KR102127125B1 - 면역체크포인트 억제제를 포함하는 항암용 조성물 - Google Patents

면역체크포인트 억제제를 포함하는 항암용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 (1) 면역체크포인트 억제제; (2) 비구아나이드계(biguanide) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; 및 (3) 2-데옥시-D-글루코스(2-deoxy-D-glucose)을 유효성분으로, 또는 이에 (4) 이노시톨 헥사포스페이트(inositol hexaphosphate) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이노시톨(inositol), 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 더 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 조성물은 제한된 적응증을 가진 면역체크포인트 억제제에 대해 다양한 암종으로 적응증을 늘릴뿐만 아니라 특정 약물들을 적절히 조합하여 상승적 항암 효과를 나타내어 치료 효과를 극대화하면서 부작용없이 암세포만을 사멸시킬 수 있으므로 암의 예방 또는 치료를 위한 항암제로서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

면역체크포인트 억제제를 포함하는 항암용 조성물 {Anticancer compositions comprising immune checkpoint inhibitors}
본 발명은 면역체크포인트 억제제와 함께 추가의 항암 효과를 나타낼 수 있는 유효성분들을 포함하는 항암용 조성물에 관한 것이다.
암은 현대의학이 정복하지 못한 대표적인 난치성 질환 가운데 하나이며, 전통적인 치료 방법인 수술, 방사선, 항암제 투여 등의 경우 단기적으로 치료효과를 보일 수 있으나 세포독성, 전이, 재발 등 많은 부작용이 나타는 문제를 해결하기 위해 새로운 치료제 개발이 절실하다. 전통적인 종양 치료 방법은 외과적 수술, 화학약물 치료제를 거쳐 표적치료제 개발로 이어졌으며, 최근 들어 면역 환경을 조절하는 면역체크포인트 항체(immune check point antibody)의 등장으로 면역치료의 중요성이 크게 부각되고 있다 (Couzin-Frankel, Science 2013;342:1432-1433).
항암 면역 반응의 억제는 치료에 대한 종양 저항의 중요한 기전으로 나타났으며, 면역체크포인트 수용체인 CTLA-4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4)와 PD-1(programmed death-1) 또는 이의 리간드 PD-L1(programmed death-ligand 1)을 차단하는 단일 클론 항체등의 개발을 통해 환자의 내인성 항암 면역 반응을 자극 및/또는 확대하는 것이 가능하게 되었다.
이러한 경로는 면역 조절에서 뚜렷한 역할을 할 수 있으며, 예컨대 CTLA-4는 일차적으로 림프절에서 T 세포 증식을 조절하는 반면, PD-1은 주로 종양 미세 환경에서 T 세포를 억제한다. 이러한 면역체크포인트 억제제는 최근 다양한 종류의 종양 유형, 특히 흑색종 및 비소세포 폐암에 대해 탁월한 효능을 입증했으며, 신속하게 환자의 표준 치료 요법이 되었다.
현재까지 FDA에서 시판 허가를 받은 면역체크포인트 억제제는 미국 제약사 브리스톨 마이어스 스퀴브(BMS)의 여보이(CTLA4 억제제·성분명 이필리무맙)와 옵디보(PD-1 억제제·성분명 니볼루맙), 미국 제약사 머크(MSD)의 키트루다(PD-1 억제제·성분명 펨브롤리주맙), 스위스 제약사 로슈의 테센트릭(PD-L1 억제제·성분명 아테졸리주맙), 미국 제약사 화이자와 독일 머크가 공동개발한 바벤시오(PD-L1 억제제·성분명 아벨루맙), 영국 제약사 아스트라제네카의 임핀지(PD-L1 억제제·성분명 더발루맙) 등 총 6개다.
그러나 면역체크포인트 억제제는 일반적으로 위장관, 내분비선, 피부 및 간을 해치는 면역 관련 부작용이 있다. 이러한 부작용은 대부분 활성화된 T 림프구에 의한 결과로 면역체계의 이상반응과 연관된 것으로 알려졌다.
또한 면역체크포인트 억제제는 소수의 환자에게만 효과적이다. 대부분의 진행된 암에서 항 PD-1/PD-L1 단일 요법의 반응률은 약 20 %이며, 항 CTLA-4의 반응률은 약 12 %이며 이는 개선의 필요성이 있음을 알 수 있다 (Borghaei et al., N Engl J Med. 2015; 373:1627-1639). 이 낮은 효능은 기존의 종양 관련 T 세포 면역이 결핍되어 있기 때문일 수 있다 (Elizabeth et al., Am J Clin Oncol. 2016 Feb; 39(1): 98-106).
이러한 면역체크포인트 억제제의 치료 효과를 극대화하기 위해 다른 항암제와의 병용 임상을 연구하고 있다. 한 예로 진행성 흑색종 치료에 두 가지 면역항암제(니볼루맙과 이필리무맙 병용치료)를 각각의 단독 요법보다 생존율 개선 효과가 더 큰 것으로 나타났다. 하지만 10명 중 4명은 치료를 중단할 만큼 치료관련된 부작용도 높았다. 이처럼 암이 유발되었을 때는 두 가지 이상의 치료법을 병용하는 것이 오늘날 암 치료의 초석이 되었지만, 면역체크포인트 억제제의 경우에는 높은 반응률과 함께 치료 중단율도 상대적으로 높은 결과를 보이고 있다.
따라서 항암제에 의한 부작용을 최소화하면서 치료 효과를 상승시키기 위한 연구가 절실하다.
또한 항암 치료가 실패하는 주요 원인은 항암제가 초기에는 효과를 나타내지만 점차 약제 내성이 발현되고, 면역력이 극도로 악화되기 때문이다. 따라서 약제의 독성을 증가시키지 않으면서 암 치료 효능을 개선시키는 방법이 필요하다. 항암제의 효능을 향상시키는 한 방식으로 항암제를 조합하여 사용할 수 있는데, 불행하게도, 항암효과가 있는 약물을 조합한다고 해서 모두 상승효과를 나타낸다고 기대할 수 없으며, 상승효과를 갖는 약물의 조합을 발견하는 것은 매우 어려운 일이다. 따라서 항암제의 부작용을 최소화하면서, 항암효과가 최대로 발휘될 수 있는 항암 복합 제제의 개발이 시급한 실정이다.
최근 암세포의 신진 대사와 성장에 중요한 세포 신호 전달 경로를 표적으로 하는 항암 치료법을 개발하는 데 현재 많은 관심의 대상이 되고 있는데 암세포의 대사에 관여하는 대표적 약물에는 비구아나이드(biguanide) 계열 화합물인 메트포르민(Metformin)과 2-데옥시-D-글루코오스(2-deoxy-D-glucose)가 있다 (Wokoun et al., Oncol Rep. 2017;37:2418-2424).
항고혈당제로서 메트포르민은 수십 년 동안 제 2 형 당뇨병의 첫 번째 치료제로 사용되고 있다. 항당뇨병 치료제로서의 메트포르민의 광범위한 사용에도 불구하고, 2001 년에 포유류에서 잠재적인 항암 효과가 처음 보고되었다. 또한 메트포민으로 치료한 제 2 형 당뇨병 환자의 암 위험 감소에 대한 첫 번째 보고서는 불과 10 년 전에 발표되었다. 그 이후로 많은 논문에서 메트포르민은 난소암을 비롯한 여러 암세포주 및 이종 이식 동물 또는 형질 전환 쥐에서 일관된 항증식 작용을 나타냈다. 대사와 관련하여 메트포르민은 복합 I 및 ATP synthase 억제제의 새로운 부류로 밝혀졌으며, 미토콘드리아에 직접 작용하여 호흡을 제한하여 에너지를 비효율적으로 만들고 구연산 순환을 통해 포도당 대사를 감소시킨다 (Andrzejewski et al., 2014;2:12-25).
2-데옥시-D-글루코오스는 해당 과정에 대한 종양 세포의 의존성 때문에 잠재적인 항암제로 간주되어 왔다. 2-데옥시-D-글루코오스는 글루코오스 유사체로, 글루코스 전달체에 의해 쉽게 흡수될 수 있고, 해당 작용의 경쟁적 억제제로서 작용하여 ATP 생산을 감소시켜 고형 종양에서 카스파제-3의 활성화를 통해 세포 사멸을 유도한다 (Zhang et al., Cancer Lett. 2014;355:176-183).
일반적으로 사용되는 메트포르민과 2-데옥시-D-글루코오스의 용량으로는 암을 충분히 치료하기엔 부족하고, 고용량 치료 시 이상반응이 나타날 수 있다는 한계점을 가지고 있다 (Raez et al., Cancer Chemother Pharmacol. 2013;71:523-530). 정(Cheong) 등이 연구한 메트포르민과 2-데옥시-D-글루코오스의 병용 치료가 유방암 세포주에 효과가 있음을 나타내었으나, 이는 사람의 인체 내에서 견딜 수 있는 농도 또는 혈장 내 투여 가능한 농도보다 높았다 (Cheong et al., Mol Cancer Ther. 2011;10:2350-2362). 다른 논문에서는 메트포르민과 2-데옥시-D-글루코오스의 조합이 인간의 혈장에서 사용 가능한 농도보다 높은 메트포르민 농도를 사용하여 전립선암 세포에서 성공적으로 테스트되었다 (Ben Sahra et al., Cancer Res. 2010;70:2465-2475). 이는 임상적으로 유효한 항암제인 메트포르민과 2-데옥시-D-글루코오스가 생체 내에서 합리적으로 달성할 수 있는 범위 내에서 그 치료 농도를 낮추는 것이 바람직함을 시사한다.
한편, 이노시톨 헥사포스페이트와 이노시톨은 대부분의 곡물, 종자, 콩과 식물에 다량 함유되어 있으며 포유동물 세포에도 존재하는 자연 유기인 화합물이며, 인산염이 적은 인산염 형태(IP1-5)와 함께 존재한다. 이노시톨 헥사포스페이트는 다양한 세포의 신호 전달, 세포 증식 및 분화와 같은 중요한 세포 기능을 조절에 중요한 역할을 하며, 천연 항산화 물질로 인정받고 있다 (Shamsuddin et al., J Nutr. 2003;133:3778S-3784S).
최근 이노시톨 헥사포스페이트는 암 예방과 실험 종양의 성장, 진행 및 전이에 대한 억제 효과가 일부 보고된 바가 있다 (Vucenik et al., Nutr Cancer. 2006;55:109-125).
예비 임상 연구에서는 이노시톨 헥사포스페이트와 이노시톨을 화학 요법과 병용 투여하면 화학 요법의 부작용을 줄이고 간 전이가 있는 유방암이나 대장암 환자의 삶의 질이 향상된다는 보고가 있으나, 아직도 이노시톨 헥사포스페이트 또는 이노시톨 헥사포스페이트 및 이노시톨로 복합 제제로 된 것만으로는 효과적으로 암세포 성장을 억제하는 것이 어려운 실정이다.
