CN117925817A - Ppic基因在制备预防和治疗特发性肺纤维化药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于靶点药物技术领域，公开了一种PPIC在制备预防和治疗特发性肺纤维化药物中的应用，所述PPIC在制备预防和治疗特发性肺纤维化药物中的应用利用RNA干扰技术研制一种PPIC基因靶向抑制剂，该抑制剂可与PPIC基因特异性结合使其沉默，从而减少肺损伤、抑制成纤维细胞激活和细胞外基质沉积，达到治疗IPF的目的；PPIC基因靶向抑制剂在IPF领域发挥重要作用，为临床治疗IPF提供新的靶向治疗药物。本发明提供一种PPIC基因作为标志物在IPF的诊断和药物制备中的应用，本发明提供了新的基因PPIC，通过敲低PPIC的表达量可有效减轻IPF。
Description
技术领域
本发明属于靶点药物技术领域，具体涉及一种PPIC基因在制备预防和治疗特发性肺纤维化药物中的应用。
背景技术
特发性肺纤维化(Idiopathicpulmonaryfibrosis，IPF)是一种能导致肺功能进行性丧失的严重的间质性肺疾病，其特征在于上皮-间质转化、成纤维细胞激活和细胞外基质大量积累。IPF好发于中老年人，且男性多于女性。据统计，每十万人中约有2-29人患有IPF，欧盟地区约有110000名患者，且每年新增35000人。目前，我国IPF患者增加，平均生存期仅2-4年，死亡率高于多数肿瘤。IPF的发病机制尚未完全阐明，尽管吡非尼酮和尼达尼布是临床上治疗IPF最推荐的两个药物，但其疗效欠佳，并不能延长患者的生存期。因此，明确IPF发病机制并探索其分子治疗靶点具有重要意义。
生信分析显示肽基脯氨酰异构酶C(PPIC)在IPF患者肺中急剧上调。PPIC编码亲环蛋白C，是亲环蛋白家族的一种酶。亲环蛋白存在于大多数组织的众多细胞区室中，参与了不同细胞室中多种蛋白质的折叠和功能。亲环蛋白在细胞信号传导中也有一定作用。最近的研究发现，PPIC在四氯化碳(CCl4)诱导的肝纤维化中异常上调，通过敲低该基因，能有效减少纤维化面积，减少细胞外基质沉积，改善肝纤维化。这也提示PPIC在IPF中存在相似的作用。目前，PPIC基因在IPF中的作用及相关机制还未见报道，在IPF基因治疗中的应用还待明确，故研究PPIC相关药物用于治疗IPF有其必要性和独特性。
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：尽管吡非尼酮和尼达尼布是临床上治疗IPF最推荐的两个药物，但其疗效欠佳，并不能延长患者的生存期；IPF的发病机制尚未完全阐明；IPF基因靶向治疗相关药物缺乏。
当前，针对IPF的治疗主要依赖于两种FDA批准的药物：吡非尼酮和尼达尼布。这两种药物通过抑制肺部的纤维化过程来延缓疾病的进展。然而，这些药物的作用机制并不具有针对性，无法直接靶向导致纤维化的特定基因或蛋白。
这种非特异性的治疗方式带来了一些技术问题：
1.由于缺乏特异性，这些药物会对非肺部组织产生副作用，导致不良反应。
2.这些药物只能延缓病情的进展，而不能根治疾病。这是因为它们无法解决导致纤维化的基因或蛋白的异常表达。
3.对于不同的患者，这些药物的效果会有很大的差异。这是因为不同的患者会存在不同的病因，而这些药物的非特异性使得他们难以对所有患者都产生疗效。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种PPIC基因在制备预防和治疗特发性肺纤维化药物中的应用。
本发明是这样实现的，一种PPIC基因在制备预防和治疗特发性肺纤维化药物中的应用，PPIC基因在IPF组织中高表达，通过抑制PPIC基因转录或蛋白表达量减少肺损伤、成纤维细胞激活和细胞外基质沉积，减轻IPF。
PPIC基因及其表达产物在作为特发性肺纤维化诊断标记物中的用途。
在制备预防和治疗特发性肺纤维化药物时，还可使用与PPIC基因同源性大于80％，且表达相同功能蛋白的基因。
