CN115581769B - 一种用于治疗或者预防个体纤维化疾病的抑制剂、药物组合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种用于治疗或者预防个体纤维化疾病的抑制剂、药物组合物及其应用,属于生物医药技术领域。该用于治疗或者预防个体纤维化疾病的抑制剂,所述抑制剂为影响PLEKHF1基因的表达水平或/和功能的物质。本发明还提出一种药物组合物,包括上述抑制剂及药学上可接受的载体。本发明还提出一种上述抑制剂或者上述药物组合物在制备治疗或者预防个体纤维化疾病药物中的应用。该抑制剂可有效治疗或者预防个体纤维化疾病。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域,具体涉及一种用于治疗或者预防个体纤维化疾病的抑制剂、药物组合物及其应用。
背景技术
含普列克底物蛋白同源域和FYVE域蛋白1(pleckstrin homology and FYVEdomain containing 1,PLEKHF1),又称APPD、LAPF、PHAFIN1或ZFYVE15,是一种溶酶体相关凋亡诱导蛋白(lysosome-associated and apoptosis-inducing protein containing PHand FYVE domains,LAPF),属于新近发现的Phafins蛋白家族。PLEKHF1作为一种广泛表达的促凋亡蛋白,可以特异性地与磷酸化p53相互作用,通过溶酶体-线粒体凋亡途径促进凋诱导。研究发现在骨肉瘤、乳腺癌和卵巢癌等疾病种均存在PLEKHF1的表达异常,但PLEKHF1在纤维化疾病的发病进程中的表达及作用仍不明确。
纤维化定义为器官内成纤维细胞过度增殖,并伴有大量沉积细胞外基质聚集,破坏组织结构,影响脏器功能。在多种疾病,如病毒性肝炎、慢性肾炎、自身免疫性疾病和病毒性肺炎等的病程晚期,器官均会发生纤维化,并最终导致器官衰竭,危害生命健康。常见的纤维化疾病包括肺纤维化、肾纤维化、肝纤维化和皮肤纤维化。大量研究表明,巨噬细胞在白介素4(IL-4)、白介素10(IL-10)、白介素13(IL-13)、转化生长因子beta(TGF-β)和免疫复合物等刺激下激活为替代活化型巨噬细胞(alternatively activated macrophages,M2,Wang Y,et al.,2021 Sci Adv,7:eabb6075)。既往研究发现肺组织中M2的数目与IPF患者的疾病进展密切相关,M2可产生和分泌TGF-β和血小板来源的生长因子(PDGF)等,诱导成纤维细胞分化为肌成纤维细胞。肌成纤维细胞分泌过量的细胞外基质蛋白,包括I型胶原蛋白和纤连蛋白(Fibronectin),导致病理基质沉积和纤维化的发生(Liu P et al.,2020,Respir Res,21;58;Wang Q,et al.,2020,Biomed Pharmacother,131;110715)。靶向减少M2数目或功能均能有效治疗多种诱因所致的肺纤维化模型(Yao Y et al.,2016,Molecular therapy,24:915-925)。尽管目前研究表明巨噬细胞活化在肺纤维化进程中发挥着重要的作用,但是目前仍缺少能有效阻断此行为,进而阻止或逆转肺纤维化进程的药物。
目前,纤维化疾病的治疗手段主要包括药物治疗及器官移植。器官移植作为晚期纤维化疾病患者仅能选择的治疗手段,其应用推广受限于供体获取困难、手术风险高、手术费用昂贵及术后长期排异治疗。而现有药物不能阻断纤维化的病程,其临床治疗效果和安全性均无法满足治疗需求。因此,亟需深入研究纤维化疾病发生机制,寻找新的治疗靶点,充分结合创新的医药发展趋势,开发新型的可有效治疗或者预防纤维化疾病且安全性高的药物。
发明内容
本发明的目的在于克服上述技术不足,提供一种用于治疗或者预防个体纤维化疾病的抑制剂,解决现有技术中如何有效治疗或者预防个体纤维化疾病的技术问题。
为达到上述技术目的,本发明的技术方案提供一种用于治疗或者预防个体纤维化疾病的抑制剂,所述抑制剂为影响PLEKHF1基因的表达水平或/和功能的物质。
进一步地,所述抑制剂为抑制巨噬细胞替代活化,进而减缓纤维化进程的抑制剂。
