JP2003277265A - ｅＮＯＳ発現に起因する疾患の予防または治療薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 eNOS遺伝子の発現産物が、eNOS本来の機能を
果たさないことに起因する疾患・病態を治療または予防
するために、eNOSを最適に機能させるよう賦活化する、
副作用がなく安全な治療剤を提供する。 【解決手段】 式（Ｉ）： 【化１】 ［式中、Ｒ¹およびＲ²は、それぞれ水素原子を表すか、
または一緒になって単結合を表し、Ｒ¹およびＲ²が水素
原子を表す場合には、Ｒ³は−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（Ｏ
Ｈ）ＣＨ₃、−ＣＨ（ＯＣＯＣＨ₃）ＣＨ（ＯＣＯＣ
Ｈ₃）ＣＨ₃、−ＣＨ₃、−ＣＨ₂ＯＨ又はフェニル基を表
し、Ｒ¹およびＲ²が一緒になって単結合を表す場合に
は、Ｒ³は−ＣＯＣＨ（ＯＨ）ＣＨ₃を表す］で表される
化合物またはその薬学的に許容される塩を有効成分とす
る、eNOS増加に起因する疾患・病態を治療または予防す
るための薬剤。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は 式（Ｉ）：

【０００２】

【化２】

【０００３】（式中、各記号は下記に定義するとおりで
ある）で表される化合物又はその薬学的に許容される塩
を有効成分とする、eNOS増加が関与する疾患・病態に対
して、あるいはeNOS蛋白量、NO産生が過剰または十分で
あるにもかかわらずその病態が進展することに対して、
その進展を抑制しあるいは回復させ、あるいはeNOSの本
来の機能活性の回復により疾患・病態の治療効果を促進
させることにより、有効に予防または改善する薬剤に関
する。

【０００４】

【従来の技術】血管内皮は血管トーヌスや血栓の形成に
重要な役割を果たす場であることは知られていたが、１
９８０年に初めて内皮由来弛緩因子（ｅｎｄｏｔｈｅｌ
ｉｕｍ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｒｅｌａｘｉｎｇ ｆａｃｔ
ｏｒ：ＥＤＲＦ）の存在が報告された。その後、１９８
７年にＥＤＲＦの本体が一酸化窒素（ＮＯ）であること
が証明された。ＮＯは、Ｌ−アルギニンが酸化され、Ｎ
G−ヒドロキシル−Ｌ−アルギニンからＬ−シトルリン
になる際に産生され、その反応はＮＯ合成酵素（ＮＯｓ
ｙｎｔｈａｓｅ：ＮＯＳ）という酵素によって触媒され
る。なお、ＮＯＳは、血管内皮、神経系、腎臓、血小
板、心筋、平滑筋など幅広く存在し、産生されるＮＯ
は、極めて多彩な作用を有するため、全身の循環調節に
おいて重要な役割を果たす。

【０００５】また、ＮＯＳについてはその遺伝子がクロ
ーニングされ、構造解析が行われた。その結果、ＮＯＳ
には補酵素として、カルモジュリン（ＣａＭ）、フラビ
ン、ＮＡＤＰＨの結合部位に加えて、本発明の有効成分
である式（Ｉ）の化合物に含まれる、（６Ｒ)−Ｌ−エ
リスロ−５，６，７，８−テトラヒドロビオプテリン
（以下、「ＢＨ４」という）の結合部位が存在すること
が判明した。さらに、ＢＨ４が実際にＮＯＳの機能制御
に関与することも示唆されている。つまり、ＮＯＳはＢ
Ｈ４存在下で、２量体（Coupling）となることによりＮ
Ｏの産生が可能となることが示されている（血管 2001:
24(2) 63-67）。これまで、特開平10-338637ではＮＯ
Ｓの機能低下に起因する疾患に対し、特開平11-246410
ではインスリン抵抗性が関与する血管機能異常を伴う疾
患に対し、WO99/43324では薬剤性腎症に対して、それぞ
れＢＨ４がＮＯＳの機能を賦活することによりそのよう
な疾患に対する予防あるいは治療効果を有することが記
載されている。

【０００６】このように動脈硬化、高脂血症、心不全、
高血圧、糖尿病など種々の疾患で内皮依存性血管拡張反
応が減弱しており、NOはこれらの疾患における心筋虚血
の発現、運動耐容能の低下などの改善に関係することが
明らかとなった。また、NOはその多彩な作用により、血
管構築の維持、さらには血管リモデリングにも深く関わ
っていることが明らかになってきた。生体内では抗動脈
硬化因子として働いている可能性が示唆されてきた。た
とえば動脈硬化モデルの内皮型ＮＯ合成酵素（eNOS）遺
伝子欠損マウス（ApoE-KO/eNOS-KO）ではNO産生も乏し
く動脈硬化が更に促進されるとの報告がある。（Kuhlen
cordt PJら：Accelerated Atherosclerosis, Aortic An
eurysm Formation,and Ischemic Heart Disease in Apo
lipoprotein E/Endothelial Nitric Oxide Synthase Do
uble-Knockout Mice. Circulation 2001;104:448-45
4）。

