BR112020014011A2

BR112020014011A2 - Oligonucleotídeos antissenso dirigidos à alfa-sinucleína e usos dos mesmos

Info

Publication number: BR112020014011A2
Application number: BR112020014011-2A
Authority: BR
Inventors: Richard E. Olson; Marianne Lerbech Jensen; Angela M. CACACE; Jere E. Meredith Jr.; Nino DEVIDZE; James K. Loy; Carl J. BALDICK; Annapurna Pendri; Ivar M. McDonald; Peter Hagedorn
Original assignee: Bristol-Myers Squibb Company; Roche Innovation Center Copenhagen A/S
Priority date: 2018-01-12
Filing date: 2019-01-11
Publication date: 2020-12-08
Also published as: IL275903A; EP3737761A1; CN111819283A; KR20200140240A; EA202091693A1; CA3087966A1; JP2021510511A; PE20211749A1; AU2019208011A1; US20200362347A1; WO2019140236A1; MX2020007439A; CO2020009715A2; SG11202006528XA

Abstract

a presente invenção refere-se a oligonucleotídeos antissenso, que têm como alvo o mrna de snca (por exemplo, em uma junção íntron éxon) em uma célula, levando à expressão reduzida da proteína snca. a redução da expressão da proteína snca é benéfica para o tratamento de certos distúrbios médicos, por exemplo, um distúrbio neurológico.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "OLIGONUCLEOTÍDEOS ANTISSENSO DIRIGIDOS À ALFA- SINUCLEÍNA E USOS DOS MESMOS".

REFERÊNCIA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS ENVIADA ELETRONICAMENTE

[0001] O conteúdo da listagem de sequências enviada eletronicamente (Nome: 3338.109PC01 SequencelListing ST25.txt, Tamanho: 13.817 bytes; e Data de criação: 10 de janeiro de 2019) neste pedido é incorporado no presente documento por referência em sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

[0002] A presente descrição refere-se a compostos oligoméricos antissenso (ASOs) que têm como alvo uma junção íntron éxon do transcrito de alfa-sinucleína (SNCA) em uma célula, levando à expressão reduzida da proteína alfa-sinucleína (SNCA). A redução da expressão da proteína SNCA pode ser benéfica para uma variedade de distúrbios médicos, tal como atrofia de múltiplos sistemas, doença de Parkinson, Demência da Doença de Parkinson (PDD), e demência com corpos de Lewy.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0003] A alfa-sinucleína (SNCA), um membro da família das proteínas sinucleína, é uma pequena proteína solúvel que é expressa principalmente nos tecidos neurais. Ver Marques O e outros, Cell Death Dis. 19: e350 (2012). Ela é expressa em muitos tipos de células, mas está predominantemente localizada nos terminais pré-sinápticos dos neurônios. Embora a função precisa ainda não esteja totalmente elucidada, sugeriu-se que SNCA desempenhe um papel importante na regulação da transmissão sináptica. Por exemplo, SNCA funciona como uma chaperona molecular na formação de complexos SNARE, que medeiam o ancoramento de vesículas sinápticas com as membranas pré-sinápticas dos neurônios. SNCA também pode interagir com outras proteínas, como a proteína tau associada aos microtúbulos, que ajuda a estabilizar os microtúbulos e a regular o tráfego de vesículas.

[0004] Devido ao papel da SNCA na regulação da transmissão sináptica, alterações na expressão e / ou na função de SNCA podem romper processos biológicos cruciais. Acredita-se que tais rupturas contribuam para as o-sinucleinopatias, que são doenças neurodegenerativas — caracterizadas pelo acúmulo anormal de agregados de proteína SNCA no cérebro. Consequentemente, inclusões insolúveis de proteína SNCA desdobrada, agregada e fosforilada são uma marca patológica para doenças como a doença de Parkinson (PD), demência da doença de Parkinson (PDD), demência com corpos de Lewy (DLB) e atrofia de múltiplos sistemas (MSA). Ver Galvin JE e outros, Archives of Neurology 58: 186 a 190 (2001); e Valera E e outros, J. Neurochem 139 Suppl 1: 346 a 352 (outubro de 2016).

[0005] As a-sinucleinopatias, tal como a doença de Parkinson, são distúrbios cerebrais neurodegenerativos progressivos altamente prevalentes, especialmente entre os idosos. Ver Recchia A e outros, FASEB J. 18: 617-26 (2004). Estima-se que aproximadamente sete a dez milhões de pessoas em todo o mundo estejam vivendo com esses distúrbios, com cerca de 60.000 novos casos por ano apenas nos Estados Unidos. Os custos de medicamentos para uma pessoa podem facilmente exceder US $ 2.500 por ano e a cirurgia terapêutica pode custar até US $ 100.000 por paciente. Portanto, são necessárias opções de tratamento mais robustas e econômicas.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0006] A presente descrição é direcionada a um oligonucleotídeo antissenso (ASO) compreendendo uma sequência de nucleotídeos contígua de 10 a 30 nucleotídeos de comprimento que são complementares a uma sequência de ácido nucleico dentro de um transcrito de alfa-sinucleína (SNCA), em que a sequência de ácido nucleico compreende os nucleotídeos 7592 - 7637 da SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a sequência de ácido nucleico compreende os nucleotídeos 7602 - 7627 da SEQ ID NO: 1. Em outras modalidades, a sequência de ácidos nucleicos corresponde aos nucleotídeos 7603- 7620 da SEQ ID NO: 1. Em certas modalidades, a sequência de ácido nucleico corresponde aos nucleotídeos 7604 - 7620 da SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o transcrito de SNCA compreende a SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a sequência de nucleotídeos contígua compreende SEQ ID NO: 4 a SEQ ID NO: 21 com uma, duas, três ou quatro incompatibilidades. Em outras modalidades, a sequência de nucleotídeos contígua compreende SEQ ID NO: 4 a SEQ ID NO: 21. Em certas modalidades, a sequência de nucleotídeos contígua compreende SEQ ID NO: 15 ou SEQ ID NO: 7.

[0007] Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo antissenso da presente descrição é capaz de inibir a expressão do transcrito de SNCA humano em uma célula que está expressando o transcrito de SNCA humano.

[0008] Em algumas modalidades, a sequência de nucleotídeos contígua compreende pelo menos um análogo de nucleotídeo. Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo antissenso é um "gapmer". Em outras modalidades, o oligonucleotídeo antissenso é um "gapmer" de flanco alternado.

[0009] Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo antissenso, como no presente documento descrito, compreende a fórmula de 5"-A- B-C-3', em que (i) a região B é uma sequência contígua de pelo menos 6 unidades de DNA, capazes de recrutar RNase; (ii) a região A é uma primeira sequência de asa de 1 a 10 nucleotídeos, em que a primeira sequência de asa compreende um ou mais análogos de nucleotídeos e, opcionalmente, uma ou mais unidades de DNA e em que pelo menos um dos análogos de nucleotídeos está localizado na extremidade 3' de A; e (iii) a região C é uma segunda sequência de asa de 1 a 10 nucleotídeos, em que a segunda sequência de asa compreende um ou mais análogos de nucleotídeos e, opcionalmente, uma ou mais unidades de DNA e em que pelo menos um dos análogos de nucleotídeos está localizado na extremidade 5' de C.

[0010] Em algumas modalidades, a região A compreende uma combinação de análogos de nucleotídeos e unidade de DNA selecionados a partir de (i) 1 a 10 análogos de nucleotídeos e O unidade de DNA; (ii) 1 a 9 análogos de nucleotídeos e 1 unidade de DNA; (iii) 1 a 8 análogos de nucleotídeos e 1 a 2 unidades de DNA; (iv) 1 a 7 análogos de nucleotídeos e 1 a 3 unidades de DNA; (v) 1 a 6 análogos de nucleotídeos e 1 a 4 unidades de DNA; (vi) 1 a 5 análogos de nucleotídeos e 1 a 5 unidades de DNA; (vii) 1 a 4 análogos de nucleotídeos e 1 a 6 unidades de DNA; (viii) 1 a 3 análogos de nucleotídeos e 1 a 7 unidades de DNA; (ix) 1 a 2 análogos de nucleotídeos e 1 a 8 unidades de DNA; e (x) 1 análogo de nucleotídeo e 1 a 9 unidades de DNA. Em algumas modalidades, a região C compreende uma combinação de análogos de nucleotídeos e unidades de DNA selecionados a partir de (i) 1 a 10 análogos de nucleotídeos e O unidade de DNA; (ii) 1 a 9 análogos de nucleotídeos e 1 unidade de DNA; (iii) 1 a 8 análogos de nucleotídeos e 1 a 2 unidades de DNA; (iv) 1 a 7 análogos de nucleotídeos e 1 a 3 unidades de DNA; (v) 1 a 6 análogos de nucleotídeos e 1 a 4 unidades de DNA; (vi) 1 a 5 análogos de nucleotídeos e 1 a 5 unidades de DNA; (vii) 1 a 4 análogos de nucleotídeos e 1 a 6 unidades de DNA; (viii) 1 a 3 análogos de nucleotídeos e 1 a 7 unidades de DNA; (ix) 1 a 2 análogos de nucleotídeos e 1 a 8 unidades de DNA; e (x) 1 análogo de nucleotídeo e 1 a 9 unidades de DNA. Em algumas modalidades, a região A é um primeiro modelo de asa selecionado a partir de quaisquer ASOs nas

Figuras 2 e 3 e / ou a região C é um segundo modelo de asa selecionado a partir de quaisquer ASOs nas Figuras 2 e 3, em que a letra maiúscula é um análogo de nucleosídeo e a letra minúscula é um DNA.

[0011] Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo antissenso da presente descrição compreende pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove ou pelo menos dez análogos de nucleotídeos. Em certas modalidades, o análogo ou análogos de nucleotídeos são um ou mais nucleosídeos de açúcar modificado selecionados a partir do grupo que consiste de ácido nucleico bloqueado (LNA); 2'-O-alquil-RNA; 2'-amino-DNA; 2'-fluoro-DNA; ácido nucleico arabino (ANA); 2'-fluoro-ANA, ácido nucleico hexitol (HNA), ácido nucleico intercalante (INA), etil nucleosídeo restrito (cEt), 2'-O-metil ácido nucleico (2-OMe), 2'-O-metoxietil ácido nucleico (2-MOE) e qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, o análogo ou análogos de nucleotídeos compreende um açúcar bicíclico. Em certas modalidades, o açúcar bicíclico compreende cEt, 2-O- metoxietil 2',4'-restrito (CMOE), LNA, a-L-LNA, B-D-LNA, ácidos nucleicos em ponte com 2'-0,4"-C-etileno (ENA), amino-LNA, oxi-LNA, ou tio-LNA. Em algumas modalidades, o análogo ou análogos de nucleotídeo compreendem um LNA.

[0012] Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo antissenso compreende uma ou mais nucleobases 5' metil citosina. Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo antissenso compreende dois a cinco LNAs na região 5' do oligonucleotídeo antissenso. Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo antissenso compreende dois a cinco LNAs na região 3' do oligonucleotídeo antissenso.

[0013] Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo antissenso tem uma tolerabilidade in vivo menor ou igual a um escore total de 4, em que o escore total é a soma de um escore unitário de cinco categorias, que são 1) hiperatividade; 2) diminuição da atividade e excitação; 3) disfunção motora e / ou ataxia; 4) postura e respiração anormais; e 5) tremor e / ou convulsões, e em que o escore unitário para cada categoria é medido em uma escala de O a 4. Em certas modalidades, a tolerabilidade in vivo é menor ou igual ao escore total de 3, ao escore total de 2, ao escore total de 1 ou ao escore total de O.

[0014] Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo antissenso reduz a expressão do MRNA de SNCA em uma célula em pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, em pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90% ou cerca de 100% em comparação com uma célula não exposta ao oligonucleotídeo antissenso. Em outras modalidades, o oligonucleotídeo antissenso reduz a expressão da proteína SNCA em uma célula em pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90% ou pelo menos cerca de 95% em comparação com uma célula não exposta ao oligonucleotídeo antissenso.

[0015] Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo antissenso compreende os nucleotídeos A, T, C e G e pelo menos um análogo dos nucleotídeos A, T, C e G, e tem um escore de sequência maior ou igual a 0,2, em que o escore da sequência é calculado pela fórmula |:

[0016] * de nucleotídeos C e seus análogos - % de nucleotídeos G e seus análogos (1) / Comprimento total de nucleotídeos

[0017] Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo antissenso tem de 10 a 24 nucleotídeos de comprimento ou de 14 a 21 nucleotídeos de comprimento. Em outras modalidades, o oligonucleotídeo antissenso tem 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou 21 nucleotídeos de comprimento.

[0018] Em algumas modalidades, a sequência de nucleotídeos do oligonucleotídeo antissenso compreende, consiste essencialmente de,

ou consiste de uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste de SEQ ID NOs: 4 a 21 com um modelo selecionado a partir do grupo que consiste dos desenhos nas Figuras 2 e 3, em que a letra maiúscula é um nucleosídeo de açúcar modificado e a letra minúscula é DNA. Em certas modalidades, a sequência de nucleotídeos compreende, consiste essencialmente de, ou consiste de SEQ ID NO: com o modelo de ASO-005459 e SEQ ID NO: 7 com o modelo de ASO-005578 ou ASO-005584. Em outras modalidades, a sequência de nucleotídeos compreende, consiste essencialmente de, ou consiste de uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste de SEQ ID NOs: 4-21 com a estrutura química correspondente nas Figuras 2 e 3. Em certas modalidades, a sequência de nucleotídeos compreende, consiste essencialmente de, ou consiste de ASO-005459, ASO-005578 e ASO-005584. Em algumas modalidades, o ASO da presente descrição compreende uma fórmula molecular de C171H214N56O90oP16S16. Em algumas modalidades, o ASO compreende uma fórmula molecular de Ci82H229N58O96P17S17. Em outras modalidades, o ASO compreende uma fórmula molecular de C181H227N58O96P17S17.

[0019] Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo antissenso da presente descrição compreende uma ligação internucleosídica selecionada a partir de: uma ligação fosfodiéster, uma ligação fosfotriéster, uma ligação metilfosfonato, uma ligação fosforamidato, uma ligação fosforotioato, e combinações das mesmas. Em certas modalidades, a ligação internucleosídica compreende uma ou mais ligações fosfato modificadas estéreo-definidas.

[0020] A presente descrição também fornece um conjugado compreendendo o oligonucleotídeo antissenso como descrito no presente documento, em que o oligonucleotídeo antissenso é covalentemente ligado a pelo menos uma porção não nucleotídica ou não polinucleotídica. Em algumas modalidades, a porção não nucleotídica ou não polinucleotídica compreende uma proteína, uma cadeia de ácidos graxos, um resíduo de açúcar, uma glicoproteína, um polímero, ou qualquer combinação dos mesmos.

[0021] Também é no presente documento fornecida uma composição farmacêutica “compreendendo o oligonucleotídeo antissenso ou o conjugado, como no presente documento descrito, e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, a composição compreende ainda um agente terapêutico. Em certas modalidades, o agente terapêutico é um antagonista de alfa-sinucleína. Em algumas modalidades, o antagonista de alfa-sinucleína é um anticorpo anti-alfa-sinucleína ou um fragmento do mesmo.

[0022] A presente descrição fornece ainda um kit compreendendo o oligonucleotídeo antissenso, o conjugado, ou a composição, conforme descrito neste documento. Também é descrito um kit de diagnóstico compreendendo o oligonucleotídeo antissenso, o conjugado, ou a composição da presente descrição.

[0023] A presente descrição também é direcionada ao método para inibir ou reduzir a expressão da proteína SNCA em uma célula, o método compreendendo administrar o oligonucleotídeo antissenso, o conjugado, ou a composição conforme descrito no presente documento para a célula que expressa a proteína SNCA, em que a expressão da proteína SNCA na célula é inibida ou reduzida após a administração. Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo antissenso inibe ou reduz a expressão do mRNA de SNCA na célula após a administração. Em certas modalidades, a expressão do MRNA de SNCA é reduzida em pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, ou cerca de 100% após a administração em comparação com uma célula não exposta ao oligonucleotídeo antissenso. Em outras modalidades, o oligonucleotídeo antissenso reduz a expressão da proteína SNCA na célula após a administração em pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80% ou pelo menos cerca de 90% em comparação com uma célula não exposta ao oligonucleotídeo antissenso. Em algumas modalidades, a célula é um neurônio.

[0024] É no presente documento fornecido um método para tratar uma sinucleinopatia em um indivíduo em necessidade de tratamento, compreendendo administrar uma quantidade eficaz do oligonucleotídeo antissenso, do conjugado, ou da composição da presente descrição. Em algumas modalidades, a sinucleinopatia é selecionada a partir do grupo que consiste de doença de Parkinson, demência da doença de Parkinson (PDD), atrofia de múltiplos sistemas, demência com corpos de Lewy, e quaisquer combinações dos mesmos.

[0025] Também é no presente documento fornecido um uso do oligonucleotídeo antissenso, do conjugado, ou da composição da presente descrição para a fabricação de um medicamento. A presente descrição também fornece o uso do oligonucleotídeo antissenso, do conjugado, ou da composição para a fabricação de um medicamento para o tratamento de uma sinucleinopatia em um indivíduo em necessidade de tratamento. Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo antissenso, o conjugado, ou a composição da presente descrição é para uso na terapia de uma sinucleinopatia em um indivíduo em necessidade de tratamento. Em outras modalidades, o oligonucleotídeo antissenso, o conjugado, ou a composição da presente descrição é para uso em terapia.

[0026] Em algumas modalidades, o sujeito é um humano. Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo antissenso, o conjugado, ou a composição é administrada por via oral, parentérica, intratecal, intra- cerebroventricular, pulmonar, tópica ou intraventricular.

[0027] Em algumas modalidades, o análogo de nucleotídeo compreende um nucleosídeo de açúcar modificado. Em algumas modalidades, o nucleosídeo de açúcar modificado é um nucleosídeo de açúcar modificado que aumenta a afinidade.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0028] As Figuras 1A, 1B e 1C mostram sequências genômicas (parciais) de alfa-sinucleína, MRNA e proteína. A sequência na Figura 1A representa uma sequência genômica de SNCA parcial (isto é, resíduos 6001 a 8400 da SEQ ID NO: 1). A SEQ ID NO: 1 é idêntica a uma sequência de pré-mRNA de SNCA, exceto que o nucleotídeo "t" na SEQ ID NO: 1 é mostrado como "u" na de pré-mRNA. A SEQ ID NO: 2 na Figura 1B representa uma sequência de MRNA de SNCA, exceto que o nucleotídeo "t" na SEQ ID NO: 2 é mostrado como "u" na de MRNA. A Figura 1C mostra a sequência de proteína SNCA (SEQ ID NO: 3).

[0029] A Figura 2 mostra ASOs exemplificativos dirigidos à junção íntron éxon do pré-mRNA de SNCA. Cada coluna da Figura 2 mostra o número de ID de sequência (SEQ ID No.) modelado apenas para a sequência, as posições inicial e final alvo na sequência de pré-mRNA de SNCA, as posições inicial e final alvo na sequência de MRNA de SNCA, o número de modelo (No. DES), a sequência de ASO com um modelo, o número de ASO (ASO No.), e a sequência de ASO com uma estrutura química.

[0030] A Figura 3 mostra ASOs dirigidos à junção íntron éxon do pré-mRNA de SNCA com modificação exemplificativa no modelo da asa. Cada coluna da Figura 3 mostra o número de ID de sequência (SEQ ID No.) modelado apenas para a sequência, as posições inicial e final alvo na sequência de pré-mRNA de SNCA, o número de modelo (No. DES), a sequência de ASO com um modelo, o número de ASO (ASO No.), e a sequência de ASO com uma estrutura química e modificação do modelo de asa identificadas. DES-316392, DES- 316393, DES-316394 e DES-316395 mostram vários modelos de ASO possíveis para SEQ ID NO: 7. DES-287031, DES-287957, DES-287959, DES-287962, DES-288906 e DES -313413 mostram vários modelos de ASO possíveis para SEQ ID NO: 12. DES-319536, DES-319537, DES- 325058, DES-325059, DES-325060, DES-325061, DES-325062, DES- 325063, DES-325064, DES-325065, DES-325066, DES-325067, DES- 325068 e DES-325069 mostram vários modelos de ASO possíveis para SEQ ID NO: 14. DES-324636, DES-324637, DES-324638, DES- 324639, DES- 324640, DES-324641, DES-324642, DES-324643, DES- 324644, DES-324645, DES-324646 e DES324647 mostram vários modelos de ASO possíveis para SEQ ID NO: 15. Para os modelos de ASO, as letras maiúsculas indicam análogos de nucleotídeo (por exemplo, LNA ou 2'-O-metil (OMe)), e as letras minúsculas indicam DNAs. As letras maiúsculas com ou sem sublinhado indicam que as duas letras podem ser análogos de nucleotídeo diferentes, por exemplo, LNA e 2'-O-metil. Por exemplo, as letras maiúsculas sublinhadas podem ser 2'-O-metil enquanto as letras maiúsculas sem sublinhados são LNA. Nos ASOs com coluna de estrutura química, OMe é o nucleotídeo 2'-O- metil, L é LNA, D é DNA, e os números seguidos por L ou D significam o número de LNAs ou DNAs.

[0031] A Figura 4 mostra a redução percentual da expressão da proteína SNCA em uma linhagem de células de neuroblastoma humano SK-N-BE(2) ("células SK") e neurônios primários isolados de camundongos transgênicos ASST-PAC ("neurônios PAC") após cultura in vitro com vários ASOs como descrito no Exemplo 2A para neurônios PAC e Exemplo 2E para células SK. Para as células SK, as células foram tratadas com 25 uM de ASO e a expressão de mMRNA de SNCA (normalizada para GAPDH) é mostrada como uma porcentagem do controle. Para os neurônios PAC, as células foram tratadas com 40 nM ou 5 uM de ASO e a expressão da proteína SNCA (normalizada para tubulina) é mostrada como porcentagem de inibição. Quando nenhum valor é fornecido, o ASO particular não foi testado sob as condições particulares.

[0032] A Figura 5 mostra a potência dos vários ASOs na redução da expressão da proteína SNCA em neurônios primários isolados a partir de camundongos transgênicos AS3T-PAC in vitro. Como descrito no Exemplo 2A, os neurônios PAC foram cultivados in vitro com uma titulação de 10 pontos dos diferentes ASOs e a potência (IC5o) dos ASOs é mostrada como uma razão de expressão de SNCA para expressão de tubulina (UM).

[0033] A Figura 6 mostra o escore de tolerabilidade ("Tox Score") e a porcentagem de redução (ou Kknockdown, "KD") da expressão de MRNA de SNCA e da proteína SNCA em camundongos transgênicos AS3ST-PAC tratados com ASO ou WT (de ocorrência natural) (consultar o Exemplo 4). Os escores de tolerabilidade são fornecidos nos dias 1 (1D) e 28 (28D) após a administração de ASO. A porcentagem de redução na expressão do mRNA de SNCA e da proteína SNCA é mostrada nos dias 3 e 28 após a administração de ASO no hipocampo (Hippo), tronco encefálico (BS), e estriado (Str).

[0034] As Figuras 7A e 7B mostram o efeito de ASO-005459 na expressão de proteínas SNCA e tubulina (Tub) em neurônios primários isolados de camundongos transgênicos AS3T-PAC. Os neurônios foram tratados com uma titulação de 10 pontos de ASO-005459 e as quantidades de SNCA e proteína tubulina foram medidas. A porcentagem de inibição da relação a-Syn / Tub (Figura 7A) e os níveis de Tub (Figura 7B) são mostrados. Cada ponto de dados representa uma replicação individual.

[0035] A Figura 8 mostra o efeito de ASO-005459 no nível de expressão de mMRNAs de SNCA (círculo), de proteína S (alfa) (PROS1

(quadrado)) e de tubulina (TUBB3 (triângulo)) nos neurônios humanos. Os neurônios foram tratados com várias concentrações de ASO-005459 por 6 dias e, em seguida, os níveis de MRNA foram medidos pelo ensaio QUANTIGENEPO. O nível de expressão dos mMRNAs é mostrado como uma porcentagem do controle. Os dados mostrados representam a média + SD de determinações duplicadas.

[0036] A Figura 9 mostra os níveis de expressão de mRNA de SNCA no hipocampo de camundongos AS53T-PAC três dias após a administração ICV de 100 ug de ASO-005459 (quadrado aberto) ou veículo de controle (círculo fechado). Os níveis de expressão de MRNA de SNCA foram medidos por gRT-PCR, normalizados para MRNA de GAPDH, e depois expressos em relação ao nível de expressão médio do grupo de veículo. A linha horizontal marca o valor de referência de 1 (isto é, valor no qual a expressão de mMRNA de SNCA seria equivalente ao nível de expressão observado no grupo de veículo de controle). Os dados mostrados representam a média + SD da determinação duplicada. As estatísticas mostradas são baseadas em ANOVA de 1 via com o pós-teste de Dunnett. *** p < 0,001.

[0037] As Figuras 10A e 10B mostram uma comparação do peso corporal médio de camundongos tratados com ASO-005459. Na Figura 10A, os camundongos AS3T-PAC foram doseados com 3,13 ug, 12,5 ug, 25 ug ou 50 ug de ASO-005459 e seus pesos corporais medidos nas semanas O, 1 e 2 após o tratamento. Na Figura 10B, os camundongos C57BL/6 foram doseados com 100 ug de ASO-005459 e o peso corporal dos animais foi medido uma vez por semana durante um período de 28 dias. Em ambas as Figuras 10A e 10B, os animais que receberam o veículo de controle foram usados como controles. Os dados mostrados representam a média + SD de vários animais (n = 5). As estatísticas mostradas são baseadas em ANOVA de duas vias.

[0038] As Figuras 11A, 11B e 11C mostram os níveis de expressão de mRNA de SNCA no hipocampo (Figura 11A), tronco encefálico (Figura 11B) e estriado (Figura 11C) de camundongos AS3T-PAC 14 dias após a administração ICV de ASO-005459 (3,13 ug, 12,5 ug, 25 pg ou 50 ug) ou o veículo de controle. Os níveis de MRNA de SNCA foram medidos por gRT-PCR, normalizados para MRNA de GAPDH e depois expressos em relação à média do grupo de veículo. Os dados mostrados representam a média + SD de vários animais (n = 5). Cada círculo representa um animal individual. A linha horizontal marca o valor de referência de 1 (isto é, valor no qual a expressão de MRNA de SNCA seria equivalente ao nível de expressão observado no grupo de veículo de controle). As estatísticas mostradas são baseadas em ANOVA de 1 via com o pós-teste de Dunnett. *** p < 0,001.

[0039] A Figura 12 mostra o nível de ASO-005459 detectado no hipocampo (preto), tronco encefálico (cinza claro) e estriado (cinza escuro) de camundongos AS3ST-PAC 14 dias após o tratamento com ASO-005459. Os camundongos receberam 3,13 ug, 12,5 ug, 25 ug ou 50 ug de ASO-005459 via administração ICV. Os dados mostrados representam a média + SD de vários animais (n = 5).

[0040] As Figuras 13A, 13B, 13C e 13D mostram a relação entre os níveis de exposição de ASO-005459 e a expressão de MRNA de SNCA no hipocampo (Figura 13A), tronco encefálico (Figura 13B) e estriado (Figura 13C) de camundongos A53T-PAC quatorze dias após o tratamento com ASO-005459. A Figura 13D mostra os dados do hipocampo (círculo), tronco encefálico (quadrado) e estriado (triângulo) em combinação. Cada ponto de dados representa um animal individual. Um ajuste não linear de quatro parâmetros é mostrado para o hipocampo (Figura 13A) e para o tronco encefálico (Figura 13B).

[0041] As Figuras 14A e 14B mostram a curva de dose - resposta do efeito de ASO-005459 no nível de expressão de MRNA de SNCA em camundongos AS53T-PAC. Os animais receberam (via injeção ICV) 12,5 ug (círculo), 25 ug (caixa) ou 50 ug (triângulo) de ASO-005459 e foram sacrificados às 24 horas, 3 dias, 4, 8, 12, 16 e 20 semanas após a administração. Os níveis de expressão de MRNA de SNCA no tronco encefálico (Figura 14A) e no estriado (Figura 14B) foram avaliados por qgRT-PCR e depois normalizados para o veículo de controle. Os dados médios são mostrados. A linha horizontal marca o valor de referência de 100% (isto é, valor no qual a expressão de mMRNA de SNCA seria equivalente ao nível de expressão observado no grupo de veículo de controle).

[0042] As Figuras 15A e 15B mostram o efeito de ASO-005459 no nível de expressão de MRNA de SNCA em camundongos ASST-PAC após 4 semanas após a administração de ASO-005459. Os animais receberam o veículo de controle ou concentrações variáveis de ASO- 005459 (12,5, 25 ou 50 ug). O nível de expressão relativo de MRNA de SNCA (normalizado para o veículo de controle) é mostrado para o tronco encefálico (Figura 15A) e o estriado (Figura 15B). Cada ponto de dados representa um animal individual. A média + SD de vários animais também é mostrada. As estatísticas mostradas são baseadas na comparação com o grupo de veículo usando ANOVA de 1 via com correção de Dunnett para múltiplas comparações. A linha horizontal marca o valor de referência de 1 (isto é, valor no qual a expressão de MRNA de SNCA seria equivalente ao nível de expressão observado no grupo de veículo de controle). * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001.

[0043] As Figuras 16A e 16B mostram a curva de dose - resposta do efeito de ASO-005459 no nível de expressão da proteína SNCA nos tecidos cerebrais de camundongos AS53T-PAC. Os animais receberam (via injeção ICV) 12,5 ug (círculo), 25 ug (caixa) ou 50 ug (triângulo) de ASO-005459 e foram sacrificados às 24 horas, 3 dias, 4, 8, 12, 16 e 20 semanas após a dosagem. Os níveis de proteína SNCA foram medidos tanto no tronco encefálico (Figura 16A) quanto no estriado (Figura 16B) por ELISA e depois normalizados para o veículo de controle. Os dados médios são mostrados. A linha horizontal marca o valor de referência de 100% (isto é, valor no qual a expressão de mMRNA de SNCA seria equivalente ao nível de expressão observado no grupo de veículo de controle).

[0044] As Figuras 17A e 17B mostram o efeito de ASO-005459 no nível de expressão da proteína SNCA em camundongos AS53T-PAC 8 semanas após a administração de ASO-005459. Os animais receberam ou o veículo de controle ou concentrações variáveis de ASO-005459 (12,5, 25 ou 50 ug). Os níveis relativos de expressão da proteína SNCA (normalizados para o veículo de controle) são mostrados para o tronco encefálico (Figura 17A) e o estriado (Figura 17B). Cada ponto de dados representa um animal individual. A linha horizontal marca o valor de referência de 100% (isto é, valor no qual a expressão de mMRNA de SNCA seria equivalente ao nível de expressão observado no grupo de veículo de controle). A média + SD de vários animais também é mostrada. As estatísticas mostradas são baseadas na comparação com o grupo de veículos usando ANOVA de 1 via com correção de Dunnett para múltiplas comparações.

[0045] As Figuras 18A e 18B mostram o efeito de ASO-005578 e ASO-005584 no nível de expressão de mMRNA de SNCA nos tecidos cerebrais de macacos cyno. Na Figura 18A, os animais receberam um dos seguintes: veículo de controle (círculo), ASO-005578 (quadrado, 4 mg) ou ASO-005584 (triângulo, 4 mg). Em seguida, os animais foram sacrificados 2 semanas após a administração. Na Figura 18B, os animais receberam o veículo de controle ou ASO-005584 (8 mg por animal) e foram sacrificados 2 semanas (quadrado) e 4 semanas após a administração (triângulo). Em ambas as Figuras 18A e 18B, o nível de expressão de mRNA de SNCA nos seguintes tecidos foi avaliado:

medula (painel superior esquerdo), putâmen - núcleo caudado (painel superior central), ponte (painel superior direito), cerebelo (painel inferior esquerdo), medula espinhal lombar (painel inferior central) e córtex frontal (painel inferior direito). Os níveis de expressão de mRNA de SNCA mostrados nas Figuras 18A e 18B foram normalizados para GAPDH e depois mostrados em relação à média do grupo de controle ("veículo"). Os dados para cada animal e a média são mostrados. A linha horizontal marca o valor de referência de 100% (isto é, valor no qual a expressão de mMRNA de SNCA seria equivalente ao nível de expressão observado no grupo de veículo de controle).

[0046] As Figuras 19A e 19B mostram a cinética dos níveis de expressão de mMRNA de SNCA e de proteína SNCA em macacos cyno após a administração de ASO-005459. Cada um dos animais recebeu ou o veículo de controle ou o ASO-005459 (8 mg) e depois foram sacrificados 24 horas, 3 dias, 2, 4, 8, 13 ou 20 semanas após a dosagem. Em cada momento, os níveis de expressão de mRNA de SNCA (Figura 19A) e da proteína SNCA (Figura 19B) foram avaliados nos seguintes tecidos: medula (painel superior esquerdo), putâmen - núcleo caudado (painel superior central), ponte (painel superior direito), cerebelo (painel inferior esquerdo), medula espinhal lombar (painel central inferior) e córtex frontal (painel inferior direito). Os níveis de expressão são mostrados como uma porcentagem do veículo de controle. Os dados para cada animal e a média são mostrados. A linha horizontal marca o valor de referência de 100% (isto é, valor no qual a expressão de mMRNA de SNCA seria equivalente ao nível de expressão observado no grupo de veículo de controle).

[0047] As Figuras 20A e 20B mostram o nível de expressão relativo (como porcentagem do veículo de controle) para o MRNA de SNCA (Figura 20A) e a proteína SNCA (Figura 20B) em macacos cyno 2 semanas após a administração de ASO-005459. Os animais receberam o veículo de controle ou concentrações variáveis de ASO-005459 (2, 4 ou 8 mg). Os níveis de expressão foram avaliados nos seguintes tecidos: medula (painel superior esquerdo), putâmen - núcleo caudado (painel superior central), ponte (painel superior direito), cerebelo (painel inferior esquerdo), medula espinhal lombar (painel inferior central), e córtex frontal (painel inferior direito). Os níveis de expressão são mostrados como uma porcentagem do veículo de controle. Os dados para cada animal e a média são mostrados. A linha horizontal marca o valor de referência de 100% (isto é, valor no qual a expressão de MRNA de SNCA seria equivalente ao nível de expressão observado no grupo de veículo de controle).

[0048] A Figura 21A mostra a sequência de nucleotídeos contígua de ASO-005459. OxyA, OxyT e Oxy MC são adenina beta D-oxi-LNA, timina beta D-oxi-LNA, e metil-citosiha beta D-oxi-LNA, respectivamente; DNAt, DNAc e DNAa são DNA de timina, DNA de citosina, e DNA de adenina, respectivamente; e s é uma ligação de fosforotioato.

[0049] A Figura 21B mostra a estrutura molecular de ASO-005459 como no presente documento descrito. A estrutura fornecida tem uma fórmula molecular de Ci71H214N56O90P16S16 E cada um de M+ é um contraíon farmaceuticamente aceitável, tal como H*, Na* ou NH,*.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO |. Definições

[0050] Nota-se que o termo "uma" entidade refere-se a uma ou mais dessa entidade; por exemplo, "uma sequência de nucleotídeos", é entendida como representando uma ou mais sequências de nucleotídeos. Como tal, os termos "um" (ou "uma"), "um ou mais" e "pelo menos um" podem ser usados no presente documento de forma intercambiável.

[0051] Além disso, "e / ou", quando usado no presente documento,

deve ser tomado como descrição específica de cada um dos dois recursos ou componentes especificados, com ou sem o outro. Assim, o termo "e / ou", conforme usado em uma frase tal como "A e / ou B" neste documento, é destinado a incluir "A e B", "A ou B", "A" (isoladamente) e "B" (isoladamente). Da mesma forma, o termo "e / ou" usado em uma frase tal como "A, B e / ou C" é destinado a abranger cada um dos seguintes aspectos: A, B e C; A, Bou C; Aou C; Aou B BouC;AeC; AeB;BecC;A (isoladamente); B (isoladamente); e C (isoladamente).

