CN112575074B - Nestin基因及蛋白在治疗器官纤维化中的应用 - Google Patents

Nestin基因及蛋白在治疗器官纤维化中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了Nestin基因及蛋白在治疗器官纤维化中的应用。本发明研究表明，Nestin可作为器官纤维化的重要标志物，同时干扰/抑制Nestin对器官纤维化有显著的治疗效果，通过干扰Nestin内源性表达，从而降低胶原含量等纤维化相关指标，减轻或缓解器官纤维化。因此，本发明对于靶向治疗器官纤维化提供了一个全新的思路和方法，具有很好的应用价值和前景。

Description

Nestin基因及蛋白在治疗器官纤维化中的应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及Nestin基因及蛋白在治疗器官纤维化中的应用。更具体地，涉及Nestin基因及蛋白作为器官纤维化治疗靶点的应用以及制备器官纤维化治疗药物中的应用。
背景技术
纤维化是对急性或慢性细胞损伤的伤口愈合反应，表现为成纤维细胞的异常激活和细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的过度沉积，在高度进展的病例中还可能导致疤痕组织并最终导致器官功能障碍，甚至器官衰竭。纤维化几乎可以在每个器官中发生，肝和肺中尤为明显，被认为是全世界发病率和死亡率的主要原因，有关统计显示，因疾病而致死的病人中约45％可以归于纤维增生疾病。
肺纤维化是由多种原因引起的肺脏纤维结缔组织异常增多和实质细胞坏死的病理过程，持续进展可导致肺组织结构破坏和功能减退，乃至呼吸衰竭，严重威胁人类的健康和生命。其中，特发性肺纤维化作为一种极其严重的慢性、进行性的不可逆肺间质纤维化疾病，至今病因不明，进展迅速，5年生存率仅为30％～50％，平均生存期不足3年。目前肺移植仍是特发性肺纤维化唯一有效的治疗措施。
肝纤维化的特征为肝星状细胞(Hepatic Stellate Cell，HSC)分泌的ECM过多沉积。在肝纤维化的微环境中，过多的ECM刺激促进HSC的活化和HSC向肌成纤维细胞的转分化，活化的HSC又可分泌促纤维化因子(如TGF-β)。正是由于HSC及其微环境之间的正反馈促使HSC的持续活化，破坏细胞稳态的自我维持，从而导致不可逆转的肝损伤。因此，在纤维化过程中靶向并调节活化的HSC可能是有效的抗肝纤维化疗法。
随着大量研究的开展，关于纤维化的发生发展机制已得到了更深入的了解。大量证据表明，纤维化形成与肾素-血管紧张素系统、炎症、氧化应激、转化生长因子β(transforming growth factorβ，TGF-β)/Smad信号传导、Wnt/β-catenin信号传导和脂质代谢有关。其中，TGF-β/Smad信号传导在纤维化中起重要作用，被认为是纤维化形成一个主要途径。TGF-β1可以通过经典(Smad依赖性)和非经典(Smad非依赖性)途径活化成肌纤维细胞，过量产生ECM以及抑制ECM降解，从而诱发纤维化。但是由于TGF-β1还参与细胞增殖和分化等其它生物学过程，所以直接靶向TGF-β1治疗纤维化的方案目前还有很多问题待解决。因此，需要进一步探究TGF-β/Smad信号转导机制，为器官纤维化的治疗寻找新型有效的靶点。
另外尽管最近发现了一些抗纤维化药物，但预后不良，只能减缓疾病的进程并具有严重的副作用，从而影响患者的生活质量。因此，迫切需要寻求一种更有效的器官纤维化治疗方案。
发明内容
本发明的目的是提供一种器官纤维化的标志物。
本发明另一目的是一种器官纤维化的治疗靶点。
本发明另一目的是一种器官纤维化的治疗药物。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明首次研究表明，对于多种脏器，随着器官纤维化进展，Nestin基因和蛋白表达水平增加，Nestin可以作为器官纤维化的重要标志物，干扰Nestin基因和蛋白表达可以减缓器官纤维化进展。动物模型和细胞实验证据提示，临床上可以利用AAV6-ShNestin靶向治疗器官纤维化。