PPIC基因靶向抑制剂在制备预防和治疗特发性肺纤维化药物中的应用。
所述抑制剂的靶点序列为：TGGGATGACTGTGGTACATTC。
PPIC抑制剂是减少PPIC基因转录或蛋白表达的化合物小分子或生物大分子。
PPIC基因表达抑制剂或敲除试剂为能够减少PPIC基因转录或蛋白表达量的shRNA、siRNA或反义核酸；或能表达或形成所述shRNA、siRNA或反义核酸的构建体。
所述体外构建体为siRNA与转染试剂的混合物溶液，具体地，转染试剂为jetPRIME(Polyplus)；或所述体内构建体为包含有该shRNA的腺相关病毒(adeno-associatedvirus，AAV)载体；
AAV包装采用的病毒类型为AAV2/9。
一种用于特发性肺纤维化诊断或预后检测的试剂盒，该试剂盒包括检测PPIC基因转录或蛋白表达量的试剂。
结合上述的技术方案和解决的技术问题，本发明所要保护的技术方案所具备的优点及积极效果为：
第一，本发明提供的PPIC基因靶向抑制剂特异性强，沉默效率高，能有效抑制PPIC基因表达量；本发明通过PPIC基因靶向抑制剂抑制PPIC基因转录或蛋白表达，减少纤维化刺激因子对肺泡上皮细胞的损伤，抑制成纤维细胞激活，减少细胞外基质沉积，从而达到防治IPF的目的；本发明提供的基于抑制PPIC基因的药物，是临床上尚未研究的PPIC基因，研究PPIC基因相关药物用于治疗特发性肺纤维化有其必要性和独特性。
第二，本发明提供一种PPIC基因作为标志物在IPF的诊断和药物制备中的应用，本发明提供了新的基因PPIC，通过抑制PPIC的表达可有效的减轻IPF。
第三，作为本发明的权利要求的创造性辅助证据，还体现在以下几个重要方面：
1.本发明的技术方案转化后的预期收益和商业价值为：
目前，吡非尼酮和尼达尼布作为IPF的治疗药物并不理想；肺移植是治疗这种疾病的唯一有效方法。然而，由于捐赠者不足、术后并发症、排斥反应和费用高等因素，许多病人无法接受肺移植。而本发明的技术方案可以实现IPF靶向治疗，延长患者生存期且安全性高，打破了IPF预防和治疗的技术壁垒，可以获得较高的预期经济和社会效益。
2.本发明的技术方案填补了国内外业内技术空白：
针对IPF的分子靶向疗法稀缺，目前国内外还没有针对PPIC基因制备IPF靶向抑制剂的技术，故可以作为IPF靶向药物填补国内外在这一方面的空白。
3.本发明的技术方案是否解决了人们一直渴望解决、但始终未能获得成功的技术难题：
IPF影响全球约300万人，诊断后的中位预期寿命为2-4年。尽管吡非尼酮和尼达尼布作为治疗药物能一定程度改善死亡率，但对延长患者生存期并无作用。本发明通过PPIC靶向抑制剂实现了IPF的特异性治疗，改善IPF，最终延长生存期。
第四，本发明提供的使用PPIC基因靶向抑制剂在制备预防和治疗特发性肺纤维化药物的实施例所带来的技术进步可以从以下几个方面进行说明：
1.靶向治疗的开发：通过对PPIC基因的靶向抑制，这种新方法提供了一种针对IPF的治疗方式，这种方法直接针对病因进行干预，而非仅仅控制症状。这标志着从对症疗法到病因治疗的重要转变，为IPF治疗提供了新的方向。
2.分子诊断的进步：利用PPIC基因作为诊断标记物，可以帮助在IPF的早期阶段进行诊断，从而实现早治疗、早干预。这在IPF的管理中是一个重要的进步，因为这种疾病通常在晚期才被诊断出来。
3.增强的治疗特异性：采用特定的shRNA序列(如TGGGATGACTGTGGT ACATTC)靶向PPIC基因，可以提高治疗的特异性，减少对非靶标细胞的影响，降低潜在的副作用，提高治疗的安全性。
4.基因疗法的创新应用：将抑制剂包装至AAV2/9型载体，利用了AAV作为基因治疗载体的高感染效率和良好的组织特异性。AAV2/9型对肺组织具有较高的亲和力，这增加了治疗效果并减少了系统性暴露的风险。
