KR20210096168A

KR20210096168A - 신경퇴행성 질환을 위한 유전자 요법

Info

Publication number: KR20210096168A
Application number: KR1020217019516A
Authority: KR
Inventors: 아사 아벨리오비치; 로라 헤크만; 헤르브 린
Original assignee: 프리베일 테라퓨틱스, 인크.
Priority date: 2018-11-28
Filing date: 2019-11-26
Publication date: 2021-08-04
Also published as: JP2022511453A; EP3887396A4; MX2021006253A; IL283496A; WO2020112802A1; AU2019388975A1; CN113557243A; EP3887396A1; US20220010001A1; BR112021010234A2; CA3121211A1

Abstract

본 개시내용은 일부 측면에서 신경퇴행성 질환, 예를 들어 알츠하이머병의 치료를 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 APOE 단백질 이소형 또는 이의 일부를 코딩하는 트랜스진, APOE 유전자 또는 이의 일부를 표적화하는 억제성 핵산, 또는 전술한 것들의 임의의 조합을 포함하는 발현 구축물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 발현 구축물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함으로써 알츠하이머병을 치료하는 방법을 제공한다.

Description

신경퇴행성 질환을 위한 유전자 요법

관련 출원

본 출원은 발명의 명칭이 "신경퇴행성 질환을 위한 유전자 요법"인 2018년 11월 28일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 62/772,230의 출원일의 35 U.S.C. 119(e) 하의 이익을 주장하며, 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

알츠하이머병 (AD)은 치매의 가장 흔한 형태이며, 미국에서만 5백만명 초과에 영향을 미친다. 알츠하이머병은 뉴런 기능을 억제하고 뉴런 간의 연결을 방해하고 궁극적으로 세포 사멸을 초래하는, 뇌 전체에 비정상적인 단백질 침착물의 존재를 특징으로 하는 비가역적인 진행성 뇌 장애이다. 이들 침착물은 아밀로이드-β의 플라크 및 인산화된-타우 단백질에 의해 형성된 엉킴을 포함한다. 경증 AD 환자는 기억 상실을 경험하며, 방황, 돈 다루기 어려움, 질문 반복, 성격 및 행동 변화로 이어진다. 중등도 AD 환자는 증가된 기억 상실을 나타내며, 친구 및 가족을 인식하는데 혼란 및 어려움, 새로운 것을 배우지 못함, 환각, 망상 및 편집증으로 이어진다. 중증 AD 환자는 의사소통을 할 수 없으며 돌봄을 위해 다른 사람에게 전적으로 의존한다. 궁극적으로, 단백질 플라크 및 엉킴이 뇌 전체에 퍼지며, 상당한 조직 수축으로 이어진다.

요약

대부분의 알츠하이머병 (AD) 환자는 대상체의 60대 중반에 증상이 나타나는 후기 발병 AD를 갖는다. 아포지질단백질 E (APOE) 유전자는 후기 발병 AD의 발병에 관여한다. APOE는 AD에 대해 보호적인 APOE2 및 후기 발병 AD의 발병에 대한 위험 증가와 연관된 APOE4를 포함하여 여러 이소형을 갖는다. 2개의 APOE4 카피를 보유한 동형접합 환자 (예를 들어, APOE4^+/+인 대상체)는 1개의 APOE4 카피 및 1개의 APOE2 또는 APOE3 카피를 보유한 이형접합 환자와 비교하여 후기 발병 AD를 발병할 위험이 훨씬 더 크다.

본 개시내용의 측면은 AD를 갖고 있거나 가질 것으로 의심되는 대상체를 치료하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 개시내용은 부분적으로 AD-연관 유전자 (예를 들어, APOE, 예컨대 APOE4)를 표적화하는 억제성 RNA (예를 들어, shRNA, miRNA, amiRNA 등)를 코딩하는 발현 구축물에 기초한다.

일부 측면에서, 본 개시내용은 APOE2 (또는 이의 일부) 및 임의로 AD-연관 유전자로부터의 하나 이상의 추가 유전자 생성물 (예를 들어, APOE4를 표적화하는 억제성 핵산)을 코딩하는 발현 구축물 (예를 들어, 벡터)에 기초한다. 어떠한 특정 이론에도 얽매이기를 원치 않지만, 본원에 기재된 유전자 생성물의 조합은 함께 (예를 들어, 상승작용적으로) 작용하여 대상체에서 발현될 때 AD의 하나 이상의 징후 및 증상을 감소시킨다.

따라서, 일부 측면에서, 본 개시내용은 APOE2 단백질을 코딩하는 발현 구축물을 포함하는 단리된 핵산을 제공하며, 여기서 단리된 핵산은 서열식별번호(SEQ ID NO): 4에 제시된 서열을 포함한다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 APOE4의 발현 또는 활성을 억제하는 억제성 핵산 및 APOE2를 발현하는 트랜스진을 코딩하는 발현 구축물을 포함하는 단리된 핵산을 제공한다. 일부 실시양태에서, 발현 구축물은 아데노-연관 바이러스 (AAV) 역위 말단 반복부 (ITR)에 의해 플랭킹된다. 일부 실시양태에서, ITR은 AAV2 ITR이다.

일부 실시양태에서, 억제성 핵산은 서열식별번호: 1에 제시된 서열의 적어도 6개의 인접 뉴클레오티드에 상보적이다. 일부 실시양태에서, 억제성 핵산은 서열식별번호: 5-8, 12-15 및 17-20 중 어느 하나에 제시된 핵산 서열을 포함하는 (또는 이에 의해 코딩되는) 억제성 RNA이다. 일부 실시양태에서, 억제성 핵산은 서열식별번호: 7, 8, 14, 15, 19 및 20 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함한다 (또는 이에 의해 코딩된다).

일부 실시양태에서, APOE2를 발현하는 트랜스진은 서열식별번호: 3에 제시된 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩한다. 일부 실시양태에서, APOE2를 발현하는 트랜스진은 코돈 최적화된 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, APOE2를 코딩하는 코돈-최적화된 핵산 서열은 서열식별번호: 4에 제시된다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 11, 16 및 21 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함하는 단리된 핵산을 제공한다.

일부 측면에서, 본 개시내용은 APOE2 단백질을 코딩하는 발현 구축물을 포함하는 단리된 핵산을 제공하며, 여기서 단리된 핵산은 서열식별번호: 4에 제시된 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 본 개시내용은 APOE4의 발현 또는 활성을 억제하는 억제성 핵산을 코딩하는 발현 구축물을 포함하는 단리된 핵산을 제공한다. 일부 실시양태에서, 발현 구축물은 아데노-연관 바이러스 (AAV) 역위 말단 반복부 (ITR)에 의해 플랭킹되고, 임의로 여기서 ITR은 AAV2 ITR이다.

일부 실시양태에서, 단리된 핵산은 하나 이상의 프로모터를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 치킨-베타 액틴 (CBA) 프로모터, CAG 프로모터, CD68 프로모터 또는 JeT 프로모터이다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용에 기재된 바와 같은 단리된 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 플라스미드이다. 일부 실시양태에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 재조합 AAV (rAAV) 벡터 또는 바큘로바이러스 벡터이다.

일부 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 단리된 핵산 또는 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 단리된 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.

일부 측면에서, 본 개시내용은 캡시드 단백질; 및 본원에 기재된 바와 같은 단리된 핵산 또는 벡터를 포함하는 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV)를 제공한다.

일부 실시양태에서, 캡시드 단백질은 혈액-뇌 장벽을 건널 수 있다. 일부 실시양태에서, 캡시드 단백질은 AAV9 캡시드 단백질 또는 AAVrh.10 캡시드 단백질이다. 일부 실시양태에서, rAAV는 중추 신경계 (CNS)의 뉴런 세포 및 비-뉴런 세포를 형질도입시킨다.

일부 측면에서, 본 개시내용은 본 개시내용에 기재된 바와 같은 단리된 핵산, 벡터, 조성물 또는 rAAV를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 알츠하이머병을 갖고 있거나 가질 것으로 의심되는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.

일부 실시양태에서, 투여는 대상체의 CNS로의 직접 주사를 포함한다. 일부 실시양태에서, 직접 주사는 대뇌내 주사, 뇌실질내 주사, 경막내 주사 또는 이들의 임의의 조합이다. 일부 실시양태에서, 대상체의 CNS로의 직접 주사는 대류 향상 전달 (CED)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 투여는 말초 주사를 포함한다. 일부 실시양태에서, 말초 주사는 정맥내 주사이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 APOE4 대립유전자에 대해 동형접합 (예를 들어, APOE4+/+)이다.

도 1은 APOE (예를 들어, APOE 전사체 변이체 4 ApoE4)를 표적화하는 억제성 RNA를 코딩하는 발현 구축물을 포함하는 rAAV 벡터를 포함하는 플라스미드의 한 실시양태를 묘사하는 개략도이다. 억제성 RNA는 H1 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
도 2는 APOE (예를 들어, APOE 전사체 변이체 4 ApoE4)를 표적화하는 억제성 RNA를 코딩하는 발현 구축물을 포함하는 rAAV 벡터를 포함하는 플라스미드의 한 실시양태를 묘사하는 개략도이다. 억제성 RNA는 인트론 내에 위치하고, 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된다.
도 3은 APOE (예를 들어, APOE 전사체 변이체 4 ApoE4)를 표적화하는 억제성 RNA를 코딩하는 발현 구축물을 포함하는 rAAV 벡터를 포함하는 플라스미드의 한 실시양태를 묘사하는 개략도이다. 억제성 RNA는 프로모터 서열 및 APOE2 단백질-코딩 서열 사이의 인트론 내에 위치된다.
도 4는 APOE (예를 들어, APOE 전사체 변이체 4 ApoE4)를 표적화하는 억제성 RNA를 코딩하는 발현 구축물을 포함하는 rAAV 벡터를 포함하는 플라스미드의 한 실시양태를 묘사하는 개략도이다. 억제성 RNA는 프로모터 서열 및 APOE2 단백질-코딩 서열 사이의 인트론 내에 위치된다.
도 5는 APOE (예를 들어, APOE 전사체 변이체 4 ApoE4)를 표적화하는 억제성 RNA를 코딩하는 발현 구축물을 포함하는 rAAV 벡터를 포함하는 플라스미드의 한 실시양태를 묘사하는 개략도이다. 억제성 RNA는 프로모터 서열 및 APOE2 단백질-코딩 서열 사이의 인트론 내에 위치된다.
도 6은 ITR의 "외부"에 위치된 "D" 영역을 포함하는 rAAV 벡터 (예를 들어, 트랜스진 삽입물 또는 발현 구축물에 대해 ITR의 말단의 근위에 있음) (상단) 및 벡터의 "내부"에 ITR을 갖는 야생형 rAAV 벡터 (예를 들어, 벡터의 트랜스진 삽입물의 근위에 있음)를 묘사하는 개략도이다.
도 7a 및 7b는 qRT-PCR에 의해 APOE4에 대한 상이한 shRNA, 및 코돈 최적화된 APOE2 코딩 서열을 운반하는 rAAV 벡터의 시험관내 검증을 보여준다. 도 7a는 여러 후보 벡터가 내인성 APOE 발현을 성공적으로 감소시켰음을 보여준다. 도 7b는 이들 벡터에 의해 발현된 shRNA가 코돈-최적화된 APOE2의 발현에 영향을 미치지 않음을 보여준다.
도 8은 APOE4 녹인 마우스를 사용하여 APOE4에 대한 상이한 shRNA, 및 코돈 최적화된 APOE2 코딩 서열을 운반하는 rAAV 벡터의 생체내 선택의 실험 설계를 묘사하는 개략도이다.

<상세한 설명>

본 개시내용은 부분적으로 대상체에서 AD-연관 유전자 생성물의 조합의 발현을 위한 조성물 및 방법에 기초한다. 유전자 생성물은 단백질, 단백질의 단편 (예를 들어, 일부), AD-연관 유전자를 억제하는 간섭 핵산 등일 수 있다. 일부 실시양태에서, 유전자 생성물은 AD-연관 유전자에 의해 코딩된 단백질 또는 단백질 단편이다. 일부 실시양태에서, 유전자 생성물은 AD-연관 유전자를 억제하는 간섭 핵산 (예를 들어, shRNA, siRNA, miRNA, amiRNA 등)이다.

AD-연관 유전자는 알츠하이머병 (AD)과 유전적으로, 생화학적으로 또는 기능적으로 연관된 유전자 생성물을 코딩하는 유전자를 지칭한다. 예를 들어, 적어도 1개의 APOE4 카피를 갖는 개체는 후기 발병 AD를 발병할 위험이 증가된다. 또 다른 예에서, APOE2는 AD의 마우스 모델에서 신경보호 효과를 나타낸다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "신경보호"는 신경보호의 부재하에 (예를 들어, 신경보호제 또는 단백질의 부재하에) 세포 또는 대상체에서 뉴런 구조 및/또는 기능의 보존과 비교하여 세포 또는 대상체에서 뉴런 구조 및/또는 기능의 보존을 지칭한다.

단리된 핵산 및 벡터

단리된 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있다. 일부 측면에서, 본 개시내용은 APOE4를 표적화하는 억제성 핵산 및/또는 APOE2 단백질 또는 이의 일부를 코딩하는 트랜스진을 코딩하는 발현 구축물을 포함하는 단리된 핵산을 제공한다.

