UA112645C2

UA112645C2 - Комбінація панобіностату та руксолітинабу при лікуванні раку, такого як мієлопроліферативне новоутворення

Info

Publication number: UA112645C2
Application number: UAA201313570A
Authority: UA
Inventors: Фаб'єн Баффер; Томас Радімерскі; Браян Гедбоу
Original assignee: Новартіс Аг
Priority date: 2011-06-14
Filing date: 2012-06-13
Publication date: 2016-10-10
Also published as: MA35168B1

Abstract

Винахід стосується комбінації, яка включає: (а) Сполуку A ((R)-3-(4-(7H-піроло[2,3-d]піримідин-4-іл)-1Н-піразол-1-іл)-3-циклопентилпропаннітрил) Формули (А)(A)або її фармацевтично прийнятну сіль; та (b) Сполуку В (N-гідрокси-3-[4-[[[2-(2-метил-1Н-індол-3-іл)етил]аміно]метил]феніл]-2Е-2-пропенамід) Формули (В)(В)або її фармацевтично прийнятну сіль; для одночасного, паралельного, окремого або послідовного застосування, особливо для застосування при лікуванні проліферативних захворювань. Винахід стосується також фармацевтичних композицій, що містять таку комбінацію, та способу лікування такою комбінацією проліферативних захворювань у ссавця, зокрема людини. Даний винахід також додатково стосується комерційної упаковка або продукту, що містить таку комбінацію.

Description

(54) КОМБІНАЦІЯ ПАНОБІНОСТАТУ ТА РУКСОЛІТИНАБУ ПРИ ЛІКУВАННІ РАКУ, ТАКОГО ЯК

МІЄЛОПРОЛІФЕРАТИВНЕ НОВОУТВОРЕННЯ

(57) Реферат:

Винахід стосується комбінації, яка включає: (а) Сполуку А ((К)-3-(4-(7Н-піроло|2,3-4|піримідин-4- іл)-1Н-піразол-1-іл)у-3-диклопентилпропаннітрил) Формули (А)

М й - с ло й

М | Х се

М

М й (А) або її фармацевтично прийнятну сіль; та (Б) Сполуку В (М-гідрокси-3-(4-((2-(2-метил-1Н-індол-3- іл)етиліаміно|метил|феніл|-2Е-2-пропенамід) Формули (В) (в) чі он одух

Н Н

М

(В) або її фармацевтично прийнятну сіль; для одночасного, паралельного, окремого або послідовного застосування, особливо для застосування при лікуванні проліферативних захворювань. Винахід стосується також фармацевтичних композицій, що містять таку комбінацію, та способу лікування такою комбінацією проліферативних захворювань у ссавця, зокрема людини. Даний винахід також додатково стосується комерційної упаковка або продукту, що містить таку комбінацію.

М й - с ло - чт | Х -

М дв) (в) он дух

Н Н

М

(В)

Галузь техніки

Винахід відноситься до комбінації, яка включає: (а) Сполуку А (назва: (К)-3-(4-(7Н-піроло|2,3-4|піримідин-4-іл)-1 Н-піразол-1-іл)-3- циклопентилпропаннітрил) Формули (А): й с ле ря се мн (А) або її фармацевтично прийнятну сіль; та (Б) Сполуку В (назва: М-гідрокси-3-І4-((2-(2-метил-1Н-індол-З3-іл)-етил|-аміно|метиліфеніл|- 2Е-2-пропенамід) Формули (В): о) др

Н Нн

М чі й (в), або її фармацевтично прийнятну сіль; для одночасного, сумісного, окремого або послідовного застосування, особливо для застосування при лікуванні проліферативних захворювань. Винахід також відноситься до фармацевтичних композицій, що включають таку комбінацію, та до способу лікування проліферативних захворювань у ссавця, зокрема, людини, за допомогою такої комбінації. Крім того, даний винахід також відноситься до комерційного упакування або продукту, що включає таку комбінацію.

Передумови винаходу

Мієлопроліферативні новоутворення (МРМ) являють собою групу захворювань, які викликають надпродукцію клітин крові (тромбоцитів, лейкоцитів та еритроцитів) у кістковому мозку. МРМ включають справжню поліцитемію (РМ), первинну або есенційну тромбоцитемію (ЕТ), первинний або ідіопатичний мієлофіброз, хронічний мієлогенний (мієлоїдний) лейкоз (СМ), хронічний нейтрофільний лейкоз (СМ), ювенільний мієломоноцитарний лейкоз (МІ) та хронічну еозинофільну лейкемію (СЕ )/гіпереозинофільний синдром (НЕ5). Ці розлади групують разом, оскільки мають деякі або всі з наступних властивостей: ураження мультипотентних гемопоетичних прогеніторних клітин, домінування трансформованого клону над

Зо нетрансформованими гемопоетичними прогеніторними клітинами, надпродукція однієї або більше гемопоетичних ліній під час відсутності певного стимулу, незалежне від фактору росту формування колоній іп мйго, підвищений вміст паренхіматозних клітин кісткового мозку, мегакаріоцитарна гіперплазія та дисплазія, порушення, що переважно зачіпають хромосоми 1, 8, 9, 13, 20, тромботичні та геморагічні діатези, надлишкове екстрамедулярне кровотворення, та спонтанна трансформація у гострий лейкоз або розвиток фіброзу кісткового мозку, але з невисокою швидкістю, у порівнянні із цим показником при СМІ. Захворюваність МРМ коливається в широких межах, починаючи приблизно від З на 100000 людей населення старше

60 років щорічно для СМІ. до 0,13 на 100000 дітей у віці від народження до 14 років щорічно для

УМ! (Магаїтап У.МУ. єї а!., Віоса 100 (7): 2292-302, 2002).

Відповідно, необхідні нові способи лікування МРМ, а також інших видів раку.

Короткий зміст винаходу

Надана комбінована терапія, що включає ЧАК-інгібуючу Сполуку А Формули (А) або її фармацевтично прийнятну сіль; та інгібуючу гістондеацетилазу (НОСАС) Сполуку В Формули (В) або її фармацевтично прийнятну сіль. Комбінована терапія придатна для лікування різних видів раку. Комбінована терапія також придатна для лікування будь-якого числа АК- опосередкованих захворювань та/"або НОАС-супутніх захворювань. Сполука А Формули (А) також відома як руксолітиніб. Сполука В Формули (В) також відома як панобіностат.

Комбінована терапія, представлена у даному документі, є корисною для лікування ЗАК- опосередкованого захворювання у суб'єкта. Відповідно, у одному аспекті, у даному документі надається спосіб лікування раку у суб'єкта, який цього потребує, що включає введення суб'єктові ефективної кількості композиції, описаної вище. У одному варіанті здійснення, рак являє собою мієлопроліферативне новоутворення. Необмежуючі приклади мієлопроліферативних новоутворень, які можна лікувати за допомогою комбінованої терапії відповідно до винаходу, без обмеження включають хронічний мієлоїдний лейкоз (СМ), справжню поліцитемію (РМ), есенційну тромбоцитемію (ЕТ), первинний або ідіопатичний мієлофіброз (РМЕ), хронічний нейтрофільний лейкоз, хронічну еозинофільну лейкемію, хронічний мієломоноцитарний лейкоз, ювенільний мієломоноцитарний лейкоз, гіпереозинофільний синдром, системний мастоцитоз та атиповий хронічний мієлогенозний лейкоз.

У одному варіанті здійснення цих способів лікування, суб'єктом є людина.

У іншому варіанті здійснення, лікування містить у собі спільне введення Сполуки А та

Сполуки В.

У іншому варіанті здійснення, Сполука А та Сполука В знаходяться у одному складі або одиничній лікарській формі.

У ще одному варіанті здійснення, лікування містить у собі введення Сполуки А та Сполуки В практично одночасно або у різний час.

Зо У іншому варіанті здійснення способу, Сполуку А вводять суб'єктові, після чого вводять

Сполуку В.

У ще одному варіанті здійснення, Сполуку В вводять суб'єктові, після чого вводять Сполуку

А.

У іншому варіанті здійснення способу, Сполуку А та/або Сполуку В вводять у кількостях, які не були б ефективними, коли одну з або обидві сполуки вводять окремо, але які ефективні у комбінації.

Короткий опис креслень

Фіг. 1 показує масу тіла після періоду лікування Сполукою А та/або Сполукою В.

Фіг. 2 та З показують ефект лікування на рівні Віо!. через 7 днів терапії, тобто на 11-ий день після ін'єкції клітин (лікування почато на день 4 після ін'єкції клітин).

Фіг. 4 показує масу селезінки після 8 днів лікування.

На Фіг. 5 та 6 показаний результат РО-маркерного аналізу (екстрактів селезінки) через 2 години після терапії.

Фіг. 7 та 8 показані самки мишей Ваїр/с, трансплантованих ЧАК2МУ617Р-трансдукованими клітинами кісткового мозку, що одержували носій, Сполуку В у дозі 8 мг/кг і.р. (еквівалент вільної основи) за схемою МЛ/Л/Е, Сполуку А у дозі 60 мг/кг (еквівалент вільної основи) ді2и або комбінацію обох агентів протягом 21 дня підряд. Зміни маси тіла та маси селезінки при забиванні представлені як середнє ж стандартна похибка середнього. М-9/групу. Середнє значення нормальної маси селезінки самок Ваїр/с знаходиться у діапазоні 100 мг. "р«0,05 на

БО день забивання (однобічний дисперсійний аналіз із наступним тестом Юиппей або тестом Т'юкі.

Значення маси селезінки у реципрокній формі були використані для статистичного аналізу).

Фіг. 9-12 показують ВаЇІр/с самок мишей, трансплантованих ЧАК2МУ617Р-трансдукованими клітинами кісткового мозку, що одержували носій, Сполуку В у дозі 8 мг/кг і.р. (еквівалент вільної основи) за схемою М/ЛЛ/Е, Сполуку А у Бій-дозі 60 мг/кг (еквівалент вільної основи) або комбінацію обох агентів протягом 21 дня підряд. У день забивання кров збирали та аналізували з використанням аналізатору крові Зузтех. М-7-9 /групу (деякі зразки у групі комбінації Сполука

А/Сполука В не піддавалися аналізу. 1 викид був зафіксований у групі з носієм (ІО 3) та 1 викид у групі із Сполукою А (ІО 27) у день забивання на підставі аналізу у сторонній програмі сгарп

Рад ОпіскК саїс5 (аналіз даних був здійснений з усіма значеннями). Фіг. 9: Неї; фіг. 10: кількість бо ретикулоцитів; Фігура 11 : кількість тромбоцитів; Фіг. 12: кількість лейкоцитів у крові. "р«0,05 у день забивання (однобічний дисперсійний аналіз із наступним тестом Юиппей або тестом Т'юкі для множинних порівнянь на І0діо трансформованих значеннях для кількості лейкоцитів та тромбоцитів).

Фіг. 13-16 демонструють репрезентативні зображення забарвлення кісткового мозку самок мишей ВаїЇБ/с, яким були пересаджені клітини туУАК2МУб617Р-ІВЕ5-ОЕР та яких лікували

Сполукою В у дозі 8 мг/кг і.р. (еквівалент вільної основи) за схемою МЛАЛ/Е, Сполукою А у дозі 60 мг/кг (еквівалент вільної основи) д21п або комбінацією обох агентів протягом 21 дня підряд.

Фіг. 17-19 демонструють репрезентативні зображення забарвлення селезінки самок мишей

Ва!р/с, яким були пересаджені клітини туАКк2М617Р-ІВЕ5-ОЕР та яких лікували Сполукою В у дозі 8 мг/кг і.р. (еквівалент вільної основи) за схемою М/ЛЛ/Е, Сполукою А у дозі 60 мг/кг (еквівалент вільної основи) д21п або комбінацією обох агентів протягом 21 дня підряд.

Фіг. 20 ілюструє схему дослідження та способи.

Фіг. 21 ілюструє довжину селезінки, що пальпується, із часом у Групі 1.

Фіг. 22 ілюструє довжину селезінки, що пальпується, із часом у Групі 2.

Фіг. 23 ілюструє довжину селезінки, що пальпується, із часом у Групі 3.

Докладний опис

Було виявлено, що введення комбінації (а) Сполуки А (К)-3-(4-(7Н-піроло|2,3-4|піримідин-4-іл)-1 Н-піразол-1-іл)-3- циклопентилпропаннітрил) Формули (А):

М

(о:

ЛІ

- -ь мн (А) або її фармацевтично прийнятної солі; та (Б) Сполуки В (М-гідрокси-3-І4-((2-(2-метил-1 Н-індол-З3-іл)-етил|-аміно|метилі|феніл|-2Е-2- пропенамід) Формули (В): (в) чі пан

Н Нн

М й (В), або її фармацевтично прийнятної солі;

Зо забезпечує дивні синергетичні ефекти при лікуванні раку у суб'єкта. Такий підхід - комбінація або одночасне застосування двох типів агентів - може виявитися корисним для лікування осіб, що страждають від раку, які не реагують на або стійкі до доступних наразі способів лікування.

Комбінована терапія, надана у даному документі, також корисна для підвищення ефективності та/або зниження побічних ефектів доступних у цей час способів лікування раку у осіб, які реагують на такі терапії.

Конкретні терміни, використовувані у даному документі, описані нижче. Сполуки відповідно до даного винаходу описуються за допомогою стандартної номенклатури. Якщо не визначене інакше, усі технічні та наукові терміни, використані у даному документі, мають той же зміст, який мається на увазі будь-яким фахівцем у галузі, до якої цей винахід належить.

Сполука А та її фармацевтично прийнятна сіль(солі) описана у літературі, наприклад, у

Патенті США 7598257. Сполука А також відома як руксолітиніб.

Сполука В та її фармацевтично прийнятна сіль(солі) описана у літературі, наприклад, у

Патентах США 6833384; 7067551; та 6552065. Сполука В також відома як панобіностат.

Якщо не зазначене інше, або чітко зазначене у тексті, посилання на сполуки, корисні при проведенні комбінованої терапії відповідно до винаходу, включають як вільну основу сполук, так і всі фармацевтично прийнятні солі цих сполук.

Як використовується у даному документі, термін "фармацевтично прийнятні солі" відноситься до нетоксичної кислоти або солей лужноземельних металів піримідинових сполук відповідно до винаходу. Ці солі можуть бути підготовлені іп 5йи у ході кінцевої ізоляції та очищення піримідинових сполук, або шляхом окремого реагування основних або кислотних функцій з підходящою органічною або неорганічною кислотою або лугом, відповідно.

Представники солей включають, як необмежуючі приклади, наступні: ацетат, адипінат, альгінат, цитрат, аспартат, бензоат, бензолсульфонат, бісульфіт, бутират, камфорат, камфорсульфонат, біглюконат, циклопентанпропіонат, лаурилсульфат, етансульфонат, глюкогептаноат, гліцерофосфат, гемісульфат, гептаноат, гексаноат, фумарат, гідрохлорид, гідробромід, гідройодид, 2-гідроксиетансульфонат, лактат, малеат, метансульфонат, нікотинат, 2- нафталінсульфонат, оксалат, памоат, пектинат, персульфат, З3-фенілпропіонат, фосфат, пікрат, півалат, пропіонат, сукцинат, сульфат, тартрат, тіоціанат, п-толуолсульфонат та ундеканоат.

Крім того, основні азот-вмісні групи можуть бути кватернізовані з такими агентами, як алкілгалогеніди, наприклад: метиловий, етиловий, пропіловий, бутиловий хлорид, броміди, йодиди; діалкілсульфати, такі як диметил, діетил, дибутил та діамілсульфати, довголанцюгові галогеніди, такі як дециловий, лауриловий, міристиловий та стеариловий хлориди, броміди та йодиди, аралкілгалогеніди, такі як бензиловий та фенілетилові броміди, та інші. Тим самим отримують водо- або маслорозчинні або диспергуємі продукти.

Приклади кислот, які можуть бути використані для формування фармацевтично прийнятних солей приєднання кислот, включають такі неорганічні кислоти, як соляна кислота, гідроборна

Зо кислота, азотна кислота, сірчана кислота та фосфорна кислота, та такі органічні кислоти, як мурашина кислота, оцтова кислота, трифтороцтова кислота, фумарова кислота, винна кислота, щавлева кислота, малеїнова кислота, метансульфонова кислота, бурштинова кислота, яблучна кислота, метансульфонова кислота, бензолсульфонова кислота та п-толуолсульфокислота, лимонна кислота та кислотні амінокислоти, такі як аспарагінова кислота та глутамінова кислота.

Солі приєднання основ можуть бути підготовлені іп 5йи у ході остаточного виділення та очищення піримідинових сполук, або окремо шляхом реагування карбоксильних груп з підходящою основою, такою як гідроксид, карбонат або бікарбонат фармацевтично прийнятного катіону металу або аміаку, або органічним первинним, вторинним та третинним аміном.

Фармацевтично прийнятні солі включають, як необмежуючі приклади, катіони на основі лужних та лужноземельних металів, такі як солі натрію, літію, калію, кальцію, магнію, алюмінію тощо, а також катіони нетоксичного амонію, четвертинного амонію та аміну, у тому числі, як необмежуючі приклади, амоній, тетраметиламоній, тетраетиламоній, метиламін, диметиламін, триметиламін, триетиламін, етиламін і таке інше. Інші типові органічні аміни, корисні для формування солей приєднання основи, включають дієтиламін, етилендіамін, етаноламін, діеєтаноламін, піперазин, піридин, піколін, триетаноламін та т.п., та основні амінокислоти, такі як аргінін, лізин та орнітин.

Представленою у даному документі є комбінована терапія, що включає ОАК-інгібуючу

Сполуку А та НОАС-інгібуючу Сполуку В. Введення комбінації містить у собі введення комбінації у єдиному складі або одиничній лікарській формі, введення окремих агентів комбінації одночасно, але окремо, або введення окремих агентів комбінації послідовно за допомогою будь-якого підходящого способу. Дозування окремих агентів комбінації може потребувати більш частого введення одного з агентів(у) у порівнянні з іншим агентом(ами) у комбінації. Тому, для забезпечення відповідного дозування, упаковані фармацевтичні препарати можуть містити одну або кілька лікарських форм, що містять комбінацію агентів, та одну або кілька лікарських форм, які містять один агент із комбінацій, але не інший агент(и) комбінації.