【０００７】ところが、一方において、ApoE-KO/eNOS-T
g（eNOS過剰発現マウス）では動脈硬化は更に促進され
ることが明らかになった（米国心臓病会議2001年11月16
日、抄録No.1312, Overexpression of Endothelial Nit
ric Oxide Synthase Accelerates Atherosclerotic Les
ion Development in ApoE-Deficient Mice）。また、遺
伝性高脂血症（WHHL）家兎の動脈硬化血管の内皮細胞ｃ
NOS（構成的NO合成酵素）のｍRNAおよび蛋白レベルの発
現は低下しておらず、むしろ増強していることが認めら
れ、動脈硬化血管における内皮依存性血管弛緩反応の低
下の機序はNOS自体の減少によるものではないとも考え
られた（NOと病態/治療、36ページ、1995、川嶋）。さ
らに、動脈硬化血管では内皮依存性血管弛緩反応が低下
しているものの、NOの産生は増加しているとの報告もあ
り（NOと病態/治療、36ページ、1995、Harrisonら：JCI
86:2109-2116,1990）、eNOSの増加とNOの関係およびeN
OS増加と病態との関係は解明されていない。

【０００８】また、高脂血症治療薬のスタチン系薬剤
（Laufs Uら：Upregulation of endothelial nitric ox
ide synthase by HMG Co A reductase inhibitors. Cir
culation 1998 ；97: 1129-1135）、高血圧、心不全の
治療薬のACE阻害薬、AT1拮抗薬（Onozato MLら：Oxidat
ive stress and nitric oxide synthase in rat diabet
ic nephropathy: Effect of ACEI and ARB. Kidney In
t. 2002; 61:186-194）、Ｃａ拮抗薬（Ding Yら：Nife
dipine and diltiazem but not verapamil up-regulate
endothelial nitric oxide synthase expression. J P
harmacol Exp Ther. 2000;292:606-609）などでは、eNO
S遺伝子の発現を増加させあるいはeNOS mRNAを安定化さ
せることなどによりeNOSを増加させると言われている。
これらの薬剤は、スタチン系薬剤では3-ヒドロキシ-3-
メチルグルタリル-CoA (HMG-CoA)を阻害すること、ACE
阻害薬ではアンジオテンシン変換酵素を阻害すること、
AT1拮抗薬はアンジオテンシン受容体に拮抗すること、C
a拮抗薬はCaチャンネルでのCaイオンの細胞流入を抑制
することでこれらの医薬品それぞれの薬効を示すもので
あり、eNOS遺伝子発現の増加あるいはeNOS mRNAの安定
化によるeNOS増加により、これらの医薬品の適応となる
疾患・病態に対する薬効をもつものではない。

【０００９】近年eNOS遺伝子を生体内に導入し血管内の
NO産生能を回復あるいは増加させようという試みがなさ
れている。Channonらは兎にeNOSあるいはnNOS遺伝子を
導入することにより動脈硬化血管にNOによる血管拡張作
用が発現することを示した（Channon et al. Circulati
on 98:1905-1911, 1998）。またQianらは高コレステロ
ール食で飼育した兎にeNOS遺伝子を導入することにより
頚動脈血管の細胞接着因子の発現および炎症細胞浸潤が
減少することを示した（Qian et al. Circulation 99:2
979-2982, 1999）。しかしこれらの知見は短期でしかも
局所的な効果を見ているに過ぎず、長期的な効果および
全身に及ぼす効果についての検討はなされていないとの
批判もある。eNOS遺伝子の過剰発現により動脈硬化を更
に悪化させるというKawashimaらの知見（米国心臓病会
議2001年11月16日、抄録No.1312）はeNOS遺伝子の長期
発現あるいは局所的な過剰発現によりeNOS遺伝子治療に
よる効果を期待した疾患をさらに悪化させる可能性も否
定できないことを示している。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、eNOS
遺伝子の発現産物が、eNOS本来の機能を果たさないこと
に起因する疾患・病態を治療または予防するために、増
加したeNOSの機能を賦活化する副作用がなく安全な治療
剤を提供することである。

【００１１】本発明の別の課題は、医薬品の投与により
または遺伝子治療により、eNOS遺伝子を発現させあるい
は発現を増加させあるいはeNOS mRNAを安定化させるこ
となどによりeNOSを増加させて種々の疾患を治療する方
法における補助薬として、発現しまたは発現が増大した
eNOSの機能を賦活化する、副作用がなく安全な治療剤を
提供することである。

【００１２】本発明の別の課題は、eNOS遺伝子を発現さ
せることあるいは発現を増加させることにより種々の疾
患を治療する方法において、その発現もしくは発現増加
による治療効果を長期間および／または持続的に得るた
めの補助薬として、増加したeNOSの機能を賦活化する、
副作用がなく安全な治療剤を提供することである。

【００１３】つまり、本発明は、eNOSが本来の機能を果
たさないことに起因する疾患・病態に対して、あるいは
eNOS蛋白量が過剰である場合に、またはその量が十分で
あるにもかかわらず、その病態が進展することに対し
て、あるいはeNOSを増加させることによる疾患・病態の
治療に対してeNOSのNO産生機能を良好な状態に保つこと
により、有効に予防または改善することにより、患者の
日常生活の質を高めるべく、副作用がなく安全な治療剤
を提供することを目的とする。

