷は、例えば、シュウ酸カルシウム結晶、尿酸結晶、コレステロール結晶、結晶シリカなどの結晶、膵島アミロイドポリペプチド（ＩＡＰＰ）、α－シヌクレイン、タウなどの凝集体、細菌毒素、リソソーム指向性薬剤、酸化ストレスなど様々な要因により生じ、これらの要因は、結晶性腎症（例えば、シュウ酸カルシウム腎症、高尿酸血性腎症など）、高尿酸血症（痛風）、２型糖尿病、動脈硬化、肺がん、珪肺症、慢性肺疾患、神経変性疾患（例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病、ポリグルタミン病、プリオン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）など）、感染症（細菌感染症など）などの多くの疾患の原因となることが知られている。従って、本発明のリソソーム損傷を修復する活性を有する化合物のスクリーニング方法は、これらリソソーム損傷に起因する疾患の予防または治療のための化合物のスクリーニング方法として有効である。
　本発明のスクリーニングにより同定された化合物は、薬理学上許容される担体と混合し、公知の製剤学的方法で製剤化することにより、医薬品とすることができる。薬理学上許容される担体としては、例えば、滅菌水や生理食塩水、植物油、溶剤、基剤、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、芳香剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤、希釈剤、等張化剤、無痛化剤、増量剤、崩壊剤、緩衝剤、コーティング剤、滑沢剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤等が挙げられるが、これらに制限されない。
　Ａ．材料および方法
　（１）細胞培養実験用の抗体と試薬
　この研究では、次の抗体と希釈液を使用した：ａｎｔｉ－Ｇａｌｅｃｔｉｎ３（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），ａｎｔｉ－ＬＡＭＰ１（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），ａｎｔｉ－ＴＦＥＢ（ウサギ，Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），ａｎｔｉ－ｐｈｏｓｐｈｏ　Ｓ６Ｋ（ウサギ，Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），ａｎｔｉ－Ｓ６Ｋ（ウサギ，Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），ａｎｔｉ－ｐｈｏｓｐｈｏ　ＧＳＫαβ（Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），ａｎｔｉ－ＧＳＫβ（Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），ａｎｔｉ－ＰＰＰ３ＣＢ（ＯｒｉＧｅｎｅ），ａｎｔｉ－ｐ６２（ウサギ，ＭＢＬ），ａｎｔｉ－ＨＡ（マウス，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ），ａｎｔｉ－ＦＬＡＧ（マウス，Ｓｉｇｍａ）。Ｌｅｕ－Ｌｅｕメチルエステル臭化水素酸塩（ＬＬＯＭｅ）は、Ｓｉｇｍａから購入した。細胞を１ｍＭ　ＬＬＯＭｅで１時間処理した後、薬物を含まないＤＭＥＭで培養した。処理の０時間、３時間、６時間、または１２時間後にサンプルを収集し、免疫組織化学検査およびウェスタンブロッティングに供した。ＭＬ－ＳＡ１はＳｉｇｍａから購入した。細胞を５０μＭ　ＭＬ－ＳＡ１で１時間処理し、免疫組織化学検査およびウェスタンブロッティングのために収集した。細胞を２μＭ　Ｔｏｒｉｎ１（ＴＯＣＲＩＳ）で１時間処理し、ウェスタンブロッティングを行った。
　（２）プラスミドとウイルスの生産
　ＥＧＦＰタグ付きヒトＴＦＥＢおよびＨＡタグ付きヒトＴＲＰＭＬ１を含むプラスミドは、Ａｄｄｇｅｎｅから入手した。ｐＭＲＸ－ＩＲＥＳ－ｐｕｒｏベクターは、山岡昇司教授（東京医科歯科大学、東京、日本）より供与された。組換えレトロウイルスを生成するために、ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎタグ付きＴＦＥＢに対応するｃＤＮＡを、ｐＭＲＸ－ＩＲＥＳ－ｐｕｒｏベクターにサブクローニングした。安定した細胞株を生成するために、既報の通り、組換えレトロウイルスを調製した（非特許文献１）。共免疫沈降実験のために、３ｘＦＬＡＧタグ付きヒトＬＣ３Ａ、ＬＣ３Ｂ、ＬＣ３Ｇ１２０Ａ、ＬＣ３Ｃ、ＧＡＢＡＲＡＰ、ＧＡＢＡＲＡＰＬ１、ＧＡＢＡＲＡＰＬ２をｐｃＤＮＡ３．１にサブクローニングした。ＬＩＲモチーフのＴＲＰＭＬ１へのアラニン置換については、プライマー「５’－ＣＡＧＧＣＣＣＴＧＧＣＧＧＣＣＣＣＴＧＡＣＧＴＧＴＣＡＣＴＧＧＧＣＣＧＧＴＡ－３’／配列番号：２３」および「５’－ＡＧＧＧＧＣＣＧＣＣＡＧＧＧＣＣＴＧＧＴＣＣＡＣＡＧＣＡＴＧＧＡＡＧＡＴＧＧ－３’／配列番号：２４」を使用してＰＣＲ増幅を行い、続いてＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ反応（タカラバイオ株式会社）を行った。
　（３）細胞培養およびトランスフェクション
　ＨｅＬａ　Ｋｙｏｔｏ、ＭＥＦ、Ｐｌａｔ－Ｅ細胞を、１０％ウシ胎児血清と適切な抗生物質を含むＤＭＥＭで培養した。Ｐｌａｔ－Ｅ細胞は、北村敏夫教授（非特許文献２）より提供された。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して一過性トランスフェクションを実施し、トランスフェクションの２４時間後に、サンプルを免疫組織化学検査または共免疫沈降実験に使用した。栄養飢餓のために、細胞をＥＢＳＳ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で４時間培養した。
