CN117919422A - Yoda1在制备治疗肝脏纤维化的药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及Yoda1在制备治疗肝脏纤维化的药物中的应用。本发明首次发现小鼠肝纤维化模型中纤维化区域的巨噬细胞Piezo1高表达，且Piezo1在肝纤维化中通过感知组织基质的硬度改变而被激活，从而调控巨噬细胞的胞葬作用，促进纤维化修复。基于动物实验的结果，本发明同时提出了Piezo1激动剂Yoda1可用于制备治疗肝脏纤维化的药物，具有广阔的应用前景。

Description

Yoda1在制备治疗肝脏纤维化的药物中的应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及Yoda1在制备治疗肝脏纤维化的药物中的应用。
背景技术
肝脏纤维化是现代人面临的一个主要的健康问题。无论病因如何，肝脏纤维化都是慢性肝病中的一个显著特征。现代研究表明，过量的酒精、药物、脂质积累、病毒感染，以及代谢或免疫失调都是常见的肝脏纤维化的诱导因素。早期的肝脏纤维化通常在诱因消除后能够自发消退。但若未及时发现并有效抑制，肝脏纤维化将逐渐不可逆地发展为肝硬化，并显著提高肝癌发生的风险，直接危及患者生命。目前治疗肝脏纤维化的选择十分有限，在临床实践中尚无有效的药物能够成功靶向已确立的纤维化。
研究表明巨噬细胞是参与纤维化进展的关键因素。在肝脏纤维化的病理过程中，肝星形细胞的激活是其显著的特征，而肝细胞的氧化损伤和凋亡及其引发的炎症反应往往是肝纤维化发生的始动因素。在肝损伤的早期，肝脏常驻巨噬细胞Kupffer细胞被死亡肝细胞释放的损伤相关分子模式(DAMPs)激活，并释放细胞因子或趋化因子，进一步招募循环单核细胞。招募而来的单核细胞分泌促炎或促纤维化因子，有助于肝星形细胞激活与瘢痕组织形成。另一方面，一部分招募而来的单核细胞逐渐转化为促修复型巨噬细胞，可调节肝星形细胞的激活状态或直接降解细胞外基质，表现出可促进纤维化修复的表型。此外，巨噬细胞还能通过胞葬作用有效清除受损肝脏中死亡的肝细胞及免疫细胞，限制肝损伤与纤维化的进展。尽管一些机制已被阐明，巨噬细胞在肝脏纤维化中的功能仍然是复杂多变的，因为巨噬细胞是异质性群体，具有相当的可塑性，其功能受到如组织定位，邻近细胞和组织的机械特性等组织环境因素的高度调节。
在肝脏纤维化中，随着反复和慢性的损伤，肝星形细胞的持续活化导致细胞外基质的沉积，组织重塑和随后的组织硬化。弹性模量是衡量材料抗弹性形变的一个量，表示单向应力下材料单位形变所需的力，单位为力学单位帕(Pa)或千帕(kPa)，也可以用来衡量组织硬度。相比健康肝脏的组织硬度，人类纤维化肝脏的组织硬度可达几十kPa，是健康肝脏硬度的数十倍。据报道，环境硬度的增加能够促进肝星形细胞的活化，这种HSC活化和肝组织硬化之间的前馈循环可能进一步促进纤维化形成。然而在肝纤维化的背景下，巨噬细胞如何响应组织硬度的变化并调节其功能仍是未知的。
Piezo1是一种机械力敏感的非选择性阳离子通道，其激活可介导Ca2+的内流，激动细胞内Ca2+依赖的信号通路，参与细胞的病理生理活动。先前的研究表明，Piezo1有利于巨噬细胞更容易在较硬的基质上表现出促炎特征；此外，髓系细胞特异性的Piezo1缺失可以改善小鼠的肺纤维化与肾纤维化。尽管如此，在肝脏的特定微环境下，Piezo1在肝脏纤维化中的具体作用仍不清楚。
当前，在慢性肝病的治疗中迫切需要能够有效逆转纤维化的药物。尽管基于促修复型巨噬细胞功能的治疗思路潜力巨大，目前仍未有任何一款已批准的药物出现。
