JP6479818B2 - 骨髄増殖性新生物の治療に適した化合物 - Google Patents
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Description
- 真性赤血球増加症 - 赤血球の過剰産生。
- 本態性血小板血症 - 血小板の過剰産生。
- 慢性骨髄単球性白血病(CMML) - 白血球(顆粒球)の過剰産生。
- 慢性好中球性白血病 - 好中球(白血球の一種)の過剰生産。
- 慢性好酸球性白血病 - 好酸球(白血球の一種)の過剰産生。
- 特発性骨髄線維症 - 骨髄組織が線維性瘢痕様組織により徐々に置換されて、正常な血液細胞の産生が破壊される病態。
本発明の第1の態様は、MPN(骨髄増殖性新生物)の治療および/または予防における使用のための、
- TrKもしくはRET受容体アゴニスト、好ましくは、β-3アドレナリン受容体アゴニスト化合物、または
- 骨髄交感神経線維を保護しうる神経保護化合物に関する。
- BRL 37344;
- CL 316243;
- AZ 002;
- BMS 187257;
- L-755507;
- L-750355;
- FR-149175;
- GW427353 (ソラベグロン(Solabegron));
- YM178 (ミラベグロン(Mirabegron)/ミルベトリク(myrbetriq));
- CR 58611 ;
- SR 58611A (アミベグロン(Amibegron));
- SR 59104A;
- SR 59119A;
- SAR150640;
- L-796568; および
- CL-316243
ならびにそれらの医薬上許容される塩。
a.該被験者から場合によっては経時的に採取された骨髄生検において存在するチロシンヒドロキシラーゼを免疫染色し、
b.工程a)の生検において存在する交感神経系線維が、正常被験者の骨髄に存在する交感神経系線維と比べて、または参照もしくは対照値と比べて減少しているかどうかを比較することにより、該被験者の骨髄における交感神経系線維の評価を指標として使用することを含み、
ここで、交感神経系線維が、正常被験者において存在する交感神経系線維と比べて、または参照もしくは対照値と比べて減少している場合には、ネスチン+ 間葉系幹細胞の減少に先行する骨髄神経損傷が該被験者において進行しており、かつ
ここで、該被験者が、正常被験者において存在する交感神経系線維と比べて、または参照もしくは対照値と比べて、チロシンヒドロキシラーゼ線維により占拠された骨髄面積における少なくとも3倍の減少を示す場合には、該被験者はMPNに罹患している。
a.被験者の骨髄から生物学的サンプルを得、
b.工程a)のサンプルにおけるグリア線維酸性タンパク質のmRNA発現を、正常被験者におけるグリア線維酸性タンパク質のmRNA発現の参照もしくは対照値と、または正常被験者から得られた生物学的サンプルにおけるグリア線維酸性タンパク質のmRNA発現と比較することを含む、被験者におけるMPNの診断または予後の方法に関するものであり、
ここで、工程a)のサンプルにおけるグリア線維酸性タンパク質のmRNA発現が参照もしくは対照値と比べて、または正常被験者から得られた生物学的サンプルにおけるグリア線維酸性タンパク質のmRNA発現と比べて低減している場合には、ネスチン+ MSCの減少に先行するBM神経損傷が該被験者において進行しており、かつ
ここで、該被験者が、対照におけるハウスキーピング遺伝子GAPDHのmRNA発現に対して正規化されたグリア線維酸性タンパク質のmRNA発現の値の少なくとも160倍の減少を示す場合には、該被験者はMPNに罹患している。
a.被験者の骨髄から生物学的サンプルを経時的に得、
b.工程a)のサンプルにおけるBMネスチン+ MSCの総数を指標として使用し、ネスチンの免疫染色、およびそれに続く、骨髄サンプル(平均7.2mm2のBMが評価され、結果は1mm2まで外挿されるべきである)におけるネスチン+ 血管周囲ニッチ(niche)(単細胞または3個までの細胞のクラスター)の数を考慮した評価により、この指標を測定し、
c.工程a)の生物学的サンプルにおけるBMネスチン+ MSCの総数を正常被験者におけるBMネスチン+ MSCの総数の参照もしくは対照値と、または正常被験者から得られた生物学的サンプルにおけるBMネスチン+ MSCの総数と比較することを含む、被験者におけるMPNの診断または予後の方法に関するものであり、
ここで、細胞数が該参照もしくは対照値と比べて、または正常被験者から得られた生物学的サンプルにおけるBMネスチン+ MSCの数と比べて減少している場合には、骨髄線維症に先行するニッチの損傷が該被験者において存在し、かつ
ここで、該被験者が正常被験者におけるBMネスチン+ MSCの数の少なくとも6倍の減少を示す場合には、該被験者はMPNに罹患している。
a.被験者の骨髄から生物学的サンプルを得、
b.工程a)のサンプルにおいてqRT-PCRによりネスチンのmRNA発現を測定することにより、工程a)のサンプルにおけるネスチン+ MSCの総数を指標として使用し、
d.工程a)のサンプルにおけるネスチンのmRNA発現を、正常被験者におけるネスチンのmRNA発現の参照もしくは対照値と、または正常被験者から得られた生物学的サンプルにおけるネスチンのmRNA発現と比較することを含む、被験者におけるMPNの診断または予後の方法に関するものであり、
ここで、工程a)のサンプルにおけるネスチンのmRNA発現が該参照もしくは対照値と比べて、または正常被験者から得られた生物学的サンプルにおけるネスチンのmRNA発現と比べて低減している場合には、骨髄線維症に先行するニッチの損傷が該患者において存在し、かつ、
ここで、該被験者が、対照におけるハウスキーピング遺伝子GAPDHのmRNA発現に対して正規化されたネスチンのmRNA発現の値の少なくとも13倍の減少を示す場合。
a.化合物を選択し、
b.該化合物が、他のベータアドレナリン受容体と比較して約≧10倍高い、より好ましくは約≧100倍高い、より一層好ましくは約≧1000倍高い、ベータ-3受容体に対する選択性を示すかどうか、およびそれがベータ-3受容体の基礎活性を、それが該受容体と接触した場合に増強するかどうかを決定し、
c.該化合物を、それが工程b)に記載の基準を満たしている場合には回収し、
d.該化合物を製造する工程を含む、MPNの治療に適した化合物のスクリーニングまたは製造方法に関する。
幹細胞ニッチは、HSC(造血幹細胞)を含む癌幹細胞の調節における重要な要素および発癌単位として最近明らかになった。BCR-ABL融合を有さないほとんどのMPN(骨髄増殖性新生物)患者は、構成的キナーゼ活性をもたらすHSCにおけるJanus(ジャヌス)キナーゼ2における獲得突然変異(JAK2V617F)を有していて、HSCならびに赤血球性、巨核球性および骨髄性前駆体の無制御増殖を招く。トロンボポエチン受容体またはカルレチクリン遺伝子における体細胞突然変異が幾つかのMPN患者において見出され、追加的なHSC突然変異も疾患の進行に影響を及ぼす。HSC微小環境における変化もMPNの発生に寄与している可能性があり、BM線維芽細胞および骨形成細胞の増殖はMSCの関与を示唆している。
- BRL 37344;
- CL 316243;
- AZ 002;
- BMS 187257;
- L-755507;
- L-750355;
- FR-149175;
- GW427353 (ソラベグロン(Solabegron));
- YM178 (ミラベグロン(Mirabegron)/ミルベトリク(myrbetriq));
- CR 58611;
- SR 58611A (アミベグロン(Amibegron));
- SR 59104a;
- SR 59119A;
- SAR150640;
- L-796568;
- CL-316243
およびそれらの医薬上許容される塩。
a.被験者の骨髄から生物学的サンプルを得、
b.所望により、標準的な方法により赤血球溶解を行い、遠心分離により残存骨髄有核細胞を得、ここで、qRT-PCRによるグリア線維酸性タンパク質のmRNA発現を工程a)のサンプルにおけるグリア細胞の総数の指標として使用することが可能であり、
c.工程a)のサンプルにおけるグリア線維酸性タンパク質のmRNA発現を正常被験者におけるグリア線維酸性タンパク質のmRNA発現の参照または対照値と、あるいは正常被験者から得られた生物学的サンプルにおけるグリア線維酸性タンパク質のmRNA発現と比較することを含む方法により実施可能であり、ここで、工程a)のサンプルにおけるグリア線維酸性タンパク質のmRNA発現が参照もしくは対照値と比べて、または正常被験者から若しくは経時的に得られた生物学的サンプルにおけるグリア線維酸性タンパク質のmRNA発現と比べて低減している場合には、ネスチン+ MSCの減少に先行するBM神経損傷が該被験者において進行している。
a.被験者の骨髄から生物学的サンプルを経時的に得、
b.ネスチンの免疫染色、およびそれに続く、BMサンプル(平均7.2mm2のBMが評価され、結果は1mm2まで外挿されるべきである)におけるネスチン+ 血管周囲ニッチ(単細胞または3個までの細胞のクラスター)の数を考慮した評価により測定した、工程a)のサンプルにおけるBMネスチン+ MSCの総数を指標として使用し、
c.工程a)の生物学的サンプルにおけるBMネスチン+ MSCの総数を正常被験者におけるBMネスチン+ MSCの総数の参照もしくは対照値と、または正常被験者から得られた生物学的サンプルにおけるBMネスチン+ MSCの総数と比較することを含む方法により実施可能であり、ここで、細胞数が該参照もしくは対照値と比べて、または正常被験者から若しくは経時的に得られた生物学的サンプルにおけるBMネスチン+ MSCの数と比べて減少している場合には、骨髄線維症に先行するニッチの損傷が該患者において存在する。
a.被験者の骨髄から生物学的サンプルを得、
b.標準的な方法により赤血球溶解を行い、遠心分離により残存骨髄有核細胞を得、ここで、qRT-PCRによるグリア線維酸性タンパク質のmRNA発現を工程a)のサンプルにおけるネスチン+ MSCの総数の指標として使用することが可能であり、
d.工程a)のサンプルにおけるネスチンのmRNA発現を、正常被験者におけるネスチンのmRNA発現の参照もしくは対照値と、または正常被験者から得られた生物学的サンプルにおけるネスチンのmRNA発現と比較することを含む方法により実施可能であり、ここで、工程a)のサンプルにおけるネスチンのmRNA発現が該参照もしくは対照値と比べて、または正常被験者から若しくは経時的に得られた生物学的サンプルにおけるネスチンのmRNA発現と比べて低減している場合には、骨髄線維症に先行するニッチの損傷が該患者において存在する。
(実施例)
実施例1.図1〜13の材料および方法
1.1. ヒトにおける研究
この研究は治験審査委員会により承認された。ヘルシンキ宣言に従い、書面によるインフォームドコンセントを全患者から得た。世界保健機関(WHO)の改訂基準に従い、MPNの診断を確定した。