Термін "єдиний склад", використовуваний у даному документі, відноситься до єдиного носія або засобу доставки, що створений для доставки ефективних кількостей обох терапевтичних агентів пацієнтові. Єдиний засіб доставки призначений для доставки ефективної кількості кожного з агентів, разом з фармацевтично прийнятним носієм або наповнювачем. У деяких варіантах здійснення, засіб доставки являє собою таблетку, капсулу, пігулку або пластир. У інших варіантах здійснення, засіб доставки являє собою розчин або суспензію.

Термін "одинична доза" використовується у даному документі для позначення одночасного введення пацієнтові, що проходить лікування, обох агентів разом, у одній лікарській формі. У деяких варіантах здійснення, одинична доза являє собою єдиний склад. У певних варіантах здійснення, одинична доза включає один або більше засобів доставки, такий, що кожен засіб доставки містить у собі ефективну кількість, принаймні, одного 3 агентів, поряд з фармацевтично прийнятними носіями та наповнювачами. У деяких варіантах здійснення одинична доза являє собою одну або більше таблеток, капсул, пігулок або пластирів, що вводяться пацієнтові у той самий час.

Термін "лікувати" використовується у даному документі для позначення зняття, ослаблення або пом'якшення, щонайменше, одного із симптомів хвороби у суб'єкта. У межах значень даного винаходу, термін "лікувати" також означає припинення, затримку початку (тобто період, що передує клінічному прояву захворювання або симптому захворювання) та/або зниження ризику розвитку або погіршення симптомів захворювання.

Термін "суб'єкт" має на увазі включення тварин. Приклади суб'єктів включають ссавців, наприклад, людей, собак, корів, коней, свиней, овець, кіз, кішок, мишей, кроликів, щурів та трансгенних тварин, відмінних від людини. У певних варіантах здійснення, суб'єкт є людиною, наприклад, людиною, що страждає від, піддається ризику страждати від, або потенційно здатна страждати від множинної мієломи.

Термін "приблизно" або "біля", як правило, означає у межах 20 95, більш переважно, у межах 10 95, та найбільш переважно, у межах 5 95 даного значення або діапазону. Крім того, особливо у біологічних системах, термін "приблизно" означає у межах приблизно Ід (тобто порядку величини), переважно у межах двох порядків даного значення.

Комбінація агентів, описаних у даному документі, демонструє синергетичний ефект. Термін "синергетичний ефект", використовуваний у даному документі, відноситься до дії двох агентів, що роблять ефект, наприклад, уповільнення симптоматичного прогресування раку або його симптомів, який більше, ніж просте додавання ефектів кожного препарату самих по собі.

Синергетичний ефект можна розрахувати, наприклад, використовуючи підходящі способи, такі як рівняння Зідтоїіад-Етах (Ноїога, М. Н. б. апа 5спеїіпег, ГІ. В., Сііп. Рпагтасокіпеї. 6: 429-453 (1981)), рівняння адитивності І оеме (І оєуе, 5. апа Миїізсппек, Н., Агсі. Ехр. Раїної! Рпаптасої. 1 14: 313-326 (1926)) та рівняння медіанного ефекту (Спои, Т. С. апа Таїаіау, Р., Адм. Епгуте

Веаш. 22: 27-55 (1984)) Кожне рівняння, згадане вище, може бути застосоване до експериментальних даних для створення відповідного графіку для сприяння оцінці ефектів комбінації препаратів. Відповідні графіки, пов'язані з рівняннями, згаданими вище, являють собою криву концентраційного ефекту, ізоболограмну криву та криву комбінаційного індексу, відповідно. "Ефективна кількість" комбінації агентів являє собою кількість, достатню, щоб забезпечити помітне поліпшення у порівнянні з контрольними клінічно спостережуваними ознаками та симптомами депресивного розладу, що зазнають лікування комбінацією. "Лікарська форма для перорального застосування" включає одиничну лікарську форму, встановлену або призначену для перорального застосування.

Способи лікування, що використовують комбінацію Сполуки А та Сполуки В

Винахід надає спосіб лікування ЗАК-асоційованих захворювань, наприклад, раку, наприклад, мієлопроліферативних новоутворень, у індивідуума, шляхом введення індивідуумові комбінації

Сполуки А та Сполуки В.

У одному з варіантів здійснення, наданими у даному документі є способи лікування ЧАК- асоційованого захворювання або розладу у суб'єкта (наприклад, пацієнта) шляхом введення індивідуумові, який потребує такого лікування, терапевтично ефективної кількості або дози комбінації відповідно до даного винаходу або її фармацевтичної композиції. "АК-асоційоване захворювання може включати будь-яке захворювання, розлад або стан, який прямо або побічно пов'язаний з експресією або активністю ЗАК, включаючи надекспресію та/або аномальні рівні активності. ЧАК-асоційоване захворювання може також містити у собі будь-яке захворювання, розлад або стан, який може бути попереджений, полегшений або вилікуваний за допомогою модуляції ЗАК-активності.

Приклади ЧАК-асоційованих захворювань включають захворювання, пов'язані з імунною системою, включаючи, наприклад, відторгнення пересадженого органу (наприклад, відторгнення алотрансплантату та реакцію трансплантат проти хазяїна).

Додаткові приклади ЧЗАК-асоційованих захворювань включають аутоімунні захворювання, бо такі як розсіяний склероз, ревматоїдний артрит, ювенільний артрит, цукровий діабет І типу,

системний червоний вовчак, псоріаз, запальні захворювання кишечнику, неспецифічний виразковий коліт, хвороба Крона, міастенія, імуноглобулінова нефропатія, аутоімунні захворювання щитовидної залози і таке інше. У деяких варіантах здійснення, аутоїмунне захворювання являє собою аутоїмунне бульозне захворювання шкіри, таке як вульгарний пемфігус (РУ) або бульозний пемфігоїд (ВР).

Додаткові приклади ЗХАК-асоційованих захворювань включають алергійні захворювання, такі як астма, харчові алергії, атопічний дерматит та риніт. Додаткові приклади ЧАК-асоційованих захворювань включають вірусні захворювання, такі як вірус Епштейна-Бара (ЕВУМ), гепатиту В, гепатиту С, ВІЛ, НТІМ 1, вірус вітряної віспи (МАМ) та вірус папіломи людини (НРМ).

Додаткові приклади ДАК-асоційованих захворювань або станів включають шкірні захворювання, такі як псоріаз (наприклад, вульгарний псоріаз), атопічний дерматит, шкірний висип, подразнення шкіри, сенсибілізація шкіри (наприклад, контактний дерматит або алергійний контактний дерматит). Наприклад, певні речовини, у тому числі деякі лікарські препарати при місцевому застосуванні можуть викликати сенсибілізацію шкіри. У деяких варіантах здійснення, захворювання шкіри піддають лікуванню введенням, принаймні, одного

УАК-інгібітору відповідно до винаходу.

У додаткових варіантах здійснення, ЗАК-асоційоване захворювання являє собою рак, у тому числі такий, який характеризується солідними пухлинами (наприклад, рак передміхурової залози, рак нирки, рак печінки, рак підшлункової залози, рак шлунку, рак молочної залози, рак легенів, рак голови та шиї, рак щитовидної залози, гліобластома, саркома Капоші, хвороба

СазхцЧетап, меланома та інші), гематологічні форми раку (наприклад, лімфома, лейкемія, така як гострий лімфобластний лейкоз, або множинна мієлома), рак шкіри, такий як шкірна Т-клітинна лімфома (СТСІ) та шкірна В-клітинна лімфома. Приклад шкірної Т-клітинної лімфоми включають синдром 5елагу та грибоподібний мікоз.

УАК-асоційовані захворювання також можуть включати такі, які характеризуються експресією мутантного УЗАК2, наприклад, що має, принаймні, одну мутацію у псевдо-кіназному домені (наприклад, "АК2М617Р).

УАК-асоційовані захворювання можуть також включати мієлопроліферативні захворювання (МРБ), такі як справжня поліцитемія (РУ), есенційна тромбоцитемія (ЕТ), мієлоїдна метаплазія з

Зо мієлофіброзом (МММ), хронічний мієлолейкоз (СМІ), хронічний мієломоноцитарний лейкоз (СММІ/У), гіпереозинофільний синдром (НЕ5), системне мастоцитне захворювання (5МСО) і таке інше.

Далі, У9АК-асоційовані захворювання включають запалення та запальні захворювання.

Приклади запальних захворювань включають запальні захворювання очей (наприклад, ірит, увеїт, склерит, кон'юнктивіт або споріднені захворювання), запальні захворювання дихальних шляхів (наприклад, верхніх дихальних шляхів, у тому числі носу та придаткових пазух, такі як риніт, синусит, або нижніх дихальних шляхів, у тому числі бронхіт, хронічна обструктивна хвороба легенів тощо), запальні міопатії, такі як міокардити, та інші запальні захворювання.

Комбінована терапія, описана у даному документі, може також застосовуватися для лікування ішемічних реперфузійних ушкоджень або захворювання або стану, пов'язаного із запальною ішемічною подією, такою як інсульт або серцевий напад. Комбінована терапія, описана у даному документі, може надалі застосовуватися для лікування анорексії, кахексії, або втоми, наприклад, таких як ті, що є результатом або пов'язаних з раком. Комбінована терапія, описана у даному документі, може надалі застосовуватися для лікування рестенозу, склеродерміту або фіброзу. Комбінована терапія, описана у даному документі, може також застосовуватися для лікування станів, пов'язаних з гіпоксією або астрогліозом, такими як, наприклад, діабетична ретинопатія, рак або нейродегенерація.

Наданими у даному документі є способи лікування захворювання, наприклад, мієлопроліферативного розладу, шляхом введення ефективної кількості Сполуки А та Сполуки

В індивідуумові, що страждає від хвороби. Кількість комбінації агентів ефективна для лікування захворювання. Важливо відзначити синергетичний ефект комбінації агентів: навіть якщо один або більше агентів, що вводяться окремо у певному дозуванні, можуть виявитися неефективними, при введенні у комбінації, у тому ж дозуванні кожного агенту, лікування є ефективним. Дози одного або декількох агентів у комбінації тому можуть бути менше, ніж схвалені ЕОА (Управління щодо санітарного нагляду за якістю харчових продуктів та медикаментів, США) дози кожного агенту.

Дозування

Оптимальна доза комбінації агентів для лікування хвороби може бути визначена дослідним шляхом для кожного індивідуума, використовуючи відомі способи, та буде залежати від ряду бо факторів, включаючи, але без обмеження, ступінь розвитку захворювання, вік, масу тіла,

загальний стан здоров'я, стать та дієту індивідуума; час та спосіб введення; та інші ліки, які приймає індивідуум. Оптимальні дози препарату можуть бути встановлені з використанням рутинних перевірок та процедур, які добре відомі у розглянутій галузі.

Кількість комбінації агентів, які можна комбінувати з матеріалами носіїв для виробництва єдиної лікарської форми, буде різнитися залежно від індивідуума, що проходить лікування, та конкретного режиму введення. У деяких варіантах здійснення, одиничні лікарські форми, що містять комбінацію агентів, як описано у даному документі, будуть містити кількості кожного агенту комбінації, які звичайно призначають, коли агенти вводять окремо.

Частота дозування може варіюватися залежно від використовуваного складу та конкретного стану, що піддається лікуванню або профілактиці. У цілому, використання мінімальних дозувань, достатніх для забезпечення ефективної терапії, є кращим. Пацієнти, як правило, можуть обстежитися на терапевтичну ефективність за допомогою аналізів, що підходять для стану, який піддається лікуванню або профілактиці, які повинні бути відомі фахівцям у розглянутій галузі.

Лікарська форма може бути підготовлена за допомогою різних традиційних способів змішування, здрібнювання та виготовлення, зовсім очевидних для фахівців у галузі хімії лікарських складів.

Лікарська форма для перорального застосування, що містить комбінацію агентів або індивідуальних агентів комбінації агентів, може бути у вигляді мікротаблеток, поміщених усередині капсули, наприклад, желатинової капсули. Для цього може бути використана желатинова капсула, як використовується у фармацевтичних препаратах, така як тверда желатинова капсула, відома як САРБИОСЕЇ, доступна від Рії7ег.

Багато з лікарських форм для перорального застосування, використовуваних тут, містять комбінацію агентів або індивідуальні агенти комбінації агентів у формі часток. Такі частки можуть бути спресовані у таблетку, що присутня у коровому елементі покритої лікарської форми, такої як лікарська форма з речовиною, що покращує смак лікарського засобу, покрита оболонкою спресована лікарська форма або шлункова покрита оболонкою лікарська форма, або можуть міститися у капсульній лікарській формі з осмотичною помпою, або іншій лікарській формі.

Зо Лікарські сполуки відповідно до даного винаходу присутні у комбінаціях, лікарських формах, лікарських препаратах, фармацевтичних композиціях та фармацевтичних складах, розкритих у даному документі, у відношенні, що знаходиться у діапазоні від 100:1 до 1:100, більш переважно, від 1:1 до 1:100, та ще більш переважно від 1:10 до 1:100.

У одному варіанті здійснення, при введенні людям, Руксолітиніб дається по 5 мг два рази на день (ВІС), Панобіностат призначають по 10 мг три рази на тиждень, один раз на два тижні (ТІМ

ОМ).

У одному варіанті здійснення, при введенні людям, Руксолітиніб дається по 10 мг ВІЮО,

Панобіностат призначають по 10 мг ТІМ/ ООМУ.

У одному варіанті здійснення, при введенні людям, Руксолітиніб дається по 15 мг ВІЮ,

Панобіностат призначають по 10 мг ТІМ/ ООМУ.

У одному варіанті здійснення, при введенні людям, Руксолітиніб дається по 15 мг ВІЮО,

Панобіностат призначають по 15 мг ТІМ/ ООМУ.

Панобіностат призначають по 20 мг ТІМ/ ООМУ.

Панобіностат призначають по 25 мг ТІМ/ ООМУ.

Панобіностат призначають по 30 мг ТІМ/ ООМУ.

У одному варіанті здійснення, при введенні людям, Руксолітиніб дається по 3-7 мг ВІО,

Панобіностат призначають по 8-12 мг ТІМ/ ООМУ.

У одному варіанті здійснення, при введенні людям, Руксолітиніб дається по 8-12 мг ВІО,

У одному варіанті здійснення, при введенні людям, Руксолітиніб дається по 10-20 мг ВІО,

Панобіностат призначають по 10-20 мг ТІМ/ ООМУ.

Панобіностат призначають по 10-30 мг ТІМ/ ООМУ.

У одному варіанті здійснення, при введенні людям, Руксолітиніб дається по 10-20 мг ВІО, 60 Панобіностат призначають по 10-30 мг ТІМ/ ООМУ.

Панобіностат призначають по 20-40 мг ТІМ/ ООМУ.

Оптимальні співвідношення, індивідуальні та комбіновані дозування та концентрації лікарських сполук, які дають ефективність без токсичності, основані на кінетиці доступності активних інгредієнтів у ділянках-мішенях, та визначаються з використанням способів, відомих фахівцям у розглянутій галузі.

Фармацевтичні композиції

Фармацевтичні композиції або комбінації, надані у даному документі, можуть бути перевірені у клінічних дослідженнях. Підходящі клінічні дослідження можуть являти собою, наприклад, відкриті дослідження з підвищенням дози препарату у пацієнтів із проліферативними захворюваннями. Такі дослідження доводять, зокрема, синергізм активних інгредієнтів комбінації відповідно до винаходу. Сприятлива дія на проліферативні захворювання може бути визначена безпосередньо через результати цих досліджень, які відомі як такі фахівцям у розглянутій галузі. Такі дослідження можуть бути підходящими, зокрема, для порівняння ефектів монотерапії з використанням активних інгредієнтів та комбінації відповідно до винаходу.

Введення фармацевтичної комбінації відповідно до винаходу може привести не тільки до сприятливого впливу, наприклад, синергічного терапевтичного ефекту, наприклад, відносно полегшення, затримки прогресування або пригнічення симптомів, але також до наступних надзвичайно сприятливих впливів, наприклад, до зменшення побічних ефектів, поліпшення якості життя, зниження захворюваності, у порівнянні з монотерапією застосування тільки одного з фармакологічно активних інгредієнтів, використовуваних у комбінації відповідно до винаходу.

Ще однією перевагою може бути те, що можуть бути використані більш низькі дози активних інгредієнтів комбінації відповідно до винаходу, наприклад, такі, що дозування найчастіше необхідні не тільки менші, але можуть також застосовуватися рідше, що може знизити частоту виникнення захворювання та ступінь важкості побічних ефектів. Це відбувається відповідно до побажань та вимог пацієнтів, що проходять лікування.

Одним завданням даного винаходу є створення фармацевтичної композиції, що містить кількість, яка може бути спільно терапевтично ефективною у спрямованості або профілактиці онкологічних захворювань, наприклад, мієлопроліферативного розладу. У цій композиції,

Зо Сполуку А та Сполуку В можна вводити спільно, одну за одною або окремо у одній комбінованій одиничній лікарській формі, або у двох окремих одиничних лікарських формах. Одинична лікарська форма також може являти собою фіксовану комбінацію.

Фармацевтичні композиції для окремого введення обох сполук або для введення у фіксованій комбінації, тобто окремої галенової композиції, що включає обидві сполуки, відповідно до винаходу, можуть бути підготовлені у порядку, відомому рег 5е, та є такими, які підходять для ентерального, такого як пероральне або ректальне, та парентерального введення ссавцям (теплокровним тваринам), включаючи людей, що містять терапевтично ефективну кількість, принаймні, одного фармакологічно активного комбінаційного партнеру самого по собі, наприклад, як зазначено вище, або у комбінації з одним або декількома фармацевтично прийнятними носіями або розріджувачами, що особливо підходять для ентерального або парентерального застосування.

Склади

Комбінації лікарських препаратів, надані у даному документі, можуть бути складені різними способами, очевидними для фахівців у галузі фармацевтичних складів. Різних властивостей вивільнення, описаних вище, можна досягти різними шляхами. Підходящі склади включають, наприклад, таблетки, капсули, пресовані покриті склади та інші склади, що легко вводяться.

