KR20140056212A

KR20140056212A - 골수성증식 신생물과 같은 암 치료에서의 파노비노스타트와 룩소리티닙의 조합물

Info

Publication number: KR20140056212A
Application number: KR1020147000599A
Authority: KR
Inventors: 파비엥 바페르; 토마스 라디메르스키; 브라이언 가드바우
Original assignee: 노파르티스 아게
Priority date: 2011-06-14
Filing date: 2012-06-13
Publication date: 2014-05-09
Also published as: ES2595407T3; CA2844407A1; CN103608012A; MX344580B; CL2013003577A1; MX2013014805A; ZA201308815B; WO2012174061A1; EP2720696A1; JP6200884B2; AU2017204469A1; IL229766A0; EA027654B1; HK1193045A1; IL229766A; PE20140604A1; SG195141A1; CO6821954A2; JP2014517039A; GT201300308A

Abstract

본 발명은 동시에, 공동으로, 별개로 또는 순차적으로 사용하기 위한, 특히 증식성 질환의 치료에 사용하기 위한, (a) 하기 화학식 A의 화합물 A ((R)-3-(4-(7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-1H-피라졸-1-일)-3-시클로펜틸프로판니트릴) 또는 그의 제약상 허용되는 염; 및 (b) 하기 화학식 B의 화합물 B (N-히드록시-3-[4-[[[2-(2-메틸-1H-인돌-3-일)-에틸]-아미노]메틸]페닐]-2E-2-프로판아미드) 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는 조합물에 관한 것이다:
<화학식 A>

<화학식 B>

본 발명은 또한 상기 조합물을 포함하는 제약 조성물, 및 포유동물, 특히 인간에서 상기 조합물을 사용하여 증식성 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 상기 조합물을 포함하는 상업용 패키지 또는 제품에 관한 것이다.

Description

골수성증식 신생물과 같은 암 치료에서의 파노비노스타트와 룩소리티닙의 조합물 {COMBINATION OF PANOBINOSTAT AND RUXOLITINIB IN THE TREATMENT OF CANCER SUCH AS A MYELOPROLIFERATIVE NEOPLASM}

본 발명은 동시에, 공동으로, 별개로 또는 순차적으로 사용하기 위한, 특히 증식성 질환의 치료에 사용하기 위한,

(a) 하기 화학식 A의 화합물 A (명칭: (R)-3-(4-(7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-1H-피라졸-1-일)-3-시클로펜틸프로판니트릴) 또는 그의 제약상 허용되는 염; 및

(b) 하기 화학식 B의 화합물 B (명칭: N-히드록시-3-[4-[[[2-(2-메틸-1H-인돌-3-일)-에틸]-아미노]메틸]페닐]-2E-2-프로판아미드) 또는 그의 제약상 허용되는 염

을 포함하는 조합물에 관한 것이다.

<화학식 A>

<화학식 B>

골수성증식 신생물 (MPN)은 골수에서 혈액 세포 (혈소판, 백혈구 및 적혈구)의 과다생성을 유발하는 장애 군이다. MPN으로는 진성 다혈구혈증 (PV), 원발성 또는 본태성 혈소판혈증 (ET), 원발성 또는 특발성 골수섬유증, 만성 골수 (골수구성) 백혈병 (CML), 만성 호중구성 백혈병 (CNL), 소아 골수단핵구성 백혈병 (JML) 및 만성 호산구성 백혈병 (CEL)/과다호산구 증후군 (HES)을 포함한다. 상기 장애는 하기 특징 중 일부 또는 그 모두를 공유한다는 이유에서 군으로 함께 분류된다: 다분화능 조혈 선조 세포 포함, 형질전환되지 않은 조혈 선조 세포에 비하여 형질전환된 클론의 우세성, 정의할 수 있는 자극 부재하의 하나 이상의 조혈 계통의 과다생성, 시험관내 성장 인자-비의존성 콜로니 형성, 골수 세포과다성, 거대핵세포 과형성 및 이형성증, 주로 1, 8, 9, 13, 및 20번 염색체가 연루되어 있는 이상, 혈전 및 출혈 소질, 과도증식 골수외 조혈, 및 급성 백혈병으로의 자발적 전환 또는 CML의 비율과 비교하였을 때 비록 그 비율은 낮지만, 골수 섬유증의 발생. MPN의 발병률은 CML의 경우, 매년 60세 초과인 개체 100,000명당 대략 3명에서부터, JML의 경우, 매년 신생아에서부터 14세까지의 100,000명의 소아당 0.13명인 범위로 매우 다양하다 (문헌 [Vardiman JW et al., Blood 100 (7): 2292-302, 2002]).

따라서, MPN 뿐만 아니라 다른 암 치료를 위한 새로운 치료법이 여전히 요구되고 있다.

본원에서는 화학식 A의 JAK 억제제 화합물 A 또는 그의 제약상 허용되는 염; 및 화학식 B의 히스톤 데아세틸라제 (HDAC) 억제제 화합물 B 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는 조합 요법을 제공한다. 조합 요법은 다양한 암을 치료하는 데 유용하다. 조합 요법은 임의의 많은 JAK-관련 질환 및 HDAC-관련 질환을 치료하는 데에도 또한 유용하다. 화학식 A의 화합물 A는 또한 룩소리티닙(ruxolitinib)으로도 알려져 있다. 화학식 B의 화합물 B는 또한 파노비노스타트(panobinostat)로도 알려져 있다.

본원에서 제공하는 조합 요법은 대상체에서 JAK-관련 질환을 치료하는 데 유용하다. 따라서, 한 측면에서, 본원에서는 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 상기 논의된 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 암 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 암은 골수성증식 신생물이다. 본 발명의 조합 요법을 사용하여 치료할 수 있는 골수성증식 신생물에 대한 비제한적인 예로는 만성 골수성 백혈병 (CML), 진성 다혈구혈증 (PV), 본태성 혈소판혈증 (ET), 원발성 또는 특발성 골수섬유증 (PMF), 만성 호중구성 백혈병, 만성 호산구성 백혈병, 만성 골수단핵구성 백혈병, 소아 골수단핵구성 백혈병, 과다호산구 증후군, 전신 비만세포증, 및 비정형 만성 골수 백혈병이 포함되나, 이에 한정되지 않는다.

본 치료 방법의 한 실시양태에서, 대상체는 인간이다.

또 다른 실시양태에서, 치료는 화합물 A 및 화합물 B를 공동 투여하는 것을 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 화합물 A 및 화합물 B는 단일 제제 또는 단위 투여 형태로 존재한다.

추가의 또 다른 실시양태에서, 치료는 화합물 A 및 화합물 B를 실질적으로 동시에 또는 상이한 시점에 투여하는 것을 포함한다.

본 방법의 또 다른 실시양태에서, 대상체에게 화합물 A를 투여한 후 화합물 B를 투여한다.

추가의 또 다른 실시양태에서, 대상체에게 화합물 B를 투여한 후 화합물 A를 투여한다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 화합물 A 및/또는 화합물 B는, 하나 또는 둘 모두가 단독으로 투여될 때에는 효과적이지 않지만 조합되었을 때에는 효과적인 양으로 투여된다.

도 1은 화합물 A 및/또는 화합물 B 처리 기간 동안의 체중을 보여주는 것이다.
도 2 및 3은 7일간의 처리 이후, 즉, 세포 주사 이후 11일째 (처리를 세포 주사 후 4일째 시작함) 처리가 BioL 수준에 미치는 효과를 보여주는 것이다.
도 4는 처리 8일 후 비장 중량을 보여주는 것이다.
도 5 및 6은 요법 후 2시간 경과하였을 때, (비장 추출물의) PD 마커 분석 결과를 보여주는 것이다.
도 7 및 8은 연속하여 21일 동안 비히클, M/W/F 스케줄로 8 mg/kg i.p. 용량 (유리 염기 등가량)의 화합물 B, q12h로 60 mg/kg 용량 (유리 염기 등가량)의 화합물 A, 또는 상기 두 작용제의 조합물을 받은, JAK2V617F 골수 형질도입된 세포를 이식받은 Balb/c 암컷 마우스를 보여주는 것이다. 희생 시점의 체중 및 비장 중량의 변화는 평균 ± SEM으로 제시되어 있다 (N = 9마리/군). Balb/c 암컷의 정상 비장 중량의 평균값은 100 mg 범위이다. 희생 당일, *p < 0.05 (일원 ANOVA 일원, 이어서 던넷 시험(Dunnett's test) 또는 터키 시험(Tukey's test) 실시. 비장 중량 값의 역수 형태가 통계학적 분석에 사용되었다).
도 9-12는 연속하여 21일 동안 비히클, M/W/F 스케줄로 8 mg/kg i.p. 용량 (유리 염기 등가량)의 화합물 B, 60 mg/kg bid 용량 (유리 염기 등가량)의 화합물 A, 또는 상기 두 작용제의 조합물을 받은, mJAK2V617F-IRES-GFP 골수 형질도입된 세포를 이식받은 Balb/c 암컷 마우스를 보여주는 것이다. 희생 당일, 혈액을 수집하고, 시스멕스(Sysmex) 혈액 분석기를 분석하였다. N = 7-9마리/군 (일부 샘플은 화합물 A/화합물 B 콤보 군에서 쉽게 분석되지 않았다). 희생 당일 그래프 패드 퀵 칼스(Graph Pad Quick calcs) 이상치 프로그램에서의 분석에 기초하여 비히클 군에서 하나의 이상치가 검출되었고 (ID 3), 화합물 A군에서 하나의 이상치가 검출되었다 (ID 27) (데이터 분석은 모든 값에 대하여 수행되었다). 도 9: Hct; 도 10: 망상적혈구 계수; 도 11: 혈소판 계수; 도 12: 백혈구 계수. 희생 당일, *p < 0.05 (WBC 및 PLT 계수에 관한 로그 10 변환된 값에 대한 다중 비교를 위해 일원 ANOVA에 이어서 던넷 시험 또는 터키 시험 실시).
도 13-16은 mJAK2V617F-IRES-GFP 세포를 이식받고, 연속하여 21일 동안 M/W/F 스케줄로 8 mg/kg i.p. 용량 (유리 염기 등가량)의 화합물 B, q12h로 60 mg/kg 용량 (유리 염기 등가량)의 화합물 A, 또는 상기 두 작용제의 조합물로 처리된, Balb/c 암컷 마우스의 대표적인 골수 염색 영상을 보여주는 것이다.
도 17-19는 mJAK2V617F-IRES-GFP 세포를 이식받고, 연속하여 21일 동안 M/W/F 스케줄로 8 mg/kg i.p. 용량 (유리 염기 등가량)의 화합물 B, q12h로 60 mg/kg 용량 (유리 염기 등가량)의 화합물 A, 또는 상기 두 작용제의 조합물로 처리된, Balb/c 암컷 마우스의 대표적인 비장 염색 영상을 보여주는 것이다.
도 20은 연구 디자인 및 방법을 도시한 것이다.
도 21은 코호트 1에서 시간 경과에 따른 촉지 비장 길이를 도시한 것이다.
도 22는 코호트 2에서 시간 경과에 따른 촉지 비장 길이를 도시한 것이다.
도 23은 코호트 3에서 시간 경과에 따른 촉지 비장 길이를 도시한 것이다.