进一步地,所述抑制剂是以PLEKHF1为靶标的siRNA、shRNA或miRNA中的至少一种。
进一步地,所述抑制剂是以PLEKHF1为靶标的siRNA,所述siRNA的序列为5’-CAGCCAAGAAGUCCUUUG UTT-3’。
此外,本发明还提出一种药物组合物,包括上述抑制剂及药学上可接受的载体。
进一步地,本发明还提出一种上述抑制剂或者上述药物组合物在制备治疗或者预防个体纤维化疾病药物中的应用。
进一步地,个体纤维化疾病药物包括个体肺纤维化疾病药物、个体肾纤维化疾病药物、个体心肌纤维化疾病药物、个体肝纤维化疾病药物或者个体皮肤纤维化疾病药物中的一种或者多种。
进一步地,所述个体肺纤维化药物为个体特发性肺纤维化疾病药物。
进一步地,所述个体为哺乳动物。
与现有技术相比,本发明的有益效果包括:本发明发现PLEKHF1抑制剂通过抑制M2型巨噬细胞极化,进而能够减缓纤维化进程,为纤维化疾病提供了一种新的靶向PLEKHF1的治疗策略,该抑制剂可有效治疗或者预防个体纤维化疾病。
附图说明
图1是本发明实施例1气道注射包载PLEKHF1 siRNA脂质体小鼠和气道注射包载Scr siRNA脂质体小鼠的肺组织的H&E、天狼星红、马松染色结果图。
图2是本发明实施例1气道注射包载PLEKHF1 siRNA脂质体小鼠和气道注射包载Scr siRNA脂质体小鼠的纤维化的阿什克罗夫特得分。
图3为本发明实施例2经博来霉素诱导纤维化后,气道注射包载PLEKHF1 siRNA脂质体小鼠和气道注射包载Scr siRNA脂质体小鼠中纤连蛋白(Fibronectin)、I型胶原(Colla)、TGF-β和PLEKHF1的western blot结果。
图4为本发明实施例2经博来霉素诱导纤维化后,气道注射包载PLEKHF1 siRNA脂质体小鼠和气道注射包载Scr siRNA脂质体小鼠中M2型巨噬细胞的标志分子精氨酸酶1(Arg1)、CD206的western blot结果。
图5为本发明实施例3经博来霉素诱导纤维化后,气道注射包载PLEKHF1 siRNA脂质体小鼠和气道注射包载Scr siRNA脂质体小鼠中羟脯氨酸的定量结果。
图6为本发明实施例4小鼠原代骨髓巨噬细胞转染PLEKHF1 siRNA敲减PLEKHF1,M2型巨噬细胞极化情况,与Scr siRNA转染原代骨髓巨噬细胞组相比,转染PLEKHF1 siRNA后Arg1、TGF-β和CD206水平显著下降。其中,*p<0.05;**p<0.01;***p<0.001。
图7为本发明实施例5小鼠原代骨髓巨噬细胞转染PLEKHF1 siRNA敲减PLEKHF1,PI3K/AKT信号通路的活化情况。
具体实施方式
目前,纤维化疾病的治疗手段主要包括药物治疗及器官移植。器官移植作为晚期纤维化疾病患者仅能选择的治疗手段,其应用推广受限于供体获取困难、手术风险高、手术费用昂贵及术后长期排异治疗。而现有药物不能阻断纤维化的病程,其临床治疗效果和安全性均无法满足治疗需求。因此,亟需深入研究纤维化疾病发生机制,寻找新的治疗靶点,充分结合创新的医药发展趋势,开发新型的可有效治疗纤维化疾病且安全性高的药物。
术语的定义和使用
纤维化疾病:在本发明中,纤维化疾病包括肺纤维化、肾纤维化、心肌纤维化、肝纤维化和皮肤纤维化。其中,肝纤维化是指由各种致病因子所致肝脏内结缔组织异常增生,肝脏内弥漫性细胞外基质过度沉淀的病理过程。多种因素均可引起肝纤维化,如病毒感染、炎症反应、氧化应激和酗酒等。肝纤维化的病理特点为汇管区和肝小叶内有大量纤维组织增生和沉积,但尚未形成小叶内间隔,肝硬化则有假小叶形成,中心静脉区和汇管区出现间隔,肝的正常结构遭到破坏,肝纤维化进一步发展即为肝硬化。我国的慢性肝病以病毒性肝炎为主,慢性病毒性肝炎引起的肝组织纤维化与肝内炎症、坏死、病毒复制等有关,该病程在早期是可逆的。因此,将抗病毒、调节机体免疫功能等治疗方案有机结合,可在一定程度上控制肝纤维化进程。
肺纤维化主要病理特点包括肺组织间充质细胞增殖、细胞外基质增生沉积及肺实质的重构等。目前主要采用抗炎、抗氧化、抗成纤维细胞增殖和胶原沉积及肺移植等措施治疗肺纤维化。