일반적으로, 본원에 기재된 바와 같은 단리된 핵산은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 억제성 핵산 (예를 들어, dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA, amiRNA 등)을 코딩할 수 있다. 일부 실시양태에서, 단리된 핵산은 10개 초과의 억제성 핵산을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 억제성 핵산 각각은 상이한 유전자 또는 유전자의 일부를 표적화한다 (예를 들어, 제1 miRNA는 유전자의 제1 표적 서열을 표적화하고, 제2 miRNA는 제1 표적 서열과 상이한 유전자의 제2 표적 서열을 표적화함). 일부 실시양태에서, 하나 이상의 억제성 핵산 각각은 동일한 유전자의 동일한 표적 서열을 표적화한다 (예를 들어, 단리된 핵산은 동일한 miRNA의 다중 카피를 코딩함).

본 개시내용의 측면은 APOE4 단백질 (예를 들어, APOE 유전자의 이소형 E4)을 표적화하는 하나 이상의 간섭 핵산 (예를 들어, dsRNA, siRNA, miRNA, amiRNA 등)을 코딩하는 발현 구축물을 포함하는 단리된 핵산에 관한 것이다. APOE 단백질은 트리글리세리드-풍부 지질단백질의 이화작용에서 역할을 하는 지방 결합 단백질인 아포지질단백질 E를 지칭한다. APOE2, APOE3 및 APOE4라고 하는 APOE의 세 가지 주요 이소형이 있다. 이소형 각각은 두 위치, 아미노산 130 및 아미노산 176에서 다른 것과 상이하다 (또한 단백질의 신호 펩티드가 배제된 경우 각각 위치 112 및 158이라고 함). APOE2는 Cys130/Cys176을 함유하고, 타입 III 고지질단백혈증 및 다른 질환과 연관된 것으로 관찰되었지만, 또한 신경보호 역할을 한다. APOE3은 Cys130/Arg176을 함유하고, 가장 흔한 APOE 대립유전자이다. APOE4는 Arg130/Arg176을 함유하고, 후기 발병 알츠하이머병, 죽상동맥경화증, 외상성 뇌 손상 (TBI) 및 다른 질환의 불리한 결과와 연관된 것으로 관찰되었다. 인간에서, APOE 유전자는 염색체 19에 위치된다. 일부 실시양태에서, APOE4는 서열식별번호: 1에 제시된 핵산 서열 (예를 들어, NCBI 참조 서열 번호 NM_001302690.1)에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, APOE2는 서열식별번호: 2에 제시된 핵산 서열 (예를 들어, NCBI 참조 서열 번호 NM_000041.3)에 의해 코딩된다.

APOE 유전자 (예를 들어, APOE4)를 표적화하는 억제성 핵산은 6 내지 50개 뉴클레오티드 길이인 상보성 영역 (예를 들어, 표적 유전자, 예를 들어 APOE4를 코딩하는 유전자에 혼성화하는 억제성 핵산 영역)을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 억제성 핵산은 약 6 내지 30개, 약 8 내지 20개, 또는 약 10 내지 19개의 뉴클레오티드 길이인 APOE와 상보성 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 억제성 핵산은 APOE 서열의 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개의 인접 뉴클레오티드와 상보적이다. 일부 실시양태에서, APOE 유전자를 표적화하는 억제성 핵산은 비-대립유전자-특이적이다 (예를 들어, 억제성 핵산은 APOE 유전자의 모든 이소형을 침묵시킴). 일부 실시양태에서, 억제성 핵산은 APOE의 하나 이상의 특이적 대립유전자, 예를 들어 APOE2, APOE3 및/또는 APOE4 중 하나 이상을 표적화한다.

일부 실시양태에서, 유전자 생성물 (예를 들어, APOE2를 코딩하는 트랜스진)은 자연 발생 유전자의 코딩 부분 (예를 들어, cDNA)에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 유전자 생성물은 APOE 유전자의 APOE2 이소형에 의해 코딩된 단백질 (또는 이의 단편)이다. 일부 실시양태에서, APOE2 유전자는 서열식별번호: 3에 제시된 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 유전자 생성물은 AD-연관 유전자 (예를 들어, APOE 유전자의 APOE4 이소형)를 표적화하는 (예를 들어, 혼성화하거나 이와 상보성 영역을 포함하는) 억제성 핵산이다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 제1 유전자 생성물 (예를 들어, APOE2) 및 제2 유전자 생성물 (예를 들어, APOE 유전자의 APOE4 이소형을 표적화하는 억제성 RNA)의 발현 순서가 일반적으로 역전될 수 있음을 인식한다 (예를 들어, 억제성 RNA가 제1 유전자 생성물이고, APOE2가 제2 유전자 생성물임). 일부 실시양태에서, 유전자 생성물은 APOE 유전자의 단편 (예를 들어, 일부)이다. 단백질 단편은 APOE 유전자에 의해 코딩된 단백질의 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90% 또는 약 99%를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 단백질 단편은 서열식별번호: 3에 제시된 아미노산 서열을 갖는 단백질의 50% 내지 99.9% (예를 들어, 50% 내지 99.9%의 임의의 값)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 유전자 생성물 (예를 들어, 억제성 RNA)은 표적 유전자의 일부에 혼성화한다 (예를 들어, 표적 유전자, 예를 들어 APOE의 APOE4 이소형, 예컨대 서열식별번호: 1에 제시된 서열의 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21개 이상의 인접 뉴클레오티드에 상보적임).

일부 실시양태에서, 발현 구축물은 모노시스트론이다 (예를 들어, 발현 구축물은 제1 유전자 생성물 및 제2 유전자 생성물을 포함하는 단일 융합 단백질을 코딩함). 일부 실시양태에서, 발현 구축물은 폴리시스트론이다 (예를 들어, 발현 구축물은 2개의 별개의 유전자 생성물, 예를 들어 2개의 상이한 단백질 또는 단백질 단편을 코딩함).

폴리시스트론 발현 벡터는 하나 이상 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5개 이상)의 프로모터를 포함할 수 있다. 임의의 적합한 프로모터, 예를 들어 구성적 프로모터, 유도성 프로모터, 내인성 프로모터, 조직-특이적 프로모터 (예를 들어, CNS-특이적 프로모터) 등이 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 치킨 베타-액틴 프로모터 (CBA 프로모터), CAG 프로모터 (예를 들어 문헌 [Alexopoulou et al. (2008) BMC Cell Biol. 9:2; doi: 10.1186/1471-2121-9-2]에 기재된 바와 같음), CD68 프로모터 또는 JeT 프로모터 (예를 들어 문헌 [Tornøe et al. (2002) Gene 297(1-2):21-32]에 기재된 바와 같음)이다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 제1 유전자 생성물, 제2 유전자 생성물, 또는 제1 유전자 생성물 및 제2 유전자 생성물을 코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 발현 카세트는 전사 인자 결합 서열, 인트론 스플라이스 부위, 폴리(A) 첨가 부위, 인핸서 서열, 레프레서 결합 부위 또는 전술한 것들의 임의의 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않는 하나 이상의 추가 조절성 서열을 포함한다.

일부 실시양태에서, 제1 유전자 생성물을 코딩하는 핵산 서열 및 제2 유전자 생성물을 코딩하는 핵산 서열은 내부 리보솜 진입 부위 (IRES)를 코딩하는 핵산 서열에 의해 분리된다. IRES 부위의 예는 예를 들어, 문헌 [Mokrejs et al. (2006) Nucleic Acids Res. 34(Database issue):D125-30]에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 제1 유전자 생성물을 코딩하는 핵산 서열 및 제2 유전자 생성물을 코딩하는 핵산 서열은 자기-절단 펩티드를 코딩하는 핵산 서열에 의해 분리된다. 자기-절단 펩티드의 예는 T2A, P2A, E2A, F2A, BmCPV 2A, 및 BmIFV 2A, 및 문헌 [Liu et al. (2017) Sci Rep. 7: 2193]에 기재된 것들을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 자기-절단 펩티드는 T2A 펩티드이다.

일부 실시양태에서, 장애, 예컨대 AD는 적어도 1개의 APOE4 카피의 발현과 연관된다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 단리된 핵산은 APOE4 (예를 들어, APOE)의 발현을 감소 또는 방지하는 억제성 핵산을 포함한다. 억제성 핵산을 코딩하는 서열은 발현 벡터의 번역되지 않은 영역 (예를 들어, 인트론, 5'UTR, 3'UTR 등)에 배치될 수 있다.

일부 실시양태에서, 억제성 핵산은 발현 구축물의 인트론, 예를 들어 제1 유전자 생성물을 코딩하는 서열의 상류에 있는 인트론에 위치된다. 억제성 핵산은 이중 가닥 RNA (dsRNA), shRNA, siRNA, 마이크로 RNA (miRNA), 인공 miRNA (amiRNA), 또는 RNA 앱타머일 수 있다. 일반적으로, 억제성 핵산은 표적 RNA (예를 들어, mRNA)의 약 6 내지 약 30 (예를 들어, 6 내지 30을 포함하는 임의의 정수)개의 인접 뉴클레오티드에 결합 (예를 들어, 혼성화)한다. 일부 실시양태에서, 억제성 핵산 분자는 miRNA 또는 amiRNA, 예를 들어 APOE의 APOE4 이소형 (APOE4 단백질을 코딩하는 유전자)을 표적화하는 miRNA이다. 일부 실시양태에서, miRNA는 혼성화하는 APOE mRNA의 영역과의 어떠한 미스매치도 포함하지 않는다 (예를 들어, miRNA는 "완벽"함). 일부 실시양태에서, 억제성 핵산은 shRNA (예를 들어, APOE를 표적화하는 shRNA), 예를 들어 서열식별번호: 7, 14 및 19 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 것이다. 일부 실시양태에서, miRNA는 혼성화하는 APOE mRNA의 영역과의 적어도 하나 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상)의 미스매치를 포함한다.

일부 실시양태에서, 억제성 핵산은 인공 마이크로RNA (amiRNA)이다. 마이크로RNA (miRNA)는 전형적으로 식물 및 동물에서 발견되는 작은 비-코딩 RNA를 지칭하며, 유전자 발현의 전사 및 번역후 조절에서 기능한다. miRNA는 RNA 폴리머라제에 의해 전사되어 pri-miRNA라고 하는 헤어핀-루프 구조를 형성하며, 이는 후속적으로 효소 (예를 들어, 드로샤, 파샤, 스플라이소솜 등)에 의해 프로세싱된 후, pre-miRNA 헤어핀 구조는 다이서에 의해 프로세싱되어, miRNA/miRNA* 듀플렉스 (여기서, *는 miRNA 듀플렉스의 패신저 가닥을 나타냄)를 형성한 후, 그 중 한 가닥은 RNA-유도 침묵 복합체 (RISC)에 혼입된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 억제성 RNA는 APOE의 APOE4 이소형을 표적화하는 miRNA (APOE4 단백질을 코딩하는 유전자)이다.

일부 실시양태에서, APOE (예를 들어, APOE의 APOE4 이소형)를 표적화하는 억제성 핵산은 miRNA/miRNA* 듀플렉스를 포함한다. 일부 실시양태에서, miRNA/miRNA* 듀플렉스의 miRNA 가닥은 서열식별번호: 5, 6, 12, 13, 17 및 18 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시양태에서, miRNA/miRNA* 듀플렉스의 miRNA* 가닥은 서열식별번호: 5, 6, 12, 13, 17 및 18 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.

인공 마이크로RNA (amiRNA)는 천연 miRNA를 변형시켜 pre-mRNA의 자연적 표적화 영역을 관심 표적화 영역으로 대체함으로써 유래된다. 예를 들어, 자연 발생 발현된 miRNA는 스캐폴드 또는 백본 (예를 들어, pri-miRNA 스캐폴드)으로서 사용될 수 있으며, 줄기 서열은 관심 유전자를 표적화하는 miRNA의 것으로 대체된다. 인공 전구체 마이크로RNA (pre-amiRNA)는 일반적으로 하나의 단일 안정한 작은 RNA가 우선적으로 생성되도록 프로세싱된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 rAAV 벡터 및 rAAV는 amiRNA를 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, amiRNA의 pri-miRNA 스캐폴드는 pri-MIR-21, pri-MIR-22, pri-MIR-26a, pri-MIR-30a, pri-MIR-33, pri-MIR-122, pri-MIR-375, pri-MIR-199, pri-MIR-99, pri-MIR-194, pri-MIR-155 및 pri-MIR-451로 이루어진 군으로부터 선택된 pri-miRNA로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, amiRNA는 APOE (예를 들어, APOE의 APOE4 이소형)를 표적화하는 핵산 서열 및 eSIBR amiRNA 스캐폴드 (예를 들어 문헌 [Fowler et al. Nucleic Acids Res. 2016 Mar 18; 44(5): e48]에 기재된 바와 같음)를 포함한다.

일부 실시양태에서, APOE (예를 들어, APOE의 APOE4 이소형)를 표적화하는 amiRNA는 서열식별번호: 8, 15 및 20 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.

본원에 기재된 바와 같은 단리된 핵산은 그 자체로 또는 벡터의 일부로 존재할 수 있다. 일반적으로, 벡터는 플라스미드, 코스미드, 파지미드, 박테리아 인공 염색체 (BAC), 또는 바이러스 벡터 (예를 들어, 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터, 레트로바이러스 벡터, 바큘로바이러스 벡터 등)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 벡터는 플라스미드 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 단리된 핵산을 포함하는 플라스미드)이다. 일부 실시양태에서, 벡터는 재조합 AAV (rAAV) 벡터이다. rAAV는 rAAV 벡터의 "플러스 가닥" 또는 "마이너스 가닥"을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, rAAV 벡터는 단일-가닥 (예를 들어, 단일-가닥 DNA)이다. 일부 실시양태에서, 벡터는 바큘로바이러스 벡터 (예를 들어, 오토그라파 캘리포니카(Autographa californica) 핵 다면체형성 (AcNPV) 벡터)이다.