发明内容
基于现有技术中缺少有效的治疗肝脏纤维化的药物的现状，本发明提供Yoda1在制备治疗肝脏纤维化的药物中的应用。
Yoda1为一种Piezo1激动剂，Yoda1的起效浓度低，活性强，特异性好，且制备流程成熟，很适合临床使用。然而，现有技术中并没有Piezo1激动剂Yoda1可以在肝脏纤维化治疗中的应用的相关报告。
本申请研究确定了髓系细胞中Piezo1的特异性敲除加剧了四氯化碳诱导的肝脏纤维化，或胆碱缺乏加高脂饮食(HFCDAA)诱导的非酒精性脂肪性肝炎模型中的肝脏纤维化。
同样的，本申请研究发现，Piezo1激动剂Yoda1的施用则有效改善了四氯化碳诱导的小鼠纤维化模型的肝脏纤维化症状。
因此，基于对肝脏纤维化治疗手段的迫切需求，本发明提供了一种以Piezo1为靶点的激动剂Yoda1在制备治疗肝脏纤维化的药物中的应用。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明首先提供Piezo1作为靶点在制备治疗肝脏纤维化的药物中的应用。
本申请公开了Piezo1在肝脏纤维化中的作用，为肝脏纤维化的治疗提供一种新的药物靶点。
在本发明的一个实施方式中，所述药物包含靶向调控Piezo1表达或激活的小分子化合物、抗体药、蛋白、核酸分子、多肽、脂类、碳水化合物或其组合物。
在本发明的一个实施方式中，所述药物通过激活巨噬细胞Piezo1促进巨噬细胞对肝脏纤维化的修复。
具体地，Piezo1作为药物靶点在肝脏纤维化中的应用可特异性地靶向巨噬细胞。因为Piezo1在纤维化肝脏的巨噬细胞中表达上调，并介导巨噬细胞的硬度感知和胞葬作用，促进了巨噬细胞转化为促修复表型，从而促进肝脏纤维化的修复。
在本发明的一个实施方式中，所述肝脏纤维化选自伴有肝纤维化或肝硬化的脂肪肝、非酒精性脂肪性肝病、非酒精性脂肪性肝炎、代谢性肝病、胆源性肝病或自身免疫性肝病等中的一种或多种。
优选地，所述肝脏纤维化与活性氧或过氧化物的过度积累相关。
优选地，所述肝脏纤维化与非酒精性脂肪性肝病或非酒精性脂肪性肝炎相关。
在本发明的一个实施方式中，所述“治疗肝脏纤维化”是指在有需要的受试对象中减轻、抑制或逆转肝脏纤维化的进展，治疗肝脏纤维化的药物选自如下(A1)-(A5)中至少一种的应用：
(A1)抑制肝脏纤维化患者肝脏中胶原沉积的产品，或者促进肝脏中胶原蛋白降解；
(A2)降低肝脏纤维化患者机体的血浆转氨酶含量的产品；
(A3)抑制肝脏纤维化患者机体肝脏中炎症因子表达的产品，或者促进促修复因子的表达；
(A4)减少肝脏纤维化患者机体肝脏中促炎免疫细胞浸润的产品；
(A5)减少肝脏纤维化患者机体肝脏中凋亡细胞的产品，或者提高肝脏纤维化患者机体肝脏对凋亡巨噬细胞的吞噬及消化。
本发明还进一步提供Yoda1在制备治疗肝脏纤维化的药物中的应用，所述Yoda1作为Piezo1激动剂，通过激活巨噬细胞Piezo1促进巨噬细胞对肝脏纤维化的修复。
所述Yoda1的结构式如(Ⅰ)所示：
所述Yoda1，Cas No.：448947-81-7，分子式为C13H8Cl2N4S，分子量为355.27，不溶于水。
在本发明的一个实施方式中，所述肝脏纤维化选自伴有肝纤维化或肝硬化的脂肪肝、非酒精性脂肪性肝病、非酒精性脂肪性肝炎、代谢性肝病、胆源性肝病或自身免疫性肝病等中的一种或多种。
在本发明的一个实施方式中，所述“治疗肝脏纤维化”是指在有需要的受试对象中减轻、抑制或逆转肝脏纤维化的进展，治疗肝脏纤维化的药物选自如下(A1)-(A5)中至少一种的应用：
(A1)抑制肝脏纤维化患者肝脏中胶原沉积的产品，或者促进肝脏中胶原蛋白降解；
