EA027654B1 - Комбинация панобиностата и руксолитиниба при лечении рака, такого как миелопролиферативное новообразование - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к применению комбинации, содержащей соединение А ((R)-3-(4-(7Н-пирроло[2,3-d]пиримидин-4-ил)-1Н-пиразол-1-ил)-3-циклопентилпропаннитрил) формулы (А) (руксолитиниб)или его фармацевтически приемлемую соль; и соединение В (N-гидрокси-3-[4-[[[2-(2-метил-1Н-индол-3-ил)этил]амино]метил]фенил]-2Е-2-пропенамид) формулы (В) (панобиностат):или его фармацевтически приемлемую соль, для лечение миелопролиферативного заболевания. Комбинация предназначена для одновременного, параллельного, раздельного или последовательного применения.

Description

Изобретение относится к применению комбинации, которая включает в себя:

(а) соединение А (название (К_)-3-(4-(7Н-пирроло[2,3-й]пиримидин-4-ил)-1Н-пиразол-1-ил)-3циклопентилпропаннитрил) формулы (А)

или его фармацевтически приемлемую соль; и (Ь) соединение В (название №гидрокси-3-[4-[[[2-(2-метил-1Н-индол-3ил)этил]амино]метил]фенил]-2Е-2-пропенамид) формулы (В)

или его фармацевтически приемлемую соль;

для одновременного, совместного, раздельного или последовательного применения, особенно для применения при лечении пролиферативных заболеваний. Изобретение также относится к фармацевтическим композициям, включающим такую комбинацию, и способу лечения пролиферативных заболеваний у млекопитающего, в частности человека, при помощи такой комбинации. Кроме того, настоящее изобретение также относится к коммерческой упаковке или продукту, включающему такую комбинацию.

Предпосылки изобретения

Миелопролиферативные новообразования (ΜΡΝ) представляют собой группу заболеваний, которые вызывают сверхпродукцию клеток крови (тромбоцитов, лейкоцитов и эритроцитов) в костном мозге. ΜΡΝ включают истинную полицитемию (РУ), первичную или эссенциальную тромбоцитемию (ЕТ), первичный или идиопатический миелофиброз, хронический миелогенный (миелоидный) лейкоз (СМБ), хронический нейтрофильный лейкоз (СЫЪ), ювенильный миеломоноцитарный лейкоз ОМЬ) и хроническую эозинофильную лейкемию (СЕБ)/гиперэозинофильный синдром (НЕ8). Эти расстройства группируют вместе, поскольку обладают некоторыми или всеми из следующих свойств: поражение мультипотентных гемопоэтических прогениторных клеток, доминирование трансформированного клона над нетрансформированными гемопоэтическими прогениторными клетками, сверхпродукция одной или более гемопоэтических линий в отсутствие определенного стимула, независимое от фактора роста формирование колоний ίη νίίτο, повышенное содержание паренхиматозных клеток костного мозга, мегакариоцитарная гиперплазия и дисплазия, нарушения, преимущественно затрагивающие хромосомы 1, 8, 9, 13, 20, тромботические и геморрагические диатезы, избыточное экстрамедуллярное кроветворение, и спонтанная трансформация в острый лейкоз или развитие фиброза костного мозга, но с невысокой скоростью, по сравнению с этим показателем при СМБ. Заболеваемость ΜΡΝ колеблется в широких пределах, начиная приблизительно от 3 на 100000 человек населения старше 60 лет ежегодно для САП, до 0,13 на 100000 детей в возрасте от рождения до 14 лет ежегодно для 1МБ (УагЙ1шап е1 а1., Βίοοά 100 (7): 2292-302, 2002).

Соответственно, необходимы новые способы лечения МР^ а также других видов рака.

Краткое содержание изобретения

Предоставлено применение комбинации, содержащей соединение А формулы (А) (руксолитиниб) или его фармацевтически приемлемую соль; и соединение В формулы (В) (панобиностат) или его фармацевтически приемлемую соль, для лечения миелопролиферативного новообразования. Комбинация дополнительно может содержать фармацевтически приемлемый носитель(ли).

Заявленную комбинацию можно применять в едином составе или в единой лекарственной форме.

Согласно одному из вариантов изобретение относится к применению эффективного количества комбинации, содержащей соединение А (руксолитиниб) или его фармацевтически приемлемую соль и соединение В (панобиностат) или его фармацевтически приемлемую соль для изготовления лекарствен- 1 027654 ного средства для лечения миелопролиферативного заболевания.

Неограничивающие примеры миелопролиферативных новообразований, которые можно лечить с помощью комбинированной терапии по изобретению, без ограничения включают хронический миелоидный лейкоз (СМЬ), истинную полицитемию (РУ), эссенциальную тромбоцитемию (ЕТ), первичный или идиопатический миелофиброз (РМР), хронический нейтрофильный лейкоз, хроническую эозинофильную лейкемию, хронический миеломоноцитарный лейкоз, ювенильный миеломоноцитарный лейкоз, гиперэозинофилический синдром, системный мастоцитоз и атипичный хронический миелогенозный лейкоз.

В одном варианте осуществления этих способов лечения субъектом является человек.

В другом варианте осуществления лечение включает в себя совместное введение соединения А и соединения В.

В другом варианте осуществления соединение А и соединение В находятся в одном составе или единичной лекарственной форме.

В еще одном варианте осуществления лечение включает в себя введение соединения А и соединения В практически одновременно или в разное время.

В другом варианте осуществления способа соединение А вводят субъекту, после чего вводят соединение В.

В еще одном варианте осуществления соединение В вводят субъекту, после чего вводят соединение А.

В еще одном варианте соединение А и соединение В находятся в отдельных составах или единичных лекарственных формах.

В одном из вариантов руксолитиниб назначают по 3-7 мг два раза в день (ВШ), панобиностат вводят по 8-12 мг три раза в неделю один раз в две недели (ΤΙΑ РОА).

В еще одном варианте руксолитиниб назначают по 8-12 мг ВШ, панобиностат вводят по 8-12 мг ΤΙΑ РОА.

В другом варианте руксолитиниб назначают по 10-20 мг ВШ, панобиностат вводят по 8-12 мг ΤΙΑ РОА.

В другом варианте руксолитиниб назначают по 10-20 мг ВШ, панобиностат вводят по 10-20 мг ΤΙΑ РОА.

В одном из вариантов руксолитиниб назначают по 10-20 мг ВШ, панобиностат вводят по 10-30 мг ΤΙΑ РОА.

В другом варианте руксолитиниб назначают по 10-20 мг ВШ, панобиностат вводят по 10-30 мг ВА РОА.

В еще одном варианте руксолитиниб назначают по 10-20 мг ВШ, панобиностат вводят по 20-40 мг 1ТА РОА.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 показывает массу тела после периода лечения соединением А и/или соединением В.

Фиг. 2 и 3 показывают эффект лечения на уровни ВюЬ через 7 дней терапии, т.е. на 11-ый день после инъекции клеток (лечение начато на день 4 после инъекции клеток).

Фиг. 4 показывает массу селезенки после 8 дней лечения.

На фиг. 5 и 6 показан результат ΡΌ-маркерного анализа (экстрактов селезенки) через 2 ч после терапии.

Фиг. 7 и 8 показаны самки мышей Ва1Ь/с, трансплантированных 1АК2У617Р-трансдуцированными клетками костного мозга, получавшие носитель, соединение В в дозе 8 мг/кг ί.ρ. (эквивалент свободного основания) по схеме М/А/Р, соединение А в дозе 60 мг/кг (эквивалент свободного основания) ς121ι или комбинацию обоих агентов в течение 21 дня подряд. Изменения массы тела и массы селезенки при забивании представлены как среднее ± стандартная погрешность среднего. Ы=9/группу. Среднее значение нормальной массы селезенки самок Ва1Ь/с находится в диапазоне 100 мг). *р<0,05 на день забивания (односторонний дисперсионный анализ с последующим тестом Виллей или тестом Тьюки. Значения массы селезенки в реципрокной форме были использованы для статистического анализа.

Фиг. 9-12 показывают Ва1Ь/с самок мышей, трансплантированных 1АК2У617Ртрансдуцированными клетками костного мозга, получавшие носитель, соединение В в дозе 8 мг/кг ί.ρ. (эквивалент свободного основания) по схеме М/А/Р, соединение А в Ыб-дозе 60 мг/кг (эквивалент свободного основания) или комбинацию обоих агентов в течение 21 дня подряд. В день забивания кровь собирали и анализировали с использованием анализатора крови Зуктех. Ы=7-9/группу (некоторые образцы в группе комбинации соединения А/соединения В не поддавались анализу. 1 выброс был зафиксирован в группе с носителем (ГО 3) и 1 выброс в группе с соединением А (ГО 27) в день забивания на основании анализа в посторонней программе Сгарй Раб Ршск са1ск (анализ данных был осуществлен со всеми значениями). Фиг. 9: Нср фиг. 10: количество ретикулоцитов; фиг. 11: количество тромбоцитов; фиг. 12: количество лейкоцитов в крови. *р<0,05 в день забивания (односторонний дисперсионный анализ с последующим тестом Виппей или тестом Тьюки для множественных сравнений на 1о§₁₀ трансформированных значениях для количества лейкоцитов и тромбоцитов).

Фиг. 13-16 демонстрируют репрезентативные изображения окрашивания костного мозга самок мы- 2 027654 шей Ва1Ь/с, которым были пересажены клетки т1АК2У617Р-1КЕЗ-СРР и которых лечили соединением В в дозе 8 мг/кг ΐ.ρ. (эквивалент свободного основания) по схеме М/МР, соединением А в дозе 60 мг/кг (эквивалент свободного основания) с]21И или комбинацией обоих агентов в течение 21 дня подряд.

Фиг. 17-19 демонстрируют репрезентативные изображения окрашивания селезенки самок мышей Ва1Ь/с, которым были пересажены клетки т1АК2У617Р-1КЕЗ-СРР и которых лечили соединением В в дозе 8 мг/кг ΐ.ρ. (эквивалент свободного основания) по схеме М/^/Р, соединением А в дозе 60 мг/кг (эквивалент свободного основания) с]21И или комбинацией обоих агентов в течение 21 дня подряд.

Фиг. 20 иллюстрирует схему исследования и способы.

Фиг. 21 иллюстрирует пальпируемую длину селезенки с течением времени в группе 1.

Фиг. 22 иллюстрирует пальпируемую длину селезенки с течением времени в группе 2.

Фиг. 23 иллюстрирует пальпируемую длину селезенки с течением времени в группе 3.

Подробное описание

Было обнаружено, что введение комбинации (а) соединения А ((К)-3-(4-(7Н-пирроло[2,3-б]пиримидин-4-ил)-1Н-пиразол-1-ил)-3циклопентилпропаннитрил) формулы (А)

или его фармацевтически приемлемой соли; и (Ь) соединения В (К-гидрокси-3-[4-[[[2-(2-метил-1Н-индол-3-ил)этил]амино]метил]фенил]-2Б-2-

обеспечивает удивительные синергетические эффекты при лечении миелопролиферативного новообразования у субъекта. Такой подход - комбинация или одновременное применение двух типов агентов - может оказаться полезным для лечения лиц, страдающих от рака, которые не реагируют на или устойчивы к доступным сейчас способам лечения. Комбинированная терапия, предоставленная в настоящем документе, также полезна для повышения эффективности и/или снижения побочных эффектов доступных в настоящее время способов лечения рака у лиц, которые реагируют на такие терапии.

