CN112481234B - 一种焦磷酸酶突变体合成核酸糖类似物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种高效的焦磷酸酶突变体合成核酸糖类似物及其应用，涉及分子生物学中糖工程技术领域。该高效的焦磷酸酶突变体合成核酸糖类似物，包括人源基因UAP1，其特征在于：所述人源基因UAP1的突变位点在于UAP1基因从5′端起第1147个核苷酸，突变结果为T到G,第1148个核苷酸，突变结果为T到G，所述人源基因UAP1编码蛋白为AGX1或者AGX2中的一种，是来源于哺乳动物的一种焦磷酸化酶，其可以识别1号位磷酸基团修饰的乙酰氨基半乳糖或乙酰胺基葡萄糖(1‑ph‑GalNAc或1‑ph‑GlcNAc)，利用三磷酸尿苷(UTP)作为底物，生成二磷酸尿嘧啶核苷‑N‑乙酰半乳糖胺或者葡萄糖胺(UDP‑GalNAc或者UDP‑GlcNAc)。本发明使得叠氮或者炔基修饰的UDP‑Sugar的合成效率大大提高，且大大简化了合成造作的流程。

Description

一种焦磷酸酶突变体合成核酸糖类似物及其应用
技术领域
本发明涉及分子生物学中糖工程技术领域，具体为一种焦磷酸酶突变体合成核酸糖类似物及其应用。
背景技术
碳水化合物在许多生理过程中具有重要的结构和功能作用，包括生物体的发育，生长，功能和生存。许多碳水化合物由于其潜在的医学应用，从而极大地吸引了科学家的注意力，例如α-Gal表位，LewisX和细菌及其衍生物的其他糖抗原等。糖基转移酶已被用于这些重要碳水化合物的酶法合成，与传统的化学合成相比，糖基转移酶的主要优点是在不需要官能团保护的情况下具有区域选择性和立体选择性。核苷酸糖是糖基转移酶进行糖基化反应的通用供体。它们可以被看作是糖分子的活化形式，通过糖基转移酶被添加到寡糖的非还原端。在真核细胞中,只有十种核酸糖，最为常见的是UDP-GlcNAc、UDP-GalNAc、CMP-Sia等。
多糖的酶法合成逐渐成为人工获取复杂多糖的主要方式，高效快捷地生产众多糖基转移酶的供体单糖显得尤为重要，尤其是利用率高的UDP-GlcNAc、UDP-GalNAc两种天然的核酸糖或其叠氮或炔基修饰的类似物，现有的方法是首先利用来源于长双歧杆菌的单糖磷酸激酶NahK生成1号位磷酸修饰的单糖(1-ph-sugar)，再进行AGX1的催化可以获得UDP-Sugar。该方法可以高效地合成天然的UDP-Sugar，但是叠氮或者炔基修饰的UDP-Sugar的合成效率低下，不能满足复杂多糖合成或者化学酶法技术的原料需求。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种焦磷酸酶突变体合成核酸糖类似物及其应用，解决了叠氮或者炔基修饰的UDP-Sugar的合成效率低下的问题。
(二)技术方案
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种焦磷酸酶突变体合成核酸糖类似物，包括人源基因UAP1，其特征在于：所述人源基因UAP1的突变位点在于UAP1基因从5′端起第1147个核苷酸，突变结果为T到G,第1148个核苷酸，突变结果为T到G，所述人源基因UAP1编码蛋白为AGX1或者AGX2中的一种，是来源于哺乳动物的一种焦磷酸化酶，其可以识别1号位磷酸基团修饰的乙酰氨基半乳糖或乙酰胺基葡萄糖(1-ph-GalNAc或1-ph-GlcNAc)，利用三磷酸尿苷(UTP)作为底物，生成二磷酸尿嘧啶核苷-N-乙酰半乳糖胺或者葡萄糖胺(UDP-GalNAc或者UDP-GlcNAc)，所述人源基因UAP1的突变引物为SEQNO:2、SEQNO:3以及与SEQNO:2和SEQNO:3互补的核苷酸。
