KR20170059998A - 항인플루엔자 바이러스제, 및 항인플루엔자 바이러스제의 스크리닝 방법 - Google Patents

항인플루엔자 바이러스제, 및 항인플루엔자 바이러스제의 스크리닝 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은, 인간을 비롯한 숙주 세포의 생체 분자를 표적으로 한 항인플루엔자 바이러스제, 및 당해 항인플루엔자 바이러스제의 후보 분자를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 즉, 본 발명은, 숙주 세포 내에 있어서의 인플루엔자 바이러스의 vRNA 또는 NP 단백질의 인플루엔자 바이러스형 입자에의 포착에 대한 억제 작용을 갖는 단백질을 코드하는 유전자의 발현 또는 기능을 억제시키는 작용을 가지며, 상기 유전자가, JAK1 유전자 등으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종 이상인 것을 특징으로 하는, 항인플루엔자 바이러스제이다.

Description

항인플루엔자 바이러스제, 및 항인플루엔자 바이러스제의 스크리닝 방법 {ANTI-INFLUENZA VIRUS AGENT, AND SCREENING METHOD FOR ANTI-INFLUENZA VIRUS AGENT}
본 발명은, 인간을 비롯한 숙주 세포의 생체 분자를 표적으로 한 항인플루엔자 바이러스제, 및 당해 항인플루엔자 바이러스제의 후보 분자를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
본원은, 2014 년 9 월 22 일에, 일본에 출원된 일본 특허출원 2014-192752호에 기초하여 우선권을 주장하고, 그 내용을 여기에 원용한다.
인플루엔자 바이러스는, 매년 유행병을 야기하고, 때로는 몇 백만명의 희생자를 내는 판데믹을 발생시킨다. 이 때문에, 보다 유효한 항인플루엔자 바이러스제의 개발이 요구되고 있다. 항인플루엔자 바이러스제의 표적 분자로서는, 바이러스 단백질보다, 바이러스의 감염이나 복제에 기여하는 숙주 세포의 생체 분자가 바람직하다. 숙주 세포의 생체 분자가, 바이러스 단백에 비해 약제에 의한 선택압에 따른 변이가 생기기 어렵기 때문이다.
최근, 6 개의 게놈 와이드 스크리닝에 의해, 인플루엔자 바이러스의 라이프 사이클에 어떠한 역할을 이루고 있다고 생각되는 합계 1449 개의 인간 유전자 (110 개의 파리 (Drosophila) 유전자의 인간 오르토로그를 포함한다.) 가 동정되었다 (비특허문헌 1 ∼ 6 참조.). 각 게놈 와이드 스크리닝의 결과는, 각각 부분적으로 밖에 일치하지 않지만, 이것은, 실험 조건이 상이하기 때문이라고 추찰된다.
Brass, et al., Cell, 2009, vol. 139, p. 1243 ∼ 1254. Hao, et al., Nature, 2008, vol. 454, p. 890 ∼ 893. Karlas, et al., Nature, 2010, vol. 463, p. 818 ∼ 822. Konig, et al., Nature, 2010, vol. 463, p. 813 ∼ 817. Shapira, et al., Cell, 2009, vol. 139, p. 1255 ∼ 1267. Sui, et al., Virology, 2009, vol. 387, p. 473 ∼ 481. Neumann, et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1999, vol. 96, p. 9345 ∼ 9350. Tobita, et al., Medical microbiology and immunology, 1975, vol. 162, p. 9 ∼ 14. Ozawa et al., Journal of General Virology, 2011, vol. 92, p. 2879 ∼ 2888. Octaviani et al., Journal of Virology, 2010, vol. 84, p. 10918 ∼ 10922. Kawakami et al., Journal of Virological Methods, 2011, vol. 173, p. 1 ∼ 6. Wishart et al., Nucleic Acids Research, 2006, vol. 34, p. D668 ∼ 672. Patterson et al., Journal of General Virology, 1979, vol. 43, p. 223 ∼ 229. Widjaja et al., Journal of Virology, 2010, vol. 84, p. 9625 ∼ 9631. Noda et al., Nature, 2006, vol. 439, p. 490 ∼ 492.
몇 개의 게놈 와이드 스크리닝에 의해, 인플루엔자 바이러스의 복제 등과 관계되는 숙주 세포의 단백질이 특정되고 있다. 그러나, 이들 단백질이 인플루엔자 감염증에 어떻게 영향을 미치는지에 대해서는 여전히 밝혀지지 않고, 새로운 항인플루엔자 바이러스제의 후보 분자가 될 수 있는지의 여부는 불분명하다.
본 발명은, 인간을 비롯한 숙주 세포 내의 생체 분자로서, 인플루엔자 바이러스의 라이프 사이클에 관여하는 단백질을 표적으로 한 항인플루엔자 바이러스제, 및 새로운 항인플루엔자 바이러스제의 후보 분자의 스크리닝 방법을 제공하는 것을 주된 목적으로 한다.
본 발명자들은, 예의 연구한 결과, 인간 배 신장 유래의 HEK293 세포의 세포 용해액을 사용한 면역 침강법에 의해, 인플루엔자 바이러스 단백질과 상호 작용을 갖는 1292 개의 인간 단백질을 특정하고, 이어서, RNA 간섭을 이용하여, 이들 인간 단백질 중에서, 발현량을 억제했을 경우에 숙주 세포의 증식성을 크게 저해하는 일 없이, 인플루엔자 바이러스의 증식이 현저하게 억제되는 단백질을 특정함으로써, 본 발명을 완성시켰다.
즉, 본 발명에 관련된 항인플루엔자 바이러스제, 및 항인플루엔자 바이러스제의 스크리닝 방법은, 하기［1］∼［10］이다.
［1］숙주 세포 내에 있어서의 인플루엔자 바이러스의 vRNA 또는 NP 단백질의 인플루엔자 바이러스형 입자에 대한 포착에 관여하는 단백질을 코드하는 유전자의 발현을 억제시키는 작용, 또는 상기 단백질의 기능을 억제시키는 작용을 가지며,
상기 유전자가, JAK1 유전자, CHERP 유전자, DDX21 유전자, DNAJC11 유전자, EEF1A2 유전자, HNRNPK 유전자, ITM2B 유전자, MRCL3 유전자, MYH10 유전자, NDUFS8 유전자, PSMD13 유전자, RPL26 유전자, SDF2L1 유전자, SDF4 유전자, SFRS2B 유전자, SNRPC 유전자, SQSTM1 유전자, TAF15 유전자, TOMM40 유전자, TRM2B 유전자, USP9X 유전자, BASP1 유전자, THOC2 유전자, PPP6C 유전자, TESC 유전자, 및 PCDHB12 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종 이상인 것을 특징으로 하는, 항인플루엔자 바이러스제.
［2］상기 유전자가 JAK1 유전자 또는 USP9X 유전자인, 상기［1］의 항인플루엔자 바이러스제.
［3］Ruxolitinib, Tofacitinib, Tofacitinib (CP-690550) Citrate, Tyrphostin B42 (AG-490), Baricitinib (LY3009104, INCB028050), AT9283, Momelotinib, CEP33779, NVP-BSK805, ZM39923, Filgotinib, JANEX-1, NVP-BSK805, SB1317, 및 WP1130 으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종 이상인, 상기［1］의 항인플루엔자 바이러스제.
［4］숙주 세포 내에 있어서의 인플루엔자 바이러스의 복제 또는 전사에 관여하는 단백질을 코드하는 유전자의 발현을 억제시키는 작용, 또는 상기 단백질의 기능을 억제시키는 작용을 가지며,
상기 유전자가, CCDC56 유전자, CLTC 유전자, CYC1 유전자, NIBP 유전자, ZC3H15 유전자, C14orf173 유전자, ANP32B 유전자, BAG3 유전자, BRD8 유전자, CCDC135 유전자, DDX55 유전자, DPM3 유전자, EEF2 유전자, IGF2BP2 유전자, KRT14 유전자, 및 S100A4 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종 이상인 것을 특징으로 하는, 항인플루엔자 바이러스제.
［5］숙주 세포 내에 있어서의 인플루엔자 바이러스형 입자의 형성에 관여하는 단백질을 코드하는 유전자의 발현을 억제시키는 작용, 또는 상기 단백질의 기능을 억제시키는 작용을 가지며,
상기 유전자가, GBF1 유전자, ASCC3L1 유전자, BRD8 유전자, C19orf43 유전자, DDX55 유전자, DKFZp564K142 유전자, DPM3 유전자, EEF2 유전자, FAM73B 유전자, FLJ20303 유전자, NCLN 유전자, C14orf173 유전자, LRPPRC 유전자, 및 RCN1 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종 이상인 것을 특징으로 하는, 항인플루엔자 바이러스제.
［6］상기 유전자가 GBF1 유전자인, 상기［5］의 항인플루엔자 바이러스제.
［7］Golgicide A 인, 상기［5］의 항인플루엔자 바이러스제.
［8］항인플루엔자 바이러스제의 후보 화합물을 스크리닝하는 방법으로서, JAK1 유전자, CHERP 유전자, DDX21 유전자, DNAJC11 유전자, EEF1A2 유전자, HNRNPK 유전자, ITM2B 유전자, MRCL3 유전자, MYH10 유전자, NDUFS8 유전자, PSMD13 유전자, RPL26 유전자, SDF2L1 유전자, SDF4 유전자, SFRS2B 유전자, SNRPC 유전자, SQSTM1 유전자, TAF15 유전자, TOMM40 유전자, TRM2B 유전자, USP9X 유전자, BASP1 유전자, THOC2 유전자, PPP6C 유전자, TESC 유전자, PCDHB12 유전자, CCDC56 유전자, CLTC 유전자, CYC1 유전자, NIBP 유전자, ZC3H15 유전자, C14orf173 유전자, ANP32B 유전자, BAG3 유전자, BRD8 유전자, CCDC135 유전자, DDX55 유전자, DPM3 유전자, EEF2 유전자, IGF2BP2 유전자, KRT14 유전자, S100A4 유전자, GBF1 유전자, ASCC3L1 유전자, C19orf43 유전자, DKFZp564K142 유전자, FAM73B 유전자, FLJ20303 유전자, NCLN 유전자, LRPPRC 유전자, 및 RCN1 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종 이상의 유전자의 발현 또는 상기 유전자가 코드하는 단백질의 기능에 대한 억제 또는 저해능이 있는 화합물을, 항인플루엔자 바이러스제의 후보 화합물로서 스크리닝하는 것을 특징으로 하는, 항인플루엔자 바이러스제의 스크리닝 방법.
［9］세포에, 항인플루엔자 바이러스제의 후보 화합물인지의 여부를 평가하는 대상의 화합물을 도입하는 공정과,
상기 화합물을 도입한 세포 중에 있어서의 상기 유전자의 발현량을 측정하는 공정과,
상기 유전자의 발현량이, 상기 화합물이 도입되기 전의 세포보다 유의하게 저감되었을 경우에, 당해 화합물을 항인플루엔자 바이러스제의 후보 화합물로서 선발하는 공정
을 갖는, 상기［8］의 항인플루엔자 바이러스제의 스크리닝 방법.
［10］상기 유전자가 코드하는 단백질이 효소이며,
상기 유전자가 코드하는 단백질의 효소 활성을, 항인플루엔자 바이러스제의 후보 화합물인지의 여부를 평가하는 대상의 화합물의 존재하에서 측정하는 공정과,
상기 화합물의 존재하에 있어서의 상기 단백질의 효소 활성이, 상기 화합물의 비존재하보다 저하된 경우에, 당해 화합물을 항인플루엔자 바이러스제의 후보 화합물로서 선발하는 공정
을 갖는, 상기［8］의 항인플루엔자 바이러스제의 스크리닝 방법.
본 발명에 관련된 항인플루엔자 바이러스제는, 인플루엔자 바이러스를 구성하는 물질이 아니고, 숙주 세포의 단백질을 표적으로 하고 있기 때문에, 약제에 의한 선택압에 따른 변이가 생기기 어렵다는 이점이 있다.
