EA030808B1 - ПРИМЕНЕНИЕ 1-ЭТИЛ-7-(2-МЕТИЛ-6-(1Н-1,2,4-ТРИАЗОЛ-3-ИЛ)ПИРИДИН-3-ИЛ)-3,4-ДИГИДРОПИРАЗИНО[2,3-b]ПИРАЗИН-2(1Н)-ОНА В ЛЕЧЕНИИ МУЛЬТИФОРМНОЙ ГЛИОБЛАСТОМЫ - Google Patents

Abstract

В описании представлены способы лечения или профилактики мультиформной глиобластомы (GBM), отличающейся экспрессией О-метилгуанин-ДНК метилтрансферазы (MGMT) и/или статусом метилирования промотора MGMT, включающие введение эффективного количества 1-этил-7-(2-метил-6-(1Н-1,2,4-триазол-3-ил)пиридин-3-ил)-3,4-дигидропиразино[2,3-b]пиразин-2(1Н)-она или его фармацевтически приемлемой соли, стереоизомера или таутомера пациенту.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

В настоящем описании представлены способы лечения или профилактики мультиформной глиобластомы (GBM), отличающейся экспрессией О⁶-метилгуанин-ДНК метилтрансферазы (MGMT) и/или статусом метилирования промотора MGMT, включающие введение эффективного количества дигидропиразино-пиразинового соединения, представляющего собой 1-этил-7-(2-метил-6-(1Н-1,2,4-триазол-3ил)пиридин-3-ил)-3,4-дигидропиразино[2,3-Ъ]пиразин-2(1Н)-он или его фармацевтически приемлемую соль, стереоизомер или таутомер, больному мультиформной глиобластомой (GBM), отличающейся экспрессией О⁶-метилгуанин-ДНК метилтрансферазы (MGMT) и/или статусом метилирования промотора MGMT.

Уровень техники

Связь между патологическим фосфорилированием белка и причиной или последующими заболеваниями известна более 20 лет. Таким образом, протеинкиназы стали крайне важной мишеневой группой для лекарственных средств. См. Cohen, Nature, 1: 309-315 (2002). Различные ингибиторы протеинкиназ используются в клинической практике для лечения широкого спектра заболеваний, таких как злокачественные опухоли и хронические воспалительные заболевания, в том числе диабет и инсульт. См. Cohen, Eur. J. Biochem., 268: 5001-5010 (2001), Protein Kinase Inhibitors for the Treatment of Disease: The Promise and the Problems, Handbook of Experimental Pharmacology, Springer Berlin Heidelberg, 167 (2005).

Протеинкиназы представляют собой большое и разнообразное семейство ферментов, которые катализируют фосфорилирование белков и играют основную роль в клеточной сигнализации. Протеинкиназы могут оказывать положительные или отрицательные регуляторные эффекты, в зависимости от их белкамишени. Протеинкиназы вовлечены в специфические сигнальные пути, которые регулируют функции клеток, такие как, но ими не ограничиваясь, метаболизм, клеточный цикл, клеточная адгезия, функция сосудов, апоптоз и ангиогенез. Нарушение функции клеточной сигнализации связано с большим числом заболеваний, наиболее характерные из которых включают злокачественные опухоли и диабет. Регуляция передачи сигнала цитокинами и связь сигнальных молекул с протоонкогенами и супрессорами опухолевых генов подробно описано в документах. Аналогично, была показана связь между диабетом и связанными состояниями и уровнями протеинкиназ с нарушенной регуляцией. См., например, Sridhar et al. Pharmaceutical Research, 17 (11): 1345-1353 (2000). Вирусные инфекции и состояния, относящиеся к ним, также связаны с регуляцией протеинкиназ. Park et al. Cell 101 (7): 777-787 (2000).

В результате того, что протеинкиназы регулируют практически каждый клеточный процесс, в том числе метаболизм, клеточную пролиферацию, клеточную дифференциацию и клеточную выживаемость, они являются привлекательными мишенями для терапевтического вмешательства при различных патологических состояниях. Например, контроль клеточного цикла и ангиогенез, при котором протеинкиназы играют основную роль, являются клеточными процессами, связанными с многочисленными патологическими состояниями, такими как, но ими не ограничиваясь, злокачественные опухоли, воспалительные заболевания, патологический ангиогенез и заболевания, относящиеся к ним, атеросклероз, дегенерация желтого пятна, диабет, ожирение и боль.

Протеинкиназы стали привлекательными мишенями для лечения злокачественных опухолей. Fabbro et al., Pharmacology & Therapeutics 93: 79-98 (2002). Было сделано предположение, что вовлечение протеинкиназ в развитие злокачественных опухолей у человека может возникать в результате: (1) геномных перестроек (например, BCR-ABL при хроническом миелолейкозе), (2) мутаций, приводящих к активности конститутивно-активной киназы, например острый миелобластный лейкоз и желудочно-кишечные опухоли, (3) нарушенной регуляции киназной активности путем активации онкогенов или потери супрессорной опухолевой функций, например, при онкологических опухолях с онкогенным RAS, (4) нарушенной регуляции киназной активности при сверхэкспрессии, как в случае EGFR, и (5) эктопической экспрессии факторов роста, которые могут внести вклад в развитие и поддержание неопластического фенотипа. Fabbro et al., Pharmacology & Therapeutics 93: 79-98 (2002).

Выяснение сложности протеинкиназных путей и комплексности отношений и взаимодействия среди и между различными протеинкиназами и путями киназ подчеркивает важность разработки фармацевтических агентов, способных действовать в качестве модуляторов протеинкиназ, регуляторов или ингибиторов, которые имеют полезную активность в отношении множества киназ или множественных киназных путей. Соответственно, остается потребность в новых модуляторах киназ.

Белок, названный mTOR (мишень рапамицина млекопитающих), который также называют FRAP, RAFTI или RAPT1), представляет собой Ser/Thr-протеинкиназу из 2549 аминокислот, которая, как было показано, является одним из наиболее важных белков в пути MTOR/PI3K/Akt, который регулирует рост и пролиферацию клеток. Georgakis and Younes Expert Rev. Anticancer Ther. 6(1): 131-140 (2006). mTOR существует в двух комплексах, mTORC1 и mTORC2. В то время как mTORC1 чувствителен к аналогам рапамицина (например, темсиролимус или эверолимус), mTORC2 в значительной степени не чувствителен к рапамицину. Примечательно, что рапамицин не является ингибитором киназы ТОР. Несколько ин- 1 030808

гибиторов mTOR уже были оценены в клинических исследованиях для лечения рака или оцениваются в настоящее время. В 2007 году темсиролимус был одобрен для использования при почечно-клеточной карциноме, а в 1999 году сиролимус был одобрен для профилактики отторжения трансплантата почек. В 2009 году эверолимус был одобрен для лечения больных почечной карциномой, которые показали прогресс при лечении ингибиторами рецепторов фактора роста эндотелия сосудов, в 2010 г. для больных туберозным склерозом (TS), связанным с субэпендимальными гигантскими клетками астроцитомы (SEGA), которым требуется терапия, но которые не являются кандидатами для хирургического удаления, и в 2011 году - для прогрессивных нейроэндокринных опухолей с панкреатическим происхождением (PNET) у больных с неоперабельным, местно-распространенным или метастатическим раком. Остается потребность в дополнительных ингибиторах киназы TOR.

ДНК-зависимая протеинкиназа (ДНК-РК) представляет собой серин/треонинкиназу, участвующую в восстановлении двунитевых разрывов ДНК (DSB). DSB считаются наиболее смертоносным повреждением ДНК, и они происходят эндогенно или в ответ на ионизирующее излучение и химиотерапевтические препараты (для обзора см. Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature Rev 2009; 461:1071-1078) . Если DSB не устраняются, то это приводит к остановке клеточного цикла и/или клеточной смерти (Hoeijmakers, J. H. J. Genome maintenance mechanisms for preventing cancer. Nature 2001; 411: 366-374; van Gent, D. C, Hoeijmakers, J. H., Kanaar, R. Chromosomal stability and the DNA double-stranded break connection. Nat Rev Genet 2001; 2: 196-206). В ответ на повреждение клетки разработали сложные механизмы восстановления таких разрывов, и эти механизмы могут служить основой для устойчивости к действию терапевтических средств. Есть два основных пути, которые используются для восстановления DSB - присоединение негомологичных концов (NHEJ) и гомологичная рекомбинация (HR). При NHEJ происходит контакт разрушенных концов ДНК и повторное их соединение независимо от второй матрицы (Collis, S. J., DeWeese, Т. L., Jeggo P. A., Parker, A.R. The life and death of DNA-PK. Oncogene 2005; 24: 949-961). Напротив, HR зависит от близости сестринских хроматид, что обеспечивает матрицу для опосредования правильного восстановления (Takata, M., Sasaki, M.S., Sonoda, E., Morrison, С, Hashimoto M., Utsumi H., et al. Homologous recombination and non-homologous end-joining pathways of DNA double-strand break repair have overlapping roles in the maintenance of chromosomal integrity in vertebrate cells. EMBO J 1998; 17: 5497-5508; Haber J. E. Partners and pathways repairing a doublestrand break. Trends Genet 2000; 16: 259-264). NHEJ восстанавливает большинство DSB. При NHEJ DSB распознаются белком Ku, который связывает, а затем активирует каталитическую субъединицу ДНК-РК. Это приводит к увеличению числа и активации ферментов для заключительной обработки, полимераз и ДНК-лигазы IV (Collis, S. J., DeWeese, Т. L., Jeggo P. A., Parker, A.R. The life and death of DNA-PK. Oncogene 2005; 24: 949-961). NHEJ в первую очередь контролируется ДНК-РК и, таким образом, ингибирование ДНК-РК является привлекательным подходом для модуляции восстановительного ответа на экзогенно индуцированные DSB. Клетки, дефицитные по компонентам пути NHEJ, неполноценны для восстановления DSB и весьма чувствительны к ионизирующей радиации и топоизомеразным ядам (обзор Smith G. С. М., Jackson, S.P. The DNA-dependent protein kinase. Genes Dev 1999; 13: 916-934; Jeggo, P.A., Caldecott, K., Pidsley, S., Banks, G.R. Sensitivity of Chinese hamster ovary mutants defective in DNA double strand break repair to topoisomerase II inhibitors. Cancer Res 1989; 49: 7057-7063) . Ингибитор ДНК-РК, как сообщалось, имеет тот же эффект сенсибилизации злокачественных клеток в отношении терапевтически индуцированных DSB (Smith, G.C.M, Jackson S.P. The DNA-dependent protein kinase. Genes Dev 1999; 13: 916-934).

Цитирование или указание любой ссылки в разделе 2 настоящего описания не должно быть истолковано как признание того, что эта ссылка является уровнем техники настоящей заявки.

Сущность

В настоящем описании представлены способы лечения или профилактики мультиформной глиобластомы (GBM), отличающейся экспрессией О⁶-метилгуанин-ДНК метилтрансферазы (MGMT) и/или статусом метилирования промотора MGMT, включающие введение эффективного количества дигидропиразино-пиразинового соединения больному GBM, отличающейся экспрессией MGMT и/или статусом метилирования промотора MGMT.

В определенных вариантах осуществления в настоящем описании представлены способы оценки ответа для рабочей группы по нейро-онкологии (RANO) для случая полного ответа, частичного ответа на лечения мультиформной глиобластомы или для случая стабильного заболевания у больного мультиформной глиобластомой, отличающейся экспрессией MGMT и/или статусом метилирования промотора MGMT, включающие введение эффективного количества дигидропиразино-пиразинового соединения указанному больному.

В определенных вариантах осуществления промотор MGMT является гипометилированным. В другом варианте осуществления экспрессируется белок MGMT.

В определенных вариантах осуществления дигидропиразино-пиразиновое соединение представляет собой соединение, как описано в настоящем документе.

Представленные варианты осуществления могут быть лучше поняты благодаря ссылки на подробное описание и примеры, которые предназначены для иллюстрации неограничивающих вариантов осу- 2 030808

ществления.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1: Анализ повторного сферообразования показывает, что Соединение 1 не нацеливается специфически на клетки, инициирующие сферообразование, в культурах клеток GBM, полученных у пациентов. Опухолевые сферы линий А) 206 В) 217 С) 254 D) 282 диссоциировании и высевали как отдельные клетки с плотностью 50000 клеток/мл среды для опухолевых сфер в общей сложности 10 мл на колбу для клеточной культуры Т-25 и 5 колб на клеточную линию. Каждую колбу обрабатывали одной концентрацией Соединения 1 в течение 7 дней. Клетки, которые выживали на 7 день обработки, отмывали от Соединения 1, диссоциировали на отдельные клетки и высевали при клональной плотности опухолевых сфер в 96-луночные планшеты. Из каждой колбы клеток высевали 60 лунок. Прежде чем их подсчитывали, опухолевые сферы оставляли расти до тех пор, пока они не достигали по меньшей мере 60 мкм в диаметре. Процент образования опухолевых сфер рассчитывали, как число подсчитанных опухолевых сфер, разделенное на число клеток, которое высевали, умноженное на эффективность покрытия в контроле.

Фиг. 2: Анализ выживания Каплана-Мейера для линии HF2354 PDX (конец исследования). Указаны схемы лечения для выживания (Rx) и "поражения мишени" (ТН).