(a) 하기 화학식 A의 화합물 A ((R)-3-(4-(7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-1H-피라졸-1-일)-3-시클로펜틸프로판니트릴) 또는 그의 제약상 허용되는 염; 및

(b) 하기 화학식 B의 화합물 B (N-히드록시-3-[4-[[[2-(2-메틸-1H-인돌-3-일)-에틸]-아미노]메틸]페닐]-2E-2-프로판아미드) 또는 그의 제약상 허용되는 염의 조합물을 투여하는 것이 놀랍게도 대상체에서 암을 치료하는 데 상승작용 효과를 제공한다는 것을 발견하게 되었다:

<화학식 A>

<화학식 B>

상기 접근법 (2가지 유형의 작용제의 조합 또는 공동 투여)은 현재 이용가능한 요법에 대하여 반응하지 않거나, 또는 저항성인, 암을 앓는 개체를 치료하는 데 유용할 수 있다. 본원에서 제공하는 조합 요법은 또한 현재 이용가능한 암 요법에 대하여 반응하는 개체를 위하여 효능을 개선시키고/거나, 상기 요법의 부작용을 감소시키는 데 유용하다.

본원에서 사용되는 특정 용어는 하기에 기술한다. 본 발명의 화합물은 표준 명명법을 이용하여 기술한다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자가 일반적으로 이해하고 있는 것과 같은 의미를 가진다.

화합물 A 및 그의 제약상 허용되는 염(들)은 문헌, 예를 들어, 미국 특허 제7,598,257호에 기술되어 있다. 화합물 A는 또한 룩소리티닙으로도 알려져 있다.

화합물 B 및 그의 제약상 허용되는 염(들)은 문헌, 예를 들어, 미국 특허 제6,833,384호; 제7,067551호; 및 제6,552,065호에 기술되어 있다. 화합물 B는 또한 파노비노스타트로도 알려져 있다.

달리 언급되지 않거나, 또는 본문에서 명확하게 명시되지 않는 한, 본 발명의 조합 요법에서 유용한 화합물에 관해 언급하는 것은 화합물의 유리 염기, 및 상기 화합물의 모든 제약상 허용되는 염, 둘 모두를 포함한다.

본원에서 사용되는 바, "제약상 허용되는 염"이라는 용어는 본 발명의 피리미딘 화합물의 비독성 산성 또는 알칼리토금속 염을 의미한다. 이러한 염은 계내에서의 피리미딘 화합물의 최종 단리 및 정제 동안, 또는 별개로 염기성 또는 산성 관능기를 각각 적합한 유기산 또는 무기산 또는 염기와 반응시킴으로써 제조될 수 있다. 대표적인 염으로는 하기: 아세테이트, 아디페이트, 알기네이트, 시트레이트, 아스파르테이트, 벤조에이트, 벤젠술포네이트, 비술페이트, 부티레이트, 캄포레이트, 캄포르술포네이트, 디글루코네이트, 시클로펜탄프로피오네이트 도데실술페이트, 에탄술포네이트, 글루코헵타노에이트, 글리세로포스페이트, 헤미-술페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 푸마레이트, 히드로클로라이드, 히드로브로마이드, 히드로아이오다이드, 2-히드록시에탄술포네이트, 락테이트, 말레에이트, 메탄술포네이트, 니코티네이트, 2-나프탈렌술포네이트, 옥살레이트, 파모에이트, 펙티네이트, 퍼술페이트, 3-페닐프로피오네이트, 포스페이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 숙시네이트, 술페이트, 타르트레이트, 티오시아네이트, p-톨루엔술포네이트, 및 운데카노에이트가 포함되나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 염기성 질소 함유 기는 알킬 할라이드, 예컨대 메틸, 에틸, 프로필, 및 부틸 클로라이드, 브로마이드, 및 아이오다이드; 디알킬 술페이트, 예컨대 디메틸, 디에틸, 디부틸, 및 디아밀 술페이트, 장쇄 할라이드, 예컨대 도데실, 라우릴, 미리스틸, 및 스테아릴 클로라이드, 브로마이드 및 아이오다이드, 아르알킬 할라이드, 예컨대 벤질 및 페네틸 브로마이드 등과 같은 작용제로 4급화될 수 있다. 그에 의해 수용성 또는 지용성, 또는 수분산성 또는 지분산성 생성물을 수득할 수 있다.

제약상 허용되는 산 부가염을 형성하는 데 사용될 수 있는 산의 예로는 염산, 히드로보론산, 질산, 황산, 및 인산과 같은 무기산, 및 포름산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 푸마르산, 타르타르산, 옥살산, 말레산, 메탄술폰산, 숙신산, 말산, 메탄술폰산, 벤젠술폰산, 및 p-톨루엔술폰산, 시트르산, 및 산성 아미노산, 예컨대 아스파르트산 및 글루탐산과 같은 유기산이 포함된다.

염기 부가 염은 계내에서의 피리미딘 화합물의 최종 단리 및 정제 동안, 또는 별개로 카르복실산 모이어티를 적합한 염기, 예컨대 제약상 허용되는 금속 양이온의 히드록시드, 카보네이트, 또는 비카보네이트와, 또는 암모니아, 또는 유기 1급, 2급 또는 3급 아민과 반응시킴으로써 제조될 수 있다. 제약상 허용되는 염으로는 알칼리금속 및 알칼리토금속계의 양이온, 예컨대 나트륨, 리튬, 칼륨, 칼슘, 마그네슘 및 알루미늄 염 등 뿐만 아니라, 암모늄, 테트라메틸암모늄, 테트라에틸암모늄, 메틸아민, 디메틸아민, 트리메틸아민, 트리에틸아민, 에틸아민 등이 포함되나, 이에 한정되지 않는, 비독성 암모늄, 4급 암모늄, 및 아민 양이온이 포함되나, 이에 한정되지 않는다. 염기 부가 염을 형성하는 유용한 다른 대표적인 유기 아민으로는 디에틸아민, 에틸렌디아민, 에탄올아민, 디에탄올아민, 피페라진, 피리딘, 피콜린, 트리에탄올아민 등, 및 염기성 아미노산, 예컨대 아르기닌, 리신, 및 오르니틴이 포함된다.

본원에서는 JAK 억제제 화합물 A 및 HDAC 억제제 화합물 B를 포함하는 조합 요법을 제공한다. 조합물을 투여하는 것은 단일 제제 또는 단위 투여 형태의 조합물을 투여하는 것, 조합물의 개별 작용제를 공동으로, 그러나 별개로 투여하는 것, 또는 조합물의 개별 작용제를 임의의 적합한 경로에 의해 순차적으로 투여하는 것을 포함한다. 조합물의 개별 작용제의 투여량을 위해서는 조합물 중의 다른 작용제(들)와 비교하여 작용제(들) 중 하나를 더욱 빈번하게 투여해야 할 수도 있다. 그러므로, 적절하게 투여될 수 있도록 하기 위해, 패키지된 제약 제품은 나머지 다른 작용제들의 조합물을 함유하는 하나 이상의 투여 형태, 작용제의 조합물 중 하나는 함유하지만 조합물의 나머지 다른 작용제(들)는 함유하지 않는 하나 이상의 투여 형태를 함유할 수 있다.

본원에서 사용되는 바, "단일 제제"라는 용어는 환자에게 유효량의 두 작용제 모두를 전달하도록 제제화된 단일 담체 또는 비히클을 의미한다. 단일 비히클은 임의의 제약상 허용되는 담체 또는 부형제와 함께 유효량의 각각의 작용제를 전달하도록 디자인된 것이다. 일부 실시양태에서, 비히클은 정제, 캡슐제, 환제, 또는 패치제이다. 다른 실시양태에서, 비히클은 액제 또는 현탁제이다.

본원에서 사용되는 바, "단위 용량"이라는 용어는 치료받는 환자에게 하나의 투여 형태로 두 작용제를 함께 동시에 투여하는 것을 의미한다. 일부 실시양태에서, 단위 용량은 단일 제제이다. 특정 실시양태에서, 단위 용량은 각 비히클이 제약상 허용되는 담체 및 부형제와 함께 하나 이상의 작용제를 유효량으로 포함하도록 하는 하나 이상의 비히클을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단위 용량은 환자에게 동시에 투여되는 하나 이상의 정제, 캡슐제, 환제, 또는 패치제이다.

본원에서 사용되는 바, "치료하다"라는 용어는 대상체에서 질환의 하나 이상의 증상을 경감, 감소 또는 완화시킨다는 것을 의미한다. 본 발명의 의미에서, "치료하다"라는 용어는 또한 발병 (즉, 질환의 임상적 소견 또는 질환의 증상이 일어나기 전 기간)을 정지, 지연시키고/거나, 질환의 증상이 발생하거나 악화될 위험을 감소시키는 것을 의미한다.

"대상체"라는 용어는 동물을 포함하는 것을 의도한다. 대상체의 예로는 포유동물, 예컨대 인간, 개, 소, 말, 돼지, 양, 염소, 고양이, 마우스, 토끼, 래트, 및 트랜스제닉 비인간 동물을 포함한다. 특정 실시양태에서, 대상체는 인간, 예컨대 다발성 골수종을 앓거나, 그를 앓을 위험이 있거나, 또는 잠재적으로 그를 앓을 수 있는 인간이다.

"약" 또는 "대략적으로"라는 용어는 보통 주어진 값 또는 범위의 20% 이내, 더욱 바람직하게, 10% 이내, 및 추가로 가장 바람직하게는 5% 이내에 있는 것을 의미한다. 별법으로, 특히 생물계에서, "약"이라는 용어는 주어진 값의 약 로그 (즉, 10¹배) 이내, 바람직하게 10²배 이내에 있는 것을 의미한다.

본원에 기술된 작용제의 조합물은 상승작용 효과를 보인다. 본원에서 사용되는 바, "상승작용 효과"라는 용어는 예를 들어, 암 또는 그의 증상의 증후성 진행을 저속화시키는 것과 같은 효과를 일으키는 두 작용제의 작용으로서, 각 약물이 단독으로 투여되었을 때 일어나는 효과를 단순히 가산한 값보다 더 큰 것을 의미한다. 상승작용 효과는 예를 들어, 적합한 방법, 예컨대 시그모이드-E맥스(Sigmoid-Emax) 방정식 (문헌 [Holford, N. H. G. and Scheiner, L. B., Clin. Pharmacokinet. 6: 429-453 (1981)]), 뢰베(Loewe) 덧셈 방정식 (문헌 [Loewe, S. and Muischnek, H., Arch. Exp. Pathol Pharmacol. 114: 313-326 (1926)]), 및 중간 효과 방정식 (문헌 [Chou, T. C. and Talalay, P., Adv. Enzyme Regul. 22: 27-55 (1984)])을 사용하여 계산할 수 있다. 상기 언급된 각각의 방정식을 실험 데이터에 적용하여 상응하는 그래프를 작성하고, 이를 통해 약물 조합 효과를 평가하는 데 도움을 줄 수 있다. 상기 언급된 방정식과 관련된 상응하는 그래프는 각각 농도-효과 곡선, 이소볼로그램 곡선 및 복합 지수 곡선이다.