【００１４】

【課題を解決すための手段】eNOSはNOを産生させること
により生体内の各種調整を行っているが、本発明者ら
は、eNOSの発現はNO濃度や活性酸素濃度などが生体にと
って良好な状態を保持するように調整することが必要で
あり、良好な状態が破綻した場合はeNOS本来の酵素作用
が十分に得られないか、得られたとしても、生体内の活
性酸素も増大し、治療すべき病気を悪化させたり新たな
疾患を生じせしめることを見いだした。つまり、eNOS遺
伝子発現、NO産生ともに過剰または十分であるにもかか
わらず疾患・病態（例えば動脈硬化）を悪化させる状況
においては、同時に活性酸素の産生も過剰な状況である
ことを見いだした。

【００１５】このような疾患の治療および／または予防
手段として、NOSはuncoupling（２量体になってない）
状態のときは活性酸素を産生することに着目した。そし
て、coupling（２量体形成）反応に関与している最も重
要な因子としてのBH4がこの状態を解決する可能性があ
る物質ではないかとの仮説をたてた。すなわちeNOS遺伝
子が過剰発現あるいは付加発現あるいはeNOS mRNAが安
定化されることなどによりeNOSが増加した状態ではBH4
の供給が間に合わない状態、つまりBH4の量が不足状態
になることにより、NOSはuncouplingとなり活性酸素を
発生させていると考えられることから、BH4を投与する
ことによりeNOSの機能を正常化させればよいであろうと
考えた。

【００１６】そこで、鋭意検討を重ねた結果、驚くべき
ことにeNOS遺伝子過剰発現に起因する動脈硬化、血管粥
腫の動物実験モデルにおいて、BH4投与により、これら
の疾患の進行が抑制されることを認め、BH4が増加したe
NOSの機能を賦活化して、eNOS増加に起因する疾患・病
態に対し、治療および予防する効果を見出し、本発明に
至った。

【００１７】従って本発明は、式（Ｉ）：

【００１８】

【化３】

【００１９】［式中、Ｒ¹およびＲ²は、それぞれ水素原
子を表すか、または一緒になって単結合を表し、Ｒ¹お
よびＲ²が水素原子を表す場合には、Ｒ³は−ＣＨ（Ｏ
Ｈ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ₃、−ＣＨ（ＯＣＯＣＨ₃）ＣＨ
（ＯＣＯＣＨ₃）ＣＨ₃、−ＣＨ₃、−ＣＨ₂ＯＨ又はフェ
ニル基を表し、Ｒ¹およびＲ²が一緒になって単結合を表
す場合には、Ｒ³は−ＣＯＣＨ（ＯＨ）ＣＨ₃を表す］で
表される化合物またはその薬学的に許容される塩を有効
成分とする、eNOS増加に起因する疾患・病態を治療また
は予防するための薬剤である。

【００２０】eNOS増加によりeNOSが本来の機能を果たさ
ないことに起因する疾患・病態には、１）eNOS遺伝子発
現の異常によりeNOSが過剰発現し、生じる疾患・病態、
２）eNOS遺伝子を外部から導入して遺伝子治療を行う場
合（例えば、心血管系の疾患や動脈硬化の治療）に、eN
OSが過剰発現したり、発現したeNOSが本来の機能を発揮
しないために、治療効果が得られなかったり、却って病
状が悪化する場合、３）さらに、スタチン系薬剤、ACE
阻害薬、AT1拮抗薬、Ca拮抗薬などの投与により増加し
たeNOSが本来の機能を発揮しないために、治療効果が得
られなかったり、却って病状が悪化する場合、等を含
む。

【００２１】本発明の薬剤は、BH4をこのようなeNOS増
加によりeNOSが本来の機能を発揮していない状態また
は、eNOS遺伝子が過剰発現した状態、またはそのような
状態を生じることが予測される場合において、治療的ま
たは予防的に投与するため、またはeNOS遺伝子導入に併
用投与するための有効な治療剤である。遺伝子導入との
併用投与は、遺伝子導入の前、ほぼ同時、または後のい
ずれに行うことも可能である。遺伝子導入後、長期間投
与を続けてもよい。

【００２２】本発明の薬剤を必要とするeNOS増加により
eNOSが本来の機能を発揮していない状態または、eNOS遺
伝子が過剰発現した状態は、例えば、心血管系の疾患、
動脈硬化、肺高血圧などとして顕在する。そのような疾
患において、生体内でeNOSが過剰発現していることある
いは正常に機能していないことを診断するには、組織
（例えば血管組織）中の活性酸素の量を組織化学的に調
べることができる。

