EA028434B1 - Лечение рака ингибиторами tor киназы - Google Patents

Abstract

Представлены способы лечения или профилактики саркомы Юинга со сверхэкспрессией Е-двадцать шесть (ETS), включающие введение эффективного количества 1-этил-7-(2-метил-6-(1H-1,2,4-триазол-3-ил)пиридин-3-ил)-3,4-дигидропиразино[2,3-b]пиразин-2(1H)-она или его фармацевтически приемлемой соли, стереоизомера или таутомера пациенту, страдающему саркомой Юинга со сверхэкспрессией ETS.

Description

Представлены способы лечения или профилактики саркомы Юинга со сверхэкспрессией ЕТ§, включающие введение эффективного количества ингибитора ТОК киназы пациенту, страдающему саркомой Юинга со сверхэкспрессией ЕТ§.

Уровень техники

Связь между аномальным фосфорилированием белка и причиной или следствием заболеваний известна более 20 лет. Следовательно, протеинкиназы стали очень важной группой для создания лекарственных средств. См. СоНсп. Ыа1иге, 1:309-315 (2002). Различные ингибиторы протеинкиназы применяют клинически для лечения множества заболеваний, таких как рак и хронические воспалительные заболевания, включая диабет и удар. См. СоЬеи, Еиг. 1. ВюсЬет., 268:5001-5010 (2001), Рго1ет Шпаке НЫЬПогк Рог Не ТгеайпеШ οί ЭБеаке: ТНе Ргот1ке аий Не РгоЬ1етк, НаийЬоок οί Е\рептеШа1 РЬагтасо1оду, Бргшдег ВеИи Не1йе1Ьег§, 167 (2005).

Протеинкиназы представляют собой большое и разнообразное семейство ферментов, которые катализируют фосфорилирование белков и играют критическую роль в клеточной передаче сигнала. Протеинкиназы могут оказывать положительные или отрицательные регулирующие эффекты, в зависимости от их целевого белка. Протеинкиназы вовлечены в специфические сигнальные пути, которые регулируют клеточные функции, такие как, но не ограниченные ими, метаболизм, развитие клеточного цикла, адгезию клеток, функции сосудов, апопотоз и ангиогенез. Нарушения функционирования клеточной передаче сигнала связаны со многими заболеваниями, наиболее характерные из которых включают рак и диабет. Регулирование трансдукции сигнала цитокинами и связь сигнальных молекул с протоонкогенами и генами-супрессорами опухоли точно задокументировано. Также, была продемонстрирована связь между диабетом и связанными с ним заболеваниями и разрегулированные уровни протеинкиназ. См., например, ЗпйНаг е1 а1. РЬагтасеийса1 КекеагсН, 17(11):1345-1353 (2000). Вирусные инфекции и родственные им состояния также были связаны с регулированием протеинкиназ. Рагк е1 а1. Се11 101 (7): 777-787 (2000).

Так как протеинкиназы регулируют практически каждый клеточный процесс, включая метаболизм, пролиферацию клеток, дифференциацию клеток и выживание клеток, они являются привлекательными целями для терапевтического вмешательства на различных стадиях заболевания. Например, контроль клеточного цикла и ангиогенеза, в которых протеинкиназы играют ключевую роль, являются клеточными процессами, связанными с множеством болезненных состояний, таких как, но не ограниченных ими, рак, воспалительные заболевания, аномальный ангиогенез и связанные с ним заболевания, атеросклероз, дегенерацию желтого пятна, диабет, ожирение и боль.

Протеинкиназы стали привлекательными целями для лечения рака. РаЬЬго е1 а1., РНагтасо1оду & ТЬегареийск 93: 79-98 (2002). Было предложено, что вовлечение протеинкиназ в развитие злокачественных образований у человека может возникнуть при:

(1) геномных перестановках (например, ВСК-АВЬ при хронической миелогенной лейкемии), (2) мутациях, приводящих к конститутивно активной активности киназы, таких как при острой миелогенной лейкемии и опухолях желудочно-кишечного тракта, (3) дерегулировании активности киназы активацией онкогенов или потерей функций суппрессора опухоли, так как при раках с онкогенной КА§, (4) дерегулирование активности киназы чрезмерной экспрессией, так как в случае ЕОРК, и (5) эктопической экспрессии факторов роста, которые вовлечены в развитие и сохранение неопластического фенотипа. РаЬЬго е1 а1., РНагтасо1оду & ТЬегареийск 93:79-98 (2002).

Разъяснение запутанности путей протеинкиназ и сложности взаимоотношений и взаимодействия между различными протеинкиназами и киназными путями подчеркивает важность разработки фармацевтических агентов, способных действовать как модуляторы, регуляторы или ингибиторы протеинкиназы, которые обладают благоприятным действием на множество киназ или множество киназных путей. Следовательно, остается необходимость в новых модуляторах киназы.

Белок, имеющий наименование тТОК (мишень рапамицина у млекопитающих), который также называют РКАР, КАРТ1 или КАРТ1), представляет собой §ег/ТНг протеинкиназу 2549-аминокислоты, которая является одним из наиболее критических белков в пути тТОК/РВК/Ак1, который регулирует рост и пролиферацию клеток. Оеогдакщ аий Уоииек Е\рег1 Кеу. Аийсаисег ТЬег. 6(1): 131-140 (2006). тТОК существует в двух комплексах, тТОКС1 и тТОКС2. Хотя тТОКС1 является чувствительным к аналогам рапамицина (таким как темсиролимус или эверолимус), тТОКС2 в основном не чувствителен к рапамицину. Следовательно, рапамицин не является ингибитором ТОК киназы. Несколько ингибиторов тТОК были или в настоящее время оцениваются в клинических испытаниях для лечения рака. Темсиролимус одобрен для применения при карциноме клеток почек в 2007, и сиролимус одобрен в 1999 для профилактики отторжения трансплантата почек. Эверолимус одобрен в 2009 для пациентов, страдающих карциномой клеток почек, которые имеют прогресс на ингибиторах рецептора сосудистого эндотелиального фактора роста, в 2010 для субэпендимальной гигантоклеточной астроцитомы (§ЕОА) связанной с тубе- 1 028434 розным склерозом (Τδ) у пациентов, которые требуют терапии, но не являются кандидатами на хирургическое вмешательство, и в 2011 для прогрессирующих нейроэндокринных опухолей поджелудочной железы (ΡΝΕΤ) у пациентов с неоперабельным, местнораспространенным или метастатическим заболеванием. Остается необходимость в дополнительных ингибиторах ΤΟΚ киназы. Семейство сарком Юинга представляет собой агрессивные опухоли костей и мягких тканей, определенные хромосомными транслокациями, вызывающими слияние генов Е-двадцать шесть (ΕΤδ). Наиболее распространенная конструкция слияния генов включает ген области-1 точечного разрыва саркомы Юинга (Ε\νδ) слитый с ДНКсвязывающим доменом фактора транскрипции ΕΤδ (РЬ1-1, ΕΤνΐ или БКО). Дисрегулирование полученных химерных белков связано с аномальной пролиферацией, инвазией и онкогенезом. Вгеппег е! а1., ΒίοсНеписа е! ВюрЬукюа Ас!а 1796:201-215 (2009). Ингибирование либо ДНК-РК, либо ΡΑΡΡ1 через миРНК ингибирует инвазию опухолевой клетки ΕΤδ+ саркомы Юинга ίη νίίτο, и ΕΤδ+ саркома Юинга является чувствительной к лечению ингибиторами ΡΑΡΡ-1 ίη νίνο (Вгеппег е! а1., Сапсег Кек. ίαη 27 Ερυό аНеаб οί ρτίηί (2012) ). Кроме того, ΕΤδ слитые белки связаны с активацией пути тΤΟК в колониях клеток и первичных опухолях, и действие рапамицина снижает количество уровней ΕΤδ химерного белка и ингибирует пролиферацию опухолевых клеток. ΜαΕο-Εοζαηο е! а1., Оп^деие 22:9282-9287 (2003); Ζαηαΐί е! а1., Апп. С1ш. ЬаЬ. 8с1. 39(2):160-166 (2009).

Цитирование и идентификация любой ссылки в разделе 2 этой заявки не считается признанием того, что она является ссылкой известного уровня техники в соответствии с данным изобретением.

Сущность изобретения

Представлены способы лечения или профилактики саркомы Юинга со сверхэкспрессией Е-двадцать шесть (ΕΤδ), включающие введение эффективного количества 1-этил-7-(2-метил-6-(1Н-1,2,4-триазол-3ил)пиридин-3-ил)-3,4-дигидропиразино[2,3-Ь]пиразин-2(1Н)-она пациенту, страдающему саркомой Юинга со сверхэкспрессией ΕΤδ.

В определенных вариантах осуществления представлены способы улучшения состояния пациента, страдающего саркомой Юинга со сверхэкспрессией Е-двадцать шесть (ΕΤδ), в соответствии с Критериями оценки ответа солидных опухолей (ΡΕί',ΊδΤ 1,1), включающий введение пациенту эффективного количества 1 -этил-7-(2-метил-6-(1Н-1,2,4-триазол-3 -ил)пиридин-3 -ил)-3,4-дигидропиразино [2,3-Ь]пиразин2(1Н)-она пациенту, страдающему саркомой Юинга со сверхэкспрессией ΕΤδ.

Варианты осуществления данного изобретения будут более полно поняты из подробного описания и примеров, которые не являются ограничивающими вариантами осуществления.

Подробное описание

4.1 Определения

В данном описании термин фармацевтически приемлемая соль(-и) относится к соли, полученной из фармацевтически приемлемой нетоксичной кислоты или основания, включая неорганическую кислоту и основание и органическую кислоту и основание. Подходящие фармацевтически приемлемые основноаддитивные соли ингибиторов ΤΟΚ киназы включают, но не ограничены ими, соли металлов, полученные из алюминия, кальция, лития, магния, калия, натрия и цинка, или органические соли, полученные из лизина, Ν,Ν'-дибензилэтилендиамина, хлорпрокаина, холина, диэтаноламина, этилендиамина, меглумина (Ν-метилглюкамина) и прокаина. Подходящие нетоксичные кислоты включают, но не ограничены ими, неорганические и органические кислоты, такие как уксусная, альгиновая, бензолсульфоновая, бензойная, камфорсульфоновая, лимонная, этенсульфоновая, муравьиная, фумаровая, фуранкарбоновая, галактуроновая, глюконовая, глюкуроновая, глутаминовая, гликолевая, бромисто-водородная, хлористоводородная, изетионовая, молочная, малеиновая, яблочная, миндальная, метансульфоновая, слизевая, азотная, памовая, пантотеновая, фенилуксусная, фосфорная, пропионовая, салициловая, стеариновая, янтарная, сульфанилиновая, серная, винная кислота и п-толуолсульфоновая кислота. Определенные нетоксичные кислоты включают хлористо-водородную, бромисто-водородную, фосфорную, серную и метансульфоновую кислоты. Примеры конкретных солей включают гидрохлорид и мезилат. Другие также хорошо известны в данной области техники, см., например, Кет^η§ίοη'κ ΡЬа^тасеυ!^са1 δ^η^κ, 18'¹' ебк., Маек ΡυΜίκ1τη§, ΕακΙοη ΡΑ (1990) или Кет^η§!οη: Τ1^ δ^ι^ апб Ρ^асί^се οί Ρ1ιαπη;κ\\ 19'¹' ебк., Маек Ρυό1ίκΗίη§, ΕακΙοη ΡΑ (1995).