작용제의 조합물의 "유효량"은 조합물로 치료되는 우울 장애의 임상적으로 관찰가능한 징후 및 증상을 기준선보다 관찰가능할 정도로 개선시키는 데 충분한 양이다.

"경구 투여 형태"는 경구 투여용으로 처방되거나, 그를 의도로 하는 단위 투여 형태를 포함한다.

화합물 A 및 화합물 B 조합물을 사용하는 치료 방법

본 발명은 개체에게 화합물 A 및 화합물 B의 조합물을 투여함으로써 개체에서 JAK-관련 질환, 예컨대 암, 예컨대 골수성증식 신생물을 치료하는 방법을 제공한다.

한 실시양태에서, 본원에서는 JAK-관련 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량 또는 용량의 본 발명의 조합물 또는 그의 제약 조성물을 투여함으로써 대상체 (예컨대, 환자)에서 JAK-관련 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. JAK-관련 질환은 과다발현 및/또는 비정상적인 활성 수준을 비롯한, JAK의 발현 또는 활성과 직접 또는 간접적으로 연관된 임의의 질환, 장애, 또는 병증을 포함할 수 있다. JAK-관련 질환은 또한 JAK 활성을 조절함으로써 예방, 호전, 또는 치유될 수 있는 임의의 질환, 장애, 또는 병증을 포함할 수 있다.

JAK-관련 질환의 예로는 예를 들어, 기관 이식 거부 (예컨대, 동종이식 거부 및 이식편대 숙주병)를 비롯한 면역계가 관여하는 질환을 포함한다.

JAK-관련 질환의 추가의 예로는 자가면역 질환, 예컨대 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 소아 관절염, I형 당뇨병, 루푸스, 건선, 염증성 장 질환, 궤양성 대장염, 크론병, 중증 근무력증, 면역글로불린 신장병증, 자가면역 갑상선 장애 등을 포함한다. 일부 실시양태에서, 자가면역 질환은 자가면역 수포성 피부 장애, 예컨대 보통 천포창 (PV) 또는 수포성 유천포창 (BP)이다.

JAK-관련 질환의 추가의 예로는 알레르기성 병증, 예컨대 천식, 음식 알레르기, 아토피 피부염 및 비염을 포함한다. JAK-관련 질환의 추가의 예로는 바이러스 질환, 예컨대 엡스타인 바르 바이러스 (EBV), B형 간염, C형 간염, HIV, HTLV 1, 수두 대상 포진 바이러스 (VZV) 및 인간 유두종 바이러스 (HPV)를 포함한다.

JAK-관련 질환 또는 병증의 추가의 예로는 피부 장애, 예컨대 건선 (예를 들어, 심상성 건선), 아토피 피부염, 피부 발진, 피부 자극, 피부 감작화 (예컨대, 접촉 피부염 또는 알레르기성 접촉 피부염)를 포함한다. 예를 들어, 일부 제약을 비롯한 특정 물질은 국소적으로 적용되었을 때에 피부 감작화를 유발할 수 있다. 일부 실시양태에서, 피부 장애는 본 발명의 하나 이상의 JAK 억제제를 국소 투여함으로써 치료된다.

추가의 실시양태에서, JAK-관련 질환은 고형 종양 (예컨대, 전립선암, 신장암, 간암, 췌장암, 위암, 유방암, 폐암, 두경부암, 갑상선암, 교모세포종, 카포시 육종, 캐슬만 질환, 흑색종 등), 혈액암 (예컨대, 림프종, 백혈병, 예컨대 급성 림프모구성 백혈병, 또는 다발성 골수종), 및 피부암, 예컨대 피부 T 세포 림프종 (CTCL) 및 피부 B 세포 림프종을 특징으로 하는 것을 비롯한 암이다. 피부 T 세포 림프종의 예로는 세자리 증후군 및 균상 식육종을 포함한다.

JAK-관련 질환은 추가로 돌연변이체 JAK2의 발현을 특징으로 하는 것, 예컨대 슈도-키나제 도메인 중 하나 이상의 돌연변이 (예컨대, JAK2V617F)를 가지는 것을 포함할 수 있다.

JAK-관련 질환으로는 추가로 골수성증식 장애 (MPD), 예컨대 진성 다혈구혈증 (PV), 본태성 혈소판혈증 (ET), 골수섬유증을 동반한 골수성 화생 (MMM), 만성 골수 백혈병 (CML), 만성 골수단핵구성 백혈병 (CMML), 과다호산구 증후군 (HES), 전신 비만 세포 질환 (SMCD) 등을 포함할 수 있다.

추가의 JAK-관련 질환으로는 염증 및 염증성 질환을 포함한다. 염증성 질환의 예로는 눈 염증성 질환 (예컨대, 홍채염, 포도막염, 공막염, 결막염, 또는 관련 질환), 기도 염증성 질환 (예컨대, 코 및 부비동을 비롯한 상기도의 염증성 질환, 예컨대 비염 또는 부비동염, 또는 기관지염을 비롯한, 하기도의 염증성 질환, 만성 폐쇄 폐 질환 등), 염증성 근육병증, 예컨대 심근염, 및 다른 염증성 질환을 포함한다.

본원에 기술된 조합 요법은 추가로 허혈 재관류 손상 또는 예컨대, 뇌졸중 또는 심장 정지와 같은 염증성 허혈 이벤트와 관련된 질환 또는 병증을 치료하는 데 사용될 수 있다. 본원에 기술된 조합 요법은 추가로 예컨대, 암으로부터 유발되거나, 암과 관련되는 식욕부진, 악액질, 또는 피로감을 치료하는 데 사용될 수 있다. 본원에 기술된 조합 요법은 추가로 재협착, 경피성 피부염, 또는 섬유증을 치료하는 데 사용될 수 있다. 본원에 기술된 조합 요법은 추가로 저산소증 또는 성상교세포증과 관련된 병증, 예컨대 당뇨 망막병증, 암, 또는 신경퇴행을 치료하는 데 사용될 수 있다.

본원에서는 질환을 앓는 개체에게 유효량의 화합물 A 및 화합물 B를 투여함으로써 질환, 예컨대 골수성증식 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 작용제의 조합물의 양은 질환을 치료하는 데 효과적이다. 작용제의 조합물의 상승작용 효과에 주목하는 것이 중요한데, 비록 하나 이상의 작용제가 특정 투여량으로 단독으로 투여되었을 때에는 효과적이지 않을 수 있지만, 각 작용제를 같은 투여량을 조합하여 투여하였을 때에 치료는 효과적이다. 그러므로, 조합되는 하나 이상의 작용제의 용량은 FDA로부터 승인받은 각 작용제에 대한 용량보다 더 적은 양일 수 있다.

투여량

질환 치료를 위한 작용제의 조합물의 최적 용량은 공지된 방법을 사용하여 각 개체에 대해 실험적으로 결정될 수 있고, 질환 진행 정도; 개체의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별, 및 섭식; 투여 시간 및 경로; 및 개체가 복용하는 다른 약물이 포함되나, 이에 한정되지 않는 다양한 인자에 따라 달라질 것이다. 최적의 투여량은 당업계에 주지된 통상의 검사 및 방법을 사용하여 확립될 수 있다.

담체 물질과의 조합을 통해 단일 투여 형태로 제조될 수 있는 작용제의 조합물의 양은 치료받는 개체 및 특정 투여 모드에 따라 달라질 것이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 작용제의 조합물을 함유하는 단위 투여 형태는 작용제가 단독으로 투여될 때 전형적으로 투여되는 양으로 조합물의 각 작용제를 함유할 것이다.

투여 빈도는 사용되는 화합물, 치료 또는 예방하고자 하는 특정 병증에 따라 달라질 것이다. 일반적으로, 효과적인 요법을 제공하는 데 충분한 최소 투여량을 사용하는 것이 바람직하다. 환자는 일반적으로 당업계의 숙련가에게 잘 알려져 있는, 치료 또는 예방하고자 하는 병증에 대하여 적합한 검정법을 사용하여 치료 효능에 대해 모니터링될 수 있다.

투여 형태는 약물 제법 화학 분야의 당업자에게 쉽게 자명한, 종래의 다양한 혼합, 분쇄 및 제조 기법에 의해 제조될 수 있다.

작용제의 조합물, 또는 작용제의 조합물을 구성하는 개별 작용제를 함유하는 경구 투여 형태는 캡슐제, 예컨대 젤라틴 캡슐제 내부에 밀봉되어 있는 미세정제 형태의 것일 수 있다. 이러한 경우, 제약 제제에서 사용되는 것과 같은 젤라틴 캡슐제, 예컨대 화이자(Pfizer)로부터 이용가능한 캡슈겔(CAPSUGEL)로 알려져 있는 경질 젤라틴 캡슐제가 사용될 수 있다.

본원에서 유용한 많은 경구 투여 형태는 작용제의 조합물, 또는 작용제의 조합물을 구성하는 개별 작용제를 입자 형태로 함유한다. 상기 입자는 정제로 압착될 수 있거나, 코팅된 투여 형태, 예컨대 맛이 차폐된 투여 형태, 프레스 코팅된 투여 형태 또는 장용 코팅된 투여 형태의 코어 요소 중에 존재할 수 있거나, 또는 캡슐제, 삼투 펌프 투여 형태, 또는 다른 투여 형태에 함유되어 있을 수 있다.

본 발명의 약물 화합물은 100:1 내지 1:100, 더욱 바람직하게, 1:1 내지 1:100, 및 더욱더 바람직하게, 1:10 내지 1:100 범위의 비로 본원에 개시된 조합물, 투여 형태, 제약 조성물 및 제약 제제 중에 존재한다.

한 실시양태에서, 인간에게 투여될 때, 룩소리티닙은 5 mg BID로 제공되고, 파노비노스타트는 10 mg TIW QOW로 투여된다.

한 실시양태에서, 인간에게 투여될 때, 룩소리티닙은 10 mg BID로 제공되고, 파노비노스타트는 10 mg TIW QOW로 투여된다.

한 실시양태에서, 인간에게 투여될 때, 룩소리티닙은 15 mg BID로 제공되고, 파노비노스타트는 10 mg TIW QOW로 투여된다.

