CN113908145B - 2-[4-[(4-硝基苯基)甲氧基]苯基]乙基氨基亚氨基硫酸酯的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了2‑[4‑[(4‑硝基苯基)甲氧基]苯基]乙基氨基亚氨基硫酸酯(KB‑R7943)在制备治疗胃癌药物中的应用，通过其对NCX1的抑制作用，达到恢复肿瘤细胞内Ca2+平衡，抑制肿瘤细胞增殖，为胃癌的治疗提供了新的候选药物，也为KB‑R7943扩宽了新的用途。

Description

2-[4-[(4-硝基苯基)甲氧基]苯基]乙基氨基亚氨基硫酸酯的 应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及2-[4-[(4-硝基苯基)甲氧基]苯基]乙基氨基亚氨基 硫酸酯在制备治疗胃癌药物中的应用。
背景技术
在世界范围内，胃癌是发病率较高的恶性肿瘤之一，其致死率位居所有恶性肿瘤致死率 的第二位。胃癌的病因复杂，其发生和发展过程中所涉及的分子机制至今尚未阐明。目前临 床上应用于胃癌治疗的手段包括手术切除，化疗，放疗，靶向治疗等。对于不适用手术治疗的胃癌患者，化疗和放疗的副作用大，且具有促进肿瘤转移的风险。而靶向治疗的药物目前 仅适用与肿瘤有特定基因突变的病人。因此，作用于胃癌本身特殊的细胞及分子生物学机制 的分子，将有助于改善胃癌的治疗。
细胞浆内的游离钙离子(Ca2+)是一个普遍存在的细胞内信使，细胞内Ca2+平衡的紊乱 是导致肿瘤发生发展及其恶性转化的重要原因。在调控细胞内Ca2+信号通路相关的分子网络 中，表达在消化道黏膜上皮细胞膜上的钠钙交换器1(Na+/Ca2+Exchanger，NCX1)，在其胞内 Ca2+平衡调节中发挥着重要的作用。在正常生理状态下，NCX1主要进行正向转运(或称为 内钙排出模式)，在细胞内生理性Ca2+信号升高后的外排中起着重要作用，以维持细胞的正常 生理功能。在肿瘤细胞中，由于肿瘤细胞内缺氧导致细胞内的H+浓度增高，进一步通过激活 Na+/H+交换器(NHE)促进细胞内Na+浓度的异常增高，驱使NCX1进行逆向转运(或称为 外钙进入模式)，最终引起细胞外Ca2+进入胞内，导致胞浆内Ca2+的持续增加。研究表明， NCX1在人体胃癌组织及癌细胞中高表达，采用NCX1的选择性激动剂Neurounina-1可以通 过促进胞浆内Ca2+浓度升高，进而促进胃癌细胞的增殖。针对与胃癌中NCX1的小分子，极有可能成为改善胃癌治疗的新手段。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供2-[4-[(4-硝基苯基)甲氧基]苯基]乙基氨基亚氨基 硫酸酯在制备治疗胃癌药物的应用。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1、2-[4-[(4-硝基苯基)甲氧基]苯基]乙基氨基亚氨基硫酸酯在制备治疗胃癌药物的应用， 2-[4-[(4-硝基苯基)甲氧基]苯基]乙基氨基亚氨基硫酸酯结构如式I：
优选的，2-[4-[(4-硝基苯基)甲氧基]苯基]乙基氨基亚氨基硫酸酯为甲磺酸盐。
优选的，所述2-[4-[(4-硝基苯基)甲氧基]苯基]乙基氨基亚氨基硫酸酯在制备抑制NCX1 激活引起的细胞内Ca2+浓度升高中的应用。
优选的，所述2-[4-[(4-硝基苯基)甲氧基]苯基]乙基氨基亚氨基硫酸酯在制备抑制胃癌细 胞增殖的药物中的应用。
优选的，所述2-[4-[(4-硝基苯基)甲氧基]苯基]乙基氨基亚氨基硫酸酯在制备抑制肿瘤生 长的药物中的应用。