이에 본 발명은 (1) 면역체크포인트 억제제; (2) 비구아나이드계(biguanide) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; 및 (3) 2-데옥시-D-글루코스(2-deoxy-D-glucose)를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 (1) 면역체크포인트 억제제; (2) 비구아나이드계(biguanide) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; (3) 2-데옥시-D-글루코스(2-deoxy-D-glucose); 및 (4) 이노시톨 헥사포스페이트(inositol hexaphosphate) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이노시톨(inositol), 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 약학 조성물은 각 화합물의 저농도의 조합으로도 효과적으로 암세포를 사멸시킬 수 있어 인체의 안전성 확보와 더불어 앞으로 암 치료 분야에서 크게 활용될 것으로 기대되며, 특히 암세포 특이적으로 독성효과를 나타내어 부작용이 감소된 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물로 역할이 가능하다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 (1) 면역체크포인트 억제제; (2) 비구아나이드계(biguanide) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; 및 (3) 2-데옥시-D-글루코스(2-deoxy-D-glucose)를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 상기 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물은 추가의 유효성분으로 (4) 이노시톨 헥사포스페이트(inositol hexaphosphate) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이노시톨(inositol), 또는 이들의 혼합물을 더 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 (1) 면역체크포인트 억제제; (2) 비구아나이드계(biguanide) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; (3) 2-데옥시-D-글루코스(2-deoxy-D-glucose); 및 (4) 이노시톨 헥사포스페이트(inositol hexaphosphate) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이노시톨(inositol), 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 위 약학 조성물들은 개별적 소량의 유효성분들을 포함하여 부작용이 적으면서도 암을 효과적으로 치료할 수 있는 우수한 효과를 가진다. 본 발명의 약학 조성물은 단일 화합물로 치료하는 경우보다 복합 제제에 포함되는 개별 화합물의 양을 더 적게 사용할 수 있으며, 이로 인해 부작용의 위험 및/또는 심각성은 상당 수준 낮추면서 치료의 전체적 효과는 유의미하게 높일 수 있는 장점이 있다.
특히 본 발명에 따르면, 면역체크포인트 수용체인 CTLA-4와 PD-1 또는 이의 리간드 PD-L1을 차단하는 면역체크포인트 억제제들은 본 발명에 따른 약학 조성물에 포함되어 사용되었을 때 낮은 농도로도 우수한 항암 효과를 나타내는 장점을 가진다.
이하, 본 발명을 자세히 설명한다.
본 발명의 약학 조성물은 (1) 면역체크포인트 억제제를 유효성분으로 포함한다.
면역체크포인트 억제제는 면역 억제력이 높은 암에서 면역 반응의 진행을 막는 면역체크포인트를 차단하여 암의 면역 회피를 억제함으로서 암을 치료할 수 있다. 면역체크포인트 억제제(immune checkpoint inhibitor)는 면역학 분야의 발전으로 인체 면역 체계에 대한 많은 이해가 이루어진 결과에 따라 개발된 새로운 종양 치료제로서 항암 전략에 많이 사용되고 있다. 면역체크포인트 억제제를 사용하여 항암 효과를 나타내기 위한 예시적인 기전으로 CTLA-4에 의한 T 림프구 억제 기전과 기활성화된 T 림프구를 억제하는 PD-1/PD-L1 기전이 있다. 그러나, 면역체크포인트 억제제만을 이용한 치료는 치료 효율이 낮고 효과가 미비하다는 등의 한계가 보고되고 있다.
그러나, 본 발명의 약학 조성물은 다른 치료기전의 유효성분들을 면역체크포인트 억제제와 병용 투여하여 상승 보완 효과로 인하여 암의 예방 및 치료에 도움을 준다.
면역체크포인트 억제제는 항체, 융합 단백질, 압타머 또는 이의 면역체크포인트 단백질-결합 단편일 수 있다. 예를 들어, 면역체크포인트 억제제는 항- 면역체크포인트 단백질 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
특정 예에서, 면역체크포인트 억제제는 항-CTLA4 항체, 이의 유도체 또는 이의 항원-결합 단편; 항-PD-L1 항체, 이의 유도체 또는 이의 항원-결합 단편; 항-LAG-3 항체, 이의 유도체 또는 이의 항원-결합 단편; 항-OX40 항체, 이의 유도체 또는 이의 항원-결합 단편; 항-TIM3 항체, 이의 유도체 또는 이의 항원-결합 단편; 및 항-PD-1 항체, 이의 유도체 또는 이의 항원-결합 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상이다.
예를 들어, 면역체크포인트 억제제는 이필리무맙(Ipilimumab), 이의 유도체 또는 이의 항원-결합 단편; 트레멜리무맙(Tremelimumab), 이의 유도체 또는 이의 항원-결합 단편; 니볼루맙(Nivolumab), 이의 유도체 또는 이의 항원-결합 단편; 페브롤리주맙(pembrolizumab), 이의 유도체 또는 이의 항원-결합 단편; 피딜리주맙(Pidilizumab), 이의 유도체 또는 이의 항원-결합 단편; 아테졸리주맙(Atezolizumab), 이의 유도체 또는 이의 항원-결합 단편; 더발루맙(Durvalumab), 이의 유도체 또는 이의 항원-결합 단편; 아밸루맙(Avelumab), 이의 유도체 또는 이의 항원-결합 단편; BMS-936559, 이의 유도체 또는 이의 항원-결합 단편; BMS-986016, 이의 유도체 또는 이의 항원-결합 단편; GSK3174998, 이의 유도체 또는 이의 항원-결합 단편; TSR-022, 이의 유도체 또는 이의 항원-결합 단편; MBG453, 이의 유도체 또는 이의 항원-결합 단편; LY3321367, 이의 유도체 또는 이의 항원-결합 단편; 및 IMP321 재조합 융합 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으며, 면역체크포인트 억제제로 사용될 수 있는 항체 또는 다른 형태의 면역체크포인트 억제제라면 제한없이 사용될 수 있다.
구체적으로, 항-CTLA4 항체, 항-PD-1 항체, 항-LAG-3 항체, 항-OX40 항체, 항-TIM3 항체 및 항-PD-L1 항체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상이 바람직하다. 상기 항체는 예컨대, 통상의 항체 제조 업체 등으로부터 구입하여 사용하거나 알려진 항체의 제조방법에 따라 제조하여 사용할 수도 있다.
상기 면역체크포인트 억제제는 위 언급된 면역체크포인트 억제제로 작용 효과가 있거나 이의 억제 메커니즘에 관여하는 저분자 화합물일 수 있다. 이러한 저분자 화합물들은 예를 들어 면역체크포인트 단백질에 결합하거나 면역체크포인트 억제에 관련된 메커니즘에 관여하는 저분자 화합물일 수 있다.
구체적으로, 저분자 화합물들은 BMS-202 (출처: BMS), BMS-8 (출처: BMS), CA170(출처: Curis/Aurigene), CA327(출처: Curis/Aurigene), Epacadostat, GDC-0919, BMS-986205 등일 수 있다. 면역체크포인트 억제제로 사용되거나 관련 효과가 있는 저분자 화합물이라면 제한없이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 (2) 비구아나이드계(biguanide) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함한다.
본 발명에서, 비구아나이드계 화합물은 예컨대 메트포르민(Metformin) 또는 펜포르민(Phenformin)이다. 구체적으로 메트포르민은 하기 화학식 1의 구조식을 가진다.
[화학식 1]
Figure 112018132249060-pat00001
구체적으로 펜포르민은 하기 화학식 2의 구조식을 가진다.
[화학식 2]
Figure 112018132249060-pat00002
본 발명에서는 (1) 면역체크포인트 억제제; (2) 비구아나이드계(biguanide) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; 및 (3) 2-데옥시-D-글루코스(2-deoxy-D-glucose)를 복합 제제로 사용하였을 때 적은 농도에서도 높은 항암 효과를 나타낸다. 또한, (4) 이노시톨 헥사포스페이트(inositol hexaphosphate) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이노시톨(inositol), 또는 이들의 혼합물을 더 포함하는 경우 보다 더 우수한 항암 효과를 나타낸다.
비구아나이드 계열 약물들은 이에 한정되는 것은 아니나 세포 내 에너지 밸런스 및 영양분 대사 조절에 중추적인 역할을 하고 있는 AMPK(AMP-activated kinase)라는 효소를 활성화시키는 작용 기전을 통해 항암 효과를 나타낼 수 있다.
랫트(rat)에 메트포르민을 경구 투여 시, LD50이 1,450 mg/kg으로서, 메트포르민은 매우 안전성이 확보된 화합물이라는 것을 알 수 있으나, 여전히 고용량으로 사용되어야 하는 문제가 있다. 한편 펜포르민은 경구용 당뇨병 치료제로 1950년 후반에 개발되어 인슐린 비의존형 당뇨병(제2형 당뇨병)의 치료에 사용되고자 하였으나, 유산산증(Lactic acidosis)이라는 심각한 부작용으로 인해 1970년대 후반 사용이 전면 금지되었다.
본 발명에서는 앞서 언급된 복합 제제가 각각의 단일 제제 또는 2종 화합물의 조합인 조성물보다 훨씬 낮은 농도에서도 높은 항암효과를 나타내면서도 메트포르민 또는 펜포르민이 가지고 있는 고용량 투여의 문제 또는 부작용의 문제점을 개선할 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 약학 조성물은 (3) (3) 2-데옥시-D-글루코스(2-deoxy-D-glucose);을 유효성분으로 포함한다.
본 발명에서, 2-데옥시-D-글루코스는 화학식 3으로 표시되는 구조를 갖는다.
[화학식 3]
Figure 112018132249060-pat00003
위 화학식 3의 화합물은 해당 작용의 억제제로 작용 효과를 가진다.
2-데옥시-D-글루코스는 포도당의 유도체로써 포도당 대사과정에 있어서 해당작용(glycolysis)을 억제하고, 소포체 내 단백질의 당화(glycosylation)를 저해하여 소포체 스트레스를 유도하는 작용효과를 가진다. 이처럼 포도당 분해 억제제인 2-데옥시-D-글루코스는 단독으로는 암세포를 죽이지는 못하는 것으로 나타났지만, 본 발명의 복합 제제를 이루어 우수한 항암 효과를 나타낸다.
본 발명의 약학 조성물은 추가의 유효성분으로 (4) 이노시톨 헥사포스페이트(inositol hexaphosphate) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이노시톨(inositol), 또는 이들의 혼합물을 더 포함할 수도 있다.
본 발명에서, 이노시톨 헥사포스페이트 및/또는 이노시톨은 암세포에서 여러 가지 중요한 경로를 조절할 수 있다. 본 발명에서, 이노시톨 헥사포스페이트는 구체적으로 화학식 4의 구조를 가진다.
[화학식 4]
Figure 112018132249060-pat00004
본 발명에서, 이노시톨은 구체적으로 화학식 5의 구조를 가진다.
[화학식 5]
Figure 112018132249060-pat00005
본 발명에서는 이노시톨 헥사포스페이트(inositol hexaphosphate) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이노시톨(inositol), 또는 이들의 혼합물을 면역체크포인트 억제제, 비구아나이드계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및 2-데옥시-D-글루코스에 조합함으로써 낮은 농도에서도 높은 항암효과가 나타남을 확인하였다.