한 실시양태에서, 인간에게 투여될 때, 룩소리티닙은 15 mg BID로 제공되고, 파노비노스타트는 15 mg TIW QOW로 투여된다.

한 실시양태에서, 인간에게 투여될 때, 룩소리티닙은 15 mg BID로 제공되고, 파노비노스타트는 20 mg TIW QOW로 투여된다.

한 실시양태에서, 인간에게 투여될 때, 룩소리티닙은 15 mg BID로 제공되고, 파노비노스타트는 25 mg TIW QOW로 투여된다.

한 실시양태에서, 인간에게 투여될 때, 룩소리티닙은 15 mg BID로 제공되고, 파노비노스타트는 30 mg TIW QOW로 투여된다.

한 실시양태에서, 인간에게 투여될 때, 룩소리티닙은 3-7 mg BID로 제공되고, 파노비노스타트는 8-12 mg TIW QOW로 투여된다.

한 실시양태에서, 인간에게 투여될 때, 룩소리티닙은 8-12 mg BID로 제공되고, 파노비노스타트는 8-12 mg TIW QOW로 투여된다.

한 실시양태에서, 인간에게 투여될 때, 룩소리티닙은 10-20 mg BID로 제공되고, 파노비노스타트는 8-12 mg TIW QOW로 투여된다.

한 실시양태에서, 인간에게 투여될 때, 룩소리티닙은 10-20 mg BID로 제공되고, 파노비노스타트는 10-20 mg TIW QOW로 투여된다.

한 실시양태에서, 인간에게 투여될 때, 룩소리티닙은 10-20 mg BID로 제공되고, 파노비노스타트는 10-30 mg TIW QOW로 투여된다.

한 실시양태에서, 인간에게 투여될 때, 룩소리티닙은 10-20 mg BID로 제공되고, 파노비노스타트는 20-40 mg TIW QOW로 투여된다.

독성 없이 효능을 발휘하는, 약물 화합물의 최적의 비, 개별 및 조합 투여량, 및 농도는 활성 성분의 표적 부위에의 이용가능성에 관한 동력학적 성질을 기초로 하며, 이는 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 결정된다.

제약 조성물

본원에 개시된 제약 조성물 또는 조합물을 임상 연구에서 시험할 수 있다. 적합한 임상 연구는 예를 들어, 증식성 질환 환자에서 수행되는 개방 표지 용량 점증 연구일 수 있다. 상기 연구를 통해 특히 본 발명의 조합물의 활성 성분의 상승작용 작용을 입증한다. 증식성 질환에 미치는 유익한 효과는 당업자에게 그와 같이 알려져 있는 상기 연구의 연구를 통해 직접적으로 확인할 수 있다. 상기와 같은 연구는 특히 본 발명의 조합물 및 활성 성분을 사용하는 단일 요법의 효과를 비교하는 데 적합할 수 있다.

본 발명의 제약 조합물을 투여하면, 예컨대 증상을 완화시키거나, 그의 진행을 지연시키거나, 또는 그를 억제시키는 것과 관련되는 유익한 효과, 예컨대 상승작용 치료학적 효과를 가져올 뿐만 아니라, 추가로, 예컨대 본 발명의 조합물에 사용되는 제약상 활성인 성분들 중 단 하나만을 적용하는 단일 요법과 비교하였을 때, 부작용 감소, 삶의 질 개선 또는 이환율 감소와 같은 놀라운 유익한 효과를 발휘한다.

추가의 이점은 본 발명의 조합물을 구성하는 활성 성분들이 보다 저용량으로 사용될 수 있다는 점, 예를 들어, 투여량은 대개 더 소량화되고, 더 적은 빈도로 적용될 수 있다는 점일 수 있고, 이를 통해 발병률, 또는 부작용의 중증도는 감소될 수 있다. 이는 치료하고자 하는 환자의 요망 및 요구 사항에 따른다.

공동으로 암, 예컨대 골수성증식 장애를 표적화 또는 예방하는 데 치료 효과적일 수 있는 양을 포함하는 제약 조성물을 제공하는 것이 본 발명의 목적이다. 상기 조성물 중에서 화합물 A 및 화합물 B는 함께, 차례로, 또는 하나의 조합된 단위 투여 형태 또는 2개의 별개의 단위 투여 형태로 별개로 투여될 수 있다. 단위 투여 형태는 또한 고정된 조합물일 수 있다.

상기 두 화합물 모두를 별개로 투여하기 위한 또는 고정된 조합물로 투여하기 위한 제약 조성물, 즉, 본 발명에 따른 두 화합물 모두를 포함하는 단일 생약 조성물은 그 자체가 공지되어 있는 방식으로 제조될 수 있고, 인간을 비롯한 포유동물 (온혈 동물)에게로의 장관내, 예컨대 경구 또는 직장, 및 비경구 투여에 적합한 것이며, 예컨대 상기 명시된 바와 같은 치료 유효량의 하나 이상의 약리학상 활성인 조합물 파트너만을 단독으로 포함하거나 특히 장관내 또는 비경구 적용에 적합한 하나 이상의 제약상 허용되는 담체 또는 희석제와 조합으로 포함한다.

제제화

본원에서 제공하는 약물 조합물은 제약 제제 분야의 당업자에게 자명한 각종 방법에 의해 제제화될 수 있다. 상기 기술된 다양한 방출 특성은 각종의 상이한 방식으로 달성될 수 있다. 적합한 제제로는 예를 들어, 정제, 캡슐제, 프레스 코팅 제제, 및 쉽게 투여되는 다른 제제를 포함한다.

적합한 제약 제제는 예를 들어, 약 0.1% 내지 약99.9%, 바람직하게, 약 1% 내지 약 60%의 활성 성분(들)을 함유할 수 있다. 장관내 또는 비경구 투여용의, 조합 요법을 위한 제약 제제는 예를 들어, 단위 투여 형태인 것, 예컨대 당의정, 정제, 캡슐제 또는 좌제, 또는 앰플이다. 달리 명시되지 않는 한, 이는 그 자체가 공지되어 있는 방식으로, 예를 들어, 종래의 혼합, 과립화, 당의, 용해 또는 동결건조 공정에 의해 제조된다. 필요한 유효량은 복수 개의 투여 단위의 투여에 의해 달성될 수 있는 바, 개별 용량의 각 투여 형태 중에 함유되어 있는 조합 파트너의 단위 함량 그 자체가 유효량을 구성할 필요는 없다는 것을 이해할 것이다.

특히, 치료 유효량의 본 발명의 조합물을 구성하는 각각의 조합 파트너는 동시에 또는 순차적으로 및 임의의 순서로 투여될 수 있고, 성분은 별개로 또는 고정된 조합물로서 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따라 질환을 치료하는 방법은 (i) 유리 또는 제약상 허용되는 염 형태의 제1 작용제 (a)를 투여하는 것, 및 (ii) 유리 또는 제약상 허용되는 염 형태의 작용제 (b)를 동시에 또는 순차적으로 임의의 순서로, 공동으로 치료 유효량으로, 바람직하게, 상승작용적으로 효과적인 양으로, 예컨대 본원에 기술된 양에 상응하는 1일 투여량으로 또는 간헐적 투여량으로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 본 발명의 조합물을 구성하는 개별 조합 파트너는 요법 과정 동안 상이한 시점에 별개로, 또는 분할 또는 단일 조합 형태로 공동으로 투여될 수 있다. 추가로, "투여하는"이라는 용어는 그 자체가 생체내에서 조합 파트너로 전환되는 조합 파트너의 전구약물을 사용하는 것을 포함한다. 그러므로, 본 발명은 상기와 같은 동시 또는 교대 치료 요법 모두를 포함하는 것으로 이해하여야 하고, "투여하는"이라는 용어는 그에 따라 해석되어야 한다.

본 발명의 조합물에 사용되는 조합 파트너 각각에 대한 유효 투여량은 사용되는 특정 화합물 또는 제약 조성물, 투여 모드, 치료되는 병증, 치료되는 병증의 중증도에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 본 발명의 조합물의 투여 요법은 투여 경로 및 환자의 신장 및 간 기능을 비롯한 다양한 인자에 따라 선택된다. 숙련된 기술을 지닌 임상의 또는 의사는 병증의 진행을 완화시키거나, 역행시키거나, 또는 정지시키는 데 필요한 유효량의 단일 활성 성분을 쉽게 결정하고, 처방할 수 있다.

실시예

본 개시내용은 하기의 비-제한적인 실시예를 통해 추가로 예시된다.

실시예 A

1·10⁶ Ba/F3 EpoR JAK2V617F-luc 클론 8 세포를 i.v. (꼬리 정맥)로 주사맞은 Scid-베이지색 마우스에서 화합물 A 및 화합물 B의 조합물의 효능을 시험하는 연구를 수행하였다.

프로토콜 :

동물:

80마리의 Scid-베이지색 암컷 마우스, 18-22 g (1군당 마우스 7마리씩 8개의 군, 무작위화 시점에 24마리는 제외되었다).

세포: Ba/F3 EpoR JAK2V617F-luc 클론 8 세포.

세포 주사 후 4, 7, 9 및 11일째 전신 제노겐(Xenogen) 영상화를 수행하였다. 주사 후 4일째 생체발광 (BioL)에 기초하여 동물을 처리군으로 무작위화시켰다.

마우스 모델 및 프로토콜은 문헌 [Baffert et al., Mol. Cancer Ther; 9(7), 1945, July 2010]에 기술되어 있다.

동물 및 세포주:

세포주: Ba/F3EpoR JAK2V617F-luc 클론 8

유전자: JAK2V617F

세포 개수/주사 부위: 200 ul 중 1x10e6개의 세포/꼬리 i.v. 주사

종: 마우스

계통: CB17/C.B-Igh-1^b/GbmsTac-Prkdc^scid-lyst^bgN7, 타코닉(Taconic) 농장 (완전한 명칭 타코닉)

성별: 암컷

연령: 22-24 g

마리수: 80마리의 마우스

세포 제조 및 주사 :

시약: RPMI 1640 (아민드(Amined))

10% FCS (아민드)

L-글루타민 2 mM (아민드)

푸로마이신(Puromycin), 1 ug/ml (시그마(Sigma), 로트 036K4073)

히그로마이신 B, 100 ug/ml (인비트로겐(invitrogen), 로트 B13871010)

Ba/F3 EpoR JAK2V617F-luc 세포를 10% FCS, 1% 글루타민, 푸로마이신 (1 ug/mL) 및 히그로마이신 (100 ug/mL)으로 보충된 RPMI 1640에서 성장시켰다. 실험 전 2주 이하의 기간 동안 매 3일마다 세포를 (1:50으로) 나누었다. 주사하기 전날, (생체내 세포 성장의 임의의 잠재적 지연을 막기 위해) 세포를 어떤 항생제도 함유하지 않은 상태에서 성장시켰다.