(A2)降低肝脏纤维化患者机体的血浆转氨酶含量的产品；
(A3)抑制肝脏纤维化患者机体肝脏中炎症因子表达的产品，或者促进促修复因子的表达；
(A4)减少肝脏纤维化患者机体肝脏中促炎免疫细胞浸润的产品；
(A5)减少肝脏纤维化患者机体肝脏中凋亡细胞的产品，或者提高肝脏纤维化患者机体肝脏对凋亡巨噬细胞的吞噬及消化。
本发明还进一步提供一种用于治疗肝脏纤维化的药物组合物，所述药物组合物包含安全有效量的Yoda1作为活性成分。
在本发明的一个实施方式中，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体。
本发明中，组合物可用于实施疾病治疗，在治疗过程中组合物可以通过口服、注射等方式，用于口服时，可将其制备成常规的固体制剂如片剂、粉剂或胶囊等；用于注射时，可将其制备成注射液，本发明的组合物的各种剂型可以采用医学领域常规的方法进行制备，活性成分的施用量可根据用药途径、患者的年龄、体重、所治疗的疾病的类型和严重程度等进行变化。载体是指药学领域常规的载体，如：稀释剂；赋形剂等；粘合剂如纤维素衍生物、明胶、聚乙烯吡咯烷酮等；填充剂如淀粉等；崩解剂如碳酸钙、碳酸氢钠等；另外，还可以在组合物中加入其他辅助剂如香味剂和甜味剂。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1、本发明首次从动物，组织，细胞，分子等多个层面探讨巨噬细胞Piezo1参与的环境硬度感知介导的胞葬作用，及其在肝脏纤维化中的作用及机制，相关内容国内外尚无报道。
2、本发明首次将Piezo1激动剂Yoda1用于治疗肝脏纤维化，并通过动物实验证明其可以有效改善肝脏纤维化症状。
附图说明
图1是在Piezo1P1tdT转基因小鼠中使用四氯化碳诱导肝纤维化四周后肝脏细胞Piezo1表达的流式细胞术与免疫荧光检测及其统计。
A.肝脏中HSEC，KC，Ly6Chi MoDM，Ly6Clo MoDM，嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞中Piezo1表达的流式分析。
B.免疫荧光显示了肝脏巨噬细胞(F4/80，青色)中Piezo1(红色)的表达。标尺：10μm。
C.对B中巨噬细胞Piezo1表达的统计分析。
图2是四氯化碳诱导的肝纤维化中髓系细胞Piezo1特异性敲除对肝脏纤维化的影响。
A.Piezo1特异性敲除小鼠与对照小鼠慢性肝损伤后24小时与48小时肝脏天狼星红染色的代表性图像。标尺：200μm。
B-C.Piezo1特异性敲除小鼠与对照小鼠慢性肝损伤后24小时(B)与48小时(C)肝脏天狼星红染色阳性区域面积的统计。每组4-5只小鼠，图中每个点代表一只小鼠。
D.Piezo1特异性敲除小鼠与对照小鼠慢性肝损伤后24小时与48小时肝脏α-SMA免疫荧光染色的代表性图像。标尺：50μm。
E-F.Piezo1特异性敲除小鼠与对照小鼠慢性肝损伤后24小时(E)与48小时(F)肝脏α-SMA免疫荧光染色阳性区域面积的统计。图中每个点代表一个ROI。
图3是四氯化碳诱导的肝纤维化中髓系细胞Piezo1特异性敲除对纤维化相关基因表达及血清ALT与AST水平的影响。
A-B.Piezo1特异性敲除小鼠与对照小鼠慢性肝损伤后24小时(A)与48小时(B)qPCR检测肝脏纤维化相关基因的表达。每组4-5只小鼠，图中每个点代表一只小鼠。
C-D.Piezo1特异性敲除小鼠与对照小鼠慢性肝损伤后24小时血清AST(C)与ALT(D)水平。每组3只小鼠，图中每个点代表一只小鼠。