优选的，所述突变引物SEQNO:2GATGGAAAAATTTGTCGGTGACATCTTCC为特异扩增人源的UAP1突变基因的上游引物；SEQNO:3CCGACAAATTTTTCCATCTTTATTCCATTGGGT为人源的UAP1突变基因的下游引物。
优选的，以人源基因UAP1编码蛋白为AGX1为例，蛋白AGX1氨基酸突变位点第383个氨基酸，突变结果是由Phenylalanine到Glycine。
优选的，人源基因UAP1的突变方法如下：
步骤一：将带有未突变的人源的UAP1基因的pET-28a质粒从大肠杆菌中提取后，进行测序确认质粒载体构建成功；
步骤二：通过FastMutagenesisSystem完成突变
1).聚合酶链式反应(PCR)：将引物依照标注的浓度用ddH2O稀释，利用快速突变试剂盒进行突变，反应体系50μL，打开PCR仪，设置各个阶段的温度和时间；
2).PCR产物的验证：利用快速PCR产物回收试剂盒进行PCR产物回收，并进行DNA浓度测定；
3).消化取出10μL突变产物中加入0.5μLDMT酶，用移液枪吹打混匀，将混合物于37℃恒温消化0.5h；
步骤三：突变后的人源的UAP1基因导入DMT感受态细胞中，然后过夜培养该菌种，第二天取突变的菌液进行测序。测序使用的引物为T7和T7-Term。测序结果与NCBI数据库提供的人源的UAP1基因比对，得到的突变位点；
步骤四：突变后的人源的UAP1基因的表达与纯化
1).使用快速质粒小提试剂盒将含有突变后的人源的UAP1基因的质粒的提取后，将其转化到Transetta感受态细胞中，依次进行卡那霉素抗性固体培养基中涂布，37℃恒温培养16小时
2).挑取单菌落活化于含30μg/mL的卡那霉素的8mLLB液体培养基中，37℃，220r/min培养12h后，重新接种扩大到500mL培养基(37℃，220r/min培养约3h)，待菌液OD600值达到0.8，加入0.1mmol/LIPTG，诱导蛋白的表达(16℃，180r/min)，诱导24h后，6000r/min离心8min收集菌体，PBS预洗1次后，加入50mLPBS充分悬浮菌体，在冰水浴条件下超声破碎菌体(160W，工作4s，间歇4s，25min)，然后4℃、13000r/min离心20min。收集上清，将上清液用0.45μm滤膜过滤后，使用预装Ni-NTA填料柱子进行纯化，首先进行柱结合过程，再依次用10mmol/L，30mmol/L，50mmol/L咪唑溶液梯度洗脱镍柱，去掉杂蛋白，最后用250mmol/L的咪唑溶液洗脱镍柱，并收集洗脱的溶液即目的蛋白溶液；
3).使用12％SDS-PAGE检测蛋白质，收集较浓的蛋白溶液混合后，使用30K的超滤膜超滤后进行BCA定量。
高效的焦磷酸酶突变体合成核酸糖类似物在UDP-Sugar类似物合成、两步酶法合成克级UDP-Sugar及其类似物和一锅酶法大量合成UDP-Sugar类似物中的应用，其具体的应用方法如下：
(1)：UDP-Sugar类似物合成
(a)小体系酶促反应
反应为体系30ul，包含pH＝8.0Tris-HCl(100mM),MgCl2(10mM),1-ph-GalNAz、1-ph-GalNAlk或1-ph-GlcNAz、1-ph-GlcNAlk(10mM),AGX1或者AGX1-F383G(0.2mg/ml),UTP(10mM),用去离子水补齐，37℃水浴条件下反应30分钟，95摄氏度加热2分钟终止反应，再进行TL C层析，展开剂为正丁醇：乙酸：水＝2:1:1，利用茴香醛染色观察；