【００２３】スタチン系薬剤、ACE阻害薬、AT1拮抗薬、
Ca拮抗薬などのeNOSの増加があるとされる薬剤と併用投
与するためには、それらの薬剤の投与前、投与中、投与
後に本発明の薬剤を投与してもよく、またはそれらの薬
剤との合剤として本発明の薬剤を投与してもよい。例え
ばスタチン系薬剤ではアトロバスタチン、フラバスタチ
ン、シンバスタチン、メバスタチン等、ACE阻害薬はア
ラセプリル、イミダプリル、エラナプリル、カプトプリ
ル、キナプリル、トランドプリル、ペリンドプリル、ラ
ミプリル等、AT1拮抗薬はロサルタン等、Ca拮抗薬では
ニフェジピン、ジルチアゼム等の薬剤はそれぞれ、動脈
硬化、高脂血症、あるいは高血圧、心不全、虚血性心疾
患の血管リモデリングの抑制、糖尿病腎症の治療に用い
られている。

【００２４】本発明の治療剤の有効成分である式（Ｉ）
の化合物は公知化合物であり、悪性高フェニルアラニン
血症、うつ病、パーキンソン病、その他の治療薬として
の用途が知られている。例えば、特開昭５９−２５３２
３号公報、同５９−７６０８６号公報、同６１−２７７
６１８号公報、同６３−２６７７８１号公報を参照。こ
れらは適当な塩として用いてもよく、そのような塩とし
ては薬理的に無毒性の酸、例えば、塩酸、リン酸、硫
酸、ホウ酸等の鉱酸、及び、酢酸、ギ酸、マレイン酸、
フマル酸、メシル酸等の有機酸との塩が例示される。

【００２５】本発明の有効成分である式（Ｉ）で表され
る具体的化合物には次のものおよびそれらの薬学的に許
容される塩が含まれる： （６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−５，６，７，８−テトラヒド
ロビオプテリン（ＢＨ４）

【００２６】

【化４】

【００２７】（６Ｒ，Ｓ）−５，６，７，８−テトラヒ
ドロビオプテリン １',２'−ジアセチル−５，６，７，８−テトラヒドロ
ビオプテリン

【００２８】

【化５】

【００２９】セピアプテリン

【００３０】

【化６】

【００３１】６−メチル−５，６，７，８−テトラヒド
ロプテリン

【００３２】

【化７】

【００３３】６−ヒドロキシメチル−５，６，７，８−
テトラヒドロプテリン

【００３４】

【化８】

【００３５】６−フェニル−５，６，７，８−テトラヒ
ドロプテリン

【００３６】

【化９】

【００３７】以上の化合物で、好ましい化合物は５，
６，７，８−テトラヒドロビオプテリン類又はその塩で
あり、更にそのうちでも最も好ましい化合物はＢＨ４又
はその塩である。

【００３８】本発明の治療剤は、式（Ｉ）で表される化
合物を一般の医薬製剤に用いられる担体と、常法によっ
て経口、直腸又は非経腸（静脈内、髄液中への投与を含
む）投与に適する製剤形態にすることにより製造され
る。

【００３９】これら医薬製剤に用いられる担体として
は、用いられる剤形によるが、一般的に賦形剤、結合
剤、崩壊剤などが挙げられる。

【００４０】賦形剤の代表的な例としては澱粉、乳糖、
白糖、ブドウ糖、マンニトール、セルロース等があり、
結合剤としてはポリビニルピロリドン、澱粉、白糖、ヒ
ドロキシプロピルセルロース、アラビアゴムなどがあ
る。又、崩壊剤の例としてはデンプン、寒天、ゼラチン
末、セルロース、ＣＭＣなどがあるが、一般に用いられ
ている賦形剤、結合剤、崩壊剤であればこれら以外でも
よい。

【００４１】本発明の治療剤は、好ましくは上記担体以
外に、有効成分を安定化するための酸化防止剤を含有す
る。酸化防止剤は医薬製剤に一般に使用されているもの
から適宜選択され、例えば、アスコルビン酸、Ｎ−アセ
チルシステイン、Ｌ−システイン、ｄｌ−α−トコフェ
ロール、天然トコフェロール等があげられる。使用する
量は、活性成分（１種またはそれ以上）を安定化させる
量であればよいが、一般的には活性成分１に対し重量で
０.２ないし２.０が好ましい。

【００４２】経口投与に適する本発明の製剤は各々所定
量の活性成分（１種またはそれ以上）を含有する錠剤、
舌下錠、カプセル剤、粉末、散剤、顆粒剤もしくは細粒
剤として、またはシロップ、エマルジョン若しくは頓服
剤のような非水性液中の懸濁液として提供できる。

【００４３】例えば、顆粒剤は、活性成分（１種または
それ以上）と１種またはそれ以上の前記担体、酸化防止
剤等の補助成分を均一に混合して造粒し、ふるいを用い
てメッシュをそろえることにより提供される。錠剤は、
活性成分（１種またはそれ以上）を、場合により１種ま
たはそれ以上の補助成分と共に、圧縮または成形により
製造できる。カプセル剤は、活性成分（１種またはそれ
以上）を、場合により１種またはそれ以上の補助成分と
均一に混合した粉末または顆粒を適当なカプセルに充填
機等を用いて充填して製造する。直腸投与用の製剤は、
カカオ脂などの慣用の担体を使用し、座薬として提供で
きる。非経腸投与用製剤は、殺菌窒素浄化容器中に活性
成分（１種またはそれ以上）を乾燥固体として密封して
提供できる。この乾燥固体製剤は非経腸投与時に、所定
量の無菌水に分散もしくは溶解して患者に投与すること
ができる。