Mx1-cr;JAK2-V617F二重トランスジェニックマウスにおいて、ヒトJAK2-V617F突然変異の発現は内因性Jak2プロモーターにより駆動され、ポリイノシン-ポリシトシン(plpC)によるミクソウイルス耐性-1(Mx1)駆動Creリコンビナーゼ活性化に際して造血細胞において条件つきで発現されうる。PlpC誘導性トランスジェニックマウス、およびこれらのマウスからのBM細胞が移植された野生型マウスはPV19,20の進行性症状を発生する。
培養内コロニー形成単位(CFU-C)アッセイを行った。BRL37344および4-メチルカテコールを、特定されている濃度でメチルセルロースに加えた。水ジャケット付きインキュベーター内での37℃、5% CO2、20% O2における7日間のインキュベーションの後、50細胞を超えるコロニーを評価した。CFU-Fアッセイのために、BM CD45- Ter119-細胞を6ウェルディッシュ内にプレーティングし、維持培地(α-MEM、15% FCS、抗生物質含有)内で培養した。10〜12日間の培養の後、接着細胞を100% メタノールで固定し、ギムザ染料(Sigma)で染色して線維芽細胞塊を明らかに示した。50細胞を超えるコロニーをCFU-Fとして評価した。
Bio-Plex ProマウスTh17サイトカインパネルA 6-plex(M60-00007NY, Bio-Rad)を製造業者のプロトコールに従い実施した。Cxcl12タンパク質レベルを通常のELISAにより測定した。簡潔に説明すると、96ウェルプレートを2μg ml-1のモノクローナル抗ヒトおよびマウスCXCL12/SDF-1抗体(MAB350, R&D Systems)で4℃で一晩コートした。ブロッキング後、骨髄細胞外液を室温で2時間インキュベートし、ついでビオチン化抗ヒトおよびマウスCXCL12/SDF-1抗体(BAF310, RD)を加えた。ストレプトアビジン-ホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲート(RPN1231V, Dako)をシグナル表示のために使用し、ホースラディッシュペルオキシダーゼ基質(TMB, ES001-500ML, Chemicon, Millipore)で反応を停止させた。
マイクロアレイ分析のために、既に記載されているとおりに、対照細胞(n=1)またはMx1-cre;JAK2-V617F(n=3)が移植されてから10日後のNes-gfpマウスから得られたBM CD45- CD31- Ter119- Nes-GFP+細胞から全RNAを単離した。RNAを、NuGen Ovation系を使用して増幅し、Affymetrix MoGene 1.0 STアレイにハイブリダイズさせた。ロバストマルチアレイ平均(Robust Multi-array Average)(RMA)アルゴリズムを使用して、データの正規化を行った。既に公開されているデータとの主成分分析(PCA)比較を行うために、GEOデータセットをダウンロードし、GEOqueryバイオコンダクター(Bioconductor)パッケージ35を使用して前処理した。正規化データセットを同じ強度範囲に調節し、ComBat36を使用してバッチ効果補正を行った。
GraphPad Prism 5ソフトウェアおよびマイクロソフト・エクセル(Microsoft Excel)で統計分析およびグラフィックスを行った。特に示されていない限り、独立両側t検定によりデータセットを比較した。0.05未満のp値を統計的に有意とみなした。
本発明者らは、成体マウスBMにおいて、ネスチンプロモーター(Nes-GFP+)の調節要素下で緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現する間質細胞がHSC-ニッチおよびMSCの特徴の両方を示したことを既に示している(Mendez-Ferrerら, 2010)。本発明者らは、まず、肢BM発生中のNes-GFP+ 細胞を特徴づけした。E18.5 Nes-GFP+細胞は、しばしば、骨軟骨接合部内の発芽内皮細胞および細動脈に結合していた(図14a〜c)。大腿BM Nes-GFP+ 細胞をは不均一であり、BMSCの大部分だけでなく、生後期に増加するCD31+ 推定内皮細胞の小サブユニットをも含んでいた(図14d〜e)。Nes-GFP-BMSCと比較して、Nes-GFP+ 細胞集団は内因性ネスチンmRNA発現に富んでいた(図14f)。蛍光顕微鏡検査によれば、細動脈はGFPに関して、より明るく見えた。なぜなら、それらは、平滑筋アクチンを発現した外層および内皮細胞の内層を含む幾つかの同心円状GFP+ 細胞を含有していたからである(図14g)。胎児BM Nes-GFP+ 細胞は、S100を発現する骨軟骨、およびα1(I)-コラーゲンプロモーターの2.3キロベースの近位断片により遺伝的に標識された骨芽細胞から区別された(Dacquinら, 2002)(図14H〜J)。周産期におけるNes-GFP-BMSCの顕著な増殖とは対照的に、Nes-GFP+ 細胞は大部分が静止状態のままであった(図14k)。その結果、Nes-GFP- BMSCは絶えず増殖し、一方、Nes-GFP+ BMSC数は有意には変化しなかった(図14l)。
胎児軟骨形成に対するネスチン+ 細胞の寄与の欠如は胎児BMにおけるそれらのMSC特性に関する問題を提起した。したがって、本発明者らは、線維芽細胞コロニー形態単位(Cfu-f)(Friedensteinら, 1970)およびメセンスフェア形成(Mendez-Ferrerら, 2010)アッセイを用いて、精製BM間質サブセットにおける中胚葉前駆体活性を測定した。Nes-GFP発現によりBMSCを単離した。後期発生中および生後第1週に、Cfu-f度数は、GFP- 間質集団においては、GFP+ 細胞より6倍高かった(図16a)。顕著なことに、より後の生後段階においては、Cfu-f活性は、GFP- BMSCにおけるその劇的な低下ゆえに、Nes-GFP+細胞に徐々に限局された(E18.5-P14中のそれぞれ>100倍対0.5倍の低下)。P7において、Nes-GFP-細胞に由来するCfu-fは大部分が前骨芽細胞を含有していた(図16b〜d)。軟骨細胞発生に関連した遺伝子の発現はE18.5において、Nes-GFP+ BMSCよりNes-GFP-においては高かった。これとは対照的に、軟骨形成、骨形成および脂肪形成のマスター調節因子の発現は、漸増MSC富化と合致して、生後Nes-GFP+ BMSCにおいて徐々に富化された(図16e)。総合すると、これらの結果が示唆するところによると、ほとんどの胎児BMSCはネスチンを発現せず、決定づけられた骨格前駆体へと急速に分化して、生後第2週までにMSC活性を喪失する。これとは対照的に、ネスチン+ 細胞は一生を通じて、保存されたMSC活性を示す。
本発明者らは、NC細胞を増殖させるために使用した類似培養条件下、成体マウスBM Nes-GFP+細胞は、連続移植中に異所性部位に造血活性を伝達しうる自己再生かつ多能性の間葉スフェアを形成しうることを既に示している(Mendez-Ferrerら, 2010)。また、本発明者らは、ヒトBM由来メセンスフェアが分泌因子によりヒト臍帯血HSCを増殖させうることを示している(Isernら, 2013b)。本発明者らは胎児BMSCにおける間葉前駆体活性を測定した。Cfu-f効率はE17.5において、Nes-GFP+ 細胞におけるよりNes-GFP- においては約3倍高かった(図3f)。逆に、非接着性スフェア形成はGFP+ 細胞においては顕著に富化されたが、GFP- 細胞に由来するほとんどのスフェアはプラスチックに迅速に接着し、自然に分化した(図16g〜h)。BM Nes-GFP+細胞により形成されたスフェアは間葉様紡錘形GFP+ 細胞を含有していた(図16i〜l)。
Mx1-cre駆動体を発現するBMSCは骨ターンオーバーに寄与するが(Parkら, 2012)、ネスチン+ MSCとのそれらの重複は依然として明らかでない。本発明者らの結果は、MSC活性が、生後段階で骨形成に関与する遺伝子を高発現したBM Nes-GFP+細胞に徐々に限局することを示している(図16e)。また、本発明者らの研究は成体骨軟骨系統に対するネスチン+ 細胞の低い寄与を示唆している(Mendez-Ferrerら, 2010)。本発明者らは、2つの独立した機能喪失モデルを用いて、縦方向の骨成長の後の骨格リモデリングを研究した。Nes-CreERT2マウスを、ジフテリア毒素(iDTA)(Brockschniederら, 2006)またはその受容体(iDTR)を発現するCre-リコンビナーゼ誘導性系統と交雑させた。二重トランスジェニックおよび対照同腹子マウスに成体時にジフテリア毒素および/またはタモキシフェンを慢性的に投与した(図17a)。骨デンシトメトリーは、ネスチン+ 細胞の枯渇の6カ月後に椎骨密度(BMD)における一過性の低減を示したに過ぎなかった(図17b)。これと合致して、満期に犠死させた実験マウスは間葉または骨芽細胞活性における相違を示さなかった(図17c〜d)。これとは対照的に、組織形態計測は破骨細胞数の増加および石灰化活性の低下を示した(図17e〜l)。全ての脊椎(中胚葉由来)骨格パラメータは正常であったが(データ非表示)、NC由来骨において幾つかの異常が認められた。これらの欠損は鼻骨および前上顎骨の骨化の低下、骨溶解性頭蓋骨病変ならびに左右非対称を含んでいた(図17m〜o)。総合すると、これらの結果は、ネスチン+ 細胞が遺伝的に除去された成体マウスにおける軽度の骨格欠損を示している。したがって、MSC活性は大部分が成体ネスチン+ 細胞内に限局しているが、それらは中軸骨格の生理的ターンオーバーに対する比較的僅かな寄与を示し、したがってMx1-cre由来間葉誘導体とは異なる様態で挙動する(Parkら, 2012)。
NC細胞はネスチン発現およびスフェア形成能によって特徴づけられる。NC由来細胞は成体マウスBMにおいて既に報告されているが(Glejzerら, 2011; Komadaら, 2012; Morikawaら, 2009b; Nagoshiら, 2008)、それらの厳密な正体、発生動態および機能は依然として把握困難である。また、これらの研究において使用されたWnt1-Creマウスにおいて、異所性Wnt1活性化が報告されている(Lewisら, 2013)。本発明者らは、異所性Wnt1活性を誘導しない最近のWnt1-Cre2系統で遺伝的予定運命決定研究を行った(Lewisら, 2013)。意外にも、新生Wnt1-Cre2;R26-Tomato二重トランスジェニックマウスからの肢骨は、骨沈着の最も最近の層を構成するNC由来骨芽細胞および破骨細胞、ならびに大腿骨頭の最外層に同様に分布した軟骨細胞を示した(図18a〜b)。予想どおり、グリア線維酸性タンパク質(GFAP)を発現するNC由来シュワン細胞も1週齢BMにおいて検出された(図18c〜d)。興味深いことに、Nes-GFP+ 細胞に類似した形態学的特徴および分布を有するGFAP- 血管周囲細胞もWnt1+ 細胞から誘導された(図18e〜f)。NC由来骨軟骨細胞数は生後第1週に増加したが(図18g)、このことは、NCが発生後期における肢骨に寄与することを示唆している。確認として、広く使用されているWnt1-Cre系統は成体BMにおけるNC由来細胞の維持をも示した。注目すべきことに、ほとんどの成体NC予定運命決定細胞はネスチンを発現し、多数は交感神経線維に結合しており(データ非表示)、後者はもう1つのNC誘導体に相当し、これを本発明者らはネスチン+ MSCの調節による概日HSCトラフィック(Mendez-Ferrerら, 2008)の制御に既に関連づけている(Mendez-Ferrerら, 2010)。