주사 당일, 세포를 수거하고, HBSS 완충제 중에 재현탁시켰다 (200 ul 중 10e6개의 세포). 27G 투베르쿨린 시린지를 사용하여 세포를 꼬리 정맥에 주사하였다.

군별 정의

1군 (마우스 7마리): 비히클 군 (0.5% HPMC po + D5W 5% ip)

2군 (마우스 7마리): 화합물 B 5 mg/kg, 주 3회 (M/W/F), ip + HPMC 0.5%po

3군 (마우스 7마리): 화합물 B 10 mg/kg, 주 3회 (M/W/F), ip + HPMC 0.5% po

4군 (마우스 7마리): 화합물 B 15 mg/kg, 주 3회 (M/W/F), ip + HPMC 0.5% po

5군 (마우스 7마리): 화합물 A 79.2 mg/kg 1일 2회, po + D5W 5% ip

6군 (마우스 7마리): 화합물 A 79.2 mg/kg 1일 2회, po + 화합물 B 5 mg/kg, 주 3회 (M/W/F), ip

7군 (마우스 7마리): 화합물 A 79.2 mg/kg 1일 2회, po + 화합물 B 10 mg/kg, 주 3회 (M/W/F), ip

8군 (마우스 7마리): 화합물 A 79.2 mg/kg 1일 2회, po + 화합물 B 15 mg/kg, 주 3회 (M/W/F), ip

동시에 처리하였다.

화합물:

화합물 A는 0.5% HPMC 파마코트(Pharmacoat) 603 중의 모노포스페이트 염, 79.2 mg/kg (등가량 60 mg / kg 유리 염기), 10 mL/kg이었다.

화합물 A를 함유하는 제제: 66 ml HPMC 파마코트 603 0.5% 중 522.7 mg 화합물 A (모노포스페이트 염 형태)

화합물 B는 D5W 5% (B. 브라운(B. Braun), 로트 395147) 중의 락트산 염 형태, 15 mg/kg (등가량 11.90 mg / kg 유리 염기), 10 mg/kg (등가량 7.94 mg / kg 유리 염기) 및 5 mg/kg (등가량 3.97 mg / kg 유리 염기), 10 mL/kg이었다.

화합물 B를 함유하는 제제: 각각 10 ml의 D5W 5% 중 15 mg 화합물 B (락트산 염 형태), 10 ml의 D5W 5% 중 10 mg, 및 10 ml의 D5W 5% 중 5 mg.

모니터링 및 데이터/샘플 수집:

트랜스폰더에 의해 동물을 확인하고, 매일 모니터링하였다.

이소플루란 마취 (3-5% vol 이소플루란, 0.8 L/분 기류)하에 세포를 주사한 후 4, 7 및 10일째 제노겐 카메라 (비침습성 IVIS^? 영상화 시스템, 캘리퍼(Caliper))를 이용하여 생체발광을 기록하였다. D-루시페린 (제노겐 코포레이션(Xenogen corporation), 참조 번호 XR-1001)을 150 mg/kg (10 ml/kg, Nacl)으로 동물에 i.p. 주사하였다. 루시페린 주사 후 15분 동안 영상화를 위해 마취된 마우스를 영상화 챔버에 놓았다.

제노겐 파라미터: D/10sec/med/15min.

4일째 동물을 무작위화하고, 비히클 처리된 동물의 안녕 상태에 기초하여 6일 이상 동안 처리를 시작하였다.

점수 기입용 시트에 체중 (BW) 및 안녕 상태를 기록하였다. BW가 연속 2일 동안 15%를 초과하였을 때에는 동물을 희생시켰다. 군당 동물의 50%를 초과하는 동물이 사망한 경우에는 마우스 모두를 희생시켰다.

희생물 샘플 수집 :

화합물 A의 경우, 최종 투여 후 2시간 경과시;

화합물 B의 경우, 최종 투여 후 2시간 경과시;

· 희생시 비장 중량을 기록하였다.

· 샘플을 수집하고, 액체 질소 중에서 급속 냉동시킨 후, 분석할 때까지 -80℃에서 보관하였다:

- PK 분석을 위해, 비장, BM, 혈액 및 간

- PD 마커 분석을 위해 비장 (p-STAT5 (화합물 A) 및 단백질 아세틸화 (화합물 B)),

- PD 마커 분석을 위해 흉골 (p-STAT5 (화합물 A)).

실시예 A의 결과 :

용량은 유리 염기 등가량으로 표시하였다.

하기 표 1.1-1.8에는 상이한 군에 대한 무작위화 시점에서의 생체발광값이 제시되어 있다.

도 1은 화합물 A 및/또는 화합물 B 처리 기간 동안의 체중을 보여주는 것이다. 화합물 A 및 화합물 B를 조합하였을 때에는 허용성에 있어 어떤 중요한 변화는 없었다.

도 2 및 3은 7일간의 처리 이후, 즉, 세포 주사 이후 11일째 (처리를 세포 주사 후 4일째 시작함) 처리가 BioL 수준에 미치는 효과를 보여주는 것이다.

도 4는 처리 8일 후 비장 중량을 보여주는 것이다.

도 5 및 6은 요법 후 2시간 경과하였을 때, (비장 추출물의) PD 마커 분석 결과를 보여주는 것이다.

하기 표 2는 치료가 바이오룩스(Biolux)의 분율 증가에 미치는 효과를 보여주는 것이다.

주석:

분율 변화는 최종일 바이오룩스/첫번째날 바이오룩스로서 계산하였다.

*, p<0.05 대 비히클 대조군

^#, p<0.05 대 화합물 A

^$, p<0.05 대 화합물 B 동일 용량

(모든 군과의 다중 비교를 위해 로그 변환된 값에 대한 일원 ANOVA, 이어서 터키 시험)

T/C는 (처리군/대조군)·100으로 계산하였다.

문헌 [Clarke R, Breast Cancer Res Treat, 1997]에 기술된 방법에 따라,

^￥는 약간의 길항작용이 있음을 나타내는 것이고,

⁺는 약간의 길항작용 또는 상가작용이 있음을 나타내는 것이고,

^&는 약간의 상승작용 또는 상가작용이 있음을 나타내는 것이다.

하기 표 3에는 요법 후 2시간 경과하였을 때의 PK 분석 결과가 열거되어 있다.

하기 결과는 화합물 A 및 화합물 B의 조합물이 Ba/F3 EpoR JAK2V617F-luc 세포 유도성 백혈병 질환을 앓는 기계론적 마우스 모델에서 허용된다는 것을 나타낸다 (화합물 B 단일 요법군과 화합물 B + 화합물 A 조합물 군 사이의 체중 손실은 유사).

백혈병 세포 확장 (제노겐 바이오룩스 판독치)을 평가하였을 때, 각각 60 mg/kg 및 12 mg/kg 용량의 화합물 A 및 화합물 B의 조합물은 단일 요법으로 제공된 상기 약물과 비교하였을 때, 유의적인 차이를 보였다.

실시예 B

진성 다혈구혈증 유사 질환을 앓는 JAK2V617F 골수 이식 모델에서 JAK1/2 억제제, 화합물 A와 조합된 데아세틸라제 억제제 화합물 B의 활성 및 허용성을 평가하였다. 화합물 B가 8 mg/kg 용량, 및 화합물 A가 60 mg/kg 용량일 때, 상기 MPN 질환 모델에서의 조합 활성을 테스트하였다. 하기에 상세하게 제시되는 바와 같이, 화합물 B와 JAK1/2 억제제, 화합물 A의 조합물은 각각의 단일 작용제와 비교하였을 때, 비장 비대, 및 골수 및 비장 조직학적 성질에 있어 유의적인 개선을 보였다.

골수 이식 및 분석

골수 감염 및 이식

본질적으로 베르니히(Wernig) 등에 의해 기술된 바와 같이 (문헌 [Wernig, G., Mercher, T., OkabeR., et al. (2006) Expression of JAK2V617F causes a polycythemia vera-like disease with associated myelofibrosis in a murine bone marrow transplant model. Blood 107: 4274-4281]), 뮤린 골수 이식 실험을 수행하였다. 간략하면, Balb/c 기증자 마우스 (6-8주령, 찰스 리버(Charles River), 수컷 또는 암컷)를 BM 이식 5일 전 5-플루오로우라실 (150 mg/kg, i.p., 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), 카탈로그 번호 F6627)로 처리하였다. 대퇴골 및 경골을 플러싱하여 기증자 마우스로부터 골수 세포를 수거하였다. 적혈구 용해 후 (스템셀테크놀러지즈(StemCellTechnologies: 프랑스 그르노블), 카탈로그 번호 07800), 이식용 배지 (RPMI + 10% FCS + 25 ng/ml IL3 (R&D 시스템즈(R&D Systems: 영국 아빙턴), 카탈로그 번호 403-ML), 25 ng/ml IL6 (R&D 시스템즈 카탈로그 번호 406-ML), 및 50 ng/ml 줄기 세포 인자 (SC F, 바이오컨셉트(Bioconcept: 스위스 올스윌), 카탈로그 번호 D-63120)) 중에서 24시간 동안 유핵 세포를 배양하였다. 다음날, 10 ㎍의 p-MSCV-JAK2V617F-IRES-GFP 벡터 (클론테크(Clontech)로부터 구입한 원 벡터 p-MSCV 벡터의 변형물) 및 10 ㎍의 pCL-ECO 벡터 (임게넥스(Imgenex), 카탈로그 번호 10045P)로 형질감염된 293T로부터의 비리온을 함유하는 1 mL의 상청액의 존재하에 6웰 플레이트 중에 2 x 10⁶개의 세포/ml/웰로 세포를 플레이팅하였다. 2회에 걸친 스핀 감염 후 (32℃에서 90 min 동안 2,500 rpm, 멀티퓨즈(Multifuge) 1S-R, 헤라우스(Heraeus)), 행크스 균형 염 용액(HBSS: Hank's balanced salt solution) 중에 비선택의 감염된 BM 세포를 재현탁시킨 후, 바이오빔 8000(BIOBEAM 8000) 감마 조사기 (비빅 게엠베하(BEBIG GmbH: 독일))를 사용하여 4시간의 시간 간격을 두고 2회에 걸쳐 4.5 또는 3.5 Gy 선량을 조사받은 (총 9 Gy 또는 7 Gy) 것인, 치사 선량의 방사선을 조사받은 Balb/c 암컷 수혜자 마우스의 꼬리 정맥 내로 세포 (감염률에 따라 1-3 x 10⁶개)를 주사하였다.

동물을 매일 모니터링하고, 주요 징후가 곤란인 경우 (기면 및 입모와 함께, 어떤 개선도 없이 연속하여 2일 초과의 기간 동안에 걸쳐 과도한 체중 손실이 있는 경우) 희생시켰다.