5.潜在的治愈性：RNA干扰技术的应用在理论上有望恢复肺组织的正常功能，因为它通过降低纤维化的关键因素(如PPIC基因的过度表达)逆转病理过程，而不仅仅是阻止其进展。
6.药物开发的新策略：通过识别同源性大于80％的基因，且表达相同功能蛋白的基因作为替代靶点，为药物开发提供了新的策略，这有助于解决由于遗传变异而导致的治疗差异问题。
7.长期治疗效果的潜力：AAV载体通常能够提供长期的基因表达。在IPF这种慢性疾病中，一次治疗带来长期效果，减少了频繁治疗的需求和患者的经济负担。
8.为未来研究奠定基础：当前的研究为未来的科学探索奠定基础，比如通过理解PPIC基因在IPF中的角色，可以揭示新的生物学途径，为发现其他潜在的治疗靶点提供线索。
这些技术进步展示了通过利用现代分子生物学技术，特别是RNA干扰技术在疾病治疗中的应用，能够在IPF等慢性、难治性疾病的管理中带来实质性的改变。
附图说明
图1为PBS和BLM处理小鼠21天后肺组织的苏木素伊红(H&E)染色、马松(Masson)染色和天狼星红(PicroSiriusRed，PSR)染色，检测病理特征、纤维化面积及胶原蛋白含量，标尺为100um；
图2为qRT-PCR检测PBS和BLM处理小鼠21天后肺组织中纤维化标志物的mRNA表达水平(图2A)、Westernblot检测纤维化标志物的蛋白表达水平并进行统计学分析作图(图2B)；
图3为qRT-PCR检测PBS和BLM处理小鼠21天后肺组织中PPIC的mRNA表达水平(图3A)、Westernblot检测PPIC的蛋白表达水平并进行统计学分析作图(图3B)；
图4为PBS和BLM处理小鼠21天后肺组织的PPIC抗体免疫组化染色(图4A)和PPIC抗体免疫荧光染色(图4B)；
图5为pAAV-U6-shRNA(PPIC)-CMV-EGFP-WPRE载体构建图；
图6为本发明实施例提供的AAV病毒注射入小鼠体内后EGFP在肺部的表达情况示意图，提示病毒成功到达肺部发挥作用；
图7为qRT-PCR检测对照组和PPIC敲低组小鼠肺组织中PPIC的mRNA表达水平(图7A)、Westernblot检测PPIC的蛋白表达水平并进行统计学分析作图(图7B)；
图8为小鼠Penh肺功能检测结果；
图9为AAV-shCtrl+BLM(BLM处理后的对照组小鼠)和AAV-shRNA-PPIC+BL M(PPIC基因靶向抑制剂组小鼠)小鼠存活率曲线；
图10为PBS、BLM、AAV-shCtrl+BLM(BLM处理后的对照组小鼠)和AAV-sh RNA-PPIC+BLM(PPIC基因靶向抑制剂组小鼠)处理小鼠肺组织H&E染色；
图11为qRT-PCR检测AAV-shCtrl+BLM(BLM处理后的对照组小鼠)和AAV-sh RNA-PPIC+BLM(PPIC基因靶向抑制剂组小鼠)处理小鼠肺组织中纤维化标志物的mRNA表达水平(图11A)、Westernblot检测其肺纤维化标志物的蛋白表达水平并进行统计学分析作图(图11B)。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
以下是本发明提供的四个关于使用PPIC基因靶向抑制剂在制备预防和治疗特发性肺纤维化药物中的具体实施例：
实施例1：PPIC基因靶向抑制剂的构建和使用
1.体外实验：构建能够表达该序列的siRNA，借助jetPRIME转染剂(Polyplus)转染肺成纤维细胞，并且确保能够在宿主细胞中准确表达。
2.在体外细胞模型中验证抑制剂的有效性，检查siRNA介导的PPIC基因沉默以及是否能减少成纤维细胞的激活和细胞外基质沉积。
3.进一步地，构建能够表达上述序列shRNA的载体，如AAV载体，确保载体中包含shRNA的序列，并且能够在肺中准确表达。
4.将shRNA表达载体包装进AAV2/9型病毒颗粒，以确保抑制剂可以有效地到达并感染肺部。
5.在IPF动物模型中测试该治疗方法的效果，通过给予相应剂量的AAV2/9型抑制剂，并观察肺损伤和纤维化的改善程度。