本発明者らは胎児BM Nes-GFP+ 細胞の考えられうる不均一性を調べた。ほとんどの成体BMネスチン+ 細胞はPDGFRαであるが、ネスチン+ PDGFRαシュワン細胞はHSCの維持に寄与することも最近見出された(Yamazakiら, 2011)。本発明者らは、BM Nes-GFP- 細胞が特徴的なGFAP+シュワン細胞と密接に関連していることを見出した(データ非表示)。本発明者らは新生GFP/-PDGFRα/- BMSCにおいて次世代配列決定を行った(図19a)。内因性PdgfrαおよびNes転写産物は、その単離法が有効であることを証明した。興味深いことに、Ly6a/Sca1発現はGFP-PDGFR +細胞において、より高かったが(非表示)、HSCニッチ形成間葉細胞を特徴づけるレプチン受容体およびHSC維持遺伝子(Cxcl12, Kitl, Angpt1)の発現(Dingら, 2012)はGFP+PDGFRα+ 細胞において非常に富んでいた(図19b)。この集団においては他のMSC遺伝子も豊富に発現された(図S5C)。これとは対照的に、Nes-GFP+ PDGFRα- 細胞は、シュワン細胞前駆体に特徴的な遺伝子(SCPs; Sox10, Plp1, Erbb3, Dhh)を発現したが、Gfapのような成熟シュワン細胞遺伝子を発現しなかった(図19C)。
神経周囲SCP遊走は、発生中の神経により産生されるニューレグリン-1リガンドと受容体チロシン-プロテインキナーゼErbB3の相互作用を要する(JessenおよびMirsky, 2005)。本発明者らはErbb3欠損マウス(Riethmacherら, 1997)の胎児肝臓およびBMを分析した。胎児肝臓造血前駆体は不変であった(図20a)。これとは対照的に、Nes-GFP+ 細胞に富むMSCマーカーCD90の発現(図20b〜c)はErbb3+/- 肢BMにおいて2倍低減し、これはBM造血前駆体5倍の低減に関連づけられた(図20d〜g)。胎児造血に対するNCの寄与を更に精査するために、本発明者らは、シュワン前駆細胞においてErbb3を欠くマウスにおいて類似分析を行った。デザートヘッジホッグ(Dhh)プロモーター(Jaegleら, 2003)の調節要素下でcreリコンビナーゼを発現する系統と交雑させたR26-Tomatoレポーターマウスは標識シュワン細胞を有していた。Dhh-CreマウスをErbB3条件的欠損マウスと交雑させた。構成的KOと同様に、Dhh-Cre;Erbb3fl/fl マウスはシュワン細胞を実質的に欠いている(Sheeanら, 2014)。これとは対照的に、Dhh-Cre;Erbb3fl/fl マウスはBM造血前駆体の正常頻度を示した。これらの結果は、シュワン細胞系統に未だ運命づけられていないNC細胞が、発生中の神経に沿ってBMへと遊走し、HSCニッチ形成MSCに寄与することを示唆している。
詳細な免疫蛍光分析は新生児BMにおけるNes-GFP+ 細胞へのHSCの有意な接近性を示した(図21a〜b)。本発明者らは、ネスチン+ 細胞においてジフテリア毒素(iDTA)またはその受容体(iDTR)を発現するマウスを使用して、胎児肝臓からBMへのHSC遊走に対するネスチン+ 細胞の寄与を調べた。Nes-CreERT2;iDTRマウスにおけるE15.5におけるネスチン+ 細胞の枯渇は48時間以内に胎児BM HSC活性における〜4倍の低減を引き起こし、これは胎児肝臓HSC活性における〜8倍の増加と逆相関した(図21c〜d)。造血前駆体の細胞周期プロファイルまたはアポトーシスは不変であったが(図S7A)、胎児肝臓におけるそれらの数は40%増加した(図21e)。ネスチン+ 細胞の枯渇を、それを行わなければ正常BM組織学的特徴を示したNes-CreERT2;iDTAマウスの生後第1週で行うことにより、類似した結果が得られた(図21f)。BMへの発生HSC遊走は生後2週まで進行したが(DzierzakおよびSpeck, 2008)、このことは、HSCを順応させるためにBM環境がこの期間中に尚も成熟しうることを示唆している。したがって、E18.5およびP7のNes-Gfp BMからGFP+/-BMSCを単離した。HSC支持遺伝子の発現は顕著に、より高く、GFP+細胞において徐々にアップレギュレーションされたが(図21g)、このことは、ネスチン+ MSCがBMにおけるHSCニッチの形成に寄与しうることを示唆している。
胎児BMへのHSC遊走はCxcl12および幹細胞因子により増強され(Christensenら, 2004)、これらは周産期のBMネスチン+ 細胞において高発現され、次第にアップレギュレーションされる。Cxcl12は種々の間質細胞により産生され、HSCによる発生BMコロニー形成に要求される(Araら, 2003)。内皮細胞およびネスチン- 間葉系前駆体によっては産生されるがネスチン+ 細胞によっては産生されないCxcl12は成体HSCの維持に必要であると主張されている(DingおよびMorrison, 2013; Greenbaumら, 2013)。本発明者らは、出生の1週間後、Cxcl12 mRNAレベルがNes-GFP+BMSCにおいてはそれぞれBM内皮およびNes-GFP-BMSCより>20〜80倍高いことを見出した(図21h)。本発明者らは、Cxcl12flマウス(Tzengら, 2010)を使用して、生後第1週に、ネスチン+細胞におけるCxcl12を条件的に欠失させた。該マウスは、この期間中に大部分がNes-GFP+ 細胞を標識している、Nes-CreERT2マウスと交雑させたものである(図21i)。タモキシフェン投与はBM内皮細胞におけるCxcl12 mRNAレベルを有意には変化させず、むしろBMSCにおけるこれらのレベルを5倍減少させた(図21j〜k)。これはBM造血前駆体の〜30%の減少に関連づけられた(図21l)。これらの結果は、ネスチン+ MSCが、Cxcl12産生により、発生中のBMにおけるHSCニッチ形成に寄与することを示している。
12.1. 動物
本研究において使用したマウス系統には以下のものが含まれた: Nes-Gfp (Mignoneら, 2004), Nes-CreERT2(BalordiおよびFishell, 2007), Sox10-CreERT2(Matsuokaら, 2005), Col2.3-Cre (Dacquinら, 2002), Dhh-Cre (Jaegleら, 2003), RCE-loxP (Sousaら, 2009), LSL-KFP (Dieguez-Hurtadoら, 2011), R26-DTA (Brockschniederら, 2006), Cxcl12floxed (Tzengら, 2010), Erbb3floxed (Sheeanら, 2014), Erbb3-null (Riethmacherら, 1997), Tg(Wnt1-cre/ERT)1Alj/J, 129S4.Cg-Tg(Wnt1-cre)2Sor/J, C57BL/6-Gt(ROSA)26Sortm1(HBEGF)Awai/J, B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J, CD1およびC57BL/6Jマウス (Jackson Laboratories)。実験手法はSpanish National Center for Cardiovascular Research、Icahn School of Medicine at New YorkおよびKarolinska Instituteの動物管理使用委員会により承認された。
既に記載されているとおりに(Isernら, 2008)、胚を解剖した。簡潔に説明すると、関心のある対立遺伝子を保有するマウス間の選択された交雑を準備し、膣栓の検出の日の朝を妊娠0.5日とみなした。本発明者らは、複合または単純トランスジェニック雄を野生型バックグラウンド(C57BL/6またはCD1)の雌と交配させることにより、父系トランスジーン伝達を優先的に用いた。誘導性系統追跡研究を以下のとおりに行った。タモキシフェン(Sigma,T-5648)を20mg/mLの最終濃度でトウモロコシ油に溶解し、示されている段階の朝に妊娠雌親に経口胃管栄養法(100〜150 mg/Kg)により投与した。新生児の誘導のために、運搬後第1日および第3日に新生仔の母にタモキシフェン(経口胃管栄養法, 4mg)を投与した。
組織学的検査用の解剖された組織をパラホルムアルデヒド2%中、4℃で固定し、15%および30% スクロース中の連続的平衡化により凍結保存し、OCT化合物(Tissue-Tek)内に瞬間凍結包埋した。幾つかの場合には、固定され凍結された肢または胸骨を、中央髄腔が露出するまで両側から連続的に切断し、ホールマウント蛍光染色のために更に加工した。厚さ15 mのクリオスタット切片を調製し、免疫染色または通常のヘマトキシリン-エオシン染色のために加工した。記載されているとおりに(Isernら, 2013a)、オイルレッドO染色を行った。
クリオスタット切片の染色を標準的な方法により行った。簡潔に説明すると、組織を室温(RT)で5〜10分間、0.1% Triton X-100で透過性促進させ、TNBバッファー(0.1M Tris-HCl, pH 7.5, 0.15M NaCl, 0.5% ブロッキング試薬, Perkin Elmer)で室温で1時間ブロッキングした。一次抗体を室温で1〜2時間または4℃で一晩インキュベートし、二次抗体を室温で1時間インキュベートした。PBS + 0.05% Tween-20で反復洗浄を行った。染色組織切片を5 M DAPIで5分間、対比染色し、PBSで洗浄した。スライドを、ベクタシールド(Vectashield)ハードセットマウンティング媒体(Vector Labs)を使用してマウントし、マニキュア液で密封した。
胎児BMおよび胎児肝臓切片の染色を標準的な方法に従い行った。使用した抗体を表(後記を参照されたい)に示す。新生マウスからの骨髄切片において、SLAM染色を行った。まず、スライドをPBS中の20% ヤギ血清中で45分間ブロッキングした。内因性アビジンおよびビオチンをアビジン/ビオチンブロッキングキット(Vector Laboratories)で各試薬につき30分間ブロッキングし、それらの間にPBSでの3回の洗浄を行った。ついでスライドをヤギブロッキングバッファー中の1:50の希釈度のラット抗マウスCD150抗体(Biolegend)中で2時間インキュベートした。Alexa555(Molecular Probes)に結合したヤギ抗ラットIgGをPBS中の20% ヤギ血清中の1:200の希釈度で1時間加えた。ついでスライドをPBS中の20% ラット血清中で10分間ブロッキングした。ついでそれらをハムスター抗マウスビオチン結合CD48(Abcam)中ならびにラット抗マウスB220、ラット抗マウスCD3、ラット抗マウスGr1、ラット抗マウスMac-1およびラット抗マウスTer119抗体(それぞれはラットブロッキングバッファー中で1:200の希釈度)を含むBiotin Mouse Lineage Panel (BD Pharmingen)中で1時間インキュベートした。Cy5結合ストレプトアビジン(Molecular Probes)をラットブロッキングバッファー中の1:200で30分間加えた。最後に、スライドをDAPI(5mg/ml ストックの1:1000希釈)と共に室温で10分間インキュベートし、Vectashield Mounting Medium (Vector)を使用してマウントした。