Подробное описание Определения

Как используется в настоящем документе, термин "фармацевтически приемлемая(ые) соль(и)" относится к соли, полученной из фармацевтически приемлемой нетоксичной кислоты или основания, включая неорганическую кислоту и основание, и органическую кислоту и основание. Подходящие фармацевтически приемлемые соли добавления оснований дигидропиразино-пиразинового соединения включают, но ими не ограничиваются, соли металлов, полученные из алюминия, кальция, лития, магния, калия, натрия и цинка, или органические соли, полученные из лизина, Ν,Ν'-дибензилэтилендиамина, хлорпрокаина, холина, диэтаноламина, этилендиамина, меглуминЩ-метилглюкамин) и прокаина. Подходящие нетоксичные кислоты включают, но ими не ограничиваются, неорганические и органические кислоты, такие как уксусная, альгиновая, антраниловая, бензолсульфоновая, бензойная, камфорсульфоновая, лимонная, этенсульфоновая, муравьиная, фумаровая, фуранкарбоновая, галактуроновая, глюконовая, глюкуроновая, глутаминовая, гликолевая, бромисто-водородная, соляная, изетионовая, молочная, малеиновая, яблочная, миндальная, метансульфоновая, муциновая, азотная, памовая, пантотеновая, фенилуксусная, фосфорная, пропионовая, салициловая, стеариновая, янтарная, сульфаниловая, серная, винная кислота и п-толуолсульфоновая кислота. Конкретные нетоксичные кислоты включают соляную, бромистоводородную, фосфорную, серную и метансульфоновую кислоты. Примеры конкретных солей, таким образом, включают соли гидрохлорид и мезилат. Другие соли представляют собой хорошо известные в данной области, см., например, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18-ое издание, Mack Publishing, Easton PA (1990) или Remington's Pharmaceutical Sciences and Practice of Pharmacy, 19-oe издание, Mack Publishing, Easton PA (1995).

Как используется в настоящем документе, и если не указано иного, термин "стереоизомер" или "стереомерно чистый" означает один стереоизомер дигидропиразино-пиразинового соединения, который, по существу, свободен от других стереоизомеров этого соединения. Например, стереомерно чистое соединение, имеющее один хиральный центр, будет, по существу, чистым от противоположного энантиомерного соединения. Стереомерно чистое соединение, имеющее два хиральных центра, будет, по существу, свободно от других диастереомерных соединений. Обычное стереомерно чистое соединение содержит более чем приблизительно 80 мас.% одного стереоизомера соединения и менее чем приблизительно 20 мас.% другого стереоизомера соединения, больше чем приблизительно 90 мас.% одного стереоизомерного соединения и менее чем приблизительно 10 мас.% другого стереоизомерного соединения, больше чем приблизительно 95 мас.% одного стереоизомерного соединения и менее чем приблизительно 5 мас.% другого стереоизомерного соединения, или больше чем приблизительно 97 мас.% одного стереоизомерного соединения и менее чем приблизительно 3 мас.% другого стереоизомерного соединения. Дигидропиразино-пиразиновые соединения могут иметь хиральные центры и могут существовать в виде рацематов, индивидуальных энантиомеров или диастереомеров, и в виде их смесей. Все такие изомерные формы входят в объем вариантов осуществления, описанных в настоящем документе, включая их смеси. Применение стереоизомерно чистых форм таких дигидропиразино-пиразиновых соединений, а также применение смесей этих форм входят в объем вариантов осуществления, описанных в настоящем документе. Например, смеси, содержащие эквивалентные или неэквивалентные количества энантиомеров конкретного дигидропиразино-пиразинового соединения можно использовать в способах и композициях, описанных в настоящем документе. Эти изомеры могут быть асимметрически синтезированными или разделены стандартными способами, такими как хиральные колонки или хиральные разделяющие агенты. См., например, Jacques, J., et al., Enantiomers_r Racemates and Resolutions (Wiley-Interscience, New York, 1981); Wilen S. H., et al., Tetrahedron 33:2725 (1977); Eliel E. L., Stereochemistry of Carbon Compounds (McGraw Hill, NY, 1962) и Wilen S. H., Tables of Resolving Agents and Optical Resolutions p. 268 (E.L. Eliel, Ed., Univ. of Notre Dame Press, Notre Dame, IN, 1972).

- 3 030808

"Таутомеры" относятся к изомерным формам соединения, которые находятся в равновесии друг с другом. Концентрации изомерных форм зависят от окружения, в котором находятся соединения, и могут отличаться в зависимости от того является ли, например, соединение твердым или находится в органическом или водном растворе. Например, в водном растворе пиразолы могут иметь следующие изомерные формы, которые обозначены как таутомеры друг друга:

Специалисту в данной области будет понятно, что широкий спектр функциональных групп и других структур может иметь таутомеризм и все таутомеры дигидропиразино-пиразиновых соединений входят в объем настоящего изобретения.

О⁶-Алкил-гуанин представляет собой основное канцерогенное повреждение в ДНК, вызванное алкилирующими мутагенами. Такой аддукт ДНК удаляется посредством ремонтного белка, О⁶метилгуанин-ДНК метилтрансферазой (MGMT), кодируемой геном MGMT. Белок не является настоящим ферментом, так как акцептирует алкильную группу из повреждения в стехиометрической реакции и активный фермент не восстанавливается после такого алкилирования. Метил-акцепторным остатком в белке является цистеин (Kaina В., Christmann M., Naumann S., Roos WP (август 2007J. DNA Repair (Amst.) 6(8): 1079-99). Пониженная экспрессия белка MGMT из-за метилирования сайтов CpG в промоторной области гена MGMT обеспечивает накопление алкилгуаниновой ДНК, которая, после неправильного спаривания оснований с тимином, запускает повреждающий сигнальный путь ДНК и гибель клеток. Метилирование промотора MGMT является ключевым механизмом сайленсинга гена MGMT.

Как используется в настоящем документе, "статус экспрессии белка MGMT" относится к экспрессии белка MGMT. В одном из вариантов осуществления белок MGMT является экспрессированным. В одном из вариантов осуществления экспрессия белка MGMT определена, например, иммуногистохимией или Вестерн-блоттингом.

Как используется в настоящем документе "статус метилирования промотора MGMT" относится к метилированию промотора гена MGMT. В одном из вариантов осуществления промотор гипометилирован. В одном из вариантов осуществления статус метилирования промотора MGMT определяют, например, ПЦР, специфическим для метилирования (MSP), и бисульфитным секвинированием (BiSEQ) 24 смежных сайтов CpG.

"Лечение", как используется в настоящем документе, означает облегчение течения, полностью или частично, GBM, отличающейся экспрессией MGMT и/или статусом метилирования промотора MGMT, или ее симптома, или замедление, или прекращение дальнейшего прогрессирования или ухудшения GBM, отличающейся экспрессией MGMT/или статусом метилирования промотора MGMT, или ее симптома. В одном из вариантов осуществления промотор MGMT гипометилирован. В другом варианте осуществления белок MGMT является экспрессированным.

"Профилактика", как используется в настоящем документе, означает предотвращение возникновения, рецидивирования или распространения, целиком или частично, GBM, отличающейся экспрессией белка MGMT и/или статусом метилирования промотора MGMT, или ее симптома. В одном из вариантов осуществления промотор MGMT гипометилирован. В другом варианте осуществления белок MGMT является экспрессированным.

Термин "эффективное количество", применительно к дигидропиразино-пиразиновому соединению, означает количество, способное облегчить, целиком или частично, симптомы, связанные с GBM, отличающейся экспрессией MGMT/или статусом метилирования промотора MGMT, или замедлить или остановить дальнейшее прогрессирование или ухудшение этих симптомов, или использоваться для лечения или профилактики GBM, отличающейся экспрессией белка MGMT и/или статусом метилирования промотора MGMT. Эффективное количество дигидропиразино-пиразинового соединения, например, в фармацевтической композиции, может быть таким количеством, при котором будет развиваться желаемый эффект; например, от приблизительно 0,005 мг/кг массы тела индивидуума до приблизительно 100 мг/кг массы тела пациента в лекарственной форме как для перорального, так и для парентерального введения. Как будет понятно специалистам в данной области, следует ожидать, что эффективное количество дигидропиразино-пиразинового соединения, описанного в настоящем документе, может изменяться в зависимости от тяжести симптома, в отношении которого направлено лечение.

В одном из вариантов осуществления пациентом является человек, страдающий GBM, отличающейся экспрессией MGMT/или статусом метилирования промотора MGMT. В одном из вариантов осуществления промотор MGMT является гипометилированным. В другом варианте осуществления белок MGMT является экспрессированным.

Термины "пациент" и "индивидуум", как используется в настоящем документе, включают животное, включая, но ими не ограничиваясь, животное, такое как корова, обезьяна, лошадь, овца, свинья, курица, индейка, перепел, кошка, собака, мышь, крыса, кролик или морская свинка, в одном из вариантов осуществления - млекопитающее, в другом варианте осуществления - человек. В одном из вариантов осуществления "пациентом" или "индивидуумом" является человек, страдающий GBM, отличающейся

- 4 030808

экспрессией MGMT/или статусом метилирования промотора MGMT. В одном из вариантов осуществления пациентом является человек с гистологически или цитологичеси подтвержденной GBM, отличающейся экспрессией MGMT/или статусом метилирования промотора MGMT, включая индивидуумов, у которых наблюдался прогресс при проведении стандартной терапии злокачественной опухоли (или у которых не развивалась толерантность) или для которых не существует стандартной терапии злокачественной опухоли. В одном из таких вариантов осуществления стандартной терапией злокачественной опухоли является терапия темозоломидом.

В контексте GBM, отличающейся экспрессией MGMT/или статусом метилирования промотора MGMT, лечение может быть оценено по ингибированию прогрессирования заболевания, по ингибированию роста опухоли, уменьшению первичной и/или вторичной опухоли(ей), по облегчению симптомов, связанных с опухолью, по улучшению качества жизни, по отсрочке возникновения первичной и/или вторичной опухоли(ей), по замедлению развития первичной и/или вторичной опухоли(ей), по снижению возникновения первичной и/или вторичной опухоли(ей), замедлению или снижению тяжести вторичных эффектов заболевания, по прекращению роста опухоли и/или регрессии опухолей, кроме прочего. В определенных вариантах осуществления лечение GBM, отличающейся экспрессией белка MGMT и/или статусом метилирования промотора MGMT, можно оценить по ингибированию фосфорилирования S6RP, 4Е-ВР1 и/или AKT в циркулирующей крови и/или опухолевых клетках и/или кожных биоптатах или опухолевых биоптатахаспиратах перед, во время и/или после лечения дигидропиразинопиразиновым соединением. В других вариантах осуществления лечение GBM, отличающейся экспрессией белка MGMT и/или статусом метилирования промотора MGMT, может быть оценено по ингибированию активности ДНК-зависимой протеинкиназы (ДНК-РК) в образцах кожи и/или кожных биоптата/асприатах, например, путем оценки количества S2056 pDNA-PK в качестве биомаркера для путей повреждения ДНК перед, во время и/или после лечения дигидропиразино-пиразиновым соединением. В одном из вариантов осуществления образец кожи облучают УФ-светом. В крайнем случае полное ингибирование называется в настоящем документе профилактикой или химиопрофилактикой. В этом контексте термин "профилактика" включает либо профилактику возникновения клинически видимой GBM, отличающейся экспрессией белка MGMT и/или статусом метилирования промотора MGMT, в общей сложности, или профилактику возникновения доклинически видимой стадии карциномы GBM, отличающейся экспрессией белка MGMT и/или статусом метилирования промотора MGMT. Также понятно, что это определение включает профилактику трансформации в злокачественные клетки, или прекращение или обращение прогрессии перехода предзлокачественных клеток в злокачественные клетки. К нему относится профилактическое лечение риска развития GBM, отличающейся экспрессией белка MGMT и/или статусом метилирования промотора MGMT.

Методики, соглашения и определения, описанные ниже, представляют руководство по реализации рекомендаций по оценки ответа для рабочей группы по нейро-онкологии (RANO) в отношении критерия ответа на лечение глиомы с высокой степенью злокачественности (Wen P., Macdonald, DR., Reardon, DA., et al. Updated response assessment criteria for highgrade gliomas: Response assessment in neuro-oncology working group. J Clin Oncol 2010; 28: 1963-1972). Первичные изменения в критерии RANO для критерия ответа во временные точки (TPR) могут включать дополнения действующих соглашений, касающиеся определения изменений в дозе глюкокортикоидов и исключение компонента клинического ухудшения у индивида для того, чтобы сфокусироваться на объективных радиологических оценках. Базовое сканирование МРТ определяется как оценка, осуществляемая в конце послеоперационного периода покоя, перед повторным проведением лечения соединением. Исходное МРТ используется в качестве эталона для оценки полного ответа (CR) и частичного ответа (PR). В свою очередь, наименьшее SPD (сумма продуктов перпендикулярных диаметров), полученная либо при базовой, либо при последующей оценках, будет обозначать самый низкий уровень оценки и использоваться в качестве эталона для определения прогрессии. За 5 дней до сканирования МРТ, предусмотренного любым протоколом, индивиды либо не получают глюкокортикоиды, либо принимают стабильную дозу глюкокортикоидов. Стабильная доза определена как одинаковая суточная доза в течение 5 последовательных дней, предшествующих сканированию МРТ. Если предписанная доза глюкокортикоидов изменяется в течение 5 дней до базового сканирования, то требуется проведение нового базового сканирования с использованием глюкокортикоидов, соответствующего критериям, описанным выше. Будут использованы следующие определения.