6.完成临床前的安全性和有效性评估后，为IPF患者设计临床试验，评估该PPIC基因靶向抑制剂在预防和治疗IPF中的应用潜力。
实施例2：PPIC基因靶向抑制剂的筛选和优化
1.利用生物信息学方法和化学合成技术，设计多个针对PPIC基因的shRNA、siRNA或反义核酸序列。
2.通过体外实验评估这些序列对PPIC基因表达的抑制效率，选择出效果最佳的序列进行进一步的研究。
3.对选定的抑制剂进行序列优化，提高其特异性和稳定性，以减少非特异性基因沉默和潜在的副作用。
4.构建表达或形成所述shRNA、siRNA或反义核酸的构建体，根据所需的治疗效果，调整shRNA、siRNA或反义核酸的表达水平。
5.在肺细胞系和IPF患者衍生的细胞中测试所选抑制剂的生物学效果，观察其对肺损伤和纤维化进程的影响。
6.根据体外实验结果，制备用于动物实验的抑制剂，评估其在动物模型中减轻IPF症状的效能，并通过分子生物学及组织病理学方法评估治疗效果。
这两个实施例都涉及对PPIC基因进行靶向干预，利用RNA干扰技术降低PPIC基因的表达，以达到预防和治疗IPF的目的。实施例1更侧重于抑制剂的实际应用和临床前的开发，而实施例2侧重于通过筛选和优化来发现最有效的抑制剂序列。
本发明实施例提供的PPIC在制备预防和治疗IPF的药物中的应用，PPIC基因在IPF中高表达，通过抑制PPIC基因的表达可以减少肺损伤、成纤维细胞激活和细胞外基质沉积，减轻IPF。
本发明实施例提供PPIC基因及其表达产物在作为IPF诊断标记物中的用途。
本发明实施例提供的PPIC基因作为分子治疗靶点在制备IPF诊断试剂中的应用。
在制备预防和治疗IPF药物时，还可使用与PPIC基因同源性大于80％，且表达相同功能蛋白的基因。
本发明实施例提供应用是PPIC基因靶向抑制剂在制备预防和治疗IPF药物中的应用。
本发明实施例提供抑制剂的靶点序列为：TGGGATGACTGTGGTACATTC。
本发明实施例提供抑制剂为能够抑制PPIC基因表达的shRNA序列或siRNA序列，所述shRNA模版序列包括正义链和反义链，所述正义链和反义链分别为：
正义链：
5’-ACCGTGGGATGACTGTGGTACATTCCTCGAGGAATGTACCACAGT CATCCCATTTTTTG-3’；
反义链：
5’-CTAGCAAAAAATGGGATGACTGTGGTACATTCCTCGAGGAATGTA CCACAGTCATCCCA-3’。
本发明利用RNA干扰技术研制一种PPIC基因靶向抑制剂，该抑制剂可与PPIC基因特异性结合使其沉默，从而抑制肺损伤、成纤维细胞激活和细胞外基质沉积，达到治疗IPF的目的；PPIC基因靶向抑制剂在IPF领域发挥重要作用，为临床治疗IPF提供新的靶向治疗药物。
PPIC基因表达抑制剂或敲除试剂为能够减少PPIC基因转录或蛋白表达量的shRNA、siRNA或反义核酸；或能表达或形成所述shRNA、siRNA或反义核酸的构建体。所述体外构建体为siRNA与转染试剂的混合物溶液；所述体内构建体为包含有该shRNA的AAV载体。
体内抑制剂可包装至AAV2/9型。AAV体内的感染效率极高，不同血清型可以相对特异性的感染不同组织，其中AAV2/9对肺的感染亲和力高；由于AAV的安全性能好和表达时效长的优点，目前已成为最有前景的基因治疗工具。
本发明实施例提供的构建IPF小鼠模型：
1.使用8-10周龄的C57BL/6J品系雄性小鼠，称体重。
2.用1ml的无菌注射器吸取1％戊巴比妥钠溶液(50mg/kg)，经腹腔注射麻醉小鼠。将麻醉好的小鼠以仰卧位固定于操作台上，然后用细线勾住小鼠上齿以固定头部，并使其颈部与腹部在同一水平面上，便于观察气管。
3.颈部消毒后，于颈部中部纵切0.5-1cm左右的开口以暴露气管，用30G胰岛素注射器经气管注射BLM。
4.注射后将小鼠保持垂直位置，并轻轻地旋转数次，以便使BLM在小鼠肺内分布均匀。