Конкретные термины, используемые в настоящем документе, описаны ниже. Соединения по настоящему изобретению описываются с помощью стандартной номенклатуры. Если не определено иначе, все технические и научные термины, использованные в настоящем документе, имеют тот же смысл, который подразумевается любым специалистом в области, которой это изобретение принадлежит.

Соединение А и его фармацевтически приемлемая соль(и) описано в литературе, например в патенте США 7598257. Соединение А также известно как руксолитиниб.

Соединение В и его фармацевтически приемлемая соль(и) описано в литературе, например в патентах США 6833384; 7067551 и 6552065. Соединение В также известно как панобиностат.

Если не указано иное, или четко указано в тексте, ссылки на соединения, полезные при проведении комбинированной терапии по изобретению, включают как свободное основание соединений, так и все фармацевтически приемлемые соли этих соединений.

Как используется в настоящем документе, термин фармацевтически приемлемые соли относится к нетоксичной кислоте или солям щелочно-земельных металлов пиримидиновых соединений по изобретению. Эти соли могут быть подготовлены ΐη §йи в ходе конечной изоляции и очистки пиримидиновых соединений, или путем отдельного реагирования основных или кислотных функций с подходящей органической или неорганической кислотой или щелочью соответственно. Представители солей включают, в качестве неограничивающих примеров, следующее: ацетат, адипинат, альгинат, цитрат, аспартат, бензоат, бензолсульфонат, бисульфит, бутират, камфорат, камфорсульфонат, биглюконат, циклопентанпропионат, лаурилсульфат, этансульфонат, глюкогептаноат, глицерофосфат, гемисульфат, гептаноат, гекса- 3 027654 ноат, фумарат, гидрохлорид, гидробромида, гидроиодид, 2-гидроксиэтансульфонат, лактат, малеат, метансульфонат, никотинат, 2-нафталинсульфонат, оксалат, памоат, пектинат, персульфат, 3фенилпропионат, фосфат, пикрат, пивалат, пропионат, сукцинат, сульфат, тартрат, тиоцианат, ртолуолсульфонат и ундеканоат. Кроме того, основные азотсодержащие группы могут быть кватернизованы с такими агентами, как алкилгалогениды, например, метиловый, этиловый, пропиловый, бутиловый хлорид, бромиды, иодиды; диалкилсульфаты, такие как диметил, диэтил, дибутил и диамилсульфаты, длинноцепочечные галогениды, такие как дециловый, лауриловый, миристиловый и стеариловый хлориды, бромиды и йодиды, аралкилгалогениды, такие как бензиловый и фенилэтиловые бромиды и другие. Тем самым получают водо- или маслорастворимые или диспергируемые продукты.

Примеры кислот, которые могут быть использованы для формирования фармацевтически приемлемых солей добавлением кислот, включают такие неорганические кислоты, как соляная кислота, гидроборная кислота, азотная кислота, серная кислота и фосфорная кислота, и такие органические кислоты, как муравьиная кислота, уксусная кислота, трифторуксусная кислота, фумаровая кислота, винная кислота, щавелевая кислота, малеиновая кислота, метансульфоновая кислота, янтарная кислота, яблочная кислота, метансульфоновая кислота, бензолсульфоновая кислота и р-толуолсульфокислота, лимонная кислота и кислотные аминокислоты, такие как аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота.

Соли добавлением оснований могут быть подготовлены ίη δίίπ в ходе окончательной изоляции и очистки пиримидиновых соединений, или отдельно путем реагирования карбоксильных групп с подходящим основанием, таким как гидроксид, карбонат или бикарбонат фармацевтически приемлемого катиона металла или аммиака, или органическим первичным, вторичным и третичным амином. Фармацевтически приемлемые соли включают, в качестве неограничивающих примеров, катионы на основе щелочных и щелочно-земельных металлов, такие как соли натрия, лития, калия, кальция, магния, алюминия и т.п., а также катионы нетоксичного аммония, четвертичного аммония и амина, в том числе, в качестве неограничивающих примеров, аммоний, тетраметиламмоний, тетраэтиламмоний, метиламин, диметиламин, триметиламин, триэтиламин, этиламин и т.п. Другие типичные органические амины, полезные для формирования солей добавлением основания, включают диэтиламин, этилендиамин, этаноламин, диэтаноламин, пиперазин, пиридин, пиколин, триэтаноламин и т.п., и основные аминокислоты, такие как аргинин, лизин и орнитин.

Представленной в настоящем документе является комбинированная терапия, включающая 1АКингибирующее соединение А и НЭАС-ингибирующее соединение В. Введение комбинации включает в себя введение комбинации в едином составе или единичной лекарственной форме, введение отдельных агентов комбинации одновременно, но по отдельности, или введения отдельных агентов комбинации последовательно при помощи любого подходящего способа. Дозировка отдельных агентов комбинации может потребовать более частого введения одного из агентов(та) по сравнению с другим агентом(ами) в комбинации. Поэтому, для обеспечения соответствующего дозирования, упакованные фармацевтические препараты могут содержать одну или несколько лекарственных форм, содержащих комбинацию агентов, и одну или несколько лекарственных форм, которые содержат один агент из комбинаций, но не другой агент(ты) комбинации.

Термин единый состав, используемый в настоящем документе, относится к единому носителю или средству доставки, составленному для доставки эффективных количеств обоих терапевтических агентов пациенту. Единое средство доставки предназначается для доставки эффективного количества каждого из агентов, вместе с фармацевтически приемлемым носителем или наполнителем. В некоторых вариантах осуществления средство доставки представляет собой таблетку, капсулу, пилюлю или пластырь. В других вариантах осуществления средство доставки представляет собой раствор или суспензию.

Термин единичная доза используется в настоящем документе для обозначения одновременного введения пациенту, проходящему лечение, обоих агентов вместе, в одной лекарственной форме. В некоторых вариантах осуществления единичная доза представляет собой единый состав. В определенных вариантах осуществления единичная доза включает одно или более средство доставки, такое, что каждое средство доставки включает в себя эффективное количество, по крайней мере, одного из агентов, наряду с фармацевтически приемлемыми носителями и наполнителями. В некоторых вариантах осуществления единичная доза представляет собой одну или более таблеток, капсул, пилюль или пластырей, вводимых пациенту в одно и то же время.

Термин лечить используется в настоящем документе для обозначения снятия, ослабления или смягчения, по меньшей мере, одного из симптомов болезни у субъекта. В пределах значений настоящего изобретения, термин лечить также означает приостановку, задержку начала (т.е. период, предшествующий клиническому проявлению заболевания или симптома заболевания) и/или снижение риска развития или усугубления симптомов заболевания.

Термин субъект подразумевает включение животных. Примеры субъектов включают млекопитающих, например людей, собак, коров, лошадей, свиней, овец, коз, кошек, мышей, кроликов, крыс и трансгенных животных, отличных от человека. В определенных вариантах осуществления субъект является человеком, например, человеком, страдающим от, подверженным риску страдать от, или потенциально способным страдать от множественной миеломы.

- 4 027654

Термин примерно или приблизительно, как правило, означает в пределах 20%, более предпочтительно, в пределах 10%, и наиболее предпочтительно, в пределах 5% данного значения или диапазона. Кроме того, особенно в биологических системах, термин примерно означает в пределах примерно 1од (т.е. порядка величины), предпочтительно в пределах двух порядков данного значения.

Комбинация агентов, описанных в настоящем документе, демонстрирует синергетический эффект. Термин синергетический эффект, используемый в настоящем документе, относится к действию двух агентов, производящих эффект, например, замедление симптоматического прогрессирования рака или его симптомов, который больше, чем простое сложение эффектов каждого препарата самих по себе. Синергетический эффект можно рассчитать, например, используя подходящие способы, такие как уравнение 8щто1Й-Етах (Ной'отй, N. Н. С. апй 8сйешет, Ь. В., СНп. РЬаттасокшеЕ 6: 429-453 (1981)), уравнение аддитивности Ьое^е (Ьоето, 8. апй МшксЬпек, Η., Лтсй. Ехр. Ра1йо1 РйатшасоЕ 114: 313-326 (1926)) и уравнение медианного эффекта (Сйои, Т.С. апй Та1а1ау, Р., Лйу. Еп/уше Кеди1. 22: 27-55 (1984)). Каждое уравнение, упомянутое выше, может быть применено к экспериментальным данным для создания соответствующего графика для содействия оценке эффектов комбинации препаратов. Соответствующие графики, связанные с уравнениями, упомянутыми выше, представляют собой кривую концентрационного эффекта, изоболограммную кривую и кривую комбинационного индекса соответственно.

Эффективное количество комбинации агентов представляет собой количество, достаточное, чтобы обеспечить заметное улучшение по сравнению с контрольными клинически наблюдаемыми признаками и симптомами депрессивного расстройства, подвергаемыми лечению комбинацией.

Лекарственная форма для перорального применения включает единичную лекарственную форму, установленную или предназначенную для перорального применения.

Способы лечения, использующие комбинацию соединения А и соединения В

Изобретение предоставляет применение комбинации соединения А и соединения для лечения 1АКассоциированных заболеваний, например, миелопролиферативных новообразований, у индивидуума.

В одном из вариантов осуществления, предоставленными в настоящем документе являются способы лечения 1АК-ассоциированного заболевания или расстройства у субъекта (например, пациента) путем введения индивидууму, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества или дозы комбинации по настоящему изобретению или фармацевтической композиции этого. 1АК-связанное заболевание может включать любое заболевание, расстройство или состояние, которое прямо или косвенно связано с экспрессией или активностью 1АК, включая сверхэкспрессию и/или аномальные уровни активности. 1АК-ассоциированное заболевание может также включать в себя любое заболевание, расстройство или состояние, которое может быть предотвращено, облегчено или излечено с помощью модуляции 1АК-активности. (ВР).

1АК-ассоциированные заболевания могут также включать миелопролиферативные заболевания (МРИ), такие как истинная полицитемия (РУ), эссенциальная тромбоцитемия (ЕТ), миелоидная метаплазия с миелофиброзом (МММ), хронический миелолейкоз (СМЬ), хронический миеломоноцитарный лейкоз (СММЬ), гиперэозинофилический синдром (НЕ8), системное мастоцитное заболевание (8МСИ) и т.п.

Предоставленными в настоящем документе являются способы лечения заболевания, например, миелопролиферативного расстройства, путем введения эффективного количество соединения А и соединения В индивидууму, страдающему от болезни. Количество комбинации агентов эффективно для лечения заболевания. Важно отметить синергетический эффект комбинации агентов: даже если один или более агентов, вводимых по отдельности в определенной дозировке, могут оказаться неэффективными, при введении в комбинации, в той же дозировке каждого агента, лечение является эффективным. Дозы одного или нескольких агентов в комбинации поэтому могут быть меньше, чем одобренные РИА (Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов, США) дозы каждого агента.

Дозировки

Оптимальная доза комбинации агентов для лечения болезни может быть определена опытным путем для каждого индивидуума, используя известные способы, и будет зависеть от ряда факторов, включая, но без ограничения, степень развития заболевания, возраста, массы тела, общего состояния здоровья, пола и диеты индивидуума; времени и способа введения; и другие лекарства, которые принимает индивидуум. Оптимальные дозы препарата могут быть установлены с использованием рутинных проверок и процедур, которые хорошо известны в рассматриваемой области.