因此，本发明要求保护以下应用：
Nestin基因或Nestin蛋白在作为器官纤维化检测/诊断标志物方面的应用。
Nestin基因或Nestin蛋白的检测试剂在制备器官纤维化检测/诊断产品方面的应用。
Nestin基因或Nestin蛋白在作为器官纤维化治疗靶点方面的应用。
Nestin基因或Nestin蛋白的靶向抑制剂在制备器官纤维化治疗药物方面的应用。
基于上述结果，本发明还提供一种器官纤维化的治疗药物，所述药物能够靶向抑制Nestin基因或Nestin蛋白的表达。所述药物能够靶向抑制Nestin基因或Nestin蛋白的表达从而延缓纤维化进展。
作为一种可选择的方案之一，一种器官纤维化的治疗药物，包括能够靶向抑制Nestin基因或Nestin蛋白表达的AAV。
腺相关病毒(AAV)作为基因治疗的一种明星载体，具有宿主范围广泛、稳定性好、外源基因表达时间长、免疫原性低、几乎无致病性等优点。与其他血清型AAV载体(如AAV2)相比，AAV6载体具有宿主范围更广、免疫原性更低等优势，是肝和肺等器官中递送效率最高的血清型AAV载体之一，并且与其他血清型AAV载体(如AAV5)相比，AAV6载体的清除动力学明显更慢。由于AAV6这些独特的生物学特性使其可以成为大多数靶向治疗的首选载体，对于人类攻克癌症或更多的重大疾病有着巨大的潜力。
因此，利用腺相关病毒(AAV)技术开发基于靶向干扰/抑制Nestin的治疗器官纤维化的药物，具有非常好的应用前景。
作为可选择的方案之一，所述AAV为CMV启动子下表达干扰Nestin的ShRNA的腺相关病毒血清6型(AAV6-ShNestin)。
所述AAV6-ShNestin各靶序列如下：
AAV6-shControl：5′-TTCTCCGAACGTGTCACGTAA-3′
AAV6-shNestin#1：5′-GTGAGACTCTGGAATGCAA-3′
AAV6-shNestin#2：5′-GCTGAAGCTGCATTTCCTTGG-3′。
所述靶向序列仅为本发明验证有效的方案之一，只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。AAV6所递送的siRNA序列与Nestin基因序列互补且能成功靶向干扰Nestin也可达到相似的治疗效果。另外，还可利用纳米颗粒、树枝状聚合物以及脂质体等体内递送siRNA，但需多次反复体内递送siRNA。如无特殊情况，本发明建议使用本方案进行器官纤维化治疗。
另外，上述AAV6-ShNestin还可以协同抗纤维化药联用。即所述器官纤维化的治疗药物可包括AAV和对所述器官纤维化具有治疗作用的抗纤维化药。
基于本发明成果，还提供一种治疗器官纤维化的方法，以Nestin为靶点抑制其表达，从而延缓/治疗器官纤维化。可在器官纤维化发生发展早期通过靶向干预Nestin表达治疗器官纤维化。
本文中，所述器官纤维化包括但不限于肺纤维化、肝纤维化、心肌纤维化、肾纤维化、骨髓纤维化。
本发明方案的受试者可以指任何动物，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、马、猪、猴等哺乳动物。
本发明所述药物可用作哺乳动物(例如人、小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、马、猪、猴等)中的器官纤维化的治疗。
本文使用的术语“治疗”是指减轻或改善病症，即延缓或抑制病症或至少一种临床症状的发展。
本发明所述药物可经由任何生理上可接受途径给药，给药途径例如口服、注射等。
本发明所述药物可制成药学上可接受的剂型。一般来说，制剂中有效成分的量为制剂总重量的1-95％。