　（４）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を介したゲノム編集
　オートファジー欠損ＫＯ　ＨｅＬａ細胞株は、以下のＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を使用して生成された。アニーリングされたｇＲＮＡオリゴヌクレオチドをベクターｐｘ４５８に挿入し、ＶｉａＦｅｃｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）トランスフェクション試薬を使用してｇＲＮＡコンストラクトをＨｅＬａ細胞にトランスフェクトした。ＧＦＰ陽性の単一細胞は、ＦＡＣＳによって９６ウェルプレートに分類した。単一クローンの候補コロニーは、特定の抗体、ＬＣ３フラックスアッセイ、およびゲノムＤＮＡ配列を使用した免疫ブロッティングによって検証した。
　（５）ｇＲＮＡ配列：
　ＡＴＧ２Ａ，５’－ＴＧＣＧＡＧＡＣＡＴＣＣＡＣＣＴＧＧＡＡ－３’／配列番号：２５
　ＡＴＧ２Ｂ，５’－ＣＡＣＴＡＴＧＣＣＴＴＧＧＣＣＧＴＴＴＴ－３’／配列番号：２６
　ＡＴＧ３，５’－ＡＣＡＡＣＣＡＴＡＡＴＣＧＴＧＧＡＧＴＣ－３’／配列番号：２７
　ＡＴＧ７，５’－ＧＡＡＡＴＡＡＴＧＧＣＧＧＣＡＧＣＴＡＣＧ－３’／配列番号：２８
　ＡＴＧ９，５’－ＧＴＧＴＴＧＧＴＧＣＡＣＧＴＣＧＣＣＧＡＧ－３’／配列番号：２９
　ＡＴＧ１３，５’－ＧＴＣＣＣＴＴＣＴＴＧＣＴＡＴＡＡＣＴＡ－３’／配列番号：３０
　ＡＴＧ１４，５’－ＡＣＡＴＡＧＧＣＡＣＴＴＴＣＴＡＧＧＧＣ－３’／配列番号：３１
　ＡＴＧ１６Ｌ１，５’－ＧＣＧＣＣＧＣＴＧＡＣＴＴＣＣＣＣＣＧＣ－３’／配列番号：３２
　ＦＩＰ２００，５’－ＣＡＡＧＡＴＴＧＣＴＡＴＴＣＡＡＣ－３’／配列番号：３３
　ＳＴＸ１７，５’－ＡＴＡＧＴＡＡＴＣＣＣＡＡＣＡＧＡＣＣ－３’／配列番号：３４。
　（６）ｓｉＲＮＡノックダウン
　ＴＦＥＢノックダウンには、ＯＮ－ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ　Ｈｕｍａｎ　ＴＦＥＢ（７９４２）ｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）を使用した。ＰＰＰ３ＣＢ　ｓｉＲＮＡおよびＡＴＧ１６Ｌ１は、Ｓｉｇｍａから購入した。ｓｉＲＮＡ（最終濃度２０ｎＭ）をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でＨｅＬａ細胞にトランスフェクトし、４８時間後に発現レベルをウェスタンブロッティングで評価した。
　（７）ウェスタンブロッティングおよび共免疫沈降
　サンプルをＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、ポリフッ化ビニリデン膜に転写した。膜を、１％スキムミルクを含むＴＢＳＴ（ＴＢＳおよび０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）でブロックし、ブロッキング溶液で希釈した一次抗体と４℃で一晩保持した。膜をＴＢＳＴで３回洗浄し、ブロッキング溶液中、５，０００倍希釈のＨＲＰ結合二次抗体（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）とともに室温で１時間保持し、ＴＢＳＴで４回洗浄した。ＣｈｅｍｉＤｏｃ　Ｔｏｕｃｈ　Ｉｍａｇｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）でＬｕｍｉｎａｔｅ　Ｆｏｒｔｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、免疫反応性バンドを検出した。
　（８）免疫蛍光および顕微鏡検査
　細胞をカバースリップ上で培養し、４％パラホルムアルデヒドで１０分間固定し、ＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳ中、５０μｇ／ｍｌジギトニンで透過処理し、ＰＢＳ中、０．２％ゼラチンでブロックした後、指定の一次抗体と保持した。二次抗体処理後、ＣＱ１（横河電機株式会社）またはＦＶ３０００共焦点顕微鏡（オリンパス）またはＩＸ８１広視野蛍光顕微鏡（オリンパス）でサンプルを観察した。ＣＱ１ソフトウェアを使用して、細胞あたりのＧａｌ－３斑点を定量化した。ＴＦＥＢ核局在化の評価のために、細胞を１ｍＭ　ＬＬＯＭｅで１時間処理し、ＤＭＥＭで洗い流した。サンプルは、洗浄の３時間後に検査した。ＥＢＳＳ飢餓を４時間行った。ＣｅｌｌＰｒｏｆｉｌｅｒを使用して、核と細胞質の比率ＴＦＥＢ：：ＥＧＦＰまたはＴＦＥＢ：：ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎを定量化した。ＬＣ３斑点の数およびＬａｍｐ１とＬＣ３Ｂとの間の共局在率を、Ｆｉｊｉを使用して分析した。
　（９）カルシウムイメージング