본 발명에서 비구아나이드계 화합물 및 이노시톨 헥사포스페이트는 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 존재할 수 있다. 염으로는 약학적으로 허용가능한 유리산에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 본 명세서에 사용된 바와 같이 "약학적으로 허용 가능한 염"이란 환자에게 비교적 비독성이고 무해한 유효작용을 갖는 농도로서 이 염에 기인한 부작용이 비구아나이드계 화합물 및 이노시톨 헥사포스페이트의 이로운 효능을 저하시키지 않는 임의의 모든 유기 또는 무기 부가염을 의미한다.
이때, 부가염으로서 무기산으로는 염산, 인산, 황산, 질산, 주석산 등을 사용할 수 있고, 유기산으로는 메탄설폰산, p-톨루엔설폰산, 아세트산, 트라이플루오로아세트산, 말레인산, 석신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산, 만데르산, 프로피온산, 구연산, 젖산, 글리콜산, 글루콘산, 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산, 글루쿠론산, 아스파르트산, 아스코르브산, 카본산, 바닐릭산, 요오드화수소산 등을 사용할 수 있으며, 이들에 제한되지 않는다.
또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속염 또는 알칼리 토금속염은, 예를 들어 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해시키고, 비용해 화합물 염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로는 특히 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘염 또는 이들의 혼합 염을 제조하는 것이 제약상 적합하나 이들에 제한되는 것은 아니다.
비구아나이드계 화합물(메트포르민 또는 펜포르민)과 이노시톨 헥사포스페이트 각각의 약학적으로 허용가능한 염은, 달리 지시되지 않는 한, 비구아나이드계 화합물(메트포르민 또는 펜포르민)과 이노시톨 헥사포스페이트 각각에 존재할 수 있는 산성 또는 염기성 기의 염을 포함한다. 예를 들어, 약학적으로 허용가능한 염으로는 하이드록시기의 나트륨, 칼륨, 칼슘 또는 마그네슘 염 등이 포함될 수 있고, 아미노기의 기타 약학적으로 허용가능한 염으로는 하이드로 브롬화물, 황산염, 수소 황산염, 인산염, 수소 인산염, 이수소 인산염, 아세테이트, 석시네이트, 시트레이트, 타르트레이트, 락테이트, 만델레이트, 메탄설포네이트(메실레이트) 및 p-톨루엔설포네이트(토실레이트) 염 등이 있으며, 당업계에 알려진 염의 제조방법을 통하여 제조될 수 있다.
본 발명의 비구아나이드계 화합물(메트포르민 또는 펜포르민)의 염으로는 약학적으로 허용가능한 염으로서, 메트포르민 또는 펜포르민과 동등한 항암효과를 나타내는 메트포르민 또는 펜포르민 염이라면 모두 사용가능하며, 바람직하게는 염산메트포르민, 숙신산메트포르민, 구연산메트포르민 또는 염산펜포르민, 숙신산펜포르민, 구연산펜포르민 등이 가능하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 이노시톨 헥사포스페이트 염으로는 약학적으로 허용가능한 염으로서, 이노시톨 헥사포스페이트와 동등한 항암효과를 나타내는 이노시톨 헥사포스페이트 염이라면 모두 사용가능하며, 바람직하게는 이노시톨 헥사포스페이트나트륨, 이노시톨 헥사포스페이트칼륨, 이노시톨 헥사포스페이트칼슘, 이노시톨 헥사포스페이트암모늄, 이노시톨 헥사포스페이트마그네슘, 이노시톨 헥사포스페이트칼슘마그네슘 등이 가능하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 비구아나이드계 화합물, 2-데옥시-D-글루코스, 및 이노시톨 헥사포스페이트는 각각 이들의 유도체도 포함한다. 상기 "유도체"란 상기 화합물의 항암 활성이 변하지 않는 한도 내에서 상기 화합물의 일부를 화학적으로 변화, 예를 들어, 작용기의 도입, 치환, 결실시켜 제조한 화합물을 의미하는 것으로, 본 발명에 제한없이 포함될 수 있다.
본 발명에서 이노시톨은 다양한 이성질체로의 형태로 존재할 수 있다. 이성질체는 거울상 이성질체와 부분입체이성질체를 모두 포함한다. 약학적으로 항암효과를 나타내는 이노시톨이라면 모두 사용가능하며, 바람직하게는 D-카이로이노시톨(D-chiro-inositol), L-카이로이노시톨(L-chiro-inositol), 미오이노시톨(myo-inositol) 및 실로이노시톨(scyllo-inositol)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상이 가능하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
각각 항암 효과가 알려진 2종 이상의 약물을 조합한다고 해서, 조합된 약물이 서로 상승효과(시너지 효과)를 나타낸다고 기대할 수 없으며, 오히려, 조합에 의해 약물의 기능이 상쇄되는 경우가 있어, 상승 효과를 갖는 약물의 조합을 발견하는 것은 매우 어려운 일이다. 본 발명에서는 항암제의 최소 농도 사용으로 부작용을 최소화하면서 항암 효과는 최대한 발휘할 수 있는 항암 복합 제제를 개발하였다.
본 발명에서 바람직한 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물의 양태는,
면역체크포인트 억제제, 비구아나이드계 화합물 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염, 및 2-데옥시-D-글루코스를 포함하는 조성물;
면역체크포인트 억제제, 비구아나이드계 화합물 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염, 2-데옥시-D-글루코스, 및 이노시톨 헥사포스페이트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 조성물;
면역체크포인트 억제제, 비구아나이드계 화합물 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염, 2-데옥시-D-글루코스, 및 이노시톨을 포함하는 조성물; 또는
면역체크포인트 억제제, 비구아나이드계 화합물 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염, 2-데옥시-D-글루코스, 이노시톨 헥사포스페이트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 이노시톨을 포함하는 조성물일 수 있다.
본 발명에서 상기 면역체크포인트 억제제는 예컨대, 항-CTLA4 항체, 항-PD-1 항체, 항-LAG-3 항체, 항-OX40 항체, 항-TIM3 항체, 항-PD-1 항체 및 항-PD-L1 항체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 보다 바람직하게, 항-CTLA4 항체, 항-PD-1 항체 및 항-PD-L1 항체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 어느 하나이다. 또는 상기 면역체크포인트 억제제는 면역체크포인트 단백질에 결합하거나 면역체크포인트 억제에 관련된 메커니즘에 관여하는 저분자 화합물일 수 있다.
예를 들어, 상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서 항-CTLA-4 항체/메트포르민/2-데옥시-D-글루코스의 복합 제제, 항-CTLA-4 항체/메트포르민/2-데옥시-D-글루코스/이노시톨 헥사포스페이트의 복합 제제, 항-CTLA-4 항체/메트포르민/2-데옥시-D-글루코스/이노시톨의 복합 제제 및 항-CTLA-4 항체/메트포르민/2-데옥시-D-글루코스/이노시톨 헥사포스페이트/이노시톨의 복합 제제는 각 화합물의 단일 제제나 2종의 화합물이 포함된 복합 제제보다 종양 크기를 감소시키는 효과가 매우 높게 나타났다.
또한 상기 목적을 달성하기 위한 다른 양태로서, 항-PD-1 항체/메트포르민/2-데옥시-D-글루코스의 복합 제제, 항-PD-1 항체/메트포르민/2-데옥시-D-글루코스/이노시톨 헥사포스페이트의 복합 제제, 항-PD-1 항체/메트포르민/2-데옥시-D-글루코스/이노시톨의 복합 제제 및 항-PD-1 항체/메트포르민/2-데옥시-D-글루코스/이노시톨 헥사포스페이트/이노시톨의 복합 제제는 각 화합물의 단일 제제나 2종의 화합물이 포함된 복합 제제보다 종양 크기를 감소시키는 효과가 매우 높게 나타났다.
또한 상기 목적을 달성하기 위한 다른 양태로서, 항-PD-L1 항체/메트포르민/2-데옥시-D-글루코스의 복합 제제, 항-PD-L1 항체/메트포르민/2-데옥시-D-글루코스/이노시톨 헥사포스페이트의 복합 제제, 항-PD-L1 항체/메트포르민/2-데옥시-D-글루코스/이노시톨의 복합 제제 및 항-PD-L1 항체/메트포르민/2-데옥시-D-글루코스/이노시톨 헥사포스페이트/이노시톨의 복합 제제는 각 화합물의 단일 제제나 2종의 화합물이 포함된 복합 제제보다 종양 크기를 감소시키는 효과가 매우 높게 나타났다.
본 발명에서 상기 비구아나이드계 화합물로서는 메트포르민 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 펜포르민 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염일 수 있다.
비구아나이드계 화합물로서는 메트포르민을 중심으로 한 조성물을 살펴보면, 본 발명의 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물은
면역체크포인트 억제제, 메트포르민 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염 및 2-데옥시-D-글루코스을 포함하는 조성물;
면역체크포인트 억제제, 메트포르민 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염, 2-데옥시-D-글루코스, 및 이노시톨 헥사포스페이트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 조성물;
면역체크포인트 억제제, 메트포르민 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염, 2-데옥시-D-글루코스, 및 이노시톨을 포함하는 조성물;
면역체크포인트 억제제, 메트포르민 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염, 2-데옥시-D-글루코스, 이노시톨 헥사포스페이트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 이노시톨을 포함하는 조성물일 수 있다.
또 다른 비구아나이드계 화합물로서는 펜포르민을 중심으로 한 조성물을 살펴보면, 본 발명의 암의 예방 또는 치료용 조성물은
면역체크포인트 억제제, 펜포르민 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염, 및 2-데옥시-D-글루코스을 포함하는 조성물;
면역체크포인트 억제제, 펜포르민 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염, 2-데옥시-D-글루코스, 및 이노시톨 헥사포스페이트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 조성물;
면역체크포인트 억제제, 펜포르민 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염, 2-데옥시-D-글루코스, 및 이노시톨을 포함하는 조성물;
면역체크포인트 억제제, 펜포르민 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염, 2-데옥시-D-글루코스, 이노시톨 헥사포스페이트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 이노시톨을 포함하는 조성물일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 본 발명에 따른 약학 조성물이 암 동물 모델에서 현저히 우수한 효과로 암을 억제할 수 있음을 확인하였다. 즉, 본 발명에 따르면, 면역체크포인트 억제제, 비구아나이드계 화합물, 2-데옥시-D-글루코스, 이노시톨 헥사포스페이트 및 이노시톨 각각은 단독으로 사용할 경우 항암 효과가 미비하여 과량으로 사용해야만 하나, 상기 화합물을 조합한 복합 제제로 사용하게 되면, 적은 양으로도 암세포를 효과적으로 사멸할 수 있음을 확인하였다.
본 발명에 따른 각 약학 조성물에서, 각 화합물의 조합의 중량비는 특별히 제한되지 않는다.