药物的剂型要适合不同给药方式。用于口服时，所述药物可制成固体制剂如片剂、粉剂、粒剂、胶囊剂或液体制剂如溶液或混悬液等。用于注射时，所述药物可制成可注射的溶液或混悬液，或可注射的干燥粉末；所述可注射的干燥粉末可在临用前溶解或分散于无菌水或其他无菌可注射介质，可立即使用。各种制剂的制备可以采用药学领域的常规生产方法。
在本发明较佳的实施方案中，所述药物的剂型为注射制剂或滴鼻制剂。
本发明所述药物还可以含有药学上允许的辅料或载体，可根据需要任选使用药学上允许的辅料或载体。这些辅料或载体是广泛熟知的，包括:口服制剂使用的粘合剂(如淀粉、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮)稀释剂(如乳糖、右旋糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、纤维素，和/或甘油)﹑润滑剂(如二氧化硅、滑石、硬脂酸或其盐，通常是硬脂酸镁或硬脂酸钙，和/或聚乙二醇)，以及如果需要，还包含：崩解剂(如淀粉、琼脂、海藻酸或其盐，通常是海藻酸钠)和/或泡腾混合物、助溶剂、稳定剂、悬浮剂、色素、矫味剂等；可注射的制剂使用的防腐剂、加溶剂、稳定剂等；局部制剂用的基质、稀释剂、润滑剂、防腐剂。
当将所述药物用于所述器官纤维化的治疗，或其他治疗时，本发明药物的总日用量须由主诊医师在可靠的医学判断范围内做出决定。对于任何具体的患者，具体的治疗有效剂量水平须根据多种因素而定，所述因素包括所治疗的障碍和该障碍的严重程度；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；所采用的具体化合物的给药时间、给药途径和排泄率；治疗持续时间；及医疗领域公知的类似因素。例如，本领域的做法是，药物的滴度从低于为得到所需治疗效果。
如果受试者将在生物学上、医学上或生活质量上受益于治疗﹐则受试者需要此类治疗。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种器官纤维化的重要标志物Nestin，为器官纤维化的检测与诊断提供了新的标志物和途径。
本发明研究显示，干扰Nestin基因和蛋白表达可以减缓器官纤维化进展，临床上可以利用AAV6-ShNestin靶向治疗器官纤维化，对于靶向治疗器官纤维化提供了新思路，具有很好的应用价值和前景，值得大力推广。
附图说明
图1为小鼠肝纤维化与Nestin表达的关系。
图2为靶向Nestin可抑制小鼠原代HSCs细胞株和LX2细胞株的纤维化。
图3为靶向Nestin可抑制CCl4诱导的小鼠肝纤维化。
图4为靶向Nestin可抑制DDC诱导的小鼠肝纤维化。
图5为小鼠肺纤维化与Nestin表达的关系。
图6为靶向Nestin可抑制小鼠肺部原代成纤维细胞的纤维化。
图7为靶向Nestin可抑制博来霉素诱导的小鼠肺纤维化。
图8为小鼠心肌、肾、骨髓纤维化与Nestin表达的关系；图中，A为心肌纤维化小鼠模型、B为肾纤维化小鼠模型、C为骨髓纤维化小鼠模型。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。
除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。
实施例1小鼠肝纤维化与Nestin表达的关系
1、构建肝纤维化小鼠模型
取8-14周龄雄性C57BL/6小鼠(南京大学模式动物研究所)分别给予以下方案处理：Oil、CCl4 2w、CCl4 4w、CCl4；Normal diet、DDC 1w、DDC 4w。小鼠腹腔注射5μl/g的20％CCl4(Sigma-Aldrich，289116)(玉米油(Sigma-Aldrich，23-0230)稀释)或同等体积的玉米油，每周两次；或者定时喂养含0.1％DDC(Sigma-Aldrich，137030)的常规小鼠饲料，Normaldiet组不做任何处理。第28天取小鼠肝组织进行实验。
2、小鼠肝纤维化模型的组织病理评价
