JP2009507848A - 神経保護薬 - Google Patents

Abstract

細胞傷害性の損傷から細胞を保護する方法が提供される。方法は、CpGオリゴヌクレオチドを含む組成物を対象に投与する段階を伴う。方法は、神経系細胞および非神経系細胞の保護に適用可能である。例えば、興奮毒性脳損傷から神経系細胞を保護する方法が提供される。興奮毒性損傷、虚血および／または低酸素症の予防的治療用の薬剤を調製する方法もまた提供される。開示される方法において使用するための組成物もまた提供される。

Description

分野
本開示は、神経学の分野に関する。特に、本開示は、興奮毒性損傷、虚血および／または低酸素症に起因する細胞および臓器損傷の、細胞のトール様受容体に結合し、それを活性化する物質の投与による保護に関する。

関連出願の相互参照
本願は、2005年9月9日に出願され、その開示全体を本明細書に引用したものとする、米国仮特許出願第60／715,881号の利益を主張するものである。

政府の支援に対する謝辞
本発明の局面は、国立神経疾患・脳卒中研究所（NINDS）からの助成金番号POI NS35965による米国政府支援を受けて作成された。米国政府は本発明において一定の権利を有するものである。

背景
虚血状態やその他の低酸素状態による有害な影響を減少させるためのプレコンディショニング療法への需要は非常に大きい。例えば、脳の閉塞性血管障害を持つ患者の25〜50％において、一過性虚血性発作（TIA's）は梗塞に先行して起こり、冠動脈バイパス手術（CABG）を受ける患者の50％が手術中の塞栓による永久的な認識の低下に苦しんでいる。CABG患者（年間336,000人）に対して周術期治療を行なうだけで、脳梗塞の発生と死亡率を有意に減少することが可能であり。さらに、脳梗塞の経験がある人々は、脳梗塞の再発の危険性が高い（5年以内で25〜40％）。

脳梗塞の発生機序と治療を調査する何十年にもわたる研究によって、研究室における強力な神経保護療法が明らかになったが、患者に対する治療への移行には全て失敗している（Plum,J.Am.Med.Assoc,285：1760−1761,2001（非特許文献1）；DeGraba and Pettigrew,Neurol.Clin.18：475−493,2000（非特許文献2））。ヒトにおいて神経保護を誘導するための薬理学的なアプローチの失敗は、選択された化合物の試験のデザイン、用量反応性、または時間窓の問題、または試験物質の副作用に起因する可能性がある。しかし、過去25年間における全ての細胞保護試験は成果の上がらないものであった。

一つ以上の短い虚血性傷害が続いて起こる傷害性の虚血に対する耐性を増大させる、脳における虚血耐性は、神経保護の内在性プログラムが関与する強力な適応的防御である（Nandagopal et al.,J.Pharm.Exp.Ther.297：474−478,2001（非特許文献3）；Chen et al.,J.Cereb.Blood Flow Metab.16：566−577,1996（非特許文献4）；Dirnagl et al.,Trends Neruosci.26：248−254,2003（非特許文献5）においてレビューされている）。この神経保護プログラムによって、シグナル伝達現象の複雑なカスケードが始まり、続いて起こる傷害に対する細胞性応答を最終的に再プログラミングする、新たなタンパク質の合成がもたらされる。プレコンディショニングを引き起こす多彩な刺激が神経保護をもたらすものと共通の経路を共有している可能性があるという証拠が浮上しているものの（Gonzalez−Zulueta et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：436−441,2000（非特許文献6）；Kasischke et al.,Neurosci.Lett.214：175〜178,1996（非特許文献7）； Gidday et al.,J.Cereb.Blood Flow Metab.19：331−340,1999（非特許文献8）；Kato et al.,Neurosci.Lett.139：118−121,1992（非特許文献9））、虚血性耐性を導く一連のイベントは、部分的にしか知られていない（Nandagopal et al.,J.Pharm.Exp.Ther.297：474−478,2001（非特許文献3））。

虚血性脳損傷に対する耐性は、非傷害性の虚血、大脳皮質の拡延性抑圧、短いてんかん発作の発現、麻酔吸入剤への曝露、低用量のエンドトキシン（リポ多糖体、LPS）をはじめとする、いくつかの明確なプレコンディショニング刺激によって誘導することができる（Simon et al.,Neurosci.Lett.163：135−137,1993（非特許文献10）；Chen and Simon,Neurology,48：306−311,1997（非特許文献11）；Kitagawa et al.,Brain Res.528：21−24,1990（非特許文献12）；Kobayashi et al.,J.Cereb.Blood Flow Metab.15：721−727,1995（非特許文献13）；Kapinya et al.,Stroke 333：1889−1898,2002（非特許文献14）；Towfighi et al.,Dev.Brain.Res.113：83−95,1999（非特許文献15））。これらのプロセス基礎をなすメカニズムと一般的なプレコンディショニングはあまり解明されていないが、他の傷害性の低用量の刺激が、続いて起こる傷害性の負荷に対する保護を誘導するという共通の関連性を共有している可能性がある（Dirnagl et al., Trends Neruosci.26：248−254, 2003（非特許文献16））。

LPSは低用量で投与されると、続いて起こる脳梗塞に対する著しい神経保護効果をもたらす。LPS誘導性の神経保護効果のある種の特徴が、それを脳梗塞治療に対する極めて有望な目標にしており、それは、1）LPSの全身性投与が強力な神経保護効果を誘導し、故に血液脳関門の問題は問題とならないこと、2）神経保護が迅速に（投与から一日以内、またそれより早く）発現すること、および、3）神経保護効果がLPS治療後少なくとも一週間持続することである。しかし、ヒトおよび動物の対象はLPSにほとんど耐えられない。従って、脳梗塞およびその他の低酸素性および／または興奮毒性損傷に対するプレコンディショニングのために、LPSに代わるものが必要である。

Plum,J.Am.Med.Assoc,285：1760−1761,2001 DeGraba and Pettigrew,Neurol.Clin.18：475−493,2000 Nandagopal et al.,J.Pharm.Exp.Ther.297：474−478,2001 Chen et al.,J.Cereb.Blood Flow Metab.16：566−577,1996 Dirnagl et al.,Trends Neruosci.26：248−254,2003 Gonzalez−Zulueta et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：436−441,2000 Kasischke et al.,Neurosci.Lett.214：175〜178,1996 Gidday et al.,J.Cereb.Blood Flow Metab.19：331−340,1999 Kato et al.,Neurosci.Lett.139：118−121,1992 Simon et al.,Neurosci.Lett.163：135−137,1993 Chen and Simon,Neurology,48：306−311,1997 Kitagawa et al.,Brain Res.528：21−24,1990 Kobayashi et al.,J.Cereb.Blood Flow Metab.15：721−727,1995 Kapinya et al.,Stroke 333：1889−1898,2002 Towfighi et al.,Dev.Brain.Res.113：83−95,1999 Dirnagl et al., Trends Neruosci.26：248−254, 2003

開示の概要
本開示は、細胞傷害性の損傷から細胞を保護するための方法および組成物に関する。本明細書で開示される方法が神経細胞だけでなく非神経系細胞にも適用可能で、てんかん、外傷性脳損傷、子宮内低酸素症、虚血性イベント（脳梗塞を含む）、アルツハイマー病に加えて、外科手術に起因する外傷および外科手術に起因しない外傷を含む、多様な医学的状態によって引き起こされる有害な転帰の予防にも適用される。方法は、対象に対してプレコンディショニング効果を発現する組成物（薬剤）の全身性投与を伴う。典型的には、組成物は興奮毒性および／または低酸素性イベントの前、または一連のイベントの一つ以上のイベントの前に、または継続中のまたは進行中の過程の発現中に投与される。故に、本開示は、細胞傷害性の損傷、例えば興奮毒性、虚血性および／または低酸素性イベントに起因する細胞損傷および細胞死の予防的治療のための方法に関する。

前述の、およびその他の目的、特徴、および利点が、添付の図を参照しながら進行する以下の詳細な説明によって明らかになるであろう。

詳細な説明
本開示は、生きている多細胞生物において、細胞傷害性の損傷、例えば興奮毒性、虚血性および／または低酸素性イベントの有害な影響から細胞を体内で保護するための方法に関する。より具体的には、本明細書で開示される方法は、続いて起こる興奮毒性、虚血性および／または低酸素性イベントに対する耐性を増加させるために、細胞をプレコンディショニングする段階を含む。本開示は、非メチル化CpGモチーフ配列を含むオリゴヌクレオチドが、興奮毒性損傷、虚血、および低酸素症から細胞を保護するためのプレコンディショニング計画で用いられる場合に、細胞保護性であるという観察に基づいて新規の方法を提供する。CpGオリゴヌクレオチドおよび／またはその他のプレコンディショニング物質の投与（たとえば、興奮毒性、虚血性、または低酸素性イベントの前に）は、ゲノム応答プログラムを変更することによって細胞変化や代謝性変化を誘発し、これにより、プレコンディショニングがなければ過度の電気化学的活性、および／または酸素の欠乏に起因する、続いて起こる傷害に対する抵抗性がもたらされる。

故に、本開示の一つの局面は、細胞（または細胞集団、または組織、臓器、または微生物）を、興奮毒性損傷、虚血、低酸素症、またはそれらの組み合わせをはじめとする、細胞傷害性の損傷から保護する方法に関する。本明細書で開示される方法は、興奮毒性、虚血性および／または低酸素性損傷の影響を受けやすく、プレコンディショニングに適する、様々な細胞の種類に適用できる。例えば、（例えば海馬ニューロンや皮質ニューロンを含む）神経系細胞、（心筋細胞、平滑筋細胞、横紋筋細胞を含む）筋細胞、肝細胞、腎細胞、内皮細胞を、本明細書で開示される方法を用いて、興奮毒性損傷、虚血および／または低酸素症から保護することができる。加えて、マクロファージやミクログリアを含む免疫系の特定の細胞は、プレコンディショニングに適している。

例えば興奮毒性、虚血性および／または低酸素性イベントに起因する細胞傷害性の損傷から細胞を保護するために、開示される方法を使用することができる。すなわち、本方法は、興奮毒性、虚血性、または低酸素性要素、またはそれらの組み合わせを含む、幅広いイベントや発現から細胞を保護するのに有用である。興奮毒性損傷は、（例えばグルタミン酸などの）特定の神経伝達物質受容体による、細胞（典型的には、中枢神経系における神経系細胞）の過度の刺激に起因する。例えば、興奮毒性損傷は、脳における過剰な化学的または電気的活性を引き起こす状態の結果のこともあし、または脳の阻害機能または調節機能の低下を引き起こす状態の結果のこともある。脳における興奮毒性損傷は、種々の異なる病因や症状を伴う様々な状態と関係があり、これにはてんかん、外傷性脳損傷、およびアルツハイマー病が含まれる。中枢神経系（CNS）における低酸素症は、虚血性イベント（例えば脳血管の虚血、または脳梗塞、心臓の血管の狭窄または閉塞による心筋虚血、外科的手技などによる医原性虚血など）と関係している可能性がある。さらに、低酸素症は、例えば、（例えば、胎盤早期剥離による）不十分な胎盤機能、子癇前症の毒性、臍帯の脱出、または麻酔の投与による合併症などの状態によって、子宮内で起こることもある。CNS外での虚血性イベントももた、腎臓、肝臓、筋肉を含む組織や臓器に対して損傷をもたらすことがある。そのような損傷は、血管障害または損傷だけでなく、外科的手技（例えば心臓血管の手術）による合併症の結果のことがある。加えて、ある種の低酸素性イベント（例えば脳梗塞）による損傷は興奮毒性要素だけでなく低酸素性要素と関連があり、全てではなく一部のケースでは虚血性イベントと関連がある。故に、これらの用語は広い範囲で重複することがあるが、プレコンディショニングに適するあらゆる状態において必ずしも同一の範囲を持つわけでないことが理解されるであろう。言及を明快にするために、本開示の文脈においては、用語「細胞傷害性の損傷」は、これらの状態のいずれかに関して言及するために、個別にまたはいずれかの組み合わせで用いられる。本明細書で開示される方法は、これらの状態のうちいずれか（および／または全て）において細胞の傷害を防ぐのに有用である。