蛍光染色からの共焦点イメージを、レーザー走査共焦点(Zeiss LSM 700, 10X/0.45, 25X/0.85)または多光子Zeiss LSM 780顕微鏡(20X/1.0)のいずれかを使用して得た。最大強度アルゴリズムを使用してZen2011ソフトウェアパッケージ(Zeiss)で光学的z-スタック投射を生成させた。ホールマウント試料の広視野イメージを、Olympus DP71カラーカメラを備えたLeica MZFLIII実体顕微鏡でイメージングした。イメージを後処理し、ImageJ(Schneiderら, 2012)およびPhotoshop(Adobe)を使用して定量した。
胎児の骨格要素を胎児から部分解剖し、切断によりホモジナイズし、0.25% コラゲナーゼ(StemCell Technologies, Cat. # 07902)中、振とうしながら37℃で15〜30分間消化した。生後骨試料を周辺組織から綺麗にし、乳鉢内で乳棒で破砕し、37℃で45〜60分間、一定の撹拌を行いながらコラゲナーゼ消化した。酵素処理後、骨格調製物を40 m細胞ストレーナーで濾過し、未消化骨材を廃棄した。得られた骨髄富化細胞懸濁液をペレット化し、2回洗浄し、更なる分析のためにFACS染色バッファー(PBS中の2% FCS)に再懸濁させた。
分散骨髄細胞調製物をFACSバッファー中、氷上で、選択された多色抗体カクテル(後記を参照されたい)で15〜30分間染色し、洗浄し、必要に応じてストレプトアビジン結合体と共に再懸濁させた。染色された細胞をペレット化し、死細胞を排除するためにDAPI含有バッファーに再懸濁させた。まず、定められた間質集団をFACS選別により単離し、ついで該選別集団をHoescht 33342で染色した後で細胞周期プロファイルを得ることにより、FACSによる細胞周期分析を行った。Diva Software(BD Biosciences)を備えたFACS CantoIIまたはLSRFortessa装置(BD Biosciences)において、あるいはFACS AriaII細胞選別機(BD Biosciences)において、FACS分析および選別を行った。Diva and FlowJo(Tree Star, Inc)を使用してデータを分析した。
CFU-Fアッセイのために、BM細胞懸濁液を100〜500細胞/cm2の細胞密度で6ウェルプレート内に直接的にFACS選別し、維持培地(α-MEM/15% FCS, 抗生物質含有)内で培養した。10〜12日間の培養の後、接着細胞を100% メタノールで固定し、ギムザ染料(Sigma)で染色して線維芽細胞塊を明らかに示した。50細胞を超えるコロニーをCFU-Fとして評価した。CFU-OBアッセイのために、プレーティングされた細胞を、1mM L-アスコルバート-2-ホスファートの存在下、維持培地内で培養した。全ての培養を37℃の水ジャケット付きインキュベーター内で5% CO2で維持し、培地交換を毎週行った。25日間の培養の後、細胞を固定し、既に記載されているとおり(Isernら, 2013a)にアリザリンレッドまたはアルカリホスファターゼで染色した。
単個細胞浮遊液をBMから調製し、サイトカインを含有するメチルセルロース含有培地と混合した(Casanova-Acebesら, 2013)。細胞(5〜7.5×104個)を35mmディッシュ(Falcon, BD)内に二重に重複してプレーティングし、20% O2および5% CO2下、水ジャケット付きインキュベーター内でインキュベートした。6〜7日間の培養の後、造血コロニー(CFU-C)を評価した。
長期培養開始細胞アッセイ(long-term culture-initiating cell assay)を、記載されているとおり(Woehrerら, 2013)に行った。簡潔に説明すると、フィーダー胎児間質細胞AFT024(K. Moore博士により快く提供されたもの)を、既に記載されているとおり(Noltaら, 2002)に維持した。使用の1週間前に、該フィーダーを137Cs照射器で照射し、96ウェルプレート内にコンフルエンシーで播いた。7〜10日後、選別された胎児肝臓Lin- Sca1+細胞およびBM有核細胞の5つの系列希釈物(それぞれは16個の重複体を有する)を照射フィーダー上に播き、10-6 M ヒドロコルチゾン(StemCell Technologies)および1% ペニシリン-ストレプトマイシン(Invitrogen)で補足されたMyelocult M5300で培養した。培養を水ジャケット付きインキュベーター内で20% O2および5% CO2下、33℃で4週間維持した。半分の培地の交換を毎週行った。ついで各ウェルを10分間トリプシン処理し、PBSで洗浄し、造血前駆体アッセイにおいてプレーティングした。プレーティングの12日後、CFU-Cを生成しなかった、各実験群における培養皿の百分率を試験細胞数に対してプロットした。長期培養開始細胞の度数を、37%の陰性応答を示した試験ウェルの数の逆数としてのポアソン統計および最大尤度のニュートン-ラプソン法により、L-CalcTMソフトウェア(StemCell Technologies)を使用して計算した。
ELISA
BM細胞外液のサンプルおよび血漿における酒石酸耐性酸性ホスファターゼ(TRAP)活性を、マウスTRAP SB-TR103キット(Immuno Diagnostics Systems)を該製造業者の推奨に従い使用して測定した。骨再吸収率を測定するためのデオキシピリジノリン(DPD)架橋尿検査を、MicroVueDPD 8007キット(Quidel Corporation)を該供給業者の推奨どおりに使用して行った。Dimension RxL Max分析装置においてALP-アルカリホスファターゼFlex試薬(Siemens)を該製造業者の説明に従い使用して、血漿およびBM細胞外液においてアルカリホスファターゼレベルを決定した。
乳棒を使用して、解剖した骨から初代BM細胞を得た。全ての培養を水ジャケット付きインキュベーター内で20% O2および5% CO2下、37℃で維持した。線維芽細胞(CFU-F)および骨芽細胞コロニー形成単位(CFU-OB)を得るために、0.5×106個のBM有核細胞を、1% ペニシリン-ストレプトマイシン、15% FBS(Invitrogen)および1mM L-アスコルビン酸2-ホスファート(Sigma)で補足されたα-MEM培地を含有する12ウェルプレートの各ウェル内に播いた。半分の培地を5日ごとに交換した。10および28日間の培養の後、それぞれCFU-FおよびCFU-OBの数を評価した。CFU-F培養物を、メタノールを使用して室温で10分間固定した。リン酸バッファー(pH 6.8)中で1:10希釈されたギムザで染色を37℃で10分間行った。CFU-Fコロニー(50個を超える細胞を含有するもの)を後日計数した。CFU-OB培養物を4% パラホルムアルデヒド(PFA)で室温で5分間固定した。該培養物に5% AgNO3を加えて、フォン・コッサ染色を行い、プレートをUV照射に20分間曝露した。その後、細胞を蒸留水中の5% (NH4)2S2O3と共に5分間インキュベートした。細胞を2% エオシンで対比染色した。アリザリンレッド染色のために、細胞を蒸留水中の2% アリザリンレッド試薬(Sigma)と共に15分間インキュベートした。アルカリホスファターゼ染色のために、Sigma Fast BCIP/NBT基質(Sigma)を細胞培養に加え、暗所中で15分間インキュベートした。インビトロ分化破骨細胞を、10% FBS、1% P/S(Invitrogen)および5 n/g hM-CSF(Peprotech)で補足されたα-MEM培地を含有する6ウェルプレートの1ウェル内で2日間にわたって、播かれたBM有核細胞から誘導した。2日後、間質プラスチック接着細胞を廃棄し、50万個の非接着細胞を、10% FBS(Invitrogen)、30 n/g hM-CSFおよび60 n/g shRANK(Peprotech)で補足されたα-MEMを含有する12ウェルプレートの各ウェル内に播いた。培地は2日ごとに交換した。細胞分化状態に応じて6〜8日後に培養を停止させた。細胞を、シトラートおよびアセトンで補足された37% ホルムアルデヒド中で1分間固定した。破骨細胞を染色するために、TRAP染色キット(Biocat)を該製造業者の推奨に従い使用した。
大腿骨をOCT内に包埋し、10μm切片を得た。酸性ホスファターゼ、白血球(TRAP)キット(Sigma)を該製造業者の説明に従い使用して、切片を染色した。
CFU-Fおよび骨芽細胞培養からのRNAを、Trizol試薬(Sigma-Aldrich)を該製造業者の説明に従い使用して抽出し、RNeasyミニカラム(Qiagen)で精製した。残留ゲノムDNAを除去するために、クリーンアップ工程の前に、オンカラムDNアーゼ消化(Qiagen)を行った。破骨細胞培養の場合、Dynabeads mRNA Directキット(Invitrogen)を使用して、mRNAを抽出した。どちらの場合も、最終的に、Hight Capacity cDNA逆転写試薬(Applied Biosystems)を使用してcDNAを作製した。SYBRgreen Universal PCR Master Mix(Applied Biosystems)を使用して、三重重複でqPCRを行った。各標的遺伝子に対して最適化されたプライマーを使用した。標準曲線法を用いてGapdh転写産物存在量に対して正規化することにより、各転写産物に関する相対的定量を得た。既に記載されているとおりに(Sunら, 2013)、骨組織形態計測研究を行った。
スフェア(sphere; 球状物)形成のために、超低接着性35mmディッシュ(StemCell Technologies)内で細胞をクローン密度(< 1,000細胞/cm2)でプレーティングした。増殖培地は、記載されているとおり(Pajtlerら, 2010; StempleおよびAnderson, 1992)に調製された15% ニワトリ胚抽出物;0.1mM β-メルカプトエタノール;1% 非必須アミノ酸(Sigma);1% N2および2% B27サプリメント(Invitrogen);組換えヒト線維芽細胞増殖因子(FGF)塩基性、組換えヒト上皮増殖因子(EGF)、組換えヒト血小板由来増殖因子(PDGF-AB)、組換えヒトオンコスタチンM(227 a.a. OSM)(20 ng/ml)および組換えヒトインスリン様増殖因子-1(IGF-1; 40 ng/ml)(Peprotech)をDMEM/F12 (1:1) / ヒト内皮 (1:2) 無血清培地 (Invitrogen)内に含有していた。該培養を水ジャケット付きインキュベーター内で37℃、5% CO2、20% O2で維持し、細胞凝集を防ぐために、触らずに低密度培養内で1週間放置した。半分の培地の交換を毎週行った。メセンスフェアを第10〜14日に評価した。