[0052] Entende-se que sempre que aspectos são no presente documento descritos com a linguagem "compreendendo", também são fornecidos aspectos análogos descritos em termos de "consistindo de" e / ou "consistindo essencialmente de".

[0053] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos no presente documento utilizados têm o mesmo significado que geralmente entendido por um versado na técnica à qual esta descrição está relacionada. Por exemplo, o Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2º ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3º ed., 1999, Academic Press; e Oxford Dictionary of Biochemistry And Molecular Biology, Revisado, 2000, Oxford University Press, fornece a um versado na técnica um dicionário geral de muitos dos termos usados nesta descrição.

[0054] As unidades, prefixos e símbolos são indicados em usa forma aceita por Systême International de Unites (SI). Intervalos numéricos incluem os números que definem o intervalo. A menos que indicado ao contrário, as sequências de nucleotídeos são escritas da esquerda para a direita na orientação 5' para 3. As sequências de aminoácidos são escritas da esquerda para a direita na orientação amino para carbóxi. Os títulos no presente documento fornecidos não são limitações dos vários aspectos da descrição, que podem ser observados por referência à especificação como um todo. Consequentemente, os termos definidos imediatamente abaixo são mais completamente definidos por referência à especificação em sua totalidade.

[0055] O termo "cerca de" é usado no presente documento para significar aproximadamente, em torno de, ou nas regiões de. Quando o termo "cerca de" é usado em conjunto com um intervalo numérico, ele modifica esse intervalo estendendo os limites acima e abaixo dos valores numéricos estabelecidos. Em geral, o termo "cerca de" pode modificar um valor numérico acima e abaixo do valor declarado por uma variação de, por exemplo, 10%, para cima ou para baixo (maior ou menor). Por exemplo, se for declarado que "o ASO reduz a expressão da proteína SNCA em uma célula após a administração do ASO em pelo menos cerca de 60%", está implícito que os níveis de SNCA são reduzidos em um intervalo de 50% a 70%.

[0056] O termo "oligonucleotídeo antissenso" (ASO) refere-se a um oligômero ou polímero de nucleosídeos, tal como nucleosídeos de ocorrência natural ou formas modificadas dos mesmos, que são covalentemente ligados entre si por meio de ligações internucleotídicas. O ASO útil para a descrição inclui pelo menos um nucleosídeo de ocorrência não natural. Um ASO é complementar a um ácido nucleico alvo, de modo que o ASO hibridiza com a sequência de ácido nucleico alvo. Os termos "ASO antissenso", "ASO" e "oligômero", conforme no presente documento utilizados, são intercambiáveis com o termo "ASO".

[0057] O termo "ácidos nucleicos" ou "nucleotídeos" é destinado a abranger ácidos nucleicos plurais. Em algumas modalidades, o termo "ácidos nucleicos" ou "nucleotídeos" refere-se a uma sequência alvo, por exemplo, pré-mRNAs, mRNAs ou DNAs in vivo ou in vitro. Quando o termo se refere aos ácidos nucleicos ou nucleotídeos em uma sequência alvo, os ácidos nucleicos ou nucleotídeos podem ser sequências que ocorrem naturalmente dentro de uma célula. Em outras modalidades, "ácidos nucleicos" ou "nucleotídeos" se referem a uma sequência nos ASOs da descrição. Quando o termo se refere a uma sequência nos ASOs, os ácidos nucleicos ou nucleotídeos não ocorrem naturalmente, isto é, são quimicamente sintetizados, produzidos enzimaticamente, produzidos recombinantemente, ou qualquer combinação dos mesmos. Em uma modalidade, os ácidos nucleicos ou nucleotídeos nos —ASOs são produzidos sintética ou recombinantemente, mas não são uma sequência que ocorre naturalmente ou um fragmento da mesma. Em outra modalidade, os ácidos nucleicos ou nucleotídeos nos ASOs não ocorrem naturalmente porque contêm pelo menos um análogo de nucleotídeo que não ocorre naturalmente na natureza. O termo "ácido nucleico" ou "nucleosídeo" refere-se a um único segmento de ácido nucleico, por exemplo, um DNA, um RNA ou um análogo do mesmo, presente em um polinucleotídeo. "Ácido nucleico" ou "nucleosídeo" inclui ácidos nucleicos de ocorrência natural ou ácidos nucleicos de ocorrência não natural. Em algumas modalidades, os termos "nucleotídeo", "unidade" e "monômero" são usados de forma intercambiável. Será reconhecido que, quando se refere a uma sequência de nucleotídeos ou monômeros, o que é referido é a sequência de bases, tal como A, T, G, CouU, e seus análogos.

[0058] O termo "nucleotídeo", conforme usado no presente documento, refere-se a um glicosídeo compreendendo uma porção de açúcar, uma porção de base e um grupo covalentemente ligado (grupo de ligação), tal como um grupo de ligação internucleotídica fosfato ou fosforotioato, e abrange tanto os nucleotídeos de ocorrência natural, tal como DNA ou RNA, quanto os nucleotídeos de ocorrência não natural compreendendo açúcar e / ou base modificados, que também são no presente documento chamados de "análogos de nucleotídeos". No presente documento, um único nucleotídeo (unidade) também pode ser chamado de uma unidade de monômero ou ácido nucleico. Em certas modalidades, o termo "análogos de nucleotídeos" refere-se a nucleotídeos que têm porções de açúcar modificadas. Exemplos não limitantes dos nucleotídeos que têm porções de açúcar modificadas (por exemplo, LNA) são descritos em outras partes deste documento. Em outras modalidades, o termo "análogos de nucleotídeos" refere-se a nucleotídeos que têm porções de nucleobases modificadas. Os nucleotídeos que têm porções de nucleobases modificadas incluem, mas não estão limitados a 5-metilcitosinay isocitosina, pseudoisocitosina, 5-bromouracila, 5-propiniluracila, 6-aminopurina, 2- aminopurina, inosina, diaminopurina, e 2-cloro-6-aminopurina.

[0059] O termo "nucleosídeo", conforme no presente documento utilizado, é usado para se referir a um glicosídeo compreendendo uma porção de açúcar e uma porção de base, que pode ser ligada covalentemente pelas ligações internucleotídicas entre os nucleosídeos do ASO. No campo da biotecnologia, o termo "nucleosídeo" é frequentemente usado para se referir a um monômero ou unidade de ácido nucleico. No contexto de um ASO, o termo "nucleosídeo" pode se referir apenas à base, isto é, uma sequência de nucleobases compreendendo citosina (DNA e RNA), guanina (DNA e RNA), adenina (DNA e RNA), timina (DNA) e uracila (RNA), no qual estão implícitas a presença da cadeia principal de açúcar e ligações internucleotídicas. Da mesma forma, particularmente no caso de oligonucleotídeos onde um ou mais dos grupos de ligação internucleotídica são modificados, o termo "nucleotídeo" pode se referir a um "nucleosídeo". Por exemplo, o termo "nucleotídeo" pode ser usado, mesmo quando se especifica a presença ou natureza das ligações entre os nucleosídeos.

[0060] O termo "comprimento de nucleotídeo", conforme no presente documento utilizado, significa o número total de nucleotídeos

(monômeros) em uma determinada sequência. Por exemplo, a sequência de AtTcctttacaccACAC (SEQ ID NO: 15) tem 17 nucleotídeos; assim, o comprimento de nucleotídeos da sequência é 17. O termo "comprimento de nucleotídeos" é, portanto, no presente documento utilizado de forma intercambiável com "número de nucleotídeos".

[0061] Como um versado na técnica reconheceria, o nucleotídeo 5' terminal de um oligonucleotídeo não compreende um grupo de ligação internucleotídica 5, embora possa compreender um grupo terminal 5'.

[0062] Como no presente documento utilizado, uma "região de codificação" ou "sequência de codificação" é uma porção de polinucleotídeo que consiste de códons traduzíveis em aminoácidos. Embora um "códon de parada" (TAG, TGA ou TAA) não seja tipicamente traduzido em um aminoácido, ele pode ser considerado parte de uma região de codificação, mas qualquer sequência de flanqueamento, por exemplo, promotores, sítios de ligação ao ribossomo, terminadores transcricionais, íntrons, regiões não traduzidas ("UTRs") e similares não fazem parte de uma região de codificação. Os limites de uma região de codificação são tipicamente determinados por um códon de partida no terminal 5', que codifica o amino terminal do polipeptídeo resultante, e um códon de parada de tradução no terminal 3', que codifica o carboxil terminal do polipeptídeo resultante.

[0063] O termo "região não codificante”, como no presente documento utilizado, significa uma sequência de nucleotídeos que não é uma região de codificação. Exemplos de regiões não codificantes incluem, mas não estão limitados a, promotores, sítios de ligação ao ribossomo, terminadores transcricionais, íntrons, regiões não traduzidas ("UTRs"), éxons não codificantes e similares. Alguns dos éxons podem ser totalmente ou parte da região não traduzida 5' (5' UTR) ou da região não traduzida 3' (3' UTR) de cada transcrito. As regiões não traduzidas são importantes para a tradução eficiente do transcrito e para controlar a taxa de tradução e a meia-vida do transcrito.

[0064] O termo "região", quando usado no contexto de uma sequência de nucleotídeos, refere-se a uma seção dessa sequência. Por exemplo, a frase "região dentro de uma sequência de nucleotídeos" ou "região dentro do complemento de uma sequência de nucleotídeos" refere-se a uma sequência mais curta do que a sequência de nucleotídeos, mas mais longa do que pelo menos 10 nucleotídeos localizados dentro da sequência de nucleotídeos particular ou do complemento da sequência de nucleotídeos, respectivamente. O termo "subsequência" também pode se referir a uma região de uma sequência de nucleotídeos.

[0065] O termo "à jusante", quando se refere a uma sequência de nucleotídeos, significa que um ácido nucleico ou uma sequência de nucleotídeos está localizado 3' a uma sequência de nucleotídeos de referência. Em certas modalidades, sequências de nucleotídeos à jusante referem-se a sequências que seguem o ponto de partida da transcrição. Por exemplo, o códon de iniciação de tradução de um gene está localizado à jusante do sítio de partida de transcrição.

[0066] O termo "a montante" refere-se a uma sequência de nucleotídeos que está localizada 5' a uma sequência de nucleotídeos de referência.

[0067] A menos que indicado ao contrário, as sequências no presente documento fornecidas são listadas de extremidade 5' (esquerda) à extremidade 3' (direita).

[0068] Como no presente documento utilizado, o termo "região reguladora" refere-se a sequências de nucleotídeos localizadas a montante (sequências não codificantes 5º), dentro, ou à jusante (sequências não codificantes 3') de uma região de codificação, e que influenciam a transcrição, processamento de RNA, estabilidade, ou tradução da região de codificação associada. As regiões reguladoras podem incluir promotores, sequências líderes de tradução, íntrons, sequências de reconhecimento de poliadenilação, sítios de processamento de RNA, locais de ligação de efetores, UTRs, e estruturas de haste - alça. Se uma região de codificação se destina à expressão em uma célula eucariótica, um sinal de poliadenilação e uma sequência de terminação de transcrição estarão geralmente localizados 3' à sequência de codificação.

[0069] O termo "transcrito", conforme usado no presente documento, pode se referir a um transcrito primário que é sintetizado por transcrição de DNA e se torna um RNA mensageiro (mMRNA) após o processamento, isto é, um RNA mensageiro precursor (pré-mRNA), e o próprio MRNA processado. O termo "transcrito" pode ser usado de forma intercambiável com "pré-mRNA" e "mRNA". Depois que as cadeias de DNA são transcritas para transcritos primários, os transcritos primários recém-sintetizados são modificados de várias maneiras para serem convertidos em suas formas funcionais maduras, tal como MRNA, tRNA, rRNA, IncRKNA, miRNA e outros. Assim, o termo "transcrito" pode incluir éxons, íntrons, 5' UTRs, e 3' UTRs.

[0070] O termo "expressão", conforme no presente documento utilizado, refere-se a um processo pelo qual um polinucleotídeo produz um produto gênico, por exemplo, um RNA ou um polipeptídeo. Ele inclui, sem limitação, a transcrição do polinucleotíideo em RNA mensageiro (mMRNA) e a tradução de um mRNA em um polipeptídeo. A expressão produz um "produto gênico". Como no presente documento utilizado, um produto gênico pode ser ou um ácido nucleico, por exemplo, um RNA mensageiro produzido pela transcrição de um gene, ou um polipeptídeo que é traduzido a partir de um transcrito. Os produtos gênicos no presente documento descritos incluem ainda ácidos nucleicos com modificações pós-transcricionaisó, por exemplo,

poliadenilação ou "splicing", ou polipeptídeos com modificações pós- traducionais, por exemplo, metilação, glicosilação, adição de lipídios, associação com outras subunidades de proteínas, ou clivagem proteolítica.

[0071] Os termos "idênticos" ou porcentagem de "identidade" no contexto de dois ou mais ácidos nucleicos se referem a duas ou mais sequências iguais ou com uma porcentagem especificada de nucleotídeos ou resíduos de aminoácidos iguais, quando comparados e alinhados (introdução de lacunas, se necessário) para correspondência máxima, sem considerar nenhuma substituição conservativa de aminoácidos como parte da identidade da sequência. A porcentagem de identidade pode ser medida usando software ou algoritmos de comparação de sequências ou por inspeção visual. São conhecidos na técnica vários algoritmos e softwares que podem ser utilizados para obter alinhamento de sequências de aminoácidos ou nucleotídeos.

[0072] Tal exemplo não limitante de um algoritmo de alinhamento de sequências é o algoritmo descrito por Karlin e outros, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci., 87: 2264 a 2268, como modificado por Karlin e outros, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci., 90: 5873 a 5877, e incorporado nos programas NBLAST e XBLAST (Altschul e outros, 1991, Nucleic Acids Res., 25: 3389 a 3402). Em certas modalidades, o Gapped BLAST pode ser usado como descrito por Altschul e outros, 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389 a 3402. BLAST-2, WU-BLAST-2 (Altschul e outros, 1996, Methods in Enzymology, 266: 460 a 480), ALIGN, ALIGN-2 (Genentech, São Francisco do Sul, Califórnia) ou Megalign (DNASTAR) são programas de software adicionais publicamente disponíveis que podem ser usados para alinhamento de sequências. Em certas modalidades, a porcentagem de identidade entre duas sequências de nucleotídeos é determinada usando o programa GAP no pacote de software GCG (por exemplo, usando uma matriz NWSgapdna.CMP e um peso de lacuna de 40, 50, 60, 70 ou 90 e um peso de comprimento de 1, 2, 3,4, 5 ou 6). Em certas modalidades alternativas, o programa GAP no pacote de software GCG, que incorpora o algoritmo de Needleman e Wunsch (J. Mol. Biol. (48): 444 a 453 (1970)) pode ser usado para determinar a porcentagem de identidade entre duas sequências de aminoácidos (por exemplo, usando uma matriz BLOSUM 62 ou uma matriz PAM250, e um peso de lacuna de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ou 4 e um peso de comprimento de 1, 2, 3, 4, 5). Alternativamente, em certas modalidades, a porcentagem de identidade entre sequências de nucleotídeos ou aminoácidos é determinada usando o algoritmo de Myers e Miller (CABIOS, 4: 11 a 17 (1989)). Por exemplo, a porcentagem de identidade pode ser determinada usando o programa ALIGN (versão 2.0) e usando um PAM120 com tabela de resíduos, uma penalidade para comprimento de lacuna de 12 e uma penalidade para lacuna de 4. Um versado na técnica pode determinar parâmetros apropriados para o alinhamento máximo por software de alinhamento particular. Em certas modalidades, os parâmetros padrão do software de alinhamento são usados.

[0073] Em certas modalidades, a porcentagem de identidade "X" de uma primeira sequência de nucleotídeos para uma segunda sequência de nucleotídeos é calculada como 100 x (Y / Z), em que Y é o número de resíduos de aminoácidos classificados como correspondências idênticas no alinhamento da primeira e da segunda sequência (conforme alinhado por inspeção visual ou um programa de alinhamento de sequências particular) e Z é o número total de resíduos na segunda sequência. Se o comprimento de uma primeira sequência for maior do que da segunda, a porcentagem de identidade da primeira sequência para a segunda sequência será maior do que a porcentagem de identidade da segunda sequência para a primeira sequência.

[0074] Diferentes regiões dentro de uma única sequência de polinucleotídeos alvo que se alihha com uma sequência de polinucleotídeos de referência podem, cada uma, ter sua própria porcentagem de identidade de sequência. Nota-se que o valor percentual da identidade da sequência é arredondado para o décimo mais próximo. Por exemplo, 80,11, 80,12, 80,13 e 80,14 são arredondados para 80,1, enquanto 80,15, 80,16, 80,17, 80,18 e 80,19 são arredondados para 80,2. Observa-se também que o valor do comprimento sempre será um número inteiro.

[0075] Como usado no presente documento, os termos "homólogo" e "homologia" são intercambiáveis com os termos "identidade" e "idêntico".

[0076] O termo "variante que ocorre naturalmente da mesma" refere-se a variantes da sequência de polipeptídeos de SNCA ou sequência de ácido nucleico de SNCA (por exemplo, transcrito) que existem naturalmente dentro do grupo taxonômico definido, tal como mamíferos, tal como camundongos, macacos, e humanos. Tipicamente, quando se referindo a "variantes que ocorrem naturalmente" de um polinucleotídeo, o termo também pode abranger qualquer variante alélica do DNA genômico codificando SNCA que é encontrado na posição cromossômica 17921 por translocação ou duplicação cromossômica, e o RNA, tal como o mMRNA derivado do mesmo. "Variantes de ocorrência natural" também podem incluir variantes derivadas de "splicing" alternativo do mMRNA de SNCA. Quando referenciado a uma sequência de polipeptídeos específica, por exemplo, o termo também inclui formas naturais da proteína, que podem, portanto, ser processadas, por exemplo, por modificações cotraducionais ou pós-traducionais, tal como clivagem de peptídeo sinal, clivagem proteolítica, glicosilação, etc.

[0077] Ao determinar o grau de "complementaridade" entre os ASOs da descrição (ou regiões dos mesmos) e a região alvo do ácido nucleico que codifica a proteína SNCA de mamífero (por exemplo, o gene SNCA), como os no presente documento descritos, o grau de "complementaridade" (também "homologia" ou "identidade") é expresso como a porcentagem de identidade (ou porcentagem de homologia) entre a sequência do ASO (ou região do mesmo) e a sequência da região alvo (ou o complemento inverso da região alvo) que melhor se alinha com ela. A porcentagem é calculada contando o número de bases alinhadas que são idênticas entre as duas sequências, dividindo pelo número total de monômeros contíguos no ASO e multiplicando por 100. Nessa comparação, se existirem lacunas, é preferencial que tais lacunas sejam meramente incompatíveis, em vez de áreas em que o número de monômeros dentro da lacuna difere entre o ASO da descrição e a região alvo.

[0078] O termo "complemento", conforme no presente documento utilizado, indica uma sequência que é complementar a uma sequência de referência. Sabe-se que a complementaridade é o princípio básico da replicação e transcrição de DNA, pois é uma propriedade compartilhada entre duas sequências de DNA ou RNA, de modo que, quando elas estão alinhadas antiparalelas uma à outra, as bases nucleotídicas em cada posição nas sequências serão complementares, assim como olhar no espelho e ver o inverso das coisas. Portanto, por exemplo, o complemento de uma sequência de 5' "ATGC" 3' pode ser escrito como 3' "TACG" 5' ou 58º "GCAT" 3'. Os termos "complemento reverso", "reverso complementar" e "complementaridade reversa", conforme no presente documento utilizados, são intercambiáveis com os termos "complemento", "complementar" e "complementaridade".

[0079] Os termos "correspondente a" e "corresponde a", ao referenciar duas sequências de ácido nucleico ou nucleotídeo separadas, podem ser usados para esclarecer regiões das sequências que correspondem ou são semelhantes entre si com base na homologia e / ou funcionalidade, embora os nucleotídeos das sequências específicas possam ser numerados de maneira diferente. Por exemplo, diferentes isoformas de um transcrito de gene podem ter porções semelhantes ou conservadas de sequências de nucleotídeos cuja numeração pode diferir nas respectivas isoformas com base em "splicing" alternativo e / ou outras modificações. Além disso, é reconhecido diferentes sistemas de numeração podem ser empregados ao caracterizar uma sequência de ácido nucleico ou nucleotídeo (por exemplo, um transcrito de gene e se deve começar a numerar a sequência a partir do códon de início da tradução ou incluir o SUTR). Além disso, é reconhecido que a sequência de ácido nucleico ou nucleotídeos de diferentes variantes de um gene ou transcrito de gene pode variar. Como no presente documento utilizado, no entanto, considera-se que as regiões das variantes que compartilham homologia e / ou funcionalidade de sequência de ácido nucleico ou nucleotídeos "correspondem" uma à outra. Por exemplo, uma sequência de nucleotídeos de um transcrito de SNCA correspondente aos nucleotídeos X a Y da SEQ ID NO: 1 ("sequência de referência") refere- se a uma sequência de transcrito de SNCA (por exemplo, pré-mRNA ou MRNA de SNCA) que tem uma sequência idêntica ou uma sequência semelhante aos nucleotídeos X a Y da SEQ ID NO: 1. Uma pessoa versada na técnica pode identificar os resíduos X e Y correspondentes na sequência de transcrito de SNCA alinhando a sequência de transcrito de SNCA com a SEQ ID NO: 1.

[0080] Os termos "análogo de nucleotídeo correspondente" e "nucleotídeo correspondente" são destinados a indicar que a nucleobase no análogo de nucleotídeo e o nucleotídeo de ocorrência natural têm a mesma capacidade de pareamento ou hibridização. Por exemplo, quando a unidade 2-desoxirribose do nucleotídeo está ligada a uma adenina, o "análogo de nucleotídeo correspondente" contém uma unidade de pentose (diferente da 2-desoxirribose) ligada a uma adenina.

[0081] O termo "Número DES" ou "DES No." como no presente documento utilizado refere-se a um número único dado a uma sequência de nucleotídeos que tem um padrão específico de nucleosídeos (por exemplo, DNA) e análogos de nucleosídeos (por exemplo, LNA). Como no presente documento utilizado, o modelo de um ASO é mostrado por uma combinação de letras maiúsculas e minúsculas. Por exemplo, DES-005459 refere-se a uma sequência ASO de AtTcctttacaccACAC (SEQ ID NO: 15) com um modelo de ASO de LDLDDDDDDDDDLLLL (ou seja, AtTcectttacaccACAC), em que o L (ou seja, letra maiúscula) indica um análogo de nucleosídeo (por exemplo, LNA) e o D (ou seja, letra minúscula) indica um nucleosídeo (por exemplo, DNA).

[0082] O termo "número ASO" ou "ASO No." como usado no presente documento refere-se a um número único dado a uma sequência de nucleotídeos que tem a estrutura química detalhada dos componentes, por exemplo, nucleosídeos (por exemplo, DNA), análogos de nucleosídeos (por exemplo, beta-D-oxi-LNA), nucleobase (por exemplo, A, T, G, C, U ou MC) e estrutura da cadeia principal (por exemplo, fosforotioato ou fosfodiéster). Por exemplo, ASO-005459 refere-se a OxyAs DNAts OxyTs DNAcs DNAcs DNAts DNAts DNAts DNAs DNAcs DNAcs DNAÃas DNAcs DNAcs DNAcs DNAcs OxyAs OxyMCs OxyAs OxyMC.

[0083] "Potência" é normalmente expresso como um valor de ICso ou ECso, em uM, nM ou pM, a menos que indicado ao contrário. À potência também pode ser expressa em termos de porcentagem de inibição. ICso é a concentração inibidora média de uma molécula terapêutica. ECso é a concentração efetiva média de uma molécula terapêutica em relação a um veículo ou controle (por exemplo, solução salina). Em ensaios funcionais, ICso é a concentração de uma molécula terapêutica que reduz uma resposta biológica, por exemplo, transcrição de mRNA ou expressão de proteína, em 50% da resposta biológica que é alcançada pela molécula terapêutica. Em ensaios funcionais, EC5o é a concentração de uma molécula terapêutica que produz 50% da resposta biológica, por exemplo, transcrição de MRNA ou expressão de proteína. ICso ou ECso podem ser calculados por qualquer número de meios conhecidos na técnica.

[0084] Por "sujeito" ou "indivíduo" ou "animal" ou "paciente" ou "mamífero", entende-se qualquer sujeito, particularmente um sujeito mamífero, para quem o diagnóstico, prognóstico ou terapia é desejado. Os sujeitos mamíferos incluem seres humanos, animais domésticos, animais de criação, animais de esportes, e animais de zoológico, incluindo, por exemplo, seres humanos, primatas não humanos, cães, gatos, porquinhos-da-Índia, coelhos, ratos, camundongos, cavalos, gado, ursos, etc.

[0085] O termo "composição farmacêutica" refere-se a uma preparação que é de tal forma a permitir que a atividade biológica do ingrediente ativo seja eficaz e que não contém componentes adicionais que sejam inaceitavelmente tóxicos para um sujeito ao qual a composição seria administrada. Tal composição pode ser estéril.

[0086] Uma "quantidade eficaz" de um ASO, conforme descrito neste documento, é uma quantidade suficiente para realizar um objetivo especificamente declarado. Uma "quantidade eficaz" pode ser determinada empiricamente e de maneira rotineira, em relação ao objetivo declarado.

[0087] Termos como "tratando" ou "tratamento" ou "tratar" ou "aliviando" ou "aliviar" referem-se tanto a (1) medidas terapêuticas que curam, desaceleram, diminuem os sintomas e / ou interrompem a progressão de uma condição ou distúrbio patológico diagnosticado quanto (2) medidas profiláticas ou preventivas que impedem e / ou retardam o desenvolvimento de uma condição ou distúrbio patológico alvo. Assim, aqueles que precisam de tratamento incluem aqueles que já estão com o distúrbio; aqueles propensos a ter o distúrbio; e aqueles em quem o distúrbio deve ser prevenido. Em certas modalidades, um sujeito é "tratado" com sucesso para uma doença ou condição descrita em outro local neste documento, de acordo com os métodos no presente documento fornecidos, se o paciente mostrar, por exemplo, alívio total, parcial ou transiente ou eliminação dos sintomas associados à doença ou distúrbio. Il. Oligonucleotídeos Antissenso

[0088] A presente descrição emprega oligonucleotídeos antissenso para uso na modulação da função de moléculas de ácido nucleico que codificam a-Syn de mamífero, tal como o ácido nucleico de SNCA, por exemplo, transcrito de SNCA, incluindo pré-mRNA de SNCA e mRNA de SNCA, ou variantes de ocorrência natural de tais moléculas de ácido nucleico que codificam a-Syn de mamífero. O termo "ASO", no contexto da presente descrição, refere-se a uma molécula formada por ligação covalente de dois ou mais nucleotídeos (isto é, um oligonucleotídeo).

[0089] O ASO compreende uma sequência de nucleotídeos contígua de cerca de 10 a cerca de 30, tal como 10 a 20, 16 a 20 ou 15 a 25 nucleotídeos de comprimento. Os termos "ASO antissenso”", "oligonucleotídeo antissenso" e "oligômero", conforme no presente documento utilizados, são intercambiáveis com o termo "ASO".

[0090] Uma referência a um SEQ ID No. inclui uma sequência de nucleobases particular, mas não inclui nenhum modelo ou estrutura química completa mostrada na Figura 2 ou 3. Além disso, os ASOs descritos nas Figuras mostram um modelo representativo, mas não estão limitados ao modelo específico mostrado nas Figuras, a menos que de outra forma indicado. No presente documento, um único nucleotídeo (unidade) também pode ser chamado de monômero ou unidade. Quando esta especificação se refere a um número ASO específico, a referência inclui a sequência, o modelo específico do ASO, e a estrutura química. Quando esta especificação se refere a um número DES específico, a referência inclui a sequência e o modelo de ASO específico. Por exemplo, quando uma reivindicação (ou esta especificação) se refere à SEQ ID NO: 15, ela inclui a sequência de nucleotídeos apenas de attcctttacaccacac. Quando uma reivindicação (ou a especificação) se refere a DES-005459, ela inclui a sequência de nucleotídeos de attcctttacaccacac com o modelo de ASO mostrado nas Figuras (ou seja, AtTcctttacaccACAC). Alternativamente, o modelo de ASO-005459 também pode ser escrito como SEQ ID NO: 15, em que cada um do primeiro nucleotídeo, do terceiro nucleotídeo e dos 14º ao 17º nucleotídeo da extremidade 5' é um nucleotídeo modificado, por exemplo, LNA, e cada um dos outros nucleotídeos é um nucleotídeo não modificado (por exemplo, DNA). O número ASO inclui a sequência e o modelo do ASO, bem como os detalhes específicos do ASO. Portanto, o ASO-005459 citado neste pedido indica OxyAs DNAts OxyTs DNAcs DNAcs DNAts DNAts DNAs DNAcs DNAas DNAcs DNAcs DNAcs DNAcs DNAcs DNAycs DNAy OxyAs OxyMCs OxyAs OxyMC, em que "Ss" indica uma ligação de fosforotioato.

[0091] Em várias modalidades, o ASO da descrição não compreende RNA (unidades) Em algumas modalidades, o ASO compreende uma ou mais unidades de DNA. Em uma modalidade, o ASO de acordo com a descrição é uma molécula linear ou é sintetizado como uma molécula linear. Em algumas modalidades, o ASO é uma molécula de fita simples e não compreende regiões curtas, por exemplo, de pelo menos 3, 4 ou 5 nucleotídeos contíguos, que são complementares a regiões equivalentes dentro do mesmo ASO (isto é, duplexes) - neste aspecto, o ASO não é (essencialmente) de fita dupla. Em algumas modalidades, o ASO não é essencialmente de fita dupla. Em algumas modalidades, o ASO não é um siRNA. Em várias modalidades, o ASO da descrição pode consistir inteiramente da região nucleotídica contígua. Assim, em algumas modalidades, o ASO não é substancialmente autocomplementar.

[0092] Em uma modalidade, o ASO da descrição pode estar na forma de quaisquer sais farmaceuticamente aceitáveis. O termo "sais farmaceuticamente aceitáveis", tal como no presente documento utilizado, refere-se a derivados dos ASOs da descrição em que o ASO é modificado (por exemplo, adição de um cátion) fazendo sais dos mesmos. Tais sais retêm a atividade biológica desejada dos ASOs sem conferir efeitos toxicológicos indesejados. Em algumas modalidades, o ASO da descrição está na forma de um sal sódio. Em outras modalidades, o ASO está na forma de um sal potássio. IL.A. O Alvo

[0093] Adequadamente, o ASO da descrição é capaz de inibir (por exemplo, reduzir ou remover) a expressão do mRNA ou da proteína SNCA. Nesse aspecto, o ASO da descrição pode afetar a inibição indireta da proteína SNCA através da redução nos níveis de MRNA do SNCA, tipicamente em uma célula de mamífero, tal como uma célula humana, tal como uma célula neuronal. Em particular, a presente descrição é direcionada a ASOs que visam uma ou mais regiões do pré- MRNA de SNCA.

[0094] Os sinônimos de SNCA são conhecidos e incluem NACP, componente não A-beta do AD amiloide, PARK1I, PARK4 e PD1. À sequência para o gene SNCA pode ser encontrada sob o Número de Acesso NC 000004.12 disponível publicamente e a sequência parcial para o transcrito de pré-mRNA de SNCA (resíduos 6001 a 8400) pode ser encontrada sob o Número de Acesso NG 011851.1 publicamente disponível (SEQ ID NO: 1) A sequência para a proteína SNCA pode ser encontrada em Números de acesso publicamente disponíveis: P37840, A8K2A4, Q13701, Q4JHI3 e Q6/AU6, cada um dos quais é incorporado por referência no presente documento em sua totalidade. São conhecidas variantes naturais do produto gênico de SNCA. Por exemplo, variantes naturais da proteina SNCA podem conter uma ou mais substituições de aminoácidos selecionadas a partir de: A3OP, E46K, H50Q, A53T e qualquer combinação das mesmas. Portanto, os ASOs da presente descrição podem ser projetados para reduzir ou inibir a expressão das variantes naturais da proteína SNCA.

[0095] Sabe-se que mutações no SNCA causam uma ou mais condições patológicas. Os ASOs da descrição podem ser usados para reduzir ou inibir a expressão de um SNP ou transcrito de SNCA alternativamente "spliced" contendo uma ou mais mutações e, consequentemente, reduzir a formação de uma proteína SNCA mutada. Exemplos de mutantes da proteína SNCA incluem, entre outros, uma proteína SNCA compreendendo uma ou mais mutações selecionadas a partir de: D2A, ES5K, Y39F, H50A, ES57K, G67 V71del, V71. V82del, AT6 V77del, A76del, V77del, A78del, A85 F94del, Y125, YI36F e qualquer combinação das mesmas. O ASO da descrição pode ser projetado para reduzir ou inibir a expressão de quaisquer mutantes das proteínas SNCA.

[0096] Um exemplo de uma sequência de ácido nucleico alvo dos ASOs é o pré-mRNA de SNCA. SEQ ID NO: 1 na Figura 1A representa uma sequência genômica de SNCA parcial (resíduos 6001 a 8400). À SEQ ID NO: 1 é idêntica a uma sequência de pré-mRNA de SNCA, exceto que o nucleotídeo "t" na SEQ ID NO: 1 é mostrado como "u" no pré-mRNA. Em certas modalidades, o "ácido nucleico alvo" compreende uma região de íntron de ácidos nucleicos codificando a proteína SNCA ou variantes dos mesmos que ocorrem naturalmente, e ácidos nucleicos de RNA derivados dos mesmos, por exemplo, pré-mRNA. Em outras modalidades, o "ácido nucleico alvo" compreende uma região de éxon de um ácido nucleico que codifica a proteína SNCA ou suas variantes de ocorrência natural, e ácidos nucleicos de RNA derivados dos mesmos. Em algumas modalidades, por exemplo, quando usado em pesquisa ou diagnóstico, o "ácido nucleico alvo" pode ser um cDNA ou um oligonucleotídeo sintético derivado dos alvos de ácido nucleico do DNA ou RNA acima. Em uma modalidade, a sequência genômica de SNCA parcial é mostrada como No. de Acesso ao GenBank NG 011851.1 (resíduos 6001 a 8400) (SEQ ID NO: 1). O mRNA que codifica a proteína SNCA é mostrado como SEQ ID NO: 2. Ver Figura 1B. A sequência da proteína SNCA codificada pelo MRNA de SNCA é mostrada como SEQ ID NO: 3. Ver Figura 1C.

[0097] Em uma modalidade, o ASO de acordo com a descrição compreende uma sequência de nucleotídeos contígua de 10 a 30 nucleotídeos de comprimento que são complementares a uma sequência de ácido nucleico dentro de um transcrito de SNCA, por exemplo, uma região correspondente a uma junção de íntron éxon de SEQ ID NO: 1, em que a sequência de ácido nucleico corresponde aos nucleotídeos 7.602 - 7.627 da SEQ ID NO: 1.

[0098] Em certas modalidades, os ASOs hibridizam ou são complementares a uma região dentro de um transcrito de SNCA, por exemplo, nucleotídeos 7.602 - 7.627 da SEQ ID NO: 1 e têm um escore de sequência igual ou superior a 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 ou 1,0. Os métodos de cálculo do escore da sequência são descritos em outras partes deste documento.