5.用5-0尼龙手术缝合线缝合切口。
6.将小鼠放在电热毯上，以维持合适温度，待小鼠麻醉苏醒后，将其放回笼中继续喂养。
7.在小鼠气管内给药后21天，处死小鼠，取肺组织。
8.用4％多聚甲醛固定肺组织后，石蜡包埋及切片，经过H&E染色、Masson染色和PSR染色，于正置显微镜下观察分析。结果显示，与PBS处理的对照组小鼠比较，BLM给药组小鼠肺组织出现大片纤维化区域，肺泡结构破坏，肺泡融合，肺泡间隔增厚，胶原蛋白明显增加，细胞外基质沉积(图1)，说明成功构建IPF小鼠模型。
9.通过qRT-PCR和Westernblot验证IPF小鼠模型的成功建立，每组6只：
(1)、qRT-PCR：使用Trizol试剂提取肺组织的总RNA。使用PrimeScriptRT试剂盒进行逆转录。使用SYBRGreenPCR试剂盒进行定量PCR反应。使用比较CT方法测量基因表达(Fn1、CollagenI、Vimentin)相对于内源参考基因的相对定量。结果显示，与PBS处理的对照组小鼠比较，BLM给药组小鼠肺组织中肺纤维化标志物Fn1、CollagenI、Vimentin显著升高(图2A)，说明成功构建IPF小鼠模型。
(2)、Westernblot：将肺组织样本在含有PMSF的RIPA裂解液中匀浆，然后离心(12000g，15min)获得上清液。总蛋白浓度使用BCA蛋白测定试剂盒测定。配置5％SDS-PAGE浓缩胶、10％SDS-PAGE分离胶，上样总蛋白为20ug；采用80V跑蛋白电泳；转膜采用200mA转2小时；5％的脱脂牛奶封闭90分钟；Vimentin、CollagenI、和内参β-actin作为一抗，抗体4度孵育过夜；第2天采用anti-Rabbit/MouseIgG二抗常温孵育1h，TBST洗涤3遍，每次12分钟。所有膜均使用ECL进行可视化。结果显示，与PBS处理的对照组小鼠比较，BLM给药组小鼠肺组织中肺纤维化标志物Vimentin、CollagenI显著升高(图2B)，说明成功构建IPF小鼠模型。
本发明提供了一种新的诊断方法，利用PPIC基因及其表达产物作为特发性肺纤维化的诊断标记物。
特发性肺纤维化是一种严重的肺部疾病，其主要特点是肺组织的炎症和纤维化。虽然其具体发病机制尚不完全清楚，但研究表明，基因在其发病过程中扮演了重要角色。
本发明通过一系列实验发现，PPIC基因在IPF病例的肺组织中高表达。这种高表达的模式与健康个体的表达模式有显著差异，表明PPIC与IPF的发病过程有关。因此，PPIC基因及其表达产物可以作为IPF的一种新的诊断标记物。
本发明提供的新的诊断方法可以提高IPF的早期诊断率，有助于患者获得更早的干预和治疗。同时，对PPIC基因在IPF中的作用的进一步研究，还为开发新的治疗方法提供线索。
本发明实施例提供的一种PPIC基因及其表达产物作为IPF诊断标记物的用途，包括以下步骤：
1.通过qRT-PCR和Westernblot分析PPIC在IPF中的表达量，每组6只，结果显示，与PBS处理的对照组小鼠比较，BLM给药组小鼠肺组织中PPIC的mRNA和蛋白表达量显著升高(图3)。
2.通过免疫组织化学和免疫组织荧光分析PPIC在IPF中的表达量：
(1)、免疫组织化学：将脱蜡的肺组织切片浸入10mM柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)中高压修复10分钟以暴露抗原。使用免疫组化试剂盒，并用DAB和苏木素染色。使用正置显微镜拍摄图片。结果显示，PPIC蛋白表达量在肺纤维化区域升高(图4A)。
(2)、免疫组织荧光：将脱蜡的肺组织切片浸入10mM柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)中高压修复10分钟以暴露抗原。然后用10％山羊血清封闭组织切片，后在含有0.3％TritonX-100和0.1％Tween-20的PBS稀释的一抗中进行染色。然后与AlexaFluor488偶联的二抗孵育，用DAPI染细胞核，后使用共聚焦显微镜拍摄图片。结果显示PPIC蛋白表达量在肺纤维化区域升高(图4B)。