전형적으로 rAAV 벡터는 2개의 AAV 역위 말단 반복부 (ITR) 서열에 의해 플랭킹된 트랜스진 (예를 들어, 프로모터, 인트론, 인핸서 서열, 단백질 코딩 서열, 억제성 RNA 코딩 서열, 폴리A 테일 서열 등 중 하나 이상을 각각 포함하는 발현 구축물)을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 벡터의 트랜스진은 본 개시내용에 기재된 바와 같은 단리된 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 벡터의 2개의 ITR 서열 각각은 전장 ITR (예를 들어, 대략 145 bp 길이이고, 기능적 Rep 결합 부위 (RBS) 및 말단 분해 부위 (trs)를 함유함)이다. 일부 실시양태에서, rAAV 벡터의 ITR 중 하나는 말단절단된다 (예를 들어, 단축되거나 전장이 아님). 일부 실시양태에서, 말단절단된 ITR은 기능적 말단 분해 부위 (trs)가 결여되고, 자기-상보적 AAV 벡터 (scAAV 벡터)의 생산에 사용된다. 일부 실시양태에서, 말단절단된 ITR은 ΔITR, 예를 들어 문헌 [McCarty et al. (2003) Gene Ther. 10(26):2112-8]에 기재된 바와 같은 것이다.

본 개시내용의 측면은 야생형 AAV ITR에 비해, 예를 들어 야생형 AAV2 ITR (예를 들어, 서열식별번호: 25)에 비해 하나 이상의 변형 (예를 들어, 핵산 첨가, 결실, 치환 등)을 갖는 ITR을 포함하는 단리된 핵산 (예를 들어, rAAV 벡터)에 관한 것이다. 야생형 AAV2 ITR의 구조는 도 6에 나타낸다. 일반적으로, 야생형 ITR은 자기-어닐링하여 2개의 교차 아암 (각각 B/B' 및 C/C'라고 하는 서열에 의해 형성됨), 더 긴 줄기 영역 (서열 A/A'에 의해 형성됨), 및 "D" 영역이라고 하는 단일-가닥 말단 영역으로 이루어진 회문 이중-가닥 T자형 헤어핀 구조를 형성하는 125개 뉴클레오티드 영역을 포함한다. (도 6). 일반적으로, ITR의 "D" 영역은 A/A' 서열에 의해 형성된 줄기 영역 및 rAAV 벡터의 트랜스진을 함유하는 삽입물 사이에 위치된다 (예를 들어, ITR의 말단에 비해 ITR의 "내부"에 위치되거나 rAAV 벡터의 트랜스진 삽입물 또는 발현 구축물의 근위에 있음). 일부 실시양태에서, "D" 영역은 서열식별번호: 23에 제시된 서열을 포함한다. "D" 영역은 예를 들어 문헌 [Ling et al. (2015) J Mol Genet Med 9(3)]에 개시된 바와 같이 캡시드 단백질에 의한 rAAV 벡터의 캡시드화에 중요한 역할을 하는 것으로 관찰되었다.

본 개시내용은 부분적으로 ITR의 "외부"에 위치된 "D" 영역을 포함하는 rAAV 벡터 (예를 들어, 트랜스진 삽입물 또는 발현 구축물에 비해 ITR의 말단의 근위에 있음)가 변형되지 않은 (예를 들어, 야생형) ITR을 갖는 ITR을 갖는 rAAV 벡터보다 AAV 캡시드 단백질에 의해 효율적으로 캡시드화된다는 놀라운 발견에 기초한다. 일부 실시양태에서, 변형된 "D" 서열 (예를 들어, "외부" 위치의 "D" 서열)을 갖는 rAAV 벡터는 야생형 ITR 서열을 갖는 rAAV 벡터에 비해 감소된 독성을 갖는다.

일부 실시양태에서, 변형된 "D" 서열은 야생형 "D" 서열 (예를 들어, 서열식별번호: 23)에 비해 적어도 하나의 뉴클레오티드 치환을 포함한다. 변형된 "D" 서열은 야생형 "D" 서열 (예를 들어, 서열식별번호: 23)에 비해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 10개 초과의 뉴클레오티드 치환을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 "D" 서열은 야생형 "D" 서열 (예를 들어, 서열식별번호: 23)에 비해 적어도 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 또는 19개의 핵산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 "D" 서열은 야생형 "D" 서열 (예를 들어, 서열식별번호: 23)과 약 10% 내지 약 99% (예를 들어, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%) 동일하다. 일부 실시양태에서, 변형된 "D" 서열은 서열식별번호: 22에 제시된 서열 (또한 문헌 [Wang et al. (1995) J Mol Biol 250(5):573-80]에 기재된 바와 같은 "S" 서열이라고 함)을 포함한다.

본 개시내용에 기재된 바와 같은 단리된 핵산 또는 rAAV 벡터는 예를 들어 문헌 [Francois, et al. 2005. J Virol The Cellular TATA Binding Protein Is Required for Rep-Dependent Replication of a Minimal Adeno-Associated Virus Type 2 p5 Element]에 기재된 바와 같이 서열식별번호: 24에 제시된 바와 같은 "TRY" 서열을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, TRY 서열은 단리된 핵산 또는 rAAV 벡터의 ITR (예를 들어, 5' ITR) 및 발현 구축물 (예를 들어, 트랜스진-코딩 삽입물) 사이에 위치된다.

일부 측면에서, 본 개시내용은 본 개시내용에 기재된 바와 같은 단리된 핵산 또는 rAAV 벡터를 포함하는 바큘로바이러스 벡터에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 바큘로바이러스 벡터는 오토그라파 캘리포니카 핵 다면체형성 (AcNPV) 벡터, 예를 들어 문헌 [Urabe et al. (2002) Hum Gene Ther 13(16):1935-43] 및 [Smith et al. (2009) Mol Ther 17(11):1888-1896]에 기재된 바와 같은 것이다.

일부 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 단리된 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 숙주 세포는 원핵생물 세포 또는 진핵생물 세포일 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포는 포유동물 세포, 박테리아 세포, 효모 세포, 곤충 세포 등일 수 있다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 포유동물 세포, 예를 들어 HEK293T 세포이다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 박테리아 세포, 예를 들어 이. 콜라이(E. coli) 세포이다.

rAAV

일부 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 핵산을 코딩하는 트랜스진을 포함하는 재조합 AAV (rAAV) (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 rAAV 벡터)에 관한 것이다. 용어 "rAAV"는 일반적으로 하나 이상의 AAV 캡시드 단백질에 의해 캡시드화된 rAAV 벡터를 포함하는 바이러스 입자에 관한 것이다. 본 개시내용에 기재된 rAAV는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 및 AAV10으로부터 선택된 혈청형을 갖는 캡시드 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, rAAV는 비-인간 숙주로부터의 캡시드 단백질, 예를 들어 레서스 AAV 캡시드 단백질, 예컨대 AAVrh.10, AAVrh.39 등을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용에 기재된 rAAV는 야생형 캡시드 단백질의 변이체, 예컨대 유래된 야생형 AAV 캡시드 단백질에 비해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 10개 초과 (예를 들어, 15, 20, 25, 50, 100개 등)의 아미노산 치환 (예를 들어, 돌연변이)을 포함하는 캡시드 단백질 변이체인 캡시드 단백질을 포함한다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용에 기재된 rAAV는 특히 CSF 공간으로 또는 뇌 실질로 직접 도입될 때 CNS를 통해 쉽게 확산된다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 개시내용에 기재된 rAAV는 혈액-뇌 장벽 (BBB)을 건널 수 있는 캡시드 단백질을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, rAAV는 AAV9 또는 AAVrh.10 혈청형을 갖는 캡시드 단백질을 포함한다. rAAV의 생산은 예를 들어, 문헌 [Samulski et al. (1989) J Virol. 63(9):3822-8] 및 [Wright (2009) Hum Gene Ther. 20(7): 698-706]에 기재되어 있다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용에 기재된 바와 같은 rAAV (예를 들어, rAAV 캡시드 입자를 형성하기 위해 AAV 캡시드 단백질에 의해 캡시드화된 재조합 rAAV 게놈을 포함함)는 바큘로바이러스 벡터 발현 시스템 (BEVS)에서 생산된다. BEVS를 사용한 rAAV의 생산은 예를 들어 문헌 [Urabe et al. (2002) Hum Gene Ther 13(16):1935-43], [Smith et al. (2009) Mol Ther 17(11):1888-1896], 미국 특허 번호 8,945,918, 미국 특허 번호 9,879,282, 및 국제 PCT 공개 WO 2017/184879에 기재되어 있다. 그러나, rAAV는 임의의 적합한 방법 (예를 들어, 재조합 rep 및 cap 유전자 사용)을 사용하여 생산될 수 있다.

제약 조성물

일부 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 단리된 핵산 또는 rAAV 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "제약상 허용되는"은 화합물의 생물학적 활성 또는 특성을 제거하지 않고 상대적으로 독성이 없는 물질, 예컨대 담체 또는 희석제를 지칭하며, 예를 들어 물질은 바람직하지 않은 생물학적 효과를 유발하지 않거나 그것이 함유된 조성물의 임의의 구성성분과 유해한 방식으로 상호작용하지 않고 개체에게 투여될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "제약상 허용되는 담체"는 본 발명 내에서 유용한 화합물을 의도된 기능을 수행할 수 있도록 환자 내에서 또는 환자에게 운반 또는 수송하는데 관여하는, 제약상 허용되는 물질, 조성물 또는 담체, 예컨대 액체 또는 고체 충전제, 안정화제, 분산제, 현탁화제, 희석제, 부형제, 증점제, 용매 또는 캡슐화 물질을 의미한다. 본 발명의 실시에 사용되는 제약 조성물에 포함될 수 있는 추가 성분은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences (Genaro, Ed., Mack Publishing Co., 1985, Easton, PA)]에 기재되어 있으며, 이는 본원에 참조로 포함된다.

본원에 제공된 조성물 (예를 들어, 제약 조성물)은 장내 (예를 들어, 경구), 비경구, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 피하, 뇌실내, 경피, 피내, 직장, 질내, 복강내, 국소 (산제, 연고제, 크림제 및/또는 점안제에 의해), 점막, 비강, 협측, 설하를 포함하는 임의의 경로에 의해; 기관내 점적주입, 기관지 점적주입 및/또는 흡입에 의해; 및/또는 구강 스프레이, 비강 스프레이 및/또는 에어로졸로서 투여될 수 있다. 구체적으로 고려되는 경로는 경구 투여, 정맥내 투여 (예를 들어, 전신 정맥내 주사), 혈액 및/또는 림프 공급을 통한 국소 투여, 및/또는 영향받은 부위로의 직접 투여이다. 일반적으로, 가장 적절한 투여 경로는 작용제의 성질 (예를 들어, 위장관 환경에서의 안정성), 및/또는 대상체의 상태 (예를 들어, 대상체가 경구 투여를 견딜 수 있는지 여부)를 포함한 다양한 인자에 따라 달라질 것이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 화합물 또는 제약 조성물은 대상체의 눈에 국소 투여하기에 적합하다.

방법

본 개시내용은 부분적으로 알츠하이머병을 치료하기 위해 함께 (예를 들어, 상승작용적으로) 작용하는 대상체에서 AD-연관 유전자 생성물의 조합의 발현을 위한 조성물에 기초한다. 본원에 사용된 바와 같은 "치료하다" 또는 "치료하는"은 (a) 알츠하이머병의 발병을 예방 또는 지연시키는 것; (b) 알츠하이머병의 중증도를 감소시키는 것; (c) 알츠하이머병의 특징적인 증상의 발달을 감소 또는 예방하는 것; (d) 및/또는 알츠하이머병의 특징적인 증상의 악화를 방지하는 것을 지칭한다. 알츠하이머병의 증상은 예를 들어, 인지 기능장애 (예를 들어, 치매, 환각, 기억 상실 등), 운동 기능장애 (예를 들어, 일상 업무 수행의 어려움 등), 및 정서 및 행동 기능장애를 포함한다.

따라서, 일부 측면에서, 본 개시내용은 본 개시내용에 기재된 바와 같은 조성물 (예를 들어, 단리된 핵산 또는 벡터 또는 rAAV를 포함하는 조성물)을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 알츠하이머병을 갖고 있거나 가질 것으로 의심되는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.

대상체는 전형적으로 포유동물, 예를 들어 인간, 개, 고양이, 돼지, 햄스터, 래트, 마우스 등이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 APOE4 대립유전자를 특징으로 한다. 대상체는 APOE4에 대해 동형접합 (예를 들어, APOE4^+/+) 또는 이형접합일 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 APOE4에 대해 이형접합이고, 대상체의 제2 APOE 대립유전자는 APOE2 및 APOE3으로부터 선택된다.