[0099] Em algumas modalidades, os ASOs da presente descrição hibridizam com uma junção de íntron éxon de um transcrito de SNCA, por exemplo, uma região correspondente a uma junção entre o íntron 1 e o éxon 2 da SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o ASO da descrição compreende uma sequência de nucleotídeos contígua que hibridiza com uma sequência de ácido nucleico, ou uma região dentro da sequência, de um transcrito de SNCA ("região alvo"), em que a sequência de ácido nucleico corresponde aos nucleotídeos 7.602 -

7.627 da SEQ ID NO : 1. Em outra modalidade, o ASO da descrição compreende uma sequência de nucleotídeos contígua que hibridiza com uma sequência de ácido nucleico, ou uma região dentro da sequência, de um transcrito de SNCA, em que a sequência de ácido nucleico corresponde aos nucleotídeos 7.602 - 7.627 da SEQ ID NO: 1, e em que o ASO tem um dos modelos no presente documento descritos (por exemplo, Seção II.H., por exemplo, um modelo de "gapmer", por exemplo, um modelo de "gapmer" de flanco alternado) ou uma estrutura química mostrada em outras partes deste documento (por exemplo, as Figuras 2 e 3).

[0100] Em algumas modalidades, a região alvo corresponde aos nucleotídeos 7.604 - 7.620 da SEQ ID NO: 1. Em outras modalidades, a região alvo corresponde aos nucleotídeos 7.603 - 7.620 da SEQ ID NO: 1. Em outras modalidades, a região alvo corresponde aos nucleotídeos 7.602 - 7.619 da SEQ ID NO: 1. Em certas modalidades, os ASOs hibridizam com uma região dentro de um éxon de um transcrito de SNCA, por exemplo, SEQ ID NO: 1, e têm um escore de sequência igual ou superior a cerca de 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 ou 1,0. Os métodos de cálculo do escore da sequência são descritos em outras partes deste documento.

[0101] Em certas modalidades, a região alvo corresponde aos nucleotídeos 7.602 - 7.627 da SEQ ID NO: 1 + 10 nucleotídeos na extremidade 3, na extremidade 5, ou em ambas. Em outras modalidades, a região alvo corresponde aos nucleotídeos 7.604 - 7.620 da SEQ ID NO: 1 + 1,+2,+3,+4,+5,+5,+6,+7,+8, +90u+10 nucleotídeos na extremidade 3', na extremidade 5º, ou em ambas.

[0102] Em certas modalidades, o ASO da descrição é capaz de hibridizar com o ácido nucleico alvo (por exemplo, transcrito de SNCA) sob condição fisiológica, isto é, condição in vivo. Em algumas modalidades, o ASO da descrição é capaz de hibridizar com o ácido nucleico alvo (por exemplo, transcrito de SNCA) in vitro. Em algumas modalidades, o ASO da descrição é capaz de hibridizar com o ácido nucleico alvo (por exemplo, transcrito de SNCA) in vitro sob condições rigorosas. As condições estritas para a hibridização in vitro dependem, entre outras coisas, da captação produtiva de células, acessibilidade do RNA, temperatura, energia livre de associação, concentração de sal, e tempo (ver, por exemplo, Stanley T Crooks, Antisense Drug Technology: Principles, Strategies and Applications, 2º Edição, CRC Press (2007)). Geralmente, são utilizadas condições de estringência alta a moderada para hibridização in vitro para permitir a hibridização entre ácidos nucleicos substancialmente semelhantes, mas não entre ácidos nucleicos dissimilares. Um exemplo de condições de hibridização estringentes inclui hibridização em tampão 5X de solução salina-citrato de sódio (SSC) (cloreto de sódio 0,75 M / citrato de sódio 0,075 M) por 1 hora a 40ºC, seguido de lavagem da amostra 10 vezes em IXSSC a 40ºC e 5 vezes em 1X tampão SSC em temperatura ambiente. As condições de hibridização in vivo consistem de condições intracelulares (por exemplo, pH fisiológico e condições iônicas intracelulares) que governam a hibridização de oligonucleotídeos antissenso com sequências alvo. As condições in vivo podem ser imitadas in vitro por condições de estringência relativamente baixas. Por exemplo, a hibridização pode ser realizada in vitro em 2X SSC (cloreto de sódio 0,3 M / citrato de sódio 0,03 M), SDS a 0,1% a 37ºC. Uma solução de lavagem contendo 4X SSC, 0,1% SDS pode ser usada a 37ºC, com uma lavagem final em 1X SSC a 45º C.

I1I.B. Sequências de ASO

[0103] Os ASOs da descrição compreendem uma sequência de nucleotídeos contígua que corresponde ao complemento de uma região do transcrito de SNCA, por exemplo, uma sequência de nucleotídeos correspondente à SEQ ID NO: 1.

[0104] Em certas modalidades, a descrição fornece um ASO que compreende uma sequência de nucleotídeos contígua de um total de 10 a 30 nucleotídeos, tal como 10 a 15 nucleotídeos, 10 a 20 nucleotídeos ou 10 a 25 nucleotídeos de comprimento, em que a sequência de nucleotídeos contígua tem pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98% ou pelo menos cerca de 99% de identidade de sequência com uma região dentro do complemento de um transcrito de SNCA de mamífero, tal como SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2.

[0105] O ASO pode compreender uma sequência de nucleotídeos contígua que é totalmente complementar (perfeitamente complementar) à região equivalente de um ácido nucleico que codifica uma proteína SNCA de mamífero (por exemplo, SEQ ID NOs: 1 e 2). O ASO pode compreender uma sequência de nucleotídeos contígua que é totalmente complementar (perfeitamente complementar) a uma sequência de ácido nucleico ou uma região dentro da sequência, correspondente aos nucleotídeos X-Y da SEQ ID NO: 1, em que X e Y são o sítio de início do pré-mRNA e o sítio final de prémRNA de NG 011851.1, respectivamente, como mostrado na Figura 2. Além disso, o ASO pode ter um modelo descrito em outra parte deste documento (por exemplo, Seção II.G. por exemplo, um modelo de "gapmer", por exemplo, um modelo "gapmer" de flanco alternado) ou uma estrutura química mostrada em outro local neste documento (por exemplo, as Figura 2 e 3). Em algumas modalidades, o ASO compreende uma sequência de nucleotídeos contígua que é totalmente complementar (perfeitamente complementar) a uma sequência de ácido nucleico, ou uma região dentro da sequência, correspondente aos nucleotídeos X-Y da SEQ ID NO: 2, em que X e Y são o sítio de início do MRNA e o sítio final do MRNA, respectivamente.

[0106] Em certas modalidades, a sequência de nucleotídeos dos ASOs da descrição ou a sequência de nucleotídeos contígua tem pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência com uma sequência selecionada a partir de SEQ ID NOs: 4 a 21 (isto é, as sequências nas Figuras 2 e 3), tal como pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96% de identidade de sequência, pelo menos cerca de 97% de identidade de sequência, pelo menos cerca de 98% de identidade de sequência, pelo menos cerca de 99% de identidade de sequência, tal como cerca de 100% de identidade de sequência (homóloga). Em algumas modalidades, o ASO tem um modelo descrito no presente documento em outro lugar (por exemplo, Seção I1.GI, por exemplo, um modelo de "gapmer", por exemplo, um modelo de "gapmer" de flanco alternado) ou uma estrutura química de nucleosídeo mostrada em outro local neste documento (por exemplo, as Figuras 2 e 3).

[0107] Em algumas modalidades, o ASO da descrição compreende pelo menos um ASO com o modelo (por exemplo, número DES) descrito nas Figuras 2 e 3. Em algumas modalidades, o ASO da descrição compreende pelo menos um ASO com o modelo (por exemplo, número DES) descrito nas Figuras 2 e 3, em que o ASO é um nucleotídeo, dois nucleotídeos, três nucleotídeos ou quatro nucleotídeos mais curto na extremidade 3' do que os ASOs descritos nas Figuras 2 e 3. Em outras modalidades, o ASO da descrição compreende pelo menos um ASO com o modelo (por exemplo, número DES) descrito nas Figuras 2 e 3, em que o ASO é um nucleotídeo, dois nucleotídeos, três nucleotídeos ou quatro nucleotídeos mais curto na extremidade 5' do que os ASOs descritos nas Figuras 2 e 3. Em ainda outras modalidades, o ASO da descrição compreende pelo menos um ASO com o modelo (por exemplo, número DES) descrito nas Figuras 2 e 3, em que o ASO é um nucleotídeo, dois nucleotídeos, três nucleotídeos ou quatro nucleotídeos mais curto na extremidade 5' e / ou na extremidade 3' do que os ASOs descritos nas Figuras 2 e 3.

[0108] Em outras modalidades, o ASO da descrição compreende pelo menos um ASO com a estrutura química (por exemplo, número de ASO) descrito nas Figuras 2 e 3. Em algumas modalidades, o ASO da descrição compreende pelo menos um ASO com a estrutura química (por exemplo, número de ASO) descrita nas Figuras 2 e 3, em que o ASO é um nucleotídeo, dois nucleotídeos, três nucleotídeos ou quatro nucleotídeos mais curto na extremidade 3' do que os ASOs descritos nas Figuras 2 e 3. Em outras modalidades, o ASO da descrição compreende pelo menos um ASO com a estrutura química (por exemplo, número de ASO) descrito nas Figuras 2 e 3, em que o ASO é um nucleotídeo, dois nucleotídeos, três nucleotídeos ou quatro nucleotídeos mais curto na extremidade 5' do que os ASOs descritos nas Figuras 2 e 3. Em ainda outras modalidades, o ASO da descrição compreende pelo menos um ASO com a estrutura química (por exemplo, número de ASO) descrito nas Figuras 2 e 3, em que o ASO é um nucleotídeo, dois nucleotídeos, três nucleotídeos ou quatro nucleotídeos mais curto na extremidade 5' e / ou na extremidade 3' do que os ASOs descritos nas Figuras 2 e 3.

[0109] Em algumas modalidades, o ASO (ou sua porção de nucleotídeos contíguos) é selecionado a partir de, ou compreende, uma das sequências selecionadas a partir do grupo que consiste de SEQ ID NOs: 4 a 21 e uma região de pelo menos 10 nucleotídeos contíguos, em que o ASO (ou sua porção de nucleotídeos contíguos) pode opcionalmente — compreender uma, duas, três ou quatro incompatibilidades quando comparado ao transcrito de SNCA correspondente.

[0110] Em uma modalidade, o ASO compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 e SEQ ID NO: 21. Em algumas modalidades, o ASO compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste de SEQ ID NO: 7 (por exemplo, a sequência de ASO-005578 e ASO-005584) e SEQ ID NO: 15 (por exemplo, a sequência de ASO-005459).

[0111] Em algumas modalidades, os ASOs da descrição se ligam à sequência de ácido nucleico alvo (por exemplo, transcrito de SNCA) e são capazes de inibir ou reduzir a expressão do transcrito de SNCA em pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90% ou cerca de 100% em um tecido (por exemplo, uma região de cérebro) de um camundongo que expressa um gene SNCA humano (por exemplo, ASST-PAC) quando administrado in vivo em doses de 3,13 ug, 12,5 ug, 25 vg, 50 pg ou 100 ug em comparação com o controle (por exemplo, um controle interno, tal como GADPH ou tubulina, ou um camundongo administrado apenas com o veículo de controle), medido por um ensaio, por exemplo, análises quantitativas de PCR ou QUANTIGENEG no presente documento descritas.

[0112] Em algumas modalidades, os ASOs são capazes de reduzir a expressão da proteína SNCA em pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90% ou cerca de 100% em um tecido (por exemplo, uma região do cérebro) de um camundongo que expressa um gene SNCA humano (por exemplo, AS3T-PAC) quando administrado in vivo em doses de 3,13 ug, 12,5 ug, ug, 50 ug ou 100 ug em comparação com o controle (por exemplo, um controle interno tal como GADPH ou tubulina ou um camundongo administrado apenas com o veículo de controle), como medido por um ensaio, por exemplo, ensaio de alto conteúdo descrito no presente documento (ver Exemplo 2A).

[0113] Em algumas modalidades, os ASOs da descrição se ligam à sequência de ácido nucleico alvo (por exemplo, transcrito de SNCA) e são capazes de inibir ou reduzir a expressão do transcrito de SNCA em pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90% ou cerca de 100% em um tecido (por exemplo, uma região do cérebro) de um cyno que expressa o gene SNCA de ocorrência natural quando administrado uma ou duas vezes in vivo em doses de 2 mg, 4 mg ou 8 mg, em comparação com o controle (por exemplo, um controle interno tal como GADPH ou tubulina, ou um cyno administrado apenas com veículo de controle), conforme medido por um ensaio, por exemplo, análises quantitativas de PCR ou QUANTIGENEPO no presente documento descritas.

[0114] Em algumas modalidades, os ASOs são capazes de reduzir a expressão da proteína SNCA em pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90% ou cerca de 100% em um tecido (por exemplo, uma região do cérebro) de um cyno que expressa o gene SNCA de ocorrência natural quando administrado uma vez ou duas vezes in vivo em doses de 2 mg, 4 mg ou 8 mg, em comparação com o controle (por exemplo, um controle interno tal como GADPH ou tubulina, ou um cyno administrado apenas com o veículo de controle), conforme medido por um ensaio, por exemplo, Ensaio de alto conteúdo no presente documento descrito (ver Exemplo 2A).

[0115] Em outras modalidades, os ASOs da descrição são capazes de reduzir a expressão do mMRNA de SNCA in vitro em pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90% ou cerca de 100% nos neurônios primários de camundongos que expressam um gene SNCA humano completo (por exemplo, neurônios PAC) quando os neurônios estão em contato com 5 UM, 3,3 UM, 1 UM, 4 nM, 40 nM ou 200 nM do oligonucleotídeo antissenso em comparação com um controle (por exemplo, um controle interno tal como GADPH ou tubulina ou neurônios primários de um camundongo que expressam um SNCA humano de comprimento total em contato apenas com solução salina), conforme medido por um ensaio, por exemplo, análise QUANTIGENEO no presente documento descrita.

[0116] Em ainda outras modalidades, os ASOs são capazes de reduzir a expressão da proteína SNCA in vitro em pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90% ou pelo menos cerca de 95% em neurônios primários de camundongo que expressam um gene SNCA humano de comprimento total (por exemplo, neurônios PAC) quando os neurônios estão em contato com 5 UM, 3,3 UM, 1 UM, 4 NM, 40 nM ou 200 nM do oligonucleotídeo antissenso em comparação com controle (por exemplo, um controle interno, tal como GADPH ou tubulina, ou neurônios primários de camundongo que expressam um gene SNCA humano de comprimento total (em contato apenas com solução salina),

conforme medido por um ensaio, por exemplo, Ensaio de Alto conteúdo descrito no presente documento (consultar Exemplo 2A).

[0117] Em algumas modalidades, os ASOs são capazes de reduzir a expressão do mMRNA de SNCA in vitro em pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90% ou cerca de 100% na linhagem de células de neuroblastoma humano (por exemplo, SK-N-BE(2)) expressando um gene SNCA humano de comprimento total quando as células de neuroblastoma estão em contato com 25 uM do oligonucleotídeo antissenso em comparação com o controle (por exemplo, um controle interno tal como GADPH ou tubulina, ou células de neuroblastoma que expressam um gene SNCA humano de comprimento total em contato apenas com solução salina), como medido por um ensaio, por exemplo, PCR quantitativo no presente documento descrito.

[0118] Em algumas modalidades, os ASOs descritos neste documento são capazes de reduzir a expressão da proteína SNCA in vitro em pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90% ou cerca de 100% na linhagem de células de neuroblastoma humano (por exemplo, SK-N-BE(2)) expressando um gene SNCA humano de comprimento total quando as células de neuroblastoma estão em contato com 25 uM do oligonucleotídeo antissenso em comparação com o controle (por exemplo, um controle interno tal como GADPH ou tubulina, ou células de neuroblastoma que expressam um gene SNCA humano de comprimento total em contato apenas com solução salina), conforme medido por um ensaio, por exemplo, análise de alto conteúdo no presente documento descrita (consultar o Exemplo 2A).

[0119] Em certas modalidades, os ASOs da descrição se ligam ao transcrito de SNCA e inibem ou reduzem a expressão do mRNA de SNCA em pelo menos cerca de 10% ou cerca de 20% em comparação com o nível de expressão normal (isto é, controle) na célula, por exemplo, pelo menos cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 90% ou cerca de 95% em comparação com o nível de expressão normal (tal como o nível de expressão na ausência do(s) ASO(s) ou conjugado(s)) na célula. Em certas modalidades, o ASO reduz a expressão da proteína SNCA em uma célula após a administração do ASO em pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% em comparação com uma célula não exposta ao ASO (ou seja, controle). Em algumas modalidades, o ASO reduz a expressão da proteína SNCA em uma célula após a administração do ASO em pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80% ou pelo menos cerca de 90% em comparação com uma célula não exposta ao ASO (ou seja, controle).

[0120] Em certas modalidades, o ASO da descrição tem pelo menos uma propriedade selecionada a partir de: (1) reduz a expressão do MRNA de SNCA em uma célula, em comparação com uma célula de controle que não foi exposta ao ASO; (2) não reduz significativamente as oscilações de cálcio em uma célula; (3) não reduz significativamente a intensidade de tubulina em uma célula; (4) reduz a expressão da proteína a-Syn em uma célula; e (5) quaisquer combinações das mesmas em comparação com uma célula de controle que não foi exposta ao ASO.

[0121] Em algumas modalidades, o ASO da descrição não reduz significativamente as oscilações de cálcio em uma célula, por exemplo, células neuronais. Se o ASO não reduzir significativamente as oscilações de cálcio em uma célula, essa propriedade do ASO corresponde a uma neurotoxicidade reduzida do ASO. Em algumas modalidades, as oscilações de cálcio são maiores ou iguais a 95%, maiores ou iguais a 90%, maiores ou iguais a 85%, maiores ou iguais a 80%, maiores ou iguais a 75%, maiores ou iguais a ou igual a 70%, maior ou igual a 65%, maiores ou iguais a 60%, maiores ou iguais a 55%, ou maiores ou iguais a 50% das oscilações em uma célula não exposta ao ASO.

[0122] As oscilações de cálcio são importantes para o bom funcionamento das células neuronais. Foi demonstrado que redes de neurônios corticais sofrem oscilações espontâneas de cálcio, resultando na liberação do neurotransmissor glutamato. As oscilações de cálcio também podem regular as interações dos neurônios com a glia associada, além de outros neurônios associados na rede, para liberar outros neurotransmissores, além do glutamato. As oscilações de cálcio reguladas são necessárias para a homeostase das redes neuronais para a função cerebral normal. (Ver Shashank e outros, Brain Research, 1006 (1): 8 a 17 (2004); Rose e outros, Nature Neurosci., 4: 773 a 774 (2001); Zonta e outros, J. Physiol Paris., 96 (3-4): 193-8 (2002); Pasti e outros, J. Neurosci., 21 (2): 477 a 484 (2001)). O glutamato também ativa dois canais iônicos distintos, receptores de ácido a-amino-3- hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropiônico (AMPA) e receptores de N-metil-D- aspartato (NMDA).

[0123] Em algumas modalidades, as oscilações de cálcio medidas nos presentes métodos são oscilações de cálcio dependentes de AMPA. Em algumas modalidades, as oscilações de cálcio são oscilações de cálcio dependentes de NMDA. Em algumas modalidades, as oscilações de cálcio são oscilações de cálcio dependentes de ácido gama-aminobutírico (GABA). Em algumas modalidades, as oscilações de cálcio podem ser uma combinação de duas ou mais oscilações de cálcio dependentes de AMPA, dependentes de NMDA ou dependentes de GABA.

[0124] Em certas modalidades, as oscilações de cálcio medidas nos presentes métodos são oscilações de cálcio dependentes de AMPA. De modo a medir as oscilações de cálcio dependentes de AMPA, as oscilações de cálcio podem ser medidas na presença de íons Mg?* (por exemplo, MgCl2). Em certas modalidades, o método compreende ainda adicionar íons Mg?* (por exemplo, MgCl2) em uma quantidade que permita a detecção de oscilações de cálcio dependentes de AMPA. Em algumas modalidades, a concentração de íons eficaz que permite a detecção de oscilações de cálcio dependentes de AMPA é de pelo menos cerca de 0,5 MM. Em outras modalidades, a concentração de íons eficaz para induzir oscilações de cálcio dependentes de AMPA é de pelo menos cerca de 0,6 mM, pelo menos cerca de 0,7 mM, pelo menos cerca de 0,8 mM, pelo menos cerca de 0,9 mM, pelo menos cerca de 1 mM, pelo menos cerca de 1,5 mM, pelo menos cerca de 2,0 MM, pelo menos cerca de 2,5 mM, pelo menos cerca de 3,0 mM, pelo menos cerca de 4 mM, pelo menos cerca de 5 mM, pelo menos cerca de 6 mM, pelo menos cerca de 7 mM, pelo menos cerca de 8 mM, pelo menos cerca de 9 mM, ou pelo menos cerca de 10 MM. Em uma modalidade particular, a concentração de íons Mg2+ (por exemplo, MgCl2) útil para os métodos é de 1 mM. Em certas modalidades, a concentração de íons Mg?* (por exemplo, MgCl2) útil para os presentes métodos é de cerca de 1 MM a cerca de 10 mM, cerca de 1 MM a cerca de 15 mM, cerca de 1 MM a cerca de 20 mM ou cerca de 1 mM a cerca de 25 milímetros. Os íons Mg?* podem ser adicionados pela adição de sais magnésio, tal como carbonato de magnésio, cloreto de magnésio, citrato de magnésio, hidróxido de magnésio, óxido de magnésio, sulfato de magnésio, e sulfato de magnésio hepta-hidratado.

[0125] Em algumas modalidades, as oscilações de cálcio são medidas no presente método através do uso de sondas fluorescentes que detectam as flutuações dos níveis intracelulares de cálcio. Por exemplo, a detecção do fluxo intracelular de cálcio pode ser alcançada pela coloração das células com corantes fluorescentes que se ligam aos íons de cálcio (conhecidos como indicadores de cálcio fluorescente) com uma resultante mudança detectável na fluorescência (por exemplo, corantes Fluo-4 AM e Fura Red AM disponíveis a partir de Molecular Probes (Eugene, OR, Estados Unidos da América).

[0126] Em outras modalidades, os ASOs da descrição não reduzem significativamente a intensidade de tubulina em uma célula. Em algumas modalidades, a intensidade de tubulina é maior ou igual a 95%, maior ou igual a 90%, maior ou igual a 85%, maior ou igual a 80%, maior ou igual a 75%, maior que ou igual a 70%, maior ou igual a 65%, maior ou igual a 60%, maior ou igual a 55%, ou maior ou igual a 50% da intensidade de tubulina em uma célula não exposta ao ASO (ou expostos à solução salina).

[0127] Em algumas modalidades, essa propriedade é observada ao usar uma concentração de 0,04 nM a 400 uM do ASO da descrição. Na mesma ou em uma modalidade diferente, a inibição ou redução da expressão de mMRNA de SNCA e / ou da proteína SNCA na célula resulta em menos de 100%, tal como menos de 98%, menos de 95%, menos de 90%, menos mais de 80%, como menos de 70%, nos níveis de MRNA ou proteína em comparação com células não expostas ao ASO. A modulação do nível de expressão pode ser determinada medindo-se os níveis de proteína SNCA, por exemplo, por métodos tal como SDS- PAGE seguido de western blot utilizando anticorpos adequados criados contra a proteína alvo. Alternativamente, a modulação dos níveis de expressão pode ser determinada medindo-se os níveis de mMRNA de SNCA, por exemplo, por northern blot ou RT-PCR quantitativa. Ao medir a inibição via níveis de MRNA, o nível de inibição ao usar uma dosagem apropriada, tal como concentração de cerca de 0,04 nM a cerca de 400 UM, é, em algumas modalidades, tipicamente a um nível de cerca de 10 a 20% dos níveis normais na célula na ausência do ASO.

[0128] Em certas modalidades, o ASO da descrição tem uma tolerabilidade in vivo menor ou igual a um escore total de 4, em que o escore total é a soma de um escore unitário de cinco categorias, que são 1) hiperatividade; 2) diminuição da atividade e excitação; 3) disfunção motora e / ou ataxia; 4) postura e respiração anormais; e 5) tremor e / ou convulsões, e em que o escore unitário para cada categoria é medido em uma escala de O a 4. Em certas modalidades, a tolerabilidade in vivo é menor ou igual ao escore total de 3, ao escore total de 2, ao escore total de 1 ou ao escore total de 0. Em algumas modalidades, a avaliação da tolerabilidade in vivo é determinada como descrito nos exemplos abaixo.

[0129] Em algumas modalidades, o ASO pode tolerar 1, 2, 3 ou 4 (ou mais) incompatibilidades, quando hibridizando com a sequência alvo e ainda assim se ligar suficientemente ao alvo para mostrar o efeito desejado, isto é, inibição do mMRNA alvo e / ou proteína. As incompatibilidades podem, por exemplo, ser compensadas pelo aumento do comprimento da sequência de nucleotídeos de ASO e / ou um aumento do número de análogos de nucleotídeos, que são descritos em outras partes deste documento.

[0130] Em algumas modalidades, o ASO de acordo com a descrição compreende não mais do que 3 incompatibilidades quando hibridizando com a sequência alvo. Em outras modalidades, a sequência de nucleotídeos — contígua — compreende não mais do que 2 incompatibilidades quando hibridizando com a sequência alvo. Em outras modalidades, a sequência de nucleotídeos contígua compreende não mais do que 1 incompatibilidade quando hibridizando com a sequência alvo.

[0131] Em algumas modalidades, o ASO de acordo com a descrição compreende uma sequência de nucleotídeos ou uma região dentro da sequência, de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 21, as sequências de ASO com o modelo conforme descrito nas Figuras 2 e 3, e a sequência de ASO com a estrutura química como descrita nas Figuras 2 e 3.

[0132] No entanto, é reconhecido que, em algumas modalidades, a sequência de nucleotídeos do ASO pode compreender nucleotídeos 5' ou 3' adicionais, tal como, independentemente, 1, 2, 3, 4 ou 5 nucleotídeos adicionais 5' e / ou 3', que não são complementares à sequência alvo. Nesse aspecto, o ASO da descrição pode, em algumas modalidades, compreender uma sequência de nucleotídeos contígua que é flanqueada 5' e / ou 3' por nucleotídeos adicionais. Em algumas modalidades, os nucleotídeos adicionais 5' e / ou 3' são nucleotídeos que ocorrem naturalmente, tal como DNA ou RNA.

[0133] Em algumas modalidades, o ASO da descrição tem um escore de sequência maior ou igual a 0,2, em que o escore de sequência é calculado pela fórmula |: f de nucleotídeos C e seus análogos - ff de nucleotídeos G e seus análogos (1) / Comprimento total de nucleotídeos.

[0134] Em outras modalidades, o ASO da descrição tem um escore de sequência maior ou igual a 0,2, em que o escore de sequência é calculado pela fórmula IA: * de nucleotídeos C e nucleotídeos de 5-metilcitosina - % de nucleotídeos G (IA) / Comprimento total de nucleotídeos.

[0135] Nestas modalidades, um escore de sequência maior ou igual a um valor de corte corresponde a uma neurotoxicidade reduzida do ASO.

[0136] Em certas modalidades, o ASO da descrição tem um escore de sequência maior ou igual a cerca de 0,1, 0,2, 0,25, 0,3, 0,35, 0,4,

0,45, 0,5, 0,55, 0,6, 0,65, 0,75, 0,75, 0,8, 0,85, 0,9, 0,95 ou 1,0. Em uma modalidade, o ASO da descrição compreende uma sequência de nucleotídeos contígua que hibridiza com uma região não codificante de um transcrito de SNCA, em que o escore da sequência de ASO é maior ou igual a cerca de 0,1, 0,2, 0,25, 0,3, 0,35, 0,4, 0,45, 0,5, 0,55, 0,6, 0,65, 0,7, 0,75, 0,8, 0,85, 0,9, 0,95 ou 1,0. Em outra modalidade, o ASO da descrição compreende uma sequência de nucleotídeos contígua que hibridiza com uma região de íntron de um transcrito de SNCA, em que O escore da sequência de ASO é maior ou igual a cerca de 0,1, 0,2, 0,25, 0,3, 0,35, 0,4, 0,45, 0,5, 0,55, 0,6, 0,65, 0,7, 0,75, 0,8, 0,85, 0,9, 0,95 ou 1,0. Em outra modalidade, o ASO da descrição compreende uma sequência de nucleotídeos contígua que hibridiza com uma junção íntron éxon de um transcrito de SNCA, em que o escore da sequência de ASO é maior ou igual a cerca de 0,1, 0,2, 0,25, 0,3, 0,35, 0,4, 0,45, 0,5, 0,55, 0,6, 0,65, 0,7, 0,75, 0,8, 0,85, 0,9, 0,95 ou 1,0. Em todas essas modalidades, quando o escore da sequência é maior ou igual ao valor de corte, o ASO é considerado como tendo neurotoxicidade reduzida. I.C. Comprimento de ASO

[0137] Os ASOs podem compreender uma sequência de nucleotídeos contígua de um total de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos contíguos de comprimento.

[0138] Em algumas modalidades, os ASOs compreendem uma sequência de nucleotídeos contígua de um total de cerca de 10 a 22, tal como 10 a 21 ou 12 a 18, tal como 13 a 17 ou 12 a 16, tal como 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou 21 nucleotídeos contíguos de comprimento.

[0139] Em algumas modalidades, os ASOs compreendem uma sequência de nucleotídeos contíguos de um total de 16, 17, 18, 19 ou (16 a 20) nucleotídeos contíguos de comprimento.

[0140] Em algumas modalidades, o ASO de acordo com a descrição consiste de não mais do que 22 nucleotídeos, tal como não mais do que 21 ou 20 nucleotídeos, tal como não mais do que 18 nucleotídeos, tal como 15, 16 ou 17 nucleotídeos. Em algumas modalidades, o ASO da descrição compreende menos de 22 nucleotídeos. Deve-se entender que, quando é fornecido um intervalo para um ASO, ou comprimento de sequência de nucleotídeos contíguos, o intervalo inclui os comprimentos inferior e superior fornecidos no intervalo, por exemplo, a partir de (ou entre) 10 a 30, inclui tanto 10 quanto 30. I1.D. Nucleosídeos e Análogos de Nucleosídeos

[0141] Em um aspecto da descrição, os ASOs compreendem um ou mais análogos de nucleotídeos que não ocorrem naturalmente. Os "análogos de nucleotídeos", como no presente documento utilizados, são variantes de nucleotídeos naturais, tal como nucleotídeos de DNA ou RNA, em virtude de modificações nas porções de açúcar e / ou base. Os análogos podem, em princípio, ser meramente "silenciosos" ou "equivalentes" aos nucleotídeos naturais no contexto do oligonucleotídeo, isto é, não têm efeito funcional na maneira como o oligonucleotídeo trabalha para inibir a expressão do gene alvo. Tais análogos "equivalentes" podem, no entanto, ser úteis se, por exemplo, são mais fáceis ou menos dispendiosos de fabricar, ou são mais estáveis às condições de armazenamento ou fabricação, ou representam uma etiqueta ou rótulo. Em algumas modalidades, no entanto, os análogos terão um efeito funcional na maneira como o ASO trabalha para inibir a expressão; por exemplo, produzindo maior afinidade de ligação ao alvo e / ou maior resistência a nucleases intracelulares e / ou maior facilidade de transporte para a célula. Exemplos específicos de análogos de nucleosídeos são descritos, por exemplo, por Freier e Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429 a 4443 e Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3 (2), 293-213, e no Esquema 1.

11.D.1. Nucleobase

[0142] O termo nucleobase inclui a porção purina (por exemplo, adenina e guanina) e pirimidina (por exemplo, uracila, timina e citosina) presente em nucleosídeos e nucleotídeos que formam ligações hidrogênio na hibridização de ácidos nucleicos. No contexto da presente descrição, o termo nucleobase também abrange nucleobases modificadas que podem diferir das nucleobases que ocorrem naturalmente, mas são funcionais durante a hibridização de ácidos nucleicos. Em algumas modalidades, a porção nucleobase é modificada modificando-se ou substituindo-se a nucleobase. Neste contexto, "nucleobase" refere-se tanto a nucleobases de ocorrência natural, tal como adenina, guanina, citosina, timidina, uracila, xantina e hipoxantina, quanto a variantes de ocorrência não natural. Tais variantes são, por exemplo, descritas por Hirao e outros, (2012) Accounts of Chemical Research vol. 45, página 2055 e Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 1.4.1.

[0143] Em algumas modalidades, a porção nucleobase é modificada alterando a purina ou pirimidina em uma purina ou pirimidina modificada, tal como purina substituída ou pirimidina substituída, tal como uma nucleobase selecionada a partir de isocitina, pseudoisocitina, S5-metil citosina, 5-tiozolo-citosina, 5-propinil-citosina, 5-propinil-uracila, B5-bromouracil B5-tiazolo-uracila, 2-tio-uracila, 2'-tio-timina, inosina, diaminopurina, 6-aminopurina, 2-aminopurina, 2,6-diaminopurina e 2- cloro-6-aminopurina.

[0144] As porções nucleobase podem ser indicadas pelo código de letra para cada nucleobase correspondente, por exemplo, A, T, G, C ou U, em que cada letra pode opcionalmente incluir nucleobases modificadas de função equivalente. Por exemplo, nos oligonucleotídeos exemplificados, as porções nucleobases são selecionadas a partir de A, T, G, C e 5-metil citosina. Opcionalmente, para "gapmers" de LNA,

nucleosídeos de LNA 5-metil citosina podem ser utilizados.

11.D.2. Modificação de Açúcar

[0145] O ASO da descrição pode compreender um ou mais nucleosídeos que têm uma porção de açúcar modificada, isto é, uma modificação da porção de açúcar quando comparada à porção de açúcar ribose encontrada no DNA e RNA. Numerosos nucleosídeos com modificação da porção de açúcar ribose foram feitos, principalmente com o objetivo de melhorar certas propriedades dos oligonucleotídeos, tal como afinidade e / ou resistência à nuclease.

[0146] Tais modificações incluem aquelas em que a estrutura do anel ribose é modificada, por exemplo, por substituição por um anel hexose (HNA) ou um anel bicíclico, que normalmente tem uma ponte birradical entre os carbonos C2' e C4' no anel ribose (LNA), ou um anel ribose não ligado que normalmente não tem uma ligação entre os carbonos C2' e C3' (por exemplo, UNA). Outros nucleosídeos de açúcar modificado incluem, por exemplo, ácidos nucleicos de biciclo-hexose (WO 2011/017521) ou ácidos nucleicos tricíclicos (WO 2013/154798). Os nucleosídeos modificados também incluem nucleosídeos onde a porção de açúcar é substituída por uma porção que não seja de açúcar, por exemplo, no caso de ácidos nucleicos peptídicos (PNA) ou ácidos nucleicos de morfolino.

[0147] As modificações de açúcar também incluem modificações feitas através da alteração dos grupos substituintes no anel ribose para grupos que não sejam hidrogênio ou o grupo 2-OH encontrado naturalmente nos nucleosídeos de RNA. Os substituintes podem, por exemplo, ser introduzidos nas posições 2', 3', 4 “ou 5". Os nucleosídeos com porções de açúcar modificado também incluem nucleosídeos 2' modificados, tal como nucleosídeos 2' substituídos. De fato, muito foco foi gasto no desenvolvimento de nucleosídeos 2' substituídos e vários nucleosídeos 2' substituídos foram encontrados com propriedades benéficas quando incorporados em oligonucleotídeos, tal como resistência a nucleosídeos aprimorada e afinidade aprimorada.

[0148] Em algumas modalidades, a modificação de açúcar compreende uma modificação de açúcar que aumenta a afinidade, por exemplo, LNA. Uma modificação de açúcar que aumenta a afinidade aumenta a afinidade de ligação dos ASOs à sequência de RNA alvo (por exemplo, junção íntron1 / éxon2 do mRNA de SNCA). Em algumas modalidades, um ASO compreendendo uma modificação de açúcar no presente documento descrita tem uma afinidade de ligação a uma sequência de RNA alvo que é melhorada em pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 100% em comparação com um controle (por exemplo, um ASO sem essa modificação de açúcar).