예를 들어, 면역체크포인트 억제제로 단일 클론 항체로 예컨대 항-CTLA4 항체, 항-PD-1 항체, 항-LAG-3 항체, 항-OX40 항체, 항-TIM3 항체, 항-PD-1 항체 및 항-PD-L1 항체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상은 1회 투여량이 0.01-25 mg/kg 범위 내에서 사용할 수 있다.
면역체크포인트 억제제를 제외한 화합물은 치료하는 암의 종류에 따라 하기와 같은 범위로 사용할 수 있다.
예를 들어, 메트포르민 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 : 2-데옥시-D-글루코스의 중량비는 1:0.2 내지 1:5 범위일 수 있으며, 치료하는 암의 종류에 따라 조합 상대적 양은 달라질 수 있다.
예를 들어, 펜포르민 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 : 2-데옥시-D-글루코스의 중량비는 1:1 내지 1:50 범위일 수 있으며, 치료하는 암의 종류에 따라 조합 상대적 양은 달라질 수 있다.
또 다른 예로서, 메트포르민 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 : 2-데옥시-D-글루코스 : 이노시톨 헥사포스페이트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 중량비는 1:0.2:0.5 내지 1:5:20 범위일 수 있으며, 치료하는 암의 종류에 따라 조합 상대적 양은 달라질 수 있다.
또 다른 예로서, 펜포르민 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 : 2-데옥시-D-글루코스 : 이노시톨 헥사포스페이트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 중량비는 1:1:1 내지 1:50:200의 범위일 수 있으며, 치료하는 암의 종류에 따라 조합 상대적 양은 달라질 수 있다.
또 다른 예로서, 메트포르민 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 : 2-데옥시-D-글루코스 : 이노시톨의 중량비는 1:0.2:0.5 내지 1:5:20 범위일 수 있으며, 치료하는 암의 종류에 따라 조합 상대적 양은 달라질 수 있다.
또 다른 예로서, 펜포르민 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 : 2-데옥시-D-글루코스 : 이노시톨의 중량비는 1:1:1 내지 1:50:200의 범위일 수 있으며, 치료하는 암의 종류에 따라 조합 상대적 양은 달라질 수 있다.
또 다른 예로서, 메트포르민 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 : 2-데옥시-D-글루코스 : 이노시톨 헥사포스페이트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 : 이노시톨의 중량비는 1:0.2:0.5:0.5 내지 1:5:20:20 의 범위일 수 있으며, 치료하는 암의 종류에 따라 조합 상대적 양은 달라질 수 있다.
또 다른 예로서, 펜포르민 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 : 2-데옥시-D-글루코스 : 이노시톨 헥사포스페이트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 : 이노시톨의 중량비는 1:1:1:1 내지 1:50:200:200의 범위일 수 있으며, 치료하는 암의 종류에 따라 조합 상대적 양은 달라질 수 있다.
본 발명은 또한 (1) 면역체크포인트 억제제; (2) 비구아나이드계(biguanide) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; (3) 2-데옥시-D-글루코스(2-deoxy-D-glucose); 및 (4) 이노시톨 헥사포스페이트(inositol hexaphosphate) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이노시톨(inositol), 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. (1) 내지 (4)의 정의는 앞서 살핀바와 같다.
본 발명에서 사용되는 용어 "암(cancer)"이란 세포의 사멸 조절과 관련된 질병으로서, 정상적인 아팝토시스 균형이 깨지는 경우 세포가 과다 증식하게 됨으로써 생기는 질병을 일컫는다. 이러한 비정상적 과다 증식 세포들은, 경우에 따라 주위 조직 및 장기에 침입하여 종괴를 형성하고, 체내의 정상적인 구조를 파괴하거나 변형시키게 되는데, 이러한 상태를 암이라고 한다. 일반적으로 종양(tumor)이라 하면 신체 조직의 자율적인 과잉성장에 의해 비정상적으로 자란 덩어리를 의미하며, 양성 종양(benign tumor)과 악성 종양(malignant)으로 구분할 수 있다. 악성 종양은 양성 종양에 비해 성장속도가 매우 빠르고, 주변 조직에 침윤하면서 전이(metastasis)가 일어나 생명을 위협하게 된다. 이러한 악성 종양을 통상적으로 '암 (cancer)'이라 부르며, 암의 종류로는 뇌척수종양, 뇌암, 두경부암, 폐암, 유방암, 흉선종, 식도암, 위암, 대장암, 간암, 췌장암, 담도암, 신장암, 방광암, 전립선암, 고환암, 생식세포종, 난소암, 자궁경부암, 자궁 내막암, 림프종, 백혈병 예컨대 급성 백혈병 또는 만성백혈병, 골육종, 다발성 골수종, 육종, 흑색종, 악성 흑색종 및 피부암 등이 있다. 본 발명의 항암용 조성물은 암의 종류에 제한없이 사용될 수 있으나, 본 발명의 목적상 간암, 폐암, 위암, 췌장암, 대장암, 자궁경부암, 유방암, 전립선암, 난소암, 뇌암, 골육종, 방광암, 두경부암, 신장암, 흑색종, 백혈병 및 림프종으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "예방 또는 치료"란 본 발명에 따른 약학 조성물 또는 복합 제제를 이용함으로써 암의 발병을 억제하거나 발병을 지연하는 모든 행위를 말하며, 특히 '치료'란 상기 조성물을 사용하여 암을 호전시키거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.
따라서, 본 발명은 암의 예방 또는 치료를 필요로 하는 대상체에게 (1) 면역체크포인트 억제제; (2) 비구아나이드계(biguanide) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; 및 (3) 2-데옥시-D-글루코스(2-deoxy-D-glucose)를 치료학적 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, 암의 예방 또는 치료 방법을 제공한다. 상기 방법은 추가로 (4) 이노시톨 헥사포스페이트(inositol hexaphosphate) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이노시톨(inositol), 또는 이들의 혼합물을 치료학적 유효량으로 투여하는 것을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물은 상기 언급한 유효성분 이외에 필요에 따라 암치료용 화학요법제를 추가적으로 포함할 수 있다.
또한 본 발명의 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 추가적으로 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 각각의 사용 목적에 맞게, 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 멸균 주사용액의 형태, 연고제 등의 외용제, 좌제 등으로 제형화하여 사용될 수 있으며, 이러한 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유 등을 들 수 있다.
경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 제형화 한다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크와 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 주사제의 기제로는 용해제, 등장화제, 현탁화제, 유화제, 안정화제 및 방부제와 같은 종래의 첨가제를 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 경구, 정맥내, 피하, 피내, 비강내, 복강내, 근육내, 경피 등 다양한 방식을 이용하여 투여할 수 있으며, 투여량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물의 투여량은 투여 경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있는데, 예를 들어 5종 화합물들의 복합 제제의 경우, 면역체크포인트 억제제로서 단일 클론 항체인 항-PD-1을 사용할 경우 1회 투여량은 0.01 내지 25 mg/kg(체중), 비구아나이드계 화합물로서 메트포르민을 사용할 경우는 1일당 5 내지 80 mg/kg(체중), 펜포르민을 사용할 경우는 1일당 0.1 내지 10 mg/kg(체중)이고, 2-데옥시-D-글루코스은 1일당 0.1 내지 160 mg/kg(체중)이고, 이노시톨 헥사포스페이트은 1일당 2 내지 600 mg/kg(체중), 그리고 이노시톨은 1일당 2 내지 600 mg/kg(체중)이다. 다만, 상기 투여량에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 (1) 면역체크포인트 억제제; (2) 비구아나이드계(biguanide) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; 및 (3) 2-데옥시-D-글루코스(2-deoxy-D-glucose)를 개체에 투여하여 암을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 (1) 면역체크포인트 억제제; (2) 비구아나이드계(biguanide) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; (3) 2-데옥시-D-글루코스(2-deoxy-D-glucose); 및 (4) 이노시톨 헥사포스페이트(inositol hexaphosphate) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이노시톨(inositol), 또는 이들의 혼합물을 개체에 투여하여 암을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 (1) 면역체크포인트 억제제; (2) 비구아나이드계(biguanide) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; 및 (3) 2-데옥시-D-글루코스(2-deoxy-D-glucose)를 포함하는 암의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 조성물에 관한 것이다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 (1) 면역체크포인트 억제제; (2) 비구아나이드계(biguanide) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; (3) 2-데옥시-D-글루코스(2-deoxy-D-glucose); 및 (4) 이노시톨 헥사포스페이트(inositol hexaphosphate) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이노시톨(inositol), 또는 이들의 혼합물을 포함하는 암의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 조성물에 관한 것이다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 암의 예방 또는 치료를 위한 의약을 제조하기 위한 (1) 면역체크포인트 억제제; (2) 비구아나이드계(biguanide) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; 및 (3) 2-데옥시-D-글루코스(2-deoxy-D-glucose)의 용도에 관한 것이다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 암의 예방 또는 치료를 위한 의약을 제조하기 위한 (1) 면역체크포인트 억제제; (2) 비구아나이드계(biguanide) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; (3) 2-데옥시-D-글루코스(2-deoxy-D-glucose); 및 (4) 이노시톨 헥사포스페이트(inositol hexaphosphate) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이노시톨(inositol), 또는 이들의 혼합물의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 조성물은 제한된 적응증을 가진 면역체크포인트 억제제에 대해 다양한 암종으로 적응증을 늘릴뿐만 아니라 특정 약물들을 적절히 조합하여 상승적 항암 효과를 나타내어 치료 효과를 극대화하면서 부작용없이 암세포만을 사멸시킬 수 있으므로 암의 예방 또는 치료를 위한 항암제로서 유용하게 사용될 수 있다.
도 1 및 2는, 인간에서 유래한 암세포주에 대해 메트포르민(MET), 2-데옥시-D-글루코스(2DG) 및 이노시톨 헥사포스페이트(IP6)의 단독 및 복합 제제를 인간의 혈장에서 사용 가능한 저농도에서 처리하여 48시간 후 MTT 분석법에 의한 세포 생존율을 백분율로 나타낸 그래프이다. 각 막대의 세로막대는 표준편차를 나타낸다. 통계 분석은 GraphPad Prism 6.0 소프트웨어를 사용하여 Tukey의 다중 비교 사후분석을 이용한 일원 분산 분석 (one-way ANOVA) 테스트에 의해 수행되었다.
(1A) 인간의 간에서 유래한 암세포인 HepG2 세포주에 대해 조사한 그래프이다. (1B) 인간의 폐에서 유래한 암세포인 A549 세포주에 대해 조사한 그래프이다. (1C) 인간의 위에서 유래한 암세포인 AGS 세포주에 대해 조사한 그래프이다. (1D) 인간의 췌장에서 유래한 암세포인 PANC-1 세포주에 대해 조사한 그래프이다. (1E) 인간의 대장에서 유래한 암세포인 DLD-1 세포주에 대해 조사한 그래프이다. (1F) 인간의 자궁 경부에서 유래한 암세포인 HeLa 세포주에 대해 조사한 그래프이다. (2A) 인간의 유방에서 유래한 암세포인 MDA-MB-231 세포주에 대해 조사한 그래프이다. (2B) 인간의 전립선에서 유래한 암세포인 PC-3 세포주에 대해 조사한 그래프이다. (2C) 인간의 난소에서 유래한 암세포인 SK-OV-3 세포주에 대해 조사한 그래프이다. (2D) 인간의 방광에서 유래한 암세포인 T24 세포주에 대해 조사한 그래프이다. (2E) 인간의 뇌에서 유래한 암세포인 U-87 MG 세포주에 대해 조사한 그래프이다. (2F) 인간의 골육에서 유래한 암세포인 Saos-2 세포주에 대해 조사한 그래프이다. **** p<0.0001.