　０．１３ｍｍのガラス製カバースリップ上で増殖した細胞を洗浄し、０．０２％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ１２７を含む２０μＭ　Ｆｕｒａ－２　ＡＭ（同仁化学研究所）を３７℃で３０分間ロードした。細胞を洗浄し、灌流チャンバーに取り付け、ニコン製の顕微鏡で２０倍の対物レンズを使用して視覚化した。画像は、２０倍の乾式対物レンズ（ＵＡｐｏ／３４０、ＮＡ０．７５；オリンパス）を備えた広視野倒立落射蛍光顕微鏡（Ｅｃｌｉｐｓｅ　Ｔｉ－Ｅ，ニコン）を使用して取得した。サンプルは、５％および２５％の減光フィルターと励起フィルターを通して１００Ｗ水銀アークランプで照らした。Ｆｕｒａ－２の短励起波長と長励起波長では、ダイクロイックミラーＦＦ４０９－Ｄｉ０３（Ｓｅｍｒｏｃｋ）と共に、それぞれ３４０／２６および３８７／１１励起フィルター（Ｓｅｍｒｏｃｋ）を使用した。長励起波長用に追加の４５％減光フィルターを挿入して、短励起波長の光パワーに匹敵するように光パワーを調整した。各励起波長の蛍光画像は、５１０／８４干渉フィルター（Ｓｅｍｒｏｃｋ）を介して順次撮影した。電子増倍型電荷結合素子（ＥＭＣＣＤ）カメラｉＸｏｎ３（Ａｎｄｏｒ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して、ＥＭ増幅なしで３００ｍｓの露光時間で各チャネルの画像を取得した。タイムラプス画像は、３秒ごとに撮影した。バックグラウンドを差し引いた後、強度変調表示モード（ＩＭＤ）でＭｅｔａＭｏｒｐｈソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して比率画像を作成した。
　（１０）マウス研究
　条件付き近位尿細管上皮細胞特異的Ａｔｇ５欠損マウスは、既報の通りに作成した（非特許文献３）。条件付き近位尿細管上皮細胞特異的Ｔｆｅｂ欠損マウスは、Ｔｆｅｂ　ｆｌｏｘ対立遺伝子を持つマウス（非特許文献４）をＫＡＰ－Ｃｒｅトランスジェニックマウスと交配することで生成したが、ここでＣｒｅリコンビナーゼは、Ｋａｐプロモーターの制御下で発現する（非特許文献３）。８～１０週齢のオスのマウスに７５ｍｇ／ｋｇのシュウ酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）を単回腹腔内注射し、指定の期間後にサクリファイスした。すべての動物実験は、大阪大学動物実験委員会の組織委員会と日本の動物愛護管理法（第２５条）によって承認された。
　（１１）組織学的分析
　マウス腎臓切片（厚さ２μｍ）を、ＰＡＳ試薬で染色した。ＰＡＳ損傷スコアは、損傷した尿細管の割合として定義した。尿細管の損傷は、刷子縁の損失、尿細管の拡張、および円柱形成によって定義した。パラフィン包埋切片の免疫組織化学染色および免疫蛍光染色、ＴＦＥＢ核局在化の定量化、および電子顕微鏡分析は、既報の通りに実施した（非特許文献５）。免疫組織化学染色および免疫蛍光染色に使用した一次抗体および希釈液は以下の通りである：ａｎｔｉ－ＴＦＥＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＰＡ１－３１５５２，１：２００），ａｎｔｉ－Ｇａｌｅｃｔｉｎ－３（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｓｃ－２３９３８，１：２００），ＬＡＭＰ１（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，５５５７９８，１：２００），ａｎｔｉ－ＬＲＰ２／ｍｅｇａｌｉｎ（日本の大阪母子医療センター研究所・骨発育疾患研究部門の道上敏美氏より供与された。１：４００００）。ＣａＯｘ結晶を可視化するために、幾つかの修正を加えて、既報の通りにＰｉｚｚｏｌａｔｏ染色を実施した（非特許文献６）。細胞死検出（ＴＵＮＥＬ）キット（タカラバイオ株式会社、日本）を使用して、アポトーシス細胞を定量した。組織染色のすべての定量分析では、各組織について、少なくとも１０の高倍率視野を盲検化してレビューした。
　（１２）生化学的測定
　血漿クレアチニンとＢＵＮは、ＣＲＥ－ＥＮ　Ｋａｉｎｏｓテスト（株式会社カイノス、日本）およびＢＵＮ－Ｔｅｓｔ－Ｗａｋｏ（Ｗａｋｏ，日本）を使用して測定した。
　（１３）ＲＮＡ抽出およびｑＲＴ－ＰＣＲ
　Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、トータルＲＮＡを抽出した。ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ　ＲＴ試薬キット（タカラバイオ株式会社）を使用してｃＤＮＡを生成した。ｑＲＴ－ＰＣＲは、Ｐｏｗｅｒ　ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、ＡＢＩ　７９００ＨＴ　ＲＴ－ＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で実行した。ＧＡＰＤＨを内部対照として使用した。　プライマー配列は、以下の通りである：
　Ｋｉｍ１－Ｆ，５’－ｔｃａｇｃｔｃｇｇｇａａｔｇｃａｃａ－３’／配列番号：３５
　Ｋｉｍ１－Ｒ，５’－ｔｇｇｔｔｇｃｃｔｔｃｃｇｔｇｔｃｔ－３’／配列番号：３６
　Ｎｇａｌ－Ｆ，５’－ｃｔａｃａａｃｃａｇｔｔｃｇｃｃａｔｇｇ－３’／配列番号：３７
　Ｎｇａｌ－Ｒ，５’－ａｃａｃｔｃａｃｃａｃｃｃａｔｔｃａｇｔ－３’／配列番号：３８
　Ｇａｐｄｈ－Ｆ，５’－ａａｃｔｔｔｇｇｃａｔｔｇｔｇｇａａｇｇ－３’／配列番号：３９
　Ｇａｐｄｈ－Ｒ，５’－ａｃａｃａｔｔｇｇｇｇｇｔａｇｇａａｃａ－３’／配列番号：４０。
　（１４）ｉｎ　ｖｉｔｒｏでの近位尿細管上皮細胞におけるＣＯＭ結晶によるリソソーム損傷の評価
　ＣＯＭ結晶は、既報の通りに調製した（非特許文献７）。ＧＦＰ－Ｇａｌ－３を安定して発現する不死化マウス近位尿細管上皮細胞は、既報に記載されている（非特許文献８）。ＣＯＭ結晶によるリソソーム損傷を評価するために、近位尿細管上皮細胞をカバースリップ上で培養し、１００μｇ／ｍＬ　ＣＯＭ結晶で２時間処理した。ＧＦＰ－Ｇａｌ－３陽性斑点は、共焦点顕微鏡（ＦＶ１０００－Ｄ［オリンパス、東京、日本］）を使用して観察した。
　（１５）ヒト腎臓標本の分析