11.D.2.a. Nucleosídeos 2' Modificados

[0149] Um nucleosídeo de açúcar 2' modificado é um nucleosídeo que tem um substituinte que não H ou -OH na posição 2' (nucleosídeo 2' substituído) ou compreende um birradical ligado a 2, e inclui nucleosídeos 2' substituídos e LNA (2'- 4' em ponte birradical). Por exemplo, o açúcar 2' modificado pode fornecer afinidade de ligação aprimorada e / ou resistência à nuclease aumentada com o oligonucleotídeo. Exemplos de nucleosídeos modificados 2' substituídos são 2'-O-alquil-RNA, 2'-O-metil-RNA, 2'-alcóxi-RNA, 2'-0- metoxieti-RNA (MOE), 2'-amino-DNA, 2'-fluoro-RNA, e 2-F-ANA nucleosídeo. Para mais exemplos, consultar, por exemplo, Freier e Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429 a 4443 e Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3 (2), 293-213 e Deleavey e Dambha, Chemistry and Biology 2012, 19, 937. Abaixo estão ilustrações de alguns nucleosídeos modificados 2' substituídos.

“o ES” “o O. Base “o os ç OCH, Tt Q 2/-O-Me 2'F-ANA 2'F-ANA “o. 0. 8º er “o. 20x Base

FE “o ls Sd 2'/-O-MOE 2'-0-Aly 2'-O-Ethylamine I1.D.2.b. Nucleosídeos de Ácido Nucleico Bloqueado (LNA).

[0150] Os nucleosídeos de LNA são nucleosídeos modificados que compreendem um grupo ligante (chamado de um birradical ou uma ponte) entre C2' e C4' do anel de açúcar ribose de um nucleotídeo. Estes nucleosídeos são também denominados ácido nucleico em ponte ou ácido nucleico bicíclico (BNA) na literatura.

[0151] Em algumas modalidades, o nucleosídeo modificado ou os nucleosídeos de LNA do ASO da descrição tem uma estrutura geral de fórmula Il ou Ill: z R po "sl Nasa: 8 Pr A E B-D 7 A Fa a-L ou Fórmula Il Fórmula Ill em que W é selecionado a partir de -O-, -S-, -N(R2) -, -C(RºR>) -, tal como, em algumas modalidades —O-; B designa uma porção nucleobase ou nucleobase modificada; Z designa uma ligação internucleosídica a um nucleosídeo adjacente ou a um grupo terminal 5' ; Z * designa uma ligação internucleosídica a um nucleosídeo adjacente ou a um grupo terminal 3'; e X designa um grupo selecionado a partir do grupo que consiste de —C(RºRP)-, -C(R9)=C(RP), -C(Rº)=N-, -O-, - SI(Rº)2-, -S-, -SO>2-, -N(Rº)-, e >C=Z.

[0152] Em algumas modalidades, X é selecionado a partir do grupo que consiste de: -O-, -S-, NH-, NRºRº, -CH2-, CRºRº, -C(=CH>7)- e - C(=CRºRb) -. Em algumas modalidades, X é -O-.

[0153] Em algumas modalidades, Y designa um grupo selecionado a partir do grupo que consiste de -C(RºRº)., -C(Rº)=C(Rº), - C(Rº)=N-, -O-, -Si(Rº)2-, -S-, -SO2-, -N(Rº)-, e >C=Z. Em algumas modalidades, Y é selecionado no grupo que consiste de: -CH>2-, - C(RºRº), —-CH2CH>-, -C(RºRb)-C(RºRº)-, —-CH2CH2CH>-, - C(RARP)C(RaRP)C(RºRP)-, -C(R)=C(Rº)-, e -C(Rº)=N-.

[0154] Em algumas modalidades, Y é selecionado a partir do grupo que consiste de: -CH2-, -CHRº-, -CHCH3a-, CRºR?-; e —X-Y- juntos designam um grupo ligante bivalente (também conhecido como radical) juntos designar um grupo ligante bivalente que consiste de 1, 2, 3 ou 4 grupos / átomos selecionados a partir do grupo que consiste de - C(RIRP)-, -C(R3)=C(Rb)-, -C(Rº)=N-, -O-, -Si(Rº)2-, -S-, -SO72-, -N(Rº)-, e >C=Z.

[0155] Em algumas modalidades, -X-Y designa um birradical selecionado a partir dos grupos que consistem de: -X-CHa-, -X-CRºR?t-, -X-CHR?, -X-C(HCH3)', -O-Y-, -O-CH2-, -S-CH2-, -NH-CH>2-, -O-CHCH3- , -CH2-0-CH2, -O-CH(CH3;CH3)-, -O-CH2-CH2-, OCH2-CH2-CH>2-,-O- CH20CH2-, -O-NCH2-, -C(=CH2)-CH2-, -NRº-CH2-, N-O-CH>, -S-CRºRº- e -S-CHR?-.

[0156] Em algumas modalidades —X-Y- designa -—-O-CH2- ou —O- CH(CH3)-.

[0157] Em certas modalidades, Z é selecionado a partir de -O-, -S- e -N(Rº)- e Rº e, quando presente Rº, cada um é independentemente selecionado a partir de hidrogênio, Ci. alquila opcionalmente substituída, C2.6 alquenila opcionalmente substituída, C2.6 alquinila opcionalmente — substituída, hidroxi, C1i6s alcóxi opcionalmente substituído, C>65 alcoxialquila, C>6 alquenilóxii carbóxii, Ci alcoxicarbonila, C1- alquilcarbonila, formila, arila, ariloxi-carbonila, arilóxi, arilcarbonila, heteroarila, heteroariloxi-carbonila, heteroariloxi, heteroarilcarbonila, amino, mono- e di (C1-.6 alquil)amino, carbamoíla, mono- e di (Cies-alguillamino-carbonila, — amino-C1-s — alquil- aminocarbonila, mono- e di (C1.6 alquil)amino-C1-6 alquil-aminocarbonila, C1-6 alquil-carbonilamino, carbamido, Ci. alcanoilóxi, sulfono, C1+6 alquilsulfonilóxi, nitro, azido, sulfanila, C1-6 alquíltio, halogênio, onde arila e heteroarila podem ser opcionalmente substituídas e onde dois substituintes geminais Rº e Rº juntos podem designar metileno opcionalmente substituído (= CH2), onde para todos os centros quirais, grupos assimétricos podem ser encontrados na orientação R ou S.

[0158] Em algumas modalidades, RI, R?à, Rà, Rº e R** são selecionados independentemente a partir do grupo que consiste de: hidrogênio, C1-.6 alquila opcionalmente substituída, C26 alquenila opcionalmente substituída, C2.6 alquinila opcionalmente substituída, hidroxi, C1.6 alcóxi, Care alcoxialquila, Ca6 alquenilóxi, carbóxi, C16 alcoxicarbonila, C1.e alquilcarbonila, formila, arila, ariloxi-carbonila, arilóxi, arilcarbonila, heteroarila, heteroariloxi-carbonila, heteroarilóxi, heteroarilcarbonila, amino, mono- e di (C1-6 alquil)amino, carbamoíla, mono- e di (Ci. alquillamino-carbonila, amino-C1.6 —alquil- aminocarbonila, mono - e di (Cis alquilamino-Ci-.s alquil- aminocarbonila, C1. alquil-carbonilamino, carbamido, C1-6 alcanilóxi, sulfono, C1-s-alquilsulfoniloxi, nitro, azido, sulfanil, Ci-.e-alguiltio e halogênio, onde arila e heteroarila podem ser opcionalmente substituídas, e onde dois substituintes geminais juntos podem designar Oxo, tioxo, imino, ou metileno opcionalmente substituído.

[0159] Em algumas modalidades R', R?, Rà, Rº e Rº* são selecionados independentemente a partir de C1-.e alquila, tal como metila, e hidrogênio.

[0160] Em algumas modalidades R', R?, Rà, Rº e Rº* são todos hidrogênio.

[0161] Em algumas modalidades R', R?º, Rº são todos hidrogênio, e ou Rº e R* também são hidrogênio e o outro de Rº e R** é diferente de hidrogênio, tal como C1-« alquila, tal como metila.

[0162] Em algumas modalidades, Rº é hidrogênio ou metila. Em algumas modalidades, quando presente, Rº é hidrogênio ou metila.

[0163] Em algumas modalidades, um ou ambos de Rº e Rb são hidrogênio.

[0164] Em algumas modalidades, um de Rº e RP é hidrogênio e o outro é diferente de hidrogênio.

[0165] Em algumas modalidades, um de Rº e Rº? é metila e o outro é hidrogênio.

[0166] Em algumas modalidades, Rº e Rº são metila.

[0167] Em algumas modalidades, o birradical -X-Y- é -O-CH2-, W é O, e todos de R', R?, Rà, Rº e Rº* são todos hidrogênio. Esses nucleosídeos de LNA são descritos nos documentos WO 99/014226, WO 00/66604, WO 98/039352 e WO 2004/046160, que são todos no presente documento incorporados por referência e incluem o que é comumente conhecido como beta-D-oxi LNA e alfa-L-oxi LNA.

[0168] Em algumas modalidades, o birradical —-X-Y- é -S-CH2-, W é O, e todos de R', R?, Rà, Rº e R5* são hidrogênio. Tais nucleosídeos tio LNA são descritos nos documentos WO 99/014226 e WO 2004/046160.

[0169] Em algumas modalidades, o birradical -X-Y- é -NH-CH2-, W é O, e todos de R', R?º, Rà, Rº e Rº* são hidrogênio. Tais nucleosídeos amino LNA são descritos nos documentos WO 99/014226 e WO 2004/046160.

[0170] Em algumas modalidades, o birradical -XY- é -O-CH2-CH>2-

ou —O-CH2-CH2-CH2-, W é O, e todos de R', R?à, Rº, Rº e R5* são hidrogênio. Tais nucleosídeos de LNA são descritos em WO 00/047599 e por Morita e outros, Bioorganic & Med.Chem. Lett. 12, 73 a 76, que são no presente documento incorporados por referência e incluem o que é comumente conhecido como ácidos nucleicos em ponte com 2'-0-4'C- etileno (ENA).

[0171] Em algumas modalidades, o birradical -XY- é -O-CH>2-, W é O, e todos de R', R?º, Rà, e um de Rº e R* são hidrogênio, e o outro de Rº e Rº* é diferente de hidrogênio, tal como C1-6 alquila, tal como metila. Esses nucleosídeos de LNA 5' substituídos são descritos em WO 2007/134181.

[0172] Em algumas modalidades, o birradical -XY- é -O-CRºRº-, em que um ou ambos de Rº e Rº são outros que não hidrogênio, tal como metila, W é O e todos de R', R?à, Rà, e um de Rº e Rº* são hidrogênio, e o outro de Rº e Rº* é outro que não hidrogênio, tal como C1-6 alquila, tal como metila. Tais nucleosídeos de LNA bis modificados são descritos em WO 2010/077578.

[0173] Em algumas modalidades, o birradical -XY- designa o grupo ligante bivalente -O-CH(CH20CH;3) - (ácido nucleico bicíclico 2'O- metoxietil - Seth, e outros, 2010, J. Org. Chem. Vol. 75 (5) pág. 1569- 81). Em algumas modalidades, o birradical XY - designa o grupo ligante bivalente —-O-CH (CH2CH3) - (ácido nucleico bicíclico 2'O-etil - Seth, e outros, 2010, J. Org. Chem. Vol. 75 (5) 1569-81). Em algumas modalidades, o birradical -X-Y- é -O-CHR2-, W é O, e todos de R', R?, Rô, Rº e Rº* são hidrogênio. Tais nucleosídeos de LNA 6' substituídos são descritos nos documentos WO 10036698 e WO 07090071.

[0174] Em algumas modalidades, o birradical -X-Y- é -O-CH (CH20CH;3) -, W é O, e todos de R', R?à, R?à, R& e Rº* são hidrogênio. Tais nucleosídeos de LNA também são conhecidos como MOESs cíclicos na técnica (cCMOE) e são descritos em WO 07090071.

[0175] Em algumas modalidades, o birradical —-X-Y- designa o grupo ligante bivalente -O-CH (CH3) — ou na configuração R ou S. Em algumas modalidades, o birradical —X-Y- designa junto o grupo ligante bivalente —O-CH2-0-CH72- (Seth e outros, 2010, J. Org. Chem). Em algumas modalidades, o birradical -X-Y- é -O-CH(CH3) -, W é O, e todos de R', R?, Rà, Rº e R5* são hidrogênio. Esses nucleosídeos de 6º metil LNA também são conhecidos como nucleosídeos cET na técnica, e podem ser estereoisômeros (S)cCET ou (R)cET, conforme descrito nos documentos WO 07090071 (beta-D) e WO 2010/036698 (alpha-L)).

[0176] Em algumas modalidades, o birradical —X-Y- é -O-CRºRº-, em que nem Rº nem Rº é hidrogênio, W é O, e todos de R', R?, Rºà, Rº e Rº* são hidrogênio. Em algumas modalidades, Rº e Rº são ambos metila. Esses nucleosídeos de LNA 6' substituídos são descritos no documento WO 2009006478.

[0177] Em algumas modalidades, o birradical -X-Y- é -S-CHR?-, W é O, e todos de R', R?, Rºà, Rº e Rº* são hidrogênio. Tais nucleosídeos de tio LNA 6' substituídos são descritos no documento WO 11156202. Em algumas modalidades de tio LNA 6' substituído, Rº é metila.

[0178] Em algumas modalidades, o birradical -XY- é -C(= CH2)-C (RºRb)-, tal como —C (= CH2) -CH2- ou —C (= CH2) -CH (CH3) -, Wé O, e todos de R', R?º, Rº, Rº e Rº* são hidrogênio. Esses nucleosídeos de vinil carbo LNA são descritos nos documentos WO 08154401 e WO

09067647.

[0179] Em algumas modalidades, o birradical -X-Y- é —N(-ORº)-, W é O, e todos de R', R?à, Rà, Rº e Rº* são hidrogênio. Em algumas modalidades Rº é C1.6 alquila, tal como metila. Tais nucleosídeos de LNA também são conhecidos como LNAs N substituídos e são descritos no documento WO 2008/150729. Em algumas modalidades, o birradical —X-Y- juntos designa o grupo ligante bivalente -O-NRº-CH;3- (Seth e outros, 2010, J. Org. Chem). Em algumas modalidades, o birradical —X-

Y- é -N(Rº) -, Wé O, e todos de R', Rº?, Rà, Rº e Rº* são hidrogênio. Em algumas modalidades Rº é C1-6 alquila, tal como metila.

[0180] Em algumas modalidades, um ou ambos de Rº e R* é hidrogênio e, quando substituído, o outro de Rº e Rº* é C1.« alquila, tal como metila. Em tal modalidade, R', R?º, Rº podem todos ser hidrogênio, e o birradical -XY- pode ser selecionado a partir de -O-CH2- ou -O-CH (CR?) -, tal como -O-CH(CH;) -.

[0181] Em algumas modalidades, o birradical é -CRºRP-O-CRºRº-, tl como CH2-0-CH2>-, W é O, e todos de R', R?, Rà, Rº e Rº* são hidrogênio. Em algumas modalidades Rº é C1.6 alquila, tal como metila. Tais nucleosídeos de LNA também são conhecidos como nucleotídeos conformacionalmente restritos (CRNs) e são descritos no documento WO 2013036868.

[0182] Em algumas modalidades, o birradical é —O-CRºRº-O- CRºRº-, tal como O-CH2-0-CH2-, W é O, e todos de R', R?, Rà, R& e Rº* são hidrogênio. Em algumas modalidades Rº é C1-.6 alquila, tal como metila. Esses nucleosídeos de LNA também são conhecidos como nucleotídeos COC e são descritos por Mitsuoka e outros, Nucleic Acids Research 2009 37 (4), 1225 a 1238.

[0183] Será reconhecido que, a menos que especificado, os nucleosídeos de LNA podem estar na estereoforma beta-D ou alfa-L.

[0184] Certos exemplos de nucleosídeos de LNA são apresentados no Esquema 1. Esquema 1

[0185] Como ilustrado nos exemplos, em algumas modalidades da descrição, os nucleosídeos de LNA nos oligonucleotídeos são nucleosídeos beta-D-oxi-LNA. I.E. Degradação Mediada por Nuclease

[0186] A degradação mediada por nuclease refere-se a um oligonucleotídeo capaz de mediar a d endoribonuclease (RNase), tal como RNase H. Exemplos de modelos de oligonucleotídeos que operam via mecanismos mediados por nuclease são oligonucleotídeos que compreendem tipicamente uma região de pelo menos 5 ou 6 nucleosídeos de DNA e são flanqueados de um lado ou de ambos os lados por nucleosídeos que aumentam a afinidade, por exemplo "gapmers". II.F. Atividade e Recrutamento de RNase H

[0188] A atividade da RNase H de um oligonucleotídeo antissenso refere-se à sua capacidade de recrutar a RNase H quando em um duplex com uma molécula de RNA complementar e induzir a clivagem e subsequente degradação da molécula de RNA complementar. O documento WO 01/23613 fornece métodos in vitro para determinar a atividade da RNase H, que pode ser usada para determinar a capacidade de recrutar a RNase H. Tipicamente, um oligonucleotídeo é considerado capaz de recrutar a RNase H se, quando fornecido com uma sequência alvo complementar de ácido nucleico, tiver uma taxa inicial, medida em pmol /1/ min, de pelo menos 5%, tal como pelo menos 10% ou mais de 20% da taxa inicial determinada ao usar um oligonucleotídeo com a mesma sequência base que o oligonucleotídeo modificado sendo testado, mas contendo apenas monômeros de DNA, com ligações fosforotivcato entre todos os monômeros no oligonucleotídeo, e usando a metodologia fornecida pelo Exemplo 91 - 95 do documento WO 01/23613.

[0189] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo é considerado essencialmente incapaz de recrutar RNaseH se, quando fornecido com o ácido nucleico alvo complementar, a taxa inicial de RNaseH, medida em pmol / |/ min, for menor do que 20%, tal como menor do que 10%, tal como menor do que 5% da taxa inicial determinada ao usar um oligonucleotídeo com a mesma sequência de bases que o oligonucleotídeo sendo testado, mas contendo apenas monômeros de DNA, sem 2' substituições, com ligações fosforotioato entre todos os monômeros nos oligonucleotídeo, e usando a metodologia fornecida pelo Exemplo 91 - 95 do documento WO 01/23613.

11.G. Modelo de ASO

[0190] O ASO da descrição pode compreender uma sequência de nucleotídeos que compreende tanto os nucleotídeos quanto os análogos de nucleotídeos, e pode estar na forma de um "gapmer". Exemplos de configurações de um "gapmer" que pode ser usado com o ASO da descrição são descritos na Publicação de Pedido de Patente US. No. 2012/0322851.

[0191] O termo "gapmer", conforme no presente documento utilizado, refere-se a um oligonucleotídeo antissenso que compreende uma região de oligonucleotídeos de recrutamento de RNase H (lacuna) que é flanqueado 5' e 3' por um ou mais nucleosídeos modificados em afinidade (flancos). Vários modelos de "gapmer" são descritos no presente documento. O termo "gapmer" de LNA é um oligonucleotídeo "gapmer" em que pelo menos um dos nucleosídeos modificados de afinidade aumentada é um nucleosídeo de LNA. O termo "gapmer" de asa mista refere-se a um "gapmer" de LNA em que as regiões do flanco compreendem pelo menos um nucleosídeo de LNA e pelo menos um nucleosídeo de DNA ou nucleosídeo de LNA não modificado, tal como pelo menos um nucleosídeo modificado 2' substituído, tal como, por exemplo, 2'-O-alquil-RNA, 2 -O-metil-RNA, 2'-alcoxi-RNA, 2-O0- metoxietil-RNA (MOE), 2'-amino-DNA, 2'-Fluoro-RNA e nucleosídeo 2'- F-ANA. Em algumas modalidades, o "gapmer" de asa mista tem um flanco que compreende nucleosídeos de LNA (por exemplo, 5' ou 3) e o outro flanco (3' ou 5º com respeito) compreende nucleosídeos modificados 2' substituídos.

[0192] Em algumas modalidades, além de aumentar a afinidade do

ASO para a região alvo, alguns análogos de nucleosídeo também medeiam a ligação e clivagem da RNase (por exemplo, RNaseH).

11.G.1. Modelo de "gapmer"

[0193] Em uma modalidade, o ASO da descrição é um "gapmer". Um ASO "gapmer" é um ASO que compreende um trecho contíguo de nucleotídeos que é capaz de recrutar uma RNase, tal como RNaseH, tal como uma região de pelo menos 6 nucleotídeos de DNA, no presente documento chamados de região B (B), em que a região B é flanqueada 5' e 3' por regiões de análogos de nucleotídeos de afinidade aumentada, tal como de 1 a 10 análogos de nucleotídeos 5' e 3' ao trecho contíguo de nucleotídeos capaz de recrutar RNase - essas regiões são chamadas de regiões A (A) e C (C), respectivamente.

[0194] Em certas modalidades, o "gapmer" é um "gapmer" de flanco alternado, cujos exemplos são discutidos abaixo. Em certas modalidades, o "gapmer" de flanco alternado exibe menos ligação ao alvo do que um "gapmer" tradicional. Em certas modalidades, o "gapmer" de flanco alternado tem melhor tolerabilidade a longo prazo do que um "gapmer" tradicional.

[0195] Um "gapmer" de flanco alternado pode compreender uma sequência de (poli) nucleotídeos de fórmula (5' a 3'), ABC, em que: a região A (A) (região 5' ou uma primeira sequência de asa) compreende pelo menos um análogo de nucleotídeo, tal como pelo menos uma unidade de LNA, tal como de 1 a 10 análogos de nucleotídeos, tal como unidades de LNA, e; a região B (B) compreende pelo menos seis nucleotídeos consecutivos que são capazes de recrutar RNase (quando formados em um duplex com uma molécula de RNA complementar, tal como o pré-mRNA ou mRNA alvo), tal como nucleotídeos de DNA, e; a região C (C) (região 3' ou uma segunda sequência de asa) compreende pelo menos um análogo de nucleotídeo, tal como pelo menos uma unidade de LNA, tal como de 1 a 10 análogos de nucleotídeo, tal como unidades de LNA; em que as regiões A e C podem incluir em qualquer posição as 1-3 inserções A e C das regiões nucleotídicas do DNA (por exemplo, inserções de DNA), nas quais essas inserções de DNA podem ter de 1 a 6 unidades de DNA de comprimento.

[0196] Em certas outras modalidades, o "gapmer", por exemplo, um "gapmer" de flanco alternado, compreende uma sequência de (poli) nucleotídeos de fórmula (5' a 3'), A-B-C, ou opcionalmente A-B-C-D ou D-A-B-C, em que: região A (A) (região 5') compreende pelo menos um análogo de nucleotídeo, tal como pelo menos uma unidade de LNA, tal como de 1 a 10 análogos de nucleotídeo, tal como unidades de LNA, e; a região B (B) compreende pelo menos cinco nucleotídeos consecutivos que são capazes de recrutar RNase (quando formados em um duplex com uma molécula de RNA complementar, tal como o mMRNA alvo), tal como nucleotídeos de DNA, e; a região C (C) (região 3') compreende pelo menos um análogo de nucleotídeo, tal como pelo menos uma unidade de LNA, tal como de 1 a 10 análogos de nucleotídeo, tal como unidades de LNA, e; a região D (D), quando presente, compreende 1, 2 ou 3 unidades de nucleotídeo, tal como nucleotídeos de DNA.

[0197] Em algumas modalidades, a região A compreende 1,2,3,4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 análogos de nucleotídeo, tal como unidades de LNA, como de 2 a 5 análogos de nucleotídeo, tal como 2 a 5 unidades de LNA, tal como 2 a 5 análogos de nucleotídeos, tal como 3 a 5 unidades de LNA; e / ou região C consiste de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 análogos de nucleotídeo, tal como unidades de LNA, tal como de 2 a 5 análogos de nucleotídeo, tal como 2 a 5 unidades de LNA, tal como 2 a 5 análogos de nucleotídeos, tal como 3 a 5 unidades de LNA.

[0198] Em algumas modalidades B compreende 5, 6, 7, 8, 9, 10,11, 12,13, 14,15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 ou 23 nucleotídeos consecutivos que são capazes de recrutar RNase, ou de 6 a 14, 7 a 14, 8 a 14, ou de 7 a 10, ou de 7 a 9, tal como 8, tal como 9, tal como 10, ou tal como 14 nucleotídeos consecutivos que são capazes de recrutar RNase. Em algumas modalidades, a região B compreende pelo menos cinco unidades de nucleotídeo de DNA, tal como 5 a 23 unidades de DNA, tal como 5 a 20 unidades de DNA, tal como 5 a 18 unidades de DNA, tal como 6 a 18 unidades de DNA, tal como 6 a 14 unidades de DNA, tal como 8 a 14 unidades de DNA, tal como 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14 unidades de DNA.

[0199] Em algumas modalidades, a região A compreende 3, 4 ou 5 análogos de nucleotídeos, tal como LNA, a região B consiste de 5, 6,7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14 unidades de DNA, e a região C consiste de 3, 4 ou 5 análogos de nucleotídeos, tal como LNA. Tais modelos incluem (ABC) 5-10-5, 3-14-3, 3-10-3, 3-10-4, 4-10-3, 3-9-3, 3-9-4, 4- 9-3, 3-8-3, 3-8-4, 4-8-3, 3-7-3, 3-7-4 e 4-7-3, e podem incluir ainda a região D, que pode tem uma a três unidades de nucleotídeos, tal como unidades de DNA.

[0200] Em algumas modalidades, o ASO da descrição, por exemplo, um "gapmer" de flanco alternado, compreende a fórmula de 5'-A-B-C-3', em que: (i) a região B é uma sequência contígua de pelo menos 5, 6, 7,8, 9 ou 10, por exemplo, 5 a 18 unidades de DNA, capazes de recrutar RNase; (ii) a região A é uma primeira sequência de asa de 1 a 10 nucleotídeos, em que a primeira sequência de asa compreende um ou mais análogos de nucleotídeos e, opcionalmente, uma ou mais unidades de DNA (por exemplo, inserção de DNA) e em que pelo menos um dos análogos de nucleotídeos está localizado na extremidade 3' de A;e (iii) a região C é uma segunda sequência de asa de 1 a 10 nucleotídeos, em que a segunda sequência de asa compreende um ou mais análogos de nucleotídeos e opcionalmente uma ou mais unidades de DNA (por exemplo, inserção de DNA) e em que pelo menos um dos análogos de nucleotídeos está localizado na extremidade 5' de C.

[0201] Em algumas modalidades, a primeira sequência de asa (região A na fórmula) compreende uma combinação de análogos de nucleotídeos e unidades de DNA selecionadas a partir de (1) 1 a 10 análogos de nucleotídeos e O unidade de DNA; (ii) 1 a 9 análogos de nucleotídeos e 1 unidade de DNA; (ili) 1 a 8 análogos de nucleotídeos e 1 a 2 unidades de DNA; (iv) 1 a 7 análogos de nucleotídeos e 1 a 3 unidades de DNA; (v) 1 a 6 análogos de nucleotídeos e 1 a 4 unidades de DNA; (vi) 1 a 5 análogos de nucleotídeos e 1 a 5 unidades de DNA; (vii) 1 a 4 análogos de nucleotídeos e 1 a 6 unidades de DNA; (viii) 1 a 3 análogos de nucleotídeos e 1 a 7 unidades de DNA; (ix) 1 a 2 análogos de nucleotídeos e 1 a 8 unidades de DNA; (x) 1 análogo de nucleotídeo e 1 a 9 unidades de DNA.

[0202] Em certas modalidades, a segunda sequência de asa (região C na fórmula) compreende uma combinação de análogos de nucleotídeos e unidade de DNA selecionados a partir de (i) 1 a 10 análogos de nucleotídeos e O unidade de DNA; (ii) 1 a 9 análogos de nucleotídeos e 1 unidade de DNA; (iii) 1 a 8 análogos de nucleotídeos e 1 a 2 unidades de DNA; (iv) 1 a 7 análogos de nucleotídeos e 1a 3 unidades de DNA; (v) 1 a 6 análogos de nucleotídeos e 1 a 4 unidades de DNA; (vi) 1 a 5 análogos de nucleotídeos e 1 a 5 unidades de DNA; (vii) 1 a 4 análogos de nucleotídeos e 1 a 6 unidades de DNA; (viii) 1 a 3 análogos de nucleotídeos e 1 a 7 unidades de DNA; (ix) 1 a 2 análogos de nucleotídeos e 1 a 8 unidades de DNA; (x) 1 análogo de nucleotídeo e 1 a 9 unidades de DNA.

[0203] Em algumas modalidades, a região A na fórmula ASO tem uma subfórmula selecionada a partir do primeiro modelo de asa de quaisquer ASOs nas Figuras 2 e 3, e / ou região C na fórmula ASO tem uma subfórmula selecionada a partir do segundo modelo de asa de quaisquer ASOs nas Figuras 2 e 3, em que a letra maiúscula é um análogo de nucleotídeo (por exemplo, análogo de açúcar modificado, que também pode ser escrito como L) e a letra minúscula é DNA (que também pode ser escrito como D).

[0204] Em certas modalidades, o ASO, por exemplo, um "gapmer" de flanco alternado, tem a fórmula de 5' ABC 3', em que a região B é uma sequência contígua de 5 a 18 unidades de DNA, a região A tem uma fórmula de LLDLL, LDLLL, ou LLLDL, e a região C tem uma fórmula de LLDLL ou LDLDLL, e em que L é uma unidade de LNA e D é uma unidade de DNA.

[0205] Em algumas modalidades, o ASO tem a fórmula de 5' ABC 3, em que a região B é uma sequência contígua de 10 unidades de DNA, a região A tem a fórmula de LDL, e a região C tem a fórmula de LLLL, em que L é uma unidade de LNA e D é uma unidade de DNA.

[0206] Outros modelos de "gapmer" são descritos no documento WO 2004/046160, que é no presente documento incorporado por referência em sua totalidade. O documento WO 2008/113832 no presente documento incorporado por referência em sua totalidade, refere-se a ASOs "gapmer" “shortmer. Em algumas modalidades, os ASOs no presente documento apresentados podem ser ASOs "gapmer" “shortmer'.

[0207] Em algumas modalidades, o ASO, por exemplo, um "gapmer" de flanco alternado, compreende uma sequência de nucleotídeos contíguos de um total de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 unidades de nucleotídeo, em que a sequência de nucleotídeos contíguos é de fórmula (5' - 3'), A-B-C, ou opcionalmente A-B-C-D ou D- A-B-C, em que: a região A consiste de 1, 2, 3, 4 ou 5 unidades de análogos de nucleotídeos, tal como unidades de LNA; a região B consiste de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14 unidades de nucleotídeos contíguos que são capazes de recrutar RNase quando formadas em um duplex com uma molécula de RNA complementar (tal como um mMRNA alvo); e a região C consiste de 1, 2, 3, 4 ou 5 unidades de análogos de nucleotídeos, tal como unidades de LNA. Quando presente, a região D consiste de uma única unidade de DNA.

[0208] Em algumas modalidades A compreende 1 unidade de LNA. Em algumas modalidades, a região A compreende 2 unidades de LNA. Em algumas modalidades, a região A compreende 3 unidades de LNA. Em algumas modalidades, a região A compreende 4 unidades de LNA. Em algumas modalidades, a região A compreende 5 unidades de LNA. Em algumas modalidades, a região C compreende 1 unidade de LNA. Em algumas modalidades C compreende 2 unidades de LNA. Em algumas modalidades, a região C compreende 3 unidades de LNA. Em algumas modalidades, a região C compreende 4 unidades de LNA. Em algumas modalidades, a região C compreende 5 unidades de LNA. Em algumas modalidades, a região B compreende 6 unidades de nucleotídeos. Em algumas modalidades, a região B compreende 7 unidades de nucleotídeos. Em algumas modalidades, a região B compreende 8 unidades de nucleotídeos. Em algumas modalidades, a região B compreende 9 unidades de nucleotídeos. Em certas modalidades, a região B compreende 10 unidades de nucleosídeos. Em certas modalidades, a região B compreende 11 unidades de nucleosídeos. Em certas modalidades, a região B compreende 12 unidades de nucleosídeos. Em certas modalidades, a região B compreende 13 unidades de nucleosídeos. Em certas modalidades, a região B compreende 14 unidades de nucleosídeos. Em certas modalidades, a região B compreende 7 a 23 monômeros de DNA ou 5 a 18 monômeros de DNA. Em algumas modalidades, a região B compreende de 6 a 23 unidades de DNA, tal como 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 ou 23 unidades de DNA. Em algumas modalidades, a região B consiste de unidades de DNA. Em algumas modalidades, a região B compreende pelo menos uma unidade de LNA que está na configuração alfa-L, tal como 2, 3, 4, 5,6,7,8,9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 ou 23 unidades de LNA na configuração alfa-L.

Em algumas modalidades, a região B compreende pelo menos uma unidade de LNA alfa-L-oxi ou em que todas as unidades de LNA na configuração alfa-L são unidades de LNA alfa-L-oxiá.

Em algumas modalidades, o número de nucleotídeos presentes em A-B-C é selecionado a partir de (unidades análogos de nucleotídeos - região B - unidades de análogos de nucleotídeos): 1-8-1, 1-8-2, 2-8-1, 2-8-2, 3-8-3, 2-8-3, 3-8-2, 4-8-1, 4-8-2, 1-8-4, 2-8-4 ou; 1- 9-1, 1-9-2, 2-9-1, 2-9-2, 2-9-3, 3-9-2, 1-9-3, 3-9-1, 4-9-1, 1- 9-4, ou; 1- 10-1, 1-10-2, 2-10-1, 2-10-2, 1-10-3 e 3-10-1. Em algumas modalidades, o número de nucleotídeos em A-B-C é selecionado a partir de: 2-7-1, 1- 7-2, 2-7-2, 3-7-3, 2-7-3, 3-7-2, 3 -7-4 e 4-7-3. Em outras modalidades, o ASO contém 10 unidades de DNA em B, LDLLL em A (primeira asa) e LLDLL em C (segunda asa). Em ainda outras modalidades, o ASO contém 9 unidades de DNA em B, LDDLL em A e LDLDLL em C.

Em ainda outras modalidades, o ASO contém 10 unidades de DNA em B, LLDLL em A e LLDLL em C.

Em outras modalidades, o ASO contém 9 unidades de DNA em B, LLLLL em A e LDDLL em C.

Em certas modalidades, cada uma das regiões A e C compreende três monômeros de LNA, e a região B consiste de 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14 monômeros de nucleosídeo, por exemplo, monômeros de DNA.

Em algumas modalidades, A e C consistem de duas unidades de LNA cada um, e B consiste de 7, 8 ou 9 unidades de nucleotídeo, por exemplo, unidades de DNA.

Em várias modalidades, outros modelos de "gapmer" incluem aqueles em que as regiões A e / ou C consistem de 3, 4, 5 ou 6 análogos de nucleosídeo, tal como monômeros contendo açúcar 2'-O-metoxietil- ribose (2-MOE) ou monômeros contendo um açúcar 2”-fluoro- desoxirribose, e a região B consiste de 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14,15,

16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 ou 23 nucleosídeos, tal como monômeros de DNA, em que as regiões A-B-C têm 3-8-3, 3-9-3, 3-10-3, 5-10-5 ou 4- 12-4 monômeros. Os modelos de "gapmer" adicionais são descritos no documento WO 2007/146511A2, no presente documento incorporado por referência em sua totalidade.