Измеримые повреждения:

Измеримые повреждения представляют собой повреждения, накапливающие контраст, которые могут быть измерены двумерно. Проводят измерение диаметра опухоли, максимально накапливающей контраст (также известен как самый большой диаметр, LD). Наибольший перпендикулярный диаметр измеряется на том же изображении. Перекрестия двумерных измерений должны пересекаться и рассчитывается произведение этих диаметров.

Минимальный диаметр:

Т1-взвешенное изображение, в котором срезы составляют 5 мм с пропуском в 1 мм. Минимальный LD измеримого повреждения устанавливается как 5 мм на 5 мм. Большие диаметры могут потребоваться для включения и/или обозначения целевых повреждений. После базового уровня целевые повреждения,

- 5 030808

которые становятся меньше, чем минимальное требование для измерения, или больше не поддаются двумерному измерению, будут записаны как значения по умолчанию 5 мм для каждого диаметра ниже 5 мм. Повреждения, которые исчезают, будет записаны как 0 мм на 0 мм.

Многоцентровое повреждение:

Повреждения, которые считаются многоцентровыми (в отличие от непрерывных), являются повреждениями, при которых между двумя (или большим количеством) повреждениями находится нормальная мозговая ткань. Для мультицентровых повреждений, которые являются дискретными очагами накопления, подходом является отдельное измерение каждого повреждения с накоплением контраста, которое отвечает критериям включения. Если между двумя (или большим количеством) повреждениями нет нормальной ткани головного мозга, то они считаются одним поражением.

Неизмеримые повреждения:

Все повреждения, которые не отвечают критерию измеримых заболеваний, как определено выше, будут считаться неизмеримыми повреждениями, а также все не накапливающие контраст и другие действительно неизмеримые поражения. Неизмеримые поражения включают очаги накопления, которые являются меньше указанного наименьшего диаметра (т.е., меньше 5 мм на 5 мм), не накапливающие контраст повреждения (например, как видно на Т1-взвешанных постконтрастных. Т2-взвешенных изображениях или на изображениях, полученных инверсией-восстановлением с ослаблением сигнала от жидкости [FLAIR]), геморрагические или преимущественно кистозные или некротические поражения и лептоменингиальную опухоль. Геморрагические поражения часто имеют внутреннюю Т1-взвешенную гиперинтенсивность, что может быть неверно истолковано как опухоль, накапливающая контраст, и по этой причине, может быть оценено предконтрастное Т1-взвешенное изображение на исключение базового или интервального подострого кровоизлияния.

При базовой оценке поражения будут классифицированы следующим образом:

Целевые повреждения: до 5 измеряемых повреждений могут быть выбраны в качестве целевых повреждений, каждое размером по меньшей мере 10 мм на 5 мм, характерных для болезни индивида;

нецелевые повреждения: все другие повреждения, в том числе всех неизмеримые повреждения (в том числе масс-эффекты и данные T2/FLAIR) и любое измеримое повреждение, не выбранное в качестве целевого повреждения. При базовой оценке повреждения должны быть измерены, как описано в определении термина измеримые повреждения и должны быть определены SPD всех целевых повреждений. Наличие всех других повреждений должны быть задокументированы. Во время всех оценок после лечения базовая классификация поражений, как целевых, так и нецелевых поражений, будет сохраняться, и поражения будут задокументированы и описаны последовательно в течение времени (например, записано в том же порядке, как в исходных документах и eCRF). Все измеримые и неизмеримые поражения должны быть оценены с помощью того же оборудования, которое использовалось при базовой оценке (например, индивиды должны быть визуализированы на одном и том же сканере МРТ томографии или, по крайней мере, с такой же силой магнита) в течение всего исследования для уменьшения трудностей интерпретации изменений. При каждой оценке будут измеряться целевые повреждения и рассчитываться SPD. Нецелевые повреждения будет качественно оцениваться, а новые поражения, если таковые возникнут, будут отдельно задокументированы. При каждой оценке будет определен ответ во временные точки для целевых поражений, нецелевых поражений и нового поражения. Прогрессирование опухоли может быть установлено, даже если оценивается только выборка повреждений. Тем не менее, если прогрессирование не наблюдается, то объективный статус (стабилизация заболевания, PR или CR) может быть определен, только если оцениваются все повреждения.

Оценка для подтверждения всех ответов во временные точки CR и PR будет осуществлена на следующей предусмотренной стадии оценки, но подтверждение может быть не сделано, если сканирования проведены с интервалом < 28 дней. Лучший ответ, включающий требования подтверждения, будет получен из серии временных точек.

В определенных вариантах осуществления лечение злокачественной опухоли может быть оценено по ингибированию фосфорилирования S6RP, 4Е-ВР1, AKT и/или ДНК-РК в циркулирующей крови и/или опухолевых клетках и/или кожных биоптатах и/или опухолевых биоптатах/аспиратах перед, во время и/или после лечения ингибитором киназы TOR, например, дигидропиразино-пиразиновым соединением. Например, ингибирование фосфорилирования S6RP, 4Е ВР1, AKT и/или ДНК-РК оценивают в Вклетках, Т-клетках и/или в моноцитах.

В других вариантах осуществления лечение злокачественной опухоли может быть оценено по ингибированию активности ДНК-зависимой протеинкиназы (ДНК-РК) кожных биоптатах и/или опухолевых биоптатах/аспиратах, например, по оценке количества рДНК-РК S2056 в качестве биомаркера для путей повреждения ДНК перед, во время и/или после лечения ингибитором киназы TOR, например дигидропиразино-пиразиновым соединением.

В одном из вариантов осуществления кожный образец облучают УФ-светом.

В крайнем случае полное ингибирование называется в настоящем документе как профилактика или химиопрофилактика. В этом контексте термин "профилактика" включает либо профилактику возникновения клинически видимой GBM, отличающейся метилированием MGMT, в общей сложности, или про- 6 030808

филактику возникновения доклинически видимой стадии GBM, отличающейся метилированием MGMT. Также понятно, что это определение включает профилактику трансформации в злокачественные клетки, или прекращение или обращение прогрессии перехода предзлокачественных клеток в злокачественные клетки. К нему относится профилактическое лечение риска развития GBM, отличающейся метилированием MGMT.

Дигидропиразино-пиразиновое соединение

Соединение, предложенное в настоящем документе, представляет собой ингибитор киназы TOR, обозначенное как "дигидропиразино-пиразиновое соединение".

Дигидропиразино-пиразиновое соединение представляет собой 1-этил-7-(2-метил-6-(4Н-1,2,4триазол-3-ил)пиридин-3-ил)-3,4-дигидропиразино[2,3-Ъ]пиразин-2(1Н)-он и его фармацевтически приемлемые соли, стереоизомеры, таутомеры.

Способы получения дигидропиразино-пиразинового соединения

Дигидропиразино-пиразиновое соединение может быть получено стандартными хорошо известными способами синтеза, см. например, March, J. Advanced Organic Chemistry; Reactions Mechanisms, and Structure, 4-ое издание, 1992. Исходные вещества, которые могут использоваться для получения соединений формулы (I) и промежуточных веществ, таким образом, коммерчески доступны или могут быть получены из коммерчески доступных веществ, используя синтетические способы и реагенты.

Конкретные способы получения соединений формулы (I) описаны в патенте США № 8110578, выданном 7 февраля 2012 г., и в патенте США № 8569494, выданном 29 октября 2013 г., каждый полностью включен в настоящий документ в качестве ссылки.

Способы применения

В настоящем описании представлены способы лечения или профилактики мультиформной глиобластомы (GBM), отличающейся экспрессией белка MGMT и/или статусом метилирования промотора MGMT, включающие введение эффективного количества дигидропиразино-пиразинового соединения пациенту, страдающему GBM, отличающейся экспрессией белка MGMT и/или статусом метилирования промотора MGMT. В определенных вариантах осуществления дигидропиразино-пиразиновое соединение вводят пациенту, который имеет локально распространенную, рецидивирующую или метастатическую GBM, отличающуюся экспрессией белка MGMT и/или статусом метилирования промотора MGMT, не поддающуюся существующим методам хирургического удаления. В другом варианте осуществления дигидропиразино-пиразиновое соединение вводят пациенту с GBM, отличающейся экспрессией белка MGMT и/или статусом метилирования промотора MGMT, у которого имелся рецидив по меньшей мере один раз до начала химиотерапии, например, темозоломидом. В определенных вариантах осуществления дигидропиразино-пиразиновое соединение вводят пациенту, страдающему GBM, отличающейся экспрессией белка MGMT и/или статусом метилирования промотора MGMT и демонстрирующей сверхэкспрессию ДНК-РК.

В определенных вариантах осуществления дигидропиразино-пиразиновое соединение вводят пациенту с GBM, отличающейся экспрессией белка MGMT и/или статусом метилирования промотора MGMT. В некоторых таких вариантах осуществления промотор MGMT является гипометилированным. В других белок MGMT является экспрессированным.

В определенных вариантах осуществления в настоящем описании представлены способы оценки ответа для рабочей группы по нейро-онкологии (RANO) для случая полного ответа, частичного ответа на лечения мультиформной глиобластомы или для случая стабильного заболевания у пациента с мультиформной глиобластомой, отличающейся экспрессией MGMT и/или статусом метилирования промотора MGMT, включающие введение эффективного количества дигидропиразино-пиразинового соединения указанному пациенту.

В одном из вариантов осуществления в настоящем описании представлены способы ингибирования фосфорилирования S6RP, 4Е-ВР1 и/или AKT у пациента с мультиформной глиобластомой, отличающейся экспрессией белка MGMT и/или статусом метилирования промотора MGMT, включающие введение эффективного количества дигидропиразино-пиразинового соединения указанному пациенту. В некоторых таких вариантах осуществления ингибирование фосфорилирования оценивают в биологическом образце пациента, например, в циркулирующей крови и/или опухолевых клетках, кожных биоптатах и/или опухолевых биоптатах или аспирате. В таких вариантах осуществления степень ингибирования фосфорилирования оценивают путем сравнения количества фосфо-S6RP, 4Е-ВР1 и/или AKT перед и после введения дигидропиразино-пиразинового соединения. В определенных вариантах осуществления в настоящем описании представлены способы измерения ингибирования фосфорилирования S6RP, 4Е-ВР1 или AKT у пациента с мультиформной глиобластомой, отличающейся экспрессией белка MGMT и/или статусом метилирования промотора MGMT, включающие введение эффективного количества дигидропиразино-пиразинового соединения указанному пациенту, измерение количества фосфорилированного S6RP, 4Е ВР1 и/или AKT у указанного пациента, и сравнение указанного количества фосфорилированного S6RP, 4Е ВР1 и/или AKT с количеством у указанного пациента до введения эффективного количества дигидропиразино-пиразинового соединения.

В определенных вариантах осуществления в настоящем описании представлены способы ингиби- 7 030808

рования фосфорилирования S6RP, 4Е-ВР1 и/или AKT в биологическом образце пациента с мультиформной глиобластомой, отличающейся экспрессией белка MGMT и/или статусом метилирования промотора MGMT, включающие введение эффективного количества дигидропиразино-пиразинового соединения указанному пациенту и сравнение количества фосфорилированного S6RP, 4Е-ВР1 и/или AKT в биологическом образце пациента, полученного перед и после введения указанного дигидропиразинопиразинового соединения, где меньшее количество фосфорилированных S6RP, 4Е-ВР1 и/или AKT в указанном биологическом образце, полученном после введения указанного дигидропиразино-пиразинового соединения, по сравнению с количеством фосфорилированных S6RP, 4Е-ВР1 и/или AKT в указанном биологическом образце, полученном перед введением указанного дигидропиразино-пиразинового соединения, указывает на ингибирование.

В одном из вариантов осуществления в настоящем описании представлены способы ингибирования активности ДНК-зависимой протеинкиназы (ДНК-РК) у пациента с мультиформной глиобластомой, отличающейся экспрессией белка MGMT и/или статусом метилирования промотора MGMT, включающие введение эффективного количества дигидропиразино-пиразинового соединения указанному пациенту с GBM, отличающейся экспрессией белка MGMT и/или статусом метилирования промотора MGMT. В определенных вариантах осуществления ингибирование ДНК-РК оценивают на коже пациента с мультиформной глиобластомой, отличающейся экспрессией белка MGMT и/или статусом метилирования промотора MGMT, в одном из примеров, в УФ-облученном кожном образце указанного пациента. В другом варианте осуществления ингибирование ДНК-РК оценивают в опухолевой биопсии или в аспирате пациента с мультиформной глиобластомой, отличающейся экспрессией белка MGMT и/или статусом метилирования промотора MGMT. В одном из вариантов осуществления ингибирование оценивают по измерению количества фосфорилированной S2056 ДНК-РК (также известна как S2056 pDNA-PK) перед и после введения дигидропиразино-пиразинового соединения. В определенных вариантах осуществления в настоящем описании представлены способы измерения ингибирования фосфорилирования ДНК-РК S2056 в кожном образце пациента с мультиформной глиобластомой, отличающейся экспрессией белка MGMT и/или статусом метилирования промотора MGMT, включающие введение эффективного количества дигидропиразино-пиразинового соединения указанному пациенту, измерение количества фосфорилированной ДНК-РК S2056, присутствующей в кожном образце, и сравнение указанного количества фосфорилированной ДНК-РК S2056 с количеством в кожном образце указанного пациента перед ведением эффективного количества дигидропиразино-пиразинового соединения. В одном из вариантов осуществления кожный образец облучают УФ-светом.