또, 본 발명에 관련된 항인플루엔자 바이러스제의 스크리닝 방법은, 인플루엔자 바이러스의 감염이나 복제에 관여하는 숙주 세포의 단백질을 표적으로 한 항인플루엔자 바이러스제의 후보 분자를 스크리닝할 수 있기 때문에, 새로운 항인플루엔자 바이러스제의 설계 및 제조에 바람직하다.
도 1 은, 실시예 2 에 있어서, Golgicide A 로 처리한 세포의 바이러스 역가 (log10(PFU/㎖)) 와 세포 생존률 (％) 의 측정 결과를 나타낸 도면이다.
도 2 는, 실시예 2 에 있어서, Ruxolitinib 로 처리한 세포의 바이러스 역가 (log10(PFU/㎖)) 와 세포 생존률 (％) 의 측정 결과를 나타낸 도면이다.
도 3 은, 실시예 3 에 있어서, 컨트롤 siRNA 를 도입한 세포 (상단) 와, JAK1 유전자의 siRNA 를 도입한 세포 (하단) 의 전자 현미경 사진이다.
＜항인플루엔자 바이러스제＞
본 발명에 관련된 항인플루엔자 바이러스제는, 인플루엔자 바이러스 단백질과 상호 작용하는 숙주 세포 단백질로서, 숙주 세포 내에 있어서 발현이 억제되면, 숙주 세포의 증식성을 과도하게 저해하는 일 없이, 인플루엔자 바이러스의 복제가 억제되는 단백질을 코드하는 유전자 (이하, 「항 Flu 유전자」 라고 하는 경우가 있다.) 의 발현을 억제시키는 작용, 또는 상기 단백질의 기능을 억제시키는 작용을 갖는다. 항 Flu 유전자로서는, 구체적으로는, JAK1 유전자, CHERP 유전자, DDX21 유전자, DNAJC11 유전자, EEF1A2 유전자, HNRNPK 유전자, ITM2B 유전자, MRCL3 유전자, MYH10 유전자, NDUFS8 유전자, PSMD13 유전자, RPL26 유전자, SDF2L1 유전자, SDF4 유전자, SFRS2B 유전자, SNRPC 유전자, SQSTM1 유전자, TAF15 유전자, TOMM40 유전자, TRM2B 유전자, USP9X 유전자, BASP1 유전자, THOC2 유전자, PPP6C 유전자, TESC 유전자, PCDHB12 유전자, CCDC56 유전자, CLTC 유전자, CYC1 유전자, NIBP 유전자, ZC3H15 유전자, C14orf173 유전자, ANP32B 유전자, BAG3 유전자, BRD8 유전자, CCDC135 유전자, DDX55 유전자, DPM3 유전자, EEF2 유전자, IGF2BP2 유전자, KRT14 유전자, S100A4 유전자, ASCC3L1 유전자, C19orf43 유전자, DKFZp564K142 유전자, FAM73B 유전자, FLJ20303 유전자, GBF1 유전자, NCLN 유전자, LRPPRC 유전자, 또는 RCN1 유전자를 들 수 있다. 후기 실시예에 나타내는 바와 같이, 이들 항 Flu 유전자가 코드하는 단백질은, 11 종의 인플루엔자 바이러스 단백질 (PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M1, M2, NS1, NS2, 및 PB1-F2) 과 직접적 또는 간접적으로 결합하는 단백질이며, 양자의 상호 작용이 인플루엔자 바이러스의 라이프 사이클에 중요한 역할을 달성한다.
본 발명에 관련된 항 Flu 유전자 중, JAK1 유전자, CHERP 유전자, DDX21 유전자, DNAJC11 유전자, EEF1A2 유전자, HNRNPK 유전자, ITM2B 유전자, MRCL3 유전자, MYH10 유전자, NDUFS8 유전자, PSMD13 유전자, RPL26 유전자, SDF2L1 유전자, SDF4 유전자, SFRS2B 유전자, SNRPC 유전자, SQSTM1 유전자, TAF15 유전자, TOMM40 유전자, TRM2B 유전자, USP9X 유전자, BASP1 유전자, THOC2 유전자, PPP6C 유전자, TESC 유전자, 및 PCDHB12 유전자는, 숙주 세포 내에 있어서의 인플루엔자 바이러스의 vRNA 또는 NP 단백질의 인플루엔자 바이러스형 입자에 대한 포착에 관여하는 단백질을 코드하는 유전자이다. 이 때문에, 이들 유전자의 발현을 억제시키는 작용, 또는 이들 유전자가 코드하는 단백질의 기능을 억제시키는 작용을 갖는 물질을 숙주 세포에 투여함으로써, 숙주 세포 내에 있어서 vRNA 또는 NP 단백질의 인플루엔자 바이러스형 입자에 대한 포착이 억제되는 결과, 항인플루엔자 바이러스 효과 (인플루엔자 바이러스의 복제 저해 효과) 가 발휘된다.
본 발명에 관련된 항 Flu 유전자 중, CCDC56 유전자, CLTC 유전자, CYC1 유전자, NIBP 유전자, ZC3H15 유전자, C14orf173 유전자, ANP32B 유전자, BAG3 유전자, BRD8 유전자, CCDC135 유전자, DDX55 유전자, DPM3 유전자, EEF2 유전자, IGF2BP2 유전자, KRT14 유전자, 및 S100A4 유전자는, 숙주 세포 내에 있어서의 인플루엔자 바이러스의 복제 또는 전사에 관여하는 단백질을 코드한다. 이 때문에, 이들 유전자의 발현을 억제시키는 작용, 또는 이들 유전자가 코드하는 단백질의 기능을 억제시키는 작용을 갖는 물질을 숙주 세포에 투여함으로써, 숙주 세포 내에 있어서 인플루엔자 바이러스의 복제 또는 전사가 억제되는 결과, 항인플루엔자 바이러스 효과가 발휘된다.
본 발명에 관련된 항 Flu 유전자 중, ASCC3L1 유전자, BRD8 유전자, C19orf43 유전자, DDX55 유전자, DKFZp564K142 유전자, DPM3 유전자, EEF2 유전자, FAM73B 유전자, FLJ20303 유전자, GBF1 유전자, NCLN 유전자, C14orf173 유전자, LRPPRC 유전자, 및 RCN1 유전자는, 숙주 세포 내에 있어서의 인플루엔자 바이러스형 입자의 형성에 관여하는 단백질을 코드한다. 이 때문에, 이들 유전자의 발현을 억제시키는 작용, 또는 이들 유전자가 코드하는 단백질의 기능을 억제시키는 작용을 갖는 물질을 숙주 세포에 투여함으로써, 숙주 세포 내에 있어서 인플루엔자 바이러스형 입자의 형성이 억제되는 결과, 항인플루엔자 바이러스 효과가 발휘된다.
본 발명에 관련된 항인플루엔자 바이러스제로서는, 본 발명에 관련된 항 Flu 유전자의 발현을 억제시키는 작용을 갖는 물질을 유효 성분으로 하는 것을 들 수 있다. 항 Flu 유전자의 발현을 억제시키는 작용을 갖는 물질로서는, 예를 들어, 항 Flu 유전자의 cDNA 의 부분 영역 (RNAi (RNA 간섭) 표적 영역) 의 센스 사슬과 안티센스 사슬로 이루어지는 2 본쇄 구조를 갖는 siRNA (small interfering RNA), shRNA (short hairpin RNA) 또는 miRNA (micro RNA) 를 들 수 있다. 또, 숙주 세포 내에 있어서, siRNA 등을 생산시킬 수 있는 RNAi 유도 벡터여도 된다. siRNA, shRNA, miRNA, 및 RNAi 유도 벡터의 제작은, 표적으로 하는 항 Flu 유전자의 cDNA 의 염기 배열 정보로부터, 통상적인 방법에 의해 설계하여 제조할 수 있다. 또, RNAi 유도 벡터는, 시판되는 각종 RNAi 벡터의 염기 배열에, RNAi 표적 영역의 염기 배열을 삽입함으로써 제작할 수도 있다.
본 발명에 관련된 항인플루엔자 바이러스제로서는, 본 발명에 관련된 항 Flu 유전자가 코드하는 단백질의 기능 (이하, 간단히 「본 발명에 관련된 항 Flu 유전자의 기능」 이라고 하는 경우가 있다.) 을 억제시키는 작용을 갖는 물질을 유효 성분으로 하는 것을 들 수 있다. 항 Flu 유전자의 기능을 억제시키는 작용을 갖는 물질로서는, 본 발명에 관련된 항 Flu 유전자가 코드하는 단백질 (이하, 간단히 「본 발명에 관련된 항 Flu 단백질」 이라고 하는 경우가 있다.) 에 대한 항체와 같이, 본 발명에 관련된 항 Flu 단백질과 결합함으로써, 당해 단백질의 기능을 억제하는 물질을 들 수 있다. 당해 항체로서는, 모노클로날 항체여도 되고, 폴리클로날 항체여도 된다. 또, 키메라 항체, 1 본쇄 항체, 인간화 항체 등의 인공적으로 합성된 항체여도 된다. 이들 항체는, 통상적인 방법에 의해 제조할 수 있다.
본 발명에 관련된 항 Flu 단백질이 효소인 경우, 항 Flu 유전자의 기능을 억제시키는 작용을 갖는 물질로서는, 당해 효소에 대한 저해제여도 된다.
본 발명에 관련된 항인플루엔자 바이러스제로서는, 1 종류의 항 Flu 유전자의 발현이나 기능을 억제하는 작용을 갖는 것이어도 되고, 2 종류 이상의 항 Flu 유전자의 발현이나 기능을 억제하는 작용을 갖는 것이어도 된다.
본 발명에 관련된 항인플루엔자 바이러스제로서는, JAK1 유전자, GBF1 유전자, 및 USP9X 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종 이상의 항 Flu 유전자의 발현이나 기능을 억제하는 작용을 갖는 것이 바람직하고, JAK1 유전자 및 GBF1 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종 이상의 항 Flu 유전자의 발현이나 기능을 억제하는 작용을 갖는 것이 보다 바람직하고, JAK1 유전자의 발현이나 기능을 억제하는 작용을 갖는 것이 더욱 바람직하다.
JAK1 유전자의 기능을 억제하는 작용을 갖는 물질로서는, Ruxolitinib (CAS No.： 941678-49-5) 나 Tofacitinib (CAS No.： 477600-75-2) 등의 JAK 저해제를 들 수 있다. Ruxolitinib 는 골수 선유증의 치료약으로서 Tofacitinib 는 류머티즘약으로서 각각 승인되어 있고, 인체에 대해 비교적 안전하게 사용 가능한 물질이다. 또, GBF1 유전자의 기능을 억제하는 작용을 갖는 물질로서는, Golgicide A (CAS No.： 1005036-73-6) 를 들 수 있다. Golgicide A 는, 투여 농도를 적절히 설정함으로써 숙주 세포의 증식에 영향을 미치는 일 없이 인플루엔자 바이러스의 증식을 억제할 수 있다.