小鼠安乐死后，用4％多聚甲醛灌注小鼠肝组织。制成组织切片后分别用PSR、IHC(rabbit anti-Nestin：Millipore，ABD69；mouse anti-α-SMA：Abcam，ab7817)和荧光染色(rabbit anti-Nestin：Millipore，ABD69)观察小鼠肝组织结构。
结果如图1中的图A和图B所示，可观察到随着小鼠肝脏纤维化程进展，Nestin蛋白质表达水平增加。
3、荧光定量PCR检测小鼠肝纤维化模型的纤维化相关基因
匀浆并提取小鼠肝脏mRNA后，通过逆转录得到cDNA，利用Roche公司LC480系统进行荧光定量PCR检测Nestin基因和纤维化相关基因Ctgf、Timp1、Mmp9、Acta2和Col1a的表达情况。
相关数据经△△Ct法分析得到如图1中的图C，可观察到随着小鼠肝脏的纤维化相关基因Ctgf、Timp1、Mmp9、Acta2和Col1a表达水平增加，Nestin基因表达水平增加。
荧光定量PCR所用的各引物如下表1所示：
表1
Figure BDA0002716285720000061
以上实验结果表明，随着小鼠肝纤维化进展，Nestin基因表达水平和蛋白表达水平增加，这提示Nestin是肝纤维化的重要标志物。
实施例2干扰Nestin对小鼠原代HSCs细胞株和LX2细胞株纤维化的影响
1、小鼠原代HSCs细胞的分离培养以及LX2细胞株培养
使用含Pronase(Sigma-Aldrich，11459643001)和Collagenase(Sigma-Aldrich，11213865001)的溶液进行逆向逐步灌注来消化小鼠肝脏。将细胞悬液以50g离心，并收集含有非实质肝细胞的上清液。通过密度梯度离心从非实质性肝细胞中纯化HSCs，并在37℃、5％CO2条件下，用含有10％胎牛血清(FBS)的DMEM中培养。
LX2细胞株(ATCC)在37℃、5％CO2条件下，用含有10％胎牛血清(FBS)的DMEM中培养。
2、构建稳定干扰Nestin的细胞系
构建Nestin慢病毒干扰载体，通过病毒包装与转染的方式，构建稳定干扰Nestin的细胞系：构建表达干扰Nestin的shRNA载体质粒，转导到DH5α感受态细菌，获得足够的质粒。利用293FT细胞将目的质粒和包装质粒进行病毒包装，获得足够的病毒，再将病毒转染目的细胞，获得干扰Nestin的细胞系。利用蛋白免疫印迹和荧光定量PCR检测干扰效率，确定干扰成功。
干扰Nestin所用的各shRNA的靶序列如下：
shNES#1：5′-GGAAGAAGTTCCCAGGCTTCT-3′
shNES#2：5′-GCTGAAGCTGCATTTCCTTGG-3′
3、荧光定量PCR检测小鼠原代HSCs细胞株和LX2细胞株的纤维化相关基因
提取小鼠原代HSCs细胞株和LX2细胞株mRNA后，通过逆转录得到cDNA，利用Roche公司LC480系统进行荧光定量PCR检测纤维化相关基因Ctgf、Acta2和Col1a1基因的表达情况。
相关数据经△△Ct法分析得到如图2中的图A所示，与Control+TGFβ组相比，ShNES#1+TGFβ组和ShNES#2+TGFβ组小鼠原代HSCs细胞株和LX2细胞株肺部的纤维化相关基因Ctgf、Acta2和Col1a1表达水平显著下调。
荧光定量PCR所用的各引物如下表2所示：
表2
Figure BDA0002716285720000071
Figure BDA0002716285720000081
4、Western Blot检测小鼠原代HSCs细胞株和LX2细胞株的纤维化相关蛋白
RIPA裂解液提取小鼠原代HSCs细胞株和LX2细胞株蛋白质，经SDS-PAGE电泳、PVDF膜恒流转膜、5％脱脂奶粉封闭、TBS/T洗涤三次、纤维化相关蛋白α-SMA(Abcam，ab7817)和CollagenⅠ(Abcam，ab34710)抗体4℃过夜孵育、洗涤后孵育二抗(Cell SignalingTechnology，7076、7074)显影后，得到图2中图B，与Control+TGFβ组相比，ShNES#1+TGFβ组和ShNES#2+TGFβ组小鼠原代HSCs细胞株和LX2细胞株的纤维化相关蛋白α-SMA和CollagenⅠ表达水平显著下调。