В данном описании и если не указано иное, термин стереоизомер или стереохимически чистый означает один стереоизомер ингибитора ΤΟΚ киназы, который по существу не содержит другие стереоизомеры этого соединения. Например, стереохимически чистое соединение, имеющее один хиральный центр, по существу не содержит противоположный энантиомер соединения. Стереохимически чистое соединение, имеющее два хиральных центра, по существу не содержит другие диастереомеры соединения. Типичное стереохимически чистое соединение содержит более около 80 мас.% одного стереоизомера соединения и менее около 20 мас.% других стереоизомеров соединения, более около 90 мас.% одного стереоизомера соединения и менее около 10 мас.% других стереоизомеров соединения, более около 95 мас.% одного стереоизомера соединения и менее около 5 мас.% других стереоизомеров соединения, или более около 97 мас.% одного стереоизомера соединения и менее около 3 мас.% других стереоизомеров соединения. Ингибиторы ΤΟΚ киназы могут иметь хиральные центры и могут существовать в виде рацематов, отдельных энантиомеров или диастереомеров, и их смесей. Все такие изомерные формы вклю- 2 028434 чены в описанные в настоящем документе варианты осуществления, включая их смеси. Применение стереохимически чистых форм таких ингибиторов ТОК киназы, а также применение смесей этих форм охвачено описанными в настоящем документе вариантами осуществления. Например, смеси, содержащие равные или не равные количества энантиомеров конкретного ингибитора ТОК киназы, могут применяться в описанных в настоящем документе способах и композициях. Эти изомеры могут быть асимметрически синтезированы или разделены с применением стандартных методов, таких как хиральные колонки или хиральные расщепляющие агенты. См., например, Засциез, 1., е! а1., Епапйотегз, Касета1ез апб Кезо1и1юпз (^11еу-1п1ег§с1епсе, \е\у Уогк, 1981); \\Леп δ. Н., е! а1., Тейакебгоп 33:2725 (1977); ЕНе1, Е. Ь., 81егеоскет1§1гу о£ СагЪоп Сотроипбз (МсОга^-НШ, ΝΥ, 1962) и \\Леп δ. Н., ТаЪ1ез о£ Кезокту Луеп1з апб Орйса1 Кезо1и1юпз р. 268 (Е.Ь. ЕНе1, Еб., ишу. о£ \'о1ге 1)ате Ргезз, \'о1ге 1)ате, ΙΝ, 1972).

Таутомеры относятся к изомерным формам соединения, которые находятся в равновесии друг с другом. Концентрации изомерных форм зависят от окружающей среды, в которой находится соединение, и могут быть различными в зависимости от, например, того, является ли соединение твердым или является органическим или водным раствором. Например, в водном растворе пиразолы могут демонстрировать следующие изомерные формы, которые названы таутомерами друг друга:

н ζ^Ν>Χ ην 7 ν'_χ ι]

Как понятно специалисту в данной области техники, множество функциональных групп и других структур может демонстрировать таутомеризм, и все таутомеры ингибиторов ТОК киназы включены в объем данного изобретения.

Лечение в данном описании, означает облегчение, полное или частичное, саркомы Юинга со сверхэкспрессией ЕТδ, или ее симптомов, или замедление или остановку дальнейшего развития или ухудшения саркомы Юинга со сверхэкспрессией ЕТδ или ее симптомов.

Профилактика в данном описании означает предотвращение наступления, возобновления или распространения, полностью или частично, саркомы Юинга со сверхэкспрессией ЕТδ, или ее симптомов.

Термин эффективное количество в отношении 1-этил-7-(2-метил-6-(1Н-1,2,4-триазол-3ил)пиридин-3-ил)-3,4-дигидропиразино[2,3-Ъ]пиразин-2(1Н)-она означает количество, способное облегчить, полностью или частично, симптомы, связанные с саркомой Юинга со сверхэкспрессией ЕТδ, или замедлить или остановить дальнейшее развитие или ухудшение этих симптомов, или лечить или предотвращать саркому Юинга со сверхэкспрессией ЕТδ. Эффективное количество ингибитора ТОК киназы, например, в фармацевтической композиции, может быть таким, чтобы оказывать желаемое действие; например, от около 0,005 мг/кг массы тела пациента до около 100 мг/кг массы тела пациента в единичной дозе для обоих перорального и парентерального введения. Как очевидно специалистам в данной области техники, ожидается, что эффективное количество ингибитора ТОК киназы, описанного в настоящем документе, варьируется в зависимости от тяжести лечимого показания.

Термины пациент и субъект в данном описании включают животных, включая, но не ограничиваясь ими, таких животных, как корова, обезьяна, лошадь, овца, свинья, курица, индейка, перепелка, кошка, собака, мышь, крыса, кролик или морская свинка, в одном варианте осуществления млекопитающее, в другом варианте осуществления человека. В одном варианте осуществления пациент или субъект включает человека, страдающего саркомой Юинга со сверхэкспрессией ЕТδ. В одном варианте осуществления пациентом является человек, страдающий гистологически или цитологически подтвержденной саркомой Юинга со сверхэкспрессией ЕТδ, включая субъектов, у которых имеется прогресс на фоне (или непереносимость) стандартной противораковой терапии или для которых не существует стандартной противораковой терапии.

В контексте саркомы Юинга со сверхэкспрессией ЕТδ, лечение может оцениваться ингибированием развития заболевания, ингибированием роста опухоли, уменьшением первичных и/или вторичных опухолей, облегчением связанных с опухолью симптомов, улучшением качества жизни, ингибированием секретируемых опухолью факторов (включая секретируемые опухолью гормоны, такие как гормоны, которые способствуют карциноидному синдрому), замедлением возникновением первичных и/или вторичных опухолей, замедлением развитием первичных и/или вторичных опухолей, понижением возникновения первичных и/или вторичных опухолей, замедлением или понижением тяжести вторичных эффектов заболевания, остановкой роста опухоли и/или регрессией опухолей, среди прочих. В определенных вариантах осуществления лечение саркомы Юинга со сверхэкспрессией ЕТδ может оцениваться ингибированием фосфорилирования δ6ΚΡ, 4Е-ВР1 и/или АКТ в кровотоке и/или клетках опухоли и/или биопсии тканей или биопсий/аспиратов опухоли, до, во время и/или после лечения ингибитором ТОК киназы. В других вариантах осуществления лечение саркомы Юинга со сверхэкспрессией ЕТδ может оцениваться ингибированием активности ДНК-зависимых протеинкиназ (ДНК-ПК) в образцах ткани и/или биопсии/аспирате опухоли, например, через оценку количества пДНК-ПК δ2056 в качестве биомеркера для путей повреждения ДНК до, во время и/или после лечения ингибитором ТОК киназы. В одном варианте осуществления образец кожи облучается УФ-светом. В высшей степени, полное ингибирование обозначено в настоящем документе как профилактика или химиопрофилактика. В этом контексте

- 3 028434 термин профилактика включает либо профилактику наступления клинически очевидной саркомы Юинга со сверхэкспрессией ЕТ§ вместе, либо профилактику наступления преклинически очевидной стадии саркомы Юинга со сверхэкспрессией ЕТ§. Также это определение охватывает предотвращение превращения в злокачественные клетки или остановку или реверс развития предопухолевых клеток в злокачественные клетки. Это включает профилактическое лечение пациентов с риском развития саркомы Юинга со сверхэкспрессией ЕТ§.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 представлен анализ ингибирования клоногенного роста для соединения 1 с ЕТ§ положительными и ЕТ§ отрицательными колониями клеток.

На фиг. 2 представлено усиление действия повреждения ДНК соединением 1 в ЕТ§ положительных клетках.

Ингибиторы ТОК киназы

В настоящем изобретении в качестве ингибитора ТОК киназы рассматривается соединение 1-этил7-(2-метил-6-(1Н-1,2,4-триазол-3-ил)пиридин-3-ил)-3,4-дигидропиразино[2,3-Ъ]пиразин-2(1Н)-он или его фармацевтически приемлемая соль, стереоизомер или таутомер.

Способы получения ингибиторов ТОК киназы

Ингибиторы ТОК киназы могут быть получены стандартными хорошо известными методами синтеза, см., например Матей, 1. Абуапсеб Отдашс СйепиУгу; Кеасйопк Месйашктк, апб 5>1гис1игс. 41Н еб., 1992.

Способы применения

Представлены способы лечения или профилактики саркомы Юинга со сверхэкспрессией Е-двадцать шесть (ЕТ§), включающие введение эффективного количества ингибитора ТОК киназы пациенту, страдающему саркомой Юинга со сверхэкспрессией ЕТ§. В определенных вариантах осуществления ингибитор ТОК киназы вводят пациенту, который страдает местнораспространенной, рецидивирующей или метастатической саркомой Юинга со сверхэкспрессией ЕТ§, не подлежащей терапевтическому хирургическому удалению. В другом варианте осуществления ингибитор ТОК киназы вводят пациенту, который получает по меньшей мере одну предшествующую линию химиотерапии на основе платины. В некоторых вариантах осуществления ингибитор ТОК киназы вводят пациенту, который имеет опухоль, демонстрирующую чрезмерную экспрессию ДНК-ПК.

В некоторых вариантах осуществления представлены способы лечения саркомы Юинга со сверхэкспрессией Е-двадцать шесть (ЕТ§), где способы включают введение эффективного количества ингибитора ТОК киназы пациенту, страдающему саркомой Юинга со сверхэкспрессией Е-двадцать шесть (ЕТ§), где лечение дает одно или более из ингибирования развития заболевания, ингибирования роста опухоли, уменьшения первичной опухоли, облегчения связанных с опухолью симптомов, ингибирования секретируемых опухолью факторов (включая секретируемые опухолью гормоны, такие, которые участвуют в карциноидном синдроме), замедления возникновения первичных или вторичных опухолей, замедления развития первичных или вторичных опухолей, замедления распространения первичных или вторичных опухолей, замедления или понижения тяжести вторичных эффектов заболевания, остановки роста опухоли и уменьшения опухолей, увеличения времени до прогрессирования заболевания (ТТР), увеличения выживаемости без прогрессирования заболевания (РР§), и/или повышения общей выживаемости (О8), среди прочих.