그 외에, Tofacitinib (CP-690550) Citrate(3-((3R,4R)-4-methyl-3-(methyl(7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-yl)amino)piperidin-1-yl)-3-oxopropanenitrile), Tyrphostin B42(AG-490)((E)-N-benzyl-2-cyano-3-(3,4-dihydroxyphenyl)acrylamide), Baricitinib(LY3009104, INCB028050)(2-[1-ethylsulfonyl-3-[4-(7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-yl)pyrazol-1-yl]azetidin-3-yl]acetonitrile), AT9283(1-cyclopropyl-3-(3-(5-(morpholinomethyl)-1H-benzo[d]imidazol-2-yl)-1H-pyrazol-4-yl)urea), Momelotinib(CYT387)(N-(cyanomethyl)-4-(2-(4-morpholinophenylamino)pyrimidin-4-yl)benzamide), CEP33779([1,2,4]Triazolo[1,5-a]pyridin-2-amine, N-[3-(4-methyl-1-piperazinyl)phenyl]-8-[4-(methylsulfonyl)phenyl]-), NVP-BSK805(8-(3,5-difluoro-4-(morpholinomethyl)phenyl)-2-(1-(piperidin-4-yl)-1H-pyrazol-4-yl)quinoxaline), ZM39923(1-Propanone, 3-[(1-methylethyl)(phenylmethyl)amino]-1-(2-naphthalenyl)-, hydrochloride(1:1)), Filgotinib(GLPG0634)(N-[5-[4-[(1,1-Dioxido-4-thiomorpholinyl)methyl]phenyl][1,2,4]triazolo[1,5-a]pyridin-2-yl]cyclopropanecarboxamide), JANEX-1(4-[(6,7-dimethoxy-4-quinazolinyl)amino]-phenol), NVP-BSK805(4-[[2,6-difluoro-4-[3-(1-piperidin-4-ylpyrazol-4-yl)quinoxalin-5-yl]phenyl]methyl]morpholine ; dihydrochloride), SB1317(20-Oxa-5,7,14,27-tetraazatetracyclo[19.3.1.12,6.18,12]heptacosa-1(25),2,4,6(27),8,10,12(26),16,21,23-decaene, 14-methyl-) 등의 JAK 저해제도, 본 발명에 관련된 항인플루엔자 바이러스제로서 사용된다. 또, USP9X 유전자의 기능을 억제하는 작용을 갖는 물질로서는, DUB 저해제인 WP1130 (Degrasyn) ((2E)-3-(6-bromo-2-pyridinyl)-2-cyano-N-[1S-phenylbutyl]-2-propenamide) 를 들 수 있다.
본 발명에 관련된 항 Flu 유전자의 발현을 억제시키는 작용을 갖는 물질을 유효 성분으로 하는 경우, 본 발명에 관련된 항인플루엔자 바이러스제로서는, 항 Flu 유전자의 발현량을, 당해 항인플루엔자 바이러스제의 비존재하와 비교해서, 50 ％ 이상 저하되는 것인 것이 바람직하고, 75 ％ 이상 저하되는 것인 것이 보다 바람직하고, 80 ％ 이상 저하되는 것인 것이 더욱 바람직하다. 마찬가지로, 항 Flu 유전자의 기능을 억제시키는 작용을 갖는 물질을 유효 성분으로 하는 경우, 본 발명에 관련된 항인플루엔자 바이러스제로서는, 항 Flu 유전자의 기능을, 당해 항인플루엔자 바이러스제의 비존재하와 비교해서, 50 ％ 이상 저하되는 것인 것이 바람직하고, 75 ％ 이상 저하되는 것인 것이 보다 바람직하고, 80 ％ 이상 저하되는 것인 것이 더욱 바람직하다.
본 발명에 관련된 항인플루엔자 바이러스제는, 동물에 대한 인플루엔자 바이러스의 감염 예방이나, 인플루엔자 바이러스에 감염된 동물에 대한 치료에 사용할 수 있다. 인플루엔자 바이러스에 대한 감염 예방 또는 인플루엔자에 대한 치료를 위해서 본 발명에 관련된 항인플루엔자 바이러스제가 투여되는 동물로서는, 예를 들어, 인간, 원숭이, 돼지, 말, 개, 고양이, 호랑이 등의 포유류 ； 닭, 집오리, 메추리, 거위, 오리, 칠면조, 사랑새, 앵무새, 원앙새, 백조 등의 조류를 들 수 있다. 본 발명에 관련된 항인플루엔자 바이러스제로서는, 인간에 대한 인플루엔자 바이러스의 감염 예방이나, 인플루엔자 바이러스에 감염된 동물에 대한 치료에 사용되는 것인 것이 바람직하다.
인플루엔자의 치료는, 인플루엔자 바이러스에 감염된 동물 또는 인플루엔자 바이러스에 대한 감염을 예방할 필요가 있는 동물에 대해, 본 발명에 관련된 항인플루엔자 바이러스제를 유효량 투여함으로써 실시할 수 있다. 항인플루엔자 바이러스제의 유효량은, 투여된 동물에 대해, 투여되어 있지 않은 경우에 비해 체내의 인플루엔자 바이러스의 양을 저감시키는 양, 또는 인플루엔자 바이러스에 대한 감염을 방지할 수 있는 양이면 되고, 당해 항인플루엔자 바이러스제에 의해 중독인 부작용이 생기지 않는 양인 것이 바람직하다. 각 항인플루엔자 바이러스제의 유효량은, 항인플루엔자 바이러스제의 종류, 투여 대상의 동물의 종류, 투여 방법 등을 고려하여 실험적으로 구할 수 있다. 예를 들어, 인플루엔자 바이러스를 감염시킨 실험 동물에 대해 투여했을 경우에, 투여하지 않은 실험 동물과 비교해서 당해 실험 동물의 체내에 있어서의 인플루엔자 바이러스량을, PFU 로 70 ％ 이하, 바람직하게는 80 ％ 이하, 보다 바람직하게는 90 ％ 이하로 할 수 있는 양을, 유효량이라고 규정할 수도 있다.
본 발명에 관련된 항인플루엔자 바이러스제는, 경구투여, 정주, 비강 또는 구강에 대한 직접 투여, 경피 투여 등의 각종 투여 형태에 적합한 제형으로, 통상적인 방법에 의해 제제화할 수 있다. 당해 제형으로서는, 정제, 산제, 과립제, 캡슐제, 츄어블제, 시럽제, 액제, 현탁제, 주사제, 함수제, 분무제, 첩부제, 연고제 등을 들 수 있다.
본 발명에 관련된 항인플루엔자 바이러스제는, 항 Flu 유전자의 발현이나 기능을 억제하는 작용을 갖는 물질에 더하여, 각종 첨가제를 함유하고 있어도 된다. 당해 첨가제로서는, 부형제, 결합제, 활택제, 습윤제, 용제, 붕괴제, 용해 보조제, 현탁화제, 유화제, 등장화제, 안정화제, 완충제, 방부제, 항산화제, 교미교취제, 착색제 등을 들 수 있다. 이들 첨가제로서는, 약학상 허용되는 물질로서, 의약의 제제화에 사용되고 있는 것 중에서 적절히 선택하여 사용할 수 있다.
＜항인플루엔자 바이러스제의 스크리닝 방법＞
본 발명에 관련된 항인플루엔자 바이러스제의 스크리닝 방법 (이하, 「본 발명에 관련된 스크리닝 방법」 이라고 하는 경우가 있다.) 은, 항인플루엔자 바이러스제의 후보 화합물을 스크리닝하는 방법으로서, 본 발명에 관련된 항 Flu 유전자의 발현 또는 기능에 대한 억제 또는 저해능이 있는 후보 화합물을, 항인플루엔자 바이러스제의 후보 화합물로서 스크리닝하는 것을 특징으로 한다. 본 발명에 관련된 스크리닝 방법에 있어서는, 1 종류의 항 Flu 유전자의 발현 또는 기능에 대한 억제 또는 저해능이 있는 물질을 스크리닝하는 방법이어도 되고, 2 종류 이상의 항 Flu 유전자의 발현 또는 기능에 대한 억제 또는 저해능이 있는 물질을 스크리닝하는 방법이어도 된다.
구체적으로는, 항 Flu 유전자의 발현에 대한 억제능 또는 저해능이 있는 물질의 스크리닝은, 먼저, 세포에, 항인플루엔자 바이러스제의 후보 화합물인지의 여부를 평가하는 대상의 화합물을 도입하고, 항 Flu 유전자의 발현이 억제되었는지의 여부를 조사한다. 항 Flu 유전자의 발현이 유의하게 억제된 경우에는, 당해 화합물을 항인플루엔자 바이러스제의 후보 화합물로서 선발한다. 즉, 세포에, 항인플루엔자 바이러스제의 후보 화합물인지의 여부를 평가하는 대상의 화합물을 도입하는 공정과, 당해 화합물을 도입한 세포 중에 있어서의 항 Flu 유전자의 발현량을 측정하는 공정과, 당해 항 Flu 유전자의 발현량이, 당해 화합물이 도입되기 전의 세포에 있어서의 당해 항 Flu 유전자의 발현량보다 유의하게 저감되었을 경우에, 당해 화합물을 항인플루엔자 바이러스제의 후보 화합물로서 선발하는 공정에 의해 실시한다.
스크리닝에 사용하는 세포는, 인플루엔자 바이러스의 숙주가 되는 생물종의 세포인 것이 바람직하고, 취급의 편리성에서, 포유류나 조류의 배양 세포주인 것이 보다 바람직하고, 인간의 배양 세포주인 것이 더욱 바람직하다. 또, 평가 대상의 화합물은, 일렉트로포레이션법, 리포펙션법, 인산칼슘법 등에 의해, 세포 내에 도입할 수 있다. 평가 대상의 화합물이 저분자 화합물인 경우에는, 당해 화합물을 배양액에 첨가함으로써, 당해 화합물을 세포 내에 도입할 수 있다.
항 Flu 유전자의 발현량의 변화는, mRNA 레벨로 평가해도 되고, 단백질 레벨로 평가해도 된다. 예를 들어, RT-PCR 법 등의 핵산 증폭 반응을 이용하거나, 면역 조직 화학법이나 웨스턴 블롯법에 의해, 항 Flu 유전자의 발현량을 정량적으로 비교할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들어, 평가 대상의 화합물을 도입한 상태에서 1 ∼ 2 일간 배양한 세포에서 추출된 RNA 로부터 역전사 반응에 의해 합성된 cDNA 를 주형으로 하여 항 Flu 유전자의 cDNA 의 전체 길이 또는 일부분을 증폭하는 PCR 을 실시한다. 얻어진 증폭 산물량이, 당해 화합물을 도입하기 전의 세포로부터 동일하게 하여 얻어진 증폭 산물량보다 유의하게 감소하고 있는 경우에, 당해 화합물은 항 Flu 유전자의 발현에 대한 억제능 또는 저해능이 있다고 평가된다. 또, 예를 들어, 평가 대상의 화합물을 도입한 상태에서 1 ∼ 2 일간 배양한 세포와 당해 화합물을 도입하기 전의 세포에 대해, 세포 내의 항 Flu 단백질을 형광 표식한 항체를 사용하여 염색하고, 세포당 형광 강도를 비교한다. 당해 화합물을 도입한 세포의 세포당 형광 강도가, 당해 화합물을 도입하지 않은 세포보다 유의하게 작은 경우에는, 당해 화합물은 항 Flu 유전자의 발현에 대한 억제 또는 저해능이 있다고 평가된다. 또, 예를 들어, 평가 대상의 화합물을 도입한 상태에서 1 ∼ 2 일간 배양한 세포와 당해 화합물을 도입하기 전의 세포의 세포 추출액 (라이세이트) 을 전기 영동하여 분리한 후에 막에 전사하고, 당해 막 상의 항 Flu 단백질 밴드를 형광 표식한 항체를 사용하여 염색하고, 밴드의 형광 강도를 비교한다. 당해 화합물을 도입한 세포에서 유래하는 항 Flu 단백질 밴드의 형광 강도가, 당해 화합물을 도입하지 않은 세포보다 유의하게 작은 경우에는, 당해 화합물은 항 Flu 유전자의 발현에 대한 억제 또는 저해능이 있다고 평가된다.
항 Flu 단백질의 기능이, 특정의 생체 분자와의 상호 작용인 경우에는, 예를 들어, 항 Flu 단백질과 당해 특정의 생체 분자와의 결합 어세이를, 평가 대상의 화합물의 존재하와 비존재하에 있어서 실시하고, 평가 대상의 화합물의 존재하에 있어서 비존재하보다 양자의 결합성이 저하된 경우에, 당해 화합물은 항 Flu 유전자의 기능에 대한 억제 또는 저해능이 있다고 평가된다. 또, 항 Flu 단백질이 효소인 경우에는, 예를 들어, 항 Flu 단백질의 효소 활성을 평가 대상의 화합물의 존재하와 비존재하에 있어서 측정하고, 평가 대상의 화합물의 존재하에 있어서 비존재하보다 항 Flu 단백질의 효소 활성이 저하된 경우에, 당해 화합물은 항 Flu 유전자의 기능에 대한 억제 또는 저해능이 있다고 평가된다.