В определенных вариантах осуществления в настоящем описании представлены способы ингибирования активности ДНК-зависимой протеинкиназы (ДНК-РК) в кожном образце пациента с мультиформной глиобластомой, отличающейся экспрессией белка MGMT и/или статусом метилирования промотора MGMT, включающие введение эффективного количества дигидропиразино-пиразинового соединения указанному пациенту и сравнение количества фосфорилированной ДНК-РК в биологическом образце пациента, полученном перед и после введения указанного дигидропиразино-пиразинового соединения, где уменьшенное количество фосфорилированной ДНК-РК в указанном биологическом образце, полученном после введения указанного дигидропиразино-пиразинового соединения по сравнению с количеством фосфорилированной ДНК-РК в указанном биологическом образце, полученном перед введением указанного дигидропиразино-пиразинового соединения указывает на ингибирование.

В одном из вариантов осуществления Соединение 1 представляет собой 1-этил-7-(2-метил-6-(1Н1,2,4-триазол-3-ил)пиридин-3-ил)-3,4-дигидропиразино[2,3-Ъ]пиразин-2(1Н)-он, или его таутомер, например, 1 -этил-7-(2-метил-6-(4Н-1,2,4-триазол-3 -ил)пиридин-3 -ил)-3,4-дигидропиразино [2,3-Ъ]пиразин2(1Н)-он, или 1-этил-7-(2-метил-6-(1Н-1,2,4-триазол-5-ил)пиридин-3-ил)-3,4-дигидропиразино[2,3Ъ]пиразин-2(1Н)-он.

Дигидропиразино-пиразиновое соединение можно комбинировать с лучевой терапией или хирургией. В определенных вариантах осуществления дигидропиразино-пиразиновое соединение вводят пациенту, который получает лучевую терапию, который ранее получал лучевую терапию или который будет получать лучевую терапию. В определенных вариантах осуществления дигидропиразино-пиразиновое соединение вводят пациенту после удаления GBM хирургическим путем.

Также в настоящем описании представлены способы лечения пациента, у которого ранее проводилось лечение мультиформной глиобластомы, отличающейся экспрессией белка MGMT и/или статусом метилирования промотора MGMT, но который не отвечал на стандартные способы терапии, например темозоломида, а также у пациентов, которые ранее не получали лечение. Кроме того, в настоящем описании представлены способы лечения пациентов, у которых была проведена операция в попытке лечения рассматриваемого состояния, а также пациентов, у которых она не была проведена. Так как пациенты с мультиформной глиобластомой, отличающейся экспрессией белка MGMT и/или статусом метилирования промотора MGMT, могут иметь различные клинические проявления и разные клинические исходы, то лечение, проводимое у пациента, может отличаться в зависимости от прогноза пациента. Специалист в данной области без труда и излишнего экспериментирования определит специфические вторичные средства, виды хирургии и типы стандартной терапии, основанной на нелекарственных средствах, кото- 8 030808

рые могут эффективно использоваться для лечения конкретного пациента с мультиформной глиобластомой, отличающейся экспрессией белка MGMT и/или статусом метилирования промотора MGMT. В определенных вариантах осуществления способы, описываемые в настоящем документе, дополнительно включают введение темозоломида. В некоторых таких вариантах осуществления, мультиформная глиобластома является устойчивой к действию темозоломида.

В одном из вариантов осуществления мультиформная глиобластома, отличающаяся экспрессией белка MGMT и/или статусом метилирования промотора MGMT, является глиобластомой, при которой активирован путь PI3K/mTOR. В определенных вариантах осуществления мультиформная глиобластома, отличающаяся экспрессией белка MGMT и/или статусом метилирования промотора MGMT, является глиобластомой, при которой активирован путь PI3K/mTOR в результате мутации ERBB2, мутации или делеции PTEN, мутации или делеции NF1, мутации PIK3Са, мутации или сверхэкспрессии EGFR, амплификации Met, активации или амплификации PDGFRa, амплификации AKT или их сочетания. В одном из вариантов осуществления мутация EGFR представляет собой мутацию EGFRviii.

Фармацевтические композиции и пути введения

В настоящем описании представлены композиции, содержащие эффективное количество дигидропиразино-пиразинового соединения, и композиции, содержащие эффективное количество дигидропиразино-пиразинового соединения и фармацевтически приемлемое носитель или разбавитель. В определенных вариантах осуществления фармацевтические композиции, описываемые в настоящем документе, подходят для перорального, парентерального, чрезслизистого, чрезкожного введения или местного применения.

Дигидропиразино-пиразиновые соединения можно вводить пациенту перорально или парентерально в общепринятой препаративной форме, такой как капсулы, микрокапсулы, таблетки, гранулы, порошки, пастилки, пилюли, суппозитории, инъекции, суспензии и сиропы. Подходящие составы могут быть получены обычно используемыми способами, используя общепринятые органические или неорганические добавки, такие как эксципиент (например, сахароза, крахмал, маннит, сорбит, лактоза, глюкоза, целлюлоза, тальк, фосфат кальция или карбонат кальция), связывающее средство (например, целлюлоза, метилцеллюлоза, гидроксиметилцеллюлоза, полипропилпирролидон, поливинилпирролидон, желатин, гуммиарабик, полиэтиленгликоль, сахароза или крахмал), дезинтегрирующее средство (например, крахмал, карбоксиметилцеллюлоза, гидроксипропилкрахмал, низкозамещенная гидроксипропилцеллюлоза, бикарбонат натрия, фосфат кальция или цитрат кальция), смазочное средство (например, стеарат магния, слабая безводная кремниевая кислота, тальк или лаурилсульфат натрия), ароматизатор (например, лимонная кислота, ментол, глицин или оранжевый порошок), консервант (например, бензоат натрия, бисульфит натрия, метилпарабен или пропилпарабен), стабилизатор (например, лимонная кислота, цитрат натрия или уксусная кислота), суспендирующее средство (например, метилцеллюлоза, поливинилпирроликлодин или стеарат алюминия), диспергирующее средство (например, гидроксипропилметилцеллюлоза), разбавитель (например, вода) и базисный воск (например, масло какао, медицинский вазелин или полиэтиленгликоль). Эффективное количество дигидропиразино-пиразинового соединения в фармацевтической композиции может иметь уровень, который будет реализовать желаемый эффект; например приблизительно 0,005 мг/кг от массы тела пациента до приблизительно 10 мг/кг массы тела пациента в единицах дозирования для перорального и для парентерального введения.

Доза дигидропиразино-пиразинового соединения для введения пациенту достаточно широко варьирует и может регулироваться в соответствии с мнением практикующего врача. В целом, дигидропиразино-пиразиновые соединения можно вводить пациенту от одного до четырех раз в сутки в дозе, равной приблизительно от 0,005 мг/кг массы тела пациента до приблизительно 10 мг/кг массы тела пациента, но выше указанные дозы могут быть подходящим образом изменены в зависимости от возраста, массы тела и общего состояния здоровья пациента и от пути введения. В одном из вариантов осуществления доза равна от приблизительно 0,01 мг/кг массы тела пациента до приблизительно 5 мг/кг массы тела пациента, от приблизительно 0,05 мг/кг массы тела пациента до приблизительно 1 мг/кг массы тела пациента, от приблизительно 0,1 мг/кг массы тела пациента до приблизительно 0,75 мг/кг массы тела пациента, от приблизительно 0,25 мг/кг массы тела пациента до приблизительно 0,5 мг/кг массы тела пациента, или от приблизительно 0,007 мг/кг массы тела пациента до приблизительно 1,7 мг/кг массы тела пациента. В одном из вариантов осуществления один доза принимается один раз в сутки. В другом варианте осуществления две дозы принимаются в течение суток. В любом случае, количество вводимого дигидропиразино-пиразинового соединения будет зависеть от таких факторов как растворимость активного компонента, используемого состава и пути введения.

В другом варианте осуществления в настоящем описании представлены способы лечения или профилактики мультиформной глиобластомы, отличающейся экспрессией белка MGMT и/или статусом метилирования промотора MGMT, включающие введение от приблизительно 0,375 мг/сутки до приблизительно 750 мг/сутки, от приблизительно 0,75 мг/сутки до приблизительно 375 мг/сутки, от приблизительно 3,75 мг/сутки до приблизительно 75 мг/сутки, от приблизительно 7,5 мг/сутки до приблизительно 55 мг/сутки, от приблизительно 18 мг/сутки до приблизительно 37 мг/сутки, от приблизительно 0,5 мг/сутки до приблизительно 60 мг/сутки, или от приблизительно 0,5 мг/сутки до приблизительно 128

- 9 030808

мг/сутки дигидропиразино-пиразинового соединения, нуждающемуся в этом пациенту. В другом варианте осуществления в настоящем описании представлены способы лечения или профилактики мультиформной глиобластомы, отличающейся экспрессией белка MGMT и/или статусом метилирования промотора MGMT, включающие введение от приблизительно 0,5 мг/сутки до приблизительно 1200 мг/сутки, от приблизительно 10 мг/сутки до приблизительно 1200 мг/сутки, от приблизительно 100 мг/сутки до приблизительно 1200 мг/сутки, от приблизительно 400 мг/сутки до приблизительно 1200 мг/сутки, от приблизительно 600 мг/сутки до приблизительно 1200 мг/сутки, от приблизительно 400 мг/сутки до приблизительно 800 мг/сутки или от приблизительно 600 мг/сутки до приблизительно 800 мг/сутки дигидропиразино-пиразинового соединения, нуждающемуся в этом пациенту. В конкретном варианте осуществления способы описываем в настоящем документе включают введение 0,5 мг/сутки, 1 мг/сутки, 2 мг/сутки, 4 мг/сутки, 8 мг/сутки, 10 мг/сутки, 15 мг/сутки, 16 мг/сутки, 20 мг/сутки, 25 мг/сутки, 30 мг/сутки, 45 мг/сутки, 60 мг/сутки, 90 мг/сутки, 120 мг/сутки или 128 мг/сутки дигидропиразинопиразинового соединения, нуждающемуся в этом пациенту.

В другом варианте осуществления в настоящем описании представлены стандартные лекарственные составы, которые содержат от приблизительно 0,1 до приблизительно 2000 мг, приблизительно от 1 до 200 мг, от приблизительно 35 до приблизительно 1400 мг, от приблизительно 125 до приблизительно 1000 мг, от приблизительно 250 до приблизительно 1000 мг или от приблизительно 500 до приблизительно 1000 мг дигидропиразино-пиразинового соединения.

В конкретном варианте осуществления в настоящем описании представлены стандартные лекарственные составы, содержащие приблизительно 0,1, 0,25, 0,5, 1, 2,5, 5, 7,5, 10, 15, 20, 30, 35, 45, 50, 60, 70, 75, 100, 125, 140, 150, 175, 200, 250, 280, 300, 350, 400, 500, 560, 600, 700, 750, 800, 1000 или 1400 мг дигидропиразино-пиразинового соединения. В конкретном варианте осуществления в настоящем описании представлены стандартные лекарственные составы, которые содержат 2,5, 5, 7,5, 8, 10, 15, 20 мг, 30, 45, 50, 60 или 100 мг дигидропиразино-пиразинового соединения. В конкретном варианте осуществления в настоящем описании представлены стандартные лекарственные составы, которые содержат 5, 7,5 или 10 мг дигидропиразино-пиразинового соединения.

Дигидропиразино-пиразиновое соединение можно вводить один, два, три, четыре или больше раз в сутки.

В определенных вариантах осуществления дигидропиразино-пиразиновое соединение вводят пациенту циклически. Циклическая терапия включает введение активного средства в течение некоторого периода времени, после чего идет покой в течение некоторого периода времени и повторение этого последовательного введения. Циклическая терапия может снижать развитие резистентности, при ней могут отсутствовать или снижаться побочные эффекты, и/или циклическая терапия может улучшать эффективность лечения.