일부 실시양태에서, 조성물은 대상체의 CNS로의 직접 주사, 예를 들어 대상체의 뇌 및/또는 척수로의 직접 주사에 의해 투여된다. CNS-직접 투여 방식의 예는 대뇌내 주사, 뇌실내 주사, 수조내 주사, 뇌실질내 주사, 경막내 주사, 및 전술한 것들의 임의의 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 대상체의 CNS로의 직접 주사는 대상체의 중간뇌, 선조체 및/또는 대뇌 피질에서 트랜스진 발현 (예를 들어, 제1 유전자 생성물, 제2 유전자 생성물 및 적용가능한 경우 제3 유전자 생성물의 발현)을 초래한다. 일부 실시양태에서, CNS로의 직접 주사는 대상체의 척수 및/또는 CSF에서 트랜스진 발현 (예를 들어, 제1 유전자 생성물, 제2 유전자 생성물 및 적용가능한 경우 제3 유전자 생성물의 발현)을 초래한다.

일부 실시양태에서, 대상체의 CNS로의 직접 주사는 대류 향상 전달 (CED)을 포함한다. 대류 향상 전달은 뇌의 외과적 노출 및 뇌의 표적 구역으로의 직접 작은-직경 카테터의 배치, 그 후 대상체의 뇌로의 치료제 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 조성물 또는 rAAV)의 직접 주입을 포함하는 치료 전략이다. CED는 예를 들어 문헌 [Debinski et al. (2009) Expert Rev Neurother. 9(10):1519-27]에 기재되어 있다.

일부 실시양태에서, 조성물은 예를 들어 말초 주사에 의해 대상체에게 말초로 투여된다. 말초 주사의 예는 피하 주사, 정맥내 주사, 동맥내 주사, 복강내 주사, 또는 전술한 것들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 말초 주사는 동맥내 주사, 예를 들어 대상체의 경동맥으로의 주사이다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용에 기재된 바와 같은 조성물 (예를 들어, 단리된 핵산 또는 벡터 또는 rAAV를 포함하는 조성물)은 말초로 및 대상체의 CNS에 직접 둘 모두로 투여된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 조성물은 대상체에게 동맥내 주사 (예를 들어, 경동맥으로의 주사) 및 뇌실질내 주사 (예를 들어, CED에 의한 뇌실질내 주사)에 의해 투여된다. 일부 실시양태에서, CNS로의 직접 주사 및 말초 주사는 동시적이다 (예를 들어, 동시에 발생함). 일부 실시양태에서, 직접 주사는 말초 주사 전에 (예를 들어, 1분 내지 1주 전에, 또는 그 이전에) 발생한다. 일부 실시양태에서, 직접 주사는 말초 주사 후에 (예를 들어, 1분 내지 1주 후에, 또는 그 이후에) 발생한다.

대상체에게 투여되는 본 개시내용에 기재된 바와 같은 조성물 (예를 들어, 단리된 핵산 또는 벡터 또는 rAAV를 포함하는 조성물)의 양은 투여 방법에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 rAAV는 약 10⁹ 게놈 카피 (GC)/kg 내지 약 10¹⁴ GC/kg (예를 들어, 약 10⁹ GC/kg, 약 10¹⁰ GC/kg, 약 10¹¹ GC/kg, 약 10¹² GC/kg, 약 10¹² GC/kg, 또는 약 10¹⁴ GC/kg)의 역가로 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 대상체는 CSF 공간으로의 주사에 의해 또는 뇌실질내 주사에 의해 높은 역가 (예를 들어, >10¹² 게놈 카피 GC/rAAV kg)로 투여된다.

본 개시내용에 기재된 바와 같은 조성물 (예를 들어, 단리된 핵산 또는 벡터 또는 rAAV를 포함하는 조성물)은 1회 또는 수회 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20회 이상) 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 예를 들어 주입 펌프를 통해 연속적으로 (예를 들어, 만성적으로) 대상체에게 투여된다.

실시예

실시예 1: 핵산 및 rAAV 벡터

본 실시예는 APOE4를 표적화하는 억제성 핵산 및/또는 APOE2 단백질 또는 이의 일부를 코딩하는 트랜스진을 포함하는 단리된 핵산 (예를 들어, 벡터, 예컨대 rAAV 벡터 및 단리된 핵산을 함유하는 rAAV)을 설명한다. 일부 실시양태에서, 본 실시예에 기재된 구축물은 적어도 1개의 APOE4 이소형 카피를 갖는 알츠하이머병을 갖고 있거나 가질 것으로 의심되는 대상체 (AD)를 치료하는데 유용하다. 일부 실시양태에서, 대상체는 APOE4 이소형에 대해 동형접합 (예를 들어, APO44^+/+)이다.

shRNA를 코딩하는 단리된 핵산은 구체적으로 시험관내 및 생체내 모두에서 APOE4 이소형의 발현을 녹다운하는데 사용된다. 일부 실시양태에서, shRNA는 비-대립유전자-특이적이고, 예를 들어 이들은 또한 다른 APOE 이소형 (예를 들어, E2, E3 또는 E4)의 발현을 녹다운할 수 있다.

APOE2-코딩 트랜스진을 코딩하는 단리된 핵산은 APOE2를 과발현하는데 사용된다. APOE2 트랜스진은 이소형에 관계없이 야생형 APOE를 표적화하는 shRNA에 의해 인식되지 않도록 세포에서 내인성 APOE2 서열과 충분히 상이하도록 코돈-최적화된다.

shRNA 및 트랜스진은 동일한 또는 별도의 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. shRNA는 별도의 프로모터, 전형적으로 Pol III 프로모터 (예를 들어, H1 프로모터), 또는 Pol II 프로모터 (예를 들어, CBA, T7 등) 하에 발현된다. 일반적으로, shRNA는 코돈-최적화된 APOE2 트랜스진을 포함하는 오픈 리딩 프레임의 상류에 있는 인트론 서열에 배치된 Pol II 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 본 개시내용에 기재된 발현 구축물의 예는 도 1-5 및 하기 표 1에 나타낸다.

단리된 핵산을 포함하는 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV)는 삼중-플라스미드 형질감염을 위한 세포, 예컨대 HEK293 세포를 사용하여 생성된다. ITR 서열은 전형적으로 하기 중 하나 이상을 포함하는 발현 구축물을 플랭킹한다: 적어도 하나의 프로모터/인핸서 요소, 3' 폴리A 신호, 및 번역후 신호, 예컨대 WPRE 요소. 다중 유전자 생성물, 예컨대 APOE의 APOE2 이소형 및 하나 이상의 억제성 핵산 (예를 들어, APOE의 APOE4 이소형을 표적화하는 억제성 핵산)은 동시에 발현된다. 발현된 유전자의 상류에서 효율적으로 스플라이싱되는 짧은 인트론 서열의 존재는 발현 수준을 개선시킬 수 있다. shRNA 및 다른 조절성 RNA는 잠재적으로 이들 서열 내에 포함될 수 있다.

<표 1>

실시예 2: APOE4^+/+ 세포로의 바이러스 형질도입의 세포 기반 검정

세포를, 예를 들어 AD 환자로부터의 섬유모세포, 단핵구, 또는 hES 세포, 또는 환자-유래 유도된 만능 줄기 세포 (iPSC)로 수득하였다. 이들 세포는 아밀로이드-β 단백질을 포함하는 단백질성 플라크 및 단백질 타우의 꼬인 가닥을 포함하는 엉킴을 축적한다.

이러한 세포 모델을 사용하여, AD와 연관된 신경퇴행성 특징을, 예를 들어 α-아밀로이드-β 항체 또는 α-포스포-타우 항체를 사용하여 단백질 응집체, 예컨대 플라크 및 엉킴의 축적의 면에서 정량화한 후, 형광 현미경검사를 사용하여 영상화하였다. 단백질 마커, 예컨대 아밀로이드-β, 포스포-타우, 또는 APOE4에 대한 ICC에 의한 AD와 연관된 신경퇴행성 특징에 대한 영상화를 또한 수행하였다. 웨스턴 블롯팅, ELISA 및/또는 qPCR을 사용하여 이들 세포에서 APOE4 발현 수준을 정량화하였다.

치료 종점 (예를 들어, AD-연관 병리의 감소)을 rAAV의 형질도입의 발현의 맥락에서 측정하여, 활성 및 기능을 확인하고 정량화하였다. 아밀로이드-β 및 포스포-타우의 수준을 또한 웨스턴 블롯팅, ELISA 및/또는 qPCR을 사용하여 정량화하였다.

실시예 3: 인간 APOE4를 발현하는 마우스를 사용한 생체내 검정

본 실시예는 돌연변이체 마우스를 사용한 rAAV의 생체내 검정을 설명한다. 돌연변이체 마우스에서 상기와 같은 rAAV의 생체내 연구를, 예를 들어 문헌 [Liao et al. (2018) J. Clin. Invest 128(5): 2144-2155]; [Rosenberg, et al. (2018) Hum Gene Ther Clin Dev 29(1): 24-47]; [Zhao et al. (2016) Neurobiol Aging 44: 159-172]에 기재된 검정을 사용하여 수행하였다. 이들 돌연변이체 마우스는 뮤린 APOE 유전자좌에 인간 APOE4 이소형을 보유하였다.

농축된 rAAV 스톡을 예를 들어 5-10 μL의 주사 부피로 사용하여 비히클 대조군 및 rAAV의 경막내 또는 뇌실내 전달 (예를 들어, 2×10¹¹ vg/마우스의 용량으로)을 수행하였다. 대류 향상 전달에 의한 뇌실질내 전달을 수행하였다.

증상 발병 전에 또는 발병 후에 치료를 개시하였다. 측정된 종점은 CNS 및 CSF에서 APOE4 및 APOE2 발현 수준이다.

실시예 4: AD의 마우스 모델의 생체내 검정

본 실시예는 돌연변이체 마우스를 사용한 rAAV의 생체내 검정을 설명한다. 돌연변이체 마우스에서 상기와 같은 rAAV의 생체내 연구를, 예를 들어 문헌 [Liao et al. (2018) J. Clin. Invest 128(5): 2144-2155]; [Rosenberg, et al. (2018) Hum Gene Ther Clin Dev 29(1): 24-47]; [Zhao et al. (2016) Neurobiol Aging 44: 159-172]에 기재된 검정을 사용하여 수행하였다. 이들 돌연변이체 마우스는 뮤린 APOE 유전자좌에 인간 APOE4 이소형을 보유하였다. 일부 경우에, 이들 마우스는 또한 인간 AD에서 아밀로이드-β 플라크의 발달을 모델링하기 위해 돌연변이체 인간 아밀로이드 전구체 단백질 (APP), 돌연변이체 인간 프레세닐린 1 (PS1) 단백질, 및/또는 돌연변이체 인간 프레세닐린 2 (PS2) 단백질을 발현한다.

농축된 rAAV 스톡을 예를 들어 5-10 μL의 주사 부피로 사용하여 비히클 대조군 및 rAAV의 경막내 또는 뇌실내 전달 (예를 들어, 2×10¹¹ vg/마우스의 용량으로)을 수행하였다. 대류 향상 전달에 의한 뇌실질내 전달을 수행하였다. 말초 전달을 꼬리 정맥 주사에 의해 달성하였다.

증상 발병 전에 또는 발병 후에 치료를 개시하였다. 측정된 종점은 CNS 및 CSF에서 APOE4 및 APOE2 발현 수준, 더 긴 아밀로이드-β (Aβ) 종, 예컨대 Aβ42 축적, 모든 Aβ 종의 증가, 운동 및 인지 종점, 및 아밀로이드-β 플라크 및 타우 엉킴의 축적이다.

실시예 5: AD 환자에서 임상 시험

본 실시예는 AD를 가진 환자에서 본 개시내용에 기재된 바와 같은 rAAV의 안전성 및 효능을 평가하기 위한 임상 시험을 설명한다.

AD 치료를 위한 본 개시내용의 rAAV의 임상 시험을, 문헌 [Grabowski et al. (1995) Ann. Intern. Med. 122(1):33-39]에 기재된 것과 유사한 연구 설계를 사용하여 수행하였다. rAAV를 CSF로, 뇌실질내로 해마로 또는 또 다른 뇌 영역으로, 또는 말초로 전달하였다.

측정된 종점은 아밀로이드-β 플라크의 수준, 타우 엉킴, 운동 및 인지 종점, 및 APOE4 및 APOE2 단백질의 수준이다.

실시예 6: 아밀로이드-β 항체와 조합된 AD 환자의 임상 시험

본 실시예는 AD를 가진 환자에서 아밀로이드-β 항체 (예를 들어, 바피네주맙 및 술라네주맙)와 조합하여 사용된 본 개시내용에 기재된 바와 같은 rAAV의 안전성 및 효능을 평가하기 위한 임상 시험을 설명한다.

AD 치료를 위한 항-아밀로이드-β 항체와 조합된 본 개시내용의 rAAV의 임상 시험을, 문헌 [Grabowski et al. (1995) Ann. Intern. Med. 122(1):33-39]에 기재된 것과 유사한 연구 설계를 사용하여 수행하였다. rAAV를 CSF로, 뇌실질내로 해마로 또는 또 다른 뇌 영역으로, 또는 말초로 전달하였다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용의 rAAV는 항-아밀로이드-β 항체와 상승작용하여 AD 환자가 APOE 유전자형과 고도로 상관관계가 있는 아밀로이드-관련 영상화 이상 (ARIA)을 발병할 가능성을 감소시킨다. ARIA는 아밀로이드-변형 요법, 특히 인간 모노클로날 항체와 연관된 AD 환자에서 관찰되는 이상 스펙트럼이다. 두 가지 타입의 ARIA, 대뇌 부종을 의미하는 ARIA-E 및 대뇌 미세출혈을 의미하는 ARIA-H가 있다.

