CN110075269A

CN110075269A - Murabutide在制备电离辐射致骨髓、小肠和脾脏损伤防治药物中应用

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Publication number: CN110075269A
Application number: CN201910316873.6A
Authority: CN
Inventors: 刘蕾; 蔡建明; 高福; 杨彦勇; 曲红金; 崔建国; 廖泽彬; 曹堃; 陈媛媛; 刘哲
Original assignee: Second Military Medical University SMMU
Current assignee: Second Military Medical University SMMU
Priority date: 2019-04-19
Filing date: 2019-04-19
Publication date: 2019-08-02
Anticipated expiration: 2039-04-19
Also published as: CN110075269B

Abstract

本发明涉及药物新用途领域，具体是Murabutide在制备电离辐射致骨髓、小肠和脾脏损伤防治药物中应用。本发明提供的Murabutide作为制备电离辐射致骨髓、小肠、脾脏损伤防治药物具有毒副作用低、对辐射敏感器官损伤防治效果明显等优势。显示出Murabutide在防治电离辐射致多辐射敏感器官损伤中的独特优势，目的在于探索更高效低毒的电离辐射损伤防治的救治方法；目前国内外对电离辐射造成的多器官损伤仍缺乏有效的防治技术手段，也是放射医学和临床放疗领域亟需研究解决的重点难题之一。因此，Murabutide作为制备电离辐射致全身多器官损伤防治药物在我国医学领域具有广阔的开发和应用前景。

Description

Murabutide在制备电离辐射致骨髓、小肠和脾脏损伤防治药物中应用

技术领域

本发明涉及药物新用途领域，具体地说，是Murabutide在制备电离辐射致骨髓、小肠和脾脏损伤防治药物中的应用。

背景技术

随着科学技术的飞速发展，核能源已日益成为各国科研和军事力量的重要组成部分，尽管核能源管理已日渐完善，但核电站发生严重事故及大量放射性物质泄露的可能性依然存在。据不完全统计，我国从1954年至2015年发生放射性事故2007起，平均每年20余起，并且，放射治疗作为临床恶性肿瘤治疗的重要辅助手段，在杀伤恶性肿瘤组织的同时也会不可避免地对肿瘤周围的正常组织造成损伤，引发造血系统、消化系统、免疫系统等的后遗症。电离辐射导致机体损伤的主要原因是电离射线通过直接和间接作用导致DNA的断裂，随后水分子在射线作用下分解产生的羟自由基造成各器官的继发性损伤，而未修复的DNA进一步加剧了损伤。电离射线引发的机体急性损伤主要表现在骨髓、肠道、脾脏等，表现为：辐射后骨髓造血功能急剧降低，造血干细胞和造血祖细胞功能受损，全血细胞减少；小肠在照射后肠绒毛破碎、断裂，肠隐窝数量也会明显下降，炎性细胞增多浸润；脾脏内白髓和红髓间界限变得模糊，白髓面积减少，脾小体萎缩，各器官结构和功能损伤的同时，还伴有免疫平衡的紊乱，进一步加剧了电离辐射对机体的损伤。因此，无论是核泄露事故或是临床放射治疗的副作用所导致的急性放射病，其研究的紧迫性都是不言而喻的。目前国际上对急性放射病的防治主要局限于造血干细胞移植、药物治疗以及对症支持疗法，但效果都不佳，因此关于急性放射病的防治措施都还需要进一步的研究和探索。有研究发现Toll样受体(TLRs)在急性辐射防护中具有一定程度的保护作用，但TLRs具有分布范围有限、过量使用毒性大的缺点，限制了TLRs在临床上的实际应用，因此亟需进一步探索其他高效低毒的辐射防护措施。