Количество комбинации агентов, которые можно комбинировать с материалами носителей для производства единой лекарственной формы, будет различаться в зависимости от индивидуума, проходящего лечение, и конкретного режима введения. В некоторых вариантах осуществления единичные лекарственные формы, содержащие комбинацию агентов, как описано в настоящем документе, будут содержать количества каждого агента комбинации, которые обычно назначают, когда агенты вводят по отдельности.

Частота дозирования может варьировать в зависимости от используемого состава и конкретного состояние, подвергаемого лечению или профилактике. В целом использование минимальных дозировок,

- 5 027654 достаточных для обеспечения эффективной терапии, является предпочтительным. Пациенты, как правило, могут обследоваться на терапевтическую эффективность с помощью анализов, подходящих для состояния, подвергаемого лечению или профилактике, которые должны быть известны специалистам в рассматриваемой области.

Лекарственная форма может быть подготовлена при помощи различных традиционных способов смешивания, измельчения и изготовления, совершенно очевидных для специалистов в области химии лекарственных составов.

Лекарственная форма для перорального применения, содержащая комбинацию агентов или индивидуальных агентов комбинации агентов, может быть в виде микротаблеток, заключенных внутри капсулы, например, желатиновой капсулы. Для этого может быть использована желатиновая капсула, как используется в фармацевтических препаратах, такая как твердая желатиновая капсула, известная как САР§иОЕЬ, доступная от РП/сг.

Многие из лекарственных форм для перорального применения, используемых здесь, содержат комбинацию агентов или индивидуальные агенты комбинации агентов в форме частиц. Такие частицы могут быть спрессованы в таблетку, присутствующую в коровом элементе покрытой лекарственной формы, такой как лекарственная форма с веществом, исправляющим вкус лекарственного средства, покрытая оболочкой спрессованная лекарственная форма или желудочная покрытая оболочкой лекарственная форма, или могут содержаться в капсульной лекарственной форме с осмотической помпой, или другой лекарственной форме.

Лекарственные соединения по настоящему изобретению присутствуют в комбинациях, лекарственных формах, лекарственных препаратах, фармацевтических композициях и фармацевтических составах, раскрытых в настоящем документе, в отношении, находящемся в диапазоне от 100:1 до 1:100, более предпочтительно от 1:1 до 1:100 и еще более предпочтительно от 1:10 до 1:100.

В одном варианте осуществления при введении людям Руксолитиниб дается по 5 мг два раза в день (ВГО), Панобиностат назначают по 10 мг три раза в неделю, один раз в две недели (Т1^ 0О\7)

В одном варианте осуществления при введении людям Руксолитиниб дается по 10 мг ВГО, Панобиностат назначают по 10 мг Т1\7 0О\7.

В одном варианте осуществления при введении людям Руксолитиниб дается по 15 мг ВГО, Панобиностат назначают по 10 мг Т1\7 0О\7.

В одном варианте осуществления при введении людям Руксолитиниб дается по 15 мг ВГО, Панобиностат назначают по 15 мг Т1\7 0О\7.

В одном варианте осуществления при введении людям Руксолитиниб дается по 15 мг ВГО, Панобиностат назначают по 20 мг Т1\7 0О\7.

В одном варианте осуществления при введении людям Руксолитиниб дается по 15 мг ВГО, Панобиностат назначают по 25 мг Т1\7 0О\7.

В одном варианте осуществления при введении людям Руксолитиниб дается по 15 мг ВГО, Панобиностат назначают по 30 мг Т1\7 0О\7.

В одном варианте осуществления при введении людям Руксолитиниб дается по 3-7 мг ВГО, Панобиностат назначают по 8-12 мг Т1\7 0О\7.

В одном варианте осуществления при введении людям Руксолитиниб дается по 8-12 мг ВГО, Панобиностат назначают по 8-12 мг Т1\7 0О\7.

В одном варианте осуществления при введении людям Руксолитиниб дается по 10-20 мг ВГО, Панобиностат назначают по 8-12 мг Т1\7 0О\7.

В одном варианте осуществления при введении людям Руксолитиниб дается по 10-20 мг ВГО, Панобиностат назначают по 10-20 мг Т1\7 0О\7.

В одном варианте осуществления при введении людям Руксолитиниб дается по 10-20 мг ВГО, Панобиностат назначают по 10-30 мг Т1\7 0О\7.

В одном варианте осуществления при введении людям Руксолитиниб дается по 10-20 мг ВГО, Панобиностат назначают по 10-30 мг Т1\7 0О\7.

В одном варианте осуществления при введении людям Руксолитиниб дается по 10-20 мг ВГО, Панобиностат назначают по 20-40 мг Т1\7 0О\7.

Оптимальные соотношения, индивидуальные и комбинированные дозировки и концентрации лекарственных соединений, которые дают эффективность без токсичности, основаны на кинетике доступности активных ингредиентов в участках-мишенях, и определяются с использованием способов, известных специалистам в рассматриваемой области.

Фармацевтические комбинации

Фармацевтические комбинации, предоставленные в настоящем документе, могут быть проверены в клинических исследованиях. Подходящие клинические исследования могут представлять собой, например, открытые исследования с повышением дозы препарата у пациентов с пролиферативными заболеваниями. Такие исследования доказывают, в частности, синергизм активных ингредиентов комбинации по изобретению. Благотворное действие на пролиферативные заболевания могут быть определены непосредственно через результаты этих исследований, которые известны как таковые специалистам в рас- 6 027654 сматриваемой области. Такие исследования могут быть подходящими, в частности, для сравнения эффектов монотерапии с использованием активных ингредиентов и комбинации по изобретению.

Введение фармацевтической комбинации по изобретению может привести не только к благотворному влиянию, например, синергичному терапевтическому эффекту, например, в отношении облегчения, задержки прогрессирования или подавления симптомов, но также к последующим удивительно благотворным воздействиям, например, уменьшению побочных эффектов, улучшению качества жизни, снижению заболеваемости, по сравнению с монотерапией применения только одного из фармакологически активных ингредиентов, используемых в комбинации по изобретению.

Еще одним преимуществом может быть то, что могут быть использованы более низкие дозы активных ингредиентов комбинации по изобретению, например, такие, что дозировки зачастую необходимы не только меньшие, но могут также применяться реже, что может снизить частоту возникновения заболевания и степень тяжести побочных эффектов. Это происходит в соответствии с пожеланиями и требованиями пациентов, проходящих лечение.

Одной задачей данного изобретения является создание фармацевтической композиции, содержащей количество, которое может быть совместно терапевтически эффективным в направленности или профилактике онкологических заболеваний, например, миелопролиферативного расстройства. В этой композиции соединение А и соединение В можно вводить совместно, одно за другим или по отдельности в одной комбинированной единичной лекарственной форме, либо в двух отдельных единичных лекарственных формах. Единичная лекарственная форма также может представлять собой фиксированную комбинацию.

Фармацевтические композиции для раздельного введения обоих соединений или для введения в фиксированной комбинации, т.е. отдельной галеновой композиции, включающей оба соединения, в соответствии с изобретением, могут быть подготовлены в порядке, известном рег 8е, и являются такими, которые подходят для энтерального, такого как пероральное или ректальное, и парентерального введения млекопитающим (теплокровным животным), включая людей, содержащие терапевтически эффективное количество по крайней мере одного фармакологически активного комбинационного партнера самого по себе, например, как указано выше, или в комбинации с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями или разбавителями, особенно подходящими для энтерального или парентерального применения.

Составы

Комбинации лекарственных препаратов, предоставленные в настоящем документе, могут быть составлены различными способами, очевидными для специалистов в области фармацевтических составов. Различные свойства высвобождения, описанные выше, можно достичь различными путями. Подходящие составы включают, например, таблетки, капсулы, прессованные покрытые составы и другие легко вводимые составы.

Подходящие фармацевтические составы могут содержать, например, примерно от 0,1 до 99,9%, предпочтительно от 1 до примерно 60% активного ингредиента(ов). Фармацевтические составы для комбинированной терапии для энтерального или парентерального введения, например, таковые в единичных лекарственных формах, такие, как таблетки, покрытые сахарной оболочкой, таблетки, капсулы или суппозитории, или ампулы. Если не указано иное, они готовятся способом, известным рег 8е, например, с помощью обычных процессов смешивания, гранулирования, покрытия сахаром, растворения или лиофилизации. Следует признать, что содержание единиц комбинационного партнера, содержащееся в индивидуальной дозе каждой лекарственной формы, само по себе не обязательно составляет эффективное количество, поскольку необходимое эффективное количество может быть достигнуто путем введения множества дозовых единиц.

В частности, терапевтически эффективное количество каждого из комбинационных партнеров комбинации по изобретению можно вводить одновременно или последовательно и в любом порядке, и компоненты можно вводить по отдельности или в виде фиксированной комбинации. Например, способ лечения заболевания, в соответствии с изобретением, может включать (ί) введение первого агента (а) в свободной форме или форме фармацевтически приемлемой соли и (ίί) введение агента (Ь) в свободной форме или в форме фармацевтически приемлемой соли, одновременно или последовательно, в любом порядке, в совместно терапевтически эффективных количествах, предпочтительно в синергически эффективных количествах, например, в ежедневных или периодических дозировках, соответствующих количествам, описанным в настоящем документе.

Индивидуальные комбинационные партнеры комбинации по изобретению можно вводить по отдельности в разное время в течение всего курса терапии или одновременно в разделенных или однократных комбинационных формах. Кроме того, термин введение также охватывает применение пролекарства комбинационного партнера, которое преобразуется ίη νίνο в комбинационного партнера как такового. Текущее изобретение, таким образом, следует понимать как охватывающее все такого рода схемы одновременного или попеременного лечения, и термин введение следует толковать соответственно.

Эффективная дозировка каждого из комбинационных партнеров, применяемых в комбинации по изобретению, может различаться в зависимости от конкретного соединения или используемой фармацев- 7 027654 тической композиции, способа введения, состояния, подвергаемого лечению, степени тяжести состояния, подвергаемого лечению. Поэтому, режим дозирования комбинации по изобретению, выбирается в соответствии с множеством факторов, включая способы введения и почечную и печеночную функцию пациента. Любой клиницист или лечащий врач может без труда определить и назначить эффективное количество отдельных активных ингредиентов, необходимых для смягчения, противодействия или остановки прогрессирования состояния.

Примеры

Настоящее открытие в дальнейшем иллюстрируется следующими неограничивающими примерами.

Пример А.

Исследование проводится с целью проверки эффективности комбинации соединения А и соединения В на мышах ЗсИ-Ьсфс при введении ί.ν. (в хвостовую вену) с 1 · 10⁶ Ва/Р3 клеток ЕроК •ГАК2У617Е1ис с1оп 8.

Протокол.

Животные:

самок мышей ЗсИ-Ьсщс. 18-22 г (8 групп по 7 мышей, 24 исключены во время рандомизации).

Клетки: клетки Ва/Р3 ЕроК 1АК2У617Р-1нс с1оп 8.