(b)HPLC定量
HPLC检测，利用UDP-GlcNAlk的合成进行举例，流动相为A相(pH为6.4，含100mM磷酸二氢钾CAS7778-77-0，8mM四丁基硫酸氢铵CAS32503-27-8),B相(乙腈中含70％A相溶液)，检测波长为254nm，色谱柱为ACEC18-PFP3.6μm,250×4.6mm,流动相时间梯度为0-35min A相100％；35-60minA相100％-60％；UDP-GlcNAlk在39.5分钟出峰；
(b)利用标准曲线进行定量分析，然后计算合成速率，利用Gr aFitVersion把数据拟合到Michaelis-Menten方程中，发现AGX1-F383G催化效率提高的倍数；
(2)：两步酶法合成克级UDP-Sugar及其类似物，克级的反应以GlcNAlk为例：
a).首先进行1-ph-糖的合成反应，体系中包含pH＝8.0Tris-HCl(100mM)、MgCl2(10mM)、GlcNAlk(100mM)、ATP(125mM)、NahK(适量)，37摄氏度，110转/每分钟的条件下反应24h，每6h取样一次，利用TLC进行检测，展开剂为正丁醇：乙酸：水＝2:1:1，利用茴香醛染色观察，取反应后的溶液，加入同等体积的甲醇进行蛋白的沉淀，然后利用0.45uM的滤膜进行过滤或者利用高速离心的方式(10000gX20分钟)取上清液，除掉蛋白，最后进行低压旋干；
b).用适量水重溶上步旋干的粗产物，加入到二氯甲烷预装硅胶柱中，用二氯甲烷：甲醇(9:1)溶剂进行冲洗柱子，再用二氯甲烷：甲醇(7:3)溶剂冲洗1.5个柱体积，继续用二氯甲烷：甲醇(1:1)的溶剂冲洗1.5个柱体积，此时会有未反应完全的GlcNAc或GalNAc及其类似物出现，然后再用二氯甲烷：甲醇(3:7)的溶剂冲洗1.5个柱体积，此时会出现产物1-磷酸-糖，再继续用甲醇冲洗柱子，后期会有未反应完全的ATP或者副产物ADP产生，利用TLC进行分析，收集纯度高的流分，进行旋干；
c).称重1-ph-GlcNAc或GalNAc及其类似物，按UTP(5-三磷酸尿苷)：1-ph-Sugar(1.25:1)比例进行投料反应，溶液中并包含pH＝8.0Tris-HCl(100mM)，MgCl2(10mM)，AGX1-F383G(适量)，37摄氏度，110转/每分钟的条件下反应24h，每3h取样一次，利用TLC进行检测，展开剂为正丁醇：乙酸：水＝2:1:1，利用茴香醛染色观察，取12h反应后的溶液，加入同等体积的甲醇进行蛋白的沉淀，然后利用0.45uM的滤膜进行过滤或者利用高速离心的方式(10000gX20分钟)取上清液，除掉蛋白，最后进行低压旋干；
d).用适量水重溶上步旋干的粗产物，加入到分子筛中，以水为洗脱剂，2mL/min的流速进行洗脱，利用分子量差异进行分离，分子量最大的UDP-sugar会优先流出，最后用TLC进行检测，展开剂为正丁醇：乙酸：水＝2:1:1，利用茴香醛染色观察，选择纯度高的组分进行冻干，称重；
(3).一锅酶法大量合成UDP-Sugar类似物
(a)反应体系，以UDP-GlcNAlk为例，其他组分相同,反应为体系50mL，包含pH＝8.0Tris-HCl(100mM)、MgCl2(10mM)、GlcNAlk(100mM)、ATP(125mM)、UTP(125mM)、NahK(4mg)、AGX1-F383G(4mg)，37摄氏度，110转/每分钟的条件下反应24h，每6h取样一次，利用TL C进行检测，展开剂为正丁醇：乙酸：水＝2:1:1，利用茴香醛染色观察，当原料GlcNAlk反应消耗完成后，加入50mL甲醇终止反应；