E-F.Piezo1特异性敲除小鼠与对照小鼠慢性肝损伤后48小时血清AST(E)与ALT(F)水平。每组4-5只小鼠，图中每个点代表一只小鼠。
图4是四氯化碳诱导的肝纤维化中髓系细胞Piezo1特异性敲除对肝脏嗜中性粒细胞浸润的影响。
A-D.慢性肝损伤后24(A)小时与48(C)小时肝脏流式的代表性图片显示了Piezo1特异性敲除小鼠肝脏嗜中性粒细胞的增加。B和D分别为A和C对应的统计图，每组4-6只小鼠，图中每个点代表一只小鼠。
E.慢性肝损伤后24(A)小时与48(C)小时肝脏免疫荧光的代表性图片显示了Piezo1特异性敲除小鼠肝脏嗜中性粒细胞(Ly6G，青色)的积累，巨噬细胞使用F4/80标记(红色)，细胞核使用Hoechst标记(蓝色)。标尺：50μm。
F-G.E中24小时(F)与48小时(G)嗜中性粒细胞数量的统计。图中每个点代表一个ROI。
图5是四氯化碳诱导的肝纤维化中髓系细胞Piezo1特异性敲除对肝脏巨噬细胞胞葬作用及肝脏凋亡细胞数量的影响。
A.慢性肝损伤后24小时肝脏免疫荧光的代表性图片显示了对照组小鼠与Piezo1特异性敲除小鼠肝脏嗜中性粒细胞(Ly6G，青色)与巨噬细胞(F4/80，红色)的共定位，细胞核使用Hoechst标记(蓝色)。标尺：15μm。
B.对A结果中嗜中性粒细胞与巨噬细胞共定位情况的统计。
C.Piezo1特异性敲除小鼠与对照小鼠慢性肝损伤后24小时肝脏凋亡细胞的TUNEL(黄色)染色，嗜中性粒细胞使用Ly6G标记(青色)，巨噬细胞使用F4/80标记(红色)，细胞核使用Hoechst标记(蓝色)。标尺：70μm。
D-E.对C结果中TUNEL阳性细胞数量(D)的统计和嗜中性粒细胞占TUNEL阳性细胞比例(E)的统计。
图6是体外巨噬细胞Piezo1敲除对巨噬细胞胞葬作用的影响。
A.代表性的免疫荧光图像显示了Piezo1特异性敲除小鼠或对照小鼠来源的BMDM(F4/80，红色)和凋亡或新鲜提取的嗜中性粒细胞(绿色)共培养时，BMDM细胞对凋亡嗜中性粒细胞的吞噬作用，细胞核使用Hoechst标记(蓝色)。标尺：15μm。
B.对A结果中巨噬细胞吞噬比例的统计。图中每个点代表一个ROI。
C.Piezo1特异性敲除小鼠或对照小鼠来源的BMDM和凋亡嗜中性粒细胞在Yoda1的刺激下共培养时，巨噬细胞吞噬比例的统计。图中每个点代表一个ROI。
D.代表性的流式图显示了Piezo1特异性敲除小鼠或对照小鼠来源的BMDM和凋亡嗜中性粒细胞在Yoda1的刺激下共培养时，BMDM细胞对凋亡嗜中性粒细胞的吞噬作用。
E.对D结果中巨噬细胞吞噬比例的统计。图中每个点代表一个复孔。
图7是四氯化碳诱导的肝纤维化中髓系细胞Piezo1特异性敲除对肝脏巨噬细胞基因表达的影响。
A.PCA图展示了对照组小鼠和Piezo1特异性敲除小鼠肝脏KC、Ly6Chi与Ly6CloMoDM转录组的变化。
B.慢性肝损伤中Piezo1特异性敲除小鼠与对照组小鼠相比肝脏Ly6Chi MoDM表达改变的基因的富集分析。
C.慢性肝损伤中Piezo1特异性敲除小鼠与对照组小鼠相比肝脏Ly6Chi MoDM表达改变的基因的表达热图。
图8是HFCDAA饮食诱导的肝纤维化中髓系细胞Piezo1特异性敲除对肝脏纤维化、脂质积累、肝损伤及纤维化相关基因表达水平的影响。
A.Piezo1特异性敲除小鼠与对照小鼠HFCDAA饮食诱导肝纤维化后肝脏天狼星红染色的代表性图像。标尺：200μm。
B.Piezo1特异性敲除小鼠与对照小鼠HFCDAA饮食诱导肝纤维化后肝脏天狼星红染色阳性区域面积的统计。每组5-6只小鼠，图中每个点代表一只小鼠。