従って、本方法は、興奮毒性、虚血性、または低酸素性イベントの一つ以上に対する危険性がある対象を選択する段階を含むことができる。本開示全体で説明される方法の文脈では、当業者によって理解されるように、様々な医学的指標に加えて、非医学的指標によって危険性が表される。例えば、様々な心臓血管の徴候や症状、例えば心房細動、狭心症、高血圧、一過性の虚血性発作、および以前に起こった脳梗塞は全て、本明細書で開示される方法に従ってプレコンディショニング物質を投与するための対象を選択する際に使用できる、危険性の指標である。同様に、外科的手技、特に心臓血管系に特異的に関連する手技、例えば動脈内膜切除術、肺バイパス術、および冠動脈バイパス手術は、プレコンディショニング物質を投与するための対象を選択する際に使用できる、危険性の指標である。

さらに、例えば、損傷の可能性の上昇と統計的に関連性がある行動様式または活動に関する、非医学的な危険性の指標は、興奮毒性、または低酸素性要素を含むことがある。例えば、外傷性脳損傷（その原因にかかわらず）は、興奮毒性要素と関連性があることが多い（また低酸素症を含むこともある）。故に、外傷性脳損傷の危険性を増加させる活動への参加は、プレコンディショニング物質（例えばCpGオリゴヌクレオチド）の投与のための対象を選択する際に用いることができる指標である。そのような活動には、例えば、オートバイの運転、カーレース、スキー、コンタクトスポーツ（フットボール、ホッケー、ラグビー、サッカー、ラクロス、格闘技、ボクシング、レスリングなど）などが含まれる。加えて、発砲または爆発に起因する衝撃または外傷は、外傷性脳損傷の原因となることが多い。従って、弾丸による負傷または爆破装置による損傷（例えば、戦闘状況で）の危険性の増加に関連する活動は、本明細書で開示される方法に従う治療のための対象を選択する際に使用できる危険性の指標である。

ある態様では、本方法は、非メチル化CpGモチーフ配列を含むオリゴヌクレオチド（またはオリゴヌクレオチドの混合物）を含む組成物を全身性に投与する段階を含む。典型的には、CpGオリゴヌクレオチドを含む組成物は、細胞傷害性の損傷、例えば興奮毒性、虚血性および／または低酸素性イベントの危険性がある対象（例えばヒトの対象）に投与される。一般的には、CpGオリゴヌクレオチドを含む組成物は、対象に投与するために調製される薬学的組成物または薬剤である。そのような組成物は、一般的に薬学的担体または賦形剤を含む。通常は、組成物は目的とする投与経路に基づいて調製される。適切な投与経路には、鼻腔内、経口、経皮的、皮下、静脈内、腹腔内投与が含まれ、これらの投与経路に適切な薬学的担体は当技術分野でよく知られている。故に、興奮毒性損傷、虚血、または低酸素症（またはそれらの危険性の上昇）の予防的治療用の薬剤の調製におけるCpGオリゴヌクレオチドの使用は本開示の一つの特徴である。

組成物は、典型的には、興奮毒性損傷、虚血および／または低酸素症に関連する（例えば、危険性を増加させる）イベントまたは活動の前に投与される。投与のプレコンディショニング効果をより効果的に実現するために、通常は、イベントまたは活動の少なくとも10時間前に、少なくとも一回量の組成物が投与される。通常は、イベントまたは活動の少なくとも24時間前に組成物が投与される。CpG組成物の単回投与の保護効果は一週間以上（例えば最大約10日間、またはそれ以上）持続する。故に、単発のイベント、すなわち、繰り返し起こるイベントではないと予測されるイベント、例えば外科手術などの場合、組成物はイベント開始前、例えばイベントまたは活動の約10時間、または約12時間、または約24時間前に投与され、またイベントの最大で一週間前に投与できる。任意で、複数用量の組成物が、（例えば手術などの）イベント開始の前に投与される。例えば、二回量、または三回量、またはそれ以上の用量を、イベント前の個別の機会に投与できる。そのような場合、第一の投与量は、典型的には8〜10日間の間、イベントの7日前、6日前、5日前、4日前、3日前、2日前、または1日前に投与される。イベントの7日前、6日前、5日前、4日前、3日前、2日前、24時間前、または12時間前などのいずれかの時間ポイントでも、その後の、一回以上の組成物の投与を行ってもよい。

例えばコンタクトスポーツへの度重なる参加など、反復して起こるイベントの場合は、複数回投与が行われ、最終用量（すなわち、イベント直前の投与量）はイベントまたは活動の前（例えば、少なくとも10時間、または最大で約1週間前）に投与される。同様に、アルツハイマー病の場合など、継続するイベントの場合も、例えば一週間間隔などの既定のスケジュールで複数回投与が行われる。CpGオリゴヌクレオチドのプレコンディショニング用量の保護効果が、特定の対象の特定の状況において最適になるように、個々の治療計画を、特定の対象のイベントまたは活動に応じてカスタマイズすることができる。

典型的には、投与されるオリゴヌクレオチドを含む組成物の投与量は、プレコンディショニング用量である。すなわち、その後の細胞傷害性の損傷、例えば興奮毒性、虚血性、または低酸素性イベントに起因する損傷から細胞を保護する（例えば、ゲノム応答において）、細胞変化を誘発するのに十分な組成物の投与が行われる。そのようなゲノム変化を検知する方法は本明細書において以下、例えば実施例2において説明する。典型的には、プレコンディショニング用量（例えば、ヒトにおいて）は、少なくとも0.005mg／kg、例えば約0.01mg／kgのオリゴヌクレオチドを含む。通常は、投与は約0.8mg／kgを超えない量のオリゴヌクレオチドを含む。例えば、プレコンディショニング用量は0.01mg／kg〜0.25mg／kgのCpGオリゴヌクレオチド、例えば0.05mg／kg〜0.2mg／kgのCpGオリゴヌクレオチドを含むことができる。特定の典型的な投与は、約0.07、約0.08、約0.09、約0.10、約0.12、または約0.15mg／kgのCpGオリゴヌクレオチドを含む。

CpGオリゴヌクレオチドを（または複数の異なるCpGオリゴヌクレオチド）を含む組成物の投与後は、そのオリゴヌクレオチド（複数のヌクレオチド）はトール様受容体9（TLR9）と結合し、それを活性化する。適合するCpGオリゴヌクレオチドリガンドによるTLR9の結合は、その受容体を発現している細胞内の遺伝的プログラムを修飾する、細胞内のシグナル経路の活性化をもたらす。ゲノム応答におけるこれらの修飾には、特定の細胞保護性サイトカインの産生の増加が含まれる。例えば、例えばB細胞、樹枝状細胞、マクロファージ、ミクログリア細胞などの特定の免疫細胞の、細胞表面上のTLR9へのCpGオリゴヌクレオチドの結合は、トランスフォーミング成長因子ベータ（TGFβ）、腫瘍壊死因子アルファ（TNFα）、およびI型インターフェロン、例えばインターフェロンベータ（IFNβ）の産生を誘導する。故に、本明細書で開示される代表的な方法は、一つ以上の細胞保護性サイトカイン、例えばTGFβ、TNFα、IFNβの産生を誘導できる、CpGオリゴヌクレオチドの投与を伴う。

数多くのCpGオリゴヌクレオチドが説明され、TLR9に結合し、細胞のシグナル経路を誘導することが知られている。興奮毒性、または低酸素性損傷に対して細胞をプレコンディショニングするための組成物という観点では、これらのうちいずれのオリゴヌクレオチドを用いてもよい。CpGオリゴヌクレオチドの体内での安定性を増すため、一つ以上のホスホロチオエート修飾ヌクレオチドを含めることでオリゴヌクレオチドを修飾してもよい。使用に適した典型的なオリゴヌクレオチド配列はマウスが（配列番号1）でヒトが（配列番号2〜5）である。

本開示の別の局面は、（海馬ニューロンや皮質ニューロンを含む）神経系細胞を、興奮毒性脳損傷から保護する方法に関する。そのような方法は、中枢神経系（CNS）の末梢またはその内部にある細胞上に発現されるトール様受容体（TLR）に結合する物質を対象に全身性に投与する段階を伴う。TLRを発現する末梢細胞やCNS細胞は非神経系細胞であってもよい。例えば、非神経系細胞は、B細胞、樹枝状細胞、マクロファージ、またはミクログリアなどの免疫細胞であってもよい。とりわけTLR2、TLR4、TLR7、そしてTLR9などの様々なTLRと結合する物質は本明細書で開示される方法において有用である。一つの態様では、物質は、TLR9と結合し、それを活性化する、非メチル化CpGオリゴヌクレオチドである。別の態様では、物質は、TLR7と結合し、それを活性化する、イミキモドまたはその他の物質である。さらに他の態様では、物質はTLR2と結合し、それを活性化する、MALP−2、またはTLR4と結合し、それを活性化する、非毒性のアナログLPSである。

興奮毒性脳損傷は、様々な異なる種類ののイベントの結果であり得る。例えば、開示される方法は、脳梗塞だけでなく、てんかん、外傷性脳損傷、およびアルツハイマー病による損傷または死から細胞を保護するのに適している。投与後、物質はTLRと結合し、例えばTGFβ、TNFα、IFNβなどの、一つ以上の神経保護サイトカインの産生を誘発することによって、細胞変化（例えば、ゲノムプログラムにおいて）を誘導する。

保護的なプレコンディショニング効果を発揮させるため、TLRと結合する物質は興奮毒性イベントの前に投与される。例えば、興奮毒性脳損傷の危険性が高いとして特定された対象へ物質を投与してもよい。一つの典型的な応用では、外科的手技、例えばCNSまたは心臓血管系に関連する外科的手技の前に、物質は対象に投与される。例えば、例えば動脈内膜切除術、肺バイパス術、冠動脈バイパス手術など、興奮毒性脳損傷の危険性の増加に関連する、動脈バイパスを伴う外科的手技に起因する興奮毒性脳損傷から対象を保護するために、そのような方法を用いてよい。外科的介入は、一般的には反復して起こるイベントではなく、故に、イベントの開始前の単回投与として、物質をイベントの前に投与してよい。最適なプレコンディショニング効果のため、通常は、物質はイベント（手術など）の少なくとも10時間前に投与され、そのイベントの最大約一週間前に投与することができる。任意で、物質を一回量より多くイベントの前に投与する。

本開示の別の局面は、トール様受容体（TLR）に結合する物質を全身性に投与することによって、非神経系細胞を虚血から保護する方法に関する。典型的には、TLRは、中枢神経系の細胞以外の細胞によって発現される。例えば、非神経系細胞は、筋細胞（骨格筋細胞、平滑筋細胞、または心筋細胞を含む）、腎細胞、肝細胞、内皮細胞、または免疫系の細胞（例えばマクロファージまたはミクログリア細胞）であってもよい。特定のケースでは、虚血性イベントは外科的手技、例えば冠動脈バイパス手術と関連する。その他のプレコンディショニング計画に対して上で述べたように、虚血の発症の前に物質が投与される。ある態様では、物質はTLR9と結合する。別の態様では、物質はTLR7と（および／またはTLR8と）結合する。さらに他の態様では、物質はTLR2またはTLR4と結合する。典型的な物質には、CpGオリゴヌクレオチド、イミキモド、MALP−2、非毒性のLPSアナログが含まれる。

技術的詳細を、以下の特定のトピックの見出しのもとでさらに説明する

用語
特に別の説明がない限りは、本明細書で用いる全ての技術的、科学的用語は、本開示が属する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を持つ。分子生物学における一般的な用語の定義は、Benjamin Lewin,Genes V（1994年オックスフォード大学プレス発行）（ISBN 0−19−854287−9）；Kendrew et al（eds.）,The Encyclopedia of Molecular Biology,（ISBN0−632−02182−9）（1994年Blackwell Science Ltd.発行）；Robert A.Meyers（ed.）,Molecular Biology and Biotechnology：a Comprehensive Desk Reference,（1995年VCH Publishers,Inc.発行）（ISBN1−56081−569−8）を参照されたい。

単数の用語「1つの（a）」、「1つの（an）」、および「その（the）」は、そうでないと明確に文脈が示さない限りは、複数の指示対象を含む。同様に、単語「または」は、そうでないと明確に文脈が示さない限りは、「および」を含むように意図されている。用語「複数」は二つ以上を意味する。核酸またはポリペプチドに与えられる全ての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、および全ての分子量または分子質量はおおよその値であり、説明のために提供されることが、さらに理解されるべきである。本明細書で説明されるものと類似する、または同等の方法と材料を、本開示を実施するまたは検査する上で用いてもよいが、適切な方法と材料が本明細書で説明される。用語「から成る」は「含む」を意味する。略語「e.g.」はラテン語のexempli gratiaに由来し、限定されない例を示すために本明細書で使用される。故に、略語「e.g.」は、用語「例えば」と同義語である。(本翻訳では、略語「e.g.」は用いられておらず、「例えば」を用いている。)