평가된 종점은 ARIA가 발생했는지 여부 및 본 개시내용의 rAAV가 ARIA의 가능성, 아밀로이드-β 플라크의 수준, 타우 엉킴, 운동 및 인지 종점, 및 APOE4 및 APOE2 단백질의 수준을 감소시키는지 여부를 결정하기 위한 치료 전후의 뇌 영상화이다.

실시예 7: APOE4^+/+, APOE4^+/- 및 APOE4^-/-인 AD 환자에서 임상 시험

본 실시예는 APOE4^+/- 또는 APOE4^-/-인 환자와 비교하여 APOE4^+/+인 AD를 가진 환자에서 뇌졸중, 관상 동맥 질환, 죽상동맥경화증, 두부 외상으로부터의 불량한 회복, 및 우회 기계에서의 수술로부터의 인지 회복을 포함한 다른 병리의 증가된 위험을 호전시키는데 있어서 본 개시내용에 기재된 바와 같은 rAAV의 효능을 평가하기 위한 임상 시험을 설명한다.

AD의 치료 및 APOE4^+/+인 환자와 연관된 다른 상태의 증가된 위험의 호전을 위한 본 개시내용의 rAAV의 임상 시험을, 문헌 [Grabowski et al. (1995) Ann. Intern. Med. 122(1):33-39]에 기재된 것과 유사한 연구 설계를 사용하여 수행하였다. rAAV를 CSF로, 뇌실질내로 해마로 또는 또 다른 뇌 영역으로, 또는 말초로 전달하였다.

본 개시내용의 rAAV를 사용한 치료 전후에 평가된 종점은 혈압, 혈중 콜레스테롤 및 혈당 수준, 운동 및 인지 종점, MRI, PET, 및 관상 동맥의 초음파 영상화, 인지 외상으로부터의 회복, 및 우회 기계에서의 수술로부터의 회복이다.

실시예 8: APOE4 이소형의 환자 보인자에서 AD의 예방 또는 AD의 치료

본 실시예는 적어도 하나의 APOE4 이소형을 갖는 대상체가 AD를 발병할 위험을 감소시키고, 적어도 하나의 APOE4 이소형을 갖는 환자에서 AD를 치료하는 것에 있어서 본 개시내용에 기재된 바와 같은 rAAV의 효능을 평가하기 위한 임상 시험을 설명한다. APOE4 이소형을 갖는 환자는 APOE4^+/+ 또는 APOE4^+/-일 수 있다.

APOE4 대립유전자의 보인자에서 AD의 예방 또는 치료를 위한 본 개시내용의 rAAV의 임상 시험을, 문헌 [Grabowski et al. (1995) Ann. Intern. Med. 122(1):33-39]에 기재된 것과 유사한 연구 설계를 사용하여 수행하였다. rAAV를 CSF로, 뇌실질내로 해마로 또는 또 다른 뇌 영역으로, 또는 말초로 전달하였다.

본 개시내용의 rAAV를 사용한 치료 전후에 평가된 종점은 CSF 및 혈액에서 APOE4 및 APOE2의 수준 및 인지 및 운동 종점이다.

실시예 9: ITR "D" 서열 배치 및 세포 형질도입의 시험

rAAV의 세포 형질도입에 대한 ITR "D" 서열의 배치의 효과를 조사하였다. HEK293 세포를 도 6에 나타낸 바와 같이, 1) 야생형 ITR (예를 들어, 트랜스진 삽입물의 근위에 있고 ITR의 말단의 원위에 있는 "D" 서열) 또는 2) 벡터의 "외부"에 위치된 "D" 서열 (예를 들어, ITR의 말단의 근위에 있고 트랜스진 삽입물의 원위에 위치된 "D" 서열)을 갖는 ITR을 갖는 ApoE2-코딩 rAAV로 형질도입시켰다.

실시예 9: 내인성 APOE 침묵 및 APOE2 과발현에 대한 shRNA의 시험관내 검증

APOE (예를 들어, APOE4) 녹다운의 정도 및 APOE2의 이종 발현을 평가하기 위해 시험관내 형질감염 스크린에서 APOE에 대한 고유한 shRNA 및 APOE2의 코돈-최적화된 코딩 서열을 함유하는 다중 플라스미드를 평가하였다. 플라스미드는 벡터-코딩된 APOE2 단백질 발현에 영향을 주지 않고 내인성 APOE 유전자를 선택적으로 녹다운하도록 특이적으로 설계되었다. 다중 플라스미드는 qRT-PCR을 통해 내인성 APOE의 감소 (도 7a) 및 코돈-최적화된 APOE2의 발현 (도 7b)을 보여준다. shRNA 후보는 코돈 최적화된 APOE2에 영향을 주지 않고 내인성 APOE의 상당한 감소를 보여주었다.

실시예 10: 내인성 APOE 침묵 및 APOE2 과발현에 대한 shRNA의 생체내 검증

코돈 최적화된 APOE2에 영향을 주지 않고 내인성 APOE의 상당한 감소를 나타내는 shRNA 후보를 추가 생체내 연구를 위해 선택하였다. APOE4에 대한 후보 shRNA의 생체내 효능을 평가하기 위해 APOE4 녹인 (KI) 마우스 모델을 사용하였다. APOE4 KI 마우스에서, 두 마우스 Apoe 대립유전자 모두를 인간 APOE-ε4에 의해 대체하였다. 마우스 (n=5)는 대뇌실내 주사 (ICV)를 통해 APOE4에 대한 후보 shRNA를 운반하는 벡터를 받았고, 인간 APOE4 mRNA의 생체분포를 주사후 60일에 분석하였다 (도 8).

균등물

이와 같이 본 발명의 적어도 하나의 실시양태의 여러 측면이 설명되어 있지만, 다양한 변경, 변형 및 개선이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 쉽게 일어날 것임을 이해해야 한다. 이러한 변경, 변형 및 개선은 본 개시내용의 일부로 의도되고, 본 발명의 취지 및 범위 내에 있는 것으로 의도된다. 따라서, 전술한 설명 및 도면은 단지 예시일 뿐이다.

본 발명의 여러 실시양태가 본원에 설명되고 예시되었지만, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 기능의 수행 및/또는 본원에 기재된 결과 및/또는 하나 이상의 장점의 획득을 위한 다양한 다른 수단 및/또는 구조를 쉽게 고려할 것이며, 이러한 변경 및/또는 변형 각각은 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 간주된다. 보다 일반적으로, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본원에 기재된 모든 파라미터, 치수, 재료 및 구성은 예시적인 것이며, 실제 파라미터, 치수, 재료 및/또는 구성은 본 발명의 교시가 사용되는 특정 적용 또는 적용들에 따라 달라질 것임을 쉽게 이해할 것이다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 일상적인 실험만을 사용하여 본원에 기재된 본 발명의 특정 실시양태에 대한 많은 균등물을 인식하거나 확인할 수 있다. 따라서, 전술한 실시양태는 단지 예로서 제시된 것이며, 첨부된 청구범위 및 이에 대한 균등물 내에서 본 발명은 구체적으로 설명되고 청구된 것과 다르게 실시될 수 있다는 것을 이해해야 한다. 본 발명은 본원에 기재된 각각의 개별 특징, 시스템, 물품, 재료 및/또는 방법에 관한 것이다. 또한, 이러한 특징, 시스템, 물품, 재료 및/또는 방법이 상호 모순되지 않는 경우, 2개 이상의 이러한 특징, 시스템, 물품, 재료 및/또는 방법의 임의의 조합은 본 발명의 범위 내에 포함된다.

본 명세서 및 청구범위에서 본원에 사용된 바와 같은 "하나"는 반대로 명확하게 표시되지 않는 한 "적어도 하나"를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.

명세서 및 청구범위에서 본원에 사용된 바와 같은 문구 "및/또는"은 그렇게 결합된 요소, 즉 일부 경우에는 결합적으로 존재하고 다른 경우에는 분리적으로 존재하는 요소의 "하나 또는 둘 모두"를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. "및/또는" 절에 의해, 반대로 명확하게 표시되지 않는 한 구체적으로 확인된 요소와 관련이 있는지 여부에 의해 구체적으로 확인된 요소 이외의 다른 요소가 임의로 존재할 수 있다. 그러므로, 비제한적인 예로서, 개방형 언어, 예컨대 "포함하는"과 함께 사용될 때 "A 및/또는 B"에 대한 언급은 한 실시양태에서 B가 없는 A (임의로 B 이외의 요소 포함); 또 다른 실시양태에서 A가 없는 B (임의로 A 이외의 요소 포함); 또 다른 실시양태에서 A 및 B 모두 (임의로 다른 요소 포함) 등을 의미할 수 있다.

명세서 및 청구범위에서 본원에 사용된 바와 같은 "또는"은 상기 정의된 바와 같은 "및/또는"과 동일한 의미를 갖는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 목록에서 항목을 구분할 때, "또는" 또는 "및/또는"은 포함되는 것으로 해석되어야 하며, 즉 요소의 개수 또는 목록 중 적어도 하나를 포함할 뿐만 아니라 하나 초과를 포함하고, 임의로 추가의 나열되지 않은 항목을 포함한다. 반대로 명확하게 표시된 용어, 예컨대 "다음 중 하나만" 또는 "다음 중 정확히 하나" 또는 청구범위에서 사용되는 경우 "다음으로 이루어진"만이 숫자의 정확히 하나의 요소 또는 요소의 목록을 포함하는 것을 의미할 것이다. 일반적으로, 본원에 사용된 바와 같은 용어 "또는"은 배타성 용어, 예컨대 "둘 중 하나", "중 하나", "중 오직 하나", 또는 "중 정확히 하나"가 선행될 때 배타적인 대안 (즉, "하나 또는 둘 다가 아닌")을 나타내는 것으로 해석되어야 한다. 청구범위에서 사용되는 경우 "본질적으로 이루어진"은 특허법 분야에서 사용되는 바와 같은 일반적인 의미를 가질 수 있다.

명세서 및 청구범위에서 본원에 사용된 바와 같이, 하나 이상의 요소의 목록과 관련하여 문구 "적어도 하나"는 요소 목록의 임의의 하나 이상의 요소로부터 선택된 적어도 하나의 요소를 의미하는 것으로 이해되어야 하지만, 반드시 요소 목록 내에 구체적으로 나열된 각각의 및 모든 요소 중 적어도 하나를 포함하지는 않고, 요소 목록의 요소의 임의의 조합을 배제하지 않는 것은 아니다. 이 정의는 또한 구체적으로 확인된 요소와 관련이 있는지 여부에 관계없이 문구 "적어도 하나"가 지시하는 요소 목록 내에서 구체적으로 확인된 요소 이외의 요소가 임의로 존재할 수 있도록 한다. 그러므로, 비제한적인 예로서, "A 및 B 중 적어도 하나" (또는 동등하게 "A 또는 B 중 적어도 하나" 또는 동등하게 "A 및/또는 B 중 적어도 하나")는 한 실시양태에서 B가 존재하지 않는 (및 임의로 B 이외의 요소를 포함) 적어도 하나 (임의로 하나 초과 포함)의 A; 또 다른 실시양태에서 A가 존재하지 않는 (및 임의로 A 이외의 요소를 포함) 적어도 하나 (임의로 하나 초과 포함)의 B; 또 다른 실시양태에서 적어도 하나 (임의로 하나 초과 포함)의 A, 및 적어도 하나 (임의로 하나 초과 포함)의 B (및 임의로 다른 요소를 포함) 등을 의미할 수 있다.

청구범위 뿐만 아니라 상기 명세서에서, 모든 전환 문구, 예컨대 "포함하는(comprising)", "포함하는(including)" "운반하는", "갖는", "함유하는", "수반하는", "보유하는" 등은 개방형인 것으로, 즉 포함하나 이에 제한되지는 않는을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 전환 문구 "이루어진" 및 "본질적으로 이루어진"만은 각각 미국 특허청 특허 심사 절차 매뉴얼, 섹션 2111.03에 제시된 바와 같이 폐쇄형 또는 반폐쇄형 전환 문구일 수 있다.

청구항 요소를 변형시키기 위해 청구범위에서 서수 용어, 예컨대 "제1", "제2", "제3" 등을 사용하는 것은 그 자체로 방법의 실행이 수행되는 또 다른 또는 시간적 순서보다 한 청구항 요소의 어떠한 우선권, 우위 또는 순서를 함축하는 것이 아니라, 단지 청구항 요소를 구별하기 위해 특정 명칭을 갖는 한 청구항 요소를 동일한 명칭을 갖는 (그러나 서수 용어 사용) 또 다른 요소와 구별하기 위한 표지로서 사용된다. 반대로 명확하게 표시되지 않는 한, 또한 하나 초과의 단계 또는 실행을 포함하는 본원에 청구된 임의의 방법에서, 방법의 단계 또는 실행의 순서는 반드시 방법의 단계 또는 실행이 언급된 순서로 제한되지 않는다는 것을 이해해야 한다.

서열

일부 실시양태에서, 하나 이상의 유전자 생성물 (예를 들어, 제1, 제2 및/또는 제3 유전자 생성물)을 코딩하는 발현 카세트는 서열식별번호: 1-21 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 유전자 생성물은 서열식별번호: 1-21 중 어느 하나에 제시된 서열의 일부 (예를 들어, 단편)에 의해 코딩된다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 억제성 핵산을 코딩하는 핵산 서열이 모든 "T"가 "U"로 대체된 서열을 설명할 수 있음을 인식한다.