C.Piezo1特异性敲除小鼠与对照小鼠HFCDAA饮食诱导肝纤维化后肝脏α-SMA免疫荧光染色的代表性图像。标尺：50μm。
D.Piezo1特异性敲除小鼠与对照小鼠HFCDAA饮食诱导肝纤维化后肝脏α-SMA免疫荧光染色阳性区域面积的统计。每组5-6只小鼠，图中每个点代表一只小鼠。
E.Piezo1特异性敲除小鼠与对照小鼠HFCDAA饮食诱导肝纤维化后肝脏油红O染色的代表性图像。标尺：100μm。
F.Piezo1特异性敲除小鼠与对照小鼠HFCDAA饮食诱导肝纤维化后肝脏油红O染色阳性区域面积的统计。每组5-6只小鼠，图中每个点代表一只小鼠。
G-H.Piezo1特异性敲除小鼠与对照小鼠HFCDAA饮食诱导肝纤维化后血清AST(G)与ALT(H)水平。每组5-6只小鼠，图中每个点代表一只小鼠。
I.Piezo1特异性敲除小鼠与对照小鼠HFCDAA饮食诱导肝纤维化后qPCR检测肝脏纤维化相关基因的表达。每组4-5只小鼠，图中每个点代表一只小鼠。
图9是四氯化碳诱导的肝纤维化中施用Yoda1对肝纤维化与肝损伤的影响。
A.慢性肝损伤中Yoda1给药的实验流程示意图。
B.慢性肝损伤小鼠Yoda1给药后肝脏天狼星红染色的代表性图片。标尺：200μm。
C.对B结果中天狼星红染色阳性面积的统计。每组5只小鼠，图中每个点代表一只小鼠。
D.慢性肝损伤小鼠Yoda1给药后α-SMA免疫荧光染色的代表性图片。标尺：50μm。
E.对D结果中α-SMA阳性区域面积的统计。每组5只小鼠，图中每个点代表一个ROI。
F.qPCR检测慢性肝损伤小鼠Yoda1给药后肝脏纤维化相关基因的表达。每组5只小鼠，图中每个点代表一只小鼠。
G-H.慢性肝损伤小鼠Yoda1给药后血清AST(G)与ALT(H)水平。每组5只小鼠，图中每个点代表一只小鼠。
图10是四氯化碳诱导的肝纤维化中施用Yoda1对肝脏嗜中性粒细胞浸润与凋亡细胞数量的影响。
A.慢性肝损伤小鼠Yoda1给药后肝脏免疫荧光的代表性图片，嗜中性粒细胞使用Ly6G标记(青色)，巨噬细胞使用F4/80标记(红色)，细胞核使用Hoechst标记(蓝色)。标尺：50μm。
B.对A结果中嗜中性粒细胞数量的统计。图中每个点代表一个ROI。
C.肝脏流式的代表性图片显示了Yoda1给药组小鼠肝脏嗜中性粒细胞的减少。
D.对C结果中小鼠肝脏嗜中性粒细胞在CD45+免疫细胞中的比例统计。每组5只小鼠，图中每个点代表一只小鼠。
E.对C结果中小鼠肝脏嗜中性粒细胞在CD45+免疫细胞中的绝对计数统计。每组5只小鼠，图中每个点代表一只小鼠。
F.慢性肝损伤小鼠Yoda1给药后肝脏TUNEL染色(黄色)的代表性图片，细胞核使用Hoechst标记(蓝色)。标尺：70μm。
G.对F结果中凋亡细胞数量的统计。图中每个点代表一个ROI。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体的实施例以及附图对本发明的技术方案进行详细描述。
以下实施例中所提及的所有小鼠均为C57BL/6背景。所有野生型小鼠均来自上海交通大学医学院实验动物中心。Piezo1P1tdT小鼠(Stock No.029214)，Piezo1fl/fl小鼠(Stock No.026948)，以及Lyz2Cre小鼠(Stock No.004781)品系均来自JacksonLaboratory。对于四氯化碳诱导小鼠的肝损伤及纤维化，均使用玉米油作为溶剂以9:1的配比将四氯化碳稀释，四氯化碳以1.5mL/kg小鼠体重的剂量腹腔注射，每周两次并持续四周以上以诱导小鼠的慢性肝损伤与肝纤维化。如无特别说明，以下实施例中的天狼星红染色，免疫荧光染色，流式细胞术，荧光定量PCR，血清ALT与AST检测，小鼠基因型鉴定等均为本领域已知的常规实验技术。