(b)纯化操作取上步操作的溶液进行4000g离心，时间20分钟，取上清液进行旋干处理，用5mL去离子水重溶，利用分子筛进行分离，流动相为去离子水,UDP-GlcNAlk最先流出，TLC鉴定纯度后，进行旋干或者冻干即可。
(三)有益效果
本发明提供了一种焦磷酸酶突变体合成核酸糖类似物及其应用。
具备以下有益效果：
1、本发明通过HPLC检测了野生型和突变体AGX1催化1-ph-Gal NAc和1-ph-GlcNAc类似物的效率，并通过对两个酶的动力学参数的测定，从数据中得到改造型酶AGX1-F383G催化1-ph-GlcNAlk的效率提升15倍左右，使得合成效率更快。
2、本发明采用一锅双酶的方法，简化中间复杂的纯化操作，一次简易纯化操作就可以实现克级的UDP-sugar类似物的合成，大大提高了合成效率降低合成成本。
附图说明
图1为本发明快速定点突变反应体系的组成表；
图2为本发明PCR各个阶段的温度与时间表；
图3为本发明两步酶法合成克级UDP-Sugar及其类似物的操作流程图；
图4为本发明突变UAP1基因测序后和未突变UAP1氨基酸序列比对图；
图5为本发明野生型AGX1和突变蛋白AGX1-F383G的SDS-PAGE蛋白纯化结果图；
图6为本发明TLC检测结果图；
图7为AGX1和突变体AGX1-F383G酶活常数测定图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例：
如图1-7所示，本发明实施例提供一种焦磷酸酶突变体合成核酸糖类似物，包括人源基因UAP1，人源基因UAP1的突变位点在于UAP1基因从5′端起第1147个核苷酸，突变结果为T到G,第1148个核苷酸，突变结果为T到G，人源基因UAP1编码蛋白为AGX1或者AGX2中的一种，是来源于哺乳动物的一种焦磷酸化酶，其可以识别1号位磷酸基团修饰的乙酰氨基半乳糖或乙酰胺基葡萄糖(1-ph-GalNAc或1-ph-GlcNAc)，利用三磷酸尿苷(UTP)作为底物，生成二磷酸尿嘧啶核苷-N-乙酰半乳糖胺或者葡萄糖胺(UDP-GalNAc或者UDP-GlcNA c)，人源基因UAP1的突变引物为SEQNO:2、SEQNO:3以及与SEQNO:2和SEQNO:3互补的核苷酸。
突变引物SEQNO:2GATGGAAAAATTTGTCGGTGACATCTTCC为特异扩增人源的UAP1突变基因的上游引物；SEQNO:3CCGACAAATTTTTCCATCTTTATTCCATTGGGT为人源的UAP1突变基因的下游引物。
以人源基因UAP1编码蛋白为AGX1为例，蛋白AGX1氨基酸突变位点第383个氨基酸，突变结果是由Phenylalanine到Glycine。
人源基因UAP1的突变方法如下：
步骤一：将带有未突变的人源的UAP1基因的pET-28a质粒从大肠杆菌中提取后，进行测序确认质粒载体构建成功；
步骤二：通过FastMutagenesisSystem完成突变
1).聚合酶链式反应(PCR)：将引物依照标注的浓度用ddH2O稀释，利用快速突变试剂盒进行突变，反应体系50μL，打开PCR仪，设置各个阶段的温度和时间；
2).PCR产物的验证：利用快速PCR产物回收试剂盒进行PCR产物回收，并进行DNA浓度测定；
3).消化取出10μL突变产物中加入0.5μLDMT酶，用移液枪吹打混匀，将混合物于37℃恒温消化0.5h；
步骤三：突变后的人源的UAP1基因导入DMT感受态细胞中，然后过夜培养该菌种，第二天取突变的菌液进行测序。测序使用的引物为T7和T7-Term。测序结果与NCBI数据库提供的人源的UAP1基因比对，得到的突变位点；