本発明者らは、Biernaskieら, Isolation of skin-derived precursors (SKPs) and differentiation and enrichment of their Schwann cell progeny. Nat Protoc (2006) vol. 1 (6) pp. 2803-12の原型法を、幾つかの修飾を加えて応用した。Nes-Gfp新生児のコラゲナーゼ処理BMから、GFPおよびPDGFR 発現に基づいて、一定の間質集団を単離した。選別細胞をラミニン/ポリリジン被覆チャンバースライドディッシュ(Labtek)上にプレーティングし、SKP培地I内で接着させ増殖させた。3日後、細胞をSKP培地II(50 ng/mLのニューレグリン-1を含有)と交換し、>10日間にわたって更に分化させた。インビトロ産生シュワン細胞は厚い伸長細胞として形態学的に定められた。分化後、細胞をPFA 4%で固定し、Triton X-100で穏やかに透過性促進させ、抗グリア線維酸性タンパク質(GFAP)抗体(Dako)で免疫蛍光用に染色した。
Nes-Gfp新生児のコラゲナーゼ処理BMから、GFPおよびPDGFR 発現に基づいて、一定の間質集団を単離し、プラスチックディッシュ内に直接的にプレーティングして線維芽細胞を付着させた。接着細胞を、15% FBSで補足された通常のa-MEM培地内で7〜14日間培養した。幾つかの場合には、組換えPDGFを20 ng/mLの濃度で加えた。培養期後、細胞を固定し、脂肪細胞を明らかに示すためにオイルレッドOで更に染色し、ヘマトキシリンで対比染色した。
Dynabeads(登録商標)mRNA DIRECT(商標)マイクロキット(Micro Kit)(Invitrogen)を使用してRNA単離を行った。逆転写系(Reverse Transcription System)(Promega)を該製造業者の推奨に従い使用して逆転写を行った。既に記載されているとおりに(Mendez-Ferrerら, 2008)、定量リアルタイムRT-PCRを行った。相対的標準曲線法を用いて各遺伝子の発現レベルを決定した。簡潔に説明すると、ヒト参照全RNA(Clontech)の系列希釈を行うことにより標準曲線を作成した。各遺伝子の発現レベルを該標準曲線からの内挿により計算した。全ての値を内因性対照としてのGAPDHで正規化した。qPCR用のオリゴヌクレオチドの配列は後記に記載されている。
次世代配列決定のために、Arcturus Picopure RNA単離キット(Life Technologies)を使用して、新生児Nes-Gfp骨髄調製物(2つの生物学的重複体)から得られた少数のFACS選別細胞(15,000〜80,000個)から全RNAを単離した。それぞれの独立したサンプルセットを複数の同腹子からのプール化骨格要素(長骨および胸骨)から得た。
インデックスタグ付きcDNAを構築するためにTruSeq RNA Sample Preparation v2 Kit (Illumina, San Diego, CA)でRNA配列決定ライブラリーを調製した。DNA-1000 Kit (Agilent Bioanalyzer)を使用してイルミナ(Illumina)ライブラリーの質、量およびサイズ分布を決定した。TruSeq SBS Kit v5を使用して、標準的なRNA配列決定プロトコールに従い、Genome Analyzer IIx (Illumina)でライブラリーを配列決定した。各ライブラリーのリード(read、読取り)を含有するFastqファイルを抽出し、Casava v1.8.2パイプライン(pipeline)を使用してデマルチプレクスに付した。
カットアダプト(cutadapt)ソフトウェアツール(MIT)を使用して配列決定アダプターの汚染をリードから除去し、得られたリードを、RSEM v1.1734(LiおよびDewey, 2011)を使用するトランスクリプトーム(NCBIM37 Ensembl gene-build 65)でマッピングし、定量した。≧2つのサンプルにおいて> 2カウント毎百万(counts per million)を有する遺伝子のみを統計分析のために考慮した。ついでデータを正規化し、差次的発現を評価した(バイオコンダクター(bioconductor)パッケージEdgeR(Robinsonら, 2010)を使用して行った)。各RNA-Seq実験からのlog2正規化カウントと共にlog2-正規化GEOデータセットに関して、ComBat(Johnsonら, 2007)を使用してバッチ補正を行った。≦0.05のベンジャミニ-ホッホバーグ(Benjamini-Hochberg)補正p値を有する遺伝子を、差次的に発現されたものとみなした。
正規化RNA-Seqデータを主成分分析(PCA)により、既に公開されているアレイ発現データと比較した(表S3を参照されたい)。GEOデータセットをダウンロードし、GEOqueryバイオコンダクター(Bioconductor)パッケージ(DavisおよびMeltzer, 2007)を使用して前処理した。既に記載されているとおりに(HeiderおよびAlt, 2013)、正規化データセットを同じ強度範囲に調節した。ComBat(Johnsonら, 2007)を使用してバッチ効果補正を行った。
Ara, T., Tokoyoda, K., Sugiyama, T., Egawa, T., Kawabata, K., and Nagasawa, T. (2003). Long-term hematopoietic stem cells require stromal cell-derived factor-1 for colonizing bone marrow during ontogeny. Immunity 19, 257-267.
Arai, F., Hirao, A., Ohmura, M., Sato, H., Matsuoka, S., Takubo, K., Ito, K., Koh, G.Y., and Suda, T. (2004). Tie2/angiopoietin-1 signaling regulates hematopoietic stem cell quiescence in the bone marrow niche. Cell 778, 149-161.
Avecilla, ST., Hattori, K., Heissig, B., Tejada, R., Liao, F., Shido, K., Jin, D.K., Dias, S., Zhang, F., Hartman, T.E., et al. (2004). Chemokine-mediated interaction of hematopoietic progenitors with the bone marrow vascular niche is required for thrombopoiesis. Nat Med 10, 64-71.
Balordi, F., and Fishell, G. (2007). Mosaic removal of hedgehog signaling in the adult SVZ reveals that the residual wild-type stem cells have a limited capacity for self-renewal. J Neurosci 27, 14248-14259.
Brockschnieder, D., Pechmann, Y., Sonnenberg-Riethmacher, E., and Riethmacher, D. (2006). An improved mouse line for Cre-induced cell ablation due to diphtheria toxin A, expressed from the Rosa26 locus. Genesis 44, 322-327.
Calvi, L.M., Adams, G.B., Weibrecht, K.W., Weber, J.M., Olson, D.P., Knight, M.C., Martin, R.P., Schipani, E., Divieti, P., Bringhurst, F.R., et al. (2003). Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche. Nature 425, 841 -846.
Caplan, A.I. (1991 ). Mesenchymal stem cells. Journal of orthopaedic research : official publication of the Orthopaedic Research Society 9, 641 -650.
Chan, C.K., Chen, CO, Luppen, OA., Kim, J.B., Deboer, AT., Wei, K., Helms, J.A., Kuo, C.J., Kraft, D.L., and Weissman, I.L. (2008). Endochondral ossification is required for haematopoietic stem-cell niche formation. Nature.
Chan, C.K., Lindau, P., Jiang, W., Chen, J.Y., Zhang, L.F., Chen, CO, Seita, J., Sahoo, D., Kim, J.B., Lee, A., et al. (2013). Clonal precursor of bone, cartilage, and hematopoietic niche stromal cells. Proc Natl Acad Sci U S A 110, 12643-12648.
Christensen, J.L., Wright, D.E., Wagers, A.J., and Weissman, I.L. (2004). Circulation and chemotaxis of fetal hematopoietic stem cells. PLoS Biol 2, E75.
Crisan, M., Yap, S., Casteilla, L., Chen, C.W., Corselli, M., Park, T.S., Andriolo, G., Sun, B., Zheng, B., Zhang, L et al. (2008). A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell stem cell 3, 301-313.