> 인간 APOE4 핵산 서열 (NM_001302690.1) (서열식별번호: 1)

> 인간 APOE2 핵산 서열 (NM_000041.3) (서열식별번호: 2)

> 인간 ApoE2 아미노산 서열 (서열식별번호: 3)

> ApoE2 핵산 서열 (코돈 최적화된) (서열식별번호: 4)

> ApoE4 shRNA 1 핵산 서열 (서열식별번호: 5)

> ApoE4 shRNA 1 핵산 서열 (서열식별번호: 6)

> 루프를 갖는 ApoE4 shRNA 1 (서열식별번호: 7)

> ApoE4 amiRNA 1 (서열식별번호: 8)

> ApoE4 amiRNA rAAV 벡터 H1 (서열식별번호: 9)

> ApoE4 amiRNA rAAV 벡터 1 (서열식별번호: 10)

> ApoE4 amiRNA-ApoE2opt rAAV 벡터 1 (서열식별번호: 11)

> ApoE4 shRNA 2 핵산 서열 (서열식별번호: 12)

> ApoE4 shRNA 2 핵산 서열 (서열식별번호: 13)

> 루프를 갖는 ApoE4 shRNA 2 (서열식별번호: 14)

> ApoE4 amiRNA 2 (서열식별번호: 15)

> ApoE4 amiRNA-ApoE2opt rAAV 벡터 2 (서열식별번호: 16)

> ApoE4 shRNA 3 핵산 서열 (서열식별번호: 17)

> ApoE4 shRNA 3 핵산 서열 (서열식별번호: 18)

> 루프를 갖는 ApoE4 shRNA 3 (서열식별번호: 19)

> ApoE4 amiRNA 3 (서열식별번호: 20)

> ApoE4 amiRNA-ApoE2opt rAAV 벡터 3 (서열식별번호: 21)

>AAV2 ITR D 영역 "S" 서열 (서열식별번호: 22)

>AAV2 ITR D 영역 "D" 서열 (서열식별번호: 23)

> TRY 모티프 서열 (서열식별번호: 24)

>야생형 AAV2 ITR 핵산 서열 (서열식별번호: 25)