　すべての研究は、大阪大学病院の治験審査委員会（ＩＲＢ番号１６５５４）によって承認された。対照標本は、組織切片に由来しており、有意な異常変化はなかった。結晶性腎症の診断には、急性リン酸腎症、シュウ酸カルシウム腎症、およびモノクローナル軽鎖尿細管症が含まれていた。ヒト腎臓パラフィン切片の免疫組織化学検査に使用した一次抗体と希釈液は以下の通りである：ＴＦＥＢ（Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，＃３７７８５，１：６００），Ｇａｌｅｃｔｉｎ－３（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｓｃ－２３９３８，１：２００），ＬＡＭＰ１（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ　Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，５５５７９８，１：２５０）。
　（１６）線虫細胞培養実験のための抗体および試薬
　本実験においては、ａｎｔｉ－Ｇａｌ－３（ラット，　１／１，０００；　Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　ｓｃ－２３９３８）を使用した。免疫蛍光用の二次抗体として、ｇｏａｔ　ａｎｔｉ－ｒａｔ　Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　５６８／６４７　ｐｒｅ－ａｂｓｏｒｂｅｄ（１／１，０００；　Ａｂｃａｍ，　ａｂ１５０１６７）を使用した。細胞は、１０μｇ／ｍｌのα－シヌクレインＡＴＴＯの繊維またはモノマーで８時間処理した。
　（１７）線虫細胞培養およびトランスフェクション
　１０％のウシ胎児血清および適当な抗生物質を含むＤＭＥＭ培地でＨｅＬａ　Ｋｙｏｔｏを培養した。Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｑｉａｇｅｎ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、またはＦｕｇｅｎｅ　６を用いて、一過性のトランスフェクションを行い、免疫組織化学実験または共免疫沈降実験のために、試料をトランスフェクション後２４～４８時間使用した。細胞を固定する前に、継続的に少なくとも８時間、線維およびモノマーを添加した。
　（１８）プラスミド構築と線虫の形質転換
　ＥＧＦＰ－ｔａｇｇｅｄ　ｈｕｍａｎ　ＴＦＥＢ（プラスミド番号３８１１９）を含むプラスミドをＡｄｄｇｅｎｅから取得した。ｐＭＲＸ－ＩＲＥＳ－ｐｕｒｏベクターは、山岡昇司教授（東京医科歯科大学、東京、日本）から供与された。組換えレトロウイルスを生成するために、ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ－ｔａｇｇｅｄ　ＴＦＥＢに相当する相補的ＤＮＡをｐＭＲＸ－ＩＲＥＳ－ｐｕｒｏベクターにサブクローン化した。安定した細胞株を作成するために、組換えレトロウイルスを既報の通り調製した。ＳＮＣＡ：：ＥＧＦＰまたはＳＮＣＡ：：ＲＦＰの翻訳融合構築物のために、ＳＮＣＡの１－ｋｂ外因性プロモーターとコード配列とをｐＥＸＰ－ａｅｘベクターまたはｐＥＸＰ－ＡＣＣベクターにクローン化した。当該ベクターは、ＥＧＦＰまたはＲＦＰのタグを含み、神経特異的に発現する。ＳＨＵ１０（ｎａｋＥｘ５［ＳＮＣＡ－ＲＦＰ：：ｕｎｃ－５４，　Ｌｉｎ４４：：ＧＦＰ］）を生成するために、ｐＥＸＰ－ａｅｘ－ＳＮＣＡ－ＲＦＰを共注入マーカーＬｉｎ４４：：ＧＦＰとともにマイクロインジェクションした。顕微鏡実験に用いるために、ＣＧＣからｍ１９７８（ｈｌｈ－３０変異体）を取得し、その株を形質転換株（ＳＨＵ１０ｘｔｍ１９７８）と異系交雑した。
　（１９）線虫の育成条件
　線虫を、大腸菌株ＯＰ５０とともに、線虫育成培地上で２０℃にて標準法で培養した。
　（２０）線虫の顕微鏡観察
　ＳＮＡＣの凝集をモニターするために、ＳＨＵ１０およびＳＨＵ１０ｘｔｍ１９７８を５０ｍＭアジ化ナトリウム中で麻酔し、神経におけるＲＦＰ斑点を、オリンパスＳＺＸ１６顕微鏡で同一の露光時間で写真撮影し、１～４日目の成虫段階で比較した。２０以上の線虫を各実験で採点し、全ての実験は、少なくとも３回繰り返した。
　（２１）免疫蛍光と顕微鏡観察
　細胞をカバーガラス上で培養し、４％パラホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳで２回洗浄し、５０μｇ／ｍｌのジギトニンを含むＰＢＳで透析し、０．２％ゼラチンを含むＰＢＳでブロッキングし、指定の一次抗体とともにインキュベートした。二次抗体で処理した後、試料をＦＶ３１Ｓ－ＳＷ（ｖｅｒｓｉｏｎ　２．３．１．１６３）で操作されるＦＶ３０００　共焦点顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）上で観察した。
　Ｂ．結果
　リソソーム損傷時のＴＦＥＢ機能を明らかにするために、先ず、ＨｅＬａ細胞におけるリソソーム損傷後のＴＦＥＢの細胞内局在化を確認した。ＴＦＥＢは、通常の栄養条件下では細胞質に局在している。しかし、飢餓等の特定の刺激に応じて、ＴＦＥＢは核に移行し、転写プログラムを活性化させる。先の発見（非特許文献８、９）と一致して、内因性ＴＦＥＢは、リソソーム指向性化合物Ｌ－ロイシル－Ｌ－ロイシンメチルエステル（ＬＬＯＭｅ）によるリソソーム損傷の誘導直後に核に局在し、処理の３～６時間後にピークに達することを見出した（図１Ａ（ｉ）および（ｉｉ））。