Dacquin, R., Starbuck, M., Schinke, T., and Karsenty, G. (2002). Mouse alpha1 (l)-collagen promoter is the best known promoter to drive efficient Cre recombinase expression in osteoblast. Dev Dyn 224, 245-251.
Dieguez-Hurtado, R., Martin, J., Martinez-Corral, I., Martinez, M.D., Megias, D., Olmeda, D., and Ortega, S. (201 1 ). A Cre-reporter transgenic mouse expressing the far-red fluorescent protein Katushka. Genesis 49, 36-45.
Ding, L., and Morrison, S.J. (2013). Haematopoietic stem cells and early lymphoid progenitors occupy distinct bone marrow niches. Nature 495, 231-235.
Ding, L., Saunders, T.L., Enikolopov, G., and Morrison, S.J. (2012). Endothelial and perivascular cells maintain haematopoietic stem cells. Nature 481, 457-462.
Dzierzak, E., and Speck, N.A. (2008). Of lineage and legacy: the development of mammalian hematopoietic stem cells. Nat Immunol 9, 129-136.
Friedenstein, A.J., Chailakhjan, R.K., and Lalykina, K.S. (1970). The development of fibroblast colonies in monolayer cultures of guinea-pig bone marrow and spleen cells. Cell Tissue Kinet 3, 393-403.
Glejzer, A., Laudet, E., Leprince, P., Hennuy, B., Poulet, C, Shakhova, O., Sommer, L, Rogister, B., and Wislet-Gendebien, S. (201 1 ). Wnt1 and BMP2: two factors recruiting multipotent neural crest progenitors isolated from adult bone marrow. Cell Mol Life Sci 68, 2101 -21 14.
Greenbaum, A., Hsu, Y.M., Day, R.B., Schuettpelz, L.G., Christopher, M.J., Borgerding, J.N., Nagasawa, T., and Link, D.C. (2013). CXCL12 in early mesenchymal progenitors is required for haematopoietic stem-cell maintenance. Nature 495, 227-230.
Isern, J., Martin-Antonio, B., Ghazanfari, R., Martin, A.M., Lopez, J.A., del Toro, R., Sanchez-Aguilera, A., Arranz, L., Martin-Perez, D., Suarez-Lledo, M et al. (2013). Self-renewing human bone marrow mesenspheres promote hematopoietic stem cell expansion. Cell Rep 3, 1714-1724.
Jaegle, M., Ghazvini, M., Mandemakers, W., Piirsoo, M., Driegen, S., Levavasseur, F., Raghoenath, S., Grosveld, F., and Meijer, D. (2003). The POU proteins Brn-2 and Oct-6 share important functions in Schwann cell development. Genes Dev 17, 1380-1391.
Jessen, K.R., and Mirsky, R. (2005). The origin and development of glial cells in peripheral nerves. Nat Rev Neurosci 6, 671-682.
John, N., Cinelli, P., Wegner, M., and Sommer, L. (201 1 ). Transforming growth factor beta-mediated Sox10 suppression controls mesenchymal progenitor generation in neural crest stem cells. Stem Cells 29, 689-699.
Katayama, Y., Battista, M., Kao, W.M., Hidalgo, A., Peired, A.J., Thomas, S.A., and Frenette, P.S. (2006). Signals from the sympathetic nervous system regulate hematopoietic stem cell egress from bone marrow. Cell 124, 407-421.
Kiel, M.J., Yilmaz, O.H., Iwashita, T., Terhorst, C, and Morrison, S.J. (2005). SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell 121, 1 109-1 121.
Komada, Y., Yamane, T., Kadota, D., Isono, K., Takakura, N., Hayashi, S., and Yamazaki, H. (2012). Origins and properties of dental, thymic, and bone marrow mesenchymal cells and their stem cells. PloS one 7, e46436.
Kunisaki, Y., Bruns, I., Scheiermann, O, Ahmed, J., Pinho, S., Zhang, D., Mizoguchi, T., Wei, Q., Lucas, D., Ito, K., et al. (2013). Arteriolar niches maintain haematopoietic stem cell quiescence. Nature 502, 637-643.
Lewis, A.E., Vasudevan, H.N., O'Neill, A.K., Soriano, P., and Bush, J.O. (2013). The widely used Wnt1 -Cre transgene causes developmental phenotypes by ectopic activation of Wnt signaling. Dev Biol 379, 229-234.
Liu, Y., Strecker, S., Wang, L., Kronenberg, M.S., Wang, W., Rowe, D.W., and Maye, P. (2013). Osterix-cre labeled progenitor cells contribute to the formation and maintenance of the bone marrow stroma. PloS one 8, e71318.
Maes, C, Kobayashi, T., Selig, M.K., Torrekens, S., Roth, S.I., Mackem, S., Carmeliet, G., and Kronenberg, H.M. (2010). Osteoblast precursors, but not mature osteoblasts, move into developing and fractured bones along with invading blood vessels. Dev Cell 19, 329-344.
Matsuoka, T., Ahlberg, P.E., Kessaris, N., lannarelli, P., Dennehy, U., Richardson, W.D., McMahon, A.P., and Koentges, G. (2005). Neural crest origins of the neck and shoulder. Nature 436, 347-355.
Mendez-Ferrer, S., Lucas, D., Battista, M., and Frenette, P.S. (2008). Haematopoietic stem cell release is regulated by circadian oscillations. Nature 452, 442-447.
Mendez-Ferrer, S., Michurina, T.V., Ferraro, F., Mazloom, A.R., Macarthur, B.D., Lira, S.A., Scadden, D.T., Ma'ayan, A., Enikolopov, G.N., and Frenette, P.S. (2010). Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche. Nature 466, 829-834. Mignone, J.L., Kukekov, V., Chiang, A.S., Steindler, D., and Enikolopov, G. (2004). Neural stem and progenitor cells in nestin-GFP transgenic mice. The Journal of comparative neurology 469, 31 1 -324.
Morikawa, S., Mabuchi, Y., Kubota, Y., Nagai, Y., Niibe, K., Hiratsu, E., Suzuki, S., Miyauchi-Hara, O, Nagoshi, N., Sunabori, T et al. (2009a). Prospective identification, isolation, and systemic transplantation of multipotent mesenchymal stem cells in murine bone marrow. J Exp Med 206, 2483-2496.
Morikawa, S., Mabuchi, Y., Niibe, K., Suzuki, S., Nagoshi, N., Sunabori, T., Shimmura, S., Nagai, Y., Nakagawa, T., Okano, H., et al. (2009b). Development of mesenchymal stem cells partially originate from the neural crest. Biochem Biophys Res Commun 379, 1 1 14-1 1 19.
Nagoshi, N., Shibata, S., Kubota, Y., Nakamura, M., Nagai, Y., Satoh, E., Morikawa, S., Okada, Y., Mabuchi, Y., Katoh, H., et al. (2008). Ontogeny and multipotency of neural crest-derived stem cells in mouse bone marrow, dorsal root ganglia, and whisker pad. Cell stem cell 2, 392-403.
Nakamura, Y., Arai, F., Iwasaki, H., Hosokawa, K., Kobayashi, I., Gomei, Y., Matsumoto, Y., Yoshihara, H., and Suda, T. (2010). Isolation and characterization of endosteal niche cell populations that regulate hematopoietic stem cells. Blood 116, 1422-1432.
Naveiras, O., Nardi, V., Wenzel, P.L., Hauschka, P.V., Fahey, F., and Daley, G.Q. (2009). Bone-marrow adipocytes as negative regulators of the haematopoietic microenvironment. Nature 460, 259-263.
Nguyen, M.T., Zhu, J., Nakamura, E., Bao, X., and Mackem, S. (2009). Tamoxifen-dependent, inducible Hoxb6CreERT recombinase function in lateral plate and limb mesoderm, CNS isthmic organizer, posterior trunk neural crest, hindgut, and tailbud. Dev Dyn 238, 467-474.
Olsen, B.R., Reginato, A.M., and Wang, W. (2000). Bone development. Annu Rev Cell Dev Biol 16, 191 -220.
Omatsu, Y., Sugiyama, T., Kohara, H., Kondoh, G., Fujii, N., Kohno, K., and Nagasawa, T. (2010). The essential functions of adipo-osteogenic progenitors as the hematopoietic stem and progenitor cell niche. Immunity 33, 387-399.
Park, D., Spencer, J.A., Koh, B.I., Kobayashi, T., Fujisaki, J., Clemens, T.L., Lin, C.P., Kronenberg, H.M., and Scadden, D.T. (2012). Endogenous bone marrow MSCs are dynamic, fate-restricted participants in bone maintenance and regeneration. Cell stem cell 10, 259-272.
Pinho, S., Lacombe, J., Hanoun, M., Mizoguchi, T., Bruns, I., Kunisaki, Y., and Frenette, P.S. (2013). PDGFRalpha and CD51 mark human Nestin+ sphere-forming mesenchymal stem cells capable of hematopoietic progenitor cell expansion. J Exp Med 210, 1351 -1367.
Raaijmakers, M.H., Mukherjee, S., Guo, S., Zhang, S., Kobayashi, T., Schoonmaker, J.A., Ebert, B.L., Al-Shahrour, F., Hasserjian, R.P., Scadden, E.O., et al. (2010). Bone progenitor dysfunction induces myelodysplasia and secondary leukaemia. Nature 464, 852-857.
Riethmacher, D., Sonnenberg-Riethmacher, E., Brinkmann, V., Yamaai, T., Lewin, G.R., and Birchmeier, C. (1997). Severe neuropathies in mice with targeted mutations in the ErbB3 receptor. Nature 389, 725-730.
Sacchetti, B., Funari, A., Michienzi, S., Di Cesare, S., Piersanti, S., Saggio, I., Tagliafico, E., Ferrari, S., Robey, P.G., Riminucci, M et al. (2007). Self-renewing osteoprogenitors in bone marrow sinusoids can organize a hematopoietic microenvironment. Cell 131, 324-336.
Schatteman, G.C., Morrison-Graham, K., van Koppen, A., Weston, J.A., and Bowen-Pope, D.F. (1992). Regulation and role of PDGF receptor alpha-subunit expression during embryogenesis. Development 115, 123-131.