模式识别受体(PRRs)作为减轻辐射毒性的重要效应方式一直广受关注，其主要包括Toll样受体(TLRs)、NOD样受体(NLRs)和C型凝集素受体(CLRs)等。TLRs已被研究发现可通过识别宿主细胞表面或者核内体的微生物配体，进而激活TLRs发挥辐射防护作用，与TLRs不同，NLRs能够识别位于宿主胞质内的细菌产物进而激活防御。NLRs包括NOD1和NOD2，NOD2激活后，核因子NF-κB信号通路和MAPK通路诱导激活，这两种信号通路已被证明作为通过调控细胞增殖和细胞凋亡的辐射防护途径，除此之外，激活NOD2具有刺激造血功能恢复，增强机体免疫力的功能。而NOD2与TLRs已被证实在宿主防御和微生物识别存在相互作用，因此激活NOD2很可能是一种有效的辐射防护策略。

胞壁酰二肽(Muramyl dipeptide，MDP)是公认的NOD2激动剂，然而，由于该分子具有较高的致热性和致关节炎性，后期开发出了一种安全的MDP衍生物Murabutide(简称MBD)。研究表明，MBD作为一种临床认可的免疫调节剂，可改善HIV患者免疫治疗研究中细胞因子和趋化因子的生物活性，且在与其他佐剂配制时，MBD也是一种很有前途的抗结核和炭疽感染的免疫佐剂，其安全性已经得到了临床验证。然而，MBD对电离辐射的保护作用尚未进行探索。目前对于电离辐射防治的研究多处于基础阶段，从研发到正式投入临床使用的周期长、成本大，所以对现有临床药物的再研发应用可以有效缩短临床转化周期，也是医药界开发新型辐射防护剂的有效手段之一。

MBD作为NOD2的激动剂，对急性全身辐射导致的骨髓、小肠和脾脏损伤防治作用显著，且具有明确的低毒优点。现有技术中未见有NOD2的激动剂MBD对急性全身辐射致骨髓、小肠和脾脏损伤防治作用的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供NOD2激动剂Murabutide(简称MBD)的新用途，即在制备电离辐射致急性骨髓、小肠和脾脏损伤防治药物中应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供Murabutide在制备电离辐射致骨髓、小肠和脾脏损伤防治药物中应用。所述的Murabutide的结构式如下式I所示：

