CN111450089A

CN111450089A - Bepridil或KB-R7943在制备治疗黑色素瘤的药物中的应用

Info

Publication number: CN111450089A
Application number: CN202010530779.3A
Authority: CN
Inventors: 宋明柯
Original assignee: Shanghai Jiaotong University School of Medicine
Current assignee: Shanghai Jiaotong University School of Medicine
Priority date: 2020-06-11
Filing date: 2020-06-11
Publication date: 2020-07-28

Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，具体是Bepridil或KB‑R7943在制备治疗黑色素瘤的药物中的应用。本发明提出了抗黑色素瘤的新策略，即应用钠钙交换体的抑制剂Bepridil或KB‑R7943治疗黑色素瘤，属于老药新用。本发明研究Bepridil或KB‑R7943杀灭肿瘤细胞的机制与以往的药物完全不同，也没有产生耐药性。这两个新药的使用有望改善黑色素瘤患者的预后和提高患者生存率，减轻社会负担，为黑色素瘤的治疗带来光明前景。

Description

Bepridil或KB-R7943在制备治疗黑色素瘤的药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体地说，是Bepridil或KB-R7943在制备治疗黑色素瘤的药物中的应用。

背景技术

黑色素瘤是由起源于神经脊的黑素细胞发展而来的恶性肿瘤，多数由正常的痣和色素斑演变形成，多发于皮肤。此外，黑色素细胞也存在于皮肤细胞外，如黏膜型黑色素瘤常发生于头颈部的鼻窦、口腔、肛门、外阴和阴道，也出现在胃肠道和泌尿生殖道之间的黏膜。50％～80％的晚期黑色素瘤患者会发生肝转移，8％～46％的黑色素瘤患者会发生脑转移，发生转移的晚期黑色素瘤中位生存时间仅为8～9个月，黑色素瘤一度被称为“癌王”。

恶性黑色素瘤好发于白色人种，西方人黑色素瘤多分布在皮肤浅表(称为皮肤型)，而我国黑色素瘤主要分布于四肢末端(称为肢端型)和黏膜(称为黏膜型)，中国黑色素瘤恶性程度和死亡率较西方更高。我国的黑色素瘤占所有恶性肿瘤的1％～3％，发病率逐年增长，年增长率为3％～5％。在我国，由于人口基数大，恶性黑色素瘤的总体罹患人数较多，尤其在沿海发达城市，恶性黑色素瘤的发病率和死亡率均呈现快速上升趋势，应引起足够的重视。

目前治疗黑色素瘤的药物主要有化学治疗药物达卡巴嗪、替莫唑胺，生物治疗药威罗菲尼、达拉菲尼、曲美替尼、易普利姆玛、nivolumab和pembrolizumab，小分子靶向药物BRAF抑制剂、MEK抑制剂、作用于程序性死亡分子1(PD-1)的免疫治疗药物以及溶瘤病毒疗法。这些治疗药物和治疗手段尽管能不同程度的提高患者的应答率和总生存率，但是仍面临着诸如不良反应较为明显、单靶点药物易产生免疫逃逸和耐药性、治疗效果并不理想等问题。抗黑色素瘤之路仍存挑战，需要进一步研发新的分子靶向药和新型化疗药物，解决黑色素瘤的药物治疗难题。

Bepridil和KB-R7943的分子式、化学结构如附图1所示。Bepridil的中文名是苄普地尔，是一种临床上正在使用的心血管药物，Bepridil的药理学作用主要是抑制钠钙交换体(NCX)和抑制钙离子慢通道，临床上用于治疗心绞痛、各种心律失常和高血压。KB-R7943的药理作用是抑制细胞膜上的钠钙交换体(Na+/Ca²⁺exchanger,NCX)，目前还没有临床使用的报道，动物实验显示KB-R7943有抗心律失常和保护心肌缺血的作用。

中国专利201711398885.5公开了KB-R7943或Bepridil在制备治疗神经胶质瘤中的应用发明。另外，中国专利201380079011.7公开了用于减轻神经系统损伤的组合物及该组合物，其具体公开一种用于减轻受治者神经损伤的方法，包括：向所述受治者施用治疗有效量的包含阿米洛利、阿米洛利类似物或它们的药学上可接受的盐的药物组合物，其中，所述阿米洛利类似物包括KB-R7943。

现有技术中，关于化合物Bepridil或KB-R7943在制备治疗黑色素瘤的药物中的应用，目前还未见报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供钠钙交换体抑制剂Bepridil或KB-R7943的制药新用途。