以上实验结果表明，体外靶向干预Nestin表达后，小鼠原代HSCs细胞株和LX2细胞株的纤维化进展显著减缓。
实施例3AAV6-ShNestin对小鼠肝纤维化的影响
1、腺相关病毒6(AAV6)和CCl4/DDC处理
CMV启动子下表达ShNestin的腺相关病毒血清6型(AAV6-ShNES)购于汉恒生物科技有限公司(中国，上海)。取24只8-14周龄雄性C57BL/6小鼠(南京大学模式动物研究所)分为4组，分别给予以下方案处理：Oil+AAV6-shControl(n＝6)、CCl4+AAV6-shControl(n＝6)、CCl4+AAV6-ShNes#1(n＝6)、CCl4+AAV6-ShNes#2(n＝6)；Normal diet+AAV6-shControl(n＝6)、DDC+AAV6-shControl(n＝6)、DDC+AAV6-ShNes#1(n＝6)、DDC+AAV6-ShNes#2(n＝6)。小鼠腹腔注射5μl/g的20％CCl4(Sigma-Aldrich，289116)(玉米油(Sigma-Aldrich，23-0230)稀释)或同等体积的玉米油，每周两次；或者定时喂养含0.1％DDC(Sigma-Aldrich，137030)的常规小鼠饲料。注射后第14天小鼠经麻醉后，分别将滴度为1.5×1012的AAV6-shControl、AAV6-ShNes#1和AAV6-ShNes#2的病毒载体经尾静脉注射。第42天取小鼠肝组织进行实验。
干扰Nestin所用的AAV6-ShNestin各靶序列如下：
AAV6-shControl：5′-TTCTCCGAACGTGTCACGTAA-3′
AAV6-shNestin#1：5′-GTGAGACTCTGGAATGCAA-3′
AAV6-shNestin#2：5′-GCTGAAGCTGCATTTCCTTGG-3′
2、小鼠肝功能主要指标检测
10％水合氯醛麻醉小鼠后，提取下腔静脉血样，沉降离心得到血清后进行肝功能主要指标检测(ALT，Alanine aminotransferase；AST，Aspartate aminotransferase；ALP，Alkaline phosphatase；Hyp；TBIL，Total bilirubin)。
结果如图3中的图D和图E，与CCl4+AAV6-shControl组相比，CCl4+AAV6-shNes#1组和CCl4+AAV6-shNes#2组小鼠肝损伤缓解；如图4中的图D和图E，与DDC+AAV6-shControl组相比，DDC+AAV6-shNes#1组和DDC+AAV6-shNes#2组小鼠肝损伤缓解。
3、小鼠肝纤维化组织病理评价
小鼠安乐死后，用4％多聚甲醛灌注小鼠肝组织，制成组织切片后分别用H&E、PSR和IHC染色(rabbit anti-Nestin：Millipore，ABD69；mouse anti-α-SMA：Abcam，ab7817)观察小鼠肝组织结构。
结果如图3中的图A所示，与CCl4+AAV6-shControl组相比，CCl4+AAV6-shNes#1和CCl4+AAV6-shNes#2小鼠肝脏纤维化进展明显减缓；如图4中的图A所示，与DDC+AAV6-shControl组相比，DDC+AAV6-shNes#1和DDC+AAV6-shNes#2小鼠肝脏纤维化进展明显减缓。图3和图4中的图B和图C分别为图3和图4中图A的PSR阳性区域和Nestin阳性区域统计图。
4、荧光定量PCR检测小鼠肝脏的纤维化相关基因
匀浆并提取小鼠肝脏mRNA后，通过逆转录得到cDNA，利用Roche公司LC480系统进行荧光定量PCR检测纤维化相关基因Acta2、Col1a、IL-1β、TNFα和CCL5的表达情况。