Хеподеп-отображение всего тела проводили в дни 4, 7, 9 и 11 после инъекции клеток. Рандомизация животных в группах лечения проводилась на основе биолюминесценции (ВюЬ) на 4 день после инъекции клеток.

Мышиная модель и протокол описан в Вайей е1 а1, Мо1. Сапсег ТЬег; 9(7), 1945, июль 2010 года.

Линии животного и клеточная линия.

Клеточная линия: Ва/Р3ЕроК 1АК2У617Е-1ис с1оп 8.

Ген: •ТАКУ617Е.

Число клеток/Участок инъекции: 1х 10⁶ клеток в 200 мкл/хвостовую ί.ν. инъекцию.

Виды: мышь.

Штамм: СВ17/С.В-1дЬ-1^Ь/0Ьт5Тас-Ргкбс^8с10-1у51^ЬдИ7, хозяйства Тасошс (полное название Тасошс).

Пол: женский.

Возраст: 22-24 г.

Количество: 80 мышей.

Подготовка клеток и инъекция.

Реактивы: КРМ11640 (аминированный).

10% ЕС8 (аминированный).

мМ Ь-глутамин (аминированный).

Пуромицин, 1 мкг/мл (81дта, 1о1 036К4073).

Гигромицин В, 100 мкг/мл (ЧпуЦгодеп, 1о1 В13871010).

Клетки Ва/Р3 ЕроК ЧАК2У617Е-1ис выращивали в КРМ11640 с добавлением 10% РС8, 1% глютамина, пуромицина (1 мкг/мл) и гигромицина (100 мкг/мл). Клетки разделяли каждые три дня (1:50) не ранее чем за две недели до эксперимента. За день до инъекции клетки выращивали без каких-либо антибиотиков (чтобы избежать возможных задержек в росте клеток щ νί\Ό).

В день инъекции клеток собирают и ресуспендируют в буфере НВ88 (10⁶ клеток в 200 мкл). Клетки вводили в хвостовую вену с помощью туберкулинового шприца 270.

Определение групп.

Группа 1 (7 мышей): группа носителя (0,5% НРМС ро + Ό5\ν 5% 1р).

Группа 2 (7 мышей): соединение В, 5 мг/кг, 3 раза в неделю (М/ν/Ρ), 1р + НРМС 0,5% ро.

Группы 3 (7 мышей): соединение В, 10 мг/кг, 3 раза в неделю (М/ν/Ρ), 1р + НРМС 0,5% ро.

Группа 4 (7 мышей): соединение В, 15 мг/кг, 3 раза в неделю (М/ν/Ρ), 1р + НРМС 0,5% ро.

Группа 5 (7 мышей): соединение А, 79,2 мг/кг, два раза в день, ро + Ό5ν5% 1р.

Группа 6 (7 мышей): соединение А, 79,2 мг/кг два раза в день, ро + соединение В, 5 мг/кг, 3 раза в неделю (М/ν/Ρ), 1р.

Группа 7 (7 мышей): соединение А, 79,2 мг/кг, два раза в день, ро + соединение В, 10 мг/кг, 3 раза в неделю (М/ν/Ρ), 1р.

Группа 8 (7 мышей): соединение А, 79,2 мг/кг, два раза в день, ро + соединение В, 15 мг/кг, 3 раза в неделю (М/ν/Ρ), 1р.

Лечения проводятся одновременно.

Соединения.

Соединение А представляет собой монофосфатную соль, 79,2 мг/кг (эквивалентно 60 мг/кг свободного основания), 10 мл/кг в 0,5% НРМС РЬагтасоа! 603.

Состав, содержащий соединение А: 522,7 мг соединения А (в форме монофосфатной соли) в 66 мл НРМС РНаппасоа! 603 0,5%.

Соединение В находится в форме соли молочной кислоты, 15 мг/кг (эквивалентно 11,90 мг/кг свободного основания), 10 мг/кг (эквивалентно 7,94 мг/кг свободного основания) и 5 мг/кг (эквивалентно

- 8 027654

3,97 мг/кг свободного основания), 10 мг/кг в Г)5Ш 5% (В. Вгаип, Ιοί 395147).

Состав, содержащий соединение В: 15 мг соединения В (в форме соли молочной кислоты) в 10 мл

Г)5Ш 5%, 10 мг в 10 мл Г)5Ш 5% и 5 мг в 10 мл Г)5Ш 5% соответственно.

Мониторинг и сбор данных/образцов.

Животных идентифицируют с использованием транспондеров и контролируют ежедневно. Биолюминесценции записывают при помощи камеры Хеподеп (неинвазивные система отображения

1У18®, Сайрег) на 4 день, 7 день и 10 день после клеточной инъекции под изофлурановой анестезией (3-5 об.% изофлуран, поток воздуха - 0,8 л/мин). Животным вводили ι.ρ. ϋ-люциферин (корпорация Хеподеп, ге£ ХК-1001), в 150 мг/кг (10 мл/кг, Ыас1). Анестезированные мыши затем помещаются в тепловизионную камеру для съемки через 15 мин после инъекции люциферина.

Параметры Хеподеп: Ώ/10 с/шеб/15 мин.

Животных рандомизировали на 4 день и начинали лечение по крайней мере в течение 6 дней, исходя из самочувствия животных, получавших носитель.

Массу тела (ВШ) и самочувствие записывают в протокол. Животных забивают, если ВШ превышает 15% 2 дня подряд. Всех мышей забивают, если более чем 50% животных в каждой группе мертвы.

Забивание, сбор образцов: через 2 ч после последней дозы соединения А; через 2 ч после последней дозы соединения В; массу селезенки при забивании записывают.

Образцы собирали и быстро замораживали в жидком азоте и хранили при -80°С до анализа: селезенка, ВМ, кровь и печень для РК-анализа;

селезенка для Ρϋ-маркерного анализа (р-5ТЛТ5 (соединение А) и ацетилирование белка (соединение В)), грудина для Ρϋ-маркерного анализа (р-5ТЛТ5 (соединение А)).

Результаты примера А.

Дозы, выраженные в эквиваленте свободного основания. Табл. 1.1-1.8 демонстрируют биолюминесценцию в момент рандомизации для различных групп.

Таблица 1.1

Группа 1 Носитель	Число мышей	В1оЬ день 4
24	1420	8,47Е+05
21	2009	1,07Е+06
70	2057	1,08Е+06
76	6080	1,43Е+06
75	7426	1,46Е+06
29	4546	1,98Е+06
6	7540	2,04Е+06
Среднее		1,42Е+06
Квадратичное отклонение		4,60Е+05
Стандартная погрешность среднего		1,74Е+05

- 9 027654

Таблица 1.2

Группа 2 Соединение В 4 мг/кг	Число мышей	В1оЬ день 4
47	1367	8,51Е+05
22	2330	1,06Е+06
58	4827	1,10Е+06
26	8199	1,40Е+06
61	5411	1,47Е+06
17	6505	1,89Е+06
62	3364	2,05Е+06
Среднее		1,40Е+06
Квадратичное отклонение		4,42Е+05
Стандартная погрешность среднего		1,67Е+05

Таблица 1.3

Группа 3 Соединение В 8 мг/кг	Число мышей	В1оЬ день 4
19	313	8,52Е+05
45	4578	1,06Е+06
23	4191	1,10Е+06
72	6127	1,39Е+06
31	3335	1,50Е+06
51	4942	1,86Е+06
28	2809	2,06Е+06
Среднее		1,40Е+06
Квадратичное отклонение		4,40Е+05
Стандартная погрешность среднего		1,66Е+05

- 10 027654

Таблица 1.4

Группа 4 Соединение В 12 мг/кг	Число мышей	В1оЬ день 4
37	4716	8,69Е+05
9	2896	1,02Е+06
42	3748	1,10Е+06
39	2934	1,37Е+06
2	8255	1,51Е+06
52	1681	1,81Е+06
8	5002	2,10Е+06
Среднее		1,40Е+06
Квадратичное отклонение		4,45Е+05
Стандартная погрешность среднего		1,68Е+05

Таблица 1.5

Группа 5 Соединение А 60 мг/кг	Число мышей	В1оЬ день 4
40	6132	8,80Е+05
66	870	9,78Е+05
18	5782	1,11Е+06
69	5545	1,35Е+06
48	9104	1,55Е+ 0 6
71	3957	1,74Е+06
14	8439	2,24Е+06
Среднее		1,41Е+06
Квадратичное отклонение		4,79Е+05
Стандартная погрешность среднего		1,81Е+05

- 11 027654

Таблица 1.6

Группа 6 Соединение А 60 мг/кг Соединение В 4 мг/кг	Число мышей	ВгоЬ день 4
63	4010	9,04Е+05
13	2805	9,70Е+05
11	3830	1,13Е+06
57	6791	1,26Е+06
55	6962	1,59Е+06
12	3656	1,71Е+06
15	2875	2,31Е+06
Среднее		1,41Е+06
Квадратичное отклонение		4,97Е+05
Стандартная погрешность среднего		1,88Е+05

Таблица 1.7

Группа 7 Соединение А 60 мг/кг Соединение В 8 мг/кг	Число мышей	В1оЬ день 4
27	3824	9,06Е+05
65	5471	9,62Е+05
49	2321	1,14Е+06
57	1127	1,22Е+06
30	6769	1,60Е+06
32	2622	1,71Е+06
79	1594	2,46Е+06
Среднее		1,43Е+06
Квадратичное отклонение		5,47Е+05
Стандартная погрешность среднего		2,07Е+05

- 12 027654

Таблица 1.8

Группа 8 Соединение А 60 мг/кг Соединение В 12 мг/кг	Число мышей	Βίο4 день 4
41	2798	9,07Е+05
33	7925	9,51Е+05
73	5754	1,16Е+06
38	2515	1,19Е+06
77	8809	1,65Е+06
20	6583	1,70Е+06
7	5799	2,82Е+06
Среднее		1,48Е+06
Квадратичное отклонение		6,67Е+05
Стандартная погрешность среднего		2,52Е+05

Фиг. 1 демонстрирует массу организма в период лечения соединением А и/или соединением В. При комбинировании соединения А и соединения В никаких существенных изменений в переносимости не отмечается.

Фиг. 2 и 3 демонстрируют эффект лечения на уровни ВюЬ через 7 дней терапии, т.е. 11-ый день после инъекции клеток (лечение начато на день 4 после инъекции клеток).

Фиг. 4 показывает массу селезенки, вес через 8 дней лечения.

Фиг. 5 и 6 демонстрируют результат ΡΌ-маркерного анализа (экстракты селезенки) через 2 ч после терапии.

В табл. 2 показан эффект лечения на относительное увеличение в Вю1их.

Таблица 2

Группа	Носитель	Соединение В 4 мг/кг	Соединение В 8 мг/кг	Соединение В 12 мг/кг	Соединение А 60 мг/кг	Соединение А 60 мг/кг + Соединение В 4 мг/кг	Соединение А 60 мг/кг + Соединение В 8 мг/кг	Соединение А 60 мг/кг + Соединение В 12 мг/кг
Отно- ситель- ное изменение в Βίοίηχ	767±279	481±83*	351±48*	204±51#*	717±137*	388±48*	267±31#*	52±9*#5
Т/С в послед- ний день(%)	100	27	20	11	40	22¥	15 +	3&

Примечания.

Относительное изменение рассчитывается как: Вю1их в последний день/Вю1их в первый день.