В одном варианте осуществления представлены способы улучшения состояния пациента, страдающего саркомой Юинга со сверхэкспрессией Е-двадцать шесть (ЕТ§), в соответствии с Критериями оценки ответа солидных опухолей (КЕС18Т 1,1) (см. Е18епйаиег Е.А., Тйетакке Р., ВодаеПъ 1., е( а1. №\у ге8рои8е еуа1иайоп сгйепа ίη воНб (итогу Кеу18еб КЕС18Т дшбейпе (уегаоп 1.1). Еигореап ί. Сапсег, 2009; (45) 228-247) у пациента, включающие введение эффективного количества ингибитора ТОК киназы пациенту, страдающему саркомой Юинга со сверхэкспрессией ЕТ§.

В одном варианте осуществления представлены способы ингибирования фосфорилирования §6КР, 4Е-ВР1 и/или АКТ у пациента, страдающего саркомой Юинга со сверхэкспрессией ЕТ§, включающие введение эффективного количества ингибитора ТОК киназы указанному пациенту. В некоторых таких вариантах осуществления ингибирование фосфорилирования оценивают в биологическом образце пациента, таком как кровь и/или опухолевые клетки, биопсия кожи и/или биопсия или аспират опухоли. В таких вариантах осуществления количество ингибирования фосфорилирования оценивают сравнением количества фосфо-86КР, 4Е-ВР1 и/или АКТ до и после введения ингибитора ТОК киназы. В определенных вариантах осуществления представлены способы измерения ингибирования фосфорилирования §6КР, 4Е-ВР1 или АКТ у пациента, страдающего саркомой Юинга со сверхэкспрессией ЕТ§, включающие введение эффективного количества ингибитора ТОК киназы указанному пациенту, измерение количества фосфорилированных §6КР, 4Е ВР1 и/или АКТ у указанного пациента, и сравнение указанного количества фосфорилированных §6КР, 4Е ВР1 и/или АКТ с тем же показателем у указанного пациента до введения эффективного количества ингибитора ТОК киназы.

В определенных вариантах осуществления представлены способы ингибирования фосфорилирования §6КР, 4Е-ВР1 и/или АКТ в биологическом образце пациента, страдающего саркомой Юинга со

- 4 028434 сверхэкспрессией ΕΤδ, включающие введение эффективного количества ингибитора ТОК киназы указанному пациенту и сравнение количества фосфорилированных §6КР, 4Е-ВР1 и/или АКТ в биологическом образце пациента, полученном до и после введения указанного ингибитора ТОК киназы, где меньшее количество фосфорилированных §6РР, 4Е-ВР1 и/или АКТ в указанном биологическом образце, полученном после введения указанного ингибитора ТОР киназы по сравнению с количеством фосфорилированных §6РР, 4Е-ВР1 и/или АКТ в указанном биологическом образце, полученном до введения указанного ингибитора ТОР киназы, указывает на ингибирование.

В одном варианте осуществления представлены способы ингибирования активности ДНКзависимых протеинкиназ (ДНК-ПК) у пациента, страдающего саркомой Юинга со сверхэкспрессией ΕΤδ, включающие введение эффективного количества ингибитора ТОР киназы указанному пациенту. В некоторых вариантах осуществления ингибирование ДНК-ПК оценивается, используя кожу пациента, страдающего саркомой Юинга со сверхэкспрессией ΕΤδ, в одном примере, на облученном УФ-светом образце кожи указанного пациента. В другом варианте осуществления ингибирование ДНК-ПК оценивают, используя биопсию или аспират опухоли пациента, страдающего саркомой Юинга со сверхэкспрессией ΕΤδ. В одном варианте осуществления ингибирование оценивают измерением количества фосфорилированной ДНК-ПК δ2056 (также известной как пДНК-ПК δ2056) до и после введения ингибитора ΤОР киназы. В определенных вариантах осуществления представлены способы измерения ингибирования фосфорилирования ДНК-ПК δ2056 на образце кожи пациента, страдающего саркомой Юинга со сверхэкспрессией ΕΤδ, включающие введение эффективного количества ингибитора ΤОР киназы указанному пациенту, измерение количества фосфорилированной ДНК-ПК δ2056, присутствующей в образце кожи, и сравнение указанного количества фосфорилированной ДНК-ПК δ2056 с этим показателем в образце кожи указанного пациента до введения эффективного количества ингибитора ΤОР киназы. В одном варианте осуществления образец кожи облучают УФ-светом.

В определенных вариантах осуществления представлены способы ингибирования активности ДНКзависимых протеинкиназ (ДНК-ПК) в образце кожи пациента, страдающего саркомой Юинга со сверхэкспрессией ΕΤδ, включающие введение эффективного количества ингибитора ΤОР киназы указанному пациенту и сравнение количества фосфорилированной ДНК-ПК в биологическом образце пациента, полученного до и после введения указанного ингибитора ΤОР киназы, где менее фосфорилированная ДНКПК в указанном биологическом образце, полученном после введения указанного ингибитора ΤОР киназы по сравнению с количеством фосфорилированной ДНК-ПК в указанном биологическом образце, полученном до введения указанного ингибитора ΤОР киназы, означает ингибирование.

В некоторых вариантах осуществления ингибитором ΤОР киназы является соединение, описанное в настоящем документе. В одном варианте осуществления ингибитором ΤОР киназы является соединение 1 (такой ингибитор ΤОР киназы, как описано выше, имеющий молекулярную формулу С₁бН₁₆Ы₈О). В одном варианте осуществления соединением является 1-этил-7-(2-метил-6-(1Н-1,2,4-триазол-3ил)пиридин-3 -ил)-3,4-дигидропиразино [2,3-Ь]пиразин-2(1Н)-он.

Ингибитор ΤОР киназы может быть объединен с радиационной терапией или хирургией. В определенных вариантах осуществления ингибитор ΤОР киназы вводят пациенту, который проходит радиационную терапию, ранее проходил радиационную терапию или будет проходить радиационную терапию. В определенных вариантах осуществления ингибитор ΤОР киназы вводят пациенту, который проходит хирургическое удаление опухоли.

Далее представлены способы лечения пациентов, которых ранее лечили от саркомы Юинга со сверхэкспрессией ΕΤδ, но которые оказались резистентными к лечению стандартными терапиями, а также тех, кого ранее не лечили. Также представлены способы лечения пациентов, которым было проведено хирургическое вмешательство с целью лечения состояния в ткани, а также таких, которым не было проведено хирургическое вмешательство. Так как пациенты, страдающие саркомой Юинга со сверхэкспрессией ΕΤδ, могут иметь гетерогенные клинические проявления заболевания и различные клинические результаты, лечение, даваемое пациенту, может варьироваться в зависимости от его/ее прогноза. Специалист в данной области техники легко определит, без излишнего экспериментирования, конкретные вторичные агенты, типы хирургического вмешательства и типы нелекарственной стандартной терапии, применяемые для лечения конкретного пациента с саркомой Юинга со сверхэкспрессией ΕΤδ.

В определенных вариантах осуществления саркомой Юинга со сверхэкспрессией ΕΤδ является саркома Юинга костей, внекостная саркома Юинга (также известная как внескелетная саркома Юинга), примитивная нейроэктодермальная опухоль (ΡΝΕΤ), периферийная эпендимома, опухоль Аскина (также известная как сарком Юинга грудной стенки) или атипичная саркома Юинга.

В одном варианте осуществления в саркоме Юинга со сверхэкспрессией Е-двадцать шесть (ΕΤδ) активирован путь ΡI3Κ/тΤОР. В определенных вариантах осуществления в саркоме Юинга со сверхэкспрессией Е-двадцать шесть (ΕΤδ) активирован путь Р13К/тТОР из-за потери ΡΤΕΝ, мутации Р1К3Са или чрезмерной экспрессии ΕΟΡР или их сочетания.

Фармацевтические композиции и способы введения

В данном описании представлены композиции, содержащие эффективное количество ингибитора ΤОР киназы, и композиции, содержащие эффективное количество ингибитора ΤОР киназы и фармацев- 5 028434 тически приемлемый носитель или наполнитель. В некоторых вариантах осуществления описанные в настоящем документе фармацевтические композиции подходят для перорального, парентерального, слизистого, чрезкожного или местного введения.

Ингибиторы ТОК киназы могут вводиться пациенту перорально или парентерально в обычной форме препаратов, такой как капсулы, микрокапсулы, таблетки, гранулы, порошки, пастилки, пилюли, суппозитории, инъекции, суспензии и сиропы. Подходящие композиции могут быть получены методами, применяемыми обычно, с использованием обычных, органических и неорганических добавок, таких как эксципиент (например, сахароза, крахмал, маннит, сорбит, лактоза, глюкоза, целлюлоза, тальк, фосфат кальция или карбонат кальция), связующий агент (например, целлюлоза, метилцеллюлоза, гидроксиметилцеллюлоза, полипропилпирролидон, поливинилпирролидон, желатин, аравийская камедь, полиэтиленгликоль, сахароза или крахмал), разрыхлитель (например, крахмал, карбоксиметилцеллюлоза, гидроксипропилкрахмал, низкозамещенная гидроксипропилцеллюлоза, бикарбонат натрия, фосфат кальция или цитрат кальция), смазывающий агент (например, стеарат магния, легкая безводная кремниевая кислота, тальк или лаурилсульфат натрия), вкусовая добавка (например, лимонная кислота, ментол, глицин или апельсиновый порошок), консервант (например, бензоат натрия, бисульфит натрия, метилпарабен или пропилпарабен), стабилизатор (например, лимонная кислота, цитрат натрия или уксусная кислота), суспендирующий агент (например, метилцеллюлоза, поливинилпирролидон или стеарат алюминия), разрыхляющий агент (например, гидроксипропилметилцеллюлоза), разбавитель (например, вода) и базисный воск (например, масло какао, белый вазелин или полиэтиленгликоль). Эффективное количество ингибитора ТОК киназы в фармацевтической композиции может быть такое, чтобы вызывать желаемое действие, например, от примерно 0,005 мг/кг массы тела пациента до примерно 10 мг/кг массы тела пациента в единичной дозе для перорального и парентерального введения.