Підходящі фармацевтичні склади можуть містити, наприклад, приблизно від 0,195 до 99,9 95, переважно від 195 до приблизно 60 95 активного(их) інгредієнту(ів). Фармацевтичні склади для комбінованої терапії для ентерального або парентерального введення, наприклад, такі у одиничних лікарських формах, такі як таблетки, покриті цукровою оболонкою, таблетки, капсули або супозиторії, або ампули. Якщо не зазначене інше, вони готуються за способом, відомим рег 5е, наприклад, за допомогою звичайних процесів змішування, гранулювання, покриття цукром, розчинення або ліофілізації. Слід визнати, що вміст одиниць комбінаційного партнера, що міститься у індивідуальній дозі кожної лікарської форми, сам по собі не обов'язково становить ефективну кількість, оскільки необхідна ефективна кількість може бути досягнута шляхом введення багатьох дозових одиниць.

Зокрема, терапевтично ефективну кількість кожного з комбінаційних партнерів комбінації відповідно до винаходу можна вводити одночасно або послідовно та у будь-якому порядку, та компоненти можна вводити окремо або у вигляді фіксованої комбінації. Наприклад, спосіб 60 лікування захворювання, відповідно до винаходу, може включати (ії) введення першого агенту

(а) у вільній формі або формі фармацевтично прийнятної солі та (ії) введення агенту (Б) у вільній формі або у формі фармацевтично прийнятної солі, одночасно або послідовно, у будь- якому порядку, у спільно терапевтично ефективних кількостях, переважно у синергічно ефективних кількостях, наприклад, у щоденних або періодичних дозуваннях, що відповідають кількостям, описаним у даному документі. Індивідуальні комбінаційні партнери комбінації відповідно до винаходу можна вводити окремо у різний час протягом усього курсу терапії або одночасно у розділених або одноразових комбінаційних формах. Крім того, термін "введення" також охоплює застосування проліків комбінаційного партнеру, які перетворюються іп мімо у комбінаційного партнера як такого. Поточний винахід, таким чином, слід розуміти як такий, що охоплює всі схеми такого роду одночасного або поперемінного лікування, та термін "введення" слід тлумачити відповідно.

Ефективне дозування кожного з комбінаційних партнерів, застосовуваних у комбінації відповідно до винаходу, може різнитися залежно від конкретної сполуки або використовуваної фармацевтичної композиції, способу введення, стану, що піддається лікуванню, ступеню важкості стану, що піддається лікуванню. Тому, режим дозування комбінації відповідно до винаходу, вибирається відповідно до багатьох факторів, включаючи способи введення та ниркову та печінкову функцію пацієнта. Будь-який клініцист або лікар може легко визначити та призначити ефективну кількість окремих активних інгредієнтів, необхідних для пом'якшення, протидії або зупинки прогресування стану.

Приклади

Дане відкриття у подальшому ілюструється наступними необмежуючими прикладами.

ПРИКЛАД А

Дослідження проводиться з метою перевірки ефективності комбінації Сполуки А та Сполуки

В на м'язах 5сід-реіде при введенні і.м. (у хвостову вену) з 1-105 Ва/ЕЗ клітин Ерок ЗХАК2М617Б-

Іс сіоп 8.

Протокол:

Тварини: 80 самок мишей 5сіа-реїде, 18-22 г (8 груп по 7 мишей, 24 виключені під час рандомізації).

Клітини: клітини Ва/ЕРЗ Ерок ЧАК2М617Р-ис сіоп 8.

Хеподеп-відображення всього тіла проводили у дні 4, 7, 9 та 11 після ін'єкції клітин.

Рандомізація тварин у групах лікування проводилась на основі біолюмінесценції (Віо!) на 4 день після ін'єкції клітин.

Мишача модель та протокол описаний у Ваїйегі еї аі, Мої. Сапсег Тег; 9(7), 1945, липень 2010 року.

Лінії тварини та клітинна лінія:

Клітинна лінія: Ва/гЗзЗЕрок ЗЧАК2М617Р-ис сіоп 8

Ген: ЧАКМ617Е

Число клітин/Ділянка ін'єкції: 1 х105 клітин у 200 мкл/хвостову і.м. ін'єкцію

Види: миша

Штам: СВ17/С.В-Ідн-15/:4ртв5 Тас-Рікасзесіа-Іувіс9м 7, хазяйства Тасопіс (повна назва Тасопіс)

Стать: жіноча

Вік: 22-24 г

Кількість: 80 мишей

Підготовка клітин та ін'єкція:

Реактиви: КРМІ1640 (амінований) 10 95 ЕС5 (амінований) 2ММ І-глутамін (амінований)

Пуроміцин, 1 мкг/мл (Зідта, Ії 036К4073)

Гігроміцин В, 100 мкг/мл (Іпмігодеп, Іюї В13871010)

Клітини Ва/ЕЗ Ерок ЧАК2М617Р-Ійс вирощували у КРМІ1640 з додаванням 10 95 ЕС5, 1 95 глютаміну, пуроміцину (1 мкг/мл) та гігроміцину (100 мкг/мл). Клітини розділяли кожні три дні (1:50) не раніше ніж за два тижні до експерименту. За день до ін'єкції клітини вирощували без яких-небудь антибіотиків (щоб уникнути можливих затримок у рості клітин іп мімо).

У день ін'єкції клітини збирали та ресуспендували у буфері НВ55 (105 клітин у 200 мкл).

Клітини вводили у хвостову вену за допомогою туберкулінового шприцу 270.

Визначення груп:

Група 1 (7 мишей): група носія (0,5 925 НРМО ро -- ОБМУ 5 95 ір).

Група 2 (7 мишей): Сполука В, 5 мг/кг, З рази на тиждень (МЛЛ/Р), ір - НРМС 0,5 9» ро.

Група З (7 мишей): Сполука В, 10 мг/кг, З рази на тиждень (МЛЛ/Е), ір - НРМО 0,5 95 ро. бо Група 4 (7 мишей): Сполука В, 15 мг/кг, З рази на тиждень (МЛЛ//Е), ір - НРМО 0,5 95 ро.

Група 5 (7 мишей): Сполука А, 79,2 мг/кг, два рази на день, ро ї- О5МУ5 95 ір.

Група 6 (7 мишей): Сполука А, 79,2 мг/кг два рази на день, ро я Сполука В, 5 мг/кг, З рази на тиждень (МЛЛ//РЕ), ір.

Група 7 (7 мишей): Сполука А, 79,2 мг/кг, два рази на день, ро ї Сполука В, 10 мг/кг, З рази на тиждень (МЛЛ//РЕ), ір.

Група 8 (7 мишей): Сполука А, 79,2 мг/кг, два рази на день, ро т Сполука В, 15 мг/кг, З рази на тиждень (МЛЛ//Е), ір.

Лікування проводяться одночасно.

Сполуки:

Сполука А являє собою монофосфатну сіль, 79,2 мг/кг (еквівалентно 60 мг/кг вільної основи), 10 мл/кг у 0,5 95 НРМО РНаптасоааї 603.

Склад, що містить Сполуки А: 522,7 мг Сполуки А (у формі монофосфатної солі) у 66 мл

НРМО РНаптасоаї 603 0,5 9.

Сполука В знаходиться у формі солі молочної кислоти, 15 мг/кг (еквівалентно 11,90 мг/кг вільної основи), 10 мг/кг (еквівалентно 7,94 мг/кг вільної основи) та 5 мг/кг (еквівалентно 3,97 мг/кг вільної основи), 10 мг/кг у ОБ5ММ 5 9 (В. Вгацп, Іої 395147).

Склад, що містить Сполуку В: 15 мг Сполуки В (у формі солі молочної кислоти) у 10 мл ОБУ 5 905, 10 мг у 10 мл О5МУ 5 95 та 5 мг у 10 мл О5МУ 5 95, відповідно.

Моніторинг та збір даних/зразків:

Тварин ідентифікують з використанням транспондерів та контролюють щоденно.

Біолюмінесценції записують за допомогою камери Хеподеп |(неінвазивна система відображення ІМІЗФ, Саїїрег) на 4 день, 7 день та 10 день після клітинної ін'єкції під ізофлурановою анестезією (3-5 95 об. ізофлуран, потік повітря - 0,8 л/хвил.). Тваринам вводили ідр. О-люциферин (корпорація Хеподеп, геї ХК-1001), у 150 мг/кг (10 мл/кг, масі). Анестезовані миші потім поміщаються у тепловізійну камеру для зйомки через 15 хвилин після ін'єкції люциферину.

Параметри Хеподеп: О/10 сек/теа/15 хвил.

Тварин рандомізували на 4 день та починали лікування, щонайменше, впродовж 6 днів, виходячи з самопочуття тварин, що одержували носій.

Зо Масу тіла (ВМУ) та самопочуття записують у протокол. Тварин забивають, якщо ВУ перевищує 15 95 2 дні підряд. Всіх мишей забивають, якщо більше ніж 50 95 тварин у кожній групі мертві.

Забивання, збір зразків: через 2 години після останньої дози Сполуки А; через 2 години після останньої дози Сполуки В; - масу селезінки при забиванні записують. - Зразки збирали та швидко заморожували у рідкому азоті та зберігали при -80 С до аналізу: - селезінка, ВМ, кров та печінка для РК-аналізу - селезінка для РО-маркерного аналізу (р-ЗТАТ5 (Сполука А) та ацетилювання білку (Сполука В)), - грудина для РО-маркерного аналізу (р-5ТАТ5 (Сполука А).

Результати Прикладу А:

Дози, виражені у еквіваленті вільної основи.

Таблиці 1.1-1.8 демонструють біолюмінесценцію у момент рандомізації для різних груп.

Таблиця 1.1 06111111111111117111111111111117540 1711111 2о4Е4О6 нини

Середнє 11111116

Квадратичневідхилення.д | 77777711 11111111 АбОБО6 (Стандартнапохибкасередньогої | 77777777 | 17465405

Таблиця 1.2

Група 2 Сполука В Кількість мишей Віо!. день 4 4 мг/кг 1367 8,51Е05 2330 1,06Е-06 4827 1,10Е-06 8199 1,40Е-06

БА 1,47Е-06 6505 1,89Е-06 3364 2,05Е-06 нини

Середнє///11Ї1Ї1111111111111111111111с1С 1,40Е-06

Квадратичневідхиленняд//-/://| (77777 4,42Е05

Стандартнапохибкасередньогої (| 00000 1,67Е--05

Таблиця 1.3 8 мг/кг 8,205 4578 1,06Е-06 4191 1,10Е-06 6127 1,39Е-06 3335 1,50Е-06 4942 1,86Е--06 2809 2,06Е 106 нини береднє////11Ї1Ї111111111111111111111с1С 1,40Е-06

Квадратичневідхилення.д/ | 11111111 4,А0Е05

Стандартнапохибкасередньогої (| 000000 1,66Е--05

Таблиця 1.4

Група 4 Сполука В Кількість мишей Віо!. день 4 12 мг/кг ню 4716 8,69Е05 91 2896 1,02Е-06 3748 1,10Е-06 2934 1,37Е 06 8255 1,51Е-06 1681 1,81Е-06 нин 5002 2,10Е-06 нини

Середнє///11Ї1Ї1111111111111111111111с1С 1,40Е-06

Квадратичневідхиленняд//-/://| (777777 4,А5Е05

Стандартна похибка середнього п 1,68Е--05

Таблиця 1.5

Група 5 Сполука А Кількість мишей Віо!. день 4 60 мг/кг 6132 8,80Е05 11116611 80СсС2С 9,78Е05 5782 ТТЕчО6

Продовження таблиці 1.5 60 мг/кг шини пиши шин: ПЕ ЕЕ С шн"шЄЮШИИИНИІПІ)Ь6бВОШІІМІІВІВОЛООТОТТТЯ

Середнє/-/://1СЇ777771111111111111111111111111111111111 вно

Квадратичневідхилення.д//-/:/ ОЇ 77777771 АТОвНО5 7 (Стандартнапохибкасередньогої | гг 81Бч05

Таблиця 1.6 ше І

Сполука А 60 мг/кг Кількість мишей Віо!. день 4

Сполука В 4 мг/кг а

Середяє/-/-/:/://1СЇ7111111111111111111111111111111111111111ЕНЄ

Квадратичневідхиленняд//-/:/ | 77777111 1111111 4еЕНОВ 7 (Стандартнапохибкасередньогої | гг | 8806

Таблиця 1.7 ше І

Сполука В 8 мг/кг а

Середнє/-/-/:/ ССС! лазенО677

Квадратичневідхиленняд//-/:/ | 77777711 1111111 БАЛЕНОВ 7 (Стандартнапохибкасередньогої | гео

Таблиця 1.8 ше

Сполука В 12 мг/кг

Продовження таблиці 1.8

Група 8

Сполука В 12 мг/кг нини

Середнє 11111111 148406

Квадратичневідхилення.д//-/:// | 77777111 11111111 6675 (Стандартнапохибкасередньогої | 77777771 25205

Фіг. 1 демонструє масу організму у період лікування Сполукою А та/або Сполукою В. При комбінуванні Сполуки А та Сполуки В ніяких суттєвих змін у переносимості не відмічається.

Фіг. 2 та З демонструють ефект лікування на рівні Віо!. через 7 днів терапії, тобто 11-ий день після ін'єкції клітин (лікування почате на день 4 після ін'єкції клітин).

Фіг. 4 показує масу селезінки, масу через 8 днів лікування.

Фіг. 5 та 6 демонструють результат РО-маркерного аналізу (екстракти селезінки) через 2 години після терапії.

У таблиці 2 показаний ефект лікування на відносне збільшення у Віойх.

Таблиця 2

Сполука А|Сполука А|Сполука А

Відносна змінау 1|7672279| 481-837 | 351-487" | 204515 | 717341377| 388-487" | 26731 | 529745

Віоїшх

Т/с в останній 100 27 20 11 40 22 15 За; день ( 95

Примітка:

Відносна зміна розраховується як: Віоїшх у останній день/Віоїих у перший день. х, ре0,05 у порівнянні з контрольною групою з носієм й, р«0,05 у порівнянні зі Сполукою А

З, р«е0,05 у порівнянні з Сполукою В у тій же дозі. (Однобічний дисперсійний аналіз з наступним тестом Т'юкі на Іод-перетворених значеннях для множинних порівнянь з усіма групами).

Т/С, розраховане як: (ті, що пройшли лікування/контролі): 100.

У відповідності з методом, описаним у Сіагке РЕ, Вгеавзі Сапзег Вез Тгєаї, 1997;

Х, відмічається незначний антагонізм; т, відмічається незначний антагонізм або адитивність; 8, відмічається незначна синергія або адитивність.

У Таблиці З приведені результати РК-аналізу через 2 години після лікування.

Таблиця З 01111110 | Кровммоль/л | Селезінканмольжх | Печінканмольлт | ВМ'нмоль/л

Сполука В 4 мг/кг вІО 1,40530,19 0,18:0,02 3,34530,35 2 години

Сполука В 8 мг/кг вІО 2,07-0,20 0,25:30,03 3,1730,36 2 години

Продовження таблиці З 01111110 | Кровммоль/л | Селезінканмольл | Печінканмольл | ВМ'нмоль/л

Сполука В 12 мг/кг во 3,6450,53 0,6350,13 7,325-1,44 2 години

Сполука А 60 мг/кг 1,96520,33 1,28:-0,28 4,54--1,38 1,4020,65 2 години

Сполука А 60 мг/кг

Сполука ВІ2,78:0,46 | 0,02:50,01 | 1,15:2-0,19 |2,80:5-0,37 | 3,49:3-0,54 | 0,30:5-0,05 | 2,59:3-0,61 | 6,15:-0,61 4 мг/кг 2 години

Сполука А 60 мг/кг

Сполука ВІ2,23:50,35 | 0,0350,00 | 1,02:-0,19 | 3,02:50,25 |2,91:3-0,40 | 0,32:5-0,02 | 1,92:30,33 | 8,43:2-0,94 8 мг/кг 2 години

Сполука А 60 мг/кг

Сполука В1І2,72:0,58 | 0,02:50,01 | 1,61-0,44 | 4,51:3-0,57 | 3,87:50,99 | 0,71:3-0,03 |2,29:50,29 | 9,81341,17 12 мг/кг 2 години

Всі дози приведені як еквівалент вільної основи. ВІ с): Нижче межі квантифікації.

Результати представлені як середнє х стандартна похибка середнього (5ЕМ), " рівні ВМ слід приймати з обережністю через проблеми з хроматограмою.

Наведені вище результати показують, що комбінація Сполуки А та Сполуки В є стерпною у механістичній мишачій моделі спрямованого клітинами Ва/ЕЗ Ерог ЧАК2М617Р-Іис лейкемічного захворювання (втрати маси тіла, порівнянні між групами монотерапії Сполуки В та Сполуки А їх

Сполуки В).

При оцінці поширення лейкозних клітин (індикація Хеподеп ВіоЇих), комбінація Сполуки А та

Сполуки В у дозах 60 мг/кг та 12 мг/кг, відповідно, продемонстрована істотна різниця у порівнянні із цими препаратами, прийнятими як монотерапія.

ПРИКЛАД В

Активність та переносимість інгібітору дезацетилази Сполуки В у комбінації з інгібітором

УАКІ1Т/2, Сполукою А, оцінювали у трансплантній ЧЗАК2Мб617 БЕ-Моделі кісткового мозку захворювання справжньою поліцитемією. Активність комбінації у цій моделі захворювання МРМ була перевірена у дозі 8 мг/кг В та 60 мг/кг Сполуки А. Як докладно показано нижче, комбінація

Сполуки В з інгібітором УАК1/2, Сполукою А, показала значне поліпшення у спленомегалії та гістології кісткового мозку та селезінки у порівнянні з кожним агентом окремо.