* р<0,05 по сравнению с контрольной группой с носителем.

# р<0,05 по сравнению с соединением А.

δ р<0,05 по сравнению с соединением В в той же дозе.

Односторонний дисперсионный анализ с последующим тестом Тьюки на 1од-преобразованных значениях для множественных сравнений со всеми группами.

Т/С, рассчитанное как: (прошедшие лечение/контроли)-100.

В соответствии с методом, описанным в С1агке К, Вгеаз! Сапзег Кез Тгеа1, 1997.

¥ отмечается незначительный антагонизм.

+ отмечается незначительный антагонизм или аддитивность.

& отмечается незначительная синергия или аддитивность.

В табл. 3 приведены результаты РК-анализа через 2 ч после лечения.

- 13 027654

Таблица 3

	Кровь ммоль/л	Селезенка нмоль/г	Печень нмоль/г	ВМ* нмоль/л
Лечение	Соединение А	Соединение В	Соединение А	Соединение В	Соединение А	Соединение В	Соединение А	Соединение В
Соединение В 4 мг/кг 2 часа		ВЬ<2		1,40±0,19		0,18±0,02		3,34±0,35
Соединение В 8 мг/кг 2 часа		ВЬ<2		2,07±0,20		0,25±0,03		3,17±0,36
Соединение В 12 мг/кг 2 часа		ВЬ<2		3,64±0,53		0,63±0,13		7,32±1,44
Соединение А 60 мг/кг 2 часа	1,9б±0,33		1,28±0,28		4,54±1,38		1,40±0,65
Соединение А 60 мг/кг Соединение В 4 мг/кг 2 часа	2,78±0,46	0,02±0,01	1,15±0,19	2,80±0,37	3,49±0,54	0,30±0,05	2,59±0,61	6,15±0,61
Соединение А 60 мг/кг Соединение В 8 мг/кг 2 часа	2,23±0,35	0,03±0,00	1,02±0,19	3,02±0,25	2,91±0,40	0,32±0,02	1,92±0,33	8,43±0,94
Соединение А 60 мг/кг Соединение В 12 мг/кг 2 часа	2,72±0,58	0,02±0,01	1,61±0,44	4,51±0,57	3,87±0,99	0,71±0,03	2,29±0,29	9,81±1,17

Все дозы приведены в качестве эквивалента свободного основания.

В^^: ниже предела квантификации.

Результаты представлены как среднее ± стандартная погрешность среднего (ЗЕМ).

* Уровни ВМ следует принимать с осторожностью из-за проблем с хроматограммой.

Приведенные выше результаты показывают, что комбинация соединения А и соединения В является переносимой в механистической мышиной модели направляемого клетками Ва/Р3 ЕроК 1АК2У617Р1ис лейкемического заболевания (потери массы тела, сопоставимые между группами монотерапии соединения В и соединения А + соединения В).

При оценке распространения лейкозных клеток (индикация Хеподеп Вю1их) комбинация соединения А и соединения В в дозах 60 и 12 мг/кг соответственно продемонстрирована существенная разница по сравнению с этими препаратами, принимаемыми в качестве монотерапии.

Пример В.

Активность и переносимость ингибитора дезацетилазы соединения В в комбинации с ингибитором 1ЛК1/2, соединением А, оценивали в трансплантной 1АК2У617Р-модели костного мозга заболевания истинной полицитемией. Активность комбинации в этой модели заболевания ΜΡΝ была проверена в дозе 8 мг/кг соединения В и 60 мг/кг соединения А. Как подробно показано ниже, комбинация соединения В с ингибитором 1ЛК1/2, соединением А, показала значительное улучшение в спленомегалии и гистологии костного мозга и селезенки по сравнению с каждым агентом по отдельности.

Трансплантация костного мозга и анализ Инфицирование и трансплантация костного мозга

Эксперименты по трансплантации костного мозга у мышей проводили, по существу, как описано в Шегшд е! а1. (Шегшд, О., Мегсйег, Т., ОкаЬеК., е! а1. (2006) Ехргеззюп оР 1АК2У617Р саизез а ро1усуШеш1а уега-Нке Фзеазе χνίΐΐι а§8ос1а!ей шуе1ойЬго§1§ ΐη а шиппе Ьопе шаггом !гап§р1ап! шойе1. В1оой 107: 42744281). Вкратце, мышей-доноров Ва1Ь/с (6-8 недельные самцы или самки, Чарлз Ривер) лечили 5 дней до пересадки ВМ 5-фторурацилом (150 мг/кг, 1.р., З1дша-ЛШпсй, са! # Р6627). Клетки костного мозга мышей-доноров были собраны с помощью промывки бедер и голеней. После лизиса красных кровяных клеток (З!ешСе11Тесйпо1од1е§, Гренобль, Франция, Кат.#07800), содержащие ядро клетки культивировали в течение 24 ч в среде для трансплантации (КРМ1+10% РСЗ+25 нг/мл 1Ь3 (Κ&Ό Зу§!еш§, АЬшд!оп, Великобритании, са!#403-МЬ), 25 нг/мл 1Ь6 (Κ&Ό Зу§!еш§ са!#406- МР) и 50 нг/мл фактора стволовых клеток (ЗС Р, Вюсопсер!, А11всИмП1, Швейцария, са!#Э-63120). На следующий день, клетки засевали с 2х10⁶ клеток/мл/лунка в 6-луночные планшеты в присутствии 1 мл надосадочной жидкости, содержащей вирионы из 293Т, трансфицированных 10 мкг вектора р-МЗСУ-1АК2У617Р-1КЕЗ-ОРР (модификация исходного вектора р-МЗСУ, приобретенного от С1оп!есй) и 10 мкг вектора рСЬ-ЕСО (1шдепех, са!#10045Р). После двух спин-инфекций (2500 об/мин в течение 90 мин при 32°С, МиШРиде 1С-К, Иегаеиз) неото- 14 027654 бранные инфицированные ВМ-клетки ресуспендировали в сбалансированном солевом растворе Хэнка (ΗΒδδ) перед клеточной инъекцией (1-3х10⁶ в зависимости от степени инфицирования) в хвостовую вену облученных летальной дозой реципиентных мышей-самок Ва1Ъ/с (всего 9 Гр или 7 Гр, полученных, как две 4,5- или 3,5 Гр-дозы с интервалом в 4 ч) с помощью установки для гамма-облучения ΒΙΟΒΕΑΜ 8000 (ΒΕΒΙΟ СтЪН, Германия).

Животных контролировали ежедневно и забивали в случае основных признаков дистресса (чрезмерная потеря массы тела более чем 2 дня подряд без улучшений, в комбинации с медлительностью и пилоэрекцией).

Сбор образцов и анализ Общий анализ крови и сбор органов

Кровь отбирали из хвостовой вены или, при забитии, из полой вены иглой 20 С под анестезией изофлюраном (терминальная процедура) и анализировали с использованием автоматизированного полного и дифференциального счетчика клеток крови (капиллярный режим с помощью разбавления 1:5 на анализаторе крови §уктех, ΧΤ2000ίν, 8уктех ΟίβίΙαηα АС, Нордерштедт, Германия). Селезенки были взвешены, чтобы оценить спленомегалию. Кровь, селезенки, грудину и печень собирали для фармакокинетики, фармакодинамики.

Обнаружение СРР-положительных клеток в образцах крови методом проточной цитометрии мкл цельной крови были использованы для выявления циркулирующих СРР-положительных клеток. Вкратце, кровь помещали в 96-луночные круглодонные планшеты (СоЧаг. са1#3795) и эритроциты (ΒΒΕ) лизировали в 200 мкл буфера для лизиса красных кровяных клеток (§1§та, са1#К-7757). После 7-минутного инкубационного периода в темноте на встряхивателе планшетов клетки центрифугировали (5 мин, 300 д) и супернатант удаляли при помощи переворачивания планшета. После 3-х этапов промывки в РАС8-буфере (фосфат-буферизованный солевой раствор (Ό-ΡΒδ), 3% ΕΒδ и 0,02% азида натрия), содержащие ядра клетки ресуспендировали в 200 мкл холодного РАС8-буфера и обрабатывали для обнаружения СЕР при помощи проточного цитометра Ь§Ы1 (ΒΌ Β^08С^еηсе8, Гейдельберг, Германия).

Гистология (р-8ТАТ5, ацетилгистон Н3, ретикулин)

Грудины и селезенки собирали, фиксировали в формалине, подравнивали, помещали в парафин и нарезали (условно) по 4 мкм с помощью микротома.

Фиброз костного мозга оценивали на грудине с помощью набора для пропитки серебром волокон ретикулина (Βίο-Орйса, са1.04-04080).

ΡΌ-маркер Ρ-8ΤΑΤ5 соединения А и ΡΌ-маркер ацетилированного гистона Н3 соединения В оценивали в селезенке и костном мозге. Вкратце, селезенку полностью удаляли, взвешивали и помещали на анатомический лоток. Селезенку разрезали поперек на две половинки, и две равные части брали из средних частей с помощью скальпеля. Кусочки селезенки не должны превышать 3-4 мм в толщину. Кусочки селезенки переносили в меченые гистокассеты и фиксировали погружением в нейтральный забуференный формалин (ΝΒΕ) 10% (об./об.) при комнатной температуре (рН 6,8-7,2) (ΕΤ. Βаке^. Мебйе, Швейцария). Объем закрепляющего раствора по крайней мере в десять раз превышал объем ткани. Грудины полностью удаляли, фиксировали в течение 48 ч в 10% ΝΒΕ при комнатной температуре, затем промывали в ΡΒδ, декальцинировали в буфере ЭДТА-лимонная кислота при рН 7,5 (Вюсус СтЪН, ЬискептаШе, Германия) 3 раза х 24 ч при 37°С. После последнего промывания в ΡΒδ, ткани разрезали и устанавливали вниз поверхностью, представляющей интерес, в универсальной гистокассете последующей обработкой в ТРС 15Ωιιο (Центр обработки ткани) для парафинизации. От каждого тканевого парафинового блока делали несколько срезов толщиной 3 мкм на нарезающем или ротационном микротоме (М1кгот 1п1егпа1юпа1 АС, Швейцария), располагали в водяной ванне при 45°С, помещали на микроскопные слайды (ТоРЧие, ν\νΡ Шегиайопаф Левен, Бельгия) и высушивали на воздухе в духовке при температуре 37°С в течение ночи. Слайды с высушенными срезами ткани брали из духовки и помещали в рак для слайдов линейного окрашивателя СОТ20 (Мебйе, Швейцария) для полностью автоматизированного окрашивания Н&Е (гематоксилин и эозин) или обработки для иммуногистохимического окрашивания (1НС). Для 1НС, образцы срезов ткани окрашивали кроличьим антителом анти-фосфо δΤΑΤ5 (клон С11С5) и кроличьим антителом анти-ацетилгистон Н3 (Мййроге, МА, υδΑ), накрывали покровным стеклом и высушивали на воздухе.