本開示の様々な態様の検討を容易にするために、特定の用語に関する以下の説明を提供する。

語句「興奮毒性損傷」または「興奮毒性脳損傷」は、細胞表面の受容体の過剰な刺激による神経系細胞、特に脳の神経系細胞の損傷（死を含む）を意味する。最も一般的には、興奮毒性損傷は、例えば、Nメチル−d−アスパラギン酸（NMDA）−タイプのグルタミン酸受容体の過剰活性化によって、その受容体が関連するイオンチャネルを通る過剰なCa^2＋の流入を引き起こすなど、グルタミン酸受容体によって仲介される。興奮毒性損傷は、てんかん、外傷、アルツハイマー病を含む多様な状態において役割を果たすと考えられている。

用語「低酸素症」は酸素の欠乏を意味する。生理学的文脈では、用語、低酸素症は細胞、組織、または微生物レベルでの酸素の不足を意味する。低酸素症は、例えば、（血液中または組織中の）酸素分圧の低下、（例えば、酸素に富む血液が目標組織または細胞に到達しないことによる）不十分な酸素運搬、または組織が酸素を使用できないなどの原因によって起こる。用語「梗塞」は、局所性の酸素欠乏（低酸素症）による細胞または組織の死を意味する。

しばしば、低酸素症は、対象組織または臓器に対する酸素を豊富に含んだ血流の減少である、「虚血」の結果である。「虚血性イベント」は、細胞、細胞の一群または細胞集団、組織、または臓器に対する血流の低下をもたらす、イベントまたは発現である。虚血性イベントには、組織または臓器に対する血流の低下をもたらす、血管収縮、血栓症や塞栓症が含まれる。

用語「脳梗塞」は、いずれかの脳の部分への血液の供給の遮断を意味する。脳梗塞は虚血性イベント（例えば、血栓または塞栓による血管の閉塞）、または出血（例えば、脳血管の出血）の結果である可能性がある。

対象が、もしも一般の集団に対して、対象が興奮毒性、虚血性、または低酸素性イベントを経験する可能性がより高い場合、「細胞傷害性の損傷の危険性」がある、または「興奮毒性、虚血性、または低酸素性イベントの危険性」があるとされる。従って、危険性は、実験および／または生命表データに基づいた統計概念である。一般的には、危険性は、一つ以上の指標、例えば対象の症状、徴候、特徴、特性、発生、イベント、または取り組みと相関し得る。例えば、脳梗塞の危険性に対して、指標には、高血圧、心房細動、一過性の虚血性イベント、以前に起こった脳梗塞、糖尿病、高コレステロール、狭心症、心臓疾患を含まれるがこれに限定されない。より一般的には、低酸素性イベントに対する危険性の指標には、手術、特に心臓血管の手術、例えば動脈内膜切除術、肺バイパス手術、または冠動脈バイパス手術が含まれる。さらなる危険性因子または指標には、非医学的活動、例えばオートバイの運転、コンタクトスポーツ、戦闘が含まれる。その他の危険性因子を本明細書で考察するが、それ以上のものが当業者によって認識することができる。

興奮毒性、または低酸素性イベントに対する用語「保護」は、細胞、組織、または微生物レベルで、興奮毒性、または低酸素性イベントを防ぐ、その重症度を低下させる、またはその他の方法でその効果を少なくする、組成物または治療計画の能力を意味する。興奮毒性、または低酸素性イベントの効果の重症度を測定する方法には、（例えば対象の神経学的検査によって確認できる）行動的徴候を含む、神経学的徴候が含まれるだけでなく、細胞および代謝パラメータを、例えばCT断層撮影法（CTスキャン、CATスキャン）、磁気共鳴映像法（MRIスキャン、MRスキャン）、経頭蓋ドップラー法（TCD）を含む頸動脈超音波検査、脳血管造影法（脳動脈造影、デジタル・サブトラクション血管撮影法［DSA］）、コンピュータ断層血管造影（CT血管造影、CT−A、CTA）、磁気共鳴血管造影（MRA）および／または当業者に既知の、その他の診断的方法によって評価することによって測定できる。

「CpGオリゴヌクレオチド」または「CpG ODN」は、典型的には長さが約12〜30ヌクレオチドで、少なくとも一つの非メチル化シトシン−グアノシンジヌクレオチドを含む、ヌクレオチド分子である。通常は、非メチル化CpGジヌクレオチドはヌクレオチド配列の末端よりも、内部に位置する。非メチル化CpGジヌクレオチドは、様々なゲノムで見つかっており、多くの細菌やウイルスのものも含まれる。しかし、本開示においては、CpGオリゴヌクレオチドは合成された（または単離された）ヌクレオチド配列である。時には、体内でのCpGオリゴヌクレオチドの安定性を増すために、CpGオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート修飾骨格を持つ一つ以上のヌクレオチドを含む。

「トール様受容体」または「TLR」は、パターン認識受容体（PRR）として機能する、I型膜貫通タンパクである。トール様受容体は、先天性免疫において、例えば保存された微生物構造、すなわち病原体関連分子パターン（PAMP）を認識することによって役割を果たすことが示されている。十数個を超えるTLRが知られており、それらをコードする核酸が説明されている。例えばGENBANK（登録商標）でヒトTLRをコードする核酸配列を見つけることができ、登録番号は、とりわけU88540（TLR1）、U88878（TLR2）、U88879（TLR3）、U88880（TLR4）AB060695（TLR5）、AB020807（TLR6）、AF245702（TLR7）、AF245703（TLR8）、AF245704、およびスプライス変異AF259262やAF259263（TLR9）、AF296673（TLR10）であり、これらの配列は周知である。複数のTLRの天然発生、および人工リガンドが明らかになっている。例えば、ペプチドグリカンフラグメント（糖ペプチド）はTLR4に結合し、dsRNA（ウイルス産物）はTLR3に結合し、LPS（細菌細胞壁の要素）はTLR4に結合し、細菌のフラゲリンはTLR5に結合し、一本鎖RNA（例えばウイルスRNA）はTLR7とTLR8に結合し、非メチル化CpGモチーフ配列（例えば細菌またはウイルスのゲノムで認められるもの）はTLR9に結合する。

リガンドは、もしもそのリガンドが受容体に結合すると、受容体を「活性化」すると言われ、そのような結合によって、例えば受容体および／またはその他のシグナル伝達分子の転位またはリン酸化などの、一つ以上のシグナル伝達現象が開始される。

投与が、投与部位から離れた一つ以上の部位で、その組成物が直接投与される臓器または身体部位ではない、組織または身体部位の細胞／およびまたは組織を含む、細胞および／または組織と接触する組成物をもたらすことを示すために、修飾語「全身性の」および「全身性」は、組成物の投与／投与する段階に関して用いられる。最も一般的には、全身投与は、組成物を直接的に、または間接的に生物の循環系に導入する段階を伴う。故に、静脈内投与は、組成物の全身投与法の一つである。さらに、組成物が（拡散または能動輸送プロセスのいずれかによって）間接的に生物の循環系に導入されるような部位に組成物を導入することで、組成物を全身性に投与できる。故に、鼻腔内、経口的、経皮的、皮下、筋肉内、くも膜下、腹腔内経路は全て、組成物の全身投与になり得る。用語、「全身性の」は、導入部位に近接した部位（例えば、同一の組織内または臓器内）に組成物を保持するような方法から、投与経路を区別するために用いられる。

「対象」は、生きた多細胞脊椎動物であり、このカテゴリーには、ヒトおよびヒト以外の哺乳類を含む、ヒトおよび動物の対象の両方が含まれる。興奮毒性損傷および／または低酸素症に対するプレコンディショニングに関する臨床設定では、動物の対象も検討されるものの、対象は通常はヒトである。

「神経系細胞」は、神経幹細胞に由来する系統にあるあらゆる細胞であり、成熟神経細胞を含む。故に、用語「神経系細胞」には、ニューロン（神経細胞）だけでなく、それらの前駆細胞が、その分化段階にかかわらず含まれる。成熟脳においては、神経系細胞の大部分は分化したニューロンである。対して、「非神経系細胞」は、神経系細胞の系統以外の系統の細胞である、これは最終的に成熟神経細胞にまで分化しない系統である。非神経系細胞は、例えば脳内（例えばグリア細胞や、B細胞、樹枝状細胞、マクロファージ、ミクログリアなどの免疫細胞）など、中枢神経系（CNS）に存在してもよく、また例えば心筋、骨格筋、または平滑筋（筋細胞）、肝臓（肝細胞）、または腎臓（腎細胞）など、CNS外の臓器に存在してもよい。生物のCNS内に存在するか、または体内の他の部位に存在するかにかかわらず、非神経系細胞には免疫系の細胞が含まれる。

「細胞保護性サイトカイン」は、細胞機能を保存し、ストレス刺激またはその他の嫌悪刺激を受けることによる細胞の死を防ぐ（または減少させる）ように機能する、細胞増殖と機能の調節に関与する可溶性タンパク（または糖タンパク）である。細胞保護サイトカインには、トランスフォーミング成長因子β（TGF−β）、腫瘍壊死因子α（TNFα）、およびI型インターフェロン、例えばインターフェロンβ（IFNβ）が含まれる。「神経保護サイトカイン」は、細胞機能を保護し、神経系細胞における細胞死を減らすように機能する細胞保護性サイトカインである。

用語「薬剤」は、用語「薬学的組成物」と入れ替えて使用できる。ヒト／および／または動物の対象に投与するためにそのような組成物は調製され、典型的には一つ以上の有効成分（例えば本明細書で開示されるCpGオリゴヌクレオチドのうち一つ以上）だけでなく、状態または疾患の治療または予防的治療（予防または縮小）の目的で、対象への投与を容易にするために、一つ以上の追加成分を含む。追加成分には、薬学的に許容される担体、緩衝剤、または賦形剤が含まれてもよい。薬学的に許容される担体、緩衝剤などは当技術分野で既知であり、たとえば、Remingtons Pharmaceutical Sciences,19^th Ed.,Mack Publishing Company,Easton,Pennsylvania,1995などで説明されている。

「予防的」治療は、イベント、状態、または疾患が完全に表れる前に、症状、徴候、またはイベント、状態、または疾患の結果を予防する、または減少させる目的で、対象を治療することを意味する。故に、本開示においては、興奮毒性損傷または低酸素症の予防的治療は、興奮毒性、または低酸素性イベントが発生する前（すなわち、最初の興奮毒性、または低酸素性イベントの前、または二次的な興奮毒性、または低酸素性イベントの前、または継続する、または繰り返し起こる興奮毒性、または低酸素性イベントの完了または全盛期の前）の、またイベントの自然の結果および／または続発症の完了の前の対象の治療を意味する。

「プレコンディショニング用量」は、興奮毒性、虚血性、または低酸素性イベントによる損傷または死から細胞を保護する、効果的な化合物、またはそのような化合物を含む組成物の投与である。効果的な化合物または組成物の投与量は、化合物によって、また種によって様々である。いかなる化合物に対しても、適切なプレコンディショニング用量を経験的に決定できる。

プレコンディショニング
閾値下レベルの（すなわち、損傷の原因となるレベルより下のレベル）のストレス（例えば細胞傷害性）刺激に細胞を曝露すると、その操作がなければ損傷をもたらすであろう、続いて起こるイベントに対する耐性を誘発することができる。この効果はプレコンディショニングと呼ばれ、神経系細胞、筋細胞（例えば骨格筋細胞および心筋細胞）、腎細胞、肝細胞を含む様々な細胞や組織において、細胞傷害性の損傷、例えば興奮毒性イベントや低酸素症（例えば虚血によるもの）を防ぐ、または減少させることと関連がある。

脳における（すなわち、神経系細胞の）、およびその他の臓器のプレコンディショニングを、閾値下レベルの、そうでなければ毒性の刺激への曝露の後にもたらされる。例えば、短時間の虚血への曝露と亜毒性用量のリポ多糖体（LPS）の投与が、次に起こる虚血性イベントに対する防御反応を発現することが示された。この効果はタンパク質のデノボ合成に依存し、炎症に関連するゲノムプログラミングの変化を伴う。