步骤四：突变后的人源的UAP1基因的表达与纯化
1).使用快速质粒小提试剂盒将含有突变后的人源的UAP1基因的质粒的提取后，将其转化到Transetta感受态细胞中，依次进行卡那霉素抗性固体培养基中涂布，37℃恒温培养16小时；
2).挑取单菌落活化于含30μg/mL的卡那霉素的8mLLB液体培养基中，37℃，220r/min培养12h后，重新接种扩大到500mL培养基(37℃，220r/min培养约3h)，待菌液OD600值达到0.8，加入0.1mmol/LIPTG，诱导蛋白的表达(16℃，180r/min)，诱导24h后，6000r/min离心8min收集菌体，PBS预洗1次后，加入50mLPBS充分悬浮菌体，在冰水浴条件下超声破碎菌体(160W，工作4s，间歇4s，25min)，然后4℃、13000r/min离心20min。收集上清，将上清液用0.45μm滤膜过滤后，使用预装Ni-NTA填料柱子进行纯化，首先进行柱结合过程，再依次用10mmol/L，30mmol/L，50mmol/L咪唑溶液梯度洗脱镍柱，去掉杂蛋白，最后用250mmol/L的咪唑溶液洗脱镍柱，并收集洗脱的溶液即目的蛋白溶液；
3).使用12％SDS-PAGE检测蛋白质，收集较浓的蛋白溶液混合后，使用30K的超滤膜超滤后进行BCA定量。
高效的焦磷酸酶突变体合成核酸糖类似物在UDP-Sugar类似物合成、两步酶法合成克级UDP-Sugar及其类似物和一锅酶法大量合成UDP-Sugar类似物中的应用，其具体的应用方法如下：
(1)：UDP-Sugar类似物合成
(a)小体系酶促反应
反应为体系30ul，包含pH＝8.0Tris-HCl(100mM),MgCl2(10mM),1-ph-GalNAz、1-ph-GalNAlk或1-ph-GlcNAz、1-ph-GlcNAlk(10mM),AGX1或者AGX1-F383G(0.2mg/ml),UTP(10mM),用去离子水补齐，37℃水浴条件下反应30分钟，95摄氏度加热2分钟终止反应，再进行TL C层析，展开剂为正丁醇：乙酸：水＝2:1:1，利用茴香醛染色观察；
(b)HPLC定量
HPLC检测，利用UDP-GlcNAlk的合成进行举例，流动相为A相(pH为6.4，含100mM磷酸二氢钾CAS7778-77-0，8mM四丁基硫酸氢铵CAS32503-27-8),B相(乙腈中含70％A相溶液)，检测波长为254nm，色谱柱为ACEC18-PFP3.6μm,250×4.6mm,流动相时间梯度为0-35min A相100％；35-60minA相100％-60％；UDP-GlcNAlk在39.5分钟出峰；
(b)利用标准曲线进行定量分析，然后计算合成速率，利用Gr aFitVersion把数据拟合到Michaelis-Menten方程中，发现AGX1-F383G催化效率提高的倍数；
(2)：两步酶法合成克级UDP-Sugar及其类似物，克级的反应以GlcNAlk为例：
a).首先进行1-ph-糖的合成反应，体系中包含pH＝8.0Tris-HCl(100mM)、MgCl2(10mM)、GlcNAlk(100mM)、ATP(125mM)、NahK(适量)，37摄氏度，110转/每分钟的条件下反应24h，每6h取样一次，利用TLC进行检测，展开剂为正丁醇：乙酸：水＝2:1:1，利用茴香醛染色观察，取反应后的溶液，加入同等体积的甲醇进行蛋白的沉淀，然后利用0.45uM的滤膜进行过滤或者利用高速离心的方式(10000gX20分钟)取上清液，除掉蛋白，最后进行低压旋干；