肾纤维化表现为大量细胞外基质和结缔组织在肾脏聚集,导致肾脏结构改变和功能受损的病理过程。几乎所有肾疾病进展到终末期均会伴有肾纤维化的发生,并最终导致肾脏衰竭。肾纤维化过程涉及炎症反应,肾小管上皮细胞的凋亡以及多种可调控纤维化的细胞因子失衡等,故可通过抗炎症、抗凋亡和针对纤维化细胞因子治疗等途径防治肾纤维化。
心肌纤维化以成纤维细胞的增殖和细胞外基质在心肌正常组织结构中沉积为主要特征。目前认为主要由高血压性心脏病、缺血性心肌病、扩张性心肌病、病毒性心肌炎、糖尿病心肌病等所致。心肌纤维化引起心脏硬度增加,顺应性降低,影响心脏的正常舒张和收缩功能,是心血管疾病预后的关键性因素。
皮肤纤维化形成瘢痕组织。瘢痕组织是肉芽组织经改建成熟形成的老化阶段的纤维结缔组织。创伤等情况下,成纤维细胞分裂、增殖,向受损部位迁移,产生细胞外基质,形成瘢痕组织,修复创伤。
PLEKHF1抑制剂:在本发明中,PLEKHF1抑制剂是指:1)所述抑制剂为影响PLEKHF1基因的表达水平或/功能的物质,其可以包括能够抑制PLEKHF1表达的siRNA、shRNA和miRNA,含有上述siRNA、shRNA和/或miRNA的载体以及含有上述载体的宿主细胞,但本发明不限于此;
2)使PLEKHF1活性降低或失活的物质;
3)促使PLEKHF1降解的物质,诸如引起降解的PLEKHF1抗体。
个体:在本发明中,术语“个体”指哺乳动物,包括但不限于大鼠、小鼠、非人灵长类、人、犬、猫、马、牛、绵羊、猪、山羊。优选为人或小鼠。
治疗:
本发明所述“治疗”是指降低纤维化的程度,或者治愈纤维化使之正常化,或者减缓纤维化的进程。
本发明通过以下实施例证实了通过抑制巨噬细胞中PLEKHF1表达,可显著降低M2型巨噬细胞的极化。其中,M2型巨噬细胞的极化在包括肝纤维化、肺纤维化、肾纤维化和皮肤纤维化等纤维化疾病的发病中发挥了极其重要的作用。
本发明还公开了一种包括PLEKHF1抑制剂的药物组合物,它包括上述的PLEKHF1抑制剂及药学上可接受的载体,该药物组合物可为注射型、胶囊、片剂、喷鼻剂或气雾剂等,以个体可接受的方式,如注射、口服、喷鼻等各种方式给与受试个体。
详细地,本具体实施方式提供了一种用于治疗或者预防个体纤维化疾病的抑制剂,所述抑制剂为影响PLEKHF1基因的表达水平或/和功能的物质。
进一步地,所述抑制剂为抑制巨噬细胞替代活化,进而减缓纤维化进程的抑制剂。
进一步地,所述抑制剂为抑制巨噬细胞替代活化,进而减缓纤维化进程的抑制剂。
进一步地,所述抑制剂是以PLEKHF1为靶标的siRNA、shRNA或miRNA中的至少一种。
进一步地,本具体实施方式提出一种抑制剂,所述抑制剂是以PLEKHF1为靶标的siRNA,所述siRNA的序列为5’-CAGCCAAGAAGUCCUUUG UTT-3’。
本具体实施方式还提出一种药物组合物,包括上述用于治疗或者预防个体纤维化疾病的抑制剂及药学上可接受的载体。
此外,本具体实施方式还提出一种上述抑制剂或者上述药物组合物在治疗或者预防个体纤维化疾病药物中的应用。
进一步地,所述个体纤维化疾病药物包括个体肺纤维化疾病药物、个体肾纤维化疾病药物、个体心肌纤维化疾病药物、个体肝纤维化疾病药物或者个体皮肤纤维化疾病药物中的一种或者多种。
进一步地,所述个体肺纤维化药物为个体特发性肺纤维化疾病药物。
进一步地,所述个体为哺乳动物。
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合附图及实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
实施例1气道注射包载PLEKHF1 siRNA脂质体对肺部纤维化程度的影响;
实验动物及材料:
1.实验动物:
来源:繁育于同济医学院动物房的野生型小鼠(WT,C57BL/6);
育龄:8~10周龄;
2.实验方法:
采用1%的戊巴比妥钠(70mg/kg)腹腔注射麻醉野生型小鼠,随后通过气道注射终浓度1.5mg/kg的博来霉素,其中,博来霉素购自MCE,且使用时溶于PBS中,使用气道注射相同体积PBS的小鼠作对照。施用博来霉素后第14天及17天,再次分别气道注射包载PLEKHF1siRNA脂质体和包载Scr siRNA脂质体,21天后处死小鼠,分析各小鼠肺部纤维化程度。
由两位病理学家使用阿什克罗夫特评分系统以盲评的方式对每个连续区域的间质纤维化严重程度进行独立评估。