Для гистологического оценивания насыщенность клетками ВМ оценивали на повышенное (3+), нормальное (2+) и пониженное (1+) содержание клеток. Структуру селезенки оценивали как разрушенную (1+) или сохраненную (0). Наличие миелоидных, эритроидных клеток и клеток-адипоцитов оценивали как 0, 1+, 2+, 3+ по насыщенности клетками. Для ρ-δΤΑΤ5 оценки, данные цифрового изображения слайда получали со стеклянных слайдов с помощью слайд-сканера 2е188 Миах (Программное обеспечение δсаη δοΓ^αΌ, версия 1.12, 2е188 АС, Германия) с конечным 200х увеличением. Всю автоматизированную количественную оценку слайдов р-ЭТАТ5-положительных и отрицательных ядер клеток проводили с помощью программного обеспечения Оейтеп8 еСодпйюп (еСодпйюп версия ΧΌ 1.5, ОеПшещ АС, Германия). Результаты выражали в виде процента р-δΤΑΤ5 положительных ядер от общего количества ядер. Окрашивание ацетилированного гистона Н3 оценивали как 1+, 2+, 3+ на основе интенсивности

- 15 027654 окрашивания и числа положительных клеток.

Вестерн-блот-анализ для ацетилированного лизина

Замороженные образцы селезенки гомогенизировали в лизис-буфере (К1РА-буфер: 50 мМ Трис-НС1 рН 7,2, 120 мМ ЫаС1, 1 мМ ЭДТА, 6 мМ БОТА рН 8,5, 1% ΝΡ-40, 20 мМ ΝιΡ с добавлением 0,1% 8Ό8, 2 мМ ванадата натрия, 10 мМ пирофосфата натрия и одной таблетки анти-протеиназного коктейля (каталог КосЬе#11836145001) с помощью гомогенизатора Ро1у1гоп (1КА ЬаЪогТесЬщк, иИга-Тигга-Т25, на полной скорости в течение 1 мин), с размещением образцов на льду во время гомогенизации. Гомогенаты затем центрифугировали при 10000 об/мин (15 мин, 4°С), фильтровали через стекловолокнистые фильтры и замораживали при -80°С. Общее содержание белка в гомогенатах измеряли с помощью набора для определения белка ВСА Щоуадеп, каталог #71285-3).

100 мкг тотального белка из каждого образца разделяли при помощи 4-12% гелей №раде (ΙπνίΙΐΌдеп, каталог #\УС1402ВХ10) и переносили на мембрану РУЭР (МПйроге 1ттоЫ1оп™, кат. #1РУН20200, ВШепса, Массачусетс, США) при помощи полусухого блоттинга (ВЮКАЭ, система для полусухого переноса, кат. #170-3940). Мембраны забивали в блокирующем растворе (5% ВЗА, 0,1%, Туееп-20 в РВЗ) 1 час при комнатной температуре с последующим промыванием в течение 30 мин в РВЗ, содержащем 0,1% Т\уееп-20. со сменами каждые 10 мин. Мембраны затем инкубировали с первичным антителом против ацетилированного лизина (кроличье поликлональное антитело против ацетилированного лизина, Се11 З1дпаШпд, каталог # 9441), разведенным 1:1000 в РВЗ, содержащим 0,1% Т\уееп-20 и 5% молока, в течение ночи при 4°С. На следующий день, мембраны промывали 30 мин в РВЗ, содержащем 0,5% Туееп-20, со сменами каждые 10 мин, а затем инкубировали 1 ч при комнатной температуре с анти-кроличьим вторичным антителом, конъюгированным с НКР, разбавленным 1:2000 в РВЗ, содержащим 0,1% Т\уееп-20 и 1% ВЗА. Мембрану снова промывали, как описано выше, и проявляли с использованием ЕСБ+ (Атегкйат Вюкшепсек, каталог #ΚРN 2132), чтобы обнаружить в экстрактах селезенки ацетилированный лизин.

Определение общего белка с помощью β-тубулина или САРБН

Для определения уровней общего β-тубулина, мембрана была отмыта в РВЗ, содержащем 0,1% Туееп 20 и 2% ЗИЗ в течение 30 мин при 60°С, промывали от 4 до 5 раз в РВЗ, содержащем 0,1% Туееп 20 и инкубировали с первичным антителом анти-β-тубулин (мышиное моноклональное антитело анти-βтубулин, §1дта, кат. #Т-4026) в разведении 1:5000 в РВЗ, содержащем 0,1% Туееп 20 и 3% ВЗА в течение ночи при 4°С. На следующий день, мембрану промывали в течение 30 мин в РВЗ, содержащем по 0,5% Туееп 20, со сменами каждые 10 мин, а затем инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре с антителом против мышиного антитела, конъюгированным с НКР, разбавленным 1:5000 в РВЗ, содержащем 0,1% Туееп 20 и 1% ВЗА. Мембрану промывали снова, как описано выше, и проявляли с ЕСЬ для детекции белка β-тубулина.

Уровни САРИН детектировали следующим образом: образцы заново наносили (40 мкг общего белка) и мембрану инкубировали с первичным антителом анти-САРИН (кроличье антитело анти-САРИН, Се11 З1дпаШпд, кат. #2118), разведенным 1:5000 в РВЗ, содержащем 0,1% Туееп 20 и 3% ВЗА в течение ночи при 4°С. На следующий день, мембрану промывали 30 мин в РВЗ, содержащем 0,5% Туееп 20, со сменами каждые 10 мин, а затем инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре с вторичным антителом против кроличьего антитела, конъюгированным с пероксидазой (СЕ НеаЙЬсаге, са! # NА931), разведенным 1:1000 в РВЗ, содержащем 0,1% Туееп 20 и 1% ВЗА. Мембрану промывали снова, как описано выше, и проявляли с ЕСЬ для детекции белка САРИН в экстрактах селезенки.

Биоаналитика (БС/М8-М8) для количественного анализа соединения А и соединения В

Концентрации соединения А и соединения В в плазме крови и тканях определяли одновременно при помощи анализа ИРЬС/МЗ-МЗ. Ткани гомогенизировали в равном объеме ВЭЖХ-воды (Вода для хроматографии, Мегск), используя систему Рак! Ргер® - 24 (М.Р. Вюте4юа1к, 1гуше, СА, США). После добавления 25 мкл смеси внутреннего стандарта (1 мкг/мл) к аналитическим аликвотам (25 мкл) крови или гомогената тканей, белки преципитировали добавлением путем добавления 200 мкл ацетонитрила. Супернатант переносили в новый виал. После испарения до сухости образцы вновь растворяли в 60 мкл ацетонитрила/воды (1/1 об./об.). Аликвоту (5 мкл) этого раствора разделяли на колонке АСЦИТУ ИРЬС ВЕН С18 (^а!егк™, размер частиц 1,7 мкм, 2,1x50 мм) с подвижной фазой, состоящие из смеси 0,1% муравьиной кислоты в воде (растворитель А) и 0,1% муравьиной кислоты в ацетонитриле (растворитель В). Использовался программированный градиент при расходе 600 мкл/мин. После уравновешивания с 95% растворителя А вводили 5 мкл образца. После латентного периода в 0,25 мин, образец элюировали с линейным градиентом 5-100% растворителя В в течение периода 0,65 мин с последующей удержанием 0,35 мин. Колонку подготавливали для следующего образца путем повторного уравновешивания свыше 0,25 мин до начальных условий. Элюент с колонки непосредственно вводили в ионный источник тройного квадрупольного масс-спектрометра ТЦИ™ (\Уа!егк Согрогайоп, МПГогй, Массачусетс, США), контролируемый программным обеспечением Макк1упх™ 4.1. Мониторинг множественной реакции электрораспылительной положительной ионизации (ЕЗ1+) использовали для МЗ/МЗ-детекции аналита. Для соединения А был использован предшественник продукта ионного перехода 307,0 т/ζ 186,0. Одновременно

- 16 027654 был записан предшественник продукта ионного перехода 350,1 т/ζ 142,9 для соединения В. Предел квантификации (ЬОЦ) для обоих соединений был установлен в 9 нг/мл и 9 нг/г для плазмы и тканей, соответственно (СУ и общий уклон менее чем 30%). Регрессионный анализ и дальнейшие расчеты проводились с использованием ЦиапЬупх™ 4.1 (М1стота88) и Ехсе1™ 2007 (Мютокой). Концентрации неизвестных образцов обратно рассчитывали по площади пика соотношений аналит/Ιδ из калибровочной кривой, построенной с использованием калибровочных образцов, внесенных к контрольной крови или ткани, полученных от животных, проходивших лечение носителем.

Условия содержания

Мышей Ва1Ь/сВуЛсо (С. Рйег. Франция) содержали в автоклавных клетках (максимум 5 животных в клетке). Цикл свет/темнота представлял собой следующее: 12 ч темнота, 12 ч светло (освещение с 6:30 утра до 6:30 вечера). Животных кормили без ограничения увлажненными гамма-облученными пищевыми продуктами и автоклавной воды с антибиотиками (ВАСТКРМ с конечной концентрацией 4 мг сульфаметоксазолима, 0,8 мг триметоприма), КосЬе РЬагта АС, КшпасЬ, Швейцария), 5 мл в 250 мл питьевой воды), чтобы помочь восстановлению животных после облучения и избежать инфекции в течение первых 2 недель после трансплантации.

Тестируемые соединения и состав

Соединение В вводили в виде соли молочной кислоты при помощи внутривенной или внутрибрюшинной инъекции. Соль молочной кислоты соединения В была составлена в изотоническом Ό5Α (5% декстроза; В. Вгаип, Бо1 395147) в концентрации 1,5, 1 и 0,5 мг/мл соответственно. Раствор оставался стабильным в течение 10 дней при комнатной температуре. Лечение проводили 3 раза в неделю в объеме 10 мл/кг. Конечные эквивалентные дозы свободного основания составляли, соответственно, 11,90, 7,94 и 3,97 мг/кг. На фигурах эти дозы учитываются как целые значения.

Монофосфатная соль соединения А была составлена в 0,5% НРМС (РЬаттасоа! 603, Эо\у СЬетюа1 Р1адиеЬпе, И8А) в концентрации 7,9 мг/мл. Раствор оставался стабильным при комнатной температуре в течение 4 дней. Лечение проводили два раза в день в объеме 10 мл/кг. Конечная эквивалентная доза свободного основания составляла 60 мг/кг.

Два соединения давались одновременно.

Статистика

Результаты, показанные на фигурах и в таблицах, представляют среднее ± стандартную погрешность среднего. Процентное изменение массы тела и абсолютных значений или преобразованных значений (1од 10, или другие, как указано) для масс селезенки, число ретикулоцитов, эритроцитов, Нс1 и гистологические данные анализировали при помощи непарного ΐ-теста или критерия суммы рангов для сравнения одной терапевтической группы с группой, получавшей носитель, или одностороннего дисперсионного анализа с последующим тест ЭиппеИ для сравнения групп лечения с группой, получавшей носитель. Множественные сравнения осуществляли с помощью теста Тьюки. Все сравнения были сделаны в день забивания животного. Уровень значимости был установлен с р<0,05. Расчеты выполняли с помощью СтарЬРаб Рйкт для Ашбо^к (СтарЬРаб 5>оП\уаге 1пс.).

Результаты примера В.

1п νί\ό эффективность и переносимость соединения А и соединения В в комбинации.

