CN113209284B - 尿胰蛋白酶抑制剂在制备治疗噬血细胞综合症药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了尿胰蛋白酶抑制剂在制备治疗噬血细胞综合症药物中的用途，所述噬血细胞综合症包括原发性噬血细胞综症和继发性噬血细胞综合症，表现出较好的治疗效果，可显著缓解模型鼠HLH的症状且差异显著，可以显著的降低模型鼠HLH的细胞因子水平，且差异显著，有效延长小鼠的生存期。

Description

尿胰蛋白酶抑制剂在制备治疗噬血细胞综合症药物中的用途

技术领域：

本发明涉及医药领域，具体涉及尿胰蛋白酶抑制剂在制备治疗噬血细胞综合症药物中的用途。

背景技术：

噬血细胞综合症(HLH)，是一组由于“细胞因子风暴”引起的淋巴细胞、巨噬细胞增生和活化，伴随吞噬血细胞现象的一类综合症。依据病因又分为原发性HLH(primary HLH,pHLH)和继发性HLH(secondary HLH,sHLH)两种类型。pHLH为常染色体或X连锁隐性遗传，伴有相关基因异常；sHLH可继发于各种病毒(如EBV)、细菌、寄生虫所引起的感染、风湿免疫性疾病、代谢性疾病及肿瘤等。

临床表现为巨噬细胞和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)侵袭组织，炎症细胞因子过度释放。尤其是白细胞介素1/6/18(interleukin 1/6/18，IL 1/6/18)、IFNγ、TNFα等引起“细胞因子风暴”是关键诱因。与HLH相关的主要症状包括长期高热、肝脾肿大和细胞减少。其他临床表现包括肝炎、神经系统症状(如癫癇发作、脑膜炎、意识水平下降)、皮疹、肺功能障碍和淋巴结病。实验室检查包括细胞减少(影响外周血中至少两个细胞系)、高铁蛋白血症、由于消耗和肝损伤引起的低纤维蛋白原血症、继发于脂蛋白脂酶的细胞因子抑制的高甘油三酯血症、转氨酶和乳酸脱氢酶升高、高胆红素血症、凝血功能异常、低钠血症和低蛋白血症。另外，由于CTL和巨噬细胞活化过度可出现可溶性CD25和CD163升高，血清铁蛋白水平趋向高于急性期反应物的预期水平，并保持在500～10 000ng/ml。与成人相比，儿童趋向于出现更高的浓度(水平＞10 000ng/ml具有95％的特异性)。

目前，通常，按照HLH-1994和2004年的方案，标准治疗包括皮质类固醇和依托泊苷。患者之后通常会接受同种异体干细胞移植，这是噬血细胞综合症唯一可能治愈的选择。对于在初次缓解后疾病复发或常规治疗难治的患者，无公认的疗法。

尿胰蛋白酶抑制剂，又名人尿胰蛋白酶抑制剂(Human Urinary TrypsinInhibitor或Bikunin),是从人体尿液中分离纯化的由143个氨基酸组成的酸性糖蛋白，它由两个通过短肽连接的Kunitz型蛋白酶抑制剂结构域以及N和C端延长链组成。在该多肽上连接了一条低硫化的硫酸软骨素链，N端连接了一个寡聚糖。它不仅是一种广谱蛋白酶抑制剂，还具有抗炎、抗肿瘤及免疫调节的作用。目前，尿胰蛋白酶抑制剂的临床应用主要是用于治疗急性胰腺炎、抗休克、心肺复苏、抗肿瘤和抗手术侵袭等方面的疾病。

随着现代研究的不断深入，尿胰蛋白酶抑制剂越来越多的用途被发现。中国专利CN101972471B公开了尿胰蛋白酶抑制剂用于制备治疗自身免疫性脑脊髓炎药物的用途及其药物组合物；中国专利CN101954071B公开了尿胰蛋白酶抑制剂作为制备治疗系统性红斑狼疫药物的用途及其药物组合物。中国专利CN105770876B公开了尿胰蛋白酶抑制剂作为治疗慢性前列腺炎药物的用途。但是，到目前为止，尚未有研究发现尿胰蛋白酶抑制剂用于制备治疗噬血细胞综合症的用途。