相关数据经△△Ct法分析得到如图3中的图F，与CCl4+AAV6-shControl组相比，CCl4+AAV6-shNes#1组和CCl4+AAV6-shNes#2组小鼠肝脏的纤维化相关基因Acta2、Col1a、Il-1β、Tnfα和CCL5表达水平显著下调；相关数据经△△Ct法分析得到如图4中的图F，与DDC+AAV6-shControl组相比，DDC+AAV6-shNes#1组和DDC+AAV6-shNes#2组小鼠肝脏的纤维化相关基因Acta2、Col1a、Il-1β、Tnfα和CCL5表达水平显著下调。
荧光定量PCR所用的各引物如下表3所示：
表3
Figure BDA0002716285720000101
以上实验结果表明，体内施用AAV6-ShNestin后，小鼠肝纤维化进展显著减缓。
实施例4小鼠肺纤维化与Nestin表达的关系
1、构建肺纤维化小鼠模型
取8周龄雄性C57BL/6小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)和Nestin-GFP转基因鼠(Dr Masahiro Yamaguchi惠赠，Neuroreport.2000)麻醉后，分别用博来霉素(Teva Pharmaceutical；3U/kg)或同等体积的PBS对小鼠进行气管内注射，第21天取小鼠肺组织进行实验。
2、小鼠肺纤维化模型的组织病理评价
小鼠安乐死后，用4％多聚甲醛灌注小鼠肺组织。制成组织切片分别用PSR、IHC和荧光染色(rabbit anti-Nestin：Millipore，ABD69；mouse anti-α-SMA：Abcam，ab7817)观察小鼠肝组织结构。
结果如图5中的图A，可观察到随着博来霉素处理时间增加，Nestin表达水平增加。使用Image Pro Plus6.0对肺组织纤维化程度进行评价，随机选取肺组织切片中的至少3个区域，计算其纤维化面积与各选定部分总面积的比值，以评估其纤维化程度，如图5中的图B所示，随着博来霉素处理时间增加，小鼠肺纤维化进展加快。该实验结果表明，随着博来霉素处理时间增加，小鼠肺纤维化进展加快，Nestin表达水平增加。
3、荧光显微镜观察小鼠肺纤维化模型的Nestin-GFP
荧光倒置显微镜下观察小鼠肺纤维化模型的Nestin-GFP，得到如图5中的图C，可观察到随着小鼠肺纤维化进展，小鼠肺纤维化模型的Nestin-GFP表达水平增加。
4、荧光定量PCR检测小鼠肺纤维化模型的纤维化相关基因
匀浆并提取小鼠肺部mRNA后，通过逆转录得到cDNA，利用Roche公司LC480系统进行荧光定量PCR检测Nestin基因和纤维化相关基因α-SMA(即Acta2)的表达情况。
相关数据经△△Ct法分析得到如图5中的图D，可观察到随着小鼠肺部的纤维化相关基因α-SMA表达水平增加，Nestin基因表达水平增加。
荧光定量PCR所用的各引物如下表4所示：
表4
Figure BDA0002716285720000111
5、Western Blot检测小鼠肺纤维化模型的纤维化相关蛋白
RIPA裂解液提取小鼠原代成纤维细胞蛋白质，经SDS-PAGE电泳、PVDF膜恒流转膜、5％脱脂奶粉封闭、TBS/T洗涤三次、纤维化相关蛋白α-SMA(Abcam，ab7817)和Nestin抗体(BD Biosciences，611658)4℃过夜孵育、洗涤后孵育二抗(Cell Signaling Technology，7076、7074)显影后，得到图5中图E，可观察到随着小鼠肺部的纤维化相关蛋白α-SMA表达水平增加，Nestin蛋白表达水平增加。图5中，图F为图E中α-SMA和Nestin蛋白质灰度统计。
以上实验结果表明，随小鼠肺纤维化进展，Nestin基因表达水平和蛋白表达水平增加，这提示Nestin可能是肺纤维化甚至是器官纤维化的重要标志物。
实施例5干扰Nestin对小鼠肺部原代成纤维细胞纤维化的影响
1、小鼠肺部原代成纤维细胞的分离培养