b).用适量水重溶上步旋干的粗产物，加入到二氯甲烷预装硅胶柱中，用二氯甲烷：甲醇(9:1)溶剂进行冲洗柱子，再用二氯甲烷：甲醇(7:3)溶剂冲洗1.5个柱体积，继续用二氯甲烷：甲醇(1:1)的溶剂冲洗1.5个柱体积，此时会有未反应完全的GlcNAc或GalNAc及其类似物出现，然后再用二氯甲烷：甲醇(3:7)的溶剂冲洗1.5个柱体积，此时会出现产物1-磷酸-糖，再继续用甲醇冲洗柱子，后期会有未反应完全的ATP或者副产物ADP产生，利用TLC进行分析，收集纯度高的流分，进行旋干；
c).称重1-ph-GlcNAc或GalNAc及其类似物，按UTP(5-三磷酸尿苷)：1-ph-Sugar(1.25:1)比例进行投料反应，溶液中并包含pH＝8.0Tris-HCl(100mM)，MgCl2(10mM)，AGX1-F383G，37摄氏度，110转/每分钟的条件下反应24h，每3h取样一次，利用TLC进行检测，展开剂为正丁醇：乙酸：水＝2:1:1，利用茴香醛染色观察，取12h反应后的溶液，加入同等体积的甲醇进行蛋白的沉淀，然后利用0.45uM的滤膜进行过滤或者利用高速离心的方式(10000gX20分钟)取上清液，除掉蛋白，最后进行低压旋干。
d).用适量水重溶上步旋干的粗产物，加入到分子筛中，以水为洗脱剂，2mL/min的流速进行洗脱，利用分子量差异进行分离，分子量最大的UDP-sugar会优先流出，最后用TLC进行检测，展开剂为正丁醇：乙酸：水＝2:1:1，利用茴香醛染色观察，选择纯度高的组分进行冻干，称重；
(3).一锅酶法大量合成UDP-Sugar类似物
(a)反应体系，以UDP-GlcNAlk为例，其他组分相同,反应为体系50mL，包含pH＝8.0Tris-HCl(100mM)、MgCl2(10mM)、GlcNAlk(100mM)、ATP(125mM)、UTP(125mM)、NahK(4mg)、AGX1-F383G(4mg)，37摄氏度，110转/每分钟的条件下反应24h，每6h取样一次，利用TL C进行检测，展开剂为正丁醇：乙酸：水＝2:1:1，利用茴香醛染色观察，当原料GlcNAlk反应消耗完成后，加入50mL甲醇终止反应；
(b)纯化操作取上步操作的溶液进行4000g离心，时间20分钟，取上清液进行旋干处理，用5mL去离子水重溶，利用分子筛进行分离，流动相为去离子水,UDP-GlcNAlk最先流出，TLC鉴定纯度后，进行旋干或者冻干即可。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (3)

1.一种焦磷酸酶突变体，为人源基因UAP1突变基因编码得到，其特征在于：所述人源基因UAP1的突变位点在于UAP1基因从5′端起第1147个核苷酸，突变结果为T到G,第1148个核苷酸，突变结果为T到G，所述人源基因UAP1编码蛋白为AGX1，是来源于哺乳动物的一种焦磷酸化酶，其可以识别1号位磷酸基团修饰的乙酰氨基半乳糖或乙酰胺基葡萄糖即1-ph-GalNAc或1-ph-Gl cNAc，利用三磷酸尿苷UTP作为底物，生成二磷酸尿嘧啶核苷-N-乙酰半乳糖胺或者葡萄糖胺即UDP-GalNAc或者UDP-GlcNAc，所述人源基因UAP1的突变引物为SEQID NO:2、SEQ ID NO:3以及与SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3互补的核苷酸；