实施例1四氯化碳诱导的肝纤维化模型中Piezo1在巨噬细胞中的表达
由于缺乏可有效应用于流式细胞术或免疫荧光的抗Piezo1抗体，在该实施例中使用了Piezo1P1tdT转基因小鼠。在该小鼠中，Piezo1被带上tdTomato荧光蛋白标签，因此可通过tdTomato指示Piezo1的表达。使用流式细胞术评估了肝脏中多种细胞的Piezo1表达，发现Piezo1在肝血窦内皮细胞、KC、Ly6Chi与Ly6Clo MoDM中有较高表达，而在嗜中性粒细胞与嗜酸性粒细胞中低表达。在慢性肝损伤的小鼠肝脏中，Piezo1在巨噬细胞中的表达显著升高(图1A)。使用免疫荧光，同样验证了巨噬细胞的Piezo1表达在慢性肝损伤中显著升高。进一步探究Piezo1阳性细胞的空间分布，发现Piezo1阳性巨噬细胞多分布于纤维化区域附近(图1B，C)。
实施例2髓系细胞Piezo1特异性敲除对四氯化碳诱导的肝纤维化的影响
为了探究巨噬细胞表达的Piezo1在慢性肝损伤与肝纤维化中的作用，在该实施例中使用Lyz2Cre小鼠与Piezo1fl/fl小鼠杂交以在巨噬细胞中特异性敲除Piezo1，在四氯化碳诱导慢性肝损伤后，分别评估了最后一次四氯化碳注射之后24小时与48小时时间点的肝脏纤维化与肝损伤水平。通过天狼星红染色，发现Piezo1特异性敲除小鼠比起其同窝对照纤维化区域面积在最后一次四氯化碳注射后24小时时间点没有显著差异。但在最后一次四氯化碳注射后48小时的时间点，Piezo1特异性敲除小鼠的肝脏纤维化区域的面积显著升高(图2A-C)。使用α-SMA的免疫荧光染色，发现类似于天狼星红染色的结果，在Piezo1敲除小鼠肝脏中α-SMA阳性区域的面积在最后一次四氯化碳注射后48小时而不是24小时显著高于同窝对照小鼠(图2D-F)。这表明四氯化碳诱导慢性肝损伤后48小时Piezo1敲除小鼠中活化的肝星形细胞更多。qPCR结果同样表明最后一次四氯化碳注射后48小时而不是24小时，Piezo1特异性敲除小鼠肝脏中纤维化相关基因表达高于对照组小鼠(图3A，B)。另一方面，也测定了血清谷草转氨酶(Aspartate aminotransferase，AST)与谷丙转氨酶(Alanineaminotransferase，ALT)的水平以评估肝损伤程度。结果表明四氯化碳慢性肝损伤24小时或48小时后，Piezo1敲除小鼠的血清AST与ALT水平都显著高于其同窝对照小鼠(图3C-F)。此外，通过流式细胞术或免疫荧光的评估表明嗜中性粒细胞在Piezo1敲除小鼠的肝脏中的比例及数量显著高于其同窝对照组，且四氯化碳诱导慢性肝损伤24小时与48小时的时间点中皆是如此(图4A-D)。这些结果表明Piezo1在巨噬细胞中的特异性敲除加重了四氯化碳诱导的肝损伤与肝纤维化。为阐明Piezo1是否通过巨噬细胞的胞葬作用修复肝脏纤维化，在免疫荧光图像的纤维化区域中做了更细致的分析，发现尽管在Piezo1敲除小鼠中纤维化区域的嗜中性粒细胞更多，然而观察到的位于巨噬细胞胞体内的嗜中性粒细胞比例明显更低(图5A，B)。此外，对肝脏冰冻切片的TUNEL染色表明，Piezo1特异性敲除小鼠肝脏中凋亡的细胞数量显著增加(图5C，D)。
实施例3巨噬细胞中Piezo1敲除对其胞葬作用的影响