Трансплантація кісткового мозку та аналіз

Інфікування та трансплантація кісткового мозку

Експерименти щодо трансплантації кісткового мозку у мишей проводили, по суті, як описано у УМегпід еї а. (УМегпід, б., Мегсопег, Т., ОКабег., еї аІ. (2006) Ехргеззіоп ої "ЗАК2МУ617Е саизез а роїусуїпетіа мега-їКе дібєеабзе м/йй аззосіаїєдй туеїоїйБгов5іб іп а тигіпе Бопе татом Ігап5ріапі тоаеї. Віоса 107: 4274-4281). Коротко, мишей-донорів ВаЇБ/с (6-8 тижневі самці або самки,

Чарлз Рівер) лікували 5 днів до пересадження ВМ 5-фторурацилом (150 мг/кг, і.р., Зідта-Аїагіси, саї Ж Е6627). Клітини кісткового мозку мишей-донорів були зібрані за допомогою промивання стегон та гомілок. Після лізису червоних кров'яних клітин (5іетсеїШесппоіодіеєх, Гренобль,

Франція, Кат.207800), що містять ядро клітини культивували протягом 24 годин у середовищі для трансплантації (ЕРМІ-ТО 95 ЕС525 нг/мл ІЗ (80 Зузіет»5, АбБіпдіоп, Великобританія, саїй403-МІ), 25 нг/мл І.6 (КО Зузіет»5 саїй406- МІ) та 50 нг/мл фактору стовбурових клітин (50 Е, Віосопсері, АїІзспм/Ії, Швейцарія, саїфО-63120). Наступного дня, клітини засівали з 2х105 клітин/мл/лунку у б-лункові планшети у присутності 1 мл надосадової рідини, що містить віриони

Зо з 293Т, трансфікованих 10 мкг вектору р-МОСМ-ЧАК2МУ617Р-ІВЕ5-СЕР (модифікація вихідного вектору р-МЗСУ, придбаного від Сіопіесії)) та 10 мкг вектору рСІ-ЕСО (Ітдепех, сани 0045Р).

Після двох спін-інфекцій (2500 об./хвил. протягом 90 хвил. при 32 "С, Мийкйиде 1С-В, Негаєив) невідібрані інфіковані ВМ-клітини ресуспендували у збалансованому сольовому розчині Хенка (НВ55) перед клітинною ін'єкцією (1-3х106 залежно від ступеня інфікування) у хвостову вену опромінених летальною дозою реципієнтних мишей-самок ВаїЇр/с (усього 9 Гр або 7 Гр, отриманих, як дві 4,5- або 3,5 Гр-дози з інтервалом у 4 години) за допомогою пристрою для гама-опромінення ВІОВЕАМ 8000 (ВЕВІС Отрн, Німеччина).

Тварин контролювали щодня та забивали у випадку основних ознак дистресу (надмірна втрата маси тіла більше, ніж 2 дні підряд без поліпшення, у комбінації з повільністю та пілоерекцією).

Збір зразків та аналіз

Загальний аналіз крові та збір органів

Кров відбирали із хвостової вени або, при забитті, з порожньої вени голкою 20 о під анестезією ізофлюраном (термінальна процедура) та аналізували з використанням автоматизованого повного та диференційного лічильника клітин крові (капілярний режим за допомогою розведення 1:5 на аналізаторі крові Зузтех, ХТ2000їМ, Бузтех Оідйапа Ас,

Нордерштедт, Німеччина). Селезінки були зважені, щоб оцінити спленомегалію. Кров, селезінки, грудину та печінку збирали для фармакокінетики, фармакодинаміки.

Виявлення СЕР-позитивних клітин у зразках крові методом проточної цитометрії

Десять мікролітрів цільної крові були використані для виявлення циркулюючих СЕР- позитивних клітин. Коротко, кров поміщали у 96-лункові круглодонні планшети (Совіаг, саїж3795) та еритроцити (КВС) лізували у 200 мкл буферу для лізису червоних кров'яних клітин (Зідта, сані-7757). Після 7-хвилинного інкубаційного періоду у темряві на струшувачі планшетів клітини центрифугували (5 хвил., 300 9) та супернатант видаляли за допомогою перекидання планшету.

Після 3-х етапів промивання у ЕАСЗ-буфері (фосфат-буферизований сольовий розчин (О-РВ5),

Зо ЕВ5 та 0,02 95 азиду натрію), клітини, що містять ядра, ресуспендували у 200 мкл холодного ЕАС5-буферу та обробляли для виявлення СЕР за допомогою проточного цитометру

І ЗК (ВО Віозсіепсе5, Гейдельберг, Німеччина).

Гістологія (р-5ТАТ»5, ацетилгістон НЗ, ретикулін)

Грудини та селезінки збирали, фіксували у формаліні, підрівнювали, поміщали у парафін та

Зо нарізали (умовно) по 4 мкм за допомогою мікротому.

Фіброз кісткового мозку оцінювали на грудині за допомогою набору для просякнення сріблом волокон ретикуліну (Віо-Оріїса, саї.04-04080).

РО-маркер Р-5БТАТ5 Сполуки А та РО-маркер ацетильованого гістону НЗ Сполуки В оцінювали у селезінці та кістковому мозку. Коротко, селезінку повністю видаляли, зважували та поміщали на анатомічний лоток. Селезінку розрізали поперек на дві половинки, та дві рівні частини брали з середніх частин за допомогою скальпелю. Шматочки селезінки не повинні перевищувати 3-4 мм у товщину. Шматочки селезінки переносили у мічені гістокасети та фіксували зануренням у нейтральний забуферений формалін (МВЕ) 10 95 (об./06.) при кімнатній температурі (рН 6,8-7,2) (9.7. ВаКег, Мейдйе, Швейцарія). Об'єм закріплюючого розчину, щонайменше, у десять разів перевищував об'єм тканини. Грудини повністю видаляли, фіксували впродовж 48 годин у 10 95 МВЕ при кімнатній температурі, потім промивали у РВ5, декальцинували у буфері ЕДТА-лимонна кислота при рН 7,5 (Віосус отрбнН, ІисКепуаїае,

Німеччина) З рази х 24 години при 37 "С. Після останнього промивання у РВ5, тканини розрізали та встановлювали вниз поверхнею, що представляє інтерес, в універсальній гістокасеті наступною обробкою у ТРОС 150цо (Центр обробки тканини) для парафінізації. Від кожного тканевого парафінового блоку робили декілька зрізів товщиною З мкм на нарізаючому або ротаційному мікротомі (Мікгот Іпегпайопа! АС, Швейцарія), розташовували у водній ванні при 45"С, поміщали на мікроскопні слайди (Роїузіпе, ММУК Іпіегпайопаї, Левен, Бельгія) та висушували на повітрі у духовці при температурі 37 "С впродовж ночі. Слайди з висушеними зрізами тканини брали з духовки та поміщали у ємкість для слайдів лінійного забарвлювача

СОТ20 (Медіїе, Швейцарія) для повністю автоматизованого забарвлення НаУЕ (гематоксилін та еозин) або обробки для імуногістохімічного забарвлення (ІНС). Для ІНС, зразки зрізів тканини забарвлювали кролячим антитілом анти-фосфо 5ТАТ5 (клон С11С5) та кролячим антитілом анти-ацетилгістон НЗ (МійПроге, МА, ОБА), накривали покривним склом та висушували на повітрі.

Для гістологічного оцінювання, насиченість клітинами ВМ оцінювали на підвищений (Зк), нормальний (25) та знижений (15) вміст клітин. Структуру селезінки оцінювали як зруйновану (15) або збережену (0). Наявність мієлоїдних, еритроїдних клітин та клітин-адипоцитів оцінювали як 0, їж, 2, З за насиченістю клітинами. Для р-5ТАТ5 оцінки, дані цифрового 60 зображення слайду одержували зі скляних слайдів за допомогою слайд-сканера 7еї55 Мігах

(Програмне забезпечення 5сап боймаге, версія 1.12, 7еіє5 АС, Німеччина) з кінцевим 200х збільшенням. Усю автоматизовану кількісну оцінку слайдів р-ЗТАТ5-позитивних та -негативних ядер клітин проводили за допомогою програмного забезпечення Оеєїїпіеп5 есодпіоп (есодпіоп версія ХО 1.5, ЮОеїппіеп5 АС, Німеччина). Результати виражали у вигляді відсотку р-5ТАТЬ5 позитивних ядер від загальної кількості ядер. Забарвлення ацетильованого гістону НЗ оцінювали як 1, 2, З-- на основі інтенсивності забарвлення та числа позитивних клітин.

Вестерн-блот-аналіз для ацетильованого лізину

Заморожені зразки селезінки гомогенізували у лізис-буфері (КІРА-буфер: 50 мМ Тріс-НСЇ рн 7,2, 120 мМ Масі, 1 мМ ЕДТА, 6 мм ЕСТА рН 8,5, 1 95 МР-40, 20 мМ Мак з додаванням 0,1 95 5О5, 2 ММ ванадату натрію, 10 мМ пірофосфату натрію та однієї таблетки анти-протеїназного коктейлю (каталог Коспей1!1836145001) за допомогою гомогенізатору Роїукоп (ІКА

І арогтТесппік, Шкіка-Тигга-Т25, на повній швидкості впродовж 1 хвил.), з розміщенням зразків на льоді під час гомогенізації. Гомогенати потім центрифугували при 10000 об./хвил. (15 хвил., 4 7С), фільтрували через скловолокнисті фільтри та заморожували при -80 "С. Загальний зміст білку у гомогенатах вимірювали за допомогою набору для визначення білку ВСА (Момадеп, каталог 71285-3). 100 мкг тотального білку з кожного зразку розділяли за допомогою 4-12 95 гелів Мираде (Іпийгодеп, каталогму14028Х10) та переносили на мембрану РМОЕ (Мійроге Іттобійоп'М, кат ЯРМН20200, ВіПегіса, Масачусетео, США) за допомогою напівсухого блотингу (ВІОКАЮ, система для напівсухого переносу, кат.-й170-3940). Мембрани забивали у блокувальному розчині (595 ВА, 0,1 95, ГТмеєп-20 у РВ5) 1 годину при кімнатній температурі з наступним промиванням протягом 30 хвил. у РВ5, що містить 0,1 95 Гмуееп-20, зі змінами кожні 10 хвил.

Мембрани потім інкубували з первинним антитілом проти ацетильованого лізину (кроляче поліклональне антитіло проти ацетильованого лізину, Сеї! Зідпаїйпу, каталог Ж 9441), розведеним 1:1000 у РВ5, що містять 0,1 965 Гиееп-20 та 5 95 молока, протягом ночі при 4 "с.

Наступного дня мембрани промивали 30 хвил. у РВ5, що містить 0,5 95 Гувеп-20, зі змінами кожні 10 хвил., а потім інкубували 1 год. при кімнатній температурі з анти-кролячим вторинним антитілом, кон'югованим з НЕР, розведеним 1:2000 у РВ5, що містять 0,1 95 Гуееп-20 та 1 95

В5А. Мембрану знову промивали, як описано вище, та проявляли з використанням ЕСсСІ ж

Зо (Атег5Ппат Віозсіепсе5, каталог ЖКРМ 2132), щоб виявити у екстрактах селезінки ацетильований лізин.

Визначення загального білку за допомогою р-тубуліну або САРОН

Для визначення рівнів загального В-тубуліну, мембрана була відмита у РВ5, що містить 0,1 96 Тмеєп 20 та 2 96 505 протягом 30 хвил. при 60 "С, промивали від 4 до 5 разів у РВ5, що містить 0,195 Тмееп 20 та інкубували з первинним антитілом анти-В-тубулін (мишаче моноклональне антитіло анти-В-тубулін, бЗідта, кат-ЖТ-4026) у розведенні 1:5000 у РВ5, що містить 0,195 Тмеєеп 20 та 395 ВБА протягом ночі при 4 "С. Наступного дня, мембрану промивали протягом 30 хвилин у РВ5, що містить по 0,5 95 Тмееп 20, зі змінами кожні 10 хвилин, а потім інкубували протягом 1 години при кімнатній температурі з антитілом проти мишачого антитіла, кон'югованим з НЕР, розведеним 1:5000 у РВ5, що містить 0,1 95 Гуееп 20 та 1945 ВЗА. Мембрану промивали знову, як описано вище, та проявляли з ЕСІ для детекції білку Д-тубуліну.

Рівні САРОН детектували у такий спосіб: зразки заново наносили (40 мкг загального білку) та мембрану інкубували з первинним антитілом анти-ЗАРОН (кроляче антитіло анти-САРОН,

Сеї! бідпаїййпу, кат.й2118), розведеним 1:5000 у РВ5, що містить 0,1 95 Тмееп 20 та 3 95 ВЗА протягом ночі при 4 "С. Наступного дня, мембрану промивали 30 хвилин у РВ5, що містить 0,5 96 Тмееп 20, зі змінами кожні 10 хвилин, а потім інкубували протягом 1 години при кімнатній температурі із вторинним антитілом проти кролячого антитіла, кон'югованим з пероксидазою (СЕ Неайсаге, саї Ж МАЗ9З1), розведеним 1:1000 у РВ5, що містить 0,1 95 Ту'ееп 20 та 1 95 В5А.

Мембрану промивали знову, як описано вище, та проявляли з ЕСІ для детекції білюу ЗСЗАРОН у екстрактах селезінки.

Біоаналітика (І С/М5-М5) для кількісного аналізу Сполуки А та Сполуки В

Концентрації Сполуки А та Сполуки В у плазмі крові та тканинах визначали одночасно за допомогою аналізу ОРІ С/М5-М5. Тканини гомогенізували в рівному об'ємі ВЕРХ-води (Вода для хроматографії, МегсК), використовуючи систему Разі РгерфФ - 24 (М.Р. Віотедіса!5, Ігміпе,

СА, США). Після додавання 25 мкл суміші внутрішнього стандарту (1 мкг/мл) до аналітичних аліквот (25 мкл) крові або гомогенату тканин, білки осаджували додаванням шляхом додавання 200 мкл ацетонітрилу. Супернатант переносили у новий віал. Після випарювання досуха зразки знову розчиняли у 60 мкл ацетонітрилу/води (1/1 об./06.). Аліквоту (5 мкл) цього розчину 60 розділяли на колонку АСОШІТМ ОРІ С ВЕН С18 (Умаїеге М, розмір часток 1,7 мкм, 2,1х50 мм) з рухомою фазою, що складається із суміші 0,1 96 мурашиної кислоти у воді (розчинник А) та 0,195 мурашиної кислоти у ацетонітрилі (розчинник В). Використовувався програмований градієнт при витраті 600 мкл/хвил. Після врівноважування з 95 95 розчиннику А вводили 5 мкл зразку. Після латентного періоду у 0,25 хвил., зразок елюювали з лінійним градієнтом 5-100 95 розчиннику В протягом періоду 0,65 хвил. з наступним утримуванням 0,35 хвил. Колонку готували для наступного зразку шляхом повторного врівноважування понад 0,25 хвил. до початкових умов. Елюент зі колонки безпосередньо вводили у іонне джерело потрійного квадрупольного мас-спектрометру ТОЮ"М (Уу/аїегз Согрогаїоп, Мігога, Массачусетс, США), що контролюється програмним забезпеченням Маб5іупх!М 4.1. Моніторинг множинної реакції електророзпилювальної позитивної іонізації (Еб5БІї) використовували для М5/М5-детекції аналіту. Для Сполуки А був використаний попередник продукту іонного переходу 307,0 --» т/2 186,0. Одночасно був записаний попередник продукту іонного переходу 350,1 --» т/2 142,9 для

Сполуки В. Межа квантифікації (І 00) для обох сполук була встановлена у 9 нг/мл та 9 нг/г для плазми та тканин, відповідно (СМ та загальний ухил менше ніж 30 95). Регресійний аналіз та подальші розрахунки проводилися з використанням Оцчапі упх"мМ 4.1 (Місготав5) та Ехсе! "М 2007 (Місгозой). Концентрації невідомих зразків назад розраховували за площею піку співвідношень аналіт/І5 з каліброваної кривої, побудованої з використанням каліброваних зразків, внесених до контрольної крові або тканини, отриманих від тварин, що проходили лікування носієм.

Умови утримання

Мишей Ва!їБ/сВуЛсо (С. Кімег, Франція) тримали у автоклавних клітках (максимум 5 тварин у клітці). Цикл світлоллемрява являв собою наступний: 12 годин темрява, 12 годин світло (висвітлення з 6:30 ранку до 6:30 вечора). Тварин годували без обмеження зволоженими гама- опроміненими харчовими продуктами та автоклавною водою з антибіотиками (ВАСТЕЇМ з кінцевою концентрацією 4 мг сульфаметоксазоліму, 0,8 мг триметоприму), Коспе Рпапта Ас,

Кеїпасі, Швейцарія), 5 мл у 250 мл питної води), щоб допомогти відновленню тварин після опромінення та уникнути інфекції протягом перших 2 тижнів після трансплантації.

Тестуємі сполуки та склад

Сполуку В вводили у вигляді солі молочної кислоти за допомогою внутрішньовенної або внутрішньоочеревинної ін'єкції. Сіль молочної кислоти Сполуки В була складена у ізотонічному

ОБМУ (595 декстроза; В. Вгашп, Гої 395147) у концентрації 1,5 мг/мл, 1 мг/мл та 0,5 мг/мл, відповідно. Розчин залишався стабільним протягом 10 днів при кімнатній температурі. Лікування проводили З рази на тиждень у об'ємі 10 мл/кг. Кінцеві еквівалентні дози вільної основи становили, відповідно, 11,90, 7,94 та 3,97 мг/кг. На фігурах ці дози враховуються як цілі значення.

Монофосфатна сіль Сполуки А була складена у 0,5 95 НРМО (РНаптасоаї 603, бом Спетісаї!

Ріадцеійпе, ОБА) у концентрації 7,9 мг/мл. Розчин залишався стабільним при кімнатній температурі протягом 4 днів. Лікування проводили два рази на день у об'ємі 10 мл/кг. Кінцева еквівалентна доза вільної основи становила 60 мг/кг.

Дві сполуки давалися одночасно.

Статистика

Результати, показані на фігурах та у таблицях, представляють середнє ж стандартна похибка середнього. Процентну зміну маси тіла та абсолютних значень або перетворених значень (Ісд 10, або інші, як зазначено) для мас селезінки, число ретикулоцитів, еритроцитів,

Неї та гістологічні дані аналізували за допомогою непарного іІ-тесту або критерію суми рангів для порівняння однієї терапевтичної групи з групою, що отримувала носій, або однобічного дисперсійного аналізу з наступним тестом Юиппей для порівняння груп лікування з групою, що отримувала носій. Множинні порівняння здійснювали за допомогою тесту Т'юкі. Всі порівняння були зроблені у день забивання тварини. Рівень значимості був встановлений з ре«б0,05.