所述突变引物SEQ ID NO:2GATGGAAAAATTTGTCGGTGACATCTTCC为特异扩增人源的UAP1突变基因的上游引物；SEQ ID NO:3CCGACA AATTTTTCCATCTTTATTCCATTGGGT为人源的UAP1突变基因的下游引物。
2.根据权利要求1所述的一种焦磷酸酶突变体，其特征在于：人源基因UAP1的突变方法如下：
步骤一：将带有未突变的人源的UAP1基因的pET-28a质粒从大肠杆菌中提取后，进行测序确认质粒载体构建成功；
步骤二：通过FastMutagenesisSystem完成突变
1).聚合酶链式反应PCR：将引物依照标注的浓度用ddH2O稀释，利用快速突变试剂盒进行突变，反应体系50μL，打开PCR仪，设置各个阶段的温度和时间
2).PCR产物的验证：利用快速PCR产物回收试剂盒进行PCR产物回收，并进行DNA浓度测定
3).消化取出10μL突变产物中加入0.5μL DMT酶，用移液枪吹打混匀，将混合物于37℃恒温消化0.5h；
步骤三：突变后的人源的UAP1基因导入DMT感受态细胞中，然后过夜培养该细胞，第二天取突变的菌液进行测序，测序使用的引物为T7和T7-Term，测序结果与NCBI数据库提供的人源的UAP1基因比对，得到的突变位点；
步骤四：突变后的人源的UAP1基因的表达与纯化
1).使用快速质粒小提试剂盒将含有突变后的人源的UAP1基因的质粒的提取后，将其转化到Transetta感受态细胞中，依次进行卡那霉素抗性固体培养基中涂布，37℃恒温培养16小时；
2).挑取单菌落活化于含30μg/mL的卡那霉素的8mLLB液体培养基中，37℃，220r/min培养12h后，重新接种扩大到500mL培养基，37℃，220r/min培养3h，待菌液OD600值达到0.8，加入0.1mmol/LIPTG，诱导蛋白的表达，16℃，180r/min，诱导24h后，6000r/min离心8min收集菌体，PBS预洗1次后，加入50mLPBS充分悬浮菌体，在冰水浴条件下超声破碎菌体，160W，工作4s，间歇4s，25min，然后4℃、13000r/min离心20min，收集上清，将上清液用0.45μm滤膜过滤后，使用预装Ni-NTA填料柱子进行纯化，首先进行柱结合过程，再依次用10mmol/L，30mmol/L，50mmol/L咪唑溶液梯度洗脱镍柱，去掉杂蛋白，最后用250mmol/L的咪唑溶液洗脱镍柱，并收集洗脱的溶液即目的蛋白溶液；
3).使用12％SDS-PAGE检测蛋白质，收集较浓的蛋白溶液混合后，使用30K的超滤膜超滤后进行BCA定量。
3.如权利要求1-2任意一项所述的焦磷酸酶突变体在UDP-Sugar类似物合成、两步酶法合成克级UDP-Sugar及其类似物和一锅酶法大量合成UDP-Sugar类似物中的应用，其具体的应用方法如下：
(1)：UDP-Sugar类似物合成
(a)小体系酶促反应
反应为体系30ul，包含100mM pH＝8.0Tris-HCl,10mM MgCl 2,10mM1-ph-GalNAz、1-ph-GalNAlk或1-ph-GlcNAz、1-ph-GlcNAlk,0.2mg/m l AGX1或者AGX1-F383G，10mM UTP,用去离子水补齐，37℃水浴条件下反应30分钟，95摄氏度加热2分钟终止反应，再进行TLC层析，展开剂为正丁醇：乙酸：水＝2:1:1，利用茴香醛染色观察；
(b)HPLC定量
HPLC检测，利用UDP-GlcNAlk的合成进行举例，流动相为A相：pH为6.4，含100mM磷酸二氢钾CAS7778-77-0，8mM四丁基硫酸氢铵CAS32503-27-8,B相：乙腈中含70％A相溶液，检测波长为254nm，色谱柱为ACEC18-PFP3.6μm,250×4.6mm,流动相时间梯度为0-35minA相100％；35-60minA相100％-60％；UDP-GlcNAlk在39.5分钟出峰；