进一步的，所述的Murabutide通过激活NOD2防治电离辐射致骨髓、小肠、脾脏损伤。

进一步的，所述的药物为减轻电离辐射后造血抑制作用，缓解电离辐射导致的造血细胞减少的进程的药物。

进一步的，所述的药物为抑制小肠绒毛和小肠隐窝的急性电离辐射损伤的药物。

进一步的，所述的药物为减轻电离辐射造成的脾脏白髓损伤的药物。

进一步的，所述的药物为减轻电离辐射引起的小肠和脾脏细胞凋亡的药物。

进一步的，所述的药物为增强电离辐射引起的NOD2升高的药物。

进一步的，所述的药物为增强电离辐射后细胞增殖和独立存活能力的药物。

进一步的，所述的药物为减轻电离辐射引起的双链DNA损伤的药物。

进一步的，所述的电离辐射为⁶⁰Coγ射线照射。

进一步的，所述的药物中Murabutide的给药剂量为15mg/kg，且在电离辐射前2小时给药。

本发明的第二方面，提供一种电离辐射防护药物，所述的电离辐射防护药物的活性成分为Murabutide。

进一步的，所述的电离辐射防护药物为注射剂。

进一步的，所述的电离辐射防护药物还包括药学上可接受的辅料。

本发明将从第二军医大学实验动物中心订购的C57BL/6雄性8周龄小鼠用于动物实验。在有12小时明暗周期，20～25℃且自由食用灭菌水和粮的环境中饲养小鼠。小鼠随分为3组：第1组，未照射+PBS对照组、第二组，照射+PBS组、第3组，照射+MBD组。小鼠在接受7Gy的⁶⁰Coγ射线全身照射前2小时，给予腹腔注射PBS或MBD，照射后30天内每天记录小鼠存活情况。结果发现，MBD预处理可以明显照射后提高小鼠生存率。同时，在照射后的0、1、3天分别取3组小鼠的骨髓、小肠和脾脏，固定、蜡块包埋、切片后进行HE染色。结果发现，未照射组骨髓内有核细胞数量正常，造血功能无异常。照后1天，照射组骨髓内有核细胞的数量减少，照后3天，骨髓有核细胞数量在不断下降，骨髓腔内空虚，提示骨髓造血功能明显抑制。通过对比照射组与照射前给予MBD组，可以发现，MBD组在照射后早期造血抑制明显减轻，且造血细胞减少的程度也明显缓解。同时，小肠的HE切片显示，未照射组的小肠绒毛结构完整，间隔紧密，绒毛长度正常，照射后则绒毛疏松紊乱甚至断裂，小肠隐窝数量也减少，但MBD预处理则能明显抑制照射后小肠绒毛和小肠隐窝的急性辐射损伤。在脾脏组织的HE切片中，照射后第1天白髓和红髓之间交界即变得模糊，白髓面积减少，并随时间发展加剧，而MBD预处理组的红白髓交界相对清晰且白髓面积减少不明显，可见MBD能够在一定程度上减轻辐射对脾脏的损伤。同时，本发明还检测了辐射后第1天小肠、脾脏组织内的凋亡情况，发现MBD预处理能明显减轻照射引起的小肠和脾脏组织的凋亡。

除此之外，本发明应用Western blot对人正常小肠上皮细胞HIEC的NOD2蛋白进行检测。结果发现MBD能够明显激活NOD2的表达，⁶⁰Coγ射线照射也能够激活NOD2的表达，且照射前加入MBD能够明显增强照射引起的NOD2的升高。并且，本发明还将不同浓度(均<5μg/mL)的MBD溶于PBS后，加入HIEC中，用CCK-8法检测培养24小时后细胞的生长情况以判断MBD的毒性浓度，结果显示，MBD在<5μg/mL的浓度范围内均无明显细胞毒性。并且，将不同浓度的MBD于照射前2小时加到HIEC细胞后，给予细胞8Gy的⁶⁰Coγ射线照射，24小时后采取CCK-8法检测发现，与照射组相比，MBD预处理能明显增强照射后细胞的增殖能力，尤其是0.5和1μg/mL的MBD预处理组较为明显。随后，本发明采用1μg/mL的MBD处理HIEC细胞后，再给予细胞不同剂量(0、2、4、6、8Gy)的⁶⁰Coγ射线照射，采用克隆形成率法检测细胞生长和增殖，结果显示，MBD预处理后，随着照射剂量的增加，可以明显增强辐射后HIEC细胞的增殖和独立存活能力。同时，本发明采用彗星电泳的方法检测了8Gy的⁶⁰Coγ射线照射后HIEC细胞双链DNA损伤的程度，结果发现，与照射组相比，MBD预处理组能明显减轻电离辐射引起的双链DNA损伤。

因此，本发明要求保护MBD在制备电离辐射致骨髓、小肠和脾脏损伤防治药物中的应用。在对动物和细胞无任何明显作用的药物浓度下，接受电离辐射前采用MBD预处理动物和人正常细胞，可以减轻电离辐射损伤，从而发挥电离辐射的防护作用。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

本发明提供的Murabutide作为制备电离辐射致骨髓、小肠、脾脏损伤防治药物具有毒副作用低、对辐射敏感器官(骨髓、小肠、脾脏)损伤防治效果明显等优势。上述性能显示出Murabutide作为制备电离辐射致骨髓、小肠和脾脏损伤防治药物在生物医药及临床治疗领域有十分广阔的研究前景，在防治电离辐射致多辐射敏感器官损伤中的独特优势，目的在于探索更高效低毒的电离辐射损伤防治的救治方法；目前国内外对电离辐射造成的多器官损伤仍缺乏有效的防治技术手段，也是放射医学和临床放疗领域亟需研究解决的重点难题之一。因此，Murabutide作为制备电离辐射致全身多器官损伤防治药物在我国医学领域具有广阔的开发和应用前景。