【００４４】これらの製剤の製造においては、有効成分
及び通常の担体の他に前述の酸化防止剤を加えて製剤す
ることが好ましく、又所望により緩衝剤、風味付与剤、
表面活性剤、増粘剤、潤滑剤、滑沢剤等から選ばれる１
種またはそれ以上の補助成分をさらに含有してもよい。

【００４５】活性成分、すなわち、式（Ｉ）で表される
化合物の投与量は投与経路、処置される症状、および処
置を受ける患者によって変わることは勿論のことである
が、最終的には医師の判断にまかせられる。

【００４６】例えば、適当な投与量は、０．１〜５０ｍ
ｇ／ｋｇ（体重）／日の範囲にあり、代表的な好適投与
量は０．５〜１０ｍｇ／ｋｇ（体重）／日である。

【００４７】所望の投与量は上記の活性成分を１日１回
投与してもよいが、１日中の適当な間隔で２〜４回分割
投与してもよい。

【００４８】投与期間は、本発明の薬剤が治療すべき症
状を観察しながら、医師が適宜定めて良い。スタチン系
薬剤、ACE阻害薬、AT1拮抗薬、Ca拮抗薬などのeNOSの増
加があるとされる薬剤と併用投与する場合は、それらの
薬剤の使用期間とほぼ同じであるが、それより適宜長く
するまたは短くすることも本発明の範囲内である。活性
成分は単独で、そのまま他の成分と混合せずに投与する
こともできるが、投与量の調節を容易にするため等の理
由から適用疾患に応じた他の活性成分を医薬製剤として
投与することもできる。

【００４９】また、本発明の製剤は、有効成分として式
（Ｉ）で表される化合物と共に、ＮＯＳの基質または補
酵素もしくは補因子の、例えばＬ−アルギニン、フラビ
ン類（例えば、ＦＡＤ、ＦＭＮ等）およびカルシウムよ
りなる群から選ばれる少なくとも１種を補助的有効成分
として含有してもよい。これら、有効成分の混合によ
り、式（Ｉ）で表される化合物の単独使用に比べて、一
層優れた治療効果を期待できる。本発明製剤中における
上記各成分の比率は特に限定されないが、例えば、重量
で式（Ｉ）で表される化合物の１に対して、Ｌ−アルギ
ニン、フラビン類およびカルシウムよりなる群から選ば
れる少なくとも１種を０.１〜１０の範囲、好ましくは
０.５〜２の範囲とすることができる。

【００５０】この混合製剤により、治療する際の適当な
投与量は、有効成分の合計量として０．１〜５０ｍｇ／
ｋｇ（体重）／日の範囲にあり、好ましくは０．５〜１
０ｍｇ／ｋｇ（体重）／日である。

【００５１】治療に当たり、式（Ｉ）で表される化合物
を単独で有効成分として含む製剤および他の有効成分と
ともに含む製剤の選択は、年齢、症状等に応じて医師に
より適宜選択される。

【００５２】本発明に用いられる活性成分は、（６Ｒ）
−Ｌ−エリスロ−５，６，７，８−テトラヒドロビオプ
テリン（ＢＨ４）およびその塩が最も好ましいが、（６
Ｒ,Ｓ）−５，６，７，８−テトラヒドロビオプテリ
ン、１',２'−ジアセチル−５，６，７，８−テトラヒ
ドロビオプテリン、セピアプテリン、６−メチル−５，
６，７，８−テトラヒドロプテリン、６−ヒドロキシメ
チル−５，６，７，８−テトラヒドロプテリンまたは６
−フェニル−５，６，７，８−テトラヒドロプテリンお
よびそれらの塩等の類似化合物でもよい。しかし、生体
内に存在する天然体であるＢＨ４が好ましいことは言う
までもない。このＢＨ４・２塩酸塩のラットに対する急
性毒性は経口投与で２ｇ／ｋｇ（体重）以上であり、ほ
とんど毒性は見い出されない。また、光学活性体でない
（６Ｒ,Ｓ）−５，６，７，８−テトラヒドロビオプテ
リンも、特開昭５９−２５３２３号公報におけるパーキ
ンソン病の治療にも見られるように毒性は弱く、本発明
の治療に用いられることは可能である。これら以外の式
（Ｉ）に属する化合物も、急性毒性は殆ど見いだされな
い。

【００５３】以下の実施例に従ってさらに詳細に説明す
るが、本発明は、これらの実施例に限定されるものでは
ない。

【００５４】

【実施例】実施例１ （顆粒剤、細粒剤） ポリビニルピロリドン（コリドン３０）１部（重量部）
を滅菌精製水に溶かし、これにアスコルビン酸１０部お
よびＬ−システイン・塩酸塩５部を加え均一な溶液とし
た後、ＢＨ４・２塩酸塩１０部を加え均一とした。