도 3 및 4는 인간에서 유래한 암세포주에 대해 펜포르민(PHE), 2DG 및 IP6의 단독 및 복합 제제를 인간의 혈장에서 사용 가능한 저농도에서 처리하여 48시간 후 MTT 분석법에 의한 세포 생존율을 백분율로 나타낸 그래프이다. 각 막대의 세로막대는 표준편차를 나타낸다. 통계 분석은 GraphPad Prism 6.0 소프트웨어를 사용하여 Tukey의 다중 비교 사후분석을 이용한 일원 분산 분석 (one-way ANOVA) 테스트에 의해 수행되었다.
(3A) 인간의 간에서 유래한 암세포인 HepG2 세포주에 대해 조사한 그래프이다. (3B) 인간의 폐에서 유래한 암세포인 A549 세포주에 대해 조사한 그래프이다. (3C) 인간의 위에서 유래한 암세포인 AGS 세포주에 대해 조사한 그래프이다. (3D) 인간의 췌장에서 유래한 암세포인 PANC-1 세포주에 대해 조사한 그래프이다. (3E) 인간의 대장에서 유래한 암세포인 DLD-1 세포주에 대해 조사한 그래프이다. (3F) 인간의 자궁 경부에서 유래한 암세포인 HeLa 세포주에 대해 조사한 그래프이다. (4A) 인간의 유방에서 유래한 암세포인 MDA-MB-231 세포주에 대해 조사한 그래프이다. (4B) 인간의 전립선에서 유래한 암세포인 PC-3 세포주에 대해 조사한 그래프이다. (4C) 인간의 난소에서 유래한 암세포인 SK-OV-3 세포주에 대해 조사한 그래프이다. (4D) 인간의 방광에서 유래한 암세포인 T24 세포주에 대해 조사한 그래프이다. (4E) 인간의 뇌에서 유래한 암세포인 U-87 MG 세포주에 대해 조사한 그래프이다. (4F) 인간의 골육에서 유래한 암세포인 Saos-2 세포주에 대해 조사한 그래프이다. **** p<0.0001.
도 5는, 인간에서 유래한 정상적인 세포주에 대해 MET, 2DG 및 IP6의 단독 및 복합 제제를 인간의 혈장에서 사용 가능한 저농도에서 처리하여 48시간 후 MTT 분석법에 의한 세포 생존율을 백분율로 나타낸 그래프이다. **** p<0.0001.
도 6은 4T1 세포에서의 생존율과 단백질 발현을 나타낸 그림이다. 각 막대의 세로막대는 표준편차를 나타낸다. 통계 분석은 GraphPad Prism 6.0 소프트웨어를 사용하여 Tukey의 다중 비교 사후분석을 이용한 일원 분산 분석 (one-way ANOVA) 테스트에 의해 수행되었다. (6A) 생쥐 유래 유방암 4T1 세포에 대한 MET, 2DG 및 IP6의 단독 및 병용 처리하여 48시간 후 MTT 분석법에 의한 세포 생존율을 백분율로 나타낸 그래프이다. (6B, 6C) MET, 2DG 및 IP6의 단독 및 병용 처리에 따른 AMPK 및 ACC의 인산화 발현을 나타낸 그림이다. * p<0.05. **** p<0.0001.
도 7은, 4T1 세포에 대한 MET, 2DG 및 IP6의 단독 및 복합 제제의 ATP 합성 억제 그래프이다. 통계 분석은 GraphPad Prism 6.0 소프트웨어를 사용하여 Tukey의 다중 비교 사후분석을 이용한 이원 분산분석(two-way ANOVA) 테스트에 의해 수행되었다. * p<0.05. **** p<0.0001.
도 8은, 실험동물에서 항-PD-1 항체, MET, 2DG, IP6 및 Ins의 단독 및 복합 제제 투여에 따른 3일 간격으로 종양 부피를 측정한 그래프이다. 통계 분석은 GraphPad Prism 6.0 소프트웨어를 사용하여 Tukey의 다중 비교 사후분석을 이용한 이원 분산분석(two-way ANOVA) 테스트에 의해 수행되었다. ** p<0.01, **** p<0.0001.
도 9은, 실험동물에서 항-PD-L1 항체, MET, 2DG, IP6 및 Ins의 단독 및 복합 제제 투여에 따른 3일 간격으로 종양 부피를 측정한 그래프이다. 통계 분석은 GraphPad Prism 6.0 소프트웨어를 사용하여 Tukey의 다중 비교 사후분석을 이용한 이원 분산분석(two-way ANOVA) 테스트에 의해 수행되었다. ** p<0.01, **** p<0.0001.
도 10은, 실험동물에서 항-CTLA-4 항체, MET, 2DG, IP6 및 Ins의 단독 및 복합 제제 투여에 따른 3일 간격으로 종양 부피를 측정한 그래프이다. 통계 분석은 GraphPad Prism 6.0 소프트웨어를 사용하여 Tukey의 다중 비교 사후분석을 이용한 이원 분산분석(two-way ANOVA) 테스트에 의해 수행되었다. *** p<0.001, **** p<0.0001.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
하기 실시예에서는 면역체크포인트 억제제로서 단일 클론 항체인 항-mouse PD-1 mAb (RMP1-14), 항-mouse PD-L1 mAb (10F. 9G2), 항-mouse CTLA-4 mAb (UC10-4F10-11)을 사용하였다. 또한, 비구아나이드계 화합물로서 메트포르민 또는 펜포르민의 약학적으로 허용가능한 여러 염의 형태 중에서 염산메트포르민(Metformin HCl), 염산펜포르민(Phenformin HCl)을 사용하였다. 이들의 염의 형태는 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다. 또한, 이노시톨 헥사포스페이트의 약학적으로 허용가능한 여러 염의 형태 중에서 이노시톨 헥사포스페이트(Phytic acid)를 사용하였다. 이들의 형태는 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다. 또한, 이노시톨의 이성질체 중에서 미오이노시톨(myo-inositol)을 사용하였다. 이들의 이성질체는 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
세포 배양
본 시험에 사용한 세포는 종양세포로서 간암(HepG2), 폐암(A549), 위암(AGS), 췌장암(PANC-1), 대장암(DLD-1), 자궁경부암(HeLa), 유방암(MDA-MB-231), 전립선암(PC-3), 난소암(SK-OV-3), 방광암(T24), 교모세포종(U-87 MG), 골육종(Saos-2), 생쥐 유래 유방암(4T1)을 사용하였으며, 비종양세포로서는 전립선(PZ-HPV-7), 대장(CCD-18Co), 폐(MRC5) 세포주를 사용하였는데 모든 세포주는 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank) 또는 미국 ATCC(American Type Culture Collection, Rockville, MD)에서 구입하여 사용하였다.
상기 세포들은 Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium (RPMI1640, Hyclone, Logan, UT, USA)에 10% fetal bovine serum (FBS, Hyclone), 1% penicillin/streptomycin (P/S, Hyclone)을 첨가한 세포배양액을 이용하였으며, 37℃ 인큐베이터 (5% CO2/95% air)에서 유지·배양하였다. 세포가 배양 접시의 80% 정도 차면 phosphate-buffered saline (PBS, Hyclone)으로 세포의 단층을 씻어내고 0.25% trypsin-2.65 mM EDTA (Hyclone) 를 처리하여 계대 배양하였고 배지는 2일마다 교환하였다.
사용한 약물
사용한 단일 클론 항체로서 항-mouse PD-1 mAb (RMP1-14), 항-mouse PD-L1 mAb (10F.9G2), 항-mouse CTLA-4 mAb (UC10-4F10-11)은 BioXcell 사에서 구입하여 제조사가 제시한 바에 따라 보관하고 취급하였다.
염산메트포르민(Metformin HCl, 이하 MET), 염산펜포르민(Phenformin HCl, 이하 PHE), 2-데옥시-D-글루코스(2-deoxy-D-glucose, 이하 2DG), 이노시톨 헥사포스페이트(Phytic acid, 이하 IP6), 미오이노시톨(myo-inositol, 이하 Ins)은 시그마사(St. Louis, USA)에서 구입하였다. 본 발명에서 실험을 통하여 얻어진 결과를 정리한 표와 도면에서 사용한 모든 약물은 약어로서 표기하였다.
참조예 1: 시험관 내 세포성장 억제 분석
MET 또는 PHE, 2DG 및 IP6의 세포 독성은 MTT assay [3-(4,5-dimethyl thiazolyl-2)-2,5-diphenyltetrazolium bromide assay]를 통해 확인하였다. 상기 세포(3~4×105 세포/웰)들을 96 웰 배양 플레이트 내에 분주하여 12시간 이상 안정화 시킨 후 각 웰의 배지를 제거하고 각각의 세포에 대한 MET 또는 PHE, 2DG 그리고 IP6를 농도별로 또는 혼합하여 혈청이 포함되지 않은 배지와 함께 처리하였다. 대조군 세포들에 대해서는 PBS를 배지 내에 첨가하였다. 48시간 동안 CO2가 포함된 37℃에서 배양 후 대조군 및 혼합물을 포함한 배지를 깨끗이 제거하고, MTT (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) 시약(0.5mg/ml)과 함께 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. 이후에는 MTT 시약을 포함한 배지를 깨끗이 제거하고, 살아있는 세포에 의해 형성된 MTT formazan 결정은 DMSO (Sigma)를 넣어 실온에서 15min 이상 방치하여 용해시켰다. 마이크로 플레이트리더기(BioTek® Instruments, Inc., Winooski, VT, USA)를 사용하여 560nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다.
참조예 2: 단일 제제 및 복합 제제 실험 방법
상기 세포(3~4×105 세포/웰)들을 96 웰 플레이트에 파종하고, 단일 제제 약물로서 MET 또는 PHE, 2DG 및 IP6 각각을 농도별로 처리하여 세포 증식 억제율을 확인하였다.
복합 제제 약물로서는 MET 또는 PHE, 2DG 및 IP6로 이루어진 군으로부터 선택된 2종 이상의 화합물로 이루어진 복합 제제의 IC50에 해당하는 약물의 농도로 처리하였다. 모든 세포주는 단일 또는 복합 제제의 농도로 48시간 배양 후, 성장 억제 효과를 MTT 분석법으로 측정하였다.