Sheean, M.E., McShane, E., Cheret, C, Walcher, J., Muller, T., Wulf-Goldenberg, A., Hoelper, S., Garratt, A.N., Kruger, M., Rajewsky, K., et al. (2014). Activation of MAPK overrides the termination of myelin growth and replaces Nrg1/ErbB3 signals during Schwann cell development and myelination. Genes Dev 28, 290-303.
Soriano, P. (1997). The PDGF alpha receptor is required for neural crest cell development and for normal patterning of the somites. Development 124, 2691 -2700.
Sousa, V.H., Miyoshi, G., Hjerling-Leffler, J., Karayannis, T., and Fishell, G. (2009). Characterization of Nkx6-2 -derived neocortical interneuron lineages. Cereb Cortex 19 Suppl 1, i1 -10.
Spiegel, A., Shivtiel, S., Kalinkovich, A., Ludin, A., Netzer, N., Goichberg, P., Azaria, Y., Resnick, I., Hardan, I., Ben-Hur, H et al. (2007). Catecholaminergic neurotransmitters regulate migration and repopulation of immature human CD34+ cells through Wnt signaling. Nat Immunol 8, 1 123-1 131.
Takashima, Y., Era, T., Nakao, K., Kondo, S., Kasuga, M., Smith, A.G., and Nishikawa, S. (2007). Neuroepithelial cells supply an initial transient wave of MSC differentiation. Cell 129, 1377-1388.
Tzeng, Y.S., Li, H., Kang, Y.L., Chen, W.C., Cheng, W.C., and Lai, D.M. (2010). Loss of Cxcl12/Sdf-1 in adult mice decreases the quiescent state of hematopoietic stem/progenitor cells and alters the pattern of hematopoietic regeneration after myelosuppression. Blood 117, 429-439.
Yamazaki, S., Ema, H., Karlsson, G., Yamaguchi, T., Miyoshi, H., Shioda, S., Taketo, M.M., Karlsson, S., Iwama, A., and Nakauchi, H. (201 1 ). Nonmyelinating Schwann cells maintain hematopoietic stem cell hibernation in the bone marrow niche. Cell 147, 1 146-1 158.
Yang, W., Wang, J., Moore, D.C., Liang, H., Dooner, M., Wu, Q., Terek, R., Chen, Q., Ehrlich, M.G., Quesenberry, P. J., et al. (2013). Ptpn1 1 deletion in a novel progenitor causes metachondromatosis by inducing hedgehog signalling. Nature 499, 491 -495.
Zaidi, M., and Mendez-Ferrer, S. (2013). Cell biology: tumour stem cells in bone. Nature 499, 414-416.
Zhang, J., Niu, C, Ye, L., Huang, H., He, X., Tong, W.G., Ross, J., Haug, J., Johnson, T., Feng, J.Q., et al. (2003). Identification of the haematopoietic stem cell niche and control of the niche size. Nature 425, 836-841.
Aquino, J.B., Hjerling-Leffler, J., Koltzenburg, M., Edlund, T., Villar, M.J., and Ernfors, P. (2006). In vitro and in vivo differentiation of boundary cap neural crest stem cells into mature Schwann cells. Exp Neurol 198, 438-449.
Casanova-Acebes, M., Pitaval, C, Weiss, L.A., Nombela-Arrieta, C, Chevre, R., N, A.G., Kunisaki, Y., Zhang, D., van Rooijen, N., Silberstein, L.E., et al. (2013). Rhythmic Modulation of the Hematopoietic Niche through Neutrophil Clearance. Cell 153, 1025-1035.
Davis, S., and Meltzer, P.S. (2007). GEOquery: a bridge between the Gene Expression Omnibus (GEO) and BioConductor. Bioinformatics 23, 1846-1847.
Heider, A., and Alt, R. (2013). virtualArray: a R/bioconductor package to merge raw data from different microarray platforms. BMC bioinformatics 14, 75.
Isern, J., Fraser, ST., He, Z., and Baron, M.H. (2008). The fetal liver is a niche for maturation of primitive erythroid cells. Proc Natl Acad Sci U S A 105, 6662-6667.
Johnson, W.E., Li, C, and Rabinovic, A. (2007). Adjusting batch effects in microarray expression data using empirical Bayes methods. Biostatistics 8, 118-127.
Mignone, J.L., Kukekov, V., Chiang, A.S., Steindler, D., and Enikolopov, G. (2004). Neural stem and progenitor cells in nestin-GFP transgenic mice. The Journal of comparative neurology 469, 311-324。
本発明者らは、マウスBMネスチン+MSCがHSCの維持に要求されること5、およびヒトBMネスチン+ 細胞がHSCを増殖させうること18を既に報告した。本発明において、本発明者らは、MPN患者におけるBM血管密度の増加にもかかわらず、ネスチン+ 細胞数およびネスチンmRNA発現が顕著に低減することを見出した(図1a〜b)。これは、plpC処理後にMPNを発生したMx1-cre; JAK2V617Fマウスにおいて再現された(図1c)。MPNマウスをNes-gfp系統と交雑させて、MSCを標識した5。複合突然変異マウスおよび突然変異BM細胞が移植されたNes-gfp動物は共にMPNを発生し、GFP、表面マーカー発現および機能分析により定められる、より低いBM MSCを示した(図1d〜gおよび図5a〜f)。MSC喪失は初期BM線維症に付随したため、本発明者らは、ネスチン+ MSCがMPNにおいて線維芽細胞または骨芽細胞へと分化し、それによりこれらのマウスにおける間質変化に寄与するかどうかを判定するために、長期インビボ系統追跡研究を行った19, 20(図5g〜j)。意外にも、GFP+ 細胞の血管パターンは、非罹患Nes-gfpマウスにおけるものに類似していた(図1h〜i)。したがって、BCR-ABL+MPNにおいて最近報告されたように21、Nes-GFP-細胞は過剰な線維芽細胞および骨芽細胞を産生しうるであろう。ネスチン+ MSCの減少は、むしろ、突然変異マウスにおけるアポトーシス率の3倍の増加により説明され(図1j)、これは、JAKインヒビターであるルクソリチニブ(ruxolitinib)によっては妨げられなかった(図6)。
本発明者らは、化学療法中にBM交感神経線維を保護しうる神経保護物質4-メチルカテコール26で症候性MPNマウスを処理した。シュワン細胞は4-メチルカテコール処理マウスにおいて維持され、好中球増加の予防も伴っていた(図3a〜b)。交感神経線維はネスチン+ MSCにおける 3-アドレナリン受容体活性化によりBM HSCトラフィックを調節する5,6。この受容体は正常またはJAK2V617F+ 造血細胞においては発現されない(図10a)。 3-アドレナリン受容体を欠くマウスにおいては疾患発生が加速した(図3c〜d)。このことはMPNにおけるこの受容体の防御的役割を明らかに示している。ネスチン+ MSCの欠損交感神経刺激を補償するために、症候性マウスを選択的 3-アドレナリンアゴニスト(BRL37344)で慢性的に処理した。顕著に、BRL37344処理はMPN関連好中球増加および血小板増加を妨げ、赤血球減少を遅延させたが、野生型マウスにおいては血球数に影響を及ぼさなかった(図3b, eおよび図10b〜d)。ビヒクル注射マウスにおける重篤な線維症とは対照的に、BRL37344処理動物のBMは過剰な骨および線維芽細胞組織を実質的に欠いていた(図3f)。これらの効果はHSCニッチ依存的であった。なぜなら、4-メチルカテコールもBRL37344も培養造血前駆体の増殖に影響を及ぼさず、ネスチン+ 細胞が枯渇したマウスにおいて白血球増加はBRL37344によってはレスキューされなかったからである(図3gおよび図11a)。同様に、幾つかのMPNマーカーが、臨床的に承認されたβ3-アドレナリンアゴニストであるミラベグロンでの処理により改善された(図11b)。尤も、おらくその難溶解性およびマウス受容体に対する比較的低いアフィニティゆえに、その度合はより低かった。
本発明は以下の実施形態を包含する:
[1] MPN(骨髄増殖性新生物)の治療および/または予防における使用のための、β-3アドレナリン受容体アゴニスト化合物、または骨髄交感神経線維を保護しうる神経保護化合物。
[2] MPNが、慢性骨髄性白血病(CML)、慢性骨髄単球性白血病(CMML)、真正赤血球増加症、本態性血小板血症、原発性骨髄線維症、特発性骨髄線維症、特発性骨髄異形成、慢性好中球性白血病、慢性好酸球性白血病および肥満細胞症からなる群から選択される、実施形態1記載の使用のための化合物。
[3] ベータ-3アドレナリン受容体アゴニスト化合物が選択的ベータ-3アドレナリン受容体アゴニスト化合物である、実施形態1または2記載の使用のための化合物。
[4] 該選択的アゴニストが、
- BRL 37344;
- CL 316243;
- AZ 002;
- BMS 187257;
- L-755507;
- L-750355;
- FR-149175;
- GW427353 (ソラベグロン(Solabegron));
- YM178 (ミラベグロン(Mirabegron)/ミルベトリク(myrbetriq));
- CR 58611 ;
- SR 58611A (アミベグロン(Amibegron));
- SR 59104A;
- SR 59119A;
- SAR150640;
- L-796568; および
- CL-316243
ならびにそれらの医薬上許容される塩からなる群から選択される、実施形態3記載の使用のための化合物。
[5] 該選択的アゴニストがフェニルエタノールアミンである、実施形態3記載の使用のための化合物。