【００５５】この溶液を賦形剤（マンニトールまたは乳
糖）５９部および崩壊剤［コーンスターチまたはヒドロ
キシプロピルセルロース（ＬＨ−２２）］１５部に加
え、練合、造粒、乾燥した後、篩別した。

【００５６】実施例２ （錠剤） 実施例１で作った活性成分の均一溶液に乳糖５８部、微
結晶セルロース１５部を混合したのち、さらにステアリ
ン酸マグネシウム１部を加え混合し打錠した。

【００５７】実施例３ （カプセル剤） 実施例１で作成した剤形のものをカプセルに充填した。
但し滑沢剤としてステアリン酸マグネシウムを０.２％
添加して製剤したものを用いた。

【００５８】実施例４ （注射用剤） ＢＨ４・２塩酸塩 1.5ｇ アスコルビン酸 1.5ｇ Ｌ−システイン・塩酸塩 0.5ｇ マンニトール 6.5ｇ 上記成分を滅菌精製水に溶かし、１００ｍｌとし除菌し
たものを、１ｍｌ又は２ｍｌずつバイアル又はアンプル
にとり凍結乾燥密封した。

【００５９】実施例５ （注射用剤） ＢＨ４・２塩酸塩 ２.０ｇを無酸素で滅菌精製水に溶
かし、１００ｍｌとした溶液を、除菌し、実施例４と同
様に密封した。

【００６０】実施例６ （座薬用剤） ＢＨ４・２塩酸塩 150部 アスコルビン酸 150部 Ｌ−システイン・塩酸塩 50部 上記成分を用い、均一な粉末にしたものをカカオ脂９９
５０部に分散させた。

【００６１】実施例７ （顆粒剤） ＢＨ４・２塩酸塩 ５部 アスコルビン酸 ５部 Ｌ−システイン・塩酸塩 ２部 上記成分を用いて均一な溶液とした。

【００６２】一方マンニトール５５部、ポリビニルピロ
リドン１部、ヒドロキシプロピルセルロース１４部、な
らびにＬ−アルギニンもしくはカルシウム５部を均一に
混合したものに上記の溶液を加え、練合、造粒、乾燥し
た後、篩別した。

【００６３】実施例８ （顆粒剤） ＢＨ４・２塩酸塩 ５部 アスコルビン酸 ５部 Ｌ−システイン・塩酸塩 ５部 マンニトール ５２部 ポリビニルピロリドン（コリドン３０）１部 ヒドロキシプロピルセルロース(ＬＨ−２２)１２部 Ｌ−アルギニンまたはカルシウム １０部 上記成分を用い実施例７と同様に造粒し、篩別した。

【００６４】実施例９ （顆粒剤） ＢＨ４・２塩酸塩 ５部 アスコルビン酸 ５部 Ｌ−システイン・塩酸塩 ２部 上記成分を使用し均一溶液とした。

【００６５】一方、Ｌ−アルギニンまたはカルシウム１
０部、マンニトール５０部、ポリビニルピロリドン（コ
リドン３０）１部およびヒドロキシプロピルセルロース
（ＬＨ−２２）９部を均一に混合したものに上記溶液を
練合、造粒、乾燥した後、篩別した。

【００６６】実施例１０ eNOS発現の確認 eNOSトランスジェニックマウスとApoE欠損マウス（ApoE
-KOホモ接合体）を交配し、eNOSを過剰発現するeNOSト
ランスジェニックApoE欠損マウス（ApoE-KO/eNOS-Tg）
を作成した（米国心臓病会議2001年11月16日、抄録No.1
312）。eNOSトランスジェニックApoE欠損マウスは遺伝
子増幅検査法（PCR法）によりeNOS遺伝子を増幅させそ
の量を測定することで選別できる。12週齢のApoE-KO/eN
OS-Tgマウスの大動脈より蛋白質を抽出し、免疫ブロッ
ト法を用いてeNOSの発現量をデンシトメーターで測定し
た。結果を図１に示す。図中、WT、eNOS-Tg、ApoE-KO、
およびApoE-KO/eNOS-Tgは、それぞれ、野生型、eNOSト
ランスジェニック、ApoE欠損、およびeNOSトランスジェ
ニックApoE欠損マウスを意味する。グラフは６回の独立
した実験の平均値±標準偏差を示す。星印はWTに対して
p<0.01、十字記号はWTに対してp<0.05、縦の複十字記号
はApoE-KOに対してp<0.05であることを示す。

【００６７】トランスジェニックマウスは、野生型マウ
スと比較して明らかにeNOS蛋白量が高く、eNOSを過剰に
発現することが示された。

【００６８】実施例１１ 大動脈洞の粥腫部位領域(1) 実施例１０で作成したマウス（ApoE-KO/eNOS-Tg）３７
匹を４週齢で離乳し、高コレステロール食（1.25％コレ
ステロール、7.5％ココアバター、7.5%カゼイン、0.5％
コール酸ナトリウム）で12週間飼育した。