[0209] Em algumas modalidades, o ASO de flanco alternado tem pelo menos 10 nucleotídeos contíguos, compreendendo a região A, a região B e a região C (A-B-C), em que a região B compreende pelo menos 5 unidades de nucleosídeos consecutivas e é flanqueada a 5' pela região A de 1 a 8 unidades de nucleosídeos contíguos e em 3' pela região C de 1 a 8 unidades de nucleosídeos contíguos, em que a região B, quando formada em um duplex com um RNA complementar, é capaz de recrutar RNaseH, e em que a região A e a região C são selecionadas a partir do grupo que consiste de: (i) a região A compreende uma unidade de nucleosídeo de LNA 5' e uma unidade de nucleosídeo de LNA 3', e pelo menos uma unidade de nucleosídeo de DNA entre a unidade nucleosídeo de LNA 5' e a unidade nucleosídeo de LNA 3' e, a região C compreende pelo menos dois nucleosídeos de LNA 3'; (ii) a região A compreende pelo menos um nucleosídeo de LNA 5' e a região C compreende uma unidade de nucleosídeo de LNA 5', pelo menos duas unidades de nucleosídeo de LNA 3' terminal, e pelo menos uma unidade de nucleosídeo de DNA entre a unidade de nucleosídeo de LNA 5' e as unidades de nucleosídeo LNA 3º, e (ili) a região A compreende uma unidade de nucleosídeo LNA 5' e uma unidade de nucleosídeo LNA 3', e pelo menos uma unidade de nucleosídeo de DNA entre a unidade de nucleosídeo de LNA 5' e a unidade de nucleosídeo de LNA 3'; e a região C compreende uma unidade de nucleosídeo de LNA 5', pelo menos duas unidades de nucleosídeo de LNA 3' termina, e pelo menos uma unidade de nucleosídeo de DNA entre a unidade de nucleosídeo de LNA 5 e as unidades de nucleosídeo de LNA 3.

[0210] Em algumas modalidades, a região A ou a região C compreende 1, 2 ou 3 unidades de nucleosídeo de DNA. Em outras modalidades, a região A e a região C compreendem 1, 2 ou 3 unidades de nucleosídeo de DNA. Em ainda outras modalidades, a região B compreende pelo menos cinco unidades de nucleosídeos de DNA consecutivas. Em certas modalidades, a região B compreende 6, 7,8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14 unidades de nucleosídeos de DNA consecutivas. Em algumas modalidades, a região B tem 8, 9 10, 11 ou 12 nucleotídeos de comprimento. Em outras modalidades, a região A compreende duas unidades de nucleosídeo de LNA 5' terminal. Em algumas modalidades, a região A tem a fórmula 5'[LNA]:-3[DNA]J-3[LNA]1-3, ou 5[LNA]-2[DNA]1- 2[LNA]1-2[DNAJ]1-2[LNA]1-2. Em outras modalidades, a região C tem a fórmula [LNA]:-3[DNA]J:-3[LNA]2-3 3', ou [LNA]:-2[DNA]1-2[LNA]1-2[DNA]1- 2[LNA]2.33'. Em ainda outras modalidades, a região A tem a fórmula S'ILNA]J1-a3[DNA]J-3[LNA]1-3, ou 5"[LNA]J1-2[DNA]1-2[LNA]1-2[DNA] 1-2[LNA] 1-2 e a região C compreende 2, 3, 4 ou 5 unidades de nucleosídeos consecutivas de LNA. Em algumas modalidades, a região C tem a fórmula [LNA] 1-3 [DNA] 1-3 [LNA] 2-33'ou [LNA] 1-2 [DNA] 1-2 [LNA] 1- 2 [DNA] 1 -2 [LNA] 2-33', e a região A compreende 1, 2, 3,4 ou 5 unidades de nucleosídeos de LNA consecutivas. Em ainda outras modalidades, a região A tem uma sequência de nucleosídeos de LNA e DNA, 5' - 3' selecionada a partir do grupo que consiste de L, LL, LDL, LLL, LLDL, LDLL, LDDL, LLLL, LLLLL, LLLDL, LLDLL, LDLLL, LLDDL, LDDLL, LLDLD, LDLLD, LDDDL, LLLLLL, LLLLDL, LLLDLL, LLDLLL, LDLLLL, LLLDDL, LLDLDL, LLDDLL, LDDLLL, LDLLDL, LDLDLL, LDDDLL, LLDDDL, e LDLDLD, em que L representa um nucleosídeo de LNA, e D representa um nucleosídeo de DNA. Em ainda outras modalidades, a região C tem uma sequência de nucleosídeos de LNA e

DNA, 5' - 3' selecionada a partir do grupo que consiste de LL, LLL, LLLL, LDLL, LLLLL, LLDLL, LDLLL, LDDLL, LDDLLL, LLDDLL, LDLDLL, LDDDLL, LDLDDLL, LDDLDLL, LDDDLLL, e LLDLDLL. Em uma modalidade adicional, a região A tem uma sequência de nucleosídeos de LNA e DNA, 5º - 3º selecionada a partir do grupo que consiste de LDL, LLDL, LDLL, LDDL, LLLDL, LLDLL, LDLLL, LLDDL, LDDLL, LLDLD, LDLLD, LDDDL, LLLLDL, LLLDLL, LLDLLL, LDLLLL, LLLDDL, LLDLDL, LLDDLL, LDDLLL, LDLLDL, LDLDLL, LDDDLL, LLDDDL, e LDLDLD, e a região C tem uma sequência de nucleosídeos de LNA e DNA, 5' - 3' selecionada a partir do grupo que consiste de LDLL, LLDL, LLLLL, LLDLL, LDLLL, LDDLL, LDDLLL, LLDDLL, LDLDLL, LDDDLL, LDLDDLL, LDDLDLL, LDDDLLL, e LLDLDLL.

[0211] Em certas modalidades, o ASO flanco alternado tem nucleotídeos — contíguos — compreendendo uma sequência de nucleosídeos, 5'— 3', selecionada a partir do grupo que consiste de LDLDDDDDDDDDDLLLL, LLDDDLLDDDDDDDDLL, LDLLDLDDDDDDDDDLL, LLLDDDDDDDDDDLDLL, LLLDDDDDDDDDLDDLL, LLLDDDDDDDDLDDDLL, LLLDDDDDDDDLDLDLL, LLLDLDDDDDDDDDLLL, LLLDLDDDDDDDDLDLL, LLLLDDDDDDDDDLDLL, LLLLDDDDDDDDLDDLL, LLLDDDLDDDDDDDDLL, LLLDDLDDDDDDDDDLL, LLLDDLLDDDDDDDDLL, LLLDDLLDDDDDDDLLL, LLLLLDDDDDDDLDDLL, LDLLLDDDDDDDDDDLL, LDLLLDDDDDDDLDDLL, LDLLLLDDDDDDDDDLL, LLDLLLDDDDDDDDDLL, LLLDLDDDDDDDDDDLL, LLLDLDDDDDDDLDDLL, LLLDLLDDDDDDDDDLL, LLLLDDDDDDDLDDDLL, LDDLDDDDDDDDDLDLLL, LDDLDDDDDDDDDLLDLL, LLLLLDDDDDDDDDLDLL, LLLLDDDDDDDDDDLDLL, LLLDDDDDDDDDDDLDLL, LLDLDDDDDDDDDDLDLL,

LDLLLDDDDDDDDDLDLL, LLLDDDDDDDDDDLDDLL, LLLDDDDDDDDDLDDDLL, LLLDDDDDDDDLDLDDLL, LLLLDDDDDDDDDLDDLL, LLLLDDDDDDDDDLDLLL, LLLLDDDDDDDDLDDDLL, LLLLDDDDDDDDLDDLLL, LLLLDDDDDDDDLDLDLL, LLLLDDDDDDDLDDLDLL, LLLLDDDDDDDLDLDDLL, LLDLLDDDDDDDDDDDLL, LLDLLLDDDDDDDDLDLL, LLLDLDDDDDDDDDDDLL, LLLDLDDDDDDDDDLDLL, LLLDLDDDDDDDDLDDLL, LLLDLDDDDDDDLDLDLL, LLLLDDDDDDDDDLLDLL, LLLLLDDDDDDDDDLDLLL, LLLLLDDDDDDDDDLDDLL, LLLLDDDDDDDDDDLLDLL, LLLLDDDDDDDDDDLDLLL, LLLLDDDDDDDDDDLDDLL, LLLDDDDDDDDDDDLLDLL, LLLDDDDDDDDDDDLDLLL, LLLLLDDDDDDDDDLLDLL, LLLDDDDDDDDDDDLDDLL, LLDLLDDDDDDDDDLDDLL, LLLDLDDDDDDDDDDLDLL, LLLDLDDDDDDDDDLDDLL, LLLLDDDDDDDDDLDLDLL, LLLLDDDDDDDDLLDLDLL, LDLLLDDDDDDDDDDLLDLL, LLDLLDDDDDDDDDDLLDLL, LLDLDDDDDDDDDDDDLLLL, LLDDLDDDDDDDDDDDLLLL, LLLDLDDDDDDDDDDDLLLL, LLDLDDDDDDDDDDDDDLLL, LLDLLDDDDDDDDDDDLLLL, LLDDLDDDDDDDDDDDDLLL, LLLDDDDDDDDDDDLDDLLL, LLLDLDDDDDDDDDDDDLLL, LLDLLDDDDDDDDDDDDLLL, LLLLDDDDDDDDDDDLLDLL, LLLLDDDDDDDDDDLLDDLL, LLLDDLDDDDDDDDDLDLLL, LLDDLDLDDDDDDDDDLLLL, LLDDLLDDDDDDDDDLDLLL, LLLDLDDDDDDDDDLDLDLL, LLDLLDDDDDDDDDLDDLLL, LLLDLDDDDDDDDDDLDLLL, LLDLDDLDDDDDDDDDLLLL, LLLLDDDDDDDDDLDLDDLL, LLLDLDDDDDDDDDLDDLLL, LLDLDLDDDDDDDDDDLLLL, LLDLLDDDDDDDDDDLDLLL, LLDLDLDDDDDDDDDLLDLL, LLDDLLDDDDDDDDDLLDLL, LLLLDDDDDDDDDLDDLDLL, LLLDDLDDDDDDDDDLLDLL,

LLDLLDDDDDDDDDLLDDLL, LLDLDLDDDDDDDDDLDLLL, LLLDLDDDDDDDDDLLDDLL, LLDDLLDDDDDDDDDDLLLL, LLDLLDDDDDDDDDLDLDLL, LLLLDDDDDDDDDDLDDLLL, LLLDDLDDDDDDDDDDLLLL, LLLDLDDDDDDDDDDLLDLL, LLLLDDDDDDDDDDLDLDLL, LLLLDDDDDDDDDDDLDLLL, e LLDDLLDDDDDDDDDDLDLL; em que L representa um nucleosídeo de LNA, e D representa um nucleosídeo de DNA. Em outras modalidades, o nucleosídeo de LNA é beta-D-oxi LNA.

[0212] Em ainda outras modalidades, um ASO de flanco alternado tem nucleotídeos contíguos compreendendo uma sequência alternada de unidades de nucleosídeos de LNA e DNA, 5"-3', selecionada a partir do grupo que consiste de: 1-1-1-10-4, 1-2-1-9-2-1-2, 1-2-1-9-1-1-3, 2-3- 2-8-2, 1-1-2-1-1-9-2, 3-10-1-1-2, 3-9-1-2-2, 3-8-1-3-2, 3-8-1-1-1-1-2, 3- 1-1-9-3, 3-1-1-8-1-1-2, 4-9-1-1-2, 4-8-1-2-2, 3-3-1-8-2, 3-2-1-9-2, 3-2-2- 8-2, 3-2-2-7-3, 5-7-1-2-2, 1-1-3-10-2, 1-1-3-7-1-2-2, 1-1-4-9-2, 2-1-3-9- 2,3-1-1-10-2, 3-1-1-7-1-2-2, 3-1-2-9-2, 4-7-1-3-2, 5-9-1-1-2, 4-10-1-1-2, 3-11-1-1-2, 2-1-1-10-1-1-2, 1-1-3-9-1-1-2, 3-10-1-2-2, 3-9-1-3-2, 3-8-1- 1-1-2-2, 4-9-1-2-2, 4-9-1-1-3, 4-8-1-3-2, 4-8-1-2-3, 4-8-1-1-1-1-2, 4-7-1- 2-1-1-2, 4-7-1-1-1-2-2, 2-1-2-11-2, 2-1-3-8-1-1-2, 3-1-1-11-2, 3-1-1-9-1- 1-2, 3-1-1-8-1-2-2, 3-1-1-7-1-1-1-1-2, 4-9-2-1-2, 4-7-1-3-3, 5-9-1-1-3, 5- 9-1-2-2, 4-10-2-1-2, 4-10-1-1-3, 4-10-1-2-2, 3-11-2-1-2, 3-11-1-1-3, 5-9- 2-1-2, 3-11-1-2-2, 2-1-2-9-1-2-2, 3-1-1-10-1-1-2, 3-1-1-9-1-2-2, 4-9-1-1- 1-1-2, 4-8-2-1-1-1-2, 1-1-3-10-2-1-2, 2-1-2-10-2-1-2, 2-1-1-12-4, 2-2-1- 11-4, 3-1-1-11-4, 2-1-1-13-3, 2-1-2-11-4, 2-2-1-12-3, 3-11-1-2-3, 3-1-1- 12-3, 2-1-2-12-3, 4-11-2-1-2, 4-10-2-2-2, 3-2-1-9-1-1-3, 2-2-1-1-1-9-4, 2- 2-2-9-1-1-3, 3-1-1-9-1-1-1-1-2, 2-1-2-9-1-2-3, 3-1-1-10-1-1-3, 2-1-1-2-1- 9-4, 4-9-1-1-1-2-2, 3-1-1-9-1-2-3, 2-1-1-1-1-10-4, 2-1-2-10-1-1-3, 2-1-1- 1-1-9-2-1-2, 2-2-2-9-2-1-2, 4-9-1-2-1-1-2, 3-2-1-9-2-1-2, 2-1-2-9-2-2-2, 2-1-1-1-1-9-1-1-3, 3-1-1-9-2-2-2, 2-2-2-10-4, 2-1-2-9-1-1-1-1-2, 4-10-1- 2-3, 3-2-1-10-4, 3-1-1-10-2-1-2, 4-10-1-1-1-1-2, 4-11-1-1-3, e 2-2-2-10-

1-1-2; em que o primeiro numeral representa um número de unidades de LNA, o seguinte representa um número de unidades de DNA, e regiões de LNA e DNA alternadas em seguida.

[0213] Em outras modalidades, os ASOs da descrição são representados como qualquer um dos números ASO selecionados a partir das Figuras 2e 3.

[0214] Em algumas modalidades, o ASO da descrição (ou seja, ASO-005459) compreende uma sequência de nucleotídeos contíguos de 17 nucleotídeos de comprimento, que corresponde ao complemento de uma região (isto é, junção entre o íntron 1 e o éxon 2) do transcrito de SNCA, isto é, nucleotídeos 7.604 - 7.620 da SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o ASO da descrição tem a sequência de nucleotídeos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 15 (isto é, attcetttacaccacac) com um modelo ASO de LDLDDDDDDDDDDLLLL (isto é, AtTcctttacaccACAC), em que o L indica um nucleosídeo de ácido nucleico bloqueado (isto é, LNA, por exemplo, beta-D-oxi-LNA) e o D indica um ácido desoxirribonucleico (DNA). Por conseguinte, o 1º, o 3º e 0 14º-17º nucleotídeos da extremidade 5' de ASO-005459 são beta- D-oxi-LNA e cada um dos outros nucleotídeos é DNA. Em outras modalidades, o ASO descrito no presente documento também tem a seguinte estrutura química: OxyAs DNAts OxyTs DNAcs DNAcs DNAts DNAts DNAts DNAas DNAcs DNAas DNAcs DNAcs DNAcs OxyAs OxyMCs OxyAs OxyMC, em que "s" indica uma ligação fosforotioato. À fórmula estrutural para ASO-005459 é fornecida na Figura 21B, em que M+ é um contraíon farmaceuticamente aceitável. O termo "contraíon farmaceuticamente aceitável", como usado no presente documento, refere-se a um íon que acompanha uma espécie iônica a fim de manter a neutralidade elétrica que não é biologicamente ou de outro modo indesejável e, desse modo, permitir a produção de uma forma de sal farmaceuticamente *aceitável.. Consequentemente, em algumas modalidades, o contraíon farmaceuticamente aceitável pode ser H*, Na*, K*, NH, Li? ou qualquer outro cátion, por exemplo, um cátion com uma carga de 1+ Em algumas modalidades, o contraíon farmaceuticamente aceitável é H*, Na*, NH ou combinações dos mesmos.

11.H. Ligações Internucleotídicas

[0215] Os monômeros dos ASOs no presente documento descritos são acoplados juntos via grupos de ligação. Adequadamente, cada monômero está ligado ao monômero adjacente 3' através de um grupo de ligação.

[0216] A pessoa versada na técnica entenderia que, no contexto da presente descrição, o monômero 5' na extremidade de um ASO não compreende um grupo de ligação 5, embora possa ou não compreender um grupo terminal 5.

[0217] Os termos "grupo de ligação" e "ligação internucleotídica" são destinados a significar um grupo capaz de acoplar covalentemente dois nucleotídeos juntos. Exemplos específicos e preferenciais incluem grupos fosfato e grupos fosforotioato.

[0218] Os nucleotídeos do ASO da descrição ou sequência de nucleotídeos contíguos dos mesmos são acoplados juntos via grupos de ligação. Adequadamente, cada nucleotídeo está ligado ao nucleotídeo 3' adjacente através de um grupo de ligação.

[0219] As ligações internucleotídicas adequadas incluem aquelas listadas no documento WO 2007/031091, por exemplo, as ligações internucleotídicas listadas no primeiro parágrafo da página 34 do documento WO 2007/031091 (no presente documento incorporadas por referência em sua totalidade).

[0220] Exemplos de ligações internucleotídicas adequadas que podem ser usadas com a descrição incluem ligação fosfodiéster, ligação fosfotriéster, ligação metilfosfonato, ligação fosforamidato, ligação fosforotioato, e combinações dos mesmos.

[0221] É, em algumas modalidades, preferencial modificar a ligação internucleotídica de seu fosfodiéster normal para uma que seja mais resistente ao ataque de nuclease, tal como fosforoticato ou boranofosfato - esses dois, sendo cliváveis pela RNaseH, também permitem que a via de inibição antissenso na redução da expressão do gene alvo.

[0222] As ligações internucleotídicas contendo enxofre (S) adequadas, como no presente documento fornecidas, podem ser preferenciais. Também são preferenciais ligações internucleotídicas fosforoticoato, particularmente para a região de lacuna (B) dos "gapmers". As ligações fosforotioato também podem ser usadas para as regiões flanqueadoras (A e C, e para ligar A ou C a D, e dentro da região D, conforme apropriado).

[0223] As regiões A, B e C podem, no entanto, compreender ligações internucleotídicas diferentes de fosforotioato, tal como ligações fosfodiéster, particularmente, por exemplo, quando o uso de análogos de nucleotídeos protege as ligações internucleotídicas nas regiões A e C da degradação da endonuclease - como quando as regiões A e C compreendem nucleotídeos de LNA.

[0224] As ligações internucleotídicas no ASO podem ser fosfodiéster, fosforotioato ou boranofosfato, de modo a permitir a clivagem pela RNaseH do RNA alvo. O fosforotioato é preferencial para melhorar a resistência à nuclease e outras razões, tal como facilidade de fabricação. Em algumas modalidades, as ligações internucleotídicas compreendem uma ou mais ligações internucleotídicas estéreo- definidas (por exemplo, como ligações fosfato modificadas estéreo- definidas, por exemplo, ligações fosfodiéster, fosforotiocato ou boranofosfato com uma estrutura estereoquímica definida). O termo "ligação internucleotídica estéreo-definida' é usado de forma intercambiável com "ligação internucleotídica quiralmente controlada" e refere-se a uma ligação internucleotídica na qual a designação estereoquímica do átomo de fósforo é controlada de modo que uma quantidade específica de R, ou S, da ligação internucleotídica esteja presente dentro de uma fita de ASO. A designação estereoquímica de uma ligação quiral pode ser definida (controlada), por exemplo, por síntese assimétrica. Um ASO tendo pelo menos uma ligação internucleotídica estéreo-definida pode ser chamado de ASO estéreo- definido, que inclui um ASO totalmente estéreo-definido e um ASO parcialmente estéreo-definido.

[0225] Em algumas modalidades, um ASO é totalmente estéreo- definido. Um ASO totalmente estéreo-definido refere-se a uma sequência ASO com um centro quiral definido (Rf ou S,) em cada ligação internucleotídica no ASO. Em algumas modalidades, um ASO é parcialmente estéreo-definido. Un ASO parcialmente estéreo-definido refere-se a uma sequência de ASO tendo um centro quiral definido (R,p ou Sp) em pelo menos uma ligação internucleotídica, mas não em todas as ligações internucleotídicas. Portanto, um ASO parcialmente estéreo- definido pode incluir ligações que são aquirais ou não estéreo-definidas, além de pelo menos uma ligação estéreo-definida. Quando uma ligação internucleotídica em um ASO é estéreo-definida, a configuração desejada, R, ou S,, está presente em pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, em pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou essencialmente 100% do ASO.

[0226] Em um aspecto do ASO da descrição, os nucleotídeos e / ou análogos de nucleotídeos estão ligados entre si por meio de grupos fosforotioato.

[0227] É reconhecido que a inclusão de ligações fosfodiéster, tal como uma ou duas ligações, em um ASO de fosforotioato, particularmente entre ou adjacente a unidades de análogos de nucleotídeo (normalmente na região A e ou C) pode modificar a biodisponibilidade e / ou a biodistribuição de um ASO - ver WO 2008/113832, no presente documento incorporado por referência.

[0228] Em algumas modalidades, tal como as modalidades mencionadas acima, quando adequadas e não especificamente indicadas, todos os grupos de ligação restantes são fosfodiéster ou fosforotioato, ou uma mistura dos mesmos.

[0229] Em algumas modalidades, todos os grupos de ligação internucleotídica são fosforotioato.

[0230] Quando se referindo a sequências de oligonucleotídeos "gapmer" específicas, como as no presente documento fornecidas, entender-se-á que, em várias modalidades, quando as ligações são ligações fosforotioato, podem ser utilizadas ligações alternativas, como as no presente documento descritas, por exemplo, ligações fosfato (fosfodiéster) podem ser usadas, particularmente para ligações entre unidades de análogos de nucleotídeos, tal como de LNA. Da mesma forma, quando se referindo a sequências de oligonucleotídeos "gapmer" específicas, como as no presente documento fornecidas, quando os resíduos C são anotados como citosina 5-metil modificada, em várias modalidades, um ou mais dos Cs presentes no ASO podem ser resíduos C não modificados.

[0231] A publicação US 2011/1130441, publicada em 2 de junho de 2011 e incorporada no presente documento por referência em sua totalidade, refere-se a compostos ASO tendo pelo menos um nucleosídeo bicíclico ligado aos terminais 3' ou 5º por uma ligação internucleosídica neutra. Os ASOs da descrição podem, portanto, ter pelo menos um nucleosídeo bicíclico ligado aos terminais 3' ou 5' por uma ligação internucleosídica neutra, tal como um ou mais fosfotriéster, metilfosfonato, MMI (3'-CH2-N (CH3) —O -5 '), amida-3 (3-CH2-C (=O) -N(H) -5'), formalcetal (3-O0-CH2-0-5') ou tioformacetal (3"-S -CH2-0-5"). As ligações restantes podem ser fosforotioato.

[0232] Em algumas modalidades, os ASOs da descrição têm ligações internucleotídicas descritas nas Figuras 2 e 3. Como no presente documento utilizado, por exemplo, as Figuras 2 e 3, as ligações fosforotioato são indicadas como "s" e as ligações fosfodiéster são indicadas pela ausência de "s".

11.1. Conjugados

[0233] O termo conjugado como no presente documento utilizado refere-se a um oligonucleotídeo que está covalentemente ligado a uma porção não nucleotídica (porção conjugada ou região C ou terceira região).

[0234] A conjugação do oligonucleotídeo da descrição a uma ou mais porções não nucleotídicas pode melhorar a farmacologia do oligonucleotídeo, por exemplo, afetando a atividade, a distribuição celular, a captação celular ou a estabilidade do oligonucleotídeo. Em algumas modalidades, a porção conjugada modifica ou aprimora as propriedades farmacocinéticas do oligonucleotídeo, melhorando a distribuição celular, a biodisponibilidade, o metabolismo, a excreção, a permeabilidade e / ou a captação celular do oligonucleotídeo. Em particular, o conjugado pode direcionar o oligonucleotídeo para um órgão, tecido ou tipo de célula específico e, assim, aumentar a eficácia do oligonucleotídeo nesse órgão, tecido ou tipo de célula. Ao mesmo tempo, o conjugado pode servir para reduzir a atividade do oligonucleotídeo em tipos de células, tecidos ou órgãos não alvo, por exemplo, a atividade ou atividade fora do alvo ou atividade em tipos de células, tecidos ou órgãos não alvo. Os documentos WO 93/07883 e

WO 2013/033230 fornecem porções conjugadas adequadas. Porções conjugadas adequadas adicionais são aquelas capazes de se ligar ao receptor de asialoglicoproteína (ASGPr). Em particular, as porções conjugadas de N-acetilgalactosamina trivalente são adequadas para ligação ao ASGPr, ver, por exemplo, WO 2014/076196, WO 2014/207232 e WO 2014/179620.

[0235] Os conjugados de oligonucleotídeos e sua síntese também foram relatados em revisões abrangentes de Manoharan em Antisense Drug Technology, Principles, Strategies, and Applications, S.T. Crooke, ed., Cap. 16, Marcel Dekker, Inc., 2001 e Manoharan, Antisense and Nucleic Acid Drug Development, 2002, 12, 103.

[0236] Em uma modalidade, a porção não nucleotídica (porção conjugada) é selecionada a partir do grupo que consiste de carboidratos, ligandos receptores de superfície celular, substâncias farmacêuticas, hormônios, substâncias lipofílicas, polímeros, proteínas, peptídeos, toxinas (por exemplo, toxinas bacterianas), vitaminas, proteínas virais (por exemplo, capsídeos), e combinações dos mesmos. Il.J. ASOs Ativados

[0237] O termo "ASO ativado", como no presente documento utilizado, refere-se a um ASO da descrição que está covalentemente ligado (isto é, funcionalizado) a pelo menos uma porção funcional que permite a ligação covalente do ASO a uma ou mais porções conjugadas, isto é, porções que não são elas próprias ácidos nucleicos ou monômeros, para formar os conjugados no presente documento descritos. Tipicamente, uma porção funcional compreenderá um grupo químico capaz de se ligar covalentemente ao ASO via, por exemplo, um grupo 3'-hidroxila ou o grupo NH2 exocíclico da base de adenina, um espaçador que pode ser hidrofílico e um grupo terminal que é capaz de se ligar a uma porção conjugada (por exemplo, um grupo amino, sulfidrila ou hidroxila). Em algumas modalidades, este grupo terminal não está protegido, por exemplo, é um grupo NH2. Em outras modalidades, o grupo terminal é protegido, por exemplo, por qualquer grupo protetor adequado, como aqueles descritos em "Protective Goups in Organic Synthesis", por Theodora W Greene e Peter GM M Wuts, 3º edição (John Wiley & Sons, 1999).

[0238] Em algumas modalidades, os ASOs da descrição são funcionalizados na extremidade 5', a fim de permitir a ligação covalente da porção conjugada à extremidade 5' do ASO. Em outras modalidades, os ASOs da descrição podem ser funcionalizados na extremidade 3. Em ainda outras modalidades, os ASOs da descrição podem ser funcionalizados ao longo da cadeia principal ou na porção de base heterocíclica. Em ainda outras modalidades, os ASOs da descrição podem ser funcionalizados em mais de uma posição selecionada independentemente da extremidade 5', da extremidade 3', da cadeia principal e da base.

[0239] Em algumas modalidades, os ASOs ativados da descrição são sintetizados incorporando-se durante a síntese um ou mais monômeros que estão covalentemente ligados a uma porção funcional. Em outras modalidades, os ASOs ativados da descrição são sintetizados com monômeros que não foram funcionalizados, e o ASO é funcionalizado após a conclusão da síntese. Ill. Composições Farmacêuticas e Vias de Administração

[0240] O ASO da descrição pode ser usado em formulações e composições farmacêuticas. Adequadamente, essas composições compreendem um diluente, veículo sal ou adjuvante farmaceuticamente aceitável.

[0241] O ASO da descrição pode ser incluído em uma formulação unitária, tal como em um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável, em uma quantidade suficiente para entregar a um paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz sem causar efeitos colaterais graves no paciente tratado. No entanto, em algumas formas de terapia, efeitos colaterais graves podem ser aceitáveis em termos de garantir um resultado positivo para o tratamento terapêutico.

[0242] O fármaco formulado pode compreender agentes de ligação e adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis. Cápsulas, comprimidos ou pílulas podem conter, por exemplo, os seguintes compostos: celulose microcristalina, goma ou gelatina como ligantes; amido ou lactose como excipientes; estearatos como lubrificantes; vários agentes adoçantes ou flavorizantes. Para cápsulas, a unidade de dosagem pode conter um veículo líquido tal como óleos graxos. Da mesma forma, revestimentos de açúcar ou agentes entéricos podem fazer parte da unidade de dosagem. As formulações de oligonucleotídeos também podem ser emulsões dos ingredientes farmacêuticos ativos e um lipídio formando uma emulsão micelular.

[0243] As composições farmacêuticas da presente descrição podem ser administradas de várias maneiras, dependendo se tratamento local ou sistêmico é desejado e da área a ser tratada. A administração pode ser (a) oral (b) pulmonar, por exemplo, por inalação ou insuflação de pós ou aerossóis, inclusive por nebulizador; intratraqueal, intranasal, (c) tópica, incluindo membranas epidérmica, transdérmica, oftálmica e mucosa, incluindo entrega vaginal e retal; ou (d) parentérica, incluindo injeção ou infusão intravenosa, intra-arterial, subcutânea, intraperitoneal ou intramuscular; ou administração intracraniana, por exemplo, intratecal, intra-cerebroventricular ou intraventricular. Em uma modalidade, o ASO é administrado |V, |P, oralmente, topicamente ou como uma injeção em bolus ou administrado diretamente no órgão alvo. Em outra modalidade, o ASO é administrado intratecal ou intra-cerebroventricular como uma injeção em bolus.

[0244] As composições e formulações farmacêuticas para administração tópica podem incluir emplastros transdérmicos,

pomadas, loções, cremes, géis, gotas, aspersões, supositórios, líquidos e pós. Veículoes farmacêuticos convencionais, bases aquosas, em pó ou oleosas, espessantes e similares podem ser necessários ou desejáveis. Exemplos de formulações tópicas incluem aquelas nas quais o ASO da descrição é misturado com um agente de administração tópica, tal como lipídios, lipossomas, ácidos graxos, ésteres de ácidos graxos, esteroides, agentes quelantes e tensoativos. As composições e formulações para administração oral incluem, mas não estão limitadas a, pós ou grânulos, micropartículas, nanopartículas, suspensões ou soluções em água ou meio não aquoso, cápsulas, cápsulas de gel, sachês, comprimidos ou minicomprimidos. As composições e formulações para administração parentérica, intratecal, intra- cerebroventricular ou intraventricular podem incluir soluções aquosas estéreis que também podem conter tampões, diluentes e outros aditivos adequados, tais como, mas não limitados a, melhoradores de penetração, compostos veículoes e outros veículoes ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

[0245] As composições farmacêuticas da presente descrição incluem, mas não estão limitadas a, soluções, emulsões e formulações contendo lipossomas. Estas composições podem ser geradas a partir de uma variedade de componentes que incluem, mas não estão limitados a, líquidos pré-formados, sólidos autoemulsionantes e semissólidos autoemulsionantes. A entrega do fármaco ao tecido alvo pode ser melhorada pela entrega mediada por veículo, incluindo, mas não limitada a, lipossomas catiônicos, ciclodextrinas, derivados de porfirina, dendrímeros de cadeia ramificada, polímeros de polietilenimina, nanopartículas e microesferas (Dass CR. J Pharm Pharmacol 2002; 54 (1): 3 a 27).

[0246] As formulações farmacêuticas da presente descrição, que podem ser convenientemente apresentadas na forma de dosagem unitária, podem ser preparadas de acordo com técnicas convencionais bem conhecidas na indústria farmacêutica. Tais técnicas incluem a etapa de associar os ingredientes ativos ao(s) veículo(s) farmacêutico(s) ou excipiente(s). Em geral, as formulações são preparadas — associando-se uniformemente e intimamente os ingredientes ativos com veículoes líquidos ou veículoes sólidos finamente divididos, ou ambos, e então, se necessário, moldando o produto.

[0247] Para administração parentérica, subcutânea, intradérmica ou tópica, a formulação pode incluir um diluente estéril, tampões, reguladores de tonicidade e antibacterianos. Os ASOs ativos podem ser preparados com veículoes que protegem contra a degradação ou eliminação imediata do corpo, incluindo implantes ou microcápsulas com propriedades de liberação controlada. Para administração intravenosa, os veículoes podem ser solução salina fisiológica ou solução salina tamponada com fosfato. A Publicação Internacional No. WO 2007/031091 (A2), publicada em 22 de março de 2007, fornece ainda diluente, veículo e adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis adequados - que são no presente documento incorporados por referência. IV. Diagnóstico

[0248] Esta descrição fornece ainda um método de diagnóstico útil durante o diagnóstico de doenças relacionadas a SNCA, por exemplo, uma sinucleinopatia. Exemplos não limitantes de sinucleinopatia incluem, mas não estão limitados a, doença de Parkinson, demência da doença de Parkinson (PDD), demência com corpos de Lewy, e atrofia de múltiplos sistemas.

[0249] Os ASOs da descrição podem ser usados para medir a expressão do transcrito de SNCA em um tecido ou fluido corporal de um indivíduo e comparar o nível de expressão medido com um nível de expressão de transcrito de SNCA padrão em tecido ou fluido corporal normal, onde um aumento no nível de expressão comparado ao padrão é indicativo de um distúrbio tratável por um ASO da descrição.

[0250] Os ASOs da descrição podem ser usados para testar os níveis de transcrito de SNCA em uma amostra biológica usando quaisquer métodos conhecidos dos versados na técnica. (Touboul e outros, Anticancer Res. (2002) 22 (6A): 3349-56; Verjout e outros, Mutat. Res. (2000) 640: 127-38); Stowe e outros, J. Virol. Methods (1998) 75 (1): 93-91).

[0251] Por "amostra biológica" entende-se qualquer amostra biológica obtida a partir de um indivíduo, linhagem celular, cultura de tecidos, ou outra fonte de células que expressem potencialmente o transcrito de SNCA. Os métodos para obter biópsias de tecidos e fluidos corporais de mamíferos são bem conhecidos na técnica. V. Kits Compreendendo ASOs

[0252] Esta descrição fornece ainda kits que compreendem um ASO da descrição no presente documento descrito e que podem ser usados para executar os métodos no presente documento descritos. Em certas modalidades, um kit compreende pelo menos um ASO em um ou mais recipientes. Em algumas modalidades, os kits contêm todos os componentes necessários e / ou suficientes para realizar um ensaio de detecção, incluindo todos os controles, instruções para a realização de ensaios, e qualquer software necessário para análise e apresentação de resultados. Um versado na técnica reconhecerá prontamente que o ASO descrito pode ser facilmente incorporado em um dos formatos de kit estabelecidos que são bem conhecidos na técnica. VI. Métodos de Uso

[0253] Os ASOs da descrição podem ser utilizados para terapêutica e profilaxia.

[0254] SNCA é uma proteína de 140 aminoácidos expressa preferencialmente em neurônios nos terminais pré-sinápticos, onde acredita-se que desempenhe um papel na regulação da transmissão sináptica. Foi proposto que ele exista nativamente como um monômero desdobrado e um tetrâmero estável de a-hélices e revelou sofrer várias modificações pós-traducionais. Uma modificação que tem sido extensivamente estudada é a fosforilação de SNCA no aminoácido serina 129 (S129). Normalmente, apenas uma pequena porcentagem de SNCA é constitutivamente fosforilada em S129 (pS129), enquanto a grande maioria de SNCA encontrada em inclusões intracelulares patológicas é pS129 SNCA. Essas inclusões patológicas consistem de acúmulos agregados e insolúveis de proteínas SNCA desdobradas e são uma característica de um grupo de doenças neurodegenerativas coletivamente conhecidas como sinucleinopatias.