샘플 수집 및 분석

CBC 및 기관 수집

이소플루란 마취 (종말 방법)하에 20 G 니들을 이용하여 꼬리 정맥으로부터, 또는 희생시 대정맥으로부터 혈액을 채취하고, 자동 일반 혈액 검사 및 감별 혈액 세포 계수기를 이용하여 (시스멕스 혈액 분석기 XT2000iV (시스멕스 디지타나 아게(Sysmex Digitana AG: 독일 노르더슈테트)) 상에서 1:5의 희석액을 이용하여 모세관 모드로) 분석하였다. 비장 중량을 측정하여 비장 비대를 평가하였다. 약동학적 성질, 약역학적 성질 분석을 위해 혈액, 비장, 흉골, 및 간을 수집하였다.

유세포 측정법에 의한 혈액 샘플 중 GFP -양성 세포 검출

10 ㎕의 전혈을 사용하여 순환 GFP-양성 세포를 검출하였다. 간략하면, 혈액을 96웰 둥근 바닥 플레이트 (코스타(Costar), 카탈로그 번호 3795)에 분포시키고, 200 ㎕의 적혈구 용해 완충제 (시그마, 카탈로그 번호 R-7757)를 이용하여 적혈구를 용해시켰다. 암실내 플레이트 교반기에서 7 min 동안 인큐베이션시킨 후, 세포를 원심분리하고 (5분, 300 g), 플레이트를 도치시켜 상청액을 버렸다. FACS 완충제 (포스페이트 완충처리된 염수 (D-PBS), 3% FBS 및 0.02% 아지드화 나트륨) 중에서 3회에 걸쳐 세척 단계를 진행한 후, 유핵 세포를 200 ㎕의 냉 FACS 완충제 중에 재현탁시키고, 프로세싱하여 LSRII 유세포 측정기 (BD 바이오사이언시즈(BD Biosciences: 독일 하이델베르크))를 이용하여 GFP 검출을 수행하였다.

조직학적 성질 (p- STAT5 , 아세틸- 히스톤 H3 , 레티쿨린 )

흉골 및 비장을 수집하고, 포르말린에 고정시키고, 트리밍하고, 파라핀에 포매시키고, 마이크로톰을 이용하여 (명목상) 4 ㎛로 절편화시켰다.

도은법용 키트 (바이오-옵티카(Bio-Optica), 카탈로그 04-04080)를 사용하여 흉골 상에서 레티쿨린 섬유에 대하여 골수 섬유증을 평가하였다.

비장 및 골수에서 화합물 A의 p-STAT5 PD 마커 및 화합물 B의 아세틸화된 히스톤 H3 PD 마커를 평가하였다. 간략하면, 비장 전체를 제거하여 중량을 측정하고, 해부용 트레이에 놓았다. 비장을 가로로 이등분하고, 외과용 메스를 이용하여 중간 부분으로부터 같은 조각 2개를 채취하였다. 비장 조각의 두께가 3-4 mm를 초과하지 않도록 하였다. 비장 조각을 표지화된 히스토카세트로 옮겨 놓고, 실온에서 중성 완충처리된 포르말린 (NBF) 10% (v/v) (pH 6.8-7.2) (J.T. 베이커(J.T. Baker: 스위스 메다이트)) 중에 침지 고정시켰다. 고정액의 부피는 조직 부피와 비교하여 10배 이상으로 과량이었었다. 흉골 전체를 제거하고, 실온에서 10% NBF 중에서 48시간 동안 고정시킨 후, PBS 중에서 세척하고, 37℃에서 3 x 24 h 동안 EDTA-시트르산 완충제 (pH 7.5) (바이오시크 게엠베하(Biocyc GmbH: 독일 루켄발데))에서 석회질을 제거하였다. PBS 중에서의 마지막 세척 후, 조직을 잘게 자르고, 관심의 대상이 되는 표면과 함께 범용 히스토카세트에 하향으로 놓이게 한 후, 파라핀 처리를 위해 TPC 15Duo (티슈 프로세싱 센터(Tissue Processing Center))에서 프로세싱하였다. 슬라이딩식 또는 회전식 마이크로톰 (미크롬 인터네셔날 아게(Mikrom International AG: 스위스))을 이용하여 각 조직의 파라핀 블록으로부터 두께 3 ㎛짜리 절편 여러 개를 절단하고, 45℃ 수조 중에 스프레드시키고, 현미경 슬라이드 (폴리신(Polysine) (VWR 인터네셔날(VWR International: 벨기에 루뱅))) 상에 탑재하고, 37℃ 오븐에서 밤새도록 대기 건조시켰다. 건조된 조직 절편 슬라이드를 오븐에서 꺼내어 전자동 H&E (헤마톡실린 & 에오신) 염색을 위해 선형 염색기 COT20 (스위스 메다이트)의 슬라이드 랙에 놓거나, 면역조직화학법 (IHC) 염색을 위해 프로세싱하였다. IHC를 위해, 조직 절편 샘플을 토끼 항-포스포 STAT5 항체 (클론 C11C5)로 염색하고, 토끼 항-아세틸 히스톤 H3 항체 (밀리포어(Millipore: 미국 매사추세츠주))로 커버 슬립핑하고, 대기 건조시켰다.

조직학적 평가를 위해, BM 세포충실성을 세포과다성 (3+), 정상세포성 (2+), 및 저세포성 (1+)으로 평가하였다. 비장 구조는 파괴 (1+) 또는 보존 (0)으로 평가하였다. 골수성, 적혈구 및 지방세포인 세포의 존재는 세포충실성을 기초하여 하여 0, 1+, 2+, 3+으로 평가하였다. p-STAT5 평가를 위해, 최종 확대 배율 200x으로 자이스 미락스(Zeiss Mirax) 슬리이드 스캐너 (스캔 소프트웨어 버전 1.12, 자이스 아게(Zeiss AG: 독일))를 이용하여 유리 슬리이드로부터 디지털 슬라이드 영상 데이터를 생성하였다. 디피니언즈 e카그니션(Definiens eCognition) 소프트웨어 (e카그니션 버전 XD 1.5, 디피니언즈 아게(Definiens AG: 독일))를 이용하여 p-STAT5-양성 및 -음성 세포 핵에 관한 전슬라이드 자동 정량 평가를 수행하였다. 결과는 전체 핵 중 양성 p-STAT5 핵의 비율(%)로서 표시하였다. 아세틸화된 히스톤 H3의 염색은 염색 강도 및 양성 세포 개수에 기초하여 1+, 2+, 3+으로 점수화하였다.

아세틸화된 리신에 대한 웨스턴 블롯 분석

폴리트론(Polytron) 균질기 (IKA 래보테크니크(IKA LaborTechnik), 울트라-투라 T25(Ultra-Turra T25), 1분 동안 전속력 가동)를 이용하여 냉동된 비장 샘플을 용해 완충제 (0.1% SDS, 2 mM 바나듐산나트륨, 10 mM 피로인산나트륨 및 한 항-플테아제 칵테일 정제 (로슈(Roche) 카탈로그 번호 11836145001)로 보충된 RIPA 완충제: 50 mM 트리스-HCl (pH 7.2), 120 mM NaCl, 1 mM EDTA, 6 mM EGTA (pH 8.5), 1% NP-40, 20 mM NaF) 중에서 균질화시키고, 균질화시키는 동안 샘플을 얼음상에서 유지시켰다. 이어서, 균질액을 10,000 rpm (15분, 4℃)으로 원심분리하고, 유리-섬유 필터를 통해 여과하고, -80℃에서 냉동시켰다. BCA 단백질 검정용 키트 (노바겐(Novagen), 카탈로그 번호 71285-3)를 이용하여 균질액 중 단백질 총 함량을 측정하였다.

각 샘플로부터 얻은 100 ㎍의 전체 단백질을 4-12% 누페이지(Nupage) 겔 (인비트로겐, 카탈로그 번호 WG1402BX10)에 의해 분해하고, 반-건식 블롯팅 (바이오래드(BIORAD), 반-건식 전달 시스템, 카탈로그 번호 170-3940)에 의해 PVDF 막 (밀리포어 임모빌론(Millipore Immobilon)™, 카탈로그 번호 IPVH20200, 미국 매사추세츠주 빌러리카)으로 옮겨 놓았다. 막을 실온에서 1시간 동안 차단 용액 (PBS 중 5% BSA, 0.1% 트윈-20) 중에서 차단한 후, 0.1% 트윈-20을 함유하는 PBS 중에서 30분 동안 세척하고, 매 10분 마다 교체하였다. 이어서, 0.1% 트윈-20 및 5% 밀크를 함유하는 PBS 중에 1:1,000으로 희석된 1차 항-아세틸화된 리신 항체 (토끼 폴리클로날 항-아세틸화된 리신 항체, 셀 시그날링(Cell Signaling), 카탈로그 번호 9441)와 함께 막을 4℃에서 밤새도록 인큐베이션시켰다. 다음날, 막을 0.5% 트윈-20을 함유하는 PBS 중에서 30분 동안 세척하고, 매 10분 마다 교체한 후, 이어서 0.1% 트윈-20 및 1% BSA를 함유하는 PBS 중 1:2,000으로 희석된 항-토끼 HRP 접합된 2차 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 막을 상기와 같이 다시 세척하고, ECL+ (아머샴 바이오사이언시즈(Amersham Biosciences), 카탈로그 번호 RPN 2132)로 발색시켜 비장 추출물 중 아세틸화된-리신을 검출하였다.

β- 튜불린 또는 GAPDH 를 이용한 전체 단백질 검출

전체 β-튜불린 수준을 검출하기 위해, 60℃에서 30분 동안 0.1% 트윈-20 및 2% SDS를 함유하는 PBS 중에서 막을 스트리핑하고, 0.1% 트윈-20을 함유하는 PBS 중에서 4 내지 5회에 걸쳐 세척하고, 0.1% 트윈-20 및 3% BSA를 함유하는 PBS 중에서 1:5,000으로 희석된 1차 항-β-튜불린 항체 (마우스 모노클로날 항-β-튜불린 항체, 시그마, 카탈로그 번호 T-4026) 중에서 4℃에서 밤새도록 인큐베이션시켰다. 다음날, 막을 0.5% 트윈-20을 함유하는 PBS 중에서 30분 동안 세척하고, 매 10분마다 교체한 후, 이어서 0.1% 트윈-20 및 1% BSA를 함유하는 PBS 중 1:5,000으로 희석된 항-마우스 HRP 접합된 2차 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 막을 상기와 같이 다시 세척하고, ECL로 발색시켜 β-튜불린 단백질을 검출하였다.