В одном из вариантов осуществления дигидропиразино-пиразиновое соединение вводят ежесуточно в одной или дробных дозах в течение приблизительно 3 дней, приблизительно 5 дней, приблизительно одну неделю, приблизительно две недели, приблизительно три недели, приблизительно четыре недели (например, 2 8 дней), приблизительно пять недель, приблизительно шесть недель, приблизительно семь недель, приблизительно восемь недель, приблизительно десять недель, приблизительно пятнадцать недель или приблизительно двадцать недель, после чего следует период отдыха в течение от приблизительно 1 дня до приблизительно десяти недель. В одном из вариантов осуществления способы, предложенные в настоящем документе, предполагают циклическое лечение в течение приблизительно одной недели, приблизительно двух недель, приблизительно трех недель, приблизительно четырех недель, приблизительно пяти недель, приблизительно шести недель, приблизительно восьми недель, приблизительно десяти недель, приблизительно пятнадцати недель или приблизительно двадцати недель. В определенных вариантах осуществления дигидропиразино-пиразиновое соединение вводят одной или дробными дозами в течение приблизительно 3 дней, приблизительно 5 дней, приблизительно одну неделю, приблизительно две недели, приблизительно три недели, приблизительно четыре недели (например, 28 дней), приблизительно пять недель или приблизительно шесть недель с периодом покоя в приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 29 или 30 дней. В определенных вариантах осуществления период покоя составляет 1 день. В определенных вариантах осуществления период покоя составляет 3 дня. В определенных вариантах осуществления период покоя составляет 7 дней. В определенных вариантах осуществления период покоя составляет 14 дней. В определенных вариантах осуществления период покоя составляет 28 дней. Частота, число и продолжительность циклов дозирования может быть увеличена или уменьшена.

Дигидропиразино-пиразиновое соединение можно вводить перорально по соображениям удобства. В одном из вариантов осуществления при пероральном введении дигидропиразино-пиразиновое соединение вводят вместе с пищей или водой. В другом варианте осуществления дигидропиразинопиразиновое соединение диспергируют в воде или соке (например, яблочном соке или апельсиновом соке) и вводят перорально в виде суспензии. В другом варианте осуществления при пероральном введении дигидропиразино-пиразиновое соединение вводят на голодный желудок.

Дигидропиразино-пиразиновое соединение также можно вводить внутрикожно, внутримышечно,

- 10 030808

внутрибрюшинно, подкожно, внутривенно, подкожно, интраназально, эпидурально, подъязычно, внутрицеребрально, интравагинально, трансдермально, ректально, через слизистую, путем ингаляции или

местно в уши, нос, глаза или на кожу. Способ введения остается на усмотрение практикующего врача и

может зависеть отчасти от места расположения патологического состояния.

В одном из вариантов осуществления в настоящем описании представлены капсулы, содержащие дигидропиразино-пиразиновое соединение без дополнительного носителя, эксципиента или разбавителя.

В другом варианте осуществления в настоящем описании представлены композиции, содержащие эффективное количество дигидропиразино-пиразинового соединения и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель, где фармацевтически приемлемлемый носитель или разбавитель может содержать эксципиент, растворитель или их смесь. В одном из вариантов осуществления композиция представляет собой фармацевтическую композицию.

Композиции может быть в форме таблеток, жевательных таблеток, капсул, растворов, парентеральных растворов, пастилок, суппозиториев и суспензий и тому подобное. Рецептура композиции может быть составлена так, чтобы содержать суточную дозу, или удобную часть от суточной дозы в единице дозирования, которая может быть единичной таблеткой или капсулой, или удобным объемом жидкости. В одном из вариантов осуществления растворы получают из водорастворимых солей, таких как гидрохлоридная соль. В целом, все композиции получают в соответствии с известными способами фармацевтической химии. Капсулы могут быть получены путем смешивания дигидропиразино-пиразинового соединения с подходящим носителем или разбавителем, и наполнением капсул соответствующим количеством смеси. Обычные носители и разбавители включают, но ими не ограничиваются, инертные порошковые вещества, такие как крахмал различных видов, порошковую целлюлозу, особенно кристаллическую и микрокристаллическую целлюлозу, сахар, такой как фруктоза, маннит и сахароза, мука зерновых культур тонкого помола и подобные съедобные порошки.

Таблетки могут быть получены путем прямого прессования, путем влажного гранулирования или путем сухого гранулирования. Их составы, как правило, включают разбавители, связывающие средства, смазочные средства и дезинтегрирующие средства, в дополнение к соединению. Обычные разбавители включают, например, различные виды крахмала, лактозы, маннита, каолина, фосфата или сульфат кальция, неорганические соли, такие как хлорид натрия и порошковый сахар. Также можно использоваться порошковые производные целлюлозы. В одном из вариантов осуществления фармацевтическая композиция не содержит лактозу. Обычные связывающие средства таблеток представляют собой вещества, такие как крахмал, желатин и сахара, такие как лактоза, фруктоза, глюкоза и тому подобное. Также подходят природные и синтетические камеди, в том числе гуммиарабик, альгинаты, метилцеллюлоза, поливинилпирролидин и тому подобное. Полиэтиленгликоль, этилцеллюлоза и воска могут служить в качестве связывающих средств.

Смазочное вещество может быть необходимо в составе таблетки для предотвращения таблетки и пресса от прилипания заготовки. Смазочное вещество быть выбрано из таких скользких твердых веществ, как тальк, стеарат магния и кальция, стеариновая кислота и гидрированные растительные масла. Дезинтеграторы таблеток, которые набухают при увлажнении для диссоциации таблети и высвобождения соединения. Они включают крахмалы, глины, целлюлозы, альгины и смолы. Более конкретно, можно использовать, например, кукурузный и картофельный крахмалы, метилцеллюлозу, агар, бентонит, древесную целлюлозу, порошкообразную природную губку, катионообменные смолы, альгиновую кислоту, гуаровую камедь, мякоть цитрусовых и карбоксиметилцеллюлозу, а также лаурилсульфат натрия. Таблетки могут быть покрыты сахаром в качестве вкусовой добавки и герметика, или пленкообразующими защитными агентами для модификации свойств растворения таблетки. Композиции могут быть также введены в состав в виде жевательных таблеток, например, с помощью веществ, таких как маннит.

Если желательно вводить дигидропиразино-пиразиновое соединение в виде суппозитория, то можно использовать обычные основы. Масло какао является обычным основанием для суппозитория, которое может быть изменено путем добавления восков для того, чтобы слегка повысить его температуру плавления. Широко используются смешиваемые с водой основы суппозиториев, включая, в частности, полиэтиленгликоли различных молекулярных масс.

Эффект дигидропиразино-пиразинового соединения может быть отложен или продлен с помощью соответствующего состава. Например, могут быть получены медленно растворимые гранулы дигидропиразино-пиразинового соединения и включены в таблетку или капсулу, или иметь вид имплантируемого средства с медленным высвобождением. Методики также включают получение гранул с различной скоростью растворения и заполнение капсул смесью таких гранул. Таблетки или капсулы могут быть покрыты пленкой, устойчивой к растворению в течение прогнозированного периода времени. Даже парентеральные препараты могут быть получены как длительно действующие путем растворения или суспендирования дигидропиразино-пиразинового соединения в масляных или эмульгированных носителях, которые позволяют ему медленно диспергировать в сыворотке.

В некоторых вариантах осуществления Соединение 1 вводят в состав, указанный в предварительной заявке США 61/813064, поданной 17 апреля 2013, которая включена в настоящее описание в полном

объеме (см. в частности, параграфы [0168]-[0189] и параграфы [0262]-[0294]). В других вариантах осу- 11 030808

ществления Соединение 1 вводят в состав, описанный в предварительной патентной заявке США №

61/911201, поданной 3 декабря 2013, которая включена в настоящее описание в полном объеме (см. в

частности, параграфы [0170]-[0190] и параграф [0264]-[0296]).

Наборы

В определенных вариантах осуществления в настоящем описании представлены наборы, содержащие дигидропиразино-пиразиновое соединение.

В других вариантах осуществления в настоящем описании представлены наборы, содержащие дигидропиразино-пиразиновое соединение и средствам для мониторинга ответа пациента на введение указанного дигидропиразино-пиразинового соединения. В определенных вариантах осуществления пациент страдает мультиформной глиобластомой, отличающейся экспрессией белка MGMT и/или статусом метилирования промотора MGMT. В конкретных вариантах осуществления измеренный ответ пациента представляет собой ингибирование прогрессирования заболевания, ингибирование роста опухоли, уменьшение первичной и/или вторичной опухоли(ей), ослабление симптомов, связанных с опухолью, улучшение качества жизни, отсрочку возникновения первичной и/или вторичной опухоли(ей), замедление развития первичной и/или вторичной опухоли(ей), снижение возникновения первичной и/или вторичной опухоли(ей), замедление или снижению тяжести вторичных эффектов заболевания, прекращение роста опухоли и/или регрессию опухоли.

В других вариантах осуществления в настоящем описании представлены наборы, содержащие дигидропиразино-пиразиновое соединение, и средства для измерения степени ингибирования фосфорилирования S6RP, 4Е-ВР1 и/или AKT у пациента. В определенных вариантах осуществления наборы содержат средства для измерения ингибирования фосфорилирования 6RP, 4Е-ВР1 и/или AKT в циркулирующей крови или в опухолевых клетках и/или кожных биоптатах или в опухолевых биоптатах/аспиратах пациента. В определенных вариантах осуществления в настоящем описании представлены наборы, содержащие дигидропиразино-пиразиновое соединение, и средства для измерения степени ингибирования фосфорилирование, как оценено по сравнению количества фосфо-S6RP, 4Е-ВР1 и/или AKT перед, во время/или после введения дигидропиразино-пиразинового соединения. В определенных вариантах осуществления пациент страдает мультиформной глиобластомой, отличающейся экспрессией белка MGMT и/или статусом метилирования промотора MGMT.

В других вариантах осуществления в настоящем описании представлены наборы, содержащие дигидропиразино-пиразиновое соединение, и средства дли измерения степени ингибирования активности ДНК-зависимой протеинкиназы (ДНК-РК) у пациента. В определенных вариантах осуществления наборы содержат средства для измерения степени ингибирования активности ДНК-зависимой протеинкиназы (ДНК-РК) в кожном образце и/или опухолевой биопсии/аспирате пациента. В одном из вариантов осуществления наборы содержат средства для измерения количества S2056 pDNA-PK в кожном образце и/или опухолевой биопсии/аспирате пациента. В одном из вариантов осуществления кожный образец облучают УФ-светом. В определенных вариантах осуществления в настоящем описании представлены наборы, содержащие дигидропиразино-пиразиновое соединение, и средства для измерения степени ингибирования активности ДНК-зависимой протеинкиназы (ДНК-РК) перед, в время и/или после введения дигидропиразино-пиразинового соединения. В определенных вариантах осуществления в настоящем описании представлены наборы, содержащие дигидропиразино-пиразиновое соединение, и средства для измерения уровня фосфорилирования ДНК-РК S2056 перед, во время и/или после введения дигидропиразинопиразинового соединения. В определенных вариантах осуществления пациент страдает мультиформной глиобластомом, отличающейся экспрессией белка MGMT и/или статусом метилирования промотора MGMT.

В определенных вариантах осуществления в настоящем документе представлены наборы, содержащие количество дигидропиразино-пиразинового соединения, эффективное для лечения ли профилактики мультиформной глиобластомы, отличающейся экспрессией белка MGMT и/или статусом метилирования промотора MGMT. В определенных вариантах осуществления в настоящем документе представлены наборы, содержащие Соединение 1.

В определенных вариантах осуществления в настоящем документе дополнительно представлены наборы, содержащие инструкции для применения, например, для применения дигидропиразинопиразинового соединения и/или мониторинга ответа пациента на введение дигидропиразинопиразинового соединения

Примеры

Составы соединения

Проиллюстрированные составы соединения 1, которые могут быть использованы в способах, приведенных в настоящем описании, представлены ниже в табл. 1.

- 12 030808

Таблица 1. Примеры составов таблеток

	% масс./масс. (мг)
Партия #	1	2	3	4
Ингредиенты
Соединение 1 (активный ингредиент)	10	10	10	10
Маннит (Mannogem EZ)	qs	qs	qs	qs
Микрокристаллическая целлюлоза (РН 112)	25	25	25	25
Крахмалгликолят натрия	3	3	3	3
Диоксид кремния	1	1	1	1
Стеариновая кислота	0, 5	0,5	0, 5	0, 5
Динатрий ЭДТА			0, 5	0, 5
ВНТ		0,4		0, 4
Стеарат магния	0, 65	0, 65	0, 65	0, 65
Всего	100	100	100	100
Цвет	Желтый	Желтый	Желтый	Желтый

Биологические примеры Биохимические анализы

Анализ mTOR HTR-FRET.

Далее приведен пример анализа, который может использоваться для определения ингибирующей активности в отношении киназы TOR тестируемого соединения. Дигидропиразино-пиразиновые соединения растворяли в DMSO и получали как 10 мМ основные растворы и для экспериментов разбавляли соответствующим образом. Реагенты получали следующим образом:

"Простой буфер TOR" (использовали для разбавления высокоглицериновую фракцию TOR): 10 мМ Tris pH 7,4, 100 мМ NaCl, 0,1% Tween-20, 1 мМ DTT. Invitrogen mTOR (кат.№ PV4753) разбавляли в этом буфере для анализа концентрации 0,200 мкг/мл.

Раствор АТФ/субстрат: 0,075 мМ АТФ, 12,5 мМ MnCl2, 50 мМ Hepes, pH 7,4, 50 мМ β-GOP, 250 нМ микроцистин LR, 0,25 мМ ЭДТА, 5 мМ DTT и 3,5 мкг/мл GST-p70S6.

Раствор реагента для детекции: 50 мМ HEPES, рН 7,4, 0,01% Triton Х-100, 0,01% BSA, 0,1 мМ ЭДТА, 12,7 мкг/мл Cy5-aGST Amersham (кат. № PA92002V), 9 нг/мл α-фосфо p70S6 (Thr389) (моноклональное мышиное в клеточном сигнальном пути #9206L), 627 нг/мл α-мышь Lance Eu (Perkin Elmer Кат. № AD0077).