附图说明

图1为本发明7Gy ⁶⁰Coγ射线全身照射后照射对照组、照射组和照射前MBD给药组小鼠存活曲线对比图；

图2为本发明7Gy ⁶⁰Coγ射线全身照射后照射对照组、照射组和照射前MBD给药组小鼠骨髓HE切片对比图；

图3为本发明7Gy ⁶⁰Coγ射线全身照射后照射对照组、照射组和照射前MBD给药组小鼠小肠HE切片对比图；

图4为本发明7Gy ⁶⁰Coγ射线全身照射后照射对照组、照射组和照射前MBD给药组小鼠脾脏HE切片对比图；

图5为本发明7Gy ⁶⁰Coγ射线全身照射后照射对照组、照射组和照射前MBD给药组小肠、脾脏的凋亡改变；

图6为本发明不同浓度的MBD的毒性研究以及加入MBD后检测NOD2被激活的蛋白表达；

图7为本发明⁶⁰Coγ射线照射后MBD预处理对HIEC细胞生长和增殖的改变；

图8为本发明8Gy ⁶⁰Coγ射线照射后MBD预处理对HIEC细胞照后DNA损伤程度的改变。

具体实施方式

下面结合附图及实例对本发明做进一步描述：

材料：细胞株和细胞培养：将人正常肠上皮细胞HIEC(购于第四军医大学)在含有10％胎牛血清的RMPI 1640培养基于37℃、5％CO₂培养箱中培养。

药物与主要试剂：药物Murabutide(简称MBD)，购于美国INVIVOGEN公司；RMPI1640培养基、胎牛血清及胰酶购自Gibco公司；CCK-8试剂盒购于日本同仁化学研究所；结晶紫染液、标准蛋白质分子量、SDS-PAGE上样缓冲液、RIPA蛋白裂解液、30％Acry-Bis、Tris-HCl、过硫酸铵(AP)、SDS、四甲基乙二胺(TEMED)、碘化丙啶(PI)染液购自江苏碧云天生物技术研究所；组织固定液、TE电泳缓冲液、转膜液、TBST洗液购自武汉谷歌生物科技有限公司；TUNEL试剂盒购于罗氏诊断产品有限公司；NOD2(CARD15)抗体、GAPDH抗体购自Abcam公司。

小鼠：第二军医大学实验动物中心订购的C57BL/6雄性8周龄小鼠。

其中，照射条件：辐射中心(第二军医大学海军医学院，中国上海)的⁶⁰Cγ射线照射。所有辐射动物接受单次剂量7Gy，剂量率为1Gy/min，均为全身照射；辐射细胞接受单次剂量8Gy，剂量率为1Gy/min。

统计学处理：以下实施例的所有实验均重复3次以上，结果采用Mean±SD表示。采用GraphPad Prism6统计软件对相关数据进行t检验，以P<0.05为有显著性差异。

实施例1：

首先建立电离辐射致全身损伤小鼠模型，将30只8周龄雄性C57BL/6小鼠随机分为三组：对照组10只、照射组10只和照射前MBD给药组(7Gy+MBD)10只，用⁶⁰Coγ射线对小鼠进行单次全身照射，小鼠吸收剂量为7Gy。通过腹腔注射的方式将MBD(15mg/kg MBD+0.2mLPBS/只)或PBS(0.2mL/只)于照射前2小时给药。在照射后每天定时观察并记录小鼠(对照组、照射组和照射前MBD给药组)30天。如图1所示，从照射后7天开始，照射组小鼠开始出现死亡，并出现体型消瘦、食欲下降的表现，而照射前给予MBD处理组的死亡时间则明显延迟。综合以上，MBD预处理能明显延长电离辐射后小鼠的存活时间。