　ＴＦＥＢ機能が損傷したリソソームの除去に不可欠か否かを判断するために、ｓｉＲＮＡでＴＦＥＢ機能をノックダウンし、ＬＬＯＭｅ処理後の損傷したリソソームの代謝回転を調査した。ガレクチン３（Ｇａｌ－３）は、βガラクトース結合性レクチンであり、損傷したエンドソームおよびリソソームのマーカーである。内腔の糖鎖は細胞質基質のガレクチン３にアクセス可能になり、次いで、斑点を形成する（I.　Paz　et　al.,　Cell　Microbiol　12,　530-544　(2010)）。リソファジーが損傷したリソソームの除去に不可欠であるという既報の発見（非特許文献２）と一致して、オートファジーに不可欠なＡＴＧ１６Ｌ１のノックダウンにより、ＬＬＯＭｅ処理をした１２時間後の、ガレクチン３陽性損傷リソソームの除去が損なわれた（図１Ａ（ｉｉｉ）および（ｉｖ），並びに図５Ａ（ｉ））。重要なことに、ＴＦＥＢのノックダウンにより、対照と比較してＧａｌ－３陽性斑点数の大幅な増加という結果もまたもたらしたが、このことは、ＴＦＥＢ機能が損傷したリソソームの除去にも不可欠であることを示している（図１Ａ（ｉｉｉ）および（ｉｖ），並びに図５Ａ（ｉ））。
　オートファジーとＴＦＥＢ機能との間のクロストークの可能性を調べるために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９法を使用して、ＡＴＧ３、ＡＴＧ７、ＡＴＧ９、ＡＴＧ１３、ＡＴＧ１４、ＡＴＧ１６Ｌ１、ＦＩＰ２００、Ｓｙｎｔａｘｉｎ１７（Ｓｔｘ１７）、Ｒｕｂｉｃｏｎ（C.　Chang　et　al.,　Mol　Cell　73,　339-353　e336　(2019)）、およびＡＴＧ２ＡとＢ（以下、ＡＴＧ２）の両方を欠く細胞を含む幾つかのオートファジー欠損ＨｅＬａ細胞を作成した。次に、これらの背景でＬＬＯＭｅ処理によるＴＦＥＢの活性化を調査した。ＴＦＥＢの活性化は、そのリン酸化状態によって制御される（R.　Puertollano　et　al.,　EMBO　J　37,　(2018)）。ウェスタンブロッティング解析では、リン酸化された細胞質性の不活性ＴＦＥＢの分子量は高くなるが、脱リン酸化された核局在性の活性化ＴＦＥＢはダウンシフトする。驚くべきことに、ＬＬＯＭｅ処理の３時間後の一部のオートファジー欠損細胞におけるＴＦＥＢ核局在化が損なわれることを確認した。特に、ＡＴＧ７およびＡＴＧ１６Ｌ１ノックアウト（ＫＯ）細胞において、ＴＦＥＢはＬＬＯＭｅ処理後もより高い分子量で持続した（図５Ａ（ｉｉ））。対照的に、他のオートファジー欠損細胞においては、ＴＦＥＢは核に局在していた（図５Ａ（ｉｉ））。
　なお、これらＡＴＧ遺伝子に対する特定の要件は、リソソーム損傷時にのみ認められ、ＥＢＳＳ飢餓状態では認められなかった（図５Ｂ（ｉｉｉ））。また、ＴＦＥＢ活性に影響を与えるＧＳＫ３β活性およびｍＴＯＲ活性のいずれもＬＬＯＭｅ処理によって変化しなかった（Y.　Li　et　al.,　Nat　Cell　Biol　18,　1065-1077　(2016)、A.　Roczniak-Ferguson　et　al.,　Sci　Signal　5,　ra42　(2012)）が、このことは、この状況でのＴＦＥＢ活性化に他のシグナル伝達経路が関与している可能性があることを示している。
　ウェスタンブロットの結果をさらに明確にするために、我々はＴＦＥＢ：：ＥＧＦＰプラスミドをさまざまな細胞株に一過性トランスフェクションし、ＬＬＯＭｅ処理時のＧＦＰ蛍光の細胞内局在化を調査した。ＴＦＥＢ：：ＥＧＦＰは、野生型（ＷＴ）、並びにＡＴＧ９およびＦＩＰ２００ノックアウト細胞でＬＬＯＭｅによって強く核局在化されたが、核局在化はＡＴＧ７ノックアウト細胞およびＡＴＧ１６ノックアウト細胞で著しく損なわれた（図１Ｂ（ｖ）および（ｖｉ））。ＡＴＧ７ノックアウト細胞およびＡＴＧ１６のノックアウト細胞は、オートファゴソームマーカーＬＣ３／ＡＴＧ８の脂質化に不可欠なＡＴＧ結合系のコンポーネントを欠いている。
　また、ＡＴＧ結合系のもう１つのコンポーネントであるＡＴＧ３を欠く変異体でもＴＦＥＢ核局在化が損なわれていることを、ＬＬＯＭｅ処理後に見出したが、ＥＢＳＳ処理後には見いださなかった（図５Ｂ（ｉｖ））。ＬＣ３Ａ、ＬＣ３Ｂ、ＬＣ３Ｃ、ＧＡＢＡＲＡＰ、ＧＡＢＡＬＡＰＬ１、ＧＡＢＡＲＡＰＬ２を含む（T.　N.　Nguyen　et　al.,　J　Cell　Biol　215,　857-874　(2016)）６つのヒトＡＴＧ８パラログを欠くヘキサＫＯ　ＨｅＬａ細胞は、ＬＬＯＭＥ処理下でのみＴＦＥＢ核局在化が損なわれたことを示した（図１Ｂ（ｖｉｉ））。マウスＡｔｇ８パラログ（ＬＣ３ａ，ＬＣ３ｂ，Ｇａｂａｒａｐ，Ｇａｂａｒａｐｌ１，およびＧａｂａｒａｐｌ２）のシングル、ダブル、またはトリプルＫＯを含むＭＥＦを使用して（M.　Sasai　et　al.,　Nat　Immunol　18,　899-910　(2017)）、これらのいずれかがＬＬＯＭｅによるＴＦＥＢ活性化に特異的に必要か否かを調査した。ＧＡＢＡＲＡＰ　ＫＯはＴＦＥＢの核移行の最も強い障害を示したが、ＫＯ細胞株はＬＬＯＭｅ処理後に顕著なＴＦＥＢ核局在化を示さなかった。このことは、ＴＦＥＢを完全に活性化するためには、すべてのパラログが存在する必要があることを示唆している（図６）。
　エンドソーム損傷および／またはリソソーム損傷が実際にＡＴＧ結合系に依存するＴＦＥＢ活性化を誘導するか否かをさらに調べるために、ＥｆｆｅｃｔｅｎｅまたはＰＥＩで被覆した人工ビーズを細胞にトランスフェクトした。既報に記載のように（N.　Fujita　et　al.,　J　Cell　Biol　203,　115-128　(2013)）、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ被覆ビーズはエンドサイトーシスされ、Ｇａｌ－３でマークされたエンドソーム損傷および／またはリソソーム損傷を引き起こしたが、ＰＥＩ（ポリエチレンイミン）被覆ビーズは損傷を引き起こさなかった（図７）。興味深いことに、ＰＥＩ被覆ビーズではなく、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ被覆ビーズのトランスフェクションにより、ＡＴＧ７依存的に堅牢なＴＦＥＢ核局在化が誘導された（図７）。これらの結果はすべて、ＬＣ３／ＡＴＧ８の脂質化の原因であるＡＴＧ結合系が、エンドリソソームの損傷によって誘導されるＴＦＥＢ核局在化に特異的に必要であることを示している。