Розрахунки виконували за допомогою СгарпРаай Ргізт для М/іпадом/5 (сгарпРайд Зоїммаге Іпс.).

Результати Прикладу В:

Іп мімо ефективність та переносимість Сполуки А та Сполуки В у комбінації

Для перевірки гіпотези про те, що ефективність Сполуки В можна підвищити за допомогою комбінації із Сполукою А, мишей ВаїБр/с, трансплантованих ЧАК2МУб617ЕР-трансдукованими клітинами кісткового мозку, піддавали лікуванню Сполукою А у комбінації з ЗАК1/2 інгібуючою

Сполукою А. Дозу, що дає проміжну ефективність, вибирали для Сполуки А для того, щоб оцінити вплив різних доз речовини В у комбінації з ЗАК-інгібуючою Сполукою А.

Мишей рандомізували на 27-й день після ВМТ на основі значення Неї (67 95 у середньому у цьому експерименті, М-9/групу) та піддавали лікуванню Сполукою В (8 мг/кг, З рази на тиждень

ММУР, і.р.) та Сполукою А (60 мг/кг, ді2и, р.о.) як єдиним агентом або у комбінації. Сполука В бо окремо показала деяку втрату маси тіла (-5 95 у середньому). Ця втрата маси тіла була значно вище, коли Сполуку В комбінували із Сполукою А (-10 95 у середньому, на Фіг. 7 та Таблиця 4).

Сполука В, яку давали окремо, зменшувала масу селезінки, але не до норми. Сполука А продемонструвала тенденцію до зниження маси селезінки, але з високою варіабельністю (у діапазоні від 67 до 1153 мг). Комбінація збільшувала ефективність із точки зору маси/об'єму селезінки, яка була приведена у норму або навіть була нижче нормального первинного діапазону (у 6 з 9 тварин) після З тижнів лікування (Фіг. 8 та Таблиця 4). Комбінація показала тенденцію на наявність сильного ефекту на кількість ретикулоцитів (з дуже низькими значеннями, спостережуваними для деяких тварин (0,1х1012/л), але цей ефект не відрізнявся суттєво від такого для груп, що одержували один агент. Число лейкоцитів зменшувалося, коли

Сполуку В давали окремо та у комбінації із Сполукою А (незважаючи на відсутність лейкоцитозу у цьому експерименті, за винятком 1 тварини у групі з носієм та 1 тварини у групі зі Сполукою

А). Лікування Сполукою В окремо та у комбінації із Сполукою А впливало на число тромбоцитів (Фіг. 11). Тенденція до зниження алельного навантаження замісної індикації (зЕР-позитивних циркулюючих клітин) була виявлена у даному дослідженні для груп Сполуки В та комбінації (Табл. 4).

Зменшення вмісту паренхіматозних клітин кісткового мозку спостерігалося для всіх груп лікарського лікування (Комбінація » Сполука А - Сполука В). Лікування поліпшувало структури селезінки з найбільшим ефектом, спостережуваним у комбінованій групі (Комбінація » Сполуки

А » Сполуки В). Незважаючи на високу варіабельність, групи Сполука А та комбінації показали тенденцію до зниження показника фіброзу, що оцінювали за забарвленням ретикуліну на зрізах грудини.

Оцінка РО-маркеру за допомогою ІНС показала помітне зниження маркеру р-5ТАТ5 після лікування Сполукою А як єдиним агентом та у комбінації із Сполукою В. Явний ріст спостерігався для ацетильованого гістону НЗ, як замісної індикації інгібування дезацетилази, після лікування тільки однією Сполукою В або у комбінації.

Фіг. 13-19 ілюструють зображення кісткового мозку та/або селезінки при різних способах забарвлення.

Комбінована схема терапії не виявляла значного впливу на експозицію сполук у тканинах (Таблиця 5).

Зо Цей приклад показує, що комбінація Сполук А та В поліпшувала ефективність з точки зору маси/об'єму селезінки.

Таблиця 4

Результати у день забивання тварин

Зміна маси Маса Лейкоцити Тромбоцити Кількість - тіла(96) | селезінки (мг)! (х109л) (х109л) ретикулоцитів / 00 Неї СЕР- ді (середнє х (середнє х (середнє х (середнє х (Се1012л) Свусереднє ж позитивні ікування (середнє ж стандартна - стандартна стандартна стандартна стандартна стандартна похибка циркулюючі похибка похибка похибка похибка клітини (95) середнього) | середнього) | середнього) | середнього) похибка середнього) середнього)

Носій ОБМУ 10 мг/кг

Комбінація

Сполука В (8 х х х х

Сполука А (60 мг/кг)

Самки мишей Ваї!р/с, трансплантовані "АК2У617Е-трансдукованими клітинами кісткового мозку, отримували або носій, або Сполуку В у дозі 8 мг/кг і.р. (еквівалент вільної основи) по схемі МЛЛ/Е, або Сполуку А у дозі 60 мг/кг (еквівалент вільної основи) ді2і або комбінацію обох агентів впродовж 21 дня підряд. Зміни маси тіла та маси селезінки при забиванні представлені як середнє х стандартна похибка середнього. М-7-9/групу.

"р-е0,05 у порівнянні з носієм, й ре0,05 у порівнянні зі Сполукою А, т р«0,05 у порівнянні зі Сполукою В на день забивання (однобічний дисперсійний аналіз з наступним тестом Юиппей або тестом Т'юкі. Реципрокна форма значень маси селезінки та

Іод10-перетворені значення для кількості лейкоцитів та тромбоцитів були використані для статистичного аналізу). 1 викид у групах носія (388,3х109/л) та Сполуки А (139,9х109/л) для кількості лейкоцитів детектував нові значення середнього х стандартна похибка середнього без викидів, даних у квадратних дужках.

Таблиця 5

Рівні після терапії 11111110 | Кровмкмольлл | Селезінканмольлт | Печінканмольл Г|Кістковий мозок нмоль/л

Тшйш | софренювом 0оониям! 0 рнюою 0 рлеозю 8 мг/кг 0,035-20,0,010 10,04541,674 0,26420,045 2,70420,345 2 години би. рин о ряеюю 0 вино 0 ражюж 60 мг/кг 8,176:1,584 2,566:-0,346 6,53721,071 2.223ж0,393 2 години

Комбінація

Сполука А 2 години

Тварин відповідних груп дозування забивали через 2 години після останньої дози Сполуки В та/або Сполуки А, та кров, селезінку, кістковий мозок та печінку відбирали для РК-аналізу. Дози наведені тут як еквівалент вільної основи. У таблиці наведені середні рівні Сполуки В та

Сполуки А у крові (мкмоль/лі та тканинах (нмоль/г| 5 стандартна похибка середнього. М-:9/групу.

ПРИКЛАД С

Клінічне дослідження

Проводиться фаза 16, відкрите, багатоцентрове, одноплечове дослідження з підбору дози для оцінки безпеки та фармакокінетики комбінації для перорального застосування панобіностату та руксолітинібу у пацієнтів з первинним мієлофіброзом (РМР), післяполіцитемічним справжнім мієлофіброзом (РР-МЕ) або післяіїдіопатичним тромбоцитеміє- мієлофіброзом (РЕТ-МЕ).

Фіг. 20 демонструє схему дослідження та способи.

Це випробування має на меті встановити одне або декілька з наступних: (1) Встановлювати МТО та/або КРІЇЮ комбінації руксолітиніб та панобіностат у пацієнтів з

МЕ; (2) Оцінити безпеку перорального сумісного введення руксолітинібу та панобіностату пацієнтам з МЕ; (3) Охарактеризувати фармакокінетику руксолітинібу у різних дозах - як єдиного агенту, та при призначенні у комбінації з панобіностатом пацієнтам з МЕ; та/або (4) Охарактеризувати фармакокінетику панобіностату у різних дозах у комбінації з руксолітинібом у пацієнтів з МЕ.

Критерії включення:

А. Пацієнти мали документально підтверджений діагноз РМЕ, РРМУ-МЕ або РЕТ-МЕ, незалежно від їх статусу мутації ЧАК2 М617Е

В. Керуючись критерієм Всесвітньої Організації Охорони Здоров'я (ВООЗ) для РМЕ, дослідження включає пацієнтів, позначених як Проміжні-ї, -2 або з високим ризиком щодо критерію Міжнародної прогностичної системи балів (ІРЗ5) та маючих відчутну спленомегалію 25

Зо см нижче реберної дуги.

С. Пацієнти повинні були мати, щонайменше, 1 з наступних факторів ризику а. Наявність конституційних симптомів (зниження маси 210 95 вихідного значення у річному попередньому циклі 1, дні 1 (С1О1), незрозумілої лихоманки або рясного нічного потовиділення, що зберігаються протягом більше ніж 1 місяця). б. Вираженої анемії (гемоглобін «10 г/дл) продемонстрованої при огляді. с. Лейкоцитоз (зміна рівня лейкоцитів у крові »25х109/л). а. Циркуляційні вибухи 21 9. р. Підвищення дози керується байєсівською моделлю логістичної регресії з контролем передозування та залежить від дозообмежуючої токсичності (ОТ) у першому циклі, а також інших висновків безпеки.

Е. Кожна група дозування складалася з 23 оцінюваних пацієнтів.

Е. Дані для 29 пацієнтів при будь-якому заданому рівні дози будуть необхідні для визначення КР2О та/або МТО. б. У серійних зразках крові, зібраних після одноразової дози тільки руксолітинібу у день 1 та у комбінації з панобіностатом у дні 2 та 6, оцінюють концентрації у плазмі крові за допомогою тандему рідинної хроматографії та мас-спектрометрії.

Н. Фармакокінетичні параметри були отримані з використанням нерозділеного аналізу.

Результати

У дослідженні запропоновані 7 груп. Дослідження все ще продовжується, на сьогоднішній день є тільки дані з груп 1-3.

Таблиця 6 показує кількість хворих та підтип захворювання для Груп 1-3.

На Фіг. 21 показана пальпуєма довжина селезінки впродовж часу у Групі 1.

Таблиця 7 показує найкращу відповідь пальпуємої довжини селезінки та симптомну відповідь у Групі 1.

На Фіг. 22 показана пальпуєма довжина селезінки впродовж часу у Групі 2.

Таблиця 8 показує найкращу відповідь пальпуємої довжини селезінки та симптомну відповідь у Групі 2.

На Фіг. 23 показана пальпуєма довжина селезінки впродовж часу у Групі 3.

Таблиця 9 показує найкращу відповідь пальпуємої довжини селезінки та симптомну відповідь у Групі 3.

Таблиця 10 повідомляє про несприятливі прояви Класу 3/4 у Групах 1-3 з підозрілим відношенням до вивчення процедури. У Групі 1 або Групі З не спостерігалося ІТ або 5АЕ. У

Групі 2 відмічена 1 0 Т тромбоцитопенії 4 класу. Також були відмічені 1 ЗАЕ нудоти класу З та проносу класу 3. Клінічно значимого порушення ЕКГ на сьогоднішній день не виявлено.

Таблиця 6. Дозування руксолітинібу та панобіностату у Групах 1, 2 та З

Підвищення дози керується байєсовською моделлю логістичної регресії з контролем передозування та буде залежати від дозообмежуючої токсичності (ОЇ Т) у кожному циклі, а

Зо також інших висновків безпеки.

Кожна група дозування складалася з 23 оцінюваних пацієнтів.

Дані для 29 пацієнтів при будь-якому заданому дозовому рівні будуть необхідні для визначення КР2О та/або МТО.

Серійні зразки крові, зібрані після одноразової дози руксолітинібу самого по собі у 1 день, та у комбінації з панобіностатом у дні 2 та 6 оцінюють за концентраціями у плазмі за допомогою

І С-мМ5/М5.

РК-параметри були отримані з використанням некомпартментаційного аналізу.

Таблиця 6 нн Деннотцнні теннитннняня г. Терапевтичне дозування

Група захворювання Ж Всього пацієнтів пе) и ря уче 10 мг 11218 1915) вжво | пшооу 10 мг 213 219181 том 10 мг 81921915 | во | том

Таблиця 7

Найкраща відповідь довжини селезінки, що пальпується, та симптоматична відповідь у Групі 1 11111111 Змінаконституційнихсимптомів.:.7//://:/-З

Довжина селезінки, Нічна пітливість, що Незрозуміла лихоманка 95 втрата й й

Ше дев: і и найкраща відповідь »1 місяця впродовж »1 місяця пацієнтів

Пацієнт! |100956зменшення |Ї- /// |Усулена.:/7/:(хКУГУ((Г/Ї|Ї-. 777777

Пацієнт2 |569озменшення |Беззмін |(Усувена./-:/ /'/ /|- ' б

Пацієнт 3а4|2395 збільшення |- (Усулена // ф|Усулена.:7/7/7/7/:/у/(У/С/С:(КСУИ

Таблиця 8

Найкраща відповідь довжини селезінки, що пальпується, та симптоматична відповідь у Групі 2 11111111 Змінаконституційнихсимптомів.:.7/о-/://:/З--Ч

Довжина селезінки, Нічна пітливість, що Незрозуміла лихоманка 10 95 втрата й й

ШЕ ЯЕЕлвш в и найкраща відповідь »1 місяця впродовж »1 місяця пацієнтів

Пацієнтб /|6096зменшення |Беззмін. |- 9 |- /

Пацієнт7 /|2796зменшення )|- (|Усулвєна./:/ / |-

Пацієнт8 |б296зменшення )|- ф|Усулввна./:/ КИКЕ|- 77777777

Пацієнт9е |8езменшення |- /// |Усулвєна./:/ И 4///| ||- 77777771

Пацієнт10 (8495зменшення |Беззмін |Усулеєна./-:// ' б |-

Пацієнт 117 |(З0О96зменшення |- ф|Усулввна./:/ КО |- 77777777

Таблиця 9

Найкраща відповідь довжини селезінки, що пальпується, та симптоматична відповідь у Групі З (Штриховка вказує на те, що цей симптом не присутній у контролі) 11111111 Змінаконституційнихсимптом./б7/7/7/://НОСЗ

Довжина селезінки, Нічна пітливість, що | Незрозуміла лихоманка 10 95 втрата : о .

ШЕ авше Ен найкраща відповідь »1 місяця впродовж »1 місяця пацієнтів

Пацієнт174 )|З38Осзменшення |- ф|Усулена./:/ КИ - |- б 8бщ г Ф (

Пацієнт15 /|99сзменшення |- ф|Усулена.:/:/ ИО///З/|- 77777777

Пацієнт 162 |10096зменшення |Беззмін. |- 9 |/-

Пацієнт177 )|5З96зменшення |Беззмін. |-

Таблиця 10

Несприятливі прояви 3/4 ступеню у Групах 1, 2, та З з підозрілим відношенням до вивчення процедури? 5

Група 1 Група2 Група З

РАМ 10 мг РАМ 10 мг РАМ 10 мг Групи всіх

РиХ 5 мг РиХ 10 мг РиХ 15 мг доз М-18

М-5 М-8 М-5

Всього ////7777771111111111Ї11171101Ї113 112 | 6 системи, п (Тромбоцитопенія,п./ 7777771 Ї1101 11111110 12 (Всього шлунково-кишкових розладів, п | 0 2 .РФЇ 1 / 0 | 1

Пронос. 77777771 Ї1117101Ї111 10 ЇЇ 1 (Нудотаап./////777777777777777771111111Ї11101Ї111 110 ЇЇ 1

РАМ, панобіностат; КОХ, руксолітиніб а Пацієнти з декількома АЕ у первинну систему класу органів були враховані тільки один раз у рядку "всього".

Б Пацієнти з декількома випадками АЕ у одному лікуванні враховуються тільки один раз у категорії АЕ для цього лікування.

Не було виявлено ні одного І Т або ЗАЕ у групі 1 або групі 3.

У групі 2 повідомлялось про 1 ОТ тромбоцитопенію 4 класу.

Також були виявлені 1 5АЕ нудота класу З та пронос класу 3.

На сьогоднішній день клінічно значимих ЕКГ-аномалій не спостерігалося.

Клінічне дослідження на даний момент показує, що комбінація руксолітинібу та панобіностату, очевидно, добре переноситься та має перспективну активність. Низький степінь анемії 3/4 класу та тромбоцитопенії спостерігалися при вивчених до сих пір дозах руксолітинібу та панобіностату. Рані дані не вказують на можливі лікарські взаємодії між руксолітинібом та панобіностатом. Додаткові групи дозволять встановити оптимальну стратегію дозування для цієї багатообіцяючої комбінації при лікуванні МЕ-пацієнтів.

Список скорочень:

Скорочення Опис

Віа Вів іп дієт вит Трансплантат кісткового мозку

ТІМ Три рази на тиждень

ОМ Через тиждень

Свс Повний аналіз крові

ЕАС5 Сортувальник флуоресцентно- активованих клітин

Фетальна сироватка крові

ЕВ5 й . великої рогатої худоби

ЕС5 Фетальна теляча сироватка 5-ГО Б-фторурацил

СЕР Зелений флуоресціюючий білок

Гр Грей

Неї Гематокрит

На Забарвлення гематоксиліном/еозином год. годинаси)

ІНС імуногістохімія і.р. внутрішньочеревинна ін'єкція ім. внутрішньовенна ін'єкція

ІБ внутрішній стандарт тіЗ Інтерлейкін-3 миші ті 6 Інтерлейкін-б6 миші хвил. хвилинаси)

УАКТ/2 Янус-кіназа 1/2

МРМ Мієлопроліферативне новоутворення розклад:

МЕ понеділок/середа/п'ятниця

РО Фармакодинаміка

РК Фармакокінетика

РІТ Тромбоцити

РМ Справжня поліцитемія р.о. Рег о5 вво Червоні кров'яні клітини

ЗСЕ Фактор стовбурових клітин

СТАТ5 Перетворювач сигналів та активатор транскрипції 5

УНС Носій

Мво Білі кров'яні клітини

УМ Дикий тип

Claims

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Комбінація, що містить Сполуку А ((К)-3-(4-(7Н-піроло|2,3-4|піримідин-4-іл)-1Н-піразол-1-іл)-3- циклопентилпропаннітрил) Формули (А) М Й (о: ЛІ й М | Х з М М й (А) або її фармацевтично прийнятну сіль; та Сполуку В (М-гідрокси-3-І(4-((2-(2-метил-1Н-індол-3-іл)етиліаміно|метилІфеніл|-2Е-2-пропенамід) Формули (В) (в) С он оду Н Н М М (В) або її фармацевтично прийнятну сіль, причому зазначена комбінація призначена для лікування мієлопроліферативних новоутворень.