发明内容：

本发明的目的是提供尿胰蛋白酶抑制剂在制备治疗噬血细胞综合症药物中的用途，为噬血细胞综合症患者提供一种新的药物。

本发明是通过以下技术方案予以实现的：

尿胰蛋白酶抑制剂在制备治疗噬血细胞综合症药物中的用途。

所述噬血细胞综合症包括原发性噬血细胞综症和继发性噬血细胞综合症。

所述药物含有治疗有效量的尿胰蛋白酶抑制剂和药学上可以接受的载体，制备成需要的剂型。

所述剂型为冻干粉针剂，载体为葡萄糖、氯化钠、甘露醇、L-精氨酸盐酸盐、乳糖、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和水解明胶中的一种或其任意混合物。

所述剂型为注射液，载体为注射用水、葡萄糖、氯化钠、醋酸钠、冰醋酸和甘露醇中的一种或其任意混合物。

本发明的有益效果如下：

本发明尿胰蛋白酶抑制剂在制备治疗噬血细胞综合症药物中的用途表现出较好的治疗效果，可显著缓解模型鼠HLH的症状且差异显著，可以显著的降低模型鼠HLH的细胞因子水平，且差异显著，有效延长小鼠的生存期。

附图说明：

图1为受试物对CpG诱导的HLH模型小鼠肝脏的影响；其中，A.正常组，B.模型组，C.阳性组，D.受试组，E.联合用药组。

图2是受试物对CpG诱导的HLH模型小鼠脾脏的影响；其中，A.正常组，B.模型组，C.阳性组，D.受试组，E.联合用药组。

图3是受试物对CpG诱导的HLH模型小鼠血涂片的影响(400×)；其中，A.正常组，B.模型组，C.阳性组，D.受试组，E.联合用药组。

图4是受试物对HLH小鼠模型肝脏病理的影响(200×)；其中，A.正常组，B.模型组，C.阳性组，D.受试组，E.联合用药组。

图5是受试物对HLH小鼠模型脾脏病理的影响(40×)；其中，A.正常组，B.模型组，C.阳性组，D.受试组，E.联合用药组。

具体实施方式：

以下是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：制备尿胰蛋白酶抑制剂冻干粉针剂

取过滤灭菌后的尿胰蛋白酶抑制剂水溶液10000万单位，加20克甘露醇溶解，加磷酸二氢钠和磷酸氢二钠调节pH到中性，加注射用水至2000毫升，加氯化钠调节等渗，无菌过滤，分装于1000个西林瓶中，在无菌条件下冷冻干燥，即得。

实施例2：制备尿胰蛋白酶抑制剂冻干粉针剂

取过滤灭菌后的尿胰蛋白酶抑制剂水溶液10000万单位，加40克L-精氨酸盐酸盐溶解，加注射用水至2000毫升，加氯化钠调节等渗，无菌过滤，分装于1000个西林瓶中，在无菌条件下冷冻干燥，即得。

实施例3：制备尿胰蛋白酶抑制剂注射液

取过滤灭菌后的尿胰蛋白酶抑制剂水溶液10000万单位，加20克甘露醇溶解，调节pH到中性，加注射用水至2000毫升，加氯化钠调节等渗，无菌过滤，分装1000个西林瓶中，即得。

实施例4、制备尿胰蛋白酶抑制剂注射液

取过滤灭菌后的尿胰蛋白酶抑制剂水溶液10000万单位，加氯化钠15.670克、醋酸钠3.882克、冰醋酸0.686g,加注射用水至2000毫升，无菌过滤，分装1000个西林瓶中，即得。

试验例一、尿胰蛋白酶抑制剂对原发性噬血细胞综合症(pHLH)的影响试验

1、试验对象：选取72只Prf1^-/-小鼠，体重为18-20g。

2、试验材料:实施例3制备的尿胰蛋白酶抑制剂注射液；溶剂对照，等容积的含有选自甘露醇、氯化钠或葡萄糖的添加剂组成的缓冲液，其成分与尿胰蛋白酶抑制剂注射液内添加剂相同。

3、原发性噬血细胞综合症(pHLH)动物模型的建立：

将Prf1^-/-小鼠平均分为6组，每组12只。全部Prf1^-/-小鼠接受2×10⁵PFUs淋巴细胞性脉络膜脑膜炎病毒(LCMV)腹腔注射，构建原发性噬血细胞综合症(pHLH)动物模型。