Доза ингибитора ТОК киназы, вводимая пациенту, сильно варьируется и может быть определена практикующим врачом. В общем, ингибиторы ТОК киназы могут вводиться пациенту от одного до четырех раз в сутки в дозе от примерно 0,005 мг/кг массы тела пациента до примерно 10 мг/кг массы тела пациента, но указанные выше дозы могут широко варьироваться в зависимости от возраста, массы тела и медицинского состояния пациента, и типа введения. В одном варианте осуществления доза составляет от примерно 0,01 мг/кг массы тела пациента до примерно 5 мг/кг массы тела пациента, от примерно 0,05 мг/кг массы тела пациента до примерно 1 мг/кг массы тела пациента, от примерно 0,1 мг/кг массы тела пациента до примерно 0,75 мг/кг массы тела пациента, от примерно 0,25 мг/кг массы тела пациента до примерно 0,5 мг/кг массы тела пациента или от примерно 0,007 мг/кг массы тела пациента до примерно 1,7 мг/кг массы тела пациента. В одном варианте осуществления в сутки дают одну дозу. В другом варианте осуществления в сутки дают две дозы. В любом случае, вводимое количество ингибитора ТОК киназы зависит от таких факторов, как растворимость активного компонента, применяемая композиция и способ введения.

В другом варианте осуществления представлены способы лечения или профилактики саркомы Юинга со сверхэкспрессией ЕТ§, включающие введение от примерно 0,375 до примерно 750 мг/сутки, от примерно 0,75 до примерно 375 мг/сутки, от примерно 3,75 до примерно 75 мг/сутки, от примерно 7,5 до примерно 55 мг/сутки, от примерно 18 до примерно 37 мг/сутки, от примерно 0,5 до примерно 60 мг/сутки или от примерно 0,5 до примерно 128 мг/сутки ингибитора ТОК киназы пациенту, нуждающемуся в этом. В другом варианте осуществления представлены способы лечения или профилактики саркомы Юинга со сверхэкспрессией ЕТ§, включающие введение от примерно 0,5 до примерно 1200 мг/сутки, от примерно 10 до примерно 1200 мг/сутки, от примерно 100 до примерно 1200 мг/сутки, от примерно 400 до примерно 1200 мг/сутки, от примерно 600 до примерно 1200 мг/сутки, от примерно 400 до примерно 800 мг/сутки или от примерно 600 до примерно 800 мг/сутки ингибитора ТОК киназы пациенту, нуждающемуся в этом. В конкретном варианте осуществления описанные в настоящем документе способы включают введение 0,5 мг/сутки, 1 мг/сутки, 2 мг/сутки, 4 мг/сутки, 8 мг/сутки, 16 мг/сутки, 20 мг/сутки, 2 5 мг/сутки, 30 мг/сутки, 45 мг/сутки, 60 мг/сутки, 90 мг/сутки или 120 мг/сутки ингибитора ТОК киназы пациенту, нуждающемуся в этом.

В другом варианте осуществления представлены стандартные лекарственные композиции, которые содержат от примерно 0,1 до примерно 2000 мг, от примерно 1 до 200 мг, от примерно 35 до примерно 1400 мг, от примерно 125 до примерно 1000 мг, от примерно 250 до примерно 1000 мг или от примерно 500 до примерно 1000 мг ингибитора ТОК киназы.

В конкретном варианте осуществления представлены стандартные лекарственные композиции, содержащие примерно 0,1, 0,25, 0,5, 1, 5, 7,5, 10, 15, 20, 30, 45, 50, 60, 75, 100, 125, 150, 200, 250, 300, 400, 600 или 800 мг ингибитора ТОК киназы.

В другом варианте осуществления представлены стандартные лекарственные композиции, содержащие 0,1, 0,25, 0,5, 1, 2,5, 5, 7,5, 10, 15, 20, 30, 35, 50, 70, 100, 125, 140, 175, 200, 250, 280, 350, 500, 560, 700, 750, 1000 или 1400 мг ингибитора ТОК киназы. В конкретном варианте осуществления представлены стандартные лекарственные композиции, содержащие 5, 7,5, 10, 15, 20, 30, 45 или 60 мг ингибитора ТОК киназы.

Ингибитор ТОК киназы может вводиться один раз, два раза, три раза, четыре или более раз в сутки.

- 6 028434

Ингибитор ТОК киназы может вводиться перорально из-за удобства. В одном варианте осуществления при пероральном введении ингибитор ТОК киназы вводят с пищей и водой. В другом варианте осуществления ингибитор ТОК киназы разводят в воде или соке (например, яблочном соке или апельсиновом соке) и вводят перорально в виде суспензии. В другом варианте осуществления при пероральном введении ингибитор ТОК киназы вводят натощак.

Ингибитор ТОК киназы также может вводиться внутрикожно, внутримышечно, внутрибрюшинно, чрескожно, внутривенно, подкожно, интраназально, эпидурально, подъязычно, интрацеребрально, интравагинально, трансдермально, ректально, через слизистую, ингаляцией или местно в уши, нос, глаза или на кожу. Способ введения определяется лечащим врачом и может частично зависеть от места возникновения медицинского состояния.

В одном варианте осуществления представлены капсулы, содержащие ингибитор ТОК киназы без дополнительного носителя, эксципиента или наполнителя.

В другом варианте осуществления представлены композиции, содержащие эффективное количество ингибитора ТОК киназы и фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель, где фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель может содержать эксципиент, разбавитель или их смесь. В одном варианте осуществления композицией является фармацевтическая композиция.

Композиции могут быть в форме таблеток, жевательных таблеток, капсул, растворов, парентеральных растворов, пастилок, суппозиториев и суспензий, и подобных. Композиции могут быть составлены так, чтобы содержать суточную дозу или удобную часть суточной дозы, в единичной дозе, которая может быть отдельной таблеткой или капсулой или удобным объемом жидкости. В одном варианте осуществления растворы готовят из водорастворимых солей, таких как гидрохлорид. В общем, все композиции получают известными методами фармацевтики. Капсулы могут быть получены смешиванием ингибитора ТОК киназы с подходящим носителем или разбавителем, и заполнены подходящим количеством смеси в капсулы. Обычные носители и разбавители включают, но не ограничены ими, инертные порошковые вещества, такие как крахмал множества различных видов, порошковую целлюлозу, особенно кристаллическую и микрокристаллическую целлюлозу, сахара, такие как фруктоза, маннит и сахарозу, тонкоизмельченные порошки и подобные съедобные порошки.

Таблетки могут быть получены прямым прессованием, влажным гранулированием или сухим гранулированием. Их композиции обычно включают разбавители, связующие агенты, смазывающие агенты и разрыхлители, а также соединение. Типичные разбавители включают, например, различные типы крахмала, лактозу, маннит, каолин, фосфат или сульфат кальция, неорганические соли, такие как хлорид натрия и порошковый сахар. Порошковые производные целлюлозы также применяются. В одном варианте осуществления фармацевтические композиции не содержат лактозу. Типичные связующие агенты для таблеток включают вещества, такие как крахмал, желатин и сахара, такие как лактоза, фруктоза, глюкоза и подобные. Также применяют природные и синтетические камеди, включая аравийскую камедь, альгинаты, метилцеллюлозу, поливинилпирролидин и подобные. Полиэтиленгликоль, этилцеллюлозу и воски также применяют в качестве связующих агентов.

Смазывающий агент может быть необходим в таблетированных композициях для предотвращения прилипания таблетки к головке поршня. Смазывающий агент может быть выбран из скользких твердых веществ, таких как тальк, стеарат магния и кальция, стеариновая кислота, и гидрированных растительных масел. Разрыхлители для таблеток включают вещества, которые набухают при смачивании, чтобы разрушить таблетку и высвободить соединение. Они включают крахмалы, глины, целлюлозы, альгины и камеди. Более конкретно, может применяться кукурузный и картофельный крахмалы, метилцеллюлоза, агар, бентонит, древесная целлюлоза, порошковая природная губка, катионообменные смолы, альгиновая кислота, гуаровая камедь, цитрусовый жом и карбоксиметилцеллюлоза, например, а также лаурилсульфат натрия. Таблетки могут быть покрыты сахаром в качестве вкусовой добавки и пломбы или пленкообразующими защитными агентами для модификации свойств растворения таблетки. Композиции также могут быть составлены в виде жевательных таблеток, например, с применением таких веществ, как манит, в композиции.

Если желательно вводить ингибитор ТОК киназы в виде суппозитория, могут применяться типичные основы. Масло какао является традиционной основой для суппозитория, которая может быть модифицирована добавлением восков для незначительного повышения его температуры плавления. Смешиваемые с водой основы для суппозиториев включают, в частности, полиэтиленгликоли с различным молекулярным весом, которые широко используются.

Действие ингибитора ТОК киназы может быть отложено или пролонгировано подходящей композицией. Например, медленнорастворимые гранулы ингибитора ТОК киназы могут быть получены и введены в таблетку или капсулу, или имплантируемое устройство с замедленным выделением. Метод также включает получение гранул с несколькими различными скоростями растворения и заполнение капсул смесью гранул. Таблетки или капсулы могут быть покрыты пленкой, которая замедляет растворение на определенный период времени. Даже парентеральные препараты могут быть сделаны длительно действующими, путем растворения или суспендирования ингибитора ТОК киназы в масляном или эмульгированном носителе, который позволяет ему медленно диспергироваться в сыворотке.

- 7 028434

Наборы

В определенных вариантах осуществления представлены наборы, содержащие ингибитор ТОК киназы.

В других вариантах осуществления представлены наборы, содержащие ингибитор ТОК киназы и средства для отслеживания реакции пациента на введение указанного ингибитора ТОК киназы. В определенных вариантах осуществления пациент страдает саркомой Юинга со сверхэкспрессией ЕТ8. В конкретных вариантах осуществления измеряемой реакцией пациента является ингибирование развития заболевания, ингибирование роста опухоли, уменьшение первичной и/или вторичной опухоли, облегчение связанных с опухолью симптомов, улучшение качества жизни, замедление появления первичной и/или вторичной опухолей, замедление развития первичной и/или вторичной опухолей, замедление проявления первичной и/или вторичной опухолей, замедление или понижение тяжести вторичных эффектов заболевания, остановка роста опухоли или регрессия опухоли.