2. Комбінація за п. 1, яка додатково містить фармацевтично прийнятний носій(ї).

3. Комбінація за п. 1 у єдиному складі або одиничній лікарській формі.

4. Застосування ефективної кількості комбінації за будь-яким з пп. 1-3 для виготовлення лікарського засобу для лікування мієлопроліферативних новоутворень у суб'єкта, який цього потребує.

5. Застосування за п. 4, де мієлопроліферативне новоутворення вибиране з групи, що включає хронічний мієлоїдний лейкоз (СМІ), справжню поліцитемію (РУ), есенційну тромбоцитемію (ЕТ),

первинний або ідіопатичний мієлофіброз (РМЕ), хронічний нейтрофільний лейкоз, хронічну еозинофільну лейкемію, хронічний мієломоноцитарний лейкоз, ювенільний мієломоноцитарний лейкоз, гіпереозинофільний синдром, системний мастоцитоз та оатиповий хронічний мієлогенозний лейкоз.

6. Застосування за будь-яким з пп. 4-5, де суб'єктом є людина.

7. Застосування за будь-яким з пп. 4-5, де лікування передбачає сумісне введення Сполуки А та Сполуки В.

8. Застосування за будь-яким з пп. 4-5, де Сполука А та Сполука В знаходяться у єдиному складі або одиничній лікарській формі.

9. Застосування за будь-яким з пп. 4-5, де лікування включає практично одночасне введення Сполуки А та Сполуки В.

10. Застосування за будь-яким з пп. 4-5, де лікування включає введення Сполуки А та Сполуки В у різний час.

11. Застосування за п. 10, де у лікуванні суб'єкту вводять Сполуку В після чого вводять Сполуку

А.

12. Застосування за п. 10, де у лікуванні суб'єкту вводять Сполуку А, після чого вводять Сполуку

В.

13. Застосування за будь-яким з пп. 7-9, де Сполука А та Сполука В знаходяться у окремих складах або одиничних лікарських формах.

14. Застосування за п. 6, де у лікуванні руксолітиніб призначають по 3-7 мг два рази на день (ВІС), панобіностат вводять по 8-12 мг три рази на тиждень, один раз на два тижні (ТІМ ООММ).

15. Застосування за п. 6, де у лікуванні руксолітиніб призначають по 8-12 мг ВІО, панобіностат вводять по 8-12 мг ТІМ ООМУ.

16. Застосування за п. 6, де у лікуванні руксолітиніб призначають по 10-20 мг ВІО, панобіностат вводять по 8-12 мг ТІМ ООМУ.

17. Застосування за п. 6, де у лікуванні руксолітиніб призначають по 10-20 мг ВІО, панобіностат вводять по 10-20 мг ТІМ ООМУ.

18. Застосування за п. 6, де у лікуванні руксолітиніб призначають по 10-20 мг ВІО, панобіностат вводять по 10-30 мг ТІМ ООМУ. Зо 19. Застосування за п. 6, де у лікуванні руксолітиніб призначають по 10-20 мг ВІОЮ, панобіностат вводять по 10-30 мг ТІМ ООМУ.

20. Застосування за п. 6, де у лікуванні руксолітиніб призначають по 10-20 мг ВІО, панобіностат вводять по 20-40 мг ТІМ ООМУ.

б 4 - в : - р н р ' з. ,

Б З. ; - ка: 7 о я У й» - піди й «вн 2 За де я а В В 8- 1 а 4 «

й . - чн з г що У 1 й я: Гані ж Їж » У Ки й і хх се лав чу р еінй ше й - сення ме АК аканта нчучтифкачжтиетяня з Кк се ма я Е с -1 У сні - ЗЕ й в 2 ! шт Ж Є -- Шо о З з; ра й В

2 й. я що ря Ж х ; - в зу о 2 4 в 8 Дві теля початку лікувань -- Носій 0,5 95 НРМО я СОБМУ хх» Сполука А ВО мг/кг -- Сполука ВА мгйг : -йе сполука ВЯ4 мг/кг Сполука Або Мо -е- Сполука ВВ мг/кг -бу Спонука ВО мг/кг озСнотука Або МОЖ -ан Сцелука В12 мгАт -- Сполука В 2 мг/кг Сполука АБО МО хре0.05 у. Конерольної грухвх з носієм бзднобічний дисперсійний аналіз з мастунним тестом Опапейі

Фіг. 1 Носій Сполука В мгикг Сполука В мг/кг Сполука В 12 мг/кг дже со о йо где дея Я о я її а Як р | «Я оо ВА ОК тк а. ов ВХ і: о у «Ве з це Й ШО о Бе ля щ аа УК, СА уки о вх ку В, | ре ЗЯЕЛ йо ВЖЕ ШЕ зщи п. м жо ки ння НН ПИТИ Ловжнемя КО То в Ле М за оч ї РУШ Н - в дк ж і ст Ж. «2 пе Кя с 2 «шок ОО ше МЕ. ж вих » я ке А : З ЕМ щу - ше ж вив о БО оо - ЦИ р М, де це Я -ш-й ши ох. А В. ВК ГЕ: й, шу МК щу» оо єр и Лов ШОУ СС че Й ак Аа кН Ох я СІЙ Спат АБО ме Сполука БО мкг є Сляшука А ВО вас ж Сполука А бо мгкЕГоО ЕЕ пе ну в ; Зсщ. «полука мекг Сполука В 4 мкг Слоляека В 8 мк Сполука В'д мг/кг МЕ, их пли томи шко. по СО . «і м. ЗШ ШК «КО, АК Е Яр у ОМ я Мк. Ж соб щи мащкя; ТУ БЕ СВ ву Ві й. ж їла а в й же зб йо КО ше ва я Ге БО м Кк Би ОК тарас й В о. ША се сов сирі Б ШИЯ Фуко і МУ ко ЕЕ. ВХ А «тА о. піді тк М г ко АД т ко а о ж з щ щ А Ко. й ай». ой ни Ши дея Фо, ах, об ЛУ. вх, "жк ам Вк ев дл ве о, ії? мий БУ БОБ Еко ШИ ши ШМК. шок МУ МЕ о йбе й Моря у о вві фе а шк лою й, У, ах Фіг 2

4.ах1995 приток нетя ння тя и ктя ж тт т тт тт тт тт т Тент ттсттттнннтт : і Я ре. ! З Ек чі

Ж. Зх ЧЕ сб 3 1 не | не ої і гай і р й Н ее Н - 5 я «7 і що жі р, і ЕК | и Жох зе і гі і Б'Є Я ! ее : Кк і «с Н - Н ж7 - Р 7 шф тах к ах І «7 т І ї ; - нт Я ж Н й ах з і І ї й ва КУ Н Б ! « я паній ! г Н ж як" моно с а ! ех пе кс - 0,0 КО а пр виуссстй СЕК 4 б 5 15 12 о ДЕ після ін єкий клітин -- Носій 0595 НРМО к ОБУ «5 Сполука А ВОмМгйг -ке Сполука Б 4 мок -- Сполука ВаАмглжт ж Сводука А БО мет -- Сполука В 8 мМгг -У Сполука ВВмг/кг з Сполука А ВО МиКг -- Сполука 8 19 мг/л - Сполука ВО мг/кг «Сполука А бо мг

Фіг. З 25О й совки - : ди а бони д ; ШЕ Чости 3555 НО МО я ОБУУ Сполука Ва мли я Сполука АБО мож СЛИЗ Сполука ВА мой БУМ Спозука Ва вгйт зсСполука Аа мг Саолуюа ЕК мг/кг ЖЖ золука В? меж Сполука дво мАг Во Спопука Вій мох до гозаейневеен бен Сполука А ВО вагіт Е 1во0-і ЩЕ С я лот ї че сит, ще З і Ре : ше Ж В «оо. БЖ р-н вжєтю | Ж З ШЕ 033 БО ря 8 ШО 5 МО БЕН го «5 ше 0355 я ж й 5 от пики ПО (в, оввввввввввво: ре З Бо ПОЛО «ЛУК ЛУИЕя Дня ах вишня з ш Шен БО сен, Кедя А : М се 5 ше 5-3 МОЯ мб ОБ : роко 5 як 0325331 Я йжекя рою

2. я: Лк СО ; Ї де ДЗ о С о. Б ним, Кая ща Кп Еко ММ о фФа "веВлД «в Контрольне! трупи внорієм Зри0 05 ув. Сполуки ІВ З тіск дозою Премітки: сте пози заліз проводя на окупереуворених знодеввх з опцобіним лисиахійним звилрюм. з мета теріом Тьзкі дня моз поріваянь з) встма групами

Фіг. 4 ж М як Ме : . 5 Е Га 5 я : оз Б 55 НЕ ж з 5 2 2 со 5 -ї 5 в ге : : ж в ОО дж . Не й - ЩО я: г щ НЕ п -- в Я і сх. ГА я ї ж зразка: з т : ; - : - о ; 5 шо 3 «463 43 44 т 53 КМ ЕХ Ши Ї ОО Ко й ОВ МК М їх МО не ІЗ коссося 45 уж З ОО ох ХО : ОБ дитинки ОКХ Пе ОХ ХОМ Жан М ОК ОО й ОКХ КК: 1. : З я х се ж що ак К кн і МК сення и шк УКВ с р ОО щд с ре З пнпнетеннен с КОХ я що й с я її . ОО 5 Ти - ПООООВ о МИ М а п АтВ МО З уоквкикй ОК о не а дров ПЕК Ко : нашу мова ке ТИ соя ОКУ ниснекхх 85) МО ОВ ПУХКИМ Ох перех кОа ссср З МО осеук тк ПК АНИК ве ж похорон : ж Ох й 0. не пеня ї і п Є Те п. 6 ресстевессе о М о щі с ш КК й М ОК чт. 5 й ОК с ПО пон Й з5 Кк с совкевеннех пиши 8 нн В. о Б . Я А НК КО В Мер ПЕДА У ПЕК та ков с в ВАС с ОО В о . о ЕЕ ДО и Еш ОБ ПМК ОН ПА о ОВ в.о о о я ІК КОТ Енн ЕЕ, А КК ЕВ і. с ТОш Му НЯ ПОН ДЯ вв ко о ПІК ОК кн СЕК ЗЕД пи ШКО МИХ Ки у о о МО ТО КИНЕ ди ТУ ПИШНІ о СОН ши с КО я СНО З ДАО М ТИХ ОДНА с КОНЯ Пон У си дОКЕК роя же З ЗВ 1 СЕК ВО я ЕДОя СЯ Кен Тит ОХ КЕ ЩІ хх ПИКА КОМИ ЕК ПОШТОЮ КИ п, о о с я ЕК я ПДК ПО зе кра о Ех с о о. с о м ЗИСК ДИ Моя МОЯ СИМ Ми но її . о УМО Б о я ПН с о . й Іо оо КМ, ТМ. МЕНЕ ще ОПІЛИЛНИН Я МЕ ПИ с ПОН їй КД, дея руках ІДИ Ух Пр, Ко АК СНО ЗВ Я раю КО Коня СЕТ ЛК МЕ ЕК КИ КАК Не ДК КО ПЕ и ПК ПЕШАОМОя ПЕ с ЕЕ я ЗХ о о. с с п КАХ, Ся ОК ПК ТК ве ОДНЕ МОМ КЕ, Ацеи ЗА я ши КО Ки ИХ, КИКОКННИЯ їх я п не й В і о о с Ен Я ОКХ пе лвоваННі ях

, о. я ОБ У ПД ЕЕИ ПКМИКНН ПИ ПДМ КАХ ПеАсЖж в и. 1 АРМ п ее КМ іоЯ ПМК а Ко о я й ХМК с я с с Кия ЧАЕС о. с я . жк: с Зх КО СУЯ ВОК ПЕК Зо : с. с. 0 еВ Я СЕТ о МЕД ММЕИВИМ БО МКК КО о ДЗ ОНА Щ ОВ ій с з КАПІ ТЕКИ Петрик ПЕВ есте Овна ПО ша . о кеш ій ОО ря п о Б й МО ВОМ хе ії о і ЗВ ФУ ОБОХ оо пооннвни шк пинннн с . ІП ши ОО й пе ПОХеНея . ПУ КОХ СМ ООН ссо МОХ зво я Око ТИХ м ОН М, ЖИ. що ТП: ЗЛИХ й пили о й Зоб ОН пок ПЕ ІТ Ку зсорсавссяе СОЯ сс ї Ох КО с Етно ЕН М Ея Ка МУ ВХ ер Кк Є ПО У ке СЕУ й Б. Фі з сеї в. туб ОХ ЕК Гувуя і. 5 ОО що ХОДА КЗ з Му Є З 5 2 5 : 5 ГЕ с ї щ « Е й АЙ х т . і 7, в . з «Е . : й ла НУ зраз пи 5 І -- о зразия: я а - Е : В 2 5 : пат кв жх кююююття її : : Щ х сежжжих сшекідннния я ; КК З х. пон вотня Е 23 24 та ще ГОНКЯ МД дослскн т78 25 пнжжжжння ВО й нн КВ зх з ав. шо ША ОО пенежтення о Що ЗДЕенх. ТО. по В я ва 5: ох о ш ЩА. 5 - Хв СОКАХ НН Зк Я пе БО Я ОХ ЮК я о Я ВЕК Я СХ КОКОН -кк КУН пох Я В ІМ Е І пвовти Вон шо о. МТВ Дек ООН кіркою ах ех МК ОО ПОПУ с тей КК ик оз оес я ВЕ Й ов я сети сення М ХХ КК Ко зах жи УКечакнвя ня пи ОК т. сю п. ше ПА кво ооо ов СУК Ва я М МК ел квех Ме ОБ оо ВАН М, 4 ? п корон ВК КК БО шт Ат 125 КД. с ОА шо ши «Да -5 с СК» шик ПН ОХ Кто ЕК ОКО ВШ - аву з о КК М М ласо 5 кДда с З с не о с Ох Ск Песни пеня ЗО 2 Клд ХНИ Хо КК жеОУ тя ЛКК я сія о я с ко о ОВО СК ЕЕ Соя ЗХ ща 0. о ЕТ с 5 ща п с В тик АВ ОО о МеВ с с ОО ОКА ЕК с ке 5 - КК ю СУ Са КО ех о о За КД; с я с с де | о. п т ом ше ЛЕЖКЕ а ї ПО МАО ЖИМ пеня ЇЗ Ме ки с . - КОХ У ВОНО Я Рея со ПЕС К В ОК 5 . т8 Кде с пон о. а с с ; я Ох ВО ТОК у ПО с КЕ с ДОК ЗО КЕ ЗЕ о що ПО ЗК ее по о В шо Мо с шо т М п шо с 1 па -й 00 її КК у с ЗИ КК КВ Ме МОХ ЗЕ о 5 ОО ЯХ ХК СВК Ка 55 ай с ДОК з КО Ку о Я Б й с ОО З ж Ен ПОВ НО с са щ САКЕ У ХЕ УКХ Ме лу с що. десолеюея МУКАХ с ТУЖО ВОК преєктку КК УВА Во ОДНО ПО МО пкетсккеск НМ ОМ Кк Х ек ве Те МУКИ КУ ок ЗК пог КОН сх 0 КО ЛО п КВ пен ск С но кое нен ОКУ ХЕ ЕЕ ОУН ПЕ : ООН ОО ще 0. о МОЯ ОКО КОМ о о. щ "7 Фк шо Убупе ріг. 6 ши Щ і КВ ВИ

Зміна маси тіла після терапії Статнетиий ант: -- Носій Меб/ груну хрхО 05, оннюбічний дисперсінний ниаліз з е, зло мой касхУпним їестам Пмипец обо одлоасвуннй о сСтпежука Або мой люснерейний аналіз з наскеунвим тестом Жлекі для 40- А визжниних порінань ях день я педа ВМ СІ лень -ф- спюолуюк ВО8 МГ ікурявНя) Н «Шо Кохооація Спеалука Док Ах Слохука В зм я

55. . - Я й БУ б а і Ї їв й я : Коди г ; З Не рія й к С-і у а От п а о р І ки хлекфкатжекикі, ЕІ є їх в, 1» КУ -5 я й г ВЕ 1 7 ; й, ; ях Н

: . 19 | ; й ; а рон стр Дві зваля зпкувацця

Фі.