4、试验方法：

于造模后第4天开始给药，各组给药途径均采用尾静脉注射方法，各组的给药量如下：

空白对照组：注射等体积的生理盐水；

溶剂对照组：注射等体积的溶剂对照；

尿胰蛋白酶抑制剂低剂量组(Ⅰ组)：注射50000单位/kg的实施例3制备的尿胰蛋白酶抑制剂注射液；

尿胰蛋白酶抑制剂中低剂量组(Ⅱ组)：注射100000单位/kg的实施例3制备的尿胰蛋白酶抑制剂注射液；

尿胰蛋白酶抑制剂中高剂量组(Ⅲ组)：注射200000单位/kg的实施例3制备的尿胰蛋白酶抑制剂注射液；

尿胰蛋白酶抑制剂中高剂量组(Ⅳ组)：注射300000单位/kg的实施例3制备的尿胰蛋白酶抑制剂注射液；

每日注射1次，连续5天为1个疗程；

2个疗程(10天)后小鼠取血测定血清铁蛋白和甘油三酯的水平。根据公认的噬血细胞综合症(HLH)诊断指标(HLH-2004指南)，铁蛋白水平升高和甘油三酯水平升高是评价HLH临床症状情况的主要指标；

2个疗程(10天)后小鼠取血测定主要细胞因子干扰素-γ(IFN-γ)、白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNFα)水平。目前普遍认为HLH是由“细胞因子风暴”引起的严重急性疾病，因此考察主要细胞因子水平是另一项评价HLH临床诱因与症状情况的主要指标；

2个疗程(10天)后停止给药，监测各组小鼠的生存期，跟踪生存期至第30日，记录各组第10日，第15日，第20日，第25日，第30日的小鼠存活情况。

结果：

1.血清铁蛋白和甘油三酯水平

原发性噬血细胞综合症(pHLH)动物模型，经尿胰蛋白酶抑制剂治疗后血清蛋白和甘油三酯水平明显改善，尿胰蛋白酶抑制剂Ⅰ组相比较空白对照组和溶剂对照组具有统计学意义(P＜0.05)，其他三个剂量组相比较空白对照组和溶剂对照组有统计学意义且差异显著(P＜0.01)。

表1血清铁蛋白和甘油三酯水平

动物分组	血清铁蛋白(ng/ml)	甘油三酯(mmol/l)
			空白对照组	11835.22±1562.12	3.63±0.22
溶剂对照组	10983.12±1087.23	3.44±0.23
			尿胰蛋白酶抑制剂Ⅰ组	8010.53±755.15	2.93±0.19
尿胰蛋白酶抑制剂Ⅱ组	3890.41±657.14	1.42±0.18
			尿胰蛋白酶抑制剂Ⅲ组	2165.69±712.32	0.94±0.24
尿胰蛋白酶抑制剂Ⅳ组	1874.76±667.52	0.51±0.19

2.主要细胞因子水平

原发性噬血细胞综合症(pHLH)动物模型，经尿胰蛋白酶抑制剂治疗后IFN-γ、IL-6、TNFα水平明显降低，尿胰蛋白酶抑制剂四个剂量组相比较空白对照组和溶剂对照组有统计学意义且差异显著(P＜0.01)。

表2主要细胞因子水平(IFN-γ、IL-6、TNFα)

3.各组小鼠生存期统计

结果参见表3，表明尿胰蛋白酶抑制剂各组，特别是除低剂量组以外各组对生存期均有明显改善。

表3各组小鼠生存期统计

试验例二、尿胰蛋白酶抑制剂对继发性噬血细胞综合症(sHLH)的影响试验

1、试验对象：选取72只野生型C57BL/6小鼠，体重为18-20g。

2、试验材料:实施例3制备的尿胰蛋白酶抑制剂注射液；溶剂对照，等容积的含有选自甘露醇、氯化钠或葡萄糖的添加剂组成的缓冲液，其成分与尿胰蛋白酶抑制剂注射液内添加剂相同。

3、继发性噬血细胞综合症(sHLH)动物模型的建立：

以成年野生型C57BL/6小鼠为对象,0、2、4和7日腹腔注射50μg CpG寡脱氧核苷酸(CpG-ODN)和0.2mg白介素10受体α抗体(αIL 10R)诱导产生sHLH模型,构建继发性噬血细胞综合症(sHLH)动物模型