　次に、ＡＴＧ結合系に依存するＴＦＥＢの核移行を引き起こす要因の特定を行った。リソソームからのカルシウム放出は、ホスファターゼカルシニューリンの活性化を介してＴＦＥＢ核局在化を誘導する（D.　L.　Medina　et　al.,　Nature　Cell　Biology　17,　288-299　(2015)）。そこで、リソソームのカルシウム流出が、ＡＴＧ結合系に依存するＴＦＥＢ活性化を引き起こすか否かを検討した。この考察と一致して、リソソームのカルシウムチャネルＴＲＰＭＬ１に特異的なアゴニストであるＭＬ－ＳＡ１は、野生型細胞において、強力なＴＦＥＢ核局在化を誘導したが、ＡＴＧ７－ＫＯ細胞では核局在化が損なわれた（図２Ａ（ｉ）および（ｉｉ））。ＡＴＧ３　ＫＯ細胞でも同様の結果が得られた（図８（ｉ））。さらに、ＡＴＧ８ｓヘキサＫＯ細胞は、ＭＬ－ＳＡ１処理時にＴＦＥＢ核局在化障害を示した（図２Ａ（ｉｉｉ））。このことは、ＡＴＧ８ｓの脂質化がリソソームのカルシウム流出によって引き起こされるＴＦＥＢ活性化を媒介することを示唆している。併せて、これらの結果は、リソソームからのカルシウム流出が、ＡＴＧ結合系に依存するＴＦＥＢ活性化を引き起こしたことを示している。
　活性化されたカルシニューリンは、飢餓中に、ＴＦＥＢを脱リン酸化して、その活性化を促進させる（D.　L.　Medina　et　al.,　Nature　Cell　Biology　17,　288-299　(2015)）。カルシニューリンのサブユニットの１つであるＰＰＰ３ＣＢをノックダウンしても、ＬＬＯＭｅ誘導ＴＦＥＢ活性化は有意に無効とはならなかった（図８（ｉｉ）および（ｉｉｉ））。このことは、カルシニューリンの幾つかのサブユニットがこのプロセスを媒介している可能性を排除することはできないものの、追加のメカニズムがこの経路に関与している可能性があることを示唆している。
　リソソームからのカルシウム流出がＴＦＥＢ活性化に不可欠であることを考えると、ＡＴＧ結合系はリソソーム損傷応答にのみ必要であり、飢餓への応答には必要ないという点は興味深い。飢餓時のｍＴＯＲダウンレギュレーションがＴＦＥＢ活性化のためにＡＴＧ結合系を不要とすることはもっともだと考えられる。この可能性を探るために、ＷＴとＡＴＧ７　ＫＯ細胞をＭＬ－ＳＡ１とｍＴＯＲ阻害剤Ｔｏｒｉｎ１で処理し、Ｔｏｒｉｎ１処理がＡＴＧ７　ＫＯ細胞におけるＴＦＥＢ核局在化の喪失を救済することを見出した（図２Ａ（ｉｖ））。これらの結果は、飢餓時に、ｍＴＯＲダウンレギュレーションがＴＦＥＢ活性化のためにＡＴＧ結合系を迂回したことを示している。
　ＭＬ－ＳＡ１処理がＡＴＧ結合系欠損変異体のＴＦＥＢ核局在化をブロックしたため、リソソームＴＲＰＭＬ１チャネルの容量がこれらの変異体で損なわれるのではないかと考えた。Ｆｕｒａ－２カルシウムイメージングで明らかにされたように、先の研究では、ＭＬ－ＳＡ１が細胞質カルシウムの強力な増加を誘導することが示された（B.　S.　Kilpatrick　et　al.,　J　Cell　Sci　129,　3859-3867　(2016)）。ＭＬ－ＳＡ１処理により、一部のＷＴ細胞で急激なカルシウムの増加が誘導されたのに対し、ＡＴＧ結合欠損ＡＴＧ７　ＫＯ細胞ではそのような増加は見られなかった（図２Ｂ（ｖ）および（ｖｉ））。これらの結果は、ＴＲＰＭＬ１チャネルの容量を全容量とするにはＡＴＧ結合系の機能が必要であることを示している。
　ＡＴＧ結合系とＴＦＥＢ活性化の関係について、さらなる洞察を得るために、次に、ＬＬＯＭｅまたはＭＬ－ＳＡ１処理後のＬＣ３の局在化を調べた。ＬＬＯＭｅ処理により、ＬＣ３の脂質化、ＬＣ３斑点の数、およびＬＣ３と共局在するＬａｍｐ１陽性リソソームの量が急速に増加した（図３Ａ（ｉ）～（ｉｉｉ）並びに図９Ａ（ｉ））。興味深いことに、Ｌａｍｐ１陽性斑点へのＬＣ３の動員は、ＦＩＰ２００－ＫＯ細胞、ＡＴＧ１３－ＫＯ細胞、ＡＴＧ１４－ＫＯ細胞、ＡＴＧ９－ＫＯ細胞、およびＲｕｂｉｃｏｎ－ＫＯ細胞でも認められたが、ＡＴＧ７－ＫＯ細胞やＡＴＧ１６Ｌ１－ＫＯ細胞では認められなかった。このことは、ＬＬＯＭｅ処理がリソファジーだけでなく、リソソーム上の脂質化ＬＣ３の動員も誘導することを示唆している（図３Ａ（ｉ）～（ｉｉｉ）および図９Ａ（ｉｉ））。同様のリソソーム上のＬＣ３動員はまた、ＭＬ－ＳＡ１の処置後に認められたが、Ｇａｌ－３斑点（図９Ｂ（ｉｉｉ）～（ｖ））を伴わなかった。このことは、リソソームへの脂質化ＬＣ３の動員を誘導するには、Ｇａｌ－３蓄積ではなく、カルシウム流出が十分であることを示している。
　次に、脂質化ＬＣ３がＴＲＰＭＬ１容量とＴＦＥＢ活性化に不可欠である理由を調査した。共免疫沈降分析により、すべてのＡＴＧ８ホモログがＴＲＰＭＬ１と相互作用することが明らかになった（図３Ａ（ｉｖ））。さらに、脂質化欠損ＬＣ３（Ｇ１２０Ａ変異体）ではなく、脂質化ＬＣ３のみが、ＴＲＰＭＬ１と共免疫沈降した（図３Ｂ（ｖ））。ＴＲＰＭＬ１チャネルはホモテトラマーとして機能し（Q.　Chen　et　al.,　Nature　550,　415-418　(2017)、P.　Schmiege　et　al.,　Nature　550,　366-370　(2017)）、幾つかのＬＩＲモチーフを含んでいる。これらのモチーフの１つにおけるアラニン置換（アミノ酸１３４～１３９、ＹＬＡＬ→ＡＬＡＡ）は、ＬＣ３との相互作用を部分的に破壊した（図３Ｂ（ｖｉ））。重要なことに、ＷＴ　ＴＲＰＭＬ１の過剰発現だけでも先の報告（D.　L.　Medina　et　al.,　Nature　Cell　Biology　17,　288-299　(2015)）と一致してＬＣ３斑点の数が増加し、ＴＦＥＢ核局在化が誘導されたが、ＬＩＲ変異体の過剰発現による増加および誘導の程度はより低かった（図３Ｂ（ｖｉｉ）～（ｉｘ））。ＡＴＧ３変異体がＭＬ－ＳＡ１処理後のＴＲＰＭＬ１容量の低下を示したこと（図２Ｂ（ｖ）および（ｖｉ））を考慮すると、これらの結果は、脂質化ＬＣ３とＴＲＰＭＬ１との間の相互作用がリソソームからのカルシウム流出に寄与し、ＴＦＥＢ活性化につながることを示唆している。脂質化ＬＣ３との相互作用は、カルシウム流出を促進するＴＲＰＭＬ１の構造変化を引き起こす可能性がある。