я. Ба ДУ ї хе Ефект лікування на спленомеганію у ПЧАКО У трансплантованих мишей тов --З пос Ж ШИ Сполука А во мгкг оо т сек г я ! ШО бСолука о БОВ Ммокг т-к Ж а З водо 5 ши зник Комбінація Сполука Ак. х Боо Сполука З З Ж З -щшї шо З г я З З й а00- - По щю ших Кк н о, 1 З но оо ! Не Мова ми ШРІ соя ЖК п а--3. праски ДК Сталпиличний аналіз: МеВ труну хр 005 одпобкчнй дисперсійний аналі? на транеформованнях значеннях з намлунцим тестом Омптпен або зицпобічний лисперейний аналі з настуцним леспамо Т'юкі для миожеаних порівняааь Фіг, 8

Е ї д ре й . Бо 80 пк в ш по А я- ж и . ів! о ш в Кк і М - і мае ОО ши "ее Ода А ух же 50 4 уч Е и и « до Ж я р жк Фо й Ки о а Е; щі "7 я! жа

5. ? а В 40 іч м! | Т І т т щ я- - - - - й о - Е х ра « « З КУ Гак гм - - т а Е 2 з 7 в х Не с Н 5, в я хи о с г 3 ш В Кк в й ї з вд Е ва вх ч -- Вт 5 - щ 7 в з т вс З й роя В що 5 З Бак! рен г т ЖК ж С КЕ ха а кот Ва У о 5) о КЕ жо се Я що во Сатвстечний ява: Меугрупу 7 лразків була викорнотано для аналізу для групи з коміннацією ж ред0 05 супроти групи з невієм, блясоїчний зиеперсійний заліз з наступним тестом Юнипей в день звбнвання МЕ між олициазцим або комоівовиним зцікувавням

Фіг. З 25-ї се Е че ; а ж в бо « Ж 2 Ф - 5 (З в по х в зай щ Е ж в 15- . хв ком м ра що Же ж і С ж ш х ря 10 ж . «ее о айй о й ж . «г в: Б З ший Ге! а вон г Б о Обов -- Фе" " х її

Ії .- ч А ж 8 В по ЗВА------ --«555. 8 6 як. - - ЩІ Ні - - г і т х хх ж и з й; Е Е Б Е « ч о Го. ж вх - я гЯ Я зх та 5 - Но Кк Ек я 7Е : - Ф 7 - що см Ка г га ФК « З жо вЖ - Е : т Щі ВА вт В Ба за ж х - віз Ф жо З дош Ба хм і г ОО ШОВ ок ЕЕ З Ж В ЕЕ ЕЕ Ж пен реч і Стаунетичний аналі: Меодруцу 7 зразків було вакористьзмо зля залізу дая груци з кометнацією ж р«0 05 супрета групи з нарієм, Сдеосрний лясперейний аналіз з-настунним тестом ютасц ко лень забизання МЕ між одиничним ло комопнованнм лкуваиням дн 10

І ж 8 і Е ! пн Антени Е і д і я 15004 а во і ж - я8 | ? А ЕЕ і и тих що і . Хв - я ? іні КУ 2- ї - ж ШІ "в чі -е т БЕ и у о п ' па І я те п . Р Ск 5004 | м - ж ж п Ї іш! ь А ім ' и яю Ов А ! " ін А Мо хе - ш - їв ж з 5 м с - ч а т Е ре є Е - х хх ія х Ж х - В БУ З ж «о «о Бе г КЕ Ед я З ви вм тк 7 ак ся Фк -щ КЕ. є ще їй ши ве За що -о Статистичний абз: Мейтрутпу 7 зразків було вихористано для зналізу ач труни з команацією жр005 супроти груша з носієм, двобічний дисперевбний аналіз з настуймим тестом Мааной в вень заснкяння М5 між одвничнне або хоманеувавнм дікуезинямМ

Фіг. 1 пят 2 вннадання 11 о 10- . че щу є щі я йо г в й ВВ в т шШ В шко 30 ї. т 5 920 а а х С КВ м МЕ Ф че жо Х зд- ж й 8 Н п п т ка Ж М! "Як -вд- рр нуту я - щ- ї- - ї- ж - ' Ка 23 а ХЕ а ру Е я ї Е « « ни ни ни НН нн и ше г ж ща рай Ф Ф то шОо- ж - ве тв « « СВЙ Ше - ві ВА ст вч ча ба кг о г хоОк Е Е З ба а Еш р - о Ко ще В м - ї- КЕ Г5я 5 5 В ЕЕ що ов Стизистичний знилі: Меолруву 7 зрозків було використано для зваліу для групи з кознинацією Же - стих іхолій : - х реб,05 Однобічний днеперсійний аналіа з звотунним зеотом Глией на ор трансформованих зваченнях збо одиосічний дисперсійний аналіз з нвезупним тестом Ток для мпожнихих попівнянь в день забнхтя Фіг, 12

- - На забарвлення, зображення кістков: арвлення, зображення кісткового мозку оплот что теку спо кВ оо сов чу ох СУКИ юне по фрди- танк Ї В А НО о и в КО хх хх ме с с ше с Ос о.

ше. о о ВАХ Вуекклк дв ЕК КК ях ше. З ВИ НК ВОМ па са пня я У В о о Ес Оу і в ОО п о и с с с г В ех с о ОО ОХ М КО я пив она о в ВВ Во с о о. о ОА о Ох КУ КК ОК МКК КО я с о о 0 А Б с . пе я ШО в. с с с я пе ПК Я КВ о п ОО ЗОМ Ох то Те ОО МАКИ: о СТО о о ун Ки я ОА о ОК а ВО ОО не в ОН МК ОК Ко ОК Я ОО МКМ не ВХ Кока о ПО КЕ Ох Ко о Є В А Я нь о ОВ ОА я ОК и По у рве ЕК і КОМ В ТІКОНУ ПА ПОшН АЕв У У пк Х о с во вл Кия о ОЙ КІ у о Ср с я В КІ ОК А Ая В УК ХХ Ка п я п А ВЕ Б с п ОО Сх у ОА КО нку пе А ОН и нн и ПЕК о АК ОН ДК о ОНКО м ОО Пе АН я В о ВМ ох шві с, : ОК о Кана иа А и НН М кни З ко ее о У КК Я пе о - Б НН МД В Ви п о А КЕКО КОВІ НС АЮ Кв п В КК КМ БИ Ка о и Я п око Ку КМ сік а Б ОК ние ох Ко А Ен ЕЕ ке о у і Те и я о с НК ЛК КН ОН В о ях жо, о пен а ко . с о ня ОК М и о ев ОО их ї с - с . о ОК п іх А пов вовк БО 33553555 ІН кн нти кя я Я в ОК ЕК Ки Ко ше екв с Как В В пише ее каси ВО КЕ иа Ух В ООе ВХ мам мем "КО ЕК сук Стелукв А СЕ ОДЮ шо -кї п омначня Сначеко А: пон в х В ун ВО КО МІ в В Ко прин ї ол ОА кока й зв зано я кож Я Шия счнука М Бо с ше с он 0 півреюєь Как рю отак о ка ом КО ко п. с ша с я сн с в Ук ! с с о Мен шо М

5. а, пе пу ак а ОН В ка а е а

5 (. п Ох п СТНКОНХ МИХ ще НК и ЖИ КО и вени

Ге . ОКА МА я ЗОН о о КО вв о ЕЛ ее но ВОК Ох. КоКАООУ го о КН КА МИ В Ну а Мо У С КК ОК КН пе ПОБАКЧИ а КК У Я в ПОКИ АВ пн с А В М ок ВИ п о пожеж Ну У, У СОН М МК я В ОК КИ У КАК и о КОВО он ОА пня пні у оо СоКов о Нв Ке ОА о ЕК УА КН Кв о я А В п. п. с

С. ки о ОН о В о демій ЗК Зх ПО ДОК я о ех ЯКО ЕК б ПК п В со КК мя Ос СКУ ОО сх с. п с 5 пе і Ме оре ар ОКА в КАН ОА о Не В СД нні В и КА оо НК А ВВ ТК о о я ОК Кен МК в НО УВУ В Ах о: оон НЯ со и В ОК к В СУК ООН кон кою Во на ШО ОО шк в нн БУ еВ о пу ум а ЕІ ВЕК ОКО и КА ОН Б о КОКО по КО М ОЗ АНЯ о в М КН Я БО в и ле в А ка о м ОКО А ПЕК НК Ки ИМЯ ее у т В У, НК ВА ко ХА

: о. п. 0 оо и со ЕКО Уа ПА ОА ок в Я ПОН р В КН м ОА я по шого пн у БО ОО ВУ ня Ми м а ОУН Пн АЖ В и ВОМ ла Я ВЕН ОН КЕ Пк Вин ОХ Ко рннк кВ С о о нн о а ки В ЗМК НН ЩІ А ЯК А ШИ и а оо В М ЕК ен Му ї Ов о А НН ВХ ОН ЗА М ПН ИН ех ВН ке ких : ро а НЕ ки МК и У М

Фіг. 13 Зх Забарвлення ретгикулін зоб і І 5 М чжен кс же г Х «зараження кісткового мозку З чне Со ВО и А НИ ВИ Дена Пи В Ки НА НАХ соці оо пов впав попросив яшни й ; кн у ЕН пром ан кон І як бод Ши рве ння ти пух ес А о на НЕ де и нн нен ях кед дк Зах ПАН м ни а НК Кая Пт и кл нн тен Ух куди о. Ти ник ння Зх ОН ТЕКИ дих по пут г чи Іл я Пот, х лн а НН ой ІЛ ПИ, ке п х СК дом Ж Коля ий щі ех но ев Я о ера Кия вка АД а я УК ше и и ВАН НИ ММ в нан я, ЕК режи й МІ. и іти и ТОЖ СТАВУ тя См р ми Н ми «де т? пе Пи нн жа НВ ЗА г еВ п нн кумис и р Уа у та перо они ХУ ах. Жим Мих у КИ ДВО ФА их, ТЕМИ их дви ов ми АН р а і ЕЕ. оо и НИЙ я Дрю т, ЕК ШК ки ВН А а ен КЕ пл Ем Ки ОБ ПЗВКИ с у Ве ОаЯ тая у ро ення МОЖ ПЕ Кр З и и По ННЯ а дини гом аст чу ТІ ДЕК я ших п. МВА, но ВК и Не Ноя ке он й ЕК тт ВЕ я КУ кн вання Молю ам м. мне Бо гі пЕАБИКЕ ЖК ІК ОМА лит ан ШИ був і ше ХОщеНХ зе м - ЗО й пок са НИ ВІШНУ Кор и вит ие Он З ОНИ ШАТИ п. ЖЕН. А ВК я шк у ов ІА Ко дали я ТУ ой ие у ДАК БУ Б во а АН НА ума. В КИ ША я пн ЕН Шия Поклм НК ЯК ЯнЕвн БД ни поляк я и тн в ви ПМ и Вих Ж о в а по КЕН КТ ЗБ ки ДАК УЗ аЮ: ЕН ВХ КУН КН Со ИНУ сх ПЕКИ ж ОКЕАН ссжестаи и: и ЛИ ОМ ИН НКИ ж, ВЕ КК и т, ни а; мн ОКУ вені зоіннн і існінінрони ой з ще ве НО в В тин АН ЗЕ ВН Є а а в Кві нн клннНя іоном спіінбанвонніннн нан ніс з Ко УК ВВ М З а у О00омканіх Сролуяв АЖ о ВИ Бах зако В Щи НЕ ЗІ пики ОО в Ж їв. сте МЕ, я с. щи сорткцека ЗА ее шик СН КНО хз Кв В ри МИ ТК в и А В г Ен : Я в В вки с де а АС Ой Ноя КН у й В ва и ОК В: ТЯ окон ДК КВ ОВ у с НИ ши щеня в М Я Кн ОСИ КА КК ден косо ЗК о но УНН КУ и о о а и и ОК Же ги я ман НН ке и и ЖЕ ОКУ пох ке пе я Ку поту в пі Кот, Ж ЕК о Сх вва Ж в мае ЗБК нях ІМ . п: З НИИ ХЕ НАУ АК ВЕК ОВО: Во и ОМ ЧЕ ОК їх. У оди ши М м ОМВК А я Се АС ня в. ЕС я н КІ ХМ паж а и ШОК ок ЕТ КВ винен З МИ ВК А ИН СИ о в В ТК В ки и НН нн. жан ака ни ен ді и ик п о: ни ки НИ вин нс ЕК Р ША і ТК : ш иа ее МОМ АПУ о о о МЕДИ дет вн В та ККУ. М КН ОН ИЙ ИЙ вана кН о аНЯ Йов о ке о Ак и а ВИ фену о ВОК КН т Шев Ус НК Со КАК и п КРБООМВаНЕ ой По Я Зоотрктию ТЕ ак ен их Кк КАК Му я Кий ЕЕ ну я а им НИ З опа ТО и КК УК М и МИ а МК ВВА КИ ВУХ ' ув

Фіг. 14 я р зажігтУ й й у четкового мозку же 5іаі5р, зображення кісткового з и кр Во К оа о вав КАК нс В сх ноу ов и В в, ши що сви чеком Кн у Кене ен У Сполука В о дкх я п а ЯК о КЕ КВ Коля Же Мои КТК осо Й ср ДЯ ДОН Ех и вся Н - КМАВ ие Зо: а, ки с нн я й суне о А 0 ці ши ах --. Ми я і ЕК Кен ОО о М ФВ Ки зим о Ям два а шк соя акне ВЕЖ ва ПУБ З е, ж еВ КО УНН о в, КО ОО А ем КЕ в ую Бон ВЕ й У ов АЖ Шок о ох АК КК ЗА о А а туя о ЩЕ р в ок СЕК КОНЯ ке оо КК ем нин ня я Ко р ие КН ЗДМУ У и з а ще ди Ж Ох жо ру ох Ми ЗБ ЯК ск о о Ка она БА Му рез Де БО ее ма я ТЕ ОМ зе ВО ОКО я В и АИХ г. п ОА КНУ КК о ве ек кв УВУ во ККУ ек Ви ВАК Ж дек не НОЯ я що іх ж вун Кн ТВ в Ес Ку ОКО я КО Се ОМА ДОК Кияни о З в ОКХ ДК ОНИ ОНИ де во КВУ МОСК АН Ке еко КД, У: о Ок и яд жа зо ВК р у Я Ба КУКИ Я Ки ек ОО уя КК КА МУ я пу БУ мук я ОД дев НИ пок Он ВЕ ЕК и Ваня а КА КАК МАВ, туту КЕ Я о р ня КО КАК ККУ ЗК й о ок я АВ що о и іх Ку ВАВ Еко пе СеКх ж и ОК ВК ЕВ СК ШИНА А кИ о ум ча Коли ТО У ИН, ун ту Ки роя Ки МКК Я Ко еВ с ж о и я НЯ пан ПК ки ОК ех о по ЯН ОК МОУ ее р КВК ТЯМИ Но От ДО АК жук ОН о я ши я вся ОНИ КН КАК КЕЙ У за ОВ ой КН пу ЕЖ кри ЕК а Ку Вин Ко ПЕКИ ков ик о ес Ко ВК ак УК певна Дек БИ о М ех Кох У ши ЖК кК х, ЯК о Кв В ТИ АВ Моди КК п ТК Ку М У их ОО СА ве пекан ей ее ня ж по Я Кк ик щ се Як В КВ; оо о ее КИ КУ Ас ке ТК па дос ДЖ Ки ОО УК ВО У ЖК УК о ен ДОА АЖ Хм МАЯ А ак Ку дов МЕ и в ж КОМІ РА У що «Ин Мк ХО ща ІК АК ОВО ТК КК ув ие хв ва ее х нн и ее Б нний й сови ВВ ее КТ и АН ов да и ек В Уфа ой мамин КК ки пе ж пен СО ок ПОЗДЕКУ АК ВОНО в Дскус ек НИ іпука А я о ех УА ОХ КО, а КК ОН осика: Комінцанія Спачу СОЯ ВЕК ОНО АХ з ин сс вних по Кия пд СО з ОНА ХО МК ера оту вра о о пов ЕК ЩЕ | НУК снорюввчяв ПК ККУ дити ва й ун о ї пев ов ху УА КЕ Мен в ее ш- еще с у с ; о Я ОО пд у с я КИ кн ехо вн ї- з тм ОК я ЖИ КУМ пт Я Ка лк Кв ДК Уся ЗМК я МО м Двес АК ЖОВ ВОК злу Кф тку се Пн УК Ох на о поки в о о а. ак жи У ЕК Кум Мих. Я ріжки СХ, ФЕВ НИ ВУ Всю ак УК п в Де ТВ ее КХ ЕХ шк Коня Я Ку ох Я: Ве ВКМ кА ни Кл И У ЯКИХ - о В Хр о вк УКХ пес ах КК да Си а Не С ПИВА Ж КА Ен в их АВК ЗВ ке ОН КЕ МА а У НО НО СИНЯ СОКИ ЕЗ ПЕВ ЗО Кн ОКА ВК СУБ Я Ко МУКА не ЗЕ Кох М Ук он КОХ Кер о Я Ок ТУ А КК каре коор вх не ев КК А ТАКУ Ср тя КУТИ В й ЕК я и НИ о ВО а ПЕК и с оо зЯ ЕОМ са Ер а ЗИ ВНКХ о у СИМ о ВУ СКК АТМ о М хх ВУ Кен С В А и Ох СК о КК Км ТО Я ке п ше вн щ с а. па шо 5 Я он с лк У АКА Му Яня а пу Как кни Ж У ПИ КВ КЛ С о и. п пах 5 п. в их ОО Тих о В "Я КА туви; пе І «СИ ля Ка КК КК Я УЗИ ОБ и УК МАХ Же КВ вимо КА а Ж Дж ие УЯВУ ОК як у Кк ТВ МЕЖ ВООК и Кк ак ж СК Ж дос Кс Я ШО УК вже і ОК ко Ти Оу Без пу ух ПЕ де КК: зе ОК УАД Ох С в ке ОЗ ен, ВК всеж Й ПИ М пох що УЖ з ДА «ех ПКД У КОВКИ о Ку ' г шен а еу КО о они ноя Ме ВК ПК ПА КК ВЕН КО й сш КО Муки Км ЗИМ Ж де, Ша Едем КИ х ОД ке С КВ М ОО в пе и по Ен Ин і нг. 15 зи же га МОЗКУ ; з НЗ зображення КІСТКО ВОГО З й; снеки Ацдаетилгіт ІН нд Ен В Кв ЗЕ це о ун хе Оу Са У и пев я ОА АКА ВСЯ св о шо дж и нак иВ о ТЕХ Оу, Я я КУКА и Ж, тиви с а Ме є, Якою пет дез а со ех Ко с п стен в в ке яма: ООН пе Ба ер пе ко з. конку ВАК ники пк СЕ Я ТУ вк ЮК М де й що Мк ку в МОСК етан ие и ие ПК Ка ЕКО У ККУ о» ОА; 3 я Бе ке МАО око УНК АЙ МА КА г З в и Кн КК З Доки ря ПК АС МО и ОТ ОКУ Кос Я вк я ДЖЕ ек ЩО ОК Кон Ада МИ у м Ух ник и ПОВИ ви КК шен с Ж ее КО В и У ка СК о КА З. СМ о я пак Мао УС ГК Ко и о мин я цк у Ок у я Ме умо пк Му а АВ р СКК ОА Км т КАК, КУЄ МАО ЗК и кам ке о ОО иа по Ме ку еь АС КК ей ди МО ЗК вн од и соя З ох пн ся Й Ох А я еВ п І - з п ООНК пи ск, и еВ о по п ан у ВН и КВК ЦО» у я та ня У; мож кн НВ їх Сея ТЕТ ПЕ вени с пок по. се он є Я и, я ЖК Кн й ен ис во ЗА ЕІ я Ки ШК ек кути Су Кв КЕ шу жо а Я УК АК су ВА ДЯ аа МА Ж З У ДЯ за е Ел У ох ЖК Я КУН Я Оки ее з ЗКя Ме ПОКИ УХ й КВ ОМ КАК со и Я уко ех у МОМ НЕ о НВ п КТК оо Ок о ЕК у КОХ о Оу ДУю ик ТЕМНО М АНЯ ОМ ВОМ И ВЕ ун Ск КИКО око ккя Уж КИ Міжн ня ко В МЕС АНИ ПМ Со ув оп Кн Ас КК ПОВ ха ел АКА ах о ОК У МУХХ ЛУК АК Со, шви Кк АК и - соми ще поки я З у пі що їй ие о М ек ХУ зо іно ван ВИ СОР я каш пики о зв Ко Ки ВЕН ренсвоетю тик юки тил ге повна рок Боян пев пін дужок ОМ Комінногія Стюмука. Кк а о вт б і вима вннінннн: Мона ТБ ВСЯ ВК, ов я МК учи соус, п р ну Я ї сзюожан А п ну Як Аля я ою о с рр ун у шен що обл юмуки о ХК о КК Я ОК Я Ми КО КОХ ВК КЗ ХК ОО ДА НИХ Ко ся и У, ін А Ми, спе Ех Я ех п ек ТА о ок. Се а, оф не Кам по ОК ке, ОН В ях щ ло Ге У а о ка се вх В Ки о Ве УК ЗК Їх СІ БК» БЖ ТИ ОК уки Мр шосе Кос КА В в НК Не Я п о КН ВА ки а КжоКХ и КН Ки ЕЕ ков Й ор в А; ни ока Ан ом о ХВ З ок Ва от А С о КК их Ко дяк і КУ ее АХ вн СУКА КоАКе АТМ ХУ У ЗАВ Док сили КУНА ДУ Пе ВК КО НЕ в яке У оки а кКя, г; ко Кая о ие и Па же КК о ВУ а Мане ке нка ци Суми СЕК шко юних УК сн ВИК хв аж ВУ Ком СК МОВ, ня ХУ о Ох БК де и ОВ Я КК ші во в и ТВО ря хх МА ФК ЕВ З - УК ув и КЕ ее У раз Анна сх З У о МА в Мем ще о й пу А ро, ну ВК ВМ УКХ АРУ КХ ХМ ща ме сю Ку - Ко ТКУ вки о СОКУ ОКА ве. а КО У я ее У ооо КЕН ОКО КТ. й ке МКМ АЯ КО ВК ин МОХ "ме Каже Аня ня ОВО ВКА ше о кА А п ки тк ке Ку о УК ОЗ оон ту Ва о нт де КК й ос Я о Ко Ху Хв ПОВНІ а ле Аг ФІ АВ а ХЕ СЯ У о ту У дя У ЗАТОКИ ДУБА Оу ЕМ кн мя пох жк а Ве муру Я 1 Ж оку шк и ВАК У У МО Я га о КУ ЖЕКи КИ о КУе птьо В ВЙ и тв УК о АКНЕ кс МИ ОЯ ми м и с В у ВЕ у я КК Бо ке У ее Енн и Ко ам в вве Ж У не ВК зе кащія пе Ви М СИНКУ НЯ МИ КУ Я В Ж З рон Р ри ві Мк ще сс Ку? Ж: ОК ше Ана щи с он ші ве ся їке с Ж о ук В р З Ул Я У а о В С АК М ся СЯ дна в Ук СВУ пл я и Я ка новий пи а пита г. 15 ФАК Фік.