【００６９】16週齢マウスをペントバルビタール処理
し、大動脈を10U/mlのヘパリンを含む生理食塩水で環流
した。その後大動脈を左心室中部から腸骨大動脈分枝部
位までの間を切り出し、4% paraformaldehydeで一晩固
定した。Excised aortaの遠位部（大動脈弓から腸骨大
動脈分枝まで）から周辺の組織を取り除いたのち、縦断
的に開放し、シリコンコートしたdishに留め、Sudan II
Iで染色した。そしてその光顕画像をNIH 1.61 Imaging
Softwareを用いて画像解析した。粥腫形成部位はlesion
area /total area of aortaで表した。結果を図２に示
す。＊はApoE-KOの雄に対してp<0.0001、十字記号はApo
E-KOの雌に対してp<0.001であることを示す。

【００７０】eNOSトランスジェニックApoE-KOマウスに
おいて粥腫部位が拡大し、動脈硬化が促進されることが
明らかとなった。

【００７１】実施例１２ 大動脈洞の粥状硬化部位領域
(2) 実施例１０で作成したマウス（ApoE-KO/eNOS-Tg）を各
群６〜８匹用い、BH4非投与群には高コレステロール食
（実施例１０参照）を、BH4投与群には高コレステロー
ル食に10mg/kg/dayのBH4を添加し、実施例１１と同じ実
験を行い、大動脈を切り出し画像解析により測定した。
結果を図３に示す。＊はBH4を投与されていない雄ApoE-
KO/eNOS-Tgマウスに対してp<0.05、十字記号はBH4を投
与されていない雌ApoE-KO/eNOS-Tgマウスに対してp<0.0
1であることを示す。

【００７２】BH4投与群ではApoE-KO/eNOS-Tgマウスにお
いて粥腫部位が縮小し、動脈効果が抑制された。

【００７３】実施例１３ スーパーオキサイド産生 実施例１２と同様にして、BH4添加及び無添加の高コレ
ステロール食で 8週間飼育した、各群６〜８匹の12週齢
のマウス（ApoE-KO/eNOS-Tg）から大動脈を取り出し、
周辺の組織を取り除いた後、pH7.4のPBSを満たした黒色
のシリコンdish上にmountした。サンプルを外部の光の
干渉を避けるため遮光した箱の中に置いた後、最終濃度
が20μｍ/LとなるようにMCLAをチャンバーに添加した。
そしてMCLA（2-methyl-6-(4-methoxyphenyl)-3,7-dihyd
roimidazol[1,2-a]pyrazin-3-one-hydrochloride）とス
ーパーオキサイドアニオンが反応することで発するLigh
temissionを5分間測定することを3回繰り返した。

【００７４】Light emissionデータはコンピュータに保
存し、得られた非線形のグレースケールの画像はpseudo
colorに変換した。スーパーオキサイドによる化学発光
（chemiluminescence）強度はWinLigh32ソフトウェアを
用いて解析した。粥腫部位ははSudan III染色で染まっ
た部位と定義した。それぞれのマウスから粥腫部位、粥
腫のない部位それぞれ約10個所（0.0012-0.002cm²）を
ランダムに選択し測定した。バックグラウンドレベルは
各Chemiluminescent signal intensityから差し引い
た。図４に野生型マウスの測定値を1.0として計算した
結果を相対値で示す。グラフは各群６から10匹の平均±
標準偏差を示す。＊はBH4を投与されていないApoE-KO/e
NOS-Tgマウスに対してp<0.01であることを示す。

【００７５】BH4投与群では、高コレステロール食で飼
育したApoE-KO/eNOS-Tgマウスにおいてplaque部位のス
ーパーオキサイド産生が有意に減少し、BH4によるスー
パーオキシド抑制作用が示された。

【００７６】実施例１４ NO産生 8週間高コレステロール食で飼育した12週齢のマウス（A
poE-KO/eNOS-Tg）から、大動脈弓から腸骨大動脈分枝ま
でを含む大動脈を取り出した後すぐにpH7.4のPBS中で周
辺の組織を取り除いた。試料を1.5mmol/L塩化カルシウ
ムを含むリン酸バッファー（pH7.4）を満たした黒色のd
ishに留め、外部光線の干渉を避けるため遮光した箱の
中に置いた。Diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2
DA)を最終濃度10μmol/Lとなるように添加し、試料を常
温で5分間放置した後、485nmの青光で励起した。DAF-2
DAとNOの反応により試料より発せられた蛍光を、中心が
532nmの帯域フィルターを装着したluminographにより感
知させ、その515nm波長の強度で1秒間測定した。大動脈
内皮からのNO産生を求めるために、試料を1μmol/Lのア
セチルコリン溶液に5分間放置し、蛍光画像を測定し
た。各実験ののち、測定された試料が粥腫部位か粥腫の
ない部分か区別するためSudan IIIで染色し観察した。
測定データはコンピュータに取り込み、NO産生はNightO
WL-imaging systemより提供されたWinLight32ソフトウ
ェアーを用い、粥腫のない部分について解析を行った。
非特異的な発光や大動脈のコラーゲン繊維の反射を排除
するため、DAF反応後の測定からバックグランウンドの
測定値を差し引いた。少なくとも10箇所の粥腫部分を含
まない部位（0.0005-0.001cm²）をランダムに選択し、N
Oと反応して発せられた蛍光を測定した。NO産生量はpic
owatt/cm²で示した。内皮からのNO産生はアセチルコリ
ン溶液放置後の測定値からアセチルコリン溶液に放置し
ない条件での測定値を差し引いて求めた。結果を図５に
示す。グラフは６回の独立した実験の平均±標準偏差を
示す。＊はBH4を投与されていないApoE-KO/eNOS-Tgマウ
スに対してp<0.01であることを示す。