К 20 мкл простого буфера mTOR добавляли 0,5 мкл тестируемого соединения в DMSO. Для инициирования реакции к 20 мкл раствора обычного буфера TOR (контроль) и к раствору соединения, полученному выше, добавляли 5 мкл раствора АТФ/субстрат. Анализ останавливали через 60 мин, добавляя 5 мкл раствора 60 мМ ЭДТА; затем добавляли 10 мкл раствора реагента для детекции, и смесь оставляли отстаиваться в течение по меньшей мере 2 ч перед считыванием на ридере для микропланшетов PerkinElmer Envision с установками для детекции LANCE Eu TR-FRET (возбуждение при 320 нм и испускание при 495/520 нм).

Дигидропиразино-пиразиновые соединения тестировали в анализе mTOR HTR-FRET и было обнаружено, что они имеют активность, причем некоторые соединения имеют IC50 ниже 10 мкМ в анализе, некоторые соединения имеют IC50 между 0,005 нМ и 250 нМ, другие имеют IC50 между 250 н и 500 нМ, другие имеют IC50 между 500 нМ и 1 мкМ, и другие имеют IC50 между 1 и 10 мкМ.

Анализ ДНК-РК.

Анализ ДНК-РК осуществляли, используя методики, основанные на наборе для анализа ДНК-РК Promega (кат. № V7810). ДНК-РК фермент можно приобрести от Promega (Promega кат. № V5811).

Выбранные дигидропиразино-пиразиновые соединения, такие как описано в настоящем документ, имеют или ожидаются, что будут иметь IC50 ниже 10 мкМ в этом анализе, при этом некоторые дигидропиразино-пиразиновые соединения, такие как описано в настоящем документе, имеют IC50 ниже 1 мкМ, а другие имеют IC50 ниже 0,10 мкМ.

Клеточные анализы

Анализ ингибирования роста мультиформной глиобластомы (GBM), отличающейся экспрессией белка MGMT и/или статусом метилирования промотора MGMT. Соединение может быть тестировано следующим образом: Тестируемое соединение (дигидропиразино-пиразиновое соединение, описанное в настоящем документе) растворяют в диметилсульфоксиде (DMSO) с получением 10 мМ основного раствора. Серийное титрование осуществляют для получения рабочих концентраций в диапазоне от 1,5 мкМ до 10 мМ. Аликвоты для получения конечных концентраций от 1,5 нМ до 10 мкМ прокапывали при помощи акустического диспенсера (EDC ATS-100b пустую 384-луночную плашку. Тестируемое соединение прокапывали методом 10-и точкового серийного разведения (3-х кратное разведение) в двух повто- 13 030808

рениях в пределах плашки. Концентрацию DMSO поддерживали постоянной для конечной аналитической концентрации 0,1% DMSO. Плашки повторяли для применения с различными клетками GBM (например, линии клеток GBM или образцы, полученные у пациента) и тестируемых периодов. После копирования плашек с соединением все плашки герметизировали (Agilent ThermoLoc) и хранили при -20°С в период времени до 1 месяца. Когда плашки были готовы к тестированию их вынимали из морозильника, размораживали и открывали сразу перед добавлением тестируемого соединения. До тестирования клетки выращивали, и они делились во флаконах для культивирования для обеспечения достаточных количеств исходных веществ. Клетки затем разбавляли до подходящей плотности и непосредственно добавляли в 348-луночные планшеты с раскапанным тестируемым соединением. Клетки оставляли расти в течение 72 ч при 37°С/5% CO₂. В момент добавления тестируемых соединений (t₀), количество инициирующих клеток оценивали в анализе на выживаемость (Cell Titer-Glo) путем количественного определения уровня люминесценции, генерируемой АТФ, присутствующей в жизнеспособных клетках. Через 72 ч жизнеспособность клеток, обработанных тестируемым соединением, оценивали Cell Titer-Glo и измеряли люминесценцию. Клеточные линии анализировали на ингибирование роста испытуемым соединением в по меньшей мере 3-х независимых испытаниях. Контрольную клеточную линию включали в каждый анализ. Ответ тестируемого соединения против контрольной клеточной линии тщательно контролировали для возможности сравнения данных, полученных в течение анализа. Все данные нормализовали и представляли как процент от DMSO-обработанных клеток. Результаты затем выражали как значение GI₅₀. Значение GI₅₀ корректировали для определения клеток в нулевой момент времени. Статус метилирования промотора MGMT определяется, например, ПЦР, специфическим для метилирования, (MSP) и бисульфитным секвинированием (BiSEQ) 24 соседних CpG-сайтов. Кроме того, экспрессия белка MGMT может быть определен, например, с помощью иммуногистохимии или Вестерн-блоттинга.

В одном из вариантов осуществления дигидропиразино-пиразиновые соединения показали ингибирование роста клеток GBM, характеризующихся гипометилированием промотора MGMT. В еще одном варианте осуществления дигидропиразино-пиразиновое соединение показали ингибирование роста клеток GBM, характеризующихся экспрессией белка MGMT.

Анализ апоптоза клеток GBM, отличающихся экспрессией белка MGMT и/или статусом метилирования промотора MGMT

Перед тестированием клетки GBM выращивали и их количество увеличивали в флаконах для культивации для того, чтобы обеспечить достаточное количество исходного материала. Клетки затем разбавляли до требуемых концентраций и добавляли непосредственно в 384-луночные планшеты с прокапанным тестируемым соединением. Клетки культивировали в течение 24 ч в 5% CO₂ при 37°С. Апоптозный ответ оценивали по количественной активности каспазы 3 и каспазы 7 (Caspase 3/7-Glo) в обработанных клетках и контрольных клетках в 24-часовой временной точке. Все данные нормализовали и представляли как значение по отношению к DMSO-обработанным клеткам. Результаты затем выражали как CalX, который представляет собой минимальной концентрацией тестируемого соединения, необходимую для удвоения уровней каспазы 3/7 по отношению к уровням DMSO-обработанных клеток, в период их обработки.

Статус метилирвоания промотора MGMT определяли с помощью, например, ПЦР, специфическим для метилирования, (MSP) и бисульфитным секвинированием (BiSEQ) 24 соседних CpG-сайтов. Кроме того, экспрессию белка MGMT определяли с помощью, например, иммуногистохимии или вестернблоттинга.

В одном варианте осуществления дигидропиразино-пиразиновые соединения демонстрировали апоптоз клеток GBM, характеризующихся гипометилированием промотора MGMT. В другом варианте осуществления дигидропиразино-пиразиновые соединения демонстрируют апоптоза клеток GBM, характеризующихся экспрессией белка MGMT.

Анализ числа клеток глиомасферы

Образцы опухоли, полученные у пациентов с первичной GBM, диссоциировали и помещали в условия культивирования, при которых продуцируются глиомасферы (т.е. среда DMEM/F12, дополненная В27, 20 нг/мл bFGF, 50 нг/мл EGF, пенициллин/стрептомицин, L-глутамин и 5 мкг/мл гепарина). Клетки высевали при плотности 5000 клеток/лунка и оставляли акклиматизироваться на ночь при 37°С. Дигидропиразино-пиразиновые соединения добавляли в культуры на День 2 и клетки поддерживали в культуре до Дня 9. На День 9 клетки фиксировали PFA/метанол и на следующий день оценивали число клеток, используя, например, SYTO-9 флуоресцентный ДНК-краситель. Плашки считывали через 48 ч с помощью визуализации лазерным сканированием. Результаты Соединения показаны в табл. 6. Значения IC₅₀ представляют собой 50% от числа клеток по сравнению с контролем DMSO. Как видно на табл. 6 Соединение 1 показало активность в отношении клеток GBM, которые экспрессируют белок MGMT, и клеток GBM, которые имеют гипометилированный промотор MGMT.

- 14 030808

Клеточная линия	Диагноз	ампл. EGFR	EGFR viii	Статус PTEN (опухоль)	Статус PTEN (клеточная линия)	Статус метилирования или экспрессии MGMT	Соедин.1 ПС50нМ) , Выживание клеток
248	Рецидивирующий		-	+	+	Немного повышен	441,3
371	Рецидивирующий	+	-	+/-	+	-	367,8
301	Первичный	+			-	-	312, 6
ззб	Рецидивирующий				+	+	231,3
393	Первичный		-			+	178,2
206	Рецидивирующий			-	+	Неизв./высокоэксперссируемый	163
347	Рецидивирующий	+		+/-	-	-	162,9
229	Рецидивирующий				-		115, 4
277	Вторичный/ рецидивирующий				+		107, 1
207	Рецидивирующий				4-		100
254	Рецидивирующий				+		99, 6
350	Рецидивирующий				-		99, 6
378	Рецидивирующий	+				-	81,3
296	Рецидивирующий	+			-	-	74,5
250	Рецидивирующий	-		-	-	Неизв./высокоэксперссируемый	70, 6
217	Первичный			-	-		71, 9
245	Рецидивирующий	+		+	+		68,7
308	Рецидивирующий	-		-	+	Неизв./высокоэксперссируемый	68,2
390	Первичный	-	-	-	+	-	65, 9
157	Первичный				+	-	46, 8
374	Первичный		+			-	165, 0

Анализ образования глиомасферы

Образцы опухолей, полученные у больных GBM, получающих первичную помощь, разделяли и помещали в условия культивирования (т.е. среда DMEM/F12 с добавлением В27, 20 нг/мл bFGF, 50 нг/мл EGF, пенициллин/стрептомицин, L-глутамин и 5 мкг/мл гепарина), что давало глиомасферы. Клетки высевали с плотностью 50 клеток на лунку и оставляли акклиматизироваться в течение ночи при 37°С. В культуры добавляли дигидропиразино-пиразиновые соединения на день 2 и пополняли каждый 7-ой день. Также каждый 7-ой день пополняли EGF и FGF. Когда самая маленькая сфера становилась больше 60 микрон, клетки фиксировали с помощью PFA/метанол тогда, обычно на 3-5 неделю. Клетки фиксировали PFA/метанолом и на следующий день оценивали количество клеток, используя, например, флуоресцентный краситель ДНК SYT0-9. Плашки считывали через 48 ч с помощью устройства формирования изображения с использованием лазерного сканирования. Значения IC₅₀ представляют 50% сферообразования по сравнению с контролем DMSO. Как видно из табл. 7 Соединение 1 показало активность в отношении клеток GBM с экспрессией белка MGMT.

Клеточная линия	Диагноз	ампл. EGFR	EGFR viii	Статус PTEN (опухоль)	Статус PTEN (клеточная линия)	Статус метилирования или экспрессии MGMT	Сферообразование, Соединение 1 (ICso-hM)
248	Рецидивирующий		-	-ь	-ь	Немного повышен
371	Рецидивирующий	+	-	+/-		-
301	Первичный	+			-	-
336	Рецидивирующий					+
393	Первичный		-			+
206	Рецидивирующий			-	-ь	Неизв./высокоэксперссируемый	142,4
347	Рецидивирующий	+		+/-	-	-
229	Рецидивирующий				-
277	Вторичный/ рецидивирующий				-ь
207	Рецидивирующий
254	Рецидивирующий				+
350	Рецидивирующий				-		39, 3
378	Рецидивирующий	+				-
296	Рецидивирующий	+			-	-	544,3

- 15 030808

250	Рецидивирующий	-		-	-	Неизв./высокозксперссируемый	39, 6
217	Первичный			-	-		42,1
245	Рецидивирующий	+		+	+		22, 6
308	Рецидивирующий	-		-	+	Неизв./высокоэксперссируемый
390	Первичный	-	-	-	+	-
157	Первичный				+	-
309	Рецидивирующий					Не определен	159, 3
282	Первичный					Не определен	25, 8

Анализ сферообразования

Линии клеток, полученные у больных GBM и культивированные в культуральных условиях для опухолевого сферообразования, поддерживали в виде высокогетерогенной популяции клеток, включая клетки, инициирующие сферообразование и более коммитированные клетки-предшественницы с ограниченной способностью к пролиферации. Для определения специфического нацеливания Соединения 1 на популяции сферообразующих клеток авторы проводили анализ повторного сферообразования после предварительной обработки Соединением 1. 500000 клеток/10 мл среды для опухолевого сферообразования обрабатывали указанной дозой Соединения 1 в течение 7 дней. Клетки, которые выживали на 7-ой день обработки, отмывали от соединения 1, диссоциировали на единичные клетки и высевали с плотностью клонирования анализа сферообразования без Соединения 1. На фиг. 1 показано, что в случае клеточных линий 206, 217, 254 и 282, полученных у больных GBM, число сфер, образованных клетками, которые выживали после предварительной обработке различными дозами Соединения 1, значительно не отличалось от числа сфер, образованных контрольными необработанными клетками, что предполагает, что процент клеток, инициирующих сферообразование, в общей клеточной популяции клеточных линий, полученных у пациента, не изменялся от обработки Соединением 1. Соединение 1 может нацеливаться как на клетки, инициирующие сферообразование, так и на более коммитированные клеткипредшественницы, поэтому процент клеток, инициирующих сферообразование, в культуре оставался постоянным после обработки Соединением 1. После обработки клеточной линии 254 500 нМ Соединения 1 повторное опухолевое сферообразование отсутствовало, что предполагает, что 500 нМ Соединения 1 является цитотоксичным для клеток, инициирующих сферообразование, в клеточной линии 254. Линия клеток 282 не тестировалась при концентрации 100 нМ или 500 нМ соединения 1.