GAPDH 수준을 하기와 같이 검출하였다: 샘플을 재로딩시키고 (40 ㎍의 전체 단백질), 막을 0.1% 트윈-20 및 3% BSA를 함유하는 PBS 중 1:5,000으로 희석된 1차 항-GAPDH 항체 (토끼 항-GAPDH 항체, 셀 시그날링, 카탈로그 번호 2118)에서 4℃에서 밤새도록 인큐베이션시켰다. 다음날, 막을 0.5% 트윈-20을 함유하는 PBS 중에서 30분 동안 세척하고, 매 10분마다 교체한 후, 이어서 0.1% 트윈-20 및 1% BSA를 함유하는 PBS 중 1:1,000으로 희석된 항-토끼 HRP 접합된 2차 항체 (GE 헬쓰케어(GE Healthcare), 카탈로그 번호 NA931)와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 막을 상기와 같이 다시 세척하고, ECL로 발색시켜 비장 추출물 중 GAPDH 단백질을 검출하였다.

화합물 A 및 화합물 B의 정량화를 위한 바이오분석 ( LC / MS - MS )

UPLC/MS-MS 검정법에 의해 혈장 및 조직 중 화합물 A 및 화합물 B의 농도를 동시에 측정하였다. 패스트 프렙(Fast Prep)^?-24 시스템 (M.P. 바이오메디칼즈(M.P. Biomedicals: 미국 캘리포니아주 어바인))을 사용하여 조직을 동량의 HPLC-워터(HPLC-Water) (워터 포 크로마토그래피(Water for chromatography) (머크(Merck))) 중에서 균질화하였다. 25 ㎕의 내부 표준 혼합물 (1 ㎍/ml)을 분석 분취량 (25 ㎕)의 혈액 또는 조직 균질액에 첨가한 후, 200 ㎕ 아세토니트릴을 첨가하여 단백질을 침전시켰다. 상청액을 새 바이알로 옮겼다. 증발 건조시킨 후, 샘플을 60 ㎕ 아세토니트릴/물 (1/1 v/v) 중에 다시 용해시켰다. 이 용액의 분취량 (5 ㎕)을, 물 중 0.1% 포름산 (용매 A) 및 아세토니트릴 중 0.1% 포름산 (용매 B)의 혼합물로 이루어진 이동상을 이용하여 액퀴티(ACQUITY) UPLC BEH C18 칼럼 (워터스(Waters)™ 1.7 ㎛ 입자 크기, 2.1 x 50 mm) 상에서 분리하였다. 600 ㎕/분의 유량으로 구배 프로그래밍을 사용하였다. 95% 용매 A를 사용하여 평형화시킨 후, 5 ㎕ 샘플을 주입하였다. 0.25분 동안의 잠재기 후, 0.65분 동안에 걸친 5 - 100% 용매 B의 선형 구배로 샘플을 용리시킨 후, 0.35분 동안 유지시켰다. 0.25분 동안에 걸쳐 출발 조건으로 재평형화시켜 다음 샘플을 위한 칼럼을 제조하였다. 매스린스(Masslynx)™ 4.1 소프트웨어로 제어되는 삼중 사중극자 질량분석기 TQD™ (워터스 코포레이션(Waters Corporation: 미국 매사추세츠주 밀포드))의 이온 공급원으로 칼럼 용리제를 직접 도입시켰다. 피분석물의 MS/MS 검출을 위해 전기분무 양성 이온화 (ESI+) 다중 반응 모니터링을 사용하였다. 화합물 A의 경우, 전구체에서 생성물로의 이온 전이 307.0→m/z 186.0을 사용하였다. 동시에, 화합물 B의 경우, 전구체에서 생성물로의 이온 전이는 350.1→m/z 142.9인 것으로 보고되었다. 상기 두 화합물 모두에 대한 정량 한계 (LOQ)는 혈장 및 조직에 대하여 각각 9 ng/ml 및 9 ng/g으로 설정하였다 (CV 및 전체 편차는 30% 미만이었다). 콴린스(QuanLynx)™ 4.1 (마이크로매스(Micromass)) 및 엑셀(Excel)™ 2007 (마이크로소프트(Microsoft))를 이용하여 회귀 분석 및 추가 계산을 수행하였다. 비히클로 처리된 동물로부터 수득된 블랭크 혈액 또는 조직 중에 스파이킹된 보정 샘플을 사용하여 작성된 보정 곡선으로부터 피분석물/IS의 피크 면적비에 기초하여 비공지 샘플의 농도를 역으로 계산하였다.

유지 조건

Balb/cByJIco 마우스 (C. 리버(C. River: 프랑스))를 오토클레이빙된 우리에 수용하였다 (한 우리당 최대 5마리의 동물). 명기/암기 사이클은 하기와 같았다: 12시간 암기, 12시간 명기 (6:30 AM부터 6:30 PM까지 명기). 방사선 조사 후 동물이 회복하는 데 도움을 주고, 이식 후 처음 2주 동안에 걸쳐 감염되지 않게 하기 위해 250 ml 식수 중 5 ml의 항생제 (최종 농도 4 mg 술파메톡사졸림, 0.8 mg 트리메토프림의 박트림(BACTRIM) (로슈 파마 아게(Roche Pharma AG: 스위스 레이나흐))와 함께, 습윤화된 감마 조사된 먹이 및 오토클레이빙된 물을 임의로 동물에게 공급하였다.

시험 화합물 및 제제

화합물 B를 락테이트 염으로서 정맥내 또는 복강내 주사에 의해 투여하였다. 화합물 B의 락트산 염을 등장성 D5W (5% 덱스트로스; B. 브라운, 로트 395147) 중에서 각각 1.5 mg/ml, 1 mg/ml 및 0.5 mg/ml의 농도로 제제화하였다. 용액은 실온에서 최대 10일까지 안정적이었다. 10 ml/kg의 부피로 주 3회에 걸쳐 처리하였다. 최종의 유리 염기 등가 용량은 각각 11.90, 7.94 및 3.97 mg/kg이었다. 도면에는 상기 용량이 전체 값으로 기록되어 있다.

화합물 A의 모노포스페이트 염을 0.5% HPMC (파마코트 603, 다우 케미칼(Dow Chemical: 미국 플라크라인)) 중에서 7.9 mg/ml 농도로 제제화하였다. 용액은 실온에서 4일 동안 안정적이었다. 10 ml/kg 부피로 bid로 처리하였다. 최종의 유리 염기 등가 용량은 60 mg/kg이었다.

두 화합물을 동시에 제공하였다.

통계

도 및 표에 제시된 결과는 평균 ± SEM을 나타낸다. 체중 변화율(%), 및 비장 중량, 망상적혈구, WBC 계수, Hct 및 조직학적 데이터에 대한 절대값 또는 변환값 (로그 10, 또는 명시된 다른 것)을 단일 처리군와 비히클 군과의 비교를 위해 단측 t 검정 또는 순위-합 검정에 의해서, 또는 처리군들과 비히클을 비교하기 위해 일원 ANOVA 후 던넷 시험에 의해 분석하였다. 다중 비교는 터키 시험을 사용하여 수행하였다. 모든 비교는 희생 당일 수행하였다. 유의 수준은 p < 0.05로 설정하였다. 윈도우용 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism for Windows) (그래프패드 소프트웨어 인코퍼레이티드(GraphPad Software Inc.))을 이용하여 계산하였다.

실시예 B의 결과 :

조합된 화합물 A 및 화합물 B의 생체내 효능 및 허용성

화합물 B의 효능이 화합물 A와의 조합으로 개선될 수 있다는 가설을 시험하기 위해, JAK2V617F 형질도입된 골수 세포를 이식받은 Balb/c 마우스를 JAK1/2 억제제 화합물 A와 조합하여 화합물 A로 처리하였다. JAK 억제제 화합물 A와 조합되는 상이한 용량의 화합물 B가 미치는 영향을 평가하기 위해, 화합물 A에 대해서는 중간 정도의 효능을 제공하는 용량을 선택하였다.

Hct 값 (본 실험에서 평균 67%, N=9마리/군)에 기초하여 BMT 후 27일째 마우스를 무작위화하고, 단일 작용제로서 또는 조합하여 화합물 B (8 mg/kg, 3x/주 MWF, i.p.) 및 화합물 A (60 mg/kg, q12h, p.o.)로 처리하였다. 화합물 B 단독으로 처리한 경우, 약간의 체중 손실을 보였다 (평균 -5%). 이러한 체중 손실은 화합물 B를 화합물 A와 조합하였을 때 유의적으로 더 높았다 (평균 -10%, 도 7 및 표 4). 화합물 B를 단독으로 제공하였을 때, 비장 중량이 감소하기는 하였지만, 정상 수준까지 감소하지는 못했다. 화합물 A는 비장 중량을 감소시키는 경향을 보였지만, 매우 가변적이었다 (67 내지 1,153 mg 범위). 조합물은 비장 중량/부피에 있어서 그 효능을 개선시켰는데, 상기 비장 중량/부피는 처리 3주 후 (9마리의 동물 중 6마리에서) 정규화되거나, 심지어는 정상적인 히스토릭 범위 아래였다 (도 8 및 표 4). 조합물은 망상적혈구 계수에 대해서는 더욱 강력한 효과를 나타내는 경향이 있었는데 (일부 동물에서는 < 0.1 x 10¹²개/L로 매우 낮은 값이 관찰됨), 이러한 효과는 단일 작용제로 처리된 군과 유의적인 차이는 없었다. WBC 계수는 화합물 B를 단독으로 제공하였을 때, 화합물 A와 조합하여 제공하였을 때에도 감소하였다 (본 실험에서는 백혈구 증가증이 없었음에도 불구하고, 비히클 군에서 동물 1마리, 및 화합물 A 군에서 동물 1마리는 예외적이었다). PLT 계수는 화합물 B의 단독 처리 및 화합물 A와의 조합에 의해 영향을 받았다 (도 11). 대립유전자 부하 대용 판독치 (GFP-양성 순환 세포)가 감소하는 경향은 화합물 B 및 조합물 군에 대한 상기 연구에서 관찰되었다 (표 4).

골수 세포과다성 감소는 처리되는 모든 약물 처리군에서 관찰되었다 (콤보 > 화합물 A = 화합물 B). 처리를 통해 비장 구조는 개선되었으며, 가장 강력한 효과는 조합물 군에서 관찰되었다 (콤보> 화합물 A > 화합물 B). 매우 가변적임에도 불구하고, 흉골 절편 상의 레티쿨린 염색으로 평가된 바, 화합물 A 및 조합물 군은 섬유증 점수를 감소시키는 경향을 보였다.

IHC에 의한 PD 마커 평가를 통해서는 화합물 A가 단일 작용제로서, 및 화합물 B와 조합되었을 때, 그 처리를 통해 p-STAT5 마커는 뚜렷이 감소한 것으로 나타났다. 화합물 B 단독으로, 또는 조합하여 처리하였을 때, 데아세틸라제 억제에 대한 대용 판독치로서 아세틸화된 히스톤 H3은 뚜렷이 증가한 것으로 관찰되었다.

도 13-19는 상이한 염색 방법하의 골수 및/또는 비장 영상을 나타낸 것이다.