SEQUENCE LISTING <110> Prevail Therapeutics, Inc. <120> GENE THERAPIES FOR NEURODEGENERATIVE DISEASE <130> P1094.70007WO00 <140> Not yet assigned <141> Concurrently herewith <150> US 62/772,230 <151> 2018-11-28 <160> 25 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1251 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 ggatggggag ataagagaag accaggaggg agttaaatag ggaatgggtt gggggcggct 60 tggtaaatgt gctgggatta ggctgttgca gataatgcaa caaggcttgg aaggctaacc 120 tgggactggc caatcacagg caggaagatg aaggttctgt gggctgcgtt gctggtcaca 180 ttcctggcag gatgccaggc caaggtggag caagcggtgg agacagagcc ggagcccgag 240 ctgcgccagc agaccgagtg gcagagcggc cagcgctggg aactggcact gggtcgcttt 300 tgggattacc tgcgctgggt gcagacactg tctgagcagg tgcaggagga gctgctcagc 360 tcccaggtca cccaggaact gagggcgctg atggacgaga ccatgaagga gttgaaggcc 420 tacaaatcgg aactggagga acaactgacc ccggtggcgg aggagacgcg ggcacggctg 480 tccaaggagc tgcaggcggc gcaggcccgg ctgggcgcgg acatggagga cgtgtgcggc 540 cgcctggtgc agtaccgcgg cgaggtgcag gccatgctcg gccagagcac cgaggagctg 600 cgggtgcgcc tcgcctccca cctgcgcaag ctgcgtaagc ggctcctccg cgatgccgat 660 gacctgcaga agcgcctggc agtgtaccag gccggggccc gcgagggcgc cgagcgcggc 720 ctcagcgcca tccgcgagcg cctggggccc ctggtggaac agggccgcgt gcgggccgcc 780 actgtggctc cctggccggc cagccgctac aggagcgggc ccaggcctgg ggcgagcggc 840 tgcgcgcgcg gatggaggag atgggcagcc ggacccgcga ccgcctggac gaggtgaagg 900 agcaggtggc ggaggtgcgc gccaagctgg aggagcaggc ccagcagata cgcctgcagg 960 ccgaggcctt ccaggcccgc ctcaagagct ggttcgagcc cctggtggaa gacatgcagc 1020 gccagtgggc cgggctggtg gagaaggtgc aggctgccgt gggcaccagc gccgcccctg 1080 tgcccagcga caatcactga acgccgaagc ctgcagccat gcgaccccac gccaccccgt 1140 gcctcctgcc tccgcgcagc ctgcagcggg agaccctgtc cccgccccag ccgtcctcct 1200 ggggtggacc ctagtttaat aaagattcac caagtttcac gcatcaaaaa a 1251 <210> 2 <211> 1220 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 gggacagggg gagccctata attggacaag tctgggatcc ttgagtccta ctcagcccca 60 gcggaggtga aggacgtcct tccccaggag ccgactggcc aatcacaggc aggaagatga 120 aggttctgtg ggctgcgttg ctggtcacat tcctggcagg atgccaggcc aaggtggagc 180 aagcggtgga gacagagccg gagcccgagc tgcgccagca gaccgagtgg cagagcggcc 240 agcgctggga actggcactg ggtcgctttt gggattacct gcgctgggtg cagacactgt 300 ctgagcaggt gcaggaggag ctgctcagct cccaggtcac ccaggaactg agggcgctga 360 tggacgagac catgaaggag ttgaaggcct acaaatcgga actggaggaa caactgaccc 420 cggtggcgga ggagacgcgg gcacggctgt ccaaggagct gcaggcggcg caggcccggc 480 tgggcgcgga catggaggac gtgtgcggcc gcctggtgca gtaccgcggc gaggtgcagg 540 ccatgctcgg ccagagcacc gaggagctgc gggtgcgcct cgcctcccac ctgcgcaagc 600 tgcgtaagcg gctcctccgc gatgccgatg acctgcagaa gcgcctggca gtgtaccagg 660 ccggggcccg cgagggcgcc gagcgcggcc tcagcgccat ccgcgagcgc ctggggcccc 720 tggtggaaca gggccgcgtg cgggccgcca ctgtgggctc cctggccggc cagccgctac 780 aggagcgggc ccaggcctgg ggcgagcggc tgcgcgcgcg gatggaggag atgggcagcc 840 ggacccgcga ccgcctggac gaggtgaagg agcaggtggc ggaggtgcgc gccaagctgg 900 aggagcaggc ccagcagata cgcctgcagg ccgaggcctt ccaggcccgc ctcaagagct 960 ggttcgagcc cctggtggaa gacatgcagc gccagtgggc cgggctggtg gagaaggtgc 1020 aggctgccgt gggcaccagc gccgcccctg tgcccagcga caatcactga acgccgaagc 1080 ctgcagccat gcgaccccac gccaccccgt gcctcctgcc tccgcgcagc ctgcagcggg 1140 agaccctgtc cccgccccag ccgtcctcct ggggtggacc ctagtttaat aaagattcac 1200 caagtttcac gcatcaaaaa 1220 <210> 3 <211> 317 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Lys Val Leu Trp Ala Ala Leu Leu Val Thr Phe Leu Ala Gly Cys 1 5 10 15 Gln Ala Lys Val Glu Gln Ala Val Glu Thr Glu Pro Glu Pro Glu Leu 20 25 30 Arg Gln Gln Thr Glu Trp Gln Ser Gly Gln Arg Trp Glu Leu Ala Leu 35 40 45 Gly Arg Phe Trp Asp Tyr Leu Arg Trp Val Gln Thr Leu Ser Glu Gln 50 55 60 Val Gln Glu Glu Leu Leu Ser Ser Gln Val Thr Gln Glu Leu Arg Ala 65 70 75 80 Leu Met Asp Glu Thr Met Lys Glu Leu Lys Ala Tyr Lys Ser Glu Leu 85 90 95 Glu Glu Gln Leu Thr Pro Val Ala Glu Glu Thr Arg Ala Arg Leu Ser 100 105 110 Lys Glu Leu Gln Ala Ala Gln Ala Arg Leu Gly Ala Asp Met Glu Asp 115 120 125 Val Cys Gly Arg Leu Val Gln Tyr Arg Gly Glu Val Gln Ala Met Leu 130 135 140 Gly Gln Ser Thr Glu Glu Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His Leu Arg 145 150 155 160 Lys Leu Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala Asp Asp Leu Gln Lys Cys 165 170 175 Leu Ala Val Tyr Gln Ala Gly Ala Arg Glu Gly Ala Glu Arg Gly Leu 180 185 190 Ser Ala Ile Arg Glu Arg Leu Gly Pro Leu Val Glu Gln Gly Arg Val 195 200 205 Arg Ala Ala Thr Val Gly Ser Leu Ala Gly Gln Pro Leu Gln Glu Arg 210 215 220 Ala Gln Ala Trp Gly Glu Arg Leu Arg Ala Arg Met Glu Glu Met Gly 225 230 235 240 Ser Arg Thr Arg Asp Arg Leu Asp Glu Val Lys Glu Gln Val Ala Glu 245 250 255 Val Arg Ala Lys Leu Glu Glu Gln Ala Gln Gln Ile Arg Leu Gln Ala 260 265 270 Glu Ala Phe Gln Ala Arg Leu Lys Ser Trp Phe Glu Pro Leu Val Glu 275 280 285 Asp Met Gln Arg Gln Trp Ala Gly Leu Val Glu Lys Val Gln Ala Ala 290 295 300 Val Gly Thr Ser Ala Ala Pro Val Pro Ser Asp Asn His 305 310 315 <210> 4 <211> 954 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 4 atgaaggtgc tgtgggccgc cctgctggtg accttcctgg ccggctgcca ggccaaagtc 60 gaacaggccg tcgagaccga gcccgagccc gagctgcgcc agcagaccga gtggcagagc 120 ggccagcgct gggagctggc cctgggccgc ttctgggact acctgcgctg ggtgcagacc 180 ctgagcgagc aggtgcagga ggagctgctg agcagccagg tgacccagga gctgcgcgcc 240 ctgatggacg agaccatgaa agaactcaaa gcttataaga gcgagctgga ggagcagctg 300 acccccgtgg ccgaggagac ccgcgcccgc ctgagcaagg agctgcaggc cgcccaggcc 360 cgcctgggcg ccgacatgga ggacgtgtgc ggccgcctgg tgcagtaccg cggcgaggtg 420 caggccatgc tgggccagag caccgaggag ctgcgcgtgc gcctggccag ccacctgcgc 480 aagctgcgca agcgcctgct gcgcgacgcc gacgacctgc agaagtgcct ggccgtgtac 540 caggccggcg cccgcgaggg cgccgagcgc ggcctgagcg ccatccgcga gcgcctgggc 600 cccctggtgg agcagggccg cgtgcgcgcc gccaccgtgg gcagcctggc cggccagccc 660 ctgcaggagc gcgcccaggc ctggggcgag cgcctgcgcg cccgcatgga ggagatgggc 720 agccgcaccc gcgaccgcct ggacgaggtg aaggagcagg tggccgaggt gcgcgccaag 780 ctggaggagc aggcccagca gatccgcctg caggccgagg ccttccaggc ccgcctgaag 840 agctggttcg agcccctggt ggaggacatg cagcgccagt gggccggcct ggtggagaag 900 gtgcaggccg ccgtgggcac cagcgccgcc cccgtgccca gcgacaacca ctaa 954 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 5 ttgtaggcct tcaactcctt c 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 6 gaaggagttg aaggcctaca a 21 <210> 7 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 7 ttgtaggcct tcaactcctt ccatctgtgg cttcactgaa ggagttgaag gcctacaa 58 <210> 8 <211> 152 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 8 ttgtcatcct cccacggtgg ccatttgttc catgtgagtg ctagtaacag gccttgtgtc 60 ctttgtaggc cttcaactcc ttccatctgt ggcttcactg aaggagttga aggcctacaa 120 gacaacagca tacagccttc agcaagcctc ca 152 <210> 9 <211> 903 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 9 ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60 cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120 gccaactcca tcactagggg ttcctgctag ctctgggtat ttaagcccga gtgagcacgc 180 agggtctcca ttttgaagcg ggaggttacg cgttcgtcga ctactagtgg gtaccagagc 240 aaaaaaattg tcatcctccc acggtggcca tttgttccat gtgagtgcta gtaacaggcc 300 ttgtgtcctt tgtaggcctt caactccttc catctgtggc ttcactgaag gagttgaagg 360 cctacaagac aacagcatac agccttcagc aagcctccag tggtctcata cagaacttat 420 aagattccca aatccaaaga catttcacgt ttatggtgat ttcccagaac acatagcgac 480 atgcaaatat tgcagggcgc cactcccctg tccctcacag ccatcttcct gccagggcgc 540 acgcgcgctg ggtgttcccg cctagtgaca ctgggcccgc gattccttgg agcgggttga 600 tgacgtcagc gtttcccatg gtgaagcttg gatctgatcc ctaggttcta gaaccggtga 660 ccaattgtta attaagttta aaccctcgag gccgcaagca gatccacgat aacaaacagc 720 ttttttgggg tgaacatatt gactgaattc cctgcaggtt ggccactccc tctctgcgcg 780 ctcgctcgct cactgaggcc gcccgggcaa agcccgggcg tcgggcgacc tttggtcgcc 840 cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcagag agggagtggc caactccatc actaggggtt 900 cct 903 <210> 10 <211> 2551 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 10 ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgcccgggc aaagcccggg 60 cgtcgggcga cctttggtcg cccggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120 gccaactcca tcactagggg ttcctgctag ctctgggtat ttaagcccga gtgagcacgc 180 agggtctcca ttttgaagcg ggaggttacg cgttcgtcga ctactagtgg gtaccagagc 240 tccctaggtt ctagaaccgg tgacgtctcc catggtgaag cttggatctg aattcggtac 300 ctagttatta atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc 360 gcgttacata acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat 420 tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc 480 aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc 540 caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt 600 acatgacctt atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta 660 ccatggtcga ggtgagcccc acgttctgct tcactctccc catctccccc ccctccccac 720 ccccaatttt gtatttattt attttttaat tattttgtgc agcgatgggg gcgggggggg 780 ggggggggcg cgcgccaggc ggggcggggc ggggcgaggg gcggggcggg gcgaggcgga 840 gaggtgcggc ggcagccaat cagagcggcg cgctccgaaa gtttcctttt atggcgaggc 900 ggcggcggcg gcggccctat aaaaagcgaa gcgcgcggcg ggcgggagtc gctgcgacgc 960 tgccttcgcc ccgtgccccg ctccgccgcc gcctcgcgcc gcccgccccg gctctgactg 1020 accgcgttac tcccacaggt gagcgggcgg gacggccctt ctcctcagcg ctgtaattag 1080 cgcttggttt aatgacggct tgttggaggc ttgctgaagg ctgtatgctg ttgtcttgta 1140 ggccttcaac tccttcagtg aagccacaga tggaaggagt tgaaggccta caaaggacac 1200 aaggcctgtt actagcactc acatggaaca aatggccacc gtgggaggat gacaatttct 1260 gtggctgcgt gaaagccttg aggggctccg ggagctagag cctctgctaa ccatgttcat 1320 gccttcttct ttttcctaca gctcctgggc aacgtgctgg ttattgtgct gtctcatcat 1380 tttggcaaag aattcctcga agatccgaag ggaaagtctt ccacgactgt gggatccgtt 1440 cgaagatatc accggttgag ccacccaatt gttaattaag tttaaaccct cgaggccgca 1500 agcttatcga taatcaacct ctggattaca aaatttgtga aagattgact ggtattctta 1560 actatgttgc tccttttacg ctatgtggat acgctgcttt aatgcctttg tatcatgcta 1620 ttgcttcccg tatggctttc attttctcct ccttgtataa atcctggttg ctgtctcttt 1680 atgaggagtt gtggcccgtt gtcaggcaac gtggcgtggt gtgcactgtg tttgctgacg 1740 caacccccac tggttggggc attgccacca cctgtcagct cctttccggg actttcgctt 1800 tccccctccc tattgccacg gcggaactca tcgccgcctg ccttgcccgc tgctggacag 1860 gggctcggct gttgggcact gacaattccg tggtgttgtc ggggaaatca tcgtcctttc 1920 cttggctgct cgcctgtgtt gccacctgga ttctgcgcgg gacgtccttc tgctacgtcc 1980 cttcggccct caatccagcg gaccttcctt cccgcggcct gctgccggct ctgcggcctc 2040 ttccgcgtct tcgccttcgc cctcagacga gtcggatctc cctttgggcc gcctccccgc 2100 atcgataccg tcgactagag ctcgctgatc agcctcgact gtgccttcta gttgccagcc 2160 atctgttgtt tgcccctccc ccgtgccttc cttgaccctg gaaggtgcca ctcccactgt 2220 cctttcctaa taaaatgagg aaattgcatc gcattgtctg agtaggtgtc attctattct 2280 ggggggtggg gtggggcagg acagcaaggg ggaggattgg gaagacaata gcaggcatgc 2340 tggggagaga tccacgataa caaacagctt ttttggggtg aacatattga ctgaattccc 2400 tgcaggttgg ccactccctc tctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag 2460 cccgggcgtc gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag 2520 ggagtggcca actccatcac taggggttcc t 2551 <210> 11 <211> 3506 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 11 ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60 cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120 gccaactcca tcactagggg ttcctgctag ctctgggtat ttaagcccga gtgagcacgc 180 agggtctcca ttttgaagcg ggaggttacg cgttcgtcga ctactagtgg gtaccagagc 240 tccctaggtt ctagaaccgg tgacgtctcc catggtgaag cttggatctg aattcggtac 300 cctagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc atagcccata tatggagttc 360 cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca 420 ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt 480 caatgggtgg actatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg 540 ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag 600 tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt 660 accatggtcg aggtgagccc cacgttctgc ttcactctcc ccatctcccc cccctcccca 720 cccccaattt tgtatttatt tattttttaa ttattttgtg cagcgatggg ggcggggggg 780 gggggggggc gcgcgccagg cggggcgggg cggggcgagg ggcggggcgg ggcgaggcgg 840 agaggtgcgg cggcagccaa tcagagcggc gcgctccgaa agtttccttt tatggcgagg 900 cggcggcggc ggcggcccta taaaaagcga agcgcgcggc gggcgggagt cgctgcgacg 960 ctgccttcgc cccgtgcccc gctccgccgc cgcctcgcgc cgcccgcccc ggctctgact 1020 gaccgcgtta ctcccacagg tgagcgggcg ggacggccct tctcctcagc gctgtaatta 1080 gcgcttggtt taatgacggc ttgttggagg cttgctgaag gctgtatgct gttgtcttgt 1140 aggccttcaa ctccttcagt gaagccacag atggaaggag ttgaaggcct acaaaggaca 1200 caaggcctgt tactagcact cacatggaac aaatggccac cgtgggagga tgacaatttc 1260 tgtggctgcg tgaaagcctt gaggggctcc gggagctaga gcctctgcta accatgttca 1320 tgccttcttc tttttcctac agctcctggg caacgtgctg gttattgtgc tgtctcatca 1380 ttttggcaaa gaattcctcg aagatccgaa gggaaagtct tccacgactg tgggatccgt 1440 tcgaagatat caccggttga gccaccatga aggtgctgtg ggccgccctg ctggtgacct 1500 tcctggccgg ctgccaggcc aaagtcgaac aggccgtcga gaccgagccc gagcccgagc 1560 tgcgccagca gaccgagtgg cagagcggcc agcgctggga gctggccctg ggccgcttct 1620 gggactacct gcgctgggtg cagaccctga gcgagcaggt gcaggaggag ctgctgagca 1680 gccaggtgac ccaggagctg cgcgccctga tggacgagac catgaaagaa ctcaaagctt 1740 ataagagcga gctggaggag cagctgaccc ccgtggccga ggagacccgc gcccgcctga 1800 gcaaggagct gcaggccgcc caggcccgcc tgggcgccga catggaggac gtgtgcggcc 1860 gcctggtgca gtaccgcggc gaggtgcagg ccatgctggg ccagagcacc gaggagctgc 1920 gcgtgcgcct ggccagccac ctgcgcaagc tgcgcaagcg cctgctgcgc gacgccgacg 1980 acctgcagaa gtgcctggcc gtgtaccagg ccggcgcccg cgagggcgcc gagcgcggcc 2040 tgagcgccat ccgcgagcgc ctgggccccc tggtggagca gggccgcgtg cgcgccgcca 2100 ccgtgggcag cctggccggc cagcccctgc aggagcgcgc ccaggcctgg ggcgagcgcc 2160 tgcgcgcccg catggaggag atgggcagcc gcacccgcga ccgcctggac gaggtgaagg 2220 agcaggtggc cgaggtgcgc gccaagctgg aggagcaggc ccagcagatc cgcctgcagg 2280 ccgaggcctt ccaggcccgc ctgaagagct ggttcgagcc cctggtggag gacatgcagc 2340 gccagtgggc cggcctggtg gagaaggtgc aggccgccgt gggcaccagc gccgcccccg 2400 tgcccagcga caaccactaa caattgttaa ttaagtttaa accctcgagg ccgcaagctt 2460 atcgataatc aacctctgga ttacaaaatt tgtgaaagat tgactggtat tcttaactat 2520 gttgctcctt ttacgctatg tggatacgct gctttaatgc ctttgtatca tgctattgct 2580 tcccgtatgg ctttcatttt ctcctccttg tataaatcct ggttgctgtc tctttatgag 2640 gagttgtggc ccgttgtcag gcaacgtggc gtggtgtgca ctgtgtttgc tgacgcaacc 2700 cccactggtt ggggcattgc caccacctgt cagctccttt ccgggacttt cgctttcccc 2760 ctccctattg ccacggcgga actcatcgcc gcctgccttg cccgctgctg gacaggggct 2820 cggctgttgg gcactgacaa ttccgtggtg ttgtcgggga aatcatcgtc ctttccttgg 2880 ctgctcgcct gtgttgccac ctggattctg cgcgggacgt ccttctgcta cgtcccttcg 2940 gccctcaatc cagcggacct tccttcccgc ggcctgctgc cggctctgcg gcctcttccg 3000 cgtcttcgcc ttcgccctca gacgagtcgg atctcccttt gggccgcctc cccgcatcga 3060 taccgtcgac tagagctcgc tgatcagcct cgactgtgcc ttctagttgc cagccatctg 3120 ttgtttgccc ctcccccgtg ccttccttga ccctggaagg tgccactccc actgtccttt 3180 cctaataaaa tgaggaaatt gcatcgcatt gtctgagtag gtgtcattct attctggggg 3240 gtggggtggg gcaggacagc aagggggagg attgggaaga caatagcagg catgctgggg 3300 agagatccac gataacaaac agcttttttg gggtgaacat attgactgaa ttccctgcag 3360 gttggccact ccctctctgc gcgctcgctc gctcactgag gccgcccggg caaagcccgg 3420 gcgtcgggcg acctttggtc gcccggcctc agtgagcgag cgagcgcgca gagagggagt 3480 ggccaactcc atcactaggg gttcct 3506 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 12 ctccaccgct tgctccacct t 21 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 13 aaggtggagc aagcggtgga g 21 <210> 14 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 14 ctccaccgct tgctccacct tagtgaagcc acagatgaag gtggagcaag cggtggag 58 <210> 15 <211> 152 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 15 tggaggcttg ctgaaggctg tatgctgttg tcctccaccg cttgctccac cttagtgaag 60 ccacagatga aggtggagca agcggtggag aggacacaag gcctgttact agcactcaca 120 tggaacaaat ggccaccgtg ggaggatgac aa 152 <210> 16 <211> 3506 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 16 ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60 cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120 gccaactcca tcactagggg ttcctgctag ctctgggtat ttaagcccga gtgagcacgc 180 agggtctcca ttttgaagcg ggaggttacg cgttcgtcga ctactagtgg gtaccagagc 240 tccctaggtt ctagaaccgg tgacgtctcc catggtgaag cttggatctg aattcggtac 300 cctagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc atagcccata tatggagttc 360 cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca 420 ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt 480 caatgggtgg actatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg 540 ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag 600 tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt 660 accatggtcg aggtgagccc cacgttctgc ttcactctcc ccatctcccc cccctcccca 720 cccccaattt tgtatttatt tattttttaa ttattttgtg cagcgatggg ggcggggggg 780 gggggggggc gcgcgccagg cggggcgggg cggggcgagg ggcggggcgg ggcgaggcgg 840 agaggtgcgg cggcagccaa tcagagcggc gcgctccgaa agtttccttt tatggcgagg 900 cggcggcggc ggcggcccta taaaaagcga agcgcgcggc gggcgggagt cgctgcgacg 960 ctgccttcgc cccgtgcccc gctccgccgc cgcctcgcgc cgcccgcccc ggctctgact 1020 gaccgcgtta ctcccacagg tgagcgggcg ggacggccct tctcctcagc gctgtaatta 1080 gcgcttggtt taatgacggc ttgttggagg cttgctgaag gctgtatgct gttgtcctcc 1140 accgcttgct ccaccttagt gaagccacag atgaaggtgg agcaagcggt ggagaggaca 1200 caaggcctgt tactagcact cacatggaac aaatggccac cgtgggagga tgacaatttc 1260 tgtggctgcg tgaaagcctt gaggggctcc gggagctaga gcctctgcta accatgttca 1320 tgccttcttc tttttcctac agctcctggg caacgtgctg gttattgtgc tgtctcatca 1380 ttttggcaaa gaattcctcg aagatccgaa gggaaagtct tccacgactg tgggatccgt 1440 tcgaagatat caccggttga gccaccatga aggtgctgtg ggccgccctg ctggtgacct 1500 tcctggccgg ctgccaggcc aaagtcgaac aggccgtcga gaccgagccc gagcccgagc 1560 tgcgccagca gaccgagtgg cagagcggcc agcgctggga gctggccctg ggccgcttct 1620 gggactacct gcgctgggtg cagaccctga gcgagcaggt gcaggaggag ctgctgagca 1680 gccaggtgac ccaggagctg cgcgccctga tggacgagac catgaaagaa ctcaaagctt 1740 ataagagcga gctggaggag cagctgaccc ccgtggccga ggagacccgc gcccgcctga 1800 gcaaggagct gcaggccgcc caggcccgcc tgggcgccga catggaggac gtgtgcggcc 1860 gcctggtgca gtaccgcggc gaggtgcagg ccatgctggg ccagagcacc gaggagctgc 1920 gcgtgcgcct ggccagccac ctgcgcaagc tgcgcaagcg cctgctgcgc gacgccgacg 1980 acctgcagaa gtgcctggcc gtgtaccagg ccggcgcccg cgagggcgcc gagcgcggcc 2040 tgagcgccat ccgcgagcgc ctgggccccc tggtggagca gggccgcgtg cgcgccgcca 2100 ccgtgggcag cctggccggc cagcccctgc aggagcgcgc ccaggcctgg ggcgagcgcc 2160 tgcgcgcccg catggaggag atgggcagcc gcacccgcga ccgcctggac gaggtgaagg 2220 agcaggtggc cgaggtgcgc gccaagctgg aggagcaggc ccagcagatc cgcctgcagg 2280 ccgaggcctt ccaggcccgc ctgaagagct ggttcgagcc cctggtggag gacatgcagc 2340 gccagtgggc cggcctggtg gagaaggtgc aggccgccgt gggcaccagc gccgcccccg 2400 tgcccagcga caaccactaa caattgttaa ttaagtttaa accctcgagg ccgcaagctt 2460 atcgataatc aacctctgga ttacaaaatt tgtgaaagat tgactggtat tcttaactat 2520 gttgctcctt ttacgctatg tggatacgct gctttaatgc ctttgtatca tgctattgct 2580 tcccgtatgg ctttcatttt ctcctccttg tataaatcct ggttgctgtc tctttatgag 2640 gagttgtggc ccgttgtcag gcaacgtggc gtggtgtgca ctgtgtttgc tgacgcaacc 2700 cccactggtt ggggcattgc caccacctgt cagctccttt ccgggacttt cgctttcccc 2760 ctccctattg ccacggcgga actcatcgcc gcctgccttg cccgctgctg gacaggggct 2820 cggctgttgg gcactgacaa ttccgtggtg ttgtcgggga aatcatcgtc ctttccttgg 2880 ctgctcgcct gtgttgccac ctggattctg cgcgggacgt ccttctgcta cgtcccttcg 2940 gccctcaatc cagcggacct tccttcccgc ggcctgctgc cggctctgcg gcctcttccg 3000 cgtcttcgcc ttcgccctca gacgagtcgg atctcccttt gggccgcctc cccgcatcga 3060 taccgtcgac tagagctcgc tgatcagcct cgactgtgcc ttctagttgc cagccatctg 3120 ttgtttgccc ctcccccgtg ccttccttga ccctggaagg tgccactccc actgtccttt 3180 cctaataaaa tgaggaaatt gcatcgcatt gtctgagtag gtgtcattct attctggggg 3240 gtggggtggg gcaggacagc aagggggagg attgggaaga caatagcagg catgctgggg 3300 agagatccac gataacaaac agcttttttg gggtgaacat attgactgaa ttccctgcag 3360 gttggccact ccctctctgc gcgctcgctc gctcactgag gccgcccggg caaagcccgg 3420 gcgtcgggcg acctttggtc gcccggcctc agtgagcgag cgagcgcgca gagagggagt 3480 ggccaactcc atcactaggg gttcct 3506 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 17 tttgtaggcc ttcaactcc 19 <210> 18 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 18 ggagttgaag gcctacaaa 19 <210> 19 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 19 tttgtaggcc ttcaactcca gtgaagccac agatgggagt tgaaggccta caaa 54 <210> 20 <211> 148 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 20 tggaggcttg ctgaaggctg tatgctgttg tctttgtagg ccttcaactc cagtgaagcc 60 acagatggga gttgaaggcc tacaaaagga cacaaggcct gttactagca ctcacatgga 120 acaaatggcc accgtgggag gatgacaa 148 <210> 21 <211> 3502 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 21 ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60 cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120 gccaactcca tcactagggg ttcctgctag ctctgggtat ttaagcccga gtgagcacgc 180 agggtctcca ttttgaagcg ggaggttacg cgttcgtcga ctactagtgg gtaccagagc 240 tccctaggtt ctagaaccgg tgacgtctcc catggtgaag cttggatctg aattcggtac 300 cctagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc atagcccata tatggagttc 360 cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca 420 ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt 480 caatgggtgg actatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg 540 ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag 600 tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt 660 accatggtcg aggtgagccc cacgttctgc ttcactctcc ccatctcccc cccctcccca 720 cccccaattt tgtatttatt tattttttaa ttattttgtg cagcgatggg ggcggggggg 780 gggggggggc gcgcgccagg cggggcgggg cggggcgagg ggcggggcgg ggcgaggcgg 840 agaggtgcgg cggcagccaa tcagagcggc gcgctccgaa agtttccttt tatggcgagg 900 cggcggcggc ggcggcccta taaaaagcga agcgcgcggc gggcgggagt cgctgcgacg 960 ctgccttcgc cccgtgcccc gctccgccgc cgcctcgcgc cgcccgcccc ggctctgact 1020 gaccgcgtta ctcccacagg tgagcgggcg ggacggccct tctcctcagc gctgtaatta 1080 gcgcttggtt taatgacggc ttgttggagg cttgctgaag gctgtatgct gttgtctttg 1140 taggccttca actccagtga agccacagat gggagttgaa ggcctacaaa aggacacaag 1200 gcctgttact agcactcaca tggaacaaat ggccaccgtg ggaggatgac aatttctgtg 1260 gctgcgtgaa agccttgagg ggctccggga gctagagcct ctgctaacca tgttcatgcc 1320 ttcttctttt tcctacagct cctgggcaac gtgctggtta ttgtgctgtc tcatcatttt 1380 ggcaaagaat tcctcgaaga tccgaaggga aagtcttcca cgactgtggg atccgttcga 1440 agatatcacc ggttgagcca ccatgaaggt gctgtgggcc gccctgctgg tgaccttcct 1500 ggccggctgc caggccaaag tcgaacaggc cgtcgagacc gagcccgagc ccgagctgcg 1560 ccagcagacc gagtggcaga gcggccagcg ctgggagctg gccctgggcc gcttctggga 1620 ctacctgcgc tgggtgcaga ccctgagcga gcaggtgcag gaggagctgc tgagcagcca 1680 ggtgacccag gagctgcgcg ccctgatgga cgagaccatg aaagaactca aagcttataa 1740 gagcgagctg gaggagcagc tgacccccgt ggccgaggag acccgcgccc gcctgagcaa 1800 ggagctgcag gccgcccagg cccgcctggg cgccgacatg gaggacgtgt gcggccgcct 1860 ggtgcagtac cgcggcgagg tgcaggccat gctgggccag agcaccgagg agctgcgcgt 1920 gcgcctggcc agccacctgc gcaagctgcg caagcgcctg ctgcgcgacg ccgacgacct 1980 gcagaagtgc ctggccgtgt accaggccgg cgcccgcgag ggcgccgagc gcggcctgag 2040 cgccatccgc gagcgcctgg gccccctggt ggagcagggc cgcgtgcgcg ccgccaccgt 2100 gggcagcctg gccggccagc ccctgcagga gcgcgcccag gcctggggcg agcgcctgcg 2160 cgcccgcatg gaggagatgg gcagccgcac ccgcgaccgc ctggacgagg tgaaggagca 2220 ggtggccgag gtgcgcgcca agctggagga gcaggcccag cagatccgcc tgcaggccga 2280 ggccttccag gcccgcctga agagctggtt cgagcccctg gtggaggaca tgcagcgcca 2340 gtgggccggc ctggtggaga aggtgcaggc cgccgtgggc accagcgccg cccccgtgcc 2400 cagcgacaac cactaacaat tgttaattaa gtttaaaccc tcgaggccgc aagcttatcg 2460 ataatcaacc tctggattac aaaatttgtg aaagattgac tggtattctt aactatgttg 2520 ctccttttac gctatgtgga tacgctgctt taatgccttt gtatcatgct attgcttccc 2580 gtatggcttt cattttctcc tccttgtata aatcctggtt gctgtctctt tatgaggagt 2640 tgtggcccgt tgtcaggcaa cgtggcgtgg tgtgcactgt gtttgctgac gcaaccccca 2700 ctggttgggg cattgccacc acctgtcagc tcctttccgg gactttcgct ttccccctcc 2760 ctattgccac ggcggaactc atcgccgcct gccttgcccg ctgctggaca ggggctcggc 2820 tgttgggcac tgacaattcc gtggtgttgt cggggaaatc atcgtccttt ccttggctgc 2880 tcgcctgtgt tgccacctgg attctgcgcg ggacgtcctt ctgctacgtc ccttcggccc 2940 tcaatccagc ggaccttcct tcccgcggcc tgctgccggc tctgcggcct cttccgcgtc 3000 ttcgccttcg ccctcagacg agtcggatct ccctttgggc cgcctccccg catcgatacc 3060 gtcgactaga gctcgctgat cagcctcgac tgtgccttct agttgccagc catctgttgt 3120 ttgcccctcc cccgtgcctt ccttgaccct ggaaggtgcc actcccactg tcctttccta 3180 ataaaatgag gaaattgcat cgcattgtct gagtaggtgt cattctattc tggggggtgg 3240 ggtggggcag gacagcaagg gggaggattg ggaagacaat agcaggcatg ctggggagag 3300 atccacgata acaaacagct tttttggggt gaacatattg actgaattcc ctgcaggttg 3360 gccactccct ctctgcgcgc tcgctcgctc actgaggccg cccgggcaaa gcccgggcgt 3420 cgggcgacct ttggtcgccc ggcctcagtg agcgagcgag cgcgcagaga gggagtggcc 3480 aactccatca ctaggggttc ct 3502 <210> 22 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 22 tattagatct gatggccgc 19 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 23 ctccatcact aggggttcct 20 <210> 24 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 24 agctctgggt atttaagccc gagtgagcac gcagggtctc cattttgaag cgggaggtta 60 <210> 25 <211> 145 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 25 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 120 gagcgcgcag agagggagtg gccaa 145