[0255] Nas sinucleinopatias, SNCA pode formar agregados patológicos em neurônios conhecidos como corpos de Lewy, que são característicos da doença de Parkinson (PD), da demência da doença de Parkinson (PDD) e da demência com corpos de Lewy (DLB). Os presentes ASOs podem, portanto, reduzir o número de agregados patológicos de SNCA ou impedir a formação dos agregados patológicos de SNCA. Além disso, lesões anormais ricas em SNCA chamadas inclusões citoplasmáticas glialis (GClIs) são encontradas em oligodendrócitos, e representam a marca registrada de uma sinucleinopatia fatal de rápido progresso conhecida como atrofia de múltiplos sistemas (MSA). Em algumas modalidades, os ASOs da descrição reduzem o número de GCls ou impedem a formação de GCls. Relatos de níveis indetectáveis ou baixos de expressão de mMRNA de SNCA em oligodendrócitos sugerem que alguma forma patológica de SNCA é propagada a partir de neurônios, onde é altamente expressa, para oligodendrócitos. Em certas modalidades, os ASOs da descrição reduzem ou impedem a propagação de SNCA, por exemplo, forma patológica de SNCA, a partir dos neurônios.

[0256] Os ASOs podem ser usados em pesquisas, por exemplo, para inibir especificamente a síntese da proteína SNCA (tipicamente através de degradação ou inibição de mRNA e, assim, impedindo a formação de proteínas) em células e animais experimentais, facilitando assim a análise funcional do alvo ou uma avaliação de sua utilidade como alvo para intervenção terapêutica. São ainda fornecidos métodos de repressão da expressão de mRNA e de SNCA / ou da proteína SNCA em células ou tecidos que compreendem colocar em contato as células ou tecidos, in vitro ou in vivo, com uma quantidade eficaz de um ou mais dos ASOs, conjugados ou composições da descrição.

[0257] Para terapêutica, um animal ou humano, suspeito de ter uma doença ou distúrbio, que pode ser tratado modulando a expressão do transcrito de SNCA e / ou proteína SNCA é tratado pela administração de compostos ASO de acordo com esta descrição. Além disso, são fornecidos métodos de tratamento de um mamífero, tal como o tratamento de um ser humano, suspeito de ter ou estar propenso a uma doença ou condição, associado à expressão do transcrito de SNCA e / ou proteína SNCA, administrando uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz de um ou mais dos ASOs ou composições da descrição. O ASO, um conjugado ou uma composição farmacêutica de acordo com a descrição são tipicamente administrados em uma quantidade eficaz. Em algumas modalidades, o ASO ou conjugado da descrição é usado em terapia.

[0258] A descrição fornece ainda um ASO de acordo com a descrição, para uso no tratamento de uma ou mais das doenças no presente documento citadas, tal como uma doença selecionada a partir do grupo que consiste de doença de Parkinson, demência da doença de Parkinson (PDD), demência com corpos de Lewy, atrofia de múltiplos sistemas, e quaisquer combinações das mesmas.

[0259] A descrição fornece ainda um método para o tratamento de a-sinucleinopatias, o método compreendendo administrar uma quantidade eficaz de um ou mais ASOs, conjugados ou composições farmacêuticas dos mesmos a um animal em necessidade de tratamento (tal como um paciente em necessidade de tratamento).

[0260] Em certas modalidades, a doença, distúrbio ou condição está associada à superexpressão do transcrito do gene SNCA e / ou da proteína SNCA.

[0261] A descrição também fornece métodos para inibir (por exemplo, reduzir) a expressão do transcrito do gene SNCA e / ou da proteína SNCA em uma célula ou tecido, o método compreendendo colocar em contato a célula ou tecido, in vitro ou in vivo, com uma quantidade eficaz de um ou mais ASOs da descrição, conjugados ou composições farmacêuticas dos mesmos, para afetar a degradação da expressão do transcrito do gene SNCA, reduzindo assim a proteína SNCA.

[0262] Em certas modalidades, os ASOs são usados para reduzir a expressão do mMRNA de SNCA em uma ou mais seções do cérebro, por exemplo, hipocampo, tronco encefálico, estriado ou qualquer combinação dos mesmos. Em outras modalidades, os ASOs reduzem a expressão do MRNA de SNCA, por exemplo, no tronco encefálico e / ou estriado, em menos de 70%, menos de 60%, menos de 50%, menos de 40%, menos de 30%, menos de 20%, menos de 10% ou menos de 5% em comparação com a expressão de mMRNA de SNCA após administração ou exposição a um veículo (sem ASO), no dia 3, dia 5, dia 7, dia 10, dia 14, dia 15, dia 20, dia 21 ou dia 25. Em algumas modalidades, a expressão do MRNA de SNCA é mantida abaixo de 70%, abaixo de 60%, abaixo de 50%, abaixo de 40%, abaixo de 40%, abaixo de 30%, abaixo de 20%, abaixo de 10%, ou abaixo de 5% em comparação com a expressão de mRNA de SNCA após administração ou exposição a um veículo (sem ASO) até o dia 28, dia 30, dia 32, dia 35, dia 40, dia 42, dia 45, dia 49, dia 50, dia 56, dia 60, dia 63, dia 70, ou dia 75.

[0263] Em outras modalidades, os ASOs da presente descrição reduzem a expressão do mRNA de SNR e / ou da proteína SNCA na medula, putâmen - núcleo caudado, ponte cerebelar, medula espinhal lombar, córtex frontal e / ou qualquer combinação dos mesmos.

[0264] A descrição também fornece o uso do ASO ou conjugado da descrição, conforme descrito para a fabricação de um medicamento. À descrição também fornece uma composição compreendendo o ASO ou seu conjugado para uso no tratamento de um distúrbio como no presente documento citado, ou para um método de tratamento de um distúrbio como no presente documento citado. A presente descrição também fornece ASOs ou conjugados para uso em terapia. A presente descrição fornece ainda ASOs ou conjugados para uso no tratamento de sinucleinopatia.

[0265] A descrição fornece ainda um método para inibir a proteína SNCA em uma célula que está expressando SNCA compreendendo administrar um ASO ou um conjugado de acordo com a descrição à célula, de modo a afetar a inibição da proteína SNCA na célula.

[0266] A descrição inclui um método para reduzir, melhorar, prevenir ou tratar a hiperexcitabilidade neuronal em um sujeito em necessidade de tratamento, compreendendo administrar um ASO ou um conjugado de acordo com a descrição.

[0267] A descrição também fornece um método para o tratamento de um distúrbio como no presente documento citado, o método compreendendo administrar um ASO ou um conjugado de acordo com a descrição conforme no presente documento descrita e / ou uma composição farmacêutica de acordo com a descrição a um paciente em necessidade de tratamento.

[0268] Os ASOs e outras composições de acordo com a descrição podem ser utilizados para o tratamento de condições associadas à superexpressão ou expressão da versão mutada da proteína SNCA.

[0269] A descrição fornece o ASO ou o conjugado de acordo com a descrição, para uso como um medicamento, tal como para o tratamento de a-sinucleinopatias. Em algumas modalidades, a a-sinucleinopatia é uma doença selecionada a partir do grupo que consiste de doença de Parkinson, Demência da Doença de Parkinson (PDD), demência com corpos de Lewy, atrofia de múltiplos sistemas, e quaisquer combinações das mesmas.

[0270] A descrição fornece ainda o uso de um ASO da descrição na fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença, distúrbio ou condição como no presente documento citado. Em algumas modalidades, o ASO ou conjugado da descrição é usado para a fabricação de um medicamento para o tratamento de uma o- sinucleinopatia, um distúrbio de convulsão, ou uma combinação dos mesmos.

[0271] Geralmente, um aspecto da descrição é direcionado a um método de tratamento de um mamífero que sofre ou é suscetível a condições associadas a níveis anormais de SNCA, isto é, uma a- sinucleinopatia), compreendendo administrar ao mamífero uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ASO direcionado ao transcrito de SNCA que compreende uma ou mais unidades de LNA. O ASO, um conjugado ou uma composição farmacêutica de acordo com a descrição são tipicamente administrados em uma quantidade eficaz.

[0272] A doença ou distúrbio, como citado neste documento, pode, em algumas modalidades, ser associado a uma mutação no gene SNCA ou um gene cujo produto proteico está associado ou interage com a proteína SNCA. Portanto, em algumas modalidades, o MRNA alvo é uma forma mutada da sequência de SNCA.

[0273] Um aspecto interessante da descrição é direcionado ao uso de um ASO (composto) como no presente documento definido ou um conjugado como no presente documento definido para a preparação de um medicamento para o tratamento de uma doença, distúrbio ou condição como no presente documento citado.

[0274] Os métodos da descrição podem ser empregados para tratamento ou profilaxia contra doenças causadas por níveis anormais de proteína SNCA. Em algumas modalidades, as doenças causadas por níveis anormais de proteína SNCA são a-sinucleinopatias. Em certas modalidades, as a-sinucleinopatias incluem doença de Parkinson, Demência da Doença de Parkinson (PDD), demência com corpos de Lewy, e atrofia de múltiplos sistemas.

[0275] Alternativamente indicado, em algumas modalidades, a descrição é ainda direcionada a um método para o tratamento de níveis anormais de proteína SNCA, o método compreendendo administrar um ASO da descrição, ou um conjugado da descrição ou uma composição farmacêutica da descrição a um paciente em necessidade de tratamento.

[0276] A descrição também se refere a um ASO, uma composição ou um conjugado como no presente documento definido para uso como um medicamento.

[0277] A descrição refere-se ainda ao uso de um composto, composição ou conjugado, conforme definido no presente documento para a fabricação de um medicamento para o tratamento de níveis anormais de proteína SNCA ou expressão de formas mutantes da proteína SNCA (tal como variantes alélicas, tal como as associadas a uma das doenças no presente documento citadas).

[0278] Um paciente que precisa de tratamento é um paciente que sofre ou é propenso a sofrer da doença ou distúrbio.

[0279] A prática da presente descrição empregará, a menos que indicado de outra forma, técnicas convencionais de biologia celular, cultura celular, biologia molecular, biologia transgênica, microbiologia, DNA recombinante, e imunologia, que estão dentro do conhecimento da técnica. Tais técnicas são explicadas por completo na literatura. Ver, por exemplo, Sambrook e outros, Ed. (1989) Molecular Cloning A Laboratory Manual (2º ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press); Sambrook e outros, Ed. (1992) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Springs Harbor Laboratory, NY); D. N. Glover ed., (1985) DNA Cloning, Volumes | e Il; Gait, ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis; Mullis e outros, Patente No. 4.683.195; Hames e Higgins, orgs. (1984) Nucleic Acid Hybridization; Hames e Higgins, orgs. (1984) Transcription And Translations; Freshney (1987) Culture Of Animal Cells (Alan R. Liss, Inc.); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press) (1986); Perbal (1984) A Practical Guide To Molecular Cloning; the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., Nova York); Miller and Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (Cold Spring Harbor Laboratory); Wu e outros, Eds., Methods In Enzymology, Vols. 154 e 155; Mayer e Walker, orgs. (1987) Methods Immunochemical in Cell and Molecular Biology (Academic Press, Londres); Weir e Blackwell, orgs., (1986) Handbook Of Experimental Immunology, Volumes |-IV; Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova York, (1986); Crooke, Antissenso drug Technology: Principles, Strategies and Applications, 2º Ed. CRC Press (2007) e por Ausubel e outros (1989) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley e Sons, Baltimore, Maryland).

[0280] Todas as referências citadas acima, bem como todas as referências citadas neste documento, são incorporadas no presente documento por referência em sua totalidade.

[0281] Os exemplos a seguir são oferecidos como ilustração e não como limitação.

EXEMPLOS Exemplo 1: Construção de ASOs

[0282] Os oligonucleotídeos antissenso no presente documento descritos foram projetados para ter como alvo várias regiões no pré- MRNA de SNCA. Ver a Figura 1A para a sequência de SNCA genômica e a Figura 1B para cDNA de SNCA. Por exemplo, os ASOs foram construídos para ter como alvo as regiões indicadas usando o sítio de início do pré-mRNA e o sítio final do pré-mRNA de NG 011851.1, como mostrado na Figura 2 e / ou o sítio de início de MRNA e o sítio final de seus mRNAs. As sequências exemplificativas dos ASOs (por exemplo, SEQ ID Nos.) são descritas nas Figuras 2 e 3. Em algumas modalidades, os ASOs foram projetados para serem "gapmers" (por exemplo, "gapmers" alternados). Ver DES Nos.

[0283] As Figuras 2 e 3 mostram exemplos não limitantes do modelo de ASO para sequências selecionadas. Os mesmos métodos podem ser aplicados a quaisquer outras sequências no presente documento descritas. Os "gapmers" foram construídos para conter ácidos nucleicos bloqueados - LNAs (letras maiúsculas). Por exemplo, um "gapmer" pode ter Beta-deoxi LNA na extremidade 5' e na extremidade 3' e ter uma cadeia principal de fosforotioato. Mas os LNAs também podem ser substituídos por quaisquer outros análogos de nucleotídeos e a cadeia principal pode ser outros tipos de cadeia principal (por exemplo, uma ligação fosfodiéster, uma ligação fosfotriéster, uma ligação metilfosfonato, uma ligação fosforamidato, ou combinações das mesmas).

[0284] Os ASOs foram sintetizados usando métodos bem conhecidos na técnica. Métodos exemplificativos de preparação de tais ASOs são descritos por Barciszewski e outros, Capítulo 10 - "Locked Nucleic Acid Aptamer" em Nucleic Acid and Peptide Aptamers: Methos and Protocols, vol. 535, Gunter Mayer (ed.) (2009), cujo conteúdo inteiro é no presente documento expressamente incorporado por referência neste documento. Exemplo 2A: Ensaio de alto conteúdo para medir a redução da proteína SNCA em neurônios primários

[0285] Os ASOs direcionados a SNCA foram testados quanto à sua capacidade de reduzir a expressão da proteína SNCA em neurônios primários de camundongo. As culturas de neurônios primários foram estabelecidas a partir do cérebro anterior de camundongos PAC-Tg (SNCAPSST)*/*: SNCA* ("PAC-A53T") portando o gene SNCA humano inteiro com uma mutação A53T em um fundo de nocaute de SNCA de camundongo. Ver Kuo Y e outros, Hum Mol Genet., 19: 1633-50 (2010). Todos os procedimentos envolvendo camundongos foram conduzidos de acordo com os Métodos de Teste com Animais (ATM) aprovados pelo Bristol-Myers Squibb Animal Care and Use Committee (ACUC). Os neurônios primários foram gerados por digestão com papaína de acordo com o protocolo do fabricante (Worthington Biochemical Corporation, LKO031050). Os neurônios isolados foram lavados e ressuspensos em meio neurobasal (NBM, Invitrogen) suplementado com B27 (Gibco), Glutamax 1,25 uM (Gibco), 100 unidades / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina, e 25 ug / ml de anfotericina B.

[0286] As células foram plaqueadas em placas de múltiplos poços revestidas com poli-D-lisina a 5.400 células / cm? (por exemplo, em placas de 384 poços, 6.000 células / poço em 25 ul de NBM). Os ASOs foram diluídos em água e adicionados às células em DIVO1 (isto é, 1 dia após o plaqueamento) Os ASOs foram adicionados a 2x a concentração final no meio e depois entregues às células manualmente. Alternativamente, os ASOs em água foram dispensados usando um dispensador acústico Labcyte ECHO. Para a dispensação por ECHO, foram adicionados 250 nl de ASO em água às células em meio seguida pela adição de uma alíquota de volume igual da alíquota fresca de NBM.

Para a triagem primária, os ASOs foram adicionados em concentrações finais de 5 uM, 3,3 uM, 1 uM, 200 nM ou 40 nM. Para determinação da potência, titulações de 8 a 10 pontos dos ASOs foram preparadas a partir de estoque de 0,75 mM e depois foram entregues às células cultivadas para uma faixa de concentração final de 2,7 a 4.000 nM ou 4,5 a 10.000 nM. ASO-000010 (TCTgtcttagctTTG, SEQ ID NO: 22) e ASO-000838 (AGAaataagtggtAGT, SEQ ID NO: 23) (5 uM) foram incluídos em cada placa como inibidores de controle de referência para tubulina e SNCA, respectivamente. As células foram incubadas com os ASOs por 14 dias para alcançar a redução no estado estacionário do MRNA.

[0287] Após a incubação de 14 dias, as células foram fixadas pela adição de fixador nas concentrações finais de formaldeído a 4% (J.T. Baker) e sacarose a 4% (Sigma) nos poços. As células foram fixadas por 15 minutos e, em seguida, o fixador aspirado a partir dos poços. Em seguida, as células foram permeabilizadas por 20 minutos com uma solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo Triton-X 100 a 0,3% e albumina de soro bovino (BSA) a 3% ou soro de cabra normal a 3%. Depois, o tampão de permeabilização foi aspirado a partir dos poços, e as células foram lavadas uma vez com PBS. Os anticorpos primários foram então diluídos em PBS contendo Triton X-100 a 0,1% e BSA a 3%. Foram utilizadas diluições de 1:1000 de anti-SNCA de coelho (Abcam) e 1:500 de anti-tubulina de frango (Abcam). As células foram incubadas com os anticorpos primários entre 2 horas e durante a noite. Após a incubação, a solução primária de coloração de anticorpo foi aspirada, e as células foram lavadas duas vezes com PBS. Uma solução de coloração secundária contendo diluição 1:500 do anticorpo Alexa de cabra anti-galinha 567, anticorpo de cabra anti coelho Alexa 488, e Hoechst (10 ug / ml) em PBS contendo Triton X-100 a 0,1% com BSA a 3% foi adicionada aos poços, e as placas foram incubadas durante 1 hora. Posteriormente, a solução de coloração secundária foi aspirada a partir dos poços, e as células foram lavadas 3 vezes com PBS. Após a lavagem das células, foram adicionados 60 ul de PBS a cada poço. As placas foram então armazenadas no PBS até a geração de imagens.

[0288] Para geração de imagens, as placas foram escaneadas em um gerador de imagens Thermo-Fisher (Cellomics) CX5 usando Spot Detector bio-application (Cellomics) para quantificar núcleos (mancha Hoechst, canal 1), extensões de tubulina (Alexa 567, canal 2) e SNCA (Alexa 488, canal 3). A contagem de objetos (núcleos) foi monitorada, mas não publicada no banco de dados. A área total coberta por tubulina foi quantificada como o recurso SpotTotalAreaCh2 e a intensidade total de coloração para SNCA quantificada como SpotTotallntenCh3. A medida da tubulina foi incluída para monitorar a toxicidade. Para determinar a redução da proteína SNCA, foi calculada a razão entre a intensidade de SNCA e a área de coloração da tubulina e os resultados normalizados como % média de inibição usando a média dos poços tratados com veículo como total e os poços com ASO-000010 ou ASO- 000838 como poços inibidos no máximo para tubulina ou SNCA, respectivamente. Exemplo 2B: Medição de oscilação de cálcio espontânea

[0289] As oscilações reduzidas na concentração intracelular de cálcio livre (oscilação de cálcio) correspondem ao aumento da neurotoxicidade e, portanto, podem indicar tolerabilidade reduzida in vivo. Para medir a oscilação espontânea de cálcio dos neurônios corticais primários, os neurônios corticais primários de ratos foram preparados a partir de embriões de ratos Sprague-Dawley (E19). Resumidamente, o córtex cerebral foi dissecado e incubado a 37º C por a 45 minutos em papaína / DNase / solução salina balanceada de Earle (EBSS). Após trituração e centrifugação dos peletes celulares, a reação foi interromida por incubação com EBSS contendo inibidores de protease, albumina sérica bovina (BSA) e DNase. As células foram então trituradas e lavadas com Neurobasal (NB, Invitrogen) suplementado com B-27 a 2%, 100 ug / ml de penicilina, 85 ug / ml! de estreptomicina, e 0,5 mM de glutamina.

[0290] As células foram plaqueadas a uma concentração de 25.000 células / poço em placas de imagem fluorescente de 384 poços revestidas com poli-D-lisina (BD Biosciences) em meio Neurobasal (NB) (contendo B27 suplementado com 25 ul / poço (contendo suplemento B27 e 2mM de glutamina). As células foram cultivadas por 12 dias a 37º C em 5% de CO,» e alimentadas com 25 ul de meio adicional em DIVO4 (ou seja, 4 dias após o plaqueamento) e DIVO8 (ou seja, 8 dias após o plaqueamento) para uso em DIV12 (ou seja, 12 dias após o plaqueamento).

[0291] No dia do experimento, o meio NB foi removido da placa e as células foram lavadas uma vez com 50 ul / poço de tampão de ensaio a 37ºC (solução salina balanceada de Hank, contendo 2 mM de CaCl2 e 10 mM de Hopes, pH 7,4). As oscilações foram testadas tanto na presença quanto na ausência de 1 mM de MgCl2. As células foram carregadas com um corante fluorescente permanente de cálcio, Fluo-4- AM (Invitrogen, Molecular Probes F14201). O Fluo-4-AM foi preparado a 2,5 MM em DMSO contendo 10% de plurônico F-127 e depois diluído 1:1000 no tampão de ensaio até uma concentração final de 2,5 uM. As células foram incubadas por 1 hora com 20 ul de Fluo-4-AM a 2,5 uM a 37ºC em 5% de CO». Após a incubação, foram adicionados mais 20 ul de tampão de ensaio em temperatura ambiente, e as células foram deixadas equilibrar em temperatura ambiente no escuro por 10 minutos.

[0292] As placas foram lidas em um leitor de placas fluorescentes FDSS 7000 (Hamamatsu) com um comprimento de onda de excitação de 485 nm e comprimento de onda de emissão de 525 nm. O tempo total de gravação de fluorescência foi de 600 segundos na taxa de aquisição de 1 Hz para todos os 384 poços. Um sinal inicial de linha de base (medição do cálcio intracelular) foi estabelecido por 99 segundos antes da adição dos ASOs. Foram adicionados ASOs com uma cabeça de 384 poços no FLIPR em 20 ul de tampão de ensaio a 75 uM até uma concentração final de 25 uM. Em alguns casos, um ASO direcionado a tau tal como ASO-000013 (OxyAs OxyTs OxyTs DNAts DNAcs DNAcs DNAas DNAas DNAas DNAts DNAts DNAcs OxyMCs OxyTs OxyT; ATTtccaaatteaCTT, SEQ ID NO: 2) ou ASO-000010 (TCTgtcttagetTTG, SEQ ID NO: 22) foi incluído como controle.

[0293] As medidas de intensidade da sequência de tempo de fluorescência (descritas acima) foram exportadas a partir do leitor Hamamatsu e transferidas para um aplicativo proprietário interno em IDBS E-Workbook para redução e normalização de dados. Em cada placa de triagem de 384 poços, até um máximo de 48 ASOs individuais foram testados em poços quadruplicados. 12 poços foram expostos a um controle positivo (ASO-000010), que inibe significativamente as oscilações de cálcio contadas durante o período de aquisição de 300 segundos e 12 poços foram expostos a um ASO inativo de controle negativo (ASO-000013), que não inibe a observação de oscilações de cálcio. Finalmente, 24 poços foram dedicados a um veículo de controle consistindo de de RNase-DNase-água livre na mesma concentração usada para diluir os ASOs de teste. Os efeitos dos ASOs de teste em poços individuais na frequência de oscilação de cálcio (durante o período de 300 s) foram expressos como uma % de controle do número médio de oscilações de cálcio contadas nos 24 poços de veículo de controle. As placas individuais de 384 poços passaram nos padrões de QC se os controles ASO positivos e negativos (ASO-000010 e ASO- 000013) exibiram farmacologia bem caracterizada no ensaio de Ca, e se os poços de veículo e controle farmacológico geraram um mínimo de

— 20 oscilações de cálcio ao longo do período experimental de 300 segundos. Exemplo 2C: Análise QUANTIGENEO (ensaio de 96 poços) para medir a redução de mMRNA em neurônios humanos

[0294] A capacidade dos ASOs de reduzir o MRNA de SNCA humano e / ou possíveis espécies de mRNA fora do alvo humano foi medida in vitro por análise QUANTIGENEG. Os neurônios humanos (Cellular Dynamics Inc., "iNeurons") foram descongelados, plaqueados e cultivados de acordo com as especificações do fabricante. Esses iNeurons são uma população altamente pura de neurônios humanos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas (IPS) usando os protocolos de diferenciação e purificação proprietários de Cellular Dynamic.

[0295] Lise: As células foram plaqueadas em placas de 96 poços revestidas com poli-L-ornitina / laminina a 50.000 a 100.000 células por poço (dependente da expressão fora do alvo sendo investigada) e mantidas em meio neurobasal suplementado com B27, glutamax e Penicilina-Estreptomicina. Os ASOs foram diluídos em água e adicionados às células em DIVO1 (isto é, 1 dia após o plaqueamento). Para medições pontuais, uma concentração final de ASO de 0,5 uM foi tipicamente usada. Para determinações de IC5o, os neurônios foram tratados com uma diluição de resposta de concentração de sete pontos 1:4, com a concentração mais alta de 5 uM para definir o IC5so. As células foram então incubadas a 37º C e 5% de CO,» por 6 dias para alcançar a redução no estado estacionário do MRNA.

[0296] Após a incubação, o meio foi removido e as células foram lavadas 1X em DPBS e lisadas como segue. A medição do RNA mensageiro lisado foi realizada usando o Sistema de Reagente QUANTIGENEG 2.0 (AFFYMETRIXO), que quantifica o RNA usando um método de amplificação de sinal de DNA ramificado, dependente do conjunto de sonda de captura de RNA projetado especificamente. À solução tampão de lise celular de trabalho foi preparada adicionando-se 50 ul de proteinase K a 5 ml da mistura de lise pré-aquecida (37º C) e diluída em dH2O até uma diluição final 1:4. O tampão de lise de trabalho foi adicionado às placas (100 a 150 ul / poço, dependendo da expressão fora do alvo sendo investigada), triturado 10 vezes, selado e incubado por 30 minutos a 55º C. Após a lise, os poços foram triturados mais 10 vezes, e as placas foram armazenadas a -80ºC ou analisadas imediatamente.

[0297] Ensaio: Dependendo da sonda de captura específica usada (isto é, SNCA, PROS1 ou tubulina), os lisados foram diluídos (ou não diluídos) na mistura de lise. Em seguida, os lisados foram adicionados às placas de captura (placa de poliestireno de 96 poços revestida com sondas de captura) a um volume total de 80 ul / poço. Os reagentes dos conjuntos de sondas de trabalho foram gerados pela combinação de água livre de nuclease (12,1 ul), mistura de lise (6,6 ul), reagente de bloqueio (1 ul), e conjunto de sonda específico 2,0 (0,3 ul) (catálogo SNCA humano *% SA-50528, humano Catálogo PROS1 % SA-10542 ou catálogo de tubulina beta 3 humana % SA-15628) de acordo com as instruções do fabricante (QUANTIGENEG 2.0 AFFYMETRIXO). Em seguida, foram adicionados 20 ul de reagentes de conjunto de sonda de trabalho a 80 ul de diluição de lisado (ou 80 ul de mistura de lise para amostras de fundo) na placa de captura. As placas foram centrifugadas a 240 g por 20 segundos e depois incubadas por 16 a 20 horas a 55ºC para hibridizar (captura de RNA alvo).

[0298] A amplificação do sinal e a detecção do RNA alvo começaram através da lavagem das placas com tampão 3 vezes (300 ul / poço) para remover qualquer material não ligado. Em seguida, o reagente de hibridização Pre-Amplifier 2.0 (100 ul / poço) foi adicionado, incubado a 55ºC por 1 hora, depois aspirado, e o tampão de lavagem foi adicionado e aspirado 3 vezes. O reagente de hibridização Amplifier

2.0 foi então adicionado como descrito (100 ul / poço), incubado por 1 hora a 55ºC e a etapa de lavagem repetida como descrito anteriormente. O reagente de hibridização 2.0 Label Probe foi adicionado a seguir (100 ul / poço), incubado por 1 hora a 50º C e a etapa de lavagem foi repetida como descrito anteriormente. As placas foram novamente centrifugadas a 240 g durante 20 segundos para remover qualquer excesso de tampão de lavagem e, em seguida, o substrato 2.0 foi adicionado (100 ul / poço) às placas. As placas foram incubadas por 5 minutos em temperatura ambiente e, em seguida, as placas foram fotografadas em um leitor de etiquetas múltiplas PerkinElmer Envision no modo luminômetro dentro de 15 minutos.

[0299] Determinação de dados: Para o gene de interesse, o sinal médio de fundo de ensaio foi subtraído do sinal médio de cada réplica técnica. Os sinais médios subtraídos em segundo plano para o gene de interesse foram então normalizados para o sinal médio em segundo plano para o RNA de tubulina housekeeping. A percentagem de inibição para a amostra tratada foi calculada em relação ao lisado da amostra tratada com controle. Os resultados dos ensaios QUANTIGENEGO para células tratadas com os ASOs são mostrados, por exemplo, na Figura

8. Exemplo 2D: Análise QUANTIGENEPGO (ensaio de 96 poços) para medir a redução de mRNA em células Ramos

[0300] Para medir a possível redução de mRNA de IKZF3 humano fora do alvo (família IKAROS dedo de zinco 3), foram usadas células Ramos (uma linhagem de células linfocítica humana). Como as células Ramos não expressam SNCA, o RB1 (corepressor de transcrição RB 1), que é expresso nas células Ramos, foi usado como um controle positivo para avaliar a expressão de mRNA de IKZF3 de "knockdown" mediada por ASO. Dois ASOs foram sintetizados para se ligar e

"knockdown" a expressão do mMRNA de RB1 humano. Microglobulina beta-2 (B2M) foi usada como controle de gene housekeeping. As células Ramos foram cultivadas em suspensão em meio RPMI suplementado com FBS, glutamina e Pen / Strep.

[0301] Lise: As células foram plaqueadas em placas de 96 poços revestidas com poli-L-ornitina / laminina a 20.000 células por poço e mantidas em meio Neurobasal contendo B27, glutamax e Penicilina- Estreptomicina. Os ASOs foram diluídos em água e adicionados às células 1 dia após o plaqueamento (DIVO1) até uma concentração final de 1 uM. Após o tratamento com ASO, as células foram incubadas a 37ºC por 4 dias para obter uma redução no estado estacionário do MRNA. Após a incubação, o meio foi removido e as células lisadas como segue. A medição do RNA mensageiro lisado foi realizada usando o Sistema de Reagente QUANTIGENEG 2.0 (AFFYMETRIXO), que quantificou o RNA usando um método de amplificação de sinal de DNA ramificado, dependente do conjunto de sonda de captura de RNA projetado especificamente. A mistura de lise (QUANTIGENEG 2.0 AFFYMETRIXO) foi pré-aquecida em uma incubadora a 37ºC por 30 minutos. Para lise das células em suspensão, foram adicionados 100 ul de tampão de lise 3X (com 10 ul / ml de proteinase K) a 200 ul de células em suspensão. As células foram trituradas 10 vezes para lise, e a placa selada e incubada por 30 min a 55ºC. Posteriormente, os lisados foram armazenados a -80ºC ou analisados imediatamente.

[0302] Ensaio: Dependendo da sonda de captura específica usada (isto é, IKZF3, RB1 e B2M), os lisados foram diluídos (ou não diluídos) na mistura de lise. Em seguida, os lisados foram adicionados à placa de captura (placa de poliestireno de 96 poços revestida com sondas de captura) a um volume total de 80 ul / poço. Os reagentes dos conjuntos de sondas de trabalho foram gerados pela combinação de 12,1 ul de água livre de nuclease, 6,6 ul de mistura de lise, 1 ul de reagente de bloqueio, 0,3 ul de conjunto de sonda específico 2,0 (catálogo humano IKZF3 t SA-17027, catálogo humano RB1 ft SA-10550 ou catálogo de microglobulina beta-2 humano f SA-10012) de acordo com as instruções do fabricante (QUANTIGENEG 2.0 AFFYMETRIXO). Em seguida, 20 ul de reagentes de conjunto de sonda de trabalho foram adicionados a 80 ul de diluição de lisado (ou 80 ul de mistura de lise para amostras de fundo) na placa de captura. As placas foram então incubadas por 16 a 20 horas a 55º C para hibridizar (captura de RNA alvo). A amplificação do sinal e a detecção do RNA alvo foram iniciadas lavando as placas com tampão 3 vezes (300 ul / poço) para remover qualquer material não ligado. Em seguida, o reagente de hibridização Pre-Amplifier 2.0 (100 ul / poço) foi adicionado, incubado a 55º C por 1 hora e depois aspirado e o tampão de lavagem foi adicionado e aspirado 3 vezes. O reagente de hibridização Amplifier 2.0 foi então adicionado como descrito (100 ul / poço), incubado por 1 hora a 55ºC e a etapa de lavagem foi repetida como descrito anteriormente. O reagente de hibridização 2.0 Label Probe foi adicionado a seguir (100 ul / poço), incubado por 1 hora a 50ºC e a etapa de lavagem novamente foi repetida como descrito anteriormente. As placas foram novamente centrifugadas a 240 g durante 20 segundos para remover qualquer excesso de tampão de lavagem e, em seguida, o substrato 2.0 foi adicionado (100 ul / poço) às placas. As placas foram incubadas por 5 minutos em temperatura ambiente e, em seguida, as placas foram fotografadas em um leitor de etiquetas múltiplas PerkinElmer Envision no modo luminômetro em 15 minutos.

[0303] Determinação de dados: Para o gene de interesse, o sinal médio de fundo do ensaio (isto é, sem lisado, apenas 1X tampão de lise) foi subtraído do sinal médio de cada replicado técnico. Os sinais médios subtraídos em segundo plano para o gene de interesse foram então normalizados para o sinal médio em segundo plano para o MRNA housekeeping (para células Ramos, era beta-2-microglobulina). A percentagem de inibição para a amostra tratada foi calculada em relação à média do lisado de amostra não tratado. Os resultados dos ensaios QUANTIGENEG para células tratadas com ASOs são mostrados na Tabela 4. Exemplo 2E: Ensaio qPCR para medir a redução do MRNA de SNCA nas células SK-N-BE(2)

[0304] O ASO SAN-O005459 dirigido a SNCA foi testado quanto à sua capacidade de reduzir a expressão de MRNA de SNCA em células de neuroblastoma humano SK-N-BE(2) adquiridas a partir de ATCC (CRL-2271).

[0305] As células SK-N-BE(2) foram cultivadas em meio de cultura celular (MEM [Sigma, cat. No. M2279] suplementado com 10% de soro fetal bovino [Sigma, cat. No. F7524], 1X GLUTAMAXTY [Sigma, cat. No. 3050 -038] 1x solução de aminoácido não essencial MEM [Sigma, cat. No. M7145] e 0,025 mg / ml de gentamicina [Sigma, cat. No. G1397]). As células foram tripsinizadas a cada 5 dias, lavando com solução salina tamponada com fosfato (PBS), [Sigma cat. No. 14190-094], seguida pela adição de solução de tripsina-EDTA a 0,25% (Sigma, T3924), 2a 3 minutos de incubação a 37ºC, e trituração antes da semeadura de células. As células foram mantidas em cultura por até 15 passagens.

[0306] Para uso experimental, 12.500 células por poço foram semeadas em placas de 96 poços (Nunc cat. No. 167008) em 100 ul de meio de crescimento. Os oligonucleotídeos foram preparados a partir de um estoque de 750 uM. O ASO dissolvido em PBS foi adicionado aproximadamente 24 horas após as células terem sido semeadas até uma concentração final de 25 uM para estudos de ponto único. As células foram incubadas por 4 dias sem qualquer alteração no meio. Para determinação da potência, 8 concentrações de ASO foram preparadas para uma faixa final de concentração de 16 a 50.000 nM.