实施例2：

(1)建立电离辐射致全身损伤小鼠模型同实施例1；

(2)小鼠分组、给药方式及照射方式同实施例1，在照射后的不同时间点(0天，1天，3天)处死小鼠，取股骨组织、小肠组织和脾脏组织，进行固定、蜡块包埋，切片后进行HE染色。股骨组织的HE结果如图2所示，与照射对照组相比，照射组骨髓腔明显空虚，有核细胞数量减少，提示造血细胞减少；而照射前给予MBD处理的小鼠(照射+MBD组)骨髓腔相对饱满，在一定程度上缓解了电离辐射导致的造血细胞减少和造血功能抑制。小肠的HE结果如图3所示，照射后小鼠的小肠与照射对照组相比，肠绒毛紊乱甚至断裂、脱落，肠隐窝数量减少，而经统计发现，照射前用MBD干预的照射组的小肠绒毛长度和隐窝数量均高于单纯照射组。同时，本发明也检测了脾脏的HE染色，如图4所示，随照射后时间的延长，照射组的白髓和红髓交界模糊且逐渐加重，白髓的面积也明显缩小，提示免疫功能受损。由统计图可见，照射前加MBD处理可以减轻照射造成的白髓损伤，说明对脾脏有辐射防护作用。

实施例3：

(1)建立电离辐射致全身损伤小鼠模型同实施例1；

(2)取实施例2中各组小鼠照射后1天的小肠和脾脏蜡块，切片后进行TUNEL染色，以TUNEL阳性的细胞数量说明照射后凋亡情况。如图5所示，小肠和脾脏内未照射组凋亡细胞数量极少，为正常细胞代谢凋亡表现。照射组TUNEL阳性的细胞数量在照射后明显升高，而照射前MBD预处理则能明显减轻照射引起的细胞凋亡。

实施例4：

(1)细胞培养：RMPI 1640培养基中预先加入10％胎牛血清，并将HIEC细胞培养于培养基中。将细胞置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，细胞长至80％-90％即传代一次，取处于对数生长期的细胞用于后续实验。

(2)CCK-8法检测MBD毒性：将状态良好的HIEC细胞接种至96孔板(3×10⁵个/孔)，每个浓度设置8个平行对照孔。待细胞全部贴壁后，加入不同浓度的MBD，使其终浓度分别为0、0.025、0.25、2.5、5μg/mL，每孔培养基100μL。培养24小时以后，向每孔内加入10μL的CCK-8溶液，并继续在培养箱内培养1-3小时，采用酶标仪测定在450nm处的吸光度(OD值)。最后采用细胞存活率＝加药组OD值/对照组OD值×100％的公式计算不同浓度MBD组细胞的存活率。结果如图6所示，MBD最高浓度至5μg/mL时仍未对细胞生长和增殖产生抑制作用。

(3)Western blot电泳检测NOD2蛋白表达：将生长状态良好的HIEC细胞铺板待细胞完全贴壁，于8Gy ⁶⁰Coγ射线照射前2小时加入终浓度为1μg/mL和5μg/mL的MBD，并在照射后0.5小时提蛋白，进行Western blot电泳检测NOD2蛋白的表达情况。结果如图6所示，浓度为1μg/mL的MBD即能明显激活HIEC细胞内NOD2的表达，并且照射也会激活NOD2，使其表达升高，但照射前加入MBD与单纯照射组相比，则能够明显增强照射引起的NOD2的升高。

实施例5：

(1)细胞培养同实施例4；

(2)CCK-8法检测细胞增殖能力：本发明运用上述方法将HIEC细胞接种至贴壁，并在给予8Gy ⁶⁰Coγ射线照射前2小时，将不同浓度的MBD加入各平行组，培养24小时后用CCK-8方法检测不同浓度组细胞的增殖情况。如附图7可见，相比于照射组，照射前加入MBD的细胞增殖能力更强，并在1μg/mL的浓度范围内基本随MBD给药浓度增加而增强，说明MBD能够在安全无毒的浓度范围内减轻电离辐射对细胞的增殖能力的抑制，促进细胞增殖。

(3)细胞克隆形成法检测细胞存活能力：将生长状态良好的HIEC细胞接种至6孔板中，根据后续即将接受照射剂量的不同而接种不同的细胞数量：0、2、4、6、8Gy照射剂量的接种量分别为250、500、1000、2000、4000个。待细胞完全贴壁后，照射+MBD组加入1μg/mL的MBD处理2小时，照射组加入等量PBS作为阴性对照。细胞接受照射后，继续培养10天左右至形成细胞克隆集落(细胞数>50个)，弃去培养基，PBS洗一次，并用组织固定液固定30分钟，结晶紫染液染色30分钟，冲洗后自然风干。在显微镜下计数克隆集落，每组均设3个复孔取平均值，每个照射剂量均采用克隆形成率＝(照射加药组形成的细胞菌落数/照射加药组铺板细胞数)/(照射组形成的细胞菌落数/照射组铺板细胞数)，即可算出不同照射剂量的细胞克隆形成率。如图7所示，随着照射剂量的增加，MBD可以明显降低电离辐射所导致的HIEC细胞的细胞死亡率。