Claims

APOE4의 발현 또는 활성을 억제하는 억제성 핵산 및 APOE2를 발현하는 트랜스진을 코딩하는 발현 구축물을 포함하는 단리된 핵산.
제1항에 있어서, 억제성 핵산이 서열식별번호(SEQ ID NO): 5-8, 12-15 및 17-20 중 어느 하나에 제시된 서열에 의해 코딩된 것인 단리된 핵산.
제1항 또는 제2항에 있어서, 억제성 핵산이 서열식별번호: 7, 8, 14, 15, 19 및 20 중 어느 하나에 제시된 서열에 의해 코딩된 것인 단리된 핵산.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, APOE2를 발현하는 트랜스진이 서열식별번호: 3에 제시된 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩하는 것인 단리된 핵산.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, APOE2를 발현하는 트랜스진이 코돈 최적화된 핵산 서열을 포함하고, 임의로 핵산 서열이 서열식별번호: 4에 제시된 것인 단리된 핵산.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 발현 구축물이 아데노-연관 바이러스 (AAV) 역위 말단 반복부 (ITR)에 의해 플랭킹된 것인 단리된 핵산.
제6항에 있어서, ITR이 AAV2 ITR인 단리된 핵산.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 핵산이 서열식별번호: 11, 16 및 21 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함하는 것인 단리된 핵산.
APOE2 단백질을 코딩하는 발현 구축물을 포함하는 단리된 핵산이며, 단리된 핵산은 서열식별번호: 4에 제시된 서열을 포함하는 것인, 단리된 핵산.
APOE4의 발현 또는 활성을 억제하는 억제성 핵산을 코딩하는 발현 구축물을 포함하는 단리된 핵산.
제9항 또는 제10항에 있어서, 발현 구축물이 아데노-연관 바이러스 (AAV) 역위 말단 반복부 (ITR)에 의해 플랭킹되고, 임의로 ITR이 AAV2 ITR인 단리된 핵산.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 프로모터를 추가로 포함하며, 임의로 하나 이상의 프로모터가 각각 독립적으로 치킨-베타 액틴 (CBA) 프로모터, CAG 프로모터, CD68 프로모터 또는 JeT 프로모터인 단리된 핵산.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 단리된 핵산을 포함하는 벡터.
제13항에 있어서, 플라스미드인 벡터.
제13항에 있어서, 벡터가 바이러스 벡터이고, 임의로 바이러스 벡터가 재조합 AAV (rAAV) 벡터 또는 바큘로바이러스 벡터인 벡터.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 단리된 핵산 또는 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항의 벡터를 포함하는 조성물.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 단리된 핵산 또는 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
(i) 캡시드 단백질; 및
(ii) 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 단리된 핵산 또는 제15항의 벡터
를 포함하는 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV).
제18항에 있어서, 캡시드 단백질이 혈액-뇌 장벽을 건널 수 있고, 임의로 캡시드 단백질이 AAV9 캡시드 단백질 또는 AAVrh.10 캡시드 단백질인 rAAV.
제18항 또는 제19항에 있어서, 중추 신경계 (CNS)의 뉴런 세포 및 비-뉴런 세포를 형질도입시키는 rAAV.
알츠하이머병을 갖고 있거나 가질 것으로 의심되는 대상체에게 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 단리된 핵산, 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항의 벡터, 제16항의 조성물, 또는 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항의 rAAV를 투여하는 것을 포함하는, 알츠하이머병을 갖고 있거나 가질 것으로 의심되는 대상체를 치료하는 방법.
제21항에 있어서, 투여가 대상체의 CNS로의 직접 주사를 포함하고, 임의로 직접 주사가 대뇌내 주사, 뇌실질내 주사, 경막내 주사 또는 이들의 임의의 조합인 방법.
제22항에 있어서, 대상체의 CNS로의 직접 주사가 대류 향상 전달 (CED)을 포함하는 것인 방법.
제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 투여가 말초 주사를 포함하고, 임의로 말초 주사가 정맥내 주사인 방법.
제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 APOE4 대립유전자에 대해 동형접합인 방법.