조합 요법이 조직에서의 화합물 노출에 대해서는 어떤 영향도 미치지 않았다 (표 5).

본 실시예는 화합물 A 및 B의 조합물이 비장 중량/부피에 있어서 효능을 개선시켰다는 것을 입증한다.

JAK2^V617F 골수 형질도입된 세포를 이식받은 Balb/c 암컷 마우스는 연속하여 21일 동안 비히클, M/W/F 스케줄로 8 mg/kg i.p. 용량 (유리 염기 등가량)의 화합물 B, q12h로 60 mg/kg 용량 (유리 염기 등가량)의 화합물 A, 또는 상기 두 작용제의 조합물을 받았다.

희생 시점의 체중 및 비장 중량의 변화는 평균 ± SEM으로 제시되어 있다. N = 7-9마리/군. 희생 당일, *p < 0.05 대 비히클, # p < 0.05 대 화합물 A, † p < 0.05 대 화합물 B (일원 ANOVA에 이어서 던넷 시험 또는 터키 시험 실시. 통계학적 분석을 위해 비장 중량 값의 역수 형태 및 WBC 및 PLT 계수에 대한 로그₁₀ 변환 값을 사용하였다). WBC 계수에 대하여 비히클 군에서 1개의 이상치 (388.3 x 10⁹개/L) 및 화합물 A군에서 1개의 이상치 (139.9 x 10⁹개/L)가 검출되었고, 이상치를 제외한 새 평균 ± SEM은 괄호 안에 제시되어 있다.

각 투여군의 동물을 화합물 B 및/또는 화합물 A 최종 투여 후 2시간 경과시에 희생시키고, 혈액, 비장, 골수 및 간을 PK 분석을 위해 샘플링하였다. 본 표에 기록된 용량은 유리 염기 등가량이다. 본 표에는 혈액 [μmol/l] 및 조직 [nmol/g] 중 화합물 B 및 화합물 A의 평균 수준 ± SEM이 제시되어 있다. N=9마리/군.

실시예 C

임상 시험

원발성 골수섬유증 (PMF), 진성 다혈구혈증 후의 골수섬유증 (PP-MF) 또는 본태성 혈소판혈증 후의 골수섬유증 (PET-MF) 환자에서 파노비노스타트 및 룩소리티닙의 경구용 조합물의 안전성 및 약동학적 성질을 평가하는 1b상, 개방-표지, 다중 센터, 단일 아암 용량 조사 연구는 진행 중에 있다.

도 20은 연구 디자인 및 방법을 도시한 것이다.

상기 시험은 하기 중 하나 이상의 것을 확립하는 것으로 목표로 하였다:

(1) MF 환자에서 룩소리티닙 및 파노비노스타트의 조합물의 MTD 및/또는 RPIID를 확립하는 것;

(2) MF 환자에서 룩소리티닙 및 파노비노스타트의 경구 공통 투여의 안정성을 평가하는 것;

(3) MF 환자에서 다양한 용량의 룩소리티닙의 단일 작용제로서의 약동학적 성질 및 파노비노스타트와 조합하여 제공되었을 때의 약동학적 성질의 특징을 규명하는 것; 및/또는

(4) MF 환자에서 룩소리티닙과 조합된, 다양한 용량의 파노비노스타트의 약동학적 성질의 특징을 규명하는 것.

포함 조건:

A. 환자는 그의 JAK2 V617F 돌연변이 상태와는 상관없이, 문서상으로 입증된 PMF, PPV-MF, 또는 PET-MF 진단을 받은 환자였다;

B. PMF에 대한 세계 보건 기구 (WHO) 기준에 의해 안내된 바에 따라, 본 연구는 국제 예후 점수 평가법(IPSS: International Prognostic Scoring System) 기준으로 중간-1, -2, 또는 고위험군으로 지정되고, 늑골연 아래 촉지 비장 비대가 ≥ 5 cm인 환자를 포함하였다;

C. 환자는 하기 위험 인자 중 하나 이상을 가져야 했다:

a. 체질 증상의 존재 (체중 손실이 1사이클, 1일 [C1D1] 이전의 한해 동안의 기준선 값의 > 10%, 설명되지 않는 발열이 1개월 넘게 지속된 경우, 또는 과도하게 식은 땀을 흘리는 것이 1개월 넘게 지속된 경우),

b. 뚜렷한 빈혈증 (스크리닝 방문시 입증된 헤모글로빈 < 10 g/dL0),

c. 백혈구 증가증 (백혈구 계수의 히스토리 > 25 x 10⁹개/L),

d. 순환 모세포 ≥ 1%;

D. 용량 점증은 과용량의 대조군과 함께 베이지언(Bayesian) 로지스틱 회귀 모델에 의해 안내되었고, 이는 제1 사이클에서 용량 제한 독성 (DLT) 뿐만 아니라, 다른 안전성 관찰 결과에 따라 달라졌다;

E. 각 투여 코호트는 3명 이상 (≥3)의 평가가능한 환자로 구성되었다;

F. RP2D 및/또는 MTD 측정을 위해서는 임의의 주어진 용량 수준에서 9명 이상 (≥9)의 환자에 대한 데이터가 필요하였다;

G. 1일째 단일 용량의 룩소리티닙을 단독으로 투여하고, 2일째 및 6일째 파노비노스타트와 조합하여 투여한 후 수집된 일련의 혈액 샘플을 액체 크로마토그래피-이중 질량 분석법에 의해 혈장 농도에 대하여 평가하였다;

H. 약동학 파라미터는 비구획적 분석을 사용하여 도출하였다.

결과:

본 연구에서는 7개의 코호트가 제안되었다. 본 연구는 여전히 진행 중에 있고, 현재까지는 코호트 1-3으로부터의 데이터만이 이용가능하다.

하기 표 6은 코호트 1-3에 대한 환자수 및 질환 서브타입이 제시되어 있다.

도 21은 코호트 1에서 시간 경과에 따른 촉지 비장 길이를 도시한 것이다.

하기 표 7에는 코호트 1에서의 최상의 촉지 비장 길이 반응 및 증상 반응이 제시되어 있다.

도 22는 코호트 2에서 시간 경과에 따른 촉지 비장 길이를 도시한 것이다.

하기 표 8에는 코호트 2에서의 최상의 촉지 비장 길이 반응 및 증상 반응이 제시되어 있다.

도 23은 코호트 3에서 시간 경과에 따른 촉지 비장 길이를 도시한 것이다.

하기 표 9에는 코호트 3에서의 최상의 촉지 비장 길이 반응 및 증상 반응이 제시되어 있다.

하기 표 10에는 코호트 1-3 내에서 본 연구 처리와 관련하여 의심되는 3/4 등급의 유해 사례가 기록되어 있다. 코호트 1 또는 코호트 3에서는 어떤 DLT 또는 SAE도 관찰되지 않았다. 코호트 2에서는 1 DLT의 4등급 저혈소판증이 보고되었다. 또한, 1 SAE의 3등급 오심 및 3등급 설사도 있었다. 현재까지는 임상적으로 유의적인 EKG 이상은 관찰되지 않았다.

현재까지의 임상 연구를 통해 룩소리티닙 및 파노비노스타트의 조합물은 유망한 활성을 가지고 있고, 우수한 허용성을 보이는 것으로 나타났다. 지금까지 연구된 룩소리티닙 및 파노비노스타트 용량에서는 3/4 등급의 빈혈증 및 저혈소판증이 낮은 비율로 관찰되었다. 종래 데이터에서는 룩소리티닙과 파노비노스타트와의 잠재적인 약물 상호작용이 제안된 바 없다. 추가의 코호트를 통해 MF 환자 치료에서 상기의 유망한 조합물에 최적의 투여 전략법을 확립할 것이다.

약어 목록

Claims

하기 화학식 A의 화합물 A ((R)-3-(4-(7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-1H-피라졸-1-일)-3-시클로펜틸프로판니트릴) 또는 그의 제약상 허용되는 염; 및
하기 화학식 B의 화합물 B (N-히드록시-3-[4-[[[2-(2-메틸-1H-인돌-3-일)-에틸]-아미노]메틸]페닐]-2E-2-프로판아미드) 또는 그의 제약상 허용되는 염
을 포함하는 조성물.
<화학식 A>

<화학식 B>
제1항에 있어서, 제약상 허용되는 담체(들)를 추가로 포함하는 조성물.
제1항에 있어서, 단일 제제 또는 단위 투여 형태의 조성물.
암 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 암 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법.
제4항에 있어서, 암이 골수성증식 신생물인 방법.
제5항에 있어서, 골수성증식 신생물이 만성 골수성 백혈병 (CML), 진성 다혈구혈증 (PV), 본태성 혈소판혈증 (ET), 원발성 또는 특발성 골수섬유증 (PMF), 만성 호중구성 백혈병, 만성 호산구성 백혈병, 만성 골수단핵구성 백혈병, 소아 골수단핵구성 백혈병, 과다호산구 증후군, 전신 비만세포증, 및 비정형 만성 골수 백혈병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 치료가 화합물 A 및 화합물 B를 공동 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.
제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물 A 및 화합물 B가 단일 제제 또는 단위 투여 형태로 존재하는 것인 방법.
제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 치료가 화합물 A 및 화합물 B를 실질적으로 동시에 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.
제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 치료가 화합물 A 및 화합물 B를 다른 시점에 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.
제11항에 있어서, 대상체에게 화합물 B를 투여한 후 화합물 A를 투여하는 것인 방법.
제11항에 있어서, 대상체에게 화합물 A를 투여한 후 화합물 B를 투여하는 것인 방법.
제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물 A 및 화합물 B가 별개의 제제 또는 단위 투여 형태로 존재하는 것인 방법.
제7항에 있어서, 룩소리티닙(Ruxolitinib)을 3-7 mg BID로 제공하고, 파노비노스타트(Panobinostat)를 8-12 mg TIW QOW로 투여하는 것인 방법.
제7항에 있어서, 룩소리티닙을 8-12 mg BID로 제공하고, 파노비노스타트를 8-12 mg TIW QOW로 투여하는 것인 방법.
제7항에 있어서, 룩소리티닙을 10-20 mg BID로 제공하고, 파노비노스타트를 8-12 mg TIW QOW로 투여하는 것인 방법.
제7항에 있어서, 룩소리티닙을 10-20 mg BID로 제공하고, 파노비노스타트를 10-20 mg TIW QOW로 투여하는 것인 방법.
제7항에 있어서, 룩소리티닙을 10-20 mg BID로 제공하고, 파노비노스타트를 10-30 mg TIW QOW로 투여하는 것인 방법.
제7항에 있어서, 룩소리티닙을 10-20 mg BID로 제공하고, 파노비노스타트를 10-30 mg TIW QOW로 투여하는 것인 방법.
제7항에 있어서, 룩소리티닙을 10-20 mg BID로 제공하고, 파노비노스타트를 20-40 mg TIW QOW로 투여하는 것인 방법.