4、试验方法：

于造模后第4天开始给药，各组给药途径均采用尾静脉注射方法，各组的给药量如下：

空白对照组：注射等体积的生理盐水；

溶剂对照组：注射等体积的溶剂对照；

尿胰蛋白酶抑制剂低剂量组(Ⅰ组)：注射50000单位/kg的实施例3制备的尿胰蛋白酶抑制剂注射液；

尿胰蛋白酶抑制剂中低剂量组(Ⅱ组)：注射100000单位/kg的实施例3制备的尿胰蛋白酶抑制剂注射液；

尿胰蛋白酶抑制剂中高剂量组(Ⅲ组)：注射200000单位/kg的实施例3制备的尿胰蛋白酶抑制剂注射液；

尿胰蛋白酶抑制剂中高剂量组(Ⅳ组)：注射300000单位/kg的实施例3制备的尿胰蛋白酶抑制剂注射液；

每日注射1次，连续5天为1个疗程；

2个疗程(10天)后小鼠取血测定血清铁蛋白和甘油三酯的水平。根据公认的噬血细胞综合症(HLH)诊断指标(HLH-2004指南)，铁蛋白水平升高和甘油三酯水平升高是评价HLH临床症状情况的主要指标；

2个疗程(10天)后小鼠取血测定主要细胞因子干扰素-γ(IFN-γ)、白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNFα)水平。目前普遍认为HLH是由“细胞因子风暴”引起的严重急性疾病，因此考察主要细胞因子水平是另一项评价HLH临床诱因与症状情况的主要指标；

2个疗程(10天)后停止给药，监测各组小鼠的生存期，跟踪生存期至第30日，记录各组第10日，第15日，第20日，第25日，第30日的小鼠存活情况。

结果：

1.血清铁蛋白和甘油三酯水平

继发性噬血细胞综合症(sHLH)动物模型，经尿胰蛋白酶抑制剂治疗后血清蛋白和甘油三酯水平明显改善，尿胰蛋白酶抑制剂Ⅰ组相比较空白对照组和溶剂对照组具有统计学意义(P＜0.05)，其他三个剂量组相比较空白对照组和溶剂对照组有统计学意义且差异显著(P＜0.01)。

表4血清铁蛋白和甘油三酯水平

2.主要细胞因子水平

继发性噬血细胞综合症(sHLH)动物模型，经尿胰蛋白酶抑制剂治疗后IFN-γ、IL-6、TNFα水平明显降低，尿胰蛋白酶抑制剂四个剂量组相比较空白对照组和溶剂对照组有统计学意义且差异显著(P＜0.01)。

表5主要细胞因子水平(IFN-γ、IL-6、TNFα)

3.各组小鼠生存期统计

结果表明，尿胰蛋白酶抑制剂各组，特别是除低剂量组以外各组对生存期均有明显改善。

表6各组小鼠生存期统计

试验例三、尿胰蛋白酶抑制剂对CpG DNA造模继发性噬血细胞综合症(sHLH)的影响试验

1、试验对象：SPF级C57BL/6J小鼠

2、试验材料:

CpG-ODN造模剂的配制：1mg ODN 1826VacciGrade^TM(ODN 1826VacciGrade^TM规格：1mg/瓶)加入500μL 0.9％氯化钠注射液溶解配制成2mg/mL储备液。储备液在-20℃可以保存6个月。吸取660μL储备液加入4620μL 0.9％氯化钠注射液，配制成浓度为250μg/mL的CpG-ODN工作液，每只注射0.2mL。

受试物尿胰蛋白酶抑制剂配制：取2瓶尿胰蛋白酶抑制剂冻干粉(10万U/瓶)每瓶加入1016μL 0.9％氯化钠注射液进行溶解并将两瓶混合均匀，配制成98.4万U/10mL的注射液。