【００７７】ApoE-KO/eNOS-Tgマウスにおいて、解析部
分（粥腫のない部分）ではNO産生が有意に増加し、BH4
によるNO産生促進作用が示された。

【００７８】

【発明の効果】本発明によればeNOSの増加によりeNOSが
本来の機能を発揮していない状態または、eNOS遺伝子が
過剰発現した状態、またはそのような状態に起因する種
々の疾患に対し、有効な予防または治療剤が提供され
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】 eNOSトランスジェニックApoE欠損マウス（Ap
oE-KO/eNOS-Tg）におけるeNOSの過剰発現を示すグラフ
である。

【図２】 ApoE-KO/eNOS-Tgマウスにおいて粥腫部位が
拡大したことを示すグラフである。

【図３】 BH4投与により、ApoE-KO/eNOS-Tgマウスの粥
状部位が縮小したことを示すグラフである。

【図４】 BH4投与により、高コレステロール食で飼育
したApoE-KO/eNOS-Tgマウスにおけるplaque部位のスー
パーオキシド産生が減少したことを示すグラフである。

【図５】 BH4投与により、ApoE-KO/eNOS-Tgマウスにお
いてNO産生が有意に増加したことを示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 9/12 Ａ６１Ｐ 9/12 39/06 39/06 43/00 １１１ 43/00 １１１ // Ｃ０７Ｄ 475/04 Ｃ０７Ｄ 475/04

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 次式（Ｉ）： 【化１】 ［式中、Ｒ¹およびＲ²は、それぞれ水素原子を表すか、
   または一緒になって単結合を表し、Ｒ¹およびＲ²が水素
   原子を表す場合には、Ｒ³は−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（Ｏ
   Ｈ）ＣＨ₃、−ＣＨ（ＯＣＯＣＨ₃）ＣＨ（ＯＣＯＣ
   Ｈ₃）ＣＨ₃、−ＣＨ₃、−ＣＨ₂ＯＨ又はフェニル基を表
   し、Ｒ¹およびＲ²が一緒になって単結合を表す場合に
   は、Ｒ₃は−ＣＯＣＨ（ＯＨ）ＣＨ₃を表す］で表される
   化合物又はその薬学的に許容される塩を有効成分とす
   る、内皮型ＮＯ合成酵素（eNOS）の増加に起因する疾患
   ・病態の予防または治療剤。
2. 【請求項２】 eNOS増加に起因する疾患・病態が、心血
   管系の疾患である、請求項１に記載の予防または治療
   剤。
3. 【請求項３】 eNOS増加に起因する疾患・病態が、動脈
   硬化である、請求項１に記載の予防または治療剤。
4. 【請求項４】 請求項１に記載の化合物又はその薬学的
   に許容される塩を有効成分とする、eNOS増加に起因する
   疾患・病態の悪化の予防または治療剤。
5. 【請求項５】 eNOS増加に起因する疾患・病態の悪化
   が、心血管系の疾患である、請求項４に記載の予防また
   は治療剤。
6. 【請求項６】 eNOS増加に起因する疾患・病態の悪化
   が、動脈硬化である、請求項４に記載の予防または治療
   剤。
7. 【請求項７】 請求項１に記載の化合物又はその薬学的
   に許容される塩を有効成分とする、eNOS増加による疾患
   ・病態の治療効果を促進する治療剤。
8. 【請求項８】 eNOS増加による疾患・病態の治療効果が
   心血管系の疾患に対してである、請求項７に記載の治療
   剤。
9. 【請求項９】 eNOS増加に起因する疾患・病態の治療効
   果が、動脈硬化に対してである、請求項７に記載の治療
   剤。
10. 【請求項１０】 Ｒ³がＬ−エリスロ−ＣＨ（ＯＨ）Ｃ
    Ｈ（ＯＨ）ＣＨ₃である、請求項１から９のいずれか１
    項に記載の予防または治療剤。
11. 【請求項１１】 eNOS増加がeNOS遺伝子発現の増加によ
    るものである請求項１から１０のいずれか１項に記載の
    予防または治療剤。
12. 【請求項１２】 eNOS増加がeNOS遺伝子導入に伴うもの
    である請求項１から１１のいずれか１項に記載の予防ま
    たは治療剤。
13. 【請求項１３】 eNOS増加がeNOS増加を促す医薬品の投
    与によるものである請求項１から１１のいずれか１項に
    記載の予防または治療剤。
14. 【請求項１４】 eNOS増加を促す医薬品がさらに配合さ
    れている請求項１から１１のいずれか１項に記載の予防
    または治療剤。