[6] 該選択的アゴニストが、以下の一般式:
(式中、
R1は水素およびハロゲンから選択される;ならびに
R2は、アリール部分および/またはアルキル部分において置換されうるアラルキル、あるいは
から選択される基である)を有する化合物である、実施形態5記載の使用のための化合物。
[7] 式Iの化合物が、
およびそれらの医薬上許容される塩からなる化合物の群から選択される、実施形態6記載の使用のための化合物。
[8] 該化合物が、骨髄交感神経線維を保護しうる神経保護化合物である、実施形態1または2記載の使用のための化合物。
[9] 該神経保護化合物が、4-メチルカテコール;NGF(ニューロン成長因子);ニュールツリン(NRTN)、アルテミン(ARTN)またはペルセフィン(PSPN)ファミリーに属するグリア細胞系由来神経栄養因子(GDNF);ニューロトロフィン3およびニューロトロフィン4/5;インターロイキン6(IL-6);インスリン様成長因子1(IGF-1);ビタミンE、特に、ビタミンEのα-トコフェロール形態;N-アセチルシステインまたはN-アセチル-L-システイン(略称NAC)としても公知であるアセチルシステイン;アセチル-L-カルニチンまたはALCAR;アミホスチン(amifostine)および白血病抑制因子(LIF)からなる群から選択されうる、実施形態8記載の使用のための化合物。
[10] 該神経保護物質が、シタグリプチン(sitagliptin)、サクサグリプチン(saxagliptin)/オングリザ(Onglyza)、リナグリプチン(linagliptin)、デュトグリプチン(dutogliptin)、ジェミグリプチン(gemigliptin)、アログリプチン(alogliptin)およびビルダグリプチン(vildagliptin)/ガルブス(Galvus)からなる群から選択されうる、実施形態8記載の使用のための化合物。
[11] MPN(骨髄増殖性新生物)の治療および/または予防における使用のための、実施形態1〜10のいずれか1項記載の化合物を含む医薬品または医薬組成物。
[12] a.被験者から場合によっては経時的に採取された骨髄生検において存在するチロシンヒドロキシラーゼを免疫染色し、
b.工程a)の生検において存在する交感神経系線維が、正常被験者の骨髄に存在する交感神経系線維と比べて、または参照もしくは対照値と比べて減少しているかどうかを比較することにより、被験者の骨髄における交感神経系線維の評価を指標として使用することを含む、ヒト被験者におけるMPNの診断または予後の方法であって、
ここで、交感神経系線維が、正常被験者において存在する交感神経系線維と比べて、または参照もしくは対照値と比べて減少している場合には、ネスチン+ 間葉系幹細胞の減少に先行する骨髄神経損傷が該被験者において進行しており、かつ
ここで、該被験者が、正常被験者において存在する交感神経系線維と比べて、または参照もしくは対照値と比べて、チロシンヒドロキシラーゼ線維により占拠された骨髄面積における少なくとも3倍の減少を示す場合には、該被験者はMPNに罹患している、方法。
[13] 交感神経線維により占拠された骨髄面積の参照または対照値が該区画における全骨髄面積の0.15±0.09%である、実施形態12記載の方法。
[14] c.被験者の骨髄から生物学的サンプルを得、
d.工程a)のサンプルにおけるグリア線維酸性タンパク質のmRNA発現を、正常被験者におけるグリア線維酸性タンパク質のmRNA発現の参照もしくは対照値と、または正常被験者から得られた生物学的サンプルにおけるグリア線維酸性タンパク質のmRNA発現と比較することを含む、被験者におけるMPNの診断または予後の方法であって、
ここで、工程a)のサンプルにおけるグリア線維酸性タンパク質のmRNA発現が参照もしくは対照値と比べて、または正常被験者から得られた生物学的サンプルにおけるグリア線維酸性タンパク質のmRNA発現と比べて低減している場合には、ネスチン+ MSCの減少に先行するBM神経損傷が該被験者において進行しており、かつ
ここで、該被験者が、対照におけるハウスキーピング遺伝子GAPDHのmRNA発現に対して正規化されたグリア線維酸性タンパク質のmRNA発現の値の少なくとも160倍の減少を示す場合には、該被験者はMPNに罹患している、方法。
[15] グリア線維酸性タンパク質のmRNA発現の参照または対照値が、ハウスキーピング遺伝子グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)のmRNA発現に対して正規化された0.48±0.03である、実施形態14記載の方法。
[16] 以下の工程、すなわち、
e.被験者の骨髄から生物学的サンプルを経時的に得、
f.工程a)のサンプルにおけるBMネスチン+ MSCの総数を指標として使用し、ネスチンの免疫染色、およびそれに続く、骨髄サンプル(平均7.2mm 2 のBMが評価され、結果は1mm 2 まで外挿されるべきである)におけるネスチン+ 血管周囲ニッチ(単細胞または3個までの細胞のクラスター)の数を考慮した評価により、この指標を測定し、
g.工程a)の生物学的サンプルにおけるBMネスチン+ MSCの総数を正常被験者におけるBMネスチン+ MSCの総数の参照もしくは対照値と、または正常被験者から得られた生物学的サンプルにおけるBMネスチン+ MSCの総数と比較することを含む、被験者におけるMPNの診断または予後の方法であって、
ここで、細胞数が該参照もしくは対照値と比べて、または正常被験者から得られた生物学的サンプルにおけるBMネスチン+ MSCの数と比べて減少している場合には、骨髄線維症に先行するニッチの損傷が該被験者において存在し、かつ
ここで、該被験者が正常被験者におけるBMネスチン+ MSCの数の少なくとも6倍の減少を示す場合には、該被験者はMPNに罹患している、方法。
[17] 正常被験者におけるBMネスチン+細胞の総数の参照または対照値が1.15±0.3ニッチ/mm 2 (それぞれのものは少なくとも1つの陽性細胞を含有する)である、実施形態16記載の方法。
[18] 以下の工程、すなわち、
c.被験者の骨髄から生物学的サンプルを得、
d.工程a)のサンプルにおいてqRT-PCRによりネスチンのmRNA発現を測定することにより、工程a)のサンプルにおけるネスチン+ MSCの総数を指標として使用し、
h.工程a)のサンプルにおけるネスチンのmRNA発現を、正常被験者におけるネスチンのmRNA発現の参照もしくは対照値と、または正常被験者から得られた生物学的サンプルにおけるネスチンのmRNA発現と比較することを含む、被験者におけるMPNの診断または予後の方法であって、
ここで、工程a)のサンプルにおけるネスチンのmRNA発現が該参照もしくは対照値と比べて、または正常被験者から得られた生物学的サンプルにおけるネスチンのmRNA発現と比べて低減している場合には、骨髄線維症に先行するニッチの損傷が該患者において存在し、かつ、
ここで、該被験者が、対照におけるハウスキーピング遺伝子GAPDHのmRNA発現に対して正規化されたネスチンのmRNA発現の値の少なくとも13倍の減少を示す場合、方法。
[19] ネスチンのmRNA発現の参照または対照値が、ハウスキーピング遺伝子グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)のmRNA発現に対して正規化された4.86±4.55である、実施形態18記載の方法。
[20] 実施形態12−19のいずれかに記載の方法のいずれかの実施に適したキット。[21] a.化合物を選択し、
b.該化合物が、他のベータアドレナリン受容体と比較して約≧10倍高い、より好ましくは約≧100倍高い、より一層好ましくは約≧1000倍高い、ベータ-3受容体に対する選択性を示すかどうか、およびそれがベータ-3受容体の基礎活性を、それが該受容体と接触した場合に増強するかどうかを決定し、
c.該化合物を、それが工程b)に記載の基準を満たしている場合には回収し、
d.該化合物を製造する工程を含む、MPNの治療に適した化合物のスクリーニングまたは製造方法。
Claims (6)
- MPNが、慢性骨髄性白血病(CML)、慢性骨髄単球性白血病(CMML)、真正赤血球増加症、本態性血小板血症、原発性骨髄線維症、特発性骨髄線維症、原因不明骨髄様化生、慢性好中球性白血病、慢性好酸球性白血病および肥満細胞症からなる群から選択される、請求項1に記載の医薬品または医薬組成物。
- ベータ-3アドレナリン受容体アゴニスト化合物が選択的ベータ-3アドレナリン受容体アゴニスト化合物である、請求項1または2に記載の医薬品または医薬組成物。
- 該選択的アゴニストが、
- BRL 37344;
- GW427353 (ソラベグロン(Solabegron));
- YM178 (ミラベグロン(Mirabegron)/ミルベトリク(myrbetriq)); および
- SR 58611A (アミベグロン(Amibegron));
ならびにそれらの医薬上許容される塩からなる群から選択される、請求項3に記載の医薬品または医薬組成物。 - a.化合物を選択し、
b.該化合物が、他のベータアドレナリン受容体と比較して約≧10倍高い、より好ましくは約≧100倍高い、より一層好ましくは約≧1000倍高い、ベータ-3受容体に対する選択性を示すかどうか、およびそれがベータ-3受容体の基礎活性を、それが該受容体と接触した場合に増強するかどうかを決定し、
c.該化合物を、それが工程b)に記載の基準を満たしている場合には回収し、
d.該化合物を製造する工程を含む、MPNの治療に適した化合物のスクリーニングまたは製造方法。
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Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN112007025B (zh) * | 2019-05-30 | 2022-04-19 | 义慧科技(深圳)有限公司 | 米拉贝隆在制备预防和/或治疗恶性肿瘤的药物中的应用 |
CN112575074B (zh) * | 2020-10-09 | 2022-12-27 | 中山大学 | Nestin基因及蛋白在治疗器官纤维化中的应用 |
Family Cites Families (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7057046B2 (en) * | 2002-05-20 | 2006-06-06 | Bristol-Myers Squibb Company | Lactam glycogen phosphorylase inhibitors and method of use |
US20060084637A1 (en) * | 2004-10-18 | 2006-04-20 | Maria Alemany | Methods of using fatty-acid esters of estrogens and thermogenic compounds for reducing the body weight of a mammal and compositions containing the same |
US9095589B2 (en) * | 2007-04-05 | 2015-08-04 | Johns Hopkins University | Chirally pure isomers of itraconazole for use as angiogenesis inhibitors |
US20110262566A1 (en) * | 2008-11-07 | 2011-10-27 | Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd. | Novel useful therapeutic agent for lower urinary tract symptom |
US8242248B2 (en) * | 2009-03-23 | 2012-08-14 | Nodality, Inc. | Kits for multiparametric phospho analysis |
KR101444572B1 (ko) * | 2010-03-22 | 2014-09-24 | 액테리온 파마슈티칼 리미티드 | 3-(헤테로아릴-아미노)-1,2,3,4-테트라히드로-9h-카르바졸 유도체 및 이의 프로스타글란딘 d2 수용체 조절제로서의 용도 |
ES2706913T3 (es) * | 2010-06-25 | 2019-04-01 | Univ Aston | Glucoproteínas que tienen propiedades de movilización de lípidos y usos terapéuticos de las mismas |
AU2012219395B2 (en) * | 2011-02-18 | 2017-05-25 | Incyte Corporation | mTOR/JAK inhibitor combination therapy |
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