適切なプレコンディショニング物質（例えばCpGオリゴヌクレオチド、イミキモド、またはTLRを活性化するその他の物質）の投与後、典型的には約10〜12時間以内に、興奮毒性および／または低酸素性損傷に対する保護が始まり、最大で数週間、またはそれ以上持続する。さらに、物質を反復投与することで保護効果を延長することができる。

炎症性経路の活性化は、興奮毒性損傷、虚血、低酸素症に対するプレコンディショニングに関わっている。例えば、TNFαと、その下流にあるシグナル伝達系のメディエーターであるセラミドはプレコンディショニング効果の達成に関与しており、（可溶性のTNF受容体またはそのフラグメントにより）TNFαをブロックすると、プレコンディショニングの保護効果が妨げられる。故に、TNFα経路に密接に関わるメンバー、例えばTNFαやその受容体、TNFR1（p55）、TNFR2（p75）に加えてスフィンゴミエリンベースのセカンドメッセンジャー、例えばセラミドは、LPSプレコンディショニングにおけるTNFαの保護効果のメディエーターの可能性がある。NF−κBによって調節される炎症分子、例えばスーパーオキシド・ジムスターゼ（SOD）がプレコンディショニングと関係していることが示されているため（Bordel et al.、J.Cereb.Blood Flow Metab.20：1190−1196、2000）、NF−κBのTNFα活性化も恐らく関連がある。

興奮毒性損傷、虚血、低酸素症からの細胞保護にインターフェロンも関与している。IFNは、I型（IFNαやIFNβ）とII型（IFNγ）IFNで構成されるサイトカインファミリーである。初めは抗ウイルス特性に基づいて特徴付けられたが、I型IFNは多くの免疫調節機能を持つ。通常は、IFNα／βは抗炎症性サイトカインと関連性がある（Shnyra et al.,J.Immunol.160：3729−3736,1998）。

動物モデルにおいて、IFNβが全身投与後に脳梗塞の転帰を改善することが示された（Veldhuis et al.,J.Cereb.Blood Flow Metab.23：1029−1039,2003； Liu et al.,Neurosci Lett.327：146−148,2002）。脳梗塞におけるIFNβの緩和効果は主に、マトリクス・メタロプロテイナーゼ9の調節によって罹患組織への細胞浸潤を減少させる、抗炎症特性によるものである。さらに、IFNβは、活性酸素種を減少させること、炎症性サイトカインを抑制すること（Hua et al.、J。Neurochem。83：1120−1128、2002）、細胞生存を促進すること（Barca et al.、J。Neuroimmunol、139：155−159、2003）が示されており、これらは脳梗塞後の転帰の改善に寄与する機能である。

IFNα／β'の調節機能のいくつかの基礎は、その後さらなるIFN誘導性遺伝子を転写活性化する、IFN制御因子（IRF）として知られるその他のIFN誘導性タンパクの発現の促進因子としての機能にある（Taniguchi et al.,Annu.Rev.Immunol.19：623−655,2001）。IRFは、その機能がある例においてはお互いに特異的で独立しているが、その他の例では相互依存しているように思われる、転写因子のファミリーを構成する（Taniguchi and Takaoka,Curr.Opin.Immunol.14：111−116,2002）。例えば、インターフェロン刺激反応要素（ISRE）と結合するIRF3は、プレコンディショニングの初期段階に関与するIFNβを誘導する。このシナリオにおいてIRF3がIFNβを転写活性する能力はNFκBにも依存する。これらの二つの転写因子間の相互作用は広範囲に及び、IRF3−NFκB複合体は、ISREだけでなくκB領域においても相互に作用することが示されている（Wietek et al.,J.Biol.Chem. 278：50923−50932,2003；Leung et al.,Cell 118：453−464,2004）。さらに、多くの遺伝子が、プロモーター領域にIRSE とκB領域の両方を含み、転写開始に関してこの二つの因子間の相互作用に依存している（Genin et al.,J.Immunol.164：5352−5361,2000）。IRF3はTLRを活性化する物質によって誘導され、プレコンディショニング物質の細胞保護効果を仲介する可能性が高い。

プレコンディショニングは、細胞死から細胞生存へと転帰を変化させる、興奮毒性、虚血性および／または低酸素性損傷に対するゲノムプログラムまたは応答の根本的な変化を伴う（すなわち、応答においてもたらされる遺伝子発現パターン）（Stenzel−Poore et al.,The Lancet 362：1028−1037,2003）。細胞傷害性の損傷、例えば興奮毒性、虚血性および／または低酸素性イベントを受けての遺伝子発現におけるこの変化、すなわちゲノムリプログラミングは、顕著な（例えば炎症性サイトカイン、および特定のイオンチャネルとK^＋やCa^＋＋チャネルなどのチャネル調節因子、例えばグルタミン酸受容体の）遺伝子発現の抑制を伴い、これは通常は傷害性である。そのような抑制は、プレコンディショニングなしの、興奮毒性、虚血性および／または低酸素性イベントによるmRNAの上方調節とは極めて対照的である。この変化は単純な応答の欠如ではなく、むしろ、代謝、細胞周期、そして神経系細胞においてはイオンチャネル活動を制御する、遺伝子の下方調節が関与するゲノム応答のリプログラミングである。さらに、特定の免疫系の細胞では、プレコンディショニングは、炎症性サイトカインから抗炎症性サイトカインへの変化を導く。

特定のサイトカインや炎症分子の抑制を導く、マクロファージにおけるプレコンディショニングは、NF−κBとAP−1の減退化や、シグナル伝達系のメディエーターであるIRAK−MやSOCS−Iの発現の増強を伴う（Kobayashi et al.,Cell110：191−200.2002；Nakagawa et al.,Immunity17：677−687,2002；Kinjyo et al.,Immunity17：583−591,2002）。同様のゲノムリプログラミングもまた、心臓組織におけるプレコンディショニングに関与する可能性があるが（Meng et al.,Am.J.Physiol275；C475−483,1998）、特異的な遺伝子は異なる可能性がある（例えばHSP70、c−jun、c−fos）。

本開示は、トール様受容体に結合する物質を全身性に投与することによって細胞をプレコンディショニングし、これにより、例えば上述のように産生されるサイトカインの性質や量を変化させることで特定の細胞のゲノムプログラムの変化を誘導する方法を提供する。例えば、TLRを活性化する物質(例えばCpGオリゴヌクレオチド）を、全身投与経路を用いて対象に投与できる。標的細胞、例えばB細胞、樹枝状細胞（DC）、マクロファージ、ミクログリア細胞を含む特定の免疫細胞の表面に発現しているTLRへの物質の結合は、ゲノムリプログラミングをもたらし、また上述の免疫細胞の場合は、細胞保護性サイトカイン、例えばTNF−α、I型インターフェロン（例えばIFN−α、IFN−β）および／またはTGFβの誘導をはじめとする、サイトカイン分泌のプロフィールの変化を誘導することができる。

細胞傷害性イベントの危険性が高い対象の選択
本明細書で開示される方法は、興奮毒性、虚血性および／または低酸素性損傷の影響を受けやすい、つまりプレコンディショニングに適しているいかなる細胞種にも適用可能である。例えば、興奮毒性、虚血性、または低酸素性イベントの発生前にプレコンディショニング物質（例えばCpGオリゴヌクレオチド）を全身性に投与することで神経系細胞（例えば海馬ニューロンや皮質ニューロンを含む）、筋細胞（心筋細胞や横紋筋細胞を含む）、肝細胞、腎細胞を、損傷や死から保護することができる。故に、プレコンディショニング物質は、典型的には、一般的な集団または危険因子を持たない対象と比較して、興奮毒性、虚血性および／または低酸素性イベントを経験する可能性の増大を示す、一つ以上の危険因子を持つと認定された（例えば診断された）対象に投与される。

興奮毒性損傷は、特定の神経伝達物質（例えばグルタミン酸）受容体による、細胞（典型的にはCNSの神経系細胞）の過剰な刺激に起因する。興奮毒性損傷は、脳における過剰な化学的または電気的活動を引き起こす状態の結果のことがあり、または脳の抑制機能または調節機能の低下を引き起こす状態の結果のこともある。脳における興奮毒性損傷は種々の異なる病因と症状を伴う様々な状態、例えばてんかん、外傷性脳損傷、およびアルツハイマー病と関連がある。例えば、てんかんまたはアルツハイマー病などの医学的な徴候に加えて、損傷の可能性の増加と統計的に関連がある行動様式または活動と関連がある非医学的な危険性の指標は興奮毒性要素を含むことがある。例えば、外傷性脳損傷は（その原因にかかわらず）多くの場合興奮毒性を伴い、（そしてまた低酸素性要素を含むことがある）。故に、外傷性脳損傷の危険性を増加させる活動への参加は、プレコンディショニング物質（例えばCpGオリゴヌクレオチド）の投与のための対象を選択する際に使用できる指標である。そのような活動には、例えば、オートバイの運転、カーレースへの参加、スキー、コンタクトスポーツ（例えば、フットボール、ホッケー、ラグビー、サッカー、ラクロス、格闘技、ボクシング、レスリング）などが含まれる。加えて、発砲または爆発に起因する衝撃または外傷は、外傷性脳損傷の原因となることが多い。従って、弾丸による負傷または爆破装置による損傷（例えば、戦闘状況で）の危険性の増加に関連する活動は、本明細書で開示される方法に従う治療のための対象を選択する際に使用できる危険性の指標である。

低酸素症は、典型的にはCNSまたは心臓血管系の他の部位における虚血性イベント（例えば脳血管の虚血、または脳梗塞、心臓の血管の狭窄または閉塞による心筋虚血、外科的手技などによる医原性虚血）と関連がある。さらに、低酸素症は、例えば不十分な胎盤機能（例えば、胎盤早期剥離による）、子癇前症の毒性、臍帯の脱出、または麻酔の投与による合併症などの状態によって、子宮内で起こることもある。さらに、ある種の低酸素性イベント（例えば脳梗塞）による損傷は、興奮毒性要素だけでなく低酸素性要素を伴う。

故に、様々な心臓血管の徴候や症状、例えば心房細動、狭心症、高血圧、一過性の虚血性症状、および以前に起こった脳梗塞は全て、プレコンディショニング物質（例えばCpGオリゴヌクレオチド）を投与するための対象を選択する際に使用できる、危険性の指標（または危険因子）である。同様に、外科的手技、特に心臓血管系に特異的に関連する手技、例えば動脈内膜切除術、肺バイパス術、および冠動脈バイパス手術は、プレコンディショニング物質を投与するための対象を選択する際に使用できる、危険性の指標である。

CpGオリゴヌクレオチド
一つの典型的な態様では、細胞傷害性の損傷、例えば興奮毒性損傷、虚血、または低酸素症から保護するために、一つ以上の細胞（または細胞種、または組織、または臓器）をプレコンディショニングする目的で、非メチル化CpGモチーフ配列を含むオリゴヌクレオチドが対象に投与される。

本開示においては、CpGオリゴヌクレオチド（またはCpG ODN）は、少なくとも一つの非メチル化シトシングアニンジヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドである。CpGオリゴヌクレオチドの産生と使用は当技術分野で既知であり、例えば、米国特許第6,194,388号や第6,406,705号において説明される。理論に縛られることなく、米国特許第6,194,388号や第6,406,705号で開示される、それらを産生する全ての組成や方法は、参照することによって本明細書に引用したものとする。

典型的には、CpG ODNは、長さが約8〜100ヌクレオチドである。CpG ODNは、長さが少なくとも10、または少なくとも12ヌクレオチドである。通常は、CpG ODNは長さが約40ヌクレオチドを超えない。長いヌクレオチドを用いることもできるが、長さに伴って生産にかかる費用が増大し、活性という点で著しい利点は得られない。故に、長さが50ヌクレオチド、または60ヌクレオチド、またはさらに70、または80、または90、または100ヌクレオチド、またはそれ以上のCpG ODNを用いるのは可能だが、そうすることで得られる利点はほとんどない。多くの場合、非メチル化CpGの両側には相補的ヌクレオチドが存在し、それによってCpGジヌクレオチドの周囲にヘアピン構造を形成する（塩基対結合によって）回文配列がCpG ODN配列に含まれる。非メチル化CpGジヌクレオチドを囲む回文配列の存在は、短鎖オリゴヌクレオチド（例えば長さが10または12ヌクレオチド）を用いる場合は、特に望ましい。