将12周龄正常小鼠新鲜肺灌注后，在无菌条件下分离出肺组织，切成约1mm3小块，于37℃下将其放在含10mg/ml dispase(Sigma-Aldrich，D4693)和20mg/mlI型胶原酶(Gibco，Thermo Fisher Scientific，9001-12-1)的DMEM(Gene Depot，CM002-050)中消化2小时，去除消化液后用血清终止酶解反应，依次通过100μm，40μm，15μm滤网过滤去除未消化的组织。PBS洗涤后置于含10％胎牛血清(FBS，Gibco)和青霉素-链霉素的DMEM(GeneDepot，CM002-050)中培养1周，在37℃、5％CO2条件下，用含有10％胎牛血清和青霉素-链霉素的DMEM中培养。
2、构建稳定干扰Nestin的细胞系
构建Nestin慢病毒干扰载体，通过病毒包装与转染的方式，构建稳定干扰Nestin的细胞系：构建表达干扰Nestin的shRNA载体质粒，转导到DH5α感受态细菌，获得足够的质粒。利用293FT细胞将目的质粒和包装质粒进行病毒包装，获得足够的病毒，再将病毒转染目的细胞，获得干扰Nestin的细胞系。利用蛋白免疫印迹和荧光定量PCR检测干扰效率，确定干扰成功。
干扰Nestin所用的各shRNA的靶序列如下：
shNES-1：5′-GGAAGAAGTTCCCAGGCTTCT-3′
shNES-2：5′-GCTGAAGCTGCATTTCCTTGG-3′
3、荧光定量PCR检测小鼠原代成纤维细胞的纤维化相关基因
提取小鼠原代成纤维细胞mRNA后，通过逆转录得到cDNA，利用Roche公司LC480系统进行荧光定量PCR检测纤维化相关基因α-SMA和CollagenⅠ的表达情况。
相关数据经△△Ct法分析得到如图6中的图A和图B所示，与Control+TGF-β组相比，ShNES-1+TGF-β组和ShNES-2+TGF-β小鼠原代成纤维细胞的纤维化相关基因α-SMA和CollagenⅠ表达水平显著下调。
荧光定量PCR所用的各引物如下表5所示：
表5
Figure BDA0002716285720000121
Figure BDA0002716285720000131
4、Western Blot检测小鼠原代成纤维细胞的纤维化相关蛋白
RIPA裂解液提取小鼠原代成纤维细胞蛋白质，经SDS-PAGE电泳、PVDF膜恒流转膜、5％脱脂奶粉封闭、TBS/T洗涤三次、纤维化相关蛋白α-SMA(Abcam，ab7817)和CollagenⅠ(Abcam，ab34710)抗体4℃过夜孵育、洗涤后孵育二抗Cell Signaling Technology，7076、7074)显影后，得到图6中图C，与Control+TGF-β组相比，ShNES-1+TGF-β组和ShNES-2+TGF-β小鼠原代成纤维细胞的纤维化相关蛋白α-SMA和CollagenⅠ表达水平显著下调，图6中的图D为图6中的图C中α-SMA和CollagenⅠ蛋白质灰度统计。
以上实验结果表明，体外靶向干预Nestin表达后，小鼠原代成纤维细胞的纤维化显著减缓。
实施例6AAV6-ShNestin对小鼠肺纤维化的影响
1、腺相关病毒6(AAV6)和博来霉素(Bleomycin)处理
CMV启动子下表达ShNestin的腺相关病毒血清6型(AAV6-ShNES)购于汉恒生物科技有限公司(中国，上海)。取24只8周龄雄性C57BL/6小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)分为4组，分别给予以下治疗方案处理：AAV6-Scramble+PBS(n＝6)、AAV6-Scramble+Bleo(n＝6)、AAV6-ShNES+PBS(n＝6)、AAV6-ShNES+Bleo(n＝6)。C57BL/6小鼠经深度麻醉后，分别将滴度为1.5×1012的AAV6-Scramble和AAV6-ShNES的病毒载体经滴鼻注射。注射后第21天麻醉小鼠后分别用博来霉素(Teva Pharmaceutical；3U/kg)或同等体积的PBS对小鼠进行气管内注射，第42天取小鼠肺组织进行实验。
干扰Nestin所用的AAV6-ShNestin各靶序列如下：