실시예
다음으로, 실시예 등에 의해 본 발명을 한층 더 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들의 예에 의해 한정되는 것은 아니다.
＜세포의 배양＞
이하의 실시예에 있어서, HEK293 세포 및 A549 세포 (인간폐 상피 세포 유래) 는, 10 ％ FCS (소 태아 혈청) 와 항생 물질을 함유시킨 DMEM 배지 (시그마 알드리치사 제조) 에서, 5 ％ 이산화탄소 분위기하, 37 ℃ 에서 배양했다. MDCK (Madin-Darby canine kidney) 세포는, 5 ％ NCS (소 신생아 혈청) 함유 이글 최소 필수 배지 (Eagle's MEM) (GIBCO 사 제조) 에서, 5 ％ 이산화탄소 분위기하, 37 ℃ 에서 배양했다.
＜인플루엔자 바이러스＞
이하의 실시예에 있어서 사용한 인플루엔자 바이러스는, 특별히 기재가 없는 한, A 형 인플루엔자 바이러스 (A/WSN/33, H1N1 서브 타입 ； WSN) 를 사용했다. 당해 바이러스는, 마우스에 적응한 인간 유래 인플루엔자 바이러스이며, 리버스 제네틱스를 사용한 수법 (비특허문헌 7 참조.) 에 의해 제작된 것이며, MDCK 세포 중에서 증식시켰다. 또, 바이러스의 역가는, MDCK 세포를 사용한 플라크 어세이에 의해 측정했다 (비특허문헌 8 참조.).
PB2-KO/Rluc 바이러스 (반딧불이 루시페라아제 유전자를 갖는 PB2 녹아웃 바이러스) 는, 복제능이 결락된 바이러스이며, 폴리머라아제 PB2 단백질의 코드 영역에, 레닐라 루시페라아제를 코드하는 리포터 유전자를 갖는다. PB2-KO/Rluc 바이러스는, pPolIPB2(120)Rluc(120) (PB2 세그먼트에서 유래하는 N 말단 및 C 말단의 120 염기에 끼워진 레닐라 루시페라아제 유전자를 코드하는 플라스미드) 과, 7 개의 바이러스 RNA 세그먼트를 코드하는 플라스미드로 제조했다. PB2-KO/Rluc 바이러스의 증식과 역가의 측정은, PB2 단백질을 항상적으로 발현하고 있는 MDCK 세포 중에서 실시했다 (비특허문헌 9 참조.).
＜항체＞
이하의 실시예에 있어서 사용한 마우스 항 HA 항체 (WS3-54), 마우스 항 NA 항체 (WS5-29), 및 마우스 항 M1 항체 (WS-27/52) 는, 국립 감염증 연구소의 다카시타 에미 주임 연구관으로부터 제공된 것을 사용했다. 마우스 항 Aichi NP 항체 (2S-347/3) 및 토끼 항 WSN 바이러스 항체 (R309) 는, 발명자들이 통상적인 방법에 의해 제작한 것을 사용했다. 항 β-액틴 (AC-74) 항체는, 시그마 알드리치사로부터 구입한 것을 사용했다.
［실시예 1］
＜인플루엔자 바이러스 단백질과 상호 작용하는 숙주 단백질의 동정＞
본 발명자들은, 먼저, 면역 침강법에 의해, 인플루엔자 바이러스 단백질과 상호 작용하는 숙주 단백질을 동정했다.
구체적으로는, 먼저, 11 종의 인플루엔자 바이러스 단백질 (PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M1, M2, NS1, NS2, 및 PB1-F2) 에 대해, 각각, N 말단 또는 C 말단에 Flag 태그를 융합시킨 Flag 융합 단백질을 코드하는 플라스미드를, HEK293 세포에 트랜스펙트로 했다. 트랜스펙션은, TransIT 293 reagent (Mirus Bio Corp 제조) 를 사용하여 실시했다. 트랜스펙션으로부터 24 시간 배양한 세포를, 세포 용해 버퍼 (50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.5 ％ Nonidet P-40, protease inhibitor mixture Complete Mini (Roche, Mannheim, Germany)) 에 혼합하고, 4 ℃, 1 시간 인큐베이트함으로써 용해시켜 라이세이트를 얻었다. 얻어진 라이세이트를 원심분리 처리하여 회수한 상청에, 항 Flag 항체가 결합한 어피니티 겔 (anti-FLAG M2 Affinity Gel, 시그마 알드리치사 제조) 을 혼합하여 4 ℃, 18 시간 인큐베이트했다. 그 후, 어피니티겔을, 세포 용해 버퍼로 3 회, 이어서 IP (면역 침강) 버퍼 (50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA) 로 2 회 세정한 후, 0.5 mg/㎖ 의 FLAG 펩티드 (F1804, 시그마 알드리치사 제조) 를 함유시킨 IP 버퍼로 4 ℃, 2 시간 교반했다. 그 후, 원심분리 처리에 의해 어피니티겔을 제거하고, 상청을 회수했다.
회수된 상청을, Ultrafree-MC filter (미리포아사 제조) 로 필터 여과한 후, 함유되어 있는 단백질을, nanoLC-MS/MS (nanoflow liquid chromatography tandem mass spectrometry) 분석에 의해 동정했다. 매스 스펙트리 데이터의 해석에는, Dina (케이와이에이 테크놀로지즈사 제조) 를 조합한 Q-STAR Elite (에이비·사이엑스사 제조) 를 사용했다. 면역 공침강한 HEK293 세포 (숙주 세포) 의 단백질의 동정은, 얻어진 MS/MS 시그널을, RefSeq (National Center for Biotechnology Information 인간 단백질 데이터베이스) 와 비교해서 실시했다. 당해 비교는, 마스코트 알고리즘 (version 2.2.04 ； Matrix Science 사 제조) 을 이용하여 하기의 조건에서 실시했다 ： variable modifications, oxidation (Met), N-acetylation ; maximum missed cleavages, 2 ; peptide mass tolerance, 200 ppm ; MS/MS tolerance, 0.5 Da.). 단백질의 동정은, 마스코트 스코어가 유의하게 임계값을 초과하는 MS/MS 시그널이 적어도 1 개 있는 것을 조건으로 했다.
이 결과, 388 개의 숙주 단백질이 PB2 단백질과 면역 공침강하고, 322 개의 숙주 단백질이 PB1 단백질과 면역 공침강하고, 304 개의 숙주 단백질이 PA 단백질과 면역 공침강하고, 351 개의 숙주 단백질이 HA 단백질과 면역 공침강하고, 574 개의 숙주 단백질이 NP 단백질과 면역 공침강하고, 675 개의 숙주 단백질이 NA 단백질과 면역 공침강하고, 659 개의 숙주 단백질이 M1 단백질과 면역 공침강하고, 531 개의 숙주 단백질이 M2 단백질과 면역 공침강하고, 113 개의 숙주 단백질이 NS1 단백질과 면역 공침강하고, 42 개의 숙주 단백질이 NS2 단백질과 면역 공침강하고, 81 개의 숙주 단백질이 PB1-F2 단백질과 면역 공침강했다. 요컨대, 합계 1292 개의 숙주 단백질이, 11 종의 인플루엔자 바이러스 단백질 중 어느 것과 면역 공침강했다.
＜siRNA＞
이어서, 면역 침강에 의해 동정된 1292 개의 숙주 단백질을 코드하는 유전자 에 대해, RNA 간섭을 실시하고, 이들 단백질이 실제로 인플루엔자 바이러스의 증식에 관여하는지의 여부를 조사했다. 사용하는 siRNA 는, 각 숙주 유전자에 대해, 각각, 게놈 와이드 Human siRNA Library (FlexiTube siRNA ； 키아겐사 제조) 에서 2 종류를 선택하여 사용했다. 또, 네거티브 컨트롤로서 AllStars Negative Control siRNA (키아겐사 제조) (컨트롤 siRNA) 를 사용했다. 또, WSN 바이러스의 NP 유전자의 siRNA (GGA UCU UAU UUC UUC GGA GUU) 는, 시그마 알드리치사로부터 구입했다.
구체적으로는, 먼저, RNAiMAX Reagent (Invitrogen 사 제조) 를 사용하여, HEK293 세포에, 2 종류의 siRNA 를 25 nM 씩 (최종 농도 ： 50 nM), 2 회 트랜스펙션했다.
＜세포의 생존성＞
siRNA 의 2 회째의 트랜스펙션으로부터 24 시간 경과 후의 세포의 생존성을, CellTiter-Glo assay system (프로메가사 제조) 을 첨부된 지시서에 따라 사용하여 조사했다. 컨트롤 siRNA 를 도입한 세포의 생세포수에 대한, 각 siRNA 를 도입한 세포의 생세포수의 비율을, 세포 생존률 (％) 로서 산출했다.
＜qRT-PCR＞
siRNA 의 트랜스펙션 전과 트랜스펙션으로부터 48 시간 경과 후의 세포에 대해, qRT-PCR (quantitative reverse transcription-PCR) 을 실시하고, siRNA 에 의해 표적의 숙주 유전자의 발현이 억제되었는지를 확인했다.
구체적으로는, 먼저, 상기 ＜siRNA＞ 와 동일하게 하여 siRNA 를 HEK293 세포에 트랜스펙션하고, 2 회째의 트랜스펙션으로부터 48 시간 경과 후의 세포를, 상기 세포 용해 버퍼에 용해시켜 라이세이트를 조제했다. 조제된 라이세이트로부터, Maxwell 16 LEV simplyRNA Tissue Kit (프로메가사 제조) 를 사용하여, 총 RNA 를 추출하고, 이것을 주형으로 하여, ReverTra Ace qPCR RT Master Mix (토요보사 제조) 또는 SuperScript III Reverse Transcriptase (Invitrogen 사 제조) 를 사용하여 역전사 반응을 실시했다. 합성된 cDNA 를 주형으로 하여, 각 숙주 유전자에 특이적인 프라이머 세트와 THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix (토요보사 제조) 를 사용하여, 정량적 PCR 을 실시했다. 각 숙주 유전자의 mRNA 발현량 레벨의 비교는, β-액틴을 내재성 표준 물질로 하여, ΔΔCt 법에 의해 산출했다. 컨트롤 siRNA 를 도입한 세포에 있어서의 mRNA 발현량에 대한, 각 siRNA 를 도입한 세포에 있어서의 mRNA 발현량의 비율을, 녹다운 효율 (％) 로서 산출했다.
＜바이러스의 증식성＞
2 개의 24 웰 디쉬에, 상기 ＜siRNA＞ 와 동일하게 하여 siRNA 를 HEK293 세포에 트랜스펙션하고, 2 회째의 트랜스펙션 후의 세포에 50 pfu (plaque-forming unit) 의 인플루엔자 바이러스를 감염시켰다. 바이러스 감염으로부터 48 시간 경과 후, 배양 상청을 회수하고, MDCK 세포를 사용한 플라크 어세이에 의해, 바이러스의 역가를 조사했다. 각 siRNA 를 도입한 세포에 있어서의 바이러스 역가의 상용 대수값을, 컨트롤 siRNA 를 도입한 세포에 있어서의 바이러스 역가의 상용 대수값으로 나눈 값을, 바이러스 역가의 변화량으로서 산출했다.