様々な組織および／または臓器において、細胞表面にあるトール様受容体9（TLR9）にCpGオリゴヌクレオチドが結合する（NishimuraとNaito,Biol.Pharm.Bull.28：886−892,2005）。TLR9へのCpGオリゴヌクレオチドの結合によって、MyD88とp38−MAPKによって仲介されるシグナル伝達経路が開始され、これがその他のゲノム変異もあるが、とりわけ、NF−κBとIFNβの発現を誘導する。

CpGオリゴヌクレオチドを、構造的、機能的性質に基づいて少なくとも三つのクラスに分類できる。例えば、AクラスCpGオリゴヌクレオチド（配列番号2によって示される）は、多量のIFNαを産生するように樹枝状細胞を刺激するが、B細胞に対する効果は弱い。対して、BクラスCpGオリゴヌクレオチド（配列番号3と配列番号5によって示される）は、IFNαの産生の誘導の程度は小さいが、B細胞の活性化と抗体産生を強く誘導する。Cクラスオリゴヌクレオチド（配列番号4によって示される）は、B細胞、IFNαに対する強力な刺激と、ナチュラルキラー細胞の活性化を示すことにより、AクラスとBクラスのオリゴヌクレオチドの効果を兼ね備える。本明細書で開示されるプレコンディショニング方法においては、防御反応を導くためにこれらのどのクラスを用いてもよい。

本明細書で開示される方法で用いるために、当技術分野で既知の多くの方法のどれかを用いて、オリゴヌクレオチドをデノボ合成してもよい。例えば、β−シアノエチルホスホルアミダイト法（Beaucage and Caruthers,Tet.Let.22：1859,1981）；ヌクレオシドH−ホスホネート法（Garegg et al.,Tet.Let.27：4051−4054,1986； Froehler et al.,Nucl.Acid.Res.14：5399−5407,1986； Garegg et al.,Tet.Let.27：4055〜4058,1986； Gafffney et al.,Tet.Let.29：2619−2622,1988）を用いることができる。市販されている様々な自動オリゴヌクレオチド合成機を用いてこれらの化学反応を行ってもよい。代替的には、既知の技術、例えば制限酵素または、エクソヌクレアーゼ、またはエンドヌクレアーゼを用いるものを用いて、存在する核酸配列（例えばゲノムDNAまたはcDNA）から、オリゴヌクレオチドを調製してもよい。

体内での使用に関しては、（例えば、エンドヌクレアーゼやエクソヌクレアーゼによる）分解に対して比較的抵抗性のあるオリゴヌクレオチドを使用するのが望ましいかもしれない。体内の分解に対して比較的抵抗性のあるオリゴヌクレオチドは「安定化オリゴヌクレオチド」と呼ばれる。リン酸骨格を修飾することでオリゴヌクレオチドの安定化を行うことができる。例えば、ODNを、一つ以上のヌクレオチド間結合のホスホロチオエート修飾（すなわち、リン酸酸素の少なくとも一つが硫黄で置換されている）によってヌクレアーゼ抵抗性にすることができる。あるケースでは、末端ヌクレオチド間結合は修飾されたホスホロチオエートである。ホスホロチオエート修飾CpGオリゴヌクレオチドを合成する手技は、例えば米国特許第5,663,153号および第5,723,335号において開示されており、これらの開示は本明細書において全ての目的で引用したものとする。

ホスホロチオエートODNの薬物動態は、げっ歯類動物においてそれらが48時間の全身半減期を有し、体内での適用に有用であることを示唆する（Agrawal et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：7595−7599,1991）。ホスホロチオエートは、ホスホルアミデートまたはHホスホネート化学反応のいずれかを使用する自動化技術を用いて合成されてもよい。

その他の安定化オリゴヌクレオチドには、非イオンDNA類似体、例えばアルキルホスホネートやアリールホスホネート（ここでは、荷電ホスホネート酸素がアルキル基またはアリール基で置換される）、ホスホジエステル、アルキルホスホトリエステル（ここでは、荷電酸素部分がアルキル化される）が含まれる。例えばテトラエチレングリコールまたはヘキサエチレングリコールなどのジオールを、いずれか一方、または両方の末端に含むオリゴヌクレオチドもまた、ヌクレアーゼ分解に対して実質的に抵抗性であることが示されている。アリール−およびアルキル−ホスホネートを作成でき（例えば、米国特許第4,469,863号で説明されるように）、アルキルホスホトリエステル（米国特許第5,023,243号および欧州特許第092,574号にて説明されるように荷電酸素部分がアルキル化される）を、市販の試薬を使用する自動化固相合成を用いて調製できる。その他のDNA骨格修飾や置換を行うための方法が説明されている（Uhlmann and Peyman,Chem.Rev.90：543−584,1990；Goodchild,Bioconjugate Chem.1：165−187,1990）。

体内での投与のため、「オリゴヌクレオチドデリバリー複合体」を形成するために、CpGオリゴヌクレオチドを、標的細胞表面への結合を高める分子および／または標的細胞による細胞取り込みの増加させる分子と結合させてもよい。当技術分野で周知の技術を用いて、イオン的に、または共有結合的にオリゴヌクレオチドを適切な分子に結合させることができる。プロテインA、カルボジイミド、N−スクシンイミジル−3−（2−ピリジルジチオ）プロピネート（SPDP）などの、様々なカップリング剤または架橋剤を用いてもよい。代替的には、デリバリーを促進するために、周知の技術を用いてリポソームまたはビロソーム中にオリゴヌクレオチドをカプセル化してもよい。

興奮毒性損傷、虚血および／または低酸素症の有害な効果を防ぐ、または減少させるために、少なくとも一つの非メチル化CpGジヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを、体内でプレコンディショニング物質として対象に投与してもよい。CpGオリゴヌクレオチドは、興奮毒性、虚血性および／または低酸素性損傷の一つ以上の危険性がある対象に、そのような損傷を引き起こす可能性があるイベントの前に全身性に投与される。プレコンディショニング物質として使用するために、効果的な量の適切なオリゴヌクレオチド（単独またはオリゴヌクレオチドデリバリー複合体として調製されたもの）を、標的細胞（例えばTLR9）の表面にある適切な受容体にオリゴヌクレオチドが結合できるようにする、どのような方法で対象に投与してもよい。CpGオリゴヌクレオチドを含む組成物の調製と投与量は、本明細書の下記で考察する。

トール様受容体を活性化する他の物質
CpGオリゴヌクレオチドに加えて、TLRに結合しそれを活性化する他の物質もまた、興奮毒性損傷および／または低酸素症の効果を防ぐ、または減少させるために、プレコンディショニング物質として用いてもよい。ヒトにおいて少なくとも10種類のTLRが報告されており（Janeway and Medzhitov,Annu.Rev.Immunol.20：197−216,2002）、マウスでは9種類が報告されている（Olson and Miller,J.Immunol.173：3916−3924,2004）。脳、心臓、腎臓、肝臓、肺、骨格筋、脾臓、胸腺など様々な組織の細胞表面でTLRが発現する。さらに、異なる免疫系の細胞上で重複するTLRのサブセットが発現する。例えば、TLR9はヒトの樹枝状細胞とB細胞強く発現しているが、TLR4と同じようにTLR2は単球上で最も強く発現している。TLR1は単球、樹枝状細胞、B細胞に加えてNK細胞やT細胞上でも高頻度に発現している。TLR5もまたT細胞、NK細胞、単球上で発現するが、B細胞または単球ではほとんど発現が見られない。TLR6は上記の細胞系統の全てで発現し、B細胞上で最も強く発現している。TLR7は単球、B細胞、樹枝状細胞で発現し、発現は樹枝状細胞で最も強い。

全てのTLRにおける共通の経路は、NFκBを誘導する能力であり、これはその後様々なサイトカイン、ケモカイン、細胞表面分子の転写を導く（Andreakos et al.,Immunol.Rev.202：250−265,2004）。このNF−κBの誘導は、プレコンディショニング計画を用いる細胞保護の確立に関与している。（CpGオリゴヌクレオチド以外の）TLRを刺激し、またプレコンディショニング物質として投与されるのに適する例示物質には、TLR4を活性化するLPSの非毒性アナログ、TLR2の作動薬であるMALP−2、およびTLR7／8の作動薬であるイミキモドが含まれる。

例えば、イミキモド（および、その他のイミダゾキノリン化合物、例えばR−848）はマウスではTLR7と結合し、それを活性化し、ヒトではTLR7とTLR8と結合しそれらを活性化する（Hemmi et al.,Nat Immunol.,3：196−200.2002；Jurk et al.,Nat Immunol.3：499,2002）。これまでに、これらの化合物は抗ウイルス剤や抗腫瘍薬として、典型的には0.25〜5mg／kgの用量範囲で使用されている。イミキモドのプレコンディショニング用量は、ヒトでは典型的に約0.002mg／kg（例えば0.005mg／kg、または0.008mg／kg、または約0.01mg／kg、または約0.02mg／kg、または約0.05mg／kg）から約0.1mg／kg、例えば約0.08mg／kgまでの範囲である。興奮毒性損傷、虚血および／または低酸素症の危険性がある対象への、そのような細胞傷害性イベントの前の、イミキモド（および／またはTLR7／8と結合し、それらを活性化するその他のイミダゾキノリン化合物または誘導体）のプレコンディショニング用量の投与は、細胞損傷および細胞死から保護する。故に、イミキモド（および関連化合物または誘導体）を、プレコンディショニング物質として、CpGオリゴヌクレオチドの代わりに、またはCpGオリゴヌクレオチドと組み合わせて用いることができる。

さらなるプレコンディショニング物質を、選択されたTLRの結合と活性化とNF−κBの誘導が、NF−κB応答性レポーターコンストラクトを用いて検知される、レポーターシステムを用いて特定できる。選択されたTLRを介するシグナル伝達に必要な分子を安定的に形質導入された細胞株、例えばHEK293に、NFκBによって誘導されるレポータープラスミドpNiFty2−SEAP（InvivoGen、San Diego）が形質導入される。このプラスミドは、分泌型アルカリホスファターゼ（SEAP）をコードするレポーター遺伝子の上流の近位ELAM（内皮白血球接着分子）プロモーターと5つのNFκB結合部位と結合させる、遺伝子操作されたプロモーターを含む。SEAPは極めて耐熱性で、例えばPHOSPHA−LIGHT（TM） chemiluminescence kitを用いて（Applied Biosystems、BP3000）、比色法または発光物質を検出するいずれかの方法を用いて、分光光度法で検出できる。このアッセイ法では、基質CSPD［3−（4−メトキシスピロ［1,2−ジオキセタン−3,2'（5'−クロロ）−トリシクロ（3.3.1.13,7）デカン］−4−イル）フェニルホスフェート］はSEAPによって脱リン酸化され、結果として得られる不安定なジオキセタン陰イオンは分解し、477nmの波長の光を発する。光のシグナルは、マイクロプレートルミノメーターで定量化され、10⁵の増感が直線状におこり、それはSEAPの濃度に比例する。上清を採取し、本アッセイ法でSEAP濃度を測定することでTLR活性化の程度を定量化できる。

マウスおよびヒトTLR1−10を発現する細胞株は市販されており（例えばInvivoGenから）、または例えばSambrook et al.,Molecular Cloning：a Laboratory Manual.,Cold Spring Harbor Press,1989で説明されるような、日常的な分子生物学手技を用いて当業者が作成することもできる。

簡潔に言うと、それぞれNF−κBレポーターコンストラクトを持つ、選択されたTLRを発現する形質導入された細胞株とHEK293親細胞を、様々な用量の試験物質で（12〜24時間の間、例えばおよそ18時間または一晩）刺激する。典型的には、用量／反応曲線を決定するために、各試験物質を複数回投与で検査する。インキュベーション後、上清を採取し、NF−κB活性をアルカリホスファターゼアッセイ法で測定する。

選択されたTLRと結合し、それを活性化する、またNF−κBを誘導する物質を検出した後は、脳梗塞の体内モデルを用いてその物質のプレコンディショニング能力を確認できる。マウス皮質神経細胞の一次培養物を培養液で、または用量／反応曲線から決定された適切な用量の、同定された試験物質で前処理する。およそ24時間後、成長培地を0.5mM CaCl₂と5mM MgCl₂を含む、pH7.4のPBSと交換する。神経培養物を85％N₂、5％H₂、10％CO₂の空気を含む嫌気性チャンバー（Forma Scientific）に静置し、35℃に保つ（酸素グルコース欠乏処理、「OGD」）。OGD処理（3時間）後、PBSを最小必須培養液（MEM）と交換し、培養物を通常の酸素状態に戻す。