以上结果说明，PPIC或可作为IPF的一种新的诊断标记物。
本发明实施例提供的针对PPIC基因的靶向抑制剂的制备：
1.pAAV-U6-shRNA(PPIC)-CMV-EGFP-WPRE的制备方法：
pAAV-U6-shRNA(PPIC)-CMV-EGFP-WPRE载体购自和元生物技术(上海)股份有限公司，腺相关病毒包装采用的病毒类型为AAV2/9，在pAAV-U6-shRNA-CMV-EGFP-WPRE-spolyA载体中插入PPIC的shRNA序列(正义链：5’-ACCGT GGGATGACTGTGGTACATTCCTCGAGGAATGTACCACAGTCATCCCATTT TTTG-3’；反义链：5’-CTAGCAAAAAATGGGATGACTGTGGTACATTCCTCGAGGAATGTACCACAGTCATCCCA-3’)，得到目的载体质粒(图5)，然后与pAAV-RC载体质粒、pHelper载体质粒共转染至293T细胞，收集病毒并纯化后得到腺相关病毒pAAV-U6-shRNA(PPIC)-CMV-EGFP-WPRE。
2.pAAV-U6-shRNA(PPIC)-CMV-EGFP-WPRE体内注射：
(1)、选用SPF级8-10周龄C57BL/6J雄性小鼠，经眼眶静脉注射AAV来构建PPIC敲低的动物模型。病毒起效时间为2周，2周后经气管内注射BLM，BLM给药后21天测标准通气指标(Penh)，该值用于小动物整个肺功能的总体筛选，可反映气道反应性。之后处死小鼠取肺组织。
(2)、将新鲜采集的肺组织埋入OCT中并冷冻在-80℃长期保存，然后将冷冻的OCT组织切成10μm的肺组织切片，正置荧光显微镜观察带EGFP标签的AAV靶向入肺组织的情况。结果显示，EGFP在小鼠肺中表达(图6)，提示病毒成功到达肺部发挥作用。
(3)、通过qRT-PCR和Westernblot检测PPIC的mRNA和蛋白表达量，每组6只。结果显示，在注射pAAV-U6-shRNA(PPIC)-CMV-EGFP-WPRE即PPIC基因靶向抑制剂后，PPIC的mRNA和蛋白表达量显著降低(图7)，提示成功制备PPIC基因靶向抑制剂，可针对性抑制PPIC基因的表达。
实施例3：PPIC基因靶向抑制剂在制备预防和治疗IPF的药物中的用途步骤如下：
1.Penh肺功能检测：Penh指标在一定程度上反映小鼠肺功能，结果显示，应用PPIC基因靶向抑制剂后，Penh值显著降低，肺功能改善(图8)，说明PPIC基因靶向抑制剂可减轻IPF。
2.通过给药后记录小鼠死亡时间统计其存活率，发现应用PPIC基因靶向抑制剂后，小鼠的存活率要远远高于对照组小鼠(图9)，说明PPIC基因靶向抑制剂对于IPF所造成的小鼠死亡有一定的缓解作用。
3.通过H&E染色分析小鼠肺组织病理变化。结果显示，应用PPIC基因靶向抑制剂后，小鼠肺纤维化程度明显降低，肺泡结构较完整，仅少数区域有炎细胞的浸润，肺纤维化面积和对照组小鼠相比显著减少(图10)。
4.通过qRT-PCR和Westernblot检测肺纤维化标志物mRNA和蛋白的表达量，每组6只。结果显示，应用PPIC基因靶向抑制剂后，Fn1的mRNA表达量显著降低(图11A)；α-SMA、Fn1、Vimentin的蛋白表达量显著降低(图11B)，提示肺成纤维细胞激活减少、细胞外基质沉积减少，IPF程度减轻。
作为本发明技术效果的验证，获取的体外效果以下进行分析说明。
1.干扰PPIC对小鼠肺成纤维细胞纤维化的影响：