참조예 3: 실험동물
특정병원체 (specific pathogen free)가 없는 5주령, 암컷 BALB/c 마우스는 (주)두열바이오텍에서 구입하여 사용하였다. 1주일간의 검역 및 적응과정을 거친 뒤 체중 감소 없는 건강한 동물을 선별하여 실험에 사용하였다.
실험동물은 온도 23 ± 3℃, 상대습도 50 ± 10%, 환기회수 10-15 회/시간, 조명시간 12시간 (08:00 - 20:00), 조도 150 - 300 Lux로 설정된 사육환경에서 사육하였다. 시험 전 기간 동안 실험동물은 실험동물용 고형사료 ((주) 카길애그리퓨리나)와 음수를 자유 섭취하도록 하였다.
참조예 4: 종양세포 이식 및 시험물질 투여
BALB/c 마우스는 1주간의 적응 기간을 거친 후, 실험동물의 왼쪽 유방 지방 조직에 유방암세포인 4T1 세포(1×105 cells/mouse)을 주입한 후 육안으로 종양 조직이 발생되는 것을 관찰하였다. 실험동물의 종양조직의 크기가 약 50 mm3 되었을 때 난괴법에 의거하여 10개의 시험군으로 분류하였다. 즉, 대조군, Ins 군(Ins 1000 mg/kg), IP6 군(IP6 1000 mg/kg), MET 군(MET 500 mg/kg), 2DG 군(2DG 1000 mg/kg), mAb 군(단일클론 항체(항-PD1 항체 또는 항-PD-L1 항체 또는 항-CTLA-4 항체)로서 150 μg/마우스), mAb+MET+2DG 군(mAb 150 μg/마우스 + MET 500 mg/kg + 2DG 1000 mg/kg), mAb+MET+2DG+Ins 군(mAb 150 μg/마우스 + MET 500 mg/kg + 2DG 1000 mg/kg + Ins 1000 mg/kg), mAb+MET+2DG+IP6 군(mAb 150 μg/마우스 + MET 500 mg/kg + 2DG 1000 mg/kg + IP6 1000 mg/kg), mAb+MET+2DG+IP6+Ins 군(mAb 150 μg/마우스 + MET 500 mg/kg + 2DG 1000 mg/kg + IP6 500 mg/kg + Ins 500 mg/kg)으로 분류하였고, 각 시험군은 각 10 마리의 실험동물을 사용하였다. 시험물질 단일클론 항체는 시험군 분리 시점을 1일로 하여 4일 주기로 복강투여 하였고, 시험물질 Ins, IP6, MET, 2DG는 시험군 분리 시점을 1일로 하여 시험 종료 시점까지 증류수에 녹여 3주 동안 일정 시간에 경구투여하였다.
참조예 6: 실험동물의 체중 및 종양 부피 측정
시험 기간 동안 실험동물의 체중은 시험물질 투여 일부터 1주에 1회 일정한 시간에 체중을 측정하였다. 종양의 부피는 3일 간격으로 디지털 캘리퍼스(caliper)를 사용하여 종양의 장축(length)과 단축(width)을 측정하고, 다음의 계산식에 대입하여 종양의 부피를 계산하였다.
Tumor volume (mm3) = (width2 × length) / 2
참조예 7: 통계처리
모든 분석 수치는 평균 ± SD으로 나타내었다. 대조군과 시험물질 투여군의 차이를 비교하기 위하여 GraphPad Prism 6.0 소프트웨어를 사용하여 Tukey의 다중 비교 사후분석을 이용한 일원 분산분석(one-way ANOVA) 또는 이원분산분석(two-way ANOVA) 테스트에 의해 유의성을 검증하였다. p < 0.05 이상일 때만 통계적으로 유의성이 있는 것으로 판단하였다.
<실시예 1> MET(또는 PHE), 2DG 및 IP6의 단일 제제 및 복합 제제의 세포 증식 억제 실험
12종의 암세포를 사용하여 MET(또는 PHE), 2DG 및 IP6의 단일 제제 및 복합 제제의 세포 증식 억제 효과를 비교하였다.
실시예 1-1: MET, 2DG 및 IP6의 단독 및 병용 투여 후 세포 생존율
도1 및 2는 인간 암세포주인 간암(HepG2), 폐암(A549), 위암(AGS), 췌장암(PANC-1), 대장암(DLD-1), 자궁경부암(HeLa), 유방암(MDA-MB-231), 전립선암(PC-3), 난소암(SK-OV-3), 방광암(T24), 교모세포종(U-87 MG), 골육종(Saos-2)을 중심으로 MET, 2DG 및 IP6의 단독 및 병용 투여 후 세포 생존율을 조사한 그림이다.
도 1A는 4 mM 농도의 MET, 1 mM 농도의 2DG, 1 mM 농도의 IP6로 단독 및 병용 처리한 간암(HepG2) 세포주에서의 생존율을 보여주고 있다. 병용처리한 제제는 대조군을 포함한 단독 처리한 것보다 생존력이 크게 감소했다 (P <0.0001). 병용처리한 그룹들과의 비교에서는 MET+2DG+IP6 조합한 것의 생존율은 17.44 ± 4.8 %로서 MET+2DG 조합한 것의 생존율인 45.40 ± 4.2 %보다 2.6배의 높은 감소를 보여 주었다 (P <0.0001).
도 1B는 4 mM 농도의 MET, 1 mM 농도의 2DG, 1 mM 농도의 IP6로 단독 및 병용 처리한 폐암(A549) 세포주에서의 생존율을 보여주고 있다. 병용처리한 제제는 대조군을 포함한 단독 처리한 것보다 생존력이 크게 감소했다 (P <0.0001). 병용처리한 그룹들과의 비교에서는 MET+2DG+IP6 조합한 것의 생존율은 19.43 ± 5.2 %로서 MET+2DG 조합한 것의 생존율인 48.84 ± 5.3 %보다 2.5배의 높은 감소를 보여 주었다 (P <0.0001).
도 1C는 2 mM 농도의 MET, 0.7 mM 농도의 2DG, 1 mM 농도의 IP6로 단독 및 병용 처리한 위암(AGS) 세포주에서의 생존율을 보여주고 있다. 병용처리한 제제는 대조군을 포함한 단독 처리한 것보다 생존력이 크게 감소했다 (P <0.0001). 병용처리한 그룹들과의 비교에서는 MET+2DG+IP6 조합한 것의 생존율은 15.20 ± 4.2 %로서 MET+2DG 조합한 것의 생존율인 53.00 ± 3.8 %보다 3.5배의 높은 감소를 보여 주었다 (P <0.0001).
도 1D는 5 mM 농도의 MET, 0.7 mM 농도의 2DG, 1 mM 농도의 IP6로 단독 및 병용 처리한 췌장암(PANC-1) 세포주에서의 생존율을 보여주고 있다. 병용처리한 제제는 대조군을 포함한 단독 처리한 것보다 생존력이 크게 감소했다 (P <0.0001). 병용처리한 그룹들과의 비교에서는 MET+2DG+IP6 조합한 것의 생존율은 25.27 ± 5.2 %로서 MET+2DG 조합한 것의 생존율인 65.40 ± 4.3 %보다 2.6배의 높은 감소를 보여 주었다 (P <0.0001).
도 1E는 5 mM 농도의 MET, 0.4 mM 농도의 2DG, 1 mM 농도의 IP6로 단독 및 병용 처리한 대장암(DLD-1) 세포주에서의 생존율을 보여주고 있다. 병용처리한 제제는 대조군을 포함한 단독 처리한 것보다 생존력이 크게 감소했다 (P <0.0001). 병용처리한 그룹들과의 비교에서는 MET+2DG+IP6 조합한 것의 생존율은 26.70 ± 4.7 %로서 MET+2DG 조합한 것의 생존율인 65.40 ± 4.6 %보다 2.4배의 높은 감소를 보여 주었다 (P <0.0001).
도 1F는 6 mM 농도의 MET, 0.5 mM 농도의 2DG, 1 mM 농도의 IP6로 단독 및 병용 처리한 자궁경부암(HeLa) 세포주에서의 생존율을 보여주고 있다. 병용처리한 제제는 대조군을 포함한 단독 처리한 것보다 생존력이 크게 감소했다 (P <0.0001). 병용처리한 그룹들과의 비교에서는 MET+2DG+IP6 조합한 것의 생존율은 24.67 ± 3.6 %로서 MET+2DG 조합한 것의 생존율인 52.89 ± 4.6 %보다 2.1배의 높은 감소를 보여 주었다 (P <0.0001).
도 2A는 6 mM 농도의 MET, 1 mM 농도의 2DG, 1 mM 농도의 IP6로 단독 및 병용 처리한 유방암(MDA-MB-231) 세포주에서의 생존율을 보여주고 있다. 병용처리한 제제는 대조군을 포함한 단독 처리한 것보다 생존력이 크게 감소했다 (P <0.0001). 병용처리한 그룹들과의 비교에서는 MET+2DG+IP6 조합한 것의 생존율은 26.37 ± 5.3 %로서 MET+2DG 조합한 것의 생존율인 55.15 ± 4.5 %보다 2.1배의 높은 감소를 보여 주었다 (P <0.0001).
도 2B는 5 mM 농도의 MET, 1 mM 농도의 2DG, 1 mM 농도의 IP6로 단독 및 병용 처리한 전립선암(PC-3) 세포주에서의 생존율을 보여주고 있다. 병용처리한 제제는 대조군을 포함한 단독 처리한 것보다 생존력이 크게 감소했다 (P <0.0001). 병용처리한 그룹들과의 비교에서는 MET+2DG+IP6 조합한 것의 생존율은 19.51 ± 5.6 %로서 MET+2DG 조합한 것의 생존율인 66.70 ± 4.6 %보다 3.4배의 높은 감소를 보여 주었다 (P <0.0001).
도 2C는 5 mM 농도의 MET, 0.5 mM 농도의 2DG, 1 mM 농도의 IP6로 단독 및 병용 처리한 난소암(SK-OV-3) 세포주에서의 생존율을 보여주고 있다. 병용처리한 제제는 대조군을 포함한 단독 처리한 것보다 생존력이 크게 감소했다 (P <0.0001). 병용처리한 그룹들과의 비교에서는 MET+2DG+IP6 조합한 것의 생존율은 22.80 ± 5.2 %로서 MET+2DG 조합한 것의 생존율인 66.80 ± 3.6 %보다 2.9배의 높은 감소를 보여 주었다 (P <0.0001).
도 2D는 4 mM 농도의 MET, 1 mM 농도의 2DG, 1 mM 농도의 IP6로 단독 및 병용 처리한 방광암(T24) 세포주에서의 생존율을 보여주고 있다. 병용처리한 제제는 대조군을 포함한 단독 처리한 것보다 생존력이 크게 감소했다 (P <0.0001). 병용처리한 그룹들과의 비교에서는 MET+2DG+IP6 조합한 것의 생존율은 26.42 ± 4.8 %로서 MET+2DG 조합한 것의 생존율인 63.30 ± 4.2 %보다 2.4배의 높은 감소를 보여 주었다 (P <0.0001).