为了验证Piezo1是否对巨噬细胞的胞葬功能至关重要，在此实施例中使用Piezo1特异性敲除小鼠与对照小鼠来源的骨髓细胞体外诱导分化的BMDM进行了测试。当对照组小鼠来源的BMDM与凋亡的嗜中性粒细胞共培养时，短短1小时就可观察到BMDM明显吞噬了凋亡的嗜中性粒细胞。然而对照组小鼠来源的BMDM与新鲜提取的嗜中性粒细胞共培养时，几乎不吞噬新鲜提取的嗜中性粒细胞。当Piezo1敲除小鼠来源的BMDM与凋亡的嗜中性粒细胞共培养时，吞噬凋亡嗜中性粒细胞的BMDM比例显著低于对照组(图6A，B)。而当使用Piezo1的特异性激动剂Yoda1处理BMDM时，对照组小鼠来源的BMDM对凋亡嗜中性粒细胞的吞噬比例进一步增加，而特异性敲除小鼠来源的BMDM的吞噬比例则无显著变化(图6C)。使用流式细胞术同样验证了这一结果，被CFSE标记的凋亡嗜中性粒细胞与对照组小鼠或Piezo1敲除小鼠来源的BMDM共培养一小时后，吞噬了凋亡嗜中性粒细胞的BMDM可检测到CFSE的荧光信号。结果表明对照组小鼠来源的BMDM中CFSE阳性细胞比例显著高于Piezo1特异性敲除小鼠来源的BMDM，并且Yoda1处理显著提高了对照组小鼠而不是特异性敲除小鼠来源的BMDM中的这一比例(图6D，E)。因此，巨噬细胞对凋亡嗜中性粒细胞的胞葬作用确实依赖于Piezo1。
实施例4髓系细胞Piezo1特异性敲除对纤维化肝脏中巨噬细胞基因表达的影响
为了全面解析Piezo1在巨噬细胞中的特异性敲除对慢性肝损伤中肝脏巨噬细胞功能的调控作用，在此实施例中进一步分选了肝脏中包括KC、Ly6Chi与Ly6Clo MoDM三种异质性的巨噬细胞，并进行RNA测序以深入分析其转录组的全面变化。对测序结果的PCA降维分析显示，KC、Ly6Chi与Ly6Clo MoDM三种细胞类型主要在PC1维度上分离。而Piezo1的特异性敲除主要使Ly6Chi MoDM在PC2维度上分离(图7A)。这表明Piezo1的特异性敲除使慢性肝损伤中Ly6Chi MoDM的转录组发生显著改变。基因富集分析表明Piezo1特异性敲除小鼠中肝脏Ly6Chi MoDM与对照组相比表达发生改变的基因主要与细胞外基质组织、细胞迁移的正调控、炎症反应、凋亡过程的正调控和嗜中性粒细胞脱颗粒有关(图7B)。与此一致，Piezo1特异性敲除小鼠中肝脏Ly6Chi MoDM大部分与趋化、促炎巨噬细胞和细胞外基质形成相关的基因显著上调。而生长因子和促修复巨噬细胞相关基因显著下调(图7C)。这表明Piezo1活化促进了慢性肝损伤中肝脏Ly6Chi MoDM向促修复型巨噬细胞的转变。
实施例5髓系细胞Piezo1特异性敲除对HFCDAA饮食诱导的肝脏纤维化的影响
在该实施例中使用Lyz2Cre小鼠与Piezo1fl/fl小鼠杂交以在巨噬细胞中特异性敲除Piezo1，在给小鼠连续喂养一个月以上的HFCDAA饮食诱导慢性肝损伤后，评估其肝脏损伤及纤维化水平。结果表明Piezo1敲除小鼠的胶原蛋白沉积及α-SMA表达水平都显著高于其同窝对照小鼠(图8A-D)。此外，Piezo1敲除小鼠肝脏的脂质积累、血清ALT与ALT、及纤维化相关基因表达水平也显著高于其同窝对照小鼠(图8E-I)。这表明巨噬细胞Piezo1的抗纤维化作用可适用于不同的肝脏纤维化疾病。
实施例6施用Yoda1对四氯化碳诱导的肝纤维化的影响