本发明的再一的目的是针对现有技术中的不足，提供一种治疗黑色素瘤的药物组合物。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

钠钙交换体抑制剂Bepridil或KB-R7943在制备治疗黑色素瘤的药物中的应用。

作为本发明的一个优选实施方案，所述药物的活性成分为Bepridil。

作为本发明的一个优选实施方案，所述药物的活性成分为KB-R7943。

作为本发明的一个优选实施方案，所述药物单独使用或者以药物组合物的形式使用；所述药物组合物包含治疗有效量的Bepridil或KB-R7943，也可以同时包含Bepridil和KB-R7943，以及黑色素瘤常规化疗药物。

作为本发明的一个优选实施方案，把Bepridil或KB-R7943与其他常规化疗药物合并使用，可以增强黑色素瘤对其他常规化疗药物的敏感性。

所述黑色素瘤治疗药物和方法包括但不限于：化学治疗药物达卡巴嗪、替莫唑胺、尼莫斯汀、卡莫斯汀、洛莫斯汀、甲基苄肼、甲氨喋呤或福莫司汀，生物治疗药威罗菲尼、达拉菲尼、曲美替尼、易普利姆玛、nivolumab和pembrolizumab，小分子靶向药物BRAF抑制剂、MEK抑制剂、作用于程序性死亡分子1(PD-1)的免疫治疗药物以及溶瘤病毒疗法。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：

一种治疗黑色素瘤的药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效量的Bepridil或KB-R7943，也可以同时包含KB-R7943和Bepridil，以及药学上可接受的载体。

所述药学上可接受的载体包括但并不限于：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、稀释剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂、甜味剂、湿润剂。

由于Bepridil和KB-R7943口服以后，通过血液循环到达黑色素瘤部位，因此包含本发明化合物的药物组合物可以根据现有技术常规方法制备固/液体口服药物制剂或静脉注射液。

固体口服形式的药物制剂可以包括稀释剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂、甜味剂、湿润剂以及药物制剂中常用的无活性且无药理活性的物质。这些药物制剂可以以现有技术已知的方法进行制备。例如，通过混合、制粒、制片、糖包衣或膜包衣处理的方法，制备成胶囊剂、颗粒剂、片剂或合剂。示例性的稀释剂例如可以是：乳糖、右旋糖、二糖、蔗糖、纤维素、玉米淀粉或马铃薯淀粉；润滑剂可以是：硅石、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁或钙和/或聚乙二醇；粘合剂可以是：淀粉类、阿拉伯胶、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮；崩解剂可以是：淀粉、海藻酸、海藻酸盐或淀粉羟乙酸钠；湿润剂可以是：卵磷脂、聚山梨酯和月桂硫酸盐(酯)。

液体口服形式的药物制剂可以是糖浆、乳剂或混悬液。糖浆可以包含作为载体的二糖，或者二糖和甘油和/或甘露醇和山梨糖醇。混悬液和乳剂可以包含作为载体例子的天然胶、琼脂、海藻酸钠、果胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素或聚乙烯醇。

静脉注射剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。

所述治疗有效量，是指本发明化合物的施加量足以达到治疗预期目的量，其根据治疗前所期望的治疗效果实现。治疗有效量的确定是本领域技术人员的常规技术手段，有效量取决于多种因素，例如接受治疗个体的体型和/或个体所患疾病或不希望有的病症的发展程度。有效量也取决于药效化合物是否以单一剂量及用药频率。

本发明中的药物治疗个体，包括哺乳动物和非哺乳动物。哺乳动物的例子包括但不限于：哺乳动物类的任何成员，例如成年人、儿童、非人的灵长类猩猩，以及其他猿和猴类；农场动物例如牛、马、羊、山羊、猪；家畜类动物例如兔、狗和猫；实验室动物包括啮齿类，例如大鼠、小鼠和豚鼠等。非哺乳动物的例子包括但不限于，鸟、鱼等。

本发明提供的抗肿瘤药物能有效杀灭黑色素瘤细胞，目前没有产生耐药性和抗药性，药物作用靶点与既往药物不同，属于老药新用，有望给黑色素瘤的治疗带来光明前景。

在治疗黑色素瘤的过程中，本发明的药物可以单独使用，也可以与手术治疗合用，或与其他化疗药物合用，与放射性治疗方法合用，产生综合治疗效果。

本发明提供的抗肿瘤药物具有见效快、疗效好的优点，细胞实验和动物实验结果显示：化学物质Bepridil或KB-R7943对黑色素瘤细胞的生长都有抑制作用，这两个药物在较高浓度杀死黑色素瘤细胞，因此化合物Bepridil或KB-R7943都可用于制备治疗黑色素瘤的药物，改善黑色素瘤患者的预后和提高其生存率。