次に細胞死の割合（％）を求める。例えば、細胞生存率に対する各化合物の効果を決定するために、OGDなしの培養液と試験物質のみを用いて背景細胞死を求めることができる。TLR4トランスフェクト細胞株のLPS（1μg／ml）プレコンディショニングを、神経保護の陽性対照として用いることができる。細胞死は、例えば、プロピジウムイオダイドによる蛍光性色素排除法でOGDのおよそ24時間後に判定する。細胞死の割合を定量化し、例えば、処理（培養液対試験物質）と低酸素性状態（OGDなし対OGDあり）についてグループ化した群間分散分析を用いて、試験物質と対照に接触させた細胞における平均値（％細胞死）の差を有意性について比較する。

物質に曝露されなかった培養物（例えば培養液のみ）と比較して、有意な保護効果、例えば少なくとも約20％の細胞死の減少を示す物質は、興奮毒性損傷および／または低酸素症から保護するためのプレコンディショニング物質として適切である。化合物のライブラリ、例えば混合液ベースポジショナルスキャニングライブラリ（Mixture Based Positional Scanning Library）を、プレコンディショニング物質に関してスクリーニングするために上述の方法を用いることができる。混合液ベースポジショナルスキャニングライブラリは、数千から数百万という数の系統的に配置された化合物の一群の活性に関する情報を提供するようにデザインされている。新規の酵素阻害薬、受容体作用薬、抗菌性化合物、抗真菌化合物、抗ウイルス化合物を同定するのに、ポジショナルスキャニング法はうまく用いられている（Houghten et al.,J.Med.Chem.42：3743−3778,1999；Pinilla et al.,Nat.Med.9：118−122,2003）。さらに、多くの研究グループによって独立してこの技術の正当性が確認されている。およそ50の研究施設によって行われた、100を超える個別の研究による発表は（Houghten et al.,J.Med.Chetm.42：3743−3778,1999）、系統的に配置された化合物の一群、例えばポジショナルスキャニングライブラリのスクリーニングの幅広い実用性を反映している。

各ポジショナルスキャニングライブラリはコアファーマコフォアを中心にデザインされている。伝統的には、ポジショナルスキャニングライブラリにおけるコアファーマコフォアは以下の基準に基づいて選ばれる。それは、直接的で費用効率のよい合成条件においてコア構造を作成できる、コア構造が多くの機能的に多様な要素を持つことができる、コア構造が生物学的に重要なものとして知られている、あるいは明らかになっていることである。各ポジショナルスキャニングサブライブラリは、中心コア周辺の構造的な多様性を可能にする位置を含む。ライブラリからのスクリーニングデータは、幅広い構造−活性関連性の情報を提供し、これにより個々の活性のある化合物の同定が可能になる。故に、個々の構造的要素と、ポジショナルスキャニングライブラリyにおけるそれらの全体の生物学的活性への代表的な寄与が明らかになる。選択されたTLRを活性化する物質を同定するために、混合液ベース低分子ポジショナルスキャニングコンビナトリアルライブラリ（mixture−based small molecule positional scanning combinatorial libraries）（Mixture Sciences,Inc.）をスクリーニングできる。典型的には、ヒトTLRは、ヒト受容体に対する最適な活性の特徴を持つ物質を同定するために使用される。

故に、典型的なスクリーニングプロトコールでは、選択されたTLRを発現する、形質導入された細胞株を、ライブラリのプールと接触させて、活性な成分を持つライブラリを同定する。ライブラリ混合物とライブラリプールは、10％ジメチルホルムアミド（DMF）中で1mg／mlで調整される。1％以下の濃度で、DMFに対する毒性について、細胞株を検査する。ライブラリプールは最大の実用的な濃度で適用され、これはDMFに対する細胞株の耐性によって決定される。

適切な濃度のDMF単独に加えてLPSを加えたDMF対照を、それぞれ96ウェルのアッセイプレートで二回測定する。インキュベーションの後、アルカリホスファターゼアッセイ用に上清を採取する。続いて、各ライブラリ骨格上最も活性が高い官能基を同定するために、活性ライブラリを個々の混合物としてスクリーニングする。最も活性が高いと予想された化合物を、個々の化合物として合成し検査する。さらに、体外モデルにおいてTLR結合（および活性化）と神経保護特性の両方を示すリガンドを、脳梗塞の体内モデルにおけるそれらの保護特徴について評価することができる。

薬学的組成物と方法
本明細書で開示されるプレコンディショニング組成物（薬剤）は、興奮毒性損傷、虚血および／または低酸素症から保護するために対象に投与することができる。従って、興奮毒性、虚血性、または低酸素性イベントの危険性がある対象に、そのようなイベントまたは発現の有害な効果を防ぐ、または減少させるためにその組成物は投与される。組成物の投与は、いずれかの細胞傷害性の損傷の発現の可能性を変化させるものとは必ずしも考えられず、むしろプレコンディショニング組成物の投与は、興奮毒性、虚血性および／または低酸素性イベントの効果を減少させる、防ぐ、または改善する、細胞変化（e.g.、ゲノムプログラムにおける）を誘導することによって、そのようなイベントの発現後の転帰を変化させる、または修正するものである。

プレコンディショニング組成物（薬剤）は、TLRと結合する少なくとも一つの物質を含む。故に、本明細書で開示されるように、薬学的組成物は、TLRのリガンドである一つ以上の物質を含む。リガンドは、組成物を投与される対象にとって適切であるように選択される。例えば、プレコンディショニング物質をヒトの対象に投与する場合、ヒトTLRと結合し、それを活性化するリガンドであるように物質は選択される。同様に、もし治療を受ける対象がヒト以外の動物ならば、物質はその種の動物のTLRと結合し、それを活性化するように選択される。一部のTLRリガンドはヒトTLRだけでなく動物TLRに結合するが、ある他のリガンドはある種のTLRだけと結合しその他の種には結合しないことに留意するべきである。当業者は、必要以上の実験を行うことなく、選択されたリガンドの適切なTLR結合を経験的に確認することができる。あるケースでは、組成物は単一のTLRリガンドを含み、他の例では、組成物は一つより多いTLRリガンドを含む。組成物が一つより多いTLRリガンドを含む場合は、組成物は、（任意で異なるシグナル伝達の結果を持つ）単一のTLRと結合し、それを活性化する、または様々なTLRと結合し、それらを活性化する複数の物質を含むことができる。

薬学的組成物に含まれる、TLR結合と、活性化物質（例えばCpGオリゴヌクレオチドまたはイミキモドの）量は、プレコンディショニング効果を提供するために決定される量である。例えば、一つ以上の用量で対象（例えばヒト）に投与される場合、プレコンディショニング組成物は、対象の体重1kgにつき少なくとも約0.005mg（0.005mg／kg）のCpGオリゴヌクレオチドを提供するのに十分な量のCpGオリゴヌクレオチドを含むことができる。故に、典型的な組成物は、約0.008mg／kg（例えば、約0.01mg／kg、または約0.02mg／kg、または約0.025mg／kg、または約0.05mg／kg）から、約0.2mg／kg（例えば、約0.08mg／kg、または約0.09mg／kg、または約0.10mg／kg、または約0.12mg／kg、または約0.15mg／kg）の間の量のCpGオリゴヌクレオチドを含む。故に、ヒト成人への投与については、組成物は、単回用量に少なくとも約0.1mg（100μg）のCpGオリゴヌクレオチドから約100mgのCpGオリゴヌクレオチドを含むように調製されてもよい。別の実施例では、TLR結合物質はイミキモドであり、これは同程度の用量で投与される（例えば、約0.005〜0.2mg／kg、例えば約0.01〜0.10、e.g.、およそ0.05〜0.08mg／kgで）。プレコンディショニング効果を持ついずれのTLR結合物質についても、当業者によって適切な用量範囲と用量が決定できる。米国特許第6,194,388号および第6,406,705号において、CpGオリゴヌクレオチドを調製する方法およびデリバリーする方法が提供される。それらの文書で開示される、CpGオリゴヌクレオチドを調製しデリバリーする方法は参照することによって本明細書に引用したものとする。

組成物は、典型的には、一つ以上の薬学的に許容される成分、例えば薬学的に許容される担体および／または薬学的に許容される希釈剤を含む。典型的には、プレコンディショニング組成物（薬剤）の調製は、発熱物質や、ヒトまたは動物に対して有害になりうるその他のいかなる不純物をも実質的に含まない薬学的組成物を調製する段階を伴う。典型的には、薬学的組成物は、組成物の成分を安定化するため、ヒトへの投与を容易にするために適切な塩や緩衝剤を含む。そのような成分は、凍結乾燥状態で供給されてもよいし、または凍結状態から、投与に対して安定な液体状態へ再構成するために使用される希釈剤に含まれてもよい。代替的には、固体の状態（例えばパウダーまたはペレット）での投与用に、不活化された病原体が調製される場合は、適切な固体の担体が製剤に加えられる。

水性の組成物は、典型的には、薬学的に許容される希釈剤または水性の媒体に、効果的な量の分散されたプレコンディショニング物質（例えば、溶解されたまたは懸濁された）を含む。薬学的に許容される化合物や組成物は、一般的には、ヒトまたは動物の対象に投与された場合に、有害な、アレルギー反応、またはその他の望ましくない反応を引き起こさない。本明細書で使用されるように、薬学的に許容される担体は、ありとあらゆる溶媒、、分散媒、コーティング、等張剤、吸収遅延剤などを含む。任意で、薬学的に許容される担体または希釈剤は、抗菌性、抗真菌性、またはその他の保存料を含んでもよい。薬学的に活性な物質に対するそのような媒体や物質の使用は、当技術分野で周知である。従来の媒体または物質がプレコンディショニング反応の産生に不適合である場合を除いて、プレコンディショニング組成物におけるそれらの使用が検討される。ある例では（例えば、液状製剤が望ましいと考えられる場合、または複数用量用に、単一の容器内で物質が最構成される場合）、これらの調合薬は、微生物の増殖を防ぐ、または抑制するために保存料を含む。

薬学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤は、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences,by E.W.Martin,Mack Publishing Co.,Easton,PA,15th Edition（1975）で説明されるように、当業者に既知であり、これは不活化病原体の薬学的な投与に適した組成物や製剤を説明している。

通常は、担体の性質は用いられる特定の投与方法による。例えば、水、生理食塩水、平衡塩類溶液、水性D形グルコース、グリセロールなどの、薬学的および生理学的に許容される液体を媒体として含む注射液が、通常は非経口製剤に含まれる。固体の組成物（例えば、パウダー、丸薬、錠剤、またはカプセル形態）では、従来の非毒性の固体の担体を含むことができる、例えば、医薬品グレードのマンニトール、乳糖、スターチ、またはステアリン酸マグネシウムである。生物学的に天然の担体に加えて、投与される薬学的組成物は、例えば、酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレートなどの湿潤剤または乳化剤、保存料、pH緩衝剤などの少量の非毒性補助剤を含むことができる。

例えば、薬学的組成物（薬剤）は、安定化界面活性剤、ミセル形成剤、油の一つ以上を含むことができる。適切な安定化界面活性剤、ミセル形成剤、油は、米国特許第5,585,103号、第5,709,860号、第5,270,202号、第5,695,770号で詳細に説明されている。安定化界面活性剤は、エマルジョンの成分が安定なエマルジョンとして保たれるようにする界面活性剤である。そのような界面活性剤には、ポリソルベート、80（TWEEN）（ソルビタン−モノ−9−オクタデセン酸−ポリ（オキシ−1,2−エタンジイル；ICI Americas,Wilmington,DE製造）、TWEEN40?、TWEEN20?、TWEEN60?、Zwittergent?3−12、TEEPOL HB7?、SPAN85?が含まれる。これらの界面活性剤は典型的には、およそ0.05〜0.5％、例えば約0.2％の量で提供される。

ミセル形成物質は、他の成分とともに形成されたエマルジョンを安定化し、ミセル様構造を形成することができる物質である。そのような物質は一般的に、細胞性応答を高めるためにマクロファージを動員するために、注射部位にある種の刺激をもたらす。そのような物質の例には、例えばSchmolka,J.Am.Oil.Chem.Soc.54：110,1977やHunter et al.,J.Immunol 129：1244,1981で説明される高分子界面活性剤や、PLURONIC? L62LF、L101、L64、PEG1000、TETRONIC? 1501、150R1、701、901、1301、130R1のような物質が含まれる。そのような物質の化学構造は当技術分野で周知である。一つの態様では、HunterおよびBennett（J.Immun.133：3167,1984）で定められるように、0〜2の親水性・親油性バランス（HLB）を持つように物質が選択される。物質は、効果的な量、例えば0.5〜10％、または1.25〜5％の量で提供されてもよい。