本发明的有益效果在于：本发明的目的在于提供2-[4-[(4-硝基苯基)甲氧基]苯基]乙基氨 基亚氨基硫酸酯在制备治疗胃癌药物的应用，通过其对NCX1的抑制作用，达到恢复肿瘤细 胞内Ca2+平衡，抑制肿瘤细胞增殖，为胃癌的治疗提供了新的思路。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为2-[4-[(4-硝基苯基)甲氧基]苯基]乙基氨基亚氨基硫酸酯具有抑制NCX1激活所引 起的胃癌细胞内Ca2+浓度增加的作用(A：MKN-45细胞处于0Na+环境下，外钙(2mM)刺激 所引起细胞内Ca2+浓度的变化；B：MKN-45细胞处于0Na+环境下，用2-[4-[(4-硝基苯基)甲 氧基]苯基]乙基氨基亚氨基硫酸酯(KB-R7943,10μM)处理后，外钙(2mM)刺激所引起的细胞 内Ca2+浓度的变化；C：对A和B的统计图，*表示P<0.05)。
图2为2-[4-[(4-硝基苯基)甲氧基]苯基]乙基氨基亚氨基硫酸酯具有抑制胃癌细胞增殖的 作用(A：2-[4-[(4-硝基苯基)甲氧基]苯基]乙基氨基亚氨基硫酸酯(KB-R7943)抑制NCX1的激 动剂Neurounina-1对胃癌细胞SGC-7901的促增殖作用；B:2-[4-[(4-硝基苯基)甲氧基]苯基]乙基氨基亚氨基硫酸酯(KB-R7943)抑制NCX1激动剂Neurounina-1刺激对胃癌细胞MKN-45 的促增殖作用；*表示P<0.05)。
图3为2-[4-[(4-硝基苯基)甲氧基]苯基]乙基氨基亚氨基硫酸酯具有抑制小鼠体内胃癌细 胞生长的作用(A：2-[4-[(4-硝基苯基)甲氧基]苯基]乙基氨基亚氨基硫酸酯(KB-R7943)以不同剂 量control(●)，1mg/kg(■)和10mg/kg(▲)对小鼠给药30天，每组5只，检测肿瘤体积；B：A图的定量统计图，*表示P<0.05)。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的 理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1
利用2-[4-[(4-硝基苯基)甲氧基]苯基]乙基氨基亚氨基硫酸酯(KB-R7943)体外抑制NCX1 激活引起的细胞内Ca2+浓度升高，具体步骤如下：
1、细胞培养及爬片准备
①细胞的计数和细胞收集：取处于对数期生长的细胞，用0.25％胰酶进行细胞消化，800 rpm，离心5min后收集细胞，溶于1mL含10％FBS的培养基中制成细胞悬液。取50μL悬液 滴于细胞计数板中，按公式：4大格细胞总数/4×104进行细胞计数，收集细胞1×105/200μL 备用。
②细胞的接种：预先将特殊的细胞爬片浸泡酒精并在紫外灯下照射15分钟后置于24孔 板内准备接种，将培养的腺泡细胞制成密度2×103的细胞悬液，滴入24孔板中，放入37℃孵 育24小时。
2、上机前准备
①上机试剂的配制：PSS液配制：称取0.41g NaCl溶解于40mL超纯水中，而后加入1M KCl 0.25mL、1M葡萄糖0.5mL、0.1M CaCl2 0.5mL，TMA/Hepes缓冲液0.5mL调pH 至7.4，最后加超纯水至50mL。Fura-2/AM配制：10μg/支的Fura-2/AM加入4μL F127和6 μL DMSO配成10μL储存液，使用时按1:1000用PSS稀释成工作液。
②Ca2+染料loading：实验前用PSS液漂洗3次后，加入终浓度为Fura-2/AM，室温避光孵 育60min，孵育结束再用PSS液漂洗3次(10min/次)，激光共聚焦显微镜下观察，数据采集间 隔时间为2s，扫描时间为20min，激发波长为340/380nm，动态观察Fura-2/AM所标Ca2+的荧 光强度的变化所表示的细胞质内游离Ca2+水平的变化，结果如图1中A所示。结果表明，0Na+所激活的NCX1引起了胃癌细胞内Ca2+浓度的增加。
3、通过NCX1选择性抑制剂KB-R7943验证NCX1对胃癌细胞内Ca2+浓度的调节作用