AAV6-Scramble：5′-TTCTCCGAACGTGTCACGTAA-3′
AAV6-ShNES：5′-GTGAGACTCTGGAATGCAA-3′
2、小鼠肺纤维化组织病理评价
小鼠安乐死后，用4％多聚甲醛灌注小鼠肺组织，制成组织切片后分别用H&E和Masson染色观察小鼠肺组织结构。
结果如图7中的图A所示，与AAV6-Scramble+Bleo组相比，AAV6-ShNES+Bleo组小鼠肺部纤维化进展显著减缓。
3、荧光定量PCR检测小鼠肺部的纤维化相关基因
匀浆并提取小鼠肺部mRNA后，通过逆转录得到cDNA，利用Roche公司LC480系统进行荧光定量PCR检测纤维化相关基因α-SMA(即Acta2)和CollagenⅠ的表达情况。相关数据经△△Ct法分析得到如图7中的图B所示，与AAV6-Scramble+Bleo组相比，AAV6-ShNES+Bleo组小鼠肺部的纤维化相关基因α-SMA和CollagenⅠ表达水平显著下调。
荧光定量PCR所用的各引物如下表6所示：
表6
Figure BDA0002716285720000141
4、Western Blot检测小鼠肺部的纤维化相关蛋白
匀浆并用RIPA裂解液提取小鼠肺部蛋白质，经SDS-PAGE电泳、PVDF膜恒流转膜、5％脱脂奶粉封闭、TBS/T洗涤三次、纤维化相关蛋白α-SMA(Abcam，ab7817)和CollagenⅠ(Abcam，ab34710)抗体4℃过夜孵育、洗涤后孵育二抗(Cell Signaling Technology，7076、7074)显影后，得到图7中图C，与AAV6-Scramble+Bleo组相比，AAV6-ShNES+Bleo组小鼠肺部的纤维化相关蛋白α-SMA和CollagenⅠ表达水平明显降低，图7中的图D为图7中的图C中α-SMA和CollagenⅠ蛋白质灰度统计。
以上实验结果表明，体内施用AAV6-ShNestin后，小鼠肺纤维化进展显著减缓。
实施例7心肌纤维化、肾纤维化、骨髓纤维化与Nestin表达的关系
1、构建纤维化小鼠模型
取8周龄雄性C57BL/6小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)和Nestin-GFP转基因鼠(Dr Masahiro Yamaguchi惠赠，Neuroreport.2000)麻醉后进行相应的器官纤维化造模。
对于心肌纤维化模型：分别植入渗透微型泵，皮下注射血管紧张素2或同等体积的生理盐水。小鼠在术后28天实施安乐死，取心脏组织进行实验。
对于肾纤维化模型：分别进行单侧输尿管梗阻(UUO)手术或假手术，术后第10天处死小鼠取肾脏组织进行实验。
对于骨髓纤维化模型：于照射清除骨髓后，分别将已转入过表达Tpo的载体或空载体的骨髓细胞移植入受体小鼠内，在移植8周后处死小鼠取胸骨进行实验。
2、荧光显微镜观察小鼠心肌、肾、骨髓纤维化模型的Nestin-GFP
荧光倒置显微镜下观察小鼠心肌、肾、骨髓纤维化模型的Nestin-GFP，得到如图8中的图A-C，可观察到小鼠在心肌、肾、骨髓纤维化下，相应器官纤维化模型的Nestin-GFP表达水平明显增加。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.Nestin基因的靶向抑制剂在制备器官纤维化治疗药物方面的应用，其特征在于，所述器官纤维化为肝纤维化；所述Nestin基因的靶向抑制剂为ShRNA，其靶序列如下：
AAV6-shNestin#1：5′-GTGAGACTCTGGAATGCAA-3′
AAV6-shNestin#2：5′-GCTGAAGCTGCATTTCCTTGG-3′。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述药物能够靶向抑制Nestin基因的表达从而延缓纤维化进展。
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