　上記発見の生理学的意義を明らかにするために、次に、ＡＴＧ結合系を媒介したＴＦＥＢ活性化がｉｎ　ｖｉｖｏでリソソーム損傷修復を導く証拠を探索した。結晶性腎症（ＣＮ）は、リソソーム損傷によって誘導される組織損傷および臓器不全の例である（S.　R.　Mulay,　H.　J.　Anders,　Nat　Rev　Nephrol　13,　226-240　(2017)）。シュウ酸腎症はシュウ酸カルシウム（ＣａＯｘ）結晶によって引き起こされる代表的な種類のＣＮであり、マウスがシュウ酸に曝露されるとこの状態を発症する（S.　R.　Mulay　et　al.,　J　Clin　Invest　123,　236-246　(2013)、F.　Knauf　et　al.,　Kidney　Int　84,　895-901　(2013)、S.　R.　Mulay　et　al.,　Nat　Commun　7,　10274　(2016)）。シュウ酸腎症は、最近は慢性腎疾患の進行と密接な関係があるため注目されているが、以前は比較的まれな障害とみなされていた（S.　S.　Waikar　et　al.,　JAMA　Intern　Med　179,　542-551　(2019)）。そこで、シュウ酸腎症モデルを用いて、ＡＴＧ結合系、ＴＦＥＢ活性化、およびリソソーム損傷修復の間の関係を調査した。
　ＣａＯｘ結晶がｉｎ　ｖｉｔｒｏでリソソーム損傷を引き起こすことを確認するために、ＧＦＰ－Ｇａｌ３を安定して発現する不死化した腎近位尿細管上皮細胞を作成した。未処理条件下では、ＧＦＰ－Ｇａｌ３は細胞質基質全体に拡散して分布していた。ＣａＯｘ結晶への曝露は、幾つかのＧＦＰ－Ｇａｌ３斑点を誘導した（図１０Ａ（ｉ））。このことは、結晶がリソソームの不安定化を引き起こしたことを示している。また、急性シュウ酸塩曝露により、血中尿素窒素（ＢＵＮ）および血漿クレアチニンが増加し（図１０Ａ（ｉｉ））、ＣａＯｘ結晶が尿細管上皮細胞（図１０Ａ（ｉｉｉ），矢印）および腎尿細管内腔に沈着したことも確認した。興味深いことに、管状内腔の顆粒円柱と近位尿細管上皮細胞の刷子縁の損失に加えて、近位尿細管上皮細胞において（主に外髄質の内縞で）、細胞質基質の液胞形成が誘導された（図１０Ａ（ｉｖ））。液胞の縁がＬＡＭＰ１で免疫染色されたが（図１０Ｂ（ｖ），矢印）、これは細胞質液胞が巨大リソソームであることを示している。さらに、ｉｎ　ｖｉｔｒｏの観察と一致して、シュウ酸塩の投与により、近位尿細管上皮細胞にガレクチン－３斑点が誘導された（図１０Ｂ（ｖｉ））。電子顕微鏡分析により、シュウ酸塩を注入したマウスの異常なリソソーム様構造の表面に沿って二重層隔離膜が確認され（図１０Ｂ（ｖｉｉ））、損傷したリソソームのオートファジー性の貪食が示唆された。重要なことに、近位尿細管上皮細胞におけるＴＦＥＢの核移行はＣａＯｘ腎症によって促進された（図１０Ｂ（ｖｉｉｉ））。併せて、これらの結果は、ＣａＯｘ結晶が、リソソーム損傷とそれに続くｉｎ　ｖｉｖｏでのＴＦＥＢ活性化を引き起こすことを明確に示している。特に、対照（Ａｔｇ５Ｆ／Ｆ）マウスと比較して、近位尿細管上皮細胞特異的Ａｔｇ５欠損（Ａｔｇ５Ｆ／Ｆ；ＫＡＰ－Ｃｒｅ）マウス（T.　Kimura　et　al.,　J　Am　Soc　Nephrol　22,　902-913　(2011)）において、シュウ酸塩投与後のＬＲＰ２／ＭＥＧＡＬＩＮ陽性近位尿細管上皮細胞におけるＴＦＥＢの核移行が損なわれた（図４Ａ（ｉ）および（ｉｉ））。このことは、ＡＴＧ結合系が、ｉｎ　ｖｉｖｏにおいて、リソソーム損傷により誘導されるＴＦＥＢ活性化を媒介することを示している。
　次に、近位尿細管上皮細胞特異的Ｔｆｅｂ欠損（ＴｆｅｂＦ／Ｆ；ＫＡＰ－Ｃｒｅ）マウスおよび対照（ＴｆｅｂＦ／Ｆ）マウスを用いて、リソソーム損傷により誘導されるＴＦＥＢ活性化経路の、ＣａＯｘ腎症におけるｉｎ　ｖｉｖｏでの寄与を検証した。重要なことに、近位尿細管上皮細胞特異的Ｔｆｅｂ欠損マウスの１５％超がシュウ酸塩投与後に死亡したが（３／１８）、野生型マウスは死亡しなかった（０／２５）。ＣａＯｘ腎症のすべての機能的および構造的パラメーターは、近位尿細管上皮細胞特異的Ｔｆｅｂ欠損マウスで著しく悪化した（図４（Ａｉｉｉ）～（ｖｉ）並びに図１１（ｉ）および（ｉｉ））。近位尿細管上皮細胞のガレクチン－３斑点の数は、近位尿細管上皮細胞特異的Ｔｆｅｂ欠損マウスで上昇した（図４Ｂ（ｖｉｉ）および（ｖｉｉｉ））。これらの結果は、ＴＦＥＢ活性化がリソソーム損傷の修復を導き、リソソーム損傷により誘導される組織損傷を防ぐことを示している。
　ヒトの結晶性腎症において、この発見を検証するために、ヒトの対照腎と結晶性腎症の標本を比較した（それぞれｎ＝３）。すべての結晶性腎症患者の近位尿細管上皮細胞には、ＬＡＭＰ－１陽性リソソームと共局在するＧａｌ－３陽性斑点が含まれていたが、対照サンプルではそのような斑点は認められなかった（図４Ｂ（ｉｘ））。核ＴＦＥＢ染色は、結晶性腎症患者の近位尿細管上皮細胞の方が対照近位尿細管上皮細胞よりも低かったが（図４Ｂ（ｘ））、このことはＴＦＥＢ発現とヒト結晶性腎症の進行との間の明確な相関関係を示している。