В других вариантах осуществления представлены наборы, содержащие ингибитор ТОК киназы и средства для измерения количества ингибирования фосфорилирования 86КР, 4Е-ВР1 и/или АКТ у пациента. В определенных вариантах осуществления наборы содержат средства для измерения ингибирования фосфорилирования 86КР, 4Е-ВР1 и/или АКТ в кровотоке или опухолевых клетках и/или биопсии кожи или биопсиях/аспиратах опухоли пациента. В определенных вариантах осуществления представлены наборы, содержащие ингибитор ТОК киназы и средства для измерения количества ингибирования фосфорилирования, оцениваемого сравнением количества фосфо-86КР, 4Е-ВР1 и/или АКТ до, во время и/или после введения ингибитора ТОК киназы. В определенных вариантах осуществления пациент имеет саркому Юинга со сверхэкспрессией ЕТ8.

В других вариантах осуществления представлены наборы, содержащие ингибитор ТОК киназы и средства для измерения количества ингибирования активности ДНК-зависимых протеинкиназ (ДНК-ПК) у пациента. В определенных вариантах осуществления наборы содержат средства для измерения ингибирования активности ДНК-зависимых протеинкиназ (ДНК-ПК) в образце кожи и/или биопсии/аспирате опухоли пациента. В одном варианте осуществления наборы содержат средства измерения количества пДНК-ПК 82056 в образце кожи и/или биопсии/аспирате опухоли пациента. В одном варианте осуществления образец кожи облучают УФ-светом. В определенных вариантах осуществления представлены наборы, содержащие ингибитор ТОК киназы и средства для измерения количества ингибирования активности ДНК-зависимой протеинкиназы (ДНК-ПК) до, во время и/или после введения ингибитора ТОК киназы. В определенных вариантах осуществления представлены наборы, содержащие ингибитор ТОК киназы и средства для измерения количества фосфорилированной ДНК-ПК 82056 до, во время и/или после введения ингибитора ТОК киназы. В определенных вариантах осуществления пациент имеет саркому Юинга со сверхэкспрессией ЕТ8.

В определенных вариантах осуществления представлены наборы, содержащие количество ингибитора ТОК киназы, эффективное для лечения или профилактики саркомы Юинга со сверхэкспрессией ЕТ8. В определенных вариантах осуществления представлены наборы, содержащие ингибитор ТОК киназы, имеющий молекулярную формулу С₁₆Н₁₆Ы₈О. В определенных вариантах осуществления представлены наборы, содержащие соединение 1.

В определенных вариантах осуществления представлены наборы, содержащие дополнительно инструкции по применению, такие как инструкции по введению ингибитора ТОК киназы и/или отслеживания реакции пациента на введение ингибитора ТОК киназы.

Примеры

Биологические примеры Биохимические анализы тТОК НТК-РКЕТ анализ.

Далее представлен анализ, который может применяться для определения активности ингибитора ТОК киназы тестируемого соединения. Ингибиторы ТОК киназы растворяют в ДМСО и получают в виде 10 мМ маточных растворов и разводят соответствующим образом для экспериментов. Реагенты готовят следующим образом:

Простой ТОК буфер (применяют для разведения фракции ТОК с высоким содержанием глицерина) : 10 мМ Тпв рН 7,4, 100 мМ №С1. 0,1% Т\уссп-20. 1 мМ ИТТ. 1пуйгодеп тТОК (са1#РУ4753) разводят в этом буфере до аналитической концентрации 0,200 мкг/мл.

Раствор АТФ/субстрата: 0,075 мМ АТФ, 12,5 мМ тЫС1₂, 50 мМ Черев, рН 7,4, 50 мМ β-ООР, 250 нМ Микроцистин ЬК, 0,25 мМ ЕИТА, 5 мМ ИТТ и 3,5 мкг/мл О8Т-р7086.

Раствор проявляющего реагента: 50 мМ НЕРЕ8, рН 7,4, 0,01% Тгйоп Х-100, 0,01% В8А, 0,1 мМ ЕИТА, 12,7 мкг/мл Су5- аО8Т Атегвйат (Са1#РА92002У), 9 нг/мл α-фосфо р7086 (Тйг389) (Се11 8щпа1ш§ Мойве Мопос1опа1 #9206Ь), 627 нг/мл α-мышиные Ьапее Ей (Регкш Е1тег Са1#АЭ0077).

К 20 мкл простого буфера тТог добавляют 0,5 мкл тестируемого соединения в ДМСО. Для начала реакции 5 мкл раствора АТФ/субстрата добавляют к 20 мкл раствора простого буфера ТОК (контроль) и к раствору соединения, полученному выше. Анализ останавливают через 60 мин добавлением 5 мкл 60

- 8 028434 мМ раствора ΕΌΤΑ; затем добавляют 10 мкл раствора проявляющего реагента и смесь выстаивают в течение по меньшей мере 2 ч перед считыванием на микропланшетном ридере Регкт-Е1шег Εηνίδίοη Μίсгор1а!е Реабег, настроенном на определение ЬДЫСЕ Ей ΤΚ-ΡΡΕΤ (возбуждение при 320 нм и излучение при 495/520 нм).

Ингибиторы ТОР киназы тестируют в анализе тТОР ΗΤΚ-ΡΡΕΤ и определяют присутствие их активности, где определенные соединения имеют 1С₅₀ ниже 10 мкМ в анализе, где некоторые соединения имеют 1С₅₀ от 0,005 до 250 нМ, другие имеют 1С₅₀ от 250 до 500 нМ, другие имеют 1С₅₀ от 500 нМ до 1 мкМ, и другие имеют 1С₅₀ от 1 мкМ до 10 мкМ.

ДНК-ПК анализ

ДНК-ПК анализы проводят с применением методик, прилагаемых к набору для анализа Рготеда ΌΝΑ-РК (каталог # У7870). ДНК-ПК фермент покупают у Рготеда (Рготеда са!#У5811).

Выбранные ингибиторы ΤΟΡ киназы, описанные в настоящем документе, имеют или предположительно имеют 1С₅₀ ниже 10 мкМ в этом анализе, где некоторые ингибиторы ΤΟΡ киназы, описанные в настоящем документе, имеют 1С₅₀ ниже 1 мкМ, и другие имеют 1С₅₀ ниже 0,10 мкМ.

Клеточные анализы

Линии клеток саркомы Юинга С.’АОО-Е81 (ΌδΜΖ), ΡΌ-Ε8 (АТСС), СОО-10 и СОО-258 и отрицательные к Ενδ-слиянию А-204 (АТСС) и δΑ-02 (АТСС) выращивают в РРМ1 1640 (Ιηνίΐτο^η, СагНЪаб, СА) с добавлением 10% РВ8 (Ιηνίίτο^η) в 5% СОг инкубаторе для клеточных культур. Все культуры выдерживают с 50 единицами/мл пенициллина/стрептомицина (Ιηνίΐτο^η).

Чувствительность к химиотерапии

Пять тысяч клеток помещают в каждую лунку планшета 96-луночного планшета наборами по десять. Клетки обрабатывают одной дозой ингибитора ΤΟΡ киназы в течение 72 ч. Анализы с νδΤ (Росйе) проводят согласно протоколу компании. Вкратце, 10% νδΤ добавляют в каждую лунку, планшеты инкубируют при 37°С с 5% СО₂ в течение 4 ч и измеряют ОЭ.

Колониеобразование в мягком агаре

Твердый слой 1% агарозы применяют для покрытия каждой лунки 96-луночного планшета. После двух часов охлаждения пятьсот клеток Юинга суспендируют в 33% агарозе (10% раствор), 33% среде с 2х РВ§ и 33% суспензии клеток в учетверенных лунках 96-луночного планшета. Клетки обрабатывают с или без ингибитора ΤΟΡ киназы в верхнем слое среды. Каждые три дня среду меняют на свежую среду, содержащую ингибитор ΤΟΡ киназы. Через 3 недели в культуре получают изображения с помощью 10х линзы объектива, и колонии подсчитывают для каждого состояния. Этот анализ проводят в трех независимых экспериментах, данные показаны на фиг. 1. Как можно увидеть, колонии клеток саркомы Юинга со сверхэкспрессией ΕΤδ являются более чувствительными к ингибированию соединением 1.

Анализы повреждения ДНК: анализ СОМЕТ

Линии клеток саркомы Юинга высевают в количестве 250000 клеток/мл в 6-луночном планшете за 24 ч до обработки ингибитором ΤΟΡ киназы или носителем в качестве контроля. Через 48 ч клетки трипсинизируют, собирают центрифугированием и повторно суспендируют в РВ§. Количество клеток нормализуют до 1х 10⁵ клеток/мл. Суспендированные клетки (25 мкл) смешивают с 250 мкл 1,0% ультрачистой агарозы с низкой температурой плавления (ЕцЦгодеп) в 1х Τ^^8-Вο^аΐе буфере. Смесь агароза-клетки капают на предметные стекла и оставляют затвердевать при 4°С в темноте в течение 20 минут перед погружением в лизисный раствор для анализа ^ΜΕΤ (Τκνί^η, СаИЬегвЪигд, ΜΌ) при 4°С в темноте в течение 45 мин. Избыточный буфер удаляют и предметные стекла погружают в свежеприготовленный нейтральный раствор (Τήδ Ваве 60,57 г, ацетат натрия 204,12 г, растворенный в 450 мл бН₂О, доведенный до рН=9,0 ледяной уксусной кислотой) при комнатной температуре в темноте в течение 40 мин. Предметные стекла промывают дважды погружением в 1х ΤВΕ буфер до нейтрального электрофореза при 20 вольтах в течение 60 мин. Предметные стекла фиксируют в 70% этаноле на 5 мин. После воздушной сушки агарозы предметные стекла окрашивают красителем §УВР Сгеен (ΙηνίΟΌ^η), и изображения получают с помощью 10х и 40х линз объектива. Хвостовые моменты СΟΜΕΤ оценивают с применением программы для обработки изображений ^ΜΕΤδ^κ.ν1,5 (АиΐοСΟΜΕΤ.сοт, §итегбиск, УА) как описано производителем, анализируя более 100 клеток в тройных экспериментах (фиг. 2). Как можно увидеть, соединение 1 стимулирует повреждение ДНК в ΕΤδ положительных клетках. Такой же эффект наблюдали для линий клеток рака простаты, которые были отрицательными (22РУ1) или положительными (УСаР и ^NСаР) к ΕΤδ слитому белку.