阳性药物地塞米松注射液配制：取5mg/mL地塞米松磷酸钠注射液83μL+5％葡糖糖注射液2417μL混合溶解，配制成1.66mg/10mL的注射液。

联合用药中阳性药物地塞米松配制：取5mg/mL地塞米松磷酸钠注射液33.2μL+5％葡萄糖注射液1967μL混合溶解，配制成0.83mg/10mL的注射液。

3、实验方法

3.1造模：30只SPF级雄性C57BL/6J小鼠，经适应性喂养及检疫后，按体重随机保留6只作为A.正常组，其余小鼠均为造模组，造模动物于第0天和第2天腹腔注射CpG-ODN 50μg/只(0.2mL)，正常组动物腹腔注射0.2mL 0.9％氯化钠注射液。于day 4进行眼眶取血检测血常规，按HGB水平将造模组随机分为B模型组、C阳性组(地塞米松)、D受试组(尿胰蛋白酶抑制剂)和E联合用药组(尿胰蛋白酶抑制剂+地塞米松)每组6只。B模型组、C阳性组(地塞米松)、D受试组(尿胰蛋白酶抑制剂)和E联合用药组(尿胰蛋白酶抑制剂+地塞米松)，第4、7、9天上午腹腔注射CpG-ODN 50μg/只(0.2mL)，正常组腹腔注射0.2mL 0.9％氯化钠注射液。

3.2给药：第4天开始，除A正常组和B模型组注射等体积0.9％氯化钠注射液外，C阳性组腹腔注射地塞米松磷酸钠注射液(1.66mg/kg)，每天1次(下午)；D受试组腹腔注射尿胰蛋白酶抑制剂(98.4万U/kg)，每天2次(中午、下午)；E联合用药组腹腔注射尿胰蛋白酶抑制剂98.4万U/kg(每天2次同D组)+地塞米松磷酸钠注射液0.83mg/kg，每天1次。第10天于17:00禁食，第11天于给药1h后进行血常规、摘眼球取血和脏器取材。

结果如下：

1、受试物对CpG诱导的HLH模型小鼠肝、脾影响取材剖检时肉眼观察如图1、2所示，与正常组相比，受试组和联合用药组肝脏、脾脏明显缩小。

2、受试物对CpG诱导的HLH模型小鼠外周血涂片的影响外周血涂片结果如图3.正常组红细胞大小均匀，形态为圆形。模型组红细胞有棒状和椭圆状红细胞出现，中心生理性淡染区扩大，细胞大小不均匀。与模型组相比受试组和联合用药组红细胞直径略有缩小，棒状和椭圆状红细胞情况有所减少，中心生理性淡染区扩大情况有所缓解。

3、受试物对CpG诱导的HLH模型小鼠肝、脾病理学改变的影响肝脏病理HE染色结果如图4、正常组小鼠肝小叶中央静脉和门管区肝细胞细胞排列整齐，结构紧密，肝细胞核大而圆，核膜清晰，常染色质丰富，细胞质丰富，有少量核固缩现象，炎性细胞浸润情况较少。模型组小鼠肝小叶中央静脉和门管区肝细胞核出现大量核固缩、核溶解的现象，多处出现坏死，血管周围有大量炎性细胞聚集，与文献报道一致。与模型组相比，受试组和联合用药组肝排列较紧密整齐细胞核较完整，炎性细胞浸润情况较少，有少量点状坏死现象，出现明显病理改善。脾脏病理HE染色结果显示如图5，正常组脾脏生发中心明显，结构排列整齐。模型组红髓部分明显扩张，脾脏结构排列紊乱，淋巴小结结构破坏。受试组、及联合用药组的脾脏红髓扩张现象减弱，脾脏结构有明显的改善。

Claims (5)

1.尿胰蛋白酶抑制剂在制备治疗噬血细胞综合症药物中的用途。

2.根据权利要求1所述尿胰蛋白酶抑制剂在制备治疗噬血细胞综合症药物中的用途，其特征在于，所述噬血细胞综合症包括原发性噬血细胞综症和继发性噬血细胞综合症。

3.根据权利要求1所述尿胰蛋白酶抑制剂在制备治疗噬血细胞综合症药物中的用途，其特征在于，所述药物含有治疗有效量的尿胰蛋白酶抑制剂和药学上可以接受的载体，制备成需要的剂型。

4.根据权利要求3所述尿胰蛋白酶抑制剂在制备治疗噬血细胞综合症药物中的用途，其特征在于，所述剂型为冻干粉针剂，载体为葡萄糖、氯化钠、甘露醇、L-精氨酸盐酸盐、乳糖、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和水解明胶中的一种或其任意混合物。

5.根据权利要求3所述尿胰蛋白酶抑制剂在制备治疗噬血细胞综合症药物中的用途，其特征在于，所述剂型为注射液，载体为注射用水、葡萄糖、氯化钠、醋酸钠、冰醋酸和甘露醇中的一种或其任意混合物。