(b)利用标准曲线进行定量分析，然后计算合成速率，利用Gr aFitVersion把数据拟合到Michaelis-Menten方程中，发现AGX1-F383G催化效率提高的倍数；
(2)：两步酶法合成克级UDP-Sugar及其类似物，克级的反应以GlcNAlk为例：
a).首先进行1-ph-糖的合成反应，体系中包含100mM pH＝8.0Tris-HCl，10mM MgCl 2，100mM GlcNAlk，125mM ATP，NahK，37摄氏度，110转/每分钟的条件下反应24h，每6h取样一次，利用TLC进行检测，展开剂为正丁醇：乙酸：水＝2:1:1，利用茴香醛染色观察，取反应后的溶液，加入同等体积的甲醇进行蛋白的沉淀，然后利用0.45uM的滤膜进行过滤或者利用高速离心的方式，即10000g离心20分钟，取上清液，除掉蛋白，最后进行低压旋干；
b).用适量水重溶上步旋干的粗产物，加入到二氯甲烷预装硅胶柱中，用二氯甲烷：甲醇＝9:1的溶剂进行冲洗柱子，再用二氯甲烷：甲醇＝7:3的溶剂冲洗1.5个柱体积，继续用二氯甲烷：甲醇＝1:1的溶剂冲洗1.5个柱体积，此时会有未反应完全的GlcNAc或GalNAc及其类似物出现，然后再用二氯甲烷：甲醇＝3:7的溶剂冲洗1.5个柱体积，此时会出现产物1-磷酸-糖，再继续用甲醇冲洗柱子，后期会有未反应完全的ATP或者副产物ADP产生，利用TLC进行分析，收集纯度高的流分，进行旋干；
c).称重1-ph-GlcNAc或GalNAc及其类似物，按UTP即5-三磷酸尿苷：1-ph-Sugar＝1.25:1比例进行投料反应，溶液中并包含100mM pH＝8.0Tris-HCl，10mM MgCl 2，AGX1-F383G，37摄氏度，110转/每分钟的条件下反应24h，每3h取样一次，利用TLC进行检测，展开剂为正丁醇：乙酸：水＝2:1:1，利用茴香醛染色观察，取12h反应后的溶液，加入同等体积的甲醇进行蛋白的沉淀，然后利用0.45uM的滤膜进行过滤或者利用高速离心的方式，10000g离心20分钟，取上清液，除掉蛋白，最后进行低压旋干；
d).用适量水重溶上步旋干的粗产物，加入到分子筛中，以水为洗脱剂，2mL/min的流速进行洗脱，利用分子量差异进行分离，分子量最大的UDP-sugar会优先流出，最后用TLC进行检测，展开剂为正丁醇：乙酸：水＝2:1:1，利用茴香醛染色观察，选择纯度高的组分进行冻干，称重；
(3).一锅酶法大量合成UDP-Sugar类似物
(a)反应体系，以UDP-GlcNAlk为例，其他组分相同,反应为体系50mL，包含100mM pH＝8.0Tris-HCl，10mM MgCl 2，100mM GlcNA lk，125mM ATP，215mM UTP，4mg NahK，4mg AGX1-F383G，37摄氏度，110转/每分钟的条件下反应24h，每6h取样一次，利用TLC进行检测，展开剂为正丁醇：乙酸：水＝2:1:1，利用茴香醛染色观察，当原料GlcNAlk反应消耗完成后，加入50mL甲醇终止反应；
(b)纯化操作取上步操作的溶液进行4000g离心，时间20分钟，取上清液进行旋干处理，用5mL去离子水重溶，利用分子筛进行分离，流动相为去离子水,UDP-GlcNAlk最先流出，TLC鉴定纯度后，进行旋干或者冻干即可。
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