ASO-004316 (CcAAAtcttataataACtAC, SEQ ID NO: 25) e ASO-002816 (TTCctttacaccACAC, SEQ ID NO: 12) foram incluídos como controles.

[0307] Após a incubação, as células foram colhidas por remoção do meio seguido pela adição de 125 ul de tampão PURELINKO Pro 96 Lysis (Invitrogen 12173.001A) e 125 ul de etanol a 70%. O RNA foi purificado de acordo com as instruções do fabricante e eluído em um volume final de 50 ul de água, resultando em uma concentração de RNA de 10 a 20 ng / ul. O RNA foi diluído 10 vezes em água antes da reação de qPCR em uma etapa. Para a reação de qPCR em uma etapa, mistura de qQPCR (qgScript TMXLE em 1 etapa RT-4PCR TOUGHMIXO Low ROX da QauntaBio, cat. No. 95134-500) foi misturada com duas sondas Tagman na relação 10:1:1 (mistura de qPCR: sonda1:sonda2) para gerar a mistura master. As sondas Tagman foram adquiridas a partir de LifeTechnologies: SNCA: Hs01103383 m1; PROS!1: Hs00165590 m1: TBP: 4325803; GAPDH 4325792. Mistura master (6 uL) e RNA (4 uL, 1-2 ng / uyL) foram então misturados em uma placa qPCR (MICROAMPO óptico de 384 poços, 4309849). Após a selagem, a placa recebeu um giro rápido, 1000 g por 1 minuto em temperatura ambiente, e foi transferida para um sistema ViialM 7 (Applied Biosystems, Thermo), e as seguintes condições de PCR utilizadas: 50ºC por 15 minutos; 95ºC por 3 minutos; 40 ciclos de: 95ºC por 5s, seguidos por uma diminuição da temperatura de 1,6º C / s, seguida de 60ºC por 45 s. Os dados foram analisados usando o software QUANTSTUDIOTY de PCR em tempo real. Exemplo 3: Análise in vitro de ASO-005459 na redução de mRNA de SNCA humano

[0308] O ASO-005459 é um ASO modificado por LNA de 17 bases que tem como alvo o limite íntron1 / éxon2 do pré-mRNA de SNCA humano (ver Figura 2, SEQ ID NO: 15). Potência de ASO-005459 em neurônios de camundongo

[0309] Utilizando os métodos descritos acima no Exemplo 2A, o ASO-005459 foi testado quanto à sua capacidade de reduzir a expressão da proteína SNCA como resultado à jusante da redução no MRNA de SNCA. Resumidamente, os neurônios primários derivados de camundongos PAC-A53T foram tratados com ASO-005459 ou ASOs de controle por 14 dias. As células foram então fixadas e os níveis de proteína SNCA e proteína tubulina foram medidos por triagem de alto conteúdo. Os níveis de tubulina foram medidos para monitorar a toxicidade e normalizar a redução da proteína SNCA.

[0310] Como mostrado na Tabela 1 abaixo, a incubação de células com 4 nM de ASO-005459 resultou em uma redução de 21% na expressão da proteína SNCA. Com 40 nM e 5 uM de ASO-005459, a expressão da proteína SNCA foi reduzida em 84% e 86%, respectivamente. Em contraste, o ASO-005459 teve um efeito mínimo ou nenhum no nível de expressão da proteína tubulina. Tabela 1: Atividade de ASO-005459 em neurônios de AS3ST-PAC “Concentração odeaso — “Sintub sD N Tub sD N 005459 %inh %inh 4 nM 21,11 33,71 3 -8,60 12,07 4 40 nM 84,28 13,21 8 4,32 28,65 7 UM 86,45 7,91 2 29,01 18,06 2 DPadesviopadrão ||| N = Número de ensaios

[0311] Para avaliar ainda mais a potência, os neurônios de A53T- PAC foram tratados com uma titulação de 10 pontos de ASO-005459, como descrito acima no Exemplo 2A, e os |Cs5so para o efeito nas proteínas SNCA e tubulina determinados. Como mostrado nas Figuras TA e 7B, e Tabela 2 (abaixo), foi observada uma redução dependente da concentração na razão a-Sin / tubulina, com uma ICso média de 7,4 nM. Esta observação foi consistente com os dados de atividade de ponto único mostrados na Tabela 1 (acima). Além disso, o ASO-005459 produziu efeitos insignificantes nos níveis de Tub. Tomados em conjunto, estes resultados indicam que o ASO-005459 reduz potentemente os níveis de proteina SNCA com efeito mínimo na viabilidade celular total. Tabela 2: Estimativa de potência e seletividade para ASO-005459 para proteína SNCA e tubulina em neurônios de ASST-PAC MCsoaSintub o ICR(AMde (nm) SD N tub SD N 742 278 6 .>400. (NA 5. DPaDesviopadrão À N = Número de ensaios Eficácia de ASO-005459 em células SK-N-BE(2)

[0312] Usando o método descrito no Exemplo 2E, o ASO-005459 foi testado quanto à sua capacidade de reduzir o MRNA de SNCA em SK-N-BE(2) após 4 dias de tratamento.

[0313] A incubação de células com 25 uM de ASO-005459 resultou em uma redução de 92% no mRNA de SNCA nas células SK-N-BE(2). Potência de ASO-005459 em neurônios humanos

[0314] A potência de ASO-005459 para SNCA foi confirmada usando neurônios humanos primários, como descrito acima no Exemplo 2C. Resumidamente, os neurônios humanos foram derivados de células-tronco pluripotentes induzidas (iPS). As células foram tratadas com ASO-005459 ou ASOs de controle por 6 dias e, em seguida, os níveis de MRNA foram medidos pelo teste QUANTIGENEGO. Como os neurônios humanos também expressam PROS1, um potencial fora do alvo para o ASO-005459, o nível de mMRNA de PROS1 também foi medido para avaliar o efeito de ASO-005459 nos genes fora do alvo. Além disso, o mRNA de tubulina (TUBB) foi medido para monitorar a toxicidade.

[0315] Como mostrado na Figura 8 e na Tabela 3 (abaixo), ASO- 005459 induziu uma redução dependente da concentração no SNCA expressa em neurônios humanos, com uma ICso média de 100 nM. Este IC5o é aproximadamente 13 vezes mais fraco que o IC5o para reduzir a proteína SNCA nos neurônios PAC-A53T (Tabela 2, acima). A razão para essa mudança de potência não está clara, mas pode ser devido a diferenças na absorção de ASO, metabolismo, ou cinética de nocaute de SNCA. Enquanto o ASO-005459 também exibiu reduções dependentes da concentração do mMRNA de PROS1 nos neurônios humanos; o IC5o foi 30 a 50 vezes mais fraco que o IC5o para SNCA. Estes resultados confirmam a atividade de ASO-005459 para o SNCA em neurônios humanos e indicam que o ASO-005459 é 30 a 50 vezes mais seletivo para SNCA em comparação com PROS1. Tabela 3: Potência e Seletividade de ASO-005459 em mRNA de SNCA e PROS1 mMRNA em neurônios humanos Mr Cde — lCwde — lCde Data do SNCA PROS1 TUBB3 — Razão delCso Ensaio Lote (nM) (nM) (nM) — PROS1/SNCA — 8/26/2018 01001 42 —— 2127 —>500/ 51 12/8/2016 01-004 157 > 5000 > 5000 >32 Lote = Número de lote específico de ASO-OO5459 usado À... Potência de ASO-005459 em células Ramos

[0316] O IKZF3 é outro potencial fora do alvo para ASO-005459, mas, diferentemente do PROS1, não é expresso em neurônios humanos. Em vez disso, o IKZF3 é expresso de maneira robusta nas células Ramos, uma linhagem de células linfocítica humana. As células Ramos foram tratadas com 1 UM de ASO-005459 e o efeito na expressão do mRNA de IKZF3 foi medido. Para monitorar a toxicidade, o MRNA de beta-2 microglobulina também foi medido. Como as células Ramos não expressam SNCA, outro gene, RB1 (corepressor de transcrição RB 1), foi usado como controle positivo para o "knockdown" mediado por ASO. ASO-006754 (GGTgaggtttagtaGA, SEQ ID NO: 26) e ASO-006755 (GGTgagatttagtagaAG, SEQ ID NO: 27) atingiram o RB1 e foram incluídos no estudo. Como mostrado na Tabela 4 (abaixo), na concentração de 1 UM, o ASO-005459 não afetou a expressão do MRNA de IKZF3, demonstrando a especificidade de ASO-005459 para o SNCA. O ASO-005459 também não afetou a expressão de MRNAs RB1 e B2M, indicando que o ASO-005459 não é tóxico para as células Ramos. Em contraste, ASO-006754 e ASO-006755 (os ASOs de controle) reduziram os níveis de RB1 em 87% e 83%, respectivamente, confirmando a atividade de ASO nas células Ramos.

Tabela 4: Efeito de 1 uM de ASO-005459 em IKZF3 em células Ramos KB RB BM. ASO Alvo Lote (% con) (% con) (% con) ASO-005459 SNCA 01-004 102 99 94 ASO-006754 RB1 01-001 104 13 87 ASO-006755 RB1 01-001 116 7 83 Lote = número de lote específico do ASO Usado |||

[0317] Coletivamente, os resultados apresentados no presente documento demonstram que o ASO-005459 é potente e altamente seletivo para reduzir o MRNA de SNCA, que, por sua vez, medeia a redução dos níveis de proteína de SNCA. Os resultados também mostram que o ASO-005459 é bem tolerado tanto em neurônios de camundongo quanto em humanos. Esses achados suportam o desenvolvimento contínuo de ASO-005459 como uma terapêutica modificadora de doença para o tratamento de sinucleinopatias. Exemplo 4: Tolerabilidade In Vivo e redução de MRNA de SNCA In Vivo

[0318] A tolerabilidade in vivo de ASOs selecionados foi testada para ver como os ASOs foram tolerados quando injetados em diferentes modelos animais (ou seja, camundongos e macacos cynomolgus): Camundongos

[0319] Sujeitos: Camundongos PAC-Tg (SNCA“ST)Y*; SNCA” ("PAC-A53T") machos e fêmeas (2 a 3 meses de idade) portadores do gene SNCA humano inteiro com uma mutação A53T em um camundongo nocaute SNCA foram utilizados para estudos de eficácia in vivo PK / PD agudos, a longo prazo. Em alguns casos, os camundongos de ocorrência natural (WT) C57B/6 foram usados para avaliação de saúde a longo prazo (isto é, 4 semanas). Os camundongos foram alojados em grupos de 4 ou 5 em uma sala de temperatura controlada, com comida e água disponíveis à vontade. Todos os procedimentos envolvendo camundongos foram conduzidos de acordo com os Métodos de Teste com Animais (ATM) aprovados pelo Bristol- Myers Squibb Animal Care and Use Committee (ACUC).

[0320] Preparação da solução de dosagem de ASO: Seringas com solução salina estéril (1 mL) equipadas com filtros Whatman de 0,2 um e tubos de centrífuga livres de nuclease foram usadas para preparar soluções de dosagem. O volume indicado de água ou solução salina foi adicionado a um pó de ASO e foi submetido a vórtice (- 1 min) para dissolver o pó de ASO. A solução foi então deixada em repouso por 10 minutos e foi agitada novamente em vórtice por — 1 minuto. Os tubos foram brevemente centrifugados para retornar todo o líquido ao fundo do tubo e, em seguida, a solução foi filtrada através de um filtro estéril de 0,2 um para um segundo tubo livre de RNase. Uma pequena alíquota do estoque primário foi diluída para 1 mg / ml para análise da concentração usando Nanodrop. A amostra analítica foi agitada no vórtice três vezes com inversão manual para misturar bem. Em seguida, a absorbância UV da amostra foi medida duas vezes a 260 nm com Nanodrop (o pedestal foi lavado e limpo três vezes antes de aplicar a amostra). A amostra de teste foi descartada assim que a análise foi concluída. A amostra foi considerada pronta para a dosagem se a absorbância UV estivesse entre 90 e 110% da amostra. Se a absorbância de UV exceder 110% da amostra, uma diluição secundária foi preparada; se a absorbância for < 90%, a amostra foi preparada em uma concentração inicial mais alta e etapas semelhantes foram seguidas como descrito acima. As amostras foram armazenadas a 4º C até o uso.

[0321] Injeção intra-cerebroventricular à mão livre (ICV): As injeções ICV foram realizadas usando uma micro seringa Hamilton equipada com uma agulha de calibre 27 ou 30, de acordo com o método de Haley e McCormick. A agulha foi equipada com uma proteção de polietileno a 2,5 a 3 mm da ponta, a fim de limitar sua penetração no cérebro. Os camundongos foram anestesiados usando anestésico de isoflurano (1-4%). Uma vez anestesiados o suficiente, os camundongos foram segurados pela pele solta na parte de trás do pescoço com o polegar e os primeiros dedos de uma mão. Aplicando pressão suave, mas firme, a cabeça do animal foi então imobilizada pressionando contra uma superfície plana e firme. A dosagem foi realizada usando seringas Hamilton de 10 uL, equipadas com uma agulha de 27 /%49g. À ponta da agulha foi então inserida através do couro cabeludo e do crânio, cerca de 1 mm lateral e 1 mm caudal ao bregma (isto é, à direita da linha média, cerca de 3 mm atrás, conforme medido a partir da linha dos olhos). Uma vez posicionada a agulha, o ASO foi administrado em um volume de 5 ul em veículo salino e injetado por — 30 segundos. À agulha foi deixada no lugar por 5 a 10 segundos antes da remoção. Os camundongos foram devolvidos à sua gaiola e foram recuperados por — 2 a 4 min. Os camundongos foram observados continuamente durante minutos imediatamente após a administração dos efeitos comportamentais adversos do fármaco e / ou dosagem. Durante esse período, qualquer camundongo que convulsionou mais de 3 vezes foi imediatamente sacrificado e recebeu um escore automático de 20. À tolerabilidade ao fármaco foi classificada 1 hora + 15 minutos após a dosagem. Os animais doseados com compostos não tolerados (escore de tolerabilidade > 4) foram sacrificados imediatamente após a avaliação de 1 hora.

[0322] Avaliação da tolerabilidade ao ASO: Os animais doseados com os ASOs foram avaliados logo após a dosagem e monitorados por 2 horas quanto a quaisquer efeitos adversos. Para estudos de tolerabilidade aguda (AT), os camundongos foram avaliados no momento da dosagem e novamente na retirada, isto é, 3 dias após a injeção de ASO. Para avaliação de saúde a longo prazo, os camundongos foram pesados semanalmente e monitorados quanto a problemas de saúde e comportamento até a conclusão do experimento. Os camundongos que tiveram perda de peso superior a 15% do seu peso corporal inicial ou exibiram problemas de tolerabilidade foram removidos dos estudos e sacrificados. As avaliações de saúde e tolerabilidade foram realizadas de acordo com o seguinte gráfico: Tabela 5: Sistema de escore de tolerabilidade*? Categoria Escore 1 Escore 2 Escore 3 Escore 4 * Atividade da Mai gaiola doméstica * Exploração de Maior moderadamente ; is , ati exploração da Hiperatividad gaiola doméstica gaiola doméstica aumentada + . e, ligeiramente (por exemplo, Estereotipias Hiperatividad estereotipias, aumentada ou escavação ' detectáveis (por e marcada + comportamen criação ' exemplo, Estereotipias ; 2 sepultamento, 7 to em gaiola comparável aos etc.) movimentos marcadas controles -M hi . circulares, ator nigiene comportamentos repetitivos, etc.) = * Coma (não * Alguma redução . ânci . à Diminuição na atividade Sonolância Estupor responde à As Ai * Resposta (responsividade estimulação, da vigilância, exploratória + ia ; = ligeiramente reduzida, reflexo — por exemplo, exploração e Responde reduzida ao toque corneano inça), sem resposta normalmente à a AAA Pinça), : = ou manuseio diminuído) reflexo estimulação corneano * Força de ; * Alteração leve * Força de preensão ave (por da força de preensão altamente 9 p . : exemplo, marcha ou de reduzida (cai em reduzida (cai em rastejamento Coordenação preensão (cai menos de 5s) + menos de 2 s) + talha na motora e entre 5€ 10 Ataxia leve (por Ataxia (por parra de força segundos) « Sem exemplo, exemplo, andar A. aderência) + quedas, resposta — respostalentado — desconcertante, in Nenhuma normal do lado lado direito, caminhada habilidade direito oscilação) prejudicada por eai queda) para a direita

Tabela 5: Sistema de escore de tolerabilidade? Categoria Escore 1 Escore 2 Escore 3 Escore 4 * Postura acentuadam ente anormal * Postura anormal (por leve (por * Postura p exemplo, exemplo, postura moderadamente a recumbência curvada, anormal (por Postura, lateral) + aparência * Postura anormal — extenuada, baixa, exemplo, Paralisia parência, muito leve (sutil) posição da cauda, recumbência : respiração cauda reta) ventral) + facial (por . 2 AS exemplo, + Piloereção ou Respiração o babando, ptose + Pelagem superficial língua despenteada protuberante) * Respiração difícil yu h * Poucas ou * Apreensão T Hiperresponsivo parciais repetida ou remor, a estímulos (por = , ; ii * Tremor ; convulsões, contínua hiperatividad detectável exemplo, ruído)* * ciacãçequeda — (corrida e, convulsão Tremores GS qu ao marcados como parte de salto, clônico convulsões e/ou tônico) ? Normal é classificado como "0", Os animais são classificados individualmente em pontos no tempo sucessivos após a dosagem. As observações são classificadas em 1 h + 15 min, depois 24 ht2he7 dias (se apropriado). As convulsões contam para o ponto no tempo de 1 hora, mesmo que ocorram antes da janela de observação. Um escore total de tolerabilidade é calculado com base na soma dos escores de categorias individuais, com um escore máximo possível de 20.

[0323] Coleta de tecidos: Após as avaliações finais de comportamento e saúde, os camundongos foram decapitados em uma guilhotina e os cérebros foram rapidamente removidos. Cada cérebro foi dividido em dois hemisférios e a) o hipocampo foi dissecado para medições de MRNA nos estudos de tolerabilidade aguda de três dias; b) hipocampo, tronco encefálico e estriado a partir de um hemisfério foram dissecados para medições de mMRNA, enquanto as mesmas regiões foram dissecadas a partir do segundo hemisfério para medições de proteína / PK nos estudos de PK / PD no curso de tempo de dose — resposta.

[0324] Em alguns dos estudos, o sangue e o líquido cefalorraquidiano (LCR) também foram coletados para medições de PK (sangue) e PK / proteína (CSF). Para coletar o sangue e o LCR, os camundongos foram anestesiados profundamente com isoflurano (4%). O sangue foi coletado por punção cardíaca com agulha 23G. Uma vez removido, o sangue foi transferido para tubos de 2 ml! BD Microtainer (K2EDTA BD t 365974) e colocado em gelo até o processamento. Para processar o sangue, os tubos foram centrifugados a 4500xg por 10 min a 4ºC. Em seguida, o plasma foi removido e colocado em tubos Eppendorf de 0,5 ml e armazenado a -80ºC até o uso. Para coletar o LCR, a cavidade torácica foi aberta expondo o coração, e o sangue foi drenado para evitar a contaminação do LCR. As amostras de LCR foram coletadas via Cisterna magna usando micropipetas e colocadas em tubos Eppendorf de proteína de ligação baixa. Em seguida, os tubos foram centrifugados a 4500xg por 15 min a 4ºC. O LCR foi cuidadosamente transferido para limpar tubos Eppendorf de 0,5 ml e armazenado a -80ºC até uso posterior.

Dados de Cyno

[0325] Sujeito: Macacos cynomolgus machos pesando 3,5 a 10,0 kg no início do estudo foram utilizados. Cada um deles foi implantado com um cateter intratecal de líquido cefalorraquidiano (LCR) que entra nas vértebras L3 ou L4. A ponta distal do cateter de poliuretano se estendeu dentro do espaço intratecal até aproximadamente as vértebras L1. À extremidade proximal foi conectada a uma porta de acesso subcutânea localizada na parte inferior das costas do animal. Os animais foram deixados cicatrizar por pelo menos duas semanas antes do início do estudo. O cuidado com animais de laboratório estava de acordo com a Public Health Service Policy on the Humane Care and Use of Laboratory Animals and the Guide for the Care and use of Laboratory Animals NRC (2011) (National Research Council: Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (The National Academies Collection: Reports funded by National Institutes of Health). National Academies Press (US), Washington (DC)). O protocolo foi aprovado pelo Wallingford Animal

Care and Use Committee de Bristol-Myers Squibb Company.

[0326] Amostra de LCR e Sangue: A porta do LCR foi acessada por via subcutânea usando técnicas assépticas, e o LCR foi coletado a partir de animais acordados sentados na vertical em uma cadeira de retenção de primatas. Aproximadamente 0,1 ml de LCR foram descartados no início da coleta para limpar o espaço morto no cateter e na porta. O LCR foi coletado por fluxo de gravidade até um máximo de 0,5 ml de LCR por amostra. O LCR foi girado a 2.000 g a 4ºC por 10 min. O sobrenadante foi congelado em gelo seco ou em nitrogênio líquido e mantido a -90ºC até análise.

[0327] Foi coletado sangue de uma veia disponível, tipicamente a veia safena. As amostras de sangue foram preparadas em vários procedimentos, dependendo da medida em questão. Para o plasma, o sangue foi coletado em tubos tratados com EDTA. Para o soro, o sangue foi coletado em tubos separadores de soro e deixado coagular por pelo menos 30 minutos antes da centrifugação. Para medidas de coagulação e fatores de coagulação, o sangue foi coletado em tubos citratados e, para análise do RNA, o sangue foi coletado em tubos contendo RNA-later. Após o processamento, as amostras foram congeladas em gelo seco ou em nitrogênio líquido e mantidas congeladas até serem analisadas.

[0328] Dosagem Intratecal: Os animais foram treinados para serem doseados enquanto estavam acordados e usando cadeiras de retenção modificadas disponíveis comercialmente, os animais foram mantidos em posição prona. Os oligonucleotídeos antissenso (ASOs) dirigidos a SNCA foram dissolvidos em solução salina, esterilizados por filtração e administrados a 0,33 ml! / min em um volume de 1,0 ml, seguido por uma lavagem com água estéril de 0,5 ml. O tempo total de infusão foi de 4,5 min. Os animais permaneceram em posição prona por 30 minutos após a infusão.

[0329] Necropsia: Macacos Cynomolgus receberam o volume apropriado de uma solução de eutanásia disponível comercialmente enquanto anestesiados com cetamina e / ou isoflurano. Os tecidos de necropsia foram obtidos imediatamente a seguir e o cérebro foi transferido para gelo úmido para dissecção. As áreas de interesse foram dissecadas usando fatias de 4 a 6 mm em uma matriz cerebral ASI Cyno, bem como técnicas de mãos livres. As amostras foram colocadas frescas em RNA-later, ou congeladas em gelo seco para análise posterior. O tecido do SNC foi rapidamente dissecado dos macacos cynomolgus e pedaços de não mais do que 4 mm em qualquer eixo foram coletados e colocados em 5 mL de RNA-later. As amostras foram armazenadas a 4ºC durante a noite e depois transferidas para -20ºC para armazenamento até serem analisadas.

[0330] As regiões do cérebro analisadas incluem medula, ponte, mesencéfalo, cerebelo, putâmen - núcleo caudado (esquerdo e direito), hipocampo (esquerdo e direito), córtex frontal (esquerdo e direito), córtex temporal (esquerdo e direito), córtex parietal (esquerda e direita), córtex occipital (esquerda e direita) e substância branca cortical. Além disso, a medula espinhal foi amostrada nas regiões cervical, torácica e lombar. Também foram coletadas amostras de fígado, rim e coração. Em algumas ocasiões, amostras de núcleos trigêmeos, nervo tibial e aorta foram coletadas para examinar a farmacologia fora do alvo nessas áreas.

[0331] Quantificação por ELISA da concentração de ASO no tecido, plasma e LCR de camundongo ou macaco:

[0332] O tecido foi homogeneizado com plasma e água na relação de 1:1. A curva padrão foi gerada por diluição em série 2 vezes de 5000 a 4,9 nM em plasma (para plasma e LCR) e em plasma:água (para amostras de tecidos) e depois diluída para um total de 5000 vezes com 5X SSCT (750 mM de NaCl, e 75 mM de citrato de sódio, pH 7,0,

contendo Tween-20 a 0,05% (em volume) isoladamente em SSCT 5X contendo 35 nM de reagentes de captura e detecção para obter uma faixa padrão de 1 a 1000 pM. O fator de diluição utilizado variou de acordo com a faixa de concentração esperada da amostra. A sonda de captura foi AAAGGAA com 3' Biotina (Exigon) e a sonda de detecção foi 5' DigN-isopropil 18 ligante - GTGTGGT (Exigon).

[0333] Amostras e padrões experimentais foram adicionados ao tampão de lise Clarity (Phenomenex, cat tt ALO-8579) em uma relação de 1:1 antes da diluição com tampão de captura e detecção e antes da transferência para a placa ELISA. As amostras de LCR foram diluídas com plasma (2 vezes) antes da adição de tampão de lise. Uma placa revestida com estreptavidina (Thermo 15119) foi lavada 3 vezes com tampão SSCT 5X. Amostras de 100 ul foram adicionadas e incubadas por 60 minutos em temperatura ambiente. A sonda de detecção, 100 ul de fragmento Fab anti-Dig-AP Fab diluído 1:4000 em PBS contendo 0,05% de Tween-20 (Roche Applied Science, Cat. No. 11 093 274 910), foi adicionada e incubada por 60 minutos em temperatura ambiente. Após a lavagem da placa com 2X tampão SSCT, 100 ul de substrato Tropix CDP-star Sapphire Il (Applied Biosystems) foram adicionados por minutos em temperatura ambiente. As concentrações de oligonucleotídeos —antissenso foram medidas por luminescência (Enspire-PerkinElmer).

[0334] Medições da proteína alfa-sinucleína:

[0335] As amostras de tecido cerebral foram homogeneizadas a 10 ml / g de tecido em tampão RIPA (50 mM de Tris HCl, 150 mM de NaCl, NP-40 a 1%, NP-40 a 0,5%, desoxicolato de sódio a 0,5%, dodecil sulfato de sódio a 0,1%) usando homogeneizador de esferas Qiagen Tissuelyser Il por 25 ciclos / s, com um cordão de aço inoxidável de 5 mm por 2 min no total. As amostras homogeneizadas foram incubadas 30 min em gelo. A alíquota de 50 ul de cada amostra foi retida para análise de PK. As amostras restantes foram centrifugadas 20.800 9, durante 60 minutos, 4º C. O sobrenadante foi retido e utilizado para análise. A proteína total foi medida usando o kit de teste de proteína Pierce BCA (23227).

[0336] Extratos de tecido cerebral: a proteína SNCA foi medida usando o MJFR1 + 4B12 ELISA. Resumidamente, as placas ELISA (Costar) foram revestidas com 100 ul do anticorpo anti-<SNCA MJFR1 (Abcam) a uma concentração de 0,1 ug / ml! diluído em tampão BupH carbonato-bicarbonato, pH 9,4 (Thermo Scientific) durante a noite (O / N) a 4º C. No dia seguinte, as placas foram lavadas 4 vezes com PBS de Dulbecco (Life Technologies) e bloqueadas com BSA a 3% (albumina de soro bovino, livre de protease, Fração V, Roche Diagnostic) em PBS por 2 -— 3h em temperatura ambiente (RT) ou durante a noite a 4º C. Ambos os padrões e as amostras cerebrais foram diluídos com BSA a 1% / Tween a 0,05% / PBS contendo inibidor de protease Roche (Roche 11836145001, 1 pelete / 25 ml) e inibidor de fosfatase 2 e 3 (Sigma, 1:100). SNCA de ocorrência natural (rPeptídeo) foi usado como padrão. As amostras foram carregadas em duplicado (50 ul / poço) e incubadas por O / Na 4º C. Após as placas serem equilibradas em RT, 50 ul do anticorpo de detecção 4B12 (Biolegend) (diluído 1:4000 em BSA a 1% / Tween a 0,1% / DPBS) foram adicionados a cada poço e coincubados com as amostras em RT por — 2 horas. O anticorpo de detecção foi pré- conjugado com fosfatase alcalina (kit AP da Novus Biologicals). As placas foram então lavadas 4 vezes com Tween / PBS a 0,05% e desenvolvidas com 100 uL de substrato de fosfatase alcalina (Tropix CDP Star pronto para uso com Sapphire Il, T-2214, Life Technologies) por 30 minutos. As contagens de luminescência foram medidas com Perkin Elmer EnVision (2102 Multilabel Reader). As placas foram mantidas agitando-as constantemente (agitador de placas Titer, velocidade 3) durante o ensaio. Os dados foram analisados usando o

GraphPad Prism. A proteína total no tecido cerebral foi medida usando um kit de análise de micro proteínas (Thermofisher t 23235) de acordo com as instruções do fabricante.

[0337] Líquido cefalorraquidiano (LCR): a proteína SNCA foi medida usando o Kit SNCA humano U-PLEX: (cat tt KI51WKK-2, Meso Scale Discovery) de acordo com as instruções do fabricante. As amostras de LCR foram diluídas 10 vezes. A hemoglobina foi medida em amostras de LCR usando o kit de hemoglobina ELISA para camundongo Abcam (ab157715). As amostras de LCR foram diluídas 40 vezes para as medidas de hemoglobina. Medições de mRNA por gqRT-PCR

[0338] As regiões do cérebro foram colhidas e colocadas em tubos de proteção de tecidos RNA-later de 1,5 ml (Qiagen cat tt 76514) que foram pré-enchidos com RNA-later, uma solução de estabilização de RNA. O tecido em solução de RNA-later pode ser armazenado a 4º C por 1 mês, ou a -20º C ou -80º C indefinidamente.

[0339] Isolamento de RNA: Mini Kit RNeasy Plus: RNA do hipocampo e córtex de camundongo foi isolado usando o Mini Kit RNeasy Plus (Qiagen cat tt 74134). As amostras de tecido foram homogeneizadas em um volume de 600 uL ou 1200 uL de tampão RLT Plus contendo 10 ul / ml de 2-mercaptoetanol e 0,5% de reagente Dx. Foram utilizados 600 uL de tampão de lise se a amostra de tecido foi < mg, 1200 ul de tampão de lise foram utilizados para amostras de tecido > 20 mg. Para homogeneização, a amostra de tecido foi transferida para um tubo Eppendorf Safe-Lock de fundo redondo de 2,0 mL (Eppendorf cat té 022600044) contendo 600 JL de tampão RLT Plus (mais 10 ul / ml de 2-mercaptoetanol e 0,5% de reagente Dx), e amostras de esferas de aço inoxidável de 5 mm (Qiagen cat 4 69989) foram homogeneizados, utilizando um instrumento TissueLyser |l da Qiagen. As amostras foram processadas por 2,0 min a 20Hz,

rotacionadas 180º e processadas por mais 2,0 min a 20 Hz.

As amostras foram então processadas 2,0 min a 30 Hz, rotacionadas 180º e processadas por mais 2,0 min a 30 Hz.

A homogeneização mais longa e / ou com maior frequência foi usada se o processamento não estava completo. 600 uL do lisado de tecido foram transferidos para uma coluna de rotação gDNA Eliminator em um tubo de coleta de 2,0 mL e as amostras foram centrifugadas por 30 segundos a 10.000 g.

Todas as etapas de centrifugação foram realizadas em temperatura ambiente.

O fluxo foi coletado e um volume igual de etanol a 70% foi adicionado e misturado. 600 uL foram transferidos para a coluna de rotação RNeasy, colocados em um tubo de coleta de 2,0 mL e as amostras foram centrifugadas por 15 segundos a 10.000 g.

O fluxo foi descartado e a amostra de 600 uL restante foi adicionada à coluna de centrifugação.

As colunas de centrifugação foram centrifugadas e o fluxo descartado.

As colunas foram lavadas com 700 ul de Tampão de Lavagem RW1, centrifugadas por 15 segundos a 10.000 g, e o fluxo descartado.

As colunas foram então lavadas 2 vezes com 500 ul de Tampão RPE contendo 4 volumes de etanol, conforme descrito no protocolo do kit.

As colunas foram primeiro centrifugadas por 15 segundos a 10.000 g para a primeira lavagem e depois por 2,0 min a 10.000 g para a segunda lavagem.

Após a segunda lavagem, as colunas foram centrifugadas uma vez por 1,0 min a 10.000 g para secar as membranas.

As colunas foram então transferidas para um novo tubo de coleta de 1,5 mL e 30 uL de água livre de RNase foram adicionados diretamente ao centro da membrana.

As membranas foram deixadas incubando por 10 min em RT.

Em seguida, as colunas foram centrifugadas por 1,0 min a 10.000 g para eluir o RNA.

A eluição, contendo o RNA, foi coletada e armazenada em gelo até que as concentrações de RNA pudessem ser determinadas por absorbância UV usando um espectrofotômetro NanoDrop (Thermo). As amostras de RNA foram armazenadas a -80ºC.

[0340] Isolamento de RNA: Mini Kit Universal RNEASYQO Plus: O RNA de todas as outras amostras de tecido de Cyno, camundongo e rato foi isolado usando o Mini Kit Universal RNEASYQO Plus (Qiagen cat f 73404). Para homogeneização, 50 ug ou menos da amostra de tecido foram transferidos para um tubo Eppendorf Safe-Lock de fundo redondo de 2,0 ml (Eppendorf cat % 022600044) contendo 900 ul de reagente de lise QIAZOLO e um cordão de aço inoxidável de 5 mm (Qiagen cat tt 69989). As amostras foram homogeneizadas, utilizando um instrumento Qiagen's TissueLyser Il.

As amostras foram processadas por 2,0 min a Hz, as amostras foram rotacionadas 180º e foram processadas por mais 2,0 min a 20 Hz.

As amostras foram então processadas 2,0 min a Hz, as amostras foram rotacionadas 180º e processadas por mais 2,0 min a 30 Hz.

A homogeneização mais longa e / ou em frequência mais alta foi usada se o processamento não estava completo.

O lisado de tecido homogeneizado foi então transferido para um novo tubo Eppendorf Safe-Lock de 2,0 mL de fundo redondo e deixado em RT por 5,0 min.

Foram adicionados 100 uL de solução eliminadora de gDNA a cada tubo e os tubos foram agitados vigorosamente por 30 segundos.

Foram adicionados 180 uL de clorofórmio (Sigma cat ft 496189) a cada tubo, e os tubos foram agitados vigorosamente durante 30 segundos.

Os tubos foram deixados em RT por 3 min.

Tubos foram centrifugados a 12.000 g por 15 min a 4ºC.

Após a centrifugação, a fase aquosa superior foi transferida para um novo tubo Eppendorf Safe-Lock de fundo redondo de 2,0 mL — 500 ul.

Um volume igual de etanol a 70% foi adicionado e misturado.

Todas as futuras etapas de centrifugação foram realizadas em temperatura ambiente. 500 uL foram transferidos para a coluna de rotação RNeasy, colocados em um tubo de coleta de 2,0 mL, e as amostras foram centrifugadas por 15 segundos a 10.000 g.

O fluxo foi descartado e a amostra de 500 uL restante foi adicionada à coluna de centrifugação.

As colunas de centrifugação foram centrifugadas e o fluxo foi descartado, e as colunas foram lavadas com 700 ul de Tampão de Lavagem RWT contendo 2 volumes de etanol. As colunas foram centrifugadas por 15 segundos a 10.000 g, o fluxo descartado. As colunas foram então lavadas duas vezes com 500 ul de tampão RPE contendo 4 volumes de etanol como descrito no protocolo do kit. As colunas foram primeiro centrifugadas por 15 segundos a

10.000 g para a primeira lavagem e depois por 2,0 min a 10.000 g para a segunda lavagem. Após a segunda lavagem, as colunas foram centrifugadas uma vez por 1,0 min a 10.000 g para secar as membranas. As colunas foram então transferidas para um novo tubo de coleta de 1,5 mL e 30 ul de água livre de RNase foram adicionados diretamente ao centro da membrana. As membranas foram deixadas incubando por 10 min em temperatura ambiente. As colunas foram centrifugadas por 1,0 min a 10.000 g para eluir o RNA. As eluições, contendo o RNA, foram coletadas e armazenadas em gelo até a concentração de RNA determinada por absorbância UV usando um espectrofotômetro NanoDrop (Thermo). As amostras de RNA foram armazenadas a -80ºC.