需要说明的是,本实施例中PLEKHF1 siRNA的序列为:5’-CAGCCAAGAAGUCCUUUGUTT-3’。
3.实验结果:
具体的,各组小鼠的肺组织的H&E、天狼星红、马松三色法染色结果如图1所示,与PBS组和空载脂质体组相比,气道注射博来霉素后肺组织表现出显著的肺损伤和纤维化;与博来霉素组相比,博来霉素+空载脂质体组及博来霉素+包载Scr siRNA脂质体组在肺损伤和纤维化无显著差异;与博来霉素+包载Scr siRNA脂质体组相比,博来霉素+PLEKHF1siRNA脂质体组的肺损伤和纤维化显著减轻;结合图1可知,经博来霉素刺激诱导后,相较于气道注射包载Scr siRNA脂质体的小鼠,气道注射包载PLEKHF1 siRNA脂质体的小鼠中肺损伤和纤维化明显减轻。
阿什克罗夫特评分结果如图2所示,与PBS组和空载脂质体组相比,气道注射博来霉素后阿什克罗夫特评分显著增加;与博来霉素组相比,博来霉素+空载脂质体组及博来霉素+包载Scr siRNA脂质体组在阿什克罗夫特评分无显著差异;与博来霉素+包载Scr siRNA脂质体组相比,博来霉素+PLEKHF1 siRNA脂质体组的阿什克罗夫特评分显著减少,其中,**p<0.01;由图2可知,气道注射包载PLEKHF1 siRNA脂质体的小鼠的阿什克罗夫得分较气道包载Scr siRNA脂质体的小鼠更低,说明其肺纤维化的程度显著减轻。
综上所述,气道注射包载PLEKHF1 siRNA脂质体,有利于预防或治疗小鼠的肺部纤维化。
实施例2气道注射包载PLEKHF1 siRNA脂质体对纤连蛋白、I型胶原、TGF-β、PLEKHF1、精氨酸酶1和CD206的蛋白的影响;
为进一步评价各小鼠经博来霉素注射后肺部的纤维化程度,本发明分别通过western blot及RT-PCR方式检测了各小鼠肺组织中纤连蛋白、I型胶原、TGF-β、PLEKHF1、精氨酸酶1和CD206的蛋白。
具体是收集实施例1实验后小鼠肺组织,通过RIPA裂解液提取组织中的蛋白,并通过Western blot检测纤维化标志分子蛋白,如纤连蛋白、I型胶原和TGF-β、PLEKHF1的蛋白表达量(结果如图3所示),以及M2型巨噬细胞标志分子蛋白如精氨酸酶1和CD206的蛋白表达量(结果如图4所示)。其中,所述Western blot为参考Wang et al.,2021;Theranostics14:7110-7125。
结合图3可知,与PBS组和空载脂质体组相比,气道注射博来霉素后Fibronectin、Col1a、TGF-β和PLEKHF1表达显著增加:与博来霉素组相比,博来霉素+空载脂质体组及博来霉素+包载Scr siRNA脂质体组上述指标无显著差异;与博来霉素+包载Scr siRNA脂质体组相比,博来霉素+PLEKHF1 siRNA脂质体组的Fibronectin、Col1a、TGF-β和PLEKHF1表达显著减少;其中,**p<0.01;***p<0.001;相较于气道注射包载Scr siRNA脂质体的小鼠,气道注射包载PLEKHF1 siRNA脂质体的小鼠的纤连蛋白、I型胶原和TGF-β的蛋白表达水平均降低,再次验证了气道注射包载PLEKHF1 siRNA脂质体的小鼠肺部纤维化得到较大程度的减轻。
结合图4可知,与PBS组和空载脂质体组相比,气道注射博来霉素后Arg1和CD206表达显著增加;与博来霉素组相比,博来霉素+空载脂质体组及博来霉素+包载Scr siRNA脂质体组上述指标无显著差异;与博来霉素+包载Scr siRNA脂质体组相比,博来霉素+PLEKHF1siRNA脂质体组的Arg1和CD206表达显著减少。其中,*p<0.05;**p<0.01。相较于气道注射包载Scr siRNA脂质体的小鼠,气道注射包载PLEKHF1 siRNA脂质体的小鼠的精氨酸酶1和CD206的蛋白表达水平均降低,表明PLEKHF1 siRNA可抑制巨噬细胞的替代活化。
实施例3气道注射PLEKHF1 siRNA对羟脯氨酸水平的影响;
1.实验材料:
羟脯胺酸检测试剂盒:南京建成生物科技有限公司。
2.实验方法:
采用羟脯胺酸检测试剂盒对实施例1中各组小鼠肺组织中的羟脯氨酸的表达水平进行测定。