①将爬片成功的细胞分为control组及2-[4-[(4-硝基苯基)甲氧基]苯基]乙基氨基亚氨基硫 酸酯(KB-R7943)组，将Fura-2/AM标记好的control组细胞放置在激光共聚焦显微镜下，先应 予以正常的PSS冲洗3-5分钟，待细胞内钙的浓度达到稳定状态后将细胞处于0Na+的环境下， 用2mM Ca2+刺激，动态观察并记录control组细胞内Ca2+荧光强度的变化情况，结果如图1中B 所示。结果显示，2-[4-[(4-硝基苯基)甲氧基]苯基]乙基氨基亚氨基硫酸酯(KB-R7943)抑制了 NCX1激活所引起的胃癌细胞内Ca2+浓度的增加。
②将胃癌细胞处于0Na+的环境下，先用2mM Ca2+刺激胃癌细胞的第一次内钙上升峰， 记录下control组Ca2+荧光强度的变化幅度，然后加入阻断剂KB-R7943(10μM)的PSS将升 高的荧光洗回基线，待基线稳定后再用含阻断剂KB-R7943的2mM Ca2+缓冲液刺激，观察经KB-R7943阻断NCX1的功能后，细胞内Ca2+的变化较control组是升高还是减低，观察加 入阻断剂前后细胞内Ca2+的荧光强度变化并采集数据，结果如图1所示。结果显示，，2-[4-[(4-硝基苯基)甲氧基]苯基]乙基氨基亚氨基硫酸酯(KB-R7943)抑制了NCX1激活所引起的胃癌细胞内Ca2+浓度的增加。
实施例2
利用2-[4-[(4-硝基苯基)甲氧基]苯基]乙基氨基亚氨基硫酸酯体外抑制胃癌细胞增殖，具 体步骤如下：
取对数生长期的MKN-45和SGC-7901细胞接种于96孔板，每孔的细胞密度控制在103左右，加药前予以无血清培养基饥饿过夜，用含10％胎牛血清的DMEM培养基配制10nMNeurounina-1以及5μM KB-R7943，分别加入到孔板中，对照组(control)加入等体积的PBS替代，于细胞培养箱中孵育72h后，采用CCK8检测试剂盒(MCE)检测细胞数量，观察并 比较不同组别在450nm下的吸光度，结果如图2所示。结果显示，与对照组相比KB-R7943 处理MKN-45和SGC-7901细胞后细胞增殖降低，差异不显著；但是将KB-R7943与 Neurounina-1联合使用减低效果明显，差异显著。
实施例3
裸鼠腋下皮下成瘤：将胃癌细胞系SGC-7901进行体外扩增，分别注射到裸鼠左右侧腋 窝皮下，建立裸鼠肿瘤模型，成瘤后，左侧瘤内隔天注射DMEM培养基作为对照，右侧瘤内 隔天KB-R7943(1mg/kg,10mg/kg)注射刺激。SPF饲养室饲养4周后在小动物活体成像系统(KODAKFX美国)下无创观察肿瘤的生长情况。一月后断颈处死裸鼠，取出皮下肿瘤， 并按照体积计算公式(V)＝ab2/2计算肿瘤的体积，其中a为肿瘤的长径，b为肿瘤的短径。 比较各组间肿瘤体积的大小，结果如图3所示。结果显示，按1mg/kg和10mg/kg加入KB-R7943 均能抑制胃癌肿瘤的生长，且10mg/kg的抑制效果更好。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限 于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范 围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (3)

1.2-[4-[(4-硝基苯基)甲氧基]苯基]乙基氨基亚氨基硫酸酯联合Neurounina-1在制备治疗胃癌药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述2-[4-[(4-硝基苯基)甲氧基]苯基]乙基氨基亚氨基硫酸酯抑制NCX1激活引起的细胞内Ca2+浓度升高。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述2-[4-[(4-硝基苯基)甲氧基]苯基]乙基氨基亚氨基硫酸酯抑制胃癌细胞增殖。
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