Комбинированный эффект Соединения 1 и темезоломида (TMZ) на клеточную линию, устойчивую к действию TMZ и чувствительную к действию TMZ, полученную у больного GBM TMZ представляет собой алкилирующее средство, которое доставляет метильную группу к пуриновому основанию ДНК (О⁶-гуанин; Н⁷-гуанин и Н³-аденин). Цитотоксическое повреждение, О⁶метилгуанин (O⁶-MeG), вызванное TMZ, может быть непосредственно восстановлено метилгуанинметилтрансферазой (MGMT) за счет прямого восстановления и может также активировать механизмы репарации ошибок спаривания (MMR). Футильные циклы MMR приводят к образованию разрывов двухцепочечной ДНК и активации ДНК-РК-опосредованных механизмов восстановления двухцепочечного разрыва. Так как Соединение 1 ингибирует mTORC1 и mTORC2, компоненты Р13-киназного пути передачи сигнала, а также ДНК-РК, фермент, который опосредует путь восстановления двухцепочечной ДНК, NHEJ, то комбинированную обработку Соединением 1 и TMZ анализировали на усиление уничтожающего эффекта TMZ на клеточные линии, полученные у больных GBM.

Опухолевые сферы, которые росли в условиях культивирования для опухолевого сферообразования, собирали, диссоциировали на единичные клетки и высевали при 5000 клеток/лунки в 96-луночных плашках. TMZ и Соединение 1 параллельно дозировали и 12 лунок с комбинирований дозой обрабатывали в течение 7 дней перед подсчетом клеток. Когда значение столбца "% фактического ингибирования" делили на "% ингибирования, расчитанный на основе суммирования", то значение > 1=синергизм, ~ 1 = суммирование, < 1=антагонизм.

- 16 030808

Таблица 7. Расчет фракционного продукта для сопутствующих комбинаций TMZ и Соединения 1 для клеточной линии 206, полученной у больного GBM

Линия клеток 206, которая имеет высокий уровень экспрессии мРНК MGMT, является устойчивой к действию TMZ, доказательством чего служит минимальное ингибирующее действие 50, 100 и 200 мкМ TMZ на выживание клеток (табл. 8). Сопутствующая обработка TMZ, при 25 или 50 мкМ, вместе с низкой дозой Соединения 1, например 50 нМ, синергетически ингибировала выживание клеток GBM. При высокой дозе Соединения 1 сопутствующая обработка Соединением 1 и TMZ давала аддитивные эффекты (табл. 8). Этот результат позволяет предположить, что Соединение 1 в комбинации с TMZ обладает синергическим эффектом на устойчивость GBM к действию TMZ, который может быть дозозависимым.

Таблица 8. Расчет фракционного продукта для сопутствующих комбинаций TMZ и Соединения 1 для клеточной линии 217, полученной у больного GBM

TMZ [МКМ]	Соед.1 [НМ]	о, фактического ингиб.	% ингиб., рассчитанного от суммиро б ания	фактического ингиб./% ингиб., рассчитанного от суммирования
25		69, 0S
50		73, OS
100		77, 0%
	100	51, OS
25	100	78, 4%	85, 1%	0,92
50	100	8 0, 4S	87, 1%	0,92
100	100	83, 7%	88, 7%	0,94

Эффект комбинированной обработки Соединением 1 и TMZ также тестировали на клеточной линии 217, чувствительной к действию TMZ. Обработка TMZ при 25, 50 и 100 мкМ ингибировала выживание клеток при 69, 73, и 77% соответственно (табл. 9), что показывает, что линия 217 является линией, чувствительной к действию TMZ. В случае линии 217 параллельная обработка различными комбинациями доз Соединения 1 и TMZ, давала аддитивный эффект (табл. 9), что предполагает, что Соединение 1 ни усиливает, ни антагонизирует уничтожение клеток, вызываемое TMZ, в клеточной линии, чувствительной к действию TMZ.

Анализы in vivo

Исследования ксенотрансплантатов проводили на GBM, отличающейся экспрессией белка MGMT

и/или статусом метилирования промотора MGMT и/или статусом экспрессии опухоли у мыши. Мышам

SCID или "голым" мышам инокулировали подкожно клетки GBM, отличающиеся экспрессией белка

MGMT и/или статусом метилирования промотора MGMT и статусом экспрессии в боковую область вы- 17 030808

ше правой задней лапы. После инокуляции животных опухоли давали расти до 150-200 мм³ до рандомизации. Испытуемое соединение вводили в состав вместе с 0,5% CMC и 0,25% Tween 80 в воде (в виде суспензии). Животным перорально вводили носитель (CMC-Tween) или испытуемое соединение один раз в сутки (QD) в течение 26-40 дней. Дозы испытуемого соединения могут изменяться от 1 до 5 мг/кг. Опухоли измеряли два раза в неделю с помощью кронциркуля и объемы опухолей рассчитывали, используя формулу W²xL/2 (где "W" представляет собой ширину опухоли и "L" представляет собой длину опухоли).

Исследование эффективности Соединения 1 на нейросферах глиобластомы больных и на ксенотрансплантатных опухолях.

Мышам с нарушенным иммунитетом ("голые" мыши NCRNU-M, TACTONIC) имплантировали линии нейросфер GBM, полученной из свежих хирургических образцов. Клеточная линия характеризовалась следующим:

Нейросфера GBM	Классификация	Статус MGMT	Известные мутации
HF2354	Первичная GBM, проведелено лечение Глиадель	-	ТР53 V216L

Обработка ксенотрансплантанта, полученного у больного (PDX), начиналась за четыре недели до предполагаемого появления симптомов у первого животного. Соединение 1 вводили в дозе 5 мг/кг и 10 мг/кг, соответственно, через желудочный зонд один раз в день, с понедельника по пятницу. Животным контрольной группы вводили только носитель. Группу намеченной цели обрабатывали одной дозой каждого соединения и умерщвляли через 2 и 24 ч (п=3/группу). При необходимости, для снижения потери веса давали жидкости и дополнительную пищу.

Результаты: Монотерапия Соединением 1 значительно повышала выживания PDX HF2354 (см. фиг. 2) Клиническое исследование

Фаза 1В, комплексное открытое исследование с поиском дозы для оценки безопасности, переносимости, фармакокинетических параметров и предварительной эффективности Соединения 1, вводимого перорально индивидуумам с GBM, отличающейся экспрессией белка MGMT и/или статусом метилирования промотора MGMT

Цели исследования

Основными задачами исследования было определить:

(1) безопасность и переносимость Соединения 1;

(2) непереносимую дозу (NTD) Соединения 1;

(3) максимально переносимую дозу (MTD) Соединения 1 и

(4) фармакокинетические параметры (РК) Соединения 1, при пероральном введении Соединения 1 больным GBM, отличающейся экспрессией белка MGMT и/или статусом метилирования промотора MGMT.

Дополнительными целями исследования было:

(1) оценить степень ингибирования фосфорилирования S6RP и/или 4Е-ВР1 для активности mTORCl и AKT и/или других соответствующих биомаркеров активности mTORC2 в крови, коже и/или в опухолевых биопсиях/аспиратах, при наличии перед и во время лечения Соединением 1;

(2) оценить ингибирование активности ДНК-зависимой протеинкиназы (DNA-PK) в образцах кожи, облученных УФ-светом, и/или опухолевых биопсиях/аспиратах, используя S2056 pDNA-PK и/или другие соответствующие биомаркеры путей повреждения ДНК, перед и во время лечения Соединением 1 и

(3) оценить эффективность Соединения 1.

Поисковыми целями исследования были:

(1) оценить гомеостаз глюкозы во время лечения Соединением 1;

(2) изучить взаимосвязь между присутствием Соединения 1 в крови и в опухоли и ответа (ингибирование mTOR и биомаркеров ДНК-РК);

(3) изучить взаимосвязь между наличием Соединения 1 в крови и в опухоли с клиническими и побочными эффектами (АЕ);

(4) изучить влияние Соединения 1 на биомаркеры, включая апоптоз и/или ингибирование пролиферации, перед и во время обработки биопсии опухоли, при наличии;

(5) исследовать, могут ли ответы на Соединение 1 быть объяснены различиями в экспрессии белка или генетической изменчивостью, в том числе, но ими не ограничиваясь, исследовать компоненты путей PI3K/Akt/mTOR, путей ответа на повреждение ДНК и семейство генов р53;

(6) определить основные метаболиты Соединения 1 в плазме и моче и

(7) проанализировать восстановление СТС для молекулярных патологий и изменение в mTOR и биомаркеров ДНК-РК.

- 18 030808

План исследования

В этом исследовании Соединение 1 вводили перорально больным с GBM, отличающейся экспрессией белка MGMT и/или статусом метилирования промотора MGMT.

Индивиды начинали с Соединения 1 в дозе 10 мг BID. Индивидов оценивают на безопасность и

противоопухолевую активность после каждого второго/третьего цикла терапии.

Исследуемая популяция

Мужчины и женщины от 18 лет и старше, с GBM, отличающейся экспрессией белка MGMT и/или статусом метилирования промотора MGMT, и в том числе индивиды, у которых отмечалось улучшение при проведении (или у которых не было устойчивости) стандартной противораковой терапии, или для которых не существует одобренной терапии.

Критерии включения

Критериями включения являются:

(1) способность понять и добровольно подписать документ о согласии перед проведением любых связанных с исследованиями оценками/процедурами;

(2) мужчины и женщины от 18 лет и старше с гистологическими и цитологическими подтверждениями GBM, характеризующейся экспрессией белка MGMT и/или статусом метилирования промотора MGMT;

(3) согласие на скрининговую биопсию опухоли;

(4) ECOG PS, равный 0 или 1;

(5) следующие лабораторные показатели:

(i) абсолютное число нейтрофилов (ANC) >1,5х10⁹/л;

(ii) гемоглобин (HGB) >9 г/дл;

(iii) тромбоциты (plt) >100х10⁹/л;

(iv) калий в пределах нормы, или корректируемый добавками;

(v) AST/SGOT и ALT/SGPT <2,5х верхний предел нормы (ULN) или <5,0xULN, если имеется опухоль печени;

(vi) сывороточный общий билирубин <1,5xULN;

(vii) сывороточный креатинин <1,5xULN, или 24-часовой клиренс >50 мл/мин и

(viii) отрицательный сывороточный тест на беременность или отрицательный сывороточный тест на беременность в моче в течение 72 ч до начала исследования лечения у женщин детородного возраста;

(6) возможность вписаться в график исследования и в другие требования протоколов;

(7) согласие на получение опухолевой ткани, фиксированной формалин-парафин (FFPE), для архивирования, либо срезов в опухолевых участках или секционных/полученных для анализа образцов;

(8) гистологически-подтвержденная GBM, характеризуемая экспрессией белка GBM и/или статусом метилирования промотора MGMT;

(9) получение предварительного лечения, включая радиационную и/или химиотерапию, с радиацией, завершенной > за 12 недель до Дня 1;

(10) запланированная хирургическая резекция опухоли на День 15±7, с ожидаемым выходом > 300 мг ткани опухоли. Скрининговая биопсия опухоли не требуется;

(11) отсутствие до или в плане имплантата пластины Gliadel®, если область для оценки и планируемой резекции не находится за пределами области, где он ранее был имплантирован;

(12) отсутствие интерстициальной брахитерапии или стереотаксической радиохирургии перед анализом, если область для оценки и планируемой резекции не находится за пределами области, где они ранее были проведены;

(13) отсутствие лечения энзим-индуцирующими противоэпилептическими средствами (EIAED), такими как карбамазепин, фенитоин, фенобарбитал, примидон или в течение 14 дней до Дня 1;

(14) наличие состояния, при котором возможно пройти повторные магнитно-резонансные томографические (МРТ) сканирования. Группа может быть расширена, внеся в список минимум 5 индивидов с опухолями, сверхэкспрессирующими ДНК-РК.

Длительность исследования

Индивидуумы начинали прием Соединения 1 с дозой 10 мг BID ежесуточно с циклами 28 дней. Прием Соединения 1 может быть прекращен при наличии доказательств прогрессирования опухоли, но индивидуум может продолжать получать тестируемый препарат до тех пор, пока исследователь считает получение выгоды. Терапия прекращается, если отмечается неприемлемая токсичность или индивид решает выйти из исследования.

Регистрация, как ожидается, займет приблизительно 30 месяцев. Расширенное лечение отвечающих индивидов и дополнительные действия могут продолжаться еще 3-6 месяцев.

Исследуемое лечение

Соединение 1 дают в виде капсул для перорального введения или как внутрижелудочный/кишечный зонд для искусственного кормления, если это возможно. Большинство индивидуумов

начинают прием Соединения 1 с дозой 10 мг BID.