在该实施例中为了考察Piezo1能否作为潜在的抗纤维化治疗靶点，使用Piezo1的特异性小分子激动剂Yoda1在慢性肝损伤造模期间持续给药，并评估了Yoda1给药对慢性肝损伤与肝纤维化的影响。具体地，Yoda1(MCE HY-18723)使用DMSO以10mg/mL浓度溶解并保存于-80℃，使用时1:9溶于玉米油中。小鼠在四氯化碳给药期间每隔一天以3mg/kg小鼠体重的剂量给药Yoda1，对照组小鼠给药相同体积的玉米油(图9A)。数据表明，与Piezo1敲除小鼠中直至慢性肝损伤后48小时时间点才发现纤维化程度的显著差异不同，Yoda1给药后小鼠的纤维化程度在24小时就已发现显著差异(图9B-E)。qPCR结果同样验证了这一点(图9F)。此外，Yoda1治疗组的肝损伤程度也显著降低(图9G，H)。此外，与Piezo1激活促进巨噬细胞胞葬作用的结果一致，Yoda1给药组小鼠的肝脏嗜中性粒细胞积累也显著减少(图10A-E)，并且总凋亡细胞数减少(图10F，G)。因此，Yoda1给药可以显著提高肝脏巨噬细胞清除凋亡细胞与嗜中性粒细胞的能力，缓解慢性肝损伤与纤维化，强调了Piezo1作为抗纤维化治疗靶点的潜力。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.Piezo1作为靶点在制备治疗肝脏纤维化的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物包含靶向调控Piezo1表达或激活的小分子化合物、抗体药、蛋白、核酸分子、多肽、脂类、碳水化合物或其组合物。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物通过激活巨噬细胞Piezo1促进巨噬细胞对肝脏纤维化的修复。
4.Yoda1在制备治疗肝脏纤维化的药物中的应用，其特征在于，所述Yoda1作为Piezo1激动剂，通过激活巨噬细胞Piezo1促进巨噬细胞对肝脏纤维化的修复；
所述Yoda1的结构式如(Ⅰ)所示：
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述肝脏纤维化选自伴有肝纤维化或肝硬化的脂肪肝、非酒精性脂肪性肝病、非酒精性脂肪性肝炎、代谢性肝病、胆源性肝病或自身免疫性肝病等中的一种或多种。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述肝脏纤维化与活性氧或过氧化物的过度积累相关。
7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述肝脏纤维化与非酒精性脂肪性肝病或非酒精性脂肪性肝炎相关。
8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，治疗肝脏纤维化的药物选自如下(A1)-(A5)中至少一种的应用：
(A1)抑制肝脏纤维化患者肝脏中胶原沉积的产品，或者促进肝脏中胶原蛋白降解；
(A2)降低肝脏纤维化患者机体的血浆转氨酶含量的产品；
(A3)抑制肝脏纤维化患者机体肝脏中炎症因子表达的产品，或者促进促修复因子的表达；
(A4)减少肝脏纤维化患者机体肝脏中促炎免疫细胞浸润的产品；
(A5)减少肝脏纤维化患者机体肝脏中凋亡细胞的产品，或者提高肝脏纤维化患者机体肝脏对凋亡巨噬细胞的吞噬及消化。
9.一种用于治疗肝脏纤维化的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含安全有效量的Yoda1作为活性成分。
10.根据权利要求9所述的一种用于治疗肝脏纤维化的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体。
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