이 결과, 323 개의 숙주 유전자에 있어서, siRNA 의 트랜스펙션에 의해 유전자 발현 레벨이 저하되었다. 이 323 개 중, 299 개의 숙주 유전자에서는, 상용 대수값으로 2 이상 인플루엔자 바이러스의 역가가 저하되고 (즉, 바이러스 역가의 변화량이 -2 이상), 24 개의 숙주 유전자에서는, 상용 대수값으로 1 이상 인플루엔자 바이러스의 역가가 향상되었다 (즉, 바이러스 역가의 변화량이 1 이상). 그 중에서도, 이하의 91 개의 숙주 유전자는, 숙주 세포의 생존성이 80 ％ 이상 유지되어 있음에도 불구하고, 상용 대수값으로 3 이상 인플루엔자 바이러스의 역가가 저하되고 있어, 항인플루엔자 바이러스제의 표적으로서 유용한 것이 시사되었다 ： ANP32B 유전자, AP2A2 유전자, ASCC3L1 유전자, ATP5O 유전자, BAG3 유전자, BASP1 유전자, BRD8 유전자, BUB3 유전자, C14orf173 유전자, C19orf43 유전자, CAPRIN1 유전자, CCDC135 유전자, CCDC56 유전자, CHERP 유전자, CIRBP 유전자, CLTC 유전자, CNOT1 유전자, CTNNB1 유전자, CYC1 유전자, DDX21 유전자, DDX55 유전자, DKFZp564K142 유전자, DNAJC11 유전자, DPM3 유전자, EEF1A2 유전자, EEF2 유전자, FAM73B 유전자, FLJ20303 유전자, GBF1 유전자, GEMIN4 유전자, HNRNPK 유전자, IARS 유전자, IGF2BP2 유전자, ITGA3 유전자, ITGB4BP 유전자, ITM2B 유전자, JAK1 유전자, KIAA0664 유전자, KRT14 유전자, LRPPRC 유전자, MRCL3 유전자, MYH10 유전자, NCAPD3 유전자, NCLN 유전자, NDUFA10 유전자, NDUFS8 유전자, NFIA 유전자, NIBP 유전자, NUP160 유전자, NUP205 유전자, PCDHB12 유전자, PHB 유전자, PPP6C 유전자, PSMA4 유전자, PSMA5 유전자, PSMB2 유전자, PSMC1 유전자, PSMC4 유전자, PSMC6 유전자, PSMD11 유전자, PSMD12 유전자, PSMD13 유전자, PSMD14 유전자, PSMD2 유전자, PSMD6 유전자, RCN1 유전자, RPL26 유전자, S100A4 유전자, SAMHD1 유전자, SDF2L1 유전자, SDF4 유전자, SF3A2 유전자, SF3B2 유전자, SF3B4 유전자, SFRS10 유전자, SFRS2B 유전자, SNRP70 유전자, SNRPC 유전자, SNRPD3 유전자, SQSTM1 유전자, STK38 유전자, TAF15 유전자, TESC 유전자, THOC2 유전자, TOMM40 유전자, TRIM28 유전자, UAP1 유전자, USP9X 유전자, VCP 유전자, XPO1 유전자, ZC3H15 유전자.
상기 91 개의 숙주 유전자의 바이러스 역가의 변화량, 세포 생존률 (％), 및 녹다운 효율 (％) 을, 표 1 ∼ 3 에 나타낸다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
＜세포 내 단백질의 합성에 대한 영향＞
이들 91 개의 숙주 유전자 발현의 억제가, 세포 내 단백질 합성에 영향을 미치는지의 여부를 조사했다.
구체적으로는, 상기 ＜siRNA＞ 와 동일하게 하여 siRNA 를 HEK293 세포에 트랜스펙션하고, 2 회째의 트랜스펙션으로부터 24 시간 경과 후의 세포에, 세포 내에서 기능하는 RNA 폴리머라아제 II 프로모터 (예를 들어, 닭β-액틴프로모터) 의 제어하에서 레닐라 루시페라아제를 발현시키는 플라스미드를, 컨트롤로서 사용했다.
트랜스펙션으로부터 48 시간 경과 후의 세포에 대해, Renilla Luciferase Assay System (프로메가사 제조) 을 사용하여, 루시페라아제 어세이를 실시했다. 루시페라아제 활성은, GloMax-96 Microplate Luminometer (프로메가사 제조) 를 사용하여 계측했다.
컨트롤 siRNA 를 도입한 세포의 레닐라 루시페라아제 활성에 대한, 각 siRNA 를 도입한 세포의 레닐라 루시페라아제 활성의 비율을, 세포 내 단백질의 합성 효율 (％) 로서 산출했다. 산출한 세포 내 단백질의 합성 효율 (％) 을 표 4 에 나타낸다. 이 결과, 상기 91 개의 숙주 유전자 중, 28 개의 숙주 유전자 (ATP5O 유전자, CNOT1 유전자, GEMIN4 유전자, ITGB4BP 유전자, NCAPD3 유전자, NUP160 유전자, NUP205 유전자, PSMA4 유전자, PSMA5 유전자, PSMB2 유전자, PSMC1 유전자, PSMC4 유전자, PSMD11 유전자, PSMD2 유전자, PSMD6 유전자, SF3A2 유전자, SF3B4 유전자, SNRPD3 유전자, VCP 유전자, PSMC6 유전자, PSMD12 유전자, PSMD14 유전자, SAMHD1 유전자, SF3B2 유전자, SNRP70 유전자, CAPRIN1 유전자, PHB 유전자, 및 SFRS10 유전자) 의 siRNA 를 도입한 세포에 있어서, 반딧불이 루시페라아제 활성이 컨트롤 siRNA 를 도입한 세포에 비해 80 ％ 이상 (p ＜ 0.05) 이나 저하되어 있었다. 이 결과로부터, 이들 숙주 유전자는 숙주 세포에 있어서의 전사나 번역에 관여하고 있고, 이들 숙주 유전자의 발현을 저하시킴으로써, 인플루엔자 바이러스의 전사나 번역이 억제되고, 나아가서는 인플루엔자 바이러스의 복제가 저해되는 것이 시사되었다.
Figure pct00004
＜미니레플리콘 어세이＞
상기 91 개의 숙주 유전자가, 바이러스 게놈 복제 및 전사에 관여하고 있는지의 여부를, 인플루엔자 바이러스의 RNA 폴리머라아제 활성을 조사하는 미니레플리콘 어세이 (비특허문헌 10 참조.) 에 의해 조사했다. 보다 상세하게는, 미니레플리콘 어세이는, 반딧불이 루시페라아제 리포터 단백질을 코드하는 바이러스형 RNA 의 복제 활성에 기초하는 바이러스 복제 복합체 (PB2 단백질, PB1 단백질, PA 단백질, 및 NP 단백질을 함유하는 복합체) 의 활성을 조사하는 어세이이다.
구체적으로는, 상기 ＜siRNA＞ 와 동일하게 하여 siRNA 를 HEK293 세포에 트랜스펙션하고, 2 회째의 트랜스펙션으로부터 24 시간 경과 후의 세포에, PA 를 발현시키기 위한 플라스미드, PB1 을 발현시키기 위한 플라스미드, PB2 를 발현시키기 위한 플라스미드, NP 를 발현시키기 위한 플라스미드, 및 반딧불이 루시페라아제를 코드하는 바이러스형 RNA 를 발현시키기 위한 플라스미드 (pPolINP(0)luc2(0)) 를 트랜스펙션했다. 또한, PA, PB1, PB2 또는 NP 를 발현시키기 위한 플라스미드는, 각각, 플라스미드 pCAGGS 의 멀티 클로닝 사이트에 각 단백질을 코드하는 cDNA 를 삽입한 것이다. 또, 숙주 세포 내에서 기능하는 RNA 폴리머라아제 II 프로모터 (예를 들어, 닭β-액틴프로모터) 의 제어하에서 레닐라 루시페라아제를 발현시키는 플라스미드를, 컨트롤로서 사용했다.
트랜스펙션으로부터 48 시간 경과 후의 세포에 대해, Dual-Glo Luciferase assay system (프로메가사 제조) 을 사용하여, 루시페라아제 어세이를 실시했다. 루시페라아제 활성은, GloMax-96 Microplate Luminometer (프로메가사 제조) 를 사용하여 계측했다. 바이러스 RNA 폴리머라아제 활성은, 레닐라 루시페라아제 활성에 의해 노멀라이즈된 반딧불이 루시페라아제 활성으로서 산출했다.
컨트롤 siRNA 를 도입한 세포의 반딧불이 루시페라아제 활성에 대한, 각 siRNA 를 도입한 세포의 반딧불이 루시페라아제 활성의 비율을, 바이러스 폴리머라아제 활성 (％) 으로서 산출했다. 이 바이러스 폴리머라아제 활성은, 반딧불이 루시페라아제 리포터 단백질의 발현 레벨을 나타내고, 바이러스 게놈 복제 및 전사의 효율의 지표가 된다. 산출한 바이러스 폴리머라아제 활성 (％) 을 표 5 에 나타낸다. 이 결과, 상기 91 개의 숙주 유전자 중, 9 개의 숙주 유전자 (BUB3 유전자, CCDC56 유전자, CLTC 유전자, CYC1 유전자, NIBP 유전자, ZC3H15 유전자, C14orf173 유전자, CTNNB1 유전자, 및 ANP32B 유전자) 의 siRNA 를 도입한 세포에 있어서, 바이러스 폴리머라아제 활성, 즉 바이러스 게놈 복제 및 전사가, 컨트롤 siRNA 를 도입한 세포에 비해 50 ％ 이상 (p ＜ 0.05) 이나 저하되어 있었다. 이 결과로부터, 이들 숙주 유전자가 바이러스 게놈 복제 및 전사에 관여하고 있고, 이들 숙주 유전자의 발현을 저하시킴으로써, 인플루엔자 바이러스의 게놈 복제 및 전사가 억제되는 것이 시사되었다.
Figure pct00005
＜PB2-KO/Rluc 바이러스 어세이＞
상기 91 개의 숙주 유전자에 대해, 바이러스의 라이프 사이클의 초기 단계에 관여하는지의 여부를 조사하기 위해, PB2-KO/Rluc 바이러스 어세이를 실시하여, 바이러스의 침입 효율을 조사했다.
구체적으로는, 상기 ＜siRNA＞ 와 동일하게 하여 siRNA 를 HEK293 세포에 트랜스펙션하고, 2 회째의 트랜스펙션으로부터 24 시간 경과 후의 세포에, PB2-KO/Rluc 바이러스를 감염시켰다. 감염으로부터 8 시간 경과 후의 세포에 대해, Renilla Luciferase Assay System (프로메가사 제조) 을 사용하여, 루시페라아제 어세이를 실시했다. 형광은, GloMax-96 Microplate Luminometer (프로메가사 제조) 를 사용하여 계측했다.
컨트롤 siRNA 를 도입한 세포의 레닐라 루시페라아제 활성에 대한, 각 siRNA 를 도입한 세포의 레닐라 루시페라아제 활성의 비율을, 바이러스의 침입 효율 (％) 로서 산출했다. 산출한 바이러스 침입 효율 (％) 을 표 6 에 나타낸다. 이 결과, 상기 91 개의 숙주 유전자 중, 23 개의 숙주 유전자 (SF3A2 유전자, GEMIN4 유전자, SFRS10 유전자, BAG3 유전자, CAPRIN1 유전자, CCDC135 유전자, IGF2BP2 유전자, KRT14 유전자, ATP5O 유전자, SAMHD1 유전자, PSMD6 유전자, BRD8 유전자, PSMD11 유전자, SF3B2 유전자, SF3B4 유전자, DPM3 유전자, NCAPD3 유전자, EEF2 유전자, PHB 유전자, NUP205 유전자, S100A4 유전자, PSMD14 유전자, 및 DDX55 유전자) 에 있어서, 바이러스 침입 효율이, 컨트롤 siRNA 를 도입한 세포에 비해 50 ％ 이상 (p ＜ 0.05) 이나 저하되어 있었다. 이 결과로부터, 이들 숙주 유전자는 인플루엔자 바이러스의 숙주 세포에 대한 침입에 관여하고 있고, 이들 숙주 유전자의 발현을 저하시킴으로써, 인플루엔자 바이러스의 숙주 세포에 대한 침입이 저해되고, 나아가서는 인플루엔자 바이러스의 복제가 저해되는 것이 시사되었다.