Анализы ΐη νίνο

Пять недельных самцов мышей δΟΌ (СВ.17. δΟΌ) покупали у Сйаг1е8 РАег, Ею. (Сйаг1е8 РАег ЬаЪога1огу, V^1т^η§ΐοη, ΜΑ). Клетки РЭ-Εδ (2х 10⁶ клеток/впрыск) или контрольные клетки А-204 повторно суспендировали в 100 мкл физиологического раствора с 50% ΜηΙπ^1 (ВЭ Втаепсе^ ВесЮп ЭтАе, N1) и имплантировали подкожно в правый и левый бок мыши. Мышей анестезировали с применением коктейля ксилазина (80-120 мг/кг, внутрибрюшинно) и кетамина (10 мг/кг, внутрибрюшинно) для химического ограничения до имплантации опухоли. Всем опухолям давали созреть перед началом обработки ингибитором ΤΟΡ киназы в течение двух недель. В начале третьей недели мышей с опухолями РЭ-Εδ

- 9 028434 (10 опухолей на обрабатываемую группу, средний размер 150-200 мм³) обрабатывали ингибитором ТОК киназы. Рост объема опухоли регистрировали еженедельно с применением цифровых штангенциркулей, и объемы опухолей рассчитывали с применением формулы (π/6) (Их XV²), где Ь = длина опухоли и = ширина. Потерю массы тела во время курса исследования также отслеживали еженедельно. В конце исследования ксенотрансплантатов мышей умерщвляли, и опухоли собирали. Все опухоли делили для сбора белка, РНК и создания фиксированных в формалине и залитых в парафин блоков, анализировали фосфорилирование ДНК-ПК и биомаркеры пути ТОК. Так как известно, что модель ксенотрансплантата КОБЗ дает метастазы в легкие, легкие собирали, хранили в формалине и затем заливали в парафин. Количество метастазов на легкое количественно анализировали с применением оптической микроскопии.

5.1.4 Клиническое исследование

Фаза 1А/1В, мультицентровое, открытое исследование подбора дозы для оценки безопасности, переносимости, фармакокинетики и предварительной эффективности соединения 1, вводимого перорально пациентам с саркомой Юинга со сверхэкспрессией ЕТЗ

Соединение 1 (ингибитор ТОК киназы такой, как описан выше, 1-этил-7-(2-метил-6-(1Н-1,2,4триазол-3-ил)пиридин-3-ил)-3,4-дигидропиразино[2,3-Ь]пиразин-2(1Н)-он) вводят перорально пациентам с саркомой Юинга со сверхэкспрессией ЕТЗ. В этом исследовании оценивают безопасность и переносимость соединения 1 у человека, а также эффективность. Исследование проводят двумя частями: фаза эскалации дозы (часть А) и фаза терапии препаратом в дозе, достигнутой во время фазы повышения дозы препарата до максимально переносимой (часть В). Пациентов включают в исследование последовательно в части А. Включение в исследование в части В делят по типу опухоли.

Соединение 1 было доступно в трех концентрациях (0,25 мг, 1,0 мг и 5,0 мг) в желатиновых капсулах, содержащих только активный фармацевтический ингредиент. Капсулы упакованы в бутылки полиэтилена высокой плотности (ПЭВП), имеющие термозапечатываемую наружную пленку и пропиленовые крышки с защитой от детей. Фармацевты, участвующие в исследовании, вскрывали упаковку и соответствующим образом распределяли препарат для каждого пациента.

От 30 до 60 пациентов вовлечены в часть А, предназначенную для установления исходной токсичности.

Часть В состоит из приблизительно 100 пациентов с предварительно указанными типами опухолей, включая саркому Юинга со сверхэкспрессией Е-двадцать шесть (ЕТЗ), для дальнейшей оценки профиля безопасности соединения 1 и получения информации по безопасности. Степень ответа опухоли оценивают в зависимости от типа опухоли и дозы. Участников части В определяют по эффективности, отмеченной во время проведения части А и по данным ведущихся доклинических исследований.

Цикловой хронометраж исследования состоит из периода отбора (от дня -28 до дня 1), период лечения и оценки (28-дневные Οϋ (один раз в день) (и/или ВГО (два раза в день)) циклы вплоть до развития опухоли, неприемлемая токсичность или решение пациента/врача прервать введение соединения 1) и конец лечения и период последующего наблюдения (конец лечебных процедур в течение 21 дня после последней дозы; последующее наблюдение в течение 28 дней после последней дозы для оценки конечной безопасности).

Пациентам начинают давать соединение 1 Οϋ или ВГО (или другой подходящий режим) на 1 день 1 цикла и получают ежедневное лечение в течение 28 дней. Соединение 1 может быть отменено, когда появятся доказательства развития опухоли, но пациент может продолжать получать исследуемое лекарственное средство столько, сколько, по мнению исследователя, оно может быть полезным. Введение соединения 1 будет прервано, когда возникнет неприемлемая токсичность или пациент решит выйти из исследования.

Соединение 1 вводят перорально один или два раза в сутки (или другой подходящий режим дозирования) без периода отдыха между циклами. Каждую Οϋ дозу дают утром по меньшей мере с 200 мл воды после ночи натощак (минимум 6 ч). Принятие пищи задерживают по меньшей мере на 90 мин после принятия дозы в дни, когда соединение 1 принимают дома. В дни посещения клиники утреннюю дозу соединения 1 дают в клинике после завершения каких-либо тестов перед принятием дозы. Пищу принимают после завершения всех тестов натощак, но не ранее чем через 90 мин после принятия дозы (3 ч после принятия дозы на 15 день). Для пациентов, получающих соединение 1 Οϋ. у которых причиняющие беспокойство симптомы со стороны ЖКТ, утомляемость или другие симптомы продолжают присутствовать после окончания цикла 1, принятие дозы может быть сдвинуто на более поздний срок в день, при условии, что пациент может выдержать 3-часовой период между введением соединения 1 и последним приемом пищи и 90-минутную задержку перед последующим приемом пищи. Соединение 1 может приниматься вплоть до 12 ч позднее, если принятие дозы задержано на один день; в противном случае, эта доза должна быть пропущена.

Соединение 1 вводят изначально в режиме Οϋ.

Дозы вводят в режиме увеличения после удовлетворительного обзора данных безопасности при меньших дозах. Необходимо минимум 28 дней после введения первой дозы последнему пациенту перед увеличением дозы. В каждой группе, вовлечение в исследование распределяется таким образом, чтобы было минимум 24 часа между 1 днем 1 цикла для каждого пациента для оценки исходной токсичности.

- 10 028434

Каждый цикл соединения 1 длится 28 дней, и между циклами нет периода отдыха. Пациенты могут продолжать получать соединение 1 так долго, сколько они получают пользу от лечения, по мнению исследователя. Введение соединения 1 прерывают, когда появляются доказательства прогрессирования заболевания, неприемлемой токсичности или когда пациент или исследователь решает прервать введение.

В части А, группы пациентов изначально получают РЭ нарастающие дозы соединения 1 для измерения РК и идентификации ΜΤΌ. В части А, 0,5 мг РЭ является начальной дозой соединения 2. Модифицированный усиленный режим титрования (§1тои, К., Ρτβίάΐίη, В., РнЬиШст. Ь., с1 а1. Ассе1ега1еб 111гайои бе8ЩП8 Тот РЬазе I. сйтса1,4па18 ίη оисо1оду, ί. Ыа1 Сапе 1п8ШШе 1997;.89, (15): 1138-1147) применяют для установления исходной токсичности. Во время фазы акселерации, изначальным группам одних пациентов дают соединение 1 в возрастающей дозе до 100% вплоть до первой инстанции 2 степени первого цикла или связанной с лекарственным средством повышенной токсичности, в этот момент фазу акселерации останавливают, и эту конкретную группу расширяют до всего 6 пациентов. Затем применяют стандартное расписание с увеличением дозы на приблизительно 50% для 6 пациентов в группе, для установления ΝΤΌ и ΜΤΌ. Также могут оцениваться меньшие увеличения дозы и дополнительные пациенты в группе приема дозы, при необходимости, на основе токсичности, результатов РК/ΡΌ или биопсии опухоли.

На основе промежуточных результатов РК и ΡΌ из групп первоначального приема дозы, режим приема два раза в день (ВГО) также оценивают в части А. Такое исследование инициируют в группах из 6 пациентов, начиная с или ниже общей суточной дозы, для которой уже установлена переносимость, но разделенной на две равные дозы, вводимые приблизительно с 12-часовым интервалом. Затем независимо увеличивают дозу для групп с приемом ΡΌ и ВГО. Периодический режим дозирования со сравнимой или меньшей дозой по сравнению с непрерывным режимом суточного приема также может приниматься для оценки.

Доза считается непереносимой, если 2 или более из 6 оцениваемых пациентов в группе приема выказывают ЦЬТ во время цикла 1. Если определена ΝΤΌ, увеличение дозы останавливают. ΜΤΌ определяется как последняя доза, тестируемая ниже ΝΤΌ, если 0 или 1 из 6 оцениваемых пациентов выказывают ΌΕΤ во время цикла 1. Промежуточная доза (т.е., доза между ΝΤΌ и последней дозой перед ΝΤΌ) или дополнительные пациенты в любой группе могут потребоваться для более точного определения ΜΤΌ, а также режимы чередования, если полученные результаты РК-ΡΌ позволяют применять такие режимы.

В части В, пациенты могут начать применять соединение 1 в режиме ΡΌ или ВГО в ΜΤΌ и/или низшей дозе, на основании данных безопасности, РК и РЭ из части А. В части В приблизительно 100 пациентов оценивают для определения безопасности и противоопухолевого действия после каждых двух циклов терапии.

Всех пациентов, которые получают по меньшей мере одну дозу соединения 1, оценивают на безопасность. В части А пациентом, которого оценивают для определения дозолимитирующей токсичности (ΌΕΤ), является такой, который в первые 28 дней после цикла 1 дозирования начинает либо: (а) получать по меньшей мере 21 из запланированных 28 доз соединения 1 в определенной для данной группы дозе и имеет достаточно данных для оценки безопасности с применением §КС, или (Ь) подвергаться исследованию связанной с лекарственным средством ΌΕΤ. Неоцениваемых пациентов заменяют в принимающей дозу группе. В части В эффективно оцениваемым пациентом для изучения реакции опухоли является такой, который получает по меньшей мере один цикл соединения 1 и имеет базовую и по меньшей мере одну после базовой оценку эффективности.

В частях А и В, снижение дозы разрешено в любом цикле, включая цикл 1. Снижение дозы, которое происходит в цикле 1 во время части А, будет составлять ΌΕΤ, но пациентам будет позволено продолжать исследование лекарства в пониженной дозе. Для градации АЕ применяют Критерии оценки степени тяжести наиболее частых нежелательных явлений Национального института онкологии США (ΝΟΊ СТСАЕ) версия 4, 2009.

Когда показано снижение дозы, выбирают следующую пониженную дозу в режиме ΡΌ или ВГО. Для снижения дозы ВГО ниже исходной дозы выбирают 10 мг ВГО, 8 мг ВГО и 4 мг ВГО. Позволено снижение двух доз. Дополнительные оценки РК могут быть проведены при модифицированном уровне(-ях) доз для характеризации внутрииндивидуальных РК профилей с чередующимися дозами.