組成物に含まれる油は、水中油型乳剤中の病原体の保持を促進するように選択され、室温で、またはエマルジョンの温度が室温と一致した場合のいずれかでエマルジョンが形成されるように、好ましくは65℃未満の融点を持つ。そのような油の例には、スクアレン、スクアラン、EICOSANE?、テトラテトラコンタン、グリセロール、ピーナッツ油またはその他の植物性油が含まれる。特定の、しかし限定されない例では、油は1〜10％、または2.5〜5％の量で提供される。対象が時間とともに油を分解でき、また悪影響、例えば肉芽腫が油の使用の際に顕著にならないように、油は生体分解性、生体適合性でなくてはならない。

プレコンディショニングまたは予防計画で使用するために薬学的組成物（薬剤）を調製し、興奮毒性、虚血性、または低酸素性イベントに対して保護反応を導くために、ヒトまたはヒト以外の対象に投与でき。例えば、脳梗塞またはその他の虚血性イベントに対する保護反応を導くために、本明細書で説明される組成物をヒト（またはヒト以外の）対象に投与できる。

薬学的組成物（例えば、CpGオリゴヌクレオチドを含むもの）を、当業者に既知のいずれかの手段、例えば鼻腔内、静脈内、筋肉内、または皮下注射によってを用いて投与できるが、投与経路が、プレコンディショニング物質の全身性の（限局性の対語として）分布をもたらすのであれば経口的や経皮的経路さえも検討される。一つの態様では、投与は鼻腔内投与である。

液状製剤に代わるものとして、プレコンディショニング組成物を固形、例えばパウダー、ペレット、または錠剤で投与することができる。例えば、プレコンディショニング物質を、経皮的無針注射器、例えばヘリウムを使用したPOWDERJECT（登録商標）注射器具を用いて、パウダーとして投与することができる。この器具は、例えば、CpGオリゴヌクレオチドを含むプレコンディショニング組成物のパウダー製剤を高速で噴射するするために高圧ヘリウムガス使用し、粒子が角質層を浸透し、表皮中の細胞と接触する。

制御放出のためににポリマーを使用することもできる。薬剤投与制御に使用するための様々な分解性および非分解性のポリマーマトリクスが当技術分野で知られている（Langer,Accounts Chem.Res.26：537,1993）。例えば、ブロック共重合体、polaxamer407は、低温において粘着性ではあるが流動性の液体として存在するが、体温では半固体のゲルを形成する（Johnston et al,Pharm.Res.9：425,1992およびPec,J.Parent.Sci.Tech.44（2）：58,1990）。代替的には、制御放出のためのマイクロキャリアとしてヒドロキシアパタイトが使用されている（Ijntema et al.,Int.J.Pharm.112：215,1994）。さらに別の局面では、制御放出だけでなく、脂質カプセル剤の薬剤標的のためにリポソームが使用される（Betageri et ah,Liposome Drug Delivery Systems,Technomic Publishing Co.,Inc.,Lancaster,PA,1993）。治療用成分の制御投与のための多数の他のシステムが知られている（例えば米国特許第5,055,303号、第5,188,837号、第4,235,871号、第4,501,728号、第4,837,028号、第4,957,735号、第5,019,369号、第5,055,303号、第5,514,670号、第5,413,797号、第5,268,164号、第5,004,697号、第4,902,505号、第5,506,206号、第5,271,961号、第5,254,342号、第5,534,496号）。

必ずしもそうとは限らないが、典型的には、興奮毒性、虚血性、または低酸素性イベントの発現の前に（または、そのようなイベントの可能性の増加の前に）プレコンディショニング組成物が投与される。通常は、組成物は、投与のプレコンディショニング効果を十分に理解するために、イベントまたは活動の少なくとも10時間前に投与される。通常は、組成物はイベントまたは活動の少なくとも24時間前に投与される。プレコンディショニング物質、例えばCpGオリゴヌクレオチドの単回投与の保護効果は一週間以上持続する（例えば最大約10日間、またはそれ以上）。故に、単発のイベント、すなわち、繰り返し起こるイベントではないと予測されるイベント、例えば外科手術などの場合、組成物はイベント開始前、例えばイベントまたは活動の約10時間、または約12時間、または約24時間前に投与され、またの最大でイベント一週間前、また一部の例では最大約10日またはそれ以上前に投与できる。例えばコンタクトスポーツへの度重なる参加など、反復して起こるイベントの場合は、複数回投与が行われ、最終用量（すなわち、イベント直前の投与量）はイベントまたは活動の前（例えば、少なくとも10時間、または最大で約1週間前）に投与される。同様に、アルツハイマー病の場合など、継続するイベントの場合も、例えば一週間間隔などの既定のスケジュールで複数回投与が行われる。代替的には、組成物は、例えばポンプなど（またはその他の静脈内またはくも膜下への）連続性の注入方法に基づいて調製され投与されてもよい。物質（例えばCpGオリゴヌクレオチド）のプレコンディショニング用量の保護効果が、特定の対象の特定の状況において最適になるように、個々の治療計画を、特定の対象のイベントまたは活動に応じてカスタマイズしてもよい。

説明される方法または組成物の正確な詳細を、説明される発明の精神から逸脱することなく変更または改良できることが明らかであろう。以下の実施例は、ある種の特定の特徴および／または態様を例証するために提供される。これらの実施例は、本発明を、説明される特定の特徴または態様に限定するものと解釈されるべきではない。以下に引用される各文献は全ての目的のために、参照することで引用したものとする。

実施例
実施例1：CpGオリゴヌクレオチドを用いたプレコンディショニングは、体外の虚血モデルにおいて神経保護をもたらす
本実施例は、神経細胞の虚血の典型的な体外モデルを提供し、CpGオリゴヌクレオチドを用いたプレコンディショニングが低酸素症から保護することを示す。

体外マウス神経細胞培養：
E−16仔マウス（C57B1／6、Jackson labs）から、Jin et al.,Neruochem.Res.27：1105−1112,2002）で説明されるように皮質神経細胞培養物を作成した。簡単に言うと、大脳皮質を切り出し髄膜、嗅球、大脳基底核、海馬から分離し、大脳皮質を0.05％トリプシンEDTA中で37℃で15分間消化した。細胞を粉砕し、単一の細胞懸濁液を5x10⁵細胞／mlの濃度で培養皿に入れた。細胞を、2％B27、2mMグルタミン酸を含むNeurobasal A培養液（Invitrogen、Carlsbad）中で培養した。細胞特異的マーカーで神経細胞、ミクログリア、星状細胞を染色することにより、神経細胞の濃縮を判定した。

体外神経細胞虚血モデル：
3時間の酸素−グルコース欠乏（OGD）処理の24時間前に、神経細胞の培養物を、1％Glutamaxを添加したNeurobasal−A培養液中で、様々な用量の典型的なCpGオリゴヌクレオチド（配列番号1）で処理した。pH7.4の、0.5mM CaCl₂と5mM MgCl₂を含むPBSと培養液を交換し、次に神経細胞の培養物を、35℃に維持された85％N₂、5％H₂、10％CO₂の空気を含む嫌気性チャンバー（Forma Scientific）に静置することによってOGDを行った。OGD処理（3時間）後、PBSを最小必須培養液（MEM）と交換し、細胞を正常の酸素状態に戻した。同一視野におけるトータルDAPI染色と比較して、二つの異なる視野における二回のプロピジウムイオダイド染色によって神経細胞死の割合を測定した。

図1に示すように、非メチル化CpGモチーフ配列（配列番号1）を含む典型的なオリゴデオキシヌクレオチドは、マウス神経細胞培養物において、酸素−グルコース欠乏に対する神経保護をもたらす。図2に示すように、イミキモドでも同様の結果が得られた。

実施例2：TLR9発現細胞株におけるCpGオリゴヌクレオチドによるNF−κB誘導
本実施例は、トール様受容体の結合および活性化を検出するための典型的なレポーターシステムを提供する。本モデルを用いて、TLR9と結合するCpGオリゴヌクレオチドが受容体を介してシグナル伝達を活性化し、NF−κB活性を誘導することを示す結果が提供される。

ヒト胎児腎細胞株HEK293は、ヒトTLR9をコードする発現核酸およびNFκBレポーターコンストラクト（InvivoGen）を形質導入された。二重形質導入細胞を5μM CpGオリゴヌクレオチド（配列番号1）と18時間インキュベートした。CpGオリゴヌクレオチド（配列番号1）での刺激後、NFκB誘導性レポータープラスミド（pNiFty2−SEAP、InvivoGen）はアルカリホスファターゼを産生し、これを基質の加水分解後熱量測定法で測定した（図3）。

実施例3：体内虚血／再かん流モデルにおける典型的なCpGオリゴヌクレオチドを用いたプレコンディショニング
本実施例は、CpGオリゴヌクレオチドを含む組成物の予防的投与が、マウスの脳梗塞モデルにおいて神経保護性であることを示す。

腹腔内投与
プレコンディショニング物質（人工脳脊髄液（aCSF）中に20μg CpGオリゴヌクレオチド（配列番号1）を含むもの）、またはaCSFのみ（対照）を、下記で説明する中大脳動脈閉塞（MCAO）の前に、規定の時間点で対象のマウスの腹腔内に投与した。

虚血／再かん流モデル
これまでに詳細が説明されているモノフィラメント縫合法（Hill et al.,Brain Res.820：45−54,1999）に従って、プレコンディショニング物質または対照組成物の投与後、成体（〜3ヶ月齢）のオスC57BL／6マウスに対して45分間のMCAOを行った。ハロタン吸入（4％／LのO₂）によってマウスを麻酔し、1.5％／LのO₂で維持した。シリコンコートの8−0モノフィラメントナイロン外科縫合糸で、外頸動脈から内頸動脈を縫い、最終的にMCAと前大脳動脈に入る分岐点を遮断して、中大脳動脈を遮断した。フィラメントを腔内に45分間維持した後除去し、これによって血流を回復した。手術の最中、レーザードップラー流量計（Periflow 5000； Perimed、Sweden）で脳血流（CBF）を監視した。手術の間と手術後2時間、サーモスタットによって制御される加温パッドを用いて体温を37℃で一定に保った。体重をMCAOの前後に測定した。これまでに発表されているように（Hill et al.,Brain Res.820：45−54,1999）、神経学的検査を解剖の前に行う。

運動機能検査
前処理および／または虚血／再かん流後、神経機能の複数の行動的指標を用いて脳梗塞による損傷を評価する。コーナーテストは、梗塞の容積と相関し、梗塞後の回復を明らかにする（Wang et al.,Stroke 35：1732−1737,2004）。このテストは、行き止まりの角に移動した後、マウスが同側を好む（向かっていく）度合いを測定する。評価はこれまでに説明されているように（Zhang et al.,J.Neurosci Method117：207−214、2002）行う。1セッションにつき、各マウスを10回テストする。前肢の機能障害を評価する、フットフォールトテストでは梗塞の大きさを予測できないが、MCAO後の回復（Wang et al.,Stroke35：1732−1737,2004）および神経保護（Gibson and Murphy,J.Cereb.Blood Flow Metab.24：805−813,2004）を反映する。高い位置においたワイヤグリッド上を歩く間のマウスのつまづきを評価する。データ（フットフォールト）は、歩いた歩数の合計の割合として表される（Zhang et al.,J.Neurosci Methods117：207−214、2002）。体性感覚機能を調べる触知性粘着紙除去試験を、（Lindner et al.,J.Neurosci.23：10913−10922、2003）で説明されるように実施する。簡潔に言うと、小さい粘着紙を、それぞれの前肢の遠位部分に取り付け、口で紙を取り除くのに要する時間を測定する（1セッションにつき、1分間隔で3回施行）。さらに、その他のマウスの行動の標準的指標を用いて神経学的症状についてマウスを評価した。

梗塞の算定
MCAO後、イソフルレンでマウスを麻酔し、ヘパリン化緩衝液で血液中の細胞を除去するためにかん流を行った（Ford et al.,J.Immunol.154：4309−4321,1995）。かん流脳を組織スライサーに設置し、冠状断面で1mmの厚さで切り出した。梗塞部位を可視化するために、0.9％リン酸緩衝生理食塩水中の1.5％の2,3,4,塩化トリフェニルテトラゾリウム（TTC）で切片を染色した（Bederson et al.,Stroke17：1304−1308,1986）。浮腫の測定アーチファクトを除外するために、これまでに説明されている原則に従って（Swanson et al.,J.Cereb.Blood Flow Metab.10：290−293,1990）、コンピュータ処理画像分析システムを用いて梗塞の大きさを決定した。図4でグラフを使って示すように、梗塞の割合は典型的なCpGオリゴヌクレオチドのプレコンディショニング用量で処理したマウスで著しく低下した。