пото тлях НЕК зайдорвлен: Гуце ПЕНЯ рвлення, зображення селезі і НС пхати оо вк НЕК Кри Кот селезінки Пежо о. НН днгежя і Ес пе Ве Го ДЕДВЮВО КО у Ваня В КК МЕЖА Я лька В ВИКО дедчкх с 00000000 ши. ши я МБОВКОНЕ. с с ше; в Кекс СО нок еко а З Фан ЗМ що ооо ОВ Ока ХОМ АННУ ІООКИе Ав З Сех: до синя о в о я В ах и я те Е А шо Мод ОК я ОВ шк пд ї ми ан МИ по о ноя ВК ее КО п НАХ Хо Ка алое и о ин КК Хе, пе Я й кОДНВК оКККнй ОКО КО ПОВ МК мя о ВАя Му У ее ол ве Я Повне у шен ОО ня ж ев ех пос жи п Таж пеаеоое Кей пн З їх З Ся АК ОКО ЕЛЕ МК У Ям ке ГЕ ОКА ЯЮ км о СН УДО ЗК Ме А ах У ОО Зод шо По УК иа З ДУХ ПК УК ВОК Те о Я ОК Ак С и В ОХ ШЕННЯ КА Є КО аж Ух й Я ЗА ОВ о ау щх АН о Кун х мо МАО Ме До КИ в. ТЕО о оно ПА Ко ШМК У ух ох ПАК Я А вс со ін КК Сх Сов ОМ АВК, ТЕ Ми сх ЕС ККУ ке ДК МНК ОО МАХ ях Ко с ЕКО СКК и Я Кия по и о ще я я ОК у ух АК ех С МА ККУ ПОЗ я ЗОВ С ї З СЕ Коен Же ОЖоя ее СК КИ Я ще КО У Мир с ще Б Су их Я ПЕ о: п З КОНЯ о о я ее св; уки с о с с с Може КАК ОК Ох їй ОК У ПО ОХ о ТУЯ еВм ВО СВОЯ й с и и с; с с ока дж УК ОКОИУ Ук ОКО СА ке СЕ ЗК Км УА СВК ПУ КК К ще ч що у с с се МЕ МОУ КВМНЬНВМ ох о Орні и І Схолука А пит ти, М о о БЕ а УА ОКО КАК КОХ НЕ. Бити ікси доні МКС ня ЗХ ЗУ я Таж шен ши пд но ох ке НЯ ем Мбикесні нон ас неоанн кі шо с ехтужн ща В п кий с я о п дотух о оековкя Бо о. КК КИ ЛЕ ши кл п по еСое нн п. с с с с й пе її їі Кая оо ооо в о ех с дон і Ки Пе ке о о ох шу с ен ення о її; ще а о ке Я "вус? дви ЖИВЕ ков АК и КУА ах па още МО з ВЕК і2 яке Ма УК по по ще о шо о. У о По п и и СН чк, ТЕ ож и Кер ЕВ у з їж СХ ОКУ МИ ТАКИ я КО пн п я ша лом вен ПОВ ех о у и я п с Б Он ще пив Кто с я а п 5, по ПА сеуек вт в ва депо с В о о ЗК ск Ко зму А А Мк КК ОАЕ ж КО и ОВК Дт сиююю Он в МАМ р ПАК и кн ее ОО по прожи ША же и МІ уник ЗМ вх ша о ноу КЛ Де ви я сяде я ден ке ноЙ ПИСК ЕВ ох Ве уки Кене КС сим лише иа ря Бо и с хо 5 о о. «Є АТАМ ЕВ о МН пеки ПМ АХ В оо х сся КН. КІ вк ре х дан» лоно зда и у ОМ ВЕ КА с оо тн пово и ОЕМ» ак с Ум ее ока зх ння ни ТАМИ ук сх я у во ек Ї СаО Мн схе

Фіг. 17 ше п но ке дхкнн третю; сеіаібр, зображе і Уне пенею нрттоя - зображення селезінки и ко пере ее ПО сени в Ева те Ку У Ки СКУ ТУ о БЖ іі я ни док в ки ВИК Яоаой дак я УКХ ка. о УК нив Як и жо МК о Ку Кв ВК ОК вин пн она В С ван ПО ЕКО ВК, я У о Ж о Я с тя кт с дя в В В ОВ п оо в и ож В В МК в ве МАЯ Не а ач ке у Ж сек и Вокер КС ж о Ух КО МА и ав ж и м а СК Кк пов Ва ху Я шов ух пил а оо ре і пр не ши І вк и в ково ше им Кок ж та ЗКАВКОО ЗВ КУ КЕ т У М м Кк жи МНК ЕЕ В о ВА Боковий Ко ее КЕ БА С м М а Я пон ке з аа в онко кине Мк пн ак УК ве не ЗОВ МКК ше м ин о о о ЕК Кв ОА Не шо ря а ви РК Ту А ово Ан неону о КВ ви дов или ЕК пе ою у С Ок ки я Ки я Кф ВХ на я ее я шу де Же В ин о пи ні ж и екю, Док СИ я дв дк ув ЕЙ у ВЕНЬ Ко Ку 5. КО, КО, МИ 5 ТІ дюсє сфе ОКО Би я фе ЩЕ нен с те В НЕ ВК ЗБ Ж ев інн фвіводіннвйу дк с ВО ВОК их ДО Оу ж ль ОК Ех и же КІ Росс» НА ПФК ин Укхає ках ОК ВАНЯ ОНА ко фа т КК МОХ по ев о СЯ пазу овку ях о Я комічних з КЕ А шовком Жов СЛУ ОО АНА КУН Є о Ух Ко п и У ки ск вими МВ гу В пе сво ве вк ше кино ЛоКко А ПЕВНЕ ан коня МК УК п Зх о кс ще «Ха Ах се в яна до Х ою Сполука В ЖК ВК Кожне вісі ж о пен кА А в т м зняв їековжакх п хх ж Як їх реа ХК КЕ щі є зе ЗК Кх во КЗ Ма дк ке в ло во пе. а а шен и ок пеня т Шо во я хх ен по в п Б НЄ вн КУ ох А фа я Мао нене еОО Кая а р я лом і. о. що с шк . - ях пи а КУ о МК З Кв ЗК ОХ ЕХ КА в. ще ие ав Ко вже с ік г ках ск еко шо. ом ив ов еОя БЦ чи я мон ка у КОН У Її и ех и шю о о КО о КА КОН ВВ Мо ВВ Оу с ВК од я А МКК асо ОХ ми М А Б. ТЕ мен ж ля ви Же нах пес Мене Коко яа и ее ОКХ У Бо КО ох КА ок зо НО, ке НЕО п А нн АН ке пон п Хо у ОО Б ки кеди шо м вх Мова КУ у рей не о ХУ ЗА се ах о Не ще: Ку ЗОЇ ие оо їв Тата не НЕ ек А щу ви «ване хо Бен се ах неон ок дя аа В сек о ВКА ЗАКО ер в КОМ оф нХ пн М ДН ек и оо Ж Ме в ВК у НН ВК. Ко тки Ку, МУ ще Ко Жея КЕ се дак Х КоОІ п я поки я я хх ЩЕ м нання ва и. Ну КК г с. ПО

Фіг. 18 ШЕ о дух о важ р МИХ Ку

Анпетилгістон З, зображення сенезінкн нн я КК КУ г ро ЗДСД ДЮ. кеелт ятени т з тю ресталтирза іже жу Ки и ї пн КК Ор и ау ХХ ру і ОА А АК уми ки в КВ о ОЗ Ше кв ен В В В Ї Мне в СК о КЕН о ситех» в ДОДКН НН ее ее ЕК Укох ВХ каст ВН и і В й Щи КВ в я реСК а п и о с в ПО о о ІН КО КК и и В КАВУ Зх х У м Ко Ми и КО М НКЯ пита ДЯ ях а ав ях Км ОО М Я ин ока неоя ОК, ПАК, ники ж СА сосе со ом я Ко ТММ хо КН ит в и ВК и КК М ВУ мом он у и и и ох Мана о Я ОО З я ПО КК дк З ЕС М А и и У ик НИ А и МК о ми а Ока и ВЕ а ИН В Мои і и В КК У ес ж о В В ЛО ее Кн и В КИ Кок Ж Ед и АК З вх и а и и КУКИ аз За м КУ КОХ т нка а Ки и сф й, се кання о с Мисик оо о в о В и НК и Оу и ВК В В в в НК УМ УВК ОК ВИ ев у о МЕ М о и ОК Ки Ки І В Ви у Ки и Ки В М оо МИ ик оо А в и МК ОО Ак Ка жи і А КУ о Ки В В и НН СУ Еф АН НО КС В АЖ о А І У вони МІН КО и и а КАК М и До ки Ми ная їх чу ушу АН М КК и В НИ В а Кн п ви плен в в ро ок КК як ; У в МК ри ин у о вне ху ан п М МА Ка В ЯК о о в Ма ок ія нні інн ЗІ АК и и и а дв вну дод тДподс Ж совок м Кеди а ме дКу т я щу Ж аспір г онн А Хе Ми ми слюмуко А ММ пе С КБ х ЕК, ос ди Я яке і Кимотзпїх Сполуки м т ше ХО ве ок ТИНИ Ен и и Кр НОВ сСиодука З о о о А ни и кв Кк п р Ел п ес. ие, се Ме ве и М А о м МЕ Ди хе вро тя он Кн По А о МА М о ша Дж о Ин у и в НИ КК о о і А ри М ОК Ов и в в ее ШК ви а Ма и и и МН МА ж то а Я ково КАЖЕ Ен иа и ви В Н Х и В В ПУ ен БАН ТН и по ОО В Ух ся ке у км ин у КИ Ки КВ, и, и КК АКХ мя рих як Кф М в Но я Ух РЕ КК ду о о Е КЕ их о ОО в в у и ми Ку о и В М и АК В о ЕН НН о М Я ХУ Я кове НК Осн Ва Кия МАК З В ОККО СЕУ МВ ді да в МК и уки КК КК УМО жа ПУ А дк рих роз М ож КУКОщх ик КО кл ЯК КН Й МЖК УМ Я см МАК ТВ се В ТАЄ КМ КК у и Ва НО Км а о КК в МК ЗАИЯ КеУ КА СОЯ Кон Маки ИН М и АК ум ки и 5 нан Не б пе МА КВ В А КУ МЕ М ОКА А М Вс В хе с В я ен і ОХ ж ДЕ и В МК и Кк КИМ У їй Зо КД се А я ке кХ дно Соя о У и КВН Ким АК МЕ ть о КЕ МК КИ Я, в НИ НО НК пвх о ее п ов а и и ою о у и пон ана КЕ оо вБкЯ ще ев НН В В КАК НН в кий хо Коди: и. кі Кия юох М М и в В А В ВХ ж В а ВК МИ и и о и а ОН ока МК аа и Ва КАН БОНН в в Кос А Ко он нн и в о

Фіг. 19 Схема Фази 165 клінічного дослідж та способ! «АС і КЛ НІЧчНО го лОослДЖенНняЯя та сти "ПЕ во задо ВШ іти итітіш птн т КО, ММК од Ви, ПК СУ. ПЕК КН КК МК БОБ с а п. і и Зареєстроваві 15 ц о З КИ МЕ ТОМИ МОВИ : г МЕ вн БО я й По оВ Що дедатконнх панієння те, Ен но В тан ВК ПЕ ЕН ВВ екю» 0 МИ Мум Мам ПТ ЕОМ КЦВ ШИ. ОО С у т ТУ: ВВОИНВ ащЯ Не Пт ЕЕ МЕ и еВ ЦО СОВИ он ет ВВ асо ще Мом Не пом в СЕ Те . ж а що вЗці с х 7 ОТ САМЕ ЕММ МИ 7 1-5. ХАН ох шо ВН ареємзровані с пу ту Ка, м підзворджеті а шен гру чо УШЕТх ою КК Де А о ВОДИ Ан Сени рок: ВЕ ща ККИЄ "Й м ЧИННИК 0 Монлоро З УК ити дипягтнеяНя 0 пику Ей МЕМ КА и - МО ИЯЛУ. ВО ШКТ Мини МЖК век ОО й вд ПАМ : ш Перепбачування далзовий рівень Передбачувана паза для комопаваного лікування 1 РуксолмінніЗ МСБО, Павдобнюєтих ТО МЕТОЮ 2 Куксолізінні 10 МгОВІЮ, Напобіностау мг ТУ ОСММ З Родсголекнв: БОМ ВІ, Матебнинзат 1) МТА ОС 4 Рудсзяйнні 1 МОВНУ, Замобниичзат та МС ТАС В Руксочінвів 15 мг БИ), Панобіностаж 20 мг ТА ОЮА Руковніитній 15 мг ВІ, Манобраоєтах 25 мг ТУКА 7 Рупсоліінні 5 мг ВНО, ЗМввобівости ЗО МОХУ ООМ МО ж Максиманьна неретосима доза КР з Рекомендована доза лли фазної й

Фіг. 20

Довжина селезінки, що пальпується, із часом у Групі 35 птн Н ЕД ПК ОВ р днлочлччччадададд дання очи п трдтнннтт декана тя ддднннннтнннн ння ттттттттттттттттттнтннннннннннннннннтннтттттттттттттттнттннтнн Б в | щ и Пацієнт 2 ій ! Що й ; зн Мацпієчух З дов нн ря о нн ПИ а ЕК У -Щ сплавом догово втавве читати с. Ей | й І п тетснннююьких тнкже Пацієнт 5 БУ на ИН се нн нн а а Що ї й : диня дн х и ших пен Цаики 3, День Цика з,Деньі Цикл з.Деньі Цикла,Деньі Цикл б.Деньї Цикл в,.день! Цикп 7,Деньї ЧасЦяко, доні І дака сх 25 днів - Дані з ри лів пане летв

Фіг. 21 Довжина селезінки, іно пальпується, із часом У Групі 2 ФО Фе фонтана их Її ! яке Націо 6 В го фін кн о п В о п в В С ЕЙ В Е І сезннє РГідмієюк В з Е " нео іїмієну З Е 15 фунти в В В п в С В БЕ НН, 5 «ов й - КНацієдт 11 М : в І І І І сне фДацієют 12 Вони сення о м Ин ЗП нн попи вона ОО июю,Деньі 000 Цика,Деньіо 000 Цикиз, День! 000 Цикл, День Час (Цикл. день і пика АК двів я Дані з пробфнив пакієтив

ФГ. 22

Довжина селезінки, що пальпується, із часом У Групі 3 кожна ! ! 2 френч і Я 2 пн ььин''и лж Ечнснн ит ти р Тівпіснт 14 сі і ее Пахаєті 15 4 Й і ли Пак нь а ШО0О5 френч др т тт тет Ми К І Же - ее аціснх 17 у і ння Пи 18 ги і Щеня -- ЩО ру ддтннтяннттотолтатдяддядятннн нн пня дон р КО дних Цикл 1, Декеї Цикл, День! Час ракл, день)

Фіг. 23