В части А повышение внутрииндивидуальной дозы выше дозы, изначально назначенной пациенту, не разрешено в цикле 1. Пациенты, продолжающие принимать соединение 1 дальше цикла 1, могут, после одобрения §КС, принимать повышенную дозу при условии, что альтернативная доза хорошо переносится по меньшей мере одной группой других пациентов в этом исследовании. В таких случаях может проводиться дополнительная оценка РК при повышенных дозах. В части В не разрешено повышение дозы, которая выше ΜΤΌ. Пациентам с саркомой Юинга, которые начали принимать одинаковую дозу, которая ниже выбранной для части В дозы для всех других опухолей, может быть повышена их доза, если во время цикла 1 не фиксируется ΌΕΤ.

Первичными целями данных фаз 1а/1Ь исследования является определение безопасности, переносимости, ΝΤΌ и ΜΤΌ соединения 1 при пероральном введении взрослым пациентам, и для определения

- 11 028434 характеристик РК перорального соединения 1. Вторичными целями являются оценка степени ингибирования фосфорилирования §6КР и/или 4Е-ВР1 для активности тТОКС1 и АКТ и/или других релевантных биомаркеров для активности тТОКС2 в крови, коже и/или биопсии/аспиратах опухоли, и для изучения противоопухолевой активности соединения 1 в выбранной дозе/режимах по типу опухоли. Другими вторичными целями является оценка ингибирования активности ДНК-ПК в образцах кожи, облученных УФ светом и/или биопсии/аспиратах опухоли с применением пДНК-ПК §2056 и других релевантных биомаркеров для путей повреждения ДНК до и во время лечения соединением 1.

Далее статистический анализ проводят для фазы исследования, дозы, режима дозирования и опухолевых групп, при необходимости или если применимо.

Определения совокупностей для исследования следующие:

(a) Совокупность начавшие получать лечение (1ТТ) - все пациенты, получившие по меньшей мере одну дозу соединения 1;

(b) Совокупность для оценки безопасности - все пациенты, которые получают по меньшей мере одну дозу соединения 1, такую же, как получает совокупность 1ТТ для этого исследования;

(c) Совокупность для оценки эффективности (ЕЕ) - все 1ТТ пациенты, которые отвечают критерию пригодности, закончившие по меньшей мере один цикл соединения 1, и имеющие базовую и по меньшей мере одну действительную пост-базовую оценку эффективности.

Вовлечение пациентов в исследование сокращают, когда вплоть до 20 оцениваемых пациента будут вовлечены для каждого типа опухоли и уровня/режима дозирования. В части В в целом, размеры образцов не основаны на статистическом расчете, но основаны на клинических эмпирических и, по существу, соображениях, традиционно применяемых для исследований фазы 1 такого типа.

Все пациенты, на которых оценивается эффективность в части В, включены в анализ эффективности. Эффективность анализируют для каждого типа опухоли, как только все пациенты выходят из исследования или завершают 6 циклов. Двухсторонние девяносто пяти процентные доверительные интервалы скорости ответа представлены для каждого типа опухоли. Представлены индивидуальные описания всех пациентов, которые демонстрируют полную или частичную реакцию во время части А. Описательный анализ другого доказательства противоопухолевой активности представлен на основе клинических, радиографических и биологических оценок эффективности.

Пациентов оценивают для определения эффективности во время четных циклов. Первичной переменной эффективности является скорость ответа. Ответ опухоли основан на Критериях оценки ответа солидных опухолей (КЕС18Т 1,1) для саркомы Юинга. Другие дополнительные переменные эффективности, включая оценку СТС, суммируют с применением таблиц частот для категориальных переменных или описательной статистики для непрерывных переменных.

Для части с эскалацией дозы и части терапии препаратом в дозе, достигнутой во время фазы повышения дозы препарата до максимально переносимой, этого протокола, критериями включения являются: (а) осмысленное и добровольное подписание документа информированного согласия перед проведением любых связанных с исследованием оценок/процедур; (Ь) мужчины и женщины, 18 лет или больше, с гистологическим или цитологическим подтверждением саркомы Юинга со сверхэкспрессией ЕТ§, включая тех, у которых было прогрессирование (или непереносимость) при стандартной противораковой терапии или которым не давали никакой из существующих обычных терапий; (с) согласие на скриннинговую биопсию опухоли (часть А необязательно; часть В обязательно, за исключением определенных конкретных типов опухоли ниже); (б) ЕСОС Р§ 0 или 1; (е) следующие лабораторные данные:

(1) абсолютное число нейтрофилов (АЫС) >1,5χ 109/л; (2) гемоглобин (Н§Ь)>9 г/дл; (3) тромбоциты (ρ1ΐ)>100χ 109/л; (4) калий в пределах нормы или корректируемый добавками; (5) А8Т/8СОТ и АЬТ/§СРТ <2,5 χ верхний предел нормы (ΗΕΝ) или <5,0 χ υΕΝ, если присутствует опухоль печени; (6) общий билирубин сыворотки <1,5 χ υΕΝ; (7) креатинин сыворотки <1,5 χ υΕΝ или 24-ч клиренс >50 мл/мин и (8) отрицательный тест на беременность на моче или сыворотке в течение 72 ч до начала исследования у женщин детородного возраста; и (£) возможность следовать расписанию посещений при исследовании и другим требованиям протокола.

Для части терапии препаратом в дозе, достигнутой во время фазы повышения дозы препарата до максимально переносимой (часть В) этого протокола критериями включения являются: (а) пациент дает согласие на возврат зафиксированной в формалине залитой в парафин (РРРЕ) архивной опухолевой ткани, либо в опухолевых блоках, либо иссеченных/установленных образцах; и (Ь) гистологически подтвержденная саркома Юинга со сверхэкспрессией ЕТ§ (рецидивная или метастатическая саркома Юинга после стандартной мультимодальной противораковой терапии; возраст 12 лет или выше, с соответствующим согласием для пациентов младше 18; измеримая болезнь согласно КЕС18Т ν1.1; бифосфонаты или денусомаб разрешены в стабильных дозах; и необязательно парные биопсии опухоли, если опухоль доступна).

Как для части с эскалацией дозы, так и части терапии препаратом в дозе, достигнутой во время фазы повышения дозы препарата до максимально переносимой, этого протокола, критериями исключения являются: (а) симптоматические метастазы в центральную нервную систему; (Ь) известный острый или

- 12 028434 хронический панкреатит; (с) любая периферийная невропатия > N01 СТСАЕ степень 2; (ά) упорный понос или малабсорбция > N01 СТСАЕ степень 2, независимо от лечения. Ухудшенная способность глотать; (е) ухудшенная сердечная функция или клинически значимые сердечные заболевания; (ί) сахарный диабет в стадии активного лечения; (д) другие сопутствующие тяжелые и/или неконтролируемые сопутствующие медицинские состояния (например, острая или неконтролируемая инфекция), которые могут вызвать неприемлемые риски безопасности или нарушение соблюдения протокола; (й) предшествующее системное противораковое лечение или экспериментальные методы <5 периодов полувыведения или 4 недель, что короче, до начала исследования лекарственного средства, или пациенты, не восстановившиеся от побочных эффектов такой терапии; (ί) полостная операция <2 недель до начала исследования лекарственного средства, или пациенты, не восстановившиеся от побочных эффектов такой терапии; (]) беременность или кормление грудью; (к) взрослые пациенты детородного возраста, которые не применяют две формы контрацепции; (1) известная инфекция ВИЧ; (т) известная хроническая инфекция вирусом гепатита В или С (НВУ/НСУ), если она не является сопутствующим заболеванием у пациентов с НСС; (п) любое значимое медицинское состояние, лабораторные отклонения или психиатрическое заболевание, включая неспособность глотать капсулы, которые могут не позволить пациенту участвовать в исследовании; (о) любое состояние, включающее присутствие лабораторных отклонений, которое может вызвать у пациента неприемлемый риск, если он будет участвовать в исследовании; (р) любое состояние, которое может препятствовать интерпретации данных исследования; или (с|) сопутствующее активное вторичное злокачественное образование, от которого пациент получает терапию, исключая немеланомный рак кожи или карциному ίη ίύιι шейки матки.

Для части терапии препаратом в дозе, достигнутой во время фазы повышения дозы препарата до максимально переносимой (часть В), этого протокола критериями включения являются предшествующее лечение агентами, нацеленными на тТОК комплексы (двойные ингибиторы Т0КС1+Т0КС2) и/или пути ΡΙ3Κ/ΑΚΤ. Однако предшествующее лечение выделенными ингибиторами Т0КС1 (например, рапалогами) позволено в обеих частях данного исследования.

В некоторых вариантах осуществления пациенты, проходящие представленный в настоящем документе клинический протокол, демонстрируют положительный ответ опухоли, такой как ингибирование роста опухоли или снижение размера опухоли. В определенных вариантах осуществления пациенты, проходящие представленный в настоящем документе клинический протокол, достигают, по градации Критериев оценки ответа солидных опухолей (например, КЕС18Т 1,1), полного ответа, частичного ответа или стабильного заболевания после введения эффективного количества соединения 1. В определенных вариантах осуществления пациенты, проходящие представленный в настоящем документе клинический протокол, показывают повышенную выживаемость без развития опухоли. В некоторых вариантах осуществления пациенты, проходящие представленный в настоящем документе клинический протокол, показывают ингибирование развития заболевания, ингибирование роста опухоли, уменьшение первичной опухоли, облегчение связанных с опухолью симптомов, ингибирование секретируемых опухолью факторов (включая секретируемые опухолью гормоны, такие как вовлечены в карциноидный синдром), замедленное появление первичных или вторичных опухолей, замедленное развитие первичных или вторичных опухолей, пониженное распространение первичных или вторичных опухолей, замедленную или пониженную тяжесть вторичных эффектов заболевания, остановку роста опухоли и регрессию опухолей, повышенное время до прогрессирования заболевания (ТТР), увеличенную выживаемость без прогрессирования заболевания (РР8) и/или повышенную общую выживаемость (08) среди прочих.

Было представлено множество ссылок, описание которых включено в настоящий документ в качестве ссылки во всей полноте. Описанные в настоящем документе варианты осуществления не ограничены в объеме конкретными вариантами осуществления, представленными в примерах, которые даны в качестве иллюстраций некоторых аспектов описанных вариантов осуществления, и любые варианты осуществления, которые функционально эквивалентны, включены в объем данного описания. Конечно, различные модификации описанных в настоящем документе вариантов осуществления, дополняющие те, которые показаны и описаны в настоящем документе, очевидны специалистам в данной области техники и включены в объем формулы изобретения.