Figure pct00006
또, 이들 23 개의 숙주 유전자 중, 9 개의 숙주 유전자 (BAG3 유전자, BRD8 유전자, CCDC135 유전자, DDX55 유전자, DPM3 유전자, EEF2 유전자, IGF2BP2 유전자, KRT14 유전자, 및 S100A4 유전자) 는, 숙주 세포의 전사나 번역에는 관여하지 않고, 인플루엔자 바이러스의 전사나 번역에 특이적으로 관여하고 있는 것을 알 수 있었다. 또, 이들 9 개의 숙주 유전자는, 상기의 미니레플리콘 어세이에서는 인플루엔자 바이러스의 복제의 저해 활성은 확인할 수 없었던 점에서, 이들 숙주 유전자는, 바이러스의 숙주 세포 표면에 대한 결합, 숙주 세포에 대한 포착, vRNP (바이러스 리보 핵산 단백질) 복합체의 핵으로의 이행 등의 바이러스의 라이프 사이클의 초기 단계에 있어서 중요한 역할을 이루고 있는 것이 시사되었다.
＜VLP 포메이션 어세이＞
상기 91 개의 숙주 유전자가, 바이러스 입자 형성에 관여하고 있는지의 여부를, 바이러스형 입자 (virus-like particle, VLP) 포메이션 어세이에 의해 조사했다.
구체적으로는, 상기 ＜siRNA＞ 와 동일하게 하여 siRNA 를 트랜스펙션한 HEK293 세포에, HA 를 발현시키기 위한 플라스미드, NA 를 발현시키기 위한 플라스미드, 및 M1 을 발현시키기 위한 플라스미드를, TransIT293 transfection reagent (Mirus 사 제조) 를 사용하여 트랜스펙션했다. 또한, HA, NA, 또는 M1 을 발현시키기 위한 플라스미드는, 각각, 플라스미드 pCAGGS 의 멀티 클로닝 사이트에 각 단백질을 코드하는 cDNA 를 삽입한 것이다.
플라스미드 트랜스펙션으로부터 48 시간 경과 후의 세포를, 100 mM DTT 를 함유시킨 SDS Sample Buffer Solution (와코 준야쿠사 제조) 에 의해 용해시켰다. 얻어진 라이세이트를 회수하여, 원심분리 처리 (3000 × g, 4 ℃, 5 분간) 를 실시하고, VLP 를 포함하는 상청을 세포 잔류물로부터 분리하여 회수했다. 얻어진 상청을, 초원심용 튜브에 주입한 30 질량/용량％ 수크로오스를 함유하는 PBS (인산 완충 생리 식염수) 위에 올리고, 초원심분리 처리 (50000 rpm, 4 ℃, 1 시간, SW55Ti Rotor) 를 실시했다. 얻어진 침전물을, 100 mM DTT 를 함유시킨 SDS Sample Buffer Solution (와코 준야쿠사 제조) 에 용해시킨 것을, 웨스턴 블롯팅용 샘플로 했다.
조제된 웨스턴 블롯팅용 샘플에 Tris-Glycine SDS sample buffer (Invitrogen 사 제조) 를 혼합한 샘플을, 4 ％ - 20 ％ Mini-PROTEAN TGX gradient gels (바이오·래드사 제조) 에 어플라이하여 SDS-PAGE 를 실시하고, 분리한 단백질을 PVDF 막에 전사하고, 전사막을 Blocking One solution (나카라이테스크사 제조) 을 사용하여 블로킹했다. 당해 전사막을, 1 차 항체 용액 (토끼 항 WSN 바이러스 항체 (R309) 또는 항 β-액틴 (AC-74) 항체를, Can Get Signal (토요보사 제조) 에 부속된 용액 solution I 로 희석한 용액) 중에서, 실온에서 적어도 1 시간 인큐베이트했다. 이어서, 당해 전사막을 0.05 용량％ 의 Tween-20 을 함유시킨 TBS (TBST) 로 3 회 세정한 후, 2 차 항체 용액 (서양 와사비 퍼옥시다아제를 연결한 ECL 당나귀 항마우스 IgG 항체 (GE 헬스케어사 제조) 를, Can Get Signal (토요보사 제조) 에 부속된 용액 solution II 로 희석한 용액) 중에서 인큐베이트한 후, TBST 로 3 회 세정했다. 당해 전사막을, ECL Prime Western blotting detection reagent (GE 헬스케어사 제조) 중에서 인큐베이트한 후, 화학 발광에 의한 시그널을 VersaDoc Imaging System (바이오·래드사 제조) 에 의해 VLP 중의 HA 단백질 및 M1 단백질의 밴드와 β-액틴의 밴드를 검출했다.
VLP 의 산생량은, 라이세이트 중의 HA 단백질 또는 M1 단백질의 양에 대한 VLP 중의 HA 단백질 또는 M1 단백질의 양의 비율로서 산출했다. 컨트롤 siRNA 를 도입한 세포의 VLP 의 산생량에 대한, 각 siRNA 를 도입한 세포의 VLP 의 산생량의 비율을, VLP 의 산생 효율 (％) 로서 산출했다. HA 단백질에 기초하는 VLP 생산 효율 (％) 의 결과를 표 7 에, M1 단백질에 기초하는 VLP 생산 효율 (％) 의 결과를 표 8 에, 각각 나타낸다. 이 결과, 상기 91 개의 숙주 유전자 중, 15 개의 숙주 유전자 (ASCC3L1 유전자, BRD8 유전자, C19orf43 유전자, DDX55 유전자, DKFZp564K142 유전자, DPM3 유전자, EEF2 유전자, FAM73B 유전자, FLJ20303 유전자, GBF1 유전자, NCLN 유전자, C14orf173 유전자, XPO1 유전자, LRPPRC 유전자, 및 RCN1 유전자) 에 있어서, VLP 의 산생 효율이, 컨트롤 siRNA 를 도입한 세포에 비해 50 ％ 이상 (p ＜ 0.05) 이나 저하되어 있었다. 이 결과로부터, 이들 숙주 유전자는 VLP 의 형성에 관여하고 있고, 이들 숙주 유전자의 발현을 저하시킴으로써, VLP 의 형성이 저해되고, 나아가서는 인플루엔자 바이러스의 복제가 저해되는 것이 시사되었다.
Figure pct00007
Figure pct00008
＜자손 바이러스 입자에 대한 vRNP 의 포착 효율＞
상기 91 개의 숙주 유전자가, 자손 바이러스 입자에 대한 vRNP 의 포착에 관여하고 있는지의 여부를 조사하기 위해, vRNA 및 NP 의 자손 바이러스 입자에 대한 포착을 조사했다.
구체적으로는, 먼저, 상기 ＜siRNA＞ 와 동일하게 하여 siRNA 를 HEK293 세포에 트랜스펙션하고, 2 회째의 트랜스펙션 후의 세포에, MOI (multiplicity of infection) 가 5 인 인플루엔자 바이러스를 감염시켰다. 감염으로부터 12 시간 경과 후에, 방출된 바이러스 입자를 포함하는 배양 상청을, 원심분리 처리 (3000 × g, 4 ℃, 5 분간) 에 의해 세포 잔류물로부터 분리하여 회수했다. 얻어진 상청을, 초원심용 튜브에 주입한 30 중량/용량％ 수크로오스를 함유하는 PBS 위에 올리고, 초원심분리 처리 (50000 rpm, 4 ℃, 1 시간, SW55Ti Rotor) 를 실시했다. 바이러스 입자를 포함하는 침전물을 PBS 중에서 호모게나이즈하고, Maxwell 16 LEV simplyRNA Tissue Kit 를 사용하여 바이러스 RNA 를 추출했다. 상청 중의 바이러스 RNA 양과 세포 중의 바이러스 RNA 양을, Kawakami 들의 방법 (비특허문헌 11 참조.) 에 준하여, 사슬 특이적 리얼타임 PCR 에 의해 정량했다. 또한, 총 RNA 를 주형으로 한 역전사 반응은, SuperScript III Reverse Transcriptase 와 5' 말단에 19 염기로 이루어지는 태그 배열을 부가한 인플루엔자 바이러스 게놈 특이적 프라이머 (vRNAtag_NP_1 F ； ggccgtcatggtggcgaatAGCAAAAGCAGGGTAGATAATCACTC (소문자 부분이 태그 배열)) 를 사용하여 실시했다. 또, 정량적 PCR 은, 상기 태그 배열에 특이적인 프라이머 (vRNAtag ； GGCCGTCATGGTGGCGAAT) 와, 바이러스 게놈에 특이적인 프라이머 (WSN-NP_100 R ； GTTCTCCATCAGTCTCCATC) 와, 6-FAM/ZEN/IBFQ 로 표식된 프로브 (IDT, WSN-NP_46-70 ； ATGGCGACCAAAGGCACCAAACGAT) 와, THUNDERBIRD Probe qPCR Mix 를 사용하여 실시했다.
자손 바이러스 입자에 대한 vRNA 및 NP 단백질의 포착량은, 배양 상청으로부터 회수된 바이러스 중에 있어서의 vRNA 또는 NP 단백질의 양을 라이세이트 중에 있어서의 vRNA 또는 NP 단백질의 양으로 나눈 값에 의해 결정했다. 컨트롤 siRNA 를 도입한 세포의 자손 바이러스 입자에 대한 vRNA 의 포착량에 대한, 각 siRNA 를 도입한 세포의 자손 바이러스 입자에 대한 vRNA 의 포착량의 비율을, vRNA 의 포착 효율 (％) 로서 산출했다. 컨트롤 siRNA 를 도입한 세포의 자손 바이러스 입자에 대한 NP 단백질의 포착량에 대한, 각 siRNA 를 도입한 세포의 자손 바이러스 입자에 대한 NP 단백질의 포착량의 비율을, NP 단백질의 포착 효율 (％) 로서 산출했다. 산출 결과를 표 9 및 10 에 나타낸다. 이 결과, 상기 91 개의 숙주 유전자 중, 16 개의 숙주 유전자 (HNRNPK 유전자, DDX21 유전자, JAK1 유전자, EEF1A2 유전자, SFRS2B 유전자, DNAJC11 유전자, SQSTM1 유전자, BASP1 유전자, PCDHB12 유전자, KIAA0664 유전자, SNRPC 유전자, PPP6C 유전자, MRCL3 유전자, ITM2B 유전자, TAF15 유전자, 및 SDF4 유전자) 의 siRNA 를 도입한 세포에 있어서, 자손 바이러스 입자에 대한 vRNA 의 포착 효율이, 컨트롤 siRNA 를 도입한 세포에 비해 50 ％ 이상 (p ＜ 0.05) 이나 저하되어 있고, 27 개의 숙주 유전자 (SFRS2B 유전자, BASP1 유전자, THOC2 유전자, SNRPC 유전자, KIAA0664 유전자, PPP6C 유전자, HNRNPK 유전자, ITM2B 유전자, SQSTM1 유전자, RPL26 유전자, NDUFS8 유전자, SDF2L1 유전자, JAK1 유전자, DDX21 유전자, EEF1A2 유전자, TRIM28 유전자, SDF4 유전자, USP9X 유전자, PSMD13 유전자, TAF15 유전자, CIRBP 유전자, CHERP 유전자, TESC 유전자, MYH10 유전자, TOMM40 유전자, MRCL3 유전자, 및 PCDHB12 유전자) 의 siRNA 를 도입한 세포에 있어서, 자손 바이러스 입자에 대한 NP 단백질의 포착 효율이, 컨트롤 siRNA 를 도입한 세포에 비해 50 ％ 이상 (p ＜ 0.05) 이나 저하되어 있었다. 이 결과로부터, 이들 숙주 유전자는 자손 바이러스 입자에 대한 vRNA 또는 NP 단백질의 포착에 관여하고 있고, 이들 숙주 유전자의 발현을 저하시킴으로써, vRNA 또는 NP 단백질의 자손 바이러스 입자에 대한 포착이 억제되고, 나아가서는 인플루엔자 바이러스의 복제가 저해되는 것이 시사되었다.