プレコンディショニングの時間経過
MCAOの前に20μg CpGオリゴヌクレオチドを間隔を置いて投与し、上述のようにMCAO後の梗塞の割合を評価することで、CpGオリゴヌクレオチド投与のプレコンディショニング効果に関する時間経過を測定した。MCAOの前72時間〜24時間での投与後に、プレコンディショニングのピークは観察されたものの、実験的に誘導された虚血の最大1週間前にCpGオリゴヌクレオチドのプレコンディショニング用量投与された場合に著しいプレコンディショニングが観察された（図5）。

実施例4：体内虚血／再かん流モデルにおけるイミキモドを用いたプレコンディショニング
本実施例は、TLR7／8結合物質であるイミキモドの予防的投与が、マウスの脳梗塞モデルにおいて神経保護性であることを示す。

人工脳脊髄液（aCSF）中のイミキモド（20μg）またはCSFのみ（対照）を、上述のように実施された40分間のMCAOの72時間前に対象マウスの腹腔内に投与した。実施例3に示すように、梗塞の大きさについて脳を分析した。図6は、イミキモドを用いたプレコンディショニングが、脳梗塞の本体内モデルにおいて細胞死から保護することをグラフを用いて示す。

開示される発明の原則を適用しうる多くの可能な態様を考慮して、例証される態様は、本発明の好適な実施例に過ぎず、本発明の範囲を限定するものと考えられるべきではないことを理解するべきである。むしろ、本発明の範囲は以下の特許請求の範囲によって定められる。従って、我々は、これらの特許請求の範囲の範囲と精神に含まれるもの我々の発明の全ての権利を主張する。

典型的なCpGオリゴヌクレオチドを用いる体外治療後の神経保護を表す棒グラフである。値は群平均＋／−標準誤差、＊はP＜0.05である。 イミキモドを用いる体外治療後の神経保護を表す棒グラフである。値は、平均＋／−標準誤差である。 典型的なCpGオリゴヌクレオチドを用いる体外治療後のNF−κB誘導を表す棒グラフである。NFκB誘導レポータープラスミド（pNifty2−SEAP）を形質導入された293−hTLR9細胞をCpG（5μM）で処理した。NFκB誘導によるアルカリホスファターゼの発現は、405nmにおけるpNppの加水分解として示される。 典型的なCpGオリゴヌクレオチドを用いるマウスの体内治療後の神経保護を表す棒グラフである。誘導された脳梗塞の72時間前にCpG処理が行われた。値は群平均＋／−標準誤差、＊はp＜0.05,＊＊はp＜0.001である。 典型的なCpGオリゴヌクレオチドを用いる、体内プレコンディショニング時間経過を表す棒グラフである。CpGの用量は20ug／マウス（0.8mg／kg）。値は群平均＋／−標準誤差、＊＊はp＜0.0001である。 イミキモドを用いる、マウスの治療後の体内神経保護を表す棒グラフである。値は、群平均±標準誤差、（生理食塩水n＝6、イミキモドn＝3）、＊はp＜0.05である。

塩基配列リストの説明
本明細書に、および／または添付の配列リストに記載する核酸およびアミノ酸配列を、37C.F.R.1.822に定められたヌクレオチド塩基の標準的なアルファベットの略号と、アミノ酸の三文字略号を用いて表す。各核酸配列の一方の鎖のみを示すが、提示された鎖を参照する場合は常に、相補鎖が含まれることは理解されるものである。
配列番号1（5'−tccatgacgttcctgacgtt−3'）は、マウスTLR9と結合し、それを活性化する典型的なオリゴヌクレオチドである。
配列番号2（5'−gggggacgatcgtcgggggg−3'）は典型的なクラスAヒトCpGオリゴヌクレオチドである。
配列番号3（5'−tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt−3'）は典型的なクラスBヒトCpGオリゴヌクレオチドである。
配列番号4（5'−tcgtcgtcgttcgaacgacgttgat−3'）は典型的なクラスCヒトCpGオリゴヌクレオチドである。
配列番号5（5'−tgactgtgaacgttcgagatga−3'）は典型的なクラスBヒトCpGオリゴヌクレオチドである。

Claims (51)

1. 対象の細胞を、興奮毒性損傷、虚血および／または低酸素症から保護する方法であって、
   CpGオリゴヌクレオチドまたはイミキモドを含む組成物を前記対象に全身性に投与し、これにより前記細胞を興奮毒性損傷または低酸素症から保護する段階を含む方法。
2. 興奮毒性、虚血性および／または低酸素性イベントの危険性がある対象を選択する段階を含む、請求項1の方法。
3. 前記危険性が、心房細動、一つ以上の一過性の虚血性イベント、脳梗塞、および／または高血圧によって示される、請求項2の方法。
4. 前記危険性が外科的手技によって示される、請求項2の方法。
5. 前記外科的手技が血管の外科的手技である、請求項4の方法。
6. 前記外科的手技が、動脈内膜切除術、肺バイパス術、または冠動脈バイパス術である、請求項5の方法。
7. 興奮毒性、虚血性および／または低酸素性イベントの前にCpGオリゴヌクレオチドを含む前記組成物を投与する段階を含む、請求項1〜6のうちいずれか一項記載の方法。
8. 興奮毒性、虚血性および／または低酸素性イベントの少なくとも10時間前にCpGオリゴヌクレオチドを含む前記組成物を投与する段階を含む、請求項7の方法。
9. CpGオリゴヌクレオチドを含む前記組成物を複数用量投与する段階を含み、最終用量が、興奮毒性、虚血性および／または低酸素性イベントの前の1週間以内に投与される、請求項7の方法。
10. 前記細胞が神経系細胞、筋細胞、肝細胞、腎臓細胞、内皮細胞、または免疫細胞である、請求項1〜9のうちいずれか一項記載の方法。
11. 前記神経系細胞が海馬ニューロンまたは皮質ニューロンである、請求項10の方法。
12. 前記筋細胞が心筋細胞である、請求項10の方法。
13. 前記対象がヒトである、請求項1〜12のうちいずれか一項記載の方法。
14. 前記低酸素症が、子宮内低酸素症または虚血性イベントと関係がある、請求項1〜12のうちいずれか一項記載の方法。
15. 前記虚血性イベントが脳梗塞を含む、請求項14の方法。
16. 前記興奮毒性損傷が、てんかん、外傷性脳損傷、またはアルツハイマー病と関連する、請求項1〜12のうちいずれか一項記載の方法。
17. 前記組成物の投与が、細胞保護性サイトカインの産生の増加をもたらす、請求項1〜12のうちいずれか一項記載の方法。
18. 前記細胞保護性サイトカインが非神経系細胞によって産生される、請求項17の方法。
19. 前記非神経系細胞が、B細胞、樹枝状細胞、マクロファージ、またはミクログリア細胞である、請求項18の方法。
20. 前記細胞保護性サイトカインが、トランスフォーミング成長因子ベータ（TGF−β）、腫瘍壊死因子アルファ（TNFα）、およびI型インターフェロンの少なくとも一つを含む、請求項17の方法。
21. 前記I型インターフェロンがIFN−βである、請求項20の方法。
22. CpGオリゴヌクレオチドを含む前記組成物を対象の鼻腔内に投与する段階を含む、請求項1〜21のうちいずれか一項記載の方法。
23. CpGオリゴヌクレオチドを含む前記組成物を、経皮的に、経口的に、くも膜下に、静脈内に、または腹腔内に、対象に投与する段階を含む、請求項1〜21のうちいずれか一項記載の方法。
24. 前記CpGオリゴヌクレオチドがトール様受容体9（TLR9）を活性化する、請求項1〜23のうちいずれか一項記載の方法。
25. 前記CpGオリゴヌクレオチドが配列5'−tccatgacgttcctgacgtt−3'（配列番号1）を含む、請求項1〜25のうちいずれか一項記載の方法。
26. 前記CpGオリゴヌクレオチドが、配列
    5'−gggggacgatcgtcgggggg−3'（配列番号2）、
    5'−tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt−3'（配列番号3）、
    5'−tcgtcgtcgttcgaacgacgttgat−3'（配列番号4）、または
    5'−tgactgtgaacgttcgagatga−3'（配列番号5）を含む、請求項1〜25のうちいずれか一項記載の方法。
27. 前記CpGオリゴヌクレオチドが、少なくとも一つのホスホロチオエート修飾ヌクレオチドを含む、請求項1〜26のうちいずれか一項記載の方法。
28. プレコンディショニング用量の前記CpGオリゴヌクレオチドを投与する段階を含む、請求項1〜27のうちいずれか一項記載の方法。
29. 少なくとも約0.005mg／kgで約0.5mg／kgを超えない、プレコンディショニング用量の前記CpGオリゴヌクレオチドを投与する段階を含む、請求項28の方法。
30. 少なくとも約0.02mg／kgで約0.2mg／kgを超えない、プレコンディショニング用量の前記CpGオリゴヌクレオチドを投与する段階を含む、請求項28の方法。
31. 興奮毒性損傷、虚血、または低酸素症の予防的治療のための薬剤の調製における、CpGオリゴヌクレオチドの使用。
32. 興奮毒性脳損傷から神経系細胞を保護する方法であって、
    トール様受容体に結合し、それを活性化する物質を、対象に全身性に投与する段階を含み、トール様受容体が中枢神経系または周辺部の少なくとも一つの細胞によって発現され、これにより前記神経系細胞を興奮毒性脳損傷から保護する方法。
33. 興奮毒性イベントの危険性が高い対象を選択する段階を含む、請求項32の方法。
34. 前記神経系細胞が海馬ニューロンまたは皮質ニューロンである、請求項32の方法。
35. 前記興奮毒性脳損傷が、てんかん、外傷性脳損傷、またはアルツハイマー病と関係がある、請求項32〜34のうちいずれか一項記載の方法。
36. 前記物質の投与が、神経保護性サイトカインの産生の増加をもたらす、請求項32〜35のうちいずれか一項記載の方法。
37. 前記物質を興奮毒性イベントの前に投与する段階を含む、請求項32〜36のうちいずれか一項記載の方法。
38. 興奮毒性イベントの危険性がある対象を選択する段階を含む、請求項32〜37のうちいずれか一項記載の方法。
39. トール様受容体に結合し、それを活性化する前記物質が、TLR9に結合し、それを活性化するCpGオリゴヌクレオチドである、請求項32〜38のうちいずれか一項記載の方法。
40. トール様受容体に結合し、それを活性化する前記物質が、TLR7および／またはTLR8に結合し、それらを活性化するイミキモドである、請求項32〜38のうちいずれか一項記載の方法。
41. 虚血から非神経系細胞を保護する方法であって、
    中枢神経系以外の組織の少なくとも一つの細胞によって発現されるトール様受容体に結合する物質を、対象に全身性に投与する段階を含む方法。
42. 虚血の危険性がある対象を選択する段階を含む、請求項41の方法。
43. 前記非神経系細胞が、筋細胞、腎細胞、肝細胞、内皮細胞、または免疫細胞である、請求項41または42の方法。
44. 前記免疫細胞がマクロファージまたはミクログリア細胞である、請求項43の方法。
45. 前記筋細胞が心筋細胞である、請求項43の方法。
46. 前記虚血が外科的手技と関係がある、請求項41〜45のうちいずれか一項記載の方法。
47. 前記外科的手技が冠動脈バイパス手術を含む、請求項46の方法。
48. 前記物質の投与が細胞保護性サイトカインの産生の増加をもたらす、請求項41〜47のうちいずれか一項記載の方法。
49. 虚血性イベントの前に前記物質を投与する段階を含む、請求項41〜48のうちいずれか一項記載の方法。
50. トール様受容体に結合し、それを活性化する前記物質が、TLR9に結合し、それを活性化するCpGオリゴヌクレオチドである、請求項41〜49のうちいずれか一項記載の方法。
51. トール様受容体に結合し、それを活性化する前記物質が、TLR7および／またはTLR8に結合し、それらを活性化するイミキモドである、請求項41〜49のうちいずれか一項記載の方法。

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