도 2E는 5 mM 농도의 MET, 0.4 mM 농도의 2DG, 1 mM 농도의 IP6로 단독 및 병용 처리한 교모세포종(U-87 MG) 세포주에서의 생존율을 보여주고 있다. 병용처리한 제제는 대조군을 포함한 단독 처리한 것보다 생존력이 크게 감소했다 (P <0.0001). 병용처리한 그룹들과의 비교에서는 MET+2DG+IP6 조합한 것의 생존율은 20.80 ± 5.7 %로서 MET+2DG 조합한 것의 생존율인 61.32 ± 4.8 %보다 2.9배의 높은 감소를 보여 주었다 (P <0.0001).
도 2F는 5 mM 농도의 MET, 0.7 mM 농도의 2DG, 1 mM 농도의 IP6로 단독 및 병용 처리한 골육종(Saos-2) 세포주에서의 생존율을 보여주고 있다. 병용처리한 제제는 대조군을 포함한 단독 처리한 것보다 생존력이 크게 감소했다 (P <0.0001). 병용처리한 그룹들과의 비교에서는 MET+2DG+IP6 조합한 것의 생존율은 24.52 ± 5.7 %로서 MET+2DG 조합한 것의 생존율인 64.33 ± 4.9 %보다 2.6배의 높은 감소를 보여 주었다 (P <0.0001).
상기 결과들로부터 MET, 2DG 및 IP6의 3중 복합 제제는 단독 또는 2중 복합 제제보다 우수한 암세포 증식 억제 효과를 확인하였다.
실시예 1-2: PHE, 2DG 및 IP6의 단독 및 병용 투여 후 세포 생존율
도3 및 4는 인간 암세포주인 간암(HepG2), 폐암(A549), 위암(AGS), 췌장암(PANC-1), 대장암(DLD-1), 자궁경부암(HeLa), 유방암(MDA-MB-231), 전립선암(PC-3), 난소암(SK-OV-3), 방광암(T24), 교모세포종(U-87 MG), 골육종(Saos-2)을 중심으로 PHE, 2DG 및 IP6의 단독 및 병용 투여 후 세포 생존율을 조사한 그림이다.
도3A는 0.3 mM 농도의 PHE, 1 mM 농도의 2DG, 1 mM 농도의 IP6로 단독 및 병용 처리한 간암(HepG2) 세포주에서의 생존율을 보여주고 있다. 병용처리한 제제는 대조군을 포함한 단독 처리한 것보다 생존력이 크게 감소했다 (P <0.0001). 병용처리한 그룹들과의 비교에서는 PHE+2DG+IP6 조합한 것의 생존율은 20.21 ± 4.1 %로서 PHE+2DG 조합한 것의 생존율인 49.55 ± 4.8 %보다 2.5배의 높은 감소를 보여 주었다 (P <0.0001).
도3B는 0.3 mM 농도의 PHE, 1 mM 농도의 2DG, 1 mM 농도의 IP6로 단독 및 병용 처리한 폐암(A549) 세포주에서의 생존율을 보여주고 있다. 병용처리한 제제는 대조군을 포함한 단독 처리한 것보다 생존력이 크게 감소했다 (P <0.0001). 병용처리한 그룹들과의 비교에서는 PHE+2DG+IP6 조합한 것의 생존율은 22.41 ± 5.2 %로서 PHE+2DG 조합한 것의 생존율인 54.77 ± 5.8 %보다 2.4배의 높은 감소를 보여 주었다 (P <0.0001).
도3C는 0.3 mM 농도의 PHE, 0.7 mM 농도의 2DG, 1 mM 농도의 IP6로 단독 및 병용 처리한 위암(AGS) 세포주에서의 생존율을 보여주고 있다. 병용처리한 제제는 대조군을 포함한 단독 처리한 것보다 생존력이 크게 감소했다 (P <0.0001). 병용처리한 그룹들과의 비교에서는 PHE+2DG+IP6 조합한 것의 생존율은 17.38 ± 3.8 %로서 PHE+2DG 조합한 것의 생존율인 50.45 ± 3.9 %보다 2.9배의 높은 감소를 보여 주었다 (P <0.0001).
도3D는 0.2 mM 농도의 PHE, 0.7 mM 농도의 2DG, 1 mM 농도의 IP6로 단독 및 병용 처리한 췌장암(PANC-1) 세포주에서의 생존율을 보여주고 있다. 병용처리한 제제는 대조군을 포함한 단독 처리한 것보다 생존력이 크게 감소했다 (P <0.0001). 병용처리한 그룹들과의 비교에서는 PHE+2DG+IP6 조합한 것의 생존율은 25.27 ± 5.2 %로서 PHE+2DG 조합한 것의 생존율인 65.40 ± 4.3 %보다 2.6배의 높은 감소를 보여 주었다 (P <0.0001).
도3E는 0.3 mM 농도의 PHE, 0.4 mM 농도의 2DG, 1 mM 농도의 IP6로 단독 및 병용 처리한 대장암(DLD-1) 세포주에서의 생존율을 보여주고 있다. 병용처리한 제제는 대조군을 포함한 단독 처리한 것보다 생존력이 크게 감소했다 (P <0.0001). 병용처리한 그룹들과의 비교에서는 PHE+2DG+IP6 조합한 것의 생존율은 22.21 ± 4.8 %로서 PHE+2DG 조합한 것의 생존율인 60.98 ± 4.7 %보다 2.7배의 높은 감소를 보여 주었다 (P <0.0001).
도3F는 0.2 mM 농도의 PHE, 0.5 mM 농도의 2DG, 1 mM 농도의 IP6로 단독 및 병용 처리한 자궁경부암(HeLa) 세포주에서의 생존율을 보여주고 있다. 병용처리한 제제는 대조군을 포함한 단독 처리한 것보다 생존력이 크게 감소했다 (P <0.0001). 병용처리한 그룹들과의 비교에서는 PHE+2DG+IP6 조합한 것의 생존율은 25.65 ± 3.9 %로서 PHE+2DG 조합한 것의 생존율인 54.67 ± 4.6 %보다 2.1배의 높은 감소를 보여 주었다 (P <0.0001).
도4A는 0.2 mM 농도의 PHE, 1 mM 농도의 2DG, 1 mM 농도의 IP6로 단독 및 병용 처리한 유방암(MDA-MB-231) 세포주에서의 생존율을 보여주고 있다. 병용처리한 제제는 대조군을 포함한 단독 처리한 것보다 생존력이 크게 감소했다 (P <0.0001). 병용처리한 그룹들과의 비교에서는 PHE+2DG+IP6 조합한 것의 생존율은 20.76 ± 4.2 %로서 PHE+2DG 조합한 것의 생존율인 48.54 ± 4.5 %보다 2.3배의 높은 감소를 보여 주었다 (P <0.0001).
도4B는 0.3 mM 농도의 PHE, 1 mM 농도의 2DG, 1 mM 농도의 IP6로 단독 및 병용 처리한 전립선암(PC-3) 세포주에서의 생존율을 보여주고 있다. 병용처리한 제제는 대조군을 포함한 단독 처리한 것보다 생존력이 크게 감소했다 (P <0.0001). 병용처리한 그룹들과의 비교에서는 PHE+2DG+IP6 조합한 것의 생존율은 20.77 ± 4.3 %로서 PHE+2DG 조합한 것의 생존율인 59.66 ± 4.6 %보다 2.9배의 높은 감소를 보여 주었다 (P <0.0001).
도4C는 0.4 mM 농도의 PHE, 0.5 mM 농도의 2DG, 1 mM 농도의 IP6로 단독 및 병용 처리한 난소암(SK-OV-3) 세포주에서의 생존율을 보여주고 있다. 병용처리한 제제는 대조군을 포함한 단독 처리한 것보다 생존력이 크게 감소했다 (P <0.0001). 병용처리한 그룹들과의 비교에서는 PHE+2DG+IP6 조합한 것의 생존율은 20.44 ± 4.2 %로서 PHE+2DG 조합한 것의 생존율인 60.54 ± 5.1 %보다 3.0배의 높은 감소를 보여 주었다 (P <0.0001).
도4D는 0.4 mM 농도의 PHE, 1 mM 농도의 2DG, 1 mM 농도의 IP6로 단독 및 병용 처리한 방광암(T24) 세포주에서의 생존율을 보여주고 있다. 병용처리한 제제는 대조군을 포함한 단독 처리한 것보다 생존력이 크게 감소했다 (P <0.0001). 병용처리한 그룹들과의 비교에서는 PHE+2DG+IP6 조합한 것의 생존율은 21.45 ± 4.2 %로서 PHE+2DG 조합한 것의 생존율인 58.70 ± 4.5 %보다 2.7배의 높은 감소를 보여 주었다 (P <0.0001).
도4E는 0.2 mM 농도의 PHE, 0.4 mM 농도의 2DG, 1 mM 농도의 IP6로 단독 및 병용 처리한 교모세포종(U-87 MG) 세포주에서의 생존율을 보여주고 있다. 병용처리한 제제는 대조군을 포함한 단독 처리한 것보다 생존력이 크게 감소했다 (P <0.0001). 병용처리한 그룹들과의 비교에서는 PHE+2DG+IP6 조합한 것의 생존율은 15.76 ± 4.2 %로서 PHE+2DG 조합한 것의 생존율인 54.32 ± 4.8 %보다 3.4배의 높은 감소를 보여 주었다 (P <0.0001).
도4F은 0.2 mM 농도의 PHE, 0.7 mM 농도의 2DG, 1 mM 농도의 IP6로 단독 및 병용 처리한 골육종(Saos-2) 세포주에서의 생존율을 보여주고 있다. 병용처리한 제제는 대조군을 포함한 단독 처리한 것보다 생존력이 크게 감소했다 (P <0.0001). 병용처리한 그룹들과의 비교에서는 PHE+2DG+IP6 조합한 것의 생존율은 22.76 ± 4.2 %로서 PHE+2DG 조합한 것의 생존율인 61.93 ± 4.7 %보다 2.7배의 높은 감소를 보여 주었다 (P <0.0001).
상기 결과들로부터 PHE, 2DG 및 IP6의 3중 복합 제제는 단독 또는 2중 복합 제제보다 우수한 암세포 증식 억제 효과를 확인하였다.
실시예 2: MET, 2DG 및 IP6의 복합 제제가 정상세포에 미치는 영향
도 5는 MET, 2DG 및 IP6의 복합 제제가 정상세포에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 종양세포로서 전립선암(PC-3), 대장암(DLD-1), 폐암(A549) 세포주를, 비종양세포로서는 전립선(PZ-HPV-7), 대장(CCD-18Co), 폐(MRC5) 세포주에 상기 3종 조합 제제를 처리하고 48시간 후에 MTT 분석법으로 세포독성을 조사한 그림이다.
5 mM 농도의 MET, 1 mM 농도의 2DG, 1 mM 농도의 IP6의 복합 제제로 처리한 PC-3, PZ-HPV-7 세포주에서의 결과를 보면 종양세포인 PC-3 세포주에서는 생존력이 크게 감소한 반면, 비종양세포 PZ-HPV-7 세포주에서는 생존력에 영향을 미치지 않았다 (P <0.0001).