Для проверки гипотезы о том, что эффективность соединения В можно повысить с помощью комбинации с соединением А, мышей Ва1Ь/с, трансплантированных 1АК2У617Р-траисдуцироваииыми клетками костного мозга, подвергали лечению соединением А в комбинации с 1АК1/2 ингибирующим соединением А. Дозу, дающую промежуточную эффективность, выбирали для соединения А для того, чтобы оценить влияние различных доз вещества В в комбинации с 1АК-ингибирующим соединением А.

Мышей рандомизировали на 27-й день после ВМТ на основе значения Нс1 (67% в среднем в этом эксперименте, Н=9/группу) и подвергали лечению соединением В (8 мг/кг, 3 раза в неделю МАР, 1.р.) и соединением А (60 мг/кг, д12Ь, р.о.) в качестве единственного агента или в комбинации. Соединение В по отдельности показало некоторую потерю массы тела (-5% в среднем). Эта потеря массы тела была значительно выше, когда соединение В комбинировали с соединением А ( -10% в среднем, на фиг. 7 и табл. 4). Соединение В, которое давали по отдельности, уменьшало массу селезенки, но не до нормы. Соединение А продемонстрировало тенденцию к снижению массы селезенки, но с высокой вариабельностью (в диапазоне от 67 до 1153 мг). Комбинация увеличивала эффективность с точки зрения массы/объема селезенки, которая была приведена в норму или даже была ниже нормального первоначального диапазона (у 6 из 9 животных) после 3 недель лечения (фиг. 8 и табл. 4). Комбинация показала тенденцию на наличие сильного эффекта на количество ретикулоцитов (с очень низкими значениями, наблюдаемыми для некоторых животных <0,1х10¹²/л), но этот эффект не отличался существенно от такового для групп, получавших один агент. Число лейкоцитов уменьшилось, когда соединение В давали отдельно и в комбинации с соединением А (несмотря на отсутствие лейкоцитоза в этом эксперименте, за исключением 1 животного в группе с носителем и 1 животного в группе с соединением А). Лечение соединением В отдельно и в комбинации с соединением А оказывало влияние на число тромбоцитов (фиг. 11). Тенденция к снижению аллельного бремени заместительной индикации (СРР-положительных циркулирующих кле- 17 027654 ток) была обнаружена в данном исследовании для групп соединения В и комбинации (табл. 4).

Уменьшение содержания паренхиматозных клеток костного мозга наблюдалось для всех групп лекарственного лечения (комбинация > соединение А = соединение В). Лечение улучшало структуры селезенки с наибольшим эффектом, наблюдаемым в комбинированной группе (комбинация > соединения А > соединения В). Несмотря на высокую вариабельность, группы соединения А и комбинации показали тенденцию к снижению показателя фиброза, что оценивали по окрашиванию ретикулина на срезах грудины.

Оценка ΡΌ-маркера при помощи 1НС показала заметное снижение маркера р-ЗТАТ5 после лечения соединением А в качестве единственного агента и в комбинации с соединением В. Явный рост наблюдался для ацетилированного гистона Н3, как заместительной индикации ингибирования дезацетилазы, после лечения только одним соединением В или в комбинации.

Фиг. 13-19 иллюстрируют изображения костного мозга и/или селезенки при различных способах окрашивания.

Комбинированная схема терапии не оказывала значительного влияния на экспозицию соединений в тканях (табл. 5).

Этот пример показывает, что комбинация соединений А и В улучшала эффективность с точки зрения массы/объема селезенки.

Таблица 4

Результаты в день забивания животных

Лечение	Изменение массы тела (%) (среднее ± стандартная погрешность среднего)	Масса селезенки (мг) (среднее ± стандартная погрешность среднего)	Лейкоциты (х109л) (среднее ± стандартная погрешность среднего)	Тромбоциты (х109л) (среднее ± стандартная погрешность среднего)	Количество ретикулоцитов (х1012л) (среднее ± стандартная погрешность среднего)	Неб (%)(среднее ± стандартная погрешность среднего)	СГР- положительные циркулирующие клетки (%)
Носитель ϋ5№ ΐ.ρ и НРМС 0,5% р.о. 10 мг/кг	2,01 ±1,18	519,9 ±121,8	53,0 ±41,9 (11,15±0,76)	628,6 ±54,2	0,57 ±0, 11	66,5 ±4,2	33,4 ±9,1
Соединение В (3 раза в неделю, 1.р, 8 мг/кг)	-4,57 ±1,14*	222,0 ±92,3*	3,88 ±0,94*	374,4 ±28,6*	0,24 ±0,10*	52,2 ±3,1*	20,4 ±6, 6
Соединение А (сд12Н, ро, 60 мг/кг)	0,45 ±0,94	346, 1 ±127,9	22,2 ±14,7 (7,4б±0,82)	695, 9 ±93, 6	0,42 ±0, 09	59,4 ±3,9	34,0 ±9,6
Комбинация	-9,52	71,9	2,41	280, 1	0,11	51,5	16, 8
Соединение В (8 мг/кг) + Соединение А (60 мг/кг)	±0,55*	±8,б*1#	±0,48*# (N=7)	±28.О*# (N=7)	±0,04* (N=7)	±3,6* (N=7)	±4,3 (N=7)

Самки мышей Ва1Ь/с, трансплантированные 1АК2У617Р-трансдуцированными клетками костного мозга, получали либо носитель, или соединение В в дозе 8 мг/кг ΐ.ρ. (эквивалент свободного основания) по схеме Μ/Ψ/Р, или соединение А в дозе 60 мг/кг (эквивалент свободного основания) ς12Η или комбинацию обоих агентов в течение 21 дня подряд. Изменения массы тела и массы селезенки вес при забивании представлены как среднее ± стандартная погрешность среднего. Х=7-9/группу.

* р<0,05 по сравнению с носителем, # р<0,05 по сравнению с соединением А, + р<0,05 по сравнению с соединением В в день забивании (односторонний дисперсионный анализ с последующим тестом 1)иппеП или тестом Тьюки. Реципрокная форма значений массы селезенки и 1од10преобразованные значения для количества лейкоцитов и тромбоцитов были использованы для статистического анализа). 1 выброс в группах носителя (388,3х 10⁹/л) и соединения А (139,9х 10⁹/л) для количества лейкоцитов детектировал новые значения среднего ± стандартной погрешности среднего без выбросов, данных в квадратных скобках.

- 18 027654

Таблица 5

Уровни после терапии

	Кровь мкмоль/л	Селезенка нмоль/г	Печень нмоль/г	Костный мозг нмоль/л
Лечение	Соединение А	Соединение В	Соединение А	Соединение В	Соединение А	Соединение В	Соединение А	Соединение В
Соединение В 8 мг/кг 2 часа		0,035±0,0,010		10,045±1,674		0,264±0,045		2,704±0,345
Соединение А 60 мг/кг 2 часа	8,17б±1,584		2,5бб±0,346		6,537±1,071		2,223±0,393
Комбинация Соединение А и Соединение В 2 часа	4,114±0,979	0,006±0,004	1,575±0,312	15,317±1387	3,568±0,730	0,33±0,039	1,469±0,318	4,398±0,413

Животных соответствующих групп дозирования забивали через 2 ч после последней дозы соединения В и/или соединения А, и кровь, селезенку, костный мозг и печень отбирали для РК-анализа. Дозы приведены здесь в качестве эквивалента свободного основания. В таблице приведены средние уровни соединения В и соединения А в крови [мкмоль/л] и тканях [нмоль/г] ± стандартная погрешность среднего. N=9/группу.

Пример С.

Клиническое исследование.

Проводится фаза 1Ь, открытое, многоцентровое, одноплечное исследование по подбору дозы для оценки безопасности и фармакокинетики комбинации для перорального применения панобиностата и руксолитиниба у пациентов с первичным миелофиброзом (РМТ), постполицитемическим истинным миелофиброзом (РР-МТ) или постидиопатическим тромбоцитемие-миелофиброзом (РЕТ-МТ).

Фиг. 20 демонстрирует схему исследования и способы.

Это испытание имеет целью установить одно или несколько из следующего.

(1) Устанавливать ΜΤΌ и/или ΚΡΙΙΌ комбинации руксолитиниб и панобиностат у пациентов с МТ.

(2) Оценить безопасность перорального совместного введения руксолитиниба и панобиностата пациентам с МТ.

(3) Охарактеризовать фармакокинетику руксолитиниба в различных дозах - в качестве единственного агента, и при назначении в комбинации с панобиностатом пациентам с МТ; и/или (4) Охарактеризовать фармакокинетику панобиностата в разных дозах в комбинации с руксолитинибом у пациентов с МТ.

Критерии включения.

A. Пациенты имели документально подтвержденный диагноз РМТ, РРУ-МТ или РЕТ-МТ, независимо от их статуса мутации 1АК2 У617Т.

B. Руководствуясь критерием Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) для РМТ, исследование включает пациентов, обозначенных как промежуточные-1, -2 или с высоким риском по критерию Международной прогностической системы баллов (1Р88) и имеющих ощутимую спленомегалию >5 см ниже реберной дуги.

C. Пациенты должны были иметь по крайней мере 1 из следующих факторов риска.

а. Наличие конституциональных симптомов (снижение массы >10% исходного значения в годовом предшествующим цикле 1, дне 1 [СЮ1], необъяснимой лихорадки или обильного ночного потоотделения, сохраняющиеся на протяжении более чем на 1 месяца).

б. Выраженной анемии (гемоглобин <10 г/дл) продемонстрированной при осмотре. с. Лейкоцитоз (изменение уровня лейкоцитов в крови >25х10⁹/л).

ά. Циркуляционные взрывы >1%.

Ό. Повышение дозы руководствуется байесовской моделью логистической регрессии с контролем передозировки и зависит от дозоограничивающей токсичности (ЭБТ) в первом цикле, а также других заключений безопасности.

Е. Каждая группа дозирования состояла из >3 оцениваемых пациентов.

Т. Данные для >9 пациентов при любом заданном уровне дозы будут необходимы для определения ΚΕ2Ό и/или МТЭ.

О. В серийных образцах крови, собранных после однократной дозы только руксолитиниба в день 1 и в комбинации с панобиностатом в дни 2 и 6, оценивают концентрации в плазме крови при помощи тандема жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии.

- 19 027654

Н. Фармакокинетические параметры были получены с использованием неразделенного анализа.

Результаты.

В исследовании предложены 7 групп. Исследование все еще продолжается, только данные из групп 1-3 имеются на сегодняшний день.

Табл. 6 показывает количество больных и подтип заболевания для группы 1-3.

На фиг. 21 показана пальпируемая длина селезенки с течением времени в группе 1.

Табл. 7 показывает наилучший ответ пальпируемой длины селезенки и симптомный ответ в группе

1.

На фиг. 22 показана пальпируемая длина селезенки с течением времени в группе 2.

Табл. 8 показывает наилучший ответ пальпируемой длины селезенки и симптомный ответ в группе

2.

На фиг. 23 показана пальпируемая длина селезенки с течением времени в группе 3.

Табл. 9 показывает наилучший ответ пальпируемой длины селезенки и симптомный ответ в группе

3.

Табл. 10 сообщает о неблагоприятных проявлениях класса 3/4 в группах 1-3 с подозрительным отношением к изучению процедуры. В группе 1 или группы 3 не наблюдалось ЭРТ или ЗЛЕ. В группе 2 отмечена 1 ЭРТ тромбоцитопении 4 класса. Также были отмечены 1 ЗЛЕ тошноты класса 3 и поноса класса 3. Клинически значимого нарушения ЭКГ на сегодняшний день не выявлено.