- 19 030808

Обзор эффективности оценок

Все индивидуумы, получавшие лечение, должны быть включены в анализ эффективности. Переменная первичной эффективности является ответом опухоли на основании оценки исследователя, используя оценку ответа для рабочей группы по нейроонкологии (RANO) для GBM. Также должны быть проанализированы дополнительные переменные эффективности (например, определение количества СТС).

Обзор оценки безопасности

Первичные переменные безопасности и переменные исследования безопасности для данного исследования включают АЕ, комплексные панели клинических лабораторных переменных (включая гематологию, химию, иммунологию и функцию щитовидной железы, и аналиты при оценке гомеостаза глюкозы), централизованная тройная электрокардиограмма (ЭКГ) в 12 отведениях, оценка фракция выброса левого желудочка (LVEF), медицинский осмотр, статус производительности ECOG (ECOG PS) и жизненно важные признаки.

Комитетом по безопасности (SRC) определяются соответствующая доза, дозы или схема введения. SRC продолжит проводить регулярную оценку данных и сделает рекомендации о продолжении исследования, при необходимости.

Обзор фармакокинетических оценок

Профили РК Соединения 1 и любого значимого обнаруживаемого метаболита определяют из серийного забора крови и мочи, включая опухолевую ткань, если имеется, и коррелируют с результатами PD, если это возможно.

Обзор фармакодинамических оценок

Исследовательские конечные точки включают ингибирование mTOR и биомаркера ДНК-РК в циркулирующих клетках крови, и других опухолевых клетках и/или тканях и аспиратах, если возможно, УФстимулированная активность ДНК-РК в коже, гистопатологический ответ и корреляции с фармакогеномными данными. Пару (перед и вовремя лечения) биопсий опухоли берут у большинства индивидуумов с опухолевыми нарушениями, определенными исследователем как способную к биопсии. Анализ должен включать в себя биомаркеры апоптоза и пролиферации в крови, коже и/или образцах опухолей, если возможно.

Обзор оценки прогнозируемых биомаркеров

Уровень мутаций и/или белка компонентов в соответствующем сигнальном пути включая, но ими не ограничиваясь, PI3K/MTOR, восстановление повреждения ДНК и путь р53 исследовали для идентификации возможных прогнозируемых биомаркеров.

В определенных вариантах осуществления больные GBM, проходящие лечение по протоколу, как описано в настоящем документе, показывают положительный опухолевый ответ, например ингибирование роста опухоли или уменьшение размера опухоли. В определенных вариантах осуществления пациенты, проходящие лечение по протоколу, как описано в настоящем документе, показывают улучшение оценки ответа для рабочей группы по нейроонкологии (RANO). В некоторых таких вариантах осуществления больные GBM отличаются экспрессией белка MGMT и/или статусом метилирования промотора MGMT. В одном из таких вариантах осуществления промотор MGMT является гипометилированным. В другом варианте осуществления белок MGMT является экспрессированным.

Был цитирован ряд ссылок, описания которых приведены в настоящем документе в качестве ссылки в полном объеме. Варианты осуществления, описанные в настоящем документе, не должны ограничиваться к определенным вариантом осуществления, раскрытым в примерах, которые предназначены в качестве иллюстративных для некоторых аспектов раскрытых вариантов осуществления и любой вариант осуществления, который является функционально эквивалентным, входит в рамки настоящего изобретения. Фактически, различные модификации вариантов осуществления, описанных в настоящем документе, приведены в дополнение к тем вариантам, которые показаны и раскрыты в настоящем документе и будут очевидны специалистам в данной области и подразумевается, что они входят в рамки прилагаемой формулы изобретения.

Claims (34)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Способ лечения мультиформной глиобластомы, отличающейся экспрессией белка MGMT и/или гипометилированием промотора MGMT, включающий введение пациенту эффективного количества 1этил-7-(2-метил-6-(1Н-1,2,4-триазол-3-ил)пиридин-3-ил)-3,4-дигидропиразино[2,3-b]пиразин-2(1Н)-она или его фармацевтически приемлемой соли, стереоизомера или таутомера.
2. 2. Способ по п.1, где мультиформная глиобластома является глиобластомой, при которой активирован сигнальный путь PI3K/mTOR.
3. 3. Способ по п.2, где мультиформная глиобластома является глиобластомой, при которой активация сигнального пути PI3K/mTOR происходит в результате мутации ERBB2, мутации или делеции PTEN, мутации или делеции NF1, мутации PIK3Са, мутации или сверхэкспрессии EGFR, амплификации Met, активации или амплификации PDGFRa, амплификации AKT или их комбинации.

   - 20 030808
4. 4. Способ по п.1, где указанному пациенту вводят от приблизительно 0,5 до приблизительно 45 мг/сутки 1-этил-7-(2-метил-6-(1Н-1,2,4-триазол-3-ил)пиридин-3-ил)-3,4-дигидропиразино[2,3-Ъ]пиразин2(1Н)-она или его фармацевтически приемлемой соли, стереоизомера или таутомера.
5. 5. Способ по п.1, где мультиформная глиобластома отличается экспрессией белка MGMT.
6. 6. Способ по п.1, где мультиформная глиобластома отличается гипометилированием протомора MGMT.
7. 7. Способ достижения полного ответа, частичного ответа или стабильного заболевания в соответствии с оценкой ответа рабочей группы по нейроонкологии (RANO) мультиформной глиобластомы у больного мультиформной глиобластомой, отличающейся экспрессией MGMT и/или гипометилированием промотора MGMT, включающий введение эффективного количества 1-этил-7-(2-метил-6-(1Н-1,2,4триазол-3-ил)пиридин-3-ил)-3,4-дигидропиразино[2,3-Ъ]пиразин-2(1Н)-она или его фармацевтически приемлемой соли, стереоизомера или таутомера указанному пациенту.
8. 8. Способ по п.7, где мультиформная глиобластома является глиобластомой, при которой активирован сигнальный путь PI3K/mTOR.
9. 9. Способ по п.8, где мультиформная глиобластома является глиобластомой, при которой активация сигнального пути PI3K/mTOR происходит в результате мутации ERBB2, мутации или делеции PTEN, мутации или делеции NF1, мутации PIK3Са, мутации или сверхэкспрессии EGFR, амплификации Met, активации или амплификации PDGFRa, амплификации AKT или их комбинации.
10. 10. Способ по п.7, где мультиформная глиобластома отличается экспрессией белка MGMT.
11. 11. Способ по п.7, где мультиформная глиобластома отличается гипометилированием протомора MGMT.
12. 12. Способ ингибирования фосфорилирования S6RP, 4Е-ВР1 и/или AKT у пациента с мультиформной глиобластомой (GBM), отличающейся экспрессией белка MGMT или гипометилированием промотора MGMT, включающий введение эффективного количества 1-этил-7-(2-метил-6-(1Н-1,2,4-триазол-3ил)пиридин-3-ил)-3,4-дигидропиразино[2,3-Ъ]пиразин-2(1Н)-она или его фармацевтически приемлемой соли, стереоизомера или таутомера указанному пациенту.
13. 13. Способ по п.10, где мультиформная глиобластома является глиобластомой, при которой активирован сигнальный путь PI3K/mTOR.
14. 14. Способ по п.13, где мультиформная глиобластома является глиобластомой, при которой активация сигнального пути PI3K/mTOR происходит в результате мутации ERBB2, мутации или делеции PTEN, мутации или делеции NF1, мутации PIK3Са, мутации или сверхэкспрессии EGFR, амплификации Met, активации или амплификации PDGFRa, амплификации АКТ или их комбинации.
15. 15. Способ по п.10, где мультиформная глиобластома отличается экспрессией белка MGMT.
16. 16. Способ по п.10, где мультиформная глиобластома отличается гипометилированием протомора MGMT.
17. 17. Способ ингибирования активности ДНК-зависимой протеинкиназы (ДНК-PK) у пациента с мультиформной глиобластомой (GBM), отличающейся экспрессией белка MGMT или гипометилированием промотора MGMT, включающий введение эффективного количества 1-этил-7-(2-метил-6-(1Н-1,2,4триазол-3-ил)пиридин-3-ил)-3,4-дигидропиразино[2,3-Ъ]пиразин-2(1Н)-она или его фармацевтически приемлемой соли, стереоизомера или таутомера указанному пациенту.
18. 18. Способ по п.17, где мультиформная глиобластома является глиобластомой, при которой активирован сигнальный путь PI3K/mTOR.
19. 19. Способ по п.18, где мультиформная глиобластома является глиобластомой, при которой активация сигнального пути PI3K/mTOR происходит в результате мутации ERBB2, мутации или делеции PTEN, мутации или делеции NF1, мутации PIK3Са, мутации или сверхэкспрессии EGFR, амплификации Met, активации или амплификации PDGFRa, амплификации AKT или их комбинации.
20. 20. Способ по п.17, где мультиформная глиобластома отличается экспрессией белка MGMT.
21. 21. Способ по п.17, где мультиформная глиобластома отличается гипометилированием протомора MGMT.
22. 22. Способ измерения ингибирования фосфорилирования S6RP, 4Е-ВР1 или AKT у пациента с мультиформной глиобластомой (GBM), отличающейся экспрессией белка MGMT или гипометилированием промотора MGMT, включающий введение эффективного количества 1-этил-7-(2-метил-6-(1Н-1,2,4триазол-3-ил)пиридин-3-ил)-3,4-дигидропиразино[2,3-Ъ]пиразин-2(1Н)-она или его фармацевтически приемлемой соли, стереоизомера или таутомера указанному пациенту, измерение количества фосфорилированного S6RP, 4Е-ВР1 или AKT у указанного пациента и сравнение указанного количества фосфорилированного S6RP, 4Е-ВР1 или AKT с количеством у указанного пациента перед введением эффективного количества 1-этил-7-(2-метил-6-(1Н-1,2,4-триазол-3-ил)пиридин-3-ил)-3,4-дигидропиразино[2,3Ъ]пиразин-2(1Н)-она или его фармацевтически приемлемой соли, стереоизомера или таутомера.
23. 23. Способ по п.22, где мультиформная глиобластома является глиобластомой, при которой активирован сигнальный путь PI3K/mTOR.
24. 24. Способ по п.23, где мультиформная глиобластома является глиобластомой, при которой активация сигнального пути PI3K/mTOR происходит в результате мутации ERBB2, мутации или делеции

    - 21 030808

    PTEN, мутации или делеции NF1, мутации PIK3Са, мутации или сверхэкспрессии EGFR, амплификации

    Met, активации или амплификации PDGFRa, амплификации AKT или их комбинации.
25. 25. Способ по п.22, где мультиформная глиобластома отличается экспрессией белка MGMT.
26. 26. Способ по п.22, где мультиформная глиобластома отличается гипометилированием протомора MGMT.
27. 27. Способ измерения ингибирования фосфорилирования ДНК-PK S2056 в кожном образце пациента с мультиформной глиобластомой (GBM), отличающейся экспрессией белка MGMT или гипометилированием промотора MGMT, включающий введение эффективного количества 1-этил-7-(2-метил-6-(1Н1,2,4-триазол-3-ил)пиридин-3-ил)-3,4-дигидропиразино[2,3-b]пиразин-2(1Н)-она или его фармацевтически приемлемой соли, стереоизомера или таутомера указанному пациенту, измерение количества фосфорилированной S2056 ДНК-PK, присутствующей в кожном образце, и сравнение указанного количества фосфорилированной S2056 ДНК-PK с количеством в кожном образце указанного пациента перед введением эффективного количества 1-этил-7-(2-метил-6-(1Н-1,2,4-триазол-3-ил)пиридин-3-ил)-3,4дигидропиразиноЦЗ-^пиразин^ЦЩ-она или его фармацевтически приемлемой соли, стереоизомера или таутомера.
28. 28. Способ по п.27, где мультиформная глиобластома является глиобластомой, при которой активирован сигнальный путь PI3K/mTOR.
29. 29. Способ по п.28, где мультиформная глиобластома является глиобластомой, при которой активация сигнального пути PI3K/mTOR происходит в результате мутации ERBB2, мутации или делеции PTEN, мутации или делеции NF1, мутации PIK3Са, мутации или сверхэкспрессии EGFR, амплификации Met, активации или амплификации PDGFRa, амплификации AKT или их комбинации.
30. 30. Способ по п.27, где мультиформная глиобластома отличается экспрессией белка MGMT.
31. 31. Способ по п.27, где мультиформная глиобластома отличается гипометилированием протомора MGMT.
32. 32. Набор, содержащий 1-этил-7-(2-метил-6-(1Н-1,2,4-триазол-3-ил)пиридин-3-ил)-3,4дигидропиразиноЦЗ-ЭДпиразин^ЦЩ-он или и его фармацевтически приемлемую соль, стереоизомер или таутомер и средства для мониторинга ответа пациента на введение указанного 1-этил-7-(2-метил-6(1Н-1,2, 4-триазол-3-ил)пиридин-3-ил)-3,4-дигидропиразино[2,3-b]пиразин-2(1Н)-она или и его фармацевтически приемлемой соли, стереоизомера или таутомера, где указанный пациент страдает мультиформной глиобластомой (GBM), отличающейся экспрессией белка MGMT или гипометилированием промотора MGMT.
33. 33. Набор по п.32, где мультиформная глиобластома отличается экспрессией белка MGMT.
34. 34. Набор по п.32, где мультиформная глиобластома отличается гипометилированием протомора MGMT.

    - 22 030808