　線維がリソソームを損傷し、過剰なα－シヌクレイン線維が細胞を破壊することが知られている。リソソームとＴＦＥＢにおける線維の影響を同定するために、我々は、ＷＴとＡＴＧ７ＫＯのＨｅｌａ細胞を最適量である１０μｇ／ｍｌのα－シヌクレインのモノマーおよび線維で処理した。８時間後、ＷＴ群において、繊維は、ガレクチン３（ｇａｌ－３）の斑点で示されるリソソーム損傷とＴＦＥＢの核移行を誘導した。しかしながら、ＡＴＧ７ＫＯ細胞では、ＴＦＥＢは核に移行しなかった。従って、ＡＴＧ共役系はα－シヌクレイン線維処理によるＴＦＥＢの核移行に必要である（図１２）。
　また、α－シヌクレインを発現するＨＬＨ－３０／ＴＦＥＢ変異体である線虫（ＳＨＵ１０ｘｔｍ１９７８）は、特に、成虫３日目（ＡＤ３）と４日目（ＡＤ４）において、ＳＨＵ１０　ＷＴバックグランドと比較して、非常に明るいａｌｆ－ｓｙｎ：：ＲＦＰを示した（図１３）。これはＨＬＨ－３０／ＴＦＥＢがａｌｆａ－ｓｙｎ：：ＲＦＰ凝集の発展を防止するのに不可欠であることを示唆する。
　以上説明したように、本発明によれば、リソソーム損傷を修復する活性を有する化合物を効率的に同定することが可能となる。リソソーム損傷は、結晶性腎症などの種々の疾患に関与していることから、本発明は、主として医薬開発に貢献しうるものである。
配列番号：２３、２４、３５~４０
＜２２３＞　プライマー
配列番号：２５~３４
＜２２３＞　ｇＲＮＡ

Claims (8)

  1. 　リソソーム損傷を修復する活性を有する化合物をスクリーニングする方法であって、
    （ａ）被検化合物を、ＡＴＧ３、ＡＴＧ５、ＡＴＧ７、ＡＴＧ８、ＡＴＧ１２、ＡＴＧ１６、およびそれらのホモログからなる群より選択される少なくとも１つのＡＴＧタンパク質を欠損した細胞に接触させる工程、
    （ｂ）当該細胞における転写因子ＥＢの活性化を検出する工程、および
    （ｃ）転写因子ＥＢを活性化する化合物を選択する工程、
    を含む方法。
  2. 　工程（ａ）において、上記細胞に対して、さらに、リソソームを損傷させる処理またはリソソームからカルシウムを放出させる処理を行う、請求項１に記載の方法。
  3. 　リソソーム損傷を修復する活性を有する化合物をスクリーニングする方法であって、
    （ａ）被検化合物を、ＡＴＧ３、ＡＴＧ５、ＡＴＧ７、ＡＴＧ８、ＡＴＧ１２、ＡＴＧ１６、およびそれらのホモログからなる群より選択される少なくとも１つのＡＴＧタンパク質を欠損した細胞および当該ＡＴＧタンパク質を欠損していない細胞に接触させる工程、
    （ｂ）両細胞における転写因子ＥＢの活性化を検出する工程、および
    （ｃ）当該ＡＴＧタンパク質を欠損していない細胞では転写因子ＥＢを活性化するが、当該ＡＴＧタンパク質を欠損した細胞では転写因子ＥＢを活性化しない化合物を選択する工程、
    を含む方法。
  4. 　リソソーム損傷を修復する活性を有する化合物をスクリーニングする方法であって、
    （ａ）被検化合物をＡＴＧ８またはそのホモログを欠損した細胞および当該ＡＴＧ８またはそのホモログを欠損していない細胞に接触させる工程、
    （ｂ）両細胞における転写因子ＥＢの活性化を検出する工程、
    （ｃ）当該ＡＴＧ８またはそのホモログを欠損していない細胞では転写因子ＥＢを活性化するが、当該ＡＴＧ８またはそのホモログを欠損した細胞では転写因子ＥＢを活性化しない化合物を選択する工程、
    （ｄ）選択した化合物が脂質化したＡＴＧ８またはそのホモログとＴＲＰＭＬ１との相互作用を促進するか否かを評価する工程、および
    （ｅ）当該相互作用を促進する化合物を選択する工程、
    を含む方法。
  5. 　ＡＴＧ３、ＡＴＧ５、ＡＴＧ７、ＡＴＧ８、ＡＴＧ１２、ＡＴＧ１６、およびそれらのホモログからなる群より選択される少なくとも１つのＡＴＧタンパク質に依存的に転写因子ＥＢを活性化する化合物を有効成分として含有する、リソソーム損傷を修復するための薬剤。
  6. 　ＡＴＧ３、ＡＴＧ５、ＡＴＧ７、ＡＴＧ８、ＡＴＧ１２、ＡＴＧ１６、およびそれらのホモログからなる群より選択される少なくとも１つのＡＴＧタンパク質に依存的に転写因子ＥＢを活性化する化合物を有効成分として含有する、リソソーム損傷に起因する疾患の予防または治療のための薬剤。
  7. 　リソソーム損傷に起因する疾患が、結晶性腎症、高尿酸血症、２型糖尿病、動脈硬化症、珪肺症、慢性肺疾患、神経変性疾患、および感染症からなる群より選択される、請求項６に記載の薬剤。
  8. 　ＡＴＧタンパク質がＡＴＧ８またはそのホモログであり、かつ、化合物が脂質化したＡＴＧ８またはそのホモログとＴＲＰＭＬ１との相互作用を促進する、請求項５～７のいずれかに記載の薬剤。
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KUMAR SURESH; JAIN ASHISH; CHOI SEONG WON; DA SILVA GUSTAVO PEIXOTO DUARTE; ALLERS LEE; MUDD MICHAL H.; PETERS RYAN SCOTT; ANONSEN: "Mammalian Atg8 proteins and the autophagy factor IRGM control mTOR and TFEB at a regulatory node critical for responses to pathogens", NATURE CELL BIOLOGY, NATURE PUBLISHING GROUP UK, LONDON, vol. 22, no. 8, 1 August 2020 (2020-08-01), London, pages 973 - 985, XP037210660, ISSN: 1465-7392, DOI: 10.1038/s41556-020-0549-1 *
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