Figure pct00009
Figure pct00010
［실시예 2］
실시예 1 에 있어서, siRNA 도입에 의해 인플루엔자 바이러스의 역가가 상용 대수값으로 2 이상 저하된 299 개의 숙주 유전자에 대해, 공지된 저해제가 항인플루엔자 바이러스제로서 사용 가능한지의 여부를 조사했다.
먼저, DrugBank database (비특허문헌 12 참조.), IPA (Ingenuity), 및 제약 메이커 (Millipore, 시그마 알드리치, Selleck Chemicals) 의 데이터베이스로부터, 이들 숙주 유전자의 기능의 저해제가 되는 화합물을 조사했다. 이 결과, 44 개의 숙주 유전자에 대한 저해제로서 61 개의 화합물이 발견되었다.
상기 61 개의 화합물로부터 표 11 에 나타내는 11 개의 저해제를 선택하고, 이들 화합물의 인플루엔자 바이러스의 복제에 대한 영향을 조사했다. 이들 중, Bortezomib 와 Colchicine 는, 인플루엔자 바이러스의 복제 저해제로서 공지이다 (비특허문헌 13 및 14 참조.).
Figure pct00011
구체적으로는, HEK293 세포 또는 A549 세포에, MOI 가 0.001 인 인플루엔자 바이러스를 감염시켰다. 감염으로부터 1 시간 경과한 세포를 세정한 후, 각 저해제를 함유하는 배양액 중에서 배양했다. 컨트롤로서 각 저해제 대신에, DMSO 용액 (최종 농도 ： 1 용량％) 을 사용했다. 저해제 존재하에서 48 시간 배양한 후, 배양 상청을 회수하고, 실시예 1 과 동일하게 하여, 바이러스의 역가를 구했다. 또, 세포의 생존률 (％) 은, CellTiter-Glo assay system (프로메가사 제조) 을 첨부된 지시서에 따라 이용하고, 컨트롤 (DMSO 용액) 을 함유하는 배지에서 배양한 세포의 생세포수에 대한, 각 저해제를 함유하는 배지에서 배양한 세포를, 세포 생존률 (％) 로서 산출했다.
이 결과, 2,3-Butanedione 2-Monoxime (30 mM), 및 WP1130 (50 μM) 은, 바이러스 역가를 상용 대수값으로 5 이상이나 저하시킬 수 있었지만, 세포 생존률도 현저하게 저하되어, 숙주 세포에 대한 독성이 강한 것을 알 수 있었다. 공지된 항인플루엔자 바이러스제인 Bortezomib (0.2 μM) 와 Colchicine (2.5 μM) 는, A549 세포에 있어서, 심한 세포 독성을 나타내는 일 없이, 바이러스 역가를 상용 대수값으로 4 (Bortezomib) 또는 2 (Colchicine) 이상이나 저하시킬 수 있었다. 한편으로, 지금까지 인플루엔자 바이러스의 복제와의 관계성은 지적되어 오지 않았던 Golgicide A (10 μM) 와 Ruxolitinib (30 μM) 는, 유의하게 바이러스 역가를 저하시킬 수 있었다. Ruxolitinib (30 μM) 는, 두드러진 세포 독성은 나타내지 않고, Golgicide A (10 μM) 는, HEK293 세포에서 세포 생존률의 저하가 확인되었지만, A549 세포에서는 확인되지 않았다. Golgicide A 의 결과를 도 1 에, Ruxolitinib 의 결과를 도 2 에, 각각 나타낸다. 이들 결과로부터, Histone acetyltransferase inhibitor II, Genistein, 2,3-Butanedione 2-Monoxime, WP1130, Golgicide A 및 Ruxolitinib 는, Bortezomib 및 Colchicine 와 마찬가지로, 항인플루엔자 바이러스 작용을 가지고 있는 것, 그 중에서도, Golgicide A 및 Ruxolitinib 는, 숙주 세포에 대한 독성이 비교적 작고, 항인플루엔자 바이러스제로서 매우 유용한 것을 알 수 있었다.
［실시예 3］
Ruxolitinib 는, 티로신 키나아제인 JAK1 에 대한 저해제이다. 실시예 1 에 나타내는 바와 같이, siRNA 도입에 의해 JAK1 의 발현을 저하시킨 세포에 있어서의 M1 단백질에 기초하는 VLP 산생 효율은, 57.7 ％ 이며, 커트오프값으로서 설정한 50 ％ 에 가까웠다. 그래서, JAK1 의 siRNA 를 도입한 세포를 전자 현미경에 의해 관찰하고, 인플루엔자 바이러스의 바이러스 입자 형성에 대한 JAK1 유전자의 발현 저하의 영향을 조사했다.
구체적으로는, 먼저, 상기 ＜siRNA＞ 와 동일하게 하여 JAK1 유전자의 siRNA 또는 컨트롤 siRNA 를 HEK293 세포에 트랜스펙션하고, 2 회째의 트랜스펙션 후의 세포에, MOI 가 5 인 인플루엔자 바이러스를 감염시켰다. 감염으로부터 12 시간 경과 후의 세포로부터, Noda 들의 방법 (비특허문헌 15) 에 따라, 세포의 초박절편을 조제하고, 이것을 전자 현미경에 의해 관찰했다. 전자 현미경은, Tecnai (등록상표) F20 electron microscope (FEI 사 제조) 를 사용했다.
컨트롤 siRNA 를 도입한 세포의 전자 현미경 사진 (상단) 과 JAK1 유전자의 siRNA 를 도입한 세포의 전자 현미경 사진 (하단) 을, 도 3 에 나타낸다. JAK1 유전자의 siRNA 를 도입한 세포에서는, 컨트롤 siRNA 를 도입한 세포보다 형성되어 있는 바이러스형 입자가 분명하게 적어, JAK1 유전자의 발현을 저하시킴으로써, 바이러스 입자의 형성을 저하시키는 것을 알 수 있었다. 이들 결과로부터, JAK1 은, 인플루엔자 바이러스 복제 사이클의 후기에 중요한 역할을 이루고 있는 것이 시사되었다.
［실시예 4］
표 12 에 나타내는 단백질 저해제를 피험 화합물로서, 세포에 대한 독성과 인플루엔자 바이러스의 증식에 대한 효과를 조사했다.
먼저, 피험 화합물 용액으로서 피험 화합물을 종농도로서 1000, 100, 10, 1, 0.1, 0.01, 또는 0.001 μM 가 되도록, 1 ％ 디메틸술폭시드 함유 MEM 으로 조제했다.
MDCK 세포, A549 세포, 및 HEK293 세포를, 최소 필수 배지 (minimum essential medium ； MEM) 에서 각각 6.25 × 105 세포/㎖, 2.5 × 106 세포/㎖, 1.25 × 105 세포/㎖ 의 농도로 조제한 세포액을, 96 구멍 플레이트에 0.1 ㎖/구멍씩 첨가하여 세포를 파종했다. 당해 96 구멍 플레이트 중의 세포를, 탄산가스 배양기 중, 37 ℃ 에서 배양하고, 파종일의 다음날에 MEM 으로 세정했다. 세정 후의 96 구멍 플레이트 중의 세포에, 각 피험 화합물 용액 0.1 ㎖ 를 하나의 농도당 3 구멍에 첨가한 후, 당해 96 구멍 플레이트 중의 세포를, 탄산가스 배양기 중, 37 ℃ 에서 48 시간 배양했다. 배양 후에 Cell Counting Kit-8 용액 (도진 화학 연구소 제조) 을 각 구멍에 10 ㎕ 씩 첨가하고, 추가로 수 시간 37 ℃ 에서 배양했다. 배양 후, 마이크로 플레이트 리더로, 당해 96 구멍 플레이트의 각 구멍의 용액의 450 nm 의 흡광도를 측정했다. 피험 화합물 대신에 용매 (1 ％ 디메틸술폭시드 함유 MEM) 를 첨가했을 때의 흡광도값을 전체 세포가 생존하는 100 ％ 로 하고, 흡광도가 50 ％ 가 될 때의 피험 화합물의 종농도값을 50 ％ 세포 독성 농도 (CC50 값) 로서 산출했다.
＜항바이러스 효과 시험＞
먼저, 피험 화합물 용액으로서, 피험 화합물을 종농도로서 1000, 100, 10, 1, 0.1, 0.01, 또는 0.001 μM 가 되도록, 1 ％ 디메틸술폭시드 함유 MEM 으로 조제했다.
MDCK 세포, A549 세포, 및 HEK293 세포를 MEM 으로 각각 1.25 × 106 세포/㎖, 5 × 106 세포/㎖, 2.5 × 105 세포/㎖ 의 농도로 조제한 세포액을, 96 구멍 플레이트에 0.1 ㎖/구멍씩 첨가하여 세포를 파종했다. 당해 96 구멍 플레이트 중의 세포를, 탄산가스 배양기 중 37 ℃ 에서 배양하고, 파종일의 다음날에 MEM 으로 세정했다. 세정 후의 96 구멍 플레이트 중의 세포에, 각 피험 화합물 용액 0.1 ㎖ 를 하나의 농도당 3 구멍에 첨가한 후, 당해 96 구멍 플레이트 중의 세포를, 탄산가스 배양기 중, 37 ℃ 에서 1 시간 배양했다. 배양 후, 각 구멍으로부터 피검 화합물 용액을 제거하고, 50 ㎕ 의 인플루엔자 바이러스 A/WSN RG＃1-1 주를 MOI (세포 1 개당 바이러스의 감염 개수) 가 0.001 이 되도록 감염시키고, 탄산가스 배양기 중, 37 ℃ 에서 1 시간 배양했다. 배양 후, 각 구멍으로부터 바이러스액을 제거하고, 1 ㎍/㎖ 트립신을 함유하는 피험 화합물 용액을 0.1 ㎖/구멍씩 첨가하고, 추가로 37 ℃ 에서 48 시간 배양했다. 배양 후의 각 구멍의 바이러스의 유무를 조사하고, 동일한 농도의 피검 화합물을 첨가한 배양 구멍의 반 (50 ％) 에서 바이러스가 없음으로 계산되는 피험 화합물의 종농도값을 50 ％ 바이러스 증식 저해 농도 (IC50) 로서 산출했다. 또한, 각 배양 구멍의 바이러스의 유무는, 각 배양 구멍으로부터 채취한 50 ㎕ 의 배양액에, 1 ％ 모르모트 적혈구를 함유하는 적혈구 용액 50 ㎕ 를 첨가했을 경우의 응집의 유무를 판정함으로써 실시했다.
각 단백질 저해제의 CC50 및 IC50 의 상용 대수값을 표 13 에 나타낸다. 표 중, 공란은, IC50 과 CC50 의 차가 10 배 미만 (상용 대수값으로 차가 1 미만) 인 것이다. 이 결과, 이들 단백질 저해제는, 적어도 MDCK 세포, A549 세포, 및 HEK293 세포 중 어느 것에 있어서, IC50 이 CC50 의 10 배 이상 낮은 농도가 되었다. 요컨대, 이들 단백질 저해제는, 숙주 세포의 증식성을 크게 저해하는 일 없이, 인플루엔자 바이러스의 증식을 억제하는 것이 가능하고, 항인플루엔자 바이러스제의 유효 성분으로서 적합했다.