[0341] Síntese de cDNA por transcrição reversa: 300 ng de RNA foram diluídos para um volume final de 10,8 ul usando água livre de nuclease (invitrogen cat % 10977-015) em uma microplaca PCR-96-AB- C (Axygen cat f 321 -65-051). Foram adicionados 6,0 ul a cada poço da mistura reacional 1 contendo o seguinte: 2,0 ul de decâmeros aleatórios a 50 uM (Ambion cat tt AM5722G) e 4,0 uL de uma mistura a 1N dNTP (Invitrogen cat % 10297-018). A placa foi selada com fita de vedação óptica (Applied Biosystems cat f& 4360954) e centrifugada durante 1,0 min a 1.000 x g em temperatura ambiente. A seguir, a placa foi aquecida por 3,0 min a 70ºC usando um sistema termociclador GeneAmp PCR 9700 (Applied Biosystems) de 96 poços. A placa foi então resfriada completamente em gelo. Em seguida, 3,25 ul. da mistura reacional 2 (contendo 2 ul de tampão de fita 10X, 1,0 ul de enzima transcriptase reversa MMLV-RT 200U / uL (Ambion cat *% 2044) e 0,25 uL de inibidor de RNase 40U / ul (Ambion cat % AM2682)) foram adicionados a cada um dos poços. A placa foi selada com fita de vedação óptica e centrifugada por 1,0 min a 1.000 x g em temperatura ambiente. Utilizando um termociclador de 96 poços, a placa foi aquecida a 42ºC por 60 min e a 95ºC por 10 min. Em seguida, as placas foram resfriadas em gelo. As placas de cDNA foram armazenadas a -20º C até estarem prontas para uso na análise por PCR.

[0342] qPCR para amplificação e quantificação da expressão de MRNA de SNCA e GAPDH: o cDNA foi diluído 5 vezes em água livre de nuclease em uma microplaca PCR-96-AB-C. 16 ul da solução Master Mix, consistindo do seguinte: 10 ul da mistura master de expressão gênica 2X Tagman (Applied Biosystems cat % 4369016), 1,0 ul do conjunto de sonda - iniciador Tagman 20X (Applied Biosystems), e 5,0 uL de água livre de nuclease, foram adicionados a cada poço de uma placa de PCR óptica de 384 poços (Applied Biosystems cat % 4483315). 4,0 uL de cDNA diluído foram adicionados a cada poço da placa de PCR óptica de 384 poços. A placa foi selada com fita de vedação óptica e centrifugada por 1,0 min a 1.000 x g em temperatura ambiente. A PCR foi realizada no sistema de PCR em tempo real Applied Biosystems 700 HT Fast, usando os seguintes parâmetros no modo padrão: 50º C por 2,0 min, 95ºC por 10 min, seguido de 40 ciclos de 95º C por 15 s e 60º C por 1,0 min.

[0343] Conjuntos de iniciador - sonda gqRT-PCR: os conjuntos de iniciador - sonda da Applied Biosystems (Thermo Fisher) incluíram o seguinte:

[0344] Sinucleína alfa humana (cat tt Hs01103383 m1) marcada com FAM

[0345] PROS1 humano (cat % HS00165590 m1) marcado com FAM

[0346] Sinucleína alfa de cyno (cat tt Mfo02793033 m1) marcada com FAM

[0347] GAPDH de cyno (cat tt MÍ04392546 g1) marcada com FAM

[0348] GAPDH de cyno (cat % Mf04392546 g1) marcada com iniciador marcado com VIC

[0349] Sinucleína alfa de rato (cat %& Rn01425141 m1) marcada com FAM

[0350] GAPDH de rato (cat tt Rn01775763-91) marcada com FAM

[0351] GAPDH de rato (cat ff 4352338E) marcada com iniciador marcado com VIC

[0352] GAPDH de camundongo (cat tt! Mm99999915-91) marcada com FAM

[0353] GAPDH de camundongo (cat ff 4352339E) marcada com iniciador marcado com VIC. Exemplo 5: Análise da atividade in vivo e tolerabilidade de ASO-005459 em camundongos

[0354] O ASO-005459 é um ASO modificado por LNA específico para SNCA humana. Os resultados in vitro (descritos acima) demonstram que o ASO-005459 é potente e seletivo para reduzir o MRNA de SNCA em neurônios primários. Os resultados in vitro também sugerem que o ASO-005459 é bem tolerado. Camundongos AS53T-PAC

[0355] Para avaliar se esses resultados também são verdadeiros in vivo, 100 ug de ASO-005459 foram administrados a camundongos AS3ST-PAC por injeção ICV, e a tolerabilidade e o nocaute (KD) de mMRNA de SNCA no hipocampo foram avaliados em 3 dias após a injeção, como descrito no Exemplo 4 (acima).

[0356] Como mostrado na Tabela 6 (abaixo), o ASO-005459 foi bem tolerado com um escore médio geral de tolerabilidade de 1. Além disso, o ASO-005459 reduziu significativamente os níveis de MRNA de SNCA em > 90% no hipocampo 3 dias após a administração (Figura 9). Tabela 6: Tolerabilidade de ASO-005459 em camundongos A53T- PAC, estudo de 3 dias “Animal Hiperatr Viglânn Motor Postural —Tremol/ — Escore H vidade cia S&C Respiração — Convulsões Total VB oO 2 1 2 oO Bo 32 o o o o o o 33 o o o o o o 34 o o o o o o o o o o o o média 1,00 SEM 1,00

[0357] Para avaliar a atividade in vivo, os camundongos ASST-PAC foram doseados com ASO-005459 em concentrações de 3,13 ug, 12,5 ug, 25 ug ou 50 ug por injeção ICV. A tolerabilidade foi avaliada medindo-se os pesos corporais nos dias 7 e 14 após a dosagem. À expressão do mMRNA de SNCA foi avaliada 14 dias após a dosagem, quando os animais foram sacrificados e seus tecidos colhidos. O "knockdown" do mMRNA de SNCA foi medido em três regiões cerebrais: hipocampo, tronco encefálico e estriado. Tronco encefálico e estriado são duas das regiões mais afetadas no cérebro de pacientes com MSA e DP. Em um estudo separado, os camundongos C57BL/6 foram doseados com 100 ug de ASO-005459 e a tolerabilidade foi avaliada medindo-se o peso corporal dos animais nos dias 7, 14,21 e 28 após a dosagem. 100 ug de ASO-005459 foram tratados ICV em camundongos de ocorrência natural (WT) C57BL/6, e o peso corporal e o comportamento foram monitorados durante um período de 4 semanas. Como o ASO-005459 não tem como alvo a SNCA de camundongo, a redução na expressão do mMRNA de SNCA não foi medida nesses animais.

[0358] Como mostrado nas Figuras 10A e 10B, não houve diferenças significativas no peso corporal dos camundongos (camundongos AS3T-PAC e C57BL/6) tratados com ASO-005459 (para todas as concentrações) e naqueles tratados com o veículo de controle. Os animais (C57BL/6) não apresentaram qualquer comportamento anormal durante o decorrer do experimento. Ver a Tabela 7 (abaixo). Tais resultados demonstram que o ASO-005459 foi bem tolerado. Além disso, em camundongos tratados com ASO-005459, houve uma redução significativa e dose-dependente na expressão do mMRNA de SNCA nas três regiões cerebrais testadas. Ver as Figuras 11A-11C. No hipocampo, a expressão do MRNA de SNCA foi reduzida em 53%, 73%, 80% e 96% para 3,13, 125, 25 e 50 pg de ASO-005459, respectivamente. “"Knockdowns" semelhantes dose-dependentes também foram observados no tronco encefálico. No estriado, os "knockdowns" do mMRNA de SNCA foram mais variáveis e menos robustos em comparação com as outras regiões (Figuras 11A-11C): um "knockdown" de 75% e 46% foi observado com 50 ug e 25 ug de ASO- 005459, respectivamente. No entanto, com 12,5 ug e 3,13 ug de ASO- 005459, não houve redução significativa na expressão de mMRNA de SNCA. As possíveis explicações para a atividade mais baixa observada no estriado podem ser devidas a diferenças nos níveis de ASO ou à cinética do "knockdown" do mMRNA de SNCA.

Tabela 7: Tolerabilidade de ASO-005459 no estudo de 28 dias “O Pontono Postura Tremor Ani- tempo — Hipera- Vigilân- Motor Respira- Convult Escore maltt (dia) tividade cia Ss&C ção sões Total 26 1 0 O O O O o 26 28 o o o o o [ 27 1 o o o o o o 27 28 o o o o o o 28 1 o o o o o [ 28 28 o o o o o 0

Tabela 7: Tolerabilidade de ASO-005459 no estudo de 28 dias O Pontonmo — Postura Tremor Ani- tempo Hipera- Vigilâno Motor Respira- Convul- Escore mal (dia) tividade cia S&C ção sões Total 29 1 o o o o o 0 29 28 o o o o o 0 30 1 o o o o o o 30 28 o o o o o [

[0359] Os níveis de ASO-005459 foram medidos nas três regiões cerebrais dos camundongos ASST-PAC. Como mostrado na Figura 12 e Tabela 8 (abaixo), as exposições cerebrais eram aproximadamente proporcionais à dose e semelhantes nas três regiões, incluindo o estriado. As relações de exposição-resposta ASO-005459 para as diferentes regiões cerebrais são mostradas nas Figuras 13A-13D. Relações similares de exposição — resposta foram observadas no hipocampo e tronco encefálico com IC5os estimados de 179 e 206 nM, respectivamente. Em comparação, a relação de exposição — resposta no estriado foi relativamente acentuada, sugerindo uma cinética mais lenta da redução do MRNA de SNCA nessa região. Ver a Figura 13C. Tabela 8: Resumo da exposição ao cérebro de ASO-005459 no estudo de 14 dias em AS3T-PAC Bose maia en Relsâocom. (ug) o hipo Hipocampo 3,13 214 43 12,5 411 140 600 223 50 1916 807 Tronco Soo 3,13 160 47 0,7 12,5 266 47 0,6

Tabela 8: Resumo da exposição ao cérebro de ASO-005459 no estudo de 14 dias em A53T-PAC pese o A ía acRelaçáocom- (no) Média (nM) SD o hipo 440 102 0,7 50 707 202 0,4 Estriado 3,13 212 38 1,0 12,5 438 103 11 25 586 109 1,0 50 1332 302 o,7

[0360] Para fornecer dados mais abrangentes de dose — resposta ao longo do tempo, o ASO-005459 foi novamente administrado (0, 12,5, 25 ou 50 ug) diretamente nos ventrículos cerebrais de camundongos AS3T-PAC por injeção ICV à mão livre. Os animais foram sacrificados 24 horas, 3 dias, 4, 8, 12, 16 e 20 semanas após a dosagem e a expressão de mRNA de SNCA no tronco encefálico e no estriado foi avaliada.

[0361] Como mostrado nas Figuras 14A e 14B (e de acordo com os dados fornecidos acima), a administração de ASO-005459 aos camundongos AS3T-PAC resultou em redução significativa do nível de expressão de mRNA de SNCA (em relação ao veículo de controle) no tronco encefálico e no estriado. A redução parecia ser tempo- e dose- dependente, com pico de redução (- 90%) observado no tronco encefálico com 50 ug de ASO-005459 aproximadamente 4 semanas após a administração (Figura 14A). No estriado, observou-se redução de pico (- 55%) com 50 ug de ASO-005459 aproximadamente 3 dias após a dosagem (Figura 14B). Os níveis de expressão de mRNA de SNCA permaneceram significativamente reduzidos em comparação com o veículo de controle nas 4 semanas após a dosagem (Figura 15A e 15B) e retornaram ao controle de linha de base cerca de 16 semanas após a dosagem (Figuras 14A e 14B).

[0362] Como mostrado nas Figuras 16A e 16B, a administração de ASO-005459 aos animais também resultou em uma redução tempo- e dose-dependente no nível da proteína SNCA no tronco encefálico e no tecido cerebral do estriado. Foi observada redução de pico (- 75%) no tronco encefálico com uma dose de 50 ug 8 semanas após a dosagem (Figura 16A). Para o tecido cerebral do estriado, também foi observada redução de pico (- 75%) com a dose de 50 ug, mas às 4 semanas após a dosagem (Figura 16B). Os níveis de expressão para os camundongos individuais às 8 semanas após a administração são fornecidos nas Figuras 17A (tronco encefálico) e 17B (estriado). Enquanto o nível de proteína SNCA retornou perto da linha de base cerca de 12 semanas após a dosagem no estriado, o nível de expressão ainda estava significativamente reduzido (- 25%) no tronco encefálico até 16 semanas após a dosagem. Exemplo 7: Análise da atividade in vivo e tolerabilidade de oligonucleotídeos antissenso dirigidos a SNCA (ASOs) em macacos Cynomolgus

[0363] Para avaliar ainda mais a atividade e a tolerabilidade do ASO in vivo, foi desenvolvido um modelo de macaco Cynomolgus portado intratecal (Cyno IT). Este modelo permite a avaliação do "knockdown" de SNCA mediado por ASO-005459, bem como do "knockdown" do potencial de incompatibilidades fora do alvo de 1 par de base PROS1 e IKZF3. Os sítios alvo de ASO-005459 em SNCA, PROS1 e IKZF3 são completamente conservados entre humanos e cyno.

[0364] Como descrito acima no Exemplo 3, cada animal foi implantado com um cateter intratecal de líquido cefalorraquidiano (LCR) que entra nas vértebras L3 ou L4. Os ASOs (ASO-005459, ASO-005584 e ASO-005578) foram dissolvidos em solução salina e administrados aos animais, infundidos por 4,5 minutos usando a porta IT (2 animais por grupo de dose). Cada um dos animais recebeu um dos seguintes: (i) ASO-005578 (4 mg no total), (ii) ASO-005584 (4 ou 8 mg no total) e (iii) ASO-005459 (8 mg no total). Os animais foram então sacrificados em vários momentos após a dosagem, quando os tecidos foram colhidos para análise da exposição e atividade do ASO. As regiões cerebrais analisadas incluíam medula (Med), ponte (V-Pons), mesencéfalo (V-MB), cerebelo (CBL), putâmen - núcleo caudado (esquerdo e direito) (CauP), hipocampo (esquerdo e direito) (Hip), córtex frontal (esquerdo e direito) (FrC), córtex temporal (esquerdo e direito) (TeC), córtex parietal (esquerdo e direito) (PaC), córtex occipital (esquerdo e direito) (Occ), e substância branca cortical (WM). Além disso, a medula espinhal foi amostrada nas regiões cervical (CSC), torácica (TSC) e lombar (LSC). Também foram coletadas amostras do fígado, rim, coração, núcleos trigeminais, nervo tibial, e aorta para examinar a farmacologia fora do alvo nessas áreas.

[0365] Como foi observado em camundongos, os ASOs foram bem tolerados no cyno, sem efeitos adversos sendo observados (dados não mostrados). E como mostrado na Figura 18A e Tabela 9 abaixo, a administração de ASO-005578 ou ASO-005584 aos animais resultou em redução significativa dos níveis de MRNA de SNCA em todos os tecidos cerebrais analisados. Às 2 semanas após a dosagem, o ASO- 005578 induziu reduções de 75%, 32%, 65%, 69%, 98% e 87% na medula, putâmen - núcleo caudado, ponte, cerebelo, medula espinhal lombar e córtex frontal, respectivamente. ASO-005584 induziu reduções de 59%, 45%, 61%, 57%, 97% e 88% na medula, putâmen - núcleo caudado, ponte, cerebelo, medula espinhal lombar e córtex frontal, respectivamente. Reduções semelhantes foram observadas nos períodos de 2 e 4 semanas após a dose após a administração de 8 mg de ASO-005584 (Figura 18B). O ASO-005459 também exibiu um "knockdown" robusto do MRNA de SNCA em várias regiões do cérebro de cyno (Tabela 9). Tabela 9: Efeito dos ASOs nos níveis de MRNA de SNCA no cérebro de cyno. Do- Ponto CB | Fr Pa Ca | Te Vv- v- cs |TS LS se |no L | c |e |upjc MB Po |c |c |c (mg) | tempo ns (sema nas) ASO- 4 2 25 32 13 27 24 38 45 27 35 15 7 2 0055 78 me e: e e e a ss 7 ss 11) es [7 Te TT e ss ss 7 7 713)

ANNNNNEILINIEILISACILICICARSENENLA ASO- 24 174 | 140 | 146 149 137 73 is O 59 24 129 138 133 145 ps O O | 8 aias | 162 fe ea O a a

[0366] Para caracterizar ainda mais a redução tempo-dependente do mRNA de SNCA descrito acima, os macacos cyno foram doseados com ASO-005459 (8 mg total por animal) e sacrificados às 24 horas, 3 dias, 2, 4, 8, 13, ou 20 semanas após a dosagem para avaliar o nível de expressão do MRNA de SNCA nos diferentes tecidos. Como mostrado na Figura 19A, observou-se redução de pico entre 2 e 13 semanas após a dosagem. Reduções de pico de 70%, 65%, 75%, 35%, 94% e 99%

foram observadas na medula, cerebelo, ponte, putâmen - núcleo caudado, córtex frontal e medula espinhal lombar, respectivamente. Esta redução no nível de expressão do MRNA de SNCA também está correlacionada com uma redução tempo-dependente no nível de expressão da proteína SNCA (Figura 19B).

[0367] Em seguida, para avaliar ainda mais se a redução no nível de expressão nos macacos cyno também dependia da dose, os animais receberam 2, 4 ou 8 mg de ASO-005459 e, em seguida, foram sacrificados duas semanas após a dosagem. Como mostrado nas Figuras 20A e 20B, a redução tanto no MRNA de SNCA quanto nos níveis de expressão da proteína SNCA também foi dose-dependente, com a maior redução observada com 8 mg de ASO-005459.

[0368] Os resultados apresentados no presente documento demonstram que o ASO-005459 é potente e seletivo para reduzir o MRNA de SNCA e que o ASO-005459 é bem tolerado em neurônios e estudos em espécies pré-clínicas in vivo. Além disso, os resultados dos neurônios ASST-PAC confirmam que as reduções do MRNA mediadas por ASO-005459 resultam em reduções dos níveis de proteína SNCA in vitro e in vivo. Além disso, os resultados em camundongos ASST-PAC e macacos cyno demonstram que o ASO-005459 reduz o mMRNA de SNCA e a proteína SNCA no cérebro em doses bem toleradas. Tomados em conjunto, esses achados suportam o desenvolvimento contínuo do ASO-005459 como uma terapêutica modificadora da doença para o tratamento de sinucleinopatias.

[0369] Este pedido PCT reivindica benefício de prioridade para o Pedido Provisório US. No. 62/616.994, depositado em 12 de janeiro de 2018, que é incorporado no presente documento por referência em sua totalidade.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Oligonucleotídeo antissenso, caracterizado pelo fato de compreender uma sequência de nucleotídeos contígua de 10 a 30 nucleotídeos de comprimento que é complementar a uma sequência de ácido nucleico dentro de um transcrito de alfa-sinucleína (SNCA), em que a sequência de ácido nucleico compreende os nucleotídeos 7592- 7637 da SEQ ID NO: 1.

2. Oligonucleotídeo antissenso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a sequência de ácido nucleico compreende os nucleotídeos 7602 - 7627 da SEQ ID NO: 1.

3. Oligonucleotídeo antissenso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a sequência de ácido nucleico corresponde aos nucleotídeos 7603 - 7620 da SEQ ID NO: 1.

4. Oligonucleotídeo antissenso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a sequência de ácido nucleico corresponde aos nucleotídeos 7604 - 7620 da SEQ ID NO: 1.

5. Oligonucleotídeo antissenso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o transcrito de SNCA compreende a SEQ ID NO: 1.

6. Oligonucleotídeo antissenso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotídeos contíguos compreende SEQ ID NO: 4 a SEQ ID NO: 21 com uma, duas, três ou quatro incompatibilidades.

7. Oligonucleotídeo antissenso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotídeos contíguos compreende SEQ ID NO: 4 a SEQ ID NO: 21.

8. Oligonucleotídeo antissenso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotídeos contíguos compreende SEQ ID NO: 15 ou

SEQ ID NO: 7.

9. Oligonucleotídeo antissenso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o oligonucleotídeo antissenso é capaz de inibir a expressão do transcrito de SNCA humano em uma célula que está expressando o transcrito de SNCA humano.

10. Oligonucleotídeo antissenso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotídeos contíguos compreende pelo menos um análogo de nucleotídeo.

11. Oligonucleotídeo antissenso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que é um "gapmer".

12. Oligonucleotídeo antissenso da reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que é um "gapmer" de flanco alternado.

13. Oligonucleotídeo antissenso, de acordo com a reivindicação 11 ou 12, caracterizado pelo fato de compreender a fórmula de 5'-A-B-C-3', em que (i) a região B é uma sequência contígua de pelo menos 6 unidades de DNA, capazes de recrutar RNase; (ii) a região A é uma primeira sequência de asa de 1 a 10 nucleotídeos, em que a primeira sequência de asa compreende um ou mais análogos de nucleotídeos e, opcionalmente, uma ou mais unidades de DNA, e em que pelo menos um dos análogos de nucleotídeos está localizado na extremidade 3' de A; e (ili) a região C é uma segunda sequência de asa de 1 a 10 nucleotídeos, em que a segunda sequência de asa compreende um ou mais análogos de nucleotídeos e, opcionalmente, uma ou mais unidades de DNA, e em que pelo menos um dos análogos de nucleotídeos está localizado na extremidade 5' de C.

14. Oligonucleotídeo antissenso, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a região A compreende uma combinação de análogos de nucleotídeos e unidades de DNA selecionados a partir de (i) 1 a 10 análogos de nucleotídeos e O unidade de DNA; (ii) 1 a 9 análogos de nucleotídeos e 1 unidade de DNA; (iii) 1 a 8 análogos de nucleotídeos e 1 a 2 unidades de DNA; (iv) 1 a 7 análogos de nucleotídeos e 1 a 3 unidades de DNA; (v) 1 a 6 análogos de nucleotídeos e 1 a 4 unidades de DNA; (vi) 1 a 5 análogos de nucleotídeos e 1 a 5 unidades de DNA; (vii) 1 a 4 análogos de nucleotídeos e 1 a 6 unidades de DNA; (viii) 1 a 3 análogos de nucleotídeos e 1 a 7 unidades de DNA; (ix) 1 a 2 análogos de nucleotídeos e 1 a 8 unidades de DNA; e (x) 1 análogo de nucleotídeo e 1 a 9 unidades de DNA.

15. Oligonucleotídeo antissenso, de acordo com a reivindicação 13 ou 14, caracterizado pelo fato de que a região C compreende uma combinação de análogos de nucleotídeos e unidades de DNA selecionados a partir de (i) 1 a 10 análogos de nucleotídeos e O unidade de DNA; (ii) 1 a 9 análogos de nucleotídeos e 1 unidade de DNA; (iii) 1 a 8 análogos de nucleotídeos e 1 a 2 unidades de DNA; (iv) 1 a 7 análogos de nucleotídeos e 1 a 3 unidades de DNA; (v) 1 a 6 análogos de nucleotídeos e 1 a 4 unidades de DNA; (vi) 1 a 5 análogos de nucleotídeos e 1 a 5 unidades de DNA; (vii) 1 a 4 análogos de nucleotídeos e 1 a 6 unidades de DNA; (viii) 1 a 3 análogos de nucleotídeos e 1 a 7 unidades de DNA; (ix) 1 a 2 análogos de nucleotídeos e 1 a 8 unidades de DNA; e (x) 1 análogo de nucleotídeo e 1 a 9 unidades de DNA.

16. Oligonucleotídeo antissenso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 15, caracterizado pelo fato de que a região A é um primeiro modelo de asa selecionado a partir de quaisquer ASOs nas Figuras 2 e 3 e / ou região C é um segundo modelo de asa selecionado a partir de quaisquer ASOs nas Figuras 2 e 3, em que a letra maiúscula é um análogo de nucleotídeo e a letra minúscula é um DNA.

17. Oligonucleotídeo antissenso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de compreender pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove ou pelo menos dez análogos de nucleotídeos.

18. Oligonucleotídeo antissenso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 17, caracterizado pelo fato de que o análogo ou análogos de nucleotídeos são um ou mais nucleosídeos de açúcar modificado selecionados a partir do grupo que consiste de ácido nucleico bloqueado (LNA); RNA 2'-O-alquil; 2:-amino-DNA; 2”-fluoro- DNA; ácido nucleico arabino (ANA); 2'-fluoro-ANA, ácido nucleico hexitol (HNA), ácido nucleico intercalante (INA), etil restrito nucleosídeo (cEt), ácido nucleico 2'-O-metil (2-OMe), ácido nucleico 2'-O-metoxietil (2'-MOE), e qualquer combinação dos mesmos.

19. Oligonucleotídeo antissenso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 17, caracterizado pelo fato de que o análogo ou análogos de nucleotídeos compreendem um açúcar bicíclico.

20. Oligonucleotídeo antissenso, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o açúcar bicíclico compreende cEt, 2'-O-metoxietil 2' 4'-restrito (CMOE), LNA, a-L-LNA, B- D-LNA, ácidos nucleicos em ponte com 2'-0,4'-C-etileno (ENA), amino- LNA, oxi-LNA ou tio-LNA.

21. Oligonucleotídeo antissenso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 20, caracterizado pelo fato de que o análogo ou análogos de nucleotídeos compreendem um LNA.

22. Oligonucleotídeo antissenso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 21, caracterizado pelo fato de que o oligonucleotídeo antissenso compreende uma ou mais nucleobases 5' metil citosina.

23. Oligonucleotídeo antissenso, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que compreende dois a cinco LNAs na região 5' do oligonucleotídeo antissenso.

24. Oligonucleotídeo antissenso, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que compreende dois a cinco LNAs na região 3' do oligonucleotídeo antissenso.

25. Oligonucleotídeo antissenso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizado pelo fato de que o oligonucleotídeo antissenso tem uma tolerabilidade in vivo menor ou igual a um escore total de 4, em que o escore total é a soma de um escore unitário de cinco categorias, que são 1) hiperatividade; 2) diminuição da atividade e excitação; 3) disfunção motora e / ou ataxia; 4) postura e respiração anormais; e 5) tremor e / ou convulsões, e em que o escore unitário para cada categoria é medido em uma escala de 0a.

26. Oligonucleotídeo antissenso, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a tolerabilidade in vivo é menor ou igual ao escore total de 3, ao escore total de 2, ao escore total de 1, ou ao escore total de O.

27. Oligonucleotídeo antissenso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 26, caracterizado pelo fato de que reduz a expressão de mMRNA de SNCA em uma célula em pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90% ou cerca de 100% em comparação com uma célula não exposta ao oligonucleotídeo antissenso.

28. Oligonucleotídeo antissenso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 27, caracterizado pelo fato de que reduz a expressão da proteína SNCA em uma célula em pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos pelo menos cerca de 95% em comparação com uma célula não exposta ao oligonucleotídeo antissenso.

29. Oligonucleotídeo antissenso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 28, caracterizado pelo fato de que compreende os nucleotídeos A, T, C e G e pelo menos um análogo dos nucleotídeos A, T, C e G, e tem um escore de sequência maior ou igual a igual a 0,2, em que o escore de sequência é calculado pela fórmula |: * de nucleotídeos C e seus análogos - f de nucleotídeos G e seus análogos (1) / Comprimento total de nucleotídeos.

30. Oligonucleotídeo antissenso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 29, caracterizado pelo fato de que tem de a 24 nucleotídeos de comprimento ou de 14 a 21 nucleotídeos de comprimento.

31. Oligonucleotídeo antissenso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 30, caracterizado pelo fato de que tem 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou 21 nucleotídeos de comprimento.

32. Oligonucleotídeo antissenso, de acordo com a reivindicação 1 a 31, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotídeos compreende, consiste essencialmente de, ou consiste de uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste de SEQ ID NOs: 4 a 21, com um modelo selecionado a partir do grupo que consiste dos modelos nas Figuras 2 e 3, em que a letra maiúscula é um nucleosídeo de açúcar modificado e a letra minúscula é DNA.

33. Oligonucleotídeo antissenso, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotídeos compreende, consiste essencialmente de, ou consiste de SEQ ID NO: 15 com o modelo de ASO-005459 e SEQ ID NO: 7 com o modelo de ASO-005578 ou ASO- 005584.

34. Oligonucleotídeo antissenso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 31, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotídeos compreende, consiste essencialmente de, ou consiste de uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste de SEQ ID NOs: 4-21 com a estrutura química correspondente nas Figuras 2e 3.

35. Oligonucleotídeo antissenso, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotídeos compreende, consiste essencialmente de, ou consiste de ASO-005459, ASO-005578 e ASO-005584.

36. Oligonucleotídeo antissenso, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que o ASO compreende uma fórmula molecular de C171H21aN56O90P16S 16.

37. Oligonucleotídeo antissenso, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que o ASO compreende uma fórmula molecular de C182H229oN58O96P17S17.

38. Oligonucleotídeo antissenso, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que o ASO compreende uma fórmula molecular de C181H227N58O96P17S17.

39. Oligonucleotídeo antissenso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 35, caracterizado pelo fato de que compreende uma ligação internucleosídica selecionada a partir de: uma ligação fosfodiéster, uma ligação fosfotriéster, uma ligação metilfosfonato, uma ligação fosforamidato, uma ligação fosforotioato, e combinações das mesmas.

40. Oligonucleotídeo antissenso, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que a ligação internucleosídica compreende uma ou mais ligações fosfato modificadas estéreo-definidas.

41. Conjugado, compreendendo o oligonucleotídeo antissenso como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 40, caracterizado pelo fato de que o oligonucleotídeo antissenso está covalentemente ligado a pelo menos uma porção não nucleotídica ou não polinucleotídica.

42. Conjugado, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que a porção não nucleotídica ou não polinucleotídica compreende uma proteína, uma cadeia de ácidos graxos, um resíduo de açúcar, uma glicoproteína, um polímero, ou qualquer combinação dos mesmos.

43. Composição farmacêutica, caracterizado pelo fato de compreender o oligonucleotídeo antissenso como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 40, ou o conjugado como definido na reivindicação 41 ou 42, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

44. Composição, de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um agente terapêutico.

45. Composição, de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato de que o agente terapêutico é um antagonista de alfa-sinucleína.

46. Composição, de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que o antagonista de alfa-sinucleína é um anticorpo anti-alfa-sinucleína ou um fragmento do mesmo.

47. Kit, caracterizado pelo fato de compreender o oligonucleotídeo antissenso como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 40, o conjugado como definido na reivindicação 41 ou 42, ou a composição como definida na qualquer uma das reivindicações 43 a 46, e instruções de uso.

48. Kit de diagnóstico, caracterizado pelo fato de compreender o oligonucleotídeo antissenso como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 40, o conjugado como definido na reivindicação 41 ou 42, ou a composição como definida em qualquer uma das reivindicações 43 a 46, e instruções de uso.

49. Método para inibir ou reduzir a expressão da proteína SNCA em uma célula, caracterizado pelo fato de compreender administrar o oligonucleotídeo antissenso como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 40, ou o conjugado como definido na reivindicação 41 ou 42, ou a composição como definida em qualquer uma das reivindicações 43 a 46 à célula que expressa a proteína SNCA, em que a expressão da proteína SNCA na célula é inibida ou reduzida após a administração.

50. Método, de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de que o oligonucleotídeo antissenso inibe ou reduz a expressão do mMRNA de SNCA na célula após a administração.

51. Método, de acordo com a reivindicação 49 ou 50, caracterizado pelo fato de que a expressão do mMRNA de SNCA é reduzida em pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, em pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90% ou cerca de 100% após a administração em comparação com uma célula não exposta ao oligonucleotídeo antissenso.

52. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 49 a 51, caracterizado pelo fato de que o oligonucleotídeo antissenso reduz a expressão da proteína SNCA na célula após a administração em pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80% ou pelo menos cerca de 90% em comparação com uma célula não exposta ao oligonucleotídeo antissenso.

53. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 49 a 52, caracterizado pelo fato de que a célula é um neurônio.

54. Método para tratar uma sinucleinopatia em um indivíduo em necessidade de tratamento, caracterizado pelo fato de compreender administrar uma quantidade eficaz do oligonucleotídeo antissenso como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 40, o conjugado como definido na reivindicação 41 ou 42, ou a composição como definida em qualquer uma das reivindicações 43 a 46 ao sujeito.

55. Uso do oligonucleotídeo antissenso, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 40, do conjugado como definido reivindicação 41 ou 42, ou da composição como definida em qualquer uma das reivindicações 43 a 46, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de um medicamento.

56. Uso do oligonucleotídeo antissenso, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 40, do conjugado como definido na reivindicações 41 ou 42, ou da composição como definida em qualquer uma das reivindicações 43 a 46, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de um medicamento para o tratamento de uma sinucleinopatia em um sujeito em necessidade do mesmo.

57. Oligonucleotídeo antissenso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 40, conjugado como definido na reivindicação 41 ou 42, ou a composição como definida em qualquer uma das reivindicações 43 a 46, , caracterizado pelo fato de ser para uso em terapia.

58. Oligonucleotídeo antissenso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 40, conjugado como definido na reivindicação 41 ou 42, ou a composição como definida em qualquer uma das reivindicações 43 a 46, caracterizado pelo fato de ser para uso na terapia de uma sinucleinopatia em um sujeito em necessidade de tratamento.

59. Método de acordo com a reivindicação 54, uso como definido na reivindicação 55 ou 56, ou oligonucleotídeo antissenso para uso como definido na reivindicação 57 ou 58, , caracterizado pelo fato de que a sinucleinopatia é selecionada a partir do grupo que consiste de doença de Parkinson, demência da doença de Parkinson, atrofia de múltiplos sistemas, demência com corpos de Lewy, e quaisquer combinações das mesmas.

60. Método de acordo com a reivindicação 54 ou 59, uso como definido em qualquer uma das reivindicações 55, 56 e 59, ou oligonucleotídeo antissenso para uso como definido em qualquer uma das reivindicações 57 a 59, , caracterizado pelo fato de ser que o sujeito é um humano.

61. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 54, 59 e 60, uso como definido em qualquer uma das reivindicações 55, 56, 59 e 60, ou oligonucleotídeo antissenso para uso como definido em qualquer uma das reivindicações 57 a 60, , caracterizado pelo fato de ser que o oligonucleotídeo antissenso, o conjugado, ou a composição é administrtado — por via orali parentérica, intratecal, — intra- cerebroventricular, pulmonar, tópica ou intraventricular.

62. Oligonucleotídeo antissenso de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 40, conjugado como definido na reivindicação 41 ou 42, composição como definida em qualquer uma das reivindicações 43 a 46, kit como definido na reivindicação 47 ou 48, método como definido em qualquer uma das reivindicações 49 a 54 e 59 a 61, uso como definido em qualquer uma das reivindicações 55, 56 e 59 a 61, ou oligonucleotídeo antissenso, caracterizado pelo fato de ser para uso como definido em qualquer uma das reivindicações 57 a 61, em que o análogo de nucleotídeo compreende um nucleosídeo de açúcar modificado.

63. Oligonucleotídeo antissenso, conjugado, composição,

kit, método, uso ou oligonucleotídeo antissenso para uso de acordo com a reivindicação 62, caracterizado pelo fato de ser que o nucleosídeo de açúcar modificado é um nucleosídeo de açúcar modificado que melhora a afinidade.