NIH-3T3细胞株(ATCC)在37摄氏度、5％CO2条件下，用含有10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养。构建干扰PPIC的细胞系：构建siRNA，借助jetPRIME转染剂(Polyplus)，通过瞬时转染的方式，构建干扰PPIC的细胞系。利用qRT-PCR和Westernblot检测干扰效率，确定干扰成功。干扰PPIC所用的siRNA靶序列如下：TGGGATGACTGTGGTACATTC。
2.Westernblot检测小鼠NIH-3T3细胞系的纤维化相关蛋白：
NIH-3T3细胞系先经siRNA干扰2天，后用纤维化刺激因子TGF-β1处理1天，提取蛋白。Westernblot结果显示，应用PPIC基因靶向抑制剂后，α-SMA、Fn1、Vimentin的蛋白表达量显著降低，表明体外靶向干预PPIC表达后，小鼠NIH-3T3细胞株的纤维化进展显著减缓。
经过各类实验，还对体内效果进行了验证，该抑制剂可与PPIC基因特异性结合使其沉默，从而减少肺损伤、抑制成纤维细胞激活和细胞外基质沉积，达到治疗IPF的目的；PPIC基因靶向抑制剂在IPF领域发挥重要作用，为临床治疗IPF提供新的靶向治疗药物。
实施例4：PPIC基因的转录组RNA-seq分析
本发明通过转录组RNA-seq技术深入探讨了PPIC基因在IPF中的作用，并对shRNA敲低PPIC后的差异表达基因进行了分析。
分析结果显示，细胞外基质降解相关通路的基因在PPIC敲低后显著下调。这一发现进一步证明了PPIC的敲低能够减少细胞外基质沉积，从而对IPF的发生和发展产生影响。
此外，本发明提供的PPIC基因的敲低通过调控多种途径来减轻IPF的病情。这一结果揭示了PPIC基因在IPF中涉及的新的生物学途径，为发现其他潜在的治疗靶点提供了重要线索。
为了进一步理解PPIC的作用机制和相关通路，通过测序分析寻找了与PPIC相关的通路和蛋白。本发明将为IPF的预防和治疗提供更多的靶点和机制，有利于深入理解该病的发病机制，为未来的研究和治疗方法的开发奠定基础。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.PPIC基因在制备预防和治疗特发性肺纤维化药物中的应用。
2.PPIC基因及其表达产物在作为IPF诊断标记物中的用途。
3.如权利要求1所述的PPIC基因在制备预防和治疗特发性肺纤维化药物中的应用，其特征在于，在制备预防和治疗IPF药物时，还可使用与PPIC基因同源性大于80％，且表达相同功能蛋白的基因。
4.PPIC基因靶向抑制剂在制备预防和治疗IPF药物中的应用。
5.如权利要求4所述的PPIC基因靶向抑制剂在制备预防和治疗特发性肺纤维化药物中的应用，其特征在于，所述抑制剂的靶向序列为：
TGGGATGACTGTGGTACATTC。
6.如权利要求4所述的PPIC基因靶向抑制剂在制备预防和治疗特发性肺纤维化药物中的应用，其特征在于，PPIC抑制剂是减少PPIC基因转录或蛋白表达的化合物小分子或生物大分子。
7.如权利要求4所述的PPIC基因靶向抑制剂在制备预防和治疗特发性肺纤维化药物中的应用，其特征在于，PPIC基因表达抑制剂或敲除试剂为能够减少PPIC基因转录或蛋白表达量的shRNA、siRNA或反义核酸；或能表达或形成所述shRNA、siRNA或反义核酸的构建体。
8.如权利要求7所述的PPIC基因在制备预防和治疗特发性肺纤维化药物中的应用，其特征在于，所述体外构建体为siRNA与转染试剂的混合物溶液，具体地，转染试剂为jetPRIME(Polyplus)；或所述体内构建体为包含有该shRNA的腺相关病毒载体。
9.如权利要求8所述的PPIC基因在制备预防和治疗特发性肺纤维化药物中的应用，其特征在于，AAV包装采用的病毒类型为AAV2/9。
10.一种用于IPF诊断或预后检测的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括检测PPIC基因转录或蛋白表达量的试剂。
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