Claims (21)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Способ лечения саркомы Юинга со сверхэкспрессией Е-двадцать шесть (ЕТ8), включающий введение эффективного количества 1-этил-7-(2-метил-6-(1Н-1,2,4-триазол-3-ил)пиридин-3-ил)-3,4дигидропиразино[2,3-Ь]пиразин-2(1Н)-она или его фармацевтически приемлемой соли, стереоизомера или таутомера пациенту, страдающему саркомой Юинга со сверхэкспрессией ЕТ8.
2. 2. Способ по п.1, где в саркоме Юинга со сверхэкспрессией Е-двадцать шесть (ЕТ8) активирован путь Р13К/тТОК.
3. 3. Способ по п.2, где в саркоме Юинга со сверхэкспрессией Е-двадцать шесть (ЕТ8) активирован путь Р13К/тТОК из-за потери РТЕК мутации Р1К3Са или чрезмерной экспрессии ЕОРК или их сочетания.

   - 13 028434
4. 4. Способ по п.1, где указанному пациенту вводят от около 0,5 до около 120 мг/сутки 1-этил-7-(2метил-6-(1Н-1,2,4-триазол-3 -ил)пиридин-3 -ил)-3,4-дигидропиразино [2,3-Ь]пиразин-2(1Н)-она или его фармацевтически приемлемой соли, стереоизомера или таутомера.
5. 5. Способ по п.4, где указанному пациенту вводят 0,5, 1, 2, 4, 8, 16, 20, 30, 45, 60, 90 или 120 мг/сутки 1 -этил-7-(2-метил-6-(1Н-1,2,4-триазол-3 -ил)пиридин-3 -ил)-3,4-дигидропиразино [2,3-Ь]пиразин2(1Н)-она или его фармацевтически приемлемой соли, стереоизомера или таутомера.
6. 6. Способ по п.1, где указанному пациенту вводят стандартную лекарственную форму, содержащую

   0,25, 1,0, 5,0, 7,5 или 10 мг 1-этил-7-(2-метил-6-(1Н-1,2,4-триазол-3-ил)пиридин-3-ил)-3,4дигидропиразино[2,3-Ь]пиразин-2(1Н)-она или его фармацевтически приемлемой соли, стереоизомера или таутомера.
7. 7. Способ улучшения состояния пациента, страдающего саркомой Юинга со сверхэкспрессией Едвадцать шесть (ЕТ§), в соответствии с критериями оценки ответа солидных опухолей (КЕС18Т 1,1), включающий введение пациенту эффективного количества 1-этил-7-(2-метил-6-(1Н-1,2,4-триазол-3ил)пиридин-3-ил)-3,4-дигидропиразино[2,3-Ь]пиразин-2(1Н)-она или его фармацевтически приемлемой соли, стереоизомера или таутомера.
8. 8. Способ по п.7, где в саркоме Юинга со сверхэкспрессией Е-двадцать шесть (ЕТ§) активирован путь Р13К/тТОК.
9. 9. Способ по п.8, где в саркоме Юинга со сверхэкспрессией Е-двадцать шесть (ЕТ§) активирован путь Р13К/тТОК из-за потери РТЕЫ, мутации Р1К3Са или чрезмерной экспрессии ЕСРК или их сочетания.
10. 10. Способ ингибирования фосфорилирования §6КР, 4Е-ВР1 и/или АКТ в биологическом образце у пациента, страдающего саркомой Юинга со сверхэкспрессией Е-двадцать шесть (ЕТ§), включающий введение эффективного количества 1-этил-7-(2-метил-6-(1Н-1,2,4-триазол-3-ил)пиридин-3-ил)-3,4дигидропиразино[2,3-Ь]пиразин-2(1Н)-она или его фармацевтически приемлемой соли, стереоизомера или таутомера указанному пациенту и сравнение количества фосфорилированных §6КР, 4Е-ВР1 и/или АКТ в биологическом образце пациента, полученном до и после введения указанного 1-этил-7-(2-метил6-(1Н-1,2,4-триазол-3-ил)пиридин-3-ил)-3,4-дигидропиразино[2,3-Ь]пиразин-2(1Н)-она или его фармацевтически приемлемой соли, стереоизомера или таутомера, где менее фосфорилированные 86КР, 4ЕВР1 и/или АКТ в указанном биологическом образце получают после введения указанного 1-этил-7-(2метил-6-(1Н-1,2,4-триазол-3 -ил)пиридин-3 -ил)-3,4-дигидропиразино [2,3-Ь]пиразин-2(1Н)-она или его фармацевтически приемлемой соли, стереоизомера или таутомера по сравнению с количеством фосфорилированных §6КР, 4Е-ВР1 и/или АКТ в указанном биологическом образце, полученном до введения указанного 1 -этил-7-(2-метил-6-(1Н-1,2,4-триазол-3 -ил)пиридин-3 -ил)-3,4-дигидропиразино [2,3Ь]пиразин-2(1Н)-она или его фармацевтически приемлемой соли, стереоизомера или таутомера, указывают на ингибирование.
11. 11. Способ по п.10, где в саркоме Юинга со сверхэкспрессией Е-двадцать шесть (ЕТ§) активирован путь Р13К/тТОК.
12. 12. Способ по п.11, где в саркоме Юинга со сверхэкспрессией Е-двадцать шесть (ЕТ§) активирован путь Р13К/тТОК из-за потери РТЕЫ, мутации Р1К3Са или чрезмерной экспрессии ЕСРК или их сочетания.
13. 13. Способ ингибирования активности ДНК-зависимой протеинкиназы (ДНК-ПК) в образце кожи пациента, страдающего саркомой Юинга со сверхэкспрессией Е-двадцать шесть (ЕТ§), включающий введение эффективного количества 1-этил-7-(2-метил-6-(1Н-1,2,4-триазол-3-ил)пиридин-3-ил)-3,4дигидропиразино[2,3-Ь]пиразин-2(1Н)-она или его фармацевтически приемлемой соли, стереоизомера или таутомера указанному пациенту и сравнение количества фосфорилированной ДНК-ПК в биологическом образце пациента, полученном до и после введения указанного 1-этил-7-(2-метил-6-(1Н-1,2,4триазол-3-ил)пиридин-3-ил)-3,4-дигидропиразино[2,3-Ь]пиразин-2(1Н)-она или его фармацевтически приемлемой соли, стереоизомера или таутомера, где менее фосфорилированная ДНК-ПК в указанном биологическом образце, полученном после введения указанного 1-этил-7-(2-метил-6-(1Н-1,2,4-триазол-3ил)пиридин-3-ил)-3,4-дигидропиразино[2,3-Ь]пиразин-2(1Н)-она или его фармацевтически приемлемой соли, стереоизомера или таутомера, по сравнению с количеством фосфорилированной ДНК-ПК в указанном биологическом образце, полученном до введения указанного 1-этил-7-(2-метил-6-(1Н-1,2,4триазол-3-ил)пиридин-3-ил)-3,4-дигидропиразино[2,3-Ь]пиразин-2(1Н)-она или его фармацевтически приемлемой соли, стереоизомера или таутомера, указывает на ингибирование.
14. 14. Способ по п.13, где в саркоме Юинга со сверхэкспрессией Е-двадцать шесть (ЕТ§) активирован путь Р13К/тТОК.
15. 15. Способ по п.14, где в саркоме Юинга со сверхэкспрессией Е-двадцать шесть (ЕТ§) активирован путь Р13К/тТОК из-за потери РТЕЫ, мутации Р1К3Са или чрезмерной экспрессии ЕСРК или их сочетания.
16. 16. Способ измерения ингибирования фосфорилирования §6КР, 4Е-ВР1 или АКТ у пациента, страдающего саркомой Юинга со сверхэкспрессией Е-двадцать шесть (ЕТ§), включающий введение эффективного количества 1 -этил-7-(2-метил-6-(1Н-1,2,4-триазол-3 -ил)пиридин-3 -ил)-3,4-дигидропиразино [2,3 - 14 028434

    Ь]пиразин-2(1Н)-она или его фармацевтически приемлемой соли, стереоизомера или таутомера указанному пациенту, измерение количества фосфорилированных 86КР, 4Е-ВР1 или АКТ у указанного пациента, и сравнение указанного количества фосфорилированных 86КР, 4Е-ВР1 или АКТ с этим параметром у указанного пациента до введения эффективного количества 1-этил-7-(2-метил-6-(1Н-1,2,4-триазол-3ил)пиридин-3-ил)-3,4-дигидропиразино[2,3-Ь]пиразин-2(1Н)-она или его фармацевтически приемлемой соли, стереоизомера или таутомера.
17. 17. Способ по п.16, где в саркоме Юинга со сверхэкспрессией Е-двадцать шесть (ЕТ8) активирован путь Р13К/тТОК.
18. 18. Способ по п.17, где в саркоме Юинга со сверхэкспрессией Е-двадцать шесть (ЕТ8) активирован путь Р13К/тТОК из-за потери РТЕН мутации Р1К3Са или чрезмерной экспрессии ЕОРК или их сочетания.
19. 19. Способ измерения ингибирования фосфорилирования ДНК-ПК 82056 в образце кожи пациента, страдающего саркомой Юинга со сверхэкспрессией Е-двадцать шесть (ЕТ8), включающий введение эффективного количества 1-этил-7-(2-метил-6-(1Н-1,2,4-триазол-3-ил)пиридин-3-ил)-3,4дигидропиразино[2,3-Ь]пиразин-2(1Н)-она или его фармацевтически приемлемой соли, стереоизомера или таутомера указанному пациенту, измерение количества фосфорилированной ДНК-ПК 82056, присутствующей в образце кожи, и сравнение указанного количества фосфорилированной ДНК-ПК 82056 с этим параметром в образце кожи указанного пациента до введения эффективного количества 1-этил-7-(2метил-6-(1Н-1,2,4-триазол-3-ил)пиридин-3-ил)-3,4-дигидропиразино[2,3-Ь]пиразин-2(1Н)-она или его фармацевтически приемлемой соли, стереоизомера или таутомера.
20. 20. Способ по п.19, где в саркоме Юинга со сверхэкспрессией Е-двадцать шесть (ЕТ8) активирован путь Р13К/тТОК.
21. 21. Способ по п.20, где в саркоме Юинга со сверхэкспрессией Е-двадцать шесть (ЕТ8) активирован путь Р13К/тТОК из-за потери РТЕН мутации Р1К3Са или чрезмерной экспрессии ЕОРК или их сочетания.