Bepridil和KB-R7943都是已知的化合物，本发明将钠钙交换体抑制剂Bepridil或KB-R7943应用到黑色素瘤的治疗，属于老药新用，有显著的创新性。

文献表明Bepridil或KB-R7943口服以后，进入血液循环和分布到全身，所以患者可以口服这两种药物，静脉注射也可以，用于治疗黑色素瘤。与现有的抗黑色素瘤药物相比较，Bepridil或KB-R7943作用于全新的药物靶点，即细胞膜上的钠钙交换体，杀灭肿瘤细胞的机制与以往的药物完全不同，目前也没有产生耐药性。

本发明优点在于：

本发明首次发现了钠钙交换体抑制剂的新用途，为黑色素瘤患者提供了新的治疗方案，通过实验结果表明：该药物与现有的抗黑色素瘤药物相比较，其杀灭肿瘤细胞的机制不同，该药物通过增加细胞内钙离子的浓度和诱发钙超载来杀死肿瘤细胞，且未产生耐药性，疗效好，实用性强，应用前景广。

附图说明

附图1是Bepridil和KB-R7943的分子式和化学结构。

附图2是Bepridil抑制黑色素瘤细胞系(A2058和A375)生长的剂量-效应曲线。

附图3是KB-R7943抑制黑色素瘤细胞系(A2058和A375)生长的剂量-效应曲线。

附图4是Bepridil(A图)和KB-R7943(B图)对在体黑色素瘤生长的抑制作用。

附图5是C57BL/J小鼠右前肢皮下种植B16黑色素瘤细胞后，记录对照组与药物治疗组的小鼠存活率，Bepridil和KB-R7943治疗组都比对照组显著延长了小鼠的生存时间。生存曲线整体比较的LogRank检验结果为P<0.05，每组15只动物。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1细胞实验

1实验方法

用DMEM培养基+10％的胎牛血清培养人黑色素瘤细胞系A2058和A375。细胞以9000个/孔接种于96孔板，放入含有5％二氧化碳的37℃培养箱内培养。待细胞长到70％-80％后，在培养基中加入一系列不同浓度的Bepridil或KB-R7943，药物孵育2天以后测定细胞的死亡状况，采用CCK-8方法检测细胞活性。

2结果

结果发现Bepridil和KB-R7943都显著抑制黑色素瘤细胞的生长。Bepridil抑制肿瘤细胞生长的剂量-效应关系如图2所示，Bepridil剂量依赖性地杀死黑色素瘤细胞系A2058和A375(图2)，通过拟合量效曲线和重复5次实验产生的50％抑制浓度(IC50)分别为：Bepridil抑制A2058细胞的IC50：17.1±0.89μM(微摩尔/升)；Bepridil抑制A375细胞的IC50：16.9±0.96μM(微摩尔/升)。

KB-R7943抑制肿瘤细胞生长的剂量-效应关系如图3所示，

KB-R7943剂量依赖性地杀死黑色素瘤细胞系A2058和A375(图3)，通过拟合量效曲线和重复5次实验产生的50％抑制浓度(IC50)分别为：KB-R7943抑制A2058细胞的IC50：20.9±2.38μM(微摩尔/升)；KB-R7943抑制A375细胞的IC50：19.7±5.08μM(微摩尔/升)。

3结论

总之，我们通过体外细胞实验证明，Bepridil和KB-R7943对黑色素瘤细胞都有显著的杀灭作用，并且没有出现耐药性。

实施例2体内动物实验

1实验方法

1)小鼠黑色素瘤细胞系B16的培养和小鼠皮下种植模型的建立：

用RPMI-1640培养基+10％FBS培养小鼠黑色素瘤细胞系B16，置于37℃、含5％CO₂的培养箱内传代生长。取对数生长期细胞，用PBS洗和0.25％胰酶消化，用PBS收集细胞制成细胞悬液，台盼蓝染色试验鉴定细胞存活率大于92％，调整细胞浓度为100000/μl后30分钟内种植到大鼠脑内，以下简述细胞种植过程。