Табл. 6.

Повышение дозы руководствуется байесовской моделью логистической регрессии с контролем передозировки и будет зависеть от дозоограничивающей токсичности (ЭЕТ) в каждом цикле, а также других заключений безопасности.

Каждая группа дозирования состояла из >3 оцениваемых пациентов.

Данные для >9 пациентов при любом заданном дозовом уровне будут необходимы для определения ΚΡ2Ώ и/или МТЭ.

Серийные образцы крови, собранные после однократной дозы руксолитиниба самого по себе в 1 день, и в комбинации с панобиностатом в дни 2 и 6 оценивают по концентрациям в плазме при помощи ЕС-МЗ/МЗ.

РК-параметры были получены с использованием некомпартментационного анализа.

Таблица 6

Дозировки руксолитиниба и панобиностата в группах 1, 2 и 3

Группа	# Число пациентов с подтипом заболевания	# Всего пациентов	Терапевтическая дозировка
РМГ	РЕТ- МЕ	ρρν- МЕ	Руксолитиниб	Панобиностат
1	2	3	0	5	5 мг ВI ϋ	10 мг Т1И/0ОИ
2	3	2	3	8	10 м ВЮ	10 мг Т1И/0ОИ
3	3	2	0	5	15 мг В Ю	10 мг Т1И/0ОИ

- 20 027654

Таблица 7

Наилучший ответ пальпируемой длины селезенки и симпгомный ответ в группе 1

		Изменение конституционных симптом
	Пальпируемая длина селезенки, наилучший ответ	10% потеря массы от ВЬ	Ночная потливость, сохраняющаяся в течение >1 месяца	Необъясненная лихорадка >37,5°С, сохраняющаяся в течение >1 месяца
Группа 1 (п=5). Данные из профилей пациентов
Пациент 1	100% уменьшение		Устранена
Пациент 2	56% уменьшение	Без изменений	Устранена
Пациент За	23% увеличение		Устранена	Устранена
Пациент 4	50% уменьшение		Устранена
Пациент 5	26% уменьшение	Без изменений	Устранена

^а Пациент испытал резкое повышение длины и был исключен из исследования по прохождению трансплантации стволовых клеток.

Таблица 8

Наилучший ответ пальпируемой длины селезенки и симптомный ответ в группе 2

		Изменение конституционных симптом
	Пальпируемая	10% потеря	Ночная	Необъясненная
	длина	массы от ВЬ	потливость,	лихорадка
	селезенки.		сохраняющаяся	>37,5°С,
	Наилучший		в течение >1	сохраняющаяся
	ответ		месяца	в течение >1
				месяца
Группа 2 (п	=8) Данные из	-
профилей	: пациентов
Пациент 6	60%	Без	-	-
	уменьшение	изменений
Пациент 7	27%	-	Устранена	-
	уменьшение
Пациент 8	62%	-	Устранена	-
	уменьшение
Пациент 9а	8% уменьшение	-	Устранена	-
Пациент 10	84%	Без	Устранена	-
	уменьшение	изменений
Пациент 11	30%	-	Устранена	-
	уменьшение
Пациент 12	10%	Без	Устранена	-
	уменьшение	изменений
Пациент 13	40%	Без	Устранена	-
	уменьшение	изменений

^а Пациент испытал тромбоцитопению 4 класса и был исключен из исследования из-за ΏΕΤ-критериев.

- 21 027654

Таблица 9

Наилучший ответ пальпируемой длины селезенки и симптомный ответ в группе 3 (штриховка указывают на то, что этот симптом не присутствует в контроле)

		Изменение конституционных симптом
	Пальпируемая	10% потеря	Ночная	Необъясненная
	длина	массы от ВЬ	потливость,	лихорадка
	селезенки.		сохраняющаяся в	>37,5°С,
	Наилучший		течение >1	сохраняющаяся в
	ответ		месяца	течение >1
				месяца
Группа 3 (п=5) Данные из
профилей пациентов
Пациент 14	38%	-	Устранена	-
	уменьшение
Пациент 15	9% уменьшение	-	Устранена	-
Пациент 16	100%	Без	-	-
а	уменьшение	изменений
Пациент 17	53%	Без	-	-
	уменьшение	изменений
Пациент 18	64%	Не сообщается об участии в	исследовании
	уменьшение

Таблица 10

Неблагоприятные проявления 3/4 степени в группах 1, 2, и 3 с подозрительным отношением к изучению процедуры а, Ь

	Группа 1 ΡΑΝ 10 мг них 5 мг N=5	Группа 2 ΡΑΝ 10 мг них 10 мг N=8	Группа 3 ΡΑΝ 10 мг них 15 мг N=5	Группы всех доз N=18
Всего	1	3	2	6
Всего нарушений крови и лимфатической системы, η	1	2	2	5
Тромбоцитопения, η	0	1	1	2
Анемия, η	1	1	2	4
Всего желудочнокишечных расстройств, η	0	1	0	1
Понос, η	0	1	0	1
Тошнота, η	0	1	0	1

ΡΑΝ - панобиностат;

КИХ - руксолитиниб.

^а Пациенты с несколькими АЕ в первичную систему класса органов были учтены только один раз в строке всего.

^Ь Пациенты с несколькими случаями АЭ в одном лечении учитываются только один раз в категории АЕ для этого лечения.

Не было выявлено ни одного ΌΕΤ или ЗАЕ в группе 1 или группы 3.

В группе 2 сообщалось об 1 ΌΕΤ тромбоцитопении 4 класса.

Также были выявлены 1 ЗАЕ тошнота класса 3 и понос класса 3.

На сегодняшний день клинически значимых ЭКГ-аномалий не наблюдалось.

Клиническое исследование на данный момент показывает, что комбинация руксолитиниба и панобиностата, по-видимому, хорошо переносится и обладает перспективной активностью. Низкая степень анемия 3/4 класса и тромбоцитопении наблюдались при изученых до сих пор дозах руксолитиниба и панобиностата. Ранние данные не указывают на возможные лекарственные взаимодействия между руксо- 22 027654 литинибом и панобиностатом. Дополнительные группы позволят установить оптимальную стратегию дозирования для этой многообещающей комбинации при лечении МР-пациентов.

Список сокращений.

Сокращение Описание

Βίά ΒΪ5 ίη άίβιη

ВМТ Трансплантат костного мозга

ΤΙΚ Три раза в неделю

0ОМ Через неделю

СВС Полный анализ крови

ЕАСЗ Сортировщик флуоресцентно-активированных клеток

ЕВЗ Фетальная сыворотка крови крупного рогатого скота

ЕСЗ Фетальная телячьей сыворотка

5-Пи 5-фторурацил

СЕР Зеленый флуоресцирующий белок

Су Грей

Нсб Гематокрит

Н&Е Окрашивание гематоксилином/эозином

Нг час

1НС

ί.ρ. ί . ν.

т1ЬЗ ш1Ь6 тФп

ДАК1/2

ΜΡΝ

МИГ

Ρϋ

РК

РЬТ ρν

р.о.

ВВС зег

ЗТАТ5

ЧНС иве

Иб

Иммуногистохимия

Внутрибрюшинная инъекция

Внутривенная инъекция

Внутренний стандарт

Интерлейкин-3 мыши

Интерлейкин-б мыши минута

Янус-киназа 1/2

Миелопролиферативное новообразование расписание: понедельник/среда/пятница Фармакодинамика

Фармакокинетика

Тромбоциты

Истинная полицитемия

Рег оз

Красные кровяные клетки

Фактор стволовых клеток

Преобразователь сигналов и активатор транскрипции 5 Носитель

Белые кровяные клетки Дикий тип

- 23 027654

Claims (20)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Применение комбинации, содержащей соединение А ((Ж)-3 -(4-(7Н-пирроло[2,3-б] пиримидин-4-ил)-1 Н-пиразол-1 -ил)-3 циклопентилпропаннитрил) формулы (А) (руксолитиниб) или его фармацевтически приемлемую соль; и соединение В (^-гидрокси-3-[4-[[[2-(2-метил-1Н-индол-3-ил)этил]амино]метил]фенил]-2Е-2пропенамид) формулы (В) (панобиностат) или его фармацевтически приемлемую соль, для лечения миелопролиферативного новообразования.
2. 2. Применение комбинации по п.1, где комбинация дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель(ли).
3. 3. Применение комбинации по п.1 в едином составе или единичной лекарственной форме.
4. 4. Применение эффективного количества комбинации, содержащей соединение А (руксолитиниб) или его фармацевтически приемлемую соль и соединение В (панобиностат) или его фармацевтически приемлемую соль по любому из вышеприведенных пунктов, для изготовления лекарственного средства для лечения миелопролиферативного заболевания.
5. 5. Применение по п.4, где миелопролиферативное новообразование выбирают из группы, включающей хронический миелоидный лейкоз (СМБ), истинную полицитемию (РУ), эссенциальную тромбоцитемию (ЕТ), первичный или идиопатический миелофиброз (РМР), хронический нейтрофильный лейкоз, хроническую эозинофильную лейкемию, хронический миеломоноцитарный лейкоз, ювенильный миеломоноцитарный лейкоз, гиперэозинофилический синдром, системный мастоцитоз и атипичный хронический миелогенозный лейкоз.
6. 6. Применение по любому из пп.4 или 5, где субъектом является человек.
7. 7. Применение по любому из пп.4 или 5, где лечение включает совместное введение соединения А и соединения В.
8. 8. Применение по любому из пп.4 или 5, где соединение А и соединение В находятся в едином составе или единичной лекарственной форме.
9. 9. Применение по любому из пп.4 или 5, где лечение включает практически одновременное введение соединения А и соединения В.
10. 10. Применение по любому из пп.4 или 5, где лечение включает введение соединения А и соединения В в разное время.
11. 11. Применение по п.10, где субъекту вводят соединение В, после чего вводят соединение А.
12. 12. Применение по п.10, где субъекту вводят соединение А, после чего вводят соединение В.
13. 13. Применение по любому из пп.7-9, где соединение А и соединение В находятся в отдельных составах или единичных лекарственных формах.
14. 14. Применение по п.6, где руксолитиниб назначают по 3-7 мг два раза в день (БГО), панобиностат вводят по 8-12 мг три раза в неделю один раз в две недели (ΤΓΥ ()Ο\Υ).
15. 15. Применение по п.6, где руксолитиниб назначают по 8-12 мг БГО, панобиностат вводят по 8-12 мг ΤΓΥ ΦΟΥ.
16. 16. Применение по п.6, где руксолитиниб назначают по 10-20 мг ВШ, панобиностат вводят по 8-12

    - 24 027654 мг Ж ρον.
17. 17. Применение по п.6, где руксолитиниб назначают по 10-20 мг ВГО, панобиностат вводят по 10-20 мг Ж ρον.
18. 18. Применение по п.6, где руксолитиниб назначают по 10-20 мг ВГО, панобиностат вводят по 10-30 мг Ж ρον.
19. 19. Применение по п.6, где руксолитиниб назначают по 10-20 мг ВГО, панобиностат вводят по 10-30 мг ην ρον.
20. 20. Применение по п.6, где руксолитиниб назначают по 10-20 мг ВГО, панобиностат вводят по 20-40 мг ην ρον.