5 mM 농도의 MET, 0.4 mM 농도의 2DG, 1 mM 농도의 IP6의 복합 제제로 처리한 DLD-1, CCD-18Co 세포주에서의 결과를 보면 종양세포인 DLD-1 세포주에서는 생존력이 크게 감소한 반면, 비종양세포 CCD-18Co 세포주에서는 생존력에 영향을 미치지 않았다 (P <0.0001).
4 mM 농도의 MET, 1 mM 농도의 2DG, 1 mM 농도의 IP6의 복합 제제로 처리한 A549, MRC5 세포주에서의 결과를 보면 종양세포인 A549 세포주에서는 생존력이 크게 감소한 반면, 비종양세포 MRC5 세포주에서는 생존력에 영향을 미치지 않았다 (P <0.0001).
상기 3종 조합 제제의 각 비종양세포에 대한 세포 사멸은 종양세포와는 다른 양상을 보여 주었으며 생체 내에서 안전한 약물임이 확인되었다.
실시예 3: MET, 2DG 및 IP6의 단독 및 복합 제제가 4T1 세포의 생존율과 단백질 발현
살아있는 세포의 대사과정은 ATP와 ADP를 에너지원으로 사용하고 AMP를 생성하게 된다. AMPK(AMP-activated protein kinase)는 serine/threonine kinase로서 지질과 포도당 대사의 조절인자로 알려져 있으며, 안과 당뇨에 중요한 조절작용을 한다. AMPK는 세포내 에너지 소모 시 증가되는 AMP에 의해 활성화되어 ATP 사용을 억제시키며, 이화작용(catabolism)을 유도하여 에너지 항상성(homeostasis)을 유지하는데 핵심적인 역할을 한다. AMPK 활성화는 암세포의 증식을 억제하는 작용을 하며, 지방대사 측면에서는 지방산 합성을 유도하는 효소인 ACC(acetyl CoA carboxylase)를 억제한다.
도6A는 5 mM 농도의 MET, 2 mM 농도의 2DG, 1 mM 농도의 IP6로 단독 및 병용 처리한 생쥐 유래 유방암(4T1) 세포주에서의 생존율을 보여주고 있다. 병용처리한 제제는 대조군을 포함한 단독 처리한 것보다 생존력이 크게 감소했다 (P <0.0001). 병용처리한 그룹들과의 비교에서는 MET+2DG+IP6 군의 생존율은 23.04 ± 4.0 %로서 MET+2DG 군의 생존율인 50.03 ± 4.0 %보다 2.2배의 높은 감소를 보여 주었다 (P <0.0001).
도6B와 도6C에서 MET+2DG 군보다 MET+2DG+IP6 군에서 AMPK를 현저하게 활성화시키고(P <0.0001), ACC의 인산화를 감소시켰다(P <0.05).
실시예 4. 4T1 세포에 대한 MET, 2DG 및 IP6의 단독 및 복합 제제의 ATP 합성 억제
ATP(아데노신3인산, adenosine triphosphate)는 생물의 에너지원으로, 세포 내 ATP 합성이 억제되면 에너지대사 활성도가 감소한다. 실시예 3의 생쥐 유래 유방암 세포주 4T1에 대하여 MET, 2DG 및 IP6의 ATP 합성 억제 효과를 확인하였다.
4T1의 각 세포(103-104 cells)를 60mm 배양접시에서 24시간 동안 배양하고, 4 mM 농도의 MET, 1 mM 농도의 2DG, 1 mM 농도의 IP6로 단독 및 병용 처리한 후, 추가로 48시간 동안 배양하였다. 이후 세포를 수확하고 계수하여 100㎕의 10 부피% FBS가 포함된 RPMI 배양액에 희석하였고, 이를 96-웰 플레이트의 각 웰에 이전하였다. 상기 세포가 들어있는 웰에 프로메가 ATP 분석 키트(G7572, Promega, Durham, NC, USA)의 분석 버퍼(rL/L reagent + reconstitution buffer) 100㎕를 첨가하고 형광의 발광 정도를 560nm에서 흡광도 측정하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.
실험 결과 도 7과 같이, 실험에 사용된 4T1 세포주에서 단독 및 병용 처리에서 단독보다는 병용처리에서 ATP 합성이 저해되는 것으로 나타났다 (P <0.0001). 그리고 MET+2DG+IP6 군은 MET+2DG 군보다 ATP 합성이 현저하게 저해되는 것으로 나타났다 (P <0.05). 이로써 MET+2DG+IP6 군의 복합제제가 암세포에서 가장 효과적으로 에너지 준위를 감소시킨다는 것을 알 수 있었다.
하기 실시예 5-7에서는 시험물질 Ins, IP6, MET, 2DG와 면역체크포인트 억제제와의 병용투여에 의한 종양 성장 억제 효과를 나타낸 것이다.
실시예 5. 항-PD-1, Ins, IP6, MET 및 2DG의 단독 및 복합 제제가 종양 부피 변화에 미치는 영향
종양조직의 크기가 약 50 mm3일 때 시험군을 분류하여 시험물질투여를 시작하였고, 시험물질투여 시작일부터 3일 간격으로 종양의 부피를 측정하였다. 실험 결과 도8과 같이, 시험물질 투여 3일째부터 대조군과 비교하여 단독 및 병용 처리군의 종양의 부피가 감소하는 경향을 나타내었다. 시험물질투여 21일째 단일클론 항체만을 투여한 항-PD-1군은 항-PD-1+MET+2DG 군과 유의한 차이를 보였다 (P <0.01). 그리고 대조군, Ins 군, IP6 군, MET 군, 2DG 군, 항-PD-1 군들은 단일클론 항체를 포함한 4종 이상 복합제제인 항-PD-1+MET+2DG+Ins, 항-PD-1+MET+2DG+IP6 군, 항-PD-1+MET+2DG+IP6+Ins 군들과 비교하여 높은 유의한 차이를 보였다 (P <0.0001). 종양부피에 있어 전체 10개의 군 중에서는 항-PD-1+MET+2DG+IP6+Ins 군이 가장 높은 감소를 보임으로 높은 종양 성장 억제 효과를 나타내었다 (도8).
실시예 6. 항-PD-L1, Ins, IP6, MET 및 2DG의 단독 및 복합 제제가 종양 부피 변화에 미치는 영향
종양조직의 크기가 약 50 mm3일 때 시험군을 분류하여 시험물질투여를 시작하였고, 시험물질투여 시작일부터 3일 간격으로 종양의 부피를 측정하였다. 실험 결과 도9와 같이, 시험물질 투여 3일째부터 대조군과 비교하여 단독 및 병용 처리군의 종양의 부피가 감소하는 경향을 나타내었다. 시험물질투여 21일째 단일클론 항체만을 투여한 항-PD-L1 군은 항-PD-L1+MET+2DG 군과 유의한 차이를 보였다 (P <0.01). 그리고 대조군, Ins 군, IP6 군, MET 군, 2DG 군, 항-PD-L1 군들은 단일클론 항체를 포함한 4종 이상 복합제제인 항-PD-L1+MET+2DG+Ins, 항-PD-L1+MET+2DG+IP6 군, 항-PD-L1+MET+2DG+IP6+Ins 군들과 비교하여 높은 유의한 차이를 보였다 (P <0.0001). 종양부피에 있어 전체 10개의 군 중에서는 항-PD-L1+MET+2DG+IP6+Ins 군이 가장 높은 감소를 보임으로 높은 종양 성장 억제 효과를 나타내었다 (도9).
실시예 7. 항-CTLA-4, Ins, IP6, MET 및 2DG의 단독 및 복합 제제가 종양 부피 변화에 미치는 영향
종양조직의 크기가 약 50 mm3일 때 시험군을 분류하여 시험물질투여를 시작하였고, 시험물질투여 시작일부터 3일 간격으로 종양의 부피를 측정하였다. 실험 결과 도10과 같이, 시험물질 투여 3일째부터 대조군과 비교하여 단독 및 병용 처리군의 종양의 부피가 감소하는 경향을 나타내었다. 시험물질투여 21일째 단일클론 항체만을 투여한 항-CTLA-4 군은 항-CTLA-4+MET+2DG 군과 높은 유의한 차이를 보였다 (P <0.001). 그리고 대조군, Ins 군, IP6 군, MET 군, 2DG 군, 항-CTLA-4 군들은 단일클론 항체를 포함한 4종 이상 복합제제인 항-CTLA-4+MET+2DG+Ins, 항-CTLA-4+MET+2DG+IP6 군, 항-CTLA-4+MET+2DG+IP6+Ins 군들과 비교하여 높은 유의한 차이를 보였다 (P <0.0001). 종양부피에 있어 전체 10개의 군 중에서는 항-CTLA-4+MET+2DG+IP6+Ins 군이 가장 높은 감소를 보임으로 높은 종양 성장 억제 효과를 나타내었다 (도10).

Claims (12)

  1. (1) 항-CTLA4 항체, 항-PD-1 항체 및 항-PD-L1 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 면역체크포인트 억제제; (2) 비구아나이드계(biguanide) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; 및 (3) 2-데옥시-D-글루코스(2-deoxy-D-glucose)를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서, (4) 이노시톨 헥사포스페이트(inositol hexaphosphate) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이노시톨(inositol), 또는 이들의 혼합물을 더 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 조성물은 (1) 항-CTLA4 항체, 항-PD-1 항체 및 항-PD-L1 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 면역체크포인트 억제제, (2) 비구아나이드계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, (3) 2-데옥시-D-글루코스, 및 (4) 이노시톨 헥사포스페이트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  4. 제2항에 있어서, 상기 조성물은 (1) 항-CTLA4 항체, 항-PD-1 항체 및 항-PD-L1 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 면역체크포인트 억제제, (2) 비구아나이드계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, (3) 2-데옥시-D-글루코스, 및 (4) 이노시톨을 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  5. 제2항에 있어서, 상기 조성물은 (1) 항-CTLA4 항체, 항-PD-1 항체 및 항-PD-L1 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 면역체크포인트 억제제, (2) 비구아나이드계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, (3) 2-데옥시-D-글루코스, 및 (4) 이노시톨 헥사포스페이트(inositol hexaphosphate) 및 이노시톨(inositol)을 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역체크포인트 억제제의 1회 투여량은 0.01-25 mg/kg의 범위인 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  9. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, (2) 비구아나이드계 화합물은 메트포르민(metformin) 또는 펜포르민(Phenformin)인 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  10. 제2항에 있어서, (4) 이노시톨 화합물은 D-카이로이노시톨(D-chiro-inositol), L-카이로이노시톨(L-chiro-inositol), 미오이노시톨(myo-inositol) 및 실로이노시톨(scyllo-inositol)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  11. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 암은 간암, 폐암, 위암, 췌장암, 대장암, 자궁경부암, 유방암, 전립선암, 난소암, 뇌암, 골육종, 방광암, 두경부암, 신장암, 흑색종, 백혈병 및 림프종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  12. 삭제
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