黑色素瘤模型的建立：选取8月龄的雄性C57BL/6J小鼠，用异氟烷麻醉机进行全身麻醉后，以小鼠右侧后腋窝为中心剃除毛发，酒精棉球擦拭消毒后，左手用尖镊提起其中央皮肤，右手用31号针头注射器在其提起皮肤下方0.3厘米处缓慢注入小鼠黑色素瘤B16细胞悬液200μL，见皮下球囊状鼓起，放松尖镊并拔针，用无菌棉球轻轻按压穿刺处10秒钟。建立模型全程应防止苏醒，同时也要防止注入部位肿瘤细胞悬液的渗漏。种植后5-7天可见皮下隆起的肿瘤结界，证明小鼠黑色素瘤模型建模成功。

2)动物分组和药物治疗方案：

实验设计共四组小鼠：

对照组一；

Bepridil治疗组；

对照组二；

KB-R7943治疗组，每组各25只动物。所有小鼠均为种植B16细胞的黑色素瘤模型，种植后第6天开始分别接受KB-R7943和Bepridil治疗。KB-R7943和Bepridil配制方法是先用DMSO溶解，最后溶解于阿拉伯树胶水溶液(5％)。KB-R7943(30mg/kg)和Bepridil(30mg/kg)溶液每天一次给小鼠灌胃给药，连续给药治疗40天。对照组小鼠仅接受阿拉伯树胶溶液灌胃，灌胃的剂量和时间与治疗组相同。

3)动物实验的疗效观察：

黑色素瘤模型小鼠治疗开始后，每天测量肿瘤体积大小，测量到第20天。方法是利用游标卡尺测量肿瘤的最小直径(a)和最大直径(b)，按V肿瘤体积＝a²×b×π/6公式计算肿瘤体积，并记录肿瘤生长延迟效应，同时观察动物的生存情况。小鼠出现频死前症状或观察期满时(治疗40天)予以处死，生存曲线绘制应用Kaplan-Meier氏方法，统计学检验方法为Log-rank检验。

2实验结果：

Bepridil和KB-R7943均显著抑制种植黑色素瘤的生长(图4)。

结果如图4所示，C57BL/J小鼠右前肢皮下种植B16小鼠黑色素瘤细胞，5-7天后形成可见肿瘤结节。B16细胞种植后第6天开始进行药物治疗，对照组仅给予溶剂治疗。从第7天开始测量种植瘤的长、短径，连续测量至第20天。通过计算肿瘤体积发现，Bepridil和KB-R7943都能显著抑制种植黑色素瘤的生长(P<0.05,t检验，每组动物数n＝10)。

Bepridil和KB-R7943均能显著延长黑色素瘤模型小鼠的生存期(图5)。

结果如图5所示，发现对照组小鼠在第17-19天开始出现死亡，第37天时死亡率达到100％；而Bepridil和KB-R7943治疗组在第22-25天出现死亡，46-49天时死亡率达到100％。应用Kaplan-Meier氏方法绘制的生存曲线，经Log-Rank检验后发现，Bepridil和KB-R7943治疗组都比对照组显著延长了小鼠的生存时间(P<0.05，每组动物数n＝15)。

3结论

针对小鼠皮下种植黑色素瘤细胞的动物模型，采取灌胃给药的方法分别给予Bepridil和KB-R7943进行药物治疗，结果发现Bepridil和KB-R7943均能显著抑制黑色素瘤的生长，并且均能显著延长荷瘤小鼠的生存时间。体内动物实验证明Bepridil和KB-R7943对黑色素瘤有治疗作用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.钠钙交换体抑制剂在制备治疗黑色素瘤的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的钠钙交换体抑制剂是Bepridil和/或KB-R7943。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的药物的活性成分为Bepridil和/或KB-R7943。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的药物单独使用或者以药物组合物的形式使用；所述的药物组合物包含治疗有效量的Bepridil和/或KB-R7943，以及黑色素瘤常规化疗药物和治疗手段。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，将Bepridil或KB-R7943与其他常规化疗药物合并使用，可以增强黑色素瘤对其他常规化疗药物的敏感性。

6.根据权利要求4-5任一所述的应用，其特征在于，所述常规化疗药物包括但不限于：化学治疗药物达卡巴嗪、替莫唑胺、尼莫斯汀、卡莫斯汀、洛莫斯汀、甲基苄肼、甲氨喋呤或福莫司汀，生物治疗药物威罗菲尼、达拉菲尼、曲美替尼、易普利姆玛、nivolumab和pembrolizumab，小分子靶向药物BRAF抑制剂、MEK抑制剂、作用于程序性死亡分子1(PD-1)的免疫治疗药物；所述的治疗手段包括但不限于溶瘤病毒疗法。

7.一种治疗黑色素瘤的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物是治疗有效量的Bepridil和/或KB-R7943，以及药学上可接受的载体。