Figure pct00013
<110> Japan Science and Technology Agency <120> Anti-influenza virus agent and Method for screening of anti-influenza virus agent <130> PC-20682 <160> 5 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: NP gene of WSN virus <400> 1 ggaucuuauu ucuucggagu u 21 <210> 2 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: vRNAtag_NP_1F Primer. <400> 2 ggccgtcatg gtggcgaata gcaaaagcag ggtagataat cactc 45 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: vRNAtag Primer. <400> 3 ggccgtcatg gtggcgaat 19 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: WSN-NP_100R Primer. <400> 4 gttctccatc agtctccatc 20 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: IDT, WSN-NP_46-70 Primer. <400> 5 atggcgacca aaggcaccaa acgat 25

Claims (10)

  1. 숙주 세포 내에 있어서의 인플루엔자 바이러스의 vRNA 또는 NP 단백질의 인플루엔자 바이러스형 입자에 대한 포착에 관여하는 단백질을 코드하는 유전자의 발현을 억제시키는 작용, 또는 상기 단백질의 기능을 억제시키는 작용을 가지며,
    상기 유전자가, JAK1 유전자, CHERP 유전자, DDX21 유전자, DNAJC11 유전자, EEF1A2 유전자, HNRNPK 유전자, ITM2B 유전자, MRCL3 유전자, MYH10 유전자, NDUFS8 유전자, PSMD13 유전자, RPL26 유전자, SDF2L1 유전자, SDF4 유전자, SFRS2B 유전자, SNRPC 유전자, SQSTM1 유전자, TAF15 유전자, TOMM40 유전자, TRM2B 유전자, USP9X 유전자, BASP1 유전자, THOC2 유전자, PPP6C 유전자, TESC 유전자, 및 PCDHB12 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종 이상인 것을 특징으로 하는, 항인플루엔자 바이러스제.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 유전자가 JAK1 유전자 또는 USP9X 유전자인, 항인플루엔자 바이러스제.
  3. 제 1 항에 있어서,
    Ruxolitinib, Tofacitinib, Tofacitinib (CP-690550) Citrate, Tyrphostin B42 (AG-490), Baricitinib (LY3009104, INCB028050), AT9283, Momelotinib, CEP33779, NVP-BSK805, ZM39923, Filgotinib, JANEX-1, NVP-BSK805, SB1317, 및 WP1130 으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종 이상인, 항인플루엔자 바이러스제.
  4. 숙주 세포 내에 있어서의 인플루엔자 바이러스의 복제 또는 전사에 관여하는 단백질을 코드하는 유전자의 발현을 억제시키는 작용, 또는 상기 단백질의 기능을 억제시키는 작용을 가지며,
    상기 유전자가, CCDC56 유전자, CLTC 유전자, CYC1 유전자, NIBP 유전자, ZC3H15 유전자, C14orf173 유전자, ANP32B 유전자, BAG3 유전자, BRD8 유전자, CCDC135 유전자, DDX55 유전자, DPM3 유전자, EEF2 유전자, IGF2BP2 유전자, KRT14 유전자, 및 S100A4 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종 이상인 것을 특징으로 하는, 항인플루엔자 바이러스제.
  5. 숙주 세포 내에 있어서의 인플루엔자 바이러스형 입자의 형성에 관여하는 단백질을 코드하는 유전자의 발현을 억제시키는 작용, 또는 상기 단백질의 기능을 억제시키는 작용을 가지며,
    상기 유전자가, GBF1 유전자, ASCC3L1 유전자, BRD8 유전자, C19orf43 유전자, DDX55 유전자, DKFZp564K142 유전자, DPM3 유전자, EEF2 유전자, FAM73B 유전자, FLJ20303 유전자, NCLN 유전자, C14orf173 유전자, LRPPRC 유전자, 및 RCN1 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종 이상인 것을 특징으로 하는, 항인플루엔자 바이러스제.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 유전자가 GBF1 유전자인, 항인플루엔자 바이러스제.
  7. 제 5 항에 있어서,
    Golgicide A 인, 항인플루엔자 바이러스제.
  8. 항인플루엔자 바이러스제의 후보 화합물을 스크리닝하는 방법으로서,
    JAK1 유전자, CHERP 유전자, DDX21 유전자, DNAJC11 유전자, EEF1A2 유전자, HNRNPK 유전자, ITM2B 유전자, MRCL3 유전자, MYH10 유전자, NDUFS8 유전자, PSMD13 유전자, RPL26 유전자, SDF2L1 유전자, SDF4 유전자, SFRS2B 유전자, SNRPC 유전자, SQSTM1 유전자, TAF15 유전자, TOMM40 유전자, TRM2B 유전자, USP9X 유전자, BASP1 유전자, THOC2 유전자, PPP6C 유전자, TESC 유전자, PCDHB12 유전자, CCDC56 유전자, CLTC 유전자, CYC1 유전자, NIBP 유전자, ZC3H15 유전자, C14orf173 유전자, ANP32B 유전자, BAG3 유전자, BRD8 유전자, CCDC135 유전자, DDX55 유전자, DPM3 유전자, EEF2 유전자, IGF2BP2 유전자, KRT14 유전자, S100A4 유전자, GBF1 유전자, ASCC3L1 유전자, C19orf43 유전자, DKFZp564K142 유전자, FAM73B 유전자, FLJ20303 유전자, NCLN 유전자, LRPPRC 유전자, 및 RCN1 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종 이상의 유전자의 발현 또는 상기 유전자가 코드하는 단백질의 기능에 대한 억제 또는 저해능이 있는 화합물을, 항인플루엔자 바이러스제의 후보 화합물로서 스크리닝하는 것을 특징으로 하는, 항인플루엔자 바이러스제의 스크리닝 방법.
  9. 제 8 항에 있어서,
    세포에, 항인플루엔자 바이러스제의 후보 화합물인지의 여부를 평가하는 대상의 화합물을 도입하는 공정과,
    상기 화합물을 도입한 세포 중에 있어서의 상기 유전자의 발현량을 측정하는 공정과,
    상기 유전자의 발현량이, 상기 화합물이 도입되기 전의 세포보다 유의하게 저감되었을 경우에, 당해 화합물을 항인플루엔자 바이러스제의 후보 화합물로서 선발하는 공정
    을 갖는, 항인플루엔자 바이러스제의 스크리닝 방법.
  10. 제 8 항에 있어서,
    상기 유전자가 코드하는 단백질이 효소이며,
    상기 유전자가 코드하는 단백질의 효소 활성을, 항인플루엔자 바이러스제의 후보 화합물인지의 여부를 평가하는 대상의 화합물의 존재하에서 측정하는 공정과,
    상기 화합물의 존재하에 있어서의 상기 단백질의 효소 활성이, 상기 화합물의 비존재하보다 저하된 경우에, 당해 화합물을 항인플루엔자 바이러스제의 후보 화합물로서 선발하는 공정
    을 갖는, 항인플루엔자 바이러스제의 스크리닝 방법.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20200077375A (ko) 2018-12-20 2020-06-30 엘지디스플레이 주식회사 발광 표시 장치

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109311897B (zh) 2017-03-20 2021-07-20 福马治疗股份有限公司 作为丙酮酸激酶(pkr)活化剂的吡咯并吡咯组合物
EP3639854A4 (en) 2017-06-16 2021-03-03 The Doshisha MTOR INHIBITIVE MEDICINAL PRODUCT FOR THE TREATMENT OR PREVENTION OF OPHTHALMIC SYMPTOMS, DISORDERS, OR DISEASES AND USE THEREOF
US20200386744A1 (en) * 2017-06-16 2020-12-10 The Doshisha Novel screening method for tgf-beta inhibitor
US20230055923A1 (en) 2018-09-19 2023-02-23 Forma Therapeutics, Inc. Activating pyruvate kinase r
US20200129485A1 (en) 2018-09-19 2020-04-30 Forma Therapeutics, Inc. Treating sickle cell disease with a pyruvate kinase r activating compound
CN111349616B (zh) * 2018-12-24 2022-11-08 北京复昇生物科技有限公司 一种筛选目标病毒相关宿主因子的方法及应用
CL2018003871A1 (es) * 2018-12-28 2021-01-15 Univ Pontificia Catolica Chile Anticuerpos monoclonales específicos para el antígeno pb2 del virus de la influenza humana (flu), secuencias nucleotídicas; método y kit de diagnóstico de infección producida por flu
CN109988762B (zh) * 2019-03-22 2020-07-28 江苏医药职业学院 降低PSMD12基因表达的siRNA、重组载体及其应用
CN110151765A (zh) * 2019-05-08 2019-08-23 武汉威立得生物医药有限公司 Azd1480在制备治疗流感病毒感染的药物中的应用
CN112481234B (zh) * 2020-12-03 2023-09-22 重庆工业职业技术学院 一种焦磷酸酶突变体合成核酸糖类似物及其应用
EP4015634A1 (en) * 2020-12-15 2022-06-22 Sylentis, S.A.U. Sirna and compositions for prophylactic and therapeutic treatment of virus diseases
CN114948918B (zh) * 2022-05-09 2023-06-23 中国人民解放军空军军医大学 蛋白激酶抑制剂用于制备抗汉滩病毒药物的应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070015172A1 (en) * 2005-06-01 2007-01-18 Z-Biomed, Inc. Expression profiles for microbial infection
WO2010134939A2 (en) * 2008-12-19 2010-11-25 Zirus, Inc. Mammalian genes involved in infection
KR20140056212A (ko) * 2011-06-14 2014-05-09 노파르티스 아게 골수성증식 신생물과 같은 암 치료에서의 파노비노스타트와 룩소리티닙의 조합물

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201002409D0 (en) * 2010-02-12 2010-03-31 Univ Nottingham Methods
WO2011109217A2 (en) * 2010-03-02 2011-09-09 Immunodiagnostics, Inc. Methods of treating or preventing rna polymerase dependent viral disorders by administration of jak2 kinase inhibitors
US9669049B2 (en) * 2010-10-31 2017-06-06 Tocagen Inc. Compositions comprising gamma retrovirus vectors and methods of treating proliferative disorders
GB201217892D0 (en) * 2012-10-05 2012-11-21 Virttu Biolog Ltd Treatment of cancer

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070015172A1 (en) * 2005-06-01 2007-01-18 Z-Biomed, Inc. Expression profiles for microbial infection
WO2010134939A2 (en) * 2008-12-19 2010-11-25 Zirus, Inc. Mammalian genes involved in infection
KR20140056212A (ko) * 2011-06-14 2014-05-09 노파르티스 아게 골수성증식 신생물과 같은 암 치료에서의 파노비노스타트와 룩소리티닙의 조합물

Non-Patent Citations (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Brass, et al., Cell, 2009, vol. 139, p. 1243 ∼ 1254.
Cell Host & Microbe. 2014. Vol.16, Issue 6, pp.795-805.* *
Hao, et al., Nature, 2008, vol. 454, p. 890 ∼ 893.
Karlas, et al., Nature, 2010, vol. 463, p. 818 ∼ 822.
Kawakami et al., Journal of Virological Methods, 2011, vol. 173, p. 1 ∼ 6.
Konig, et al., Nature, 2010, vol. 463, p. 813 ∼ 817.
Nature Reviews Drug Discovery. 2012. Vol.11, pp.103-104.* *
Neumann, et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1999, vol. 96, p. 9345 ∼ 9350.
Noda et al., Nature, 2006, vol. 439, p. 490 ∼ 492.
Octaviani et al., Journal of Virology, 2010, vol. 84, p. 10918 ∼ 10922.
Ozawa et al., Journal of General Virology, 2011, vol. 92, p. 2879 ∼ 2888.
Patterson et al., Journal of General Virology, 1979, vol. 43, p. 223 ∼ 229.
Shapira, et al., Cell, 2009, vol. 139, p. 1255 ∼ 1267.
Sui, et al., Virology, 2009, vol. 387, p. 473 ∼ 481.
Tobita, et al., Medical microbiology and immunology, 1975, vol. 162, p. 9 ∼ 14.
Widjaja et al., Journal of Virology, 2010, vol. 84, p. 9625 ∼ 9631.
Wishart et al., Nucleic Acids Research, 2006, vol. 34, p. D668 ∼ 672.

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20200077375A (ko) 2018-12-20 2020-06-30 엘지디스플레이 주식회사 발광 표시 장치

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