实施例6：

(1)细胞培养同实施例4；

(2)彗星电泳法检测DNA损伤：照射前，先将清洁的载玻片浸入熔融的1％高熔点胶中并擦干背面，制备彗星电泳底片。将生长状态良好的HIEC细胞接种于6孔板中，使细胞密度为3×10⁵个/孔。待细胞完全贴壁后，于照射前2小时向照射+MBD组加入终浓度为1μg/mL的MBD，照射组加入等量PBS。给予细胞8Gy ⁶⁰Coγ射线照射后4小时，分别收集各组细胞，并用不含Ca²⁺、Mg²⁺的PBS液洗一遍，并用不含Ca²⁺、Mg²⁺的PBS吹打至单细胞悬浮液，使细胞密度为2×10⁴/mL，取0.4mL的单细胞悬液浸入1.2mL的0.65％低熔点胶中混匀，并快速取0.5mL混合液平铺到载玻片底片的表面上。晾干后将玻片浸于4℃预冷的中性细胞裂解液中，避光裂解过夜后，取出玻片置入水平电泳槽，25V电泳25分钟。双蒸水清洗后用10μg/mL的PI染色20分钟，双蒸水清洗后用荧光显微镜观察，并使用CASP 1.2.3b2软件进行分析。结果如图8所示，照射组的尾部与总彗星荧光比、尾矩均明显升高，提示照射引起DNA损伤，而照射前用MBD预处理则能明显减轻照射引起的DNA损伤且有统计学差异。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims

1.Murabutide在制备电离辐射致骨髓、小肠和脾脏损伤防治药物中应用。

2.根据权利要求1所述的Murabutide在制备电离辐射致骨髓、小肠和脾脏损伤防治药物中应用，其特征在于，所述的药物为减轻电离辐射后造血抑制作用，缓解电离辐射导致的造血细胞减少的进程的药物。

3.根据权利要求1所述的Murabutide在制备电离辐射致骨髓、小肠和脾脏损伤防治药物中应用，其特征在于，所述的药物为抑制小肠绒毛和小肠隐窝的急性电离辐射损伤的药物。

4.根据权利要求1所述的Murabutide在制备电离辐射致骨髓、小肠和脾脏损伤防治药物中应用，其特征在于，所述的药物为减轻电离辐射造成的脾脏白髓损伤的药物。

5.根据权利要求1所述的Murabutide在制备电离辐射致骨髓、小肠和脾脏损伤防治药物中应用，其特征在于，所述的药物为减轻电离辐射引起的小肠和脾脏细胞凋亡的药物。

6.根据权利要求1所述的Murabutide在制备电离辐射致骨髓、小肠和脾脏损伤防治药物中应用，其特征在于，所述的药物为增强电离辐射引起的NOD2升高的药物。

7.根据权利要求1所述的Murabutide在制备电离辐射致骨髓、小肠和脾脏损伤防治药物中应用，其特征在于，所述的药物为增强电离辐射后细胞增殖和独立存活能力的药物。

8.根据权利要求1所述的Murabutide在制备电离辐射致骨髓、小肠和脾脏损伤防治药物中应用，其特征在于，所述的药物为减轻电离辐射引起的双链DNA损伤的药物。

9.根据权利要求1所述的Murabutide在制备电离辐射致骨髓、小肠和脾脏损伤防治药物中应用，其特征在于，所述的电离辐射为⁶⁰Coγ射线照射；所述的药物中Murabutide的给药剂量为15mg/kg，且在电离辐射前2小时给药。

10.一种电离辐射防护药物，其特征在于，所述的电离辐射防护药物的活性成分为Murabutide。