测定结果如图5所示,结合图5可知,与PBS组和空载脂质体组相比,气道注射博来霉素后羟脯氨酸水平显著增加;与博来霉素组相比,博来霉素+空载脂质体组及博来霉素+包载Scr siRNA脂质体组羟脯氨酸水平无显著差异;与博来霉素+包载Scr siRNA脂质体组相比,博来霉素+PLEKHF1 siRNA脂质体组的羟脯氨酸水平显著减少,其中,**p<0.01;与上述实施例2的表达结果一致,相较于气道注射包载PLEKHF1 siRNA脂质体的小鼠,气道注射包载Scr siRNA脂质体的小鼠经博来霉素诱导后,其纤维化程度更为严重,肺组织中羟脯氨酸水平显著上调。
实施例4敲减PLEKHF1对M2型巨噬细胞极化的影响
越来越多的证据表明,M2型巨噬细胞极化这一过程,对于维持肺纤维化是必须的。因此我们进一步检测了PLEKHF1对于经IL-4和IL-13刺激后M2型巨噬细胞极化的影响。
如图6所示,western blot及RT-PCR结果表明,相较于转染Scr siRNA的细胞,采用IL-4(10ng/mL)和IL-13(10ng/mL)刺激后转染PLEKHF1 siRNA的小鼠原代骨髓巨噬细胞的M2型表型蛋白表达显著降低,过表达PLEKHF1后,小鼠原代骨髓巨噬细胞的M2型表型蛋白表达显著增加。
实施例5敲减PLEKHF1对PI3K/AKT信号通路的影响
鉴于PI3K/AKT信号通路在肺部纤维化病程中的作用,接下来检测了小鼠原代骨髓巨噬细胞中敲减PLEKHF1后p-P85(PI3K的调控亚基)和p-AKT的表达变化情况。如图7所示,随着IL4/13的刺激p-P85、p-AKTT308、p-AKTS473水平逐渐升高,与Scr siRNA转染原代骨髓巨噬细胞组相比,转染PLEKHF1 siRNA后p-P85、p-AKTT308、p-AKTS473水平显著下降;其中,**p<0.01;敲减PLEKHF1后,p-P85和p-AKT表达水平显著下调,过表达PLEKHF1后,p-P85和p-AKT表达水平显著升高。
综上所述,上述数据表明抑制PLEKHF1可抑制M2型巨噬细胞极化,进而减缓肺纤维化进程。而M2型巨噬细胞极化在肾纤维化,心肌纤维化、肝纤维化和皮肤纤维化中亦发挥重要的作用,故抑制PLEKHF1可减缓上述纤维化的发病,为其治疗提供新的靶点。
以上所述本发明的具体实施方式,并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所做出的各种其他相应的改变与变形,均应包含在本发明权利要求的保护范围内。
Claims (3)
1.PLEKHF1抑制剂在制备治疗或者预防个体纤维化疾病药物中的应用,其中,个体纤维化疾病药物为个体肺纤维化疾病药物;
所述抑制剂是以PLEKHF1为靶标的siRNA,所述siRNA的序列为5’-CAGCCAAGAAGUCCUUUGUTT-3’;
所述抑制剂为抑制巨噬细胞替代活化,进而减缓纤维化进程的抑制剂。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述个体肺纤维化药物为个体特发性肺纤维化疾病药物。
3.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述个体为哺乳动物。
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Differences in the Degree of Cerulein-Induced Chronic Pancreatitis in C57BL/6 Mouse Substrains Lead to New Insights in Identification of Potential Risk Factors in the Development of Chronic Pancreatitis;Barbara Ulmasov等;《The American Journal of Pathology》;第183卷(第3期);第692-708页 * |
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PB01 | Publication | ||
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